JP6931718B2 - 抗ウイルス効果及び免疫調節効能を有するラクトバチルス・プランタルムｃｊｌｐ４７５菌株及びそれを含む組成物 - Google Patents

Description

本出願は、耐酸性、耐胆汁性及び免疫増強活性を有するラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株に関し、特にラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株又はその培養物を含む組成物、飼料添加剤、食品、化粧品及び医薬品に関する。

現在の畜産業界においては、伝染性の高いウイルス性疾患により家畜が斃死し、それに伴って農家に経済的被害が発生することが多い。特に、養豚産業において、４大慢性消耗性疾患である豚呼吸器病症候群（porcine respiratory disease complex）、離乳後全身性消耗症候群（Postweaning multisystemic wasting syndrome）、豚生殖器・呼吸器症候群（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome）、豚流行性下痢（Porcine epidemic diarrhea）などのウイルスや細菌による感染性疾患により莫大な経済的損失が発生している。

前記豚流行性下痢は、コロナウイルス科（corona virus family）に属する豚流行性下痢ウイルス（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）の感染により発生する豚消化器疾患である。前記ウイルスは、小腸や大腸の絨毛細胞で増殖し、全ての日齢の豚、特に子豚において急性腸炎、嘔吐、水様性下痢を誘発する。特に、１１月から４月までの主に冬期に被害が深刻であり、生後１週齢以内の哺乳子豚の斃死率は約５０％に達し、重篤な場合は激しい脱水により斃死率が約１００％に達することが知られている。

ＰＥＤウイルスは１９７１年にヨーロッパで初めて観察され、１９７６年にベルギーでＧ１ａ ｔｙｐｅ ＰＥＤＶ ＣＶ７７７がさらに検出及び分離され、８０年代にヨーロッパで流行し、９０年代に中国、韓国、日本、台湾などの東アジア地域で発生した。また、前記Ｇ１ａ ｔｙｐｅより病原性の高いＧ２ｂ ｔｙｐｅ ＰＥＤＶが２０１０年に中国をはじめとして発生した。前記新種ｔｙｐｅのＰＥＤＶは、北米地域（米国，カナダ）だけでなく、東南アジア、ヨーロッパでも発生して大きな被害をもたらした。２０１３年には米国養豚産業において生産性損失により約２兆２，０００億韓国ウォンの被害が発生し、韓国においては現在年間２０〜４０％の農家で毎年発生し、それにより子豚全体の６％が斃死すると報告されている。さらに、屠殺場出入車両の感染率が約６０％に達すると報告されている（韓国農村経済研究院，韓国養豚獣医師協会）。

現在までＧ２ｂ ｔｙｐｅ ＰＥＤウイルスに対する根本的な予防は、徹底して消毒する方法が唯一であった。多くの農場でウイルス疾患による被害を予防するために、人工感染法を用いたり、従来のＧ１ａ ｔｙｐｅ ＰＥＤＶワクチンを接種しているが、Ｇ２ｂ ｔｙｐｅ ＰＥＤＶ感染を予防するには限界がある。前記問題を補完するために、ＰＥＤウイルス予防（ワクチンなど）及び治療（ＩｇＹ、精油（Essential oil）、有機酸、プロバイオティクスなど）用製剤の開発が盛んに行われており、最近は特に抗ウイルス効果を有すると共に生体内の免疫系を刺激する機能性素材を用いて免疫を増強する方法が研究されている。

免疫は、一般に先天性免疫（Innate immunity）と後天性免疫（Adaptive immunity）に分けられる。先天性免疫は、病原体の感染を第一線で速やかに防御するシステムであり、侵入因子（抗原）に直接作用したり、後天性免疫を誘導する。後天性免疫は、より複雑で精密なシステムであり、侵入因子を認知して除去したり、当該侵入因子に対する記憶などの作用を有し、先天性免疫に比べてより永久的な免疫作用を有する。先天性免疫に関する抗原提示細胞（Antigen-presenting cells）である樹状細胞（Dendritic cells, DCs）、マクロファージ（Macrophages）、ナチュラルキラー細胞（natural killer cells）などは、直接の先天性免疫作用を有し、各種Ｔ細胞の活性を促進する受容体を有するので、それを介してサイトカイン（cytokines）を分泌する。後天性免疫は、体内に侵入した抗原に対する２次防御システムであり、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球により起こる特異的免疫反応である。抗原により活性化するＴ細胞の免疫反応としては、細胞傷害性Ｔ細胞（Cytotoxic T cell）反応、ヘルパーＴ細胞（Helper T cell, Th）反応などが挙げられる。先天性免疫に関する樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞などにおいても、外部侵入物質を認知してＩＬ−１２やＩＬ−４などの各種サイトカインを分泌し、宿主動物の免疫を適切に変化させる反応を引き起こして免疫防御メカニズムを好ましい方向に導く。Ｔ細胞の前駆体の役割を果たすＮａｉｖｅ ＣＤ４ Ｔ細胞は、中心的なサイトカインにより分化が決定されるが、高濃度のＩＬ−１２（interleukin-12）が存在する場合は、Ｔｈ１（T helper 1）細胞分化を促進し、細胞内病原体（intracellular pathogen）を退治するＣＴＬ（Cytotoxic T lymphocyte）反応を誘導する。ＩＬ−４（interleukin-4）が高濃度の場合は、外部侵入物質を特異的に退治する（Ｂ細胞の抗体分泌）反応を誘導する。また、前述した免疫細胞は、炎症反応などの過度の免疫反応を抑制するためにＴＧＦ−ｂｅｔａ（Beta transforming growth factor）とＩＬ−１０を分泌したり、過度の免疫反応を抑制するためにＴＧＦ−ｂｅｔａを分泌することによりｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ細胞を活性化したり、ＴＧＦ−ｂｅｔａやＩＬ−６（interleukin-6）などの分泌によりＢ細胞をプラズマ細胞に変形させて抗体生成を促進したり、誤った自己免疫と外部侵入物質を退治する免疫反応（Ｔｈ１７）を誘導するなど、精巧かつ複雑な過程を経て体内に侵入した因子に対して適宜対応する。しかし、時にこのような免疫反応において均衡が取れないこともあり、免疫反応が不十分なこともあるので、適切な免疫増強剤をさらに必要とする。

本発明者らは、前記ウイルスに抑制活性を示すと共に免疫系を活性化する新規な微生物を分離及び同定してその活性を確認し、本出願を完成した。

本出願は、寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株を提供することを目的とする。

また、本出願は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む組成物を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む飼料又は飼料添加剤を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む食品を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む化粧品を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む医薬品を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記菌株又は前記組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、個体の免疫増強方法を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記菌株又は前記組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、個体のウイルス感染疾患の予防又は治療方法を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株のウイルス感染疾患の予防又は治療用途を提供することを目的とする。

本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、耐酸性、耐胆汁性に優れるのでプロバイオティクスとして提供することができ、生体内免疫細胞を活性化することにより免疫機能を調節することができ、特に豚流行性下痢ウイルスに対しても優れた感染抑制活性を示す。また、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を家畜に経口投与すると、免疫調節効果を発揮した。よって、本出願は、ＰＥＤＶに対する抗ウイルス活性、免疫増強活性効果を有する新規なラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を提供することができ、前記菌株は、飼料組成物、食品組成物、化粧品組成物又は薬学組成物として有用である。

ＣＪＬＰ４７５菌株の電子顕微鏡写真である。 菌株に溶血性がないことが確認される血液寒天平板培地の写真である。 ＣＪＬＰ４７５菌株に細胞毒性がないことが確認されるグラフである。 豚末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、脾臓細胞（Ｓｐｌｎ）及び腸間膜（ｍＬＮ）を培養してＩＬ−１２の分泌を測定した結果を示すグラフである。 豚末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、脾臓細胞（Ｓｐｌｎ）及び腸間膜（ｍＬＮ）を培養してＩＬ−１０の分泌を測定した結果を示すグラフである。 ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株によるＰＥＤウイルス感染抑制効果を示す顕微鏡写真である。 ＣＪＬＰ４７５菌株を経口投与し、その後離乳子豚の脾臓細胞（Ｓｐｌｎ）を分離してＩＬ−１０とＴＧＦ−ｂｅｔａの分泌を測定した結果を示すグラフである。 ＣＪＬＰ４７５菌株を経口投与し、その後離乳子豚の血液中の総白血球数値、リンパ球数値、単核球数値を分析したグラフである。

以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。

前記目的を達成するための本出願の一態様は、寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株を提供する。前記菌株は、表３の糖発酵パターンの生化学的性質及び配列番号１の１６Ｓ ｒＤＮＡを有する菌株であり、１６Ｓ ｒＤＮＡの検討において同一の菌株がないことが確認され、本発明者らにより新たに同定された菌株である。

前記菌株は、耐酸性、耐胆汁性及び免疫増強活性を有するものであってもよい。

本出願における「ラクトバチルス（Lactobacillus）」とは、自然界に広く分布する好気性又は通性嫌気性のグラム陽性桿菌属微生物である。ラクトバチルス属に属する微生物にはラクトバチルス・プランタルムなどがある。本発明者らは、ラクトバチルス・プランタルムに属する新規な菌株を寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託して提供し、それをラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５と命名した。これは、プロバイオティクス菌株に該当し、人体に無害であり、副作用を引き起こすことなく用いられる。

本出願における「プロバイオティクス」とは、体内に入って健康によい効果を与える生きた菌を意味する。これまでに知られているほとんどのプロバイオティクスは、ラクトバチルスなどの乳酸菌を用いて製造された発酵乳製品として摂取されてきたが、最近はラクトバチルス以外に、ビフィドバクテリウム、エンテロコッカスなどの一部の菌株を含む発酵乳、顆粒、粉末などの形態で販売されている。本出願の前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５も、発酵乳、顆粒、粉末などの形態で用いられるが、これらに限定されるものではない。

本出願における「耐酸性」とは、高い酸度に耐えられる性質を意味する。プロバイオティクスが耐酸性を有すると、経口をはじめとする様々な投与経路で摂取されて胃腸内の強い酸性条件にさらされても、分解されたり、損傷することを防止することができる。

本出願における「耐胆汁性」とは、胆汁内の消化酵素に対する抵抗性を意味する。胆汁は、肝臓で生成されて胆嚢に一時貯蔵され、小腸内の十二指腸で脂肪の消化作用を助ける弱アルカリ性の緑褐色の液体であり、脂肪質を乳化して消化、吸収を助ける。このような胆汁は、経口をはじめとする様々な経路で摂取されたプロバイオティクスに対しても作用するので、プロバイオティクス投与効果を減少させる主要原因の一つとなる。

本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、前記耐酸性及び耐胆汁性を同時に有するので、優れたプロバイオティクスとして用いられる。

具体的には、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、伝統発酵食品である醤油から分離して得たものである。本出願の菌株の形態学的特徴はグラム陽性桿菌であり、配列番号１の１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を有する。前記塩基配列を分析した結果、ラクトバチルス・プランタルムと９９％の相同性を示した。よって、本出願者らは、新規に分離したラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を２０１８年７月１１日付けでブダペスト条約上の寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms）に寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託した。

本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、長期間安定して保存するために、水にグリセリン成分を所定量混合して作製した保存液に菌体を浮遊させて−７０℃で保管するか、滅菌した１０％脱脂乳に懸濁して凍結乾燥してもよいが、これらに限定されるものではなく、様々な公知の方法で長期保存形態にされてもよい。

本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、赤血球に対する溶血性を示さないものであってもよい。溶血とは、赤血球が破壊されてヘモグロビンが外部に流出することを意味し、生体内の有害菌から産生された酵素により赤血球が溶血する。よって、前記ＣＪＬＰ４７５は、生体内に投与されても血管内で溶血を起こさない安定した微生物に該当する。

また、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、抗生剤に対する耐性が弱いか、ないものであってもよい。前記抗生剤は、具体的にはアンピシリン、クリンダマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、エリスロマイシン、アンピシリン／スルバクタム、クロラムフェニコール又はストレプトマイシンであってもよいが、これらに限定されるものではない。よって、前記ＣＪＬＰ４７５を医薬品、機能性食品、飼料添加剤などに用いても、抗生剤に対する耐性がないので、それによる薬理効果や環境面で問題となる可能性が低い。

前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、免疫細胞の活性化を促進してサイトカインの分泌量を増加させるか、生体内に投与されて免疫機能を促進するものであってもよい。

前記「免疫細胞」とは、生体内の免疫機能に関与するあらゆる細胞を意味し、大きくＴ細胞とＢ細胞に分けられる。前記免疫細胞には、Ｔｈ１又はＴｈ２細胞が含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。本出願の前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、免疫細胞を刺激してＩＬ−１２、ＩＬ−１０及び／又はＴＧＦ−ｂｅｔａなどのサイトカインの分泌量を増加させる活性を有してもよい。

一般に、高い斃死率を示すウイルス性疾病においては、ウイルスによる細胞や組織自体の壊死により、他の菌株の２次感染及び敗血症、過度に活性化した免疫反応による炎症疾患、又は食欲低下及び脱水症が発生する。よって、ウイルス感染を抑制する抗ウイルス効能（Ｔｈ１、Ｔｈ２関連）と、２次感染と過度な炎症反応を調節する免疫反応（Ｔｈ２，Antiinflammation）が同時に増強されると、効果的なウイルス性疾病の予防及び治療効果が得られる。このように、プロバイオティクスによる免疫増強効能において、Ｔｈ１とＴｈ２を同時に増強する菌株は公知ではなく、本発明者により見出されたものである。また、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５には、Ｔｈ１／Ｔｈ２の不均衡を調節する免疫調節力がある。

本出願における「サイトカイン」とは、身体防御システムを制御して刺激する信号物質として用いられる糖タンパク質を意味し、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１０又はＴＧＦ−ｂｅｔａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

前記菌株は、個体に投与すると免疫活性効果を発揮するものであってもよい。

本出願における「個体」とは、免疫が弱まっているか、弱まる可能性のある、ヒトを含むあらゆる動物を意味する。例えば、前記個体としては、ヒトを除く動物、又はヒトを含む動物が挙げられる。前記動物には、ヒトだけでなく、前記効能の発揮を必要とするあらゆる動物が含まれ、具体的にはウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、イヌ、ネコなどの哺乳動物が含まれ、その他家畜又はペットが含まれる。

前記投与方法は、特に限定されるものではなく、標的組織に送達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路で投与することができる。例えば、経口投与を用いることができる。

前記菌株は、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する抗ウイルス活性を有するものであってもよい。

本出願における「抗ウイルス」とは、ウイルス感染を抑制する性質を意味する。プロバイオティクスは、独自にウイルスを不活性化することはできないが、免疫活性によりウイルスに感染した個体の免疫力を向上させてウイルス感染に抵抗できるようにする。

前記豚流行性下痢ウイルスは、豚の小腸細胞に感染するコロナウイルスであると共に、激しい下痢及び脱水症を伴う豚流行性下痢を誘発するウイルスであり、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株により感染が抑制されるウイルスが全て含まれる。

本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物で処理すると、前記豚流行性下痢ウイルスの活性及び感染が著しく抑制されるので、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む組成物は、豚流行性下痢ウイルスに対する抗ウイルス用組成物、豚流行性下痢の予防もしくは治療用薬学組成物、又は豚流行性下痢の予防もしくは改善用機能性食品、医薬品もしくは飼料組成物として活用することができる。

本出願の他の態様は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む組成物を提供する。前記菌株の詳細については前述した通りである。

本出願の新規に分離した菌株は、通常のラクトバチルス菌株の培養方法で培養することができる。培地としては、天然培地又は合成培地が挙げられる。培地の炭素源としては、例えばグルコース、スクロース、デキストリン、グリセリン、スターチなどが用いられ、窒素源としては、ペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥酵母、大豆、アンモニウム塩、ナイトレート、及びその他有機もしくは無機窒素含有化合物が用いられるが、これらの成分に限定されるものではない。培地に含まれる無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄、カリウムなどが用いられてもよいが、これらに限定されるものではない。前記炭素源、窒素源及び無機塩の成分以外に、アミノ酸、ビタミン、核酸及びそれに関する化合物が培地に添加されてもよい。本出願の新規に分離した菌株は、培養温度条件を２０〜４０℃の温度範囲として１２時間〜４日間培養することができる。

具体的には、新規に分離した菌株の培養液は、菌体を含む培養原液であってもよく、また、培養上清を除去した菌体や濃縮した菌体であってもよい。前記培養液の組成は、通常のラクトバチルス培養に必要な成分だけでなく、ラクトバチルスの生長に相乗的に作用する成分をさらに含んでもよく、それらの組成は当該技術分野において通常の技術を有する者が容易に選択することができる。

さらに、菌株の状態は、液状状態又は乾燥状態であってもよく、乾燥方法としては、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥及び凍結乾燥が用いられるが、これらに限定されるものではない。

前記組成物におけるラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株の濃度は、これに限定されるものではないが、１０^３ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０^３ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^９ＣＦＵ／ｍｌ、１０^３ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、１０^３ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^７ＣＦＵ／ｍｌ、１０^３ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^６ＣＦＵ／ｍｌ、１０^３ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^５ＣＦＵ／ｍｌ、１０^３ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^４ＣＦＵ／ｍｌ、１０^４ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０^５ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０^６ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０^７ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０^８ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０^９ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ、１０^４ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^９ＣＦＵ／ｍｌ、１０^５ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、又は１０^６ＣＦＵ／ｍｌ〜１０^７ＣＦＵ／ｍｌであってもよい。

前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含んでもよい。前記凍結保護剤又は賦形剤は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記凍結保護剤又は賦形剤は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株が自然に接触しない物質、又は前記菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、一具体例として、前記組成物は、グリセリン、トレハロース、マルトデキストリン、脱脂粉乳及びデンプンからなる群から選択される少なくとも１つの凍結保護剤、並びに／又はグルコース、デキストリン及び脱脂牛乳からなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤をさらに含んでもよい。本出願の凍結保護剤は、前記組成物の総重量に対して０．０１重量％〜２０重量％、０．０１重量％〜１０重量％含まれてもよく、具体的には、前記グリセリンは５重量％〜２０重量％、前記トレハロースは２重量％〜１０重量％、前記マルトデキストリンは２重量％〜１０重量％、前記脱脂粉乳は０．５重量％〜２重量％、前記デンプンは０．１重量％〜１重量％の割合で前記組成物に含まれてもよい。また、前記賦形剤は、前記組成物の総重量に対して７５重量％〜９５重量％、又は８５重量％〜９５重量％含まれてもよい。

また、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む組成物を製造する方法は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物と添加剤を混合するステップを含んでもよい。前記添加剤は、前述した凍結保護剤又は賦形剤であってもよい。

前記組成物は、免疫増強用であってもよい。

前記組成物は、抗ウイルス用であってもよい。

前記組成物は、食品用組成物、機能性食品用組成物、飼料用組成物、飼料添加剤用組成物、化粧品用組成物又は医薬品用組成物であってもよい。

本出願のさらに他の態様は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を有効成分として含むプロバイオティクス組成物を提供する。

プロバイオティクスは、腸内の消化管の壁に定着して有害菌の定着を抑制し、ウイルスの増殖を抑制する。また、プロバイオティクスが産生する有益な消化酵素は、栄養素の吸収と利用を容易にすることにより成長を促進する。

前記プロバイオティクス組成物を製造する方法は、寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株を培養するステップと、回収した菌株を添加剤と混合するステップとを含んでもよい。

一具体例として、前記添加剤は凍結保護剤であってもよく、前記混合するステップの後に凍結乾燥するステップをさらに含んでもよい。

ここで、前記凍結乾燥した組成物中の菌株は、生菌状態であってもよい。

他の具体例として、前記製造方法は、前記混合するステップの後に所定の含有量で包装するステップを含んでもよい。

ここで、前記所定の含有量で包装するステップは、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を含む菌株総量が１０^６ＣＦＵ／ｇ以上となるように包装するものであってもよい。

本出願のさらに他の態様は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む飼料又は飼料添加剤を提供する。

ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株については前述した通りである。具体的には、本出願のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、成長促進、下痢率減少、免疫促進、ウイルス活性抑制のために、飼料添加剤又は前記飼料添加剤を含む飼料に添加されてもよい。

本出願における「飼料添加剤」とは、栄養素補充及び体重減少予防、飼料中の繊維素の消化利用性向上、乳質改善、繁殖障害予防及び受胎率向上、夏期高温ストレス予防など様々な効果を目的として飼料に添加する物質を意味する。本出願の飼料添加剤は、飼料管理法上の補助詞料に該当し、炭酸水素ナトリウム、ベントナイト（bentonite）、酸化マグネシウム、複合鉱物質などの鉱物質製剤、亜鉛、銅、コバルト、セレンなどの微量鉱物質であるミネラル製剤、カロテン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、ニコチン酸、ビタミンＢ複合体などのビタミン剤、メチオニン、リシンなどの保護アミノ酸剤、脂肪酸カルシウム塩などの保護脂肪酸剤、生菌剤（乳酸菌剤）、酵母培養物、カビ発酵物などの生菌、酵母剤などがさらに含まれてもよい。

本出願における「飼料」とは、動物が食べて摂取し、消化させるための、又はそれに適した任意の天然又は人工の規定食、一食など、又は前記一食の成分を意味し、本出願による代謝疾患の予防又は治療用組成物を有効成分として含む飼料は、当該技術分野で公知の様々な形態の飼料に製造することができ、具体的には濃厚飼料、粗飼料及び／又は特殊飼料に製造することができる。

飼育対象には、本出願の飼料を摂取できる生命体が全て含まれ、本出願の目的上、豚が含まれる。

本出願による飼料組成物中のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株の含有量は、適用個体の種類及び年齢、適用形態、目的とする効果などに応じて適宜調節することができ、例えば０．０１〜２０重量％、０．０１〜１５重量％、０．０１〜１０重量％、０．０１〜５重量％、０．０１〜１重量％、１〜２０重量％、１〜１５重量％、１〜１０重量％、１〜５重量％、５〜２０重量％、５〜１５重量％、５〜１０重量％、１０〜２０重量％、１０〜１５重量％、又は１５〜２０重量％であってもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願の飼料組成物は、投与のために、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸などの有機酸、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、重合リン酸塩などのリン酸塩、ポリフェノール、カテキン、トコフェロール、ビタミンＣ、緑茶抽出物、キトサン、タンニン酸などの天然抗酸化剤の少なくとも１種をさらに混合して用いてもよく、必要に応じて抗インフルエンザ剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤又は滑沢剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化してもよい。

さらに、本出願の飼料組成物は、補助成分としてのアミノ酸、無機塩類、ビタミン、抗酸化剤、抗真菌剤、抗菌剤などの各種補助剤、及び粉砕又は破砕したコムギ、オオムギ、トウモロコシなどの植物性タンパク質飼料、血粉、肉粉、魚粉などの動物性タンパク質飼料、動物性脂肪、植物性脂肪などの主成分以外にも、栄養補充剤、成長促進剤、消化吸収促進剤、疾病予防剤と共に用いてもよい。

本出願の飼料組成物を飼料添加物として用いる場合は、前記飼料組成物をそのまま添加してもよく、他の成分と共に用いてもよく、通常の方法で適宜用いられてもよい。飼料組成物の投与形態は、非毒性の製薬上許容される担体と組み合わせて即時放出又は徐放性剤形を用いてもよい。前記担体は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記担体は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株が自然に接触しない物質、又は前記菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。このような食用担体は、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、プロピレングリコールであってもよい。固体担体の場合は錠剤、散剤、トローチ剤などの投与形態であってもよく、液体担体の場合はシロップ剤、液体懸濁液剤、エマルジョン剤、溶液剤などの投与形態であってもよい。また、投与剤は、保存剤、滑沢剤、溶解促進剤、安定化剤を含有してもよく、他の炎症疾患改善剤及びウイルス予防上有用な物質を含有してもよい。

本出願による飼料組成物は、飼料に乾燥重量で１ｋｇ当たり約１０〜５００ｇ、具体的には１０〜１００ｇの量で混合してもよく、完全に混合してからマッシュで供給してもよく、追加加工工程によりペレット化、膨張化、押出工程を経てもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願のさらに他の態様は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む食品組成物又は機能性食品を提供する。

具体的には、本出願の組成物は、成長促進、下痢率減少、免疫促進、ウイルス活性抑制のために、食品組成物に添加されてもよい。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５については前述した通りである。食品組成物は、食品学的に許容される担体を含んでもよい。前記担体は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記担体は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株が自然に接触しない物質、又は前記菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願の食品組成物には、機能性食品（functional food）、栄養補助剤（nutritional supplement）、健康食品（health food）、食品添加剤（food additives）などのあらゆる形態が含まれ、前記タイプの食品組成物は、当該技術分野で公知の通常の方法で様々な形態に製造することができる。

ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を食品添加物として用いる場合は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株をそのまま添加してもよく、他の食品又は食品成分と共に用いてもよく、通常の方法で適宜用いられる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康又は治療的処置）に応じて適宜決定される。一般に、食品又は飲料の製造時に、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を含む原料組成物中に０．０００１〜１重量％、具体的には０．００１〜０．１重量％の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的とするか、又は健康調節を目的とする長期間の摂取においては、前記量は前記範囲以下であってもよい。

前記食品の種類は特に限定されるものではない。前記物質を添加する食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類をはじめとする乳製品、各種スープ、清涼飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤などが挙げられ、通常の意味における健康食品が全て含まれる。

本出願の健康飲料組成物は、通常の飲料のように、様々な香味剤や天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。前述した天然炭水化物は、グルコース、フルクトースなどの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類、デキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、ソーマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味剤などを用いることができる。前記追加成分の割合は、本出願の組成物１００重量部当たり０．０１〜０．０４重量部、具体的には０．０２〜０．０３重量部であってもよい。

前記以外に、本出願の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド、増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有してもよい。これらの添加剤の割合はそれほど重要でないが、本出願の組成物１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択されるのが一般的である。その他に、本出願の組成物は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。これらの果肉の割合はそれほど重要でないが、本出願の組成物１００重量部当たり０．０１〜１０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。これらの成分は独立して又は組み合わせて用いることができる。

本出願のさらに他の態様は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む化粧品を提供する。

具体的には、本出願の組成物は、免疫促進による抗炎症効果、ウイルス活性抑制効果を有するので、化粧品に用いられてもよい。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５については前述した通りである。

前記本出願による組成物を化粧品として用いる場合は、当該化粧品技術分野で公知の通常の剤形の様々な化粧品に製造することができる。各剤形に製剤化する場合は、各剤形の製造に必要な化粧品製造上許容される担体又は添加剤を付加して製造することができる。前記担体又は添加剤は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記担体又は添加剤は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株が自然に接触しない物質、又は前記菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願のさらに他の態様は、前記ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む医薬品を提供する。

本出願による組成物を医薬品として用いる場合は、当該技術分野で公知の通常の薬剤学的剤形に製剤化することができる。前記医薬品は、具体的には経口剤形に製剤化することができ、例えば液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、エキス剤などの経口投与用剤形に製剤化することができる。前述した各剤形に製剤化する場合は、各剤形の製造に必要な薬剤学的に許容される担体又は添加剤を付加して製造することができる。前記担体又は添加剤は、非自然に発生した（non-naturally occurring）物質、又は自然に発生した物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。他の具体例として、前記担体又は添加剤は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株が自然に接触しない物質、又は前記菌株と自然に同時に含まれない物質であってもよいが、これらに限定されるものではない。代表的には、経口投与用剤形に製剤化する場合は、前記担体として希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、甘味剤、安定剤及び防腐剤から少なくとも１種を選択して用いることができ、添加剤として香料、ビタミン類及び抗酸化剤から少なくとも１種を選択して用いることができる。前記担体及び添加剤は、薬剤学的に許容されるものであれば全て用いることができ、具体的には、希釈剤として、ラクトース、トウモロコシデンプン、大豆油、微晶質セルロース又はマンニトールを用いることができ、滑沢剤として、ステアリン酸マグネシウム又はタルクを用いることができ、結合剤として、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルセルロースを用いることができる。また、崩壊剤として、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ポラクリリンカリウム又はクロスポビドンを用いることができ、甘味剤として、白糖、フルクトース、ソルビトール又はアスパルテームを用いることができ、安定剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、β−シクロデキストリン、白蝋又はキサンタンガムを用いることができ、防腐剤として、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル又はソルビン酸カリウムを用いることができる。

本出願のさらに他の態様は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株又は本出願の組成物を個体に投与するステップを提供する。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、個体及び組成物については前述した通りである。

前記投与における投与量は、これらに限定されるものではないが、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株に換算して１０^６ＣＦＵ／日以上、１０^７ＣＦＵ／日以上、１０^８ＣＦＵ／日以上、１０^９ＣＦＵ／日以上、１０^１０ＣＦＵ／日以上又は１０^１１ＣＦＵ／日以上であってもよい。

本出願のさらに他の態様は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株又は本出願の組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、個体の免疫増強方法を提供する。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、組成物及び個体については前述した通りである。

本出願における「投与」とは、任意の適切な方法で個体に本出願の菌株又は組成物を導入することを意味し、投与経路は、標的組織に送達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路で投与することができる。

本出願のさらに他の態様は、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株又は本出願の組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、個体のウイルス感染疾患の予防又は治療方法を提供する。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、組成物及び個体については前述した通りである。

本出願における「予防」とは、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株又は本出願の組成物の投与によりウイルス感染疾患を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。また、本出願における「治療」とは、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株又は本出願の組成物の投与により感染疾患の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。

以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。

菌株の分離及び選択
１−１．試料確保及び菌株の分離
本出願の菌株であるラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５（Lactobacillus plantarum CJLP475）は、伝統発酵食品である醤油から分離及び同定したラクトバチルス・プランタルムの新規な菌株であることを特徴とする。確保した試料を段階的に希釈してＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養した。各試料から分離した菌株を新たな培地に移して培養する方法で純粋分離し、２０％グリセリンを添加した栄養培地に純粋分離して培養した菌を接種し、零下７０℃以下で保存した。以下の実施例により、優れた抗ウイルス活性などを有する菌株を選択した。

１−２．菌株の耐酸性及び耐胆汁性の評価
プロバイオティクスとして活用できる菌株を選択するために、前記確保した菌株に対して耐酸性及び耐胆汁性に関する活性評価を行った。

耐酸性の評価のために、人工胃液培地を作製した。より具体的には、前記人工胃液培地は、ＭＲＳ液体培地にペプシンを添加してｐＨ２．５になるように調整し、その後滅菌して準備した。

実施例１−１の菌株を２回継代培養し、その後ＭＲＳ液体培地にて温度３７℃で１８時間静置培養した。前記人工胃液培地に前培養した菌株を１％接種して３７℃で静置培養し、０時間及び３時間経過時点で培養液をサンプリングした。サンプリングした培養液を段階的に希釈してＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養して生菌数を測定した。

耐胆汁性の評価のために、人工胆汁液培地を作製した。より具体的には、前記人工胆汁液培地は、０．５％ｏｘｇａｌｌ（黄牛の胆汁）を添加したＭＲＳ液体培地を滅菌して準備した。

実施例１−１の菌株を２回継代培養し、その後ＭＲＳ液体培地にて温度３７℃で１８時間静置培養した。前記人工胆汁液培地に前培養した菌株を１％接種して３７℃で静置培養し、０時間及び２４時間経過時点で培養液をサンプリングした。サンプリングした培養液を段階的に希釈してＭＲＳ固体培地に塗抹し、３７℃で４８時間培養して生菌数を測定した。

前記評価により、最も耐酸性及び耐胆汁性に優れる菌株を選択し、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５号として特定した。選択した菌株は、以下の実施例に示すように、ラクトバチルス・プランタルムとして同定された。前記ＣＪＬＰ４７５菌株の耐酸性及び耐胆汁性を従来公知の菌株と比較するために、韓国微生物保存センターから分譲されたラクトバチルス・プランタルム標準菌株（ＫＣＣＭ１２１１６）の耐酸性及び耐胆汁性を前記と同様の方法で評価した。

耐酸性の評価（単位：ＣＦＵ／ｍｌ）

耐胆汁性の評価（単位：ＣＦＵ／ｍｌ）

表１及び表２に示すように、ラクトバチルス・プランタルム標準菌株（ＫＣＣＭ１２１１６）は、人工胃液培地及び人工胆汁培地において菌株数が減少した。よって、一般に知られている全てのラクトバチルス・プランタルムが耐酸性及び耐胆汁性を有するのではないことが分かる。

それに対して、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は、ラクトバチルス・プランタルム標準菌株（ＫＣＣＭ１２１１６）と比較して耐酸性の評価において菌株数の減少幅が小さく、耐胆汁性の評価においては菌株数が逆に増加したので、耐酸性及び耐胆汁性に優れる菌株であることが分かる。

１−３．菌株の形態学的及び生化学的特性の調査
前記ＣＪＬＰ４７５菌株の同定のために、１次的に形態学的、生化学的調査を行った。形態学的な特徴として、グラム染色の結果、グラム陽性であり、電子顕微鏡撮影の結果、桿菌であることが確認された（図１）。生化学的特性を分析するために、ＡＰＩ ５０ＣＨＬ ｓｙｓｔｅｍ（biomerieux Vitek, Inc., フランス）により菌株の糖発酵パターンを分析した（表３）。

分離菌株の糖発酵パターンの分析

＋：陽性，−：陰性

１−４．菌株の同定
菌株をより正確に同定するために、ＤＮＡ塩基配列による分子系統分類学的方法を用いた。塩基配列の分析は、ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（バイオニア，韓国）とユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’ ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ ３’，配列番号２）、１４９２Ｒ（５’ ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ ３’，配列番号３）を用いて、１６ｓ ｒＤＮＡの遺伝子を増幅した。遺伝子増幅時の総反応液量を２０μｌとし、９４℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間を計３０回繰り返し、増幅したＤＮＡ塩基配列を分析した。分離菌株の分析された１６ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、配列番号１の通りである。

前記分析の結果、ＣＪＬＰ４７５はラクトバチルス・プランタルムと９９％の相同性を有する微生物であると同定された。よって、前記分離した菌株を「ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５」と命名した。このように同定した新規微生物をブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年７月１１日付けでラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５として寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐが付与された。

菌株の安定性の評価
２−１．菌株の溶血性の確認
β−溶血とは、赤血球により供給されるリン脂質が有害菌から産生されたリン脂質酵素により加水分解され、結果として赤血球が溶血する作用を意味する。ＣＪＬＰ４７５の溶血性を調べるために、血液寒天平板培地（sheep blood 5% agar, （株）ハンイルコメッド, 韓国）を用いた。準備した血液寒天平板培地に画線接種（streaking）し、３７℃で２４時間培養して溶血の有無を確認した。

その結果、図２に示すように、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株は溶血性を示さないことが確認された。これらの結果は、生体内で有害菌として作用しないことを示唆するものである。

２−２．抗生剤感受性の評価
ＣＪＬＰ４７５菌株をＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間静置培養した。培養した菌を滅菌綿棒につけてＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ固体培地（Difco）に塗抹し、その後前記培地上に抗生剤ディスクを載せて３７℃で２４時間培養した。抗生剤検査のための抗生剤ディスクとしては、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ、ｋａｎａｍｙｃｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｕｌｂａｃｔａｍ、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎディスク（Oxoid, 英国）を準備して用いた。

ＣＪＬＰ４７５菌株の抗生剤感受性検査の結果、ＣＪＬＰ４７５菌株は前記抗生剤に対する耐性がないことが確認された（表４）。よって、ＣＪＬＰ４７５菌株を医薬品、機能性食品、飼料、飼料添加剤などに用いても、抗生剤に対する耐性がないので、それによる耐性問題や環境的問題は発生する可能性が低いことが分かる。

抗生剤による菌株成長阻害度

細胞毒性の評価
前記菌株が細胞の生存に及ぼす影響を調べるために、ＭＴＳ分析方法（3-(4,5-dimethyl-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, promega, USA）を用いて、ＩＰＥＣ−Ｊ２（ブタ腸上皮細胞，intestinal pig epithelium cells）細胞上で細胞毒性レベルを評価した。各細胞を９６ウェル細胞培養プレートで培養し、その後各濃度（１０^３〜１０^８ＣＦＵ／ｍｌ）のＣＪＬＰ４７５で処理して培養した。２４時間後に細胞培養液にＭＴＳ溶液を添加して２時間培養し、マイクロプレートリーダにて波長４９０ｎｍで吸光度を測定して細胞生存率（％）を計算した。

その結果、図３に示すように、６つの濃度で処理した場合、１０^８ＣＦＵ／ｍｌ以下の濃度では細胞（５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）死滅がほとんど起こらないことが確認された。

免疫増強活性の評価
ＣＪＬＰ４７５菌株の免疫増強効果を確認するために、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）培地でＩＰＥＣ−Ｊ２細胞を培養した。また、２１日齢の離乳子豚から腸間膜リンパ節細胞（mLN, lymphocytes in mesenteric lymph nodes）、末梢血単核細胞（PBMC, peripheral blood mononuclear cell）、パイエル板細胞（Peyer's patches, Cells in peyer's patch）及び脾臓細胞（Spln, Splenocytes）を採取し、各組織及び血液から次の方法で免疫細胞を得た。

脾臓及び腸間膜リンパ節組織から免疫細胞を得るために、細断（chopping）した組織を注射器のプランジャー（plunger）と７０マイクロメートルのセルストレーナー（Cell strainer）（BD Falcon）を用いて粉砕し、その後ＲＰＭＩ−１６４０（Roswell Park Memorial Institute-1640, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA）培地を用いて細胞を洗浄した。最後の洗浄の前の段階において、ＲＢＣ ｌｙｓｉｓバッファ（eBioscience, USA）を用いて残存するＲＢＣ（赤血球）を除去した。最後の洗浄の後に収集した免疫細胞をトリパンブルー（Trypan blue）で染色し、血球計算盤（hemocytometer）でカウントして用いた。

パイエル板細胞を得るために、小腸から当該組織を分離して手術用はさみで細断及び粉砕し、その後Ｄｎａｓｅ Ｉ（Roche, Germany）、Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩ（Sigma aldrich, USA）、ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、ＦＢＳ、１５ｍＭ ４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）で１時間反応させて単一細胞を得た。その後、前記と同様の方法で免疫細胞を得た。

採取した血液は、ＰＢＳと１：１で混合してＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（GE healthcare Life Sciences, NJ, USA）上に載せ、遠心分離によりＷＢＣ（白血球）凝集層を分離した。分離した層から、前記と同様の方法で末梢血単核細胞を得た。

免疫増強効果を評価するために、当該菌株（ＣＪＬＰ４７５）と前記方法で得られた各免疫細胞を１０：１で混合し、その後５％ＣＯ_２を含有する３７℃の細胞培養器で２０時間培養した。培養終了時に遠心分離し、その後サイトカインＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）を用いて培養上清の免疫活性効果を評価した。より具体的には、外部侵入因子（Pathogen）に対する防御機能を有するＴｈ１（T helper 1）関連免疫メカニズムを活性するＩＬ−１２（interleukin-12）と、Ｔｈ２（T helper 2）による炎症反応調節と後天性免疫を示すＩＬ−１０（interleukin-10）に対するＥＬＩＳＡ（R&D Systems, USA）を行った。

ＩＬ−１２及びＩＬ−１０を測定した結果をそれぞれ図４及び図５のグラフに示す。各グラフにおいて、対照群としては、菌株処理を行っていない陰性対照群を用いた。

その結果、図４及び図５に示すように、ＣＪＬＰ４７５菌株は免疫細胞を刺激してＩＬ−１２、ＩＬ−１０の分泌量を増加させる活性を有することが確認された。よって、ＣＪＬＰ４７５がＴｈ１免疫メカニズムだけでなく、Ｔｈ２免疫メカニズムを同時に増強することにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応の均衡を維持する効果を発揮することが分かる。

ウイルス感染抑制効果
ＣＪＬＰ４７５菌株のウイルス感染抑制効果を測定するために、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ，ＳＭ９８又はＫＰＥＤＶ９菌株）を準備した。具体的には、前記ウイルスをＶｅｒｏ（ＣＣＬ−８１，アフリカミドリザル由来腎臓上皮細胞）細胞で増殖培養し、前記Ｖｅｒｏ細胞を培養するための培地としてＭＥＭ（Eagle's Minimum Essential Medium, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA）、熱処理により不活性化した１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum, ｖ／ｖ）、１％（ｖ／ｖ）ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを用いた。前記Ｖｅｒｏ細胞を単層培養し、その後培地で２回洗浄して全溶液を除去した。５μｇ／ｍｌ ＴＰＣＫ（N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone）で処理したトリプシンを含むＦＢＳ無添加のＭＥＭに０．１ＭＯＩ（Multiplicity of infection）レベルのウイルスを混合し、その最小量を用いて準備した培養細胞を処理し、その後５％ＣＯ_２を含有する３７℃の細胞培養器で２〜３日間培養した。

ウイルス感染の有無は、ウイルスシンシチウム（virus syncytium）形成の有無により判断した。シンシチウムが形成された場合は、３〜６時間以内にウイルス培養液を回収し、遠心分離機にて細胞を除去して−８０℃で保管した。ウイルス感染力価の計算においては、９６−ｗｅｌｌプレートでＶｅｒｏ細胞を２×１０^４ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌのレベルに培養して細胞をＰＢＳで洗浄し、その後ウイルスを２倍連続希釈した培養液を入れて２４〜４８時間培養してウイルス感染の有無を確認し、Ｒｅｅｄ ＆ Ｍｕｅｎｃｈ法によりウイルス感染力価を計算した。

ＣＪＬＰ４７５菌株のウイルス感染抑制効果を測定するために、ＣＪＬＰ４７５菌株と実施例４で抽出した４種の免疫細胞を２０〜２４時間反応させて培養液を得た。前記培養液を用いて、ＩＰＥＣ−Ｊ２が培養された９６ウェル細胞培養プレートをそれぞれ処理し、５％ＣＯ_２を含有する３７℃の細胞培養器で２〜４時間培養した。それぞれのプレートに１００ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ（50% of tissue cell infectious dose）のＰＥＤウイルス（ＳＭ９８又はＫＰＥＤＶ９）をスポッティングし、その後４８時間培養した。ウイルス感染の有無を確認するために、培養終了後に細胞培養プレートをメタノールで固定してクリスタルバイオレットで染色し、その後細胞変性したウェルを顕微鏡で確認し、ウイルス感染の有無を判断した。

ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５により活性化した免疫細胞によるＰＥＤウイルス（SM98/KPEDV9 strain）感染抑制効果

＋＋：完全抑制，＋：部分的抑制，−：感染

その結果、表５及び図６に示すように、豚免疫細胞とラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５で処理すると、菌株により免疫細胞が活性化されてウイルス感染が明確に抑制される効果が確認された。よって、免疫細胞とＣＪＬＰ４７５で共に処理すると、ＰＥＤウイルスに対する優れた抗ウイルス活性を示すことが分かる。

家畜の免疫に及ぼす効果の確認
ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５を家畜に投与した際の免疫に及ぼす影響を確認するために次の実験を行った。

２１日齢の離乳子豚１６頭を購入してコンテナ飼育場で３週間飼育し、飼料としては抗生剤を添加していない一般のクランブル飼料を供給した。ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を凍結乾燥粉末の形態に作製して冷蔵保管しておき、経口投与のために１日に１頭当たり１０^１０ＣＦＵ／日ずつ摂取できるようにクランブル飼料に均一に混合した。３週間の経口投与後、離乳子豚の免疫に及ぼす効果を確認するために、１処理群当たりランダムに４頭を選択し、剖検して血液及び組織サンプルを収集した。免疫増強活性の評価のために、実施例５と同様の方法により、脾臓から免疫細胞を得て培養し、ＥＬＩＳＡ試験を行った。具体的には、当該菌株（ＣＪＬＰ４７５）を用いることなく、菌株を給餌した離乳子豚から得られた免疫細胞を培養した培養上清の免疫活性効果を評価した。各グラフにおいて、対照群としては、菌株を給餌していない離乳子豚から得られた免疫細胞を用いた。

ＩＬ−１０及びＴＧＦ−ｂｅｔａを測定した結果を図７のグラフに示す。また、血液分析結果を図８のグラフに示す。

その結果、図７に示すように、ＣＪＬＰ４７５を含む飼料を給餌した離乳子豚の脾臓免疫細胞において、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−ｂｅｔａの分泌量の増加が確認された。よって、ＣＪＬＰ４７５がＴｈ２免疫メカニズムを増強して抗炎効果を発揮することが分かる。また、図８に示すように、ＣＪＬＰ４７５を含む飼料を給餌した離乳子豚の血液において、総白血球数の増加が確認され、そのうちリンパ球（Ｔ細胞，Ｂ細胞）及び単核球数の増加によりＣＪＬＰ４７５が免疫活性効果を発揮することが分かる。

ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５（Lactobacillus plantarum CJLP475）を含む生菌剤の作製
実施例１で同定されたプロバイオティクスであるラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を医薬品、食品、飼料、飼料添加剤又は化粧品の原料として適用するために大量生産し、それを凍結乾燥して生菌剤化した。

菌の生産のために、ＭＲＳ液体培地（Difco）にて２５％ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを６．０に調節し、３７℃で約１８時間培養して遠心分離を行うことにより菌体を回収した。回収した菌体は、デキストリン５％と脱脂牛乳１０％を凍結保護剤として用いて−４０℃で凍結し、その後３７℃で乾燥した菌体をミキサーで粉砕して粉体化した。粉体化した生菌は、目標とする菌数に調節し、保管のために適量のグルコース、ラクトース、脱脂牛乳などの賦形剤と混合し、密封可能なアルミニウムパウチに入れて包装した。

このように作製した生菌剤は、飼料の原料として用いられる穀粉と混合して飼料用生菌剤として活用したり、担体や添加剤などを混合して錠剤、カプセルなどの医薬品、食品用生菌剤として活用したり、化粧品の原料に所定量を混合することにより化粧品用生菌剤として活用するなど、医薬品、食品、飼料、飼料添加剤、化粧品などの様々な分野において当該技術分野における通常の方法で活用することができる。

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims (15)

1. 寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株。
2. 前記菌株は、耐酸性、耐胆汁性及び免疫増強活性を有し、前記免疫増強活性は、免疫細胞の活性化を促進してサイトカインの分泌量を増加させるものであり、前記サイトカインは、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２又はＴＧＦ−ｂｅｔａである、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株。
3. 前記菌株は、個体に投与すると免疫を増強させるものである、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株。
4. 前記個体は、家畜又はペットである、請求項３に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株。
5. 請求項１に記載のラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株、その破砕物、その培養物、その濃縮液又はその乾燥物を含む組成物。
6. 前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
7. 前記凍結保護剤は、グリセリン、トレハロース、マルトデキストリン、脱脂粉乳及びデンプンからなる群から選択される少なくとも１つであり、
   前記賦形剤は、グルコース、デキストリン及び脱脂牛乳からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の組成物。
8. 前記組成物は、免疫増強用、豚流行性下痢（ＰＥＤ）ウイルスに対する抗ウイルス用、医薬品用、飼料又は飼料添加剤用、食品用及び化粧品用からなる群から選択される用途に用いられる、請求項５に記載の組成物。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の菌株又は組成物をヒトを除く個体に投与するステップを含む、ヒトを除く個体の免疫増強方法。
10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の菌株又は組成物をヒトを除く個体に投与するステップを含む、ヒトを除く個体の豚流行性下痢（ＰＥＤ）ウイルス感染疾患の予防又は治療方法。
11. 寄託番号ＫＣＣＭ１２２８７Ｐとして寄託したラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＣＪＬＰ４７５菌株を培養するステップと、
    回収した菌株を添加剤と混合するステップとを含む、プロバイオティクス組成物を製造する方法。
12. 前記添加剤は凍結保護剤であり、前記混合するステップの後に凍結乾燥するステップをさらに含む、請求項１１に記載のプロバイオティクス組成物を製造する方法。
13. 前記凍結乾燥した組成物中の菌株は、生菌状態である、請求項１２に記載のプロバイオティクス組成物を製造する方法。
14. 前記混合するステップの後に所定の含有量で包装するステップを含む、請求項１１に記載のプロバイオティクス組成物を製造する方法。
15. 前記所定の含有量で包装するステップは、ラクトバチルス・プランタルムＣＪＬＰ４７５菌株を含む菌株総量が１０^６ＣＦＵ／ｇ以上となるように包装するものである、請求項１４に記載のプロバイオティクス組成物を製造する方法。

Images