ES2914814T9 - Tratamiento de células enfermas CD47+ con fusiones SIRP Alfa-Fc - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de células enfermas CD47+ con fusiones SIRP Alfa-Fc

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión Fc terapéuticas, útiles en particular para el tratamiento de sujetos que presentan células enfermas CD47+. Las proteínas de fusión se basan en un dominio de la región extracelular de la SIRPa humana, e incorporan una región Fc que potencia el efecto anticancerígeno de la proteína de fusión.

Antecedentes de la invención

La proteína reguladora de señales alfa (SIRPa) es una proteína transmembrana perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas y un receptor de CD47. La clonación y expresión de una forma humana de SIRPa ha sido descrita por Ullrich et al en US 6541615. La implicación de SIRPa y CD47 en la etiología del cáncer y de otras enfermedades ha sido implicada por Sarfati et al en WO1999/040940 y por Van den Berg et al en WO00/66159, quienes sugieren el uso terapéutico de un inhibidor de SIRPa. Más recientemente, Jaiswal et al han sugerido el uso de anticuerpos contra CD47 para el tratamiento de cánceres hematopoyéticos, en WO2009/091601. La interacción entre SIRPa y CD47 desempeña un papel importante en la regulación de la fagocitosis de las células leucémicas y las células madre de la leucemia (LSC) por parte de los macrófagos. Se ha demostrado que los anticuerpos bloqueantes contra CD47 promueven la fagocitosis de las LSC por parte de los macrófagos. Además, Wang et al han sugerido tratamientos contra el cáncer basados en proteínas de fusión SIRPa en WO 2010/130053. Para el tratamiento de trastornos inmunológicos, Smith et al han sugerido el uso de fusiones Fc basadas en CD47, en US2008/0131431. El tratamiento de los trastornos inflamatorios e inmunitarios también es enseñado por Raymond et al, en W02010/070047.

Sería útil proporcionar agentes que inhiban la señalización a través del eje SIRPa/CD47 para su uso en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una proteína de fusión SIRPa humana, una composición farmacéutica, un consrtucto de ADN, una producción de proteínas, una célula huésped, un procedimiento y una proteína de fusión dimérica como se define en las reivindicaciones independientes adjuntas. Las características preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes.

En el presente documento se divulga la SIRPa como una proteína de fusión Fc en la que los componentes se seleccionan para la inhibición óptima del eje CD47/SIRPa. Los presentes inventores han descubierto que un dominio particular y singular dentro de la región extracelular de la SIRPa humana se une a CD47 con mayor afinidad que la región extracelular intacta de la SIRPa humana. También se demuestra en el presente documento que la eficacia in vivo de las fusiones SIRPaFc es sorprendente y dramáticamente mejorada cuando la región constante (Fc) es una que tiene función efectora, a pesar de que la inhibición del eje CD47/SIRPa no debería requerir tal actividad, y a pesar de las indicaciones in vitro de que se debería preferir una región Fc sin efector.

Las presentes proteínas de fusión SIRPaFc también demuestran un agonismo CD47 insignificante, lo que les permite actuar como un inhibidor dedicado de la señalización mediada por SIRPa in vivo. Como atributo adicional, la proteína de fusión presenta una unión insignificante a los glóbulos rojos. Esto está en marcado constraste con otros inhibidores de este eje, como los anticuerpos CD47, que se unen fuertemente a los glóbulos rojos, provocando en algunos casos la hemaglutinación. Con la presente proteína de fusión, la dosificación no necesita tener en cuenta el efecto "sumidero" en el que el fármaco administrado queda secuestrado e inactivo en forma de glóbulos rojos, ni tener en cuenta los efectos adversos causados por la interacción con los glóbulos rojos.

Se divulga en el presente documento una proteína de fusión SIRPaFc útil para inhibir la estimulación mediada por SIRPa de CD47 unido a células, la proteína de fusión que comprende un componente de proteína SIRPa y, fusionado con ella, un componente de región constante de anticuerpo (Fc), en el que el componente de proteína SIRPa consiste o comprende el dominio V de SIRPa humano y el componente Fc es la región constante de una IgG que tiene función efectora. El Fc puede seleccionarse de la región constante de un anticuerpo IgG1 o de un anticuerpo IgG4.

Se divulga en el presente documento un polinucleótido que codifica una forma secretable de la fusión SIRPaFc como polipéptido de cadena simple. Se divulga en el presente documento un huésped celular útil para producir la proteína de fusión SIRPaFc, el huésped que tiene el polinucleótido incorporado de forma expresable en el mismo. Se divulga en el presente documento un procedimiento para obtener la proteína de fusión SIRPaFc, que comprende el cultivo o crecimiento del huésped, y la recuperación de la fusión SIRPaFc como una proteína dimérica. El huésped puede ser un huésped eucariota de cualquier especie que glicosile proteínas expresadas.

Se divulga en el presente documento una composición farmacéutica útil para tratar a un sujeto que presenta una célula enferma que es CD47+, la composición comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad de la proteína de fusión SIRPaFc eficaz para inhibir el crecimiento o la proliferación de la célula enferma CD47+.

Se divulga en el presente documento un procedimiento para tratar a un sujeto que presenta células enfermas CD47+, el procedimiento comprende administrar al sujeto una cantidad de la proteína de fusión SIRPaFc eficaz para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de las células enfermas. Se divulga en el presente documento el uso de la proteína SIRPaFc para tratar el cáncer o cualquier otra enfermedad en la que estén presentes las células enfermas CD47+. En el presente documento se describe el uso de la proteína SIRPaFc para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer u otra enfermedad en la que estén presentes las células enfermas CD47+. Del mismo modo, se divulga en el presente documento una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una célula enferma CD47+, que comprende la proteína SIRPa-Fc y un portador farmacéuticamente aceptable. Las células de la enfermedad pueden ser células cancerosas CD47+, incluyendo particularmente las células de leucemia CD47+, como la AML.

Estos y otros aspectos de la presente invención se describen ahora con mayor detalle con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

Referencia a las cifras

La Figura 1 compara la unión de las fusiones de SIRPa designadas TTI-602 y TTI-616 a CD47 humano utilizando un ensayo de unión directa (Figura 1A) y un ensayo de competencia indirecta (Figura 1B).

Más particularmente, la unión de SIRPaFc con un único dominio V de SIRPa N-terminal (TTI-616) se comparó con una fusión que consistía en los tres (V-C-C) dominios extracelulares de SIRPa (TTI-602). A) Ensayo de unión directa. Se incubaron células T Jurkat humanas CD47+ con cantidades tituladas de TTI-602 o TTI-616 y se analizó la unión mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo policlonal anti-IgG. B) Ensayo de inhibición competitiva. Las células Jurkat se incubaron con SIRPaFc biotinilado (Tt I-601) en presencia de cantidades tituladas del competidor frío TTI-602 o TTI-616. La unión se midió por citometría de flujo y los resultados se convirtieron en porcentaje de inhibición, definiéndose el 0 % como la unión en ausencia del competidor.

La figura 2 muestra los perfiles de unión (Kd) para tres proteínas de fusión SIRPa diferentes. Se revelan perfiles de unión muy similares, que producen valores de afinidad de unión (Kd) casi idénticos (2,3-2,4 nM).

Esto era de esperar, ya que las tres proteínas contienen la misma región SIRPa y no se predijo que la región Fc afectara a la unión del ligando. Más concretamente, se incubaron células T Jurkat humanas CD47+ con cantidades tituladas de proteínas de fusión y se analizó la unión mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo policlonal anti-IgG. A continuación, se normalizaron las medias geométricas y se generaron las curvas de unión y los valores de Kd con Prism (Graphpad) utilizando una regresión no lineal que ajustaba los datos a un modelo de unión de un sitio.

La figura 3 (véase también la figura 6) muestra que el TTI-621 y el TTI-622 presentan una actividad pro-fagocitosis similar, mientras que el TTI-616 es claramente más débil (esto es particularmente evidente a la dosis de 10 nM). Esto indica que se requiere una región IgG4 o IgGlFc de tipo salvaje para la máxima destrucción de células tumorales desencadenada por SIRPaFc por parte de los macrófagos. Más concretamente, los macrófagos se generaron cultivando monocitos CD14+ de sangre periférica humana durante al menos 1 semana en presencia del factor estimulante de colonias de monocitos, y luego se activaron con interferón-gamma (durante una noche) y LPS (1 hora). Las células OCI/AML-2 se marcaron con CFSE y se incubaron durante 30 minutos con fusiones SIRPaFc a las concentraciones indicadas o con proteínas Fc de control (hIgG4 Fc mutado (TTI-401) o hIgG1 Fc (TTI-402)) a 1 mM o se dejaron sin tratar (UT). A continuación, las células AML-2 y los macrófagos se co-cultivaron durante 2 horas, y los macrófagos se tiñeron con el conjugado Alexa Fluor® 555 de aglutinina de germen de trigo y se analizaron mediante microscopía confocal. El índice de fagocitosis se define como el número de células AML engullidas por cada 100 macrófagos, contando al menos 200 macrófagos por muestra. Las proteínas de fusión con una región Fc de hIgG4 mutada se muestran como barras blancas, la hIgG4 de tipo salvaje como barras grises y la IgG1 de tipo salvaje como barras negras. **p<0,05, *p<0,01 vs. control de isotipo (ANOVA unidireccional y post-prueba de Dunnett).

La figura 4 muestra que la proteína de fusión TTI-621 con una región Fc de IgGI fue la única proteína capaz de mediar un efecto antileucémico en el lugar del trasplante (el fémur inyectado). En la médula ósea no inyectada, hubo un claro efecto dependiente del Fc, con TTI-621 (actividad Fc completa) > TTI-622 (baja actividad Fc) > TTI-616 (sin actividad Fc). Los ratones NOD/ShiLtJ-Prkdcscid (NOD.SCID) (de 8 a 12 semanas de edad) fueron irradiados subletalmente con 275 cGy de un irradiador g de 137Cs y tratados con el anticuerpo anti-CD 122 (para agotar las células NK) antes de la inyección intrafemoral de células AML recogidas de un paciente con leucemia humana. A partir de tres semanas después del trasplante, los ratones fueron tratados con proteínas de fusión SIRPaFc (8 mg/kg IP tres veces por semana) o con dosis equimolares de proteínas Fc de control TTI-401 (IgG4 humana mutada) o TTI-402 (IgG1 humana). Tras 4 semanas de tratamiento, se sacrificaron los ratones y se detectaron las células leucémicas humanas en el fémur inyectado, la médula ósea no inyectada y el bazo mediante análisis de citometría de flujo, con tinción para la expresión de los marcadores CD45 y CD33 humanos. El injerto de AML se expresó como el porcentaje de células humanas CD45+CD33+ en cada compartimento.

Figura 5 Las células T Jurkat humanas CD47+ se incubaron con proteínas de fusión SIRPaFc o Fc de control (3 pM) o se dejaron sin tratar (UT) durante la noche y luego se tiñeron para Annexin-V y se analizaron por citometría de flujo.

Se incluyó el agente pro-apoptótico estaurosporina (Staur) a 1 ^M como control positivo. Una muestra que contenía TTI-602 fue pretratada con B6H12, un anticuerpo bloqueadorde CD47.

La Figura 6 muestra los resultados obtenidos utilizando los protocolos descritos para la Figura 3, pero con un conjunto de datos más desarrollado.

Figura 7 A) Se tiñeron eritrocitos humanos con cantidades tituladas del anticuerpo anti-CD47 B6H12 o TTI-616 y se analizaron por citometría de flujo. B) Los eritrocitos humanos se tiñeron con un panel de monoclonales anti-CD47 (2D3, B6H12, BRIC126 y CC2C6) o con la proteína de fusión SIRPaFc TTI-622 y se analizaron por citometría de flujo. Cada reactivo se utilizó a una concentración de saturación identificada en experimentos de optimización anteriores. El TTI-401 se utilizó como Fc de control. Los datos mostrados son un conjunto de seis donantes. C) Las células tumorales AML-2 se tiñeron con anticuerpos CD47 o TTI-622 y se analizaron por citometría de flujo. Los datos se muestran para una única dosis alta (660 nM) de cada reactivo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la proteína SIRPa humana, en una forma fusionada directa o indirectamente con una región constante de anticuerpo, o Fc. A menos que se indique lo contrario, el término "SIRPa humana", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una forma madura, endógena y de tipo salvaje de SIRPa humana. En los seres humanos, la proteína SIRPa se encuentra en dos formas principales. Una forma, la variante 1 o forma V1, tiene la secuencia de aminoácidos establecida como NCBI RefSeq Np_542970.1 (los residuos 27-504 constituyen la forma madura). Otra forma, la variante 2 o forma V2, difiere en 13 aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos establecida en el GenBank como CAA71403.1 (los residuos 30-504 constituyen la forma madura). Estas dos formas de SIRPa constituyen aproximadamente el 80 % de las formas de SIRPa presentes en los seres humanos, y ambas se engloban en el presente documento en el término "SIRPa humana". También se incluyen en el término "SIRPa humana" las formas menores de la misma que son endógenas a los humanos y tienen la misma propiedad de desencadenar la transducción de señales a través de CD47 al unirse a ella. La presente invención se dirige más particularmente a la forma variante 2, o V2.

Las presentes proteínas de fusión SIRPaFc incorporan uno de los tres llamados dominios de inmunoglobulina (Ig) que se encuentran dentro de la región extracelular de la SIRPa humana. Más concretamente, las presentes proteínas SIRPaFc incorporan los residuos 32-137 de la SIRPa humana (un 106-mer), que constituyen y definen el dominio IgV de la forma V2 según la nomenclatura actual. Esta secuencia de SIRPa, que se muestra a continuación, se referencia en el presente documento como SEQ ID N° 1

EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTT

VSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGA [SEQ IDNo.l]

Las proteínas de fusión SIRPaFc pueden incorporar el dominio IgV tal como se define en la SEQ ID N° 1, y residuos adicionales, flanqueantes, contiguos dentro de la secuencia SIRPa. Esta forma preferida del dominio IgV, representada por los residuos 31-148 de la forma V2 de la SIRPa humana, es un 118-merque tiene la SEQ ID N°22 que se muestra a continuación

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVT

TVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS [SEQ ID

No.22]

Se ha encontrado que la actividad de esta forma V2 de SIRPa humana es sorprendentemente mayor, en términos de afinidad de unión a CD47, en relación con la afinidad de unión a CD47 de todo el dominio extracelular de SIRPa. Esta afinidad de unión es al menos dos veces mayor que la afinidad de unión de todo el dominio extracelular. La afinidad es al menos 3 veces, 4 veces, 5 veces o mayor para el dominio V2 en relación con todo el dominio extracelular. En un ensayo de unión directa, como se informa en el Ejemplo 1 del presente documento, una proteína de fusión que incorpora este dominio SIRPa tiene una afinidad de unión aproximadamente 10 veces mayor que una proteína de fusión que incorpora todo el dominio extracelular SIRPa. Asimismo, en un ensayo de competencia indirecta también recogido en el Ejemplo 1 del presente documento, la fusión de dominio único V2/IgV proporciona una afinidad de unión superior a la afinidad de unión a CD47 de una fusión que incorpora toda la región extracelular de SIRPa. En consecuencia, las fusiones de SIRPaFc basadas en este dominio V preferido tienen el potencial de una mayor potencia en la inhibición de la señalización de CD47 que se estimula al unirse con SIRPa.

Las presentes proteínas de fusión SIRPa también incorporan una región Fc que tiene función efectora. La preferencia por la función efectora es totalmente sorprendente y difícil de explicar con la información actual sobre el eje CD47/SIRPa. Cabría esperar que una región Fc sin efectores tuviera actividad suficiente para inhibir este eje, y que no se ganara nada más integrando la función de los efectores. Sin embargo, los datos presentados en el presente documento, en particular en el Ejemplo 5, muestran claramente que un beneficio se vincula a un Fc efector-activo, en términos de la actividad antileucémica in vivo de la fusión. Esto es particularmente sorprendente a la luz de los resultados mostrados en el Ejemplo 4, donde la actividad fagocítica de la fusión parece no mostrar ninguna preferencia particular por las fusiones basadas en componentes Fc con o sin efectores.

Para su uso en las presentes fusiones SIRPaFc, los componentes Fc adecuados son, por tanto, aquellos que tienen una función efectora. Un componente Fc "que tiene función efectora" es un componente Fc que tiene al menos alguna función efectora, como al menos alguna contribución a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o alguna capacidad de fijar el complemento. Además, el Fc se unirá al menos a los receptores Fc. Estas propiedades pueden revelarse mediante ensayos establecidos para este fin. Los ensayos funcionales incluyen el ensayo estándar de liberación de cromo que detecta la lisis de las células objetivo. Según esta definición, una región Fc de tipo salvaje de IgG1 o IgG4 tiene función efectora, mientras que la región Fc de una IgG4 humana mutada para eliminar la función efectora, como por ejemplo mediante la incorporación de una serie de alteraciones que incluyen Pro233, Val234, Ala235 y la supresión de Gly236 (EU), se considera que no tiene función efectora. El Fc puede estar basado en anticuerpos humanos del isotipo IgG1. La región Fc de estos anticuerpos será fácilmente identificable para los expertos en la materia. En las realizaciones, la región Fc incluye los dominios bisagra inferior-CH2-CH3.

La región Fc puede basarse en la secuencia de aminoácidos de una IgG1 humana establecida como P01857 en UniProtKB/Swiss-Prot, residuos 104-330, y tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra a continuación y a la que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID No.2

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV

DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* [SEQ ID

No.2]

Así, la región Fc puede tener una secuencia de tipo salvaje o una secuencia consenso de una región constante de IgG1. Alternativamente, la región Fc incorporada en la proteína de fusión se deriva de cualquier anticuerpo IgG1 que tenga una región constante efector-activa típica. Las secuencias de dichas regiones Fc pueden corresponder, por ejemplo, con las regiones Fc de cualquiera de las siguientes secuencias de IgG1 (todas referenciadas en el GenBank), por ejemplo: BAG65283 (residuos 242-473), BAC04226.1 (residuos 247-478), BAC05014.1 (residuos 240-471), CAC20454.1 (residuos 99-20), BAC05016.1 (residuos 238-469), BAC85350.1 (residuos 243-474), BAC85529.1 (residuos 244-475) y BAC85429.1 (residuos 238-469).

La región Fc puede tener una secuencia de una región constante de IgG4 humana de tipo salvaje. Alternativamente, la región Fc incorporada en la proteína de fusión se deriva de cualquier anticuerpo IgG4 que tenga una región constante con actividad efectora que esté presente pero, naturalmente, sea significativamente menos potente que la región Fc de IgG1. Las secuencias de dichas regiones Fc pueden corresponder, por ejemplo, con las regiones Fc de cualquiera de las siguientes secuencias de IgG4: P01861 (residuos 99-327) de UniProtKB/Swiss-Prot y CAC20457.1 (residuos 99-327) de GenBank.

La región Fc puede basarse en la secuencia de aminoácidos de una IgG4 humana establecida como P01861 en UniProtKB/Swiss-Prot, residuos 99-327, y tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra a continuación y a la que se hace referencia en el presente documento como SEQ ID No. 23

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDYSQEDPEVQFNWY

VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[SEQ ID No.23]

La región Fc puede incorporar una o más alteraciones, normalmente no más de aproximadamente 5 alteraciones de este tipo, incluyendo sustituciones de aminoácidos que afectan a ciertas propiedades Fc. En una realización específica y preferida, la región Fc incorpora una alteración en la posición 228 (numeración EU), en la que la serina en esta posición se sustituye por una prolina (S228P), para así estabilizar el enlace disulfuro dentro del dímero Fc. Otras alteraciones dentro de la región Fc pueden incluir sustituciones que alteran la glicosilación, como la sustitución de Asn297 por glicina o alanina; alteraciones que aumentan la semivida como T252L, T253S y T256F como se enseña en US62777375 y muchas otras. Son especialmente útiles las alteraciones que mejoran las propiedades Fc mientras permanecen silenciosas con respecto a la conformación, por ejemplo, conservando la unión al receptor Fc.

En el caso de que el componente Fc sea un Fc de IgG4, el Fc puede incorporar al menos la mutación S228P, y tiene la secuencia de aminoácidos establecida a continuación y referenciada en el presente documento como SEQ ID N° 24:

ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ.EDPEVQ.FNWY

VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[SEQ ID No.24]

Se divulga en el presente documento una proteína de fusión útil para inhibir la unión de SIRPa humana y CD47 humana, para así inhibir o reducir la transmisión de la señal mediada a través de CD47 unido a SIRPa, la proteína de fusión que comprende un componente SIRPa humano y, fusionado con el mismo, un componente Fc, en el que el componente SIRPa comprende o consiste en un único dominio IgV de SIRPa V2 humana y el componente Fc es la región constante de una IgG humana que tiene función efectora.

La proteína de fusión puede comprender un componente SIRPa que consiste en al menos los residuos 32-137 de la forma V2 de la SIRPa humana de tipo salvaje, es decir, SEQ ID No.1. El componente SIRPa puede consistir en los residuos 31-148 de la forma V2 de SIRPa humana, es decir, SEQ ID No. 22. El componente Fc puede ser el componente Fc de la IgG1 humana designada P01857, y puede tener la secuencia de aminoácidos que incorpora la región inferior de la bisagra-CH2-CH3 de la misma, es decir, SEQ IDNo.2.

Se divulga en el presente documento una proteína de fusión SIRPaFc, como polipéptido de cadena única expresado y como fusión dimérica secretada de la misma, en la que la proteína de fusión incorpora un componente SIRPa que tiene SEQ ID N° 1 y preferentemente SEQ ID

N° 22 y, fusionada con ella, una región Fc con función efectora y que tiene la SEQ ID N° 2. Cuando el componente SIRPa es la SEQ ID No. 1, esta proteína de fusión comprende la s Eq ID No. 3, mostrada a continuación

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTIVSEST

KRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPELL

GGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST

YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV

SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKITPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

MHEALHNHYTQKSLSLSPGK* [SEQ ID No.3]

Cuando el componente SIRPa es la SEQ ID No. 22, esta proteína de fusión comprende la SEQ ID No. 25, mostrada a continuación

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVT

TVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSDKT

HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ IDNo.25]

El componente Fc de la proteína de fusión puede basarse en una IgG4, y preferentemente una IgG4 que incorpore la mutación S228P. En el caso de que la proteína de fusión incorpore el dominio IgV de SIRPa preferido de la SEQ ID No.

22, la proteína SIRPa-Fc basada en IgG4 resultante tiene la SEQ ID No. 26, mostrada a continuación

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVT

TVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSESKY

GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDYSQEDPEVQFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG

QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK [SEQ ID No.26]

La proteína de fusión puede comprender, como dominio SIRPa IgV de la proteína de fusión, una secuencia que es la SEQ ID N° 22. El SIRPaFc puede ser la SEQ ID No.25.

En la proteína de fusión SIRPaFc, el componente SIRPa y el componente Fc se fusionan, directa o indirectamente, para proporcionar un polipéptido de cadena única que se produce finalmente como un dímero en el que los polipéptidos de cadena única se acoplan a través de enlaces disulfuro intracadena formados dentro de la región Fc. La naturaleza de la región de fusión no es crítica. La fusión puede ser directa entre los dos componentes, constituyendo el componente SIRP el extremo N-terminal de la fusión y el componente Fc el extremo C-terminal. Alternativamente, la fusión puede ser indirecta, a través de un enlazador compuesto por uno o más aminoácidos, deseablemente codificados genéticamente, como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos, o cualquier número de aminoácidos entre 5 y 100 aminoácidos, como entre 5 y 50, 5 y 30 o 5 y 20 aminoácidos. Un enlazador puede comprender un péptido codificado por ADN que constituye un sitio de restricción, como un sitio BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SalI y XhoI y similares.

Los aminoácidos enlazadores típicamente y deseablemente proporcionarán cierta flexibilidad para permitir que los componentes Fc y SIRPa adopten sus conformaciones activas. Los residuos que permiten tal flexibilidad son típicamente Gly, Asn y Ser, de modo que prácticamente cualquier combinación de estos residuos (y particularmente Gly y Ser) dentro de un enlazador es probable que proporcione el efecto de enlace deseado. En un ejemplo, dicho enlazador se basa en la llamada secuencia G4S (Gly-Gly-Gly-Ser) que puede repetirse como (G4S)n donde n es 1, 2, 3 o más, o se basa en (Gly)n, (Ser)n, (Ser-Gly)n o (Gly-Ser)n y similares. El enlazador puede ser GTELSVRAKPS (SEQ ID No.21). Esta secuencia constituye la secuencia SlRPa que flanquea C-terminalmente el dominio IgV (entendiéndose que esta secuencia de flanqueo podría considerarse un enlazador o una forma diferente del dominio IgV cuando se acopla con la secuencia mínima de IgV descrita anteriormente). Sólo es necesario que la región de fusión o enlazador permita a los componentes adoptar sus conformaciones activas, y esto puede lograrse mediante cualquier forma de enlazador útil en la técnica.

La fusión SIRPaFc es útil para inhibir la interacción entre SIRPa y CD47, bloqueando así la señalización a través de este eje. Se sabe que la estimulación de la SIRPa en los macrófagos por parte de CD47 inhibe la fagocitosis mediada por los macrófagos al desactivar la miosina-II y la actividad citoesquelética contráctil implicada en la atracción de un objetivo hacia un macrófago. La activación de esta cascada es, por tanto, importante para la supervivencia de las células enfermas CD47+, y el bloqueo de esta vía permite a los macrófagos erradicar la población de células enfermas CD47+.

El término "CD47+" se utiliza con referencia al fenotipo de las células a las que se dirige la unión de los presentes polipéptidos. Las células que son CD47+ pueden ser identificadas por citometría de flujo utilizando el anticuerpo CD47 como ligando de afinidad. Los anticuerpos CD47 debidamente marcados están disponibles comercialmente para este uso (por ejemplo, el clon B6H12 está disponible en Santa Cruz Biotechnology). Las células examinadas para el fenotipo CD47 pueden incluir muestras de biopsia tumoral estándar, incluyendo particularmente muestras de sangre tomadas del sujeto que se sospecha que alberga células cancerosas CD47+ endógenas. Las células enfermas de CD47 de particular interés como objetivos para la terapia con las presentes proteínas de fusión son aquellas que "sobreexpresan" CD47.

Estas células CD47+ son típicamente células de la enfermedad, y presentan CD47 en una densidad en su superficie que excede la densidad normal de CD47 para una célula de un tipo dado. La sobreexpresión de CD47 variará en función de los distintos tipos de células, pero en el presente documento se refiere a cualquier nivel de CD47 que se determine, por ejemplo, mediante citometría de flujo como se ejemplifica en el presente documento o mediante inmunotinción o análisis de expresión génica o similares, que sea mayor que el nivel medible en una célula homóloga que tenga un fenotipo de CD47 que sea normal para ese tipo de célula.

En consecuencia, para uso terapéutico, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de la presente proteína de fusión SIRPaFc. Tal como se utiliza en el presente documento, "portador farmacéuticamente aceptable" significa todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles y útiles en el arte de la formulación de proteínas/anticuerpos. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además pequeñas cantidades de sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que mejoran la vida útil o la eficacia del agente farmacológico. En las realizaciones, la fusión SIRPaFc se formula utilizando prácticas estándar en el arte de la formulación de anticuerpos terapéuticos. Son especialmente útiles las soluciones aptas para la administración intravenosa, como por ejemplo por inyección o infusión.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes señalados anteriormente, según sea necesario, seguido de una microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación son el secado al vacío y el secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante un período de tiempo determinado necesario, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del agente farmacológico puede variar según factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del agente farmacológico para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del agente farmacológico es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

La proteína de fusión SIRPaFc puede administrarse al sujeto a través de cualquiera de las vías establecidas para la administración de proteínas, en particular la inyección o infusión intravenosa, intradérmica y subcutánea, o por administración oral o nasal. La proteína de fusión se administrará típicamente a una dosis en el intervalo de 0,5 a 15mg/kg de peso corporal del sujeto por día. Se apreciará que la dosis efectiva (una cantidad efectiva para tratar la enfermedad o condición, como se evidencia por una reducción en el crecimiento o tasa de proliferación o tamaño de las células o masa cancerosas) variará de acuerdo a un número de factores incluyendo la edad y salud general del sujeto y la severidad de la enfermedad a tratar.

La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación única variará según el sujeto que se trate y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo requerida para producir una forma de dosificación unitaria será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, del cien por ciento, esta cantidad oscilará entre aproximadamente el 0,01 por ciento y el noventa y nueve por ciento del ingrediente activo, preferentemente entre aproximadamente el 0,1 por ciento y el 70 por ciento, por ejemplo, entre aproximadamente el 1 por ciento y el 30 por ciento del ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

Una composición de la presente invención puede ser administrada a través de una o más rutas de administración utilizando uno o más de una variedad de procedimientos conocidos en el arte. Como apreciará el artesano experto, la ruta y/o el modo de administración variarán en función de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para las proteínas de fusión de la invención incluyen la intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo por inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" que incluye la inyección como la intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intrastemal y la infusión.

Alternativamente, una proteína de fusión de la invención puede administrarse por una vía no parenteral, como por instilación o por una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal o sublingual.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, o varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según lo indique la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. "Forma de dosificación unitaria", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas, adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas de unidades de dosificación de la invención están dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que debe lograrse, y (b) las limitaciones inherentes al arte de componer dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Para la administración de la proteína de fusión, la dosis unitaria estará dentro del intervalo de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más usualmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kb de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1 -10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a seis meses. Los regímenes de dosificación preferidos para la proteína de fusión de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, administrándose la proteína de fusión utilizando uno de los siguientes esquemas de dosificación; (i) cada cuatro semanas durante seis dosificaciones, y luego cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez, seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos procedimientos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de proteína de fusión en plasma de aproximadamente 1-1000 ug/ml y en algunos procedimientos de aproximadamente 25-300 ug/ml.

La presente proteína de fusión muestra una unión insignificante a los glóbulos rojos. Por lo tanto, no es necesario tener en cuenta un "sumidero" de glóbulos rojos a la hora de establecer regímenes de dosificación eficaces. En relación con otros inhibidores de SIRPa/CD47 que se unen a los glóbulos rojos, se estima que la presente fusión SIRP-Fc puede ser eficaz a dosis que son menos de la mitad de las dosis requeridas para los fármacos que se unen a los glóbulos rojos, como los anticuerpos CD47.

Además, la proteína de fusión SIRPa-Fc es un antagonista dedicado de la señal mediada por SIRPa, ya que muestra un agonismo insignificante de CD47 cuando se une a ella. Por lo tanto, no es necesario, al establecer regímenes de dosificaciones unitarias médicamente útiles, tener en cuenta cualquier estimulación inducida por el fármaco.

La proteína de fusión también puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían en función de la semivida de la proteína de fusión en el paciente. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar en función de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes siguen recibiendo tratamiento durante el resto de su vida. En las aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine, y preferentemente hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de entonces, el paciente puede ser tratado con un régimen profiláctico.

Las proteínas SIRPaFc de la presente invención son útiles para tratar una variedad de células enfermas CD47+. Entre ellas se encuentran especialmente las células cancerosas CD47+, incluyendo los tumores líquidos y sólidos. En una realización, las proteínas SIRPaFc se utilizan para inhibir el crecimiento o la proliferación de cánceres hematológicos. Tal y como se utiliza en este documento, el "cáncer hematológico" se refiere a un cáncer de la sangre, e incluye la leucemia, el linfoma y el mieloma, entre otros. "Leucemia" se refiere a un cáncer de la sangre, en el que se producen demasiados glóbulos blancos que son ineficaces para combatir las infecciones, desplazando así a las otras partes que componen la sangre, como las plaquetas y los glóbulos rojos. Se entiende que los casos de leucemia se clasifican como agudos o crónicos. Algunas formas de leucemia pueden ser, a modo de ejemplo, la leucemia linfocítica aguda (ALL); la leucemia mieloide aguda (AML); la leucemia linfocítica crónica (CLL); la leucemia mielógena crónica (CMK); el trastorno/neoplasma mieloproliferativo (MPDS) y el síndrome mielodisplásico. "Linfoma" puede referirse a un linfoma de Hodgkin, a un linfoma no Hodgkin tanto indolente como agresivo, a un linfoma de Burkitt y a un linfoma folicular (de células pequeñas y de células grandes), entre otros. El mieloma puede referirse al mieloma múltiple (MM), al mieloma de células gigantes, al mieloma de cadena pesada y al mieloma de cadena ligera o de Bence-Jones.

En algunas realizaciones, el cáncer hematológico tratado con la proteína SIRPaFc es una leucemia CD47+, preferentemente seleccionada entre la leucemia linfocítica aguda, la leucemia mieloide aguda, la leucemia linfocítica crónica, la leucemia mielógena crónica y el síndrome mielodisplásico, preferentemente, la leucemia mieloide aguda humana.

En otras realizaciones, el cáncer hematológico tratado con la proteína SIRPaFc es un linfoma o mieloma CD47+ seleccionado entre el linfoma de Hodgkin, el linfoma no Hodgkin indolente y agresivo, el linfoma de Burkitt, el linfoma folicular (de células pequeñas y de células grandes), el mieloma múltiple (MM), el mieloma de células gigantes, el mieloma de cadena pesada y el mieloma de cadena ligera o de Bence-Jones, así como el leimiosarcoma.

Los tumores sólidos también pueden ser tratados con la presente proteína de fusión, para reducir el tamaño, el número o la tasa de crecimiento de los mismos y para controlar el crecimiento de las células madre cancerosas. Entre estos tumores sólidos se encuentran los tumores CD47+ de vejiga, cerebro, mama, pulmón, colon, ovarios, próstata, hígado y otros tejidos también.

La proteína SIRPaFc puede ser administrada sola, como monoterapia, o en combinación con cualquier otro agente útil en el tratamiento de la indicación objetivo.

La proteína SIRPaFc también es útil para detectar la presencia de células CD47+. Esto puede lograrse de forma indirecta, incubando primero la proteína y las células de prueba con la proteína de fusión y luego sondeando con un agente detectable que se une a la proteína de fusión, o directamente proporcionando la proteína de fusión en forma marcada.

En otro aspecto, la presente invención presenta la proteína de fusión conjugada con una fracción diagnóstica o terapéutica, como un marcador detectable, una citotoxina, un fármaco o una radiotoxina. Los conjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan "inmunotoxinas" o conjugados farmacológicos. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, que las mate). Los ejemplos incluyen taxol, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, mighramicina y actinomicina D. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina y citarabina), agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, busulfán, mitomicina C y cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina y doxorrubicina) y antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC), y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina)

Ejemplos no limitantes de marcadores detectables a los que se puede conjugar una proteína de fusión incluyen fluoresceína, cianina, Cy-3, biotina, radioisótopos incluyendo I-123 e I-125, y similares. Las proteínas de fusión pueden etiquetarse con dichos marcadores detectables por procedimientos conocidos en la técnica. Las citotoxinas pueden conjugarse con las proteínas de fusión de la invención utilizando la tecnología de enlaces disponible en la técnica. Los ejemplos de tipos de enlazadores que se han utilizado para conjugar una citotoxina con una proteína de fusión incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptidos.

Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden conjugarse con un isótopo radiactivo para generar radiofármacos citotóxicos, también denominados radioconjugados. Entre los ejemplos de isótopos radiactivos que pueden conjugarse con proteínas de fusión para su uso diagnóstico o terapéutico se encuentran, pero no se limitan a, el yodo131, el indio111, el itrio90 y el lutecio177. Los procedimientos para preparar radioconjugados están establecidos en la técnica.

En una realización, las proteínas de fusión pueden utilizarse para detectar los niveles de CD47, o los niveles de células que contienen CD47 en su superficie de membrana. La detección de CD47 utilizando una proteína de fusión SIRPaFc puede lograrse, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra (como una muestra in vitro ) y una muestra de control con la proteína de fusión en condiciones que permitan la formación de un complejo entre la proteína de fusión y CD47. Los complejos formados entre la proteína de fusión y CD47 se detectan y se comparan en la muestra y en el control. Por ejemplo, los procedimientos de detección estándar, bien conocidos en la técnica, como los ensayos ELISA y de citometría de flujo, pueden realizarse utilizando las composiciones de la invención.

Las proteínas de fusión son, por tanto, útiles para fines de diagnóstico, incluidas las pruebas de muestras y la obtención de imágenes in vivo, y para fines terapéuticos con el fin de tratar enfermedades que tienen, como sello distintivo, células enfermas en las que CD47 está sobrerregulado.

Para cualquiera de los propósitos, la proteína de fusión puede conjugarse con un agente apropiado, para formar un conjugado farmacológico. Los agentes apropiados para el tratamiento de la enfermedad incluyen agentes citotóxicos como los quimioterapéuticos y los radioterapéuticos. Para fines de diagnóstico, los agentes apropiados son etiquetas detectables que incluyen radioisótopos, para la obtención de imágenes de todo el cuerpo, y radioisótopos, enzimas, etiquetas fluorescentes y otras etiquetas de anticuerpos adecuadas para el análisis de muestras.

Para la detección de CD47, las etiquetas detectables pueden ser de cualquiera de los diversos tipos utilizados actualmente en el campo del diagnóstico in vitro, incluidas las etiquetas de partículas que incluyen soles metálicos como el oro coloidal, isótopos como I125 o Tc99 presentados, por ejemplo, con un agente quelante peptídico del tipo N2S2, N3S o N4, cromóforos que incluyen marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores fosforescentes y similares, así como etiquetas enzimáticas que convierten un sustrato determinado en un marcador detectable, y etiquetas de polinucleótidos que se revelan tras la amplificación, como por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Las etiquetas enzimáticas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina y similares. Por ejemplo, la etiqueta puede ser la enzima fosfatasa alcalina, que se detecta midiendo la presencia o la formación de quimioluminiscencia tras la conversión de sustratos de 1,2 dioxetano como el adamantilo metoxi fosforiloxi fenil dioxetano (AMPPD), 3-(4-(metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo{3.3.1.1 3,7}decan}-4-il) fenil fosfato de disodio (CSPD), así como CDP y CDP-star® u otros sustratos luminiscentes bien conocidos por los expertos, por ejemplo los quelatos de lantánidos adecuados como el terbio (III) y el europio (III). El medio de detección viene determinado por la etiqueta elegida. La apariencia de la etiqueta o de sus productos de reacción puede lograrse a simple vista, en el caso de que la etiqueta sea de partículas y se acumule en niveles adecuados, o utilizando instrumentos como un espectrofotómetro, un luminómetro, un fluorímetro y similares, todo ello de acuerdo con la práctica habitual.

Para la terapia basada en la proteína de fusión SIRPaFc, la citotoxina puede ser conjugada con la proteína de fusión a través de una interacción no covalente, pero más deseablemente, son acopladas por enlace covalente ya sea directamente o, más preferentemente, a través de un enlazador adecuado. En una realización preferida, el conjugado comprende una citotoxina y una proteína de fusión. Los conjugados de la proteína de fusión y la citotoxina se realizan utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales como el propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol), el iminotiolano, los derivados bifuncionales de imidoésteres como el HCl de dimetil adipimidato, ésteres activos como el suberato de disuccinimidilo, aldehídos como el glutaraldehído, compuestos bis-azidos como la bis-(p-diazonio-benzoil)-etilendiamina), diisocianatos como el 2,6-diisocianato de tolueno y compuestos fluorados bis-activos (como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El ácido 1-isotiocianobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con C14 es un agente quelante adecuado para la conjugación del radionúclido con el anticuerpo.

El componente citotóxico del inmunoconjugado puede ser un agente quimioterapéutico, un anticuerpo terapéutico, una toxina como una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma, o una toxina de molécula pequeña, o un isótopo radiactivo como 212Bi, 131I, 131In, 111In, 90Y, y 186Re, o cualquier otro agente que actúe para inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula cancerosa.

Entre los agentes quimioterapéuticos útiles para la generación de dichos conjugados farmacológicos se encuentran los maytansinoides, incluidos DM-1 y DM-4, las auristatinas, la adriamicina, la doxorrubicina, la epirubicina, el 5-fluorouracilo, el arabinósido de citosina ("Ara-C"), la ciclofosfamida, latiotepa, el busulfán, la citoxina, lostaxoides, por ejemplo paclitaxel y docetaxel, taxotere, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas, 5-FU, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, actinomicina D, VP-16, clorambucil, melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se incluyen los agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en los tumores, como el tamoxifeno y la onapristona. Las toxinas y sus fragmentos que pueden utilizarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no vinculantes de la toxina de la difteria, la toxina del cólera, la toxina botulínica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, Las proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de diantina, las proteínas de Phytolaca Americana (PAPI, PAPII y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia, la curcina, la crotina, la sapaonaria, el inhibidor de officinalis, la gelonina, la saporina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina y los tricotecenos. Las toxinas de moléculas pequeñas incluyen, por ejemplo, las calicheamicinas, los maytansinoides, la palitoxina y el CC1065.

Las proteínas de fusión se unen selectivamente al antígeno diana, CD47, y se utilizan, de acuerdo con un aspecto de la invención, para cribado de células cancerosas y de otras enfermedades para detectar aquellas que presentan el antígeno CD47 en alta densidad. En una realización preferida, el cribado se aplica a una muestra de células cancerosas tomada de un sujeto candidato a la terapia con la proteína de fusión SIRPaFc. Los sujetos que den positivo a las células cancerosas que presenten el antígeno CD47 en alta densidad pueden entonces ser programados para la terapia con la presente proteína de fusión, o un híbrido conjugado de la misma. Las técnicas estándar, combinadas con las proteínas de fusión descritas en el presente documento, pueden utilizarse para examinar las células cancerosas. Deseablemente, la proteína de fusión incorpora una etiqueta detectable. La etiqueta puede ser detectable por sí misma. (por ejemplo, etiquetas radioisotópicas o fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable. Los radionucleidos que pueden servir como etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, y Pd-109.

La detección in situ de la unión a las células cancerosas CD47+ puede realizarse, utilizando el presente anticuerpo o fragmento, mediante inmunofluorescencia o microscopía inmunoelectrónica. Para ello, se extrae una muestra histológica del paciente y se le aplica una forma marcada de la proteína de fusión, preferentemente superponiendo el anticuerpo a una muestra biológica. Este procedimiento también permite examinar la distribución del antígeno CD47 en el tejido tumoral sometido a biopsia. Será evidente para los expertos en la materia que hay una gran variedad de procedimientos histológicos disponibles para la detección in situ.

Más particularmente, las proteínas de fusión SIRPaFc de la presente invención pueden utilizarse para monitorizar la presencia o ausencia de reactividad de la proteína de fusión en una muestra biológica (por ejemplo, una biopsia de tejido, una célula o un fluido) utilizando ensayos de detección estándar. Los ensayos inmunológicos pueden implicar la detección directa, y son particularmente adecuados para el cribado de grandes cantidades de muestras para la presencia de células cancerosas que son CD47+. Por ejemplo, la proteína de fusión puede utilizarse en el papel de cualquier anticuerpo en cualquier formato de inmunoensayo estándar (por ejemplo, ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, citometría de flujo o ensayo RIA) para medir la formación de complejos. En estos ensayos de detección puede utilizarse cualquier etiqueta apropiada que pueda visualizarse directa o indirectamente, incluyendo, sin limitación, cualquier etiqueta radiactiva, fluorescente, cromogénica (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano) o quimioluminiscente, o hapteno (por ejemplo, digoxigenina o biotina) que pueda visualizarse utilizando un anticuerpo específico de hapteno marcado u otro compañero de unión (por ejemplo, avidina). Se describen ejemplos de inmunoensayos, por ejemplo, en Ausubel et al, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988), y Moynagh y Schimmel, Nature 400:105, 1999. Por ejemplo, utilizando las proteínas de fusión descritas en el presente documento, la alta densidad de CD47 se detecta fácilmente en la superficie celular utilizando procedimientos estándar de citometría de flujo. Las muestras que contienen el complejo marcado en comparación con las muestras de control apropiadas se consideran indicativas de la presencia de una alta densidad de CD47 y, por tanto, de un cáncer u otra enfermedad susceptible de tratamiento con las presentes proteínas de fusión.

Se apreciará que las presentes proteínas de fusión comprenden dos moléculas, cada una de las cuales comprende un polipéptido de cadena simple que incorpora un componente proteico SIRPa fusionado a un componente Fc. La fusión de los polipéptidos de cadena simple para formar un dímero es el resultado de los puentes disulfuro que se forman entre los componentes Fc cuando los polipéptidos de cadena simple son secretados por la célula huésped que los produce. Así, el producto recuperado como proteína de fusión es una proteína dimérica resultante del enlace disulfuro entre dos moléculas del polipéptido de cadena simple que incorpora tanto el componente Fc como el componente SIRPa.

La presente invención proporciona así no sólo los polipéptidos de cadena única en los que el componente proteico SIRPa se fusiona con la región Fc, es decir, el componente CH, sino que también proporciona una proteína de fusión dimérica en la que dos copias de estos polipéptidos de cadena única se fusionan a través de sus respectivos componentes Fc. Las formas multiméricas, en las que se fusionan más de dos copias de cada polipéptido, también están dentro del ámbito de la invención.

Para producir las presentes proteínas de fusión SIRPaFc, se obtiene el ADN que codifica una forma secretable del polipéptido de cadena simple, se incorpora dentro de un vector de expresión/secreción adecuado y luego se transfecta en un huésped de producción adecuado. El cultivo del transfectante resultante produce la proteína de fusión dimérica como un producto secretado que puede ser cosechado y purificado, todo ello de acuerdo con la práctica establecida, y como se ejemplifica en el presente documento. Un polipéptido en forma de cadena simple puede obtenerse de forma similar, pero se produce sin la ayuda de una señal de secreción y en un huésped como un procariota, de forma que no se produce la dimerización y el polipéptido es recuperable como proteína intracelular.

En consecuencia, se divulgan en el presente documento polinucleótidos, incluidos el ADN y el ARN, que al expresarse producen una forma secretable de los polipéptidos de cadena simple que constituyen las presentes proteínas de fusión. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de cadena única preferido y secretable comprende la secuencia de ADN que tiene la SEQ ID No. 8, en la que los primeros 90 residuos codifican la señal de secreción de 30 meros nativa de la SIRPa humana, y los restantes residuos de ácido nucleico (SEQ ID No. 7) codifican el polipéptido de cadena única SIRPaFc. Las realizaciones incluyen polinucleótidos en los que uno o más codones son sustituidos por codones sinónimos de los ilustrados.

Se divulga en el presente documento un polinucleótido que codifica una forma secretable de la proteína de fusión basada en IgG1 que tiene la SEQ ID N°25, el polinucleótido que comprende la SEQ ID N°27. También se proporciona un polinucleótido que codifica una forma secretable de la proteína de fusión basada en IgG4 que tiene la s Eq ID N° 26, el polinucleótido que comprende la SEQ ID N° 28.

Se apreciará que los polinucleótidos pueden sintetizarse de novo, utilizando técnicas estándar de síntesis de genes y de clonación y amplificación para ensamblar los polinucleótidos intactos. Alternativamente, y por ejemplo, un polinucleótido que codifica el componente proteico SIRPa (por ejemplo, SEQ ID No. 5) y un polinucleótido que codifica el componente Fc seleccionado (por ejemplo, SEQ ID No. 6) pueden obtenerse mediante amplificación por PCR a partir de fuentes disponibles públicamente de estos genes, y los polinucleótidos amplificados pueden unirse por ligadura, ya sea directamente o a través de un enlazador que codifique uno o más residuos de aminoácidos inocuos en términos de actividad biológica, todo ello de acuerdo con las técnicas establecidas, y como se ejemplifica en el presente documento.

Para la expresión, se incorpora un polinucleótido que codifica el polipéptido de cadena única en forma secretable dentro de vectores tales como plásmidos adecuados para expresar los polinucleótidos en el huésped de producción de proteínas de fusión elegido. Dichos vectores están disponibles en el mercado y suelen estar construidos para permitir la introducción del polinucleótido que codifica la proteína de fusión secretable directamente bajo el control de un promotor eficaz para impulsar la expresión en el huésped elegido. Los procedimientos de transfección del huésped están bien establecidos en el arte, y los sistemas de expresión que incluyen vectores, y los hospedadores de expresión para dichos vectores, están disponibles comercialmente. Entre ellos se encuentran los vectores pcDNA adecuados para la cotransfección en los huéspedes 293, CHO o NSO, para expresar los polinucleótidos codificadores de proteínas de fusión bajo el control del promotor CMV, disponibles en Invitrogen, y el sistema de vectores pTandem-1 para expresar cadenas de proteínas de fusión bajo el promotor CMV y a partir de ARN bicistrónico en los huéspedes 293, c Ho o NSO, también disponibles en Invitrogen. Otro sistema de expresión útil, descrito en los ejemplos del presente documento, hace uso del promotor CMV y está disponible comercialmente en el Biotechnology Research Institute de Montreal, Canadá.

Los huéspedes de producción adecuados para las proteínas de fusión de la invención son células que incorporan, de forma transitoria o estable, un polinucleótido que codifica el polipéptido de cadena simple formador de la fusión en forma secretable. La forma expresada de la proteína de fusión incorpora una secuencia de señalización que permite la secreción de cada cadena de proteína de fusión del huésped, permitiendo así la formación de los enlaces disulfuro deseados dentro y a través de las cadenas de proteína de fusión producidas, y proporcionando una proteína de fusión funcional. La señal de secreción puede ser codificada por cualquier señal funcional en el huésped elegido. En una realización, la señal de secreción es la señal de secreción normalmente asociada al componente proteico SIRPa.

Las células huésped de mamífero adecuadas para expresar las proteínas de fusión recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO, incluidas las células dhfr-CHO y las células CHOcTA), células de mieloma NSO, células SOS y células SP2. En una realización específica, el huésped es una línea celular CHO, como una línea celular CHO-S. Para su uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión del gen GS divulgado en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Las proteínas de fusión se producen cultivando las células huésped transfectadas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la secreción de la proteína de fusión en el medio de cultivo en el que crecen las células huésped. Las proteínas de fusión pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando procedimientos estándar de purificación de proteínas, todo ello como se ha ejemplificado ahora.

Ejemplos

En la descripción del trabajo que sigue, se hace referencia a las proteínas de fusión por código. Por comodidad, a continuación se resumen los componentes funcionales de las fusiones referidas:

Tabla 1

(continuación)

Todas las regiones Fc de la IgG4 humana poseen la mutación S228P estabilizadora de la bisagra, excepto cuando se indica con un asterisco (*). Los Fc IgG4 designados como "mut" contienen mutaciones en las posiciones 233-236 (sistema de numeración de la EU) que reducen aún más la unión del FcyR (Armour et al. 1999 Eur. J. Immunol, 29:2613). AFD6 (L4V, V6I, A27I, I31F, E47V, K53R, E54Q, H56P, V63I, L66T, K68R, V92I) y las mutaciones CV1 (V6I, A27I, I31F, E47V, K53R, E54Q, H56P, L66T, V92I) descritas en Weiskopf et al. 2013 Science 341:88. " Proteína comercialmente disponible vendida por R&D Systems (Cat #4546-SA-050).

1. Producción de la proteína de fusión SIRPa-Fc

Los constructos SIRPaFc se generaron mediante un proceso de clonación en tres etapas, utilizando los cebadores que se muestran a continuación:

En la primera reacción de PCR, se amplificaron 100 ng de ADN molde (SIRPa humano sintético GenBank#AAH26692, de Blue Heron Biotechnology) utilizando la ADN polimerasa Pfx de platino (Invitrogen) en 1 mM de MgSO4, 0,4 mM de cada dNTP y 20 pmol de cada cebador, según las condiciones siguientes:

TTI-602: cebadores P#5863 y P#5929; fusión inicial a 94°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en 94°C durante 1 min, 56°C durante 2 min y 68°C durante 2 min.

TTI-616: cebadores P#5863 y P#0874; fusión inicial a 94°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en 94°C durante 1 min, 50°C durante 1,5 min y 63°C durante 3 min.

TTI-621: cebadores P#5863 y P#4197; fusión inicial a 94°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en 94°C durante 0,5 min, 50°C durante 1,5 min y 63°C durante 3 min.

TTI-622: cebadores P#5863 y P#4195; fusión inicial a 94°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en 94°C durante 0,5 min, 50°C durante 1,5 min y 63°C durante 3 min.

Las reacciones se mantuvieron a 72°C durante 10 minutos y se enfriaron a 4°C. Los productos de la reacción se electroforizaron en geles de agarosa al 1-1,4 % y se visualizaron con bromuro de etidio.

A continuación, los fragmentos de IgG Fc se amplificaron en la reacción PCR2, utilizando la ADN polimerasa Pfx (Invitrogen), en 1 mM de MgSO4, 0,4 mM de cada dNTP, 20 pmol de cada cebador y 100 ng de ADN molde (IgG1 humana e IgG4 humana, previamente clonadas) en las siguientes condiciones

TTI-602: cebadores P#5930 y P#1035; fusión inicial a 94°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en 94°C durante 1 min, 56°C durante 2 min y 72°C durante 2 min.

TTI-616: cebadores P#0875 y P#1035; fusión inicial a 94°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en 94°C durante 1 min, 50°C durante 1,5 min y 63°C durante 3 min.

TTI-621: cebadores P#4198 y P#1737; fusión inicial a 94°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en 94°C durante 0,5 min, 60°C durante 0,5 min y 68°C durante 0,5 min.

TTI-622: cebadores P#4196 y P#2058; fusión inicial a 94°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en 94°C durante 0,5 min, 50°C durante 1,5 min y 63°C durante 3 min.

Las reacciones se mantuvieron a 72°C durante 10 minutos y se enfriaron a 4°C. Los productos de la reacción se electroforizaron a través de geles de agarosa al 1-1,4 % y se visualizaron con bromuro de etidio.

Finalmente, el ADNc de SIRPa y Fc se ensambló mediante PCR solapada en la reacción PCR3. Los productos de la PCR1 y la PCR2 (100 ng) se incubaron con la ADN polimerasa platino Pfx (Invitrogen), en 1 mM de MgSO4, y 0,4 -0,8 mM de cada dNTP a 94°C durante 5 min, seguidos de 10 ciclos que consistieron en 94°C durante 30 seg -1 min, luego 52-60°C durante 80 seg - 3min, y enfriados a 4°C. A continuación, se añadieron los cebadores (20 - 40 pmol cada uno) a la primera reacción y se ejecutó una reacción de segunda etapa en las siguientes condiciones: fusión a 94°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en 94°C durante 30 seg -1 min, 50-56°C durante 30 seg -3 min y 30 seg. Los detalles de cada condición se encuentran a continuación:

TTI-602: 10 ciclos a 94°C durante 1 min y 56°C durante 3 min, seguidos de 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 2,5 min y 72°C durante 3 min utilizando los cebadores P#5863 y P#1035.

TTI-616: Sin primer ciclo de PCR; 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 2 min y 63°C durante 3,5 min utilizando los cebadores P#5863 y P#1035.

TTI-621: 10 ciclos a 94°C durante 1 min y 52°C durante 3 min, seguidos de 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 52°C durante 2 min y 63°C durante 4 min utilizando los cebadores P#5863 y P#1737.

TTI-622: 10 ciclos a 94°C durante 1 min y 60°C durante 3 min, seguidos de 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 52°C durante 2 min y 63°C durante 4 min utilizando los cebadores P#5863 y P#2058.

Las reacciones se mantuvieron a 68-72°C durante 7-8 minutos y se enfriaron a 4°C. Los productos de la reacción se separaron a través de geles de agarosa al 1-1,4 % y se visualizaron con bromuro de etidio y se ligaron en el vector de expresión pMPG (Biotechnology Research Institute de Montreal, Canadá) de la siguiente manera: La banda de ADN de interés de la amplificación por PCR se extrajo y purificó del gel de agarosa utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). Este producto de PCR purificado se digirió con las enzimas de restricción Nhel y BamHI (New England BioLabs) y se purificó del gel utilizando el kit de purificación de gel Qiaquick (Qiagen). A continuación, el fragmento se ligó con la ADN ligasa T4 (Invitrogen) en el plásmido de expresión pMPG, que había sido digerido de forma similar con las enzimas NheI y BamHI. El plásmido pMPG utiliza un promotor CMV y un terminador TK Poly A y contiene un marcador de selección de resistencia a la higromicina. a continuación, se transformaron 2 pl de la reacción de ligación en 25 pl de células competentes de E. coli DH5a (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las transformantes se extendieron en placas de LB-agar que contenían 100 pg/ml de ampicilina (Sigma), y se incubaron a 37°C durante 20 horas. El ADN del plásmido se extrajo y purificó a partir de cultivos de E. coli a pequeña escala utilizando el kit QIAprep Spin mini-prep (Qiagen), y la secuencia del ADN se confirmó mediante secuenciación automatizada utilizando ddNTPs conjugados con colorantes fluorescentes (Core Molecular Biology Facility, York University). Para las transfecciones, se prepararon grandes cantidades de ADN plasmídico utilizando el kit EndoFree Plasmid Maxi (Qiagen), y luego se reconfirmó la secuencia mediante secuenciación automatizada utilizando ddNTPs conjugados con tintes fluorescentes (Core Molecular Biology Facility, York University).

Producción de líneas celulares

Se generaron transfectantes estables utilizando la línea celular CHO-S (Invitrogen). En resumen, el ADN plasmídico aislado se linealizó mediante XbaI (New England BioLabs), y se purificó utilizando columnas QIAGEN (Qiagen). Las células CHO-S que crecían en un medio químico definido sin suero (CD-CHO, Invitrogen) complementado con 8 mM de L-glutamina y un suplemento de 1xHT se transfectaron con el plásmido linealizado utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 48 horas, las células se transfirieron a placas de 96 pocillos y se sembraron a diferentes concentraciones (10000, 5000 o 2000 células/pocillo) en medio que contenía 600 pg/ml de higromicina B (Invitrogen). El control de transfección simulada se realizó de forma idéntica sin añadir ADN a la mezcla. a las 2-3 semanas de la transfección se recogió un panel de oligoclones resistentes a los fármacos y los sobrenadantes de un estudio de expresión de 48 horas se analizaron por ELISA como sigue: las placas de 96 pocillos se recubrieron con 0,1 pg/pocillo de Ab de captura (IgGFc antihumano de cabra), y se incubaron durante la noche a 4°C. Los pocillos se lavaron y se bloquearon con 200pl de BSA al 2 % en PBST a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras el lavado, se diluyeron 100 pl de muestras con BSA al 1 % en PBST, se añadieron a los pocillos, se incubaron durante 1 hora, se lavaron y, a continuación, se incubaron con el Ab de detección conjugado con HRP (IgGFc de cabra conjugado con HRP), durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se lavaron los pocilios y se añadió el sustrato TMB (Moss Inc.) y se incubó durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. La absorbencia se midió a una longitud de onda de 450 nm/655 nm utilizando el lector de microplacas iMark (Biorad), y se construyó una curva estándar utilizando una cantidad conocida de proteína de fusión purificada. Se realizó una segunda dilución limitante de los 3 oligoclones de mayor expresión a concentraciones celulares más bajas (0,1, 0,25 y 0,5 células/pocillo) en medio CD-CHO completo que contenía 600 pg/ml de higromicina B. Después de 2 a 3 semanas, los clones resistentes al fármaco se evaluaron de nuevo para la producción de proteínas recombinantes mediante ELISA, como se ha descrito anteriormente. La productividad se expresó en pg/célula/día y estuvo en el intervalo de 1,4 - 23,9 pg/célula/día para las proteínas de fusión SIRPa humanas. Los clones unicelulares de mayor expresión se utilizaron para la producción de lotes de sobrenadantes en un sistema de biorreactor WAVE. En algunos casos, antes de llegar a la fase de clon único, se utilizó el mejor clon de oligo para la producción.

Purificación de proteínas

Para la producción rápida de pequeños lotes de proteínas, algunos lotes de SIRPaFc se hicieron en células 293F transfectadas transitoriamente. En resumen, se cultivaron células FreeStyle 293F (Invitrogen) en medio 293F (Invitrogen), se transfectaron con ADN plasmídico no linealizado y el reactivo 293Fectin (Invitrogen) y se cultivaron en lotes de frascos agitadores en volúmenes de 80-100 ml/frascos a 37°C, 5 % de CO² durante 3-6 días. La densidad y la viabilidad de las células se controlaron cada día hasta que la viabilidad de las células descendió a un 90 %. La viabilidad de las células en el momento de la recolección del lote era del 85-90 %.

Para la purificación a partir de células CHO-S, se generó un sobrenadante de cultivo de 5 o 10 L a partir de clones de células individuales u oligo de alta expresión transfectadas de forma estable en un sistema de biorreactor de bolsa desechable WAVE Base20/50 EHT (GE Healthcare). En resumen, las transfectantes CHO-S se cultivaron en frascos estáticos T150 en un medio de crecimiento completo (CD-CHO complementado con 8 mM de L-glutamina, suplemento 1xHT y 600 pg/ml de higromicina B) a 37°C para producir un número suficiente de células para iniciar un cultivo de 1 L o 2 L a 0,5*10^® células/ml para una serie de 5 L o 10 L respectivamente. Se inoculó la bolsa del biorreactor y se incubaron las células a 37°C, 10 % de CO², velocidad de balanceo 15-20 rpm, ángulo 7° y flujo de aire 0,2-0,4 Lpm. Cuando el cultivo alcanzó una densidad de 2 a 2,5*10^® células/ml (normalmente a los 2-3 días de la inoculación), el biorreactor se amplió a 5 L o 10 L y s e siguió incubando a 37°C, 10 % de CO², velocidad de oscilación 15-20, ángulo 7°, flujo de aire 0,2-0,4 Lpm. Cuando las células han alcanzado una densidad de 1 - 1,5*10^® células/ml, se bajó la temperatura a 30°C y se siguió incubando el cultivo durante otros 7 a 10 días en las condiciones especificadas anteriormente. Comenzando el día 0 a 30°C, los cultivos se alimentaron con un suplemento de biorreactor de alimentación de CHO al 1 % (Sigma) cada dos días y se cosecharon cuando la viabilidad de las células cayó alrededor del 90 %. Se recogió el sobrenadante, se centrifugó a 3000 x g durante 40 minutos a 4°C y se congeló a - 20°C hasta su purificación.

Todas las proteínas se purificaron mediante un procedimiento de dos pasos, primero utilizando cromatografía de proteína A. El sobrenadante intercambiado con tampón se diluyó 9 veces con tampón de unión (20 mM de Na-P y 3 M de NaCl, pH 7,8) y se cargó en una columna de rProteína A (GE Healthcare) a un flujo de 2-3 ml/min (dependiendo del volumen de carga y del tiempo de carga) durante la noche a 4°C. A continuación, la columna se lavó con tampón de unión (20 volúmenes a 3 ml/min), y la proteína se eluyó con ácido cítrico 0,1 M de pH 4,0 y pH 2,2 a 3 ml/min. El material eluido se ajustó a pH neutro con 1M y posteriormente se purificó utilizando el cromatógrafo HiTrap Phenyl HP. En resumen, las proteínas se diluyeron al menos 4 veces en sulfato de amonio 0,2 M con pH 7,5 y se cargaron en la columna HiTrap Phenyl HP (GE Healthcare) a 2-3 ml/min (dependiendo del tamaño de la columna y del tiempo de carga). La proteína SIRPaFc no agregada se recogió en la fracción de flujo. Se utilizó la filtración de flujo tangencial utilizando una membrana BioMax 10 (Millipore) para concentrar e intercambiar la proteína en PBS pH 7,4. La calidad de cada proteína se determinó mediante SDS-PAGE, transferencia Western utilizando anticuerpo anti-IgGFc de cabra y y conjugado de HRP IgG anti-cabra de conejo, y análisis HPLC. La identidad de todas las proteínas se confirmó mediante secuenciación N-terminal y espectrometría de masas.

1. Comparación de las fusiones de SIRPaFc de uno y tres dominios

La SIRPa consiste en tres dominios extracelulares similares a la inmunoglobulina (Ig), sin embargo la unión a CD47 se localiza en el dominio N-terminal. Para determinar la región óptima de SIRPa para las fusiones de SIRPaFc, se generaron proteínas que incorporaban los tres dominios extracelulares de SIRPa (TTI-602) o el único dominio N-terminal (TTI-616).

Ambas proteínas se construyeron sobre una columna vertebral de IgG4 humana mutada que carece de función efectora. Se comparó la unión de TTI-602 y TTI-616 a CD47 humano utilizando un ensayo de unión directa (Figura 1A) y un ensayo de competencia indirecta (Figura IB). Para el ensayo de unión directa, se incubaron células Jurkat humanas CD47+ con las distintas concentraciones (según se indica) de proteínas hSIRPaFc en hielo durante 1 hora. A continuación, se lavaron las células para eliminar cualquier proteína no unida y se incubaron con un anticuerpo FITC específico anti-hIgG Fcg (Fab')² en hielo durante 1 hora. A continuación, se lavaron las células y se fijaron incubándolas con una solución de paraformaldehído al 2 % durante la noche. A continuación se lavó la solución de fijación y las células se analizaron por citometría de flujo (BD FACScan). Los datos se ajustaron a un modelo de unión de un sitio utilizando una regresión no lineal. Para el ensayo indirecto, se incubó una cantidad fija y saturada de SIRPaFc humano biotinilado (TTI-601) solo o con cantidades valoradas de TTI-602 o TTI-616 durante 15 minutos en hielo. Esta mezcla se añadió a las células humanas CD47+ Jurkat, se incubó en hielo durante 1 hora, se lavó para eliminar las proteínas no unidas y se incubó con una cantidad saturada de estreptavidina-PE en hielo y en la oscuridad durante 1 hora. A continuación, las células se lavaron, se fijaron y se analizaron por citometría de flujo como se ha indicado anteriormente. A continuación se normalizaron las medias geométricas, siendo el 100 % de inhibición la media geométrica de la estreptavidina-PE sola y el 0 % de inhibición la media geométrica del TTI601 biotinilado solo. Se obtuvo una línea de mejor ajuste mediante un análisis de regresión no lineal utilizando el ajuste de la curva dosisrespuesta sigmoidal (Prism, Graphpad).

Los datos de las Figuras 1A y 1B muestran claramente una diferencia de unión entre el TTI-602 y el TTI-616, con el TTI-616 uniéndose con mayor afinidad en ambos ensayos. En el ensayo de unión directa, TTI-616 se unió con una afinidad 10 veces mayor que TTI-602 (valores EC50: 13,4 nM frente a 139 nM). En el ensayo de unión indirecta, TTI-616 se unió con una afinidad 7 veces mayor que TTI-602 (valores EC50: 4,5 nM frente a 32,1 nM). Estos resultados fueron inesperados, ya que los datos publicados anteriormente indican que el dominio N-terminal de SIRPa se unió a CD47 con una afinidad comparable a la de SIRPa que contiene los tres dominios extracelulares (Hatherley et al. 2007 J. Biol. Chem. 282:14567).

2. Diseño de fusiones SIRPaFc humanas con diferentes regiones Fc

Una vez establecida la preferencia por una proteína de fusión que incorpore un único dominio SIRPa, se realizaron estudios para determinar la región Fc óptima. Se generaron tres fusiones humanas diferentes de SIRPaFc que contienen la misma región SIRPa (31-148) pero que se construyeron sobre diferentes componentes Fc que tienen una actividad efectora variable. Los detalles del diseño se resumen en la Tabla 2. Las secuencias de ADN y proteínas anotadas se muestran en el Apéndice 1.

Tabla 2. Diseño de proteínas de fusión SIRPaFc humanas.

3. Unión de fusiones SIRPaFc a CD47

Se compararon las tres fusiones de SIRPaFc para su unión a la superficie celular de CD47 humano. En resumen, las células Jurkat humanas CD47+ se incubaron con las distintas concentraciones (como se indica) de proteínas hSIRPaFc en hielo durante 1 hora. A continuación, se lavaron las células para eliminar cualquier proteína no unida y se incubaron con un anticuerpo Fcg específico (Fab')² FITC anti-hIgG en hielo durante 1 hora. A continuación, se lavaron las células y se fijaron incubándolas con una solución de paraformaldehído al 2 % durante la noche. A continuación se lavó la solución de fijación y las células se analizaron por citometría de flujo (BD FACScan). A continuación, se normalizaron las medias geométricas y se generaron las curvas de unión y los valores de Kd con Prism (Graphpad) utilizando una regresión no lineal que ajustaba los datos a un modelo de unión de un sitio.

Como se muestra en la Figura 2, las tres proteínas de fusión mostraron perfiles de unión muy similares, produciendo valores de afinidad de unión (Kd) casi idénticos (2,3-2,4 nM). Esto era de esperar, ya que lastres proteínas contienen la misma región SIRPa y no se preveía que la región Fc afectara a la unión del ligando.

4. Actividad pro-fagocitosis in vitro de las fusiones SIRPaFc

El bloqueo de CD47 por SIRPaFc aumenta la fagocitosis de las células tumorales humanas de leucemia mieloide aguda (AML) por parte de los macrófagos humanos activados. La actividad profagocítica de las tres proteínas de fusión se comparó in vitro para determinar si la región Fc afecta a la fagocitosis de la AML. Los macrófagos humanos se generaron aislando primero los monocitos CD14+ a partir de células mononucleares de sangre periférica humana purificadas con Ficoll mediante selección magnética. Los monocitos se cultivaron en medios X-vivo que contenían factor estimulante de colonias de monocitos humanos a 20 ng/ml durante al menos 1 semana para promover el desarrollo en macrófagos. A continuación, los macrófagos se colocaron en portaobjetos de vidrio en una placa de cultivo de 24 pocilios y se incubaron con interferón gamma humano durante la noche. Al día siguiente, se lavaron los pocilios y se añadió LPS durante al menos 1 hora. Se contaron las células humanas de la AML y se marcaron con CFSE. Tras el marcaje, las células AML se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) con PBS, proteínas SIRPaFc o controles de isotipo. A continuación, se añadieron las células de AML a los pocillos individuales, se mezclaron y se incubaron en un incubador celular humidificado a 37°C y 5 % de CO2 durante 2 horas. Tras la incubación, se lavaron los pocillos y se marcaron los macrófagos con el conjugado de aglutinina de germen de trigo Alexa Fluor® 555 (Invitrogen, cat# W32464) durante 15 minutos a RT con agitación. A continuación se lavaron los pocillos y se fijaron con paraformaldehído al 2 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se lavaron los pocillos y se mantuvieron en la oscuridad a 4°C durante la noche. Los portaobjetos se analizaron mediante microscopía confocal de barrido (Quorum Wave FX-XI Spinning Disc Confocal System, Quorum Technologies, Guelph, ON, Canadá). La fagocitosis de las células AML se cuantificó mediante un índice de fagocitosis, como se indica a continuación: (número de células AML dentro de los macrófagos/número de macrófagos) x 100; contando al menos 200 macrófagos por muestra. Como se muestra en la Figura 3, el TTI-621 y el TTI-622 presentan una actividad pro­ fagocitosis similar, mientras que el TTI-616 es claramente más débil (esto es particularmente evidente a la dosis de 10 nM). Esto indica que se requiere una región Fc de tipo salvaje IgG4 o IgG1 para la máxima destrucción de células tumorales desencadenada por SIRPaFc por parte de los macrófagos.

Se evaluó un panel ampliado de proteínas de fusión SIRPaFc para la actividad de fagocitosis utilizando la línea celular de AML OCI/AML-2 como dianas. Como se muestra en la Figura 6, los datos indican claramente que el nivel más alto de fagocitosis de AML-2 es inducido por proteínas de fusión que contienen un único dominio SIRPa y una región Fc de IgG4 o IgGI de tipo salvaje (es decir, T^t I-622, -620 o TTI-621). Las proteínas de fusión que carecen de cualquier función de efector Fc (por ejemplo, TTI-616) pueden desencadenar la fagocitosis, pero el efecto es considerablemente más débil. Esto concuerda con los datos de la figura 3. Los SIRPaFc con tres dominios extracelulares (TTI-601, TTI-602 e I+D) también muestran sólo un bajo nivel de actividad profagocítica, y en el caso de la fusión I+D esta pobre actividad no puede ser superada con una región Fc IgG1. Además, las proteínas de fusión que contienen secuencias SIRPa mutadas que confieren una unión a CD47 sustancialmente mayor (TTI-623 y TTI-624) no dan lugar a una mayor actividad de fagocitosis en comparación con una SIRPaFc de tipo salvaje que lleva la misma región Fc (TTI-616). Estos resultados sugieren que el aumento de la afinidad de unión a CD47 por encima del nivel alcanzado con un dominio SIRPa de tipo salvaje no produce ningún beneficio adicional in vitro. Esta conclusión es inesperada, ya que se informó de que las SIRPa mutadas FD6 y CV1 unidas a la Fc IgG4 tienen una mayor actividad profagocitaria que las SIRPa-IgG4 de tipo salvaje (Weiskopf et al. 2013 Science 341:88).

5. Actividad antileucémica in vivo de las fusiones SIRPaFc

Se probó la capacidad de las tres proteínas de fusión SIRPaFc para controlar el crecimiento de las células tumorales humanas de AML en un modelo estándar de xenotransplante. Los ratones NOD/ShiLtJ-Prkdcscid (NOD.SCID) (de 8 a 12 semanas de edad) fueron irradiados subletalmente con 275 cGy de un Y-irradiador de 137Cs 24 horas antes de la inyección intrafemoral de células de AML recogidas de un paciente de leucemia humana. A partir de tres semanas después del trasplante, los ratones fueron tratados con proteínas de fusión SIRPaFc (8 mg/kg IP tres veces por semana) o con dosis equimolares de proteínas Fc de control TTI-401 (IgG4 humana mutada) o TTI-402 (IgG1 humana). Tras 4 semanas de tratamiento, se sacrificaron los ratones y se detectaron las células leucémicas humanas en el fémur inyectado, la médula ósea no inyectada y el bazo mediante análisis de citometría de flujo, con tinción para la expresión de los marcadores CD45 y CD33 humanos. El injerto de AML se expresó como el porcentaje de células humanas CD45+CD33+ en cada compartimento.

Como se muestra en la Figura 4, la proteína de fusión TTI-621 con una región Fc IgG1 fue la única proteína capaz de mediar un efecto antileucémico en el lugar del trasplante (el fémur inyectado). En la médula ósea no inyectada, hubo un claro efecto dependiente del Fc, con TTI-621 (actividad Fc completa) > TTI-622 (baja actividad Fc) > TTI-616 (sin actividad Fc). Las tres proteínas de fusión mostraron actividad antileucémica en el bazo, aunque este sitio es una prueba de actividad menos rigurosa, ya que el nivel de injerto general (como se observa en los ratones de control) es mucho menor que en la médula ósea inyectada o no inyectada. En conjunto, estos resultados indican que una proteína SIRPaFc con una región Fc de IgG1 humana tiene la mayor actividad en un modelo de xenotransplante de AML humana. La actividad superior in vivo de la fusión basada en IgG1 no se habría predicho basándose en los datos de fagocitosis in vitro (Figura 2), en los que TTI-621 y TTI-622 mostraron una actividad similar.

6. Actividad de hemaglutinación de las fusiones SIRPaFc

Se prepararon glóbulos rojos humanos utilizando sangre entera heparinizada de donantes sanos. se trasladaron con pipeta 4 ml de sangre entera en un tubo cónico de 15 ml, se rellenó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugó a 200 x g, a temperatura ambiente, durante 10 minutos para eliminar las plaquetas. Después de aspirar la fracción de plaquetas, el tubo se llenó hasta 15mL con PBS, el contenido se mezcló bien invirtiendo el tubo y los glóbulos rojos se empaquetaron por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Este lavado se repitió 3 veces más. Tras el último lavado, se aspiró el sobrenadante y se añadió suficiente PBS a los eritrocitos empaquetados para obtener una solución de glóbulos rojos al 10 % (por ejemplo, si se obtuvieron 1mL de glóbulos rojos empaquetados, se diluyeron con 9mL de PBS para obtener una solución de glóbulos rojos al 10 %). la solución de glóbulos rojos al 10 % almacenada a 4C era utilizable en una semana. Se preparó una solución fresca de glóbulos rojos al 1 % inmediatamente antes del ensayo de hemaglutinación.

Se analizó la capacidad de las proteínas SIRPaFc expresadas en células CHO o 293 para aglutinar los glóbulos rojos humanos, como lo demuestra la agregación de glóbulos rojos y la prevención de la formación de gránulos de glóbulos rojos. El ensayo se llevó a cabo en placas de fondo redondo de 96 pocillos sin tratamiento de cultivo de tejidos y con baja unión a proteínas. Se preparó una solución fresca de glóbulos rojos al 1 % inmediatamente antes del ensayo de hemaglutinación. Se transfirieron 50 pl de solución de glóbulos rojos al 1 % a cada pocillo. Se añadieron proteínas de fusión SIRPaFc humanas diluidas en serie 3 veces a partir de una concentración final de 3 pM o un control de vehículo en 50 pl por pocillo a los pocillos correspondientes. Los pocillos se mezclaron suavemente y se incubaron durante la noche a 37°C, 5 % de CO2. Tras una incubación de una noche, se fotografiaron las placas. En ausencia de reticulación, los eritrocitos ruedan hacia el fondo de los pocillos y aparecen como un gránulo apretado. La evidencia de hemaglutinación se demuestra por la presencia de glóbulos rojos no asentados que aparecen como una neblina en comparación con un gránulo de glóbulos rojos bien definido. Las proteínas de fusión SIRPaFc que desencadenan la hemaglutinación impedirán la formación de un gránulo de glóbulos rojos y, por tanto, producirán un patrón difuso o nebuloso. Los resultados indican que las proteínas de fusión SIRPaFc de tres dominios TTI-601 y TTI-602 muestran una mayor propensión a inducir la hemaglutinación en comparación con las fusiones de un solo dominio. Esto sugiere que los SIRPaFcs de un solo dominio tendrían menos probabilidades de causar toxicidad en los glóbulos rojos in vivo.

7. Actividad agonista de CD47 de las fusiones de SIRPaFc

Las células T Jurkat humanas clon E6-1 se compraron a ATCC (Cat# TIB-152) y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10 % de FBS, 2mM de L-glutamina, 1mM de piruvato sódico, 10mM de HEPES y 1,5g/L de bicarbonato sódico. La expresión de CD47 se analizó mediante citometría de flujo demostrando la unión a la superficie celular de los mAbs anti-CD47 clones B6H12, 2D3, BRIC126 y CC2C6. El día anterior a un ensayo con agonistas se sembraron células Jurkat a ~3*105 células/ml en un medio de crecimiento completo en un matraz de cultivo de tejidos T75/T150.

Se cosecharon células T Jurkat altamente viables (>95 %) y se sembraron en un medio de crecimiento completo a razón de 2*105 células/200pl por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se pretrataron con el medio solo o con un anticuerpo bloqueador de CD47 clon B6H12 a 12,5pg/20pL por pocillo durante 1 hora a 37°C, 5 % de CO2. Las proteínas de fusión SIRPaFc o los Fcs de control se añadieron a una concentración final de 3 pM en 20pL/pocillo y el agente pro-apoptótico estaurosporina se utilizó como control positivo se añadió a 1 pM en 20pL/pocillo. Las células no tratadas (UT) recibieron 20pL/pocillo de medio solo. Las células se incubaron durante la noche a 37°C, 5 % de CO2. Tras una incubación de una noche, las células se tiñeron con el kit de detección de apoptosis Annexin-V:FITC/7-AAD de eBiosciences (Cat# 88-8005-75) siguiendo las instrucciones del fabricante y se analizaron por citometría de flujo en las 4 horas siguientes a la tinción para evitar la progresión de la apoptosis.

Como se muestra en la Figura 5, TTI-602, una fusión de tres dominios, indujo un nivel mucho mayor de apoptosis de Jurkat que las proteínas de fusión de un solo dominio TTI-616 y TTI-620. El efecto del TTI-602 fue claramente específico de CD47, ya que se neutralizó al tratar previamente las células con B6H12, un anticuerpo bloqueador de c D47. Estos resultados indican que se prefiere una proteína de fusión SIRPaFc de un solo dominio a una SIRPaFc de tres dominios para minimizar la actividad agonista de CD47.

8. Unión de eritrocitos

Una preocupación con las terapias basadas en CD47 es la expresión de la diana en la superficie de los glóbulos rojos (RBC), que tiene el potencial de actuar como un gran sumidero de antígenos y causar toxicidad hematológica. De hecho, se ha informado de anemia en animales tratados con variantes de SIRPaFcs de alta afinidad y anticuerpos específicos de CD47. Por lo tanto, se evaluó la unión de las proteínas de fusión SIRPaFc a los eritrocitos humanos mediante citometría de flujo. Los glóbulos rojos humanos se prepararon utilizando sangre entera heparinizada. La sangre entera se centrifugó a 200 x g, a temperatura ambiente, durante 10 minutos para eliminar las plaquetas. Tras la aspiración de la fracción de plaquetas, el tubo se llenó hasta el volumen original con PBS, el contenido se mezcló bien invirtiendo el tubo y los glóbulos rojos formaron gránulos por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Este lavado se repitió 3-5 veces más. Tras el último lavado, se aspiró el sobrenadante y se rellenó el tubo con PBS hasta el volumen de sangre original. Los glóbulos rojos se contaron con un hemocitómetro y se resuspendieron a 5*108 células/ml antes del ensayo de unión de glóbulos rojos. La pureza de los eritrocitos se evaluó mediante citometría de flujo con la demostración de CD235a antihumano (eBiosciences Cat #12-9978).

Se observó que las proteínas de fusión que contienen secuencias SIRPa de tipo salvaje se unen muy pobremente a los eritrocitos humanos, produciendo una señal que es menos de 2 veces por encima del fondo incluso a altas concentraciones. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales contra CD47 se unen típicamente a >100 veces por encima del fondo. La sorprendente diferencia en la unión a los glóbulos rojos entre los anticuerpos SIRPaFc y ^c D47 se muestra en la Figura 7A, que compara la unión de TTI-616 al anticuerpo CD47 B6H12 en un intervalo de concentraciones. Para demostrar que este fenómeno no es exclusivo de B6H12, se evaluaron otros tres anticuerpos CD47 (2D3, BRIC126 y CC2C6). Como se muestra en la Figura 7B, los cuatro anticuerpos se unieron a los glóbulos rojos humanos a niveles dramáticamente más altos que el SIRPaFc. Obsérvese que las proteínas de fusión SIRPaFc se unen poco a los glóbulos rojos humanos, independientemente del isotipo Fc o de la estructura de uno o tres dominios (datos no mostrados). Además, la diferencia en la unión a los eritrocitos entre los anticuerpos SIRPaFc y CD47 no refleja simplemente una diferencia en la afinidad de CD47, ya que ambas clases de proteínas se unen de forma similar a una línea celular tumoral de AML (véase la Figura 7C).

De estos estudios se obtuvieron varios resultados inesperados. En primer lugar, la afinidad de unión superior del SIRPaFc de un solo dominio en comparación con el SIRPaFc de tres dominios no es coherente con la literatura publicada. En segundo lugar, el fuerte papel de la región Fc en la eliminación de las células leucémicas in vivo es incompatible con los datos publicados por otros, que han argumentado que la eficacia de los anticuerpos CD47 se debe al bloqueo de la interacción CD47- SIRPa. Además, la eficacia superior in vivo de TTI-621 (IgG1) no se podría predecir a partir de los datos de fagocitosis in vitrn. Además, la muy baja unión del SIRPaFc de dominio único a los eritrocitos, y la baja actividad agonista de CD47, apoyan el uso médico del SIRPaFc enseñado en el presente documento con preferencia a otros inhibidores de CD47.

En conjunto, estos datos indican que una proteína de fusión SIRPaFc humana óptima debe contener un único dominio SIRPa (N-terminal) unido a una región Fc competente para el efector, como la región Fc de una IgG1 humana preferentemente, o la región Fcde una IgG4 humana convenientemente.

Apéndice 1 Resumen de los listados de secuencias

ID Tipo de secuencia Origen de la secuencia

1 aminoácido SIRPa V2 versión región IgV

2 aminoácido Región Fc de la secuencia de la IgG1 humana basada en P01857

3 aminoácido secuencia completa de la SIRPaFc madura

4 aminoácido secuencia completa de SIRPaFc secretable

5 ADN secuencia de codificación de la región similar a la IgV de la versión humana de la SIRPa V2

ADN secuencia de codificación de la región Fc de la IgG1 humana designada P018 ADN secuencia de codificación de la SIRPaFc madura

ADN secuencia de codificación de SIRPaFc secretable

ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

10 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

11 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

12 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

13 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

14 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

15 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

16 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

17 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

18 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

19 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

20 ADN cebador uti izado en la construcción del gen SIRPaFc

21 aminoácido secuencia de enlace

22 aminoácido dominio IgV de la SIRPa V2 humana

23 aminoácido secuencia del Fc de la IgG4 de tipo salvaje

24 aminoácido secuencia de IgG4 Fc alterada

25 aminoácido secuencia de SIRPaFc basada en IgG1

26 aminoácido secuencia de SIRPaFc basada en IgG4

27 ADN secuencia de codificación de la SEQ ID No. 25

28 ADN secuencia de codificación de la SEQ ID No. 26

INFORMACION DEL LISTADO DE SECUENCIAS

SIRPa V2 versión IgV [SEQ ID No.1]

EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISI SNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGA

Región Fcde IgG1 [SEQ ID No.2]

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP

SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

SIRPaGI madura [SEQ ID No.3]

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSIS ISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

SIRPaGI secretable [SEQ ID No.4]

MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARE LIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

Secuencia de codificación de la SIRPaGI madura [SEQ ID No.5]

GAG GAG CTG CAG GTG ATT CAG CCT GAC AAG TCC GTA TCA GTT GCA GCT GGA GAG TCG GCC ATT CTG CAC TGC ACT GTG ACC TCC CTG ATC CCT GTG GGG CCC ATC CAG TGG TTC AGA GGA GCT GGA CCA GCC CGG GAA TTA ATC TAC AAT CAA AAA GAA GGC CAC TTC CCC CGG GTA ACA ACT GTT TCA GAG TCC ACA AAG AGA GAA AAC ATG GAC TTT TCC ATC AGC ATC AGT AAC ATC ACC CCA GCA GAT GCC GGC ACC TAC TAC TGT GTG AAG TTC CGG AAA GGG AGC CCT GAC ACG GAG TTT AAG TCT GGA GCA

Secuencia codificadora de la región Fc de la IgG1 humana per se [SEQ ID No.6]

GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCA CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA

Secuencia de codificación de la SIRPaGI madura [SEQ ID No.7]

GAG GAG CTG CAG GTG ATT CAG CCT GAC AAG TCC GTA TCA GTT GCA GCT GGA GAG TCG GCC ATT CTG CAC TGC ACT GTG ACC TCC CTG ATC CCT GTG GGG CCC ATC CAG TGG TTC AGA GGA GCT GGA CCA GCC CGG GAA TTA ATC TAC AAT CAA AAA GAA GGC CAC TTC CCC CGG GTA ACA ACT GTT TCA GAG TCC ACA AAG AGA GAA AAC ATG GAC TTT TCC ATC AGC ATC AGT AAC ATC ACC CCA GCA GAT GCC GGC ACC TAC TAC TGT GTG AAG TTC CGG AAA GGG AGC CCT GAC ACG GAG TTT AAG TCT GGA GCA GGC ACT GAG CTG TCT GTG CGT GCC AAA CCC TCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCA CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA 1TGA

Secuencia de codificación de la SIRPaGI secretable [SEQ ID No.8]

ATS GAG CCC GCC GGC CCG GCC CCC GGC CGC CTC GGG CCG CTG CTC TGC CTG CTG CTC GCC GCG TCC TGC GCC TGG TCA GGA GTG GCG GGT GAG GAG GAG CTG CAG GTG ATT CAG CCT GAC AAG TCC GTA TCA GTT GCA GCT GGA GAG TCG GCC ATT CTG CAC TGC ACT GTG ACC TCC CTG ATC CCT GTG GGG CCC ATC CAG TGG TTC AGA GGA GCT GGA CCA GCC CGG GAA TTA ATC TAC AAT CAA AAA GAA GGC CAC TTC CCC CGG GTA ACA ACT GTT TCA GAG TCC ACA AAG AGA GAA AAC ATG GAC TTT TCC ATC AGC ATC AGT AAC ATC ACC CCA GCA GAT GCC GGC ACC TAC TAC TGT GTG AAG TTC CGG AAA GGG AGC CCT GAC ACG GAG TTT AAG TCT GGA GCA GGC ACT GAG CTG TCT GTG CGT GCC AAA CCC TCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCA CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA

Dominio SIRPa IgV preferido [SEQ ID No.22]

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRE NMDFSISISNITPADAGT YYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS [SEQ ID No.22]

Secuencia de IgG4 per se [SEQ ID No.23]

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLGK [SEQ ID No.23]

Secuencia de IgG4 alterada per se [SEQ ID No. 24]

ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK

TKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM

TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLGK [SEQID No.24]

SIRPaGI [SEQ ID No. 25]

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRE NMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [SEQ ID No.25]

SIRPaG4 [SEQ ID No. 26]

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRE NMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[SEQ ID No.26]

Secuencia de codificación de la forma secretable de la SIRPaGI de la SEQ ID No. 25 [SEQ ID No. 27]

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión SIRPa humana útil para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de una célula enferma CD47+, en la que la proteína de fusión SIRPa humana comprende la SEQ ID No. 26.

2. La proteína de fusión SIRPa humana de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión SIRPa humana consiste en la SEQ ID No. 26.

3. La proteína de fusión SIRPa humana de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende además una etiqueta detectable.

4. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad de una proteína de fusión SIRPa humana eficaz para inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula enferma CD47+, en la que la proteína de fusión SIRPa humana comprende la SEQ ID No. 26.

5. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la proteína de fusión SIRPa humana consiste en la SEQ ID No. 26.

6. Una proteína de fusión SIRPa humana que comprende la SEQ ID No. 26, para su uso en la inhibición del crecimiento de las células enfermas CD47+ en un sujeto que la necesite.

7. La proteína de fusión SIRPa humana para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la célula enferma es una célula cancerosa CD47+.

8. La proteína de fusión SIRPa humana para su uso de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en la que la célula enferma es una célula cancerosa hematológica CD47+.

9. La proteína de fusión SIRPa humana para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la célula enferma es una célula de leucemia CD47+.

10. La proteína de fusión SIRPa humana para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la célula enferma es un tumor sólido que comprende células cancerosas CD47+.

11. La proteína de fusión SIRPa humana para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en la que la proteína de fusión SIRPa humana consiste en la SEQ ID No. 26.

12. Un constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión SIRPa humana de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

13. Una célula huésped para la producción de proteínas, que comprende un constructo de ADN expresable incorporado de acuerdo con la reivindicación 12.

14. Un procedimiento para producir una proteína de fusión SIRPa humana, que comprende el cultivo de una célula huésped de producción de proteínas que tiene incorporado para su expresión en ella un polinucleótido que codifica una proteína de fusión SIRPaFc humana que comprende o consiste en la SEQ ID No. 26.

15. Una proteína de fusión dimérica que comprende dos polipéptidos de cadena simple fusionados a través de sus respectivos componentes Fc, siendo cada polipéptido de cadena simple una proteína de fusión SIRPa humana de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

16. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad de una proteína de fusión SIRPa humana dimérica de acuerdo con la reivindicación 15 eficaz para inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula enferma CD47+.

17. Una proteína de fusión SIRPa humana dimérica de acuerdo con la reivindicación 15, para su uso en la inhibición del crecimiento de las células enfermas CD47+ en un sujeto que la necesite.

18. La proteína de fusión SIRPa humana para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en la que la célula enferma es una célula cancerosa CD47+.

19. La proteína de fusión SIRPa humana para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en la que la célula enferma es una célula cancerosa hematológica CD47+.

20. Un procedimiento para producir la proteína de fusión SIRPa humana dimérica de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende cultivar una célula huésped de producción de proteínas que tiene incorporado para su expresión en la misma un polinucleótido que codifica una forma secretable de la proteína de fusión SIRPaFc humana que comprende o consiste en la s Eq ID No. 26.