CN106146670B - 一种新的重组双功能融合蛋白及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
一种基因重组融合蛋白，可以通过两种机制达到消灭肿瘤的目的，一是通过阻断肿瘤细胞诱导的巨噬细胞的抑制性信号，一是通过直接激活巨噬细胞的吞噬作用。该蛋白由人信号调节蛋白(Signal‑regulatory proteins)alpha(SIRPα)的膜外端第一个Ig样区(SIRPαD1)与人IgG1的Fc片段连接而成(SIRPαD1‑Fc)。本发明提供一种编码重组双功能融合蛋白的核苷酸分子以及表达该蛋白的表达载体，一种制备所述蛋白的方法以及一种治疗过度表达CD47相关疾病的方法。该蛋白属于同源二聚体，分子量为90kDa。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组双功能融合蛋白及其制备方法和应用，尤其是其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
肿瘤细胞为了加速自身的生长，往往“发明”一些途径来逃避宿主对肿瘤细胞的免疫监视。已知的途径包括三种：1)逃避T淋巴细胞的免疫监视。肿瘤细胞往往高表达膜蛋白PD-L1及PD-L2，而PD-L1/PD-L2可以与T细胞膜表面的PD-1结合，诱导T细胞凋亡。2)逃避天然杀伤(NK)细胞的免疫监视。NK细胞的细胞膜上有一种能激活NK细胞的蛋白NKG2D，当NKG2D与肿瘤细胞膜上的MICA/MICB结合以后，可以激活NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。但是肿瘤细胞本身则有一种机制可以促使MICA/MICB从细胞膜上脱落，脱落掉的MICA/MICB与NK细胞膜表面的NKG2D结合，从而封闭了NKG2D与肿瘤细胞膜表面的MICA/MICB结合。3)逃避巨噬细胞(Mφ)的免疫监视。几乎所有的肿瘤细胞在其细胞膜表面都高表达CD47，而CD47可与巨噬细胞(Mφ)膜表面的信号调节蛋白(SIRPα)结合，从而诱导一种抑制性信号，抑制巨噬细胞(Mφ)对肿瘤细胞的吞噬功能。所以肿瘤细胞很“聪明”，之所以能快速生长繁殖，是由于其“创造”的逃避机制所决定的。相应的，要想消灭肿瘤，就要从这些途径入手，并结合其它手段来设计有效的药物。
本发明则是针对信号调节蛋白SIRPα。信号调节蛋白(SIRP)是一种穿膜糖蛋白，包括三个家族成员，SIRPα(CD172a)、SIRPβ(CD172b)、SIRPγ(CD172g)。这三个成员具有相似的膜外端，但不同的膜内区(图1A)。膜外端均含有三个免疫球蛋白(Ig)样区域，其中第一个区域属于Ig-V区，第二、三个区域属于Ig-C区。SIRPα(CD172a)的膜内区含有两个抑制性信号域，可传 递抑制信号，抑制细胞的相应功能。SIRPβ(CD172b)和SIRPγ(CD172g)膜内区很短，没有信号传递区域，但SIRPβ(CD172b)可通过适配器蛋白(Adaptor protein，如DAP12)传递激活信号(图1)。SIRPs蛋白主要表达在巨噬细胞(Mφ)、树突状细胞(DC)、及神经元细胞。
CD47也是一种穿膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，在包括红细胞在内的几乎所有细胞表面表达。CD47的配体包括黏附因子(integrins)、凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin-1)、以及信号调节蛋白(SIRPs)。CD47具有多种生物学功能，包括细胞迁移、T细胞、树突状细胞活化、轴突发育等。除此之外，CD47通过与SIRPα相互作用可抑制巨噬细胞的吞噬作用。CD47以这种方式传递一种所谓的“不要吃我”("Don't eat me")信号，可以保护血细胞等正常细胞不被巨噬细胞吞噬。
研究发现，除正常组织细胞表达CD47以外，许多肿瘤细胞过度表达CD47，并通过与巨噬细胞表面的SIRPα相结合而阻止巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，这被视为肿瘤逃避机体免疫监视的一种机制。高表达CD47的肿瘤包括急性髓样白血病细胞(AML)、慢性髓样白血病细胞(CML)、急性淋巴细胞白血病细胞(ALL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、***癌、肺癌、大肠癌、乳腺癌、胰腺癌等等。
研究表明，用具有阻断CD47-SIRPα结合活性的CD47-特异性抗体给荷瘤小鼠注射，可以显著抑制肿瘤在小鼠体内的生长。给携带有人白血病细胞的小鼠注射同样的抗体则可以达到完全消灭肿瘤细胞的效应(Theocharides APA,et al.,2012)。
Fc受体是在某些细胞表面发现的蛋白质。所述细胞包括：B淋巴细胞、滤泡树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、肥大细胞这些有助于免疫***的保护功能的细胞。Fc受体与附着在受感染细胞、侵入的病原体或癌细胞上的抗体结合，并刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞，从而通过抗体介导的噬菌作用或抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用来摧毁微生物、受感染细胞或癌细胞。
关于SIRPα-Fc及SIRPαD1-Fc与CD47的结合活性，以前曾有报道(Lee WY et al，2007)，但其与靶点CD47的亲和活性不足。
发明内容
本发明涉及一种基因重组融合蛋白，可以通过两种机制达到消灭肿瘤的目的，一是通过阻断肿瘤细胞诱导的巨噬细胞的抑制性信号，一是通过直接激活巨噬细胞的吞噬作用。该蛋白由人信号调节蛋白(Signal-regulatory proteins)alpha(SIRPα)的膜外端第一个Ig样区(SIRPαD1)与人IgG1的Fc片段连接而成(SIRPαD1-Fc)。该蛋白属于同源二聚体，分子量为90kDa由SIRPα的膜外端第一个区域(Domain1,D1)与人IgG的Fc片段所组成的融合蛋白(SIRPαD1-Fc)，与整个膜外端重组蛋白(SIRPα-Fc)相比，具有更高的靶点结合活性。本发明人进一步发现，去除SIRPα膜外端D1区域的糖基化位点(N89A)可进一步增加靶点的结合活性；而保留Fc与Fc受体的结合活性可以大大增加SIRPαD1-Fc的抗肿瘤活性。
经过细胞株筛选，利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)制备了该蛋白的稳定表达细胞株，并经过摇床培养制备了该蛋白。体外实验证实，该蛋白可与CD47结合，结合活性比SIRPα-Fc显著增加。而如果把SIRPαD1中的糖基化位点“NIT”通过基因修饰予以去除(N89A)(SIRPαD1-Fc(N89A),命名为HY03M)，则HY03M与靶点CD47的结合活性进一步增强。而如果把“Fc区域的第192个氨基酸从天冬氨酸突变为丙氨酸(D192A)(SIRPαD1-Fc(N89A/D192A)，命名为HY03MM)，则HY03MM与Fc受体(CD16a、CD32、CD64)的结合活性显著降低。利用人急性淋巴细胞白血病及急性早幼粒细胞白血病小鼠模型，研究了HY03M的体内抗肿瘤疗效，结果表明，HY03M具有强大的抗肿瘤活性，经过HY03M治疗的小鼠，肿瘤细胞的生长被完全抑制，个别小鼠已检测不到肿瘤。为验证HY03M的Fc是否参与抗肿瘤活性，在人淋巴瘤小鼠模型中比较研究了HY03M及HY03MM的体内疗效，并与美罗华进行了比较。结果发现，与阴性对照组相比，HY03M具有显著的抗肿瘤疗效，其疗效显著优于美罗华。而HY03MM虽然具有明显的肿瘤生长抑制活性，但与HY03M相比，其活性大大降低，提示Fc区域通过与巨噬细胞的Fc受体结合，参与了抗肿瘤活性。
在一个实施例中，本发明的重组蛋白为HY03M(SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6)。HY03M具有强大的抗肿瘤活性，其作用原理包括两个方面：1)通过阻断CD47-SIRPa的相互作用；2)通过Fc与Fc受体的结合激活巨噬细胞；HY03M可用于治疗各种靶点阳性的肿瘤。
本发明还提供了一种编码重组双功能融合蛋白的核酸分子、一种表达所述蛋白的表达载体、一种制备改蛋白的方法以及一种治疗过度表达CD47的疾病的方法。
在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白包括信号调节蛋白(SIRP)膜外端的Ig样区，与人IgG1的Fc片段连接，其中所述蛋白与CD47结合，从而阻断CD47与巨噬细胞表面SIRP的结合，激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。
在一个实施例中，重组双功能融合蛋白中的所述信号调节蛋白为SIRPα，信号调节蛋白膜外端的Ig样区为SIRPαD1。
在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白包括Fc片段，其为免疫球蛋白分子的一部分。虽然Fc片段没有抗原结合位，但其有助于一些效应子功能，例如在多种细胞上帮助抗体与Fc受体的结合以及与补体***的结合。在一个实施例中，Fc片段为IgG1的Fc片段。
在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白包括与SEQ ID NO.:6具有至少95％相似性的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.:6具有至少98％的相似性。在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.:6具有至少99％的相似性。在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白包括SEQ ID NO.:6的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明提供一种编码本发明的重组双功能融合蛋白的多聚核苷酸分子，其包括信号调节蛋白(SIRP)膜外端的Ig样区，与人IgG1 的Fc片段连接，其中所述蛋白与CD47结合，从而阻断CD47与巨噬细胞表面SIRP的结合，激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。
在一个实施例中，本发明的多聚核苷酸分子编码重组双功能融合蛋白，其包括SIRPα，优选SIRPαD1。
在一个实施例中，本发明的多聚核苷酸分子编码重组双功能融合蛋白，其包括Ig的Fc片段，优选人IgG1的Fc片段。
在一个实施例中，本发明的多聚核苷酸分子编码重组双功能融合蛋白，其包括与SEQ ID NO.:6具有至少95％相似性的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.:6具有至少98％的相似性。在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.:6具有至少99％的相似性。在一个实施例中，本发明的多聚核苷酸分子编码重组双功能融合蛋白，其包括SEQ ID NO.:6的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明提供一种包括本发明的多聚核苷酸分子的表达载体，所述多聚核苷酸分子编码重组双功能融合蛋白。
在一个实施例中，本发明提供一种包括本发明的表达载体的宿主细胞。
在一个实施例中，本发明提供一种药物组合物，包括本发明的重组双功能融合蛋白以及至少一种佐剂。
在一个实施例中，本发明提供一种治疗由过度表达CD47引起的疾病的方法，包括向病人或对象给予治疗有效量的本发明的药物组合物。在一个实施例中，本发明提供一种重组双功能融合蛋白在制备用于治疗CD47过度表达引起的疾病。
在一个实施例中，本发明的方法用于治疗的疾病选自髓细胞性白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、***癌、肺 癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌以及肾细胞癌。在一个实施例中，本发明提供一种用于治疗克罗恩病、髓过敏性哮喘以及类风湿性关节炎。
附图说明
图1是SIRPs和SIRPαD1-Fc的分子结构及工作示意图。
图2是SIRPα-Fc核苷酸及氨基酸序列。
图3是SIRPαD1-Fc核苷酸及氨基酸序列。
图4是HY03M核苷酸及氨基酸序列。
图5是HY03MM核苷酸及氨基酸序列。
图6是四种融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图7是SIRPα-Fc与SIRPαD1-Fc与PC-3细胞靶点结合活性分析结果。
图8是未标记蛋白对荧光标记SIRPα-Fc的靶点阻断活性分析。
图9是Fc受体结合活性及诱导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性。
图10是四种融合蛋白对肿瘤的体内药效。
具体实施方式
本发明涉及一种基因重组融合蛋白，可以通过两种机制达到消灭肿瘤的目的，一是通过阻断肿瘤细胞诱导的巨噬细胞的抑制性信号，一是通过直接激活巨噬细胞的吞噬作用。该蛋白由人信号调节蛋白(Signal-regulatory proteins)alpha(SIRPα)的膜外端第一个Ig样区(SIRPαD1)与人IgG1的Fc片段连接而成(SIRPαD1-Fc)。该蛋白属于同源二聚体，分子量为90kDa。经过细胞株筛选，我们利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)制备了该蛋白的稳定表达细胞株，并经过摇床培养制备了100毫克该蛋白。体外实验证实，该蛋白可与CD47结合，结合活性比SIRPα-Fc显著增加。而如果把SIRPαD1中的糖基化位点“NIT”通过基因修饰予以去除(N89A)(SIRPαD1-Fc(N89A),命名为HY03M)，则HY03M 与靶点CD47的结合活性进一步增强。而如果把“Fc区域的第211个氨基酸从天冬氨酸突变为丙氨酸(D192A)(SIRPαD1-Fc(N89A/D192A)，命名为HY03MM)，则HY03MM与Fc受体(CD16a、CD32、CD64)的结合活性显著降低。利用人急性淋巴细胞白血病及急性早幼粒细胞白血病小鼠模型，我们研究了HY03M的体内抗肿瘤疗效，结果表明，HY03M具有强大的抗肿瘤活性，经过HY03M治疗的小鼠，肿瘤细胞的生长被完全抑制，个别小鼠已检测不到肿瘤。为验证HY03M的Fc是否参与抗肿瘤活性，我们在人淋巴瘤小鼠模型中比较研究了HY03M及HY03MM的体内疗效，并与美罗华进行了比较。结果发现，与阴性对照组相比，HY03M具有显著的抗肿瘤疗效，其疗效显著优于美罗华。而HY03MM虽然具有明显的肿瘤生长抑制活性，但与HY03M相比，其活性大大降低，提示Fc区域通过与巨噬细胞的Fc受体结合，参与了抗肿瘤活性。
本发明的融合蛋白包括两部分，即目标结合片段(即SIRPαD1)以及Fc片段。
本发明的重组双功能融合蛋白还可与非多肽分子结合以获得期望的性能，例如减少降解和/或提高半衰期(half-life)、减少毒性、降低免疫原性和/或提高生物活性。所述分子的例子包括但不限于：聚合物，如聚乙二醇(PEG)，多聚赖氨酸，葡聚糖；血脂；胆固醇组(如激素)；碳水化合物，或寡糖分子。
Fc片段的长度可以为232个氨基酸，包括铰链区(hinge region)中的一个半胱氨酸、CH2区中的两个半胱氨酸以及CH3区中的两个半胱氨酸。铰链区中的半胱氨酸用于形成两个单体间的二硫键，从而产生二聚体，CH2区及CH3区中的胱氨酸可以形成键内二硫键从而稳定所述蛋白。
例如，在融合蛋白中可使用能够与CD47结合的SIPR(SIRPα,SIRPγ)膜外端的Ig区。
较佳地，人源性序列可用于人类癌症的治疗，因为源于非人类动物的蛋白或肽具有强免疫原性，会导致过敏及其他副作用。然而，其他动物蛋白或肽可用于本发明的其他应用目的。
在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白中的所述信号调节蛋白为SIRPα。所述信号调节蛋白膜外端的Ig样区为SIRPαD1.
本发明可以使用任何免疫球蛋白的Fc片段。免疫球蛋白包括IgG,IgA,IgM,IgD以及IgA，其中IgG最丰富以及相对稳定的。优选IgG的Fc片段、IgG1的Fc片段、人IgG1的Fc片段，因为该些Fc片段显示出对葡萄球菌蛋白A(staphylococcus Protein A)具有最高的结合性，从而容易被纯化。
在一个实施例中，本发明的重组双功能融合蛋白包括人SIRPα膜外端的第一Ig样区，通过人IgG1的Fc片段连接。
在一个实施例中本发明的重组双功能融合蛋白的氨基酸序列如图4B(SEQ IDNO.:6)。在另一个实施例中，所述重组双功能融合蛋白包括SEQ ID NO.:6所示序列的多肽。在另一个实施例中，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.:6具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的相似性，其中所述多肽能够与CD47结合，并能抑制肿瘤细胞的生长。
本发明另一方面提供了一种分离的核酸分子，包括编码重组双功能融合蛋白的多聚核苷酸，所述蛋白包括SEQ ID NO.:6所示序列的多肽。在一个实施例中，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.:6具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的相似性，其中所述多肽能够与CD47结合，并能抑制肿瘤细胞的生长。
本发明还提供一种药物组合物，包括前述重组双功能融合蛋白以及至少一种药学上接受的赋形剂。根据需要，所述药物组合物中还可包括一种或多种载体或赋形剂。所述载体包括药剂学中常见的稀释剂、赋形剂、膨胀剂、黏结剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
所述组合物包括治疗或与预防上有效量多肽或蛋白，并混合有药学上可接受的物质及生理学上可接受的制剂物质。所述药物组合物可包括用于修改、维持或保藏的制剂物质，例如，pH值，渗透压，粘度，透明度，颜色，气味，无菌，保序性，稳定性，溶解或释放率，组合物的吸附和渗透。合适的配方的材 料包括，但不限于，氨基酸(如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸和赖氨酸)；抗菌药物；抗氧化剂(如抗坏血酸，亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸，碳酸氢铵，Tris-HCl，柠檬酸盐，磷酸盐，其他有机酸)；膨胀剂(如甘露醇、甘氨酸)，螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖，甘露糖，或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；着色；调味品和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐的抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵，苯甲酸，水杨酸，硫柳汞，苯乙醇，对羟基苯甲酸甲酯，尼泊金丙酯，洗必泰，山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油，丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如PLURONICS，PEG，山梨酸酯，聚山梨酯类如聚山梨酯20，聚山梨酯80，Triton，氨丁三醇，卵磷脂，胆固醇，tyloxapal)；稳定性增强剂(蔗糖和山梨醇)；紧张性增强剂(如碱金属卤化物(最好是氯化钠和氯化钾，甘露醇山梨醇)；输送剂；稀释剂；赋形剂和/或药用辅料。
本领域技术人员会根据计划的给予途径、输送形式以及期望的剂量选择理想的药物组合物。例如，请参见Remington's Pharmaceutical Sciences,supra。该些药物组合物会影响物理状态、稳定性、多肽的体内释放率以及体内清除率。例如，适当的组合物可以为注射用水、生理盐水。
在药物组合物中的主要载体可以是水性或非水性。例如，一个合适的载体可以是注射用水，生理盐水或人工脑脊液，可辅以其他常见的注射用材料。例如，载体可是是中性缓冲溶液或生理盐水与血清白蛋白混合。另一个典型的药物组合物包含Tris缓冲液，或醋酸缓冲液，其可进一步包括山梨醇或合适的替代物。在本发明的一个实施例中，为了便于存储，组合物可以通过将具有期望纯度的所选组合物与可选的制剂混合(Remington'sPharmaceutical Sciences,supra)，以冻干蛋糕或水溶液形式来制备。此外，治疗组合物可使用适当的辅料，如蔗糖配制成冻干物。
所述制剂可以各种方法输送，例如，通过吸入治疗，口服或注射。当考虑胃肠外给药时，本发明的药物组合物的形式可以是胃肠外可接受的水溶液， 其包括药学上可接受载体中所需的多肽。一种特别适合胃肠外注射载体为无菌蒸馏水，其中多肽以适合保存的无菌、等渗溶液形式制备。另一种制备包含所需的分子与一种制剂，如注射微球，生物性微粒，聚合物(聚乳酸，聚乙醇酸)，珠，或脂质体，其用于产品的缓释及持续释放，随后通过积存注射(depot injection)输送。也可以使用透明质酸，这会促进血液循环中的缓释持续时间。期望分子引入的其他合适的手段包括可植入的药物输送装置。
在另一方面，适用于注射给药的药物制剂可以水溶液形式制备，最好是在生理学上可相容的缓冲剂，如汉克斯液(Hanks'solution)，林格液(Ringer's solution)，或生理缓冲液。注射水悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，或葡聚糖。此外，该活性化合物悬浮液可制备成适当的油性注射悬浮液。合适的脂溶性溶剂或载体包括脂肪油，如香油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯，甘油三酯，或脂质体。非脂质的阳离子氨基聚合物也可用于输送。可选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或制剂，以增加化合物的水溶性并允许高浓度溶液的制备。在另一实施例中，一种药物组合物可被配制用于吸入。吸入溶液也可以以推进剂的形式制备，用于气溶胶输送。在另一实施例中，溶液可以是雾化的。肺部的给予在PCT申请号为PCT/US94/001875中进一步描述，它描述了化学修饰的蛋白的肺部给药。
可以想到某些制剂可以以口服的形式给予。在本发明的一个实施例中，以这种方式给药的分子可以用固体剂型如片剂和胶囊中常用的载体来制备，也可不包含所述载体。例如，当需要最大化生物利用度并最小化预***降解时，胶囊可被设计用于在胃肠道中释放活性物质。可包括附加剂，从而促进治疗分子的吸收。还可使用稀释剂，香料，低熔点蜡，植物油，润滑油，悬浮剂，片剂的崩解剂和粘结剂。口服药物组合物可以用本领域熟悉的药学上可接受的、适于口服的载体制备。这样的载体可使药物组合物以片剂，丸剂，粒糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆，悬浮液等的形式被病人服用。
口服制剂可以通过将活性化合物与固体赋形剂结合，并加工颗粒的混合物来得到(可选，研磨后)，从而获得片剂或糖衣丸芯。可以添加适当的助剂，如果需要的话。适宜的赋形剂包括碳水化合物或蛋白质的填料，如糖，包括乳糖， 蔗糖，甘露醇，山梨醇；玉米，小麦，大米，土豆淀粉，或其他植物；纤维素，如甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素钠；黏胶，包括***胶浆；和蛋白质，如明胶及胶原。如果需要的话，可增加崩解或溶解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，和藻酸或其盐，如褐藻酸钠。
糖衣丸芯可与适当的涂层的结合，如浓缩糖溶液，其中还可以包含***胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆凝胶，聚乙二醇，和/或二氧化钛，漆溶剂，和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向片剂或糖衣丸芯添加染料或颜料，用于产品识别或区分活性化合物的数量即剂量。
口服药物制剂还包括明胶制成软、封闭的推入配合胶囊，以及涂层，如甘油或山梨醇。推入配合胶囊含有活性成分，与填料和粘合剂混合，如乳糖和淀粉，润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁，以及任选的稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体，如脂肪油，液，或液体聚乙二醇，可添加也可不添加稳定剂。
对于本领域技术人员容易理解可包含额外的药物组合物，包括用于缓释及持续释放配方的多肽。本领域的技术人员也熟知各种其他缓释及持续释放配方的手段，如脂质体载体，生物性微粒或多孔珠和长效注射剂。例如，PCT/US93/00829描述了用于控制药物组合物输送的多孔聚合物微粒释放。缓释制剂另外的例子包括在物品的形状，微粒形式的半透膜聚合物矩阵，例如薄膜或微胶囊。缓释矩阵可以包括聚酯，水凝胶，聚乳酸(Langer etal.,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277,(1981)；Langer et al.,Chem.Tech.,12:98-105(1982)),ethylene vinyl acetate(Langer et al.,supra)or poly-D(-)-3-hydroxybutyric acid(EP 133,988)，乙烯-醋酸乙烯酯(Langer et al.,supra)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。缓释组合物还包括脂质体，其可通过本领域已知的几种方法制备。例如，参见Eppstein et al.,PNAS(USA),82:3688(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949。
用于体内给予的所述药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤来实现。当组合物为冻干时，这种方法可以在灭菌或冻干重组之前或之后进行。胃肠外给药的组合物可以以冻干形式或溶液的形式储存。此外，肠外 用组合物通常是放置到具有无菌接入口的容器中，例如具有塞子的静脉输液袋或瓶，所述塞子通过皮下注射针可被刺穿。
一旦药物组合物被制备，它可以以溶液，悬浮液，凝胶，乳液，固体，或脱水或冻干粉的形式被存储在无菌瓶内。这样的制剂可以以给药前待用的形式或需要重建(例如，冻干)的形式存储。
在一个具体实施例中，本发明涉及用于制备单剂量给药单元的试剂盒。所述试剂盒可以包含具有干燥蛋白的第一容器以及具有水性制剂的第二容器。本发明还包含单、多腔预填充注射器(例如，液体注射器和lyosyringes)。
药物组合物用于治疗的有效量取决于，例如，治疗环境及对象。本领域技术人员能够理解，用于治疗的适当剂量水平部分区别于分子的输送，多肽使用的指标，给药途径，和病人的尺寸(体重，体表或器官大小)和条件(年龄和一般健康)。因此，临床医生可滴定剂量并修改给药途径从而获得最佳的治疗效果。一个典型的剂量范围为约0.1毫克/公斤至100毫克/公斤或更多，这取决于上述因素。多肽组合物可优选注射或静脉注射。长效药物组合物可以根据半衰期和具体配方的清除率每三到四天，每一周或两周给予。给药频率取决于所使用的制剂的多肽药物动力学参数。通常，给予组合物直到用量达到预期的效果。因此，该组合物可随着时间的推移作为单剂量或多剂量(以相同的或不同的浓度/剂量)或作为持续注射给予。可进一步调节适当的剂量。适当的剂量可通过使用适当的剂量-反应数据确定。
药物组合物的给药途径是已知的，如口服，通过静脉，腹腔内，脑(脑实质)，侧脑室，肌肉，内眼动脉，门静脉，病灶内路线，髓内，鞘内注射，脑室，透皮，皮下，或腹腔内注射；以及鼻内，肠内，外用，舌下，尿道，***，或直肠的手段，通过缓释***或通过植入装置。如需要，所述组合物可以通过单次快速静脉注射或连续输注给药，或通过注入装置注射。可替换地或附加地，该组合物可局部给药，通过膜，海绵植入，或其他合适的材料上吸附或包裹所需的分子来给药。如使用植入装置，该装置可以移植到任何合适的组织或器官，并可以通过扩散，定时释放丸，或连续给药的方式输送预期的分子。
在某些情况下，本发明的重组双功能融合蛋白可以通过移植某些细胞输送，所述细胞通过于此描述的方法被转基因，从而表达和分泌多肽。这些细胞可能是动物或人类的细胞，可以示自体，异体或异种的。可选地，可以是永生化的细胞。为了降低免疫反应的机会，封闭这些细胞以避免周围组织浸润。封闭材料通常是生物相容性的，半渗透性的聚合物外壳或膜，其允许释放多肽产物，但可通过病人的免疫***或周围组织的其他破坏因素来防止破坏细胞。
还可进行体内基因治疗，其中向对象直接引入编码本发明重组双功能融合蛋白的核酸分子，或其衍生物。例如，一个核酸编码一个双功能融合蛋白，通过核酸的局部注射向靶细胞引入编码本发明的重组双功能融合蛋白的核酸序列，可选使用输送载体，如腺相关病毒载体。替代病毒载体包括但不限于，逆转录病毒，腺病毒，单纯疱疹病毒和***瘤病毒载体。该病毒载体的体内通物理输送可通过局部注射所需的核酸构建体或其他适当含有目标核酸序列的输送载体，脂质体介导转移，直接喷射(裸DNA)，或微粒轰击(基因枪)来实现。
本发明的组合物可以单独使用或与其它治疗剂的组合，来提高疗效或减少潜在的副作用。
本发明的另一目的是提供一种方法，用于制备所述重组双功能融合蛋白和包含它的药物组合物。在一个实施例中，所述方法包括：(1)提供一种用于编码的多聚核苷酸分子；(2)构建含有(1)中所述多聚核苷酸分子的表达载体；(3)用(2)中所述表达载体转染或转化合适的宿主细胞，并在宿主细胞中培养，以表达蛋白；以及(4)纯化所述蛋白。制备可通过本领域技术人员供职的技术进行。
本发明的另一目的是提供一种使用本发明药物组合物治疗癌症的方法，包括向病人或对象给予有效量的所述药物组合物。在一个实施例中，所述药物组合物用于治疗CD47表达相关肿瘤或癌症，包括但不限于急性髓系白血病(AML)，慢性粒细胞白血病(CML)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，多发性骨髓瘤(MM)，膀胱癌，卵巢癌，***癌，肺癌，结肠癌，乳腺癌，胰腺癌和肾癌。
在一个实施例中，过度表达CD47相关疾病，包括但不限于克罗恩病，过敏性哮喘，类风湿性关节炎。
同时，本发明提供了一种编码重组双功能融合蛋白的多聚核苷酸分子，以及一种表达所述重组双功能融合蛋白的表达载体。所述载体的例子包括但不限于质粒，病毒载体，酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)，可转化人工染色体(TAC)，哺乳动物人工染色体(MAC)和人工附加染色体(HAEC)。
本发明提供包括上述表达载体的宿主细胞。宿主细胞可用表达载体转化或转染。合适的宿主细胞包括大肠杆菌，酵母菌和其它真核生物。优选地，大肠杆菌，酵母或哺乳动物细胞系(如COS or CHO)的使用。
本发明将通过非限制性的例子进一步被详细描述。
实施例
实施例1：
实验材料及方法
1、SIRPα-Fc及SIRPαD1-Fc表达载体构建
表达载体用的是pIg-Tail(R&D Systems)。用引物1(SEQ ID No.:9)和引物2(SEQID No.:10)、引物1(SEQ ID No.:9)和引物3(SEQ ID No.:11)分别将SIRPα的膜外端及SIRPαD1基因编码序列从THP-1(TIB-202TM)细胞中扩增出来，PCR产物分别克隆至改良过的pIg-Tail载体的HindIII/EcoRI位点，从而构成pSIRPα-Fc及pSIRPαD1-Fc载体。
2、HY03M及HY03MM表达载体的构建
将携带有N89A突变体的SIRPαD1基因序列送交南京金斯瑞合成(项目编号：7009323-1)，合成的基因克隆至pIg-Tail载体的HindIII/EcoRI位点，从而构成HY03M表达载体。利用引物4(SEQ ID No.:12)和引物5(SEQ ID No.: 13)，经定点突变PCR，将HY03M的Fc端192位点编码天冬氨酸的基因序列(GAC)突变成丙氨酸编码序列(GCC)，由此得到HY03MM表达载体。
表1、 PCR引物
注解:蓝色粗体代表基因特异性序列，下划线代表内切酶识别序列。
2、蛋白表达及纯化
将含有CHO细胞的完全培养基(DMEM，10％FBS)加入到24-孔培养板中，每孔0.5ml，将培养板放置在细胞培养箱中培养24小时。转染时，将0.5μg质粒DNA及2μl脂质体2000(Cat#11668-027,Invitrogen)分别溶解到50μl无血清培养基中，将二者混到一起，室温放置20分钟，然后缓缓加入到细胞孔中，并将细胞培养板放回到细胞培养箱中继续培养24小时。第二天取100μl上清用酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测蛋白表达情况。
3、蛋白表达检测
蛋白表达检测是用ELISA检测的。具体步骤是：将针对人IgG的羊抗体F(ab’)2片段(Biosource International Inc)溶解到PBS磷酸缓冲液中，然后加入到96孔ELISA检测板中，每孔20ng,然后将ELISA板放置于4度冰箱过夜。检测时，用封闭液(PBS,0.05％吐温20，3％无脂牛奶)先封闭一小时，然后加入经过稀释的上清，室温孵育一个小时，经洗涤液(PBS,0.05％吐温20)洗 涤5次，然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的、针对人IgG Fc片段的兔抗体(Jackson ImmunoResearch Lab),室温孵育一个小时，洗涤5次后加入HRP的底物，显色反应2分钟后加入终止液(1N H2SO4)中止反应，用450nM波长测光密度。
4、稳定细胞株筛选
基因转染的细胞经过浓度递增的抗生素加压筛选(Geneticin,Cat#10131035,Invitrogen),不稳定的细胞将逐渐被杀死，剩余的存活细胞经过稀释加入到5个96孔细胞培养板中，每孔含有0.5-1个细胞。将培养板放置于细胞培养箱中培养10-15天，然后用ELISA对含有单个克隆的细胞孔进行检测，然后将阳性表达的细胞放大培养，并逐渐用无血清Ex-CELL CD CHO培养基(Cat#14361C-1000ML,SIGMA)驯化培养。经过进一步筛选，将具有最高表达水平的细胞株挑选出来冻存备用。
5、蛋白生产及纯化
将稳定表达细胞株(3x105/ml)接种到含有300ml无血清培养基的2升摇瓶中，将摇瓶放置于摇床中培养，待细胞密度生长至5x106/ml收获培养上清，用Protein A柱进行纯化，纯化后的蛋白经过透析置换到PBS中(pH7.0)。经过蛋白电泳分析，确保蛋白纯度大于98％。
6、靶点结合活性：
用流式细胞仪，分别测定SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc、HY03M与靶点CD47的结合活性。
与CD47的结合活性检测分别采用两种细胞PC-3细胞及Jurkat细胞，前者属于人***癌细胞，后者为T淋巴细胞白血病细胞。细胞经PBS洗涤以后，悬浮于PBS中，调细胞浓度至1x106/ml，将hIgG(1μg/ml)加入到细胞悬液，4度冰箱孵育1个小时，用PBS洗涤后将细胞转入96-孔U-型细胞培养板(Cat#163320，NUNC)中，每孔100l,然后加入不同浓度的纯化蛋白，4度冰箱孵育1个小时，洗涤后悬浮于PBS，再与FITC标记的抗人IgG-Fc抗体 (Cat#F9512，Sigma)进行孵育，一个小时后用流式细胞仪(Guava easyCyte6HT-2L，Millipore)进行分析检测。
7、靶点阻断实验
为检测各纯化蛋白对CD47-SIRPα的结合是否具有阻断作用,我们利用FITC标记的SIRPα-Fc(Cat#4546-SA-050,R&D Systems)蛋白(100nM)分别与未标记的、不同浓度的SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc、HY03M、HY03MM及hIgG-Fc蛋白一起混合，然后加入到含有Jurkat细胞的96孔U-型板中，4度冰箱孵育1小时，经PBS洗涤后重悬于200mlPBS中，并用流式细胞仪分析不同浓度条件下荧光阳性细胞比率。
8、FcγR结合实验
与不同FcγR蛋白的结合活性采用ELISA方法进行检测。具体方法如下：
用包被缓冲液CBS(Sigma-Aldrich Co.,Product code:1001329288C3041-100CAP)将CD64(FcγRI)(Cat:1257-FC-050,R&D Systems)、CD32a(FcγRIIa)(Cat:1330- CD-050/CF,R&D Systems)、CD32b(FcγRIIb)(Cat: 1875-CD-050,R&D Systems)、CD16a(FcγRIIIa)(Cat:4325-FC-050,R&D Systems)稀释至1000ng/ml，取100ul加入到ELISA板(Cat#442404,NuncTM)中，每孔100ng,将包被板置于4℃冰箱过夜。检测时先用0.05％PBS-T洗涤包被板一次，再用3％脱脂牛奶室温封闭1小时。将稀释好的HY03M及HY03MM蛋白(800、400、200nM)加入到包被板中，每孔100ul。室温孵育一个小时以后，弃样品，用0.05％PBS-T洗涤5次，然后加入100ul经过稀释(1:20000)的HRP-Rabbit Anti-Human IgG Fc(Cat#:309-036-008,Jackson ImmunoResearch Lab)，室温孵育一个小时，洗涤液洗涤5次，加入HRP底物，避光显色10-20分钟以后用1N H2SO4终止显色反应，于酶标仪上读取0D450值。
9、巨噬细胞吞噬实验
将小鼠巨噬细胞(Raw264.7)加入到96-孔细胞培养板中，每孔50万个细胞，37度培养箱培养2个小时。将CFSE(2.25uM)标记的Jurkat细胞与 2.5ug/ml的HY03M、HY03MM、及IgG-Fc一起37度孵育30分钟，然后转入到含有Raw264.7细胞的培养板中，37度继续孵育3小时，经PBS洗涤三次，将游离的Jurkat细胞洗去，然后用流式细胞仪分析Raw264.7细胞内的CFSE信号。
10、抗肿瘤实验
利用HL60皮下肿瘤模型，首先对HY03M的体内抗肿瘤活性进行了研究。给20只Balb/c裸鼠皮下注射白血病(HL60)细胞，每只小鼠注射4x106个细胞，待肿瘤生长至100-150mm3时随机分为三组，第一组腹腔注射PBS，第二组腹腔注射VEGF阻断剂(VEGFinhibitor)，第三组腹腔注射HY03M，每组药物剂量均为10mg/kg，每周两次，连续6次给药。每周两次测量肿瘤体积及体重。
为分析Fc端是否参与抗肿瘤活性，我们利用淋巴瘤模型分析了HY03M及HY03MM的抗肿瘤活性，并与美罗华(Rituximab)进行比较。给38只Balb/c裸鼠皮下注射淋巴瘤(Daudi)细胞，每只小鼠注射1x107个细胞，待肿瘤生长至100-150mm3时随机分为五组，第一组腹腔注射PBS，第二组腹腔注射HY03M，第三组腹腔注射HY03MM，第四组腹腔注射美罗华，第五组腹腔注射HY03MM及美罗华，每组药物剂量均为5mg/kg，每周两次，连续8次给药。每周两次测量肿瘤体积及体重。
四、实验结果
1、表达载体构建
SIRPαD1-Fc的设计结构如图1B和图1D所示，将SIRPαD1通过分子克隆技术连接在人IgG1-Fc的氨基端。各蛋白的DNA及氨基酸序列见图2-5。其中SIRPα-Fc的基因编码序列由1752个核苷酸组成(图2A)(SEQ ID No.:1)，共编码583个氨基酸(图2B)(SEQ ID No.:2)，其中1047个核苷酸编码SIRPα，696个核苷酸编码Fc，6个核苷酸为EcoRI酶切为点。SIRPαD1-Fc的基因编码序列由1131个核苷酸组成(图3A)(SEQ ID No.:3)，共编码376个氨基酸(图3B)(SEQ ID No.:4)，426个核苷酸编码SIRPαD1，696个核苷酸编码Fc，6个核苷酸为EcoRI酶切为点。HY03M及HY03MM均含有1125个核苷酸，其中 HY03M含有N89A突变(图4A、4B)(SEQ IDNo.:5&No.:6)，而HY03MM含有N89A及D192A双突变(图5A、5B)(SEQ ID No.:7&No.:8)。
2、蛋白表达分析
四种蛋白的理论分子量分别为：SIRPα-Fc：～128kDa，SIRPαD1-Fc：～82.7kD，HY03M：～82.3kDa，HY03MM：～82.3kDa。通过蛋白电泳(SDS-PAGE)分析发现，在非还原条件下蛋白分子量均大于理论分子量(图6)，这可能是由于蛋白的糖基化所造成的，因为在SIRPαD1区域有一个天冬酰氨连锁的糖基化位点。该位点的不规则糖基化很可能是导致SIRPαD1-Fc在SDS-PAGE胶上还原条件下出现两条带的原因(图6B)，因为去除该糖基化位点以后(HY03M及HY03MM)两条带则变成了一条带(图6C、6D)。
3、靶点结合活性分析
我们利用流式细胞仪首先比较分析了SIRPα-Fc及SIRPαD1-Fc与PC-3细胞的结合活性(图7A)，发现SIRPαD1-Fc的结合活性(EC50＝6.57nM)显著高于SIRPα-Fc(EC50＝12.63nM)。由于以前的研究表明D1区域的糖基化与否并不影响D1与CD47的结合(Lee WY etal.,2007)，我们将D1区域的N89突变为了N89A(突变体命名为HY03M)，并比较分析了HY03M及SIRPαD1-Fc与CD47的结合活性。结果发现(图7B)，去除糖基化位点以后，HY03M的靶点结合活性(EC50＝0.5nM)显著高于SIRPαD1-Fc(EC50＝1.0nM)。结论：该研究表明，只含有D1区域的蛋白比含有整个膜外端的蛋白靶点活性要好，而去除糖基化位点以后的D1区域，靶点活性更好(靶点活性：HY03M>SIRPαD1-Fc>SIRPα-Fc)。
4、靶点阻断活性分析
利用流式细胞仪我们分析了未标记蛋白(SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc、HY03M、HY03MM)对荧光标记的SIRPα-Fc蛋白与靶点结合活性的影响。结果显示(图8)，四种蛋白均能剂量依赖性地阻断荧光标记蛋白与靶细胞(Jurkat)的结合，其中以SIRPαD1-Fc及HY03M的阻断效应最好(图8下方表格)。
5、HY03M及HY03MM与FcγRs的结合活性及对巨噬细胞吞噬活性的影
在人IgG1-Fc区域第265位点有一个天冬氨酸(D)，在抗体发挥效应功能的过程中发挥关键作用，如果将天冬氨酸突变为丙氨酸(D265A)，IgG几乎完全丧失与FcγRs(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA)的结合活性(Shields RL,et al.,2001)以及相应的ADCC、CDC等活性。为检验HY03M中的Fc是否参与抗肿瘤活性，我们将HY03M的Fc区域相应位点天冬氨酸突变成了丙氨酸(HY03MM，D192A)of Figure 5B并比较分析了HY03M及HY03MM与FcγRs(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA)的结合活性。结果表明(图9A)，突变以后的蛋白(HY03MM)与FcγRs的结合活性均显著下降，尤以对FcγRIIA、FcγRIIB、及FcγRIIIA的结合活性下降显著。
为分析突变体对巨噬细胞活性的影响，我们将荧光(CFSE)标记的靶细胞(Jurkat)与巨噬细胞(Raw264.7)分别与HY03M及HY03MM共培养，结果发现(图9B),与隐性对照(IgG)相比，HY03M显著促进巨噬细胞的吞噬活性，而突变体HY03MM则丧失了该活性，与IgG诱导的吞噬活性没有差别。
上述研究表明，单纯阻断CD47与SIRPα的相互作用(比如HY03MM)并不足于诱导巨噬细胞对靶细胞的吞噬活性，必须同时依靠Fc与巨噬细胞膜表面的FcγRs相互作用，才能充分激活巨噬细胞的吞噬活性。
6、HY03M及HY03MM的体内抗肿瘤活性
利用HL60皮下肿瘤模型，我们首先研究了HY03M蛋白的体内抗肿瘤活性。如图10A所示，经VEGF抑制剂治疗的荷瘤小鼠，肿瘤生长并未得到明显的抑制，而HY03M治疗组则显著抑制肿瘤生长，肿瘤大小从治疗开始时的100mm3逐渐萎缩，至实验结束时几乎完全消失了。阴性对照组小鼠的肿瘤体积则随着时间的延长逐渐生长，至结束时肿瘤体积高达1000mm3。该实验结果表明，单独抑制VEGF的活性，对HL60肿瘤没有显著治疗作用，标明HL60肿瘤的生长对VEGF的依赖性不强。但阻断肿瘤细胞诱导的巨噬细胞吞噬活性的抑制功能，则可增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬、并进而消灭肿瘤细胞。
为研究Fc区域是否参与HY03M的抗肿瘤活性，我们利用淋巴瘤(Daudi)模型研究了HY03M、HY03MM、及美罗华(Rituximab)对淋巴瘤的治疗作用。结果表明(图10B)，经HY03M治疗的小组，肿瘤生长显著被抑制(TGI＝72.5％)，抑制效果显著优于美罗华(TGI＝45.6％)，而带有Fc突变的HY03MM对肿瘤生长的抑制活性则大大减弱了(TGI＝26.4％)，表明Fc区域的确参与了HY03M蛋白的抗肿瘤活性。
该实验研究表明，HY03M对肿瘤的治疗作用机理包括两个方面，一方面通过阻断CD47与SIRPα的结合，从而阻断SIRPα传递的抑制性信号而被动激活巨噬细胞；另一方面则通过Fc与FcγRs的结合，主动激活巨噬细胞。
五、结论
1、结论：
我们的研究表明基因重组Fc融合蛋白SIRPαD1-Fc具有良好的靶点结合活性，其活性显著优于SIRPα-Fc。而去除糖基化位点以后(HY03M)，靶点活性进一步得到提高。体内研究表明HY03M蛋白具有强大的抗肿瘤活性，对于HL60模型，可以达到彻底消灭肿瘤的疗效。该蛋白的主要抗肿瘤作用机制包括两个方面，一方面通过阻断CD47与SIRPα的结合，从而阻断SIRPα传递的抑制性信号而被动激活巨噬细胞；另一方面则通过Fc与FcγRs的结合，主动激活巨噬细胞。这两种机制相互协同，充分激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，而巨噬细胞可进一步将肿瘤抗原交叉递呈给T淋巴细胞(Tseng D,et al.,2013)，最终把肿瘤细胞消灭掉。
如上所述，关于SIRPα-Fc及SIRPαD1-Fc与CD47的结合活性，以前曾有报道(Lee WYet al，2007)，但其二者与靶点CD47的亲和活性并未有差别。而我们的研究结果则表明，SIRPαD1-Fc与CD47的亲和活性(PC-3细胞)(EC50＝6.57nM)显著高于SIRPα-Fc(EC50＝12.63nM)。分析氨基酸序列发现，与Lee WY et al构建的载体相比，我们的SIRPαD1-Fc蛋白在氨基端多了九个氨基酸(SCAWSGVAG)，这可能是导致靶点活性增加的原因之一。进一步研究发现，去除D1区域的糖基化位点(N89A)以后，靶点活性得到进一步增强。 另外，通过Fc区域的定点突变(D192A),我们还发现Fc不仅有助于蛋白纯化(通过Protein A亲和层析)及蛋白稳定，而且还参与HY03M的抗肿瘤活性，因为D192A突变体的抗肿瘤活性大大降低。
本发明通过上述一个或多个实施例描述，但可以理解的是本发明不限于实施例，该描述旨在覆盖所附权利要求精神及范围内包括的所有替换、修改及等同。所有的参考文献及文字提及的专利及文献作为参考全部包含于本发明中。
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Claims (10)
1.一种重组双功能融合蛋白，包括信号调节蛋白(SIRP)膜外端的Ig样区，与免疫球蛋白的Fc片段连接，其中所述Ig样区能够与肿瘤细胞的CD47结合，从而阻断CD47与巨噬细胞表面SIRP的结合，所述Fc片段能够与巨噬细胞的Fc受体结合，激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，其中，所述信号调节蛋白为SIRPα，所述信号调节蛋白膜外端的Ig样区为SIRPαD1，且所述SIRPαD1经修饰去除其糖基化位点，其中，去除糖基化位点通过将SIRPαD1的第89位氨基酸由N变为A而实现。
2.如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白，其中，所述重组双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。
3.如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白，其中所述Fc片段为IgG1的Fc片段。
4.如权利要求3所述的重组双功能融合蛋白，其中所述IgG1为人IgG1。
5.一种如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白的同型二聚体，其中所述同型二聚体包括由一个或多个二硫键连接的两个重组双功能融合蛋白分子。
6.一种多聚核苷酸，其编码如权利要求1或2所述的重组双功能融合蛋白。
7.一种表达载体，其包含权利要求6所述的多聚核苷酸。
8.一种宿主细胞，其包含如权利要求7所述的表达载体。
9.一种药物组合物，包括如权利要求1所述的重组双功能融合蛋白以及至少一种药物佐剂。
10.权利要求1或2所述的重组双功能融合蛋白在制备一种治疗由过度表达
CD47引起的疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自髓细胞性白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤
(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌、卵巢癌、***癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌以及过敏性哮喘。
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