JP7052092B2

JP7052092B2 - 抗ウイルス及び免疫調節効能を有するラクトバチルス・プランタルムｃｊｌｐ１７及びそれを含む組成物

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Publication number: JP7052092B2
Application number: JP2020571325A
Authority: JP
Inventors: ムン・ホジン; キム・ヒヨン; ウ・ソヒョン; イ・ギョンミン; チャン・ユンテク; キム・ソンフン; ウン・ジョンス
Original assignee: シージェイチェイルジェダンコーポレイション
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2019-05-03
Publication date: 2022-04-11
Anticipated expiration: 2039-05-03
Also published as: DK3747989T3; EP3747989A4; EP3747989B1; KR20190127156A; EP3747989A1; WO2019212299A1; SG11202009008PA; CN112204130B; CN112204130A; US20210038657A1; PL3747989T3; ES2929354T3; PT3747989T; JP2021516069A; PH12020551375A1; US11344588B2; BR112020022085A2

Description

KCCM

KCCM12249P

本出願は、耐酸性、耐胆汁性及び免疫増強活性を有するラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ１７菌株に関し、特にラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む組成物、飼料添加剤、機能性食品などに関する。

現在の畜産業界においては、伝染性の高いウイルス性疾患により家畜が斃死し、それに伴って農家に経済的被害が発生することが多い。特に、養豚産業において、４大慢性消耗性疾患である豚呼吸器病症候群（porcine respiratory disease complex）、離乳後全身性消耗症候群（Postweaning multisystemic wasting syndrome）、豚生殖器・呼吸器症候群（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome）、豚流行性下痢（Porcine epidemic diarrhea）などのウイルスや細菌による感染性疾患により莫大な経済的損失が発生している。

前記豚流行性下痢は、コロナウイルス科（corona virus family）に属する豚流行性下痢ウイルス（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）の感染により発生する豚消化器疾患である。前記ウイルスは、小腸や大腸の絨毛細胞で増殖し、全ての日齢の豚、特に子豚において急性腸炎、嘔吐、水様性下痢を誘発する。特に、１１月から４月までの主に冬期に被害が深刻であり、生後１週齢以内の哺乳子豚の斃死率は約５０％に達し、重篤な場合は激しい脱水により斃死率が約１００％に達することが知られている。

ＰＥＤウイルスは、１９７１年にヨーロッパで初めて観察され（非特許文献１）、１９７６年にベルギーでＧ１ａｔｙｐｅＰＥＤＶＣＶ７７７がさらに検出及び分離され（非特許文献２）、８０年代にヨーロッパで流行し、９０年代に中国、韓国、日本、台湾など東アジア地域で発生した。また、前記Ｇ１ａｔｙｐｅより病原性の高いＧ２ｂｔｙｐｅＰＥＤＶが２０１０年に中国をはじめとして発生した。前記新種ｔｙｐｅのＰＥＤＶは、北米地域（米国，カナダ）だけでなく、東南アジア、ヨーロッパでも発生して大きな被害をもたらした（非特許文献３）。２０１３年には米国養豚産業において生産性損失により約２兆２，０００億韓国ウォンの被害が発生し、韓国においては現在年間２０～４０％の農家で毎年発生し、それにより子豚全体の６％が斃死すると報告されている。さらに、屠殺場出入車両の感染率が約６０％に達すると報告されている（韓国農村経済研究院，韓国養豚獣医師協会）。

現在までＧ２ｂｔｙｐｅＰＥＤウイルスに対する根本的な予防は、徹底して消毒する方法が唯一であった。多くの農場でウイルス疾患による被害を予防するために、人工感染法を用いたり、従来のＧ１ａｔｙｐｅＰＥＤＶワクチンを接種しているが、Ｇ２ｂｔｙｐｅＰＥＤＶ感染を予防するには限界がある。このような問題を補完するために、ＰＥＤウイルス予防（ワクチンなど）及び治療（ＩｇＹ、精油（Essential oil）、有機酸、プロバイオティクスなど）用製剤の開発が盛んに行われており、最近は特に抗ウイルス効果を有すると共に生体内の免疫系を刺激する機能性素材を用いて免疫を増強する方法が研究されている。

免疫は、一般に先天性免疫（Innate immunity）と後天性免疫（Adaptive immunity）に分けられる。先天性免疫は、病原体の感染を第一線で速やかに防御するシステムであり、侵入因子（抗原）に直接作用したり、後天性免疫を誘導する。後天性免疫は、より複雑で精密なシステムであり、侵入因子を認知して除去したり、当該侵入因子に対する記憶などの作用を有し、先天性免疫に比べてより永久的な免疫作用を有する。先天性免疫に関する抗原提示細胞（Antigen-presenting cells）である樹状細胞（Dendritic cells, DCs）、マクロファージ（Macrophages）、ナチュラルキラー細胞（natural killer cells）などは、直接の先天性免疫作用を有し、各種Ｔ細胞の活性を促進する受容体を有するので、それを介してサイトカイン（cytokines）を分泌する。後天性免疫は、体内に侵入した抗原に対する２次防御システムであり、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球により起こる特異的免疫反応である。抗原により活性化するＴ細胞の免疫反応としては、細胞傷害性Ｔ細胞（Cytotoxic T cell）反応、ヘルパーＴ細胞（Helper T cell, Th）反応などが挙げられる。このようなＴ細胞の前駆体の役割を果たすＮａｉｖｅＣＤ４Ｔ細胞は、ＩＬ－１２（interleukin-12）を分泌し、細胞内病原体（intracellular pathogen）を退治するＣＴＬ（Cytotoxic T lymphocyte）反応を誘導したり、ＩＬ－４（interleukin-4）を分泌し、外部侵入物質を特異的に退治する（Ｂ細胞の抗体分泌）反応を誘導する。また、炎症反応などの過度の免疫反応を抑制するためにＴＧＦ－ｂｅｔａ（Beta transforming growth factor）を分泌したり、ＴＧＦ－ｂｅｔａやＩＬ－６（interleukin-6）などの分泌によりＢ細胞をプラズマ細胞に変形させて抗体生成を促進したり、誤った自己免疫と外部侵入物質を退治する免疫反応（Ｔｈ１７）を誘導するなど、精巧かつ複雑な過程を経て体内に侵入した因子に対して適宜対応する。

Oldham J., Letter to the editor. Pig Farming, 1972, 10:72-73 Pensaert MB et al., A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine. Arch Virol., 1978, 58:243-247 Song D. et al., Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines, Virus Genes, 2012, 44:167-175

本発明者らは、前記ウイルスに抑制活性を示すと共に免疫系を活性化する新規な微生物を分離及び同定してその活性を確認し、本出願を完成するに至った。

本出願は、耐酸性、耐胆汁性及び免疫増強活性を有する、寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ１７菌株を提供することを目的とする。

また、本出願は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む組成物を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む飼料添加剤を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む機能性食品を提供することを目的とする。

本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は、耐酸性、耐胆汁性に優れるのでプロバイオティクスとして提供することができ、生体内免疫細胞を活性化することにより免疫機能を調節することができ、特に豚流行性下痢ウイルスに対しても優れた感染抑制活性を示す。また、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７を家畜に経口投与すると、免疫調節効果により下痢発生率が大幅に低下するだけでなく、日増体量が改善されるという効果を発揮した。よって、本出願は、ＰＥＤＶに対する抗ウイルス活性、免疫増強活性、増体量改善効果及び家畜の下痢発生率減少効果を有する新規なラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株を提供することができ、前記菌株は、薬学組成物、食品組成物又は飼料組成物として有用である。

ＣＪＬＰ１７の電子顕微鏡写真である。菌株の溶血性の有無を示す血液寒天平板培地の写真である。ＣＪＬＰ１７の細胞毒性の有無を示すグラフである。豚脾臓細胞（グラフにＳｐｌｎと表示）及び末梢血単核球（グラフにＰＢＭＣと表示）を培養し、ＩＬ－１２の分泌を測定した結果を示すグラフである。豚脾臓細胞（グラフにＳｐｌｎと表示）及び末梢血単核球（グラフにＰＢＭＣと表示）を培養し、ＩＬ－１０の分泌を測定した結果を示すグラフである。腸間膜（グラフにｍＬＭと表示）及びパイエル板細胞（グラフにＰＰと表示）を培養し、ＴＧＦ－ｂｅｔａの分泌を測定して陰性対照群に対する増加量（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７によるＰＥＤウイルス感染抑制効果を示す顕微鏡写真である。ＣＪＬＰ１７の経口投与が離乳子豚の平均日増体量（mean value of ADG）に及ぼす影響を示すグラフである。ＣＪＬＰ１７の経口投与が離乳子豚の下痢率に及ぼす影響を示すグラフである。

以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。

前記目的を達成するための本出願の一態様は、耐酸性、耐胆汁性及び免疫増強活性を有する、寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ１７菌株を提供する。

本出願におけるラクトバチルス（Lactobacillus）は、自然界に広く分布する好気性又は通性嫌気性のグラム陽性桿菌属微生物である。ラクトバチルス属に属する微生物にはラクトバチルス・プランタルムなどがある。本発明者らは、ラクトバチルス・プランタルムに属する新規な菌株を寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託して提供する。これは、プロバイオティクス菌株に該当し、人体に無害であり、副作用を引き起こすことなく用いられる。

本出願における「プロバイオティクス」とは、体内に入って健康によい効果を与える生きた菌を意味する。これまでに知られているほとんどのプロバイオティクスは、ラクトバチルスなどの乳酸菌を用いて製造された発酵乳製品として摂取されてきたが、最近はラクトバチルス以外に、ビフィドバクテリウム、エンテロコッカスなどの一部の菌株を含む発酵乳、顆粒、粉末などの形態で販売されている。

本出願における「耐酸性」とは、高い酸度に耐えられる性質を意味する。プロバイオティクスが耐酸性を有すると、経口で摂取されて胃腸内の強い酸性条件にさらされても、分解されたり、損傷することを防止することができる。

本出願における「耐胆汁性」とは、胆汁内の消化酵素に対する抵抗性を意味する。胆汁は、肝臓で生成されて胆嚢に一時貯蔵され、小腸内の十二指腸で脂肪の消化作用を助ける弱アルカリ性の緑褐色の液体であり、脂肪質を乳化して消化、吸収を助ける様々な酵素を含む。このような胆汁は、経口で摂取されたプロバイオティクスに対しても作用するので、プロバイオティクス投与効果を減少させる主要原因の一つとなる。

具体的には、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は、豚流行性下痢ウイルスが発生した韓国の農場の母豚、子豚の糞便及び初乳から分離して得たものである。本出願の菌株の形態学的特徴はグラム陽性桿菌であり、配列番号１の１６ｓｒＤＮＡ塩基配列を有する。前記塩基配列を分析した結果、ラクトバチルス・プランタルムと９９％の相同性を示した。よって、本発明者らは、新規に分離したラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７を２０１８年４月１３日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms）に寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託した。

本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は、長期間安定して保存するために、水にグリセリン成分を所定量混合して作製した保存液に菌体を浮遊させて－７０℃で保管するか、滅菌した１０％脱脂乳に懸濁して凍結乾燥してもよい。

前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は、病原性微生物に対する抗菌活性を有するものであってもよい。

本出願における「抗菌」とは、病原性微生物を含む菌の生育又は増殖を抑制し、菌の感染を予防又は治療する活性を意味する。

本出願で「病原性微生物（pathogenic microorganism）」とは、人体に寄生することにより疾患を引き起こす微生物を意味する。「病原性」とは、病原体が宿主に感染して疾病を引き起こす能力を意味し、細菌又は酵母の浸透性、増殖性、毒素生産性などを総称する。前記病原性微生物の例として、大腸菌（E.coli）、腸管毒素原性大腸菌（Enterotoxigenic E. coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）及びビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahemolyticus）からなる群から選択される少なくとも１つの病原性微生物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は病原性微生物に対する抗菌活性を有するが、一般の全てのラクトバチルス属微生物が病原性微生物に対する抗菌活性を有するわけではない。

本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は、赤血球に対する溶血性を示さないものであってもよい。溶血とは、赤血球が破壊されてヘモグロビンが外部に流出することを意味し、生体内の有害菌から産生された酵素により赤血球が溶血する。よって、前記ＣＪＬＰ１７は、生体内に投与されても血管内で溶血を起こさない安定した微生物に該当する。

また、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は、抗生剤に対する耐性が弱いか、ないものであってもよい。前記抗生剤は、具体的にはアンピシリン、クリンダマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、エリスロマイシン、アンピシリン／スルバクタム、クロラムフェニコール又はストレプトマイシンであってもよいが、これらに限定されるものではない。よって、前記ＣＪＬＰ１７を医薬品、機能性食品、飼料添加剤などに用いても、抗生剤に対する耐性がないので、それによる薬理効果や環境面で問題となる可能性が低い。

前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は、免疫細胞の活性化を促進してサイトカインの分泌量を増加させるか、生体内に投与されて免疫機能を促進するものであってもよい。

前記「免疫細胞」とは、生体内の免疫機能に関与するあらゆる細胞を意味し、大きくＴ細胞とＢ細胞に分けられる。前記免疫細胞には、Ｔｈ１又はＴｈ２細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。本出願の前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は、免疫細胞を刺激してＩＬ－１２、ＩＬ－１０及び／又はＴＧＦ－ｂｅｔａなどのサイトカインの分泌量を増加させる活性を有してもよい。

一般に、高い斃死率を示すウイルス性疾病においては、ウイルスによる細胞や組織自体の壊死により、他の菌株の２次感染及び敗血症、過度に活性化した免疫反応による炎症疾患、又は食欲低下及び脱水症が発生する。よって、ウイルス感染を抑制する抗ウイルス効能（Ｔｈ１、Ｔｈ２関連）と、２次感染と過度な炎症反応を調節する免疫反応（Ｔｈ２，Antiinflammation）が同時に増強されると、効果的なウイルス性疾病の予防及び治療効果が得られる。このようにプロバイオティクスによる免疫増強効能において、Ｔｈ１とＴｈ２を同時に増強する菌株は公知ではなく、本発明者により新たに見出されたものである。

前記サイトカインとは、身体防御システムを制御して刺激する信号物質として用いられる糖タンパク質を意味し、例えばＩＬ－１２、ＩＬ－１０又はＴＧＦ－ｂｅｔａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

前記菌株は、家畜に経口投与すると、家畜の成長を促進するか、下痢発生率を低下させるものであってもよい。

前記菌株は、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する抗ウイルス活性を有するものであってもよい。

前記豚流行性下痢ウイルスは、豚の小腸細胞に感染するコロナウイルスであり、激しい下痢及び脱水症を伴う豚流行性下痢を誘発する。本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物で処理すると、前記豚流行性下痢ウイルスの活性及び感染が著しく抑制されるので、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む組成物は、豚流行性下痢ウイルスに対する抗ウイルス用組成物、又は豚流行性下痢の予防もしくは治療用薬学組成物、予防もしくは改善用機能性食品、医薬部外品もしくは飼料組成物として活用することができる。

本出願の他の態様は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む組成物を提供する。前記菌株の詳細については前述した通りである。

本出願の新規に分離した菌株は、通常のラクトバチルス菌株の培養方法で培養することができる。培地としては、天然培地又は合成培地を使用してもよい。培地の炭素源としては、例えばグルコース、スクロース、デキストリン、グリセリン、スターチなどが用いられ、窒素源としては、ペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥酵母、大豆、アンモニウム塩、ナイトレート、及びその他有機もしくは無機窒素含有化合物が用いられてもよいが、これらの成分に限定されるものではない。培地に含まれる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カリウムなどが用いられるが、これらに限定されるものではない。前記炭素源、窒素源及び無機塩の成分以外に、アミノ酸、ビタミン、核酸及びそれに関する化合物が培地に添加されてもよい。本出願の新規に分離した菌株は、培養温度条件を２０～４０℃の温度範囲として１２時間～４日間培養することができる。

具体的には、新規に分離した菌株の培養液は、菌体を含む培養原液であってもよく、また、培養上清を除去した菌体や濃縮した菌体であってもよい。前記培養液の組成は、通常のラクトバチルス培養に必要な成分だけでなく、ラクトバチルスの生長に相乗的に作用する成分をさらに含んでもよく、それらの組成は当該技術分野において通常の技術を有する者が容易に選択することができる。

さらに、菌株の状態は、液状状態又は乾燥状態であってもよく、乾燥方法としては、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥及び凍結乾燥が用いられるが、これらに限定されるものではない。

前記組成物におけるラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の濃度は、これに限定されるものではないが、１０^３ＣＦＵ／ｍｌ～１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、１０^４ＣＦＵ／ｍｌ～１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、１０^５ＣＦＵ／ｍｌ～１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、１０^６ＣＦＵ／ｍｌ～１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、１０^３ＣＦＵ／ｍｌ～１０^７ＣＦＵ／ｍｌ、１０^４ＣＦＵ／ｍｌ～１０^７ＣＦＵ／ｍｌ、１０^５ＣＦＵ／ｍｌ～１０^７ＣＦＵ／ｍｌ、１０^６ＣＦＵ／ｍｌ～１０^７ＣＦＵ／ｍｌであってもよい。

前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含んでもよい。より具体的には、前記組成物は、グリセリン、トレハロース、マルトデキストリン、脱脂粉乳及びデンプンからなる群から選択される少なくとも１つの凍結保護剤、並びに／又はグルコース、デキストリン及び脱脂牛乳からなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤をさらに含んでもよい。本出願の凍結保護剤は、前記組成物の総重量に対して０．０１重量％～２０重量％、０．０１重量％～１０重量％含まれてもよく、具体的には、前記グリセリンは５重量％～２０重量％、前記トレハロースは２重量％～１０重量％、前記マルトデキストリンは２重量％～１０重量％、前記脱脂粉乳は０．５重量％～２重量％、前記デンプンは０．１重量％～１重量％の割合で前記組成物に含まれてもよい。また、前記賦形剤は、前記組成物の総重量に対して７５重量％～９５重量％、又は８５重量％～９５重量％含まれてもよい。

また、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む組成物を製造する方法は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物と添加剤を混合するステップを含んでもよい。前記添加剤は、前述した凍結保護剤又は賦形剤であってもよい。

本出願のさらに他の態様は、本出願の新規分離した菌株又は培養物を有効成分として含むプロバイオティクス製剤を提供する。

プロバイオティクスは、腸内の消化管の壁に定着して有害菌の定着を抑制し、ウイルスの増殖を抑制する。また、プロバイオティクスが産生する有益な消化酵素は、栄養素の吸収と利用を容易にすることにより成長を促進する。

前記組成物は、食品、機能性食品、飼料、飼料添加剤、化粧料組成物、薬学的組成物及び医薬部外品からなる群から選択されるものであってもよい。

前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む組成物は、病原性微生物に対する抗菌用であってもよい。前記菌株、病原性微生物、抗菌については前述した通りである。

具体的には、前記病原性微生物は、大腸菌（E.coli）、腸管毒素原性大腸菌（Enterotoxigenic E. coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）及びビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahemolyticus）からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。

前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む組成物は、免疫増強用であってもよい。

本出願のさらに他の態様は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む飼料添加剤又は飼料組成物を提供する。

ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株については前述した通りである。具体的には、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株は、抗菌、成長促進、下痢率減少、ウイルス活性抑制のために、飼料添加剤又は前記飼料添加剤を含む飼料組成物に添加されてもよい。

本出願における「飼料添加剤」には、栄養素補充及び体重減少予防、飼料中の繊維素の消化利用性向上、乳質改善、繁殖障害予防及び受胎率向上、夏期高温ストレス予防など様々な効果を目的として飼料に添加する物質が含まれる。本出願の飼料添加剤は、飼料管理法上の補助詞料に該当し、炭酸水素ナトリウム、ベントナイト（bentonite）、酸化マグネシウム、複合鉱物質などの鉱物質製剤、亜鉛、銅、コバルト、セレンなどの微量鉱物質であるミネラル製剤、カロテン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、ニコチン酸、ビタミンＢ複合体などのビタミン剤、メチオニン、リシンなどの保護アミノ酸剤、脂肪酸カルシウム塩などの保護脂肪酸剤、生菌剤（乳酸菌剤）、酵母培養物、カビ発酵物などの生菌、酵母剤などがさらに含まれてもよい。

本出願における「飼料」とは、動物が食べて摂取し、消化させるための、又はそれに適した任意の天然又は人工の規定食、一食など、又は前記一食の成分を意味し、本出願による代謝疾患の予防又は治療用組成物を有効成分として含む飼料は、当該技術分野で公知の様々な形態の飼料に製造することができ、具体的には濃厚飼料、粗飼料及び／又は特殊飼料に製造することができる。

飼育対象には、本出願の飼料を摂取できる生命体が全て含まれ、本出願の目的上、豚が含まれる。

本出願による飼料組成物内のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株の含有量は、適用家畜の種類及び年齢、適用形態、目的とする効果などに応じて適宜調節することができ、例えば０．０１～２０重量％であるが、これに限定されるものではない。

本出願の飼料組成物は、投与のために、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸などの有機酸、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、重合リン酸塩などのリン酸塩、ポリフェノール、カテキン、トコフェロール、ビタミンＣ、緑茶抽出物、キトサン、タンニン酸などの天然抗酸化剤の少なくとも１種をさらに混合して用いてもよく、必要に応じて抗インフルエンザ剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤又は滑沢剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化してもよい。

さらに、本出願の飼料組成物は、補助成分としてのアミノ酸、無機塩類、ビタミン、抗酸化剤、抗真菌剤、抗菌剤などの各種補助剤、及び粉砕又は破砕したコムギ、オオムギ、トウモロコシなどの植物性タンパク質飼料、血粉、肉粉、魚粉などの動物性タンパク質飼料、動物性脂肪、植物性脂肪などの主成分以外にも、栄養補充剤、成長促進剤、消化吸収促進剤、疾病予防剤と共に用いてもよい。

本出願の飼料組成物を飼料添加物として用いる場合は、前記飼料組成物をそのまま添加してもよく、他の成分と共に用いてもよく、通常の方法で適宜用いられてもよい。飼料組成物の投与形態は、非毒性の製薬上許容される担体と組み合わせて即時放出又は徐放性剤形を用いてもよい。このような食用担体は、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、プロピレングリコールであってもよい。固体担体の場合は錠剤、散剤、トローチ剤などの投与形態であってもよく、液体担体の場合はシロップ剤、液体懸濁液剤、エマルジョン剤、溶液剤などの投与形態であってもよい。また、投与剤は、保存剤、滑沢剤、溶解促進剤、安定化剤を含有してもよく、他の炎症疾患改善剤及びウイルス予防上有用な物質を含有してもよい。

本出願による飼料組成物は、家畜飼料に乾燥重量で１ｋｇ当たり約１０～５００ｇ、具体的には１０～１００ｇの量で混合してもよく、完全に混合してからマッシュで供給してもよく、追加加工工程によりペレット化、膨張化、押出工程を経てもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願のさらに他の態様は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む食品組成物又は機能性食品を提供する。

具体的には、本出願の組成物は、抗菌用途、成長促進、免疫促進、下痢率減少、ウイルス活性抑制のために、食品組成物に添加されてもよい。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７については前述した通りである。食品組成物は、食品学的に許容される担体を含んでもよい。

本出願の食品組成物には、機能性食品（functional food）、栄養補助剤（nutritional supplement）、健康食品（health food）、食品添加剤（food additives）などのあらゆる形態が含まれ、前記タイプの食品組成物は、当該技術分野で公知の通常の方法で様々な形態に製造することができる。

ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株を食品添加物として用いる場合は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株をそのまま添加してもよく、他の食品又は食品成分と共に用いてもよく、通常の方法で適宜用いられる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康又は治療的処置）に応じて適宜決定されてもよい。一般に、食品又は飲料の製造時に、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株を含む原料組成物中に０．０００１～１重量％、具体的には０．００１～０．１重量％の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的とするか、又は健康調節を目的とする長期間の摂取においては、前記量は前記範囲以下であってもよい。

前記食品の種類は、特に限定されるものではない。前記物質を添加する食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類をはじめとする乳製品、各種スープ、清涼飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤などが挙げられ、通常の意味における健康食品が全て含まれる。

本出願の健康飲料組成物は、通常の飲料のように、様々な香味剤や天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。前述した天然炭水化物は、グルコース、フルクトースなどの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類、デキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、ソーマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味剤などを用いることができる。前記追加成分の割合は、本出願の組成物１００重量部当たり０．０１～０．０４重量部、具体的には０．０２～０．０３重量部であってもよい。

前記以外に、本出願の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド、増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有してもよい。これらの添加剤の割合はそれほど重要でないが、本出願の組成物１００重量部当たり０．０１～０．１重量部の範囲で選択されるのが一般的である。その他に、本出願の組成物は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。これらの果肉の割合はそれほど重要でないが、本出願の組成物１００重量部当たり０．０１～１０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。これらの成分は独立して又は組み合わせて用いることができる。

本出願における前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む組成物を対象に投与するステップを含んでもよい。前記投与により、本出願の対象に対して組成物の効能、すなわち病原性微生物に対する抗菌活性、免疫増強活性などを発揮することができる。

前記対象には、ヒトを除く動物、又はヒトを含む動物が含まれてもよい。前記動物には、ヒトだけでなく、前記効能の発揮を必要とするあらゆる動物が含まてもよく、具体的にはウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌ、ネコなどの哺乳動物が含まてもよく、その他ペットが含まれてもよい。

前記投与における投与量は、これらに限定されるものではないが、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７に換算して１０^６ＣＦＵ／日以上、１０^７ＣＦＵ／日以上、１０^８ＣＦＵ／日以上、１０^９ＣＦＵ／日以上、１０^１０ＣＦＵ／日以上であってもよい。

以下、実施例を挙げて本出願の構成及び効果をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。

菌株の分離及び選択
１－１．試料確保及び菌株の分離
ＰＥＤＶが慢性的に発生した韓国の農場の母豚、子豚の糞便サンプル及び初乳サンプルを確保した。確保した試料を段階的に希釈してＭＲＳ及びＢＨＩ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した。各試料から分離した菌株を新たな培地に移して培養する方法で純粋分離し、２０％グリセリンを添加した栄養培地に純粋分離して培養した菌を接種し、零下７０℃以下で保存した。その結果、全１，５５２種の菌株を確保し、以下の実施例により、優れた抗ウイルス活性などを有する菌株を選択した。

１－２．菌株の耐酸性及び耐胆汁性の評価
プロバイオティクスとして活用できる菌株を選択するために、前記確保した菌株に対して耐酸性及び耐胆汁性に関する活性評価を行った。

耐酸性の評価のために、人工胃液培地を作製した。より具体的には、前記人工胃液培地は、ＭＲＳ液体培地にペプシンを添加してｐＨ２．５になるように調整し、その後滅菌して準備した。

実施例１－１の菌株を２回継代培養し、その後ＭＲＳ液体培地にて温度３７℃で１８時間静置培養した。前記人工胃液培地に前培養した菌株を１％接種して３７℃で静置培養し、０時間及び３時間経過時点で培養液をサンプリングした。サンプリングした培養液を段階的に希釈してＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養して生菌数を測定した。

耐胆汁性の評価のために、人工胆汁液培地を作製した。より具体的には、前記人工胆汁液培地は、０．５％ｏｘｇａｌｌ（雄牛の胆汁）を添加したＭＲＳ液体培地を滅菌して準備した。

実施例１－１の菌株を２回継代培養し、その後ＭＲＳ液体培地にて温度３７℃で１８時間静置培養した。前記人工胆汁液培地に前培養した菌株を１％接種して３７℃で静置培養し、０時間及び２４時間経過時点で培養液をサンプリングした。サンプリングした培養液を段階的に希釈してＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養して生菌数を測定した。

前記評価により、最も耐酸性及び耐胆汁性に優れる菌株であるＣＪＬＰ１７を選択した。選択した菌株は、以下の実施例に示すように、ラクトバチルス・プランタルムとして同定された。前記ＣＪＬＰ１７菌株の耐酸性及び耐胆汁性を従来公知の菌株と比較するために、韓国微生物保存センターから分譲されたラクトバチルス・プランタルム標準菌株（ＫＣＣＭ１２１１６）の耐酸性及び耐胆汁性を前記と同様の方法で評価した。

表１及び表２に示すように、ラクトバチルス・プランタルム標準菌株（ＫＣＣＭ１２１１６）は、人工胃液培地及び人工胆汁培地において菌株数が減少した。よって、一般に知られている全てのラクトバチルス・プランタルムが耐酸性及び耐胆汁性を有するわけではないことが分かる。

それに対して、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７は、両培地において菌株数が逆に増加したので、耐酸性及び耐胆汁性に優れる菌株であることが分かる。

１－３．菌株の形態学的及び生化学的特性の調査
前記ＣＪＬＰ１７菌株の同定のために、１次的に形態学的、生化学的調査を行った。形態学的な特徴として、グラム染色の結果、グラム陽性であり、電子顕微鏡撮影の結果、桿菌であることが確認された（図１）。生化学的特性を分析するために、ＡＰＩ５０ＣＨＬｓｙｓｔｅｍ（biomerieux Vitek, Inc., フランス）により菌株の糖発酵パターンを分析した（表３）。

１－４．菌株の同定
菌株をより正確に同定するために、ＤＮＡ塩基配列による分子系統分類学的方法を用いた。塩基配列分析は、ＰＣＲｐｒｅｍｉｘ（バイオニア，韓国）とユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’ ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ３’）、１４９２Ｒ（５’ ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３’）を用いて、１６ｓｒＤＮＡの遺伝子を増幅した。遺伝子増幅時の総反応液量を２０μｌとし、９４℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間を計３０回繰り返し、増幅したＤＮＡ塩基配列を分析した。分離菌株の分析された１６ｓｒＤＮＡの塩基配列は、配列番号１の通りである。

前記分析の結果、ＣＪＬＰ１７はラクトバチルス・プランタルムと９９％の相同性を有する微生物であると同定された。よって、前記分離した菌株を「ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７」と命名した。このように同定した新規微生物を韓国微生物保存センターに２０１８年４月１３日付けでラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７として寄託した（寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐ）。

ＣＪＬＰ１７の抗菌活性特性の分析
病原性微生物として大腸菌（E.coli）、腸管毒素原性大腸菌（Enterotoxigenic E. coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）及びビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahemolyticus）を準備し、それら病原性微生物に対するＣＪＬＰ１７の抗菌活性評価を行った。

ＣＪＬＰ１７をＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間静置培養した。前記病原性微生物のうち大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフィムリウム及び黄色ブドウ球菌はＢＨＩ液体培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１８時間培養し、ビブリオ・パラヘモリティカスは３％Ｎａｃｌを添加したＬＢ液体培地に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで１８時間培養した。

ＭＲＳ固体培地にＣＪＬＰ１７の培養液１０μｌをスポッティングして乾燥させ、その後３７℃で１８時間前培養した。前記病原性微生物の培養液をＢＨＩ固体培地１０ｍｌにそれぞれ１％接種し、その後それを前記ＣＪＬＰ１７が前培養されたＭＲＳ固体培地に注入して完全に固化させた。その後、３７℃で２４時間培養し、形成された環の大きさを測定した。環の大きさが大きいほど抗菌活性が高いことを意味する。抗菌活性を比較するために、ラクトバチルス・プランタルム標準菌株（ＫＣＣＭ１２１１６）の抗菌活性を前記と同様の方法で評価した。

前記方法で環の大きさを測定した結果、表４に示すように、ＣＪＬＰ１７は全ての病原性微生物においてラクトバチルス・プランタルム標準菌株に比べて抗菌活性に優れることが確認された。

菌株の安定性の評価
３－１．菌株の溶血性の確認
β－溶血とは、赤血球により供給されるリン脂質が有害菌から産生されたリン脂質酵素により加水分解され、結果として赤血球が溶血する作用を意味する。ＣＪＬＰ１７の溶血性を調べるために、血液寒天平板培地（sheep blood 5% agar, （株）ハンイルコメッド, 韓国）を用いた。準備した血液寒天平板培地に画線接種（streaking）し、３７℃で２４時間培養して溶血の有無を確認した。

その結果、図２に示すように、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株は溶血性を示さないことが確認された。

３－２．抗生剤感受性の評価
ＣＪＬＰ１７をＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間静置培養した。培養した菌を滅菌綿棒につけてＭｕｅｌｌｅｒＨｉｎｔｏｎＩＩ固体培地（Difco）に塗抹し、その後前記培地上に抗生剤ディスクを載せて３７℃で２４時間培養した。抗生剤検査のための抗生剤ディスクとしては、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、ｋａｎａｍａｙｃｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ／ｓｕｌｂａｃｔａｍ、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎディスク（Oxoid, 英国）を準備して用いた。

ＣＪＬＰ１７の抗生剤感受性検査の結果、ＣＪＬＰ１７は前記抗生剤に対する耐性がないことが確認された（表５）。よって、ＣＪＬＰ１７を医薬品、機能性食品、飼料添加剤などに用いても、抗生剤に対する耐性がないので、それによる耐性問題や環境的問題は発生する可能性が低いことが分かる。

細胞毒性の評価
前記菌株が細胞の生存に及ぼす影響を調べるために、ＭＴＳ分析方法（3-(4,5-dimethyl-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, promega, USA）を用いて、ＩＰＥＣ－Ｊ２（ブタ腸上皮細胞，intestinal pig epithelium cells）細胞上で細胞毒性水レベルを評価した。各細胞を９６ウェル細胞培養プレートで培養し、その後各濃度（１０^３～１０^８ＣＦＵ／ｗｅｌｌ）のＣＪＬＰ１７で処理して培養した。２４時間後に細胞培養液にＭＴＳ溶液を添加して２時間培養し、マイクロプレートリーダにて波長４９０ｎｍで吸光度を測定して細胞生存率（％）を計算した。

その結果、図３に示すように、６つの濃度で処理した場合、１０^７ＣＦＵ／ｍｌ以下の濃度では細胞死滅がほとんど起こらず、１０^８ＣＦＵ／ｍｌでは約８０％の細胞生存率を示すことが確認された。よって、ＣＪＬＰ１７は実質的に１０^７ＣＦＵ／ｍｌ以下の濃度で細胞毒性をほとんど示さないことが分かる。

免疫増強活性の評価
ＣＪＬＰ１７菌株の免疫増強効果を確認するために、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）培地でＩＰＥＣ－Ｊ２細胞を培養した。また、２１日齢の離乳子豚から腸間膜リンパ節細胞（lymphocytes in mesenteric lymph nodes）、末梢血単核細胞（PBMC, peripheral blood mononuclear cell）、パイエル板細胞（PP, Cells in peyer’s patch）及び脾臓細胞（Splenocytes）を採取し、各組織及び血液から次の方法で免疫細胞を得た。

脾臓及び腸間膜リンパ節組織から免疫細胞を得るために、細断（chopping）した組織を注射器のプランジャー（plunger）と７０マイクロメートルのセルストレーナー（Cell strainer）（BD Falcon）を用いて粉砕し、その後ＲＰＭＩ－１６４０（Roswell Park Memorial Institute-1640, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA）培地を用いて細胞を洗浄した。最後の洗浄の前の段階において、ＲＢＣｌｙｓｉｓバッファ（eBioscience, USA）を用いて残存するＲＢＣ（赤血球）を除去した。最後の洗浄の後に収集した免疫細胞をトリパンブルー（Trypan blue）で染色し、血球計算盤（hemocytometer）でカウントして用いた。

パイエル板細胞を得るために、小腸から当該組織を分離して手術用はさみで細断及び粉砕し、その後ＤｎａｓｅＩ（Roche, Germany）、ＤｉｓｐａｓｅＩＩ（Sigma aldrich, USA）、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、ＦＢＳ、１５ｍＭ４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（ｐＨ７．２）で１時間反応させて単一細胞を得た。その後、前記と同様の方法で免疫細胞を得た。

採取した血液は、ＰＢＳと１：１で混合してＦｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰｌｕｓ（GE healthcare Life Sciences, NJ, USA）上に載せ、遠心分離によりＷＢＣ（白血球）凝集層を分離した。分離した層から、前記と同様の方法で末梢血単核細胞を得た。

免疫増強効果を評価するために、当該菌株（ＣＪＬＰ１７）と前記方法で得られた各免疫細胞を１０：１で混合し、その後５％ＣＯ_２を含有する３７℃の細胞培養器で２０時間培養した。培養終了時に遠心分離し、その後サイトカインＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）を用いて培養上清の免疫活性効果を評価した。より具体的には、外部侵入因子（Pathogen）に対する防御機能を有するＴｈ１（T helper 1）関連免疫メカニズムを活性するＩＬ－１２（interleukin-12）に対するＥＬＩＳＡ（R&D Systems, USA）を行った。全身免疫におけるＴｈ１、Ｔｈ２免疫反応を評価するために、ＩＬ－１２とＩＬ－１０においては脾臓細胞と末梢血単核球を用い、腸内における抗炎反応をより正確に測定するために、パイエル板細胞と腸間膜リンパ球を用いてＴＧＦ－ｂｅｔａＥＬＩＳＡ試験を行った。

ＩＬ－１２、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－ｂｅｔａを測定した結果をそれぞれ図４～図６のグラフに示す。各グラフにおいて、対照群としては、菌株処理を行っていない陰性対照群を用いた。

その結果、図４～図６に示すように、ＣＪＬＰ１７菌株は免疫細胞を刺激してＩＬ－１２、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－ｂｅｔａの分泌量を増加させる活性を有することが確認された。よって、ＣＪＬＰ１７がＴｈ１免疫メカニズムだけでなく、Ｔｈ２免疫メカニズムを同時に増強する効果を発揮することが分かる。

ウイルス感染抑制効果
ＣＪＬＰ１７菌株のウイルス感染抑制効果を測定するために、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ，ＳＭ９８又はＫＰＥＤＶ９菌株）を準備した。具体的には、前記ウイルスをＶｅｒｏ（ＣＣＬ－８１，アフリカミドリザル由来腎臓上皮細胞）細胞で増殖培養し、前記Ｖｅｒｏ細胞を培養するための培地としてＭＥＭ（Eagle's Minimum Essential Medium, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA）、熱処理により不活性化した１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum, ｖ／ｖ）、１％（ｖ／ｖ）ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを用いた。前記Ｖｅｒｏ細胞を単層培養し、その後培地で２回洗浄して全溶液を除去した。５μｇ／ｍｌＴＰＣＫ（N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone）で処理したトリプシンを含むＦＢＳ無添加のＭＥＭに０．１ＭＯＩ（Multiplicity of infection）レベルのウイルスを混合し、その最小量を用いて準備した培養細胞を処理し、その後５％ＣＯ_２を含有する３７℃の細胞培養器で２～３日間培養した。

ウイルス感染の有無は、ウイルスシンシチウム（virus syncytium）形成の有無により判断した。シンシチウムが形成された場合は、３～６時間以内にウイルス培養液を回収し、遠心分離機にて細胞を除去して－８０℃で保管した。ウイルス感染力価の計算においては、９６－ｗｅｌｌプレートでＶｅｒｏ細胞を２×１０^４ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌのレベルに培養して細胞をＰＢＳで洗浄し、その後ウイルスを２倍連続希釈した培養液を入れて２４～４８時間培養してウイルス感染の有無を確認し、Ｒｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ法によりウイルス感染力価を計算した。

ＣＪＬＰ１７菌株のウイルス感染抑制効果を測定するために、ＣＪＬＰ１７菌株と実施例５で抽出した４種の免疫細胞を２０～２４時間反応させて培養液を得た。前記培養液を用いて、ＩＰＥＣ－Ｊ２が培養された９６ウェル細胞培養プレートをそれぞれ処理し、５％ＣＯ_２を含有する３７℃の細胞培養器で２～４時間培養した。それぞれのプレートに１００ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ（50% of tissue cell infectious dose）のＰＥＤウイルス（ＳＭ９８又はＫＰＥＤＶ９）をスポッティングし、その後４８時間培養した。ウイルス感染の有無を確認するために、培養終了後に細胞培養プレートをメタノールで固定してクリスタルバイオレットで染色し、その後細胞変性したウェルを顕微鏡で確認し、ウイルス感染の有無を判断した。

その結果、表６及び図７に示すように、豚免疫細胞とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７で処理すると、菌株により免疫細胞が活性化されてウイルス感染が明確に抑制される効果が確認された。よって、免疫細胞とＣＪＬＰ１７で共に処理すると、ＰＥＤウイルスに対する優れた抗ウイルス活性を示すことが分かる。

家畜の成長及び下痢に及ぼす効果の確認
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７を経口投与した際の成長成績及び下痢率に及ぼす影響を確認するために次の実験を行った。

２１日齢の離乳子豚３２頭を購入し、３１±１℃、湿度５０％が保持されるインキュベーターで１４日間飼育した。飼料としては抗生剤を添加していない一般のクランブル飼料を供給し、水は無制限に与えた。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７を凍結乾燥粉末の形態に作製して冷蔵保管しておき、経口投与のために１日に１頭当たり１０^１０ＣＦＵ／日ずつ摂取できるようにクランブル飼料に均一に混合した。このような全１４日間の離乳子豚飼養試験により、前記菌株が子豚の生産性及び下痢／軟便発生率に及ぼす影響を図８、図９に示す。

その結果、ＣＪＬＰ１７を含む飼料を給餌した処理区の離乳子豚の平均日増体量（mean value of ADG）が対照群より優れることが確認された（図８）。また、ＣＪＬＰ１７を含む飼料を給餌した処理区において、対照群に比べて４８％の下痢率改善効果が現れることが確認された（図９）。

よって、ＣＪＬＰ１７は、家畜の成長、すなわち生産性を向上させるだけでなく、下痢発生率を大幅に低下させる効果を発揮することが分かる。

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims

耐酸性、耐胆汁性及び免疫増強活性を有する、寄託番号ＫＣＣＭ１２２４９Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ１７菌株であって、前記菌株は、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する抗ウイルス活性を有する、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株。
前記菌株は、病原性微生物に対する抗菌活性を有する、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株。
前記病原性微生物は、大腸菌（E.coli）、腸管毒素原性大腸菌（Enterotoxigenic E. coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）及びビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahemolyticus）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株。
前記菌株は、免疫細胞の活性化を促進してサイトカインの分泌量を増加させる、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株。
前記サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０又はＴＧＦ－ｂｅｔａである、請求項４に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株。
前記菌株は、家畜に経口投与すると、家畜の成長を促進するか、下痢発生率を低下させる、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株。
請求項１に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む組成物。
前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
前記凍結保護剤は、グリセリン、トレハロース、マルトデキストリン、脱脂粉乳及びデンプンからなる群から選択される少なくとも１つであり、前記賦形剤は、グルコース、デキストリン及び脱脂牛乳からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の組成物。
前記組成物は、病原性微生物に対する抗菌活性を有する、請求項７に記載の組成物。
前記病原性微生物は、大腸菌（E.coli）、腸管毒素原性大腸菌（Enterotoxigenic E. coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）及びビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahemolyticus）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１０に記載の組成物。
前記組成物は免疫を増強する、請求項７に記載の組成物。
請求項１に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む飼料添加剤。
請求項１に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ１７菌株又はその培養物を含む機能性食品。