ES2963598T3 - Dominios de unión al antígeno humanizado contra CD19 y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona un anticuerpo anti-CD 19 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH) en la que las regiones VL y VL humanizadas se derivan del anticuerpo anti-CD 19 de ratón. anticuerpo clon FMC63; la región VL humanizada y/o VH humanizada comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en la región estructural. El anticuerpo anti-CD 19 humanizado o el fragmento de unión a antígeno puede ser parte de un fragmento variable de cadena única (scFv), un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR). Otros aspectos de la invención se refieren a células que comprenden el CAR o el TCR y su uso en una terapia con células T. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dominios de unión al antígeno humanizado contra CD19 y métodos de uso
Antecedentes de la invención
Los cánceres humanos, por su propia naturaleza, comprenden células normales que han sufrido una conversión genética o epigenética para convertirse en células cancerígenas anormales. Al hacer esto, las células cancerígenas comienzan a expresar proteínas y otros antígenos que son distintos a los expresados por las células normales y/o las proteínas se expresan en cantidades significativamente mayores que las expresadas por las células normales.
Los receptores de antígenos quiméricos (CARs) y los receptores de células T (TCRs) diseñados, los cuales comprenden dominios de unión capaces de interactuar con la proteína expresada en células cancerígenas, permiten que las células T se dirijan y maten a las células cancerígenas que expresan a la proteína en particular. De manera similar, los anticuerpos que están conjugados con un agente terapéutico son capaces de proporcionar selectivamente el agente terapéutico a las células cancerígenas que expresan a la proteína en particular y matan a estas células cancerígenas. La técnica anterior describe células cancerígenas que expresan a<c>D19 en su superficie. El documento de la técnica anterior WO2017/015783 describe un anticuerpo murino, FMC63, que reconoce a CDI y versiones humanizadas del mismo. Existe una necesidad de CARs, TCRs y anticuerpos que comprenden dominios de unión al antígeno humanizados para dirigir y matar a las células cancerígenas que expresan CD19.
Sumario de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier otro aspecto o realización establecido en la presente que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones es solamente para información.
Sumario de la enseñanza
La invención está basada en la enseñanza general que se va a explicar a continuación. La presente enseñanza aborda esta necesidad al proporcionar composiciones y métodos que incluyen células inmunes diseñadas que expresan receptores de antígenos quiméricos (CARs) o receptores de células T (TCRs) que tienen dominios de unión al antígeno humanizados; estos CARs y TCRs se dirigen específicamente a las células cancerígenas y las matan. La presente enseñanza también aborda esta necesidad al proporcionar composiciones y métodos que incluyen anticuerpos que se dirigen específicamente a las células cancerígenas y las matan.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión del mismo se selecciona del grupo que consiste en una IgG, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv y un scFv. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un scFv.
De acuerdo con la presente invención, la VL comprende SEQ ID NO: 14 y la VH comprende SEQ ID NO: 15.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende SEQ ID NO: 24.
Otro aspecto de la presente enseñanza es un polipéptido codificado por el anticuerpo anti-CD19 humanizado de un aspecto o realización anterior.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una Etiqueta de His que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, el polipéptido está unido a un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico, una citocina, un átomo radiactivo, un ARNip o una toxina. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.
En algunas realizaciones, el agente es un átomo radiactivo.
Otro aspecto más de la presente enseñanza es un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR). El CAR o TCR comprenden (i) un dominio de unión al antígeno, (ii) un dominio coestimulador y (iii) un dominio de activación. El dominio coestimulador comprende un dominio extracelular, un dominio transmembranal y un dominio intracelular, y el dominio de unión al antígeno comprende al menos el polipéptido de la reivindicación 52.
En algunas realizaciones, el dominio coestimulador es de o se deriva de CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), Cd 69 (ClEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, receptor Fc gamma, molécula MHC clase 1, molécula MHC clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores activadores de células Nk , un receptor del ligando Toll y fragmentos o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el dominio transmembranal es de o se deriva de 4-1BB/CD137, una cadena alfa de un receptor de células T, una cadena beta de un receptor de células T, CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5),<c>D69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), Cd 84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, receptor Fc gamma, molécula MHC clase 1, molécula MHC clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores activadores de células N<k>, un receptor del ligando Toll y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el dominio intracelular es de o se deriva de 4-1BB/CD137, que activa los receptores de céluls NK, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8alfa, CD8beta, CD96 (Táctil), CDl la, CDl lb, CDl lc, CDl ld, CDS, CEACAM1, CRT AM, receptores de citocina, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc gamma, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig alfa (CD79a), IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, proteínas tipo inmunoglobulinas, coestimulador de las células T inducible (ICOS), integrinas, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2,<l>A<t>, LFA-1, LFA-1, un ligando que se une específicamente a CD83, LIGHT, LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1 (CD1 la/CD18), molécula MHC clase I, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, muerte programada-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), moléculas de activación de señalización linfocítica (proteínas SLAM), SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, proteínas receptoras de TNF, TNFR2, un receptor del ligando Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 o VLA-6, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el dominio extracelular es de o se deriva de CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, receptor Fc gamma, molécula MHC clase 1, molécula MHC clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores celulares activados por Nk , un receptor del ligando Toll y fragmentos o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el dominio de activación es de o se deriva de CD3-zeta o CD3-episilon.
Un aspecto de la presente enseñanza es un anticuerpo anti-CD 19 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que codifica el CAR o TCR de un aspecto o realización mencionado anteriormente.
Otro aspecto más de la presente enseñanza es un vector que comprende el anticuerpo anti-CD 19 humanizado o un fragmento de unión al antígeno de un aspecto o realización mencionado anteriormente
En algunas realizaciones, el vector es un vector adenoviral, un vector asociado a adenovirus, un vector de ADN, un vector lentiviral, un plásmido, un vector retroviral o un vector de ARN. En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral. En algunas realizaciones, el vector retroviral es un vector lentiviral.
Otro aspecto de la presente enseñanza es el receptor de antígeno quimérico (CAR) o el receptor de células T (TCR) codificado por el vector de un aspecto o realización mencionado anteriormente
Otro aspecto más de la presente enseñanza es una célula que comprende un anticuerpo anti-CD 19 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de un aspecto o realización mencionado anteriormente, un vector de un aspecto o realización mencionado anteriormente, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) o receptor de células T (TCR) de un aspecto o realización mencionado anteriormente.
En algunas realizaciones, la célula es una célula T
En algunas realizaciones, la célula T es una célula T alogénica, una célula T autóloga, una célula T autóloga diseñada (eACT) o un linfocito infiltrante de tumores (TIL).
En algunas realizaciones, la célula T es una célula T CD4+.
En algunas realizaciones, la célula T es una célula T CD8+.
En algunas realizaciones, la célula es una célulain vitro.
En algunas realizaciones, la célula T es una célula T autóloga.
En algunas realizaciones, la célula produce al menos Interferón gamma (IFN<y>) tras unirse al CD 19 humano.
Un aspecto de la presente enseñanza es una composición que comprende una pluralidad de células de un aspecto o realización mencionado anteriormente
En algunas realizaciones, la composición comprende células CD4+ o CD8+. En algunas realizaciones, la composición comprende células CD4+ y CD8+. En algunas realizaciones, entre alrededor de 20% y 80% de las células T son células CD4+ y el resto de las células T son células CD8+. En algunas realizaciones, entre alrededor de 30% y 70% de las células T son células CD4+ y el resto de las células T son células CD8+. En algunas realizaciones, entre alrededor de 40% y 60% de las células T son células CD4+ y el resto de las células T son células CD8+. En algunas realizaciones, alrededor de 50% de las células T son células CD4+ y alrededor de 50% de las células T son células CD8+.
En algunas realizaciones, cada célula en la pluralidad de células es una célula T autóloga.
En algunas realizaciones, la composición comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la presente enseñanza es una composición que comprende un anticuerpo anti-CD 19 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de un aspecto o realización mencionado anteriormente, un vector de un aspecto o realización mencionado anteriormente, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) o receptor de células T (TCR) de un aspecto o realización mencionado anteriormente.
Otro aspecto más de la presente enseñanza es un método para fabricar una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR). El método comprende el paso de transducir a una célula con un anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de un aspecto o realización mencionado anteriormente o un vector de un aspecto o realización mencionado anteriormente.
En algunas realizaciones, la célula es un linfocito aislado de un paciente en necesidad del tratamiento.
En algunas realizaciones, el linfocito es una célula asesina natural, una célula T o una célula B.
En algunas realizaciones, el método comprende además el paso de cultivar la célula bajo condiciones que promuevan la proliferación celular y/o la activación de las células T.
En algunas realizaciones, el método comprende además el paso del aislamiento de las células T deseadas.
En algunas realizaciones, el paso del aislamiento de las células T deseadas se produce después de alrededor de seis días de cultivo.
En algunas realizaciones, las células T deseadas expresan CD4+ y/o CD8+.
Otro aspecto más de la presente enseñanza es un método para tratar un linfoma de células B que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una célula de un aspecto o realización mencionado anteriormente o una composición de un aspecto o realización mencionado anteriormente.
En algunas realizaciones, el linterna de células B se selecciona del grupo que consiste en Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL), Linterna relacionado con el SIDA, Linterna de células B grandes ALK positivo, Linterna de Burkitt, Leucemia Linfocítica Crónica, CLL), Linterna de Hodgkin Clásico, Linterna Difuso de Células B grandes (DLBCL), Linterna folicular, Linterna intravascular de células B grandes, Linterna de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, Granulomatosis linfomatoide, Linterna linfoplasmocítico, Linterna de células del manto (MCL), Linterna de zona marginal de células B (MZL), Linterna de tejido linfático asociado a mucosas (MALT), Linterna de células B de la zona marginal ganglionar (NMZL), Linterna de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares, Linfoma no Hodgkin, Linfoma plasmablástico, Linfoma primario del sistema nervioso central, Linforma de derrame primario, Linfoma de la zona marginal esplénica (SMZL) y macroglobulinemia de Waldenstrom. En algunas realizaciones, el linfoma de células B se selecciona del grupo que consiste en Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL), Leucemia Linfocítica Crónica, CLL), Linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), Linfoma folicular, Linfoma de células del manto (MCL), Linfoma de células B de la zona marginal (MZL), Linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT) y Linfoma no Hodgkin. En algunas realizaciones, el linfoma de células B es un linfoma no Hodgkin.
Generalmente, la presente enseñanza se relaciona con la Terapia de Células Autólogas Diseñadas, abreviada como "eACT™", también conocida como transferencia celular adoptiva eACT™, es un proceso mediante el cual las propias células T de un paciente se recolectan y posteriormente se diseñan genéticamente para reconocer y dirigir uno o más de los antígenos expresados en la superficie celular de una o más indicaciones específicas de cáncer. Las células T pueden diseñarse para expresar, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR). Véase, FIG. 1A, FIG. 1B, y FIG. 2. Las células T CAR positivas (CAR+) están diseñadas para expresar un CAR. Los CARs pueden comprender, por ejemplo, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) humanizado con especificidad por un antígeno tumoral particular, por ejemplo, CD19 humano. El scFv puede estar vinculado directa o indirectamente a una parte de señalización intracelular que comprende al menos un dominio coestimulador, el cual, a su vez, está vinculado directa o indirectamente con al menos un dominio de activación. Los componentes de un CAR pueden disponerse en cualquier orden. Se describen ejemplos de terapias y construcciones de las células T con CAR en las Publicaciones de patentes de EE. UU. Nos. 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309, y 2014/0050708; Solicitudes provisionales de EE. UU. Nos. 62/470,703 y 62/317,258; Publicaciones Internacionales de Patentes Nos. WO2012033885, W02012079000, WO2014127261, WO2014186469, WO2015080981, WO2015142675, WO2016044745, y WO2016090369; y Rosenberg and Restifo, Cancer Immunology and Immunotherapy, 348: 62-68 (2015).
Además, la presente enseñanza se refiere generalmente a un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) humanizado con especificidad por CD19 humano. El scFV CD19 anti-humano scFV humanizado puede conjugarse (por ejemplo, unirse) a un agente terapéutico (por ejemplo, un agente quimioterapéutico y un átomo radiactivo) para unirse a una célula cancerígena, administrar el agente terapéutico a la célula cancerígena y matar la célula cancerígena que expresa CD19 humano.
Cualquier aspecto o realización descrito en la presente se puede combinar con uno otro cualquiera de los aspectos o realizaciones como se divulgan en la presente. Mientras que la presente enseñanza se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción precedente pretende ilustrar y no limitar el alcance de la presente enseñanza, la cual se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
La literatura científica y de patentes a la que se hace referencia en la presente establece el conocimiento que está disponible para aquellos con experiencia en la técnica.
Otras características y ventajas de la enseñanza serán evidentes a partir de los Figuras y la Descripción Detallada a continuación, incluidos los Ejemplos y las reivindicaciones.
Descripción breve de las Figuras
Las características anteriores y otras adicionales se apreciarán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada cuando se tome en conjunto con las figuras adjuntas. Sin embargo, las figuras tienen únicamente fines ilustrativos; no para limitación.
FIG. 1A y FIG. 1B son caricaturas que representan características de la fabricación y el uso del receptor de antígeno quimérico (CAR). La FIG. 1A muestra un polinucleótido ejemplar que codifica para un CAR, un vector viral que comprende el polinucleótido que codifica para el CAR, la transducción del vector viral en la célula T de un paciente, la integración en el genoma del hospedero y la expresión de un CAR en la superficie de la célula T transducida ("CAR-diseñado"). La FIG. 1B muestra una célula T diseñada con un CAR que ha reconocido un antígeno diana localizado en la superficie de una célula cancerígena. El reconocimiento y la unión del antígeno diana activa mecanismos en las células T, incluida la actividad citolítica, la liberación de citocina y la proliferación de las células T; estos mecanismos promueven la muerte de las células cancerígenas.
FIG. 2 es una caricatura que muestra los pasos principales realizados durante la terapia de células autólogas diseñadas (eACT™).
FIG. 3A y FIG. 3B son gráficas que muestran los datos de citometría de flujo para siete scFv humanizados seleccionados para la unión a las células Raji (CD19+homo sapienslinterna de Burkitt). RS, CS, BS, SS, JS, AS, AS-R y NS representan la convención de denominación interna del inventor para los anticuerpos humanizados; TS representa el tipo silvestre.
FIG. 4A a FIG. 4D son gráficas que muestran el análisis de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de los scFv humanizados NS, SS, JS y AS. Este ensayo refleja la propensión a la agregación soluble de estos anticuerpos.
FIG. 5A y FIG. 5B son gráficas que muestran la rampa térmica para determinar la estabilidad polipeptídica de los CARs que comprenden los scFv humanizados NS, SS, JS y AS. En la FIG. 5A, la termoestabilidad se determinó en presencia de 50 mM de NaCl y en la FIG. 5B, se omitió el NaCl. Se muestra el CAR derivado de scFv AS ("□"), SS ("A"), JS ("O") y NS ("X").
FIG. 6A y FIG. 6B incluyen una serie de gráficas que muestran la detección de los CARs que comprenden SS-, JS-, AS- y NS- de la presente enseñanza expresados en la superficie de las células T, los cuales se obtuvieron de dos sujetos donadores 5244 (FIG. 6A) y 5273 (FIG. 6B). También se preparó un CAR simulado que expresa células del donador y células del donador que expresan un CAR que comprende el anticuerpo parental scFv ("FMC63").
FIG. 7A a FIG. 7D incluye una serie de gráficas de barras que demuestran la actividad citolítica de los CARs de la presente enseñanza con células de donadortransducidas mediante CAR o simuladas, del donador 5244. Se agregaron células de donadortransducidas con CAR o simuladas en una proporción de efector a diana de 1:1 o 4:1. Se utilizaron cuatro tipos de células diana: Raji (CD19+homo sapienslinfoma de Burkitt; FIG. 7A), Namalawa (CD19+homo sapienscélulas de linfoma de Burkitt; FIG. 7B), Eol-1 (CD19‘homo sapienscélulas de leucemia mieloide aguda (eosinófila); FIG. 7C), y Mv411 (CD19‘homo sapienscélulas de leucemia mielomonocítica bifenotípica B; FIG. 7D). Se utilizó estaurosporina ("Stauro") como control positivo para la muerte de las células tumorales.
FIG. 8A a FIG. 8D incluyen una serie de gráficas de barras que demuestran la actividad citolítica de los CARs de la presente enseñanza con células de donador transducidas mediante CAR o simuladas, del donador 5273. Se añadieron células de donador transducidas mediante CAR o simuladas en una proporción de efector a diana de 1:1 o 4:1 Se utilizaron cuatro tipos de células diana: células Raji (FIG. 8A), células Namalawa (FIG. 8B), células Eol-1 (FIG. 8C) y células Mv411 (FIG. 8D). Stauro se utilizó como control positivo para la muerte de las células tumorales.
FIG. 9A y 9B muestran la cinética de crecimiento de las células T transducidas con CAR o simuladas de un donador adicional medidas durante diez días después de la estimulación inicial con OKT3. Los perfiles de crecimiento observados de cada CAR se muestran en la FIG. 9A. Luego se estimularon por segunda vez las células T transducidas con CAR o simuladas y se observaron diferencias en la cinética de crecimiento como se muestra en la FIG. 9B.
FIG. 10A muestra la caracterización de las poblaciones de las células T en el día 10 utilizando un anticuerpo anti-CAR y CD3. La FIG. 10B muestra la tinción de CD4/CD8 durante la producción de las células T con CAR.
FIG. 11A y 11B muestran ensayos de citotoxicidad realizados en células NAMALWACD19+ (FIG. 11A) o EOL-1 CD19-(FIG. 11B). Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
Descripción detallada
La presente enseñanza se refiere a nuevos polipéptidos que comprenden dominios de unión al antígeno humanizados, los cuales reconocen y se unen a CD19 humano y polinucleótidos que codifican para el mismo. Algunos aspectos de la enseñanza se refieren a un polinucleótido que codifica para un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende el dominio de unión al antígeno humanizado CD19 anti-humano. La presente enseñanza también proporciona vectores (por ejemplo, vectores virales) que comprenden dichos polinucleótidos y composiciones que comprenden dichos vectores. La presente enseñanza proporciona además polinucleótidos que codifican para dichos CARs o TCRs y composiciones que comprenden a dichos polinucleótidos. La presente enseñanza proporciona adicionalmente células diseñadas (por ejemplo, células T) que comprenden dichos polinucleótidos y/o transducidas con dichos vectores virales y composiciones que comprenden dichas células diseñadas. La presente enseñanza proporciona composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que incluyen una pluralidad de las células T diseñadas. La presente enseñanza proporciona métodos para fabricar dichas células T diseñadas y composiciones y usos (por ejemplo, en el tratamiento de un linfoma de células B) de dichas células T diseñadas y composiciones. Y la presente enseñanza proporciona un método para inducir una inmunidad contra un tumor que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un polinucleótido, un vector o un polipéptido de la presente enseñanza. Otros aspectos de la enseñanza se relacionan a células que comprenden el c Ar o el TCR y su uso en una terapia con células T, por ejemplo, una terapia de células autólogas (eACT™), para el tratamiento de un paciente que padece de un cáncer.
Definiciones
Para que la presente enseñanza se pueda entender más fácilmente, a continuación, se definen primero ciertos términos. A lo largo de la Especificación se establecen definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos.
Como se utilizan en esta Especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se indique específicamente o que sea obvio por el contexto, como se utiliza en la presente, se entiende que el término "o" es inclusivo y cubre tanto "o" como "y".
El término "y/o" cuando se utiliza en la presente debe tomarse como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" tal como se utiliza en una frase como "A y/o B" en la presente pretende incluir A y B; A o B; A (por sí solo); y B (por sí solo). Asimismo, el término "y/o" tal como se utiliza en una frase tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (por sí solo); B (por sí solo); y C (por sí solo).
Los términos "por ejemplo," y "es decir" tal como se utilizan en la presente, se utilizan simplemente a modo de ejemplo, sin intención de limitación, y no deben de interpretarse como una referencia únicamente a aquellos elementos enumerados explícitamente en la especificación.
Los términos "o más", "al menos", "más que", y similares, por ejemplo, "al menos uno" se entiende que incluye, pero no se limitan a, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más que el valor indicado. También se incluye cualquier número mayor o fracción intermedios.
Por el contrario, el término "no más de" incluye cada valor menor que el valor indicado. Por ejemplo, "no más de 100 nucleótidos" incluye 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, y 0 nucleótidos. También se incluye cualquier número menor o fracción intermedio.
Se entiende que los términos "pluralidad", "al menos dos", "dos o más", "al menos un segundo" y similares incluyen, pero no se limitan a, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más. También se incluye cualquier número mayor o fracción intermedios.
A lo largo de la especificación, se entenderá que la palabra "que comprende", o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", implica la inclusión de un elemento indicado, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos, pero no la exclusión de otro elemento uno cualquiera, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos. Se entiende que siempre que se describan aspectos en la presente con el término "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en". A menos que se indique específicamente o sea evidente por el contexto, como se utiliza en la presente, el término "alrededor de" se refiere a un valor o composición que está dentro de un intervalo de error aceptable para el valor o composición particular según lo determine un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor o la composición, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "alrededor de" o "que comprende esencialmente de" puede significar dentro de una o más de una desviación estándar de acuerdo con la práctica en la técnica. "Alrededor de" o "que comprende esencialmente de" puede significar un intervalo de hasta10% (es decir, ±10%). Por lo tanto, se puede entender que "alrededor de" está dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, o 0.001% mayor o menor que el valor indicado Por ejemplo, alrededor de 5 mg pueden incluir cualquier cantidad entre 4.5 mg y 5.5 mg. Además, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces un valor. Cuando se proporcionan valores o composiciones particulares en la presente divulgación, a menos que se indique lo contrario, se debe asumir que el significado de "alrededor de" o "que comprende esencialmente de" está dentro de un intervalo de error aceptable para ese valor o composición particular.
Como se describe en la presente, se debe entender que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de proporción o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tales como un décimo y un centésimo de un número entero), a menos que se indique lo contrario.
Las unidades, prefijos y símbolos utilizados en la presente se proporcionan utilizando su forma aceptada por elSystéme International de Unites(SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona con habilidades ordinarias en la técnica con la que se relaciona esta divulgación. Por ejemplo, Juo, “The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology", 2nd ed., (2001), CRC Press; "The Dictionary of Cell & Molecular Biology", 5th ed., (2013), Academic Press; y "The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology", Cammack et al. eds., 2nd ed, (2006), Oxford University Press, proporcionan a los expertos en la técnica un diccionario general para muchos de los términos utilizados en esta divulgación.
"Administrar" se refiere a la introducción física de un agente a un sujeto, utilizando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica. Las vías de administración ejemplares para las formulaciones descritas en la presente incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se utiliza en la presente significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación inyección e infusión, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbitaria, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, así como electroporaciónin vitro.En algunas realizaciones, la formulación se administra por vía no parenteral, por ejemplo, oralmente. Otras vías no parenterales incluyen una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La administración también se puede realizar, por ejemplo, una vez, varias veces y/o durante uno o más períodos prolongados.
El término "anticuerpo" (Ab) incluye, sin limitación, una glicoproteína inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. En general, un anticuerpo puede comprender al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una molécula de unión al antígeno de las mismas. Cada cadena P comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio constante, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL comprende tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el amino terminal al carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los Abs pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedero, incluidas varias células del sistema inmunológico (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
Los anticuerpos pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (incluidos anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos diseñados, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, inmunoglobulinas, anticuerpos sintéticos, anticuerpos tetraméricos que comprenden moléculas de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, un anticuerpo monómero de cadena ligera, un anticuerpo monómero de cadena pesada, un anticuerpo dímero de cadena ligera, un anticuerpo dímero de cadena pesada, un par de anticuerpo de cadena ligera y anticuerpo de cadena pesada, intracuerpos, fusiones de anticuerpos (a veces denominadas en la presente como "conjugados de anticuerpo"), anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos de dominio único, anticuerpos monovalentes, anticuerpos de cadena sencilla o Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos camelizados, aficuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fvs unidos por disulfuro (Fvds), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluidos, por ejemplo, anticuerpos antianti-Id), minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en la presente como "anticuerpos miméticos") y fragmentos de unión al antígeno de cualquiera de los anteriores. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en la presente se refieren a poblaciones de anticuerpos policlonales.
Una inmunoglobulina puede derivar de cualquiera de los isotipos comúnmente conocidos, incluidos, pero limitados a IgA, IgA secretora, IgG, IgE e IgM. Las subclases de IgG también son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. "Isotipo" se refiere a la clase o subclase de Ab (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada. El término "anticuerpo" incluye, a modo de ejemplo, Abs que se producen de forma natural y que no se producen de forma natural; Abs monoclonales y policlonales; Abs quiméricos y humanizados; Abs humanos o no humanos; Abs totalmente sintéticos; y Abs de cadena sencilla. Un Ab no humano puede humanizarse mediante métodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en el hombre. Cuando no se indique expresamente, y a menos que el contexto indique lo contrario, el término "anticuerpo" también incluye un fragmento de unión al antígeno o una porción de unión al antígeno de cualquiera de las inmunoglobulinas antes mencionadas, e incluye un fragmento o porción monovalente y divalente, y un Ab de cadena sencilla.
Una "secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo" puede derivarse físicamente, por ejemplo, expresado a partir de un fragmento de un polinucleótido que codifica para el anticuerpo, o puede ser derivadoin silico,por ejemplo, la secuencia de nucleótidos determinada para codificar el anticuerpo (o fragmento del mismo) se utiliza para sintetizar una secuencia (o fragmento) de polinucleótidos artificial y la secuencia de polinucleótidos artificial se expresa como el anticuerpo, o fragmento del mismo.
Una "molécula de unión al antígeno", "porción de unión al antígeno" o "fragmento del anticuerpo" se refiere a una molécula cualquiera que comprende las partes de unión al antígeno (por ejemplo, CDRs) del anticuerpo del que se deriva la molécula. Una molécula de unión al antígeno puede incluir las regiones determinantes de complementariedad antigénica (CDRs). Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv, dAb, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de moléculas de unión al antígeno. Los pepticuerpos (es decir, moléculas de fusión Fc que comprenden dominios de unión a péptidos) son otro ejemplo de moléculas de unión al antígeno adecuadas. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno en una célula tumoral. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno de una célula implicada en una enfermedad hiperproliferativa o a un antígeno viral o bacteriano. En determinadas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a CD19. En realizaciones adicionales, la molécula de unión al antígeno es un fragmento de anticuerpo que se une específicamente al antígeno, incluyendo una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del mismo.
En realizaciones adicionales, la molécula de unión al antígeno es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). Una molécula polipeptídica scFv es un heterodímero unido covalentemente: V<h>: :V<l>, que puede expresarse a partir de una fusión de genes que incluye genes que codifican para V<h>- y V<l>- unidos por un enlazador que codifica para un péptido. (Véase Huston et al. (1988) Proc Nat Acad Sci EE.UU. 85(16):5879-5883). El péptido enlazador (por ejemplo, de alrededor de diez a alrededor de 25 aminoácidos) suele ser rico en glicina para la flexibilidad, así como en serina o treonina para la solubilidad. El enlazador puede conectar ya sea el N-terminal de la VH con el C-terminal de la VL o conectar el C-terminal de la VH con el N-terminal de la VL. Esta proteína conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del enlazador. Un scFv también puede incluir una secuencia peptídica N-terminal, la cual a veces se denomina "péptido señal" o "secuencia líder". Se han descrito varios métodos para discernir estructuras químicas para convertir a las cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas agregadas naturalmente, pero separadas químicamente, de una región V del anticuerpo en una molécula scFv, la cual se plegará en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Patentes de EE. UU. Nos. 5,091,513; 5,132,405; y 4,946,778.
Se han creado y pueden crearse bibliotecas de scFv humanos ingenuos muy grandes para ofrecer una gran fuente de genes de anticuerpos reordenados contra una gran cantidad de moléculas diana. Se pueden construir bibliotecas más pequeñas a partir de individuos con enfermedades infecciosas para aislar anticuerpos específicos a la enfermedad (Véase Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:9339-43 (1992).); Zebedee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:3175-79 (1992)).
Como se utiliza en la presente, los términos "región variable" o "dominio variable" se utilizan indistintamente y son comunes en la técnica. La región variable típicamente se refiere a una porción de un anticuerpo, generalmente, una porción de una cadena ligera o pesada, típicamente alrededor de los 110 a 120 aminoácidos en el amino-terminal en la cadena pesada madura y alrededor de 90 a 115 aminoácidos en la cadena ligera madura, los cuales difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), mientras que las regiones más conservadas en el dominio variable se denominan regiones marco (FR). Sin desear quedar limitado por ningún mecanismo o teoría en particular, se cree que las CDRs de las cadenas ligera y pesada son las principalmente responsables de la interacción y especificidad del anticuerpo con el antígeno. En determinadas realizaciones, la región variable es una región variable humana. En determinadas realizaciones, la región variable comprende CDRs de roedores o murinos y regiones marco (FRs) humanas. En realizaciones particulares, la región variable es una región variable de un primate (por ejemplo, primate no humano). En ciertas realizaciones, la región variable comprende CDRs de roedor o murino y regiones marco (FRs) de primate (por ejemplo, primates no humanos).
Los términos "VL", "región VL" y "dominio VL" se utilizan indistintamente para referirse a la región variable de la cadena ligera de un dominio de unión al antígeno tal como un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y comprenden una, dos, o las tres CDRs.
Los términos " VH ", "región VH " y "dominio VH " se utilizan indistintamente para referirse a la región variable de la cadena pesada de un dominio de unión al antígeno tal como un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y comprenden una, dos, o las tres CDRs.
Se utilizan habitualmente varias definiciones de CDRs: Numeración de Kabat, numeración de Chothia, numeración de AbM o numeración de contacto. La definición de AbM es un compromiso entre las dos utilizadas por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. La definición del contacto se basa en un análisis de los complejos de las estructuras cristalinas disponibles.
Tabla 1. Numeración de CDR
El término "numeración de Kabat" y términos similares se reconocen en la técnica y se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácidos en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, o una molécula de unión al antígeno del mismo. En ciertos aspectos, las CDRs de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (véase, por ejemplo, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 y Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242). Utilizando el sistema de numeración de Kabat, las CDRs dentro de una molécula de cadena pesada de anticuerpo generalmente están presentes en las posiciones de aminoácidos 31 a 35, las cuales opcionalmente pueden incluir uno o dos aminoácidos adicionales, después de 35 (denominados en el esquema de numeración de Kabat como 35A y 35B) (CDR1), posiciones de aminoácidos 50 a 65 (CDR2) y posiciones de aminoácidos 95 a 102 (CDR3). Utilizando el sistema de numeración de Kabat, las CDRs dentro de una molécula de la cadena ligera de un anticuerpo normalmente están presentes en las posiciones de aminoácidos 24 a 34 (CDR1), posiciones de aminoácidos 50 a 56 (CDR2) y posiciones de aminoácidos 89 a 97 (CDR3). En una realización específica, las CDRs de los anticuerpos descritos en la presente se han determinado de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat.
En ciertos aspectos, las CDRs de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia, el cual se refiere a la ubicación de los bucles estructurales de las inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; y Patente de EE. UU. No.
7,709,226). Normalmente, cuando se utiliza la convención de numeración de Kabat, el bucle Chothia CDR-H1 está presente en los aminoácidos de la cadena pesada 26 a 32, 33 o 34, el bucle Chothia CDR-H2 está presente en los aminoácidos de la cadena pesada 52 a 56 y el bucle Chothia CDR-H3 está presente en los aminoácidos de la cadena pesada 95 a 102, mientras que el bucle Chothia CDR-L1 está presnte en los aminoácidos de la cadena ligera 24 a 34, el bucle Chothia CDR-L2 está presente en los aminoácidos de la cadena ligera 50 a 56, y el bucle Chothia CDR-L3 está presente en los aminoácidos de la cadena ligera 89 a 97. El final del bucle Chothia CDR-HI cuando se numera utilizando la convención de numeración de Kabat varía entre P32 y P34 dependiendo de la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en P35A y P35B; si ni 35A ni 35B están presentes, el bucle termina en 32; si sólo está presente 35A, el bucle termina en 33; si tanto 35A como 35B están presentes, el bucle termina en 34). En una realización específica, las CDRs de los anticuerpos descritos en la presente se han determinado de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia.
Tabla 2. CDR para la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo anti-CD19 FMC63 o un fragmento del mismo
Tabla 3. CDR para la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo anti-CD19 FMC63 o fragmento del mismo
Tal como se utilizan en la presente, los términos "región constante" y "dominio constante" son intercambiables y tienen el significado común en la técnica. La región constante es una porción del anticuerpo, por ejemplo, una porción del carboxilo terminal de una cadena ligera y/o pesada, la cual no está directamente implicada en la unión de un anticuerpo al antígeno pero que puede mostrar diversas funciones efectoras, tales como la interacción con el receptor Fc. La región constante de una molécula de inmunoglobulina generalmente tiene una secuencia de aminoácidos más conservada en relación con un dominio variable de inmunoglobulina.
Como se utiliza en la presente, el término "cadena pesada" cuando se utiliza en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, alfa (a), delta (8), épsilon (e), gamma (y) y mu (p), basado en la secuencia de aminoácidos del dominio constante, dando lugar a las clases de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluidas las subclases de IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Como se utiliza en la presente, el término "cadena ligera" cuando se utiliza en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, kappa (<k>) o lambda (<á>) de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera son bien conocidas en la técnica. En realizaciones específicas, la cadena ligera es una cadena ligera humana.
La "afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre el único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se utiliza en la presente, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente puede representarse mediante la constante de disociación (K<d>). La afinidad se puede medir y/o expresar de varias formas conocidas en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, la constante de disociación de equilibrio (K<d>), y la constante de asociación de equilibrio (K<a>). La K<d>se calcula a partir del cociente de kapagado/kprendido, mientras que K<a>se calcula a partir del cociente de kprendido/kapagado. kprendido se refiere a la constante de la tasa de asociación de, por ejemplo, un anticuerpo a un antígeno, y kapagado se refiere a la disociación de, por ejemplo, un anticuerpo a un antígeno. La kprendido y kapagado puede determinarse mediante técnicas conocidas por una persona con habiliddes ordinarias en la técnica, tales como BIACORE® o KinExA.
CD19 (también conocido como clúster de diferenciación 19, antígeno de linfocitos B CD19, antígeno de superficie de linfocitos B B4, B4, CVID3, antígeno de diferenciación CD19) es una proteína que en los humanos está codificada por el genCD19.Se encuentra en la superficie de las células B. Dado que CD19 es un sello distintivo de las células B, puede ser un antígeno útil para el reconocimiento de las células cancerígenas que surgen de este tipo de células B, es decir, los linfomas de células B.
Como se utiliza en la presente, una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). En determinadas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos dentro de una(s) CDR(s) o dentro de una(s) región(es) marco de un anticuerpo o molécula de unión al antígeno del mismo se pueden reemplazar con un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar.
Tal como se utiliza en la presente, el término "heterólogo" significa de cualquier fuente distinta a las secuencias que se producen de forma natural. Por ejemplo, una secuencia heteróloga, incluida como parte de una proteína coestimuladora que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, por ejemplo, la proteína coestimuladora humana correspondiente, son aminoácidos que no se producen de forma natural, es decir, que no se alinean con, la proteína coestimuladora humana de tipo silvestre. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos heteróloga se refiere a una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia que codifica para la proteína coestimuladora humana de tipo silvestre.
Como se utiliza en la presente, un "epítope" es un término en la técnica y se refiere a una región localizada de un antígeno a la que se puede unir específicamente un anticuerpo. Un epítope puede ser, por ejemplo, aminoácidos contiguos de un polipéptido (epítope lineal o contiguo) o un epítope puede, por ejemplo, venir junto de dos o más regiones no contiguas de un polipéptido o polipéptidos (conformacionales, no lineales, epítope discontinuo o no contiguo). En determinadas realizaciones, el epítope al que se une un anticuerpo puede determinarse mediante, por ejemplo, espectroscopia de RMN, estudios de cristalografía por difracción de rayos X, ensayos de ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio acoplado con espectrometría de masas (por ejemplo, cromatografía líquida espectrometría de masas por electropulverización), ensayos de exploración de oligopéptidos basados en arreglos y/o mapeo por mutagénesis (por ejemplo, mapeo por mutagénesis sitio dirigida). Para la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23, Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Los cristales de anticuerpo:antígeno se pueden estudiar utilizando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden refinar utilizando software informático conocido en la técnica, por ejemplo, Refmac y Phenix. Los estudios de mapeo por mutagénesis se pueden realizar utilizando cualquier método conocido por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 y Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 para obtener una descripción de las técnicas de mutagénesis, incluidas las técnicas de mutagénesis por exploración de alanina.
Como se utiliza en la presente, una molécula de unión al antígeno, un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo "compite de forma cruzada" con un anticuerpo de referencia o una molécula de unión al antígeno del mismo si la interacción entre un antígeno y la primera molécula de unión, un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo bloquea, limita, inhibe o de otro modo reduce la capacidad de la molécula de unión al antígeno, el anticuerpo de referencia o una molécula de unión al antígeno del mismo para interactuar con el antígeno. La competencia cruzada puede ser completa, por ejemplo, la unión de la molécula de unión al antígeno bloquea completamente la capacidad de la molécula de unión de referencia para unirse al antígeno, o puede ser parcial, por ejemplo, la unión de la molécula de unión al antígeno reduce la capacidad de la molécula de unión de referencia para unirse al antígeno. En determinadas realizaciones, una molécula de unión al antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión al antígeno de referencia se une al mismo o a un epítope superpuesto que la molécula de unión al antígeno de referencia. En otras realizaciones, la molécula de unión al antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión al antígeno de referencia se une a un epítope diferente al de la molécula de unión al antígeno de referencia. Se pueden utilizar varios tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una molécula de unión al antígeno compite con otra, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida; inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida; ensayo de competencia en sándwich (Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619); ensayo de marcado directo en fase sólida, ensayo en sándwich de marcado directo en fase sólida (Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de etiqueta directa de fase sólida utilizando la etiqueta 1-125 (Morel et al., 1988, Molec. Inmunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina directa en fase sólida (Cheung, et al., 1990, Virología 176:546-552); y RIA de etiquetado directo (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Inmunol.
32:77-82).
Como se utilizan en la presente, los términos "une inmunoespecíficamente", "reconoce inmunoespecíficamente", "une específicamente" y "reconoce específicamente" son términos análogos en el contexto de los anticuerpos y se refieren a moléculas que se unen a un antígeno (por ejemplo, epítope o complejo inmune) tal como unión es entendido por un experto en la técnica. Por ejemplo, una molécula que se une específicamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos, generalmente con menor afinidad de acuerdo con lo determinado por, por ejemplo, inmunoensayos, BIACORE®, instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID) u otros ensayos conocidos en la técnica. En una realización específica, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno se unen al antígeno con una K<a>es decir, al menos 2 logs, 2.5 logs, 3 logs, 4 logs o más que la K<a>cuando las moléculas se unen a otro antígeno.
En una realización específica, en la presente se proporciona un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo que se une a un antígeno humano diana, por ejemplo, CD19 humano, con mayor afinidad que por otra especie del antígeno diana, por ejemplo, un CD19 no humano. En ciertas realizaciones, en la presente se proporciona un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo que se une al antígeno humano diana, por ejemplo, CD19 humano, con una afinidad de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o superior que a otra especie del antígeno diana como se mide por, por ejemplo, un radioinmunoensayo, resonancia de plasmón superficial o ensayo de exclusión cinética. En una realización específica, un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo descritos en la presente, que se unen a un antígeno humano diana, se unirá a otra especie del antígeno diana con menos de 10%, 15% o 20% de la unión del anticuerpo o una molécula de unión al antígeno del mismo al antígeno humano medido por, por ejemplo, un radioinmunoensayo, resonancia de plasmón superficial o ensayo de exclusión cinética.
Un "antígeno" se refiere a cualquier molécula que provoque una respuesta inmune o que sea capaz de unirse mediante un anticuerpo o una molécula de unión al antígeno. La respuesta inmune puede implicar la producción de anticuerpos, la activación de células específicas inmunológicamente competentes, o ambas. Una persona experta en la técnica entendería fácilmente que cualquier macromolécula, incluidas prácticamente todas las proteínas o péptidos, pueden servir como un antígeno. Un antígeno puede expresarse endógenamente, es decir, expresarse mediante ADN genómico, o puede expresarse de forma recombinante. Un antígeno puede ser específico de un tejido determinado, tal como una célula cancerígena, o puede expresarse de manera amplia. Además, fragmentos de moléculas más grandes pueden actuar como antígenos. En una realización, los antígenos son antígenos tumorales. En una realización particular, el antígeno es todo o un fragmento de CD 19 humano.
El término "neutralizante" se refiere a una molécula de unión al antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une a un ligando y previene o reduce el efecto biológico de ese ligando. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea directamente un sitio de unión en el ligando o altera de otro modo la capacidad del ligando para unirse a través de medios indirectos (tales como alteraciones estructurales o energéticas en el ligando). En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno, scFv, anticuerpo o un fragmento del mismo evita que la proteína a la cual está unido realice una función biológica.
Tal como se utiliza en la presente, el término "autólogo" significa cualquier material derivado del mismo individuo al cual posteriormente se le reintroducirá. Por ejemplo, la Terapia de Células Autólogas Diseñadas (eACT™), también conocida como transferencia celular adoptiva, es un proceso mediante el cual se recolectan las células T del propio paciente y posteriormente se diseñan genéticamente para expresar un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido que codifica para un CAR que reconoce y dirige a uno o más de los antígenos expresados en la superficie celular de una o más células tumorales o neoplasias malignas específicas, y luego se administra nuevamente al mismo paciente.
El término "alogénico" se refiere a cualquier material derivado de un individuo el cual es luego introducido en otro individuo de la misma especie, por ejemplo, trasplante alogénico de las células T
Los términos "transducción" y "transducido" se refieren al proceso mediante el cual se introduce ADN externo en una célula a través de un vector viral (véase Jones et al., "Genetics: principles and analysis," Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)). En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral de vaccinia, un vector viral del herpes simple, un vector asociado al adenovirus, un vector lentiviral, o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se utilizan en la presente, los términos "diseño genético" o "diseño" se utilizan indistintamente y significan un método para modificar el genoma de una célula, que incluye, pero no se limita a, eliminar una región codificante o no codificante o una porción de la misma o insertar una región codificante o una porción de la misma. En algunas realizaciones, la célula que se modifica es un linfocito, por ejemplo, una célula T, la cual puede obtenerse de un paciente o de un donador. La célula puede modificarse para expresar una construcción exógena, tal como, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR), que se incorpora al genoma de la célula.
Un "cáncer" se refiere a un amplio grupo de diversas enfermedades caracterizadas por el crecimiento descontrolado de células anormales en el cuerpo. La división y el crecimiento celular no regulados dan como resultado la formación de tumores malignos que invaden los tejidos vecinos y también pueden metastatizar a partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o del torrente sanguíneo. Un "cáncer" o "tejido cancerígeno" puede incluir un tumor. Los ejemplos de cánceres que pueden tratarse mediante los métodos de la presente enseñanza incluyen, pero no se limitan a, cánceres del sistema inmunológico, incluyendo linfoma, leucemia, mieloma y otras neoplasias malignas de leucocitos.
Los cánceres que pueden tratarse incluyen linfomas de células B, Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL), Linfoma relacionado con el SIDA, Linfoma de células B grandes ALK positivo, Linfoma de Burkitt, Leucemia Linfocítica Crónica, CLL), Linfoma de Hodgkin Clásico, Linfoma Difuso de Células B grandes (DLBCL), Linfoma folicular, Linfoma intravascular de células B grandes, Linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, Granulomatosis linfomatoide, Linfoma linfoplasmocítico, Linfoma de células del manto (MCL), Linfoma de zona marginal de células B (MZL), Linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT), Linfoma de células B de la zona marginal ganglionar (NMZL), Linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares, Linfoma no Hodgkin, Linfoma plasmablástico, Linfoma primario del sistema nervioso central, Linfoma de derrame primario, Linfoma de la zona marginal esplénica (SMZL) y macroglobulinemia de Waldenstrom, o una combinación de los mismos. En una realización, el linfoma de células B se selecciona del grupo que consiste en Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL), Leucemia Linfocítica Crónica, CLL), Linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), Linfoma folicular, Linfoma de células del manto (MCL), Linfoma de células B de la zona marginal (MZL), Linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT) y Linfoma no Hodgkin. En una realización, el linfoma de células B es un linfoma no Hodgkin.
El cáncer en particular puede responder a la quimioterapia o radioterapia o el cáncer puede ser refractario. Un cáncer refractario se refiere a un cáncer que no se puede corregir mediante una intervención quirúrgica y que inicialmente no responde a la quimioterapia o radioterapia o el cáncer deja de responder con el tiempo.
Un "efecto antitumoral" como se utiliza en la presente, se refiere a un efecto biológico que puede presentarse como una disminución en el volumen del tumor, una disminución en el número de células tumorales, una disminución en la proliferación de células tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento en la supervivencia general o libre de progresión, un aumento en la esperanza de vida o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con el tumor. Un efecto antitumoral también puede referirse a la prevención de la aparición de un tumor, por ejemplo, una vacuna.
Una "citocina", como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína que no es un anticuerpo que es liberada por una célula en respuesta al contacto con un antígeno específico, en el que la citocina interactúa con una segunda célula para mediar una respuesta en la segunda célula. Una citocina puede expresarse endógenamente por una célula o administrarse a un sujeto. Las células inmunes, incluidos los macrófagos, las células B, las células T y los mastocitos, pueden liberar citocinas para propagar una respuesta inmune. Las citocinas pueden inducir diversas respuestas en la célula receptora. Las citocinas pueden incluir citocinas homeostáticas, quimiocinas, citocinas proinflamatorias, efectores y proteínas de fase aguda. Por ejemplo, las citocinas homeostáticas, incluidas la interleucina (IL) 7 e IL-15, promueven la supervivencia y proliferación de las células inmunes, y las citocinas proinflamatorias pueden promover una respuesta inflamatoria. Los ejemplos de citocinas homeostáticas incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15 e interferón (IFN) gamma. Los ejemplos de citocinas proinflamatorias incluyen, pero no se limitan a, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-13, IL-17a, factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa, TNF-beta, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 2, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), molécula de adhesión intercelular soluble 1 (sICAM-1), molécula de adhesión vascular soluble 1 (CAMVs-1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-C, VEGF-D y factor de crecimiento placentario (PLGF). Los ejemplos de los efectores incluyen, pero no se limitan a, granzima A, granzima B, ligando de Fas soluble (sFasL) y perforina. Ejemplos de proteínas de fase aguda incluyen, pero no se limitan a, proteína C reactiva (CRP) y amiloide A sérico (SAA).
[0099]Las "quimiocinas" son un tipo de citocina que media la quimiotaxis celular o el movimiento direccional. Los ejemplos de quimiocinas incluyen, pero no se limitan a, IL-8, IL-16, eotaxina, eotaxina-3, quimiocina derivada de macrófagos (MDC o CCL22), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1 o CCL2), MCP-4, proteína inflamatoria de macrófagos 1a (MIP-1a, MlP-1a), MlP-1 p (MIP-1b), proteína 10 inducida por gamma (PI-10) y quimiocina regulada por activación y timo (TARC o CCL17).
Una "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis eficaz", "cantidad eficaz" o "dosis terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico, por ejemplo, células CAR T diseñadas, es cualquier cantidad que, cuando se utiliza sola o en combinación con otro agente terapéutico, protege a un sujeto contra la aparición de una enfermedad o promueve la regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico para promover la regresión de la enfermedad se puede evaluar utilizando una variedad de métodos conocidos por el profesional experto, tales como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelos animales predictivos de eficacia en humanos, o ensayando la actividad del agente en ensayosin vitro.
El término "linfocito", tal como se utiliza en la presente, incluye células asesinas naturales (NK), células T o células B. Las células NK son un tipo de linfocito citotóxico (tóxico celular) que representa un componente importante del sistema inmunológico inherente. Las células NK rechazan tumores y células infectadas por los virus. Funciona mediante el proceso de apoptosis o muerte celular programada. Se les denominó "asesinos naturales" porque no requieren activación para poder matar células. Las células T desempeñan un papel importante en la inmunidad mediada por células (sin la participación de anticuerpos). Sus receptores de células T (TCR) se diferencian de otros tipos de linfocitos. El timo, un órgano especializado del sistema inmune, es el principal responsable de la maduración de las células T Hay seis tipos conocidos de las células T, denominadas: Células T auxiliares (por ejemplo, células CD4+), células T citotóxicas (también conocidas como TC, linfocitos T citotóxicos, CTL, células T asesinas, células T citolíticas, células T CD8+ o células T asesinas), células T de memoria ((i) células de memoria madre T<scm>, como células ingenuas, son CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-selectina), CD27+, CD28+ e IL-7Ra+, pero también expresan grandes cantidades de CD95, IL-2Rp, CXCR3 y LFA-1, y muestran numerosos atributos funcionales distintivos de las células de memoria); (ii) Las células de memoria central T<cm>expresan L-selectina y CCR7, secretan IL-2, pero no IFNy o IL-4, y (iii) células de memoria efectora T<em>, sin embargo, no expresan L-selectina o CCR7, pero producen citocinas efectoras como IPNy e IL-4), las células T reguladoras (Tregs, células T supresoras o células T reguladoras CD4+CD25+), células T asesinas naturales (NKT) y células T gamma delta. Las células B, por otra parte, juegan un papel principal en la inmunidad humoral (con la participación de los anticuerpos). Las células B producen anticuerpos, procesan antígenos para desempeñar la función de las células presentadoras de antígenos (APCs) y se desarrollan en células B de memoria después de la activación mediante la interacción con el antígeno. En los mamíferos, las células B inmaduras se desarrollan en la médula ósea, de donde deriva su nombre.
El término "diseñado genéticamente" o "diseñado" se refiere a un método para modificar el genoma de una célula, que incluye, pero no se limita a, eliminar una región codificante o no codificante o una porción de la misma o insertar una región codificante o una porción de la misma. En algunas realizaciones, la célula que se modifica es un linfocito, por ejemplo, una célula T, la cual puede obtenerse de un paciente o de un donador. La célula puede modificarse para expresar una construcción exógena, tal como, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR), el cual se incorpora al genoma de la célula.
Una "respuesta inmune" se refiere a la acción de una célula del sistema inmune (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, células asesinas naturales (NK), macrófagos, eosinófilos, mastocitos, células dendríticas y neutrófilos) y macromoléculas solubles producidas por cualquiera de estas células o el hígado (incluidos Abs, citocinas y complementos) que resultan en la selección dirigida, unión a, daño a, destrucción a y/o eliminación del cuerpo de un vertebrado de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerígenas u otras células anormales, o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.
El término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento de un sujeto que padece, o está en riesgo de contraer o sufrir una recurrencia de, una enfermedad mediante un método que comprende inducir, aumentar, suprimir o de otro modo modificar una respuesta inmune. Los ejemplos de inmunoterapia incluyen, pero no se limitan a, terapias con células T La terapia con células T puede incluir terapia con células T adoptivas, inmunoterapia con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), terapia de células autólogas, terapia de células autólogas diseñadas (eACT™) y trasplante alogénico de las células T Sin embargo, un experto en la técnica reconocería que los métodos de acondicionamiento divulgados en la presente mejorarían la eficacia de cualquier terapia de células T trasplantadas. Se describen ejemplos de terapias de células T en Publicaciones de patentes de EE. UU. Nos. 2014/0154228 y 2002/0006409, Patente de EE.UU. No.
5,728,388, y Publicación Internacional No. WO 2008/081035.
Las células T de la inmunoterapia pueden proceder de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, las células T pueden diferenciarsein vitrode una población de células madre hematopoyéticas, o se pueden obtener células T de un sujeto. Las células T pueden obtenerse de, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Además, las células T pueden derivar de una o más líneas celulares T disponibles en la técnica. Las células T también se pueden obtener a partir de una unidad de sangre recolectada de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la técnica, tales como separación y/o aféresis con FICOLL™. Se describen métodos adicionales para aislar células T para una terapia de células T en la Publicación de patente de EE. UU. No. 2013/0287748.
El término "terapia de células autólogas diseñadas", que puede abreviarse como "eACT™", también conocido como transferencia celular adoptiva, es un proceso mediante el cual las propias células T de un paciente se recolectan y posteriormente se alteran genéticamente para reconocer y atacar a uno o más antígenos expresados en la superficie celular de una o más células tumorales o neoplasias malignas específicas. Las células T pueden diseñarse para expresar, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos (CARs) o receptores de células T (TCRs) o ambos. Las células T CAR positivas (+) están diseñadas para expresar uno o más fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) extracelulares con especificidad por un antígeno tumoral particular unido a una parte de señalización intracelular que comprende al menos un dominio coestimulador y al menos un dominio de activación. El dominio coestimulador puede derivarse de un dominio coestimulador que se produce de forma natural o una variante del mismo, y el dominio de activación puede derivarse de, por ejemplo, CD3-zeta y CD3-episilon. En determinadas realizaciones, el CAR está diseñado para tener dos, tres, cuatro o más dominios coestimuladores. El CAR de scFv puede diseñarse para dirigirse, por ejemplo, a CD19 humano, que es una proteína transmembranal expresada por células del linaje celular B, incluidas todas las células B normales y las células B malignas, incluidas, pero sin limitarse a, NHL, CLL y no-ALL de células T. En algunas realizaciones, el CAR se diseña de manera que el dominio coestimulador se expresa como una cadena polipeptídica separada. Se describen ejemplos de terapias y construcciones de células T con CAR en Publicaciones de patentes de EE. UU. Nos. 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309, y 2014/0050708 y Solicitudes Provisionales de EE. UU. Nos. 62/470,703 y 62/317,258.
Un "paciente" tal como se utiliza en la presente, incluye cualquier humano que padezca un cáncer (por ejemplo, un linfoma o una leucemia). Los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente en la presente.
Tal como se utiliza en la presente, el término "célulain vitro"se refiere a cualquier célula que se cultivaex vivo.En particular, una célulain vitropuede incluir una célula T.
Los términos "péptido", "polipéptido", y "proteína" se utilizan indistintamente, y se refieren a un compuesto que comprende residuos de aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. Una proteína o péptido contiene al menos dos aminoácidos y no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que puede comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Como se utiliza en la presente, el término se refiere tanto a cadenas cortas, a las que también se hace referencia comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, y para cadenas más largas, a las que generalmente se hace referencia en la técnica como proteínas, de las cuales hay muchos tipos. "Polipéptidos" incluye, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos, o una combinación de los mismos.
"Estimulación", como se utiliza en la presente, se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora con su ligando cognado, en el que la unión media un evento de transducción de señales. Una "molécula estimuladora" es una molécula de una célula T, por ejemplo, el complejo receptor de células T (TCR)/CD3, que se une específicamente con un ligando estimulador cognado presente en una célula presentadora de antígeno. Un "ligando estimulador" es un ligando que cuando está presente en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una APC, una célula dendrítica, una célula B, y similares) pueden unirse específicamente con una molécula estimulante en una célula T, mediando así una respuesta primaria por parte de la célula T, que incluye, pero no se limita a, activación, iniciación de una respuesta inmune, proliferación, y similares. Los ligandos estimuladores incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-CD3 (tal como OKT3), una molécula de MHC Clase I cargada con un péptido, un anticuerpo superagonista anti-CD2, y un anticuerpo superagonista anti-CD28.
Una "señal coestimuladora", como se utiliza en la presente, se refiere a una señal, la cual, en combinación con una señal primaria, tal como la ligadura de TCR/CD3, conduce a una respuesta de las células T, tal como, pero no se limita a, proliferación y/o regulación positiva o regulación negativa de moléculas clave.
Un "ligando coestimulador" como se utiliza en la presente, incluye una molécula en una célula presentadora de antígeno (APC) que se une específicamente a una molécula cognada coestimuladora en una célula T De forma alternativa/adicional, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD28) puede ser un ligando coestimulador cuando se une a una placa, una perla, una APC, o en solución. La unión del ligando coestimulador proporciona una señal que media una respuesta de las células T, que incluye, pero no se limita a, proliferación, activación, diferenciación, y similares. Un ligando coestimulador induce una señal que se suma a la señal primaria proporcionada por una molécula estimuladora, por ejemplo, mediante la unión de un complejo receptor de células T (TCR)/CD3 con una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) cargada con péptido. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no se limita a, 3/TR6, ligando 4-1BB, agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligando CD30, CD40, CD7, CD70, CD83, mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), antígeno leucocitario humano G (HLA-G), ILT4, transcrito tipo inmunoglobulina (ILT) 3, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM), ligando que se une específicamente con B7-H3, receptor de linfotoxina beta, proteína A relacionada con la cadena del MHC clase I (MICA), proteína B relacionada con la cadena del MHC clase I (MICB), ligando OX40, PD-L2, o muerte programada (PD) L1 Un ligando coestimulador incluye, sin limitación, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero no se limita a, 4-1BB, B7-h 3, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD7, ICOS, ligando que se une específicamente a CD83, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), receptor C de células asesinas naturales (NKG2C), OX40, PD-1 o superfamilia del factor de necrosis tumoral miembro 14 (TNFSF14 o LIGHT).
Una "molécula coestimuladora" es un compañero de unión cognado en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por parte de la célula T, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, 4-1BB/CD137, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD 33, CD 45, CD100 (SEMA4D), CD103, CD134, CD137, CD154, CD16, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD22, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 (alfa; beta; delta; épsilon; gamma; zeta), CD30, CD37, CD4, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD5, CD64, CD69, CD7, CD80, ligando CD83, CD84, CD86, CD8alfa, CD8beta, CD9, CD96 (Táctil), CDl-la, CDl-lb, CDl-lc, CDl-ld, CDS, CEACAM1, CRT AM, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc gamma, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, ICOS, Ig alfa (CD79a), IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, integrina, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, LIGHT, LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1 (CDl la/CD18), molécula MHC clase I, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX40, PAG/Cbp, PD-1, PSGL1, SELPLG (CD162), molécula de activación de señalización linfocítica, SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, TNF, TNFr, TNFR2, receptor del ligando Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 o VLA-6, o fragmentos, truncamientos, o combinaciones de los mismos.
Los términos "reducir" y "disminuir" se utilizan indistintamente en la presente e indican cualquier cambio que sea menor que el original. "Reducir" y "disminuir" son términos relativos que requieren una comparación entre las mediciones previas y posteriores. "Reducir" y "disminuir" incluyen agotamientos completos.
"Tratamiento" o "tratar" de un sujeto se refiere a cualquier tipo de intervención o proceso realizado sobre, o la administración de un agente activo al sujeto con el objetivo de revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o prevenir la aparición, progresión, desarrollo, gravedad o recurrencia de un síntoma, complicación o afección, o indicios bioquímicos asociados con una enfermedad. En una realización, "tratamiento" o "tratar" incluye una remisión parcial. En otra realización, "tratamiento" o "tratar" incluye una remisión completa.
Para calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan normalmente se alinean de una manera que se proporcione la mayor coincidencia entre las secuencias. Un ejemplo de un programa informático que se puede utilizar para determinar el porcentaje de identidad es el paquete del programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). El algoritmo informático GAP se utiliza para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los cuales se va a determinar el porcentaje de identidad de la secuencia. Las secuencias se alinean para lograr la coincidencia óptima de sus respectivos aminoácidos o nucleótidos (el "intervalo de coincidencia", según lo determina el algoritmo). En ciertas realizaciones, una matriz de comparación estándar (véase, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación Pa M 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) también es utilizada por el algoritmo.
Varios aspectos de la enseñanza se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.
I. Receptores de antígenos quiméricos y receptores de células T
Los receptores de antígenos quiméricos (CARs o CAR-Ts) y los receptores de células T (TCRs) son receptores genéticamente diseñados. Estos receptores diseñados pueden insertarse y expresarse fácilmente en las células inmunes, incluidas las células T, de acuerdo con técnicas que son conocidas en la técnica. Con un CAR, se puede programar un único receptor para reconocer un antígeno específico y, cuando se une a ese antígeno, activar la célula inmune para atacar y destruir la célula que porta ese antígeno. Cuando estos antígenos existen en las células tumorales, una célula inmune que expresa el CAR se puede dirigir a y matar a la célula tumoral.
Los pasos realizados en la fabricación de una célula que expresa un CAR se muestran en la FIG. 1A y el mecanismo de muerte mediada por CAR mediante el reconocimiento de una diana en una célula tumoral se muestra en la FIG.
1B.
La presente enseñanza se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR) y receptores de células T (TCR) que comprenden un dominio de unión al antígeno, tal como un scFv, que se une específicamente a CD19 humano y células T diseñadas que comprenden un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a CD19 humano. En algunas realizaciones, un dominio de unión al antígeno de la presente enseñanza es un scFv derivado de un anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo FMC63. Se pueden utilizar otros anticuerpos dirigidos a CD19 humano.
Un CAR o TCR anti-CD19 humano de la presente enseñanza comprende un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a CD19 humano. En algunas realizaciones, el CAR o TCR anti-CD19 humano comprende además un dominio coestimulador, y/o un dominio extracelular (es decir, una región "bisagra" o "espadadora"), y/o un dominio transmembranal, y/o un dominio intracelular (de señalización), y/o un dominio de activación CD3-zeta o CD3-episilon. En algunas realizaciones, el CAR o TCR anti-CD19 humano comprende un dominio de unión al antígeno scFv que se une específicamente al CD19 humano, un dominio coestimulador, un dominio extracelular, un dominio transmembranal, y un dominio de activación de CD3-zeta o CD3-episilon.
En algunas realizaciones, la orientación de los CAR de acuerdo con la enseñanza comprende un dominio de unión al antígeno (tal como un scFv) en conjunto con un dominio coestimulador y un dominio de activación. El dominio coestimulador puede comprender uno o más de una porción extracelular, una porción transmembranal y una porción intracelular. En otras realizaciones, se pueden utilizar múltiples dominios coestimuladores en conjunto.
I A. Dominios de unión al antígeno
Los CARs se pueden diseñar para unirse a un antígeno (como un antígeno de la superficie celular) al incorporar una molécula de unión al antígeno que interactúa con un antígeno diana específico. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno es un fragmento de anticuerpo de la misma, por ejemplo, uno o más fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla ("scFv"). Un scFv es un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla que tiene las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo unidas entre sí. Véase Patentes de EE. UU. Nos. 7,741,465, y 6,319,494 así como Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136. Un scFv conserva la capacidad del anticuerpo parental para interactuar específicamente con el antígeno diana. Los scFv son útiles en receptores de antígenos quiméricos porque pueden diseñarse para que se expresen como parte de una cadena sencilla junto con los otros componentes del CAR. Id. Véase también Krause et al., J. Exp. Med., Vol 188, No. 4, 1998 (619-626); Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797. Se apreciará que la molécula de unión al antígeno normalmente está contenida dentro de la porción extracelular del CAR de manera que sea capaz de reconocer y unirse al antígeno de interés. Dentro del alcance de la enseñanza, se contemplan CARs biespecíficos y multiespecíficos, con especificidad a más de una diana de interés.
La presente enseñanza se refiere a anticuerpos anti-CD19 humano, fragmentos de los mismos, por ejemplo, scFv de receptores de antígenos quiméricos (CARs) y receptores de células T (TCRs) que tienen dominios de unión al antígeno humanizados.
Las siguientes secuencias de nucleótidos se muestran en el formato de "Secuencialíder-VL-Enlazador-VH- Etiqueta deH/s-codón de alto", es decir, la "secuencia líder" está en negritas, el "enlazador" está en itálicas, la "Etiqueta de His" está en negritas itálicas, y la VL, VH, y el "codón de alto" están en fuente estándar.
TS-FMC63-scFv
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTCCTGCTGAGCGTGACAGCCGGCGTGCACTCTGACAT C CAAATGAC
GCAAACGACCTCAAGTCTGTCCGCGAGCCTGGGCGACCGTGTTACGATTAGCTGCCGTGCTTCACAAGATA
TCAGTAAATACCTGAACTGGTATCAGCAAAAACCGGATGGTACCGTTAAACTGCTGATCTATCATACGTCT
CGTCTGCACAGTGGCGTCCCGTCCCGCTTTAGCGGTTCTGGCAGTGGTACCGATTATTCACTGACGATTTC
GAACCTGGAACAGGAAGACATCGCGACCTACTTTTGCCAGCAAGGTAATACCCTGCCGTATACGTTCGGCG
GTGGCACCAAACTGGAAATCACCGGCTCCACGTCAGGCTCGGGTAAACCGGGCAGCGGTGAAGGCTCTACC
AAAGGrGAAGTCAAACTGCAGGAAAGCGGTCCGGGTCTGGTCGCACCGAGCCAATCTCTGAGTGTGACCTG
TACGGTGTCGGGTGTTAGCCTGCCGGATTACGGCGTGTCATGGATTCGTCAGCCGCCGCGTAAAGGTCTGG AATGGCTGGGTGTTATCTGGGGCTCGGAAACCACGTATTACAATAGTGCACTGAAATCCCGTCTGACCATT ATCAAAGACAACTCCAAATCACAGGTTTTCCTGAAAATGAACAGCCTGCAAACCGATGACACGGCGATCTA TTACTGCGCCAAACATTATTACTATGGTGGCTCTTATGCTATGGATTATTGGGGTCAAGGCACCTCGGTTA
<CGGTCTCGTCACATCATCATCATCATCATTGATAA>(SEQ ID NO: 1).
scFv-SS ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTCCTGCTGAGCGTGACAGCCGGCGTGCACTCTGACAT C CAAATGAC CCAGTCGCCGTCCTTTCTGAGCGCAAGCGTCGGTGACCGTGTTACGATTACCTGCCGTGCCAGCCAAGACA TCTCTAAATACCTGAACTGGTATCAGCAAAAACCGGATCAGGCACCGAAACTGCTGATCAAACATACCTCA CGTCTGCACTCGGGTGTCCCGAGCCGCTTTAGTGGTTCCGGCTCAGGTACCGATTTTACCTTCACGATTAG CTCTCTGCAGCCGGAAGACATCGCCACGTATTACTGCCAGCAAGGTAATACCCTGCCGTACACGTTCGGCC AAGGTACCAAACTGGAAATCAAAGGCTCGACGAGCGGCTCTGGTAAACCGGGCTCTGGTGAAGGCAGTACC AAAGGrGAAGTGCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAACCGGGTCGTTCCCTGCGTCTGTCATG TACGGCGAGTGGTGTCTCCCTGCCGGACTATGGCGTCTCCTGGGTGCGTCAGCCGCCGGGTAAAGGTCTGG AATGGATTGGTGTGATCTGGGGCAGTGAAACCACGTATTACAACTCGGCCCTGAAAAGCCGTTTTACCATT TCTCGCGATAACAGTAAAAATACGCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGCGCGCGGAAGACACCGCCGTTTA CTACTGCGCAAAACATTACTACTACGGTGGCAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGCACGCTGGTTA
<CG GT GT CGT CACATCATCATCATCATCATT GAT AA>(SEQ ID NO: 2).
scFv-JS ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTCCTGCTGAGCGTGACAGCCGGCGTGCACTCTGATATTCAAATGAC CCAGTCCCCGTCCTCCCTGAGTGCCTCCGTCGGTGACCGTGTTACGATTACCTGCCGTGCGAGCCAAGACA TCTCTAAATACCTGAACTGGTATCAGCAAAAACCGGATCAGGCACCGAAACTGCTGATCAAACATACCTCA CGTCTGCACTCGGGTGTGCCGAGCCGCTTTAGTGGTTCCGGCTCAGGTACCGATTACACCCTGACGATCAG CTCTCTGCAGCCGGAAGACTTTGCCACGTATTACTGCCAGCAAGGTAATACCCTGCCGTATACGTTCGGCC AAGGTACCAAACTGGAAATCAAAGGCTCGACGAGCGGCTCTGGTAAACCGGGCTCTGGTGAAGGCAGTACC AAAGGrGAAGTGCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAACCGGGTCGTTCCCTGCGTCTGTCATG TACGGCGAGTGGTGTCTCCCTGCCGGACTATGGCGTGTCCTGGATTCGTCAGCCGCCGGGTAAAGGCCTGG AATGGATTGGTGTCATCTGGGGCAGTGAAACCACGTATTACAACTCGGCCCTGAAAAGCCGTTTCACCATC TCTCGCGATAACAGTAAAAATACGCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGCGCGCGGAAGACACCGCCGTTTA CTACTGCGCAAAACATTACTACTACGGTGGCAGCTATGCTATGGATTACTGGGGTCAAGGCACGCTGGTCA
<CC GT T T CGT CACATCATCATCATCATCATT GAT AA>(SEQ ID NO: 3).
scFv-AS
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTCCTGCTGAGCGTGACAGCCGGCGTGCACTCTGACATTCAGATGACGCAAAGTCCGAGTCCGGTTCAGGCACCGATTTTACCTTCACGATTAGCTCTCTGCAACCGGAAGACATCGC CACGTATTACTGCCAGCAAGGCAATACCCTGCCGTACACGTTCGGTCAGGGCACCAAACTGGAAATCAAAGGTTCGACGAGCGGTTCTGGCAAACCGGGTTCTGGCGAAGGTAGTACCAAAGGCCAGGTCCAACTGCAGGAA AGCGGCCCGGGTCTGGTGAAACCGTCCGGTACCCTGTCACTGACGTGTGCGGTGAGTGGCGTTTCCCTGCC GGACTATGGTGTTTCCTGGATTCGTCAACCGCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGATTGGCGTCATCTGGGGTA GTGAAACCACGTATTACAACTCGGCCCTGAAAAGCCGTGTGACCATCTCTCGCGATAACAGTAAAAATACG CTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGCGCGCGGAAGACACCGCCGTTTACTACTGCGCAAAACATTACTACTA CGGCGGTAGCTATGCTATGGATTACTGGGGTCAAGGCACGCTGGTTACGGTTTCCTCGCATCATCArCArCATCACT<GATAA>(SEQ ID NO: 4).
scFv-NS
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTCCTGCTGAGCGTGACAGCCGGCGTGCACTCTGACAT T CAGATGAC ACAGAGCCCTTCTTCCCTGAGCGCCAGCGTCGGAGATAGAGTGACCATTACTTGTAGAGCCAGCCAGGACA TTTCCAAATACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGGAAAGCTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCT CGGCTGCATAGTGGAGTCCCTTCAAGATTCTCAGGCAGCGGGTCCGGAACTGACTATACTCTGACCATCAG CTCCCTGCAGCCTGAGGATATTGCAACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCATATACATTTGGCG GGGGAACCAAACTGGAGATTAAGGGGTCTACAAGTGGCTCAGGGAAACCAGGAAGCGGCGAAGGGTCCACA AAGGGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGACCAGGCCTGGTGAAGCCCTCTGAAACTCTGAGTGTCACATG TACTGTGAGCGGAGTCTCCCTGCCCGACTACGGCGTGAGTTGGATCAGGCAGCCCCCTGGGAAAGGACTGG AGTGGCTGGGCGTCATTTGGGGGAGCGAAACCACATACTATAACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTGACAATC TCCAAAGACACTTCTAAGAATCAGGTGTTTCTGAAAATGTCTAGTCTGACTGCCGCTGATACCGCAATCTA CTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCCTATGCTATGGATTATTGGGGGCAGGGGACTCTGGTCA<C T GT C T C AAG C CATCATCATCATCATCATT GAT AA>(SEQ ID NO: 5).
En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos puede ser al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor de 100% idéntica a una secuencia de polinucleótidos mencionada anteriormente.
Secuencias de aminoácidos para el scFv de tipo silvestre y cuatro de los siete scFv humanizados seleccionados Las siguientes secuencias de polipéptidos se muestran en el formato de "Secuencia líder-VL-Enlazador-VH-Etiqueta de His",es decir, la "secuencia líder" está en negritas, el "enlazador" está en itálicas, y la "Etiqueta de His" está en negritas itálicas.
La secuencia líder utilizada en cada uno de los siguientes scFv tiene la secuencia de aminoácidos deMEWTWVFLFLLSVTAGVHS(SEQ ID NO: 6). La secuencia enlazadora utilizada en cada uno de los siguientes scFv tiene la secuencia de aminoácidos deGSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO: 7). La secuencia de la Etiqueta de His utilizada en cada uno de los siguientes scFv tiene la secuencia de aminoácidos deHHHHHH(SEQ ID NO: 8) FMC63-scFv-TS MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSrSGSGKPGSGEGSr AGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTI<IKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSHHHHHff>(SEQ ID NO: 9).
La secuencia de la VL para FMC63-scFv-TS tiene la secuencia de aminoácidos de DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY
<SLTISNLEQEDIATYFCQQG NTLPYTFGG GTKLEIT>(SEQ ID N O :36)
La secuencia de la VH para FMC63-scFv-TS tiene la secuencia de aminoácidos de EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIK<DNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS>(SEQ ID NO: 37). scFv-SS MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGSrSGSGPPGSGFGSr KGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWVRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTI<SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSHHHHHH>(SEQ ID NO: 10). La secuencia de la VL para el scFv-SS tiene la secuencia de aminoácidos de DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDF<TFTISSLQPEDIATYYCQQG NTLPYTFGQ GTKLEIK>(SEQ ID NO: 11).
La secuencia de la VH para el scFv-SS tiene la secuencia de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWVRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTISR<DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS>(SEQ ID NO: 12) scFv-JS MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGSrSGSGAPGSGFGSr AGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTI<SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSflHHHHH>(SEQ ID NO: 13).
La secuencia de la VL para scFv-JS tiene la secuencia de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY<TLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK>(SEQ ID NO: 14).
La secuencia de la VH para scFv-JS tiene la secuencia de aminoácidos de EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTISR<DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS>(SEQ ID NO: 15). scFv-AS MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGSrSGSGAPGSGFGSr KGQVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRVTI
<SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSHHHHHH>(SEQ ID NO: 16) La secuencia de la VL para el scFv-AS tiene la secuencia de aminoácidos de
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDF
<TFTISSLQPEDIATYYCQQG NTLPYTFGQ GTKLEIK>(SEQ ID NO: 17).
La secuencia de la VH para el scFv-AS tiene la secuencia de aminoácidos de QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRVTISR<DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS>(SEQ ID NO: 18).
scFv-NS MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIKGSrSGSGAPGSGEGSr KGQVQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTI
<SKDTSKNQVFLKMSSLTAADTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSHHHHHH>(SEQ ID NO: 19). La secuencia de la VL para scFv-NS tiene la secuencia de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDY<TLTISSLQ PEDIATYFCQ Q G NTLPYTFG G G TKLEIK>(SEQ ID NO: 20).
La secuencia de la VH para scFv-NS tiene la secuencia de aminoácidos de QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTISK<DTSKNQVFLKMSSLTAADTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS>(SEQ ID NO: 21).
Las secuencias de aminoácidos FMC63-TS, scFv -SS, -JS, -AS, y -NS descritas anteriormente pueden carecer de la Etiqueta de His (de SEQ ID NO: 8). Por consiguiente, los scFv tendrían las siguientes secuencias de aminoácidos: FMC63-scFv-TS (sin Etiqueta de His) MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTI<IKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS>(SEQ ID NO: 22). scFv-SS (sin Etiqueta de His) MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGSrSGSGKPGSGEGSr EGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWVRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTI<SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS>(SEQ ID NO: 23) scFv-JS (sin Etiqueta de His) MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGSrSGSGKPGGGEGSr KGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRFTI<SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS>(SEQ ID NO: 24). scFv-AS (sin Etiqueta de His)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDQAPKLLIKHTS
RLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGSrSGSGKPGSGEGSr
KGQVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRVTI
<SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS>(SEQ ID NO: 25).
scFv NS (sin Etiqueta de His)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAVKLLIYHTS
RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIKGSrSGSGKPGGGEGSr
EGQVQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTI
<SKDTSKNQVFLKMSSLTAADTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS>(SEQ ID NO: 26).
En algunas realizaciones, una secuencia polipeptídica puede ser al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor de 100% idénticos a una cualquiera de las secuencias polipeptídicas mencionadas anteriormente.
Un anticuerpo humanizado, por ejemplo, scFv, tiene una región VL que difiere de SEQ ID NO: 36 por al menos un aminoácido, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2021, 22, 23, 24, 25, o más aminoácidos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado, por ejemplo, scFv, puede tener una región VL que difiere de SEQ ID NO: 36 al tener una Ser en la posición 7, Pro en la posición 8, Val en la posición 15, Thr en la posición 22, Gln en la posición 41, Lys en la posición 42, Gln en la posición 42, Ala en la posición 43, Pro en la posición 44, Lys en la posición 49, Thr en la posición 72, Ser en la posición 77, Gln en la posición 79, Pro en la posición 80, Phe en la posición 83, Tyr en la posición 87, Gln en la posición 100, y/o Lys en la posición 107. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado, por ejemplo, scFv, puede tener una región VL que difiere de SEQ ID NO: 36 al tener una Ser en la posición 7, Pro en la posición 8, Val en la posición 15, Thr en la posición 22, Gln en la posición 42, Ala en la posición 43, Pro en la posición 44, Lys en la posición 49, Thr en la posición 72, Ser en la posición 77, Gln en la posición 79, Pro en la posición 80, Phe en la posición 83, Tyr en la posición 87, Gln en la posición 100 y/o Lys en la posición 107. En otras realizaciones, el anticuerpo humanizado, por ejemplo, scFv, puede tener una región V<l>que difiere de SEQ ID NO: 36 al tener una Ser en la posición 7, Pro en la posición 8, Val en la posición 15, Thr en la posición 22, Gln en la posición 41, Lys en la posición 42, Ala en la posición 43, Thr en la posición 72, Ser en la posición 77, Gln en la posición 79, Pro en la posición 80, y Lys en la posición 107.
Un anticuerpo humanizado, por ejemplo, scFv, tiene una región VH que difiere de SEQ ID NO: 37 por al menos un aminoácido, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2021, 22, 23, 24, 25, o más aminoácidos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado, por ejemplo, scFv, puede tener una región VH que difiere de SEQ ID NO: 37 al tener una Gln en la posición 1, Gln en la posición 3, Val en la posición 5, Gly en la posición 9, Lys en la posición 13, Gln en la posición 13, Gly en la posición 15, Arg en la posición 16, Thr en la posición 16, Thr en la posición 17, Arg en la posición 19, Leu en la posición 20, Ser en la posición 21, Ala en la posición 24, Gly en la posición 42, Ile en la posición 48, Phe en la posición 67, Ser en la posición 70, Arg en la posición 71, Thr en la posición 73, Asn en la posición 76, Thr en la posición 77, Leu en la posición 78, Tyr en la posición 79, Gln en la posición 81, Ser en la posición 83, Thr en la posición 86, Arg en la posición 86, Ala en la posición 87, Glu en la posición 88, Ala en la posición 88, Val en la posición 92, y/o Leu en la posición 115. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado, por ejemplo, scFv, puede tener una región VH que difiere de SEQ ID NO: 37 al tener una Gln en la posición 3, Val en la posición 5, Gly en la posición 9, Gln en la posición 13, Gly en la posición 15, Arg en la posición 16, Arg en la posición 19, Leu en la posición 20, Ser en la posición 21, Ala en la posición 24, Gly en la posición 42, Ile en la posición 48, Phe en la posición 67, Ser en la posición 70, Arg en la posición 71, Asn en la posición 76, Thr en la posición 77, Leu en la posición 78, Tyr en la posición 79, Gln en la posición 81, Arg en la posición 86, Ala en la posición 87, Glu en la posición 88, Val en la posición 92, y/o Leu en la posición 115. En otras realizaciones, el anticuerpo humanizado, por ejemplo, scFv, puede tener una región VH que difiere de SEQ ID NO: 37 al tener una Gln en la posición 1, Gln en la posición 3, Lys en la posición 13, Thr en la posición 16, Thr en la posición 17, Gly en la posición 42, Ser en la posición 70, Thr en la posición 73, Asn en la posición 76, Ser en la posición 83, Thr en la posición 86, Ala en la posición 87, Ala en la posición 88, y/o Leu en la posición 115.
En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno diana (por ejemplo, CD19 humano) con una Kd de menos de 1 x 10-6 M, menos de 1 x 10-7 M, menos de 1 x 10-8 M, o menos de 1 x 10-9 M. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno diana(porejemplo, CD19 humano) con una Kd de alrededor de 1 x 10-8 M, alrededor de 2 x 10-8 M, alrededor de 3 x 10-8 M, alrededor de 4 x 10-8 M, alrededor de 5 x 10-8 M, alrededor de 6 x 10-8 M, alrededor de 7 x 10-8 M, alrededor de 8 x 10-8 M, alrededor de 9 x 10-8 M, alrededor de 1 x 10-9 M, alrededor de 2 x 10-9 M, alrededor de 3 x 10-9 M, alrededor de 4 x 10-9 M, alrededor de 5 x 10-9 M, alrededor de 6 x 10-9 M, alrededor de 7 x 10-9 M, alrededor de 8 x 10-9 M, o alrededor de 9 x 10-9 M. En ciertas realizaciones, la Kd se calcula como el cociente de kapagado/kprendido, y el kprendido y kapagado se determinan utilizando un anticuerpo monovalente, tal como un fragmento Fab, medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial BIAcore®. En otras realizaciones, la K<d>se calcula como el cociente de kapagado/ kprendido, y el kprendido y kapagado se determinan utilizando un anticuerpo bivalente, tal como un fragmento Fab, medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial BIAcore®.
En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno diana (por ejemplo, CD19 humano) con una tasa de asociación (kprendido) de menos de 1 x 10-4 M-1 s-1, menos de 2 x 10-4 M-1 s-1, menos de 3 x 10-4 M-1 s-1, menos de 4 x 10-4 M-1 s-1, menos de 5 x 10-4 M-1 s-1, menos de 6 x 10-4 M-1 s-1, menos de 7 x 10-4 M-1 s-1, menos de 8 x 10-4 M-1 s-1, menos de 9 x 10-4 M-1 s-1, menos de 1 x 10-5 M-1 s-1, menos de 2 x 10-5 M-1 s-1, menos de 3 x 10-5 M-1 s-1, menos de 4 x 10-5 M-1 s-1, menos de 5 x 10-5 M-1 s-1, menos de 6 x 10-5 M-1 s-1, menos de 7 x 10-5 M-1 s-1, menos de 8 x 10-5 M-1 s-1, menos de 9 x 10-5 M-1 s-1, menos de 1 x 10-6 M-1 s-1, menos de 2 x 10-6 M-1 s-1, menos de 3 x 10-6 M-1 s-1, menos de 4 x 10-6 M-1 s-1, menos de 5 x 10-6 M-1 s-1, menos de 6 x 10-6 M-1 s-1, menos de 7 x 10-6 M-1 s-1, menos de 8 x 10-6 M-1 s-1, menos de 9 x 10-6 M-1 s-1, o menos de 1 x 10-7 M-1 s-1. En ciertas realizaciones, la kprendido se determina utilizando un anticuerpo monovalente, tal como un fragmento Fab, medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial BIAcore®. En otras realizaciones, el kprendido se determina utilizando un anticuerpo bivalente medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial BIAcore®.
En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno se une a un antígeno diana (por ejemplo, CD19 humano) con una tasa de disociación (kapagado) de menos de 1 x 10-2 s-1, menos de 2 x 10-2 s-1, menos de 3 x 10-2 s-1, menos de 4 x 10-2 s-1, menos de 5 x 10-2 s-1, menos de 6 x 10-2 s-1, menos de 7 x 10-2 s-1, menos de 8 x 10-2 s-1, menos de 9 x 10 2 s-1, menos de 1 x 10-3 s-1, menos de 2 x 10-3 s-1, menos de 3 x 10-3 s-1, menos de 4 x 10-3 s-1, menos de 5 x 10-3 s-1, menos de 6 x 10-3 s-1, menos de 7 x 10-3 s-1, menos de 8 x 10-3 s-1, menos de 9 x 10-3 s-1, menos de 1 x 10-4 s-1, menos de 2 x 10-4 s-1, menos de 3 x 10-4 s-1, menos de 4 x 10-4 s-1, menos de 5 x 10-4 s-1, menos de 6 x 10-4 s-1, menos de 7 x 10-4 s-1, menos de 8 x 10-4 s-1, menos de menos de 1 x 10-4 s-1, o menos de 5 x 10-4 s-1. En ciertas realizaciones, el kapagado se determina utilizando un anticuerpo monovalente, tal como un fragmento Fab, medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial BIAcore®. En otras realizaciones, el kapagado se determina utilizando un anticuerpo bivalente medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial BIAcore®.
En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica para un TCR, en el que el TCR comprende además una cuarta región determinante de complementariedad (CDR4). En determinadas realizaciones, el polinucleótido codifica para un TCR, en el que el TCR comprende además una región constante. En algunas realizaciones, la región constante se selecciona de una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, e IgM.
I.B. Dominios coestimuladores
Los receptores de antígenos quiméricos incorporan dominios coestimuladores (señalizadores) para aumentar su potencia. Véase Patentes de EE. UU. Nos. 7,741,465, y 6,319,494, así como Krauseet al.y Finneyet al.(supra), Song et al., Blood 119:696-706 (2012); Kalos et al., Sci Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011), y Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016). Una proteína coestimuladora ejemplar tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína coestimuladora que se encuentra de forma natural en las células T. La secuencia de aminoácidos nativa completa de esta proteína coestimuladora se describe en la Secuencia de referencia de NCBI: NP_006130.1.
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de otros dominios coestimuladores se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica para un dominio coestimulador comprende una secuencia de nucleótidos de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor de 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos que se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica de un dominio coestimulador comprende una secuencia polipeptídica de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor de 100% idéntica a la secuencia polipeptídica que se conoce en la técnica.
I.B.1 Dominios Extracelulares o "Bisagra"
En una realización, un CAR o TCR de la presente divulgación comprende un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador", los cuales son términos que se utilizan indistintamente en la presente. En otra realización, un dominio extracelular es de o se deriva de (por ejemplo, comprende todo o un fragmento de) CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD28T, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CeAc AM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de las células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, receptor Fc gamma, molécula MHC clase 1, molécula de m Hc clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína inmunoglobulina, un receptor de citocinas, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor del ligando Toll, y fragmentos o combinaciones de los mismos. Un dominio o región "extracelular" o "bisagra" o "espaciador" puede derivarse de una fuente natural o sintética. Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de estos dominios bisagra son conocidas en la técnica.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica para un dominio bisagra comprende una secuencia de nucleótidos de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor de 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos que se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica de un dominio bisagra comprende una secuencia polipeptídica al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%,al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor de 100% idéntica a la secuencia polipeptídica que se conoce en la técnica.
En algunas realizaciones, un dominio bisagra se coloca entre un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, un scFv) y un dominio transmembranal. En esta orientación, el dominio bisagra proporciona distancia entre el dominio de unión al antígeno y la superficie de una membrana celular a través de la cual se expresa el CAR. En algunas realizaciones, un dominio bisagra proviene o se deriva de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, un dominio bisagra se selecciona de las regiones bisagra de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, e IgM, o un fragmento de los mismos. En otras realizaciones, un dominio bisagra comprende, es de o se deriva de la región bisagra de CD8 alfa. En algunas realizaciones, un dominio bisagra comprende, es de, o se deriva de la región bisagra de CD28. En algunas realizaciones, un dominio bisagra comprende un fragmento de la región bisagra de CD8 alfa o un fragmento de la región bisagra de CD28, en el que el fragmento es cualquier cosa menos que la región bisagra completa. En algunas realizaciones, el fragmento de la región bisagra de CD8 alfa o el fragmento de la región bisagra de CD28 comprende una secuencia de aminoácidos que excluye al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 aminoácidos en el N-terminal o el C-terminal, o ambos, de la región bisagra de CD8 alfa, o de la región bisagra de CD28.
I.B.2 Dominios transmembranales
El dominio coestimulador para el CAR o TCR de la enseñanza puede comprender además un dominio transmembranal y/o un dominio de señalización intracelular. El dominio transmembranal puede diseñarse para estar fusionado con el dominio extracelular del CAR. De manera similar, puede fusionarse con el dominio intracelular del CAR. En una realización, se utiliza el dominio transmembranal que está asociado de forma natural con uno de los dominios en un CAR. En algunos casos, el dominio transmembranal puede seleccionarse o modificarse mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembranales de las proteínas de membrana de superficie iguales o diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. El dominio transmembranal puede derivarse de una fuente ya sea natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio se puede derivar de cualquier proteína transmembranal o unida a membrana. Las regiones transmembranales de uso particular en esta enseñanza pueden derivarse de (es decir, comprender) 4-1BB/CD137, activando receptores de células NK, una proteína inmunoglobulina, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8alfa, CD8beta, CD96 (Táctil), CDlla, CDllb, CDllc, CDlld, CDS, CEACAM1, CRT AM, receptor de citocinas, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc gamma, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig alfa (CD79a), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, coestimulador de las células T inducible (ICOS), integrinas, ITGA4, ITGa 4, ITGA6 , ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2,<l>A<t>, LFA-1, LFA-1, un ligando que se une específicamente con CD83, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1; CDl-la/CD18), molécula MHC clase 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, muerte programada-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), Moléculas de señalización de activación linfocítica (proteínas S<l>A<m>), SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Lyl08), SLAMF7, SLP-76, proteínas receptoras de TNF, TNFR2, TNFSF14, un receptor del ligando Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 o VLA-6, o un fragmento, truncamiento o una combinación de los mismos. Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de estos dominios transmembranales se conocen en la técnica.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica para un dominio transmembranal comprende una secuencia de nucleótidos de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor del 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos que se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica de un dominio transmembranal comprende una secuencia polipeptídica de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor del 100% idéntica a la secuencia de polipéptidos que se conoce en la técnica.
Opcionalmente, los enlazadores cortos pueden formar enlaces entre alguno cualquiera o algunos de los dominios extracelular, transmembranal, e intracelular del CAR.
I.B.3. Dominios intracelulares (de señalización)
El dominio intracelular (de señalización) de las células T diseñadas de la enseñanza puede proporcionar señalización a un dominio de activación, el cual posteriormente activa al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser una actividad citolítica o una actividad auxiliar que incluye la secreción de citocinas.
En determinadas realizaciones, los dominios de señalización intracelular adecuados incluyen (es decir, comprenden), pero no se limitan a, 4-1BB/CD137, receptores activadores de las células NK, una proteína inmunoglobulina, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8alfa, CD8beta, CD96 (Táctil), CDlla, CDllb, CDllc, CDlld, CDS, CEACAM1, CRT AM, receptor de citocinas, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc gamma, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig alfa (CD79a), IL-2R beta, iL-2R gamma, IL-7R alfa, coestimulador de las células T inducible (ICOS), integrinas, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, ligando que se une específicamente con CD83, LIGHT, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), Ly108), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1; CDl-la/CD18), molécula MHC clase 1, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, muerte programada-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), Moléculas de señalización de activación linfocítica (proteínas SlAm ), SLAM (s La Mf 1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A, SLAMF7, SLP-76, proteínas receptoras de<t>N<f>, TNFR2, TNFSF14, un receptor del ligando Toll, TRANCE/RANKL, VLA1, o VLA-6, o un fragmento, truncamiento o una combinación de los mismos. Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de estos dominios de señalización intracelular son conocidas en la técnica.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica para un dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de nucleótidos de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%,al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor del 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos que se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica de un dominio de señalización intracelular comprende una secuencia polipeptídica de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor del 100% idéntica a la secuencia polipeptídica que se conoce en la técnica.
I.C. Dominios de Activación
CD3 es un elemento del receptor de células T en las células T nativas y se ha demostrado que es un elemento de activación intracelular importante en los CARs. En algunas realizaciones, el CD3 es CD3-zeta o CD3-épsilon, de los cuales cada una de las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos se conocen en la técnica.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica para un dominio de activación comprende una secuencia de nucleótidos de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor del 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos que se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica de un dominio de activación comprende una secuencia polipeptídica de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%,al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor del 100% idéntica a la secuencia de polipéptidos que se conoce en la técnica.
I.D. Dominios de Interruptor
Se apreciará que los eventos adversos pueden minimizarse transduciendo las células inmunes (que contienen uno o más CARs o TCRs) con un gen suicida. También puede ser deseable incorporar un interruptor inducible "prendido" o "acelerador" en las células inmunes. Las técnicas adecuadas incluyen el uso de la caspasa-9 inducible (Aplicación de EE. UU. 2011/0286980) o una timidina cinasa, antes, después o al mismo tiempo, a medida que las células se transducen con la construcción del CAR de la presente enseñanza. Los métodos adicionales para introducir genes suicidas y/o interruptores "prendido" incluyen TALENS, dedos de zinc, ARNi, ARNip, ARNhc, tecnología antisentido, y otras técnicas conocidas en la técnica.
De acuerdo con la enseñanza, en la presente se pueden incorporar técnicas adicionales de prendido y apagado u otros tipos de interruptores de control. Estas técnicas pueden emplear el uso de dominios de dimerización y activadores opcionales de dichos dominios de dimerización. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, las descritas por Wu et al., Science 2014350 (6258) utilizando sistemas de dimerización FKBP/Rapalog en determinadas células. Tecnología de dimerización adicional se describe, por ejemplo, en Fegan et al. Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336 así como en Patentes de EE. UU. Nos. 5,830,462; 5,834,266; 5,869,337; y 6,165,787. Los pares de dimerización adicionales pueden incluir ciclosporina-A/ciclofilina, receptor, estrógeno/receptor de estrógeno (utilizando opcionalmente tamoxifeno), glucocorticoides/receptor de glucocorticoides, tetraciclina/receptor de tetraciclina, vitamina D/receptor de vitamina D. Se pueden encontrar más ejemplos de tecnología de dimerización en, por ejemplo, WO 2014/127261, WO 2015/090229, US 2014/0286987, US 2015/0266973, US 2016/0046700, Patente de EE.UU. No. 8,486,693, US 2014/0171649, y US 2012/0130076.
I. E. Péptidos líder o secuencias líder
En algunas realizaciones, el polinucleótido de la presente enseñanza codifica para un CAR o un TCR, los cuales pueden además comprender un péptido líder (también denominado en la presente como un "péptido señal" o "secuencia líder"). En determinadas realizaciones, el péptido líder comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos MEWTWVFLFLLSVTAGVHS (SEQ ID NO: 6) o MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 35). En algunas realizaciones, el péptido líder comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 35.
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de otros péptidos líder se conocen en la técnica.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica para un péptido líder comprende una secuencia de nucleótidos de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor de 100% idéntica a la secuencia de nucleótidos que se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica de un péptido líder comprende una secuencia polipeptídica de al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 65%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor de 100% idéntica a la secuencia polipeptídica que se conoce en la técnica
En algunas realizaciones, el polinucleótido de la presente enseñanza codifica para un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende un péptido líder (P), una molécula de unión al antígeno (B), un dominio extracelular de una proteína coestimuladora (E), un dominio transmembranal (T), una región coestimuladora (C), y un dominio de activación (A), en el que el CAR está configurado de acuerdo con lo siguiente: P-B-E-T-C-A. En algunas realizaciones, la molécula de unión al antígeno comprende una VH y una VL, en el que el CAR está configurado de acuerdo con lo siguiente: P- VH-VL-E-T-C-A o P-VL-VH-E-T-C-A. En algunas realizaciones, la VH y la VL están conectadas mediante un enlazador (L), en el que el CAR está configurado de acuerdo con lo siguiente, desde el N-terminal al C-terminal: P-VH-L-VL-E-T-C-A o P-VH-L-VL-E-T-C-A.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de la presente enseñanza codifica para un CAR o TCR, en el que el CAR o TCR comprende una secuencia de aminoácidos al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos para un CAR o TCR conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, US 62/470,703 y US 62/317,258.
II. Vectores, células, y composiciones farmacéuticas
En ciertos aspectos, proporcionados en la presente son vectores que comprenden un polinucleótido de la presente enseñanza. En algunas realizaciones, la presente enseñanza se dirige a un vector o un conjunto de vectores que comprenden un polinucleótido que codifica para un CAR o un TCR que comprende el dominio de unión al antígeno como se describe en la presente.
Cualquier vector conocido en la técnica puede ser adecuado para la presente enseñanza. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral. En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector del virus de la leucemia murina, un vector SFG, un plásmido, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral de vaccinia, un vector viral del herpes simple, un vector asociado a adenovirus (VAA), un vector lentiviral, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos, en la presente se proporcionan células que comprenden un polinucleótido o un vector de la presente enseñanza. En algunas realizaciones, la presente enseñanza está dirigida a células, por ejemplo, célulasin vitro,que comprenden un polinucleótido que codifica para un CAR o que comprende el dominio de unión al antígeno como se describe en la presente. En otras realizaciones, la presente enseñanza está dirigida a células, por ejemplo, célulasin vitro,que comprenden un polipéptido codificado por un CAR o un TCR que comprende el dominio de unión al antígeno como se describe en la presente.
Puede utilizarse cualquier célula como célula hospedera para los polinucleótidos, los vectores, o los polipéptidos de la presente enseñanza. En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula procariótica, una célula fúngica, una célula de levadura, o células eucariotas superiores tales como una célula de mamífero. Las células procarióticas adecuadas incluyen, sin limitación, eubacteria, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo,Enterobactehaceatal comoEscherichia,por ejemplo,E. coli; Enterobacter; Erwinia; Klebsiella; Proteus; Salmonela,por ejemplo,Salmonella typhimurium; Serratia,por ejemplo,Serratia marcescana,yShigella; Bacilostal comoB. subtilisyB. licheniformis; PseudomonascomoP aeruginosa;yStreptomyces.En algunas realizaciones, la célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula es una célula inmune. En algunas realizaciones, la célula inmune se selecciona del grupo que consiste en una célula T, una célula B, un linfocito infiltrante de tumores (TIL), una célula que expresa un TCR, una célula asesina natural (NK), una célula dendrítica, un granulocito, una célula linfoide innata, un megacariocito, un monocito, un macrófago, una plaqueta, un timocito, y una célula mieloide. En una realización, la célula inmune es una célula T En otra realización, la célula inmune es una célula NK. En determinadas realizaciones, la célula T es un linfocito infiltrante de tumores (TIL), una célula T autóloga, una célula T autóloga diseñada (eACT™), una célula T alogénica, una célula T heteróloga, o cualquier combinación de las mismas.
La célula de la presente enseñanza se puede obtener a través de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, las células T se pueden diferenciarin vitrode una población de células madre hematopoyéticas, o las células T se pueden obtener de un sujeto. Las células T se pueden obtener de, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo, y tumores. Además, las células T se pueden derivar de una o más líneas celulares T disponibles en la técnica. Las células T también se pueden obtener a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la técnica, tales como separación y/o aféresis con FICOLL™. En determinadas realizaciones, las células recolectadas mediante aféresis se lavan para eliminar la fracción de plasma y se colocan en un tampón o medio apropiado para su posterior procesamiento. En algunas realizaciones, las células se lavan con PBS. Como se apreciará, se puede utilizar un paso de lavado, tal como mediante el uso de una centrífuga de flujo continuo semiautomática, por ejemplo, el Procesador celular Cobe™ 2991, el Baxter CytoMate™, o similares. En algunas realizaciones, las células lavadas se resuspenden en uno o más tampones biocompatibles u otra solución salina con o sin tampón. En determinadas realizaciones, se eliminan los componentes no deseados de la muestra de aféresis. Se divulgan métodos adicionales para aislar células T para una terapia con células T en la Publicación de patente de EE. UU. No. 2013/0287748.
En determinadas realizaciones, las células T se aíslan de PBMCs lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, mediante el uso de centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL™. En algunas realizaciones, una subpoblación específica de las células T, tales como CD4+, CD8+, CD28+, CD45RA+, y CD45RO+ se aíslan además mediante técnicas de selección positiva o negativa conocidas en la técnica. Por ejemplo, el enriquecimiento de una población de las células T mediante selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. En algunas realizaciones, se puede utilizar la clasificación y/o selección de células mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer para células c D4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales normalmente incluye anticuerpos contra CD8, CD11b, CD14, CD16, CD20, y HLA-DR. En determinadas realizaciones, se utiliza citometría de flujo y clasificación de células para aislar poblaciones de células de interés para su uso en la presente enseñanza.
En algunas realizaciones, las PBMCs se utilizan directamente para la modificación genética con las células inmunes (tales como CARs o TCRs) utilizando métodos como se describen en la presente. En determinadas realizaciones, después de aislar las PBMCs, se aíslan adicionalmente los linfocitos T, y tanto los linfocitos T citotóxicos como los auxiliares se clasifican en subpoblaciones de las células T ingenuas, de memoria, y efectoras, ya sea antes o después de la modificación y/o expansión genética.
En algunas realizaciones, las células CD8+ se clasifican además en células ingenuas, de memoria central, y efectoras mediante la identificación de antígenos de la superficie celular que están asociados con cada uno de estos tipos de células CD8+. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores fenotípicos de las células T de memoria central incluyen CCR7, CD3, CD28, CD45RO, CD62L, y CD127 y son negativos para granzima B. En algunas realizaciones, las células T de memoria central son CD8+, CD45RO+, y células T CD62L+. En algunas realizaciones, las células T efectoras son negativas para CCR7, CD28, CD62L, y CD127 y positivas para granzima B y perforina. En ciertas realizaciones, las células T CD4+ se clasifican además en subpoblaciones. Por ejemplo, las células T CD4+ colaboradoras se pueden clasificar en células ingenuas, de memoria central, y efectoras identificando poblaciones de células que tienen antígenos de superficie celular.
En algunas realizaciones, las células inmunes, por ejemplo, las células T, se modifican genéticamente tras su aislamiento mediante métodos conocidos, o las células inmunes se activan y expanden (o se diferencian en el caso de las progenitoras)in vitroantes de ser modificadas genéticamente. En otra realización, las células inmunes, por ejemplo, las células T, están modificadas genéticamente con los receptores de antígenos quiméricos descritos en la presente (por ejemplo, transducidas con un vector viral que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican para un CAR) y luego se activan y/o expandenin vitro.Los métodos para activar y expandir a las células T se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Patentes de EE. UU. Nos. 6,905,874; 6,867,041; y 6,797,514; y Publicación PCT No. WO 2012/079000. Generalmente, tales métodos incluyen poner en contacto PBMC o células T aisladas con un agente estimulante y agente coestimulador, tal como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente unidos a una perla u a otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tal como IL-2. Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la misma perla sirven como una célula presentadora de antígeno (APC) "sustituta". Un ejemplo son los sistemas Dynabeads®, un sistema activador/estimulador de CD3/CD28 para la activación fisiológica de las células T humanas. En otras realizaciones, las células T se activan y estimulan para que proliferen con células alimentadoras y anticuerpos y citocinas apropiados utilizando métodos tales como los descritos en Patentes de EE. UU. Nos. 6,040,177 y 5,827,642 y Publicación PCT No. WO 2012/129514.
En determinadas realizaciones, las células T se obtienen de un sujeto donador. En algunas realizaciones, el sujeto donador es un paciente humano que padece de un cáncer o un tumor. En otras realizaciones, el sujeto donador es un paciente humano que no padece de un cáncer o tumor.
Otros aspectos de la presente enseñanza se dirigen a composiciones que comprenden un polinucleótido descrito en la presente, un vector descrito en la presente, un polipéptido descrito en la presente, o una célulain vitrodescrita en la presente. En algunas realizaciones, la composición comprende un vehículo, diluyente, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición comprende un excipiente. En una realización, la composición comprende un polinucleótido que codifica para un CAR o un TCR que comprende el dominio de unión al antígeno como se describe en la presente. En otra realización, la composición comprende un CAR o un TCR que comprende el dominio de unión al antígeno, como se describe en la presente, codificado por un polinucleótido de la presente enseñanza. En otra realización, la composición comprende una célula T que comprende un CAR o un TCR que comprende el dominio de unión al antígeno como se describe en la presente.
III. Métodos de la enseñanza
Otro aspecto de la enseñanza se dirige a un método para producir una célula que expresa un CAR o un TCR que comprende una célula transducida con un polinucleótido descrito en la presente bajo condiciones adecuadas. En algunas realizaciones, el método comprende transducir una célula con un polinucleótido que codifica para un CAR o un TCR, como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el método comprende transducir una célula con un vector que comprende el polinucleótido que codifica para un CAR o un TCR.
Otro aspecto de la presente enseñanza se dirige a un método para inducir una inmunidad contra un tumor que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un polinucleótido descrito en la presente, un vector descrito en la presente, o un CAR o un TCR descritos en la presente. En una realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un polinucleótido que codifica para un CAR o un TCR divulgados en la presente. En otra realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica para un CAR o un TCR divulgados en la presente. En otra realización, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un CAR o un TCR codificado por un polinucleótido divulgado en la presente.
Otro aspecto de la presente enseñanza está dirigido a un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de las células inmunes diseñadas de la presente aplicación. En algunas realizaciones, la respuesta inmune es una respuesta inmune mediada por células T. En algunas realizaciones, la respuesta inmune mediada por células T se dirige contra una o más células diana. En algunas realizaciones, la célula inmune diseñada comprende un CAR o un TCR, en el que el CAR o el TCR comprende el dominio de unión al antígeno como se describe en la presente. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula tumoral.
Otro aspecto de la presente enseñanza se dirige a un método para tratar o prevenir una enfermedad maligna, comprendiendo dicho método administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de al menos una célula inmune, en el que la célula inmune comprende al menos un CAR o TCR, y en el que el CAR o el TCR comprenden el dominio de unión al antígeno como se describe en la presente.
Otro aspecto de la presente enseñanza se dirige a un método para tratar un cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto un polinucleótido, un vector, un CAR o un TCR, una célula, o una composición divulgada en la presente. En una realización, el método comprende administrar un polinucleótido que codifica para un CAR o un TCR. En otra realización, el método comprende administrar un vector que comprende un polinucleótido que codifica para un CAR o un TCR. En otra realización, el método comprende administrar un CAR o un TCR codificado por un polinucleótido divulgado en la presente. En otra realización, el método comprende administrar una célula que comprende el polinucleótido, o un vector que comprende el polinucleótido, que codifica para un CAR o un TCR.
En algunas realizaciones, los métodos para tratar un cáncer en un sujeto en necesidad del mismo comprenden una terapia con células T En una realización, la terapia con células T de la presente enseñanza es una terapia de células autólogas diseñada (eACT™). De acuerdo con esta realización, el método puede incluir recolectar células sanguíneas del paciente. Las células sanguíneas aisladas (por ejemplo, las células T) pueden entonces diseñarse para expresar un CAR o un TCR de la presente enseñanza. En una realización particular, las células T CAR o las células T TCR se administran al paciente. En algunas realizaciones, las células T CAR o las células T TCR tratan un tumor o un cáncer en el paciente. En una realización, las células T CAR o las células T TCR reducen el tamaño de un tumor o un cáncer.
En algunas realizaciones, las células T del donador para su uso en la terapia con células T se obtienen del paciente (por ejemplo, para una terapia de las células T autólogas). En otras realizaciones, las células T del donador para uso en la terapia con células T se obtienen de un sujeto que no es el paciente.
Las células T se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de las células T puede ser al menos alrededor de 104 células, al menos alrededor de 105 células, al menos alrededor de 106 células, al menos alrededor de 107 células, al menos alrededor de 108 células, al menos alrededor de 109, o al menos alrededor de 1010 En otra realización, la cantidad terapéuticamente eficaz de las células T es alrededor de 104 células, alrededor de 105 células, alrededor de 106 células, alrededor de 107 células, o alrededor de 108 células. En una realización particular, la cantidad terapéuticamente eficaz de las células T CAR o de las células T TCR es alrededor de 2 x 106 células/kg, alrededor de 3 * 106 células/kg, alrededor de 4 * 106 células/kg, alrededor de 5 * 106 células/kg, alrededor de 6 * 106 células/kg, alrededor de 7 * 106 células/kg, alrededor de 8 * 106 células/kg, alrededor de 9 * 106 células/kg, alrededor de 1 * 107 células/kg, alrededor de 2 * 107 células/kg, alrededor de 3 * 107 células/kg, alrededor de 4 * 107 células/kg, alrededor de 5 * 107 células/kg, alrededor de 6 * 107 células/kg, alrededor de 7 * 107 células/kg, alrededor de 8 * 107 células/kg, o alrededor de 9 * 107 células/kg.
IV. Tratamiento para el cáncer
Los métodos de la enseñanza se pueden utilizar para tratar un cáncer en un sujeto, reducir el tamaño de un tumor, matar células tumorales, prevenir la proliferación de células tumorales, prevenir el crecimiento de un tumor, eliminar un tumor de un paciente, prevenir la recaída de un tumor, prevenir metástasis tumorales, inducir la remisión en un paciente o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, los métodos inducen una respuesta completa. En otras realizaciones, los métodos inducen una respuesta parcial.
Los cánceres que pueden tratarse incluyen los linfomas de células B. En determinadas realizaciones, los linfomas de células B Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL), Linfoma relacionado con el SIDA, Linfoma de células B grandes ALK positivo, linfoma de Burkitt, Leucemia Linfocítica Crónica, CLL), Linfoma de Hodgkin Clásico, Linfoma Difuso de Células B grandes (DLBCL), Linfoma folicular, Linfoma intravascular de células B grandes, Linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, Granulomatosis linfomatoide, Linfoma linfoplasmocítico, Linfoma de células del manto (MCL), Linfoma de zona marginal de células B (MZL), Linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT), Linfoma de células B de la zona marginal ganglionar (NMZL), Linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares, linfoma no Hodgkin, Linfoma plasmablástico, Linfoma primario del sistema nervioso central, Linfoma de derrame primario, Linfoma de la zona marginal esplénica (SMZL), y macroglobulinemia de Waldenstrom, o una combinación de los mismos. En una realización, el linfoma de células B se selecciona del grupo que consiste en Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL), Leucemia Linfocítica Crónica, CLL), Linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), Linfoma folicular, Linfoma de células del manto (MCL), Linfoma de células B de la zona marginal (MZL), Linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT) y Linfoma no Hodgkin. En una realización, el linfoma de células B es un linfoma no Hodgkin.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además administrar un quimioterapéutico.
En otras realizaciones, la molécula de unión al antígeno, las células transducidas (o de otro modo diseñadas) (tales como CARs o TCRs), y el agente quimioterapéutico se administran cada uno en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o afección en el sujeto.
En determinadas realizaciones, las composiciones que comprenden células efectoras inmunes que expresan CAR y/o TCR divulgadas en la presente se pueden administrar antes de, en conjunto con y/o después de cualquier número de agentes quimioterapéuticos. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquilo sulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, clorpromazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido clorhidrato de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenetesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrino; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2, 2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb) y doxetaxel (TAXOTERE®, Ródano-Poulenc Rorer); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos del platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposida; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™, (alitretinoína); ONTAK™ (denileucina diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden células efectoras inmunes que expresan CAR y/o TCR descritas en la presente se pueden administrar junto con un agente antihormonal que actúa para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como anti estrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se administran combinaciones de agentes quimioterapéuticos cuando sea apropiado, incluyendo, pero no limitado a, CHOP, es decir, ciclofosfamida (Cytoxan®), doxorrubicina (hidroxidoxorrubicina), Vincristina (Oncovin®), y prednisona.
En determinadas realizaciones, las composiciones que comprenden células efectoras inmunes que expresan CAR y/o TCR divulgadas en la presente pueden administrarse antes de, en conjunto con y/o después de CHOP CHOP consiste en (C)ciclofosfamida, un agente alquilante que daña el ADN al unirse a él y ocasionando la formación de enlaces entrecruzados; (H)hidroxidaunorrubicina (también llamada doxorrubicina o adriamicina), un agente intercalante que daña el ADN al insertarse entre las bases de ADN; (O)ncovin (vincristina), que evita que las células se dupliquen uniéndose a la proteína tubulina; y (P)rednisona o (P)rednisolona, que son corticosteroides.
En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra al mismo tiempo o dentro de una semana después de la administración de la célula o ácido nucleico diseñados. En otras realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra de 1 a 4 semanas o de 1 semana a 1 mes, de 1 semana a 2 meses, de 1 semana a 3 meses, de 1 semana a 6 meses, de 1 semana a 9 meses o de 1 semana a 12 meses después de la administración de la célula o ácido nucleico diseñados. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se administra al menos 1 mes antes de administrar la célula o el ácido nucleico. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además administrar dos o más agentes quimioterapéuticos.
Agentes terapéuticos adicionales adecuados para su uso en combinación con la enseñanza incluyen, pero no se limitan a, ibrutinib (IMBRUVICA®), ofatumumab (ARZERRA®), rituximab (RITUXAN®), bevacizumab (AVASTIN®), trastuzumab (HERCEPTIN®), trastuzumab emtansina (KADCYLA®), imatinib (GLEEVEC®), cetuximab (ERBITUX®), panitumumab (VECTIBIX®), catumaxomab, ibritumomab, ofatumumab, tositumomab, brentuximab, alemtuzumab, gemtuzumab, erlotinib, gefitinib, vandetanib, afatinib, lapatinib, neratinib, axitinib, masitinib, pazopanib, sunitinib, sorafenib, toceranib, lestaurtinib, axitinib, cediranib, lenvatinib, nintedanib, pazopanib, regorafenib, semaxanib, sorafenib, sunitinib, tivozanib, toceranib, vandetanib, entrectinib, cabozantinib, imatinib, dasatinib, nilotinib, ponatinib, radotinib, bosutinib, lestaurtinib, ruxolitinib, pacritinib, cobimetinib, selumetinib, trametinib, binimetinib, alectinib, ceritinib, crizotinib, aflibercept, adipotida, denileucina diftitox, inhibidores de mTOR tales como Everolimus y Temsirolimus, inhibidores de hedgehog como sonidegib y vismodegib, inhibidores de CDK, tal como el inhibidor de CDK (palbociclib).
Agentes terapéuticos adicionales adecuados para su uso en la presente enseñanza incluyen átomos radiactivos. Ejemplos de tales átomos radiactivos incluyen 131I, 90Y, 212Bi, 186Re, 221At, 99mTcy mezclas de los mismos. Sin embargo, también se pueden utilizar otros átomos radiactivos como se conoce en la técnica.
En realizaciones adicionales, la composición que comprende las células T que expresan CAR y/o TCR, un conjugado que comprende un scFvo el propio scFv, se administran con un agente antiinflamatorio. Los agentes o medicamentos antiinflamatorios pueden incluir, pero no se limitan a, esteroides y glucocorticoides (incluidos betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos (NSAIDS) incluyendo aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato. Los NSAIDs ejemplares incluyen ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2, y sialilatos. Los analgésicos ejemplares incluyen acetaminofén, oxicodona, tramadol o clorhidrato de proporxifeno. Los glucocorticoides ejemplares incluyen cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica ejemplares incluyen moléculas dirigidas contra marcadores de la superficie celular (por ejemplo, CD4, CDS, etc.), inhibidores de citocinas, tales como los antagonistas del TNF, (por ejemplo, etanercept (ENBREL®), adalimumab (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®), inhibidores de quimiocinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales, así como formas recombinantes de moléculas. Los DMARDs ejemplares incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, oro (oral (auranofina) e intramuscular) y minociclina.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en la presente se administran en conjunto con una citocina. "Citocina", tal como se utiliza en la presente, pretende referirse a proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de citocinas son las linfocinas, monocinas, y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas del crecimiento tales como la hormona del crecimiento humana, la hormona del crecimiento humana N-metionil, y la hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático (HGF); factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); prolactina; lactógeno placentario; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso (NGFs) tales como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformantes (TNF) tales como TNF-alfa y TNF-beta; factores de crecimiento tipo insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón alfa, beta, y gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs) tales como macrófagos-CSF (M-CSF); granulocitos-macrófagos-CSF (GM-CSF); y granulocitos-CSF (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (LK). Tal como se utiliza en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes, y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
V. Conjugados
Un dominio de unión al antígeno de la presente enseñanza (por ejemplo, un scFv CD19 anti-humano), se puede conjugar (por ejemplo, unir) a un agente terapéutico (por ejemplo, agente quimioterapéutico y átomo radiactivo) como se describe en la presente.
Las técnicas para conjugar dichos agentes terapéuticos con anticuerpos, por ejemplo, scFv, son bien conocidas; véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; and Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58, 1982.
VI. Humanización de anticuerpos
La humanización de anticuerpos es el proceso de sustitución de estructuras de anticuerpos no humanos, por ejemplo, scFv, con estructuras humanas. La humanización exitosa de los anticuerpos depende de mantener la afinidad después de reemplazar los residuos. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos en las que al menos parte de la secuencia tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada surgen de genes humanos. Dichos anticuerpos se denominan en la presente "anticuerpos humanizados", "anticuerpos humanos" o "anticuerpos totalmente humanos". Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar utilizando la técnica del trioma; la técnica del hibridoma de células B humanas (véase Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase Cole, et al, 1985 en: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) Los anticuerpos monoclonales humanos pueden producirse utilizando hibridomas humanos(véaseCoté, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 80: 2026-2030) o transformando células B humanas con el virus de Epstein Barrin vitro(véase Cole et al, 1985 en: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96.
Además, se pueden producir anticuerpos humanos, por ejemplo, scFv, utilizando técnicas adicionales, incluidas bibliotecas de presentación de fagos(VéaseHoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). De manera similar, se pueden producir anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo,ratones en los cuales los genes endógenos de inmunoglobulinas han sido parcial o completamente inactivados. Tras el desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, la cual se parece mucho a la observada en humanos en todos los aspectos, incluido el reordenamiento genético, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Esta aproximación se describe en Patentes de EE. UU. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995).
GenScript® proporciona un método para humanizar anticuerpos. El método sigue la combinación de injerto de CDR, método de retromutación basado en estructura, y Detección Rápida para nivel de Expresión, propiedades Biofísicas, y tecnología de Afinidad (FASEBA), que genera un anticuerpo humanizado, por ejemplo, scFv, con afinidad y propiedades optimizadas. La tecnología FASEBA se utiliza para optimizar las propiedades del anticuerpo humanizado, como el nivel de expresión y la termoestabilidad, las cuales son importantes para una fabricación óptima y el comportamientoin vivo.Detalles adicionales del método de GenScript® se encuentra en laWorld Wide Web(www) en genscript.com/Antibody-Humanization.html.
La presente enseñanza se ilustra mejor con los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Humanización de los scFv del anticuerpo FMC63.
El objetivo de este ejemplo fue humanizar una clon FMC63 del anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) anti-CD19 utilizando un injerto de CDR más una retromutación sin sacrificar la afinidad de unión del anticuerpo parental (tipo silvestre).
Validación de unión de células antigénicas y anticuerpos de referencia.
Las células Raji(homo sapienslinfoma de Burkitt) se cultivaron y se recolectaron mediante centrifugación. Alrededor de 3*105 células por pocillo se lavaron con PBS dos veces y se incubaron en 200 pl de diluciones en serie de anticuerpos de referencia (FMC63: un anticuerpo IgG anti-células B humanas (CD19) de ratón) durante 30 minutos a 4°C. Después de lavar con PBS, se añadió a las células anticuerpo secundario (5 pg/ml de IgG anti-ratón de cabra [FITC]) y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Después de lavar con PBS, se analizó la unión de EC50 a las células utilizando FACSCalibur™. (BD Bioscience, San José, CA) y software FlowJo (Ashland, OR).
El anticuerpo de referencia (FMC63) se unió a las células Raji, pero no a las células Eol-1(homo sapiensleucemia mieloide (eosinofílica) aguda) (datos no mostrados).
Generación de bibliotecas FMC63 humanizadas.
Se diseñó la biblioteca de detección combinatoria de retromutación (BM) humanizada para las cadenas pesada y ligera de FMC63. La construcción de la biblioteca se llevó a cabo siguiendo los procedimientos operativos estándar de GenScript.
Aislamiento de scFv FMC63 humanizados de la biblioteca de presentación de fagos
La biblioteca de presentación de fagos scFv humanizada obtenida de la biblioteca humanizada mencionada anteriormente fue analizada contra las células Raji(homo sapienslinfoma de Burkitt). Las partículas de fagos de entrada se pre incubaron con y sin células Eol-1(homo sapiensleucemia mieloide (eosinofílica) aguda), y el fago unido se eluyó mediante TEA con elución competitiva previa mediante anticuerpo de tipo silvestre, para obtener aglutinantes diversificados y de alta afinidad.
Los clones de fagos de salida individuales se amplificaron en placas de 96 pocillos profundos y los fagos amplificados se analizaron mediante ELISA basada en células y validación por citometría de flujo. El fago unido se sondeó mediante un anticuerpo monoclonal HRP/Anti-M13.
El paneo terminó cuando se encontró que un buen porcentaje de clones de fagos se unían a las células Raji, pero no a las células Eol-1. El paneo y ELISA de fagos se llevaron a cabo siguiendo los procedimientos operativos estándar de GenScript.
Detección Rápida para expresión, Propiedades Biofísicas y Afinidad (FASEBA)
Se utilizó el fago seleccionado de salida para infectar células TG1 (competentes en presentación de fagos) en crecimiento exponencial. Se cultivaron células transfectadas, de las cuales se extrajeron los ADNdc. El fragmento scFv humanizado se digirió a partir del fagémido de doble hebra y se insertó en el vector pFASEBA para la selección de los mejores clones de anticuerpos humanizados.
Los clones individuales se expresaron en placas de 96 pocillos profundos y la proteína cruda secretada porE. colial medio se analizó mediante ELISA contra BSAy validación FACS contra células Raji para la evaluación de la expresión y la actividad de unión, respectivamente.
Construcción y producción de scFv FMC63 humanizado.
Las secuencias de ADN que codifican para las cadenas pesada y ligera humanizadas para FMC63 (anticuerpo IgG anti-células B humanas (CD19) de ratón) se sintetizaron y se insertaron en el vector de expresión pTT5 para construir plásmidos que expresan scFv- (fragmento variable de cadena sencilla). La expresión de anticuerpos humanizados se realizó en 100 ml de cultivo celular HEK293 y los sobrenadantes se purificaron con una columna de afinidad quelante de Ni. El anticuerpo purificado se intercambió portampón con PBS utilizando una columna de desalinización PD-10. La concentración y pureza de las proteínas purificadas se determinaron mediante DO280 y SDS-PAGE, respectivamente.
Titulación por citometría de flujo de scFv FMC63 humanizados
Para la clasificación de la afinidad de los anticuerpos FMC63 humanizados contra las células Raji, los anticuerpos purificados se sometieron a una valoración por citometría de flujo. En resumen, las células Raji se cultivaron y recolectaron mediante centrifugación. Alrededor de 3x105 células por pocillo se lavaron con PBS dos veces y se incubaron en 200 pl de diluciones seriadas de scFv durante 30 minutos a 4 °C. Después de lavar con PBS, se añadió a las células un anticuerpo secundario (5 pg/ml de anticuerpo para Etiqueta de His [FITC]) y se incubó durante 30 minutos a 4 °C. Después de lavar con PBS, se analizó la unión de EC50 a las células utilizando FACSCalibur™ y el software FlowJo.
Aislamiento de clones de scFv FMC63 humanizadas de la biblioteca de presentación de fagos
Se realizó un paneo de la biblioteca de fagos scFv humanizados preincubados con y sin células Eol-1 (Tabla 4).
Tabla 4: Detalles del paneo celular y validaciones de ELISA de fagos.
La tasa positiva (el número de clones humanizados específicas de antígeno sobre el número total de clones seleccionados al azar) de la segunda ronda fue de -40%. Los resultados de ELISA basado en células contra las células Raji y Eol-1 se observaron consistentemente seguidos de validaciones con citometría de flujo.
Cribado por FASEBA
Los ADN que codifican para los fragmentos scFv del segundo fago de salida se amplificaron y se insertaron en el vector pFASEBA para la detección de los anticuerpos principales. Se inocularon e indujeron clones de la biblioteca FASEBA individuales para su expresión en placas de 96 pocillos profundos. Se realizó un cribado FACS para aislar scFv que reconocen específicamente a las células Raji.
De acuerdo con los resultados, se seleccionaron siete clones (denominadas RS, CS, BS, SS, JS, AS, y NS) para la expresión, purificación y medición de la afinidad.
Expresión y purificación de scFv FMC63 humanizados
Los siete scFv humanizados y los scFv de tipo silvestre mencionados anteriormente se expresaron en 100 ml de células HEK293 y se purificaron mediante resina NTA-Ni. La pureza de cada scFv fue superior al 90% de acuerdo con lo evaluado mediante SDS-PAGE.
Titulación por citometría de flujo de scFv FMC63 humanizados
La unión de scFv humanizados con células Raji se investigó por primera vez mediante FACS comenzando con 3 pM de anticuerpos purificados en uso. Se observaron consistentemente señales de unión positivas para las siete clones de scFv humanizadas mencionadas anteriormente durante dos rondas de citometría de flujo.
Finalmente, estos siete scFv humanizados se seleccionaron para análisis mediante citometría de flujo. Las medias geométricas y EC50 de los siete anticuerpos humanizados seleccionados se muestran en la FIG. 3A y FIG. 3B y en la Tabla 5. Es de destacar que EC50 de los clones de scFv SS, JS, AS/AS-R, y NS fue de 72.76 nM, 65.98 nM, 53.06/61.97 nM y 34.02 nM respectivamente, comparable con 27.11 nM del anticuerpo de tipo silvestre.
Tabla 5: Las medias geométricas de siete scFv humanizados seleccionados mediante titulación FACS
Caracterización de cuatro de los siete scFv seleccionados.
Las secuencias de nucleótidos que codifican para el scFv de tipo silvestre y cuatro de los siete scFv humanizados seleccionados se describen anteriormente en la Descripción detallada. Asimismo, las secuencias de aminoácidos para el scFv de tipo silvestre y cuatro de los siete scFv humanizados seleccionados se describen anteriormente en la Descripción detallada.
Se eligieron cuatro scFv humanizados (clones denominadas SS, JS, AS, y NS), que tenían EC50 de unión comparable al scFv de tipo silvestre, para una caracterización adicional.
Se realizó un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de los cuatro clones, en parte para identificar la propensión de los scFv a formar agregados solubles. Como se muestra en la FIG. 4A y FIG. 4B, los clones NS y JS muestran un único pico en SEC; por lo tanto, los scFv NS y JS no forman agregados en las condiciones del ensayo. Por otro lado, como se muestra en la FIG. 4C y FIG. 4D, los clones SS y AS muestran picos duales en SEC; Véase, los recuadros en cada figura. Por tanto, los scFv SS y AS forman una cantidad apreciable de agregados solubles en las condiciones probadas.
Conclusión
En este ejemplo, el clon FMC63 del anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) anti-CD19 se humanizó con éxito. Se obtuvieron siete scFv humanizados a partir de la tecnología de detección de fagos y detección de alto rendimiento de FASEBA. Cuatro scFv humanizados (clones denominados SS, JS, AS, y NS) mostraron una unión comparable (valores de EC50) al scFv FMC63 de tipo silvestre.
Ejemplo 2: Caracterización de los receptores de antígenos quiméricos (CAR) que comprenden cada scFv seleccionado
Se diseñaron receptores de antígenos quiméricos (CAR) que expresan uno de los cuatro scFv seleccionados (SS, JS, AS, y NS) así como su molécula de unión al antígeno.
Se realizó un ensayo de termo-ramificación para determinar la termoestabilidad de los cuatro scFv que comprenden los dominios de unión al CAR.
La estabilidad mejorada es una propiedad deseada de las proteínas. Esto suele evaluarse determinando la temperatura de fusión de una proteína en diversas condiciones. Las proteínas con una temperatura de fusión más alta generalmente son estables durante períodos más prolongados de tiempo. Cuando un CAR es más termoestable, puede estar funcionalmente activo durante períodos de tiempo más largos en la superficie de una célula.
La estabilidad térmica de los scFv que comprenden los dominios de unión de los CARs de la presente invención se midió utilizando un ciclador térmico Bio-Rad C1000, sistema CFx96 de Tiempo Real. El desplegamiento de las proteínas se monitoreó utilizando el colorante fluorescente Naranja SYPRO® (Invitrogen) que se une a los aminoácidos hidrofóbicos que quedan expuestos a medida que se despliega la proteína. Se configuró un gradiente de temperatura de 25 °C a 95 °C con incrementos graduales de 1 °C/minuto. Cada muestra contenía 10 pM de CAR scFv y 5X Tinción naranja de proteína en gel SYPRO® (Molecular Probes™; Concentrado 5,000X en DMs O). Se incluyó NaCl 50 mM en las muestras mostradas en la FIG. 5A.
En este ensayo, una temperatura de fusión aceptable para un CAR era idealmente superior a 60°C.
Como se muestra en la FIG. 5A, los CAR que comprenden scFv humanizados mostraron termoestabilidad variada en presencia de NaCl 50 mM, con poca diferencia cuando se omitió el NaCl (como se muestra en la FIG. 5B). Además, los scFv de los CARs de la presente invención eran bastante estables en relación con otros scFv estudiados utilizados en otros CARs. scFv AS ("□") tenía la temperatura de fusión más baja de alrededor de 58 °C; Se observaron temperaturas de fusión crecientes para los scFv del clon SS ("A"; 65 °C), el clon JS ("0"; 67 °C), y el clon JS NS ("X"; 73 °C).
Expresión de CAR en dos líneas celulares.
Los CARs que comprenden scFv- SS-, JS-, AS-, y NS- se expresaron en dos células T de donadores de células: 5244 (FIG. 6A) y 5273 (FIG. 6B) También se prepararon muestras de células de donador que expresan un CAR simulado y células de donador que expresan un c Ar que comprende el scFv FMC63 (parental).
Los CARs se detectaron en la superficie de las células del donador incubando las células con un anticuerpo anti-CAR conjugado con PE. El porcentaje de CAR positivo y la intensidad de la fluorescencia se midieron mediante citometría de flujo.
La FIG. 6A y FIG. 6B muestran que no se expresó CAR en las células T transducidas de forma simulada. En las células de cualquiera de los donadores, se expresó más SS CAR que en los otros tres clones de scFv humanizados seleccionadas; el AS CAR tuvo la menor cantidad de expresión.
Ejemplo 3: Los CAR que comprenden cada uno de los scFv seleccionados matan selectivamente a las células tumorales
Células T transducidas con CAR o simuladas del donador 5244 (Figuras 7A a 7D) o 5273 (Figuras 8A a 8D) se agregaron a líneas celulares diana en una proporción de efector a diana de 1:1 o 4: 1. Se utilizaron cuatro tipos de células diana: Raji (CD19+ homo sapiens linfoma de Burkitt; FIG. 7A y FIG. 8A), Namalawa (CD19+ homo sapiens linfoma de Burkitt; FIG. 7B y FIG. 8B), Eol-1 (CD19‘homo sapienscélulas de leucemia mieloide aguda (eosinófila); FIG. 7C y FIG. 8C), y Mv411 (CD19‘homo sapienscélulas de leucemia mielomonocítica bifenotípica B; FIG. 7D y FIG.
8D). Se utilizó estaurosporina ("Stauro") como control positivo para la muerte de células tumorales.
Después del cocultivo durante 18 horas a 37 °C, se agregaron a cada pocillo 50 pl de reactivo de luciferina Glo estable en medio R10 y las placas se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. La actividad de la luciferasa se utilizó como una medida de la viabilidad celular. La luminiscencia se leyó en un lector de placas Varioskan Flash.
Figuras 7A-7D y 8A-8D muestran la luminiscencia medida para las células donadoras transducidas con CAR e incubadas con las células diana. Cada uno de los CARs de la presente invención es capaz de matar las células diana CD19+.
La cinética de crecimiento de las células T transducidas con CAR o simuladas de un donador adicional se midieron durante diez días después de la estimulación inicial con OKT3. Los perfiles de crecimiento observados de cada CAR se muestran en la FIG. 9A. Luego se estimularon por segunda vez células T transducidas con CAR o transducidas de forma simulada y se observaron las diferencias en la cinética de crecimiento como se muestra en la FIG. 9B. En el día 10, se llevó a cabo la caracterización de las poblaciones de las células T con un anticuerpo anti-CAR y CD3 (FIG. 10 A). También se realizó tinción con CD4/CD8 para monitorear el enriquecimiento de las células CD8 durante la producción de las células T con CAR que se muestra en la FIG. 10B. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron en CD19+ NAMALWA (FIG. 11A) o CD19- EOL-1 (FIG. 11B) en una proporción de efector a diana de 1:1.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-CD19 humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH),
en el que la región VL comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 14; y
en el que la región VH comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 15.
2. El anticuerpo anti-CD19 humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en una IgG, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, y un scFv, preferiblemente el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un scFv.
3. El anticuerpo anti-CD19 humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende SEQ ID NO: 24.
4. Un polipéptido que comprende el anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido opcionalmente
(i) comprende además una etiqueta de His que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, en el que el polipéptido comprende SEQ ID NO: 13; y/o
(ii) está unido a un agente terapéutico, tal como un agente quimioterapéutico, una citocina, un átomo radiactivo, un ARNip, o una toxina, en particular un agente quimioterapéutico o un átomo radiactivo.
5. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR), que comprende: (I) un dominio de unión al antígeno, (II) un dominio coestimulador, y (III) un dominio de activación,
en el que el dominio coestimulador comprende un dominio extracelular, un dominio transmembranal y un dominio intracelular, y
en el que el dominio de unión al antígeno comprende al menos un polipéptido que comprende el anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. El receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) de la reivindicación 5, en el que
(i) el dominio coestimulador es de o se deriva de CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, receptor Fc gamma, molécula MHC clase 1, molécula MHC clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor del ligando Toll, y fragmentos o combinaciones de los mismos; y/o
(ii) el dominio transmembranal es de o se deriva de 4-1BB/CD137, una cadena alfa de un receptor de las células T, una cadena beta de un receptor de las células T, CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, Cd 4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, un receptor Fc gamma, una molécula MHC clase 1, una molécula MHC clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína inmunoglobulina, un receptor de citocinas, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor del ligando Toll, y combinaciones de los mismos; y/o
(iii) el dominio intracelular es de o se deriva de 4-1BB/CD137, que activa los receptores de células NK, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8alfa, CD8beta, CD96 (Táctil), CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CRT AM, receptores de citocina, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc gamma, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig alfa (CD79a), IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, proteínas tipo inmunoglobulinas, coestimulador de las células T inducible (ICOS), integrinas, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, L<f>A-1, LFA-1, un ligando que se une específicamente a CD83, LIGHT, LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1 (CD11a/CD18), molécula MHC clase I, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, muerte programada-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Ly108), SLAMF7, SLP-76, proteínas receptoras de TNF, TNFR2, un receptor del ligando Toll, TRANCE/RANKL, VLA1 o VLA-6. o una combinación de los mismos; y/o
(iv) el dominio extracelular es de o se deriva de CD2, CD3 delta, CD3 épsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8p, CD11a (ITGAL), CD11b (ITGAM), CD11c (ITGAX), CD11d (ITGAD), CD18 (ITGB2), CD19 (B4), CD27 (TNFRSF7), CD28, CD29 (ITGB1), CD30 (TNFRSF8), CD40 (TNFRSF5), CD48 (SLAMF2), CD49a (ITGA1), CD49d (ITGA4), CD49f (ITGA6), CD66a (CEACAM1), CD66b (CEACAM8), CD66c (CEACAM6), CD66d (CEACAM3), CD66e (CEACAM5), CD69 (CLEC2), CD79A (cadena alfa asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD79B (cadena beta asociada al complejo del receptor del antígeno de células B), CD84 (SLAMF5), CD96 (Táctil), CD100 (SEMA4D), CD103 (ITGAE), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD158A (KIR2DL1), CD158B1 (KIR2DL2), CD158B2 (KIR2DL3), CD158C (KIR3DP1), CD158D (KIRDL4), CD158F1 (KIR2DL5A), CD158F2 (KIR2DL5B), CD158K (KIR3DL2), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (SLAMF3), CD244 (SLAMF4), CD247 (CD3-zeta), CD258 (LIGHT), CD268 (BAFFR), CD270 (TNFSF14), CD272 (BTLA), CD276 (B7-H3), CD279 (PD-1), CD314 (NKG2D), CD319 (SLAMF7), CD335 (NK-p46), CD336 (NK-p44), CD337 (NK-p30), CD352 (SLAMF6), CD353 (SLAMF8), CD355 (CRTAM), CD357 (TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS), LFA-1 (CD11a/CD18), NKG2C, DAP-10, ICAM-1, NKp80 (KLRF1), IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL), SLP-76 (LCP2), PAG1/CBP, un ligando CD83, receptor Fc gamma, molécula MHC clase 1, molécula MHC clase 2, una proteína receptora de TNF, una proteína inmunoglobulina, un receptor de citocina, una integrina, receptores activadores de células NK, un receptor del ligando Toll, y fragmentos o combinaciones de los mismos; y/o
(v) el dominio de activación es de o deriva de CD3-zeta o CD3-episilon.
7. Un polinucleótido que codifica para el CAR o TCR de la reivindicación 5 o 6.
8. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7,
en el que el vector es preferiblemente un vector adenoviral, un vector asociado a adenovirus, un vector de ADN, un vector lentiviral, un plásmido, un vector retroviral, o un vector de ARN, preferiblemente un vector retroviral, en particular un vector lentiviral.
9. Una célula que comprende un anticuerpo anti-CD19 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido de la reivindicación 7, un vector de la reivindicación 8, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) o receptor de células T (TCR) de la reivindicación 5 o 6,
en el que la célula es preferiblemente una célula T, tal como una célula T alogénica, una célula T autóloga, una célula T autóloga diseñada (eACT), o un linfocito infiltrante de tumores (TIL), en particular es una célula T CD4+ o es un célula T CD8+, en el que la célula produce preferiblemente al menos interferón gamma (IPNy) al unirse al CD19 humano.
10. Una composición que comprende (I) una pluralidad de células de la reivindicación 9 o 10, y que comprende opcionalmente al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que la composición comprende preferiblemente células CD4+ o CD8+ o células CD4+ y CD8+, en el que preferiblemente
(i) entre 20% y 80% de las células T son células CD4+ y el resto de las células T son células CD8+;
(ii) entre 30% y 70% de las células T son células CD4+ y el resto de las células T son células CD8+;
(iii) entre 40% y 60% de las células T son células CD4+ y el resto de las células T son células CD8+;
(iv) 50% de las células T son células CD4+ y 50% de las células T son células CD8+;
(v) entre 20% y 80% de las células T son células CD8+ y el resto de las células T son células CD4+;
(vi) entre 30% y 70% de las células T son células CD8+ y el resto de las células T son células CD4+; o
(vii) entre 40% y 60% de las células T son células CD8+ y el resto de las células T son células CD4+; o
(II) un anticuerpo anti-CD19 humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido de la reivindicación 7, un vector de la reivindicación 8, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) o receptor de células T (TCR) de la reivindicación 5 o 6.
11. Un método para fabricar una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR), que comprende un paso de transducir una célulain vitrocon un polinucleótido de la reivindicación 7 o un vector de la reivindicación 8 y que además comprende opcionalmente,
un paso de cultivar la célula bajo condiciones que promuevan la proliferación celular y/o la activación de las células T y/o
un paso de aislamiento de las células T deseadas, el paso de aislamiento de las células T deseadas ocurre preferiblemente después de seis días de cultivo, en el que las células T deseadas expresan preferiblemente CD4+ y/o CD8+,
en el que preferiblemente la célula es un linfocito aislado de un paciente en necesidad de tratamiento, en el que el linfocito es preferiblemente una célula asesina natural, una célula T o una célula B.
12. Una célula de la reivindicación 9 para uso en un método para tratar un linfoma de células B.
13. Una composición de la reivindicación 10 para uso en un método para tratar un linfoma de células B.
14. La célula para uso de la reivindicación 12 o la composición para uso de la reivindicación 13, en la que el linfoma de células B se selecciona del grupo que consiste en Leucemia linfoblástica aguda (ALL), Linfoma relacionado con el SIDA, Linfoma de células B grandes ALK positivo, Linfoma de Burkitt, Leucemia Linfocítica Crónica, (CLL), Linfoma de Hodgkin Clásico, Linfoma Difuso de Células B grandes (DLBCL), Linfoma folicular, Linfoma intravascular de células B grandes, Linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, Granulomatosis linfomatoide, Linfoma linfoplasmocítico, Linfoma de células del manto (MCL), Linfoma de zona marginal de células B (MZL), Linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT), Linfoma de células B de la zona marginal ganglionar (NMZL), Linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares, Linfoma no Hodgkin, Linfoma plasmablástico, Linfoma primario del sistema nervioso central, Linfoma de derrame primario, Linfoma de la zona marginal esplénica (SMZL). y macroglobulinemia de Waldenstrom.
preferiblemente del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda (ALL), Leucemia linfocítica crónica (CLL), Linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), Linfoma folicular, Linfoma de células del manto (MCL), Linfoma de células B de la zona marginal (MZL), Linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT). y linfoma no Hodgkin,
en el que el linfoma de células B es preferiblemente linfoma no Hodgkin.
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