ES2891578T3 - Antígeno quimérico y receptores de células T y métodos de uso - Google Patents

Antígeno quimérico y receptores de células T y métodos de uso Download PDF

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Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende (i) una molécula de unión a antígeno, (ii) un dominio coestimulador y (iii) un dominio de activación, en donde el dominio coestimulador comprende un dominio extracelular con una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio intracelular, caracterizado porque dicha bisagra es un dominio bisagra truncado (THD) que consiste de: (a) aminoácidos 123-152 de SEQ ID NO: 1, o (b) una variante de (a), que tiene la misma longitud pero con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de (a); o (c) una variante de (a) o (b), con uno a seis aminoácidos añadidos o eliminados de la secuencia de aminoácidos del THD; en donde de uno a seis aminoácidos que se pueden añadir o eliminar de la secuencia de aminoácidos en el THD pueden estar en el N-terminal, en el C-terminal, o tanto en el N-terminal como en el C-terminal.

Description

DESCRIPCIÓN
Antígeno quimérico y receptores de células T y métodos de uso
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. 62/317,258, presentada el 1 de abril de 2016.
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene una Lista de Secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 28 de febrero de 2019, se denomina K-1031_02US_SL.txt y tiene un tamaño de 450,469 bytes.
Antecedentes
Los cánceres humanos están compuestos por su naturaleza de células normales que han sufrido una conversión genética o epigenética para convertirse en células cancerosas anormales. Al hacerlo, las células cancerosas comienzan a expresar proteínas y otros antígenos que son distintos de los expresados por las células normales. El sistema inmunológico innato del cuerpo puede utilizar estos antígenos tumorales aberrantes para atacar y destruir específicamente las células cancerosas. Sin embargo, las células cancerosas emplean diversos mecanismos para evitar que las células inmunitarias, como los linfocitos T y B, se dirijan con éxito a las células cancerosas.
Las terapias actuales con células T se basan en células T humanas enriquecidas o modificadas para atacar y destruir las células cancerosas en un paciente. Para aumentar la capacidad de las células T para atacar y destruir una célula cancerosa particular, se han desarrollado métodos para diseñar células T para expresar constructos que direccionan las células T a una célula cancerosa diana particular. Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) y los receptores de células T modificados (TCR), que comprenden dominios de unión capaces de interactuar con un antígeno tumoral particular, permiten que las células T se direccionen y eliminen las células cancerosas que expresan el antígeno tumoral particular. Se describen ejemplos de tales CAR, por ejemplo, en los documentos WO2013142034 y WO2015077789.
Existe una necesidad de CAR y TCR mejorados para atacar y destruir células cancerosas.
Resumen de la invención
La presente invención aborda esta necesidad proporcionando diversos medios y usos relacionados con los receptores de antígenos quiméricos (CAR) que se definen en las reivindicaciones adjuntas. La invención se centra en los CAR con propiedades mejoradas mediante la elección de un dominio de bisagra modificado.
Resumen de las enseñanzas
La presente divulgación proporciona enseñanzas que en algunos aspectos van más allá de la divulgación de la invención como tal, que está definida exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no es parte de la invención. En particular, el término "realización" no debe interpretarse como necesariamente una referencia a una realización de la invención, a menos que la "realización" en cuestión esté dentro del alcance de las reivindicaciones.
Un CAR puede comprender, por ejemplo, (i) un componente específico de antígeno ("molécula de unión a antígeno"), (ii) uno o más dominios coestimuladores (que incluye un dominio bisagra) y (iii) uno o más dominios activadores. Cada dominio puede ser heterogéneo, es decir, estar compuesto por secuencias derivadas de diferentes cadenas de proteínas. Las células inmunitarias que expresan CAR (como las células T) pueden usarse en diversas terapias, incluidas las terapias contra el cáncer.
Como se describe con más detalle a continuación, incluida la sección de Ejemplos, los CAR que comprenden un dominio coestimulador que incluye un dominio bisagra truncado ("THD") proporcionan propiedades inesperadamente superiores en comparación con un CAR que comprende un dominio coestimulador que incluye un dominio bisagra completo ("CHD"). Los polinucleótidos que codifican dichos CAR se pueden transducir en células T y los CAR se expresan en células T, por ejemplo, las propias células T del paciente. Cuando las células T transducidas se trasplantan de nuevo a un paciente, los CAR se direccionan a las células T para que reconozcan y se unan a un epítopo presente en la superficie de las células cancerosas, lo que permite la unión de células cancerosas en lugar de células no cancerosas. Esta unión conduce a la activación de mecanismos citolíticos en la célula T que destruyen específicamente las células cancerosas unidas. Antes de la presente enseñanza, se desconocía que un CAR que comprende una THD es superior a un CAR que comprende una CHD. Por tanto, la presente enseñanza satisface una necesidad insatisfecha que existe de terapias nuevas y mejoradas para tratar el cáncer.
Un aspecto de la presente enseñanza es un polinucleótido aislado que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR), que comprende (i) una molécula de unión a antígeno, (ii) un dominio coestimulador y (iii) un dominio receptor activador. El dominio coestimulador puede comprender un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular, en donde el dominio extracelular comprende un dominio bisagra truncado que consiste esencialmente en o que consiste en (i) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idénticos a los aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, (ii) de uno a seis aminoácidos.
En algunas realizaciones, de uno a seis aminoácidos son aminoácidos heterólogos.
En algunas realizaciones, el dominio de bisagra truncado consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idénticos a los aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos está codificada por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntico a SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de 4-1BB/CD137, una cadena alfa de un receptor de células T, una cadena beta de un receptor de células T, CD3 epsilon, CD4, CD5, CD8 alfa, CD9, CD16, CD19, CD22, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 o una cadena zeta de un receptor de células T, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntico a SEQ ID NO: 5.
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana está codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99% o aproximadamente un 100% idéntico a SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, el dominio intracelular comprende una región de señalización de 4-1BB/CD137, que activa los receptores de células NK, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD29, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gama, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8alfa, CD8beta, CD96 (Táctil), CD11a, CD11b, CD1 lc, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, receptores de citoquinas, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor gamma Fc, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig alfa (CD79a), IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, proteínas similares a inmunoglobulina, coestimulador inducible de células T (ICOS), integrinas, ITGA4, ITGA4, It Ga 6 , ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, un ligando que se une específicamente con CD83, LIGHT, LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), linfocito antígeno 1 asociado a la función (LFA-1 (CD11a/CD18), molécula MHC de clase I, Nk G2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, muerte programada-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SlA m ), SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, proteínas receptoras de TNF, TNFR2, un receptor de ligando Toll, TrANCE/RANKL, VLA1 o VLA-6, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el dominio intracelular comprende una región de señalización 4-1BB/CD137.
En algunas realizaciones, el dominio intracelular comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntico a SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, el dominio intracelular comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntico a SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en la que VH comprende 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR) y VL comprende 3 CDR.
En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en 5T4, alfafetoproteína, antígeno de maduración de células B (BCMA), CA-125, antígeno carcinoembrionario, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD56. , CD123, CD138, c-Met, CSPG4, molécula 1 similar a lectina tipo C (CLL-1), EGFRvIII, antígeno tumoral epitelial, ERBB2, FLT3, proteína de unión a folato, GD2, GD3, HER1-HER2 en combinación, HER2 -HER3 en combinación, HER2/Neu, HEr V-K, glicoproteína de la envoltura del VIH-1 gp41, glicoproteína de la envoltura del VIH-1 gp120, IL-llRalpha, cadena kappa, cadena lambda, antígeno asociado a melanoma, mesotelina, MUC-1, p53 mutado , ras mutado, antígeno prostético específico, ROR1 o VEGFR2, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une específicamente a BCMA, CLL-1 o FLT3.
En algunas realizaciones, el dominio de activación comprende una secuencia de aminoécidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntico a SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 251.
En algunas realizaciones, el dominio de activación esté codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99% o aproximadamente un 100% idéntico a SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, el CAR o TCR comprende ademés un péptido guía.
En algunas realizaciones, el péptido guía comprende una secuencia de aminoécidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntico a SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones, el péptido guía esté codificado por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99% o aproximadamente un 100% idéntico a SEQ ID NO: 10.
Otro aspecto de la presente enseñanza es un vector que comprende el polinucleótido de un aspecto o realización anterior.
En algunas realizaciones, el vector es un vector adenoviral, un vector asociado a adenovirus, un vector de ADN, un vector lentiviral, un plésmido, un vector retroviral o un vector de ARN, o cualquier combinación de los mismos.
Otro aspecto més de la presente enseñanza es un polipéptido codificado por el polinucleótido de un aspecto o realización anterior o el vector de un aspecto o realización anterior.
En otro aspecto, la presente enseñanza es una célula que comprende el polinucleótido de un aspecto o realización anterior, el vector de un aspecto o realización anterior, o el polipéptido de un aspecto o realización anterior, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la célula es una célula T.
En algunas realizaciones, la célula T es una célula T alogénica, una célula T autóloga, una célula T autóloga diseñada (eACT™) o un linfocito infiltrante de tumor (TIL).
En algunas realizaciones, la célula T es una célula T CD4+
En algunas realizaciones, la célula T es una célula T CD8+.
En algunas realizaciones, la célula T es una célula in vitro.
En algunas realizaciones, la célula T es una célula T autóloga.
Un aspecto de la presente enseñanza es una composición que comprende el polinucleótido de un aspecto o realización anterior, que comprende el vector de un aspecto o realización anterior, que comprende el polipéptido de un aspecto o realización anterior, o que comprende la célula de un aspecto o realización anterior.
En algunas realizaciones, la composición se formula para administrarse a un sujeto, opcionalmente, que comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la presente enseñanza es un método para fabricar una célula que expresa un CAR o TCR que comprende transducir una célula con el polinucleótido de un aspecto o realización anterior en condiciones adecuadas.
En algunas realizaciones, el método comprende además aislar la célula.
Otro aspecto más de la presente enseñanza es un método para inducir una inmunidad contra un tumor que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una célula que comprende el polinucleótido de un aspecto o realización anterior, que comprende el vector de un aspecto o realización anterior, o el polipéptido de un aspecto o realización anterior, o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, la presente enseñanza es un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto el polinucleótido de un aspecto o realización anterior, el vector de un aspecto o realización anterior, el polipéptido de un aspecto anterior o realización, la célula de un aspecto o realización anterior, o la composición de un aspecto o realización anterior.
En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematológico.
En algunas realizaciones, el cáncer es de glóbulos blancos.
En algunas realizaciones, el cáncer es de células plasmáticas.
En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia, linfoma o mieloma.
En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia linfoblástica aguda (LLA) (que incluye LLA no de células T), leucemia mieloide aguda, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mieloide crónica, leucemia aguda o crónica, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), leucemia de células pilosas, Enfermedad de Hodgkin, afecciones linfoproliferativas malignas, Linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS), mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin (LNH), trastorno proliferativo de células plasmáticas (incluido el mieloma asintomático (mieloma múltiple latente o mieloma indolente), linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, plasmocitomas (incluida discrasia de células plasmáticas; mieloma solitario; plasmacitoma; plasmocitoma extramedular; y plasmocitoma múltiple), síndrome POEMS (también conocido como síndrome de Crow-Fukase; enfermedad de Takatsuki; y síndrome PEP), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBC), linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, linfoma de zona marginal esplénica ( SMZL), amiloidosis sistémica de cadena ligera amiloide, leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), linfoma de células T, linfoma folicular transformado o macroglobulinemia de Waldenstrom, o una combinación de los mismos.
En general, la presente enseñanza se refiere a la terapia de células autólogas diseñadas, abreviada como "eACT ™", también conocida como transferencia de células adoptivas. eACT™, es un proceso mediante el cual las propias células T de un paciente se recolectan y posteriormente se modifican genéticamente para reconocer y apuntar a uno o más antígenos expresados en la superficie celular de una o más células cancerosas específicas. Las células T pueden diseñarse para expresar, por ejemplo, un CAR o TCR. Las células T CAR positivas (CAR+) están diseñadas para expresar un CAR. Los CAR pueden comprender, por ejemplo, un fragmento variable extracelular de cadena única (scFv) con especificidad por un antígeno tumoral particular, que está directa o indirectamente unido a una parte de señalización intracelular que comprende al menos un dominio coestimulador, que está directa o indirectamente unido a al menos un dominio de activación; los componentes pueden disponerse en cualquier orden. El dominio coestimulador puede derivarse de una proteína coestimuladora conocida en la técnica, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, y el dominio activador puede derivarse de, por ejemplo, cualquier forma de CD3-zeta. En algunas realizaciones, el CAR está diseñado para tener dos, tres, cuatro o más dominios coestimuladores. En algunas realizaciones, un CAR se diseña de manera que el dominio coestimulador se exprese como una cadena polipeptídica separada. Se describen ejemplos de terapias y constructos de células T con CAR en las publicaciones de patente de Estados Unidos Nos.
2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309 y 2014/0050708; Publicaciones de Patentes Internacionales Nos. WO2012033885, WO2012079000, WO2014127261, WO2014186469, WO2015080981, WO2015142675, WO2016044745 y WO2016090369; y Sadelain et al, Cancer Discovery, 3: 388-398 (2013).
Otras características y ventajas de la enseñanza serán evidentes a partir de los Dibujos y la siguiente Descripción Detallada, incluidos los Ejemplos y las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
Las características anteriores y adicionales se apreciarán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada cuando se tome junto con los dibujos adjuntos. Sin embargo, los dibujos son solo para fines ilustrativos; no como limitación.
La FIGURA 1A muestra una proteína coestimuladora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. El dominio bisagra de la proteína coestimuladora (subrayado sólido), el dominio transmembrana (subrayado punteado) y el dominio de señalización (subrayado discontinuo) están marcados. Un nuevo dominio de bisagra truncado ("THD") está en negrita. Las FIGURAS 1B y 1C proporcionan diagramas de cinta del dominio extracelular de la proteína coestimuladora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. La FIGURA 1B muestra un ejemplo de una región dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 usada para derivar una realización de una región bisagra en el contexto de CAR, es decir, una región que contiene los aminoácidos 114 a 152 de SEQ ID NO: 1 (denominado en el presente documento dominio de bisagra completo o "CHD"; está marcado en negro y gris oscuro). La FIGURA 1C muestra la THD que contiene los aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1 (marcado en negro). En la FIGURA 1B, la parte de la región de bisagra que está excluida de la FIGURA 1C está marcado en gris oscuro y rodeado por un círculo.
Las FIGURAS 2A-2H muestran CLUTSTAL W (2.83) alineamientos de secuencia múltiple de ocho ejemplos de moléculas de unión descritas en el presente documento. La FIGURA 2A muestra un alineamiento de secuencia de ejemplos de moléculas de unión anti-CLL-1 que comprenden un dominio VH. Se muestran las CDR y las regiones marco FR, según se determina mediante la numeración de Chothia (FIGURA 2A). La FIGURA 2B es una tabla que proporciona la SEQ ID NO para cada VH y CDR ilustrados en la FIGURA 2A. La FIGURA 2C muestra un alineamiento de secuencia de ejemplos de moléculas de unión anti-CLL-1 que comprenden un dominio VL. Se muestran las CDR y FR, según se determina mediante la numeración de Chothia (FIGURA 2C). La FIGURA 2D es una tabla que proporciona la SEQ ID NO para cada secuencia VH y CDR ilustrada en la FIGURA 2C. La FIGURA 2E muestra un alineamiento de secuencia de ejemplos de moléculas de unión anti-BCMA que comprenden un dominio VH. Se muestran las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR), según se determina mediante la numeración de Chothia (FIGURA 2E). SEQ ID NOs: 253-260, CDR1 en orden de arriba a abajo; SEQ ID NO: 261-268, CDR2 de arriba a abajo, SEQ ID n O: 269-276, CDR3 de arriba a abajo. La FIGURA 2F es una tabla que proporciona la SEQ ID NO para cada VH y CDR ilustrados en la FIGURA 2E. La FIGURA 2G muestra un alineamiento de secuencia de moléculas de unión anti-BCMA de ejemplo que comprenden un dominio VL. Se muestran las CDR y FR, según se determina mediante la numeración de Chothia (FIGURA 2G). La FIGURA 2H es una tabla que proporciona la SEQ ID NO para cada secuencia VH y CDR ilustrada en la FIGURA 2G. SEQ ID NO.: 37-44, CDR1 en orden de arriba a abajo; SEQ ID NO: 45-52, CDR2 de arriba a abajo, SEQ ID NO: 277-284, CDR3 de arriba a abajo.
La FIGURA 3 representa la expresión de CAR en células T humanas primarias sometidas a electroporación con ARNm que codifica varios CAR. Se muestran los datos obtenidos de CAR que tiene un dominio de bisagra completo ("CHD") y se muestran los datos obtenidos de CAR que tiene un dominio de bisagra truncado ("THD").
Las FIGURAS 4A-4X muestran la producción de IFNy, IL-2 y TNFa por células T CAR anti-FLT3 sometidas a electroporación después de 16 horas de cocultivo con las líneas celulares diana indicadas. Las FIGURAS 4A-4B, 4G-4H, 4M-4N y 4S-4T muestran la producción de IFNy después del cocultivo con Namalwa, EoL-1, HL60 y MV4; 11 células diana, respectivamente. Las FIGURAS 4C-4D, 4I-4J, 4O-4P y 4U-4V muestran producción de IL-2 después de cocultivo con Namalwa, EoL-1, HL60 y MV4; 11 células diana, respectivamente. Las FIGURAS 4E-4F, 4K-4L, 4Q-4R y 4W-4X muestran la producción de TNFa después del cocultivo con Namalwa, EoL-1, HL60 y MV4; 11 células diana, respectivamente.
Las FIGURAS 5A-5H muestran la actividad citolítica de células T CAR anti-FLT3 sometidas a electroporación contra Namalwa (FIGURAS 5A-5B), EoL1 (FIGURAS 5C-5D), HL60 (FIGURAS 5E-5F) y MV4; 11 (FIGURAS 5G) -5H) líneas celulares diana después de 16 horas de cocultivo.
Las FIGURAS 6A-6B representan la expresión de CAR en células T humanas primarias transducidas por lentivirus de dos donantes sanos.
Las FIGURAS 7A-7F muestran la producción de IFNy (FIGURAS 7A-7B), TNFa (FIGURAS 7C-7D) e IL-2 (FIGURAS 7E-7F) por células T CAR transducidas por lentivirus de dos donantes sanos después de 16 horas de co- cultivo con las líneas celulares diana indicadas.
Las FIGURAS 8A-8D muestran la actividad citolítica media a lo largo del tiempo de dos donantes sanos que expresan los constructos CAR anti-FLT3 cocultivados con Namalwa (FIGURAS 8A), EoL1 (FIGURAS 8B), MV4; 11 (FIGURA 8C) y HL60 (FIGURA 8D) líneas celulares diana durante 16, 40, 64, 88 o 112 horas.
Las FIGURAS 9A-9B representan la proliferación de células T CAR transducidas con lentivirus marcadas con CFSE de dos donantes sanos después de 5 días de cocultivo con perlas CD3-CD28 o las líneas celulares diana indicadas.
Las FIGURAS 10A-10D representan la expresión de CAR en células T humanas primarias transducidas por lentivirus utilizadas para estudios in vivo. Las FIGURAS 10E-10F muestran representaciones gráficas de imágenes de bioluminiscencia medidas de células de leucemia mieloide aguda (LMA) marcadas después de la inyección intravenosa de células T CAR de control (simulacro) o anti-FLT3 (10E3-CHD, 10E3-THD o 8B5-THD) en un modelo xenogénico, realizado por duplicado. La FIGURA 10G proporciona los valores p para los puntos de datos respectivos en la FIGURA 10E. Las FIGURAS 10H-10K muestran curvas de supervivencia de ratones inyectados con simulacro o 10E3-CHD (FIGURA 10H), simulacro o 10E3-THD (FIGURA 10I), simulacro o 8B5-THD (FIGURA 10J), o 10E3-THD o 8B5- THD (FIGURA 10K) células T CAR.
Las FIGURAS 11A-11B muestra la expresión de CAR de CLL-1 determinada por la proteína L 6 horas después de la electroporación con ARNm.
Las FIGURAS 12A-12C muestran los resultados de un ensayo de liberación de citoquinas de diferentes constructos de células CLL-1 CAR-T 24 horas después de la electroporación con ARNm. Los niveles de producción de IL-2 (FIGURA 12A), IFNy (FIGURA 12B) y TNFa (FIGURA 12C) se muestran para los controles (diana sola, simulada, GFP y células T con CAR CD19) y CAR anti-CLL-1 Células T (24C1_HL-THD, 24C1_HL_CHD, 24C8_HL-CHD y 24C8_HL_THD) cocultivadas con células Namalwa, MV4; 11, U937, HL60 y EoL-1, como se indica.
Las FIGURAS 13A-13E muestran actividad citolítica de diferentes constructos de células CLL-1 CAR-T 24 horas después de la electroporación con ARNm. Células T sometidas a electroporación con constructos de control (simulacro, GFP y CAR CD19) o constructos CAR anti-CLL-1 (24C8_HL-CHD y 24C8_HL_THD) se cultivaron conjuntamente con Namalwa (FIGURA 13A), MV; 411 (FIGURA 13B), EoL-1 (FIGURA 13C), HL-60 (FIGURA 13D) y células diana U937, y se determinó el porcentaje de lisis específica de cada línea celular diana.
Las FIGURAS 14A-14C muestran los resultados de un ensayo de liberación de citoquinas de diferentes células T CAR anti-CLL-1 transducidas 16 horas después del cocultivo con diferentes líneas celulares. Los niveles de producción de IFNy (FIGURA 14A), IL-2 (FIGURA 14B) y TNFa (FIGURA 14C) se muestran para los controles (diana sola y simulada) y células T CAR anti-CLL-1 transducidas (10E3_THD y 24C1_LH_THD) cocultivadas con Namalwa, HL-60 o MV4; 11 células diana, como se indica.
Las FIGURAS 15A-15C muestran actividad citolítica de células T con CAR anti-CLL-1 (C1_24C1_LH_THD) 16 horas y 40 horas después del cocultivo con Namalwa (FIGURA 15A), MV4; 11 (FIGURA 15B) o HL-60 (FIGURA 15C) células diana.
Las FIGURAS 16A-16F muestran la producción de IFNy, TNFa e IL-2 por células T CAR transducidas por lentivirus de dos donantes sanos después de 16 horas de cocultivo con EoL-1 (negro), NCI-H929 (gris claro) o MM1S (gris) líneas celulares diana. Las FIGURAS 16A y 16B muestran la producción de IFNy (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus de un primer donante (FIGURA 6A) y un segundo donante (FIGURA 16B). Las FIGURAS 16C y 16D muestran la producción de TNFa (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus de un primer donante (FIGURA 16C) y un segundo donante (FIGURA 16D). Las FIGURAS 16E y 16F muestran la producción de IL-2 (pg/ml; eje y) en células T CAR transducidas por lentivirus de un primer donante (FIGURA 16E) y un segundo donante (FIGURA 16F).
Las FIGURAS 17A-17F muestran la actividad citolítica media (como porcentaje de células diana viables restantes; eje y) a lo largo del tiempo de dos donantes sanos que expresan los CAR indicados cocultivados con EoL1 (FIGURAS 17A y 17B), NCI-H929 (FIGURAS 17C y 17D), o células diana MM1S (FIGURAS 17E y 17F) durante 16 horas, 40 horas, 64 horas, 88 horas o 112 horas. Las FIGURAS 17Ay 17B muestran la actividad citolítica media de las células CAR T transducidas de un primer donante (FIGURA 17A) y un segundo donante (FIGURA 17B) cocultivados con células diana EoL1 durante 16 horas, 40 horas, 64 horas, 88 horas o 112 horas. Las FIGURAS 17C y 17D muestran la actividad citolítica media de las células CAR T transducidas de un primer donante (FIGURA 17C) y un segundo donante (FIGURA 17D) cocultivados con células diana NCI-H929 durante 16 horas, 40 horas, 64 horas, 88 horas o 112 horas. Las FIGURAS 17E y 17F muestran la actividad citolítica media de las células CAR T transducidas de un primer donante (FIGURA 17E) y un segundo donante (FIGURA 17F) cocultivados con células diana MM1S durante 16 horas, 40 horas, 64 horas, 88 horas o 112 horas.
Las FIGURAS 18A y 18B muestran la proliferación de células T CAR transducidas con lentivirus marcadas con CFSE de un primer donante sano (FIGURA 18A) y un segundo donante sano (FIGURA 18B) después de 6 días de cocultivo con perlas CD3-CD28 (fila superior), EoL-1 (segunda fila), NCI-H929 (tercera fila) o líneas celulares diana MM1S (fila inferior).
La FIGURA 19A y FIGURA 19B son gráficos que muestran la termoestabilidad de los receptores de antígenos quiméricos (CAR) de la presente enseñanza. La FIGURA 19A: en una solución salina regulada con fosfato (PBS), un CAR que comprende un dominio extracelular con un dominio de bisagra truncado ("THD") tiene una temperatura de fusión más alta en relación con un CAR que comprende un dominio extracelular con un dominio de bisagra completo ("CHD"). La FIGURA 19B: En presencia de NaCl 50 mM, un CAR que comprende un dominio extracelular con una THD tiene una temperatura de fusión más alta que un CAR que comprende un dominio extracelular con una CHD.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona enseñanzas que en algunos aspectos van más allá de la divulgación de la invención como tal, que está definida exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no es parte de la invención. En particular, el término "realización" no debe interpretarse como necesariamente una referencia a una realización de la invención, a menos que la realización esté dentro del alcance de las reivindicaciones.
La presente enseñanza se refiere a nuevos polipéptidos que comprenden un nuevo dominio de bisagra truncado ("THD") y polinucleótidos que lo codifican. Algunos aspectos de la enseñanza se refieren a un polinucleótido que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende la THD descrita en el presente documento. La presente enseñanza también proporciona vectores (por ejemplo, vectores virales) que comprenden tales polinucleótidos y composiciones que comprenden tales vectores. La presente enseñanza proporciona además polinucleótidos que codifican tales CAR o TCR y composiciones que comprenden tales polinucleótidos. La presente enseñanza proporciona adicionalmente células modificadas genéticamente (por ejemplo, células T) que comprenden dichos polinucleótidos y/o transducidas con dichos vectores virales y composiciones que comprenden dichas células modificadas genéticamente. La presente enseñanza proporciona composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que incluyen una pluralidad de células T diseñadas. La presente enseñanza proporciona métodos para fabricar tales células T modificadas y composiciones y usos (por ejemplo, en el tratamiento de un melanoma) de dichas células T modificadas y composiciones. Y la presente enseñanza proporciona un método para inducir una inmunidad contra un tumor que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una célula que comprende un polinucleótido, un vector o un polipéptido de la presente enseñanza. Otros aspectos de la enseñanza se relacionan con las células que comprenden el CAR o el TCR y su uso en una terapia con células T, por ejemplo, una terapia con células autólogas (eACT™), para el tratamiento de un paciente que padece un cáncer.
Definiciones
Para que la presente enseñanza se entienda más fácilmente, primero se definen algunos términos a continuación. Las definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo de la Especificación.
Como se usa en esta Especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, como se usa en este documento, se entiende que el término "o" es inclusivo y cubre tanto "o" como "y".
El término "y/o", cuando se usa en el presente documento, debe tomarse como divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" tal como se utiliza en una expresión como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir A y B; A o B; A (solo); y B (solo). Asimismo, el término "y/o" como se usa en una expresión como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos:
A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
Los términos "por ejemplo" y "es decir' como se usa en el presente documento, se usan simplemente a modo de ejemplo, sin limitación intencionada, y no debe interpretarse como una referencia solo a los elementos enumerados explícitamente en la memoria descriptiva.
Se entiende que los términos "o más", "al menos", "más que" y similares, por ejemplo, "al menos uno" incluyen, entre otros, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ,7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,
62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117,
118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140,
141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000,
5000 o más que el valor indicado. También se incluye cualquier número mayor o fracción intermedia.
Por el contrario, el término "no más de" incluye cada valor menor que el valor indicado. Por ejemplo, "no más de 100 nucleótidos" incluye 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81 , 80, 79, 78, 77, 76,
75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56 , 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45,
44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 , 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14,
13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ,5 , 4, 3, 2, 1 y 0 nucleótidos. También se incluye cualquier número menor o fracción intermedia.
Se entiende que los términos "pluralidad", "al menos dos", "dos o más", "al menos un segundo" y similares incluyen, entre otros, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 31, 32, 33 , 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 , 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 , 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,
92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 , 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,
117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 , 134, 135, 136, 137, 138, 139,
140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 , 1000, 2000, 3000,
4000, 5000 o más. También se incluye cualquier número mayor o fracción intermedia.
A lo largo de la especificación, el término "que comprende" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos. Se entiende que siempre que se describen aquí aspectos con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de "que consiste en" y /o "que consiste esencialmente en".
A menos que se indique específicamente o sea evidente por el contexto, como se usa en este documento, el término "aproximadamente" se refiere a un valor o composición que está dentro de un rango de error aceptable para el valor o composición particular según lo determine un experto en la técnica, que dependerá en parte sobre cómo se mide o determina el valor o la composición, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" puede significar dentro de una o más de una desviación estándar según la práctica en la técnica. "Acerca de" o "que comprende esencialmente de" puede significar un rango de hasta el 10% (es decir, ± 10%). Por tanto, "aproximadamente" puede entenderse dentro del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, o 0.001% mayor o menor que el valor establecido. Por ejemplo, aproximadamente 5 mg pueden incluir cualquier cantidad entre 4.5 mg y 5.5 mg. Además, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces un valor. Cuando se proporcionan valores o composiciones particulares en la presente divulgación, a menos que se indique lo contrario, se debe suponer que el significado de "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" está dentro de un intervalo de error aceptable para ese valor o composición particular.
Como se describe en este documento, cualquier rango de concentración, rango de porcentaje, rango de relación o rango de números enteros debe entenderse incluyendo el valor de cualquier número entero dentro del rango mencionado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tales como un décimo y un centésimo de un número entero), a menos que se indique lo contrario.
Las unidades, prefijos y símbolos utilizados en este documento se proporcionan utilizando su forma aceptada por Sistema Internacional de Unidades (SI). Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que se refiere esta divulgación. Por ejemplo, Juo, "The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology", 2nd ed., (2001), CRC Press; "The Dictionary of Cell & Molecular Biology", 5th ed., (2013), Academic Press; y "The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology", Cammack et al. eds., 2nd ed, (2006), Oxford University Press, proporcione a los expertos en la técnica un diccionario general para muchos de los términos utilizados en esta descripción.
"Administrar" se refiere a la introducción física de un agente a un sujeto, usando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica. Vías de administración de ejemplo para las formulaciones descritas en el presente documento incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, espinal u otras vías de administración parenterales, por ejemplo mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" como se usa en este documento significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección, e incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, inyección e infusión intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, así como electroporación in vivo. En algunas realizaciones, la formulación se administra mediante una ruta no parenteral, por ejemplo, por vía oral. Otras rutas no parenterales incluyen una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La administración también se puede realizar, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados.
El término "anticuerpo" (Ab) incluye, sin limitación, una glucoproteína inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. En general, un anticuerpo puede comprender al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una molécula de unión a antígeno del mismo. Cada cadena H comprende una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio constante, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los Abs pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
Los anticuerpos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (incluidos los anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos diseñados, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, inmunoglobulinas, anticuerpos sintéticos, anticuerpos tetraméricos que comprenden dos cadenas pesadas y dos moléculas de cadena ligera, un monómero de cadena ligera de anticuerpo, un monómero de cadena pesada de anticuerpo, un dímero de cadena ligera de anticuerpo, un dímero de cadena pesada de anticuerpo, un par de cadena ligera de anticuerpocadena pesada de anticuerpo, intracuerpos, fusiones de anticuerpos (a veces denominadas en este documento como "anticuerpo conjugados"), anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos de dominio único, anticuerpos monovalentes, anticuerpos monocatenarios o Fvs monocatenarios (scFv), anticuerpos camelizados, affybodies, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fvs unidos por disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-anti-Id), minicuerpos, anticuerpos de dominio, hormiga sintética anticuerpos (a veces denominados en el presente documento "miméticos de anticuerpos") y fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento se refieren a poblaciones de anticuerpos policlonales.
Una inmunoglobulina puede derivar de cualquiera de los isotipos comúnmente conocidos, incluidos, entre otros, IgA, IgA secretora, IgG, IgE e IgM. Las subclases de IgG también son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. "Isotipo" se refiere a la clase o subclase Ab (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada. El término "anticuerpo" incluye, a modo de ejemplo, Abs tanto de origen natural como de origen no natural; Abs monoclonales y policlonales; Abs quiméricos y humanizados; Abs humanos o no humanos; Abs totalmente sintéticos; y Abs monocatenario. Un Ab no humano puede humanizarse mediante métodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en el hombre. Cuando no se indique expresamente, y a menos que el contexto indique lo contrario, el término "anticuerpo" también incluye un fragmento de unión a antígeno o una porción de unión a antígeno de cualquiera de las inmunoglobulinas mencionadas anteriormente, e incluye un fragmento o porción monovalente y divalente, y una cadena sencilla Ab.
Una "molécula de unión a antígeno", "porción de unión a antígeno" o "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier molécula que comprende las partes de unión a antígeno (por ejemplo, CDR) del anticuerpo del que se deriva la molécula. Una molécula de unión a antígeno puede incluir las regiones determinantes de complementariedad antigénica (CDR). Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, dAb, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de moléculas de unión a antígeno. Los pepticuerpos (es decir, moléculas de fusión Fc que comprenden dominios de unión a péptidos) son otro ejemplo de moléculas de unión a antígenos adecuadas. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno en una célula tumoral. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno en una célula involucrada en una enfermedad hiperproliferativa o a un antígeno viral o bacteriano. En determinadas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a BCMA, CLL-1 o FLT3. En realizaciones adicionales, la molécula de unión al antígeno es un fragmento de anticuerpo que se une específicamente al antígeno, incluyendo una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del mismo. En realizaciones adicionales, la molécula de unión al antígeno es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno comprende o consta de avímeros.
Como se usa en este documento, el término "región variable" o "dominio variable" se usa indistintamente y son comunes en la técnica. La región variable se refiere típicamente a una porción de un anticuerpo, generalmente, una porción de una cadena ligera o pesada, típicamente alrededor de los 110 a 120 aminoácidos aminoterminales en la cadena pesada madura y alrededor de 90 a 115 aminoácidos en la cadena ligera madura, que difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se denominan regiones marco (FR). Sin desear limitarse a ningún mecanismo o teoría particular, se cree que las CDR de las cadenas ligera y pesada son las principales responsables de la interacción y especificidad del anticuerpo con el antígeno. En determinadas formas de realización, la región variable es una región variable humana. En determinadas formas de realización, la región variable comprende CDR de roedor o murino y regiones marco humanas (FR). En realizaciones particulares, la región variable es una región variable de primates (por ejemplo, primates no humanos). En determinadas realizaciones, la región variable comprende CDR de roedor o murino y regiones marco (FR) de primates (por ejemplo, primates no humanos).
Los términos "VL" y "dominio VL" se usan indistintamente para referirse a la región variable de cadena ligera de un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo.
Los términos "VH" y "dominio VH" se usan indistintamente para referirse a la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo.
Se utilizan comúnmente varias definiciones de los CDR: numeración de Kabat, numeración de Chothia, numeración de AbM o numeración de contacto. La definición de AbM es un compromiso entre los dos utilizados por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. La definición de contacto se basa en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles.
Tabla 1. Numeración de CDR
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El término "numeración de Kabat" y términos similares se reconocen en la técnica y se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una molécula de unión a antígeno del mismo. En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (véase, por ejemplo, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 y Kabat EAet al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).Usando el sistema de numeración de Kabat, las CDR dentro de una molécula de cadena pesada de anticuerpo están típicamente presentes en las posiciones de aminoácidos 31 a 35, que opcionalmente pueden incluir uno o dos aminoácidos adicionales, después de 35 (referidos en el esquema de numeración de Kabat como 35A y 35B). (CDR1), posiciones de aminoácidos 50 a 65 (CDR2) y posiciones de aminoácidos 95 a 102 (CDR3). Usando el sistema de numeración de Kabat, las CDR dentro de una molécula de cadena ligera de anticuerpo están típicamente presentes en las posiciones de aminoácidos 24 a 34 (CDR1), las posiciones de aminoácidos 50 a 56 (CDR2) y las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (CDR3). En una realización específica, las CDR de los anticuerpos descritos en este documento se han determinado según el esquema de numeración de Kabat.
En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia, que se refiere a la ubicación de los bucles estructurales de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; y Patente de Estados Unidos No. 7,709,226). Normalmente, cuando se utiliza la convención de numeración de Kabat, el bucle Chothia CDR-H1 está presente en los aminoácidos 26 a 32, 33 o 34 de la cadena pesada, el bucle Chothia CDR-H2 está presente en los aminoácidos 52 a 56 de la cadena pesada y el El bucle de Chothia CDR-H3 está presente en los aminoácidos de cadena pesada 95 a 102, mientras que el bucle de Chothia CDR-L1 está presente en los aminoácidos de cadena ligera 24 a 34, el bucle de Chothia CDR-L2 está presente en los aminoácidos de cadena ligera 50 a 56, y el bucle Chothia CDR-L3 está presente en los aminoácidos de la cadena ligera 89 a 97. El final del bucle Chothia CDR-HI cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 dependiendo de la longitud del bucle (esto es porque el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si ni 35A ni 35B están presentes, el bucle termina en 32; si solo hay 35A, el bucle termina en 33; si tanto 35A como 35B están presentes, el bucle termina en 34). En una realización específica, las CDR de los anticuerpos descritos en este documento se han determinado según el esquema de numeración de Chothia.
Como se usan en este documento, los términos "región constante" y "dominio constante" son intercambiables y tienen un significado común en la técnica. La región constante es una porción de anticuerpo, por ejemplo, una porción carboxilo terminal de una cadena ligera y/o pesada que no está involucrada directamente en la unión de un anticuerpo al antígeno pero que puede exhibir varias funciones efectoras, tales como interacción con el receptor Fc. La región constante de una molécula de inmunoglobulina generalmente tiene una secuencia de aminoácidos más conservada en relación con un dominio variable de inmunoglobulina.
Como se usa en este documento, el término "cadena pesada" cuando se usa en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, alfa (a), delta (8), épsilon (£), gamma (y) y mu (|j), basados en la secuencia de aminoácidos del dominio constante, que dan lugar a clases de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluyendo subclases de IgG, por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3 e IgG4.
Como se usa en este documento, el término "cadena ligera" cuando se usa en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, kappa (k) o lambda (A) basado en la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera son bien conocidas en la técnica. En realizaciones específicas, la cadena ligera es una cadena ligera humana.
"Afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en este documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente se puede representar mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir y/o expresar de varias formas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, constante de disociación de equilibrio (Kd) y constante de asociación de equilibrio (Ka). El Kd se calcula a partir del cociente de kddesactivado/kactivado, mientras que Ka se calcula a partir del cociente de kactivado/kdesactivado. kactivado se refiere a la constante de velocidad de asociación de, por ejemplo, un anticuerpo a un antígeno, y kdesactivado se refiere a la disociación de, por ejemplo, un anticuerpo a un antígeno. kactivado y kdesactivado se pueden determinar mediante técnicas conocidas por un experto en la técnica, tales como BIACORE® o KinExA.
Como se usa en el presente documento, una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). En ciertas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos dentro de una(s) CDR o dentro de una(s) región(es) marco de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno del mismo pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar.
Como se usa en este documento, el término "heterólogo" significa de cualquier fuente distinta a las secuencias de origen natural. Por ejemplo, una secuencia heteróloga incluida como parte de una proteína coestimuladora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, por ejemplo, La correspondiente proteína coestimuladora humana, son aminoácidos que no ocurren naturalmente como, es decir, no se alinean con, la proteína coestimuladora humana de tipo salvaje. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos heteróloga se refiere a una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia que codifica la proteína coestimuladora humana de tipo salvaje.
Como se usa en el presente documento, un "epítopo" es un término en la técnica y se refiere a una región localizada de un antígeno a la que un anticuerpo puede unirse específicamente. Un epítopo puede ser, por ejemplo, aminoácidos contiguos de un polipéptido (epítopo lineal o contiguo) o un epítopo puede, por ejemplo, venir juntos de dos o más regiones no contiguas de un polipéptido o polipéptidos (conformacional, no lineal, epítopo discontinuo o no contiguo). En determinadas realizaciones, el epítopo al que se une un anticuerpo se puede determinar mediante, por ejemplo, espectroscopía de RMN, estudios de cristalografía por difracción de rayos X, ensayos de ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio acoplado con espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas por electroaspersión con cromatografía líquida), matriz ensayos de exploración de oligopéptidos basados en y/o mapeo de mutagénesis (por ejemplo, mapeo de mutagénesis dirigida al sitio). Para la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Los cristales de anticuerpo:antígeno se pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden refinar usando software de ordenador como X-PLOR (Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.; véase por ejemplo Meth Enzymol (1985) volúmenes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S. 2004/0014194), and BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Los estudios de mapeo de mutagénesis se pueden realizar usando cualquier método conocido por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 y Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 para una descripción de técnicas de mutagénesis, incluyendo técnicas de mutagénesis por barrido de alanina.
Como se usa en este documento, una molécula de unión a antígeno, un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo "compite de forma cruzada" con un anticuerpo de referencia o una molécula de unión a antígeno del mismo si la interacción entre un antígeno y la primera molécula de unión, un anticuerpo, o una molécula de unión a antígeno del mismo bloquea, limita, inhibe o reduce de otro modo la capacidad de la molécula de unión de referencia, el anticuerpo de referencia o una molécula de unión a antígeno del mismo para interactuar con el antígeno. La competencia cruzada puede ser completa, por ejemplo, la unión de la molécula de unión al antígeno bloquea completamente la capacidad de la molécula de unión de referencia para unirse al antígeno, o puede ser parcial, por ejemplo, la unión de la molécula de unión al antígeno reduce la capacidad de la molécula de unión de referencia para unir el antígeno. En determinadas realizaciones, una molécula de unión a antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión a antígeno de referencia se une al mismo epítopo o un epítopo superpuesto que la molécula de unión a antígeno de referencia. En otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión a antígeno de referencia se une a un epítopo diferente como molécula de unión a antígeno de referencia. Se pueden usar numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una molécula de unión a antígeno compite con otra, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA); inmunoensayo enzimático directo o indirecto en fase sólida (EIA); ensayo de competición en sándwich (Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA biotina-avidina directa en fase sólida (Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619); ensayo de etiquetado directo en fase sólida, ensayo sándwich de etiquetado directo en fase sólida (Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de etiquetado directo de fase sólida con etiqueta 1-125 (Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); EIA biotina-avidina directa en fase sólida (Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); y etiquetado directo RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82).
Como se usa en este documento, los términos "se une inmunoespecíficamente", "reconoce inmunoespecíficamente", "se une específicamente" y "reconoce específicamente" son términos análogos en el contexto de anticuerpos y se refieren a moléculas que se unen a un antígeno (por ejemplo, epítopo o complejo inmune) tal como dicha unión es entendida por un experto en la técnica. Por ejemplo, una molécula que se une específicamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos, generalmente con menor afinidad determinada, por ejemplo, inmunoensayos, BIACORE®, instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID) u otros ensayos conocidos en el arte. En una realización específica, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno se unen al antígeno con un Ka que es al menos 2 logaritmos, 2.5 logaritmos, 3 logaritmos, 4 logaritmos o mayor que el Ka cuando las moléculas se unen a otro antígeno.
En otra realización, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno se unen con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 1 x 10'7 M. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une específicamente a un antígeno con "alta afinidad" cuando la Kd es aproximadamente 1 x 10'9 M a aproximadamente 5 x 10'9 M. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une específicamente a un antígeno con "afinidad muy alta" cuando la Kd es de 1 x 10'1° M a aproximadamente 5 x 10'1° M. En una realización, la molécula de unión al antígeno tiene una Kd de 10'9 M. En una realización, la tasa de desviación es menor de aproximadamente 1 x 10'5 M. En otras realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une al BCMA humano con una Kd de entre aproximadamente 1 x 10'7 M y aproximadamente 1 x 10'13 M. En otra realización más, la molécula de unión al antígeno se une al BCMA humano con una Kd de aproximadamente 1 x 10'10 M hasta aproximadamente 5 x 10'10 M.
En una realización específica, aquí se proporciona un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno humano diana, por ejemplo, BCMA humana o CLL-1 humana, con mayor afinidad que a otra especie del antígeno diana, por ejemplo, un antígeno no diana. -BCMA humana o una CLL-1 no humana. En determinadas realizaciones, se proporciona aquí un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo que se une al antígeno humano diana, por ejemplo, BCMA humana o CLL-1 humana, con un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o mayor afinidad que con otra especie del antígeno diana medida por, por ejemplo, un radioinmunoensayo, resonancia de plasmón de superficie, o ensayo de exclusión cinética. En una realización específica, un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo descrito en este documento, que se une a un antígeno humano diana, se unirá a otra especie del antígeno diana con menos del 10%, 15% o 20% de la unión del anticuerpo o una molécula de unión de antígeno del mismo al antígeno humano medido mediante, por ejemplo, un radioinmunoensayo, resonancia de plasmón superficial o ensayo de exclusión cinética.
Un "antígeno" se refiere a cualquier molécula que provoque una respuesta inmune o que sea capaz de unirse a un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno. La respuesta inmune puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. Un experto en la técnica comprenderá fácilmente que cualquier macromolécula, incluidas prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Un antígeno puede expresarse de forma endógena, es decir, expresarse mediante ADN genómico, o puede expresarse de manera recombinante. Un antígeno puede ser específico para un determinado tejido, como una célula cancerosa, o puede expresarse de forma amplia. Además, los fragmentos de moléculas más grandes pueden actuar como antígenos. En una realización, los antígenos son antígenos tumorales. En una realización particular, el antígeno es todo o un fragmento de BCMA, FLT3 o CLL-1.
El término "neutralizante" se refiere a una molécula de unión a antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une a un ligando y previene o reduce el efecto biológico de ese ligando. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo, bloquea directamente un sitio de unión en el ligando o altera de otro modo la capacidad del ligando para unirse a través de medios indirectos (como alteraciones estructurales o energéticas en el ligando). En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo evita que la proteína a la que está unida realice una función biológica.
Como se usa en el presente documento, el término "BCMA" se refiere al antígeno de maduración de células B, que puede incluir, pero no se limita a, BCMA nativo, una isoforma de BCMA o un homólogo de BCMA entre especies de BCMA. El Bc Ma (también conocido como TNFRSF17, CD269 y TNFRSF13A) es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF). BCMA se expresa en la superficie de células de mieloma múltiple, mientras que está muy restringido a células plasmáticas y a un subconjunto de células B maduras en tejido sano. La secuencia de aminoácidos de BCMA humana (hBCMA) se proporciona en NCBI Acceso Q02223.2 (GI:313104029). Como se usa en el presente documento, BCMA incluye Bc Ma humano y homólogos de BCMA no humano, así como variantes, fragmentos o formas modificadas post-transnacionalmente de los mismos, que incluyen, pero no se limitan a, formas glicosiladas de BCMA ligadas a N y O. Las proteínas de BCMA pueden incluir además fragmentos que comprenden todo o una parte del dominio extracelular de BCMA (por ejemplo, todos o una parte de los aminoácidos 1-54 de hBCMA).
Como se usa en este documento, el término "CLL-1" se refiere a la molécula 1 similar a lectina de tipo C, que puede incluir, pero no se limita a, CLL-1 nativa, una isoterma de CLL-1 o una CLL-1 interespecie. homólogo de c LL-1. CLL-1 (también conocido como miembro A de la familia 12 del dominio de lectina de tipo C, CLEC12A, lectina 2 asociada a células dendríticas, DCAL-2, receptor de tipo lectina de tipo C inhibidor mieloide y MICL) es un receptor de superficie celular que modula cascadas de señalización y media en la fosforilación de tirosina de las MAP quinasas diana. La expresión de CLL-1 se observa, por ejemplo, en células de leucemia mieloide aguda (AML). La secuencia de aminoácidos de CLL-1 humana (hCLL-1) se proporciona en UniProtKB/Swiss-Prot N° de Acceso Q5QGZ9.3 (GI: 308153619). Como se usa en el presente documento, CLL-1 incluye CLL-1 humano y homólogos de CLL-1 no humano, así como variantes, fragmentos o formas modificadas post-translacionalmente de los mismos, que incluyen, pero no se limitan a, formas glicosiladas de CLL-1 ligadas a N- y O-.
Como se usa en el presente documento, el término "FLT3" se refiere a tirosina quinasa 3 similar a Fms (FLT-3), que puede incluir, pero no se limita a, FLT3 nativo, una isoforma de FLT3, o un homólogo de FLT3 entre especies de FLT3. FLT3 (también conocido como Aglomeración de antígeno de diferenciación 135 (CD135), tirosina-proteína quinasa tipo receptor FLT3, tirosina quinasa 3 relacionada con FMS, tirosina quinasa 1 de células madre, receptor de citoquina FL, receptor de factor de crecimiento tirosina quinasa tipo III, STK1, o quinasa de hígado fetal-2 (Flk2)) es un receptor de citoquina que pertenece al receptor de tirosina quinasa de clase III. CD135 es el receptor del ligando de citoquina Flt3 (FLT3L). FLT3 se expresa en la superficie de diversas células progenitoras hematopoyéticas y en la superficie de células de leucemia mieloide aguda (AML). La secuencia de aminoácidos de FLT3 humano (hFLT3) se proporciona en UniProtKB/Swiss-Prot Acceso No. P36888 (GI: 156630887). Como se usa en el presente documento, FLt 3 incluye FLT3 humano y homólogos de FLT3 no humanos, así como variantes, fragmentos o formas modificadas posttransnacionalmente de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, formas glicosiladas de FLT3 ligadas a N- y O-.
El término "autólogo" se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que se volverá a introducir posteriormente. Por ejemplo, el método de terapia de células autólogas diseñadas (eACT™) descrito en este documento implica la recolección de linfocitos de un paciente, que luego se diseñan para expresar, por ejemplo, un constructo CAR, y luego se administran de nuevo al mismo paciente.
El término "alogénico" se refiere a cualquier material derivado de un individuo que luego se introduce en otro individuo de la misma especie, por ejemplo, trasplante alogénico de células T.
Los términos "transducción" y "transducido" se refieren al proceso mediante el cual se introduce ADN extraño en una célula a través de un vector viral (véase Jones et al., "Genetics: principles and analysis," Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)). En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral de vaccinia, un vector viral de herpes simple, un adenovirus vector asociado, un vector lentivírico o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en este documento, el término "truncado" se refiere a cualquier cosa menor que la totalidad. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos del dominio bisagra truncado (denominada alternativamente en el presente documento "THD") puede incluir cualquier secuencia de aminoácidos más corta que el dominio bisagra completo o de longitud completa ("CHD"). En algunas realizaciones, un THD consiste esencialmente en o consiste en los aminoácidos 118­ 152, 119-152, 120-152, 121-152, 122-152, 123-152, 124-152, 125-152, 126-152, 127-152, 128-152, 129-152 o 130­ 152, de SEQ ID NO: 1. En una realización, el THD consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que consiste de aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1.
Un "cáncer" se refiere a un amplio grupo de diversas enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de células anormales en el cuerpo. La división y el crecimiento celular no regulados dan como resultado la formación de tumores malignos que invaden los tejidos vecinos y también pueden hacer metástasis en partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. Un "cáncer" o "tejido canceroso" puede incluir un tumor. Ejemplos de cánceres que se pueden tratar mediante los métodos de la presente enseñanza incluyen, pero no se limitan a, cánceres del sistema inmunológico que incluyen linfoma, leucemia, mieloma y otras neoplasias malignas de leucocitos. En algunas realizaciones, los métodos de la presente enseñanza pueden usarse para reducir el tamaño tumoral de un tumor derivado de, por ejemplo, cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, mieloma múltiple, Enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBC), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma folicular transformado, linfoma esplénico de la zona marginal (SMZL), cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula paratiroidea, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer del pene, leucemia aguda o crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda (LLA) (incluida la LLA no de células T), leucemia linfocítica crónica (LLC), tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga , cáncer de riñón o uréter, carcinoma de pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma de tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos por el medio ambiente, incluidos los inducidos por asbesto, otras neoplasias malignas de células B y combinaciones de dichos cánceres. En una realización particular, el cáncer es mieloma múltiple. El cáncer particular puede responder a quimioterapia o radioterapia o el cáncer puede ser refractario. Un cáncer refractario se refiere a un cáncer que no se puede corregir con una intervención quirúrgica y el cáncer inicialmente no responde a quimioterapia o radioterapia o el cáncer deja de responder con el tiempo.
Un "efecto antitumoral" como se usa en este documento, se refiere a un efecto biológico que puede presentarse como una disminución en el volumen del tumor, una disminución en el número de células tumorales, una disminución en la proliferación de células tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento en la supervivencia general o libre de progresión, un aumento en la esperanza de vida o una mejoría de varios síntomas fisiológicos asociados con el tumor. Un efecto antitumoral también puede referirse a la prevención de la aparición de un tumor, por ejemplo, una vacuna.
Una "citoquina", como se usa en este documento, se refiere a una proteína que no es un anticuerpo que es liberada por una célula en respuesta al contacto con un antígeno específico, en donde la citoquina interactúa con una segunda célula para mediar una respuesta en la segunda célula. Una citoquina puede ser expresada de forma endógena por una célula o administrada a un sujeto. Las citoquinas pueden ser liberadas por las células inmunitarias, incluidos los macrófagos, las células B, las células T y los mastocitos para propagar una respuesta inmunitaria. Las citoquinas pueden inducir diversas respuestas en la célula receptora. Las citoquinas pueden incluir citoquinas homeostáticas, quimioquinas, citoquinas proinflamatorias, efectores y proteínas de fase aguda. Por ejemplo, las citoquinas homeostáticas, incluidas la interleucina (IL) 7 e IL-15, promueven la supervivencia y proliferación de las células inmunitarias, y las citoquinas proinflamatorias pueden promover una respuesta inflamatoria. Ejemplos de citoquinas homeostáticas incluyen, entre otros, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15 e interferón (IFN) gama. Ejemplos de citoquinas proinflamatorias incluyen, pero no se limitan a, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-13, IL-17a, factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa, TNF-beta, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 2, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), molécula de adhesión intercelular soluble 1 (sICAM-1), molécula de adhesión vascular soluble 1 (sVCAM-1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-C, VEGF-D y factor de crecimiento placentario (PLGF). Ejemplos de efectores incluyen, pero no se limitan a, granzima A, granzima B, ligando Fas soluble (sFasL) y perforina. Ejemplos de proteínas de fase aguda incluyen, pero no se limitan a, proteína C reactiva (CRP) y amiloide A sérico (SAA).
Las "quimioquinas" son un tipo de citoquina que media la quimiotaxis celular o el movimiento direccional. Ejemplos de quimioquinas incluyen, entre otros, IL-8, IL-16, eotaxina, eotaxina-3, quimioquinas derivadas de macrófagos (MDC o CCL22), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1 o CCL2), MCP-4, proteína inflamatoria de macrófagos 1a (M1P-1a, MIP-1a), MIP-1p (MIP-1b), proteína 10 inducida por gamma (IP-10), y quimioquina regulada por timo y activación (TARC o CCL17).
Una "cantidad terapéuticamente efectiva", "dosis efectiva", "cantidad efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva" de un agente terapéutico, por ejemplo, células CAR T modificadas genéticamente, es cualquier cantidad que, cuando se usa sola o en combinación con otro agente terapéutico , protege a un sujeto contra la aparición de una enfermedad o promueve la regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico para promover la regresión de la enfermedad se puede evaluar usando una variedad de métodos conocidos por el médico experto, como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelos animales que predicen la eficacia en humanos, o ensayando la actividad del agente en ensayos in vitro.
El término "linfocito", como se usa en el presente documento, incluye células asesinas naturales (NK), células T o células B. Las células NKson un tipo de linfocitos citotóxicos (tóxicos para las células) que representan un componente principal del sistema inmunológico inherente. Las células NK rechazan los tumores y las células infectadas por virus. Funciona mediante el proceso de apoptosis o muerte celular programada. Se les denominó "asesinos naturales" porque no requieren activación para matar células. Las células T juegan un papel importante en la inmunidad mediada por células (sin participación de anticuerpos). Sus receptores de células T (TCR) se diferencian de otros tipos de linfocitos. El timo, un órgano especializado del sistema inmunológico, es el principal responsable de la maduración de las células T. Hay seis tipos de células T, a saber: células T Auxiliares (por ejemplo, Células CD4+), células T citotóxicas (también conocidas como TC, linfocitos T citotóxicos, CTL, células T asesinas, células T citolíticas, CD8+ T- células T asesinas), células T de memoria ((i) células Tscm de memoria madre, como las células vírgenes, son CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-selectina), CD27+, CD28+ e IL-7Ra+, pero también expresan grandes cantidades de CD95, IL-2Rp, CXCR3 y LFA-1, y muestran numerosos atributos funcionales distintivos de las células de memoria); (ii) las células Tcm de memoria central expresan L-selectina y CCR7, secretan IL-2, pero no IFNy o IL-4, y (iii) las células Tem de memoria efectora, sin embargo, no expresan L-selectina o CCR7 pero producen citoquinas efectoras como IFNy e IL-4), células T reguladoras (Treg, células T supresoras o células T reguladoras CD4+CD25 ), células T Asesinas Naturales (NKT) y células T Gamma Delta. Las células B, por otro lado, juegan un papel principal en la inmunidad humoral (con participación de anticuerpos). Produce anticuerpos y antígenos y desempeña el papel de células presentadoras de antígeno (APC) y se convierte en células B de memoria después de la activación por interacción del antígeno. En los mamíferos, las células B inmaduras se forman en la médula ósea, de donde se deriva su nombre.
El término "diseñado genéticamente" o "diseñado" se refiere a un método para modificar el genoma de una célula, que incluye, entre otros, eliminar una región codificante o no codificante o una parte de la misma o insertar una región codificante o una parte de la misma. En algunas realizaciones, la célula que se modifica es un linfocito, por ejemplo, una célula T, que puede obtenerse de un paciente o de un donante. La célula puede modificarse para expresar un constructo exógeno, como, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR), que se incorpora al genoma de la célula.
Una "respuesta inmune" se refiere a la acción de una célula del sistema inmune (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, células asesinas naturales (NK), macrófagos, eosinófilos, mastocitos, células dendríticas y neutrófilos) y macromoléculas solubles producidas por cualquiera de estas células o el hígado (incluidos Abs, citoquinas y complemento) que resulte en un ataque selectivo, unión, daño, destrucción y/o eliminación del cuerpo de un vertebrado de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos. células cancerosas u otras células anormales o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.
El término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento de un sujeto que padece, o está en riesgo de contraer o sufrir una recurrencia de una enfermedad mediante un método que comprende inducir, potenciar, suprimir o modificar de otro modo una respuesta inmune. Ejemplos de inmunoterapia incluyen, pero no se limitan a, terapias con células T. La terapia con células T puede incluir terapia con células T adoptivas, inmunoterapia con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), terapia con células autólogas, terapia con células autólogas modificadas (eACT™) y trasplante alogénico de células T. Sin embargo, un experto en la técnica reconocería que los métodos de acondicionamiento divulgados en este documento mejorarían la eficacia de cualquier terapia de células T trasplantadas. Se describen ejemplos de terapias con células T en las publicaciones de Patente de Estados Unidos Números 2014/0154228 y 2002/0006409, Patente de Estados Unidos No. 5,728,388 y Publicación Internacional No. WO 2008/081035.
Las células T de la inmunoterapia pueden provenir de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, las células T se pueden diferenciar in vitro de una población de células madre hematopoyéticas, o las células T se pueden obtener de un sujeto. Las células T pueden obtenerse, por ejemplo, de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón, tejido de timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido de bazo y tumores. Además, las células T pueden derivarse de una o más líneas de células T disponibles en la técnica. Las células T también pueden obtenerse de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la materia, tales como separación y/o aféresis FICOLL™. En la publicación de Patente de Estados Unidos No. 2013/0287748 se describen métodos adicionales de aislamiento de células T para una terapia con células T.
El término "Terapia de Células Autólogas diseñadas", que puede abreviarse como "eACT™", también conocido como transferencia de células adoptivas, es un proceso mediante el cual se recolectan las propias células T de un paciente y, posteriormente, se modifican genéticamente para reconocer y atacar uno o más antígenos. expresado en la superficie celular de una o más células tumorales específicas o neoplasias. Las células T pueden diseñarse para expresar, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos (CAR) o receptores de células T (TCR). Las células T CAR positivas (+) se diseñan para expresar un fragmento variable extracelular de cadena sencilla (scFv) con especificidad por un antígeno tumoral particular unido a una parte de señalización intracelular que comprende al menos un dominio coestimulador y al menos un dominio activador. El dominio coestimulador puede derivarse de un dominio coestimulador de origen natural, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma, por ejemplo, una variante que tiene un dominio de bisagra truncado ("THD"), y el dominio de activación puede derivarse de, por ejemplo, CD3-zeta. En determinadas realizaciones, el CAR está diseñado para tener dos, tres, cuatro o más dominios coestimuladores. El CAR scFv puede diseñarse para dirigirse, por ejemplo, a CD19, que es una proteína transmembrana expresada por células en el linaje de células B, incluidas todas las células B normales y las neoplasias malignas de células B, incluidas, entre otras, células NHL, CLL ALL no T. En algunas realizaciones, el CAR está diseñado de manera que el dominio coestimulador se exprese como una cadena polipeptídica separada. Ejemplos de terapias y constructos de células T con CAR se describen en las Publicaciones de Patente de Estados Unidos Números 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309 y 2014/0050708.
Un "paciente", como se usa en el presente documento, incluye a cualquier ser humano que padece un cáncer (por ejemplo, un linfoma o una leucemia). Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento.
Como se usa en este documento, el término "célula in vitro" se refiere a cualquier célula que se cultiva ex vivo. En particular, una célula in vitro puede incluir una célula T.
Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un compuesto compuesto por residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o péptido contiene al menos dos aminoácidos y no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Como se usa en este documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, y a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica proteínas, de las cuales hay muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.
Estimulación, como se usa en el presente documento, se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimulante con su ligando afín, en donde la unión media un evento de transducción de señales. Una "molécula estimulante" es una molécula en una célula T, por ejemplo, el complejo receptor de células T (TCR)/CD3, que se une específicamente con un ligando estimulador análogo presente en una célula presente en antígeno. Un "ligando estimulante" es un ligando que cuando está presente en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una APC, una célula dendrítica, una célula B y similares) puede unirse específicamente con una molécula estimulante en una célula T, mediando así una respuesta primaria de la célula T, que incluye, pero no se limita a, activación, iniciación de una respuesta inmune, proliferación y similares. Los ligandos estimuladores incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-CD3 (tal como OKT3), una molécula de MHC Clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD2 superagonista y un anticuerpo anti-CD28 superagonista.
Una "señal coestimuladora", como se usa en este documento, se refiere a una señal, que en combinación con una señal primaria, como la ligadura de TCR/CD3, conduce a una respuesta de células T, como, pero no limitado a, proliferación y/o regulación positiva o regulación a la baja de moléculas clave.
Un "ligando coestimulador" como se usa en el presente documento, incluye una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora análoga en una célula T. La unión del ligando coestimulador proporciona una señal que media una respuesta de células T, que incluye, pero no se limita a, proliferación, activación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador induce una señal que se suma a la señal primaria proporcionada por una molécula estimulante, por ejemplo, mediante la unión de un complejo receptor de células T (TCR)/CD3 con una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) cargada con péptido. Un ligando coestimulador puede incluir, entre otros, 3/TR6, ligando 4-1BB, agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligando CD30, CD40 , CD7, CD70, CD83, mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), antígeno leucocitario humano G (HLA-G), ILT4, transcrito similar a inmunoglobulina (ILT) 3, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM) ), ligando que se une específicamente con B7-H3, receptor de linfotoxina beta, proteína A relacionada con la cadena del MHC clase I (MICA), proteína B relacionada con la cadena del MHC clase I (MICB), ligando OX40, PD-L2 o muerte programada (PD) L1. Un ligando coestimulador incluye, sin limitación, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en una célula T, como, entre otros, 4-1BB, B7-H3, CD2, CD27, CD28, CD30 CD40, CD7, ICOS, ligando que se une específicamente con CD83, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), receptor C de células asesinas naturales (NKG2C), OX40, PD-1 o miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF14 o LIGHT).
Una "molécula coestimuladora" es una pareja de unión análoga en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por parte de la célula T, tal como, pero sin limitarse a, la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una "molécula coestimuladora" que es una asociada de unión análoga en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por la célula T, como, entre otros, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, entre otras, 4-1BB/CD137, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD33, CD45, CD100 (SEMA4D), CD103, CD134, CD137, CD154, CD16, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD22, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 (alfa; beta; delta; epsilon; gamma; zeta), CD30, CD37, CD4 , CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD5, CD64, CD69, CD7, CD80, ligando CD83, CD84, CD86, CD8alfa, CD8beta, CD9, CD96 (Táctil), CD1-1a, CD1-1b, CD1-1c , CD1-1d, CDS, CEACAM1, CRT AM, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor gamma Fc, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, ICOS, Ig alfa (CD79a ), IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, integrina, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, LIGHT, LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1 (CD1 1a/CD18), molécula del MHC de clase I, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 , NKp80 (KLRF1), OX40, PAG/Cbp, P D-1, PSGL1, SELPLG (CD162), molécula de activación linfocítica de señalización, SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, TNF, TNFr, TNFR2, Receptor de ligando de peaje, TRANCE/RANKL, VLA1 o VLA-6, o fragmentos, truncamientos o combinaciones de los mismos.
Los términos "reducir" y "disminuir" se usan indistintamente en este documento e indican cualquier cambio que sea menor que el original. "Reducir" y "disminuir" son términos relativos que requieren una comparación entre las mediciones previas y posteriores. "Reducir" y "disminuir" incluyen agotamientos completos.
"Tratamiento" o "tratar" de un sujeto se refiere a cualquier tipo de intervención o proceso realizado en, o la administración de un agente activo al sujeto con el objetivo de revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o prevenir el inicio, progresión, desarrollo, gravedad o recurrencia de un síntoma, complicación o afección, o indicios bioquímicos asociados con una enfermedad. En una realización, "tratamiento" o "tratar" incluye una remisión parcial. En otra realización, "tratamiento" o "tratar" incluye una remisión completa.
Para calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean típicamente de una manera que da la mayor coincidencia entre las secuencias. Un ejemplo de un programa informático que se puede utilizar para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas g Cg , que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, Wis.). El algoritmo informático GAP se utiliza para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para un emparejamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos o nucleótidos (el "intervalo emparejado", según lo determinado por el algoritmo). En ciertas realizaciones, una matriz de comparación estándar (véase, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix) también es utilizado por el algoritmo.
Diversos aspectos de la enseñanza se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.
I. Receptores de antígenos quiméricos y receptores de células T
Los receptores de antígenos quiméricos (CAR o CAR-Ts) y los receptores de células T (TCR) son receptores modificados genéticamente. Estos receptores diseñados pueden insertarse y expresarse fácilmente en células inmunitarias, incluidas las células T, de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica. Con un CAR, se puede programar un solo receptor para reconocer un antígeno específico y, cuando se une a ese antígeno, activar la célula inmunitaria para atacar y destruir la célula que lleva ese antígeno. Cuando estos antígenos existen en las células tumorales, una célula inmunitaria que expresa el CAR puede atacar y destruir la célula tumoral.
Un aspecto de la presente enseñanza está dirigido a polinucleótidos que codifican receptores de antígenos quiméricos (CAR) o receptores de células T (TCR) que comprenden un dominio coestimulador que comprende un nuevo dominio extracelular que comprende un dominio de bisagra truncado ("THD") y células T modificadas genéticamente que comprenden un dominio coestimulador que comprende el nuevo THD. El dominio coestimulador puede comprender además un dominio transmembrana y/o un dominio intracelular. En algunas realizaciones, un CAR o TCR codificado por el polinucleótido de la presente enseñanza comprende además una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno diana. En algunas realizaciones, el CAR o TCR codificado por el polinucleótido comprende además un dominio de activación. En una realización particular, el CAR o TCR codificado por el polinucleótido comprende (i) una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno diana, (ii) un dominio coestimulador que comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular, y (iii) un dominio de activación, en donde el dominio extracelular comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un THD descrito en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, una orientación de los CAR de acuerdo con las enseñanzas comprende un dominio de unión a antígeno (tal como scFv) en tándem con un dominio coestimulador y un dominio activador. El dominio coestimulador puede comprender una o más de una porción extracelular, una porción transmembrana y una porción intracelular. En otras realizaciones, se pueden utilizar múltiples dominios coestimuladores en tándem.
I.A. Dominio Coestimulador
Los receptores de antígenos quiméricos incorporan dominios coestimuladores (de señalización) para aumentar su potencia. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nos. 7,741,465 y 6,319,494, así como Krause et al. and Finney et al. (supra), Song et al., Blood 119:696-706 (2012); Kalos et al., Sci Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011), y Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016). La proteína coestimuladora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 es una proteína coestimuladora que se encuentra naturalmente en las células T. La secuencia de aminoácidos nativa completa de esta proteína coestimuladora se describe en NCBI Secuencia de Referencia: NP_006130.1. Véase la Figura 1A. La secuencia de ácido nucleico nativa completa de esta proteína coestimuladora se describe en la Secuencia de Referencia NCBI: NM_006139.1.
Nuevo Dominio Extracelular: la presente divulgación muestra que un nuevo dominio extracelular de una proteína coestimuladora y que comprende un dominio de bisagra truncado ("THD") puede mejorar una o más propiedades de un CAR o un TCR. En algunas realizaciones, el dominio THD es una versión truncada de un dominio bisagra completo ("CHD"). En ciertas realizaciones, el polinucleótido aislado que codifica una THD comprende (i) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idénticos a los aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1, donde el dominio THD no contiene los aminoácidos 1 a 122 de SEQ ID NO: 1.
En otras realizaciones, la THD consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idénticos a los aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, la THD consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97% , al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntico a la SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, el polinucleótido aislado que codifica un THD consiste esencialmente en o consiste en (i) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idénticos a los aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1 y (ii) opcionalmente ± un aminoácido, ± dos aminoácidos, ± tres aminoácidos, ± cuatro aminoácidos, ± cinco aminoácidos o ± seis aminoácidos. En algunas realizaciones, el polinucleótido aislado que codifica un THD consiste esencialmente en o consiste en (i) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idénticos a los aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1 y (ii) opcionalmente uno o dos aminoácidos, uno a tres aminoácidos, uno a cuatro aminoácidos, uno a cinco aminoácidos o uno a seis aminoácidos. Los uno a seis aminoácidos que se pueden añadir o eliminar de la secuencia de aminoácidos en el THD pueden estar en N-terminal, en el C-terminal, o tanto en el N-terminal como en el C-terminal.
En algunas realizaciones, el polinucleótido aislado que codifica una THD consiste esencialmente en o consiste en (i) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idénticos a los aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1 y (ii) un aminoácido N-terminal adicional, dos aminoácidos N-terminales adicionales, tres aminoácidos N-terminales adicionales, cuatro aminoácidos N-terminales adicionales, cinco aminoácidos N-terminales adicionales o seis aminoácidos N-terminales adicionales.
En algunas realizaciones, los aminoácidos adicionales pueden ser aminoácidos N-terminales. En algunas realizaciones, los aminoácidos adicionales pueden ser heterólogos. En otras realizaciones, los aminoácidos adicionales son parte de la secuencia de proteína coestimuladora de origen natural.
En algunas realizaciones, la THD consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idénticos a los aminoácidos 123 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 122 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 121 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 120 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 119 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 118 a 152 de SEQ ID NO: 1, o aminoácidos 117 a 152 de SEQ ID NO: 1.
En otras realizaciones, la THD consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idénticos a los aminoácidos 124 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 125 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 126 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 127 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 128 a 152 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 129 a 152 de SEQ ID NO: 1, o aminoácidos 130 a 152 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la THD no comprende los aminoácidos 1-116 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la THD no comprende los aminoácidos 1-117 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la THD no comprenden los aminoácidos 1-118 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el THD no comprende los aminoácidos 1-119 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el THD no comprende los aminoácidos 1-120 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la THD no comprende los aminoácidos 1-121 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la THD no comprende los aminoácidos 1-122 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones , la THD no comprende los aminoácidos 1-123 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la THD no comprende los aminoácidos 1-124 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la THD no comprende los aminoácidos 1-125 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el THD no comprende los aminoácidos 1-126 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el THD no comprende los aminoácidos 1-127 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el THD no comprende los aminoácidos 1-128 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el THD no comprende los aminoácidos 1-129 de SEQ ID NO: 1.
La secuencia de aminoácidos correspondiente de THD se expone en SEQ ID NO. 3 LDNEKSNGTI IHVKGKHLCPSPLFPGPSKP. Una secuencia de nucleótidos que codifica la porción extracelular de THD se expone en SEQ ID NO. 2 CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTC TGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCA.
En determinadas realizaciones, el polinucleótido que codifica un dominio coestimulador en un CAR o TCR comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, como mínimo al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntico a SEQ ID NO: 3, donde la secuencia de nucleótidos codifica un THD y donde el CAR o TCR no comprende los aminoácidos 1 a 122 de SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, la THD consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En una realización específica, el polinucleótido que codifica THD consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, la THD comprende además parte o la totalidad de un miembro de la familia de las inmunoglobulinas tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM o un fragmento de las mismas.
En algunas realizaciones, el THD se deriva de un dominio de bisagra completo humano ("CHD"), por ejemplo, de la proteína coestimuladora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, el THD se deriva de un roedor, CHD murino o de primate (por ejemplo, primate no humano) de una proteína coestimuladora. En algunas realizaciones, la THD se deriva de una CHD quimérica de una proteína coestimuladora.
Dominio Transmembrana: el dominio coestimulador para el CAR o TCR de la enseñanza puede comprender además un dominio transmembrana y/o un dominio de señalización intracelular. El dominio transmembrana puede diseñarse para fusionarse con el dominio extracelular del CAR. De manera similar, puede fusionarse con el dominio intracelular del CAR. En una realización, se usa el dominio transmembrana que naturalmente está asociado con uno de los dominios en un CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de membrana de superficie o diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. El dominio transmembrana puede derivarse de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína transmembrana o unida a la membrana. Las regiones transmembrana de uso particular en esta enseñanza pueden derivarse de (es decir, comprender) 4-1BB/CD137, receptores de células NK activadoras, una proteína de inmunoglobulina, B7-H3, BAFFR, b La ME (SLAMF8), BTLA, c D100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f , CD69, CD7, CD84, CD8alfa, CD8beta, CD96 (Táctil), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, receptor de citoquinas, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc gama, GADS, GITR , HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig alfa (CD79a), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, coestimulador inducible de células T (iCo S), integrinas, ITGA4, ITGa 4 , ITg A6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, un ligando que se une específicamente con CD83, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229) , antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1; CD1-1a/CD18), molécula de MHC de clase 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (K LRF1), OX-40, PAG/Cbp, muerte programada-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, proteínas receptoras de TNF, TNFR2, Tn Fs F14, un receptor de ligando Toll, TRANCE/Ra Nk L, VLA1 o VLA-6 , o un fragmento, truncamiento o una combinación de los mismos.
Opcionalmente, los conectores cortos pueden formar enlaces entre cualquiera o algunos de los dominios extracelulares, transmembrana e intracelular del CAR.
En una realización específica, la secuencia de nucleótidos del dominio transmembrana de la proteína coestimuladora se expone en SEQ ID NO. 4: TTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTC TGGGTT
En una realización, el polinucleótido que codifica un dominio transmembrana dentro de un dominio coestimulador comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.
La secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana de la proteína coestimuladora se expone en SEQ ID NO.
5: FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV.
En una realización particular, el dominio transmembrana dentro de un dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
En otra realización, el dominio transmembrana se deriva de (es decir, comprende) CD8. En una realización, la secuencia de nucleótidos del dominio de dominio y de transmembrana extracelular CD8 se expone en la SEQ ID NO: 238
GCTGCAGCATTGAGCAACTCAATAATGTATTTTAGTCACTTTGTACCAGTGTTCTT GCCGGCTAAGCCTACTACCACACCCGCTCCACGGCCACCTACCCCAGCTCCTACC ATCGCTTCACAGCCTCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCTTGCCGACCGGCCGCAGGGG GCGCTGTTCATACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGATATCTATATCTGGGCACC CCTGGCCGGAACCTGCGGCGTACTCCTGCTGTCCCTGGTCATCACGCTCTATTGT AATCACAGGAAC.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica un dominio transmembrana dentro de un dominio coestimulador comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos de el dominio transmembrana CD8.
La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CD8 y del dominio transmembrana se establece en la SEQ ID NO. 239 AAALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVH TRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN.
En una realización particular, el dominio transmembrana dentro de un dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana CD8.
Dominio Intracelular (señalización): El dominio intracelular (señalización) de las células T modificadas genéticamente de la enseñanza puede proporcionar señalización a un dominio activador, que luego activa al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluida la secreción de citoquinas.
En ciertas realizaciones, el dominio de señalización intracelular adecuado incluye (es decir, comprende), pero no se limita a 4-1BB/CD137, receptores de células NK activadoras, una proteína de inmunoglobulina, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 ( SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8alfa, CD8beta, CD96 (táctil), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, receptor de citoquinas, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc gamma, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig alfa (CD79a), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, coestimulador inducible de células T (Ic Os ), integrinas, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, ligando que se une específicamente con CD83, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9 ( CD229), Ly108), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1; CD1-1a/CD18), molécula de MHC de clase 1, NKG2C, NKG2D, NKp3 0, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, muerte programada-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SlAm ), SLAM (s La MF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A, SLAMF7, SLP-76, proteínas receptoras de t Nf , TNFR2, TNFSF14, un receptor de ligando Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 o VLA-6, o una fragmento, truncamiento o una combinación de los mismos.
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de señalización intracelular se expone en SEQ ID NO. 6: AGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGC CGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCG CTGCCTATCGGAGC
En una realización, el polinucleótido que codifica un dominio de señalización intracelular dentro de un dominio coestimulador comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, como mínimo al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6.
Un ejemplo de un dominio de señalización intracelular se expone en SEQ ID NO. 7: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS.
En una realización particular, el dominio de señalización intracelular dentro de un dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, el dominio coestimulador comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el THD extracelular y los dominios transmembrana e intracelular de las proteínas coestimuladoras. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio coestimulador se expone en SEQ ID NO. 240:
CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTC TGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGT GGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCT GGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCC ACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGC
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica un dominio coestimulador comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%. %, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 240, en la que el dominio coestimulador no comprende los aminoácidos 1 a 122 de SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 1 a 121 de SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 1 a 120 de SEQ ID NO : 1, aminoácidos 1 a 119 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 118 de SEQ ID NO: 1, o aminoácidos 1 a 118 de SEQ ID NO: 1.
La secuencia de aminoácidos correspondiente del dominio coestimulador se expone en SEQ ID NO. 241: LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
En algunas realizaciones, el dominio coestimulador comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 241, donde el dominio coestimulador no comprende los aminoácidos 1 a 122 de SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 1 a 121 de SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 1 a 120 de SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 1 a 119 de SEQ ID NO: 1 , los aminoácidos 1 a 118 de SEQ ID NO: 1, o los aminoácidos 1 a 118 de SEQ ID NO: 1.
I.B. Dominio de activación
El CD3 es un elemento del receptor de linfocitos T en los linfocitos T nativos y se ha demostrado que es un elemento activador intracelular importante en los CAR. En una realización, el CD3 es CD3 zeta, cuya secuencia de nucleótidos se establece en SEQ ID NO. 8:
AGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAAC CAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGAC AAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCC CCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTC TGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGT ACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAG CCCTGCCACCTAGG
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica un dominio de activación comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8.
El aminoácido correspondiente de CD3 zeta intracelular se expone en SEQ ID NO. 9: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR
En algunas realizaciones, el dominio de activación comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
En algunas realizaciones, el dominio de activación comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de:
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ
EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP
PR (SEQ ID NO: 251).
I.C. Moléculas de Unión a Antígenos
Los CAR se pueden diseñar para que se unan a un antígeno (como un antígeno de superficie celular) mediante la incorporación de una molécula de unión a antígeno que interactúa con ese antígeno diana. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo de la misma, por ejemplo, uno o más fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla ("scFv"). Un scFv es un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla que tiene las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo unidas entre sí. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nos. 7,741,465 y 6,319,494 así como Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136. Un scFv conserva la capacidad del anticuerpo original para interactuar específicamente con el antígeno diana. Los scFv son útiles en los receptores de antígenos quiméricos porque pueden diseñarse para expresarse como parte de una sola cadena junto con los otros componentes CAR. Identificación. Véase también Krause et al., J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619-626); Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797. Se apreciará que la molécula de unión al antígeno está contenida típicamente dentro de la porción extracelular del CAR de manera que es capaz de reconocer y unirse al antígeno de interés. Los CAR biespecíficos y multiespecíficos se contemplan dentro del alcance de la enseñanza, con especificidad para más de un objetivo de interés.
En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica un CAR o un TCR que comprende un THD de la presente enseñanza y una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno diana. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno tumoral. En algunas realizaciones, el antígeno se selecciona de un antígeno de superficie asociado al tumor, como 5T4, alfafetoproteína (AFP), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), BCMA, B-gonadotropina coriónica humana, CA-125. , antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD123, CD133, CD138, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD4, CD40, CD44, CD56, CD8, CLL-1 , c-Met, antígeno específico de CMV, CSPG4, CTLA-4, disialogangliósido GD2, mucina ductal-epitelial, antígeno específico de VEB, variante III de EGFR (EGFRvIII), ELF2M, endoglina, efrina B2, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), antígeno tumoral epitelial, ErbB2 (HER2/neu), proteína asociada a fibroblastos (fap), FLT3, proteína de unión a folato, GD2, GD3, antígeno asociado a glioma, glucoesfingolípidos, gp36, antígeno específico del VHB, antígeno específico del VHC, HER1-HER2, HER2-HER3 en combinación, HERV-K, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), glicoproteína de la envoltura del VIH-1 gp41, antígeno específico del VPH, transcriptasa inversa de telomerasa humana, receptor IGFI, IGF-II, IL-11Ralfa, IL-13R-a2, antígeno específico del virus de la influenza; CD38, factor de crecimiento de la insulina (IGF1)-1, carboxil esterasa intestinal, cadena kappa, LAGA-la, cadena lambda, antígeno específico del virus Lassa, AFP reactiva a lectina, antígeno específico de linaje o específico de tejido como CD3, MAGE, MAGE -A1, molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que presenta un epítopo peptídico específico del tumor, M-CSF, antígeno asociado a melanoma, mesotelina, mesotelina, MN-CA IX, MUC-1, mut hsp70 -2, p53 mutado, p53 mutado, ras mutado, elastasa de neutrófilos, NKG2D, Nkp30, NY-ESO-1, p53, PAP, prostasa, antígeno específico de prostasa (PSA), antígeno tumoral de carcinoma de próstata-1 (PCTA-1), antígeno prostático específico, prosteína, PSMA, RAGE-1, ROR1, RU1, RU2 (AS), molécula de adhesión superficial, superviviente y telomerasa, TAG-72, el dominio extra A (EDA) y el dominio extra B (EDB) de fibronectina y el dominio Al de tenascina-C (TnC A1), tiroglobulina, antígenos del estroma tumoral, receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), superficie específica del virus a ntígeno tal como un antígeno específico del VIH (tal como VIH gp120), así como cualquier derivado o variante de estos marcadores de superficie. En determinadas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se une específicamente a BCMA. En otras realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une específicamente a CLL-1. En otras realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une específicamente a FLT3.
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se une específicamente a BCMA. En determinadas realizaciones, la molécula de unión al antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 13-20; (b) una v H CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 21-28; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 29-36; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 37-44; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 45-52; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 53-60.
En una realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 13; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.
En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 14; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.
En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 15; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.
En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 16; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 17; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57.
En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 18; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 19; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.
En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 20; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.
En determinadas realizaciones, la molécula de unión al antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 77-84 y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 85-92. En una realización, la molécula de unión a antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85. En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86. En otra realización, la molécula de unión al antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87. En otra realización, la molécula de unión al antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88. En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89. En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende un VH que comprende un aminoácido secuencia de SEC I D NO: 82 y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90. En otra realización, la molécula de unión al antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91. En otra realización, la molécula de unión al antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92.
En una realización particular, el polinucleótido de la presente enseñanza comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% , al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 61-68. En otra realización, el polinucleótido de la presente enseñanza comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69-76.
Se pueden usar otros anticuerpos anti-BCMA o moléculas de unión a antígeno de los mismos conocidos como moléculas de unión a antígeno de un CAR o TCR que comprenden un THD de la presente enseñanza. Ejemplos no limitantes de tales anticuerpos BCMA o molécula de unión a antígeno de los mismos incluyen anticuerpos o moléculas de unión a antígeno descritos en WO2015158671A1, publicado el 22 de Octubre de 2015 y WO2016014565A2, publicado el 28 de Enero de 2016.
En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une específicamente a CLL-1. En determinadas realizaciones, la molécula de unión al antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 93-96; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 97-100; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 101-104; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 105-108; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 109­ 112; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 113-116.
En una realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 93; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.
En una realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 94; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.
En una realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 95; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.
En una realización, la molécula de unión a antígeno comprende (a) una VH CDR1 que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 96; (b) una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 100; (c) una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; (d) una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; (e) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; y/o (f) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116.
En determinadas realizaciones, la molécula de unión al antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQC ID NO: 125-128 y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 129-132. En una realización, la molécula de unión a antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129. En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130. En otra realización, la molécula de unión al antígeno comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131. En otra realización, la molécula de unión a antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132.
En una realización particular, el polinucleótido de la presente enseñanza comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% , al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 117-120. En otra realización, el polinucleótido de la presente enseñanza comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 121-124.
Otros ejemplos de anticuerpos anti-CLL-1 o moléculas de unión a antígeno de los mismos incluyen anticuerpos o moléculas de unión a antígeno descritos en WO2016014535, publicada el 28 de Enero de 2016, y US 2016/0051651 A1, publicada el 25 de Febrero de 2016.
La molécula de unión al antígeno codificada por el polinucleótido de la presente enseñanza puede ser de cadena sencilla o doble. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno es de cadena sencilla. En determinadas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un scFv, un Fab, un Fab', un Fv, un F (ab')2, un dAb y cualquier combinación de los mismos. En una realización particular, la molécula de unión al antígeno comprende un scFv.
En determinadas realizaciones, la molécula de unión al antígeno comprende una cadena sencilla, en la que la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera están conectadas por un enlazador. En algunas realizaciones, el VH está ubicado en el terminal N del enlazador y el VL está ubicado en el terminal C del enlazador. En otras formas de realización, el VL está ubicado en el terminal N del enlazador y el VH está ubicado en el terminal C del enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador comprende al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 13, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 18, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90 o al menos aproximadamente 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende al menos aproximadamente 18 aminoácidos. En ciertas realizaciones, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 12) o la secuencia de aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 237). En una realización, el enlazador es un enlazador Whitlow. En determinadas realizaciones, la molécula de unión comprende una cadena sencilla, en la que la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera están conectadas por un enlazador, donde el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se une a un antígeno diana (por ejemplo, BCMA humano, FLT3 humano o CLL-1 humano) con una Kd de menos de 1 x 10'6 M, menos de 1 x 10'7 M, menos de 1 x 10'8 M, o menos de 1 x 10'9 M. En una realización particular, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno diana (por ejemplo, BCMA humano, FLT3 humano o CLL-1 humano) con una Kd de menos de 1 x 10‘7 M. En otra realización, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno diana (por ejemplo, BCMA humano, FLT3 humano o CLL-1 humano) con una Kd de menos de 1 x 10'8 M. En En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno diana (por ejemplo, BCMA humano, FLT3 humano o CLL-1 humano) con una Kd de aproximadamente 1 x 10'7 M, aproximadamente 2 x 10‘7 M, aproximadamente 3 x 10‘7 M, aproximadamente 4 x 10‘7 M, aproximadamente 5 x 10'7 M, aproximadamente 6 x 10‘7 M, aproximadamente 7x 10‘7 M, aproximadamente 8x 10‘7 M, aproximadamente 9 x 10'7 M, aproximadamente 1 x 10'8 M, aproximadamente 2 x 10'8 M, aproximadamente 3x 10'8 M, aproximadamente 4 x 10'8 M, aproximadamente 5 x 10'8 M, aproximadamente 6 x 10'8 M, aproximadamente 7x 10'8 M, aproximadamente 8 x 10'8 M, aproximadamente 9 x 10'8 M , aproximadamente 1 x 10'9 M, aproximadamente 2 x 10'9 M, aproximadamente 3 x 10'9 M, aproximadamente 4 x 10'9 M, aproximadamente 5x 10'9 M, aproximadamente 6 x 10'9 M, aproximadamente 7 x 10'9 M, aproximadamente 8 x 10'9 M, aproximadamente 9 x 10'9 M, aproximadamente 1 x 10'1° M, o aproximadamente 5 x 10'10 M. En ciertas realizaciones, el Kd se calcula como el cociente de k¡nact¡vado/kact¡vado, y el kactivado y kinactivado se determinan usando un anticuerpo monovalente, tal como un fragmento Fab, medido, por ejemplo, mediante la tecnología de resonancia de plasmón de superficie BIAcore®. En otras realizaciones, el KD se calcula como el cociente de kmactivado/kactivado, y el kon y koff se determinan usando un anticuerpo bivalente, tal como un fragmento Fab, medido, por ejemplo, mediante la tecnología de resonancia de plasmón de superficie BIAcore®.
En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno diana (por ejemplo, BCMA humano, FLT3 humano o CLL-1 humano) con una tasa de asociación (kactivado) de menos de 1 x 10'4 M'1 s-1, menos menos de 2 x 10'4 M’1 s-1, menos de 3 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 4 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 5 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 6 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 7 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 8 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 9 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 1 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 2 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 3 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 4 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 5 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 6 x 10‘5 M-1 s-1, menos de 7 x 10-5 M-1 s-1, menos de 8 x 10-5 M-1 s-1, menos de 9 x 10-5 M-1 s-1, menos de 1 x 10-6 M-1 s-1, menos de 2 x 10-6 M-1 s-1, menos de 3 x 10-6 M-1 s-1, menos de 4 x 10-6 M-1 s-1, menos de 5 x 10-6 M-1 s-1, menos de 6 x 10-6 M-1 s-1, menos de 7 x 10-5 M-1 s-1, menos de 8 x 10-6 M-1 s-1, menos de 9 x 10-6 M-1 s-1, o menos de 1 x 10-7 M-1 s-1. En ciertas realizaciones, el kactivado se determina usando un anticuerpo monovalente, tal como un fragmento Fab, medido, por ejemplo, mediante la tecnología de resonancia de plasmón de superficie BIAcore®. En otras realizaciones, el kactivado se determina usando un anticuerpo bivalente medido, por ejemplo, mediante la tecnología de resonancia de plasmón de superficie BIAcore®.
En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno diana (por ejemplo, BCMA humano, FLT3 humano o CLL-1 humano) con una tasa de disociación (kinactivado) de menos de 1 x 10-2 s-1, menos de 2 x 10-2 s-1, menos de 3 x 10-2 s-1, menos de 4 x 10-2 s-1, menos de 5 x 10-2 s-1, menos de 6 x 10-2 s-1, menos de 7 x 10-2 s-1, menos de 8 x 10-2 s-1, menos de 9 x 10-2 s-1, menos de 1 x 10-3 s-1, menos de 2 x 10-3 s-1, menos de 3 x 10-3 s-1, menos de 4 x 10-3 s-1, menos de 5 x 10-3 s-1, menos de 6 x 10-3 s-1, menos de 7 x 10-3 s-1, menos de 8 x 10-3 s-1, menos de 9 x 10-3 s-1, menos de 1 x 10-4 s-1, menos de 2 x 10-4 s-1, menos de 3 x 10-4 s-1, menos de 4 x 10-4 s-1, menos de 5 x 10-4 s-1, menos de 6 x 10-4 s-1,, menos de 7 x 10-4 s-1,menos de 8 x 10-4 s-1, menos de 9 x 10-4 s-1, menos de 1 x 10-4 s-1, o menos de 5 x 10-4 s-1. En ciertas realizaciones, el kinactivado se determina usando un anticuerpo monovalente, tal como un fragmento Fab, medido, por ejemplo, mediante la tecnología de resonancia de plasmón de superficie BIAcore®. En otras realizaciones, el kinactivado se determina usando un anticuerpo bivalente medido, por ejemplo, mediante la tecnología de resonancia de plasmón de superficie BIAcore®.
En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica un TCR, en donde el TCR comprende además una cuarta región determinante de complementariedad (CDR4). En determinadas realizaciones, el polinucleótido codifica un TCR, en donde el TCR comprende además una región constante. En algunas realizaciones, la región constante se selecciona de una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE e IgM.
I.D. Dominio de conmutación
Se apreciará que los eventos adversos pueden minimizarse transduciendo las células inmunes (que contienen uno o más CAR o t Cr ) con un gen suicida. También puede ser deseable incorporar un conmutador inducible "encendido" o "acelerador" en las células inmunes. Las técnicas adecuadas incluyen el uso de caspasa-9 inducible (Solicitud de Estados Unidos 2011/0286980) o una timidina quinasa, antes, después o al mismo tiempo, cuando las células se transducen con el constructo CAR de la presente enseñanza. Los métodos adicionales para introducir genes suicidas y/o conmutadores "activados" incluyen TALENS, dedos de zinc, ARNi, ARNip, ARNhc, tecnología antisentido y otras técnicas conocidas en el arte.
De acuerdo con las enseñanzas, se pueden incorporar aquí otros tipos de técnicas de conmutadores de control de activación/inactivación u otros tipos. Estas técnicas pueden emplear el uso de dominios de dimerización y activadores opcionales de tal dominio de dimerización. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, las descritas por Wu et al., Science 2014350 (6258) que utilizan sistemas de dimerización FKBP/Rapalog en ciertas células. La tecnología de dimerización adicional se describe en, por ejemplo, Fegan et al. Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336, así como las Patentes de Estados Unidos No. 5,830,462; 5,834,266; 5,869,337; y 6,165,787. Los pares de dimerización adicionales pueden incluir ciclosporina-A/ciclofilina, receptor, receptor de estrógeno/estrógeno (opcionalmente usando tamoxifeno), glucocorticoides/receptor de glucocorticoide, receptor de tetraciclina/tetraciclina, receptor de vitamina D/vitamina D. Se pueden encontrar más ejemplos de tecnología de dimerización en, por ejemplo, WO 2014/127261, WO 2015/090229, US 2014/0286987, US 2015/0266973, US 2016/0046700, Patente de Estados Unidos No. 8,486,693, US 2014/0171649 y US 2012/0130076.
I.E. Péptido guía
En algunas realizaciones, el polinucleótido de la presente enseñanza codifica un CAR o un TCR puede comprender además un péptido guía (también denominado en el presente documento "péptido de señalización"). En ciertas realizaciones, el péptido guía comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones, el péptido guía comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de la presente enseñanza codifica un CAR o un TCR, en donde el CAR o el TCR comprende un péptido guía (P), una molécula de unión a antígeno (B), un dominio extracelular (E) de una proteína coestimuladora, una transmembrana dominio (T), una región coestimuladora (C), y un dominio de activación (A), en donde el CAR está configurado de acuerdo con lo siguiente: P-B-E-T-C-A. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno comprende un VH y un VL, en donde el CAR se configura de acuerdo con lo siguiente: P-VH-VL-E-T-C-A o P-VL-VH-E-T-C-A. En algunas realizaciones, el VH y el VL están conectados por un enlazador (L), en donde el CAR está configurado de acuerdo con lo siguiente, desde el extremo N al extremo C: P-VH-L-VL-E-T-C-A o P-VH-L-VL-E-T-C-A.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de la presente enseñanza codifica un CAR, en donde el CAR comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%. %, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de la Tabla 2. En ciertas realizaciones, el polinucleótido de la presente enseñanza codifica un CAR, en donde el CAR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la Tabla 2.
Tabla 2. Ejemplos de Secuencias CAR
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En algunas realizaciones, el polinucleótido de la presente enseñanza codifica un CAR, en donde el CAR comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%. %, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 178, 180, 190, 192, 202, 204, 214, 216, 226 y 228. En determinadas realizaciones, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 178, 180, 190, 192, 202, 204, 214, 216, 226 y 228.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de la presente enseñanza comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o 100% idéntico a un aminoácido secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 177, 179 , 189, 191, 201, 203, 213, 215, 225 y 227. En ciertas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 177, 179, 189, 191, 201, 203, 213, 215, 225 y 227.
II. Vectores, células y composiciones farmacéuticas
En ciertos aspectos, aquí se proporcionan vectores que comprenden un polinucleótido de la presente enseñanza. En algunas realizaciones, la presente enseñanza se dirige a un vector o un conjunto de vectores que comprenden un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR que comprende el dominio de bisagra truncado ("THD"), como se describió anteriormente.
Cualquier vector conocido en la técnica puede ser adecuado para la presente enseñanza. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral. En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector del virus de la leucemia murina, un vector SFG, un plásmido, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral de vaccinia, un vector viral de herpes simple, un vector asociado a adenovirus (AAV), un vector lentiviral o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, un vector que puede emplearse en el contexto de la presente enseñanza es pGAR y tiene la secuencia codificante:
CTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCA GCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCT TCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCC TTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAG GGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGA CGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACT CAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCT ATTGGTT AAAAAATGAGCTGATTT AAC AAAAATTT AACGCGAATTTT AACAAAAT ATTAACGCTTACAATTTGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGG CGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTG CAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAAC GACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGACCCGGGGATGGCGCG CCAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTT ACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCAT TGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTG ACGTC AATGGGTGGAGT ATTTACGGT AAACTGCCC ACTTGGC AGT ACATCAAGTG TATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCT GGC ATT ATGCCCAGT AC 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AGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAA T ACTCAT ACTCTTCCTTTTTC AATATTATTGAAGCATTT ATC AGGGTT ATTGTCTC ATGAGCGGAT AC ATATTTGAATGTATTT AGAAAAAT AAAC AAAT AGGGGTTCCG CGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC (SEQ ID NO: 252)
El mapa vectorial pGAR se muestra a continuación:
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Ejemplos de vectores adicionales adecuados incluyen, por ejemplo, pBABE-Puro, pBABE-neo largeTcDNA, pBABE-hygro-hTERT, pMKO.1 GFP, MSCV-IRES-GFP, pMSCV PIG (plásmido vacío Puro IRES GFP), pMSCV-loxp-dsRedloxp -eGFP-Puro-WPRE, MSCV IRES Luciferase, pMIG, MDH1-PGK-GFP_2.0, TtRMPVIR, pMSCV-IRES-mCherry FP, pRetroX GFP T2A Cre, pRXTN, pLncEXP y pLXIN-Luc.
En otros aspectos, se proporcionan aquí células que comprenden un polinucleótido o un vector de la presente enseñanza. En algunas realizaciones, la presente enseñanza se dirige a células, por ejemplo, células in vitro, que comprenden un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR que comprende un TCD descrito en el presente documento. En otras realizaciones, la presente enseñanza se dirige a células, por ejemplo, células in vitro, que comprenden un polipéptido codificado por un CAR o un TCR que comprende un TCD descrito en el presente documento.
Puede usarse cualquier célula como célula huésped para los polinucleótidos, los vectores o los polipéptidos de la presente enseñanza. En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula procariota, una célula fúngica, una célula de levadura o células eucariotas superiores, como una célula de mamífero. Las células procariotas adecuadas incluyen, sin limitación, eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobactehaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli; Enterobacter; Erwinia; Klebsiella; Proteo; Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium; Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella; Bacilos como B. subtilis y B. licheniformis; Pseudomonas como P. aeruginosa; y Streptomyces. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula es una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en una célula T, una célula B, un linfocito infiltrante de tumor (TIL), una célula que expresa TCR, una célula asesina natural (NK), una célula dendrítica, un granulocito, una célula linfoide innata, un megacariocito, un monocito, un macrófago, una plaqueta, un timocito y una célula mieloide. En una realización, la célula inmunitaria es una célula T. En otra realización, la célula inmunitaria es una célula NK. En determinadas realizaciones, la célula T es un linfocito infiltrante de tumor (TIL), una célula T autóloga, una célula T autóloga diseñada (eACT™), una célula T alogénica, una célula T heteróloga o cualquier combinación de los mismos.
La célula de la presente enseñanza puede obtenerse a través de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, las células T se pueden diferenciar in vitro de una población de células madre hematopoyéticas, o las células T se pueden obtener de un sujeto. Las células T pueden obtenerse, por ejemplo, de células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Además, las células T pueden derivarse de una o más líneas de células T disponibles en la técnica. Las células T también pueden obtenerse de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la materia, tales como separación y/o aféresis FICOLL™. En ciertas realizaciones, las células recolectadas por aféresis se lavan para eliminar la fracción de plasma y se colocan en un regulador o medio apropiado para su procesamiento posterior. En algunas realizaciones, las células se lavan con PBS. Como se apreciará, se puede usar una etapa de lavado, tal como usando una centrífuga de flujo continuo semiautomatizada, por ejemplo, el procesador de células Cobe™ 2991, el Baxter CytoMate™, o similares. En algunas realizaciones, las células lavadas se resuspenden en uno o más reguladores biocompatibles u otra solución salina con o sin regulador. En determinadas realizaciones, se eliminan los componentes no deseados de la muestra de aféresis. En la Publicación de Patente de Estados Unidos No. 2013/0287748 se describen métodos adicionales de aislamiento de células T para una terapia con células T.
En determinadas realizaciones, las células T se aíslan de las PBMC sometiendo a lisis los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, utilizando centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™. En algunas realizaciones, una subpoblación específica de células T, tales como células T CD4+, CD8+, CD28+, CD45RA+, y las células T CD45RO+ se aíslan adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa conocidas en la técnica. Por ejemplo, el enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie únicos para las células seleccionadas negativamente. En algunas realizaciones, se puede usar la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales típicamente incluye anticuerpos contra CD8, CD11b, CD14, CD16, CD20, y HLA-DR. En determinadas realizaciones, la citometría de flujo y la clasificación de células se utilizan para aislar poblaciones de células de interés para su uso en la presente enseñanza.
En algunas realizaciones, las PBMC se usan directamente para la modificación genética con las células inmunes (tales como CAR o TCR) usando métodos como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, después de aislar las PBMC, los linfocitos T se aíslan adicionalmente, y los linfocitos T citotóxicos y auxiliares se clasifican en, subpoblaciones de células T vírgenes, memoria y subpoblaciones de células T efectoras antes o después de la modificación y/o expansión genética.
En algunas realizaciones, las células CD8+ se clasifican además en células vírgenes, de memoria central y efectoras identificando los antígenos de la superficie celular que están asociados con cada uno de estos tipos de células CD8+. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores fenotípicos de las células T de memoria central incluye CCR7, CD3, CD28, CD45RO, CD62L, y CD127 y son negativas para la granzima B. En algunas realizaciones, las células T de memoria central son CD8+, CD45RO+y CD62L+ T células. En algunas realizaciones, las células T efectoras son negativas para CCR7, CD28, CD62L y CD127 y positivas para granzima B y perforina. En determinadas realizaciones, las células T CD4+ se clasifican además en subpoblaciones. Por ejemplo, las células auxiliares T CD4+ pueden clasificarse en células vírgenes, de memoria central y efectoras identificando poblaciones de células que tienen antígenos de superficie celular.
En algunas realizaciones, las células inmunes, por ejemplo, las células T, se modifican genéticamente después del aislamiento usando métodos conocidos, o las células inmunes se activan y expanden (o diferencian en el caso de progenitores) in vitro antes de ser modificadas genéticamente. En otra realización, las células inmunes, por ejemplo, las células T, se modifican genéticamente con los receptores de antígenos quiméricos descritos en este documento (por ejemplo, se transducen con un vector viral que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un CAR) y luego se activan y/o expanden en vitro. Los métodos para activar y expandir células T se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos No. 6,905,874; 6,867,041; y 6,797,514; y Publicación PCT No. w O 2012/079000. Generalmente, tales métodos incluyen poner en contacto PBMc o células T aisladas con un agente estimulante y un agente coestimulador, como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente unidos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citoquinas apropiadas, como IL. -2. Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la misma perla sirven como una célula presentadora de antígeno (APC) "sustituta". Un ejemplo es el sistema Dynabeads®, un sistema activador/estimulador CD3/CD28 para la activación fisiológica de las células T humanas. En otras realizaciones, las células T se activan y estimulan para que proliferen con células alimentadoras y anticuerpos y citoquinas apropiados usando métodos como los descritos en las Patentes Estadounidenses Números 6,040,177 y 5,827,642 y la publicación PCT número WO 2012/129514.
En determinadas realizaciones, las células T se obtienen de un sujeto donante. En algunas realizaciones, el sujeto donante es un paciente humano que padece un cáncer o un tumor. En otras realizaciones, el sujeto donante es un paciente humano que no padece un cáncer o un tumor.
Otros aspectos de la presente enseñanza están dirigidos a composiciones que comprenden un polinucleótido descrito aquí, un vector descrito aquí, un polipéptido descrito aquí, o una célula in vitro descrita aquí. En algunas realizaciones, la composición comprende un vehículo, diluyente, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición comprende un excipiente. En una realización, la composición comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR que comprende un dominio de bisagra truncado ("THD") descrito en el presente documento. En otra realización, la composición comprende un CAR o un TCR que comprende un TCD codificado por un polinucleótido de la presente enseñanza. En otra realización, la composición comprende una célula T que comprende un CAR o un TCR que comprende un TCD descrito en el presente documento.
En otras realizaciones, la composición se selecciona para administración parenteral, para inhalación o para administración a través del tracto digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la capacidad de un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, se usan reguladores para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente más bajo, típicamente dentro de un rango de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. En ciertas realizaciones, cuando se contempla la administración parenteral, la composición está en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende una composición descrita en el presente documento, con o sin agentes terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, el vehículo para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que la composición descrita en el presente documento, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, se formula como una solución isotónica estéril, debidamente conservada. En ciertas realizaciones, la preparación implica la formulación de la molécula deseada con compuestos poliméricos (como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o sostenida del producto, que luego se administran a través de una inyección de depósito. En determinadas realizaciones, se utilizan dispositivos implantables de administración de fármacos para introducir la molécula deseada.
III. Métodos de la enseñanza
Otro aspecto de la presente enseñanza se dirige a un método para hacer una célula que exprese un CAR o un TCR que comprende transducir una célula con un polinucleótido descrito en este documento en condiciones adecuadas. En algunas realizaciones, el método comprende transducir una célula con un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el método comprende transducir una célula con un vector que comprende el polinucleótido que codifica un CAR o un TCR.
Otro aspecto de la presente enseñanza está dirigido a un método para inducir una inmunidad contra un tumor que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una célula que comprende un polinucleótido descrito aquí, un vector descrito aquí, o un CAR o TCR descrito aquí. En una realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una célula que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR descritos en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una célula que comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR descritos en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva de una célula que comprende un CAR o un TCR codificado por un polinucleótido descrito en el presente documento.
Otro aspecto de la presente enseñanza está dirigido a un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar una cantidad efectiva de las células inmunitarias modificadas de la presente solicitud. En algunas realizaciones, la respuesta inmune es una respuesta inmune mediada por células T. En algunas realizaciones, la respuesta inmune mediada por células T se dirige contra una o más células diana. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria modificada comprende un CAR o un TCR, en donde el CAR o el TCR comprende un THD descrito en la presente divulgación. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula tumoral.
Otro aspecto de la presente enseñanza está dirigido a un método para tratar o prevenir una neoplasia maligna, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de al menos una célula inmunitaria, donde la célula inmunitaria comprende al menos un CAR o TCR, y en donde el CAR o el TCR comprende un THD descrito en el presente documento.
Otro aspecto de la presente enseñanza está dirigido a un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un polinucleótido, un vector, un CAR o un TCR, una célula o una composición descrita en el presente documento. En una realización, el método comprende administrar un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR. En otra realización, el método comprende administrar un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR o un TCR. En otra realización, el método comprende administrar un CAR o un t Cr codificado por un polinucleótido descrito en el presente documento. En otra realización, el método comprende administrar una célula que comprende el polinucleótido, o un vector que comprende el polinucleótido, que codifica un CAR o un TCR.
En algunas realizaciones, los métodos para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita comprenden una terapia con células T. En una forma de realización, la terapia con células T de la presente enseñanza es Terapia de Células Autólogas (eACT™) diseñada por ingeniería genética. Según esta realización, el método puede incluir la recolección de células sanguíneas del paciente. Las células sanguíneas aisladas (por ejemplo, células T) pueden modificarse luego por ingeniería genética para expresar un CAR o un TCR de la presente enseñanza. En una realización particular, las células CAR T o las células TCR T se administran al paciente. En algunas realizaciones, las células c Ar T o las células TCR T tratan un tumor o cáncer en el paciente. En una realización, las células CAR T o las células TCR T reducen el tamaño de un tumor o cáncer.
En algunas realizaciones, las células T del donante para su uso en la terapia con células T se obtienen del paciente (por ejemplo, para una terapia con células T autólogas). En otras realizaciones, las células T del donante para su uso en la terapia con células T se obtienen de un sujeto que no es el paciente.
Las células T se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de células T puede ser al menos aproximadamente 104 células, al menos aproximadamente 105 células, al menos aproximadamente 106 células, al menos aproximadamente 107 células, al menos aproximadamente 108 células, al menos aproximadamente 109 o al menos aproximadamente al menos aproximadamente 1010. En otra realización, la cantidad terapéuticamente efectiva de células T es aproximadamente 104 células, aproximadamente 105 células, aproximadamente 106 células, aproximadamente 107 células o aproximadamente 108 células. En una realización particular, la cantidad terapéuticamente efectiva de células T CAR o células T TCR es aproximadamente 2 X 106 células/kg, aproximadamente 3 X 106 células/kg, aproximadamente 4 X 106 células/kg, aproximadamente 5 X 106 células/kg, aproximadamente 6 X 106 células/kg, aproximadamente 7 X 106 células/kg, aproximadamente 8 X 106 células/kg, aproximadamente 9 X 106 células/kg, aproximadamente 1 X 107 células/kg, aproximadamente
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107 células/kg, aproximadamente 3 X 107 células/kg, aproximadamente 4 X 107 células/kg, aproximadamente 5 X 107 células/kg, aproximadamente 6 X 107 células/kg, aproximadamente 7 X 107 células/kg, aproximadamente 8 X 107 células/kg, o aproximadamente 9 X 107 células/kg.
IV. Tratamiento del cáncer
Los métodos de la enseñanza pueden usarse para tratar un cáncer en un sujeto, reducir el tamaño de un tumor, matar células tumorales, prevenir la proliferación de células tumorales, prevenir el crecimiento de un tumor, eliminar un tumor de un paciente, prevenir la recaída de un tumor, prevenir la metástasis tumoral, inducir la remisión en un paciente o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, los métodos inducen una respuesta completa. En otras realizaciones, los métodos inducen una respuesta parcial.
Los cánceres que pueden tratarse incluyen tumores que no están vascularizados, que aún no están sustancialmente vascularizados o vascularizados. El cáncer también puede incluir tumores sólidos o no sólidos. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematológico. En algunas realizaciones, el cáncer es de glóbulos blancos. En otras realizaciones, el cáncer es de células plasmáticas. En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia, linfoma o mieloma. En determinadas realizaciones, el cáncer es leucemia linfoblástica aguda (LLA) (incluida LLA sin células T), leucemia linfoide aguda (LLA) y linfohistocitosis hemofagocítica (HLH)), leucemia prolinfocítica de células B, leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides, linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mieloide crónica (LMC), enfermedad granulomatosa crónica o aguda, leucemia aguda o crónica, linfoma difuso de células B grandes, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular, linfoma folicular (FL), leucemia de células pilosas, síndrome hemofagocítico (síndrome de activación de macrófagos (MAS), enfermedad de Hodgkin, granuloma de células grandes, deficiencia de adhesión de leucocitos, afecciones linfoproliferativas malignas, linforma MALT, linfoma de células del manto, linterna de zona marginal, gammapatía monoclonal de significado indeterminado (GMSI), mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico (SMD), mieloide enfermedades que incluyen, entre otras, leucemia mieloide aguda (LMA), linfoma no Hodgkin (LNH), trastornos proliferativos de células plasmáticas (por ejemplo, mieloma asintomático (mieloma múltiple latente o mieloma indolente), linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, plasmacitomas (por ejemplo, discrasia de células plasmáticas; mieloma solitario; plasmocitoma solitario; plasmocitoma extramedular; y plasmocitoma múltiple), síndrome POEMS (síndrome de Crow-Fukase; enfermedad de Takatsuki; síndrome PEP), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBC), linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, linfoma de zona marginal esplénica (SMZL), amiloidosis de cadena ligera amiloide, leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), linfoma de células T, linfoma folicular transformado, macroglobulinemia de Waldenstrom o una combinación de los mismos.
En una realización, el cáncer es un mieloma. En una realización particular, el cáncer es mieloma múltiple. En otra forma de realización, el cáncer es una leucemia. En una realización, el cáncer es leucemia mieloide aguda.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además administrar un agente quimioterapéutico. En ciertas realizaciones, el agente quimioterapéutico seleccionado es un agente quimioterapéutico linfosupresor (preacondicionamiento). Los regímenes de tratamiento de preacondicionamiento beneficiosos, junto con los biomarcadores beneficiosos correlativos, se describen en el documento US2018369283, que reivindica la prioridad de las Solicitudes de Patente Provisional de Estados Unidos 62/262,143 y 62/167,750. Estos describen, por ejemplo, métodos para acondicionar a un paciente que necesita una terapia con células T que comprenden administrar al paciente dosis beneficiosas específicas de ciclofosfamida (entre 200 mg/m2/día y 2000 mg/m2/día) y dosis específicas de fludarabina (entre 20 mg /m2/día y 900 mg/m2/día). Uno de estos regímenes de dosis implica tratar a un paciente que comprende administrar diariamente al paciente aproximadamente 500 mg/m2/día de ciclofosfamida y aproximadamente 60 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de células T modificadas genéticamente al paciente.
En otras realizaciones, la molécula de unión al antígeno, las células transducidas (o modificadas) (tales como CAR o TCR) y el agente quimioterapéutico se administran cada uno en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad o afección en el sujeto.
En determinadas realizaciones, las composiciones que comprenden células efectoras inmunitarias que expresan CAR y/o TCR descritas en el presente documento pueden administrarse junto con cualquier número de agentes quimioterapéuticos. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina resume; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clomafazina, cloofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxino-L-epidirrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldophosphamide; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo Squibb) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifoscinfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™; ONTAK™ (denileucina diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden células efectoras inmunitarias que expresan CAR y/o TCR descritas en el presente documento pueden administrarse junto con un agente antihormonal que actúa para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos, incluido, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se administran combinaciones de agentes quimioterapéuticos cuando sea apropiado, que incluyen, entre otros, CHOP, es decir, Ciclofosfamida (Cytoxan®), Doxorrubicina (hidroxdoxorrubicina), Vincristina (Oncovin®) y Prednisona.
En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra al mismo tiempo o dentro de una semana después de la administración de la célula diseñada o el ácido nucleico. En otras realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra de 1 a 4 semanas o de 1 semana a 1 mes, de 1 semana a 2 meses, de 1 semana a 3 meses, de 1 semana a 6 meses, de 1 semana a 9 meses o de 1 semana a 12 meses después de la administración de la célula diseñada o del ácido nucleico. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra al menos 1 mes antes de administrar la célula o el ácido nucleico. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la administración de dos o más agentes quimioterapéuticos.
Se puede usar una variedad de agentes terapéuticos adicionales junto con las composiciones descritas en este documento. Por ejemplo, agentes terapéuticos adicionales potencialmente útiles incluyen inhibidores de PD-1 como nivolumab (OPDIVO®), pembrolizumab (KEYTRUDA®), pembrolizumab, pidilizumab (CureTech) y atezolizumab (Roche).
Los agentes terapéuticos adicionales adecuados para su uso en combinación con las enseñanzas incluyen, entre otros, ibrutinib (IMBRUVICA®), ofatumumab (a Rz ERRA®), rituximab (RITUXAN®), bevacizumab (AVASTIN®), trastuzumab (HERCEPTIN®), trastuzumab emtansina (KADCYLA®), imatinib (GLEEv Ec ®), cetuximab (ERBITUX®), panitumumab (VECTIBIX®), catumaxomab, ibritumomab, ofatumumab, tositumomab, brentuximab, alemtuzumab, gemlotin, vandatibitibina, neparatibina axitinib, masitinib, pazopanib, sunitinib, sorafenib, toceranib, lestaurtinib, axitinib, cediranib, lenvatinib, nintedanib, pazopanib, regorafenib, semaxanib, sorafenib, sunitinib, tivozanctib, toceranib, ponatibin, vanatibin, vanatibina radotinib, bosutinib, lestaurtinib, ruxolitinib, pacritinib, cobimetinib, selumetinib, trametinib, binimetinib, alectinib, ceritinib, crizotinib, aflibercept, adipotida, denileucina diftitox, inhibidores de mTOR como Everolimus y Temsirolimus, inhibidores de Hedgehog como sonidegib y vismodegib, inhibidores de CDK como el inhibidor de CDK (palbociclib).
En realizaciones adicionales, la composición que comprende el sistema inmunológico que contiene CAR y/o TCR se administra con un agente antiinflamatorio. Los agentes o fármacos antiinflamatorios pueden incluir, entre otros, esteroides y glucocorticoides (incluyendo betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE) incluyendo aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato. AINE de ejemplo incluyen ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 y sialilatos. Analgésicos de ejemplo incluyen acetaminofeno, oxicodona, tramadol o hidrocloruro de proporxifeno. Ejemplos de glucocorticoides incluyen cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica de ejemplo incluyen moléculas dirigidas contra marcadores de superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), inhibidores de citoquinas, como los antagonistas de TNF, (por ejemplo, etanercept (ENBREL®), adalimumab (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®), inhibidores de quimioquinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales y formas recombinantes de moléculas. Ejemplos de FARME incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, Oro (oral (auranofina) e intramuscular) y minociclina.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se administran junto con una citoquina. "Citoquina", como se usa en el presente documento, se refiere a proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de citoquinas son linfocinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen hormonas de crecimiento tales como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana N-metionil y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina prorelaxina; hormonas glicoproteicas como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático (HGF); factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); prolactina; lactógeno placentario; sustancia inhibidora de Muller; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso (NGF) tales como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformadores (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como macrófagos-CSF (M-CSF); granulocitosmacrófagos-CSF (GM-CSF); y granulocitos-CSF (G-CSF); interleucinas (IL) como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, iL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Como se usa en este documento, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.
La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como una limitación adicional de la presente invención, que sólo está limitada por los términos de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Los plásmidos que codifican un promotor T7, un constructo CAR y una secuencia estabilizadora de beta globina se linealizaron mediante digestión durante la noche de 10 pg de ADN con EcoRI y BamHI (NEB). A continuación, el ADN se digirió durante 2 horas a 50°C con proteinasa K (Thermo Fisher, 600 U/ml), se purificó con fenol/cloroformo y se precipitó añadiendo acetato de sodio y dos volúmenes de etanol. A continuación, se secaron los sedimentos, se resuspendieron en agua libre de ARNasa/ADNsa y se cuantificaron usando NanoDrop. A continuación, se utilizó un pg del ADN lineal para la transcripción in vitro utilizando el mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra (Thermo Fisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se purificó adicionalmente usando el kit MEGAClear (Thermo Fisher) siguiendo las instrucciones del fabricante y se cuantificó usando NanoDrop. La integridad del ARNm se evaluó usando movilidad en un gel de agarosa. Se aislaron PBMC de leucopaks de donantes sanos (Hemacare) usando centrifugación de densidad ficoll-paque según las instrucciones del fabricante. Las PBMC se estimularon usando OKT3 (50 ng/ml, Miltenyi Biotec) en medio R10 IL-2 (300 Ul/ml, Proleukin®, Prometheus® Therapeutics and Diagnostics). Siete días después de la estimulación, las células T se lavaron dos veces en medio Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) y se resuspendieron a una concentración final de 2.5 x 107 células/ml en medio Opti-MEM. Se utilizaron diez pg de ARNm por electroporación. La electroporación de las células se realizó usando un sistema Gemini X2 (Harvard Apparatus BTX) para suministrar un único pulso de 400 V durante 0,5 ms en cubetas de 2 mm (Harvard Apparatus BTX). Las células se transfirieron inmediatamente a medio R10 IL-2 y se dejaron recuperar durante 6 horas. Para examinar la expresión de CAR, se tiñeron células T con FLT-=3-HIS (Sino Biological Inc.) o Proteína L biotinilada (Thermo Scientific) en regulador de tinción (BD Pharmingen) durante 30 minutos a 4°C. A continuación, las células se lavaron y se tiñeron con anti-HIS-PE (Miltenyi Biotec) o PE estreptavidina (BD Pharmingen) en regulador de tinción durante 30 minutos a 4°C. A continuación, las células se lavaron y se resuspendieron en regulador de tinción con yoduro de propidio (BD Pharmingen) antes de la adquisición de datos. La expresión de FLT3 CAR en células T sometidas a electroporación se muestra en la FIGURA 3.
Las células T se sometieron a electroporación con plásmidos que codifican un CAR anti-FLT3 que comprende una molécula de unión anti-FLT3 10E3, 2E7, 8B5, 4E9 o 11F11 y una región de bisagra seleccionada del dominio de bisagra de longitud completa (un dominio de bisagra completo o "CHD") o un dominio de bisagra truncado ("THD"). Las células T CAR anti-FLT3 sometidas a electroporación se cocultivaron luego con células diana Namalwa (FLT3 negativo), EoL1 (FLT3 positivo), HL60 (FLT3 positivo) o MV4; 11 (FLT3 positivo) a una relación E:T de 1:1 en medio R10. Dieciséis horas después del cocultivo, los sobrenadantes de Namalwa (Figuras 4A-4F), EoL1 (FIGURAS 4G-4L), HL60 (Figuras 4M-4R y MV4; 11 (4S-4X) fueron analizados por Luminex (EMD Millipore) para la producción de IFNy (FIGURAS 4A, 4B, 4G, 4H, 4M, 4N, 4S y 4T), IL-2 (FIGURAS 4C, 4D, 4I, 4J, 4O, 4P, 4U y 4V) y TNFa (FIGURAS 4E, 4F, 4K, 4L, 4Q, 4R, 4W y 4X).
La viabilidad de las células diana se evaluó mediante análisis por citometría de flujo de la captación de yoduro de propidio (PI) por células CD3 negativas. Las células T CAR anti-FLT3 sometidas a electroporación se cultivaron conjuntamente con células diana Namalwa (FIGURAS 5A-5B), EoL1 (FIGURAS 5C-5D), HL60 (FIGURAS 5E-5F y Mv 4; 11 (5G-5H) a las 16 horas post-cocultivo.
Ejemplo 2
Se utilizó un vector de transferencia lentiviral de tercera generación que contiene los diferentes constructos CAR junto con la mezcla de empaquetado lentiviral ViraPower (Life Technologies) para generar los sobrenadantes lentivirales. En resumen, se generó una mezcla de transfección mezclando 15 pg de ADN y 22.5 pl de polietileneimina (Polysciences, 1 mg/ml) en 600 pl de medio OptiMEM. La mezcla se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Simultáneamente, se tripsinizaron células 293T (ATCC), se contaron y se sembraron en placa un total de 10 x 106 células en total en un matraz T75 a lo largo de la mezcla de transfección. Tres días después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes y se filtraron a través de un filtro de 0.45 pm y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Se aislaron PBMC de leucopaks de donantes sanos (Hemacare) usando centrifugación de densidad Ficoll-Paque según las instrucciones del fabricante. Las PBMC se estimularon usando OKT3 (50 ng/ml, Miltenyi Biotec) en medio R10 IL-2 (300 UI/ml, PROLEUKIN®, PROMETHEUS® Therapeutics and Diagnostics). Cuarenta y ocho horas después de la estimulación, las células se transdujeron usando lentivirus a una MOI = 10. Las células se mantuvieron a 0.5-2.0 x 106 células/ml antes de su uso en ensayos de actividad. Para examinar la expresión de CAR, se tiñeron células T con FLT-3-HIS (Sino Biological Inc.) o Proteína L biotinilada (Thermo Scientific) en regulador de tinción (BD Pharmingen) durante 30 minutos a 4°C. A continuación, las células se lavaron y se tiñeron con anti-HIS-PE (Miltenyi Biotec) o PE estreptavidina (BD Pharmingen) en regulador de tinción durante 30 minutos a 4°C. A continuación, las células se lavaron y se resuspendieron en regulador de tinción con yoduro de propidio (BD Pharmingen) antes de la adquisición de datos. La expresión de FLT3 CAR en células T de dos donantes sanos se muestra en las FIGURAS 6A-6B.
Se transdujeron células T de dos donantes sanos con vectores lentivirales que codifican células T CAR anti-FLT3 que comprenden una molécula de unión 10E3, 8B5 o 11F11 y una región bisagra seleccionada del dominio bisagra completo ("CHD"), un dominio bisagra truncado ("THD") y la región de bisagra CD8. Las células T transducidas se cultivaron conjuntamente con células diana en una relación E: T 1:1 en medio R10. Dieciséis horas después del cocultivo, los sobrenadantes fueron analizados por Luminex (EMD Millipore) para la producción de IFNy (FIGURAS 7A-7B), TNFa (FIGURAS 7C-7D) e IL-2 (FIGURAS 7E-7F).
La viabilidad de las células diana se evaluó mediante análisis por citometría de flujo de la captación de yoduro de propidio (PI) por células CD3 negativas. Se midió la actividad citolítica promedio de células T CAR transducidas por lentivirus (de dos donantes sanos) cocultivadas con Namalwa (FIGURA 8A), EoL1 (FIGURA 8B), MV4; 11 (FIGURA 8C) y HL60 (FIGURA 8D) de las células diana.
Para evaluar la proliferación de células T con CAR en respuesta a células diana que expresan FLT3, las células T se marcaron con CFSE antes del cocultivo con células diana en una relación E:T 1:1 en medio R10. Cinco días después, se evaluó la proliferación de células T mediante análisis citométrico de flujo de dilución de CFSE. La proliferación de células T CAR FLT3 se muestra en las FIGURAS 9A-9B.
Ejemplo 3
Para examinar la actividad antileucémica in vivo, se generaron células FLT3 CAR T para su uso en un modelo xenogénico de AML humana. La expresión de CAR de las diversas líneas efectoras utilizadas en el modelo xenogénico de AML humana se muestra en las FIGURAS 10A-10D. Se inyectaron por vía intravenosa MV4; 11 células marcadas con luciferasa (2 x 106 células/animal) en ratones NSG hembra de 5 a 6 semanas de edad. Después de 6 días, se inyectaron por vía intravenosa 6 x 106 células T (~ 50% CAR+) en 200 pl de PBS, y se midió semanalmente la carga tumoral de los animales usando imágenes de bioluminiscencia (FIGURAS 10E-10G). El análisis de supervivencia se realizó mediante inyección de controles (simulacro) o 10E3-CHD (FIGURA 10H), 10E3-THD (FIGURA 10I) o 8B5-THD (FIGURA 10J) que expresan células CAR T.
Ejemplo 4
Las células T se sometieron a electroporación con plásmidos que codifican los constructos CAR anti-CLL-1 24C8_HL-CHD CAR (que comprenden un dominio bisagra completo de la proteína coestimuladora) y 24C8_HL-THD CAR (que comprende un dominio bisagra truncado de la proteína coestimuladora). La expresión de anti-CLL-1 por células T sometidas a electroporación se muestra en las FIGURAS 11A-11D. Las células T CAR anti-CLL-1 se cultivaron luego con la diana Namalwa (ATCC; CLL-1 negativo), U937 (ATCC; CLL-1 positivo), HL-60 (ATCC; CLL-1 positivo), EoL-1 (Sigma; CLL-1 positivo), KG1a (ATCC; CLL-1 positivo) y MV4; células 11 (At Cc ; CLL-1 positivo) en una relación E:T de 1:1 en medio R10 6 horas después de la electroporación con ARNm. Dieciséis horas después del cocultivo, los sobrenadantes fueron analizados por Luminex (EMD Millipore), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para la producción de IL-2 (FIGURA 12A), IFNy (FIGURA 12B) y TNFa (FIGURA 12C).
La viabilidad de las células diana se evaluó mediante análisis por citometría de flujo de la captación de yoduro de propidio (PI). Las células T CAR anti-CLL-1 sometidas a electroporación se cultivaron conjuntamente con Namalwa (FIGURA 13A), MV4; 11 (FIGURA 13B), EoL-1 (FIGURA 13C), HL-60 (FIGURA 13D), o células diana U937 (FIGURA 13E) durante 16 horas. Como se esperaba, las células Namalwa cocultivadas con las células T CAR anti-CLL-1 mostraron pocos cambios en la viabilidad de las células diana, en relación con los controles (FIGURA 13A). Sin embargo, se observó una mayor actividad citolítica en MV; 411 células cocultivadas con células T 24C8_HL-CHD y 24C8_HL-THD, en relación con los controles, con una mayor actividad citolítica de células diana observada en el cocultivo de células T 24C8_HL-THD (FIGURA 13B). Además, se observó una mayor actividad citolítica en células EoL-1 cocultivadas con células T 24c 8_HL-CHD y 24C8_HL-THD, en relación con los controles (FIGURA 13C). Se observó una mayor actividad citolítica en células HL-60 cocultivadas con células T 24C8_HL-CHD y 24C8_HL-THD, en relación con los controles (FIGURA 13D). Se observó una mayor actividad citolítica en células U937 cocultivadas con células T 24C8_HL-CHD y 24C8_HL-THD, en relación con los controles, con una mayor actividad citolítica de células diana observada en el cocultivo de células T 24C8_HL-THD (FIGURA 13E).
Ejemplo 5
Las células T transducidas con vectores lentivirales que comprenden un constructo CAR anti-CLL-1 con un dominio de bisagra truncado ("THD") de la proteína coestimuladora, 10E3_THD o 24C1_LH_THD, se cultivaron conjuntamente con Namalwa, U937, HL-60, EoL-1 , KG1a y MV4; células diana 11 en una relación E:T de 1:1 en medio R10 12 días después de la estimulación de células T. Dieciséis horas después del cocultivo, los sobrenadantes fueron analizados por Luminex (EMD Millipore), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para la producción de las citoquinas IFNy (FIGURA 14A), IL-2 (FIGURA 14B) y TNFa (FIGURA 14C) en cocultivos de células T 10E3_THD CAR T efectoras y células T CAR 24C1_l H_THD con Namalwa, Hl-60 o MVA diana; células 11, como se indica.
La viabilidad de las células diana se evaluó mediante análisis por citometría de flujo de la captación de yoduro de propidio (PI). Se cocultivaron células T con CAR Efector 24C1_LH_THD transducidas con Namalwa, U937, HL-60, EoL-1, KG1a o MV4; 11 células diana durante 16 horas o 40 horas. El cocultivo de células diana de Namalwa con células T CAR C1_24C1_LH_THD transducidas no tuvo efecto sobre el porcentaje de células diana de Namalwa viables a las 16 y 40 horas, en comparación con los controles simulados (FIGURA 15A). Sin embargo, las células T C1_24C1_LH_THD CAR cocultivadas con células diana MV4; 11 (FIGURA 15B) o HL-60 (FIGURA 15C) dieron como resultado un porcentaje menor de células diana viables tanto a las 16 horas como a las 40 horas, en comparación con controles simulados.
Ejemplo 6

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polinucleótido aislado que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende (i) una molécula de unión a antígeno, (ii) un dominio coestimulador y (iii) un dominio de activación,
en donde el dominio coestimulador comprende un dominio extracelular con una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio intracelular, caracterizado porque dicha bisagra es un dominio bisagra truncado (THD) que consiste de:
(a) aminoácidos 123-152 de SEQ ID NO: 1, o
(b) una variante de (a), que tiene la misma longitud pero con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de (a); o
(c) una variante de (a) o (b), con uno a seis aminoácidos añadidos o eliminados de la secuencia de aminoácidos del THD; en donde de uno a seis aminoácidos que se pueden añadir o eliminar de la secuencia de aminoácidos en el THD pueden estar en el N-terminal, en el C-terminal, o tanto en el N-terminal como en el C-terminal.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde de uno a seis aminoácidos son aminoácidos heterólogos en el sentido de que no forman parte de la secuencia de proteína coestimuladora de origen natural de SEQ ID NO: 1.
3. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de 4-1BB/CD137, una cadena alfa de un receptor de células T, una cadena beta de un receptor de células T, CD3 epsilon, CD4, CD5, CD8 alfa, CD9, CD16, CD19, CD22, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 o una cadena zeta de un receptor de células T, o cualquier combinación de los mismos, o donde el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 5.
4. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio intracelular comprende una región de señalización de 4-1BB/CD137, que activa los receptores de células NK, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD29, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7 , CD84, CD8alfa, CD8beta, CD96 (táctil), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, receptores de citoquinas, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc gama, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR ), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig alfa (CD79a), IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, proteínas similares a las inmunoglobulinas, coestimulador de células T inducible (ICOS), integrinas, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, un ligando que se une específicamente con CD83, LIGHT, LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1 (CD11a/CD18), Molécula de MHC clase I, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, muerte programada-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, proteínas receptoras de TNF, TNFR2, un receptor de ligando Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 o VLA-6, o una combinación de los mismos, o donde el dominio intracelular comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos al menos 99%, o 100% idéntico a SEQ ID NO: 7.
5. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en donde la molécula de unión al antígeno comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde VH comprende 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR) y VL comprende 3 CDR.
6. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en donde la molécula de unión al antígeno se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en 5T4, alfafetoproteína, antígeno de maduración de células B (BCMA), CA-125, antígeno carcinoembrionario, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD56, CD123, CD138, c-Met, CSPG4, molécula 1 similar a lectina tipo C (CLL-1), EGFRvIII, antígeno tumoral epitelial, ERBB2, FLT3, proteína de unión a folato, GD2, GD3, HER1-HER2 en combinación, HER2-HER3 en combinación, HER2/Neu, HERV-K, glicoproteína de la envoltura del VIH-1 gp41, glicoproteína de la envoltura del VIH-1 gp120, IL-11Ralfa, cadena kappa, cadena lambda, antígeno asociado al melanoma, mesotelina , MUC-1, p53 mutado, ras mutado, antígeno prostático específico, ROR1 o VEGFR2, o una combinación de los mismos.
7. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio de activación comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntico a SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 251.
8. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el CAR comprende además un péptido guía, en donde el péptido guía comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95 %, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntico a SEQ ID NO: 11.
9. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el vector es preferiblemente un vector adenoviral, un vector asociado a adenovirus, un vector de ADN, un vector lentiviral, un plásmido, un vector retroviral o un vector de ARN, o cualquier combinación de los mismos.
10. Un polipéptido codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Una célula que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el vector de la reivindicación 9, el polipéptido de la reivindicación 10 o cualquier combinación de los mismos, en donde la célula es preferiblemente una célula T.
12. Una composición que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el vector de la reivindicación 9, el polipéptido de la reivindicación 10 o la célula de la reivindicación 11, que se formula preferiblemente para ser administrado a un sujeto, opcionalmente, que comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. Un método in vitro para hacer una célula que expresa un CAR que comprende transducir una célula con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en condiciones adecuadas, que comprende opcionalmente una etapa adicional de aislamiento de la célula.
14. Un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un vector de la reivindicación 9, un polipéptido de la reivindicación 10, una célula de la reivindicación 11 o una composición de la reivindicación 12 para su uso en terapia, preferiblemente para inducir una inmunidad contra un tumor o para tratar un cáncer, en donde el cáncer es preferiblemente un cáncer hematológico, un cáncer de los glóbulos blancos o un cáncer de las células plasmáticas.
15. El polinucleótido para su uso de la reivindicación 14, el vector para su uso de la reivindicación 14, el polipéptido para su uso de la reivindicación 14, la célula para su uso de la reivindicación 14 o la composición para su uso de la reivindicación 14, en donde el cáncer es leucemia, linfoma, o mieloma o en donde el cáncer es leucemia linfoblástica aguda (LLA) (incluida LLA no de células T), leucemia mieloide aguda, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt , leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mieloide crónica, leucemia aguda o crónica, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), leucemia de células pilosas, Enfermedad de Hodgkin, afecciones linfoproliferativas malignas, Linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS), mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin (NHL), trastorno proliferativo de células plasmáticas (incluido mieloma asintomático (mieloma múltiple latente o mieloma indolente), linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, plasmacitomas (incluida discrasia de células plasmáticas; mieloma solitario; plasmocitoma solitario; plasmocitoma extramedular; y plasmocitoma múltiple), síndrome POEMS (también conocido como síndrome de Crow-Fukase; enfermedad de Takatsuki; y síndrome PEP), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBC), linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, linfoma de zona marginal esplénica ( SMZL), amiloidosis sistémica de cadena ligera amiloide, leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), linfoma de células T, linfoma folicular transformado o macroglobulinemia de Waldenstrom, o una combinación de los mismos.
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