KR20150037876A - Fgfr3 관련 상태의 치료 방법 - Google Patents

Fgfr3 관련 상태의 치료 방법 Download PDF

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KR20150037876A
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fgfr3
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hvr
biomarker
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도로시 프렌치
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제넨테크, 인크.
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Abstract

병리학적 상태, 예컨대 암의 치료를 위한 바이오마커 및 요법, 및 FGFR3 길항제를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 특히, 암에서의 환자 선택 및 예후를 위한 바이오마커로서의 FGFR3 뿐만 아니라 치유적 치료 방법, 제조품 및 그의 제조 방법, 진단 키트, 검출 방법 및 이와 관련된 광고 방법이 제공된다.

Description

FGFR3 관련 상태의 치료 방법 {METHODS OF TREATING FGFR3 RELATED CONDITIONS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2012년 7월 27일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/676,857, 2012년 8월 31일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/695,853, 및 2012년 9월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/704,052를 우선권 주장하며, 이들은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2013년 7월 23일에 생성된 상기 ASCII 복사본의 명칭은 P4950R1-US.txt이고, 크기는 49,775 바이트이다.
분야
병리학적 상태, 예컨대 암의 치료를 위한 바이오마커 및 요법, 및 FGFR3 길항제를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 특히, 암에서의 환자 선택 및 예후를 위한 바이오마커로서의 FGFR3 뿐만 아니라 치유적 치료 방법, 제조품 및 그의 제조 방법, 진단 키트, 검출 방법 및 이와 관련된 광고 방법이 제공된다.
암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중 하나로 남아있다. 미국에서 암은 매년 거의 130만명의 새로운 환자를 발생시키고, 이는 심장 질환 다음으로 두번째 주요 사망 원인이며, 사망자 4명 중 대략 1명을 차지한다. 예를 들어, 유방암은 두번째로 가장 흔한 형태의 암이며, 미국 여성에서 두번째 주요 암 사망 원인이다. 또한, 암은 5년내 사망의 1위 원인으로서 심혈관 질환을 능가할 수도 있을 것으로 예상된다. 고형 종양은 대부분의 이러한 사망의 원인이 된다. 특정 암의 의학적 치료에 있어 상당한 진전이 있었으나, 모든 암에 대한 전반적 5년 생존율은 지난 20년 동안 단지 약 10%만 개선되었다. 암 또는 악성 종양은 비제어된 방식으로 신속하게 전이되어 성장하기 때문에, 적시의 검출 및 치료가 극히 어려워진다.
암 치료에서의 상당한 진전에도 불구하고, 개선된 요법이 여전히 요망되고 있다.
특허 출원 및 공개를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전문이 참조로 포함된다.
FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체) 및 그의 사용 방법이 본원에 제공된다. 질환 또는 장애를 갖는 개체가 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준을 갖는 것으로 나타난 경우에 상기 개체에게 치료 유효량의 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 개체로부터의 샘플이 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준을 포함하는지 결정하는 것, 및 개체에게 유효량의 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 투여하여 질환 또는 장애를 치료하는 것을 포함하는, 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
개체에게 유효량의 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 치료는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준에 기초하는 것인 방법이 본원에 제공된다.
또한, FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하는 것, 및 바이오마커의 수준에 기초하여 의약을 선택하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 개체를 위한 요법을 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 의약은 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준에 기초하여 선택된다.
질환 또는 장애를 갖는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료로부터 이익을 나타낼 가능성이 더 크다는 것을 나타내거나 또는 FGFR3 바이오마커의 감소된 수준은 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료로부터 이익을 나타낼 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료로부터 이익을 나타낼 가능성이 더 크거나 또는 더 작은 질환 또는 장애를 갖는 개체를 확인하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 표적 청중에게 FGFR3 바이오마커의 수준에 기초하여 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는데 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)의 사용을 촉구하는 것을 포함하는, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 광고하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제의 사용은 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준에 기초한다.
또한, (a) 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하는 것; (b) FGFR3 바이오마커의 수준에 기초하여 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 권장하는 것을 포함하는, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 제공받을 질환 또는 장애를 갖는 개체를 확인하기 위한 검정이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준에 기초하여 권장된다.
질환 또는 장애를 갖는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하며, 여기서 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준의 검출은 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 사용하여 치료되는 경우에 증가된 효능을 의미하고, FGFR3 바이오마커의 낮은 또는 실질적으로 검출가능하지 않은 수준의 검출은 질환을 갖는 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 사용하여 치료되는 경우에 감소된 효능을 의미하는 것인 진단 키트가 본원에 제공된다. 또한, 제약상 허용되는 담체 중 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체) 및 상기 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)가 FGFR3 바이오마커의 발현에 기초하여 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 함께 포장하여 포함하는 제조품이 본원에 제공된다. 치료 방법은 본원에 개시된 임의의 치료 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 제약 조성물 및 상기 제약 조성물이 FGFR3 바이오마커의 발현에 기초하여 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 패키지로 조합하는 것을 포함하는, 제조품을 제조하는 방법에 관한 것이다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3이다. 일부 실시양태에서, FGFR3은 면역조직화학에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 상승된 발현은 상승된 단백질 발현이고, 추가 실시양태에서 IHC를 이용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 IHC 임상 스코어는 2 이상이다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 IHC 임상 스코어는 3이다. 일부 실시양태에서, IHC 임상 스코어는 3이다. 일부 실시양태에서, IHC 임상 스코어는 2 또는 3이다. 일부 실시양태에서, 1의 IHC 임상 스코어는 a) > 10% 세포질 및/또는 막 염색 및 b) 약한 세포질 및/또는 막 염색 및 양성으로 염색된 세포 중 < 10%에서의 중간 정도 및/또는 강한 염색을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 1의 IHC 임상 스코어는 RPMI8226 세포주 염색과 유사하고/거나 실질적으로 동일한 염색을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 2의 IHC 임상 스코어는 a) > 10% 세포질 및/또는 막 염색 및 b) 세포 중 > 10%에서의 중간 정도 세포질 및/또는 막 염색 및 양성으로 염색된 세포 중 < 10%에서의 강한 염색을 나타내며; 약한 염색은 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 2의 IHC 임상 스코어는 OPM2 세포주 염색과 유사하고/거나 실질적으로 동일한 염색을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 3의 IHC 임상 스코어는 a) > 10% 세포질 및/또는 막 염색 및 b) 양성으로 염색된 세포 중 > 10%에서의 강한 세포질 및/또는 막 염색을 나타내며; 약한 및 중간 정도 염색은 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 3의 IHC 임상 스코어는 KMS11 세포주 염색과 유사하고/거나 실질적으로 동일한 염색을 나타낸다.
일부 실시양태에서, FGFR3은 항-FGFR3 진단 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 인간 FGFR3에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 인간 FGFR3의 아미노산 25-124를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 LGTEQRVVGRAAEVPGPEPGQQEQLVFGSGDAVELSCPPPGGGPMGPTVWVKDGTGLVPSERVLVGPQRLQVLNASHEDSGAYSCRQRLTQRVLCHFSVR (서열 181)을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 래트, 마우스 또는 토끼 항체이다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 모노클로날 항체이다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 IgG2 항체이다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 IgG2a 항체이다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)로부터의 sc-13121 (즉, B-9)이다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 돌연변이는 하기 FGFR3 아미노산 변이체 중 하나 이상을 코딩한다: FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, FGFR3 S371C, FGFR3 Y373C, FGFR3 G380R,FGFR3 K650X (예를 들어, FGFR3 K650E), FGFR3 K650M, 및 FGFR3 G697C. 일부 실시양태에서, FGFR3 돌연변이는 하기 FGFR3 아미노산 변이체 중 하나 이상이다: FGFR3 c.746C>G, FGFR3 c.1118A>G, FGFR3 c.742C>T, FGFR3c.1108G>T, FGFR3 c.1111A>T.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 실시양태에서, 샘플은 개체로부터의 조직 샘플이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 종양 조직 샘플 (예를 들어, 생검 조직)이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 방광 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 요로상피 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 방광에 인접한 조직이다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 실시양태에서, 방법, 검정 및/또는 키트는 개체에게 유효량의 FGFR3 길항제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 소분자 및/또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 항-FGFR3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 (즉, 요로상피 세포 암종)이다.
도 1 | 항-FGFR3 항체 IHC 염색 프로토콜의 개략도.
도 2 | A-B) 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용한 조직 샘플의 음성 IHC 염색. C) 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용한 H1155 세포주의 IHC 염색.
도 3 | A-D) 1의 임상 스코어를 갖는 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용한 조직 샘플의 IHC 염색. E) 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용한 RPMI8226 세포주의 IHC 염색.
도 4 | A-D) 2의 임상 스코어를 갖는 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용한 조직 샘플의 IHC 염색. E) 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용하는 OPM2 세포주의 IHC 염색.
도 5 | A-D) 3의 임상 스코어를 갖는 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용한 조직 샘플의 IHC 염색. E) 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용하는 KSM11 세포주의 IHC 염색.
도 6 | A-E) 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용하는 조직 샘플의 IHC 염색.
도 7 | A-C) 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용하는 요로상피 암종 조직의 패널의 IHC 염색.
도 8 | A-C) 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121; B-9)를 사용하는 임상 조직 샘플의 패널 (A: 환자 4, B: 환자 8, 및 C: 환자 9)의 IHC 염색.
도 9 | A-F: 항-FGFR3 항체의 중쇄 및 경쇄 HVR 루프 서열. 도면은 중쇄 HVR 서열, H1, H2 및 H3, 및 경쇄 HVR 서열, L1, L2 및 L3을 보여준다. 서열 넘버링은 다음과 같다:
클론 184.6 (HVR-H1은 서열 1이고; HVR-H2는 서열 2이고; HVR-H3은 서열 3이고; HVR-L1은 서열 4이고; HVR-L2는 서열 5이고; HVR-L3은 서열 6임);
클론 184.6.1 (HVR-H1은 서열 7이고; HVR-H2는 서열 8이고; HVR-H3은 서열 9이고; HVR-L1은 서열 10이고; HVR-L2는 서열 11이고; HVR-L3은 서열 12임)
클론 184.6.58 (HVR-H1은 서열 13이고; HVR-H2는 서열 14이고; HVR-H3은 서열 15이고; HVR-L1은 서열 16이고; HVR-L2는 서열 17이고; HVR-L3은 서열 18임)
클론 184.6.62 (HVR-H1은 서열 48이고; HVR-H2는 서열 49이고; HVR-H3은 서열 50이고; HVR-L1은 서열 51이고; HVR-L2는 서열 52이고; HVR-L3은 서열 53임)
클론 184.6.21 (HVR-H1은 서열 54이고; HVR-H2는 서열 55이고; HVR-H3은 서열 56이고; HVR-L1은 서열 57이고; HVR-L2는 서열 58이고; HVR-L3은 서열 59임)
클론 184.6.49 (HVR-H1은 서열 60이고; HVR-H2는 서열 61이고; HVR-H3은 서열 62이고; HVR-L1은 서열 63이고; HVR-L2는 서열 64이고; HVR-L3은 서열 65임)
클론 184.6.51 (HVR-H1은 서열 66이고; HVR-H2는 서열 67이고; HVR-H3은 서열 68이고; HVR-L1은 서열 69이고; HVR-L2는 서열 70이고; HVR-L3은 서열 71임)
클론 184.6.52 (HVR-H1은 서열 72이고; HVR-H2는 서열 73이고; HVR-H3은 서열 74이고; HVR-L1은 서열 75이고; HVR-L2는 서열 76이고; HVR-L3은 서열 77임)
클론 184.6.92 (HVR-H1은 서열 78이고; HVR-H2는 서열 79이고; HVR-H3은 서열 80이고; HVR-L1은 서열 81이고; HVR-L2는 서열 82이고; HVR-L3은 서열 83임)
클론 184.6.1.N54S (HVR-H1은 서열 84이고; HVR-H2는 서열 85이고; HVR-H3은 서열 86이고; HVR-L1은 서열 87이고; HVR-L2는 서열 88이고; HVR-L3은 서열 89임)
클론 184.6.1.N54G (HVR-H1은 서열 90이고; HVR-H2는 서열 91이고; HVR-H3은 서열 92이고; HVR-L1은 서열 93이고; HVR-L2는 서열 94이고; HVR-L3은 서열 95임)
클론 184.6.1.N54A (HVR-H1은 서열 96이고; HVR-H2는 서열 97이고; HVR-H3은 서열 98이고; HVR-L1은 서열 99이고; HVR-L2는 서열 100이고; HVR-L3은 서열 101임)
클론 184.6.1.N54Q (HVR-H1은 서열 102이고; HVR-H2는 서열 103이고; HVR-H3은 서열 104이고; HVR-L1은 서열 105이고; HVR-L2는 서열 106이고; HVR-L3은 서열 107임)
클론 184.6.58.N54S (HVR-H1은 서열 108이고; HVR-H2는 서열 109이고; HVR-H3은 서열 110이고; HVR-L1은 서열 111이고; HVR-L2는 서열 112이고; HVR-L3은 서열 113임)
클론 184.6.58.N54G (HVR-H1은 서열 114이고; HVR-H2는 서열 115이고; HVR-H3은 서열 116이고; HVR-L1은 서열 117이고; HVR-L2는 서열 118이고; HVR-L3은 서열 119임)
클론 184.6.58.N54A (HVR-H1은 서열 120이고; HVR-H2는 서열 121이고; HVR-H3은 서열 122이고; HVR-L1은 서열 123이고; HVR-L2는 서열 124이고; HVR-L3은 서열 125임)
클론 184.6.58.N54Q (HVR-H1은 서열 126이고; HVR-H2는 서열 127이고; HVR-H3은 서열 128이고; HVR-L1은 서열 129이고; HVR-L2는 서열 130이고; HVR-L3은 서열 131임).
클론 184.6.1.NS D30E (HVR-H1은 서열 143이고; HVR-H2는 서열 144이고; HVR-H3은 서열 145이고; HVR-L1은 서열 140이고; HVR-L2는 서열 141이고; HVR-L3은 서열 142임).
아미노산 위치는 하기 기재된 바와 같은 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
도 10 | 항-FGFR3 항체 184.6.1.N54S, 184.6.1', 184.6.58 및 184.6.62의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
I. 정의
용어 "섬유모세포 성장 인자 수용체 3" 및 "FGFR3"은 본원에서 천연 서열 FGFR3 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체 및 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체의 단편 (본원에서 추가로 정의됨)을 지칭한다. 본원에 기재된 FGFR3 폴리펩티드는 다양한 공급원으로부터, 예컨대 인간 조직 유형으로부터 또는 또 다른 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
"천연 서열 FGFR3 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래된 상응하는 FGFR3 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 천연 서열 FGFR3 폴리펩티드는 P22607-1 또는 P22607-2의 유니프롯(UniProt) 데이터베이스로부터의 아미노산 서열을 포함한다.
"FGFR3 폴리펩티드 변이체" 또는 그의 변이체는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 천연 서열 FGFR3 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 FGFR3 폴리펩티드, 일반적으로 활성 FGFR3 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 FGFR3 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 1개 이상의 아미노산 잔기가 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 첨가 또는 결실된 FGFR3 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, FGFR3 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 바와 같은 천연 서열 FGFR3 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 통상적으로, FGFR3 변이체 폴리펩티드는 길이가 적어도 약 10개 아미노산, 대안적으로 길이가 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600개 아미노산 또는 그 초과일 것이다. 임의로, FGFR3 변이체 폴리펩티드는 천연 FGFR3 폴리펩티드 서열에 비해 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 FGFR3 폴리펩티드 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
본원에 정의된 용어 "FGFR3 길항제"는 천연 서열 FGFR3에 의해 매개되는 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자이다. 특정 실시양태에서 이러한 길항제는 FGFR3에 결합한다. 한 실시양태에 따르면, 길항제는 폴리펩티드이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 길항제는 항-FGFR3 항체이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 길항제는 소분자 길항제이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 길항제는 폴리뉴클레오티드 길항제이다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 존재하는 경우에 중합체의 어셈블리 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에 예컨대 표지와의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 "캡" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결부 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결부 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)를 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)을 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)을 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형 연결부 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)를 갖는 것 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기가 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기로 대체되거나, 표준 보호 기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결이 만들어지도록 활성화되거나, 또는 고체 또는 반고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 인산화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사형, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결이 대안적인 연결 기로 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO- 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결부를 함유하는 치환 또는 비치환 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜임)로 대체되는 실시양태를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 (반드시는 아니지만) 길이가 약 250개 미만의 뉴클레오티드인 짧은 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 합성될 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.
용어 "프라이머"는 핵산에 혼성화하고, 일반적으로 유리 3'-OH 기를 제공함으로써 상보성 핵산의 중합을 허용할 수 있는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
용어 "소분자"는 약 2000 달톤 이하, 바람직하게는 약 500 달톤 이하의 분자량을 갖는 임의의 분자를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
용어 "항-FGFR3 항체" 및 "FGFR3에 결합하는 항체"는 항체가 FGFR3의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 FGFR3에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항-FGFR3 항체의 비관련, 비-FGFR3 단백질에 대한 결합의 정도는 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정시에 항체의 FGFR3에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 상이한 종으로부터의 FGFR3 사이에서 보존된 FGFR3의 에피토프에 결합한다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 항체이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시양태가 하기 기재된다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변경을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하고, 반대로 경쟁 검정에서 참조 항체가 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하도록 사용되고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 상기 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 통상의 기술자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
용어 "검출"은 직접 및 간접 검출을 비롯한 임의의 검출 수단을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "바이오마커"은 샘플에서 검출될 수 있는 표지자, 예를 들어 예측, 진단 및/또는 예후를 지칭한다. 바이오마커는 특정의 분자, 병리학적적, 조직학적 및/또는 임상적 특징에 의해 특성화된 특정한 하위유형의 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)의 표지자로서 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 유전자이다. 바이오마커는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA), 폴리펩티드, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 번역후 변형), 탄수화물 및/또는 당지질-기재 분자 마커를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "바이오마커 서명", "서명", "바이오마커 발현 서명" 또는 "발현 서명"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 그의 발현이 표지자, 예를 들어 예측, 진단 및/또는 예후인 바이오마커 중 하나 또는 그의 조합을 지칭한다. 바이오마커 서명은 특정의 분자, 병리학적, 조직학적 및/또는 임상적 특징에 의해 특성화된 특정한 하위유형의 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)의 표지자로서 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 서명은 "유전자 서명"이다. 용어 "유전자 서명"은 "유전자 발현 서명"과 교환가능하게 사용되고, 그의 발현이 표지자, 예를 들어 예측, 진단 및/또는 예후인 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 그의 조합을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 바이오마커 서명은 "단백질 서명"이다. 용어 "단백질 서명"는 "단백질 발현 서명"과 교환가능하게 사용되고, 그의 발현이 표지자, 예를 들어 예측, 진단 및/또는 예후인 폴리펩티드 중 하나 또는 그의 조합을 지칭한다.
개체에 대한 증가된 임상적 이익과 연관된 바이오마커의 "양" 또는 "수준"은 생물학적 샘플 중의 검출가능한 수준이다. 이것은 통상의 기술자에게 공지되고 또한 본 발명에 의해 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가되는 바이오마커의 발현 수준 또는 양은 치료에 대한 반응을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "발현의 수준" 또는 "발현 수준"은 일반적으로 교환가능하게 사용되고, 일반적으로 생물학적 샘플에서 바이오마커의 양을 지칭한다. "발현"은 일반적으로 정보 (예를 들어, 유전자-코딩 및/또는 후성학)가 세포 내에 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 과정을 지칭다. 따라서, 본원에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드로의 전사, 폴리펩티드로의 번역 또는 심지어 폴리뉴클레오티드 및/또는 풀리펩티드 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 번역후 변형)을 지칭할 수 있다. 전사된 폴리뉴클레오티드, 번역된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 풀리펩티드 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 번역후 변형)은 또한 이들이 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 전사체 또는 분해된 전사체로부터 유래하든지 또는 예를 들어 단백질분해에 의한 폴리펩티드의 번역후 프로세싱으로부터 유래하든지 발현되는 것으로 여겨질 것이다. "발현된 유전자"는 mRNA로서 폴리뉴클레오티드로 전사되고, 이어서 폴리펩티드로 번역되는 것, 또한 RNA로 전사되지만 폴리펩티드로 번역되지 않는 것 (예를 들어, 운반 및 리보솜 RNA)을 포함한다.
"상승된 발현", "상승된 발현 수준" 또는 "상승된 수준"은 대조군, 예컨대 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 앓고 있지 않은 개체 또는 개체들 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 바이오마커)에 비해 개체에서 바이오마커의 증가된 발현 또는 증가된 수준을 지칭한다.
"감소된 발현", "감소된 발현 수준" 또는 "감소된 수준"은 대조군, 예컨대 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 앓고 있지 않은 개체 또는 개체들 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 바이오마커)에 비해 개체에서 바이오마커의 감소된 발현 또는 감소된 수준을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 감소된 발현은 거의 없거나 또는 전혀 없는 발현이다.
용어 "하우스키핑 바이오마커"는 전형적으로 모든 세포 유형에서 유사하게 존재한 바이오마커 또는 바이오마커의 군 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 하우스키핑 바이오마커는 "하우스키핑 유전자"이다. "하우스키핑 유전자"는 본원에서 그의 활성이 세포 기능의 유지에 필수적이고 전형적으로 모든 세포 유형에서 유사하게 존재하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자의 군을 지칭한다.
본원에 사용된 "증폭"은 일반적으로 원하는 서열의 다중 카피를 생산하는 과정을 지칭한다. "다중 카피"는 적어도 2개의 카피를 의미한다. "카피"가 반드시 주형 서열에 대한 완전한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하는 것이 아니다. 예를 들어, 카피는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 데옥시이노신, 의도적인 서열 변경 (예컨대, 주형에 혼성화가능하지만 상보성이지는 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입되는 서열 변경), 및/또는 증폭 동안 발생하는 서열 오류를 포함할 수 있다.
용어 "멀티플렉스-PCR"은 단일 반응에서 2개 이상의 DNA 서열을 증폭시키는 목적을 위해 하나 초과의 프라이머 세트를 사용하여 단일 공급원 (예를 들어, 개체)으로부터 수득한 핵산에 대해 수행되는 단일 PCR 반응을 지칭한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 그의 융점 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화 가능 서열 사이의 바람직한 상동성 정도가 클수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격도에 대한 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.
본원에 정의된 바와 "엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 다음에 의해 확인될 수 있다: (1) 세척시 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 사용하거나, (2) 혼성화 동안에 42℃에서 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 함유하는 50% (v/v) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하거나, 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용하고 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 중에 10분 세척한 후에, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC로 이루어진 고엄격도 세척을 10분 수행하여 용액 중에서 밤샘 혼성화한다.
"중간 정도 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 %SDS)의 사용을 포함한다. 중간 정도 엄격한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 필터를 약 37-50℃에서 1 x SSC로 세척하는 것이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 알 것이다.
용어 "진단"은 분자 또는 병리학적 상태, 질환 또는 상태 (예를 들어, 암)의 확인 또는 분류를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "진단"은 특정한 유형의 암의 확인을 지칭할 수 있다. "진단"은 또한 예를 들어 조직병리학적 기준, 또는 분자 특징 (예를 들어, 바이오마커 (예를 들어, 특정한 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질) 중 하나 또는 그의 조합의 발현에 의해 특성화된 하위유형)에 의한 특정한 유형의 암의 분류를 지칭할 수 있다.
용어 "진단을 돕는 것"은 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)의 특정한 유형의 증상 또는 상태의 존재 또는 특성에 대한 임상적 결정을 돕는 방법을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, 질환 또는 상태 (예를 들어, 암)의 진단을 돕는 방법은 개체로부터 생물학적 샘플에서 특정 바이오마커를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징에 기초하여 특성화 및/또는 확인되는 세포성 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는 관심 대상체 및/또는 개체로부터 얻거나 이들체로부터 유래된 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 어구 "질환 샘플" 및 그의 변형 표현은 특성화되는 세포성 및/또는 분자 엔티티를 함유하는 것으로 예상되거나 공지된 관심 대상으로부터 얻은 임의의 샘플을 의미한다. 샘플은 일차 또는 배양된 세포 또는 세포주, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈소판, 혈청, 혈장, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 유액, 전혈, 혈액-유래 세포, 소변, 뇌척수액, 타액, 객담, 누액, 땀, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지, 조직 추출물, 예컨대 균질화된 조직, 종양 조직 및 세포 추출물, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"조직 샘플" 또는 "세포 샘플"은 대상체 또는 개체의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선하고/하거나 냉동되고/되거나 보존된 기관, 조직 샘플, 생검 및/또는 흡인물로부터의 고체 조직, 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분, 예를 들어 뇌 척수액, 양수, 복수액 또는 간질액과 같은 체액 및 대상체의 임신 또는 발생 중 임의의 시점으로부터의 세포 또는 혈장일 수 있다. 또한, 조직 샘플은 일차 또는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 질환 조직/기관으로부터 수득한다. 조직 샘플은 자연에서 조직과 자연적으로 서로 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "참조 샘플", "참조 세포", "참조 조직", "대조 샘플", "대조 세포" 또는 "대조 조직"은 비교 목적을 위해 사용되는 샘플, 세포, 조직, 표준 또는 수준을 지칭한다. 한 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 동일한 대상체 또는 개체의 건강한 및/또는 비-이환된 신체 일부 (예를 들어, 조직 또는 세포)로부터 수득한다. 예를 들어, 건강한 및/또는 비-이환된 세포 또는 조직은 이환된 세포 또는 조직 (예를 들어, 종양에 인접한 세포 또는 조직)에 인접하여 있다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 개체의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 개체의 건강한 및/또는 비-이환된 신체의 일부 (예를 들어, 조직 또는 세포)로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 개체의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포로부터 수득한다.
본원에서의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직의 박편 또는 세포를 의미한다. 조직 샘플의 동일한 절편이 형태 및 분자 수준 둘 다에서 분석되거나, 또는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 둘 다에 대해 분석될 수 있음을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 채취하여 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.
"상관시키다" 또는 "상관시키는"은 임의의 방식으로든 제1 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜의 수행시에 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/있거나 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 제2 분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분석 또는 프로토콜의 실시양태와 관련하여, 폴리뉴클레오티드 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 특정 치료 요법을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다.
"개체 반응" 또는 "반응"은 (1) 질환 진행 (예를 들어, 암 진행)의 어느 정도까지의 억제, 예를 들어 지연 및 완전한 정지, (2) 종양 크기의 감소, (3) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (4) 전이의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (5) 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)와 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화, (6) 무진행 생존 기간의 증가, 및/또는 (9) 치료 후 주어진 시점에서의 감소된 사망률을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 개체에게 이익을 나타내는 임의의 종점을 이용하여 평가할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 통상의 기술자가 2개의 수치값 (예를 들어, Kd 값 또는 발현)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서, 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 상이한"은 통상의 기술자가 2개의 수치 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과 및/또는 약 50% 초과이다.
단어 "표지"는 본원에 사용된 경우에 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 전형적으로 시약, 예컨대 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합되고, 그와 접합되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수도 있고 (예를 들어, 방사선동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 생성물을 생성하는 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수도 있다.
"유효량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.
물질/분자, 효능제 또는 길항제의 "치료 유효량"은 인자, 예컨대, 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 도출하는 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 또한 치료 유효량은 물질/분자, 효능제 또는 길항제의 치료상 유익한 효과가 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 원하는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계 전에 또는 보다 초기 단계에서 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해 사용된다.
용어 "항암 요법"은 암을 치료하는데 유용한 요법을 지칭한다. 항암 치료제의 예는, 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항혈관신생제, 아폽토시스성 작용제, 항-튜불린 작용제, 및 암을 치료하기 위한 다른 작용제, 항-CD20 항체, 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec)™ (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 시토카인, 하기 표적 PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 수용체(들) 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성제 및 유기 화학적 작용제 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그의 조합이 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하도록 의도된다. 다른 세포독성제는 하기 기재되어 있다. 종양사멸제는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323 (경구 알파-4 인테그린 억제제); 다이네미신 (다이네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (독실(DOXIL)®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (마이오세트(MYOCET)®), PEG화 리포솜 독소루비신 (케릭스(CAELYX)®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (유프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (젤로다(XELODA)®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론, 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®) 및 카르보플라틴; 미세소관을 형성하는 튜불린 중합을 억제하는 빈카 (빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®) 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®) 포함); 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보빈; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산 (벡사로텐 (탈그레틴(TARGRETIN)®) 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®) 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식과 연관된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (수니티닙, 수텐트(SUTENT)®, 화이자(Pfizer)); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R 11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리메르센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제 (하기의 정의 참조); 티로신 키나제 억제제 (하기의 정의 참조); 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)™); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 플레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료 요법의 약어)를 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 혼합된 효능제/길항제 프로파일을 갖는 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)®), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예컨대 SERM3; 효능제 특성을 갖지 않는 순수한 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®) 및 EM800 (이러한 작용제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고/거나, DNA 결합을 억제하고/거나, ER 턴오버를 증가시키고/거나 ER 수준을 억제할 수 있음); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트라졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®) 및 아미노글루테티미드, 및 다른 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르(RIVISOR)®), 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 파드로졸 및 4(5)-이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 효능제, 예를 들어 류프롤리드 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)®, 고세렐린, 부세렐린 및 트립테렐린; 성 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예컨대 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예컨대 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 호르몬 그 자체일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전구약물"은 모 약물에 비해 종양 세포에 덜 세포독성이고, 보다 활성의 모 형태로 효소에 의해 활성화되거나 전환될 수 있는, 제약 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조한다. 본 발명의 전구약물은, 보다 활성의 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-개질된 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기 기재된 화학요법제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 경우에 "성장 억제제"는 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 그의 성장이 FGFR3 발현에 의존하는 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에서) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 전통적인 M-기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 또한 S-기 정지로까지 이어진다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)] (특히, p. 13)에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목으로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래된 도세탁셀 (탁소테레®, 롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer))은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb))의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세관 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세관을 안정화시켜서 세포에서의 유사분열 억제를 유발한다.
"방사선 요법"은 정상적으로 기능하거나 세포를 파괴하는 능력이 완전히 제한되도록 세포에 대한 충분한 손상을 유도하기 위해 지정된 감마선 또는 베타선을 사용하는 것을 의미한다. 투여량 및 치료의 지속시간을 결정하기 위한 관련 기술분야에 공지된 수많은 방법이 있음을 이해할 것이다. 전형적인 치료는 1회 투여로 제공되며, 전형적인 투여량은 1일에 10 내지 200 유닛 (Gray)의 범위이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "공동으로"는 2종 이상의 치료제의 투여가 적어도 일부의 투여 시간이 중첩되는 경우를 지칭하도록 본원에 사용된다. 따라서, 공동 투여는 하나 이상의 작용제(들)의 투여를 하나 이상의 다른 작용제(들)의 투여를 중단한 후에 계속하는 경우의 투여 요법을 포함한다.
"감소시키거나 또는 억제하는"은 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 전반적 감소를 발생시키는 능력을 의미한다. 감소 또는 억제는 치료할 장애의 증상, 전이물의 존재 또는 크기, 또는 원발성 종양의 크기를 지칭할 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업용 패키지 내에 통상적으로 포함되어 있으며 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 사항, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
"제조품"은 하나 이상의 시약, 예를 들어 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 치료하기 위한 의약 또는 본원에 기재된 바이오마커를 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 패키지 또는 용기) 또는 키트이다. 특정 실시양태에서, 제조품 또는 키트는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 판촉되거나, 배급되거나 또는 판매된다.
"표적 청중"은, 마케팅 또는 광고에 의해서와 같이, 특히 특정한 용도, 치료 또는 적응증을 위한 특정한 의약이 프로모션되고 있거나 프로모션되도록 의도되는 일군의 사람들 또는 기관, 예컨대 개체, 집단, 신문, 의학 문헌 및 잡지의 구독자, 텔레비젼 또는 인터넷 시청자, 라디오 또는 인터넷 청취자, 의사, 제약 회사 등이다.
본원에 사용되는 경우에 어구 "에 기초하여"는 하나 이상의 바이오마커에 대한 정보가 치료 결정, 포장 삽입물 상에 제공되는 정보, 또는 마케팅/프로모션 안내 등을 알리는데 이용된다는 것을 의미한다.
통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함(하고 이를 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에 기재된 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태로 "로 이루어지는" 및/또는 "로 본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 단수 형태는 달리 나타내지 않는 한 복수 언급대상을 포함한다.
II. 방법 및 용도
FGFR3 바이오마커를 이용하는 방법이 본원에 제공된다. 특히, FGFR3 길항제 및 FGFR3 바이오마커를 이용하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 질환 또는 장애를 갖는 개체가 FGFR3 바이오마커의 존재 및/또는 상승된 수준을 갖는 것으로 나타난 경우에 상기 개체에게 치료 유효량의 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 개체로부터의 샘플이 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준을 포함하는지 결정하는 것, 및 개체에게 유효량의 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 투여하여 질환 또는 장애를 치료하는 것을 포함하는, 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3 발현이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 발현은 FGFR3 폴리펩티드 발현이고, FGFR3 폴리펩티드 발현은 IHC에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 (즉, 요로상피 세포 암종)이다.
개체에게 유효량의 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 치료는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 존재 및/또는 상승된 수준에 기초하는 것인 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3 발현이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 발현은 FGFR3 폴리펩티드 발현이고, FGFR3 폴리펩티드 발현은 IHC에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 (즉, 요로상피 세포 암종)이다.
또한, FGFR3 바이오마커의 존재 및/또는 수준을 결정하는 것, 및 바이오마커의 존재 및/또는 수준에 기초하여 의약을 선택하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 개체를 위한 요법을 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 의약은 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3 발현이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 발현은 FGFR3 폴리펩티드 발현이고, FGFR3 폴리펩티드 발현은 IHC에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 (즉, 요로상피 세포 암종)이다.
개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 존재 및/또는 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플에서의 FGFR3 바이오마커의 존재 및/또는 상승된 수준은 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료로부터 이익을 나타낼 가능성이 더 크다는 것을 나타내거나 또는 FGFR3 바이오마커의 부재 및/또는 감소된 수준은 개체가 FGFR3 길항제(예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료로부터 이익을 나타낸 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료로부터 이익을 나타낼 가능성이 더 크거나 또는 더 작은 질환 또는 장애를 갖는 개체를 확인하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3 발현이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 발현은 FGFR3 폴리펩티드 발현이고, FGFR3 폴리펩티드 발현은 IHC에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 (즉, 요로상피 세포 암종)이다.
또한, 표적 청중에게 FGFR3 바이오마커의 존재 및/또는 수준에 기초하여 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는데 FGFR3 길항제(예를 들어, 항-FGFR3 항체)의 사용을 촉구하는 것을 포함하는, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 광고하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제의 사용은 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준에 기초한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3 발현이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 발현은 FGFR3 폴리펩티드 발현이고, FGFR3 폴리펩티드 발현은 IHC에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 (즉, 요로상피 세포 암종)이다.
또한, (a) 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 존재 및/또는 수준을 결정하는 것; (b) FGFR3 바이오마커의 존재 및/또는 수준에 기초하여 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 권장하는 것을 포함하는, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 제공받을 질환 또는 장애를 갖는 개체를 확인하기 위한 검정이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준에 기초하여 권장된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3 발현이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 발현은 FGFR3 폴리펩티드 발현이고, FGFR3 폴리펩티드 발현은 IHC에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 (즉, 요로상피 세포 암종)이다.
질환 또는 장애를 갖는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하며, 여기서 FGFR3 바이오마커의 존재 및/또는 상승된 수준의 검출은 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 사용하여 치료되는 경우에 증가된 효능을 의미하고, FGFR3 바이오마커의 낮은 또는 실질적으로 검출가능하지 않은 수준의 검출은 질환을 갖는 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 사용하여 치료되는 경우에 감소된 효능을 의미하는 것인 진단 키트가 본원에 제공된다. 또한, 제약상 허용되는 담체 중 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체) 및 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)가 FGFR3 바이오마커의 발현에 기초하여 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 함께 포장하여 포함하는 제조품이 본원에 제공된다. 치료 방법은 본원에 개시된 임의의 치료 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 제약 조성물 및 제약 조성물이 FGFR3 바이오마커의 발현에 기초하여 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 것임을 나타내는 포장 삽입물을 패키지로 조합하는 것을 포함하는, 제조품의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3 발현이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 발현은 FGFR3 폴리펩티드 발현이고, FGFR3 폴리펩티드 발현은 IHC에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 (즉, 요로상피 세포 암종)이다.
또한, 개체에게 유효량의 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 투여하는 것 및 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 사용하는 치료 동안 개체로부터의 샘플에서 하나 이상의 FGFR3 바이오마커의 수준을 (예를 들어, 참조에 비해) 평가하는 것을 포함하는, 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 개체에게 유효량의 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 치료는 개체로부터의 샘플에서 하나 이상의 FGFR3 바이오마커의 수준에 (예를 들어, 참조에 비해) 기초하는 것인 방법이 제공된다. 개체로부터의 샘플에서 하나 이상의 FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플에서 하나 이상의 FGFR3 바이오마커의 (예를 들어, 참조에 비해) 감소된 수준은 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료에 반응성일 가능성이 더 크거나 또는 하나 이상의 FGFR3 바이오마커의 (예를 들어, 참조에 비해) 상승된 수준 및/또는 전처리 수준과 실질적으로 동일한 수준은 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료에 대해 반응성일 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료에 대한 개체에서의 반응성을 모니터링하는 방법이 제공된다. 또한, 개체로부터의 샘플에서 하나 이상의 FGFR3 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 하나 이상의 FGFR3 바이오마커의 (예를 들어, 참조에 비해) 상승된 수준 및/또는 전처리 수준과 실질적으로 동일한 수준은 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료를 중단해야 함을 결정하고, 하나 이상의 FGFR3 바이오마커의 (예를 들어, 참조에 비해) 감소된 수준은 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료를 계속해야 함을 결정하는 것인, 질환 또는 장애를 갖는 개체가 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)를 포함하는 치료를 계속해야 할지 또는 중단해야 할지 여부를 결정하는 방법이 제공된다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 FGFR3 바이오마커는 FABP4, PLAT, DUSP6, FGFBP1, SCNN1B, TRIM22, UPK1A, ID2, LDLR, LOXL1, IDI1, SEPP1, FDFT1, CCDC85A, MUC15, SC4MOL, CRISP3, S100A2, ERP27, FRAS1, PCSK9, SQLE, CYP4B1, IGHA1, MMP1, F2R, TSPAN12, ABP1, COL4A4, INSIG1, SLCO4A1, PDE8B, ATP1A4, CLDN8, NT5E, TNS1, VSIG2, PHLDA1, SCNN1G, COL4A2, FGFR3, HMGCS1, S100A9, VTCN1, CCDC80, SPATA17, MAN1A1, SPOCK1, SULF2, ACAT2, MUC20, MMP10, TMC4, HMGCR, CDK14, FASN, ATP6V1B1, DHRS2, TNS3, ATP2B4, PDZK1, MYCL1, CYB5B, KRT15, DAPL1, FAR2, DHCR7, ASPH, CFD, IFIT1, MR1, OLR1, C3orf58, DHRS9, IQGAP2, PPP1R3B, HS3ST1, C16orf54, FGD3, PIK3IP1, LGALS8, OPTN, LAMB3, SCD, GKN1, MICB, ID1, SPTLC3, ETV4, ACSL3, SLC20A1, TSC22D3, DBP, IGFBP5, CYP1B1, CDC42EP3, SLC35A1, ID3, ITGA2, FOXO6, NDRG1, TBX3, SEZ6L2, WNT4, HOXA5, LRP8, PAICS, C10orf54, ELOVL5, CTNNAL1, SEMA3E, PFKFB3, KITLG, BCL11A, NEBL, TIMP2, STARD5, IL1RN, PCDHB14, MVP, TMEM47, CHAC2, OLFML2A, GDA, MMD, ALDH3B1, NME1, CLU, APOBEC3G, DDX39A, HBEGF, PNP, FDPS, FAM171B, ERO1L, ADORA2B, CYP51A1, TUBG1, LSS, STOX2, CTPS, ABAT, SEPW1, GABRP, TACC3, TCF7L1, TFPI2, FYB, MATN2, WNT10A, TFRC, RIMS2, PSMD14, GRHL3, ZFP36L1, TSGA10, GART, SLC45A3, ATL1, ANKDD1A, ACPL2, ITLN1, C20orf114, ARHGAP26, CYP24A1, HIST1H2AC, FAM49A, PLD1, TMPRSS2, PP14571, MAFB, SDR16C5, WDR4, TNIK, FAM46A, FAM134B, SEMA5A, PRICKLE1, ID4, PPP2R2B, MGC16075, ZNF404, IFI44, SMPDL3A, JDP2, CD55, ZIC2, C6orf141, CPAMD8, ME1, GGT6, C17orf103, FAM84A, CLIC5, KAL1, APCDD1, MT1F, MPPED2, SYNPO, TRIM16, TSPAN8, ARNT, DAPK2, SH3BGRL, PLK1, MBIP, METRNL, ANXA3, GSN, LIPG, PPIL1, SYTL5, UPK3B, SYNE1, PLSCR4, PTGER4, GMFG, MAFF, TMEM37, HCFC1R1, ZDHHC8P1, AXL, HLA-E, MVK, CASQ1, EBP, DNAJC4, BTN3A3, LRMP, IRF9, ART3, LYAR, SNRPD1, UPK2, MTHFD1L, EGFL6, BST2, LOC283788, AGPAT5, SERPINF1, CTSS, PROS1, TFF1, GJB2, TBC1D9, C9orf40, IPO5, LOC100289610, GPC3, PDK4, NFKBIA, CASZ1, SNCG, TIPIN, EPHA4, BAMBI, LMO4, PIK3C3, CXCL11, IL1R1, HSD17B2, PEA15, IRAK2, PRODH, CYP26B1, WDR78, WLS, SGSH, KLF9, CHORDC1, TRPC1, HS6ST3, ETV5, TRIM31, COL4A1, C3orf26, RPS6KA6, BMP2, SSFA2, TMCC3, IL1RAP, BBOX1, TMEM27, PDSS1, DSE, NR3C1, CPEB2, TPRG1, C15orf57, MGAM, HAMP, TLR4, GABRB3, GATA6, CLCN4, ZNF763, ACP1, GIMAP2, LOC284837, SNRPN, MBD5, CD109, JSRP1, TMEM151B, PIWIL1, FAM65B, EML5, COL4A3, PRKD2, MATR3, ACER3, NCRNA00247, 및 LOC100507557로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 MMP1이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 MMP10이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 요 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 질환 또는 장애이다. 일부 실시양태에서, 증식성 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암이다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 (즉, 요로상피 세포 암종)이다.
바이오마커 (예를 들어, FGFR3)의 존재 및/또는 발현 수준/양은 대사물, DNA, mRNA, cDNA, 단백질, 단백질 단편 및/또는 유전자 카피수를 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 기준에 기초하여 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 샘플에서 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양은 제2 샘플에서의 존재/부재 및/또는 발현 수준/양에 비해 증가한다. 특정 실시양태에서, 제1 샘플에서 바이오마커의 존재/부재 및/또는 발현 수준/양은 제2 샘플에서의 존재 및/또는 발현 수준/양에 비해 감소한다. 특정 실시양태에서, 제2 샘플은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직이다. 유전자의 존재/부재 및/또는 발현 수준/양을 결정하기 위한 추가의 개시내용이 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 상승된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 관련 기술분야 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상승된 발현은 샘플에서 바이오마커의 발현 수준/양의 증가를 지칭하며, 여기서 증가는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 또는 100X이다. 일부 실시양태에서, 상승된 수준은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 대조 조직 또는 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 유전자)과 비교하여 약 1.5배, 약 1.75배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 2.75배, 약 3.0배 또는 약 3.25배 초과의 전반적 증가를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 감소된 발현은 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직과 비교하여 표준 관련 기술분야 공지의 방법, 예컨대 본원에 기재된 것에 의해 검출된 바이오마커 (예를 들어, 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자 또는 mRNA))의 수준의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 전반적 감소를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 감소된 발현은 샘플에서 바이오마커의 발현 수준/양의 감소를 지칭하며, 여기서 감소는 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직에서 각각의 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X, 또는 0.01X이다.
샘플 중 다양한 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양은 면역조직화학 ("IHC"), 웨스턴 블롯 분석, 면역침전, 분자 결합 검정, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 ("FACS"), 매스어레이(MassARRAY), 단백질체학, 정량적 혈액 기반 검정 (예를 들어, 혈청 ELISA), 생화학적 효소적 활성 검정, 계내 혼성화, 서던 분석, 노던 분석, 전체 게놈 서열분석, 폴리머라제 연쇄 반응 ("PCR") (정량적 실시간 PCR ("qRT-PCR") 포함) 및 다른 증폭 유형 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등), RNA-Seq, FISH, 마이크로어레이 분석, 유전자 발현 프로파일링 및/또는 유전자 발현의 일련의 분석 ("SAGE") 뿐만 아니라 단백질, 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 매우 다양한 검정 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 방법론에 의해 분석될 수 있으며, 이들 중 다수는 관련 기술분야에 공지되어 있고 통상의 기술자에 의해 이해된다. 유전자 및 유전자 산물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology] (유닛 2 (노던 블롯팅), 4 (서던 블롯팅), 15 (이뮤노블롯팅) 및 18 (PCR 분석))에서 찾아볼 수 있다. 또한, 멀티플렉스화 면역검정, 예컨대 룰즈 베이스드 메디슨(Rules Based Medicine) 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) ("MSD")로부터 입수가능한 것이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양은 (a) 샘플 (예컨대, 대상체 암 샘플)에 대해 유전자 발현 프로파일링, PCR (예컨대, rtPCR), RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, 매스어레이 기술, 또는 FISH를 수행하는 것; 및 b) 샘플에서 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 마이크로어레이 방법은 엄격한 조건 하에 상기 언급된 유전자를 코딩하는 핵산 분자에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 갖거나 또는 상기 언급된 유전자에 의해 코딩되는 단백질 중 하나 이상에 결합할 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드 (예컨대, 펩티드 또는 항체)를 갖는 마이크로어레이 칩의 사용을 포함한다. 한 실시양태에서, PCR 방법은 qRT-PCR이다. 한 실시양태에서, PCR 방법은 멀티플렉스-PCR이다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 마이크로어레이에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 유전자 발현은 qRT-PCR에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 발현은 멀티플렉스-PCR에 의해 측정된다.
임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 돌연변이는 하기 FGFR3 아미노산 변이체 중 하나 이상을 코딩한다: FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, FGFR3 S371C, FGFR3 Y373C, FGFR3 G380R,FGFR3 K650X (예를 들어, FGFR3 K650E), FGFR3 K650M, 및 FGFR3 G697C. 일부 실시양태에서, FGFR3 돌연변이는 하기 FGFR3 아미노산 변이체 중 하나 이상이다: FGFR3 c.746C>G, FGFR3 c.1118A>G, FGFR3 c.742C>T, FGFR3c.1108G>T, FGFR3 c.1111A>T.
세포에서 mRNA의 평가 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 상보적 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정 (예컨대, 하나 이상의 유전자에 특이적인 표지된 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 검정 (예컨대, 하나 이상의 유전자에 특이적인 상보적 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형의 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.
포유동물로부터의 샘플은 노던, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여 mRNA에 대해 편리하게 검정될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 생물학적 샘플에서 표적 mRNA의 수준의 결정 (예를 들어, "하우스키핑" 유전자, 예컨대 액틴 패밀리 구성원의 비교 대조 mRNA 서열 수준을 동시에 조사함으로써 결정됨)을 허용하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 증폭된 표적 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.
임의의 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플 중의 mRNA, 예컨대 표적 mRNA를 검사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여, 시험 및 대조 조직 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이어서, 프로브를 고체 지지체 상에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 어레이는 어레이의 각각의 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있도록 구성된다. 예를 들어, 그의 발현이 항혈관신생 요법의 증가된 또는 감소된 임상적 이익과 상관되는 유전자의 선택물을 고체 지지체 상에 배열할 수 있다. 특정한 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 그 유전자를 발현한다는 것을 나타낸다.
일부 실시양태에 따르면, 존재 및/또는 발현 수준/양은 상기 언급된 유전자의 단백질 발현 수준을 관찰함으로써 측정된다. 특정 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바이오마커 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)의 결합을 허용하는 조건 하에 상기 바이오마커에 대한 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것, 및 항체와 바이오마커 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 FGFR3 길항제, 예를 들어 개체의 선택을 위한 바이오마커를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 샘플 내의 바이오마커 단백질의 존재 및/또는 발현 수준/양은 IHC 및 염색 프로토콜을 이용하여 조사된다. 조직 절편의 IHC 염색은 샘플 내의 단백질의 존재를 결정 또는 검출하는 신뢰할만한 방법인 것으로 밝혀졌다. 임의의 방법, 검정 및/또는 키트의 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커는 FGFR3이다. 일부 실시양태에서, FGFR3은 면역조직화학에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 개체로부터의 샘플에서의 FGFR3 바이오마커의 상승된 발현은 상승된 단백질 발현이고, 추가 실시양태에서 IHC를 이용하여 결정된다. 한 실시양태에서, 바이오마커의 발현 수준은 (a) 항체를 사용하여 샘플 (예컨대, 대상체 암 샘플)의 IHC 분석을 수행하는 것; 및 b) 샘플에서 바이오마커의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, IHC 염색 강도는 참조물과 비교하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 참조물은 참조 값이다. 일부 실시양태에서, 참조물은 참조 샘플 (예를 들어, 대조군 세포주 염색 샘플)이다.
IHC는 형태 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 같은 추가의 기술과 함께 수행할 수 있다. 2가지 일반적 IHC 방법; 즉 직접 및 간접 검정이 이용가능하다. 첫번째 검정에 따르면, 표적 항원에 대한 항체의 결합은 직접 결정된다. 이러한 직접 검정은 추가의 항체 상호작용 없이도 시각화될 수 있는 표지된 시약, 예컨대 형광 태그 또는 효소-표지된 일차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정에서, 미접합 일차 항체가 항원에 결합한 후에, 표지된 이차 항체가 일차 항체에 결합한다. 이차 항체가 효소 표지에 접합된 경우에, 발색 또는 형광 기질을 첨가하여 항원의 시각화를 제공한다. 여러 이차 항체가 일차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
IHC에 사용되는 일차 및/또는 이차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다: (a) 방사성동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H 및 131I; (b) 콜로이드성 금 입자; (c) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드, 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민, 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌, 또는 상업적으로 입수가능한 형광단, 예컨대 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7)과 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 중 임의의 하나 이상의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 형광 표지; (d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 번호 4,275,149는 이들 중 일부의 개관을 제공한다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시타제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다.
효소-기질 조합물의 예는 예를 들어 기질로서 수소 퍼옥시다제와의 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO); 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트와의 알칼리성 포스파타제 (AP); 및 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제)과의 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)를 포함한다. 이들의 일반적 검토를 위해, 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980을 참조한다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, FGFR3은 항-FGFR3 진단 항체 (즉, 일차 항체)를 이용하는 면역조직화학에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 인간 FGFR3에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 인간 FGFR3의 아미노산 25-124를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 LGTEQRVVGRAAEVPGPEPGQQEQLVFGSGDAVELSCPPPGGGPMGPTVWVKDGTGLVPSERVLVGPQRLQVLNASHEDSGAYSCRQRLTQRVLCHFSVR (서열 181)을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 비인간 항체이다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 래트, 마우스 또는 토끼 항체이다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 모노클로날 항체이다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 IgG2 항체이다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 IgG2a 항체이다. 임의의 FGFR3 진단 항체의 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터의 sc-13121 (즉, B-9)이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 진단 항체는 직접 표지된다.
이에 따라 제조된 시료를 탑재하고 이에 커버슬립을 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 관련 기술분야에 통상적으로 사용되는 염색 강도 기준을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 1+ 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 특정 실시양태에서, IHC 검정에서 약 2+ 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 다른 실시양태에서, 약 3 이상의 염색 패턴 스코어가 진단 및/또는 예측된다. 한 실시양태에서, 종양 또는 결장 선종으로부터의 세포 및/또는 조직을 IHC를 사용하여 검사하는 경우, 염색은 일반적으로 (샘플 중에 존재할 수 있는 기질 또는 주위 조직에 반대되는 것으로서) 종양 세포 및/또는 조직에서 측정 또는 평가되는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 IHC 임상 스코어는 2 이상이다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 IHC 임상 스코어는 3이다. 일부 실시양태에서, IHC 임상 스코어는 3이다. 일부 실시양태에서, IHC 임상 스코어는 2 또는 3이다.
임의의 방법, 검정, 및/또는 키트의 일부 실시양태에서, 1의 IHC 임상 스코어는 a) > 10% 세포질 및/또는 막 염색 및 b) 약한 세포질 및/또는 막 염색 및 양성으로 염색된 세포 중 < 10%에서의 중간 정도 및/또는 강한 염색을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 1의 IHC 임상 스코어는 RPMI8226 세포주 염색과 유사하고/거나 실질적으로 동일한 염색을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 2의 IHC 임상 스코어는 a) > 10% 세포질 및/또는 막 염색 및 b) 세포 중 > 10%에서의 중간 정도 세포질 및/또는 막 염색 및 양성으로 염색된 세포 중 < 10%에서의 강한 염색을 나타내며; 약한 염색은 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 2의 IHC 임상 스코어는 OPM2 세포주 염색과 유사하고/거나 실질적으로 동일한 염색을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 3의 IHC 임상 스코어는 a) > 10% 세포질 및/또는 막 염색 및 b) 양성으로 염색된 세포 중 > 10%에서의 강한 세포질 및/또는 막 염색을 나타내며; 약한 및 중간 정도 염색은 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 3의 IHC 임상 스코어는 KMS11 세포주 염색과 유사하고/거나 실질적으로 동일한 염색을 나타낸다. 임의의 IHC 방법의 일부 실시양태에서, IHC 임상 스코어는 본원에 기재된 바와 같이 FGFR3 진단 항체를 사용하여 결정된다.
대안적 방법에서, 샘플을 항체-바이오마커 복합체 형성에 충분한 조건하에서 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉시킨 후에 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 다수의 방법, 예를 들어 혈장 및 혈청을 포함하는 다양한 조직 및 샘플을 검정하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차에 의해 검출될 수 있다. 이러한 검정 포맷을 이용한 광범위한 면역검정 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653을 참조한다. 이들은 비-경쟁적 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정 뿐만 아니라, 통상적인 경쟁적 결합 검정을 둘 다 포함한다. 또한, 이러한 검정은 표적 바이오마커에 대한 표지된 항체의 직접 결합을 포함한다.
조직 또는 세포 샘플에서 선택된 바이오마커의 존재 및/또는 발현 수준/양은 또한 기능 또는 활성-기반 검정에 의해 조사될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커가 효소인 경우에, 관련 기술분야에 공지된 검정을 수행함으로써 조직 또는 세포 샘플에서 주어진 효소 활성의 존재를 결정 또는 검출할 수 있다.
특정 실시양태에서, 샘플은 검정된 바이오마커의 양의 차이 및 사용된 샘플의 품질의 가변성 둘 다, 및 검정 수행 사이의 가변성에 대해 정규화된다. 널리 공지되어 있는 하우스키핑 유전자, 예컨대 ACTB를 비롯한, 특정의 표준화 바이오마커의 발현을 검출하고 그를 도입함으로써 상기와 같은 정규화를 달성할 수 있다. 대안적으로, 정규화는 검정된 유전자 또는 그의 큰 하위세트 모두의 평균 또는 중간 신호에 기초할 수 있다 (전반적 정규화 접근법). 유전자마다, 대상체 종양 mRNA 또는 단백질의 측정된 정규화 양을 참조 세트에서 확인된 양과 비교한다. 각 대상체마다 시험된 종양당 각 mRNA 또는 단백질에 대해 정규화된 발현 수준은 참조 세트에서 측정된 발현 수준의 백분율로서 표현될 수 있다. 분석할 특정한 대상체 샘플에서 측정된 존재 및/또는 발현 수준/양은 이러한 범위 내의 일부 백분위수에 포함될 것이며, 이는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 유전자의 상대 발현 수준은 다음과 같이 결정된다:
상대 발현 유전자1 샘플1 = 2 exp (Ct 하우스키핑 유전자 - Ct 유전자1) (Ct는 샘플에서 결정됨).
상대 발현 유전자1 참조 RNA = 2 exp (Ct 하우스키핑 유전자 - Ct 유전자1) (Ct는 참조 샘플에서 결정됨).
정규화된 상대 발현 유전자1 샘플1 = (상대 발현 유전자1 샘플1 / 상대 발현 유전자1 참조 RNA) x 100.
Ct는 역치 사이클이다. Ct는 반응 내에서 생성된 형광이 역치 선을 넘는 사이클 수이다.
모든 실험은 다양한 조직 공급원 (예를 들어, 클론테크(Clontech) (캘리포니아주 마운틴 뷰)로부터의 참조 RNA #636538)으로부터 RNA의 포괄적 혼합물인 참조 RNA에 대해 정규화된다. 동일한 참조 RNA를 각각의 qRT-PCR 실행에 포함시켜서 상이한 실험 실행 사이의 결과의 비교를 허용한다.
한 실시양태에서, 샘플은 임상 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 진단 검정에 사용된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 수득된다. 조직 생검은 종양 조직의 대표적인 조각을 얻기 위해 종종 사용된다. 대안적으로, 종양 세포는 관심 종양 세포를 함유하는 것으로 공지되어 있거나 그렇게 여겨지는 조직 또는 유체의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 폐암 병변의 샘플은 절제, 기관지경검사, 미세 바늘 흡인, 기관지 찰과술에 의해, 또는 객담, 흉막액 또는 혈액으로부터 수득될 수 있다. 유전자 또는 유전자 산물은 암 또는 종양 조직으로부터, 또는 다른 신체 샘플, 예를 들어 소변, 객담, 혈청 또는 혈장으로부터 검출될 수 있다. 암성 샘플에서 표적 유전자 또는 유전자 산물의 검출에 대해 상기 논의된 것과 동일한 기술이 다른 신체 샘플에도 적용될 수 있다. 암 세포는 암 병변으로부터 벗겨져서 이러한 신체 샘플 중에 나타날 수 있다. 이러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써 이들 암에 관한 간단한 조기 진단을 달성할 수 있다. 또한, 요법의 진행은 이러한 신체 샘플을 표적 유전자 또는 유전자 산물에 대해 시험함으로써 보다 용이하게 모니터링될 수 있다.
특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 단일 샘플 또는 시험 샘플이 수득되는 때보다 하나 이상의 다른 시점에 수득된 동일한 대상체 또는 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 예를 들어, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 시험 샘플이 수득된 때보다 이른 시점에 동일한 대상체 또는 개체로부터 수득된다. 이러한 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 참조 샘플이 암의 초기 진단 동안 수득되고 시험 샘플이 암이 전이성이 되었을 때 이후에 수득되는 경우에 유용해질 수 있다.
특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 하나 이상의 건강한 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 갖는 하나 이상의 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 정상 조직으로부터 모은 RNA 샘플 또는 대상체 또는 개체가 아닌 하나 이상의 개체로부터 모은 혈장 또는 혈청 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 종양 조직으로부터 모은 RNA 샘플 또는 대상체 또는 개체가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)를 갖는 하나 이상의 개체로부터 모은 혈장 또는 혈청 샘플이다.
특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 샘플 세포주이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 RPMI8226, KSM11 및/또는 OPM2이다.
일부 실시양태에서, 샘플은 개체로부터의 조직 샘플이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 종양 조직 샘플 (예를 들어, 생검 조직)이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 방광 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 요로상피 조직이다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 방광에 인접한 조직이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 악성 암성 종양 (즉, 암)이다. 일부 실시양태에서, 종양 및/또는 암은 고형 종양 또는 비-고형 또는 연부 조직 종양이다. 연부 조직 종양의 예는 백혈병 (예를 들어, 만성 골수 백혈병, 급성 골수 백혈병, 성인 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 성숙 B-세포 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전림프구성 백혈병 또는 모발상 세포 백혈병) 또는 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종 또는 호지킨병)을 포함한다. 고형 종양은 혈액, 골수 또는 림프계 이외의 신체 조직의 임의의 암을 포함한다. 고형 종양은 상피 세포 기원의 종양 및 비-상피 세포 기원의 종양으로 추가로 나누어질 수 있다. 상피 세포 고형 종양의 예는 위장관, 결장, 결장직장 (예를 들어, 기저양 결장직장 암종), 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소 (예를 들어, 자궁내막양 난소 암종), 두경부, 구강, 위, 십이지장, 소장, 대장, 항문, 담낭, 음순, 비인두, 피부, 자궁, 남성 생식 기관, 비뇨 기관 (예를 들어, 요로상피 암종, 이형성 요로상피 암종, 이행 세포 암종), 방광 및 피부의 종양을 포함한다. 비-상피 기원의 고형 종양은 육종, 뇌 종양 및 골 종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 이행 세포 암종 또는 요로상피 암종이다. 일부 실시양태에서, 암은 편평 세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 암은 선암종이다. 종양의 다른 예는 정의 부분에 기재되어 있다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편, 및 FGFR3에 결합하는 항체 단편이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 개체는 인간일 수 있다.
추가 실시양태에서, 암을 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 방법은 이러한 암을 갖는 개체에게 유효량의 FGFR3 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 하기 기재된 바와 같은 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 인간일 수 있다.
본원에 기재된 FGFR3 길항제는 요법에서 단독으로 또는 기타 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 FGFR3 길항제는 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 화학요법제이다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 개별 제제에 포함됨) 및 개별 투여를 포괄하고, 이 경우에 길항제의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 일어날 수 있다. 본원에 기재된 FGFR3 길항제는 또한 방사선 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
본원에 기재된 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 소분자) (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여가 단기간인지 또는 장기간인지의 여부에 부분적으로 의존하여, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본원에 기재된 FGFR3 길항제 (예를 들어, 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 소분자)는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려할 요인은 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 요인을 포함한다. FGFR3 길항제는 반드시 그러할 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 FGFR3 길항제의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 요인에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원에 기재된 FGFR3 길항제의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, FGFR3 길항제가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 FGFR3 길항제에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. FGFR3 길항제는 환자에게 적합하게는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 FGFR3 길항제가 환자에게 제공되도록). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시적인 투여 요법은 투여를 포함한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)는 약 2-30 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)는 약 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)는 28일 사이클에서 약 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제 (예를 들어, 항-FGFR3 항체)는 사이클 1, 제8일에 부하 용량과 약 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 투여량으로 투여된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 FGFR3 길항제를 대신하여 또는 이에 더하여 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
III. 치료 조성물
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 유용한 FGFR3 길항제가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 및/또는 폴리뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, FGFR3에 결합하는 FGFR3 길항제가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3 IIIb 이소형 및/또는 FGFR3 IIIc 이소형에 결합한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 돌연변이된 FGFR3 (예를 들어, FGFR3 IIIb R248C, S249C, G372C, Y375C, K652E 중 하나 이상, 및/또는 FGFR3 IIIc R248C, S249C, G370C, Y373C, K650E 중 하나 이상)에 결합한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 단량체성 FGFR3 (예를 들어, 단량체성 FGFR3 IIIb 및/또는 IIIc 이소형)에 결합한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 단량체성 FGFR3의 형성을, 예컨대 이량체성 FGFR3 형태와 관련하여 단량체성 FGFR3 형태를 안정화시킴으로써 촉진한다.
일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 구성적 FGFR3 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, 구성적 FGFR3 활성은 리간드-의존성 FGFR3 구성적 활성이다. 일부 실시양태에서, 구성적 FGFR3 활성은 리간드-비의존성 구성적 FGFR3 활성이다.
일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbR248C에 상응하는 돌연변이를 포함하는 FGFR3을 억제한다. 본원에 사용된 용어 "FGFR3-IIIbR248C에 상응하는 돌연변이를 포함하는"은 FGFR3-IIIbR248C 및 FGFR3-IIIcR248C 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb R248에 상응하는 위치에서 R에서 C로의 돌연변이를 포함하는 추가의 FGFR3 형태를 포괄하는 것으로 이해된다. 통상의 기술자는 각각의 FGFR3 서열 사이의 상응하는 잔기를 확인하기 위해 FGFR3 서열을 정렬하는 방법, 예를 들어, FGFR3-IIIc 서열을 FGFR3-IIIb 서열과 정렬하여 FGFR3-IIIb에서 R248 위치에 상응하는 FGFR3에서의 위치를 확인하는 것을 이해하고 있다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbR248C 및/또는 FGFR3-IIIcR248C를 억제한다.
일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbK652E에 상응하는 돌연변이를 포함하는 FGFR3을 억제한다. 편의상, 용어 "FGFR3-IIIb K652E에 상응하는 돌연변이를 포함하는"은 FGFR3-IIIb K652E 및 FGFR3-IIIc K650E 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb K652에 상응하는 위치에서 K에서 E로의 돌연변이를 포함하는 추가의 FGFR3 형태를 포괄하는 것으로 이해된다. 통상의 기술자는 각각의 FGFR3 서열 사이의 상응하는 잔기를 확인하기 위해 FGFR3 서열을 정렬하는 방법, 예를 들어, FGFR3-IIIc 서열을 FGFR3-IIIb 서열과 정렬하여 FGFR3-IIIb에서 K652 위치에 상응하는 FGFR3에서의 위치를 확인하는 것을 이해하고 있다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIb K652E 및/또는 FGFR3-IIIc K650E를 억제한다.
일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbS249C에 상응하는 돌연변이를 포함하는 FGFR3을 억제한다. 편의상, 용어 "FGFR3-IIIbS249C에 상응하는 돌연변이를 포함하는"은 FGFR3-IIIb S249C 및 FGFR3-IIIc S249C 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb S249에 상응하는 위치에서 S에서 C로의 돌연변이를 포함하는 추가의 FGFR3 형태를 포괄하는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbS249C 및/또는 FGFR3-IIIc S249C를 억제한다.
일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbG372C에 상응하는 돌연변이를 포함하는 FGFR3을 억제한다. 편의상, 용어 "FGFR3-IIIbG372C에 상응하는 돌연변이를 포함하는"은 FGFR3-IIIb G372C 및 FGFR3-IIIc G370C 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb G372에 상응하는 위치에서 G에서 C로의 돌연변이를 포함하는 추가의 FGFR3 형태를 포괄하는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbG372C 및/또는 FGFR3-IIIc G370C를 억제한다.
일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbY375C에 상응하는 돌연변이를 포함하는 FGFR3을 억제한다. 편의상, 용어 "FGFR3-IIIbY375C에 상응하는 돌연변이를 포함하는"은 FGFR3-IIIbY375C 및 FGFR3-IIIcY373C 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb S249에 상응하는 위치에서 S에서 C로의 돌연변이를 포함하는 추가의 FGFR3 형태를 포괄하는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbY375C 및/또는 FGFR3-IIIcY373C를 억제한다.
일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 (a) FGFR3-IIIbK652E 및 (b) FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3 -IIIbS249C, 및 FGFR3IIIb G372C 중 하나 이상을 억제한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 (a) FGFR3-IIIcK650E 및 (b) FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3 -IIIcS249C, 및 FGFR3IIIc G370C 중 하나 이상을 억제한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 (a) FGFR3-IIIbR248C 및 (b) FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbG372C 중 하나 이상을 억제한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 (a) FGFR3-IIIcR248C 및 (b) FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 및 FGFR3-IIIcG370C 중 하나 이상을 억제한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 (a) FGFR3-IIIbG372C 및 (b) FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbR248C 중 하나 이상을 억제한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 (a) FGFR3-IIIcG370C 및 (b) FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 및 FGFR3-IIIcR248C 중 하나 이상을 억제한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIb S249C, 및 FGFR3-IIIb G372C를 억제한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIc S249C, 및 FGFR3-IIIc G370C를 억제한다.
A. 항체
일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 항-FGFR3 항체이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 항체는 FGFR3에 결합하는 단리된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-FGFR3 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하여, 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1" 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 단리된 항-FGFR3 항체이며, 여기서 항체의 전장 IgG 형태는 인간 FGFR3에 1 x 10-7의 Kd로 또는 이보다 더 강하게 결합한다. 관련 기술분야에서 잘 확립된 바와 같이, 그의 수용체에 대한 리간드의 결합 친화도는 임의의 다양한 검정을 이용하여 결정할 수 있고, 다양한 정량적 값으로 표현할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 결합 친화도는 Kd 값으로 표현되고, (예를 들어, 최소화된 결합력 효과와 함께) 내인성 결합 친화도를 반영한다. 일반적으로 및 바람직하게는, 결합 친화도는 세포-무함유 또는 세포-관련 세팅에 관계없이 시험관내에서 측정한다. 본원에 기재된 것을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 다수의 검정을 사용하여 결합 친화도 측정 (예를 들어, 비아코어(Biacore), 방사성면역검정 (RIA) 및 ELISA 포함)을 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 전장 IgG 형태는 1 x 10-8의 Kd로 또는 이보다 더 강하게, 1 x 10-9의 Kd로 또는 이보다 더 강하게, 또는 1 x 10-10의 Kd로 또는 이보다 더 강하게 인간 FGFR3에 결합한다.
일반적으로, 항-FGFR3 항체는 길항제 항체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 FGFR3 활성 (예를 들어, FGFR3-IIIb 및/또는 FGFR3-IIIc 활성)을 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체 (일반적으로 2가 형태)는 실질적인 FGFR3 효능제 기능을 보유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항-FGFR3 길항제 항체 (일반적으로 2가 형태)는 거의 또는 전혀 FGFR3 효능제 기능을 보유하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체 (일반적으로 2가 형태)는 통계적으로 유의한 배경 수준보다 높은 FGFR3 효능제 활성 수준을 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, FGFR3에 대한 항체의 결합은 수용체의 또 다른 유닛과 수용체의 이량체화를 억제할 수 있으며, 이에 의해 수용체의 활성화가 억제된다 (적어도 부분적으로는 수용체 이량체화의 결여 때문임). 억제는 직접적이거나 간접적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 실질적인 아폽토시스 활성을 보유하지 않는 (예를 들어, 세포, 예를 들어 이행 세포 암종 세포 또는 다발성 골수종 세포, 예컨대 t(4;14) 전위와 같은 FGFR3 전위를 포함하는 다발성 골수종 세포의 아폽토시스를 유도하지 않는) 항-FGFR3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 거의 또는 전혀 아폽토시스 기능을 보유하지 않는다. 일부 실시양태에서, FGFR3 항체는 통계적으로 유의한 배경 수준보다 높은 아폽토시스 기능을 나타내지 않는다.
일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 실질적인 FGFR3 하향조절을 유도하지 않는 항-FGFR3 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 거의 또는 전혀 수용체 하향조절을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, FGFR3 항체는 통계적으로 유의한 배경 수준보다 높은 수용체 하향조절을 유도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 이펙터 기능을 보우한 항-FGFR3 항체이다. 한 실시양태에서, 이펙터 기능은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-FGFR3 항체 (일부 실시양태에서, 네이키드 항-FGFR3 항체)는 세포, 일부 실시양태에서는 다발성 골수종 세포 (예를 들어, 전위, 예를 들어 t(4;14) 전위를 포함하는 다발성 골수종 세포)를 사멸시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 세포당 약 10,000개 이상의 FGFR3 분자 (예컨대 세포당 약 11,000개, 약 12,000개, 약 13,000개, 약 14,000개, 약 15,000개, 약 16,000개, 약 17,000개, 약 18,000개 또는 그 초과의 FGFR3 분자)를 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포는 세포당 약 2000개, 약 3000개, 약 4000개, 약 5000개, 약 6000개, 약 7000개, 약 8000개 또는 그 초과의 FGFR3 분자를 발현한다.
일부 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 (a) (i) 서열 A1-A11 (여기서, A1-A11은 RASQDVDTSLA (서열 87)임)을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 B1-B7 (여기서, B1-B7은 SASFLYS (서열 88)임)을 포함하는 HVR-L2, (iii) 서열 C1-C9 (여기서, C1-C9는 QQSTGHPQT (서열 89)임)를 포함하는 HVR-L3, (iv) 서열 D1-D10 (여기서, D1-D10은 GFTFTSTGIS (서열 84)임)을 포함하는 HVR-H1, (v) 서열 E1-E18 (여기서, E1-E18은 GRIYPTSGSTNYADSVKG (서열 85)임)을 포함하는 HVR-H2, 및 (vi) 서열 F1-F20 (여기서, F1-F20은 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY (서열 86)임)을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 초가변 영역 (HVR) 서열; 및 (b) 적어도 1개의 변이체 HVR을 포함하는 단리된 항-FGFR3 항체이며, 여기서 변이체 HVR 서열은 서열 1-18, 48-131 및 140-145에 제시된 서열의 적어도 1개의 잔기 (적어도 2개의 잔기, 적어도 3개 또는 그 초과의 잔기)의 변형을 포함한다. 변형은 바람직하게는 치환, 삽입 또는 결실이다.
일부 실시양태에서, HVR-L1 변이체는 하기 위치의 임의의 조합에 1-6개 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 치환을 포함한다: A5 (V 또는 D), A6 (V 또는 I), A7 (D, E 또는 S), A8 (T 또는 I), A9 (A 또는 S) 및 A10 (V 또는 L). 일부 실시양태에서, HVR-L2는 하기 위치의 임의의 조합에 1-2개 (1 또는 2개)의 치환을 포함한다: B1 (S 또는 G), B4 (F 또는 S 또는 T) 및 B6 (A 또는 Y). 일부 실시양태에서, HVR-L3 변이체는 하기 위치의 임의의 조합에 1-6개 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 치환을 포함한다: C3 (G 또는 S 또는 T), C4 (T 또는 Y 또는 A), C5 (G 또는 S 또는 T 또는 A), C6 (A 또는 H 또는 D 또는 T 또는 N), C7 (Q 또는 P 또는 S), 및 C8 (S 또는 Y 또는 L 또는 P 또는 Q). 일부 실시양태에서, HVR-H1 변이체는 하기 위치의 임의의 조합에 1-3개 (1, 2, 또는 3개)의 치환을 포함한다: D3 (S 또는 T), D5 (W 또는 Y 또는 S 또는 T), D6 (S 또는 G 또는 T). 일부 실시양태에서, HVR-H2 변이체는 하기 위치의 임의의 조합에 1-6개 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 치환을 포함한다: E2 (R 또는 S), E6 (Y 또는 A 또는 L 또는 S 또는 T), E7 (A 또는 Q 또는 D 또는 G 또는 Y 또는 S 또는 N 또는 F), E8 (A 또는 D 또는 G), E9 (T 또는 S), E10 (K 또는 F 또는 T 또는 S), E11 (Y 또는 H 또는 N 또는 I).
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) (i) 서열 RASQX1X2X3X4X5 X6A (여기서, X1은 V 또는 D이고, X2는 V 또는 I이고, X3은 D, E 또는 S이고, X4는 T 또는 I이고, X5는 A 또는 S이고, X6은 V 또는 L임) (서열 146)를 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 X1ASFLX2S (여기서, X1은 S 또는 G이고, X2는 A 또는 Y임) (서열 147)를 포함하는 HVR-L2, (iii) 서열 QQX1X2X3X4X5X6T (여기서, X1은 G, S 또는 T이고, X2는 T, Y 또는 A이고, X3은 G, S, T, 또는 A이고, X4는 A, H, D, T, 또는 N이고, X5는 Q, P 또는 S이고, X6은 S, Y, L, P 또는 Q임) (서열 148)를 포함하는 HVR-L3, (iv) 서열 GFX1FX2X3TGIS (여기서, X1은 S 또는 T이고, X2는 W, Y, S 또는 T이고, X3은 S, G, 또는 T임) (서열 149)를 포함하는 HVR-H1, (v) 서열 GRIYPX1X2X3X4X5X6YADSVKG (여기서, X1은 Y, A, L, S, 또는 T이고, X2는 A, Q, D, G, Y, S, N 또는 F이고, X3은 A, D, 또는 G이고, X4는 T 또는 S이고, X5는 K, F, T, 또는 S이고, X6은 Y, H, N 또는 I임) (서열 150)를 포함하는 HVR-H2, 및 (vi) 서열 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY (서열 151)를 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 단리된 항-FGFR3 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, HVR-L1은 서열 RASQX1VX2X3X4VA (여기서, X1은 V 또는 D이고, X2는 D, E 또는 S이고, X3은 T 또는 I이고, X4는 A 또는 S임) (서열 152)를 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-L3은 서열 QQX1X2X3X4X5X6T (여기서, X1은 S, G 또는 T이고, X2는 Y, T 또는 A이고, X3은 T 또는 G이고, X4는 T, H 또는 N이고, X5는 P 또는 S이고, X6은 P, Q, Y 또는 L임) (서열 153)을 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-H2는 서열 GRIYPX1X2GSTX3YADSVKG (여기서, X1은 T 또는 L이고, X2는 N, Y, S, G, A 또는 Q이고, X3은 N 또는 H임) (서열 154)를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 단리된 항-FGFR3 항체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하고, 여기서 각각의 HVR은 서열 1-18, 48-131 및 140-145로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지고, 여기서 서열 1, 7, 13, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126 또는 143은 HVR-H1에 상응하고, 서열 2, 8, 14, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 또는 144는 HVR-H2에 상응하고, 서열 3, 9, 15, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128 또는 145는 HVR-H3에 상응하고, 서열 4, 10, 16, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129 또는 140은 HVR-L1에 상응하고, 서열 5, 11, 17, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130 또는 141은 HVR-L2에 상응하고, 서열 6, 12, 18, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131 또는 142는 HVR-L3에 상응한다.
한 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 1, 2, 3을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 4, 5, 6을 함유함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 7, 8, 9를 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 10, 11, 12를 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 13, 14, 15를 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 16, 17, 18을 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 48, 49, 50을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 경쇄 가변 영역 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 51, 52, 53을 포함함)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 54, 55, 56을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 57, 58, 59를 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 60, 61, 62, 63을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 63, 64, 65를 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 66, 67, 68을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 69, 70, 71을 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 72, 73, 74를 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 75, 76, 77을 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 78, 79, 80을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 81, 82, 83을 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 84, 85, 86을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 87, 88, 89를 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 90, 91, 92를 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 93, 94, 95를 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 96, 97, 98을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 99, 100, 101을 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 102, 103, 104를 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 105, 106, 107를 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 108, 109, 110을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 111, 112, 113을 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 114, 115, 116을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 117, 118, 119를 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 120, 121, 122를 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 123, 124, 125를 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 126, 127, 128을 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 129, 130, 131을 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 143, 144, 145를 포함함)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3 (여기서, 이들은 각각 순서대로 서열 140, 141, 142를 포함함)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
서열 1-18, 48-131 및 140-145의 아미노산 서열은 도 1에 나타낸 바와 같이 개별 HVR (즉, H1, H2 또는 H3)에 대해 넘버링되고, 넘버링은 아래 기재된 바와 같은 카바트 넘버링 시스템과 일치한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 132를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 133을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 132를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 133을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 134를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 135를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 134를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 135를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 항-FGFR3 항체 R3MAb는 서열 134를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 135를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-FGFR3 항체이다. 특히, 서열 134를 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 135를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-FGFR3 항체 및 이러한 단리된 항-FGFR3 항체의 사용 방법 (질환 또는 장애, 예컨대 암의 치료에서의 사용 방법 포함)이 본원에 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 136을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 137을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 136을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 137을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 138을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 139를 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 138을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 139를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 SASSSVSYMH (서열 155), SASSSVSYMH (서열 156) 또는 LASQTIGTWLA (서열 157)를 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 TWIYDTSILAS (서열 158), RWIYDTSKLAS (서열 159), 또는 LLIYAATSLAD (서열 160)를 포함하는 HVR-L2, (c) 서열 QQWTSNPLT (서열 161), QQWSSYPPT (서열 162), 또는 QQLYSPPWT (서열 163)를 포함하는 HVR-L3, (d) 서열 GYSFTDYNMY (서열 164), GYVFTHYNMY (서열 165), 또는 GYAFTSYNMY (서열 166)를 포함하는 HVR-H1, (e) 서열 IGYIEPYNGGTSYNQKFKG (서열 167), WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG (서열 168), 또는 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG (서열 169)를 포함하는 HVR-H2, 및 (f) 서열 ASPNYYDSSPFAY (서열 170), ARGQGPDFDV (서열 171), 또는 ARWGDYDVGAMDY (서열 172)를 포함하는 HVR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 항-FGFR3 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 SASSSVSYMH (서열 155)를 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 TWIYDTSILAS (서열 158)를 포함하는 HVR-L2, (c) 서열 QQWTSNPLT (서열 161)를 포함하는 HVR-L3, (d) 서열 GYSFTDYNMY (서열 164)를 포함하는 HVR-H1, (e) 서열 IGYIEPYNGGTSYNQKFKG (서열 167)를 포함하는 HVR-H2, 및 (f) 서열 ASPNYYDSSPFAY (서열 170)를 포함하는 HVR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 항-FGFR3 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 SASSSVSYMH (서열 156)를 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 RWIYDTSKLAS (서열 159)를 포함하는 HVR-L2, (c) 서열 QQWSSYPPT (서열 162)를 포함하는 HVR-L3, (d) 서열 GYVFTHYNMY (서열 165)를 포함하는 HVR-H1, (e) 서열 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG (서열 168)를 포함하는 HVR-H2, 및 (f) 서열 ARGQGPDFDV (서열 171)를 포함하는 HVR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 항-FGFR3 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 LASQTIGTWLA (서열 157)를 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 LLIYAATSLAD (서열 160)를 포함하는 HVR-L2, (c) 서열 QQLYSPPWT (서열 163)를 포함하는 HVR-L3, (d) 서열 GYAFTSYNMY (서열 166)를 포함하는 HVR-H1, (e) 서열 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG (서열 169)를 포함하는 HVR-H2, 및 (f) 서열 ARWGDYDVGAMDY (서열 172)를 포함하는 HVR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 항-FGFR3 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) (i) 서열 SASSSVSYMH (서열 155)를 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 TWIYDTSILAS (서열 158)를 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열 QQWTSNPLT (서열 161)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄; 및/또는 (b) (i) 서열 GYSFTDYNMY (서열 164)를 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열 IGYIEPYNGGTSYNQKFKG (서열 167)를 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열 ASPNYYDSSPFAY (서열 170)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-FGFR3 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) (i) 서열 SASSSVSYMH (서열 156)를 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 RWIYDTSKLAS (서열 159)를 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열 QQWSSYPPT (서열 162)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄; 및/또는 (b) (i) 서열 GYVFTHYNMY (서열 165)를 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG (서열 168)를 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열 ARGQGPDFDV (서열 171)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-FGFR3 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) (i) 서열 LASQTIGTWLA (서열 157)를 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 LLIYAATSLAD (서열 160)를 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열 QQLYSPPWT (서열 163)를 포함하는 HVR-L3을 포함하는 경쇄; 및/또는 (b) (i) 서열 GYAFTSYNMY (서열 166)를 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG (서열 169)를 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열 ARWGDYDVGAMDY (서열 172)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄를 포함하는 항-FGFR3 항체를 제공한다. 항체의 일부 실시양태는 하기 서열 173에 제시된 바와 같은 인간화 4D5 항체 (huMAb4D5-8) (헤르셉틴(HERCEPTIN)®, 제넨테크, 인크., 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)의 경쇄 가변 도메인을 포함한다 (또한, 미국 특허 번호 6,407,213 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093] 참조):
Figure pct00001
한 실시양태에서, huMAb4D5-8 경쇄 가변 도메인 서열은 위치 30, 66 및 91 (상기에서 각각 볼드체/이탤릭체로 나타낸 Asn, Arg 및 His) 중 하나 이상에서 변형된다. 특정 실시양태에서, 변형된 huMAb4D5-8 서열은 위치 30에서 Ser, 위치 66에서 Gly 및/또는 위치 91에서 Ser을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서 항체는 하기 서열 174에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다:
Figure pct00002
huMAb4D5-8에 대해 치환된 잔기는 볼드체/이탤릭체로 나타낸다.
항체는 FGFR3에 대한 결합 활성이 실질적으로 유지되는 한 임의의 적합한 프레임워크 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 항체는 인간 하위군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 이들 항체의 한 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에서 치환을 포함한다. 이들 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나 78은 A이다. 한 실시양태에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8 (헤르셉틴®, 제넨테크, 인크., 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코) (또한, 미국 특허 번호 6,407,213 및 5,821,337, 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093]에 언급됨)의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이들 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 이들 항체는 미국 특허 번호 6,407,213 및 5,821,337에 기재된 바와 같은 huMAb4D5-8의 경쇄 HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8 (헤르셉틴®, 제넨테크, 인크., 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코) (또한, 미국 특허 번호 6,407,213 및 5,821,337, 및 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093]에 언급됨)의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 중쇄 가변 도메인을 포함하고, HVR H1, H2, 및 H3 서열은 각각 서열 13, 14 및/또는 15이다. 또 다른 실시양태에서, HVR H1, H2, 및 H3 서열은 각각 서열 48, 49 및/또는 50이다. 또 다른 실시양태에서, HVR H1, H2, 및 H3 서열은 각각 서열 84, 85 및/또는 86이다. 추가 실시양태에서, HVR H1, H2, 및 H3 서열은 각각 서열 108, 109 및/또는 110이다.
특정한 실시양태에서, 항체는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, HVR L1, L2, 및 L3 서열은 각각 서열 16, 17 및/또는 18이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, HVR L1, L2, 및 L3 서열은 각각 서열 51, 52 및/또는 53이다. 추가 실시양태에서, 항체는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, HVR L1, L2, 및 L3 서열은 각각 서열 87, 88 및/또는 89이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, HVR L1, L2, 및 L3 서열은 각각 서열 111, 112 및/또는 113이다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 132의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 133의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 134의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 135의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 136의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 137의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 138의 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 139의 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열: LAVPAANTVRFRCPA (서열 179) 및/또는 SDVEFHCKVYSDAQP (서열 180)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 폴리펩티드에 결합하는 항-FGFR3 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 항체는 성숙 인간 FGFR3 아미노산 서열의 아미노산 번호 164-178 및/또는 269-283을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 폴리펩티드에 결합한다.
한 실시양태에서, 항-FGFR3 항체는 서열 LAVPAANTVRFRCPA (서열 179) 및/또는 SDVEFHCKVYSDAQP (서열 180)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-FGFR3 항체는 잔기 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314 중 적어도 1, 2, 3, 4개 또는 모두까지의 임의의 수에 결합한다,
추가 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-FGFR3 항체는 하기 섹션에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 ~10 반응 단위 (RU)로 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주사한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주사한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트가 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 온-레이트는 분광측정계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295nm, 방출 = 340nm, 16nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선하기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 관련 기술분야의 공지된 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
항체는 원하는 활성 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공개는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 FGFR3에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 FGFR3의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 FGFR3과 같은 폴리펩티드를 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 이용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 FGFR3 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
a) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 및 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결손" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
b) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 일부 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결손되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결손될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가, 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 1개 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.) 특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 발생시키는 변경이 Fc 영역에서 만들어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 1개 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 1개 이상의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826). Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
c) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 임의의 1개 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
B. 면역접합체
또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-FGFR3 항체를 포함하는 면역접합체가 본원에 제공된다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체 (ADC)이며, 여기서 항체는 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 약물에 접합된다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편 (디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체는 검출용으로 사용되는 경우에 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (또한 자기 공명 영상화, mri로 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교-링커 시약 (BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않음)으로 제조된 이러한 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지는 않는다.
C. 결합 폴리펩티드
결합 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 FGFR3에 결합하는, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드는 FGFR3 길항제이다. 결합 폴리펩티드는 공지된 폴리펩티드 합성 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있거나 또는 재조합 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 결합 올리고펩티드는 통상적으로는 적어도 약 5개 아미노산 길이, 대안적으로는 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개 또는 그 초과의 아미노산 길이이고, 여기서 이러한 결합 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 표적, FGFR3에 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 결합 폴리펩티드는 널리 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 폴리펩티드에 대해 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 것으로 주지된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, 및 Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 널리 공지된 기술이며, 이는 큰 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 표적 폴리펩티드, 예를 들어 FGFR3에 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리의 구성원(들)을 확인하는 것을 허용한다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상의 코트 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다 (문헌 [Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386]). 파지 디스플레이의 유용성은, 선택적으로 무작위화된 단백질 변이체 (또는 무작위 클로닝된 cDNA)의 대규모 라이브러리가 표적 분자에 고친화도로 결합하는 서열에 대하여 빠르고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지 상에서 펩티드 (문헌 [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]) 또는 단백질 (문헌 [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]) 라이브러리의 디스플레이가 수백만가지의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 특이적 결합 특성을 갖는 것에 대해 스크리닝하는데 사용되고 있다 (문헌 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리 분류는 다수의 변이체를 구축하여 증식시키는 전략, 표적 수용체를 사용하여 친화도 정제하는 절차, 및 결합 풍부화의 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다. 미국 특허 번호 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 및 5,663,143.
대부분의 파지 디스플레이 방법에서 필라멘트형 파지가 사용되어 왔지만, 람다형 파지 디스플레이 시스템 (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), T4 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)]) 및 T7 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993)]; U.S. 5,766,905)이 또한 공지되어 있다.
추가의 개선은 선택된 표적 분자와의 결합에 대해 펩티드 라이브러리를 스크리닝하고 이러한 단백질을 바람직한 특성에 대해 스크리닝하는 잠재성을 이용하여 기능적 단백질을 디스플레이하는 디스플레이 시스템의 능력을 증진시킨다. 파지 디스플레이 반응에 대한 조합 반응 장치가 개발되었으며 (WO 98/14277), 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 이분자 상호작용 (WO 98/20169; WO 98/20159) 및 억제된 나선형 펩티드의 특성 (WO 98/20036)을 분석 및 제어하였다. WO 97/35196은 파지 디스플레이 라이브러리를, 리간드가 표적 분자에 결합할 하나의 용액 및 친화성 리간드가 표적 분자에 결합하지 않을 제2 용액과 접촉시켜 친화성 리간드를 단리함으로써 결합 리간드를 선택적으로 단리하는 방법을 기재한다. WO 97/46251은 친화도 정제된 항체를 사용하여 무작위 파지 디스플레이 라이브러리를 바이오패닝한 후에 결합 파지를 단리하고, 이후에 마이크로플레이트 웰을 사용하는 마이크로패닝 과정에 의해 고친화도 결합 파지를 단리하는 방법을 기재한다. 친화성 태그로서의 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphlylococcus aureus) 단백질 A의 용도가 또한 보고되었다 (문헌 [Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187]). WO 97/47314는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있는 조합 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하는 기질 제외 라이브러리의 사용을 기재한다. 파지 디스플레이를 이용하여 세제 중에 사용하기에 적합한 효소를 선택하는 방법은 WO 97/09446에 기재되어 있다. 특이적 결합 단백질을 선택하는 추가의 방법은 미국 특허 번호 5,498,538, 5,432,018, 및 WO 98/15833에 기재되어 있다.
펩티드 라이브러리를 생성하고 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 또한 미국 특허 번호 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, 및 5,723,323에 개시되어 있다.
D. 결합 소분자
FGFR3 소분자 길항제로서 사용하기 위한 결합 소분자가 본원에 제공된다.
결합 소분자는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 FGFR3에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 본원에 정의된 바와 같은 결합 폴리펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 결합 유기 소분자는 공지된 방법론을 이용하여 확인되고 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 결합 유기 소분자는 통상적으로 크기가 약 2000 달톤 미만이고, 대안적으로 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이며, 여기서 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 이러한 유기 소분자는 널리 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 것으로 주지된다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 결합 유기 소분자는 예를 들어 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 브리바닙, 도비티닙 (TKI-258), 및/또는 HM-80871A이다.
E. 길항제 폴리뉴클레오티드
폴리뉴클레오티드 길항제가 본원에 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 안티센스 핵산 및/또는 리보자임일 수 있다. 안티센스 핵산은 FGFR3 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나, 절대 상보성은 바람직하기는 하지만 요구되지는 않는다.
본원에 지칭된 "RNA의 적어도 일부에 상보적인" 서열은 RNA와 혼성화하여 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있도록 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하고; 따라서 이중 가닥 FGFR3 안티센스 핵산의 경우에, 듀플렉스 DNA의 단일 가닥을 시험할 수 있거나 또는 트리플렉스 형성을 검정할 수 있다. 혼성화 능력은 안티센스 핵산의 상보성 정도 및 길이 둘 다에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화 핵산이 길수록 FGFR3 RNA와의 염기 미스매치가 더 많을 수 있고, 안정한 듀플렉스 (또는 경우에 따라 트리플렉스)를 함유하고 계속 형성할 수 있다. 통상의 기술자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하기 위해 표준 절차를 이용하여 허용가능한 미스매치의 정도를 확인할 수 있다.
메시지의 5' 말단, 예를 들어 AUG 개시 코돈까지 및 이를 포함하는 5' 비번역 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 번역을 억제하는데 가장 효율적으로 작동해야 한다. 그러나, mRNA의 3' 비번역 서열에 상보적인 서열이 또한 mRNA의 번역을 억제하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 문헌 [Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335]을 참조한다. 따라서, FGFR3 유전자의 5'- 또는 3'-비-번역, 비-코딩 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 안티센스 접근법에 사용하여 내인성 FGFR3 mRNA의 번역을 억제할 수 있다. mRNA의 5' 비번역 영역에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 상보체를 포함해야 한다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 번역의 보다 덜 효율적인 억제제이지만, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. FGFR3 mRNA의 5'-, 3'- 또는 코딩 영역에 혼성화되도록 설계되는지 여부에 관계없이, 안티센스 핵산은 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이를 가져야 하며, 바람직하게는 6 내지 약 50개 뉴클레오티드 범위의 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 구체적 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개의 뉴클레오티드, 적어도 17개의 뉴클레오티드, 적어도 25개의 뉴클레오티드 또는 적어도 50개의 뉴클레오티드이다.
한 실시양태에서, FGFR3 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터의 전사에 의해 세포내에서 생산된다. 예를 들어, 벡터 또는 그의 일부가 전사되어, FGFR3 유전자의 안티센스 핵산 (RNA)을 생산한다. 이러한 벡터는 FGFR3 안티센스 핵산을 코딩하는 서열을 함유할 것이다. 이러한 벡터는 원하는 안티센스 RNA를 생산하도록 전사될 수 있는 한 에피솜을 보유하거나 또는 염색체에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 관련 기술분야 표준의 재조합 DNA 기술 방법에 의해 구축될 수 있다. 벡터는 척추동물 세포에서 복제 및 발현을 위해 사용되는, 플라스미드, 바이러스 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 것일 수 있다. FGFR3, 또는 그의 단편을 코딩하는 서열의 발현은 척추동물, 바람직하게는 인간 세포에서 작용하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 임의의 프로모터에 의한 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성 또는 구성적일 수 있다. 이러한 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역 (문헌 [Bernoist and Chambon, Nature 29:304-310 (1981)]), 라우스(Rous) 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터 (문헌 [Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980)]), 헤르페스 티미딘 프로모터 (문헌 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981)]), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (문헌 [Brinster, et al., Nature 296:39-42 (1982)]) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
F. 항체 및 결합 폴리펩티드 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 표적-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체 및/또는 결합 폴리펩티드 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
<표 1>
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기가 치환되는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL로 높은 빈도에서 돌연변이화를 수행하는 코돈에 의해 코딩되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 이차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 이차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-지정된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체의 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
G. 항체 및 결합 폴리펩티드 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 부착되어 있는 중합체의 수는 달라질 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착되어 있는 경우에, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체 및/또는 결합 폴리펩티드 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티에 대한 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체 및/또는 결합 폴리펩티드-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
IV. 재조합 방법 및 조성물
항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 항-FGFR3 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감전환됨): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같은, 항체, 예컨대 항-FGFR3 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체 및/또는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.
항체, 예컨대 항-FGFR3 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체 및/또는 글리코실화 결합 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산 및/또는 결합 폴리펩티드 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
기재는 항체- 및 결합 폴리펩티드-코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 생산하는 것과 주로 관련된다. 물론, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 제조하기 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 대안적 방법을 사용할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열, 또는 그의 부분을 고체-상 기술을 이용하여 직접 펩티드 합성에 의해 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 펩티드 합성기 (캘리포니아주 포스터 시티)를 제조업체의 지침에 따라 이용하여 달성될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 다양한 부분은 개별적으로 화학적으로 합성되고, 원하는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 생산하기 위해 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합될 수 있다.
항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 형태는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막-결합된 경우에, 적합한 세제 용액 (예를 들어, 트리톤-X 100)을 사용하거나 효소적 절단에 의해 이를 막으로부터 방출시킬 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 순환, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴할 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 절차는 예시적인 적합한 정제 절차이다: 이온-교환 칼럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 오염물, 예컨대 IgG를 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼; 및 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 에피토프-태그부착된 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 칼럼. 다양한 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 이용된 생산 공정의 특성, 및 생산된 특정한 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 따라 달라질 것이다.
재조합 기술을 이용하는 경우에, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 세포내에서 생산되거나, 주변세포질 공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 중으로 직접 분비될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 세포 내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 입자 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하는 절차가 기재되어 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드가 배지 중으로 분비되는 경우에, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제할 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 회수할 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전이 또한 이용될 수도 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및/또는 결합 폴리펩티드 및 오염물을 포함하는 혼합물을, pH 약 2.5-4.5의 용리 완충제를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염으로부터)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있다.
V. 바람직한 기능을 갖는 FGFR3 길항제의 스크리닝 및/또는 확인 방법
FGFR3 길항제, 예컨대 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 소분자를 생성하는 기술에 상기 기재되어 있다. 본원에 제공된 추가의 FGFR3 길항제, 예컨대 항-FGFR3 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 결합 소분자는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 및/또는 특성화될 수 있다.
암 세포 사멸을 유도하는 FGFR3 길항제를 선택하기 위해, 예를 들어 프로피듐 아이오다이드 (PI), 트리판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 지시된 바와 같은 막 완전성의 상실을 참조물에 대해 평가할 수 있다. PI 흡수 검정은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행될 수 있다. FGFR3-발현 종양 세포는 배지 단독 또는 적절한 FGFR3 길항제를 함유하는 배지와 인큐베이션한다. 세포를 3일 기간 동안 인큐베이션한다. 각각의 처리 후에 세포를 세척하고, 35 mm 여과-마개가 장착된 12 x 75 튜브 (튜브당 1 ml, 처리군당 3개의 튜브)로 분취하여 세포 응집물을 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 μg/ml)를 넣는다. 샘플은 팩스캔(FACSCAN)® 유동 세포측정기 및 팩스컨버트(FACSCONVERT)® 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 이용하여 분석될 수 있다. PI 흡수에 의해 결정시에 통계적으로 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 이들 FGFR3 길항제가 세포 사멸-유도 항체, 결합 폴리펩티드, 또는 결합 소분자로서 선택될 수 있다.
관심 항체에 의해 결합된 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하여 이와 상호작용하는 FGFR3 길항제를 스크리닝하기 위해, 통상적인 교차-차단 검정, 예컨대 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것을 수행할 수 있다. 이러한 검정을 이용하여 후보 FGFR3 길항제가 기지의 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는지 결정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 에피토프 맵핑은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드 서열은 예컨대 알라닌 스캐닝에 의해 돌연변이화되어 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 돌연변이체 항체는 처음에 폴리클로날 항체 및/또는 결합 폴리펩티드와의 결합에 대해 시험하여 적절한 폴딩을 확실하게 하였다. 상이한 방법에서, 폴리펩티드의 상이한 영역에 상응하는 펩티드를 후보 항체들 및/또는 폴리펩티드들, 또는 후보 항체 및/또는 결합 폴리펩티드 및 특징적인 또는 기지의 에피토프를 갖는 항체를 사용하는 경쟁 검정에 사용할 수 있다.
임의의 스크리닝 및/또는 확인 방법의 일부 실시양태에서, FGFR3 후보 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 후보 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 소분자이다.
한 실시양태에서, FGFR3 길항제는 예를 들어 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
VI. 제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 FGFR3 길항제의 제약 제제는 바람직한 정도의 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의적인 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 결합 소분자, 항체, 결합 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드이다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 이는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지 않다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
또한, 본원에서 제제는 치료되는 특정한 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 FGFR3 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
VII. 제조품
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 하나 이상의 활성제는 본원에 기재된 FGFR3 길항제이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조품은 (a) 그 내부에, FGFR3 길항제를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기; 및 (b) 그 내부에, 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제조품은 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물을 포함하고; 여기서 조성물은 하나 이상의 시약 (예를 들어, 하나 이상의 바이오마커에 결합하는 일차 항체 (예를 들어, B-9 산타 크루즈 바이오테크놀로지 항체) 또는 본원에 기재된 바이오마커 중 하나 이상에 대한 프로브 및/또는 프라이머), 조성물이 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 나타내는 용기 상의 라벨, 및 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 존재를 평가하기 위해 시약을 사용하기 위한 지침을 포함한다. 제조품은 샘플의 제조 및 시약의 활용에 대한 지침 및 물질의 세트를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제조품은 시약, 예컨대 일차 및 이차 항체 둘 다를 포함할 수 있으며, 여기서 이차 항체는 표지, 예를 들어 효소 표지에 접합된다. 일부 실시양태에서, 제조품은 본원에 기재된 바이오마커 중 하나 이상에 대한 하나 이상의 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다. 임의의 제조품의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 FGFR3이다.
임의의 제조품의 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 항체, 결합 폴리펩티드, 결합 소분자 또는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, FGFR3 길항제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편, 및 FGFR3에 결합하는 항체 단편이다.
이러한 실시양태에서의 제조품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
제조품 중의 다른 임의의 성분은 하나 이상의 완충제 (예를 들어, 차단 완충제, 세척 완충제, 기질 완충제 등), 다른 시약, 예컨대 효소 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예를 들어, 발색체), 에피토프 복구 용액, 대조 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함한다.
임의의 상기 제조품이 FGFR3 길항제를 대신하여 또는 이에 더하여 본원에 기재된 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
다음은 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예를 위한 물질 및 방법
샘플: 포르말린-고정된 파라핀-포매 종양 시편 또는 종양 샘플 또는 암 세포주의 염색되지 않은 파라핀 슬라이드를 분석하였다.
면역조직화학 (IHC): 포르말린-고정된, 파라핀-포매 조직 절편을 탈파라핀화시킨 후에 항원 검색하고, 차단하고, 일차 항-FGFR3 항체와 인큐베이션하였다. 이차 항체와 인큐베이션하고, 효소 색을 발현시킨 후에, 절편을 대조염색시키고 일련의 알콜 및 크실렌에서 탈수시킨 다음 커버슬립을 덮었다.
하기 프로토콜을 IHC에 이용하였다. 벤타나 벤치마크(Ventana Benchmark) XT 시스템을 이용하여 하기 시약 및 물질을 사용하는 FGFR3 IHC 염색을 수행하였다:
일차 항체: 항-FGFR3 (B-9) 토끼 모노클로날 일차 항체 (sc-13121)
시편 유형: 포르말린-고정된 파라핀 포매 (FFPE) 샘플 및 다양한 염색 강도의 대조군 세포 펠릿
절차 종: 인간
기기: 벤치마크 XT
에피토프 복구 조건: 세포 조건화, 표준1 (CC1, 벤타나, 카탈로그 # 950-124)
일차 항체 조건: 1/200, 희석제 951191 μg/ml /60분 (37℃)
희석제: 벤타나 항체 희석 완충제 (트리스 HCl 완충제, 카탈로그# 95119)
음성 대조군을 위한 나이브 항체: 3 μg/ml의 나이브 마우스 IgG (벤타나 컨펌(Ventana Confirm) 음성 대조군 IgG)
검출: 제조업체의 지침에 따라 사용되는 울트라뷰 유니버셜(Ultraview Universal) DAB 검출 키트 (벤치마크 시약, 중합체 시스템, 벤타나 카탈로그 # 760-500) 및 증폭 키트.
대조염색: 벤타나 헤마톡실린 II (카탈로그 # 790-2208)/ 청색화 시약 (카탈로그 # 760-2037) 포함 (각각 8분 및 4분)
벤치마크 XT 프로토콜은 다음과 같았다:
1. 파라핀 (선택됨)
2. 탈파라핀화 (선택됨)
3. 세포 조건화 (선택됨)
4. 컨디셔너 #1 (선택됨)
5. 표준 CC1 (선택됨)
6. Ab 인큐베이션 온도 (선택됨)
7. 37℃ Ab 인큐베이션 (선택됨)
8. 적정 (선택됨)
9. 수동 적용 (일차 항체) 및 (60분) 동안의 인큐베이션
10. 대조염색 (선택됨)
11. (헤마톡실린 II) 한 방울 적용 (대조염색), 커버슬립 적용, 및 (8분) 동안 인큐베이션
12. 포스트 대조염색 (선택됨)
13. (청색화 시약) 한 방울 적용 (포스트 대조염색), 커버슬립 적용, 및 (4분) 동안 인큐베이션
14. 슬라이드를 비누 물에서 세척하여 오일 제거
15. 슬라이드를 물로 세정
16. 95% 에탄올, 100% 에탄올에서 크실렌 (라이카(Leica) 자동염색기 프로그램 #9)을 통한 슬라이드의 탈수
17. 커버슬립 덮기.
실시예 1-IHC에 의한 FGFR3 발현 스코어링
요로상피 암종에서, FGFR-3 IHC 검정에서 표지된 신생물성 세포를 양성 퍼센트 및 DAB 신호의 강도에 대해 평가하였다. 요로상피 암종에서의 면역조직화학 염색은 막 및/또는 세포질 패턴에 따른다. 준세포 국재화에 관계없이, 신호는 강함, 중간 정도, 약함 또는 음성으로 분류되었다.
강한 신호 강도는 4X 및 10X 대물렌즈를 이용하여 검출가능한 금빛 내지 암갈색 (종종 과립형)의 세포질 및/또는 막 염색을 특징으로 하였다. 중간 정도 신호 강도는 10X 및 20X 대물렌즈를 이용하여 검출가능한 담갈색 내지 황갈색의 세포질 및/또는 막 염색을 특징으로 하였다. 중간 정도 신호는 강한 염색 강도를 갖는 세포에서 나타나는 갈색의 풍부함이 부족하고; 막은 또한 보다 얇고 전체적 염색은 덜 과립형이었다. 약한 신호 강도는 20X 및 일부 경우에서는 심지어 40X 대물렌즈의 사용을 필요로 하는 배경 강도 바로 위의 연한 황갈색에서 회색의 세포질 및/또는 막 염색을 특징으로 한다. 약한 신호는 중간 정도 염색 강도에서 나타나는 갈색 색조가 부족하고; 막은 매우 얇고 약하여 보다 낮은 배율에서 검출가능하지 않았다. 음성 신호 강도는 임의의 검출가능한 신호의 부재 또는 연회색 또는 회색빛-청색 및 막 증진의 증거 부재를 특징으로 하는 신호를 특징으로 하였다.
신호는 종양의 신생물성 부분의 전반에 걸쳐 균일한 수준의 강도를 가지면서 균등하게 분포되거나 또는 1 초과의 강도 수준을 가지면서 불균등하게 분포된다. 신호 강도의 상대 백분율은 시각적으로 추정하였고, 이를 사용하여 진단 스코어를 생성하였다. 원발성 요로상피 암종 샘플에서, 비-신생물성 요로상피는 음성에서 중간 정도 막 및/또는 세포질 신호 범위의 다양한 염색을 나타내었다. 대표적인 FGFR-3-표지된 비-신생물성 요로상피의 사진이 본원에 제공된다. 이소형 음성 대조군을 사용하여 시험 샘플에서의 배경의 존재를 평가하였다.
염색은 H&E의 경우에 하나의 연속 조직 절편, 항-FGFR-3의 경우에 제2의 연속 조직 절편, 및 이소형 음성 대조군 항체의 경우에 제3의 연속 조직 절편을 필요로 하였다. 항-FGFR-3 OPM-2, KMS11, 및 RPMI8226 세포주 대조군 슬라이드를 진행 대조군 및 검정 특이성에 대한 참조물로서 사용하였다. 개별 시편과 동일한 방식으로 고정 및 처리된 양성 대조군 조직을 시험 조건의 각 세트에 대한 양성 대조군으로 진행하였으며, 모든 항-FGFR-3 염색 진행을 수행하였다. 대조군 조직을 새로운 부검/생검/수술적 시편으로부터 준비하고, 가능한 빨리 시험 조직과 동일한 방식으로 고정시켰다.
샘플이 종양의 부재 또는 <50개의 생존 종양 세포의 존재로 인해 H&E 평가에 기초하여 적절하기 않은 경우에, 새로운 샘플이 요청될 것이다. OPM-2, KMS11, 및 RPMI8226 세포주 대조군 슬라이드가 허용되지 않은 경우에, 절편을 이용할 수 있다면 염색을 반복하였다. 이소형 음성 대조군이 허용되지 않거나 또는 항-FGFR-3이 평가가능하지 않은 경우에도, 염색을 반복하였다. 양성 대조군 조직이 예상된 바와 같은 신생물성 세포의 세포질 및/또는 막 염색의 양성 염색을 보이지 않은 경우에, 양성 대조군이 허용되지 않았으며, 개별 시편의 염색은 적절한 대조군과 함께 반복하였다. 평가가능하지 않은 항-FGFR-3은 반응성의 결정이 괴사, 조직/종양의 부재, 염색 또는 고정의 인공물, 또는 가장자리 인공물로 인해 가능하지 않았다는 것을 나타내었다. 대조군이 허용되고 항-FGFR-3이 평가가능한 경우에, 슬라이드는 하기 스코어링 기준 섹션에 기재된 바와 같이 숙련된 병리학자에 의해 스코어링된다.
스코어링 기준
FGFR-3 IHC의 평가에 따라, 임상 스코어를 할당하고, 임상 진단 (Dx)을 결정하였다. 표 2에서 설명된 바와 같이, 음성의 임상 진단 (Dx)은 0의 임상 스코어를 갖는 사례에 할당된다. 1+, 2+ 또는 3+의 임상 스코어를 갖는 사례는 양성 임상 진단으로 할당되었다. 항-FGFR-3 (B-9) 마우스 모노클로날 항체로 염색된 요로상피 암종 사례의 임상적 해석은 표 2에 언급된 기준에 기초하였다.
<표 2>
Figure pct00004
항-FGFR-3 (B-9)으로 염색된 평가가능한 슬라이드를 도 1에 언급된 접근법을 이용하여 평가하였다. 음성 사례 (임상 스코어 = 0)의 예가 도 2A-B에 제시된다. 음성 염색 강도는 임의의 검출가능한 신호의 부재 또는 (갈색 또는 황갈색보다는 오히려) 연회색에서 청색 및 막 증진의 부재를 특징으로 하는 신호를 특징으로 하였다. 신생물성 세포 중 <10%가 면역염색에 대해 양성인 경우 (또는 > 90%가 음성인 경우)에 사례는 음성이었다 (임상 스코어 = 0).
H1155 세포주 대조군 슬라이드는 도 2C에 나타난 바와 같이 0의 임상 스코어를 갖는 음성 대조군 (종양 세포에서 염색이 전혀 없거나 모호한 염색을 가짐 또는 < 10% 종양 세포가 임의의 강도의 막 및/또는 세포질 염색을 가짐)을 나타내었다.
1의 임상 스코어를 갖는 항-FGFR-3 마우스 모노클로날 항체 염색된 사례가 도 3A-D에 제시된다. 약한 염색 강도는 연한 황갈색에서 회색의 세포질 및/또는 매우 약한 막 증진을 특징으로 하였다 (패널 C 및 D). 약한 신호는 중간 정도 염색 강도에서 나타나는 갈색 색조가 부족하고, 막은 보다 얇고, 낮은 배율에서 용이하게 검출가능하지 않았다. 신생물성 세포 중 >10%가 약한 강도를 갖고 중간 정도 및 강한 강도를 갖는 것이 종양 세포 중 < 10%를 차지하는 경우에 사례는 양성 (임상 스코어 = 1)이다.
도 3E에 제시된 바와 같은 RPMI8226 세포주 대조군은 종양 세포 중 > 10%가 약한 세포질 염색을 입증하고, 중간 정도 및 강한 염색이 종양 세포 중 < 10%에서 나타나는 임상 스코어 1을 갖는 양성 대조군을 나타내었다. 세포주 RPMI8226는 약한 세포질 또는 불완전하고 약한 막 염색 (약한 염색 강도)을 갖는다. 이러한 세포주 대조군은 막 염색을 입증하지 않았다.
2의 임상 스코어를 갖는 항-FGFR-3 마우스 모노클로날 항체 염색된 사례가 도 4A-D에 제시된다. 중간 정도 염색 강도는 보다 밝은 갈색에서 황갈색의 세포질 및/또는 낮은 내지 중간 배율에서 검출가능한 약간 두꺼워진 막을 특징으로 하였다. 중간 정도 염색 강도는 강한 염색 강도에서 나타나는 풍부한 갈색이 부족하고, 막은 덜 과립형이고 보다 얇다 (패널 C). 신생물성 세포 중 ≥10%가 면역염색에 대해 중간 정도이고 종양 세포 중 < 10%가 강한 염색을 입증한 경우에 사례는 양성 (임상 스코어 = 2)이다.
도 4E에 제시된 OPM2 세포주 대조군은 세포 중 ≥ 10%에서의 원주형 막 염색을 특징으로 하는, 임상 스코어 2를 갖는 양성 대조군을 나타내며; 강한 염색이 세포 중 < 10%에서 보이고, 약한 세포질 염색이 대부분의 종양 세포에서 보였다. 세포주 OPM2는 중간 정도 세포질 및/또는 막 염색 (중간 정도 염색 강도)을 갖는다.
3의 임상 스코어를 갖는 항-FGFR-3 마우스 모노클로날 항체 염색된 사례가 도 5A-D에 제시된다. 강한 염색 강도는 낮은 힘에서 통상적으로 검출가능한 유사한 강도의 금빛에서 암갈색 (종종 정교한 내지 조잡한 과립형)의 세포질 및/또는 과립형의, 금빛 갈색에서 암갈색의 막을 특징으로 하였다. 신생물성 세포 중 ≥10%가 면역염색에 대해 강한 경우에 사례는 양성 (임상 스코어 = 3)이다. 중간 정도 및 약한 강도를 갖는 종양 세포가 최대 90% 존재할 수도 있다는 점에 주목한다.
도 5E에 제시된 KMS11 세포주 대조군은 세포 중 >10%에서의 보다 두껍고 보다 어두운 과립형의 원주형 막을 특징으로 하는 임상 스코어 3을 갖는 양성 대조군을 나타내었다. 중간 정도 막 염색을 입증하는 혼합 세포가 존재한다는 점에 주목한다. 세포주 KMS11은 강한 세포질 및/또는 원주형의 두꺼워진 막 염색 (강한 염색 강도)을 갖는다.
도 6A-C에 나타난 바와 같이 요로상피 암종 시편에서 이질성이 존재하였다. 도 6A에서, 약한 내지 강한 강도 범위의 세포질 염색이 시야에서 보일 수 있다. 중간 정도 및 강한 강도 막 염색이 또한 보일 수 있다. 샘플에 대한 임상 스코어는 3으로 평가되었다. 도 6B에서, 막 및 세포질 염색은 중간 정도 내지 강한 강도를 가졌다. 샘플에 대한 임상 스코어는 3으로 평가되었다. 도 6C에서, 세포질 염색의 범위는 음성 내지 강한 강도였으며, 집중된 강한 막 염색을 보였다. 샘플에 대한 임상 스코어는 3으로 평가되었다.
양성 요로상피 및 정상 (비-상피) 요소에서의 염색 패턴이 도 6 D-E에 제시된다. 원발성 요로상피 암종 샘플에서, 비-신생물성 요로상피는 음성에서 중간 정도 막 신호 범위의 다양한 염색을 나타내었다. FGFR-3-표지된 비-신생물성 요로상피의 동역학 범위의 예는 도 6D에 제공된다. 또한, 정상 요소 (근육내 비만 세포)에서 중간 정도 및 강한 염색이 관찰되었다 (도 6E).
항-FGFR-3 마우스 모노클로날 항체에 사용되는 대조군 슬라이드는 다음과 같이 포르말린-고정된 파라핀-포매 배양된 세포주로 이루어진다: OPM-2, KMS11, 및 RPMI8226. 이러한 슬라이드는 자동화 슬라이드 염색기 상에서 면역조직화학적 항-FGFR-3 염색 과정의 수행을 모니터링하는데 사용하기 위한 마우스 모노클로날 일차 항체와 함께 검정된, 반-정량적 품질 관리 물질로서 사용되도록 의도된다. 염색은 조직학적 검사 및 적절한 임상 정보와 함께 자격을 갖춘 병리학자에 의해 해석되었다.
<표 3>-스코어링 형태:
Figure pct00005
실시예 2 - 요로상피 암종 패널에서의 FGFR3 IHC의 스코어링
데피니언스(Definiens) 소프트웨어를 이용하여 150개의 요로상피 암종 사례의 패널에서 FGFR3 IHC의 발현 강도를 평가하였다. 슬라이드를 상기 기재된 바와 같이 염색하고, 20x 대물렌즈 및 8 비트 카메라로 나노주머(Nanozoomer) 소프트웨어를 실행하는 하마마츠(Hamamatsu) 나노주머 디지털 슬라이드 스캐너를 이용하여 스캐닝하였다. 모든 슬라이드는 시편 조직이 존재하는 영역에서만 스캐닝하였다. 모든 영상을 RGB (적색, 녹색 및 청색) 스펙트럼을 이용하여, 데피니언스 현상제 (뮌헨, 아게(Munich, AG))를 사용하여 분석하였다. 영상을 2% 다운샘플링하고, 조직 영역을 배경에 해당하는 슬라이드의 밝은 영역을 제외시킴으로써 선택하였다. 조직 내에서, 염색 영역은 0.99 초과의 정규화된 [적색 / 청색] 강도 값을 갖는 영역을 찾아 확인하였다. 평균 명도 (적색, 녹색 및 청색 스펙트럼의 평균 값)는 각각의 슬라이드에서의 염색 영역 내에서 뿐만 아니라 염색되지 않은 조직 영역에서 계산하였다. 데피니언스는 0 (가장 어두움) 내지 255 (가장 밝음)의 픽셀 강도를 표시한다. "염색 강도"를 얻기 위해 값 [염색되지 않은 조직의 평균 명도 - 염색된 조직의 평균 명도]을 계산하였으며, 여기서 보다 큰 값은 상대적으로 보다 어두운 염색을 나타낸다.
B9 항-FGFR3 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지 sc-13121)를 사용하는 스코어 분포에 의해 나타난 바와 같은 발현의 범위가 존재하였다 (도 7A-B). 데이터는 병리학자 스코어와 상관되는 염색 강도의 명백한 분포를 입증하였다 (도 7C).
실시예 3 - FGFR3 항체 R3MAb를 사용하는 치료 및 IHC에 의한 FGFR3의 스코어링
수용체 티로신 키나제인 FGFR3은 암 종양발생에 관련된다. 항-FGFR3 항체 R3Mab는 FGFR3-매개된 세포 증식을 억제하는 신규 인간 모노클로날 IgG1 항체이며, 요로상피 세포 암종 (UCC)의 이종이식편 모델에서 항종양 활성을 발휘한다. 도 10의 클론 184.6.1'을 참조한다. 전임상 데이터는 또한 다른 고형 종양에서 FGFR3을 표적화하는 전략을 뒷받침하였다. 이러한 I상 용량-상승 연구는 항-FGFR3 항체 R3MAb의 안전성, 약동학 (PK), 및 권장되는 II상 용량 (RP2D)을 평가하였다.
표준 3+3 설계를 이용하여, 표준 요법에 불응성인 진전된 고형 악성종양을 갖는 환자를 5개의 용량-상승 코호트 (2-30 mg/kg, 28일 사이클, 사이클 1, 제8일에 추가의 부하 용량을 가짐)에서 정맥내 항-FGFR3 항체 R3MAb를 사용하여 치료하였다. 사이클 1은 용량-제한 독성 (DLT) 평가 창을 포함하였다. 환자내 용량 증량이 허용되었다. 안전성, PK, 약역학, 및 반응을 평가하였다.
26명 (중간 연령 63, 범위 21-77; 42% 여성)에게 투여하였다. 30 mg/kg에서 8명의 DLT-평가가능한 환자 중 1명이 항-FGFR3 항체 R3Mab에 기인한 등급 (G) 4 혈소판감소증의 DLT를 경험하였다. 이 환자는 또한 두 작용제의 중단 및 스테로이드의 투여 후에 빠른 혈소판 회복과 함께 혼재하는 새로운 병행 약물치료를 받았다. 다른 ≥ G4 유해 사례 (AE)는 없었다. 최대 허용 용량은 확인되지 않았다. G3 오심은 2명의 환자에서 보고되었다. ≥ 2명의 환자에서 보고된 항-FGFR3 항체 R3MAb와 관련된 적으로 여겨지는 AE는 피로 (15%), 오심 (12%), 설사, 구토, 점막 염증, 호흡곤란, 소양증, 및 홍조 (각각 8%)였다. 2명의 환자는 AE로 인해 치료를 중단하였다: 1명은 2 mg/kg에서 항-FGFR3 항체 R3MAb에 기인한 G3 백혈구감소증으로 인해 중단하고, 다른 환자는 30 mg/kg에서 항-FGFR3 항체 R3MAb에 기인하지 않은 G2 SAE 동빈맥으로 인해 중단하였다. 예비 PK 분석은 노출의 용량 비례 증가의 경향 (농도-시간 곡선 아래 면적) 및 2 내지 8 mg/kg의 최대 농도를 입증하였다. 클러어런스는 ~0.35 L/일이고, 분포의 중심 부피는 ~3.1 L이었으며, 이는 항-FGFR3 항체 R3MAb가 다른 전형적인 IgG 모노클로날 항체와 유사한 PK 특성을 갖는다는 것을 제안한다. 10명의 UCC 환자 중 5명은 그의 가장 우수한 반응으로서 안정한 질환 (SD) (4명 SD, 1명 비-CR/비-PD)을 가졌다. 4명의 다른 환자는 그의 가장 우수한 반응으로서 SD를 가졌다. 그의 종양 유형은 선양 낭성 암종 (n=2), 및 카르시노이드 종양 (n=2)을 포함하였다.
항-FGFR3 항체 R3MAb의 RP2D는 30 mg/kg이다. 항-FGFR3 항체 R3MAb는 유리한 안정성 프로파일을 가지면서 내약성이 우수하였고, 일부 환자에서 연장된 기간의 질환 안정성을 나타내었다.
실시예 4-FGFR3 항체 R3MAb를 사용하여 치료된 개체로부터의 FGFR3 샘플의 IHC에 의한 스코어링
치료전 개체 샘플을 항-FGFR3 항체 R3MAb를 사용하여 치료된 I상 환자로부터 분석하였다. 결과는 하기에 제시되며, 예시적 실시예는 도 8에 제시된다. P-진행. PD-진행성 질환. SD-안정한 질환. FGFR3 돌연변이는 환자 샘플에서 검출되지 않았다.
<표 4>
Figure pct00006
실시예 5-FGFR3 녹다운은 유전자의 발현을 억제함
세포 배양, siRNA 형질감염 및 시약
인간 방광암 세포주 SW780, BFTC-905 및 Cal29는 ATCC로부터 입수하였다. RT112 세포는 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤 셀 컬쳐스(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (DSMZ, 독일)로부터 구입하였다. FGFR3 또는 EGFP를 표적화하는 독시시클린-유도성 shRNA를 안정하게 발현하는 RT112 세포는 이전에 기재되어 있다 (24). 방광암 세포주 UMUC-14는 미시간 대학교로부터 에이치.비. 그로스만(H.B. Grossman) 박사 (현재 텍사스 대학 M.D. 앤더슨 캔서 센터(Anderson Cancer Center), 텍사스주)로부터 입수하였다. 방광암 세포주 TCC-97-7은 세인트 제임스(St. James) 대학 병원 (영국 리즈)의 마가렛 놀즈(Margret Knowles) 박사로부터의 현물이었다. 세포는 37℃에서 5% CO2의 조건 하에 10% 태아 소 혈청 (FBS) (시그마), 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신 및 L-글루타민이 보충된 RPMI 배지에서 유지하였다.
모든 RNA 간섭 실험은 온-타켓플러스(ON-TARGETplus) siRNA (50nM, 다마콘(Dharmacon), 콜로라도주 라파예트)를 사용하여 수행하였다. 세포를 리포펙타민 RNAiMax (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)로 형질감염시키고, 세포 증식 또는 아폽토시스를 형질감염 48시간 또는 72시간 후에 평가하였다.
유전자 발현 어레이 및 분석
FGFR3 또는 EGFP를 표적화하는 독시시클린-유도성 shRNA를 발현하는 RT112 세포를 10 cm 플레이트에서 독시시클린 (1 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 성장시켰다. 전면성장-미만의 세포 배양물로부터 총 RNA를 RNAeasy 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 단리하였다. RNA 품질을 애질런트(Agilent) 생물분석기 2100 상에 샘플을 구동시켜 검증하고, 충분한 품질의 샘플을 아피메트릭스(Affymetrix) HGU133-Plus_2.0 칩 상에 프로파일링하였다. 마이크로어레이 연구를 삼중 RNA 샘플을 사용하여 수행하였다. 상보적 RNA의 제조, 어레이 혼성화, 스캐닝 및 이후의 어레이 영상 데이터 분석을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 모든 프로브 세트에 대한 발현 요약 값은 바이오컨덕터(Bioconductor)로부터의 아피(affy) 패키지에서 실행되는 바와 같은 RMA 알고리즘을 이용하여 계산하였다. 차등 발현되는 유전자의 통계적 분석은 바이오컨덕터로부터의 림마(limma) 패키지에서 실행되는 바와 같은 선형 모델 및 경험적 베이스(Bayes) 적합화 통계를 이용하여 수행하였다. 차등 발현되는 유전자에 의해 과다-출현하는 생물학적 과정을 수득하기 위해, 진 온톨로지(Gene Ontology) (GO) 생물학적 과정 카테고리 및 유전자의 연관에 대한 초기하 시험을을 위한 고스태츠(GOstats) 및 카테고리 패키지를 이용하여 수행하였다. 발현 프로파일의 계층적 클러스터링은 거리 척도로서 (1 - 피어슨(Pearson) 상관관계) 및 응집 방법으로서 와드(Ward) 최소-분산 방법을 이용하여 수행하였다.
BSA-복합체화된 올레에이트 및 팔미테이트의 제조
50 mM 올레에이트 또는 팔미테이트 원액을 올레에이트 또는 팔미테이트의 나트륨 염 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 사용하여 4 mM NaOH에서 제조하였다. 지방산-무함유 BSA (시그마-알드리치)를 증류된 H2O에서 4 mM의 최종 농도로 제조하였다. 1 부피의 올레에이트 또는 팔미테이트의 50 mM 원액을 1.5 부피의 4 mM BSA와 합하고, 55℃에서 1시간 동안 가열하여 ~8.3:1의 지방산/BSA 비로 BSA-복합체화된 올레에이트 또는 팔미테이트의 20 mM 원액을 수득하였다.
세포 증식 및 아폽토시스 연구
소형 간섭 RNA 실험의 경우에, 형질감염 72시간 후에, 세포를 [메틸-3H] 티미딘 혼입을 위해 처리하였다. 독시시클린-유도성 shRNA 실험의 경우에, 세포를 1 μg/mL 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 72시간 동안 처리한 후에 [3H] 티미딘과 16시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. SCD1 소분자 억제제 실험의 경우에, 세포를 DMSO 중 지시된 농도의 소분자 억제제 또는 DMSO 단독으로 48시간 동안 처리하였다. 세포 생존율을 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) (프로메가(Promega))로 평가하였다. 값은 4개조의 평균 +/- SD로 제시된다.
통계
모은 데이터를 평균 +/- SEM으로 나타내었다. 언페어드 스튜던트 t 검정 (양측)을 이용하여 2개의 군 사이를 비교하였다. P < 0.05의 값은 모든 실험에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과
독시시클린-유도성 shRNA를 사용하여, 방광암 세포주 RT112에서의 FGFR3의 녹다운은 문헌 [Qing et al. J. Clin. Invest. 119(5):1216-1229 (2009)]에 이전에 제시된 바와 같이 시험관내 및 생체내에서 종양 성장을 상당히 감쇠시켰다. 잠재적 FGFR3-하류 표적을 확인하기 위해, 대조군 shRNA 또는 3개의 독립적 FGFR3 shRNA를 발현하는 RT112-유래 세포주의 전사 프로파일을 비교하였다. 상이한 FGFR3 shRNA를 발현하는 3개의 RT112-유래 세포주를 사용하여 이들 독립적으로 확립된 세포주에서 비-특이적 차이에 대한 대조군을 제공하였다. 모든 세포주를 독시시클린의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 처리하여 FGFR3 단백질을 고갈시킨 후에 마이크로어레이 분석을 위해 mRNA를 단리하였다. 모든 3개의 FGFR3 shRNA 세포주에서 독시시클린 유도시에 차등 발현되지만 (오류 발견율 < 0.1, 변화 배수 > 2) 대조군 shRNA 세포에서는 그렇지 않은 유전자가 잠재적 FGFR3-조절된 유전자로 여겨진다. 어레이 상에 나타난 19,701개의 유전자 중에서, 313개의 유전자는 FGFR3 녹다운에 반응하여 지속적인 차등 발현을 보여주었으며, 196개는 상향조절되고 117개는 하향조절되었다. 결과는 표 5에 제시된다.
<표 5>
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
상기 본 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> METHODS OF TREATING FGFR3 RELATED CONDITIONS CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS <130> P4950R1-WO <140> <141> <150> 61/704,052 <151> 2012-09-21 <150> 61/695,853 <151> 2012-08-31 <150> 61/676,857 <151> 2012-07-27 <160> 182 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Phe Thr Phe Thr Ser Thr Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Ala Arg Thr Tyr Gly Ile Tyr Asp Leu Tyr Val Asp Tyr Thr Glu Tyr 1 5 10 15 Val Met Asp Tyr 20 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> 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peptide" <400> 182 Asp Glu Ala Asp 1

Claims (23)

  1. 질환 또는 장애를 갖는 개체가 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준을 갖는 것으로 나타난 경우에 상기 개체에게 치료 유효량의 FGFR3 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법.
  2. 개체로부터의 샘플이 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준을 포함하는지 결정하는 것, 및 개체에게 유효량의 FGFR3 길항제를 투여하여 질환 또는 장애를 치료하는 것을 포함하는, 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  3. 개체에게 유효량의 FGFR3 길항제를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 치료는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준에 기초하는 것인 방법.
  4. FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하는 것, 및 바이오마커의 수준에 기초하여 의약을 선택하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 갖는 개체를 위한 요법을 선택하는 방법.
  5. 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준은 개체가 FGFR3 길항제를 포함하는 치료로부터 이익을 나타낼 가능성이 더 크다는 것을 나타내거나 또는 FGFR3 바이오마커의 감소된 수준은 개체가 FGFR3 길항제를 포함하는 치료로부터 이익을 나타낼 가능성이 더 작다는 것을 나타내는 것인, FGFR3 길항제를 포함하는 치료로부터 이익을 나타낼 가능성이 더 크거나 또는 더 작은 질환 또는 장애를 갖는 개체를 확인하는 방법.
  6. 표적 청중에게 FGFR3 바이오마커의 수준에 기초하여 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는데 FGFR3 길항제의 사용을 촉구하는 것을 포함하는, FGFR3 길항제를 광고하는 방법.
  7. (a) 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하는 것; (b) FGFR3 바이오마커의 수준에 기초하여 FGFR3 길항제를 권장하는 것을 포함하는, FGFR3 길항제를 제공받을 질환 또는 장애를 갖는 개체를 확인하기 위한 검정.
  8. 질환 또는 장애를 갖는 개체로부터의 샘플에서 FGFR3 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하며, 여기서 FGFR3 바이오마커의 상승된 수준의 검출은 개체가 FGFR3 길항제를 사용하여 치료되는 경우에 증가된 효능을 의미하고, FGFR3 바이오마커의 낮은 또는 실질적으로 검출가능하지 않은 수준의 검출은 질환을 갖는 개체가 FGFR3 길항제를 사용하여 치료되는 경우에 감소된 효능을 의미하는 것인 진단 키트.
  9. 제4항 또는 제5항에 있어서, 개체에게 유효량의 FGFR3 길항제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR3 바이오마커가 FGFR3인 방법, 검정 및/또는 키트.
  11. 제10항에 있어서, FGFR3이 면역조직화학에 의해 검출되는 것인 방법, 검정 및/또는 키트.
  12. 제10항에 있어서, FGFR3이 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)로부터의 sc-13121을 사용하는 면역조직화학에 의해 검출되는 것인 방법, 검정 및/또는 키트.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR3 바이오마커의 상승된 수준이 양성의 IHC 임상 진단 또는 1 이상의 IHC 임상 스코어에 의해 검출되는 것인 방법, 검정 및/또는 키트.
  14. 제13항에 있어서, 1 이상의 IHC 임상 스코어가 2 이상인 방법, 검정 및/또는 키트.
  15. 제13항에 있어서, 1 이상의 IHC 임상 스코어가 3인 방법, 검정 및/또는 키트.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 조직 샘플인 방법, 검정 및/또는 키트.
  17. 제16항에 있어서, 조직 샘플이 종양 조직 샘플인 방법, 검정 및/또는 키트.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, FGFR3 길항제가 항체, 결합 폴리펩티드, 소분자 및/또는 폴리뉴클레오티드인 방법, 검정 및/또는 키트.
  19. 제18항에 있어서, FGFR3 길항제가 항-FGFR3 항체인 방법, 검정 및/또는 키트.
  20. 제19항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법, 검정 및/또는 키트.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 항체가 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 방법, 검정 및/또는 키트.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 증식성 질환 또는 장애인 방법, 검정 및/또는 키트.
  23. 제22항에 있어서, 증식성 질환 또는 장애가 암인 방법, 검정 및/또는 키트.
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