ES2929700T3

ES2929700T3 - Inhibidores de KRas g12c

Info

Publication number: ES2929700T3
Application number: ES20834024T
Authority: ES
Inventors: Serge Louis Boulet; Kevin Charles Fortner; Deqi Guo; David Michael Hyman; Sheng-Bin Peng; Chong Si
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2022-12-01
Anticipated expiration: 2040-12-04
Also published as: AU2020402701A1; CN114828964A; CO2022008091A2; KR20220087566A; IL293394B1; PE20230238A1; ECSP22046699A; CL2022001513A1; JP7023421B2; US20230339968A1; CA3161162A1; HRP20221301T1; EP3886991B1; MX2022006986A; PL3886991T3; PT3886991T; IL293394A; IL304534A; US11731984B2; RS63719B1

Abstract

La presente invención proporciona compuestos de fórmula: donde R1, R2, R3, R4, R5, A, B e Y son como se describe en este documento, sus sales farmacéuticamente aceptables y métodos para usar estos compuestos y sales para tratar pacientes con cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de KRas g12c

La presente invención se refiere a nuevos compuestos heterocíclicos tricíclicos y sales aceptables para uso farmacéutico de los mismos, a composiciones farmacéuticas que incluyen los compuestos heterocíclicos tricíclicos y las sales, y al uso de los compuestos y las sales para tratar cánceres tales como el cáncer de pulmón, el cáncer colorrectal, el cáncer de páncreas, el cáncer de vejiga, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de endometrio, el cáncer de ovario, el colangiocarcinoma o el cáncer de esófago.

La vía de señalización MAPK/ERK transmite estímulos extracelulares al núcleo, para de ese modo regular diversas respuestas celulares, que incluyen la proliferación, la diferenciación y la apoptosis. La proteína KRas es un iniciador de la vía de señalización MAPK/ERK y funciona como un interruptor responsable de inducir la división celular. En su estado inactivo, KRas se une a la guanosina difosfato (GDP), para enviar efectivamente una señal negativa para suprimir la división celular. En respuesta a una señal extracelular, KRas se activa alostéricamente para permitir el intercambio de nucleótidos de GDP para guanosina trifosfato (GTP). En su estado activo unido a GTP, KRas recluta y activa las proteínas necesarias para la propagación de la señalización inducida por el factor de crecimiento, así como otros receptores de señalización celular. Los ejemplos de las proteínas reclutadas por KRas-GTP son c-Raf y PI3-cinasa. KRas, como GTP-asa, convierte el GTP unido de nuevo en GDP, para de ese modo volver a un estado inactivo, y propagar de nuevo las señales para suprimir la división celular. Las mutaciones de ganancia de función de KRas muestran un mayor grado de unión a GTP y una menor capacidad de convertir GTP en GDP. El resultado es un aumento de la señal MAPK/ERK que promueve el crecimiento de las células cancerosas. Las mutaciones sin sentido de KRas en el codón 12 son las más comunes y disminuyen notablemente la actividad GTPasa.

Se han identificado mutaciones oncogénicas de KRas en aproximadamente el 30% de los cánceres humanos y se ha demostrado que activan múltiples vías de señalización descendentes. A pesar de la prevalencia de las mutaciones de KRas, ha sido un objetivo terapéutico difícil. (Cox, A.D. Drugging the Undruggable RAS: Mission Possible? Nat. Rev. Drug Disc. 2014, 13, 828 a 851, Pylayeva-Gupta, y et al. RAS Oncogenes: Weaving a Tumorigenic Web. Nat. Rev. Cancer 2011, 11, 761 a 774).

Los documentos WO2015/054572 y WO2016/164675 desvelan ciertos derivados de quinazolina capaces de unirse a KRas G12C. El documento WO2016/044772 también desvela procedimientos de uso de dichos derivados de quanzolina. El documento WO2020/0081282 desvela inhibidores de KRas G12C. Los documentos WO2018/206539 y WO2020/178282 desvelan ciertos compuestos heteroarilo capaces de unirse a las proteínas RAS KRas G12C. Sigue existiendo la necesidad de proporcionar inhibidores alternativos de KRas de molécula pequeña. En particular, existe la necesidad de proporcionar inhibidores de KRas más potentes y de administración oral que sean útiles para el tratamiento del cáncer. Más concretamente, existe la necesidad de proporcionar inhibidores de moléculas pequeñas que inhiban específicamente la actividad GTP de KRas. También existe la necesidad de proporcionar inhibidores de KRas de molécula pequeña que presenten una mayor eficacia con la misma o reducida actividad inhibidora de KRas. Además, existe el deseo de proporcionar inhibidores de KRas que presenten mejores propiedades farmacocinéticas/farmacodinámicas. También, es necesario proporcionar inhibidores de KRas más potentes que muestren una mayor eficacia con efectos adversos o no deseados reducidos o minimizados. La presente invención aborda una o más de estas necesidades por medio del suministro de nuevos inhibidores de KRas.

La presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en la que:

A es -OCH2-, -N(Ra)CH2, -OCH2CH2-, -N(Ra)CH2CH2-, -CH2OCH2-, o -CH2N(Ra)CH2-;

B es -CH2- o -C(O)-;

Y es -C(CN)- o -N-;

Ri es -CN, -C(O)C=CR8, o un grupo de la fórmula

R2 es H, metilo o -CH2CN;

R3 y R5 son cada uno independientemente H, halógeno, -alquilo Cü.3-cidopropilo, -alquilo C1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R10, o -O-alquilo C1.6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R10;

R4 es H, halógeno, o -alquilo C1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R10;

R6 es H o -alquilo C1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R10;

R7 es H, halógeno, -NR11R12, -CH2NR11R12, -alquilo C1.6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R10 o R13, -alquilo C0-3 ciclopropilo, o -O-alquilo C1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R10 o R13;

R8 es H, -alquilo C1-4 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R10, o -cicloalquilo C3-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R10;

Rg es H, halógeno, -CN, -alquilo C0-3-cicloalquilo C3-6, o -alquilo C1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R10;

R10 es, independientemente, en cada caso, halógeno, oxígeno, hidroxi, -alquilo C1-4, o -O-alquilo C1.4;

R11 y R12 son cada uno independientemente H, -alquilo C1-4, o -heteroalquilo C1.4, en el que R11 y R12 se pueden combinar para formar un heterocicloalquilo; y

R13 es independientemente en cada ocurrencia -N-alquilo C1-4.

Como se utiliza en la presente memoria, el término halógeno significa fluoro (F), cloro (Cl), bromo (Br) o yodo (I). Como se utiliza en la presente memoria, el término alquilo significa radicales hidrocarburos monovalentes saturados de cadena lineal o ramificada de uno a seis átomos de carbono, por ejemplo, “-alquilo CW Los ejemplos de alquilos incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, 1 -propilo, isopropilo, butilo, pentilo y hexilo. Como se utiliza en la presente memoria, el término heteroalquilo significa radicales hidrocarbonados monovalentes saturados de cadena lineal o ramificada que contienen de dos a cinco átomos de carbono y al menos un heteroátomo, por ejemplo, “-heteroalquilo C1-4” Como se utiliza en la presente memoria, el término cicloalquilo significa moléculas cíclicas monovalentes saturadas con tres a seis átomos de carbono, por ejemplo, “-cicloalquilo C3-6” Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Como se utiliza en la presente memoria, el término heterocicloalquilo significa moléculas cíclicas monovalentes saturadas con dos a cinco átomos de carbono y al menos un heteroátomo, por ejemplo, “-heterocicloalquilo C3-6” Los ejemplos de grupos heterocicloalquilos incluyen, entre otros, pirrolidina, piperidina, imidazolidina, pirazolidina y piperazina.

En los casos en los que se indica un cero, por ejemplo, -alquilo C0-3-cicloalquilo C3-6, el componente alquilo del grupo sustituyente puede estar ausente, por lo tanto, si Rg de la Fórmula I es un grupo ciclopropilo sin alquilo principal, el sustituyente se describiría por medio del sustituyente -alquilo C0-3-ciclopropilo como se describe para Rg (es decir, el grupo sustituyente sería -Co-ciclopropilo).

En cuanto a R11 y R12, los dos grupos se pueden combinar con el nitrógeno al que están unidos cuando la química lo permite para formar un heterocicloalquilo . Los ejemplos de dichos grupos heterocicloalquilos incluyen, pero no se limitan a, piperidina, piperazina y morfolina.

En una realización la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula la

en el que Ri, R2, R3, R4, R5, A, B, e Y son como se definen anteriormente, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2-, -N(Ra)CH2-, -OCH2CH2-, -N(Ra)CH2CH2-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2- o -OCH2CH2-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2CH2-,

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que B es -C(O)-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Y es -C(CN)- o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Y es -N-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R1 es -CN, -C(O)CECR8, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Ri es un grupo de la Fórmula

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R2 es H o metilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R2 es H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R3 es H, halógeno, metilo, metoxi, etilo, isopropilo o ciclopropilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R3 es halógeno, (preferentemente F o Cl), o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R4 es H o halógeno, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R4 es H o F, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R5 es halógeno (preferentemente Cl)

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R6 es H o CH3, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o la, en la que Rg es H, F, Cl, -CH2F, -CF3, o -CH2OH, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o la, en la que Rg es H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o la, en la que R7 es H, -CHF2, -CH2F, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2N(CH3)2, o -CH2 -morfolina, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o la, en la que R7 es H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Rg es H y R7 es H, -CHF2, -CH2F, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2N(CH3)2, o -CH2 -morfolina, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Rg es H, F, Cl, -CH2F, -CF3, o -CH2OH y R7 es H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R7 y Rg son ambos H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona el compuesto de la Fórmula I, en la que R1 es -CN, -C(O)CECR8, y R8 es H, metilo, -CH2F, o -CH2OH, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R1 es un grupo de la fórmula

y R7 y Rg son ambos H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

y R7 es terc-butilo y Rg es -CN, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2-, -N(Rg)CH2-, -OCH2CH2-, -N(Rg)CH2CH2-, y B es -C(O)-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona el compuesto de la Fórmula I, en la que A es -OCH2-o -OCH2CH2- y B es -C(O)-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2CH2- y B es -C(O)-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2-, -N(Rg)CH2-, -OCH2CH2-, -N(Rg)CH2CH2-, B es C(O) y R2 es H o -CH3, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2- o -OCH2CH2-, B es -C(O)- y R2 es H o metilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona el compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2CH2-, B es -C(O)- y R2 es H o metilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2-, -N(Rg)CH2-, -OCH2CH2-, -N(Rg)CH2CH2-, B es -C(O)- y R2 es H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o la, en la que A es -OCH2- o -OCH2CH2-, B es -C(O)- y R2 es H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona el compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2CH2-, B es -C(O)- y R2 es H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona el compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2CH2- y R2 es H o metilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona el compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2CH2- y R2 es H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que B es -C(O)- y R2 es H o metilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que B es -C(O)- y R2 es H, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R3 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de H, halógeno o metilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R3 o R5 son halógeno, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R3 y R5 son halógeno, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que R3 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de F o Cl, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Y es -C(CN)- y R4 es H o halógeno (preferentemente F o Cl); o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Y es -N- y R4 es H o halógeno (preferentemente F o Cl), o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización más, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Y es -C(CN)-, y R3 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de metilo o halógeno, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización más, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Y es -C(CN)-, y R3 y R5 son cada uno halógeno (preferentemente F o Cl), o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización más, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Y es -N-, R3 y R5 se seleccionan cada uno independientemente de metilo o halógeno, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización más, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que Y es -N-, R3 y R5 son cada uno halógeno (preferentemente F o Cl), o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización más, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2-, -OCH2CH2-, -N(Ra)CH2CH2-, -CH2OCH2-, o-CH2N(Ra)CH2; B es -CH2- o -C(O)-; Y es -C(CN)-o -N-; R1 es -CN, -C(O)CECR8, o un grupo de la fórmula

R2 es H o metilo; R3 y R5 son cada uno H, F, Cl o metilo; R4 es H o F; R6 es H o metilo; R7 es H, -CHF2, CH2OH, -CH2OCH3, -CH2N(CH3)2, -CH2-morfolina o terc-butilo; R8 es metilo, -CH2F o -CH2OH; y R9 es H, F, Cl, -CH2F, -CF3, -CH2OH o CN; o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra realización más, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula I o Ia, en la que A es -OCH2-o -OCH2CH2-; B es -CH2- o -C(O)-; Y es -C(CN)- o -N-;R2, R7 y R8 son cada uno H; R4 es H o halógeno; R3 y R5 son

cada uno halógeno; o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

La presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula II:

en la que R es

X es Cl o F;

y m es 1 o 2.

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

La presente invención también proporciona un compuesto de la Fórmula IIa:

en la que R es

X es Cl o F;

y m es 1 o 2.

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

Otra forma de describir el compuesto de la Fórmula II es con la Fórmula Ib:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en la que:.

A es -OCH2- o -OCH2CH2-;

Y es -C(CN)- o -N-;

R3 es Cl o F;

R4 es H o F cuando Y es C(CN); y

R4 es F cuando Y es N.

Otra forma de describir el compuesto de la Fórmula IIa es con la Fórmula Ib, en la que A es

■

La presente invención también proporciona un compuesto seleccionado de cualquiera de las fórmulas III a VI siguientes:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra forma, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula III que es:

Fórmula III,

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra forma, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula IV que es:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra forma, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula V que es:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

En otra forma, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula VI que es:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y un portador, diluyente o excipiente aceptable para uso farmacéutico.

La presente invención también proporciona un compuesto o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo de acuerdo con una cualquiera de las Fórmulas I a VI para su uso en terapia. El compuesto o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, puede ser para su uso en el tratamiento del cáncer. Preferentemente, el cáncer es un cáncer de pulmón, un cáncer colorrectal, un cáncer de páncreas, un cáncer de vejiga, un cáncer de cuello de útero, un cáncer de endometrio, un cáncer de ovario, un colangiocarcinoma o un cáncer de esófago. En realizaciones preferentes, el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas o cáncer colorrectal. En otras realizaciones más preferentes, el cáncer es un cáncer de pulmón de células no pequeñas. En otras realizaciones, el cáncer tiene una o más células cancerosas que expresan la proteína KRas G12C mutante. Preferentemente, el cáncer se selecciona entre: Cáncer de pulmón de células no pequeñas mutante en KRas G12C, cáncer colorrectal mutante en KRas G12C y cáncer de páncreas mutante en KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un cáncer de pulmón de células no pequeñas, y una o más células expresan la proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es colorrectal, y una o más células expresan la proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es de páncreas y una o más células expresan la proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el paciente tiene un cáncer que se determinó que tenía una o más células que expresaban la proteína mutante KRas G12C antes de la administración del compuesto o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

La presente invención también proporciona un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más de un inhibidor de PD-1 o PD-L1, un inhibidor de CD4/CDK6, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, un inhibidor de EGFR, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, un inhibidor de ERK, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, un agente de platino, y pemetrexed, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en el tratamiento del cáncer. La presente invención también proporciona una combinación que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las fórmulas I A VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y uno o más de un inhibidor de PD-1 o PD-L1, un inhibidor de CD4/CDK6, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, un inhibidor de EGFR, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, un inhibidor de ERK, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, un agente de platino, y pemetrexed, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del cáncer.

La presente invención también proporciona una combinación que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las fórmulas I A VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y un inhibidor de PD-1 o PD-L1, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del cáncer. En otra realización, el compuesto es un compuesto de las Fórmulas I a VI o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1 es pembrolizumab. En otra realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1 es nivolumab. En otra realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1 es cimiplimab. En otra realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1 es sentilimab. En otra realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1 es atezolizumab. En otra realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1 es avelumab. En otra realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1 es durvalumab. En otra realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1 es lodapilimab. En otra realización, el cáncer es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un carcinoma colorrectal en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un cáncer de páncreas mutante en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, la presente invención comprende el tratamiento de cánceres de otros orígenes portadores del mutante KRas G12C.

La presente invención también proporciona un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un inhibidor de CDK4/CDK6, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína KRas G12C mutante. La presente invención también proporciona una combinación que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y un inhibidor de CDK4/CDK6, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína KRas G12C mutante. En otra realización, el inhibidor de CDK4/CDK6 es abemaciclib. En otra realización, el inhibidor de CDK4/CDK6 es palbociclib. En otra realización, el inhibidor de CDK4/CDK6 es ribociclib. En otra realización, el cáncer es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un carcinoma colorrectal en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un cáncer de páncreas mutante en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, la presente invención comprende el tratamiento de cánceres de otros orígenes portadores del mutante KRas G12C.

La presente invención también proporciona un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un inhibidor de EGFR, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para el tratamiento del cáncer. La presente invención también proporciona una combinación que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y un inhibidor de EGFR, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del cáncer. En una realización, el compuesto es un compuesto de las Fórmulas I a VIo una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización, el inhibidor de EGFR es erlotinib. En otra realización, el inhibidor de EGFR es afatinib. En otra realización, el inhibidor de EGFR es gefitinib. En otra realización, el inhibidor de EGFR es cetuximab. En otra realización, el cáncer es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un carcinoma colorrectal en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un cáncer de páncreas mutante en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, la presente invención comprende el tratamiento de cánceres de otros orígenes portadores del mutante KRas G12C.

La presente invención también proporciona un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un inhibidor de ERK, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína KRas G12C mutante. La presente invención también proporciona una combinación que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y un inhibidor de EGFR, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del cáncer. En una realización, el compuesto es un compuesto de las Fórmulas I a VIo una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización, el inhibidor de ERK es LY3214996. En otra realización, el inhibidor de ERK es LTT462. En otra realización, el inhibidor de ERK es KO-947. En otra realización, el cáncer es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un carcinoma colorrectal en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un cáncer de páncreas mutante en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, la presente invención comprende el tratamiento de cánceres de otros orígenes portadores del mutante KRas G12C.

La presente invención también proporciona un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un agente de platino, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína KRas G12C mutante. La presente invención también proporciona una combinación que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y un agente de platino, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del cáncer. En una realización, el compuesto es un compuesto de las Fórmulas I a VI o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En una realización, el agente de platino es cisplatina. En una realización, el agente de platino es carboplatina. En una realización, el agente de platino es oxaliplatina. En otra realización, el cáncer es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un carcinoma colorrectal en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un cáncer de páncreas mutante en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, la presente invención comprende el tratamiento de cánceres de otros orígenes portadores del mutante KRas G12C.

La presente invención también proporciona un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con pemetrexed, para el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína KRas G12C mutante. La presente invención también proporciona una combinación que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las Fórmulas I a VI, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y pemetrexed, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del cáncer, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína KRas G12C mutante. En una realización, el compuesto es un compuesto de las Fórmulas I a VI o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo. En otra realización, el cáncer es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas, en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, también se administra al paciente un agente de platino. En una realización, el agente de platino es cisplatina. En una realización, el agente de platino es carboplatina. En una realización, el agente de platino es oxaliplatina. En otra realización, el cáncer es un carcinoma colorrectal en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, el cáncer es un cáncer de páncreas mutante en el que el cáncer tiene una o más células que expresan una proteína mutante KRas G12C. En otra realización, la presente invención comprende el tratamiento de cánceres de otros orígenes portadores del mutante KRas G12C.

El término “sal aceptable para uso farmacéutico”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una sal de un compuesto que se considera aceptable para el uso clínico y/o veterinario. Se pueden encontrar ejemplos de sales aceptables para uso farmacéutico y la metodología común para prepararlas en “Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use", 2da Edición Revisada (Wiley-VCH, 2011, y S.M. Berge, et al., “Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, 1977, 66(1), 1 a 19.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar mediante el uso de aditivos aceptables para uso farmacéutico. El término “aditivo(s) aceptable(s) para uso farmacéutico”, como se utiliza en la presente memoria para las composiciones farmacéuticas, se refiere a uno o más portadores, diluyentes y excipientes que son compatibles con los otros aditivos de la composición o formulación y no son perjudiciales para el paciente. Se pueden encontrar ejemplos de composiciones farmacéuticas y procesos para su preparación en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, Loyd, V., et al. Eds., 22da Ed., Mack Publishing Co., 2012. Los ejemplos no limitantes de portadores, diluyentes y excipientes aceptables para uso farmacéutico incluyen los siguientes: solución salina, agua, almidón, azúcares, manitol y derivados de sílice; agentes aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona; caolín y bentonita; y polietilglicoles.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad que es una dosis, que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o enfermedad, tal como una lesión cancerosa o la progresión del crecimiento celular anormal y/o la división celular. El médico que diagnostica, como experto en la técnica, puede determinar fácilmente una cantidad eficaz mediante el uso de técnicas convencionales y la observación de los resultados obtenidos en circunstancias análogas. Las dosis por día de tratamiento normalmente se encuentran dentro de un intervalo de entre aproximadamente 1 mg por día o dos veces al día y 1000 mg por día o dos veces al día, más preferentemente 100 mg por día o dos veces al día y 900 mg por día o dos veces al día. Los factores considerados en la determinación de una cantidad o dosis eficaz de un compuesto incluyen: si se administrará el compuesto o su sal; la coadministración de otros agentes, si se usan; la especie de mamífero; su tamaño, edad y estado de salud general; el grado de afectación o la gravedad del trastorno; la respuesta del paciente individual; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; el régimen de dosis seleccionado; y el uso de medicación concomitante.

Un médico tratante, un veterinario u otro profesional podrán determinar una cantidad efectiva del compuesto para el tratamiento de un paciente que lo necesite. Las composiciones farmacéuticas preferentes se pueden formular como un comprimido o cápsula para administración oral, una solución para administración oral o una solución inyectable. El comprimido, la cápsula o la solución pueden incluir un compuesto de la presente invención en una cantidad eficaz para tratar un paciente en necesidad de tratamiento para el cáncer.

Como se utiliza en la presente memoria, los términos “tratar”, “en tratamiento” o “tratamiento”, incluyen la ralentización, la reducción o la inversión de la progresión o la gravedad de un síntoma, un trastorno o una afección existente, que puede incluir específicamente la ralentización del crecimiento de una lesión cancerosa o la progresión del crecimiento celular anormal y/o la división celular.

Como se utiliza en la presente memoria, un “paciente” se refiere a un mamífero que necesita tratamiento. Preferentemente, el paciente es un humano que necesita tratamiento para el cáncer, por ejemplo, los cánceres portadores del mutante KRas G12C.

Ciertas abreviaturas se definen de la siguiente manera: “ACN” se refiere a acetonitrilo; “AIBN” se refiere a azobisobutironitrilo; “Boc-Gly-OH” se refiere a A/-(terc-butoxicarbonil)glicina; “DCM” se refiere a diclorometano; “DIEA” se refiere a N,N-diisopropil etilamina; “DMAP” se refiere a la 4-dimetilaminopiridina; “DMEM” se refiere al medio de Eagle modificado por Dulbecco; “DMF” se refiere a la N,N-dimetilformamida; “DMSO” se refiere al dimetilsulfóxido; “ADN” se refiere al ácido desoxirribonucleico; “DPEPhosPdCh” se refiere al diclorobis(difenilfofenil)éter de paladio (II); “DTT” se refiere al ditiotreitol; “EDTA” se refiere al ácido etilendiaminotetraacético; “EGTA” se refiere al ácido etilenglicol-bis(p-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético; “ELISA” se refiere al ensayo inmunoenzimático; “ERK” se refiere a las quinasas reguladas por señales extracelulares; “EtOAc” se refiere al acetato de etilo; “EtOH” se refiere al etanol; “FBS” se refiere al suero fetal bovino; “GDP” se refiere al difosfato de guanosina; “GTP” se refiere al trifosfato de guanosina; “HPLC” se refiere a la cromatografía líquida de alto rendimiento; “HRP” se refiere a la peroxidasa de rábano picante; “IPA” se refiere al alcohol isopropílico; “IPAm” se refiere a la amina isopropílica; “LC-ES/MS” se refiere a la cromatografía líquidaespectrometría de masas por electrolisis; “LC-MS” se refiere a la cromatografía líquida-espectrometría de masas; “MAPK” se refiere a las proteínas quinasas activadas por mitógenos; “MeOH” se refiere al metanol; “NaOMe” se refiere al metóxido de sodio; “NBS” se refiere a la N-bromosuccinimida; “NCS” se refiere a la N-clorosuccinimida; “NMP” se refiere a la 1-metilpirrolidina-2-ona; “PCR” se refiere a la reacción en cadena de la polimerasa; “RPMI” se refiere al Roswell Park Memorial Institute; “SCX” se refiere al intercambio catiónico fuerte; “TEA” se refiere a la trietilamina; “TFA” se refiere al ácido trifluoracético; y “THF” se refiere al tetrahidrofurano.

Los isómeros y enantiómeros individuales pueden ser separados o resueltos por los expertos en la técnica en cualquier punto conveniente de la síntesis de los compuestos de la invención, por medio de procedimientos tales como las técnicas de cristalización selectiva o la cromatografía quiral (véase, por ejemplo, J. Jacques, et al., “Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981 y E.L. Eliel y S.H. Wilen,”Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994. La presente invención incluye ciertos compuestos, que son atropisómeros y que pueden existir en diferentes conformaciones o como diferentes rotómeros. Los atropisómeros son compuestos que existen en diferentes conformaciones derivadas de la rotación restringida en torno a un único enlace. Los atropisómeros se pueden aislar como especies químicas separadas si la barrera energética a la rotación alrededor del single es lo suficientemente alta y la tasa de interconversión es lo suficientemente lenta como para permitir que los rotómeros individuales se separen entre sí. Las presentes invenciones contemplan todos los isómeros, enantiómeros, diastereómeros y atropisómeros desvelados en la presente memoria o que se podrían hacer mediante el uso de los compuestos desvelados en la presente memoria.

Un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I a VI se convierte fácilmente en una sal aceptable para uso farmacéutico y se puede aislar como tal. La formación de la sal puede ocurrir tras la adición de un ácido aceptable para uso farmacéutico para formar la sal de adición de ácido. Las sales también se pueden formar simultáneamente tras la desprotección de un nitrógeno o un oxígeno, es decir, la eliminación del grupo protector. Se pueden encontrar ejemplos, reacciones y condiciones para la formación de sales enGould, P.L., “Salt selection for basic drugS’, International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al., “Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entitieé’, Organic Process Research and Development, 4: 427 a 435 (2000); y Berge, S.M., et al., “Pharmaceutical Salts’’, Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1 a 19 (1977).

Los compuestos de la presente invención, o las sales de los mismos, se pueden preparar por medio de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, algunos de los cuales se ilustran en las preparaciones y los ejemplos siguientes. Las etapas sintéticas específicas de cada una de las vías descritas se pueden combinar de diferentes maneras, o junto con etapas de diferentes esquemas, para preparar compuestos de la invención, o sales de los mismos. Los productos de cada etapa de los esquemas que se presentan a continuación se pueden recuperar por medio de procedimientos convencionales muy conocidos en la técnica, que incluyen la extracción, la evaporación, la precipitación, la cromatografía, la filtración, la trituración y la cristalización.

El Esquema 1, la etapa A, representa la bromación del compuesto (1) mediante el uso de NBS y AIBN en un disolvente adecuado tal como CCU para dar el compuesto (2). La etapa B muestra la sustitución nucleofílica en el compuesto (2) mediante el uso de cianuro de potasio a reflujo en un sistema de disolventes adecuado, tal como EtOH y agua, para dar el compuesto (3). La adición de isotiocianato de etoxicarbonilo al compuesto (3) mediante el uso de hidruro de sodio en un disolvente adecuado tal como DMF y la posterior ciclización al compuesto (4) se muestra en la etapa C. La desprotección básica del compuesto (4) con NaOH acuoso en DMSO a reflujo y la posterior reprotección mediante el uso de dicarbonato de d-terc-butilo con una base adecuada tal como DlEA y DMAP catalítico en un sistema de disolventes tales como THF y DMF para dar el compuesto (5) se representa en la etapa D. La etapa E muestra la reacción del bromo del compuesto (5) con bis(pinacolato)diborón mediante el uso de una base adecuada tal como acetato de potasio y un sistema catalizador-ligando tal como acetato de paladio y 1,1'-bis(diisopropilfosfino)ferroceno en un disolvente adecuado tal como 1,4-dioxano para dar el compuesto (6). Los expertos en la técnica reconocerán que se podrían utilizar diversas combinaciones de catalizador-ligando para lograr esta reacción.

Esquema 2

El Esquema 2 representa una vía alternativa para la síntesis del compuesto (6). La etapa A representa la reducción del benzaldehído (7) mediante el uso de un agente reductor apropiado, tal como el borohidruro de sodio, en un disolvente apropiado, tal como EtOH, para dar el compuesto (8). La etapa B muestra la cloración del compuesto (8) mediante el uso de cloruro de tionilo en un disolvente apropiado tal como DCM para dar el compuesto (9). La etapa C representa la sustitución nucleofílica en el compuesto (9) mediante el uso de cianuro de potasio en un disolvente apropiado tal como el DMSO para dar el compuesto (3). La adición de isotiocianato de etoxicarbonilo al compuesto (3) mediante el uso de hidruro de sodio en un disolvente adecuado tal como DMF y la posterior ciclización mediante el uso de L-prolina y CuI para dar el compuesto (4) se muestra en la etapa D. La desprotección básica del compuesto (4) con NaOH acuoso en DMSO a reflujo y la posterior reprotección mediante el uso de dicarbonato de di-terc-butilo con una base adecuada tal como DIEA y d Ma P catalítico en un disolvente tal como THF para dar el compuesto (5) se representa en la etapa E. La etapa F muestra la reacción del bromo del compuesto (5) con bis(pinacolato)diboro mediante el uso de una base adecuada tal como acetato de potasio y un sistema catalizadorligando tal como acetato de paladio y bis(2-difenilfosfenil)éter en un disolvente adecuado tal como 1,4-dioxano para dar el compuesto (6). Los expertos en la técnica reconocerán que se podrían utilizar diversas combinaciones de catalizador-ligando para lograr esta reacción.

Esquema 3

El Esquema 3, etapa A, representa la reducción del aldehido del compuesto (10) con borohidruro de sodio en MeOH y la posterior mesilación mediante el uso de anhídrido metano sulfónico con una base adecuada tal como DIEA en un disolvente tal como THF para dar el compuesto (11). Las condiciones utilizadas para la transformación del compuesto (11) en el compuesto (12) son esencialmente análogas a las que se encuentran en el esquema 1, etapa B. La adición de isotiocianato de etoxicarbonilo al compuesto (12) mediante el uso de ferc-butóxido de potasio en un disolvente adecuado tal como DMF y la posterior ciclización al compuesto (13) se muestra en la etapa C. Las condiciones utilizadas para la transformación del compuesto (13) en el compuesto (14) son esencialmente análogas a las que se encuentran en el esquema 1, etapa D. La etapa E muestra la reacción del bromo del compuesto (14) con bis(neopentilglicolato)diborón mediante el uso de una base adecuada tal como acetato de potasio y un sistema catalizador-ligando tal como DPEPhosPdCh en un disolvente adecuado tal como 1,4-dioxano para dar el compuesto (15). Los expertos en la técnica reconocerán que se podrían utilizar diversas combinaciones de catalizador-ligando para lograr esta reacción.

Esquema 4

₂₁ 22

El Esquema 4, la etapa A, representa la formación de una tiourea a partir de la reacción del compuesto (16) y la 5-fluoro-2-metoxianilina, mientras se mantiene una temperatura de reacción fría, seguida por una desprotección básica para obtener el compuesto (17). La etapa B muestra la ciclización del compuesto (17) en cloroformo tras la adición de bromo para proporcionar el compuesto (18). La etapa C representa la desmetilación del compuesto (18) que se puede lograr por medio de la adición de BBr3 mientras se mantiene una mezcla de reacción fría bajo una atmósfera inerte para dar el compuesto (19). La etapa D muestra la protección del compuesto (19) con dicarbonato de di-tercbutilo mediante el uso de una base adecuada tal como TEA y DMAP catalítico en un sistema de disolventes tal como 1,4-dioxano para dar el compuesto (20). El compuesto (20) se trata con una base tal como la piridina seguida por anhídrido trifluorometansulfónico en un disolvente tal como DCM para dar el compuesto (21) como se muestra en la etapa E. La etapa F representa la reacción del triflato del compuesto (21) con bis(pinacolato)diboro mediante el uso de una base adecuada tal como acetato de potasio y un catalizador tal como tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) en un disolvente adecuado tal como 1,4-dioxano para dar el compuesto (22). Los expertos en la técnica reconocerán que se podrían utilizar diversas combinaciones de catalizador-ligando para lograr esta reacción.

Esquema 5

El Esquema 5 representa una vía alternativa para la síntesis del compuesto (22). La etapa A representa la formación de tiourea a partir de la reacción del compuesto (23) y la 2-bromo-5-fluoroanilina en un disolvente tal como THF, seguida por una desprotección básica para obtener el compuesto (24). La etapa B muestra la bromación y ciclación del compuesto (24) mediante el uso de un agente bromante apropiado, tal como el tribromuro de piridinio, en un disolvente tal como el ácido sulfúrico, para dar el compuesto (25). La etapa C muestra la protección del compuesto (25) con dicarbonato de di-terc-butilo mediante el uso de una base adecuada tal como DMAP en un sistema de disolventes tal como DCM para dar el compuesto (26). La etapa D representa la transformación del compuesto (26) en el compuesto (22) por medio del tratamiento con hidruro de sodio en un disolvente tal como t Hf a bajas temperaturas, seguido por la adición de n-butilitio y borato de triisopropilo.

Esquema 6

El Esquema 6, etapa A, representa la cloración del compuesto (27) con NCS en un disolvente apropiado, tal como DMF, para dar el compuesto (28). La etapa B muestra una reacción de Sandmeyer para convertir el nitrógeno de la anilina del compuesto (28) en un yodo, cuyas condiciones serán conocidas por los expertos en la técnica, para dar el compuesto (29). La etapa C muestra la hidrólisis básica del éster del compuesto (29) al ácido del compuesto (30).

Esquema 7

El Esquema 7, las etapas A a C se llevan a cabo de manera esencialmente análoga a los procedimientos encontrados en las etapas A a C del Esquema 6 para dar los compuestos (32 a 34).

Esquema 8

El Esquema 8, la etapa A se lleva a cabo de manera esencialmente análoga al procedimiento de la etapa A del Esquema 6 para dar el compuesto (36). La etapa B muestra una reacción de Sandmeyer para convertir el nitrógeno de la anilina del compuesto (36) en un bromo, cuyas condiciones serán conocidas por los expertos en la técnica, para dar el compuesto (37). La etapa C se lleva a cabo de manera esencialmente análoga al procedimiento de la etapa C del Esquema 6 para dar el compuesto (38).

Esquema 9

39 40 41

El Esquema 9, la etapa A se lleva a cabo de manera esencialmente análoga al procedimiento de la etapa A del Esquema 6 para dar el compuesto (40). La etapa B se lleva a cabo de manera esencialmente análoga al procedimiento de la etapa B del Esquema 8 para dar el compuesto (41).

Esquema 10

48

El Esquema 10, etapa A, representa una aminación reductora entre el compuesto (42) y el benzaldehído en un disolvente adecuado, tal como DCM, con un agente reductor adecuado, tal como el triacetoxiborohidruro de sodio, para dar el compuesto (43). La etapa B muestra el acoplamiento de amida entre el compuesto (43) y un aminoácido protegido por boc mediante el uso de anhídrido propilfosfónico con una base adecuada tal como TEA en un disolvente tal como DCM para dar el compuesto (44). La etapa C representa la desprotección ácida y el reordenamiento del compuesto (44) mediante el uso de TFA en un disolvente tal como DCM para dar el compuesto (45). La etapa D muestra la reducción global de la amida del compuesto (45) mediante el uso de un agente reductor tal como el hidruro de litio y aluminio en un disolvente tal como THF para dar el compuesto (46). La etapa E representa la protección del compuesto (46) mediante el uso de dicarbonato de di-terc-butilo en bicarbonato de sodio acuoso para dar el compuesto (47). La etapa F muestra la desprotección del compuesto (47) por medio de hidrogenación para dar el compuesto (48).

El Esquema 11 muestra la ciclización del compuesto (49) mediante el uso de cloruro de tionilo e imidazol en un disolvente tal como DCM a -78 °C, seguido por un tratamiento con periodato de sodio y cloruro de rutenio (III) en ACN para dar el compuesto (50-R). El enantiómero S (50-S) se sintetiza mediante el uso de las mismas condiciones.

Esquema 12

54 55 56

En el Esquema 12, etapa A, se muestra un acoplamiento de amida entre el compuesto (51) y el éster etílico de bencilglicina mediante el uso de un agente de acoplamiento adecuado tal como la N,N'-diclohexilcarbodiimida en un disolvente tal como DCM para dar el compuesto (52). La etapa B representa la ciclización del compuesto (52) al compuesto (53) mediante el uso de un ácido tal como el TFA en un disolvente tal como DCM. La etapa C representa la reducción global de la amida y la desprotección del compuesto (53) con un agente reductor tal como el hidruro de litio y aluminio en un disolvente tal como THF para dar el compuesto (54). La etapa D muestra la hidrogenación del compuesto (54) al compuesto (55) mediante el uso de un catalizador adecuado tal como el Pd(OH)2 en un disolvente tal como el MeOH. La etapa E representa la protección con dicarbonato de di-terc-butilo del compuesto (55) y la posterior formación de la sal con ácido fosfórico para dar el compuesto (56).

Esquema 13

En el Esquema 13, el compuesto (57) representa los ácidos benzoicos de los Esquemas 6 a 9, así como los ácidos benzoicos comercialmente disponibles. El acoplamiento de amida entre el compuesto (57) y el compuesto (58) mediante el uso de HATU y una base apropiada tal como DIEA en un disolvente tal como THF para dar el compuesto (59) se muestra en la etapa A. Alternativamente, el acoplamiento de amida se lleva a cabo mediante el uso de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina y una base apropiada tal como 4-metilmorfolina en un disolvente tal como THF. Los expertos en la técnica reconocerán que hay una variedad de condiciones para llevar a cabo un acoplamiento de amidas. La etapa B representa la ciclización intramolecular del compuesto (59) al compuesto (60) mediante el uso de una base apropiada tal como el hidruro de sodio en un disolvente tal como DMF.

Esquema 14

El Esquema 14, la etapa A se lleva a cabo de manera esencialmente análoga al procedimiento de la etapa A del Esquema 13 para dar el compuesto (63). La etapa B consiste en la ciclización del compuesto (63) de manera esencialmente análoga al procedimiento de la etapa B del Esquema 13, seguida por la metilación con yoduro de metilo. Los compuestos (64) y (65) se recuperan después de esta etapa.

Esquema 15

D

El Esquema 15, etapa A, representa la ciclización del compuesto (66) por medio del tratamiento con trifluoroacetato de talio(III) en TFA, seguido por la adición de óxido de magnesio, cloruro de litio y MeOH con un catalizador tal como el cloruro de paladio(II) bajo una atmósfera de monóxido de carbono para dar el compuesto (67). La etapa B muestra la nitración del compuesto (67) mediante el uso de nitrato de potasio en ácido sulfúrico concentrado para dar el compuesto (68). La hidrogenación del grupo nitro del compuesto (68) mediante el uso de Pt/C en un sistema de disolventes tal como DCM y TFA para dar el compuesto (69) se muestra en la etapa C. La etapa D muestra una reacción de Sandmeyer para convertir el nitrógeno de la anilina del compuesto (69) en un cloro, cuyas condiciones serán conocidas por los expertos en la técnica, para dar el compuesto (70). La etapa E representa la hidrólisis del compuesto (70) mediante el uso de una base adecuada tal como el NaOH acuoso con calor para dar el compuesto (71). La alquilación del compuesto (71) con el compuesto (50-R) mediante el uso de una base adecuada tal como NaH en un sistema de disolventes tales como DMF y THF para dar el compuesto (72) se muestra en la etapa F. La etapa G representa un acoplamiento de amida intramolecular en el compuesto (72) mediante el uso de HATU y una base adecuada tal como DIEA en un disolvente tal como DMF para dar el compuesto (73).

Esquema 16

El Esquema 16, la etapa A se lleva a cabo de manera esencialmente análoga al procedimiento de la etapa A del Esquema 6 para dar el compuesto (75). La etapa B muestra una reacción de Sandmeyer para convertir el nitrógeno de la anilina del compuesto (75) en un yodo, cuyas condiciones serán conocidas por los expertos en la técnica, para dar el compuesto (76). Las etapas C a E se llevan a cabo de manera esencialmente análoga al procedimiento de las etapas E a G del Esquema 15 para dar los compuestos (77 a 79).

Esquema 17

El Esquema 17, etapa A, representa la cloración del compuesto (80) con un agente clorante apropiado, tal como el NCS, en un disolvente apropiado, tal como el ácido acético, con calentamiento para dar el compuesto (81). La etapa B representa una reacción de Mitsunobu entre los compuestos (81) y (82) mediante el uso de fosfina de trifenilo y azodicarboxilato de diisopropilo en un disolvente tal como THF para dar el compuesto (83). La etapa C muestra la desbencilación del compuesto (83) mediante el uso de diisopropil amina y cloroformato de 1 -cloroetilo en un disolvente apropiado tal como DCM para dar el compuesto (84). La etapa D representa la hidrólisis básica del éster del compuesto (84) mediante el uso de una base apropiada tal como el hidróxido de litio en un sistema de disolventes tales como THF y el agua para dar el compuesto (85). El acoplamiento amídico intramolecular del compuesto (85) mediante el uso de anhídrido propilfosfónico con una base adecuada tal como la TEA en un disolvente tal como DCM para dar el compuesto (86) se representa en la etapa E.

El Esquema 18 muestra el acoplamiento del compuesto (37) y el compuesto (87) y la posterior cidización para dar el compuesto (88) mediante el uso de una base apropiada tal como el carbonato de cesio en un disolvente tal como DMF con calentamiento.

Esquema 19

D Paso A “ gBr Paso C

_d ^u

_-Y ^.

_" ¹

_y, ⁿ- D. Y A ' , □ - P--a--s-o--- B- . D- y '¿ 'n D ---------- 11

_Br ^DD

89 90 91

92 93

El Esquema 19, etapa A, muestra la conversión del compuesto (89) en el compuesto (90) por medio del tratamiento con una base adecuada, tal como el KOH, en un sistema de disolventes tales como EtOH deuterado en D2O. La etapa B representa una reacción de Grignard del compuesto (90) con magnesio en un disolvente tal como THF para dar el compuesto (91). La carboxilación del compuesto (91) con 13CO2 en un disolvente tal como THF para dar el compuesto (92) se muestra en la etapa C. La etapa D muestra la reacción del compuesto (92) con cloruro de oxalilo en un disolvente tal como DCM con DMF catalítico para dar el compuesto (93).

Esquema 20

Paso A i|

95

En el Esquema 20, el compuesto (94) representa los núcleos tricíclicos descritos en los Esquemas 13 a 18. En la etapa A, la amida del compuesto (94) se reduce mediante el uso de un agente reductor adecuado, tal como el complejo de sulfuro de dimetilo de borano en THF, para dar el compuesto (95). El compuesto (94) y el compuesto (95) se pueden someter a un acoplamiento cruzado de Suzuki con boronatos, como se describe en los Esquemas 1 a 5, mediante el uso de un catalizador adecuado, tal como dicloruro de paladio 1,1'-bis(di-terc-butilfosfino)ferroceno, con una base adecuada, tal como el fosfato de potasio tribásico, en un sistema de disolventes tales como 1,4 dioxano y el agua, con calentamiento, para dar el compuesto (96). Este acoplamiento se podría llevar a cabo alternativamente mediante el uso de un catalizador adecuado tal como DPEPhosPdCh con una base tal como el carbonato de cesio en un disolvente tal como tolueno con calentamiento. Los expertos en la técnica reconocerán que hay muchas combinaciones de catalizador, base y disolvente que se pueden utilizar para llevar a cabo este tipo de transformación. La etapa C muestra la desprotección ácida del compuesto (96) con un ácido tal como el TFA en un disolvente tal como ^dC^mpara dar el compuesto (97). La etapa D muestra un acoplamiento entre el compuesto (97) y un socio para dar compuestos de la Fórmula I. La pareja puede ser un cloruro de ácido, un ácido carboxílico o un bromuro de cianógeno. En los casos con un cloruro de ácido, se utiliza una base adecuada tal como TEA o DIEA en un disolvente tal como DCM. El cloruro de ácido también se puede utilizar con carbonato de potasio como base en un sistema de disolventes bifásico tal como EtOAc, THF y agua. En los casos en los que el socio es un ácido carboxílico, las condiciones incluyen un reactivo de acoplamiento adecuado tal como el anhídrido propilfosfónico con una base adecuada tal como la DIEA en un disolvente tal como DMF. Si el socio es el bromuro de cianógeno, se utiliza una base adecuada tal como el NaOH acuoso en un disolvente tal como DCM.

Preparaciones y ejemplos

Las siguientes Preparaciones y Ejemplos ilustran aún más la invención y representan la síntesis típica de los compuestos de la invención, pero no se deben interpretar para limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Los reactivos y materiales de partida están fácilmente disponibles o pueden ser fácilmente sintetizados por los expertos en la técnica.

Los compuestos se pueden caracterizar por medio de cromatografía líquida-espectrometría de masas por electrodifusión (LC-ES/MS) llevada a cabo en un sistema de cromatografía líquida Agilent HP 1100. Las mediciones de espectrometría de masas por electrospray (adquiridas en modo positivo y/o negativo) se llevan a cabo en un espectrómetro de masas cuadrupolar con detector selectivo de masas interconectado al HPLC HP1100. Condiciones LC-MS (pH bajo): columna: PHENOMENEX® GEMINI® NX C-182,1 * 50 mm 3,0 pm; gradiente: de 5 a 100% B en 3 min, luego 100% B durante 0,75 min temperatura de la columna: 50 °C /-10 °C; caudal: 1,2 mL/min; Disolvente A: agua desionizada con 0,1% de HCOOH; Disolvente B: ACN con 0,1% de ácido fórmico; longitud de onda 214 nm. Condiciones alternativas de LC-MS (pH alto): columna: Columnas WATERS™ XTERRA® MS C-18 de 2,1 * 50 mm, 3,5 pm; gradiente: 5% de disolvente A durante 0,25 min, gradiente de 5% a 100% de disolvente B en 3 min y 100% de disolvente B durante 0,5 min o 10% a 100% de disolvente B en 3 min y al 100% de disolvente B durante 0,75 min; temperatura de la columna: 50 °C /-10 °C; caudal: 1,2 mL/min; Disolvente A: 10 mM NH4HCO3 pH 9; Disolvente B: Ac N; longitud de onda: 214 nm.

La cromatografía preparativa en fase inversa se lleva a cabo en un LC-ES/MS Agilent 1200 equipado con un espectrómetro de masas con detector selectivo de masas y un automuestreador/colector de fracciones Leap. Los procedimientos de alto pH se ejecutan en una columna PHENOMENEX® GEMINI®-NX de 75 * 30 mm, con un tamaño de partícula de 5 pm y un protector de 10 * 20 mm. Flujo de 85 mL/min. El eluyente es bicarbonato de amonio 10 mM (pH 10) en Ac N.

Preparación 1

1,3-Dibromo-2-(bromometil)benceno

Se añade NBS (35,0 g, 195 mmol) a una solución de 2,6-dibromotolueno (50,0 g, 194 mmol) en tetracloruro de carbono (500 L). La mezcla se calienta a 80 °C y se añade AIBN (3,20 g, 19,1 mmol). La mezcla se somete a reflujo durante 16 horas. Transcurrido este tiempo, la mezcla se enfría a temperatura ambiente y se filtra. El filtrado se diluye con EtOAc y se lava con agua, solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y solución acuosa saturada de cloruro de sodio. Los productos orgánicos se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo resultante se seca a alto vacío para dar el compuesto del título (67,5 g, 84%). RMN de 1H (CDCh) d 7,58 (2H, d), 7,04 (1H, t), 4,86 (2H, s).

Preparación 2

(2,6-Dibromofenil)metanol

Se añade borohidruro de sodio (7,83 g, 207 mmol) en tres porciones a intervalos de 10 minutos a una solución de 2,6-dibromobenzaldehído (148,7 g, 552,3 mmol) en EtOH (1,4 L) que se agita a 0 °C. Tras la adición final, la mezcla se agita durante 30 minutos antes de apagarla cuidadosamente con una solución acuosa saturada de NH4O (600 mL). Se añade DCM (1,75 L) y agua (200 mL) y se separan las capas. La capa acuosa se extrae una vez más con DCM. Los productos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio y se filtran a través de una almohadilla de sílice con enjuague con EtOAc (2 * 500 mL). El filtrado se concentra in vacuo, se recolecta en tolueno y se concentra de nuevo in vacuo para dar el compuesto del título como un sólido blanco (148,7 g, 99%). RMN de 1H (DMSO-d6) d 7,66 (2H, d), 7,17 (1H, t), 5,20 (1H, t), 4,74 (2H, d).

Preparación 3

1,3-Dibromo-2-(clorometil)benceno

A una solución a 0 °C de (2,6-dibromofenil)metanol (199,3 g, 749,4 mmol) en DCM (1,5 L) tratada con DMF (0,5 mL) se añade cloruro de tionilo (160 mL, 2196 mmol) gota a gota durante 1 hora. Transcurrido este tiempo, se deja que la mezcla se caliente hasta alcanzar la temperatura ambiente y posteriormente se calienta a 50 °C durante la noche. Se retira el calor y se enfría la reacción hasta 0 °C antes de apagarla cuidadosamente con agua (500 mL). La mezcla se diluye con DCM y se separan las capas. Los elementos orgánicos se lavan con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio, con agua y de nuevo con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio. Los productos orgánicos se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo para dar el producto del título como un sólido blanco (206,98 g, 95%). RMN de 1H (DMSO-d6) d 7,75 (2H, d), 7,26 (1H, t), 4,95 (2H, s).

Preparación 4

2-(2,6-Dibromofenil)acetonitrilo

Una mezcla de 1,3-dibromo-2-(bromometil)benceno (57,0 g, 137 mmol) y cianuro de potasio (28,0 g, 417 mmol) en EtOH (350 mL) y agua (90 mL) se somete a reflujo durante 5 horas. A continuación, la mezcla se enfría a temperatura ambiente y se concentra in vacuo. El residuo se disuelve en EtOAc y se lava con una solución saturada de bicarbonato de sodio. La fase acuosa se extrae con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavan con agua y solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo resultante se purifica por cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 10 a 100% de DCM/hexanos para dar el compuesto del título (34,5 g, 87%). RMN de 1H (CDCh) d 7,62 (2H, d), 7,12 (1H, t), 4,14 (2H, s).

Preparación Alternativa 4

Se añade cianuro de potasio (142,2 g, 2183,5 mmol) a una solución de 1,3-dibromo-2-(clorometil)benceno (206,98 g, 727,83 mmol) en DMSO (600 mL) y se agita a temperatura ambiente durante 2 días. Transcurrido este tiempo, se vierte la mezcla en agua helada y se agita durante 2 horas en el que se forma un precipitado blanco. El precipitado se filtra y se lava tres veces con agua antes de secarlo en una estufa de vacío. El sólido resultante se purifica por medio de cromatografía en columna de gel de sílice al eluir con DCM/hexanos al 10 a 70% para dar el compuesto del título como un sólido blanco (189,23 g, 94%). RMN de 1H (DMSO-d6) d 7,78 (2H, d), 7,28 (1H, t), 4,22 (2H, s). Preparación 5

N-(4-bromo-3-ciano-benzotiofen-2-il)carbamato de etilo

Se enfría a 0 °C una solución de 2-(2,6-dibromofenil)acetonitrilo (20,0 g, 71,3 mmol) en DMF (200 mL). Se añaden porciones de hidruro de sodio (60% en masa en aceite de parafina) (2,85 g, 71,3 mmol). Tras la adición, la mezcla se agita a 0 °C durante 10 minutos, y a continuación se añade gota a gota isotiocianato de etoxicarbonilo (8,60 mL, 71,4 mmol) a 0 a 5 °C. Después de la adición, la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y posteriormente se calienta a 100 °C durante 4 horas. Transcurrido este tiempo, el disolvente se evapora in vacuo. El residuo se agita en una mezcla de EtOAc y solución saturada de bicarbonato de sodio. El precipitado resultante se recolecta por filtración, se lava con agua y se seca en una estufa de vacío a 60 a 65 °C durante la noche para dar el compuesto del título (10,5 g, 45%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 322,8/324,8 [M+H]-.

Preparación Alternativa 5

Se suspende hidruro de sodio (60% en masa en aceite de parafina) (24,85 g, 621,3 mmol) en DMF (500 mL) y se enfría a 0 °C. A la suspensión fría se le añade gota a gota una solución de 2-(2,6-dibromofenil)acetonitrilo (169,14 g, 615,19 mmol) en DMF (600 mL) durante 1 hora de forma que la temperatura no supere los 7 °C. Después de 30 minutos, se añade isotiocianato de etoxicarbonilo (77,81 mL, 646,0 mmol) a lo largo de 30 minutos mientras sigue a 0 °C. La mezcla se agita a 0 °C durante 10 minutos antes de sacarla del baño de hielo y agitarla durante 20 minutos más. Transcurrido este tiempo, se añade L-prolina (14,16 g, 123,0 mmol) y yoduro cuproso (11,71 g, 61,49 mmol) y se calienta la mezcla a 65 °C durante 4,5 horas. La mezcla se trata con EDT^aacuoso 0,5M (4 L) diluido con EtOAc (1,6 L) y se agita enérgicamente durante la noche. Transcurrido este tiempo, se filtra la lechada turbia resultante y el sólido recolectado se lava con agua y EtOAc. El sólido se seca al vacío durante 1,5 horas y posteriormente se seca en una estufa de vacío durante 2 horas más para dar el compuesto del título como un sólido blanco (187,24 g, 77%). RMN de 1H (DMSO-d6) d 11,76 (1H, s), 8,01 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,27 (1H, t), 4,90 (2H, q), 1,31 (3H, t). Preparación 6

2-Amino-4-bromo-benzotiofen-3-carbonitrilo

Se añade NaOH 5N (765 mL, 3825 mmol) a una solución de N-(4-bromo-3-ciano-benzotiofen-2-il)carbamato de etilo (155 g, 476,6 mmol) en DMSO (480 mL). La mezcla se calienta a 125 °C durante la noche. Transcurrido este tiempo, se retira el calor y se vierte la reacción en agua helada (4,2 L) y se agita enérgicamente durante 10 minutos. Se forma un precipitado que se filtra, se lava con agua y se seca en una estufa de vacío durante 2 días para dar el producto del título como un sólido amarillo (73,6 g, 61%). RMN de 1H (DMSO-d6) d 7,96 (2H, s), 7,70 (1H, d), 7,46 (1H, d), 7,02 (1H, t).

Preparación 7

n-(4-bromo-3-ciano-benzotiofen-2-il)carbamato de terc-butilo

Una solución de 2-amino-4-bromo-benzotiofen-3-carbonitrilo (20 g, 79,2 mmol), DIEA (21 mL, 120 mmol) y DMAP (800 mg, 6,55 mmol) en THF (270 mL) y DMF (40 mL) se trata con di-terc-butildicarbonato (19,6 g, 87,1 mmol). La mezcla se agita bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluye con agua, solución de bicarbonato de sodio y EtOAc, y se agita durante 10 minutos. El precipitado resultante se recolecta por filtración, se lava con EtOAc frío y se seca en una estufa de vacío a 60 °C durante la noche para obtener el compuesto del título como un sólido beige (10,8 g, 38,6%). El filtrado se extrae dos veces más con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavan con agua y solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo resultante se purifica por medio de cromatografía flash en gel de sílice, al eluir con DCM/hexano al 20 a 100% para obtener el compuesto adicional (12,5 g, 45%) para dar un rendimiento total de 23,3 g (83%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 351/353 [M+H]-.

Preparación Alternativa 7

Se añaden DIEA (77 mL, 441 mmol) y DMAP (2 g, 16 mmol) a una solución de 2-amino-4-bromo-benzotiofen-3-carbonitrilo (74,5 g, 294 mmol) en THF (2 L), seguida por la adición de dicarbonato de di-terc-butilo (73,1 g, 325 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. Transcurrido este tiempo, la mezcla se diluye con agua, EtOAc y solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio, que se filtra para obtener un sólido blanquecino. Este sólido se lava con agua y EtOAc y se seca durante la noche para dar el producto del título (32 g, 31%). A continuación se separan las capas filtradas y se extrae el acuoso dos veces con EtOAc. Los productos orgánicos combinados se lavan con cloruro de sodio acuoso saturado, se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo resultante se recolecta en DCM (260 mL), se sonica, se diluye de nuevo con hexanos (275 mL), se sonica, se tritura y se filtra para dar el producto del título adicional (60,5 g, 58%) y un rendimiento combinado de 92,5 g (89%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 351/353 [M+H]-.

Preparación 8

N-[3-ciano-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzotiofen-2-il] carbamato de terc-butilo

Una solución de N-(4-bromo-3-ciano-benzotiofen-2-il)carbamato de terc-butilo (10,90 g, 30,7 mmol), bis(pinacolato)diborón (23,50 g, 92,54 mmol) y acetato de potasio (9,05 g, 92,2 mmol) en 1,4-dioxano (150 mL) se rocía con nitrógeno a 50 °C durante 30 minutos. Se carga el matraz con 1,1'-bis(diisopropilfosfino)ferroceno (2,25 g, 5,38 mmol) y acetato de paladio (0,700 g, 3,12 mmol) y se calienta a 100 °C bajo nitrógeno. Después de 2 horas, la mezcla se enfría a temperatura ambiente, se diluye con EtOAc, se filtra a través de tierra de diatomeas y se lava con EtOAc. El filtrado se trata con gel de sílice (150 g), se concentra hasta sequedad y se carga en un cartucho. El producto crudo se purifica por cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 0 a 50% de DCM/hexanos para dar el compuesto del título (9,15 g, 67%). ES/M^s(m/z): 399,2 (M-H).

Preparación Alternativa 8

El 1,4-Dioxano (500 mL) se calienta a reflujo mientras se rocía con nitrógeno durante 1 hora. A continuación, se reduce la temperatura a 80 °C mientras se continúa con el chorro de nitrógeno. A esta temperatura, se añadieron N-(4-bromo-3-ciano-benzotiofen-2-il)carbamato de terc-butilo (32 g, 90,59 mmol), bis(pinacolato)diboro (60 g, 236 mmol), acetato de potasio (26,67 g, 271,8 mmol), y finalmente se añade acetato de paladio (2,03 g, 9,04 mmol) y bis(2-difenilfosfenil)éter (8,54 g, 15,9 mmol). La mezcla se calienta a 100 °C durante tres horas. Transcurrido este tiempo, se retira el calor y la mezcla se diluye con EtOAc, se filtra a través de tierra de diatomeas y se concentra in vacuo. El residuo resultante se disuelve en DCM, se trata con 200 g de sílice y se concentra in vacuo. Esta sílice se coloca en una precolumna y el material se purifica por medio de cromatografía en gel de sílice al eluir con DCM al 10 a 95% y una solución premezclada de DCM/EtOAc al 95%. Las fracciones resultantes se separan en función de la pureza relativa. Cada conjunto se concentra por separado in vacuo, se sonica en heptanos, se tritura, se filtra y se enjuaga con heptanos. Los sólidos resultantes se secan durante la noche y posteriormente se combinan para dar el compuesto del título (23,86 g, 65%). RMN de 1H (DMSO-d6) d 11,32 (1H, s), 8,02 (1H, d), 7,59 (1H, d), 7,34 (1H, t), 1,53 (9H, s), 1,37 (12H, s).

Preparación 9

6-Bromo-2,3-difluorobencemetanol

Se disuelve 6-bromo-2,3-difluorobenzaldehído (20,0 g, 88,7 mmol) en MeOH (250 mL) y se añade borohidruro de sodio (6,70 g, 177 mmol) en porciones. Tras enfriar la reacción exotérmica a temperatura ambiente (~1 hora), se vierte la mezcla de reacción en una solución saturada de cloruro de amonio y se extrae tres veces con DCM. Los extractos orgánicos combinados se lavan con agua y solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo se seca a alto vacío durante la noche para dar el compuesto del título como un sólido blanco (19,5 g, 97%). RMN de 1H (CDCla) d 7,37 (1H, m), 7,07 (1H, m), 4,88 (2H, m), 2,13 (1H, m).

Preparación 10

(6-Bromo-2,3-difluorofenil)metanosulfonato de metilo

Se disuelve 6-bromo-2,3-difluorobencemetanol (19,5 g, 85,7 mmol) en THF (200 mL) y se añade DIEA (18,0 mL, 103 mmol). La mezcla se enfría a 0 °C y posteriormente se trata con anhídrido metanosulfónico (17,1 g, 94,2 mmol). Tras agitar a temperatura ambiente durante 18 horas, la mezcla se diluye con EtOAc:metil terc-butil éter (1:1) y se lava con agua fría. Las capas se separan y el acuoso se extrae dos veces con EtOAc:metil terc-butil éter (1:1). Los compuestos orgánicos combinados se lavan con agua y solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de magnesio y carbonato de potasio, se filtran y se concentran in vacuo para dar el compuesto del título como un aceite amarillo (26,0 g, 99+%). RMN de 1H (CDCh) d 7,44 (1H, m), 7,18 (1H, m), 5,43 (2H, d), 3,12 (3H, s).

Preparación 11

2-(6-Bromo-2,3-difluoro-fenil)acetonitrilo

Una mezcla de (6-bromo-2,3-difluorofenil)metanosulfonato de metilo (26,0 g, 82,0 mmol) y cianuro de potasio (6,06 g, 90,3 mmol) en EtOH (200 mL) y agua (40,0 mL) se somete a reflujo durante 30 minutos y posteriormente se enfría a temperatura ambiente. El disolvente se elimina in vacuo y el residuo se suspende en DCM. La mezcla se lava con agua, solución saturada de bicarbonato de sodio y solución acuosa saturada de cloruro de sodio. Los productos orgánicos se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran in vacuo. El producto crudo se purifica por medio de cromatografía en columna flash de gel de sílice, al eluir con DCM/hexano al 10 a 100% para dar el compuesto del título (17,9 g, 94%). RMN de 1H (CDCla) d 7,44 (1H, m), 7,15 (1H, m), 3,91 (2H, d).

Preparación 12

N-(4-bromo-3-ciano-7-fluoro-benzotiofen-2-il)carbamato de etilo

Una solución de 2-(6-bromo-2,3-difluoro-fenil)acetonitrilo (17,9 g, 77,2 mmol) en DMF (200 mL) se enfría en un baño de hielo y posteriormente se trata con ferc-butóxido de potasio (9,30 g, 81,2 mmol) en porciones. Tras la adición, la mezcla se agita durante 10 minutos (la reacción se vuelve de color rojo intenso) y se añade gota a gota isotiocianato de etoxicarbonilo (9,80 mL, 81,4 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y posteriormente se calienta a 100 °C durante 30 minutos. A continuación, la mezcla se enfría en un baño de hielo durante 10 minutos y se añade agua (500 mL) lentamente con agitación. El precipitado resultante se recolecta por filtración, se enjuaga con agua y hexanos y se seca al aire. El sólido se seca además en una estufa de vacío a 60 °C durante la noche para dar el compuesto del título (24,5 g, 84%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 340,8/342,8 [M+H]'.

Preparación 13

2-Amino-4-bromo-7-fluoro-benzotiofen-3-carbonitrilo

Una mezcla de N-(4-bromo-3-ciano-7-fluoro-benzotiofen-2-il)carbamato de etilo (24,5 g, 71,4 mmol), DMSO (100 mL) y NaOH 5N (80,0 mL, 400 mmol) se somete a reflujo durante 4 horas. La mezcla se enfría a temperatura ambiente y se trata con agua fría mientras se agita enérgicamente. El precipitado resultante se recolecta por filtración, se lava con agua y se seca en una estufa de vacío a 65 °C durante la noche para dar el compuesto del título (15,5 g, 80%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 268,8/270,8 [M+H]'.

Preparación 14

N-(4-bromo-3-ciano-7-fluoro-benzotiofen-2-il)carbamato de terc-butilo

El compuesto del título se prepara a partir de 2-amino-4-bromo-7-fluoro-benzotiofen-3-carbonitrilo de manera esencialmente análoga al procedimiento de preparación 7. ES/MS m/z (79Br/81Br) 314,8/316,8 [M-t-Bu+H]+.

Preparación 15

N-[3-ciano-4-(5,5-dimetil-1,3,2-dioxaborinan-2-il)-7-fluoro-benzotiofen-2-il]carbamato de terc-butilo

El N-(4-bromo-3-ciano-7-fluoro-benzotiofen-2-il)carbamato de tere-butilo (16,0 g, 41,4 mmol) y el bis(neopentilglicolato)diborón (37,0 g, 157 mmol) se disuelven en 1,4-dioxano (300 mL) bajo nitrógeno. Se añade acetato de potasio (12,2 g, 124 mmol), y la mezcla se rocía con nitrógeno durante 1 hora a 50 °C. Se añade DPEPhosPdCh (3,0 g, 4,2 mmol) y se calienta el matraz a 95 °C durante 1 hora. A continuación, la mezcla se enfría a temperatura ambiente, se concentra in vaeuo hasta ~100 mL, se diluye con heptano (200 mL), se agita durante 10 minutos y se filtra a través de tierra de diatomeas enjuagando con heptano y heptano:metil terc-butil éter (1:1). El filtrado se concentra, se disuelve en DCM mínimo y se filtra a través de una almohadilla de gel de sílice que se enjuaga con EtOAc:heptano (1:1). El filtrado se lava con una solución saturada de cloruro de amonio y una solución acuosa saturada de cloruro de sodio. Los productos orgánicos se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran in vaeuo. El residuo se purifica por cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 5 a 50% (20% de acetona en DCM)/ hexanos para dar el compuesto del título (13,0 g, 78%). RMN de 1H (DMSO-d6) d 11,6 (1H, s), 7,61 (1H, m), 7,20 (1H, m), 3,78 (4H, s), 1,54 (9H, s), 1,03 (6H, s).

Preparación 16

(5-Fluoro-2-metoxi-fenil)tiourea

Se combinan el isotiocianato de benzoilo (110 g, 671 mmol) y el THF (875 mL) y se enfrían a 5 °C bajo nitrógeno. Se añade gota a gota 5-Fluoro-2-metoxianilina (83,2 mL, 705 mmol) mientras se mantiene la temperatura interna de la reacción por debajo de 10 °C. La mezcla se calienta a temperatura ambiente y se agita durante 30 minutos. Se añaden NaOh 5N (161 mL, 805 mmol) y agua (200 mL) y la mezcla se calienta a reflujo durante 3,5 horas. Transcurrido este tiempo, se añade agua (500 mL) y acetato de isopropilo (800 mL) y se enfría la mezcla a temperatura ambiente. Se añade HCl acuoso concentrado para ajustar el pH a ~9 a 10. Las capas se separan. La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y se concentra in vaeuo. Se añaden EtOAc (360 mL) y hexanos (840 mL) al residuo y la mezcla se somete a reflujo durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo, la mezcla se enfría a -20 °C y se deja reposar toda la noche. El sólido resultante se filtra y el sólido recolectado se lava con hexanos fríos para dar el compuesto del título como un sólido incoloro (118 g, 88%). ES/MS (m/z): 201 (M+H).

Preparación 17

Bromuro de hidrógeno de 7-fluoro-4-metoxi-1,3-benzotiazol-2-amina

Una solución de (5-fluoro-2-metoxi-fenil)tiourea (118 g, 571 mmol) y CHCI3 (2 L) se enfría a 5 °C bajo nitrógeno. Se añade bromo (30,1 mL, 582 mmol) gota a gota mientras se mantiene la temperatura interna de la reacción por debajo de 7 °C. La mezcla se agita a 0 °C durante 30 minutos antes de calentar a reflujo durante 2,25 horas. Transcurrido este tiempo, la mezcla se enfría a -20 °C y se deja reposar toda la noche. Los sólidos resultantes se filtran y se lavan con hexanos fríos para dar el compuesto del título como un sólido amarillo (141 g, 89%). ES/MS (m/z): 199 (M+H).

Preparación 18

Bromuro de hidrógeno de 2-amino-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-ol

Se añade BBr3 (150 mL, 1589 mmol) por medio de una cánula a DCM (1,5 L) a 0 °C bajo nitrógeno. Se añade bromuro de hidrógeno de 7-fluoro-4-metoxi-1,3-benzotiazol-2-amina (141 g, 506 mmol) en porciones durante 15 minutos y se deja que la mezcla de reacción se caliente lentamente hasta la temperatura ambiente y con agitación durante la noche. La mezcla se enfría a 0 °C y se enfría cuidadosamente con MeOH mientras se mantiene la temperatura interna por debajo de 10 °C. Mientras se enfría, la salida de gas se burbujea en NaOH 5N frío. El sólido resultante se filtra y se lava con DCM frío para dar el compuesto del título como un sólido incoloro (117 g, 87%). ES/MS (m/z): 185 (M+H).

Preparación 19

(7-Fluoro-4-hidroxi-1,3-benzotiazol-2-il)carbamato de íerc-butilo

Se enfría a 10 °C el bromuro de hidrógeno de 2-amino-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-ol (117 g, 441 mmol) en 1,4-dioxano (1,5 L). Se añade TEA (129 mL, 926 mmol) mientras se mantiene la temperatura interna de la reacción por debajo de 15 °C. Se añaden DMAP (2,7 g, 22 mmol) y dicarbonato de di-terc-butilo (228 g, 1014 mmol) y la mezcla de reacción se calienta lentamente hasta la temperatura ambiente y se agita durante dos días. La mezcla se diluye con agua, EtOAc y cloruro de sodio acuoso saturado y se separan las capas. La capa orgánica se concentra in vacuo. Se añade MeOH (900 mL) y NaOMe (5M en MeOH, 132 mL) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. Se añade más NaOMe (5M en MeOH, 10 mL) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante tres horas antes de concentrarse in vacuo. Se añaden agua y EtOAc y se separan las capas. La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y se concentra in vacuo hasta que se formen sólidos. Se añaden hexanos y los sólidos resultantes se filtran y se lavan con hexanos para dar el compuesto del título como un sólido de color canela claro (97,2 g, 78%). ES/MS (m/z): 283 (M-H).

Preparación 20

2-[(íerc-ButoxicarbonN)amino]-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-M trifluorometanosulfonato

Se combinan el (7-fluoro-4-hidroxi-1,3-benzotiazol-2-il)carbamato de ferc-butilo (116 g, 407 mmol), DCM (1,4 L) y piridina (66 mL, 814 mmol) y se enfrían a 5 °C bajo nitrógeno. Se añade anhídrido trifluorometansulfónico (83 mL, 488 mmol) gota a gota mientras se mantiene la temperatura interna de la reacción por debajo de 10 °C. La mezcla se diluye con agua y se separan las capas. La capa orgánica se lava con ácido cítrico acuoso al 10%. La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y se concentra in vacuo. El residuo resultante se purifica por cromatografía de fase normal, al eluir con un gradiente de 25 a 28% de B en A (A: hexanos, B: 25% DCM en EtOAc), para dar el compuesto del título como un sólido amarillo (123 g, 73%). ES/MS (m/z): 415 (M-H). Preparación 21

N-[(2-Bromo-5-fluoro-fenil)carbamotioil]benzamida

Se agita una solución de 2-bromo-5-fluoroanilina (250 g, 1289,4 mmol) en THF (400 mL) con un agitador mecánico elevado. Se añade isotiocianato de benzoílo (130 g, 780,6 mmol) en THF (800 mL) durante 30 minutos mediante el uso de un embudo de adición. Se utiliza un baño de agua para mantener la temperatura interna por debajo de los 30 °C durante la adición. Después de 1,5 horas, la mezcla de reacción se vierte por igual en tres matraces de 4 litros que contienen agua (3 L). Los sólidos resultantes se filtraron al vacío a través de un embudo de vidrio sinterizado. Los sólidos se lavaron con agua desionizada (8 L) y se secaron al aire bajo vacío para dar el compuesto del título como un sólido de color tostado (456 g, 99+%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 353/355 [M+H]-.

Preparación 22

(2-Bromo-5-fluoro-fenil)tiourea

A una suspensión de N-[(2-bromo-5-fluoro-fenil)carbamotioil]benzamida (1600 g, 4,53 mol), THF (6 L) y MeOH (1,6 L) se añade NaOH 5N acuoso (1 L). Tras 18 horas de agitación a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra a través de una almohadilla de tierra de diatomeas para eliminar las partículas negras. La almohadilla se enjuagó con THF/MeOH y posteriormente con MeOH al 100%. El disolvente se elimina in vacuo para obtener un sólido de color canela. Se añade agua helada (4 L) al sólido y con el uso de un agitador de techo, se añade HCl 5N (~ 300 mL) en porciones de 100 mL para ajustar el pH a 7. Se añade más agua helada y se agita la mezcla durante aproximadamente una hora. Se añade agua (4 L) y la suspensión se filtra a través de un gran embudo de vidrio sinterizado al vacío. Los sólidos se enjuagan con agua desionizada y, una vez eliminada la mayor parte del agua, se enjuagan con hexanos (8 L) y se secan al aire. Los sólidos se colocan en una estufa de vacío a 50 °C durante 24 horas para dar el compuesto del título como un sólido blanquecino (1035 g, 92%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 249/251 [M+H]-.

Preparación 23

4-Bromo-7-fluoro-1,3-benzotiazol-2-amina

El ácido sulfúrico (350 mL), enfriado con un baño de hielo/cloruro de sodio, se agita con un agitador mecánico aéreo. Se añade (2-Bromo-5-fluoro-fenil)tiourea (130,5 g, 523,9 mmol) en porciones durante un período de 5 minutos. Tras diez minutos, la temperatura interna alcanzó ~1 °C. Bajo nitrógeno, se añade tribromuro de piridinio (185 g, 549,53 mmol) en 8 porciones durante un período de ~15 minutos mientras se mantiene la temperatura interna por debajo de 5 °C. El vapor generado se burbujea a través de una trampa de NaOH enfriada en hielo. Tras agitar a ~0 °C durante 75 minutos, la reacción se calienta a temperatura ambiente. A continuación, se calienta la reacción hasta una temperatura interna inicial de 50 °C y, después, se calienta gradualmente hasta 59 °C. Después de 1,5 horas, la reacción se enfría a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se vierte en un matraz grande con hielo. El pH se ajusta cuidadosamente a ~7 con NaOH 18,9N (620 mL). Los sólidos se filtran a través de un embudo de vidrio sinterizado y se enjuagan con agua desionizada hasta que el pH del filtrado coincida con el del agua desionizada. El sólido se seca al aire y posteriormente se coloca en un horno de vacío a ~50 °C durante 24 horas para dar el compuesto del título como un sólido de color canela (129,3 g, 99+%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 247/249 [M+H]+.

Preparación 24

N-(4-bromo-7-fluoro-1,3-benzotiazol-2-il)carbamato de terc-butilo

A una suspensión agitada de 4-bromo-7-fluoro-1,3-benzotiazol-2-amina (370,6 g, 1500 mmol) y DMAP (36,6 g, 300 mmol) en DCM (1500 mL) se añade por partes una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (388 g, 1724 mmol) disuelta en DCM (150 ml) a través de un embudo de adición a una velocidad tal que se controle la evolución del gas. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y posteriormente se añade una porción adicional de dicarbonato de di-terc-butilo (5,0 g, 23 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos y posteriormente se añade ácido cítrico acuoso al 10% (800 mL) y se separan las capas. La capa acuosa se extrae dos veces con DCM y los extractos orgánicos combinados se lavan una vez con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. La capa orgánica se concentra in vacuo y al residuo se le añade DCM (200 mL) y hexanos (1800 mL). La suspensión espesa adquirida se filtra, se seca al aire y se reserva el sólido recolectado. El filtrado se concentra in vacuo y al residuo se le añade MeOH (500 mL) y metóxido de sodio (20 mL, 5N en MeOH, 100 mmol). La mezcla se concentra in vacuo a 45 °C. Al residuo se le añade MeOH (500 mL) y NaOH 5N (100 mL, 500 mmol). La mezcla se concentra in vacuo a 45 °C. Al residuo se le añade agua y DCM y se separan las capas. La capa acuosa se extrae una vez con DCM. Los productos orgánicos se secan sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo. Al residuo se le añaden 100 mL de DCM y 900 mL de hexanos, el sólido resultante se lixivia, se filtra, se seca al aire y se combina con el sólido adquirido inicialmente para dar el compuesto del título como un sólido blanquecino (489,55 g, 94%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 290,8/292,8 [M-t-Bu+H]+.

Preparación 25

Ácido [2-(ferc-butoxicarbonilamino)-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-N]borónico

2-[(terc-Butox/carbon//)amino]-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-il trifluorometanosulfonato (20,0 g, 48,1 mmol), acetato de potasio (14,2 g, 144 mmol), bis(pinacolato)diboro (97,7 g, 385 mmol), tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (5,55 g, 4,8 mmol) y 1,4-dioxano (240 mL) se combinan y se rocían con nitrógeno durante diez minutos. La mezcla se calienta a 80 °C durante la noche antes de enfriar a temperatura ambiente y diluir con agua y EtOAc. Las capas se separan. La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y se concentra in vacuo. Se añade acetona (500 mL), agua (500 mL) y acetato de amonio (112 g, 1443 mmol). A continuación se añade NaIO4 (309 g, 1443 mmol), mientras se mantiene la temperatura interna de la reacción entre 18 y 23 °C. La mezcla se agita enérgicamente a temperatura ambiente durante toda la noche. Pasado este tiempo, se añade EtOAc. La mezcla se agita durante 30 minutos, se filtra con tierra de diatomeas y se separan las capas. La capa orgánica se concentra in vacuo. La capa acuosa se diluye con solución acuosa saturada de cloruro de sodio y se extrae dos veces con EtOAc. Estos extractos orgánicos se combinan con la capa orgánica previamente concentrada. Los extractos combinados se lavan con agua, solución acuosa saturada de cloruro de sodio, agua y solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y se concentra in vacuo. El residuo se somete a una suspensión espesa en hexanos con una pequeña cantidad de DCM. Los sólidos resultantes se filtran y se lavan con hexanos para dar el compuesto del título como un sólido de color canela (13,4 g, 89%). ES/MS (m/z): 313 (M+H).

Preparación Alternativa 25

A una suspensión de hidruro de sodio (60% en aceite de parafina) (34,6 g, 865 mmol) en THF (2000 mL) a una temperatura interna de -17 °C se añade una solución de N-(4-bromo-7-fluoro-1,3-benzotiazol-2-il)carbamato de terc- butilo (250,18 g, 720,6 mmol) disuelta en THF (500 mL) durante 15 minutos mientras se mantiene la temperatura interna entre -10 °C y -15 °C en el curso de la adición. Tras la adición, la mezcla se agita a una temperatura de entre -10 °C y -15 °C durante 15 minutos, momento en el que cesa la evolución del gas. La mezcla de reacción se enfría hasta una temperatura interna de -65 °C y a continuación se añade n-butilitio (350 mL, 2,5M en hexanos, 875 mmol) gota a gota a través de un embudo de adición durante 30 minutos a una velocidad tal que mantenga la temperatura interna entre -60 °C y -65 °C. Después de la adición, la mezcla de reacción se agita a esta temperatura durante 20 minutos y a continuación se añade borato de triisopropilo (416 ml, 1800 mmol) gota a gota durante 15 minutos mientras se mantiene una temperatura interna inferior a -60 °C. Se deja que la mezcla de reacción se caliente lentamente hasta una temperatura interna de 0 °C durante 5 horas y 45 minutos, y después se añade cuidadosamente una solución acuosa saturada de cloruro amónico (400 mL) para controlar la evolución del gas. A la mezcla se le añade agua (400 mL) y EtOAc (400 mL) y se separan las capas. A la capa acuosa se le añade suficiente HCl acuoso 1N para llevar el pH a 3 a 4 y posteriormente se extrae la capa acuosa dos veces con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo. Al residuo se le añade n-heptano (500 mL) y la mezcla se concentra in vacuo a 55 °C. Al residuo se le añade una porción adicional de n-heptano (500 mL) y la mezcla se concentra in vacuo a 55 °C. Al residuo sólido se le añaden 200 mL de DCM y 1800 mL de hexanos, y la mezcla se somete a una suspensión espesa. El sólido se filtra, se lava con hexanos y se seca al aire para obtener el compuesto del título como un sólido blanquecino (217,2 g, 94%). ES/MS (m/z): 313 (M+H).

Preparación 26

4-Amino-3,5-dicloro-2-fluoro-benzoato de metilo

Se disuelven 4-amino-2-fluoro-benzoato de metilo (27,0 g, 160 mmol) y NCS (46,3 g, 336 mmol) en DMF (300 mL) y se calienta a 80 °C. Tras 40 minutos, la mezcla de reacción se vierte sobre agua helada y se extrae dos veces con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavan una vez con NaOH 5N, dos veces con LiCl acuoso 0,2N, se secan sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo para dar el compuesto del título (37,0 g, 97%). ES/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 238/240 [M+H]+.

Tabla 1: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 26

Preparación 29

Ácido 3,5-dicloro-2-fluoro-4-yodo-benzoico

Se combinan el yoduro de cobre (10,0 g, 51,5 mmol), el ACN (128 mL) y el nitrito de terc-butilo (13,6 mL, 103 mmol) y la mezcla se calienta a 50 °C durante 30 minutos y posteriormente se añade a la mezcla el 4-amino-3,5-dicloro-2fluoro-benzoato de metilo (6,11 g, 25,7 mmol). Se observa la evolución del gas. Tras 1 hora y 40 minutos a 50 °C, se elimina el disolvente in vacuo. Se añade agua, EtOAc y HCl acuoso 1N. La capa acuosa se extrae dos veces con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavan con bisulfito de sodio acuoso (500 mL), se secan sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo. La mezcla cruda se purifica por cromatografía flash en gel de sílice al eluir con 3 a 5% de EtOAc en hexanos. Las fracciones más limpias se combinan y se concentran in vacuo para dar el intermedio éster metílico (5,85 g, 65%).

Al 3,5-dicloro-2-fluoro-4-yodo-benzoato de metilo (5,85 g, 16,8 mmol) se añade MeOH (170 mL) y NaOH acuoso 1N (17 mL). En el transcurso de la agitación a temperatura ambiente durante 40 minutos, el material se disuelve completamente. El MeOH se elimina in vacuo. Al residuo se le añade EtOAc y HCl acuoso 1N. La capa acuosa se extrae dos veces con EtOAc y los extractos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo para dar el compuesto del título (5,56 g, 99%): RMN de 1H (CDCh) d 8,063 a 8,08 (d, 1H, J= 6,34 Hz).

Preparación 30

5-Cloro-2-fluoro-4-yodo-3-metil-benzoato de metilo

Se añade 4-amino-5-cloro-2-fluoro-3-metil-benzoato de metilo (14,8 g, 68,0 mmol) en ACN (100 mL) a una mezcla agitada de yoduro cuproso (15,7 g, 82,4 mmol), ACN (100 mL) y nitrito de terc-butilo (12,3 mL, 103 mmol). La mezcla se calienta bajo N2 a 40 °C durante 18 horas. La mezcla se concentra in vacuo hasta la mitad del volumen original, se diluye con EtOAc y se filtra dos veces a través de tierra de diatomeas. El filtrado recolectado se concentra in vacuo. La mezcla cruda se purifica por cromatografía flash en gel de sílice al eluir con EtOAc en hexanos. Las fracciones más limpias se combinan y se concentran in vacuo para dar el compuesto del título (22,46 g, 52,8%). RMN de 1H (CDCla) d 7,91 (d, J= 6,6 Hz, 1H), 3,95 (s, 3H), 2,53 (d, J= 3,1 Hz, 3H).

Preparación 31

4-Amino-3-cloro-2,5-difluoro-benzoato de metilo 25*30

A una solución de 4-amino-2,5-difluorobenzoato de metilo (25 g, 127 mmol) en DMF (100 mL) se añade NCS (19,9 g, 146 mmol) a temperatura ambiente y posteriormente se calienta la mezcla a 45 °C durante 18 horas. La mezcla de reacción se vierte en una mezcla de agua (1,5 L) y éter dietílico (1,2 L), y se separan las capas. La capa acuosa se extrae con éter dietílico (1 L). Los extractos orgánicos combinados se lavan con NaOH acuoso 1N frío, agua y solución acuosa saturada de cloruro de sodio. Los productos orgánicos se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo se purifica por medio de cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 10 a 30% (EtOAc al 75% en DCM) / hexanos para dar el compuesto del título (24,5 g, 87%). ES/MS (m/z): 222,2 (M+H).

Preparación 32

4-Bromo-3-cloro-2,5-difluoro-benzoato de metilo

Se añade 4-amino-3-cloro-2,5-difluoro-benzoato de metilo (24,5 g, 111 mmol) en ACN (100 mL) a una mezcla fría de bromuro cúprico (6,2 g, 28 mmol) y nitrito de terc-butilo (20 mL, 168 mmol) en ACN (100 mL). La mezcla de color verde se calienta hasta la temperatura ambiente durante 18 horas. A continuación, la mezcla de reacción se diluye con ACN, se filtra a través de una almohadilla de tierra de diatomeas y se aclara con DCM. El filtrado se concentra y se diluye con DCM, se filtra de nuevo a través de tierra de diatomeas y se aclara con DCM. El filtrado se lava con agua, una solución saturada de cloruro de amonio (2 veces), una solución acuosa saturada de cloruro de sodio (2 veces), se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra in vacuo. El residuo se purifica por medio de cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 0 a 50% (EtOAc al 10% en DCM) / hexano para dar el compuesto del título (23,5 g, 70%). RMN de 1H (CDCla) d 7,68 (1H, m), 3,99 (3H, s).

Tabla 2: Compuesto sintetizado de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 32

Preparación 34

Ácido 4-bromo-3-cloro-2,5-difluoro-benzoico

A una solución de 4-bromo-3-cloro-2,5-difluoro-benzoato de metilo (10,8 g, 37,8 mmol) en THF (100 mL) se añade MeOH (50 mL). La solución homogénea se enfría en un baño de hielo y se añade gota a gota NaOH 2N (60 mL, 120 mmol). Después de la adición, la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos. El disolvente orgánico se elimina in vacuo. El acuoso se enfría con hielo y se ajusta el pH a ~2,0 con HCl 5N (24 mL). El acuoso se extrae con EtOAc (3 veces). Los extractos orgánicos combinados se lavan con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo resultante se seca en una estufa de vacío a 60 °C durante la noche para dar el compuesto del título (10,3 g, 99%). RMN de 1H (DMSO-d6) d 7,81 (dd, J= 6,0, 8,6 Hz, 1H).20

Tabla 3: Compuesto sintetizado de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 34

Preparación 36

4-Bromo-3-cloro-5-fluoro-2-hidroxi-benzoato de metilo

A una solución de 4-bromo-5-fluoro-2-hidroxibenzoato de metilo (9 g, 34,3 mmol) en ácido acético (70 mL) se añade NCS (14 g, 104,8 mmol) y la mezcla se calienta a 55 °C. Después de 18 horas, se añade NCS adicional (5,5 g, 37,7 mmol) y la mezcla se agita durante 24 horas a 55 °C. A continuación, la reacción se enfría a temperatura ambiente y el exceso de ácido acético se elimina in vacuo. El residuo se purifica por cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 100% de DCM para dar el compuesto del título como un sólido (7,1 g, 73%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 281/283 [M+H]-.

Preparación 37

(3aR)-1,1-dioxo-3a,4,6,7-tetrahidro-3H-oxatiazol[3,4-a]pirazin-5-carboxilato de tere-butilo

A una suspensión de imidazol (24,9 g, 362 mmol) en DCM (181 mL) a 0 °C se añade cloruro de tionilo (8,0 mL, 110 mmol) gota a gota. La mezcla se agita a 0 °C durante 5 minutos y a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se enfría a -78 °C y se añade una solución de (3R)-3-(hidroximetil)piperazin-1-carboxilato de ferc-butilo (8,00 g, 36,2 mmol) en DCM (181 mL) gota a gota durante 45 minutos. La mezcla se calienta hasta temperatura ambiente y se agita durante 2,5 días. La reacción se apaga con cloruro de amonio acuoso saturado y se diluye con agua y DCM. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae de nuevo con DCM. Las capas orgánicas combinadas se lavan con cloruro de sodio acuoso saturado, se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo para dar un jarabe ámbar. A una solución del jarabe en acetonitrilo (282 mL) a 0 °C se añade una solución de periodato de sodio (10,2 g, 47,6 mmol) en agua (92 mL). Se añade cloruro de rutenio (III) (76 mg, 0,37 mmol). La suspensión resultante se agita a 0 °C durante 5 minutos y a temperatura ambiente durante 5 horas. La reacción se apaga con cloruro de amonio acuoso saturado y se diluye con agua y EtOAc. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae de nuevo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavan con cloruro de sodio acuoso saturado, se secan sobre sulfato de sodio y se filtran a través de papel de filtro y posteriormente a través de un tapón corto de gel de sílice. El filtrado se concentra in vacuo. Al residuo se le añade DCM, y la mezcla se concentra in vacuo y se coloca bajo vacío durante la noche para dar el compuesto del título como un sólido de color canela (9,39 g, 93%). RMN de 1H (CDCla) d 4,63 (1H, dd), 4,23 (1H, t), 4,23 (1H, br s), 4,07 (1H, br s), 3,64 (1H, m), 3,45 (1H, d), 3,13 (1H, m), 2,96 (2H, td), 1,47 (9H, s).

Tabla 4: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 37

Preparación 39

5-Bromo-4-metil-3H-isobenzofurano-1-ona

A una suspensión de (3-bromo-2-metilfenil)metanol (15,0 g, 73,1 mmol) en TFA (75 mL) se añade trifluoroacetato de talio(III) (41,8 g 73,1 mmol). Se utiliza TFA adicional (25 mL) para enjuagar el trifluoroacetato de talio(III) en el recipiente de reacción. La mezcla se agita bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante la noche y se concentra in vacuo y se seca al vacío para obtener un sólido de color marrón claro. El sólido se coloca bajo nitrógeno y se combina con óxido de magnesio (6,01 g, 149 mmol), cloruro de litio (6,32 g, 149 mmol) y MeOH (300 mL). Se añade cloruro de paladio(II) (1,32 g, 7,38 mmol). La mezcla se purga cinco veces con monóxido de carbono y se coloca bajo una atmósfera de monóxido de carbono (presión de globo). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 horas y se añade cloruro de paladio(II) (262 mg, 1,46 mmol) y óxido de magnesio (1,18 g, 29,2 mmol). La mezcla se purga tres veces con monóxido de carbono y se coloca bajo una atmósfera de monóxido de carbono (presión de globo). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 30 minutos y se añade cloruro de paladio(II) (262 mg, 1,46 mmol) y óxido de magnesio (1,18 g, 29,2 mmol). La mezcla se purga cuatro veces con monóxido de carbono y se coloca bajo una atmósfera de monóxido de carbono (presión de globo). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas y se añade cloruro de paladio(II) (327 mg, 1,83 mmol) y óxido de magnesio (1,77 g, 43,9 mmol). La mezcla se purga con monóxido de carbono y se coloca bajo una atmósfera de monóxido de carbono (presión de globo). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas, se filtra a través de tierra de diatomeas y se lava a través de la tierra de diatomeas con EtOAc. El filtrado se concentra in vacuo para dar un residuo. El producto crudo se purifica por medio de cromatografía de resolución rápida en gel de sílice al eluir con 0 a 30% de EtOAc / hexanos. Las fracciones que contienen el producto se concentran in vacuo para dar el compuesto del título como un sólido blanco (14,48 g, 70%). ES/MS m/z C 79Br/81Br) 227,0/229,0 [M+H]+.

Preparación 40

5-Bromo-4-metil-6-nitro-3H-isobenzofuran-1-ona

Una solución de 5-bromo-4-metil-3H-isobenzofurano-1-ona (14,4 g, 50,7 mmol, 80% de pureza) en ácido sulfúrico concentrado (160 mL) se enfría a -5 °C y se añade nitrato de potasio (9,62 g, 95,2 mmol). La mezcla se agita bajo nitrógeno durante 2,5 horas y se añade hielo (750 g) con agitación. La mezcla se extrae tres veces con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavan con cloruro de sodio acuoso saturado, se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo. El material crudo se purifica por medio de cromatografía flash en gel de sílice al eluir con 10 a 70% de EtOAc / hexanos. Las fracciones que contienen el producto se concentran in vacuo para dar el compuesto del título como un sólido de color blanquecino a amarillo/naranja (11,98 g, 87%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 247/249 [M+H]+.

Preparación 41

6-Amino-5-bromo-4-metil-3H-isobenzofuran-1-ona

En un matraz a presión se añaden 5-bromo-4-metil-6-nitro-3H-isobenzofurano-1-ona (11,98 g, 44,04 mmol), DCM (1000 mL), TFA (300 mL, 4 mol) y platino (5% sobre carbono, sulfurado, 3,00 g, 0,769 mmol). La mezcla se purga con hidrógeno y se presuriza a 45 PSI durante 1,25 horas. La mezcla de reacción se filtra a través de tierra de diatomeas y se lava con DCM. El filtrado se concentra in vacuo para dar un residuo. El residuo se seca al vacío y se purifica por cromatografía flash en gel de sílice al eluir con 10a 60% de EtOAc / DCM. Las fracciones que contienen el producto se concentran in vacuo para dar el compuesto del título como un sólido de color melocotón (9,86 g, 96%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 242,0/244,0 [M+H]+.

Preparación 42

5-Amino-4,6-dicloro-3H-isobenzofurano-1-ona

A una solución de 5-amino-3H-isobenzofurano-1-ona (10,44 g, 68,60 mmol) en DMF (100 mL) a temperatura ambiente se añade NCS (20,56 g, 150,9 mmol). La mezcla se agita a 50 °C durante 2,5 horas a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se vierte en agua (1 L) y el precipitado se filtra con una frita filtrante, se lava dos veces con agua y posteriormente con éter dietílico, y se seca haciendo pasar aire por la frita. El precipitado se recolecta en EtOAc, se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra in vacuo para dar el compuesto del título como un sólido amarillo-anaranjado (14,27 g, 93%). ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 218,2/220,0 [M+H]+.

Preparación 43

4,6-Dicloro-5-yodo-3H-isobenzofurano-1-ona

A una suspensión de 5-amino-4,6-dicloro-3H-isobenzofurano-1-ona (8,00 g, 35,6 mmol) en acetonitrilo (237 mL) a -15 °C se añade ácido sulfúrico concentrado (6,5 mL, 120 mmol) gota a gota. Se añade lentamente una solución de nitrito de sodio (4,96 g, 71,2 mmol) en agua (36 mL). La reacción se agita a 0 °C durante 30 minutos. Se añade gota a gota una solución de yoduro de potasio (23,6 g, 142 mmol) en agua (36 mL). La mezcla se agita a 0 °C durante 15 minutos y a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla se diluye con sulfito de sodio acuoso saturado y se concentra parcialmente al vacío para eliminar la mayor parte del acetonitrilo. La mezcla se diluye con EtOAc y se separan las capas. La capa orgánica se lava con cloruro de sodio acuoso saturado, se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra in vacuo. El material crudo se purifica por medio de cromatografía flash en gel de sílice al eluir con 0 a 25% de EtOAc / hexanos. Las fracciones que contienen productos impuros se concentran in vacuo y se purifican por medio de cromatografía flash en gel de sílice al eluir con DCM al 100%. Las fracciones que contienen el producto puro de ambas purificaciones cromatográficas se combinan, se concentran in vacuo y se ponen al vacío durante la noche para dar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (6,62 g, 51%). RMN de 1H (CDCh) d 7,89 (1H, s), 5,25 (2H, s).

Preparación 44

5-Bromo-6-cloro-4-metil-3H-isobenzofuran-1-ona

A una suspensión de cloruro cúprico (5,85 g, 43,5 mmol) en acetonitrilo (150 mL) en un baño de agua fría se añade nitrito de ferc-butilo (12,9 mL, 108 mmol) durante 5 minutos. La mezcla se agita durante 10 minutos y se retira el baño de agua fría. La mezcla se agita bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante 25 minutos Se añade gota a gota una solución de 6-amino-5-bromo-4-metil-3H-isobenzofurano-1-ona (8,73 g, 36,1 mmol) en acetonitrilo (550 mL) y se agita la mezcla bajo nitrógeno durante 1,5 horas. La mezcla se concentra parcialmente in vacuo para reducir el volumen a unos 275 mL. La mezcla se diluye con cloruro de sodio acuoso saturado (300 mL) y HCl 1^m(500 mL) y se extrae dos veces con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavan dos veces con bicarbonato de sodio acuoso saturado, se lavan dos veces con cloruro de sodio acuoso saturado, se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo. El material crudo se purifica por medio de cromatografía flash en gel de sílice al eluir con 5 a 30% de EtOAc / DCM. Las fracciones que contienen el producto se concentran in vacuo para dar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (9,03 g, 96%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 242,0/244,0 [M+H]+.

Preparación 45

4-Bromo-5-cloro-2-(hidroximetil)-3-metil-benzoato de sodio

En un vial con tapón de rosca y barra de agitación se añade 5-bromo-6-cloro-4-metil-3H-isobenzofurano-1-ona (2,459 g, 8,557 mmol) y NaOH 1M (9,4 mL, 9,4 mmol). El vial se tapa y se calienta a 100 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y se transfiere a un matraz de 1 L. Se añade tolueno (100 mL) y la mezcla se concentra in vacuo durante 3 días para dar el compuesto del título como un sólido de color canela (2,81 g, 99+%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 276,8/278,8 [M+H]-.

Tabla 5: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 45

Preparación 47

(3S)-4-[bencil-(2-etoxi-2-oxoetil)amino]-3-(terc-butoxicarbonilamino)-4-oxo-butanoato de bencilo

Se añade a un recipiente de reacción el éster de 4-bencil del ácido Boc-L-aspártico (114 g, 352,6 mmol). Se añade DCM (950 mL) y N,N'-didohexilcarbodiimida (74,5 g, 361 mmol), y se enfría la mezcla a 10 a 20 °C. Se añade gota a gota el éster etílico de bencilglicina (68,2 g, 353 mmol), mientras se mantiene la temperatura por debajo de 20 °C. La mezcla se agita a 10 a 20 °C durante 17 horas, después se filtra y se concentra in vacuo. Se añade MTBE (230 mL) y se agita la mezcla durante 0,5 horas. La mezcla se filtra y se concentra in vacuo para dar el compuesto del título como un aceite (174,4 g, 99%).

Preparación 48

Acetato de 2-[(2S)-4-bencil-3,6-dioxo-piperazin-2-il] de bencilo

Se añade (3 S)-4-[bencil-(2-etoxi-2-oxo-etil)amino]-3-(terc-butoxicarbonilamino)-4-oxo-butanoato (174,4 g, 349,8 mmol) a un recipiente de reacción junto con DCM (500 mL) y TFA (230 mL). La mezcla se agita a 15 a 20 °C durante 16 horas y posteriormente se concentra in vacuo hasta sequedad. El residuo se disuelve en isopropanol (500 mL) y se calienta a 80 °C durante 1 hora. La mezcla se concentra in vacuo y se diluye con agua (230 mL). La mezcla se neutraliza con NaOH al 15% en agua hasta alcanzar un pH de 8 a 9 (se utilizan 109 g de NaOH al 15% acuoso). La mezcla se filtra y se aclara con agua (2 * 100 mL). Los sólidos se secan al vacío a 50 a 55 °C durante 2 días para dar el compuesto del título como un sólido (95,9 g, 78%). RMN de 1H (CDCh) 87,44 a 7,29 (m, 8H), 7,32 a 7,23 (m, 2H), 6,91 (br s, 1H), 5,18 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 5,14 (d, J= 12,2 Hz, 1H), 4,64 (d, J= 14,5 Hz, 1H), 4,54 (d, J= 14,5 Hz, 1H), 4,44 (br d, J= 7,9 Hz, 1H), 3,88 (d, J= 17,7 Hz, 1H), 3,82 (d, J= 17,7 Hz, 1H), 3,15 (dd, J= 17,5, 3,4 Hz, 1H), 2,93 (dd, J= 17,5, 8,3 Hz, 1H).

Preparación 49

2-[(2S)-4-Bencilpiperazin-2-il]etanol

Se añade hidruro de aluminio y litio (13 g, 342,5 mmol) a un recipiente de reacción junto con THF (200 mL). La mezcla se enfría a -5 a 0 °C. Se añade a un segundo recipiente 2-[(2S)-4-bencil-3,6-dioxo-piperazin-2-il]acetato (50 g, 141,9 mmol) junto con THF (400 mL). La solución de 2-[(2S)-4-bencil-3,6-dioxo-piperazin-2-il]acetato de bencilo se añade lentamente a la solución de hidruro de aluminio y litio, mientras se mantiene la temperatura entre -5 y 0 °C. La mezcla de reacción se calienta a 60 a 65 °C y se agita durante 2 horas. La mezcla se enfría hasta 20 a 30 °C y se agita durante 16 horas. Se añade agua (13 g) y posteriormente se añade NaOH al 4% en agua (52 g). La mezcla se agita durante 1 hora, se filtra y se concentra in vacuo. Se añade acetato de isopropilo (200 mL) y HCl 2M (150 g). Las capas se separan y la capa acuosa se lava de nuevo con acetato de isopropilo (100 mL). La capa acuosa se ajusta a pH 11 a 12 con NaOH y se añade DCM (150 mL). Las capas se separan y la capa orgánica se lava con agua (100 mL). Las capas se separan y la capa orgánica se concentra in vacuo para dar el compuesto del título como un sólido (20,1 g, 64%).35

RMN de 1H (CDCla) 87,44 a 7,20 (m, 5H), 3,81 (t, J= 5,2 Hz, 2H), 3,50 (s, 2H), 3,08 a 2,93 (m, 2H), 2,93 a 2,82 (m, 1H), 2,76 (d, J= 11,5 Hz, 2H), 2,02 (td, J= 11,1, 3,3 Hz, 1H), 1,85 (t, J= 10,4 Hz, 1H), 1,67 - 1,52 (m, 2H).

Preparación 50

2-[(2S)-Piperazin-2-il]etanol

Se añade 2-[(2S)-4-Bencilpiperazin-2-il]etanol (20 g, 91 mmol) a un recipiente de reacción enjuagado con H2. Se añade MeOH (200 mL) y se añade Pd(OH)2 (2 g). La mezcla se enjuaga con H2 y posteriormente se presuriza a 45 psi de H2. La mezcla se calienta hasta 50 °C y se agita durante 44 horas. La mezcla de reacción se filtra y se concentra in vacuo para dar el compuesto del título como un aceite (12,7 g, 99+%). RMN de 1H (CDCh) 83,84 a 3,65 (m, 2H), 3,44 (s, 1H), 2,99 a 2,83 (m, 4H), 2,78 (td, J = 11,6, 2,5 Hz, 1H), 2,68 (td, J = 11,4, 2,8 Hz, 1H), 2,54 a 2,42 (m, 1H), 1,65 a 1,43 (m, 2H).

Preparación 51

(3S-3-2-hdroxilierazin-1-carboxilato de terc-butilo ; ácido fosfórico

Se añade 2-[(2S)-Piperazin-2-il]etanol (9,2 g, 70,4 mmol) a un recipiente de reacción, junto con MeOH (83 mL) y agua (9 mL). La mezcla se agita durante 0,5 horas a 15 °C. Se añade dicarbonato de di-terc-butilo (15,4 g, 70,6 mmol) a un segundo recipiente, junto con MeOH (92 mL). La solución de dicarbonato de di-terc-butilo se añade a la solución de 2-[(2S)-piperazin-2-il]etanol durante 0,5 horas, mientras se mantiene la temperatura por debajo de 15 °C. La mezcla se agita durante 2 horas a 15 °C. Se combinan el ácido fosfórico (fuerza del 85%, 8,11 g, 70,4 mmol) y el EtOH en un recipiente separado, y se añade la solución de ácido fosfórico a la mezcla de reacción durante 30 minutos. La mezcla se agita durante 20 minutos a 15 °C y posteriormente se enfría a -5 °C durante 3 horas. La mezcla se agita a -5 °C durante 1 hora, se filtra y se lava con EtOH, después se seca a 50 °C durante 4 horas para dar el compuesto del título como un sólido (5,82 g, 25%). RMN de 1H (D2O) 84,11 a 4,03 (m, 1H), 4,00 (br s, 1H), 3,75 a 3,62 (m, 2H), 3,43 a 3,30 (m, 2H), 3,30 a 3,18 (m, 1H), 3,17 a 2,95 (m, 2H), 1,86 a 1,78 (m, 2H), 1,38 (s, 9H).

Preparación 52

(3S)-3-(bencilamino)tetrahidrofurano-2-ona

Una suspensión de clorhidrato de L-homoserina lactona (100 g, 726,93 mmol, tamices moleculares en polvo 4Á (178 g), y benzaldehído (57 mL, 561,3 mmol) en DCM (2500 mL) se agita durante la noche bajo nitrógeno a 35 °C. Después de este tiempo, se retira el calentamiento y se enfría la mezcla a 20 °C. Se añade triacetoxiborhidruro de sodio (208 g, 981,41 mmol) a la mezcla, que se deja calentar a temperatura ambiente después de 20 minutos y se agita durante 2 horas. Transcurrido este tiempo, la mezcla se enfría a -10 °C y se enfría cuidadosamente con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (400 mL). El pH se ajusta a 8 con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y bicarbonato de sodio sólido. La mezcla se filtra a través de una almohadilla de tierra de diatomeas y se enjuaga con DCM. Las capas se separan y el acuoso se extrae una vez más con DCM (1 L). Los productos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo para dar el compuesto del título como un aceite claro (87 g, 66,5%, 81% en masa). ES/Ms m/z: 192,2 (M+H). Para el trabajo analítico posterior, se purifica una muestra del compuesto del título (1 g) por medio de cromatografía flash en gel de sílice al eluir con 10 a 50% de EtOAc / DCM para dar 422 mg de compuesto del título purificado. Este material se analiza mediante el uso de Chiralpak® IC, 4,6 x 150 mm, 10% IPA (0,2% IPAm)/CO2, 5 mL/min, 225 nm mostrando >98% de e.e.

Preparación 53

N-[2-(2-ciclopropilpirimidin-3-il)etilamino]etil]carbamato de terc-butilo

Una mezcla de (3S)-3-(bencilamino)tetrahidrofurano-2-ona (86 g, 364,27 mmol, 81% en masa), boc-Gly-OH (97 g, 553,71 mmol) y TEA (103 mL, 739 mmol) en DCM (700 mL) se enfría a ~5 °C. El anhídrido propilfosfónico (50% en masa en EtOAc) (430 mL, 737 mmol) se añade gota a gota durante una hora a la mezcla mientras se mantiene la temperatura interna ~10 °C. Tras la adición, se deja que la mezcla se caliente hasta la temperatura ambiente. Tras siete horas, la mezcla se enfría a 10 °C y se añaden más boc-Gly-OH (3,1 g, 18 mmol), TEA (5 mL, 35,9 mmol) y anhídrido propilfosfónico (50% en masa en EtOAc) (22 mL, 37,7 mmol). La mezcla se calienta a temperatura ambiente y se agita durante la noche. Transcurrido este tiempo, la mezcla se enfría a 8 °C y se añaden más boc-Gly-OH (9,6 g, 55 mmol), TEA (10 mL, 71,7 mmol) y anhídrido propilfosfónico (50% en masa en EtOAc) (42 mL, 71,9 mmol). La mezcla se calienta hasta temperatura ambiente y se agita durante ~7 horas. Transcurrido este tiempo, se vierte la mezcla sobre hielo y se enfría cuidadosamente con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (1 L). Se ajusta el pH a 8 con bicarbonato de sodio sólido y se separan las capas. El acuoso se extrae dos veces más con DCM. Los productos orgánicos combinados se lavan con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio (500 mL). La capa orgánica se filtra a través de una almohadilla de tierra de diatomeas y sulfato de sodio. Los productos orgánicos se concentran in vacuo hasta un volumen de 1 L y se lavan dos veces con solución acuosa saturada de cloruro de sodio. Los productos orgánicos se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran in vacuo para dar el compuesto del título que se utilizará sin más purificación (194 g, 53,5%, 35% en masa). ES/MS m/z: 249,0 (M-t-Bu+H)

Tabla 6: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 53

Preparación 56

(6S)-1-Bencil-6-(2-hidroxietil)piperazin-2,5-diona

Se añade TFA (100 mL, 1310 mmol) a una mezcla de N-[bencil-[(3S)-2-oxotetrahidrofurano-3-il]amino]-2-oxoetil]carbamato de terc-butilo (194 g, 194,9 mmol, 35% en masa) en DCM (500 mL). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. Transcurrido este tiempo, se añade TFA adicional (50 mL, 653 mmol) y se agita la mezcla a temperatura ambiente. Tras dos horas, se añade TFA adicional (50 mL, 653 mmol) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. Transcurrido este tiempo, la mezcla se concentra in vacuo. El residuo resultante se diluye con agua (600 mL) y se lava dos veces con éter dietílico. El pH se ajusta a 7 con una solución acuosa de NaOH 1N y se ajusta además a pH 12 con una solución acuosa de NaOH 5N. Se añade MeOH (~10 mL) y se agita la mezcla a temperatura ambiente. Se añade a la mezcla una solución acuosa de NaOH 5N a intervalos de cinco minutos para reajustar el pH a 12. En resumen, la mezcla se agita a pH 12 durante 35 minutos. Pasado este tiempo, se ajusta el pH a 8 con una solución acuosa de HCl al 10% y se extrae con DCM (5*1L). A continuación se ajusta el pH acuoso a 5 con una solución acuosa de HCl al 10% y se extrae de nuevo con DCM (1 L). Los productos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo para dar el compuesto del título como un sólido de color marrón claro (17 g, 33,4%). Se llevan a cabo extracciones adicionales del acuoso con IPA/cloroformo al 25% y DCM alternativamente hasta que se extrae el producto del título del acuoso de acuerdo con LC/MS. A los productos orgánicos combinados se añade IPA (150 mL). Los productos orgánicos se lavan con solución acuosa saturada de cloruro de sodio dos veces, se secan sobre sulfato de sodio y sulfato magnésico, se filtran y se concentran in vacuo para dar el compuesto del título adicional (17,2 g, 35,5%) para un rendimiento global de 34,2 g (68,9%). ES/MS m/z: 249,0 (M+H)

Tabla 7: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 56

Preparación 59

2-[(2S)-1-Bencilpiperazin-2-il]etanol

A una solución a 45 °C de hidruro de aluminio de litio 2M en THF (131 mL, 262 mmol) se añade una solución de (6S)-1-bencil-6-(2-hidroxietil)piperazin-2,5-diona (34 g, 131,5 mmol) en THF (200 mL) en forma de gota. Tras la adición, la mezcla se calienta a 60 °C. Después de ~3,5 horas, se añade hidruro de aluminio y litio 2M en THF (33 mL, 66 mmol) y la mezcla se agita a 60 °C. Después de una hora, se añade más hidruro de aluminio y litio 2M en THF (131 mL, 262 mmol) y la mezcla se agita a 60 °C durante la noche. Después de este tiempo, se añade hidruro de aluminio y litio 2M en THF (6 mL, 12 mmol) y se agita la mezcla a 60 °C. Después de cuatro horas, se añade hidruro de aluminio y litio 2M en THF (6 mL, 12 mmol) y la mezcla se agita durante dos horas a 60 °C. Se retira el calor y se enfría la mezcla a 10 °C. Se añade agua (16 mL) gota a gota, seguido por la adición gota a gota de NaOH acuoso 3,75M (16 mL) y posteriormente THF (300 mL). Se añade agua (48 mL) y la mezcla resultante se agita durante la noche a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, la mezcla se filtra a través de una almohadilla de tierra de diatomeas y se aclara con EtOAc. El filtrado se concentró al vacío para dar el producto deseado (28,8 g, 67,6%). ES/MS m/z: 221,0 (M+H)

Tabla 8: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 59

Preparación 62

(3S)-4-bencil-3-(2-hidroxietil)piperazin-1-carboxilato de tere-butilo

Se añade bicarbonato de sodio (80 g, 952 mmol) en agua (500 mL) al 2-[(2S)-1-bencilpiperazin-2-il]etanol (28 g, 86,43 mmol) en 1,4-dioxano (500 mL) a temperatura ambiente. A continuación se añade dicarbonato de di-terc-butilo (26,6 g, 122 mmol) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 20 minutos. Pasado este tiempo, se añade hielo (400 mL), agua (200 mL) y EtOAc (1 L) y se separan las capas. El acuoso se extrae una vez más con EtOAc (1 L). Los productos orgánicos combinados se lavan con agua (250 mL) y solución acuosa saturada de cloruro de sodio (250 mL), se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo se purifica por medio de cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 10 a 70% de EtOAc / hexanos para dar el compuesto del título (20,79 g, 74%). ES/MS m/z: 321,2 (M+H) Este material se analiza con Chiralpak® IC, 4,6 x 150 mm, 15% IPA (0,2% IPAm)/CO2, 5 mL/min, 225 nm mostrando un 96% de e.e.

Tabla 9: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 62

Preparación 65

(3S)-3-(2-hidroxietil)piperazin-1-carboxilato de tere-butilo

Se añade un 20% de Pd(OH)2 sobre carbono (24,39 g, 176,4 mmol) a un recipiente purgado con nitrógeno. Se añade EtOH (620 mL) al recipiente seguido por terc-butil(3S)-4-bencil-3-(2-hidroxietil)piperazin-1-carboxilato (61,93 g, 193,3 mmol) y EtOH (620 mL). El recipiente se sella, se purga con nitrógeno, se purga con hidrógeno y se presuriza con hidrógeno (60 psi). El recipiente se coloca en un agitador Parr durante 15 horas a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se filtra y se concentra in vacuo para dar el compuesto del título (42,74 g, 98%). ES/MS m/z 231,0: (M+H).

Preparación 68

(3S)-4-(3,5-dicloro-2-fluoro-4-yodo-benzoil)-3-(2-hidroxietil)piperazin-1-carboxilato de tere-butilo

El ácido 3,5-dicloro-2-fluoro-4-yodo-benzoico (0,80 g, 2,4 mmol) se añade a DIEA (2 mL, 11,5 mmol) en THF (22 mL) seguido por HATU (0,84 g, 2. 2 mmol) y se agita durante 1 hora.se añade entonces el (3S)-3-(2-hidroxietil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (0,50 g, 2,2 mmol) y la mezcla de reacción se somete a reflujo durante la noche. Pasado este tiempo, se añade NaOH 5N y se agita la reacción durante 1 hora. Se añade EtOAc y agua. La capa acuosa se extrae dos veces con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo. La mezcla cruda se purifica por medio de cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con EtOAc: hexanos (30:70) para dar el compuesto del título (0,858 g, 72%). ES/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 491/493 [M-t-Bu+H]+

Tabla 11: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 68.

Preparación 85

(3S)-4-(4-bromo-3-cloro-2,5-difluoro-benzoil)-3-(2-hidroxietil)piperazin-1-carboxilato de tere-butilo 5*10

Una solución de ácido 4-bromo-3-cloro-2,5-difluoro-benzoico (10,2 g, 37,6 mmol) y 4-metilmorfolina (7,50 mL, 68,0 mmol) en THF (200 mL) se enfría a 0 °C en un baño de hielo y se trata con 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (9,10 g, 50,8 mmol). La mezcla se agita en baño de hielo durante 30 minutos, y posteriormente se añade gota a gota (3S)-3-(2-hidroxietil)piperazin-1-carboxilato de tere-butilo (0,93M en THF, 40,0 mL, 37,2 mmol) a través de un embudo de goteo. Tras 1 hora a 0 °C, se añade NaOH 5N (35,0 mL, 180 mmol) y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla se diluye con EtOAc, se trata con una solución saturada de bicarbonato de sodio y se agita durante 15 minutos. Se separa la fase orgánica, se lava con solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra in vacuo. El residuo se purifica por cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 0 a 90% (20% de acetona en DCM) / hexanos para dar el compuesto del título (16,0 g, 88%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 290,8/292,8 [M-t-Bu+H]+.

Tabla 12: Compuesto sintetizado de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 85

Preparación 87

(3S)-4-(2-amino-4-bromo-5-cloro-benzoil)-3-[2-(p-tolilsulfoniloxi)etil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo

A una solución a 0 °C de terc-butil (3S)-4-(2-amino-4-bromo-5-cloro-benzoil)-3-(2-hidroxietil)piperazin-1-carboxilato (1 g, 2,16 mmol) y TEA (1 mL, 7,14 mmol) en DCM (25 mL) se añade D^mA^p(45 mg, 0,36 mmol) y cloruro de ptoluenosulfonilo (469 mg, 2,39 mmol). La mezcla de reacción se agita a 0 °C durante 15 minutos antes de dejar que se caliente a temperatura ambiente. Se añade cloruro de p-toluenosulfonilo (122 mg, 0,62 mmol) después de 3 horas. Después de 1 hora, la reacción se diluye con DCM y se lava con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. los productos orgánicos se lavan con cloruro de sodio acuoso saturado, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran in vacuo. El residuo resultante se purifica por cromatografía de resolución rápida en gel de sílice para dar el compuesto del título (473 mg, 35%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 616,0/618,0 [M+H]+.

Preparación 88

Clorhidrato de ácido 4-bromo-2-[(2R)-4-terc-butoxicarbonilpiperazin-2-il]metoximetil]-5-cloro-3-metilbenzoico

Al 4-bromo-5-cloro-2-(hidroximetil)-3-metil-benzoato de sodio (2,05 g, 6,39 mmol) en un matraz de 250 mL se añade tolueno (50 mL) y la mezcla se concentra in vacuo. El residuo se disuelve en DMF (21 mL) y THF (11 mL) y se enfría a 0 °C. Se añade hidruro de sodio (60% en masa en aceite de parafina) (511 mg, 12,8 mmol). Después de la adición, la mezcla se agita a 0 °C durante 10 minutos. Al (3aR)-1,1-dioxo-3a,4,6,7-tetrahidro-3H-oxatiazol[3,4-a]pirazin-5-carboxilato de ferc-butilo (1,96 g, 7,04 mmol) en un segundo matraz se añade tolueno (20 mL) y la mezcla se concentra in vacuo. El residuo se disuelve en THF (11 mL) y se añade gota a gota al contenido del primer matraz a 0 °C. La mezcla se calienta a temperatura ambiente y se agita durante 1,5 horas. Se añade lentamente HCl 5M (7 mL) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos y posteriormente se apaga con bicarbonato de sodio acuoso saturado. El pH se reduce a pH 2 por medio de la adición lenta de HCl 5M, y la mezcla se diluye con EtOAc. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae tres veces con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo se disuelve en THF (40 mL) y se añade HCl 5M (6 mL). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla se diluye con cloruro de sodio acuoso saturado y EtOAc y se separan las capas. La capa orgánica se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra in vacuo durante 2 horas para dar el compuesto del título como un sólido de color canela (4,27 g, 73%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 477,2/479,2 [M+H]+.

Tabla 13: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 88

Preparación 91

(3S)-4-bencil-3-[2-(3-bromo-2-cloro-4-fluoro-6-metoxicarbonil-fenoxi)etil]piperazin-1-carboxilato de ferc-butilo

Una solución de 4-bromo-3-cloro-5-fluoro-2-hidroxi-benzoato de metilo (3,0 g, 11,0 mmol), fosfina de trifenilo (4,19 g, 16,0 mmol) y (3S)-4-bencil-3-(2-hidroxietil)piperazin-1-carboxilato de ferc-butilo (12 mL, 1,039M en THF) en THF (~50 mL) se enfría a 0 °C durante 10 minutos. Se añade gota a gota azodicarboxilato de diisopropilo (3,1 mL, 16 mmol) y se deja que la mezcla se caliente a temperatura ambiente. Una vez consumido el alcohol de partida, se añade hielo y se diluye la reacción con EtOAc. La mezcla se lava dos veces con solución acuosa saturada de cloruro de sodio y la capa orgánica se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra in vacuo hasta obtener un aceite de color ámbar. El residuo se purifica por medio de cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 0 a 10% de EtOAc / hexanos para dar el compuesto del título (6,2 g, 99+%). Se obtiene una muestra analítica ~ 95% de pureza por medio de cromatografía en columna de gel de sílice, al eluir con 25 a 50% (1:1 EtOAc:DCM) / hexanos para dar el compuesto del título como un aceite incoloro. ES/MS m/z (79Br/81Br) 585/587 [M+H]+..

Preparación 92

(3S)-3-[2-(3-bromo-2-cloro-4-fluoro-6-metoxicarbonil-fenoxi)etil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo

A una solución de (3S)-4-bencil-3-[2-(3-bromo-2-cloro-4-fluoro-6-metoxicarbonil-fenoxi)etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (7,0 g, 11,35 mmol) en DCM (75 mL) se añade N,N-diisopropilamina (5,94 mL, 34,1 mmol). La solución se enfría en un baño de hielo y se añade gota a gota cloroformato de 1 -cloroetilo (3,7 mL, 34 mmol). Tras la adición, se retira el baño de hielo y la reacción se agita a temperatura ambiente durante 18 horas. Se añade cloroformato de 1 -cloroetilo (2 mL, 17 mmol) y N,N-diisopropilamina (3 mL, 17 mmol) gota a gota a temperatura ambiente y después de 7 horas, se añade más cloroformato de 1 -cloroetilo (0,60 mL, 5,67 mmol) y N,N-diisopropilamina (1 mL, 5,67 mmol) para consumir el material de partida restante. La mezcla de reacción se concentra in vacuo. Al residuo se le añade tolueno y la mezcla se concentra (repetir 2 veces). El semisólido resultante se diluye con MeOH (100 mL) y se agita a temperatura ambiente hasta que se complete la formación del producto. El disolvente se elimina in vacuo para dar un residuo de color ámbar. El residuo se purifica por cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 0 a 10% de MeOH / DCM para dar el compuesto del título como un sólido (5,11 g, 91%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 495/497 [M+H]+ .

Preparación 93

Ácido 4-bromo-2-[2-[(2S)-4-terc-butoxicarbonilpiperazin-2-il]etoxi]-3-cloro-5-fluorobenzoico

Una solución de (3S)-3-[2-(3-bromo-2-cloro-4-fluoro-6-metoxicarbonil-fenoxi)etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (5 g, 10,08 mmol) en THF (100 mL) y MeOH (12 mL) se enfría con un baño de hielo. Se añade una solución acuosa de hidróxido de litio (6,5 mL, 6,25M) y agua desionizada (10 mL). Se retira el baño de hielo y se agita la mezcla a temperatura ambiente. Después de 3 horas, se añade hielo a la mezcla de reacción y se ajusta el pH entre 5 a 6 con ácido cítrico al 10% (12 mL). Se añade solución acuosa de cloruro de sodio (100 mL) y la mezcla se diluye con EtOAc (400 mL) y se separan las capas. La capa acuosa se extrae de nuevo con EtOAc (300 mL) y los productos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo para dar el compuesto del título como un sólido (4,83 g, 98%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 481/483 [M+H]+.

Preparación 94

(13aS)-8,10-dicloro-9-iodo-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de tere-butilo

Se enfría a 0 °C el (3S)-4-(3,5-didoro-2-fluoro-4-yodo-benzoN)-3-(2-hidroxietN)piperazin-1-carboxNato de terc-butilo (4,438 g, 8,110 mmol) en DMF (100 mL) y posteriormente se añade a la solución hidruro de sodio sólido (60% en masa en aceite de parafina) (0,81 g, 20 mmol). Después de 1 hora a 0 °C, la mezcla de reacción se apaga con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. Se añade agua y EtOAc. La capa acuosa se extrae dos veces con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavan dos veces con cloruro de litio acuoso 0,2 M, se secan sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo se purifica por medio de cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 30 a 50% de EtOAc / hexanos para dar el compuesto del título (3,394 g, 79%). ES/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 471/473 [M-t-Bu+H]+

Tabla 14: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 94

Preparación 113

(13aS)-9-bromo-8-cloro-11-metN-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzodiazocin-2-carboxilato de tere-butilo y (13aS)-9-bromo-8-cloro-6-oxo-3,4,11,12,13,13a-hexahidro-1H-pirazin[2,1-d] [1, 5]benzodiazocin-2-carboxilato de tere-butilo

El (3 S)-4-(2-amino-4-bromo-5-doro-benzoil)-3-[2-(p-tolilsulfoniloxi)etil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo (473 mg, 0,767 mmol) en DMF (15 mL) se enfría a 0 °C y posteriormente se añade a la solución hidruro de sodio sólido (60% en masa en aceite de parafina) (49 mg, 1,225 mmol). La mezcla de reacción se agita a 0 °C durante 2 horas antes de dejar que se caliente a temperatura ambiente y se agite durante otras 2 horas. Transcurrido este tiempo, se enfría la mezcla de reacción a -78 °C y se añade yoduro de metilo (50 pl, 0,803 mmol). Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se calienta a 0 °C y se agita durante 18 horas y se calienta a temperatura ambiente. La mezcla se enfría de nuevo a 0 °C y se añade más yoduro de metilo (50 pl, 0,803 mmol). Después de 1 hora, no se observa ninguna metilación adicional, la mezcla de reacción se calienta a temperatura ambiente y se añade trietilamina (100 pl, 0,717 mmol). Después de otra 1 hora, la mezcla de reacción se apaga con agua, se diluye con solución acuosa saturada de NH4Cl y EtOAc. Las capas se separan y el acuoso se extrae dos veces más con EtOAc. Los elementos orgánicos combinados se lavan con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran in vaeuo. El sólido resultante se tritura con ACN y se seca al vacío sin más purificación para dar una mezcla de los compuestos del título (3:2 NH a NMe, 345 mg, 99+%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 444,0/446,0 [M+H] y 458,0/460,0 [M+H] .

Preparación 114

(13aR)-9-bromo-8-cloro-10-metil-6-oxo-1,3,4,11,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][2,5]benzoxazocin-2-carboxilato de tere-butilo

Se añade una solución de clorhidrato de ácido 4-bromo-2-[(2R)-4-terc-butoxicarbonilpiperazin-2-il]metoximetil]-5-cloro-3-metil-benzoico (500 mg, 0,749 mmol) y DIEA (0,39 mL, 2,2 mmol) en DMF (3,7 mL) se añade gota a gota a una solución de HATU (581 mg, 1,50 mmol) en DMF (3,7 mL) a 0 °C. La mezcla se agita a 0 °C durante 1 hora y a temperatura ambiente durante 30 minutos. En un matraz separado, se añade una solución de clorhidrato de ácido 4 bromo-2-[[(2R)-4-terc-butoxicarbonilpiperazin-2-il]metoximetil]-5-cloro-3-metilbenzoico (2,62 g, 3,92 mmol, 77% de pureza) y DIEA (2,1 mL, 12 mmol) en DMF (20 mL) se añade gota a gota a una solución de HATU (3,04 g, 7,84 mmol) en DMF (20 mL) a 0 °C. La mezcla se agita a 0 °C durante 1 hora y a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las dos mezclas de reacción se combinan, se diluyen con EtOAc y se lavan con HCl 0,5M, agua, bicarbonato de sodio acuoso saturado y cloruro de sodio acuoso saturado. La capa orgánica se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra in vacuo. El material crudo se purifica por medio de cromatografía flash en gel de sílice al eluir con 0 a 65% de EtOAc / hexanos. Las fracciones puras se concentran in vacuo. Al residuo se le añade DCM y la mezcla se concentra in vacuo durante 3 horas para dar el compuesto del título como un sólido blanco (1,95 g, 86%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 495/497 [M+H]+ .

Tabla 15: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 114

Preparación 117

(13aS)-9-bromo-10-cloro-8-fluoro-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de tere-butilo

A una solución de ácido 4-bromo-2-[2-[(2S)-4-terc-butoxicarbonilpiperazin-2-il]etoxi]-3-cloro-5-fluoro-benzoico (4,8 g, 10 mmol) en DCM (50 mL), enfriada con un baño de hielo, se añade TEA (2,8 mL, 20 mmol). Se añade gota a gota anhídrido propilfosfónico (11 mL, 18,8 mmol, 50% en masa en EtOAc). Tras la adición, la mezcla se agita durante 10 minutos. Se añade DCM (250 mL) y solución saturada de cloruro de amonio (100 mL). Se elimina la capa acuosa y se extrae con DCM (100 mL) y las capas orgánicas combinadas se lavan con solución acuosa saturada de cloruro de sodio (100 mL), se secan sobre sulfato de sodio y se filtran. El filtrado se trata con carbón activado (3,5 g) y se agita durante 10 minutos. La mezcla se filtra a través de una almohadilla de tierra de diatomeas y se concentra in vacuo hasta obtener un aceite. Se añade cloroformo y se concentra in vacuo (repetir 2 veces) para dar el compuesto del título como un sólido (4,64 g, 99%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 407/409 [M-t-Bu+H]+.

Preparación 118

(3R,13aS)-9-bromo-10-cloro-8-fluoro-3-metil-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de tere-butilo

Una solución de 4-bromo-3-cloro-2,5-difluoro-benzoato de metilo (1,00 g, 3,50 mmol) y (2R,5S)-5-(2-hidroxietil)-2-metil-piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (1,07 g, 4,38 mmol) en DMF (17,5 mL) se enfría con un baño de hielo. Se añade carbonato de cesio (2,31 g, 7,01 mmol). Se deja que la reacción se caliente lentamente hasta la temperatura ambiente durante la noche. Tras 18 horas, la reacción se calienta a 80 °C durante 24 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, se añade una solución acuosa de cloruro de sodio medio saturada (50 mL) y se diluye la mezcla con EtOAc (100 mL) y se separan las capas. La capa acuosa se extrae dos veces más con EtOAc (50 mL) y los productos orgánicos combinados se lavan con agua (2 * 50 mL), solución acuosa saturada de cloruro de sodio (50 mL) y posteriormente se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran al vacío. El material crudo se purifica por medio de cromatografía flash en gel de sílice al eluir con 0 a 100% de MTBE / hexanos para dar el compuesto del título como un sólido (690 mg, 41%). ES/MS m/z (79Br/81Br) 476,0/478,0 [M+H]+.

Preparación 119

(13aS)-8,10-dicloro-9-iodo-3,4,6,12,13,13a-hexahidro-1H-pirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de tere-butilo

Se añade un complejo de dimetilsulfuro de borano 1M en THF (2 mL, 2 mmol) a una mezcla agitada de (13aS)-8,10-dicloro-9-iodo-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de terc-butilo (1,0 g, 1,9 mmol) en THF (20 mL) y se calienta a reflujo durante 18 horas. Transcurrido este tiempo, se añade a la mezcla un complejo de dimetil sulfuro de borano 1M en THF (2 mL, 2 mmol) y se agita a reflujo durante 5 horas más. La mezcla se enfría a temperatura ambiente, se apaga cuidadosamente con MeOH y se concentra in vacuo. El residuo se purifica por medio de cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 30 a 70% de EtOAc / hexanos para dar el compuesto del título (900 mg, 90%). ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 512,8/514,8 [M+H]-+.

Tabla 16: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 119

Preparación 132

(13aS)-9-[2-(terc-butox/carbon/7am/no)-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-M]-8,10-dicloro-6-oxo-1,3,4,12,13,13ahexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de terc-butilo

En un tubo con cierre de rosca y barra de agitación se añade ácido terc-butílico (13aS)-8,10-dicloro-9-iodo-6-oxo-1,3,4, 12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato (750 mg, 1,423 mmol), ácido [2-(terc-butox/carbon/lam/no)-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-il]borónico (650 mg, 2,083 mmol), fosfato de potasio tribásico (450 mg, 2,12 mmol) y dicloruro de 1,1'-bis(di-terc-butilfosfino)ferroceno paladio (100 mg, 0,15 mmol). Se añaden 1,4 dioxano (15 mL) y agua (5 mL), previamente mezclados y desgasificados, y se purga la mezcla con nitrógeno durante 20 minutos. El tubo se tapa y se calienta a 80 °C durante 1 hora. A continuación, el contenido de la mezcla de reacción se vierte sobre agua, solución acuosa saturada de cloruro de sodio y EtOAc. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae una vez con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secan sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo se purifica por medio de cromatografía de resolución rápida en gel de sílice, al eluir con 30 a 70% de EtOAc / hexanos para dar el compuesto del título (724 mg, 76%). ES/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 667/669 [M+H]+. relación 45:55 de atropisómeros (LC).

Tabla 17: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 132

Preparación 167

(13aS)-9-[2-(ferc-butoxicarbonNamino)-3-ciano-benzotiofen-4-M]-10-cloro-8-fluoro-6-oxo-1,3,4,12,13,13ahexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de ferc-butilo

En un matraz sellado se añaden tolueno (300 mL), (13aS)-9-bromo-10-cloro-8-fluoro-6-oxo-1,3,4,12,13,13ahexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de ferc-butilo (620 g, 11,0 mmol), y N-[3-ciano-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzotiofen-2-il]carbamato de ferc-butilo (6,20 g, 15,5 mmol). La mezcla se rocía con nitrógeno durante 30 minutos y posteriormente se añade DPEPhosPdCh (1,20 g, 1,68 mmol), seguido por carbonato de cesio (9,00 g, 27,6 mmol). El matraz se sella y agita a 105 °C durante 6 horas. La mezcla se enfría a temperatura ambiente y se filtra a través de tierra de diatomeas, se lava con EtOAc y el filtrado se concentra in vacuo. El residuo se purifica por medio de cromatografía en columna flash de gel de sílice, al eluir con 0 a 30% de acetona / hexanos. El diastereómero deseado se elude después del indeseado para dar el compuesto del título (mayor, 3,50 g, 49%). ES/MS (m/z) (15Cl/17Cl) 657,0/659,0 [M+H]+.

Tabla 18: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 167

Preparación 175

(13aS)-9-(2-Amino-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-il)-8,10-dicloro-2,3,4,12,13,13a-hexahidro-1H-pirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-6-ona

(13aS)-9-[2-(ferc-butoxicarbomlam¡no)-7-fluoro-1,3-benzot¡azol-4-¡l]-8,10-d¡doro-6-oxo-1,3,4,12,13,13ahexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de ferc-butilo (724 mg, 1,084 mmol) se disuelve en DCM (4 mL) y TFA (2 mL, 26,45 mmol) y se agita a temperatura ambiente. Tras 6 horas, la mezcla se concentra in vacuo. El crudo se carga en una columna SCX, se lava con MeOH y se eluye con NH37N en MeOH. El filtrado se concentra in vacuo para dar el producto deseado (500 mg, 98%). ES/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 467/469 [M+H]+.

Tabla 19: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 175

Preparación 187

4-[(13aS)-10-cloro-8-fluoro-6-oxo-2,3,4,12,13,13a-hexahidro-1H-pirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-9-il]-2-aminobenzotiofen-3-carbonitrilo

A una suspensión de (13aS)-9-[2-('terc-butoxicarbonilamino)-3-ciano-benzotiofen-4-il]-10-cloro-8-fluoro-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carboxilato de terc-butilo (2,64 g, 4,02 mmol) en DCM (10,0 mL) a 0 °C se añade TFA (10 mL) gota a gota. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se concentra in vacuo, se disuelve en EtOAc y se concentra de nuevo in vacuo. Este procedimiento se repite una vez más. El residuo resultante se purifica por medio de cromatografía en columna de gel de sílice, al eluir primero con 0 a 80% (10% de MeOH en DCM) / D^cM, y segundo con 0 a 100% [10% (7N NH3 en MeOH) en DCM] / DCM para dar el compuesto del título (1,58 g, 86%). ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 457,0/459,0 [M+H]+.

Tabla 20: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la de la Preparación 187

Preparación 219

4-[(13aS)-10-cloro-2-(2-cianoacetil)-8-fluoro-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-9-il]-2-amino-7-fluoro-benzotiofen-3-carbonitrilo

Se añaden ácido cianoacético (138 mg, 1,61 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (222 mg, 1,61 mmol), DIEA (0,5 mL, 3 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (306 mg, 1,60 mmol) se añaden a una suspensión de 4-[(13aS)-10-cloro-8-fluoro-6-oxo-2,3,4,12,13,13a-hexahidro-1H-pirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-9-il]-2-amino-7-fluoro-benzotiofen-3-carbonitrilo (500 mg, 1,05 mmol) en DCM (10 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 18 horas antes de diluir con DCM y lavar con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio y una solución acuosa saturada de cloruro de sodio. Los productos orgánicos se secan sobre sulfato de sodio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo se disuelve en DCM (5 mL) y se añaden unas gotas de MeOH y posteriormente hexano para precipitar el producto. El precipitado se filtra para dar el compuesto del título como un sólido blanco (410 mg, 72%). ES/MS m/z (35Cl/37Cl) 542,4/544,4 [M+H]+.

Preparación 220

1-Bromo-1,2,2-trideuterio-etileno

Se añade gota a gota 1,2-Dibromoetano-d4 (25,0 g, 130,28 mmol) a una solución de hidróxido de potasio (15,19 g, 243,63 mmol) en etanol-OD al 95% (95 mL) y D2O (5 mL) a 33 °C. La mezcla se agitó primero a 60 °C durante 1,5 horas y posteriormente a 63 °C durante 1,5 horas para dar el compuesto del título como un aceite incoloro, que se destiló continuamente de la reacción durante el curso del calentamiento y se recolectó en un matraz receptor enfriado en un baño de hielo seco-acetona (7,3 g, 50%).

Preparación 221

Ácido 2,3,3-Trideuterioprop-2-enoico-13C

Se colocan en un matraz virutas de magnesio (1,67 g, 69,71 mmol), un cristal de yodo y THF anhidro (20 mL). Mientras tanto, se prepara una solución de 1-bromo-1,2,2-trideuterio-etileno (7,3 g, 66,39 mmol) en THF anhidro (30 mL). La mezcla que contiene el magnesio se calienta a 50 °C y se añade una porción de la solución de bromuro de vinilo (2 mL). La mezcla se calienta a 50 °C hasta que se inicia la reacción de Grignard y la mezcla empieza a refluir (65 °C). El resto de la solución de bromuro de vinilo en THF se añade gota a gota entre 55 y 65 °C durante 1,5 horas. La mezcla resultante se calienta a 65 °C durante 1,5 horas para que la reacción sea completa. Esta solución de (1,2,2-trideuteriovinilo)bromuro de magnesio recién preparada en t Hf se enfría a temperatura ambiente y se utiliza inmediatamente.

Se burbujea gas dióxido de carbono-13C a través de THF anhidro (50 mL) a -65 °C durante 5 minutos. Se añade gota a gota la solución de bromuro de magnesio (1,2,2-trideuteriovinilo) recién preparada en THF (66,39 mmol), momento en el que la temperatura de reacción se eleva a -20 °C. La mezcla se calienta hasta -10 °C y se agita durante 10 minutos. Se hace burbujear gas de dióxido de carbono-13C a través de la mezcla durante 2 minutos más. La mezcla se calienta hasta temperatura ambiente y se agita durante 10 minutos. Se añade hidroquinona (10 mg), seguida por la adición gota a gota de ácido sulfúrico 6M (6,5 mL) para apagar la reacción mientras se mantiene la temperatura por debajo de 20 °C. La mezcla se diluye con éter dietílico (400 mL) y se añade sulfato de sodio (100 g). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos, se filtra y se concentra in vacuo entre 0 y 5 °C para dar el producto crudo (7,5 g) como un aceite amarillo. El producto crudo se purifica por medio de destilación al vacío de trayecto corto para dar el compuesto del título como un aceite incoloro (1,2 g, 24%).

Preparación 222

Cloruro de ácido 2,3,3-Trideuterioprop-2-enoico-13C

Se añade cloruro de oxalilo (0,24 mL, 2,85 mmol) a una solución de ácido 2,3,3-trideuterioprop-2-enoico-13C (0,181 g, 2,38 mmol) y DMF (1 gota) en DCM anhidro (10 mL) a 0 °C y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora. El compuesto del título se utiliza directamente en la siguiente etapa como solución.

Preparación 223

Sonda Kras

N-(2-{2-[2-({6-Cloro-8-fluoro-7-(3-hidroxinaftalen-1-il)-4-[4-(prop-2-enoil)piperazin-1-il]quinazolin-2-il}amino)etoxi]etoxi}etil)-5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]127enzoxazo-4-il]pentanamida

Etapa A: El 4-(7-bromo-2,6-didoro-8-fluoroquinazoNn-4-N)piperazin-1-carboxNato de ferc-butilo (0,51 g, 1,1 mmol) y el IPA (5 mL) se combinan en un recipiente para microondas. Se añaden DIPEA (0,55 mL, 3,3 mmol) y 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]127enzoxazo-4-il]-N-[2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etil]pentanamida (0,48 g, 1,32 mmol) y se calienta la mezcla a 120 °C en un reactor de microondas durante seis horas. Transcurrido este tiempo, se diluye la mezcla con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio y 25% de IPA en CHCh y se separan las capas. La capa orgánica se lava con solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se filtra y se concentra in vacuo. El residuo resultante se purifica por cromatografía de fase normal, al eluir con un gradiente de 50 a 100% de B en A (A: hexanos, B: 10% de MeOH en DCM), para dar el 4-{7-bromo-6-cloro-8-fluoro-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]128enzoxazo-4-il]pentanoil}amino)etoxi]etoxi}etil)amino]quinazolin-4-il}piperazin-1-carboxilato de ferc-butilo como un sólido amarillo (0,68 g, 78%). ES/MS m/z: 819 (M+H).

Etapa B: 4-{7-bromo-6-cloro-8-fluoro-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]128enzoxazo-4-il]pentanoil}amino)etoxi]etoxi}etil)amino]quinazolin-4-il}piperazin-1-carboxilato de ferc-butilo (0,30 g, 0,37 mmol), 1,4-dioxano (4 mL) y agua (0,75 mL). Se añaden carbonato de potasio (0,24 g, 1,11 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)naftalen-2-ol (0,20 g, 0,74 mmol) y tetrakis(trifenilfosfina) paladio(0) (0,085 g, 0,074 mmol) y se agita la mezcla a 85 °C bajo nitrógeno durante 12 horas. Transcurrido este tiempo, la mezcla se enfría a temperatura ambiente y se filtra para eliminar los sólidos. El filtrado se diluye con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio y EtOAc y se separan las capas. La capa orgánica se lava con solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se filtra y se concentra in vacuo. El residuo resultante se purifica por cromatografía de fase normal, al eluir con un gradiente de 90 a 100% de B en A (A: hexanos, B: 10% de MeOH en DCM), para dar 4-{6-cloro-8-fluoro-7-(3-hidroxinaftalen-1-il)-2-[(2-(2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]128enzoxazo-4-il]pentanoil}amino)etoxi]etoxi}etilo)amino]quinazolin-4-il}piperazin-1-carboxilato de fercbutilo como un sólido amarillo (0,31 g, 96%). ES/MS m/z: 881 (M+H).

Etapa C: Una solución de 4-{6-cloro-8-fluoro-7-(3-hidroxinaftalen-1-il)-2-[(2-(2-[2-(5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]128enzoxazo-4-il]pentanoil}amino)etoxi]etoxi}etil)amino]quinazolin-4-il}piperazin-1-carboxilato de fercbutilo (0,31 g, 0,35 mmol) en MeOH (4 mL) se enfría a 0 °C. Se añade HCl (3 M en MeOH, 6 mL, 17,5 mmol) y la mezcla se agita a 0 °C durante 30 minutos antes de dejar que se caliente a temperatura ambiente. Tras ~18 horas, la mezcla de reacción se concentra in vacuo. El residuo se diluye con DCM y se concentra de nuevo in vacuo. El residuo resultante se diluye con hexanos y se agita a temperatura ambiente durante dos horas. El sólido resultante se filtra y se seca al vacío para dar N-{2-[2-(2-{[6-cloro-8-fluoro-7-(3-hidroxinaftalen-1-il)-4-(piperazin-1-il)quinazolin-2-il]amino}etoxi)etoxi]etil}-5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]129enzoxazo-4-il]cloruro de hidrógeno de pentanamida. Esta sal de clorhidrato (0,19 g, 0,23 mmol) se neutraliza por medio de la combinación con DIEA (0,16 mL, 0,92 mmol) en DCM (2,5 mL). La mezcla se enfría a -78 °C y se añade cloruro de acriloilo (0,5 M en DCM, 0,4 mL, 0,21 mmol). Después de 30 minutos, la mezcla se calienta a temperatura ambiente. Tras una hora, la mezcla se diluye con MeOH (1 mL) y se concentra in vacuo. El residuo resultante se purifica por cromatografía de fase inversa, al eluir con un gradiente de 35 a 60% de B en A (A: 10 mM de NH4HCO3 acuoso con 5% de MeOH; B: ACN), para dar el compuesto del título como un sólido blanco (0,027 g, 14%). ES/MS m/z: 835 (M+H).

Ejemplo 1

(13aS)-9-(2-Ammo-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-il)-8,10-dicloro-2-prop-2-enoil-1,3,4,12,13,13ahexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-6-ona

La (13aS)-9-(2-Amino-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-N)-8,10-didoro-2,3,4,12,13a-hexahidro-1H-pirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-6-ona (500 mg, 1,070 mmol) se disuelve en DCM (5 mL) y TEA (0,75 mL, 5,4 mmol). La mezcla se enfría a -78 °C y a continuación se añade cloruro de acriloilo (0,085 mL, 1,0 mmol) y se agita la mezcla a -78 °C. Después de 5 minutos se añaden unas gotas de alcohol isopropílico a -78 °C y a continuación la mezcla se concentra in vacuo y se somete a cromatografía de fase inversa para dar una mezcla de dos atropisómeros. La mezcla de atropisómeros se separa mediante el uso de Chiralpak® IC, 4,6 x 150 mm, 40% EtOH/CO2, 5 mL/min, 225 nm. El segundo compuesto de la columna se identifica como el atropisómero activo (165 mg, 55%). ES/MS (m/z) (15Cl/17Cl) 521/523 [M+H] (>98% e.e.). El atropisómero menos activo es el primero en salir de la columna (133 mg, 44%). ES/MS (m/z) (15Cl/17Cl) 521/523 [M+H] (>98% e.e.).

Tabla 21: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la del Ejemplo 1

Ejemplo 34

4-[(13aS)-10-cloro-8-fluoro-6-oxo-2-prop-2-enoil-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-9-il]-2-amino-benzotiofen-3-carbonitrilo

Una suspensión de 4-[(13aS)-10-doro-8-fluoro-6-oxo-2,3,4,12,13,13a-hexahidro-1H-pirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-9-il]-2-amino-benzotiofen-3-carbonitrilo (1,58 g, 3,46 mmol) en EtOAc (35 mL), THF (15 mL) y agua (40 mL) se carga con carbonato de potasio (1,90 g, 13,7 mmol). La mezcla se agita rápidamente y se enfría a 0 °C. Se añade gota a gota cloruro de acrilo en DCM (13,0 mL, 3,25 mmol, 0,25M) a través de un embudo de goteo. Tras 10 minutos de agitación en un baño de hielo, la mezcla se diluye con EtOAc y se vierte en un embudo de separación. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae de nuevo con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavan con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo se purifica por medio de cromatografía en columna flash de gel de sílice, al eluir primero con 0 a 100% (10% de MeOH en DCM) / DCM, y segundo con 0 a 100% [10% (7N NH3 en MeOH) en DCM] / DCM para dar el producto deseado como un sólido esponjoso. El sólido se sonicó en éter durante 30 minutos, se filtró y se secó en alto vacío para dar el compuesto del título (1,60 g, 91%). ES/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 511,0/513,0 [M+H]+.

Tabla 22: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la del Ejemplo 34

Ejemplo 46

A una solución de (4aR)-8-(2-amino-7-fluoro-1,3-benzotiazol-4-N)-7,9-didoro-1,2,3,4,4a,5-hexahidropirazin[2,1-c][1,4]benzoxazepina-11-ona (46 mg, 0,10 mmol), ácido 2-fluoroprop-2-enoico (11 mg, 0,12 mmol), DIEA (53 j L, 0,30 mmol) en DMF (1 mL) enfriada en un baño de hielo a 0 °C se añade una solución de anhídrido propilfosfónico al 50% en EtOAc (91 j L, 0,15 mmol). Tras 45 min, la mezcla de reacción se concentra in vacuo. La mezcla cruda se purifica por cromatografía de fase inversa, al eluir con un gradiente de 20 a 80% de B en A (A: 10 mM de NH4HCO3 acuoso con 5% de MeOH; B: ACN), para dar el compuesto del título como un sólido blanco (25 mg, 47%). ES/MS m/z: 525 (M+H)

Tabla 23: Compuestos sintetizados de manera esencialmente análoga a la del Ejemplo 46

Ejemplo 58

4-[(13aS)-10-cloro-8-fluoro-2-(4-fluorobut-2-moil)-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazm[2,1-d][l,5]benzoxazocm-9-il]-2-ammo-7-fluoro-benzotiofen-3-carbomtrilo

Se añade trifluoruro de dietilaminosulfuro (0,03 mL, 0,2 mmol) se añade gota a gota por medio de jeringa a un vial sellado que contiene una solución a 0 °C de 4-[(13aS)-10-cloro-8-fluoro-2-(4-hidroxibut-2-inoil)-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-9-il]-2-amino-7-fluoro-benzotiofen-3-carbonitrilo (120 mg, 0,215 mmol) en DCE (2 mL). La mezcla de reacción se agita durante 30 minutos y posteriormente se diluye con agua y una solución de IPA/cloroformo al 25%. Los productos orgánicos se separan, se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo resultante se purifica por medio de cromatografía flash en gel de sílice al eluir con 0 a 100% de NH37M en DCM / DCM y se purifica aún más por medio de cromatografía de fase inversa para dar el compuesto del título como un sólido blanco (7 mg, 6%). Es/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 559,4/561,4 [M+H]+.

Tabla 24: Compuesto sintetizado de manera esencialmente análoga a la del Ejemplo 57

Ejemplo 60

(13aS)-9-(2-Ammo-3-ciano-7-fluoro-benzotiofen-4-il)-10-cloro-8-fluoro-6-oxo-1,3,4,12,13,13ahexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-2-carbonitrilo

Se añade bromuro de cianógeno (3M en DCM, 0,15 mL, 0,45 mmol) se añade a un matraz que contiene 4-[(13aS)-10-cloro-8-fluoro-6-oxo-2,3,4,12,13,13a-hexahidro-1H-pirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-9-il]-2-amino-7-fluorobenzotiofen-3-carbonitrilo (100 mg, 0,211 mmol) y NaOH IN (1 mL) en DCM (1 mL). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 18 horas y posteriormente se diluye con agua y una solución de IPA/cloroformo al 25%. Los productos orgánicos se separan, se secan sobre sulfato de sodio anhidro, se filtran y se concentran in vacuo. El residuo resultante se somete a cromatografía de fase inversa para dar el compuesto del título como un sólido blanco (29 mg, 27%). ES/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 517,0/519,0 [M+H]+.

Ejemplo 61

4-[(13aS)-10-cloro-2-[(E)-2-ciano-4,4-dimetil-pent-2-enoil]-8-fluoro-6-oxo-1,3,4,12,13,13a-hexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocm-9-il]-2-ammo-7-fluoro-benzotiofen-3-carbomtrilo

Se carga un vial de microondas de 20 mL con 4-[(13aS)-10-cloro-2-(2-cianoacetilo)-8-fluoro-6-oxo-1,3,4,12,13,13ahexahidropirazin[2,1-d][1,5]benzoxazocin-9-il]-2-amino-7-fluoro-benzotiofen-3-carbonitrilo (0,410 g, 0,756 mmol), EtOH (8 mL), piperidina (0,15 mL, 1,5 mmol) y trimetilacetaldehído (0,7 mL, 6 mmol) y se cerró con un tapón de septo. La mezcla de reacción se calienta en un reactor de microondas a 120 °C durante 60 minutos, otros 90 minutos a 120 °C y otra hora a 100 °C antes de concentrarla in vacuo. El residuo resultante se purifica por medio de cromatografía flash en gel de sílice al eluir con acetona : DCM al 0 a 50% para dar el producto del título como un sólido amarillo pálido (117 mg, 25%). ES/MS (m/z) (35Cl/37Cl) 610,6/612,6 [M+H]+.

Ensayos biológicos

Los siguientes ensayos demuestran que los compuestos ejemplificados son inhibidores de KRas G12C e inhiben el crecimiento de ciertos tumores in vitro y/o in vivo.

Ensayo TR-FRET de ocupación de la sonda KRas G12C

El propósito de este ensayo es medir la capacidad de un inhibidor para competir con una sonda para unirse a KRas G12C y modificarlo covalentemente en el codón 12. La señal se genera por la transferencia de fluorescencia resuelta en el tiempo entre el europio de un anticuerpo unido a KRas G12C marcado con europio y Anti-Histidine Tag LanthaScreen (el anticuerpo Eu Anti-His) y el trazador fluorescente 647 (Alexa Fluor™) unido a KRas G12C a través de estreptavidina y un inhibidor biotinilado (la “Sonda KRas”, véase la Preparación 223).

Los inhibidores se prueban en formato de respuesta a la dosis a partir de existencias de 10 mM en 100% de DMSO. El Labycyte Echo® 555 se utiliza para diluir y transferir 100 nL por pocillo que contiene una dilución en serie de 10 puntos y 2,8 veces a una placa de ensayo. Se preparan dos copias de la placa de ensayo para medir la potencia tras 5 y 60 minutos de incubación del inhibidor con KRas G12C. Se añade KRas G12C marcado con His (20 nM) a las placas en tampón de ensayo (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,01% TX-100 y 1 mM DTT). Tras 5 o 60 minutos de incubación, se añade 1 pM de sonda KRas y se deja que modifique covalentemente el KRas G12C libre durante 1 hora. Se diluye 4 veces en un tampón que contiene anticuerpo Eu Anti-His y Trazador 647 revestido de estreptavidina (ambos de Life Technologies) para obtener KRas G12C (5 nM), anticuerpo Anti-His (2 nM), sonda KRas (300 nM) y Trazador 647 revestido de estreptavidina (500 nM). Después de 30 minutos, se lee la señal fluorescente en un Envision™ Plate Reader (excitación a 340 nM, emisión del trazador (em) a 665 nM y emisión del anticuerpo a 615 nM). Los pozos de control máximo carecen de inhibidor y los pozos de control mínimo carecen tanto de inhibidor como de KRas G12C. La relación de señales (em a 665 / em a 615) se convierte en porcentaje de inhibición por medio de la siguiente ecuación: % de Inhibición = 100 -[(Señal del Compuesto de Prueba - Señal Mínima Mediana) / (Señal Máxima Mediana - Señal Mínima Mediana) * 100]. El CI50 se determina por medio del ajuste del porcentaje de inhibición a cada concentración de inhibidor a la ecuación logística no lineal de cuatro parámetros mediante el uso de Genedata Screener®: y = (A+((B-A) / (1 ((C/x)AD)))) en el que, y =% de inhibición, A = asíntota mínima, B = asíntota máxima, C= CI50 relativo o la concentración de inhibidor que produce el 50% de inhibición dentro del intervalo ajustado de ambas asíntotas, y D = Pendiente de Hill. Los compuestos dentro del ámbito de esta invención se evalúan en este ensayo sustancialmente como se ha descrito anteriormente. Los compuestos ejemplificados de la invención evaluados en este ensayo exhiben una actividad inhibidora de KRas G12C al competir con una sonda para unirse a KRas G12C y modificarlo covalentemente en el codón 12. El compuesto del Ejemplo 1, por ejemplo, evaluado en este ensayo presenta un CI50 inferior a 0,015 pM, a los 5 y 60 minutos, n = 4.

H358 Fosfo-ERK celular AlphaLISA®

El propósito de este ensayo es medir la capacidad de los compuestos de prueba para inhibir la fosforilación de p-ERK1/2, un efector descendente de KRas en las células humanas de cáncer de pulmón H358 (ATCC CRL-5807). Brevemente, el ensayo AlphaLISA® SureFire® Ultra™ p-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) es un inmunoensayo tipo sándwich para la detección cuantitativa de fosfo-ERK 1/2 (fosforilada en Thr202/Tyr204 en ERK1, o Thr185/Tyr187 en ERK2) en lisados celulares mediante el uso de la tecnología Alpha (Perkin Elmer Cat. Núm. ALSU-PERK-A50K).

Las células H358 se colocan en 40K células por pocillo en 100 pl de medio (RPMI 1640, GIBCO Cat. Núm. 22400 071) que contiene 10% de FBS (GIBCO Cat. Núm.: 10082-147) en una placa de 96 pocilios (Costar Núm. 3596) y se incuban durante la noche en bandejas húmedas a 37 °C, 5% de CO2. A la mañana siguiente, 10 |jl de compuestos de prueba diluidos en serie (3 veces) (concentración máxima de 50 jM ) y 10 j l de controles (pozos de señal máxima: 5% de DMSO y pozos de señal mínima: Se añaden 2 jM de N-(3-{3-ciclopropil-5-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-6,8-dimetil-2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetrahidropirido[4,3-D]pirimidina-l(2H)-il}fenil)acetamida (trametinib, como control positivo) a la placa celular y se incuban durante 2 horas en bandejas húmedas a 37 °C/5% de CO2. El tampón de lisis se prepara a temperatura ambiente y contiene un cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas. El medio de cultivo se elimina por medio de la inversión y la agitación de la placa de células en el fregadero y, a continuación, se seca en una toalla de papel. Se añade tampón de lisis a la placa celular (50 j l por pocillo) y se incuba la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos en un agitador. Para la detección de p-ERK, las perlas aceptoras se diluyen en una mezcla de suspensión con tampón. Mediante el uso de un manipulador de líquidos STARlet, se transfieren 5 j l de perlas aceptoras y 2 j l de lisado celular como una dilución en un solo etapa en una placa de ensayo de 384 pocillos. La placa de ensayo se sella con papel de aluminio y se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas. Las perlas donantes se diluyen en una mezcla de suspensión con tampón. Mediante el uso del STARlet, se añaden 5 j l de perlas donantes a la placa de ensayo que se sella, envuelta con papel de aluminio. La placa se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas en la oscuridad. A continuación, la placa de ensayo se lee en un EnVision™ Plate Reader (Perkin Elmer) mediante el uso de un programa de luminiscencia.

La señal se convierte en porcentaje de inhibición mediante el uso de la siguiente ecuación: % de inhibición = 100 -[(Señal del Compuesto de Prueba - Señal Mínima Mediana) / (Señal Máxima Mediana - Señal Mínima Mediana) * 100]. La Señal máxima es un pozo de control sin inhibidor. La Señal mínima es un pozo de control que contiene un inhibidor de referencia suficiente para inhibir completamente la actividad. El CI50 se determina por medio del ajuste del porcentaje de inhibición a cada concentración de inhibidor a la ecuación logística no lineal de cuatro parámetros mediante el uso de Genedata Screener®: y = (A+((B-A) / (1 ((C/x)AD)))) en el que, y = % de inhibición, A = asíntota mínima, B = asíntota máxima, C = CI50 relativo o la concentración de inhibidor que produce el 50% de inhibición dentro del intervalo ajustado de ambas asíntotas, y D = pendiente de la colina.

Los compuestos dentro del alcance de esta invención se evalúan en este ensayo sustancialmente como se ha descrito anteriormente. Los compuestos de los Ejemplos exhiben una capacidad para inhibir la fosforilación de p-ERK1/2. El compuesto del ejemplo 1, por ejemplo, presenta una CI50 relativa en este ensayo de 0,00178 jM n =3. Estos datos muestran que los compuestos de los Ejemplos exhiben una actividad de inhibición de KRas G12C en este ensayo celular.

H358 GTPasa RAS activa celular ELISA

El propósito de este ensayo es medir la capacidad de los compuestos de prueba para inhibir la actividad de RAS GTPasa constitutiva en las células cancerosas humanas H358 (ATCC CRL-5807). El kit ELISA de RAS GTPasa (Active Motif Cat. Núm. 52097) contiene una placa de 96 pocillos prerevestida con glutatión para capturar una proteína GST-Raf-RBD suministrada por el kit. Los RAS activados (unidos a GTP) en extractos celulares se unen específicamente al Raf-RBD. El RAS unido se detecta con un anticuerpo primario que reconoce el KRas humano. Un anticuerpo secundario conjugado con HRP reconoce el anticuerpo primario y una solución de desarrollo proporciona una lectura quimioluminiscente.

Las células H358 se colocan a 80.000 células/pocillo en 90 j l de medio libre de suero (RPMI 1640, GIBCO) y se incuban durante la noche a 37 °C/5% de CO2. A la mañana siguiente, 10 j l de compuestos de prueba diluidos en serie (3 veces) (concentración máxima de 500 jM ) y 10 j l de controles (pozos de señal máxima: 5% de DMSO y pozos de señal mínima: 500 jM 1-[4-[6-cloro-8-fluoro-7-(3-hidroxi-1-naftil)quinazolin-4-il]piperazin-1-il]prop-2-en-1-ona, WO2015054572 como inhibidor) se añaden a la placa celular y se incuban durante 2 horas a 37 °C/5 % deCO2. Se prepara un tampón de lisis/unión completo que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa y GST-Raf-RBD y se almacena en hielo. Una hora antes de finalizar la incubación de la placa celular, se diluyen 50 j l de GST-Raf-RBD en tampón de lisis/vinculación, y se añade el tampón a la placa de ensayo ELISA, que se incuba durante 1 hora a 4 °C con una suave agitación. Después de 2 horas, las células se lavan con 100 j l de PBS frío y se lisan con 100 j l de tampón de lisis/vinculación. La placa de células se agita durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la placa de células se centrifuga a 1500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo, se prepara el tampón de lavado IX a temperatura ambiente y se utiliza para lavar (3 * 100 jl) la placa de ensayo revestida de GST-Raf-RBD. Tras el lavado, se añaden 50 j l de lisado celular a la placa de ensayo revestida de GST-Raf-RBD y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Durante este período de incubación, se prepara el Tampón de Unión de Anticuerpos IX y se lleva a temperatura ambiente. La placa de ensayo se lava 3 * 100 j l con Tampón de Lavado IX y posteriormente se añaden 50 j l de Anticuerpo Primario (diluido 1:500 en Tampón de Unión de Anticuerpos 1*). Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa de ensayo se lava 3 * 100 j l con Tampón de Lavado IX y posteriormente se añaden 50 j l de Anticuerpo Secundario (diluido 1:5000 en Tampón de Unión de Anticuerpos IX) y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa de ensayo se lava 4 * 100 jL con Tampón de Lavado IX y posteriormente se añaden 50 jL de solución de trabajo quimioluminiscente a temperatura ambiente. A continuación, la placa de ensayo se lee en un EnVision™ Plate Reader (Perkin Elmer) mediante el uso de un programa de luminiscencia.

La señal se convierte en porcentaje de inhibición mediante el uso de la siguiente ecuación: % de Inhibición = 100 [(Señal del Compuesto de Prueba - Señal Mínima Mediana) / (Señal Máxima Mediana - Señal Mínima Mediana) * 100]. La Señal máxima es un pozo de control sin inhibidor. La Señal mínima es un pozo de control que contiene un inhibidor de referencia suficiente para inhibir completamente la actividad. El CI50 se determina por medio del ajuste del porcentaje de inhibición a cada concentración de inhibidor a la ecuación logística no lineal de cuatro parámetros mediante el uso de Genedata Screener®: y = (A+((B-A) / (1 ((C/x)AD)))) en el que, y = % de inhibición, A = asíntota mínima, B = asíntota máxima, C = CI50 relativo o la concentración de inhibidor que produce el 50% de inhibición dentro del intervalo ajustado de ambas asíntotas, y D = pendiente de la colina.

Los compuestos dentro del alcance de esta invención se evalúan en este ensayo sustancialmente como se ha descrito anteriormente. Los compuestos de los Ejemplos exhiben una capacidad para inhibir la actividad constitutiva de la GTPasa del SRA. El compuesto del ejemplo 1, por ejemplo, presenta una CI50 relativa de 0,00672 jM, n = 4 en este ensayo. Estos datos muestran que los compuestos de los Ejemplos exhiben una actividad de inhibición de KRas-GTP en este cultivo celular de cáncer de pulmón humano.

Ensayo de Proliferación Celular 3D H358

El propósito de este ensayo es evaluar la inhibición del compuesto de prueba en un ensayo de proliferación 3D mediante el uso de células de cáncer de pulmón humano, H358, (ATCC CRL-5807). La señal que refleja la proliferación celular se detecta con el reactivo CellTiterGlo® 3D (Promega G9683). Las células se cultivan en RPMI 1640 (GIBCO®) complementado con un 10% de FBS inactivado por calor y 0,1 mg/mL de penicilina/estreptomicina. Las células H358 se cultivan en la fase de crecimiento y se colocan cinco mil células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo transparente y superficie de fijación ultrabaja (Corning® Cat. Núm. 4520) con 80 jl/pocillo de medio de cultivo. Las células se incuban durante la noche a 37 °C en una cámara húmeda. se añaden 20 jl/pocillo de compuesto de prueba diluido en serie a la placa, que se incuba durante 96 horas. Las placas se ponen a temperatura ambiente y se añade un volumen igual de reactivo CellTiterGlo® 3D a temperatura ambiente. Las placas se agitan a 750 RPM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras una incubación de 1 hora a temperatura ambiente para estabilizar la señal, se mide la señal luminiscente en el lector de placas EnVision™. La señal se convierte en porcentaje de inhibición por medio de la siguiente ecuación: % de Inhibición = 100 -[(Señal del Compuesto de Prueba - Señal Mínima Mediana) / (Señal Máxima Mediana-Señal Mínima Mediana) * 100]. La Señal Máx. es un pozo de control sin inhibidor. La Señal Mínima es un pozo de control que contiene un inhibidor de referencia (trametinib) suficiente para inhibir completamente la proliferación celular. El CI50 se determina por medio del ajuste del porcentaje de inhibición a cada concentración de inhibidor a la ecuación logística no lineal de cuatro parámetros mediante el uso de Genedata Screener®: y = (A+((B-A) / (1 ((C/x)AD)))) en el que, y = % de inhibición, A = asíntota mínima, B = asíntota máxima, C = CI50 relativo o la concentración de inhibidor que produce el 50% de inhibición dentro del intervalo ajustado de ambas asíntotas, y D = pendiente de la colina.

Los compuestos dentro del alcance de esta invención se evalúan en este ensayo sustancialmente como se ha descrito anteriormente. El compuesto del ejemplo 1, por ejemplo, presenta una CI50 relativa de 0,0083 jM en este ensayo. Estos datos muestran que el compuesto del Ejemplo 1 inhibe la proliferación de las células de cáncer de pulmón humano H358.

Ensayo de proliferación celular CeMTiterGIo®

El propósito de este ensayo es evaluar el crecimiento de las líneas tumorales mutantes de KRas G12C tras el tratamiento con un compuesto de prueba. Se recolecta un panel de líneas celulares tumorales que albergan KRas G12C u otras mutaciones de KRas (Tabla 25). Todas las líneas celulares proceden de ATCC o de otras fuentes indicadas.

Normalmente las células se cultivan en RPMI1640 o en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, GIBCO) suplementado con 10% de FBS (GIBCO, Invitrogen). Para el cultivo en 2D, las células (4*103/pocillo) mantenidas en el medio de crecimiento descrito anteriormente, se colocan en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Corning® Cat. 3603) un día antes del tratamiento. Las células se tratan con el compuesto durante 96 horas, y posteriormente se analiza la viabilidad mediante el uso del CellTiterGlo® Luminescent Cell Viability Assay® (Promega Núm.G7572 para 2D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y un lector de placas EnVision™. Para calcular la mitad de la concentración máxima inhibitoria (CI50) se utiliza la regresión no lineal y las curvas sigmoidales dosis-respuesta con el software Graphpad Prism 4.

Tabla 25: Actividades antiproliferación in vitro de los Ejemplos 1, 34 a 36 en un panel de líneas celulares tumorales con mutación KRas G12C

Los datos indican que los compuestos de los Ejemplos 1, 34 a 36 inhiben el crecimiento de muchas líneas celulares tumorales mutantes de KRas G12C enumeradas en la Tabla 26.

Como se resume en la Tabla 25, los compuestos del Ejemplo 1, 34 a 36 exhiben actividades antiproliferación en la mayoría de las células tumorales con mutación KRas G12C en condición de cultivo 2D. En las células A549 con mutación KRas G12S, los compuestos de los Ejemplos 1, 34 a 36 muestran poca actividad, lo que sugiere que los Ejemplos 1, 34 a 36 inhiben selectivamente las células tumorales con mutación KRas G12C.

Inhibición de los Marcadores Farmacodinámicos (PD) de KRas G12C en el Modelo Xenográfico H358 y en el Modelo de Xenoinjerto de Cáncer de Páncreas MiaPaca-2

El propósito de estos ensayos es evaluar la inhibición in vivo de la diana de un compuesto de prueba administrado por vía oral. Células humanas de cáncer de pulmón H358, o de cáncer de páncreas MiaPaca-2, se implantan en modelos tumorales de xenoinjerto en ratones desnudos. Las células H358 o MiaPaca-2 (10 * 106en una mezcla de Matrigel® 1:1, 0,2 mL de volumen total) se implantan por medio de inyección subcutánea en la pata trasera de ratones hembra desnudos (Harlan Laboratories). Se utiliza un total de 3 a 4 ratones en cada grupo para el estudio de la participación en el objetivo y la EP. El tratamiento se inicia con la administración oral (gavage) de un compuesto de prueba o vehículo (20% Captisol®, 25 mM de fosfato, pH 2,0 en 0,2 mL) cuando el tamaño del tumor alcanza aproximadamente 300 mg.

Para la inhibición de la diana in vivo y el análisis de la EP, los tumores se trituran con un mortero sobre hielo seco y los fragmentos tumorales se añaden a 800 pl de tampón de lisis que contiene 1% de Triton™ X-100, 25 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de cloruro de sodio, 1 mM de EDTA y 1 mM de EGTA con un cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas Halt (Thermo Scientific, Núm. de cat. 1861281) en tubos de matriz de lisis D (MP Biomedical®, Núm. de cat. 6913-500) con una perla grande adicional (MP Biomedical® 1/4” ceramic sphere bead cat. Núm. 6540-412) por tubo. Los fragmentos tumorales se homogeneizan en un preparador rápido Thermo Bio101® (FP120) a la configuración 4 durante 15 minutos en frío, por un total de 2 veces. Los lisados se centrifugan a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para su clarificación. La estimación de las proteínas se lleva a cabo en el sobrenadante del lisado mediante el uso de un ensayo de proteínas BioRad Dc® y los lisados se diluyen en el tampón completo de lisis/unión del Ras GTPase Chemi ELiSa Kit® (Active Motif, Núm. de cat. 52097). El ELISA de KRas activo se lleva a cabo de la siguiente manera: los pocillos de ELISA revestidos de glutatión se incuban con RAF1-GST diluido en un tampón de lisis/vinculación completo durante 1 hora a 4 °C con agitación suave. Los pocillos se lavan 3 veces con tampón de lavado y se añaden 100 pg de lisados a cada pocillo y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. Los pocillos se lavan 3 veces más y, a continuación, se añade a cada pocillo el anticuerpo primario, diluido en tampón de unión de anticuerpos. Las placas se incuban durante 1 hora. Los pocillos se lavan 3 veces más antes de añadir a cada pocilio el anticuerpo secundario conjugado con HRP, diluido en tampón de unión de anticuerpos. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocilios de ELISA se lavan 4 veces, se añade el reactivo quimioluminiscente y se lee la luminiscencia. Para el ELISA de pERK de Meso Scale Discovery, se utilizan 25 |jg de proteína con un 0,1% de SDS; Meso Scale Discovery Whole Cell Lysate Kit for pERK es proporcionado por Meso Scale Discovery.

Inhibición de la diana in vivo dependiente de la dosis y efectos farmacodinámicos en el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón H388:

El propósito de este ensayo es evaluar la inhibición del objetivo in vivo dependiente de la dosis y los efectos farmacodinámicos en un modelo de cáncer de pulmón. El compuesto de prueba se dosifica en el modelo de xenoinjerto de ratón H358 de cáncer de pulmón en un intervalo de dosis de 12,5 a 100 mg/kg. Las muestras tumorales se recolectan 8 horas después de una dosis única. Se preparan los lisados tumorales y se mide la inhibición de pERKy KRas activa como se ha descrito anteriormente. Los resultados se proporcionan en la Tabla 26; el compuesto del Ejemplo 34 exhibe una inhibición dependiente de la dosis de pERK y KRas activa después de un tratamiento de dosis única de 12,5 a 100 mg/kg a las 8 horas. El compuesto del Ejemplo 35 también presenta una buena inhibición de la pERK y de la KRas activa tras un tratamiento de dosis única de 12,5 a 100 mg/kg. En estos niveles de dosis se observa una inhibición de la pERK del 82,2% al 90,6% y una inhibición activa de la KRas del 73,4% al 94%.

Tabla 26: Inhibición dependiente de la dosis de pERK, pMEK y Kras activo en el modelo de xenoinjerto H358

Inhibición de la Diana en Función del Tiempo In Vivo y Efectos Farmacodinámicos en el Modelo de Ratón de Xenoinjerto de Cáncer de Pulmón H388

El propósito de este ensayo es evaluar la inhibición del objetivo in vivo dependiente del tiempo y los efectos farmacodinámicos en un modelo de cáncer de pulmón. Los compuestos de los Ejemplos 35 y 36 también se dosifican a 30 mg/kg en un experimento de curso de tiempo. Tras una dosis única, las muestras tumorales se recolectan a las 2, 4, 8, 12 y 24 horas después. Se preparan los lisados tumorales y se mide la inhibición de la pERK y la KRas activa como se ha descrito anteriormente. Los resultados se proporcionan en la Tabla 27. El compuesto del Ejemplo 35 presenta una inhibición dependiente del tiempo de la pERK y de la KRas activa después de un tratamiento de dosis única de 30 mg/kg. Con 30 mg/kg, se observa una inhibición de la pERK del 82,6% a las 8 horas, y la inhibición de la pERK disminuye al 65,2% a las 24 horas. En el caso del KRas activo, se consigue una inhibición del 80,2% a las 8 horas, y la inhibición del KRas activo disminuye al 54,9% a las 24 horas. El compuesto del Ejemplo 36 también exhibe una inhibición dependiente del tiempo de la pERK y de la KRas activa después de un tratamiento de dosis única de 30 mg/kg. Con 30 mg/kg, se observa una inhibición de la pERK del 82,6% a las 8 horas, y la inhibición de la pERK disminuye al 48,8% a las 24 horas. En el caso del KRas activo, se consigue una inhibición del 88,5% a las 8 horas, y la inhibición del KRas activo disminuye al 43,2% a las 24 horas.

Tabla 27. Inhibición Dependiente del Tiempo de pERK y KRas Activo en el Modelo H358

Inhibición de la Diana In Vivo y Efectos Farmacodinámicos en el Modelo de Xenoinjerto de Cáncer de Páncreas MiaPaca-2

El propósito de este ensayo es evaluar la inhibición de la diana in vivo y los efectos farmacodinámicos dependientes del tiempo en un modelo de cáncer de páncreas. El compuesto de los Ejemplos 35 se dosifica a 5, 10 o 30 mg/kg en un experimento de curso de tiempo. Tras una dosis única, las muestras tumorales se recolectan a las 2, 4, 8, 12 y 24 horas después. Se preparan los lisados tumorales y se mide la inhibición de la pERK y la KRas activa como se ha descrito anteriormente. Los resultados se proporcionan en la Tabla 28. El compuesto del Ejemplo 35 presenta una inhibición dependiente de la dosis y del tiempo de la pERK y de la KRas activa tras un tratamiento de dosis única de 5, 10 o 30 mg/kg. Con 5 mg/kg, se observa una inhibición del 63,8% del Ras activo y del 50,9% de la pERK a las 4 horas. Con 10 mg/kg, se observa una inhibición del 85,5% del Ras activo y del 58,5% de la pERK a las 4 horas. Con 30 mg/kg, se observa una inhibición del 90,9% de Ras activo y del 58,7% de pERK a las 4 horas, y una inhibición del 60,7% de Ras activo que se mantiene a las 24 horas.

Tabla 28. Inhibición Dependiente de la Dosis y el Tiempo de pERK y KRas Activo en el Modelo MiaPaca-2

Actividad de Crecimiento Antitumoral en el Modelo de Ratón de Xenoinjerto de Cáncer de Pulmón H358:

El propósito de este ensayo es determinar las actividades antitumorales de los compuestos de prueba (Ejemplo 34, 35 y 36) en un modelo de xenoinjerto de ratón H358 de cáncer de pulmón. Se implantan células tumorales de pulmón H358 (10 * 106) por medio de inyección subcutánea en la pata trasera de ratones hembra desnudos (Taconic Biosciences). Para el estudio de eficacia se utilizan un total de 4 ratones en cada grupo. El tratamiento se inicia con la administración oral (por sonda) del compuesto de prueba o del vehículo (20% Captisol®, 25 mM de fosfato, pH 2,0 en un volumen de 0,2 mL) una o dos veces al día durante 28 días cuando el tamaño del tumor alcanza aproximadamente 300 mg. El crecimiento del tumor y el peso corporal se monitorizan a lo largo del tiempo para evaluar la eficacia y los signos de toxicidad. Los resultados resumidos se proporcionan en la Tabla 29. A 100 mg/kg en un esquema de dosificación de una vez al día, se observó una regresión del crecimiento tumoral de -6,28 a -30,96% para el compuesto del Ejemplo 34. A 30 mg/kg en un esquema de dosificación diaria, se observó una regresión tumoral de -67,68 a -72,14% para el compuesto del Ejemplo 35. A 30 mg/kg en un esquema de dosificación de dos veces al día, se logró un -68,96% de progresión tumoral para el compuesto del Ejemplo 36. No se observó una pérdida significativa de peso corporal de los animales a lo largo de todo el estudio para estos compuestos.

Tabla 29: Actividad de crecimiento antitumoral en el modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de pulmón H358

Actividades de Crecimiento Antitumoral en Otros Modelos de Cáncer de Pulmón y de Cáncer Colorrectal, Pancreático, de Vejiga y de Esófago

Además del modelo de xenoinjerto H358, el compuesto del Ejemplo 35 se prueba en otros modelos de xenoinjerto o de xenoinjerto derivado de paciente (PDX) de cáncer de pulmón, colorrectal, de páncreas, de vejiga y de esófago a diferentes dosis. Para los modelos de xenoinjerto de H1373, HCC44, MiaPaca-2, SW1463, KYSE-410 y UM-UC-3, normalmente se implantan 5-10 * 106 células en una mezcla de matrigel 1:1 (0,2 mL de volumen total) por medio de inyección subcutánea en la pata trasera de ratones desnudos. En general, se utiliza un total de 4 ratones por grupo para el estudio de eficacia. El tratamiento se inicia con la administración oral (por sonda) del compuesto de ensayo o del vehículo (captisol al 20%, fosfato 25 mM, pH2,0) en un volumen de 0,2 mL cuando el tamaño del tumor alcanza aproximadamente 200 a 300 mg. El crecimiento del tumor y el peso corporal se monitorizan a lo largo del tiempo para evaluar la eficacia y los signos de toxicidad. Para el modelo PDX de EL3187, los viales congelados que contienen fragmentos tumorales se descongelan a 37 °C en un baño de agua. Los fragmentos tumorales se transfieren a un tubo Falcon de 50 mL y se añade lentamente el medio DMEM frío en el tubo hasta un volumen total de 35 mL. A continuación, los fragmentos tumorales se centrifugan a 130 * g durante 2 minutos a 4 °C y se aspira el sobrenadante. Esta etapa de lavado se repite dos veces y los fragmentos tumorales se resuspenden en 10 mL de DMEM para su implantación en ratones atímicos nude-Foxnlnu (Envigo RMS, Inc., Mount Comfort, Indiana). Una vez que los volúmenes de los tumores alcanzan entre 800 y 1000 mm3, los animales son sacrificados y los tumores son cosechados mediante el uso de una técnica aséptica. Los tumores frescos se cortan en fragmentos de 10 a 15 mm3 y se colocan en un medio de hibernación frío de Gibco. Los fragmentos tumorales se implantan por vía subcutánea en los animales con una aguja de trocar de 10 g. Cuando el tamaño del tumor alcanza entre 200 y 300 mm3, los animales son asignados al azar para el tratamiento compuesto.

Las actividades de crecimiento o regresión antitumoral del compuesto del Ejemplo 35 se resumen en la Tabla 30. Entre los modelos enumerados en la Tabla 31, EL3187 es un modelo de xenoinjerto derivado de paciente (PDX), y todos los demás son modelos de xenoinjerto tumoral. Como se ilustra en la Tabla 31, el compuesto del Ejemplo 35 demuestra actividades antitumorales dependientes de la dosis en todos los modelos, lo que sugiere que el compuesto del Ejemplo 35 es activo contra los cánceres con la mutación KRasG12C, que incluye el cáncer de pulmón, colorrectal, de páncreas, de vejiga y de esófago.

Tabla 30: Actividad Antitumoral del Compuesto del Ejemplo 35 en Modelos de Xenoinjerto o PDX de Cáncer de Pulmón, Colorrectal, de Páncreas, de Vejiga y de Esófago.

Eficacia de la Combinación in Vitro del Compuesto del Ejemplo 35 con Otras Terapias Dirigidas Además de la monoterapia, el compuesto del Ejemplo 35 se evalúa para su eficacia de combinación con otras terapias dirigidas, tal como el inhibidor de CDK4 y CDK6 abemaciclib, los inhibidores de molécula pequeña de EGFR erlotinib o afatinib, el anticuerpo monoclonal de EGFR cetuximab y el inhibidor de ERK LY3214996. Once líneas celulares para este estudio se obtienen de ATCC y se cultivan en las condiciones recomendadas por ATCC. Todas las líneas celulares tienen una mutación KRAS G12C, y son seis líneas celulares de cáncer de pulmón (H358, H1373, H1792, H2030, H2122, SW1573 y HCC44), dos líneas celulares de cáncer colorrectal (SW837 y SW1463), una línea celular de cáncer de páncreas (MiaPaca-2) y una línea celular de cáncer de esófago (KYSE410). El ensayo de proliferación se lleva a cabo como un ensayo de crecimiento de 4 días mediante el uso de Cell TiterGlo® como lectura. Brevemente, las células se colocan en placas de cultivo celular de 96 pocillos y se dejan adherir durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las células se tratan con compuestos, ya sea en tratamientos individuales o combinados. En primer lugar, los compuestos de prueba se diluyen en serie en DMSO, seguido por la dilución en los medios como una concentración de 5 veces con 1% de DMSO, y finalmente se añade a las células en los medios para diluir a IX. Las células se incuban a 37 °C durante 4 días más. Al final del período de incubación, se mezcla el reactivo Cell TiterGlo® y se añade a los pocillos. Después de 10 minutos, se lee la luminiscencia con un instrumento Perkin Elmer Envision. Se generan los valores absolutos de CI50 generados por un modelo logístico de 4 parámetros para los tratamientos únicos y combinados, seguidos por los índices de combinación para cada tratamiento combinado y línea celular. Los valores de CI50 de la combinación se ajustan en función de la concentración total de cada compuesto cuando se suman. (Ejemplo: para una relación de concentración 1:1 del compuesto 1 y del compuesto 2, la CI50 de la combinación se multiplica por 2). El índice de combinación (IC) mide el grado en que la potencia de una terapia combinada difiere de la potencia esperada si es aditiva y se basa en la definición de aditividad de Loewe.

En la que

• Ca,y y Ce,yson las concentraciones de las terapias A y B que producen un efecto, y, cuando se administran en combinación

• ICA,y e ICB,y son las concentraciones de A y B que producen un efecto, y, cuando se administran individualmente

En algunos casos, si se utiliza un valor CI50 estimado para el cálculo del IC, el IC calculado se denomina Índice de Potenciación. La interpretación biológica del índice de combinación o potenciación es de la siguiente manera: sinérgico si el índice de combinación o potenciación es < 0,5, aditivo si el índice de combinación o potenciación está entre 0,5 y 2, y antagónico si el índice de combinación o potenciación es > 2.

Como se muestra en la Tabla 31, la combinación del compuesto del Ejemplo 35 y abemaciclib tiene una eficacia aditiva o sinérgica en la inhibición de las células tumorales con la mutación KRasG12C. Entre once líneas celulares ensayadas, se observan efectos aditivos en cinco líneas celulares, con un Índice de Combinación (IC) entre 0,5 y 1,2, y se observa un efecto sinérgico en seis líneas celulares, con un IC < 0,5, lo que sugiere que la combinación del compuesto del Ejemplo 35 y abemaciclib puede proporcionar beneficios a los pacientes con cáncer con una mutación KRas g 12C.

Tabla 31: Combinación In Vitro del Compuesto del Ejemplo 35 y el Inhibidor de CDK4/ CDK6 Abemaciclib

Como se muestra en la Tabla 32, la combinación del compuesto del Ejemplo 35 y el inhibidor de molécula pequeña del EGFR erlotinib o afatinib tiene un efecto aditivo o sinérgico en la inhibición de células tumorales que albergan una mutación KRasG12C. Para la combinación de erlotinib, entre las once líneas celulares probadas, se observa un efecto aditivo en cinco líneas celulares, con un Índice de Combinación o Potenciación entre 0,5 y 1,15, y un efecto sinérgico en seis líneas celulares, con un Índice de Combinación o Potenciación < 0,5. En el caso de la combinación de afatinib, entre las nueve líneas celulares probadas, se observa un efecto de adición en cuatro líneas celulares, con un IC entre 0,5 y 1,1, y un efecto sinérgico en cinco líneas celulares, con un IC < 0,5. Estos datos sugieren que la combinación del Ejemplo 35 y un inhibidor de molécula pequeña del EGFR pueden proporcionar beneficios a los pacientes de cáncer con una mutación G12C del KRas.

Tabla 32: Combinación In Vitro del Compuesto del Ejemplo 35 y el Inhibidor de Molécula Pequeña del EGFR Erlotinib o Afatinib

Como se muestra en la Tabla 33, la combinación del compuesto del Ejemplo 35 y el anticuerpo EGFR cetuximab tiene una eficacia aditiva o sinérgica en la inhibición de células tumorales con la mutación KRas G12C. Entre las once líneas celulares probadas, cinco líneas celulares tienen efectos aditivos con un Índice de Potenciación (IC) entre 0,5 y 1,06, y seis líneas celulares tienen efectos sinérgicos con un Índice de Potenciación <0,5, lo que sugiere que la combinación del Ejemplo 35 y el Cetuximab puede proporcionar beneficios a los pacientes con cáncer con mutación KRasG12C.

Tabla 33: Combinación In Vitro del Ejemplo 35 y el Anticuerpo EGFR Cetuximab

Como se muestra en la Tabla 34, la combinación del compuesto del Ejemplo 35 y el inhibidor de ERK LY3219446 tiene una eficacia aditiva o sinérgica en la inhibición de células tumorales con la mutación KRas G12C. Entre las diez líneas celulares ensayadas, se observa un efecto aditivo en 5 líneas celulares, con un IC entre 0,5 y 1,2, y se observa un efecto sinérgico en 5 líneas celulares, con un Índice de Combinación o Potenciación < 0,5, lo que sugiere que la combinación del Ejemplo 35 y un inhibidor de ERK puede proporcionar beneficios a los pacientes de cáncer con la mutación KRas G12C.

Tabla 34: Combinación In Vitro del Compuesto del Ejemplo 35 y el Inhibidor de ERK LY3214996

Eficacia de la Combinación In Vitro del Compuesto del Ejemplo 35 con Quimioterapias

El compuesto del Ejemplo 35 también se combina con quimioterapia, que incluye pemetrexed, carboplatino o cisplatino, en tres líneas celulares de cáncer de pulmón, H1792, H358 y H2122, in vitro. Como se muestra en la Tabla 35, para la combinación de pemetrexed se observan efectos aditivos o sinérgicos en función del IC. Se observan efectos combinados similares con la combinación de carboplatino y cisplatino.

Tabla 35: Combinación In Vitro del Compuesto del Ejemplo 35 y Quimioterapias (Índice de combinación).

Eficacia de la Combinación In Vivo del Ejemplo 35 con Otras Terapias Dirigidas

El compuesto del Ejemplo 35 se evalúa en combinación con el inhibidor de CDK4/CDK6 abemaciclib, los inhibidores de molécula pequeña de EGFR erlotinib o afatinib, el anticuerpo monoclonal anti-EGFR cetuximab, o el inhibidor de ERK LY3214996, en un modelo animal PDX. Se utilizan un total de seis modelos de xenoinjertos o PDX in vivo: cuatro modelos de pulmón (H358, H1373, LU99 y EL3187 PDX), un modelo colorrectal (SW1463) y un modelo pancreático (MiaPaca-2). La Tabla 36 es un resumen de todos estos resultados de estudios de combinación in vivo. La combinación del compuesto del Ejemplo 35 y el inhibidor de CDK4/6 abemaciclib se estudia en los seis modelos. En los seis modelos, la combinación es mejor que el compuesto del Ejemplo 35 o el abemaciclib solo. En cuatro modelos de cáncer de pulmón y en un modelo de cáncer de páncreas, se observa una sinergia y una regresión significativa del crecimiento tumoral para la combinación. En el modelo colorrectal SW1463, se observa una mejor actividad antitumoral que para el compuesto del Ejemplo 35 o abemaciclib solo.

La combinación del compuesto del Ejemplo 35 y el inhibidor de molécula pequeña del EGFR erlotinib se lleva a cabo en los seis modelos. En los seis modelos, la combinación es mejor que el compuesto del Ejemplo 35 o el erlotinib solo. En tres modelos de cáncer de pulmón y un modelo de cáncer de páncreas, se observa una sinergia y una regresión significativa del crecimiento tumoral para la combinación. En el modelo SW1463 de cáncer colorrectal y en el modelo LU99 de cáncer de pulmón, la combinación es mejor que el compuesto del Ejemplo 35 o el erlotinib por separado. En el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón H358, se observa un efecto aditivo y una mejor actividad antitumoral de la combinación del compuesto del Ejemplo 3 y el inhibidor de molécula pequeña del EGFr afatinib, en relación con cualquiera de los dos compuestos por separado.

Los estudios de combinación in vivo del Ejemplo 35 y el anticuerpo EGFR cetuximab se llevan a cabo en el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón H358 y en el modelo de xenoinjerto de cáncer colorrectal SW1463. En ambos modelos, se observa una regresión del crecimiento tumoral y una mayor eficacia de la combinación. La combinación es mejor que el compuesto del Ejemplo 35 o el cetuximab por sí solo.

La combinación del compuesto del Ejemplo 35 y el inhibidor de ERK (ERKi) LY3214996 se estudia en los seis modelos. En los seis modelos, se observa una sinergia o un efecto aditivo para la combinación, y la combinación es mejor que el compuesto del Ejemplo 35 o el inhibidor de ERK por separado. En tres modelos de cáncer de pulmón (H358, H1373 y EL3187), un modelo de cáncer de páncreas y un modelo colorrectal, se observa una regresión significativa del crecimiento tumoral.

Tabla 36. Actividades Antitumorales In Vivo del Compuesto del Ejemplo 35 en Combinación con Otras Terapias Dirigidas en Modelos de Xenoinjertos Tumorales o PDX

Eficacia de la Combinación con Inmunoterapias, Anticuerpos Anti-PD-1 o Anti-PD-Ll

Se utiliza un modelo singénico de ratón para evaluar los efectos de la inhibición de KRas G12C y la combinación de inmunoterapia. En este modelo, la mutación KRas G12D se convierte en la mutación KRas G12C por medio de knock-in ^cRⁱSPR en la línea celular CT-26, una línea celular de tumor colorrectal de ratón. El knock-in de KRas G12C se confirma por medio de la caracterización genética y funcional. La línea celular modificada se denomina CT-26-H4/KRas G12C. Estas células se implantan en los ratones Balb/c, y el tratamiento con el compuesto se inicia 6 días después de la implantación de las células tumorales. En este estudio, el compuesto del Ejemplo 35 se combina con el anticuerpo anti-PD-Ll (RMP1 (BioXcell Cat. Núm. BE0146)) o un anticuerpo anti-PD-1 (Holmgaard RB, et al., J. Immunotherapy Cáncer 2018; 6(47): 1 a 15), con el esquema de dosis que figura en la Tabla 37. Como se muestra en la Tabla 37, el compuesto del Ejemplo 35 demuestra una actividad significativa como agente único, con un promedio del 89,4% de inhibición del crecimiento tumoral, y ninguna respuesta completa a 30 mg/kg al final de la dosis de 3 semanas. El anticuerpo anti-PD-L1 de ratón 178G7 muestra una inhibición del crecimiento tumoral del 36,1%, sin respuesta completa, y el anticuerpo anti-PD-1 RMP1 muestra una inhibición del crecimiento tumoral del 70,7% y una respuesta completa del 10% (1 de cada 10) al final de la dosis (día 21) o al día 59. Sin embargo, la combinación del compuesto del Ejemplo 35 con el anticuerpo anti-PD-Ll o el anticuerpo anti-PD-1 logra una actividad antitumoral significativamente mejor. Al final de la dosis de 3 semanas, la combinación del compuesto del Ejemplo 35 con el anticuerpo anti-PD-Ll o anti-PD-1 muestra una regresión tumoral del -33,9% y -19,4%, y una respuesta completa del 30% y 40%, respectivamente. Después de 3 semanas, el tratamiento compuesto se detiene y todos los tumores en los grupos de monoterapia, con excepción de 1 animal en el grupo anti-PD-1, comenzaron a rebrotar. Sin embargo, muchos tumores de los dos grupos combinados no muestran signos de rebrote. 38 días después de la última dosis (día 59), los grupos de combinación tienen un 40% y un 60% de respuesta completa, lo que indica que muchos tumores en los grupos de combinación son eliminados. Estos resultados sugieren que el tratamiento con el compuesto del Ejemplo 35, en combinación con un anticuerpo anti-PD-Ll o un anticuerpo anti-PD-1, puede ser beneficioso para los pacientes de cáncer con la mutación G12C de KRas.

Tabla 37: Actividad Antitumoral In Vivo del Compuesto del Ejemplo 35 en Combinación con la Inmunoterapia (anticuerpo Anti-PD-1 o Anti-PD-Ll) en el Modelo Singénico CT-26-H4/KRasG12C

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula:

en la que:

A es -OCH²-, -N(Ra)CH², -OCH²CH²-, -N(Ra)CH²CH²-, -CH²OCH²-, o -CH²N(Ra)CH²-;

B es -CH²- o -C(O)-;

Y es -C(CN)- o -N-;

R¹es -CN, -C(O)CECR8, o un grupo de la fórmula

R ² es H, metilo o -CH ² CN;

R ³ y R ⁵ son cada uno independientemente H, halógeno, -alquilo Co- ³ -cidopropilo, -alquilo C ^1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R ¹⁰ , o -O-alquilo C ^1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R ¹⁰ ;

R ⁴ es H, halógeno, o -alquilo C ^1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R ¹⁰ ;

R6 es H o -alquilo C ^1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R ¹⁰ ;

R ⁷ es H, halógeno, -NR ¹¹ R ¹² , -CH ² NR ¹¹ R ¹² , -alquilo C ^1.6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R ¹⁰ o R ¹³ , -alquilo C ^0-3 ciclopropilo, o -O-alquilo C ^1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R ¹⁰ o R ¹³ ;

R ⁸ es H, -alquilo C ^1-4 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R ¹⁰ , o -cicloalquilo C ^3-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R ¹⁰ ;

Rg es H, halógeno, -CN, -alquilo C ⁰ - ³ -cicloalquilo C ³ - ⁶ , o -alquilo C ^1-6 opcionalmente sustituido 1 a 3 veces con R ¹⁰ ;

R ¹⁰ es, independientemente, en cada caso, halógeno, oxígeno, hidroxi, -alquilo C ¹ - ⁴ , o -O-alquilo C ¹ . ⁴ ; R ¹¹ y R ¹² son cada uno independientemente H, -alquilo C ¹ - ⁴ , o -heteroalquilo C ¹ . ⁴ , en el que R ¹¹ y R ¹² se pueden combinar para formar un heterocicloalquilo; y

R ¹³ es independientemente en cada ocurrencia -N-alquilo C ¹ . ⁴ ,

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que A es -OCH ² CH ² -, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que B es -C(O)-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

4. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Y es -C(CN)-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

5. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Y es -N-, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

6. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que R ¹ es un grupo de la fórmula

y en el que R7 es H, F, Cl, metilo, etoxi, etilo, isopropilo o ciclopropilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

7. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que Ri es un grupo de la fórmula

y en el que Rg es H, F, Cl, -CHF2, -CF3, o -CH2OH, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

8. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que R1 es -CN, -C(O)CECR8, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

9. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que R2 es H o metilo, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

10. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que R3 es H, F, Cl, metilo, metoxi, etilo, isopropilo o ciclopropilo o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

11. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que R4 es H, F o Cl, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

12. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que R5 es H, -CHF2,-CH2F, -CH2OH, o -CH2OCH3, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

13. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, de la fórmula;

en la que:

A es -OCH2- o -OCH2CH2-;

Y es -C(CN)- o -N-;

R3 es Cl o F;

R4 es H o F cuando Y es C(CN); y

R4 es F cuando Y es N,

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

14. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 13, en el que A es:

15. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado de:

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

16. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 15, que es:

17. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y un portador, diluyente o excipiente aceptable para uso farmacéutico.

18. El compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para su uso en terapia.

19. El compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para su uso en el tratamiento del cáncer.

20. El compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el cáncer se selecciona entre el cáncer de pulmón, el cáncer de páncreas, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de esófago, el cáncer de endometrio, el cáncer de ovario, el colangiocarcinoma y el cáncer colorrectal.

21. El compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el cáncer es un cáncer de pulmón de células no pequeñas, y en el que una o más células expresan la proteína mutante KRas G12C.

22. El compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el cáncer es colorrectal, y en el que una o más células expresan la proteína mutante KRas G12C.

23. El compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el cáncer es cáncer de páncreas, y en el que una o más células expresan la proteína mutante KRas G12C.

24. El compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más de un inhibidor de PD-1 o PD-L1, un inhibidor de CD4/CDK6, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, un inhibidor de EGFR, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, un inhibidor de ERK, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, un agente de platino, y pemetrexed, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, en el tratamiento del cáncer.