ES2602743T3 - Receptores de antígenos quiméricos con una región bisagra optimizada - Google Patents

Receptores de antígenos quiméricos con una región bisagra optimizada Download PDF

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Abstract

Una proteína que comprende (i) un péptido señal; (ii) un dominio de reconocimiento específico de diana; (iii) una región enlazadora, que conecta el dominio (ii) y el dominio (iv), en la que la región enlazadora no contiene resto o restos de cisteína y se selecciona de cualquiera de los siguientes: la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2, una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 2, con la condición de que el resto de aminoácido 48 no sea una cisteína y sea una serina, y una secuencia de aminoácidos que difiere en uno, dos o tres restos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2, con la condición de que el resto de aminoácido 48 no sea una cisteína y sea una serina; y (iv) un dominio efector que comprende una región transmembrana y uno o más dominios de señalización intracelular, en la que el dominio efector (iv) comprende o es una fusión del dominio transmembrana e intracelular de CD28 humana con el dominio intracelular de la cadena zeta de CD3 humana.

Description

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enlazadora (iii) en las proteínas multifuncionales. La región bisagra modificada específica de la invención que se usa como región enlazadora (iii) en las proteínas multifuncionales de acuerdo con la invención evita la aparición de cisteínas desapareadas no incluyendo las cisteínas presentes de forma natural en las posiciones de aminoácido 115 y 181 de la cadena alfa de CD8 humana, y el remplazo de resto de cisteína presente de forma natural en la posición de aminoácido 164 de la cadena alfa de CD8 humana con un resto de serina químicamente similar. Además, la longitud de 62 restos de aminoácido de la región bisagra modificada específica de la invención que se usa como región enlazadora (iii) en las proteínas multifuncionales de acuerdo con la invención asegura una distancia espacial óptima del dominio de reconocimiento específico de diana (ii) unido de forma N-terminal desde el dominio efector transmembrana e intracelular (iv) unido de forma C-terminal, proporcionando alta flexibilidad y eficacia del reconocimiento de la célula diana. En contraste, la técnica anterior describe CAR que emplean como regiones enlazadoras fragmentos no modificados de la región bisagra de la cadena alfa de CD8 humana (véase, por ejemplo, Fitzer-Attas y col. 1998, documento WO 2008/045437) o la cadena alfa de CD8 murina (véase, por ejemplo, el documento WO 95/30014) que contiene cisteínas de origen natural de la cadena alfa de CD8, que puede afectar negativamente a la expresión y funcionalidad de estos CAR a través de la formación de enlaces disulfuro intra o intermoleculares indeseados. Además, la técnica anterior describe CAR que emplean como regiones enlazadoras fragmentos modificados de la región bisagra de la cadena alfa de CD8 humana que abarca secuencias significativamente más cortas de aminoácidos (tales como de solamente aproximadamente 30 a aproximadamente 40 restos de aminoácido, véase, por ejemplo, el documento US 2007/0031438), que reduce la distancia espacial del domino de reconocimiento específico de diana desde el dominio efector y puede afectar negativamente a la flexibilidad y eficacia del reconocimiento de la célula diana.
(iv) El domino efector
El dominio efector (iv) comprende una región transmembrana y uno o más dominios de señalización intracelular.
El acoplamiento del reconocimiento de la diana/antígeno a la maquinaria de señalización intracelular. La unión del dominio de reconocimiento específico de diana (ii) de la proteína multifuncional (CAR) a su diana afín sobre la superficie de células diana/virus además transmite una señal a las células efectoras inmunitarias que expresan la proteína multifuncional (CAR) mediante el dominio o dominios de señalización intracelular de la proteína multifuncional (que son parte del dominio efector) que activa la actividad citotóxica endógena de dichas células efectoras inmunitarias.
De acuerdo con la invención, el dominio efector (iv) comprende o consiste en (es)
(b) una fusión del dominio transmembrana e intracelular de CD28 humana con el dominio intracelular de la cadena zeta de CD3 humana.
La expresión "equivalente funcional" define una proteína o secuencia de nucleótidos, que tiene una secuencia diferente de aminoácidos o bases, en comparación con las secuencias divulgadas en el presente documento, pero que muestran la misma función in vitro e in vivo. Un ejemplo de un equivalente funcional es un gen modificado o sintético, que codifica la expresión de una proteína idéntica o altamente homóloga a la codificada por el gen o secuencia de tipo silvestre divulgada en el presente documento.
La presente invención también describe:
La secuencia de la cadena zeta de la glucoproteína CD3 de superficie de linfocitos T humanos (número de acceso Swiss-Prot P20963 (CD3Z_HUMANA); Isoforma 3) [SEQ ID NO. 3]
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Por ejemplo, un dominio efector puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO. 3 o uno o más fragmentos de la misma (tal como el dominio transmembrana e intracelular de la cadena zeta de CD3 humana, tal como los restos de aminoácido 29 a 163 de la secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO. 3) o un equivalente funcional de la misma, en la que un "equivalente funcional" tiene menor identidad de secuencia (tal como al menos un 80 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 90 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 95 % de identidad de secuencia o un 99 % de identidad de secuencia) pero es una cadena zeta funcional del complejo CD3 del receptor de linfocitos T.
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De acuerdo con la invención, la cadena zeta es de origen humano. Dentro del TCR la cadena zeta de CD3 existe como homodímero disulfuro. Una "cadena zeta de CD3 funcional" o "una cadena zeta funcional del complejo CD3 del receptor de linfocitos T" es una proteína que tras la expresión en hibridomas de linfocitos T deficientes en la expresión de zeta endógena es capaz de restaurar en dichos hibridomas un TCR funcionalmente activo.
De acuerdo con la invención, la fusión de un fragmento del receptor CD28 coestimulador fusionado a un fragmento de la cadena zeta del complejo CD3 del receptor de linfocitos T contiene:
(b1) el dominio transmembrana de CD28 humana;
(b2) el dominio intracelular de CD28 humana; y
(b3) el dominio intracelular de la cadena zeta de CD3 humana;
La secuencia de la glucoproteína CD28 de superficie específica de linfocitos T humanos (número de acceso Swiss-Prot P10747 (CD28_HUMANA)) [SEQ ID NO. 4]
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en la que (b1) es preferentemente los restos de aminoácido 151-180 de la SEQ ID NO. 4, (b2) es los restos de aminoácido 181-220 de la SEQ ID NO. 4 y (b3) es los restos de aminoácido 52-163 de la SEQ ID NO. 3 (= SEQ ID NO. 5):
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El dominio efector (iv) comprende o consiste en (es) una secuencia de aminoácidos con la secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO. 5 o un equivalente funcional de la misma, en la que un "equivalente funcional" tiene menor identidad de secuencia (tal como al menos un 80 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos un 95 % de identidad de secuencia o un 99 % de identidad de secuencia) pero es una fusión funcional de un receptor CD28 coestimulador fusionado a un fragmento de la cadena zeta del complejo CD3 del receptor de linfocitos T.
Preferentemente, la proteína multifuncional de acuerdo con la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de un péptido señal (escindible) (i), un scFv (ii), la región bisagra modificada (iii) (como se define en el presente documento, preferentemente de la SEQ ID NO. 2) y la fusión del dominio transmembrana e intracelular de CD28 humana con el dominio intracelular de la cadena zeta de CD3 humana (iv) (en la que el péptido señal esta en el extremo N-terminal y la cadena zeta/fusión está en el extremo C-terminal).
La invención describe también una proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 6.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 6 se refiere a la secuencia de aminoácidos de una proteína multifuncional con los dominios:
(i) [péptido señal] -(ii) [scFv anti-ErbB2] -(iii) [bisagra modificada] -(iv) [dominio transmembrana e intracelular de la cadena zeta de CD3 humana]
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-el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 5;
o -la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO. 10 (= secuencia de nucleótidos que codifica la fusión del
dominio transmembrana e intracelular de CD28 humana con el dominio intracelular de la cadena zeta de CD3
humana),
o sus secuencias complementarias;
o secuencias que tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia o un 99 % de identidad de secuencia con las secuencias anteriores,
preferentemente fusionadas al ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2 o la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO. 8
o a sus secuencias complementarias;
o a secuencias que tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia o un 99 % de identidad de secuencia con las secuencias anteriores SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 8 (con la condición de que el resto de aminoácido n.º 48 de la SEQ ID NO. 2 no sea una cisteína y sea una serina y con la condición de que la región bisagra modificada no contenga ningún resto de cisteína).
Preferentemente, un ácido nucleico de la invención comprende o consiste en
-el ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 7;
o -la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO. 12 (= secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
multifuncional con los dominios (i) [péptido señal] -(ii) [scFv anti-ErbB2] -(iii) [bisagra modificada] -(iv) [fusión del
dominio transmembrana e intracelular de CD28 humana con el dominio intracelular de la cadena zeta de CD3
humana]);
o sus secuencias complementarias;
o secuencias que tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia, o un 99 % de identidad de secuencia con las secuencias anteriores (con la condición de que el resto de aminoácido n.º 48 de la SEQ ID NO. 2 no sea una cisteína y sea una serina y con la condición de que la secuencia de aminoácidos de la región bisagra modificada (es decir, los restos de aminoácido n.º 261 a 322) no contenga ningún resto de cisteína).
Preferentemente, las secuencias de ácidos nucleico de la presente invención están optimizadas en los codones para la expresión en células de mamífero, preferentemente para la expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que generalmente son infrecuentes en genes muy expresados de una especie dada por codones que son generalmente frecuentes en genes muy expresados de dicha especie, codificando dichos codones los mismos aminoácidos que los codones que se están intercambiando.
Dentro del alcance de la presente invención están las secuencias de nucleótidos obtenidas debido a la degeneración del código genético de las secuencias anteriores de nucleótidos.
Como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona construcciones de expresión para expresar la proteína de la invención en una célula.
Preferentemente, las construcciones de expresión comprenden adicionalmente secuencias promotoras y terminadoras.
Una "construcción de expresión o génica" (en la que ambos términos se usan de forma intercambiable durante toda esta memoria descriptiva) se refiere a una construcción de ácido nucleico, habitualmente un vector de expresión o plásmido que se usa para introducir una secuencia génica específica en una célula diana. Una vez la construcción de expresión o génica está dentro de la célula, la proteína que está codificada por el gen se produce por la maquinaria celular de transcripción y traducción. La construcción de expresión o génica está diseñada para contener secuencias reguladoras respectivas que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y conducen a una transcripción eficaz del gen portado en la construcción, incluyendo secuencias promotoras y terminadoras. El objetivo de una construcción de expresión o génica bien diseñada es la producción de grandes cantidades de ARNm estable, y por lo tanto proteínas.
Los expertos en la materia pueden seleccionar componentes adecuados adicionales de construcciones de expresión
o génicas.
Los ácidos nucleicos y/o en particular construcciones de expresión de la invención son capaces de dirigir la síntesis/expresión de la proteína multifuncional de la invención en una célula huésped adecuada.
Los ácidos nucleicos y/o construcciones de expresión de la invención son ADNbc, ADNmc, ARN o ARNm o combinaciones de los mismos.
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Como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona células huésped que expresan una proteína de la invención o que comprenden un ácido nucleico o una construcción de expresión de la invención.
De acuerdo con la invención, la célula huésped se selecciona de células efectoras del sistema inmunitario, y en la que las células efectoras del sistema inmunitario son células asesinas naturales (NK), linfocitos T asesinos naturales (NKT) o una preparación de linfocitos que contiene células NK y células NKT.
"Células efectoras" del sistema inmunitario o "células efectoras inmunitarias" se refiere a células de origen hematopoyético incluyendo, aunque sin limitación, los tipos celulares mencionados anteriormente que están funcionalmente implicados en el inicio y/o ejecución de respuestas inmunitarias innatas y/o adaptativas.
Usos de las proteínas, ácidos nucleicos, construcciones de expresión y células huésped
Como se ha descrito anteriormente, la invención proporciona el uso de la proteína multifuncional, ácido nucleico o construcción de expresión para generar células efectoras específicas de antígeno.
"Células efectoras específicas de antígeno" o "células efectoras específicas de diana" se refieren a células efectoras del sistema inmunitario o células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas para expresar la proteína multifuncional de la invención por transferencia de una construcción de expresión o ácido nucleico que codifica dicha proteína multifuncional. Dichas células efectoras específicas de antígeno o específicas de diana son medios versátiles, en particular en el tratamiento de enfermedades (como se describe a continuación para ACT y tratamiento del cáncer).
Como se ha descrito anteriormente, la invención proporciona la proteína multifuncional, ácido nucleico, construcción de expresión o célula huésped para su uso como medicamento.
Como se ha descrito anteriormente, la invención proporciona la proteína multifuncional, ácido nucleico, construcción de expresión o célula huésped para su uso en el tratamiento del cáncer.
Como se ha descrito anteriormente, la invención proporciona la proteína multifuncional, ácido nucleico, construcción de expresión o célula huésped para su uso en inmunoterapia adoptiva específica de célula diana.
"Inmunoterapia adoptiva específica de célula diana" se refiere a una forma de terapia en que se transfieren células inmunitarias a huéspedes que albergan tumor. Las células inmunitarias tienen una reactividad antitumoral y pueden mediar efectos antitumorales directos o indirectos.
"Inmunoterapia adoptiva específica de célula diana" o "terapia celular adoptiva (ACT)" es un tratamiento que usa células efectoras inmunitarias, tales como linfocitos con actividad antitumoral, expandidas in vitro e infundidas en el paciente con cáncer. Ha surgido ACT usando linfocitos de infiltración tumoral autólogos como el tratamiento más eficaz para pacientes con melanoma metastásico y puede mediar la regresión objetiva del cáncer en aproximadamente el 50 % de los pacientes. El uso de linfocitos donantes para ACT es un tratamiento eficaz para pacientes inmunosuprimidos que desarrollan linfomas postrasplante (revisado en Rosenberg y col., 2008). Sin embargo, la capacidad de diseñar genéticamente linfocitos humanos y usarlos para mediar la regresión del cáncer en paciente, que se ha demostrado recientemente (véase, Morgan y col., 2006), ha abierto posibilidades para la ampliación de la inmunoterapia ACT a pacientes con una amplia diversidad de tipos de cáncer y es un nuevo enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer. Por tanto, la ingeniería genética de linfocitos con receptores de antígenos quiméricos (CAR), tales como los proporcionados por la presente invención, es muy adecuado, para ACT y abre más posibilidades en el tratamiento del cáncer. Especialmente, como los estudios han demostrado claramente que la administración de linfocitos T antitumorales muy ávidos dirigidos contra una diana adecuada pueden mediar la regresión de cánceres grandes, vascularizados y metastásicos en seres humanos y proporcionan principios de guía, así como estímulos para el desarrollo adicional de inmunoterapia para el tratamiento de pacientes con cáncer.
Procedimientos de tratamiento
Además, la invención divulga procedimientos para generar células efectoras específicas de antígeno.
El procedimiento para generar células efectoras específicas de antígeno puede comprender
(a)
proporcionar una proteína multifuncional, ácido nucleico o construcción de expresión de acuerdo con la invención;
(b)
proporcionar una célula huésped o línea celular, que se selecciona de células efectoras del sistema inmunitario, tales como linfocitos incluyendo, aunque sin limitación, linfocitos citotóxicos, linfocitos T, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T auxiliares, linfocitos T Th17, células asesinas naturales (NK), linfocitos T asesinos naturales (NKT), mastocitos, células dendríticas, células dendríticas citolíticas, linfocitos B;
(c)
transferir la proteína multifuncional, ácido nucleico o construcción de expresión proporcionado en la etapa (a) a la célula huésped o línea celular proporcionada en la etapa (b);
(d)
selección opcional de las células transgénicas (modificadas con el gen).
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Construcción de CAR. Se mutó un fragmento de ADNc que codificaba la región bisagra derivada de la cadena alfa de CD8 humana por mutagénesis dirigida al sitio para remplazar el codón que codifica la cisteína desapareada de la región bisagra por un codón que codifica un resto de serina (Figura 1). Las secuencias que codifican un péptido señal de cadena pesada de inmunoglobulina, un fragmento de anticuerpo scFv específico para el antígeno de superficie asociado a tumor ErbB2, la región bisagra modificada derivada de la cadena alfa de CD8 humana y los dominios transmembrana e intracelular de la cadena zeta de CD3 humana se ensamblaron en una única fase de lectura abierta produciendo un ADNc que codifica un CAR específico de ErbB2. La secuencia codificante de CAR se insertó en el vector de transferencia lentivírico SIEW para la expresión en linfocitos bajo el control del promotor del virus formador de focos en el bazo (Figura 2). Para una comparación se produjo vector de transferencia lentivírico que codificaba un CAR similar que contenía la región bisagra no modificada derivada de la cadena alfa de CD8 humana.
Transducción de células NK. Se produjeron partículas de vector lentivírico pseudotipadas VSV-G por triple transfección transitoria de células 293T con el vector de transferencia junto con las construcciones de empaquetado pMD-VSVG y 8.91. Se usó el vector lentivírico para transducción de células NK y las células NK transducidas se enriquecieron por dos rondas de clasificación FACS basándose en la expresión de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) como gen marcador codificado por el vector SIEW.
Expresión superficial de CAR. La expresión de CAR sobre la superficie de células NK transducidas y clasificadas por FACS se investigó por análisis FACS con una proteína de fusión ErbB2-Fc (R&D Systems) seguido por fragmento F(ab)2 anti-Fc humano conjugado con APC. Las células NK transducidas por CAR que contenía la región bisagra de cadena alfa de CD8 modificada presentaban una mayor expresión superficial global de CAR en comparación con células NK que expresaban un CAR similar que contenía la región bisagra de cadena alfa de CD8 no modificada (Figura 3).
Análisis de inmunotransferencia de expresión de CAR. La expresión de CAR y la multimerización en células NK transducidas y clasificadas por FACS se investigó por análisis de inmunotransferencia. Se separaron las proteínas en lisados celulares de células transducidas por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. El posterior análisis de inmunotransferencia con anticuerpo anticadena zeta de CD3 demostró una marcada reducción en el nivel de cadena zeta endógena desapareada y mayores niveles de heterodímeros de CAR-cadena zeta y homodímeros de CAR en muestras de células NK que expresaban CAR con la región bisagra de cadena alfa de CD8 modificada en comparación con células NK que expresaban un CAR similar que contenía la región bisagra de cadena alfa de CD8 no modificada (Figura 4).
Actividad citotóxica de células NK que expresan CAR. La actividad citotóxica de células NK que expresan CAR se midió en ensayos de citotoxicidad basados en FACS. Las células NK que expresaban CAR específico de ErbB2 que contenían la región bisagra de cadena alfa de CD8 modificada o no modificada presentaban actividad citotóxica similar hacia células de control de eritroleucemia K562 sensibles a NK pero negativas a ErbB2, pero ambas eran incapaces de lisar células de carcinoma de mama MDA-MB468 resistentes a NK y negativas a ErbB2. Cuando se ensayó la actividad citotóxica hacia células de carcinoma de mama MDA-MB453 positivas a ErbB2, las células NK que expresaban el CAR específico de ErbB2 con la región bisagra de cadena alfa de CD8 modificada mostraban eliminación celular específica de ErbB2 marcadamente potenciada en comparación con células NK que expresaban el CAR específico de ErbB2 con la región bisagra de cadena alfa de CD8 no modificada (Figura 5). Estos resultados demuestran que el CAR modificado posee funcionalidad potenciada.
Ejemplo 2
Construcción de CAR que contiene los dominios de señalización CD28 y cadena zeta de CD3. Las secuencias que codifican un péptido señal de cadena pesada de inmunoglobulina, un fragmento de anticuerpo scFv específico para el antígeno de superficie asociado a tumores ErbB2, la región bisagra modificada derivada de la cadena alfa de CD8 humana descrita en el Ejemplo 1, los dominios transmembrana e intracelular de CD28 humana, y el dominio intracelular de la cadena zeta de CD3 humana se ensamblaron en una única fase de lectura abierta produciendo un ADNc que codifica CAR específico de ErbB2 que contiene los dominios de señalización de CD28 y cadena zeta de CD3. La secuencia que codifica CAR se introdujo en el vector de transferencia lentivírica SIEW para expresión en linfocitos bajo el control del promotor del virus formador de focos en el bazo (Figura 6A).
Transducción de células NK. Se produjeron partículas de vector lentivírico pseudotipadas VSV-G por triple transfección transitoria de células 293T con el vector de transferencia junto con las construcciones de empaquetado pMD-VSVG y 8.91. el vector lentivírico se usó para transducción de células NK y las células NK transducidas se enriquecieron por dos rondas de clasificación FACS basándose en la expresión de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) como gen marcador codificado por el vector SIEW.
Expresión superficial de CAR que contiene los dominios de señalización CD28 y cadena zeta de CD3. La expresión de CAR que contiene los dominios de señalización de CD28 y cadena zeta de CD3 sobre la superficie de células NK transducidas y clasificadas por FACS se investigó por análisis FACS con una proteína de fusión ErbB2-Fc (R&D Systems) seguido por fragmento F(ab)2 anti-Fc humano conjugado con APC. Las células NK transducidas con CAR que contenía la región bisagra de la cadena alfa de CD8 modificada y los dominios de señalización de
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CD28 y cadena zeta de CD3 presentaban alta expresión superficial de CAR (Figura 6B).
Actividad citotóxica de células NK que expresan un CAR que contiene los dominios de señalización de CD28y cadena zeta de CD3. La actividad citotóxica de células NK que expresan un CAR que contiene la región bisagra de cadena alfa de CD8 modificada y los dominios de señalización de CD28 y cadena zeta de CD3 se midió en ensayos de citotoxicidad basados en FACS. Las células NK que expresan este CAR específico de ErbB2 y las células NK de control que no expresan un CAR ambas fueron incapaces de lisar células de carcinoma de mama MDA-MB468 resistentes a NK y negativas a ErbB2 (Figura 6C). Cuando se ensayó la actividad citotóxica hacia células de carcinoma de mama MDA-MB453 positivas a ErbB2, las células NK que expresaban el CAR específico de ErbB2 con la región bisagra de cadena alfa de CD8 modificada y los dominios de señalización de CD28 y cadena zeta de CD3 mostraron alta eliminación celular específica de ErbB2 mientras que las células NK de control que no expresaban un CAR fueron incapaces de lisar las células diana a un grado significativo (Figura 6D). Estos resultados demuestran que la funcionalidad de la región bisagra de cadena alfa de CD8 modificada se retiene como parte de un CAR que contiene los dominios de señalización de CD28 y cadena zeta de CD3.
Materiales y procedimientos (para el Ejemplo 1 y 2)
Células y condiciones de cultivo. Las células NK humanas se mantuvieron en medio X-VIVO10 suplementado con plasma humano al 5 % y 100 UI/ml de IL-2.
Producción de vectores pseudotipados VSV-G en células 293T. Se generaron partículas de vector por transfección transitoria de 4x106 células HEK-293T con un sistema de tres plásmidos que consistía del plásmido de empaquetado que codificaba la proteína de envuelta VSV-G (pMD-VSVG), el plásmido de expresión de glucoproteína que codifica gag y pol (8.91) y el plásmido de transferencia que porta el gen de interés. Las células se transfectaron por transfección con fosfato cálcico usando un total de 20 µg de ADN plasmídico que consistía en 6,5 µg de gag pol, 3,5 µg de VSV-G y 10 µg de plásmidos de transferencia. Se añadieron gota a gota precipitados de ADN-fosfato cálcico a monocapas celulares y se añadió cloroquina 10 mM. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular que contenían partículas de vector lentivírico pseudotipado 48 h después. Los sobrenadantes se filtraron a esterilidad (filtro de 0,45 µm) y se usaron directamente para transducción de células NK.
Transducción lentivírica. Para la transducción, se sembraron 5x105 células NK en un único pocillo de una placa de 6 pocillos. Se añadieron partículas de vector a las células en presencia de 8 µg/ml de polibreno y se centrifugaron durante 60 min a 1800 r.p.m. a 32 ºC. A las 48 h después de la transducción, se analizaron las células por FACS para la expresión de EGFP y CAR.
Análisis citométrico de flujo. Para el análisis de la expresión de CAR, se incubaron células NK transducidas con 1 µg de la proteína de fusión ErbB2-Fc (R&D Systems) durante 1 h a 4 ºC. Después las células se lavaron y se tiñeron con un fragmento de anticuerpo F(ab)2 secundario anti-Fc humano acoplado a APC durante 20 min a 4 ºC. Las muestras se lavaron en tampón FACS (DPBS, FCS al 3 %) y se resuspendieron en 250 µl para el análisis FACS usando un citómetro de flujo FACSCanto (BD Biosciences). Células NK no transducidas y células NK transducidas con vector lentivírico SIEW vacío sirvieron como control.
Análisis de inmunotransferencia. Se recogieron 5x106 células NK y se sedimentaron. Después de lavar dos veces con DPBS, se añadieron 500 µl de tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,3, NaCl 137 mM, glicerol al 10 %, Triton X-100 al 1 %, EDTA 2 mM, inhibidores de proteasa) al sedimento celular y se incubaron durante 20 min en hielo. Se retiraron los deshechos celulares por centrifugación a 14.000 r.p.m. durante 10 min a 4 ºC. Se añadió tampón de Lämmli sin adición de reactivos reductores a los sobrenadantes aclarados, y las muestras se sometieron a SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia con anticuerpo anticadena zeta de CD3 seguido por procedimientos convencionales.
Ensayos de citotoxicidad basados en FACS. Para investigar la actividad citotóxica de células NK precursoras y modificadas genéticamente (células efectoras, E) hacia diferentes líneas de células tumorales (células diana, T), se usó un ensayo de citotoxicidad basado en FACS. Se marcaron células diana con violeta de calceína AM (Molecular Probes, Invitrogen). Las células se recogieron, se contaron y se lavaron en tampón de lavado de calceína (RPMI1640). La cantidad de células se ajustó a 4x106 células/ml, y se añadieron 1,5 µl de violeta de calceína AM disueltos en 42 µl de DMSO a las células. La tinción de las células se realizó durante 30 min en hielo. Después las células se lavaron tres veces con tampón de lavado de calceína y se ajustó la cantidad de células a 5x105 células/ml. Para ensayar la actividad citotóxica de células NK modificadas genéticamente, se cocultivaron células efectoras y diana marcadas a diversas relaciones, efector a diana (E/T). En primer lugar, se sedimentaron las células efectoras, se contaron y se ajustó la cantidad de células a 5x106 células/ml. Se prepararon diluciones apropiadas. Para experimentos de cocultivo, las células diana se resuspendieron en medio X-VIVO que contenía plasma humano al 5 % y 100 UI/ml de IL-2. Se cocultivaron 100 µl de células diana con 100 µl de células efectoras a diversas relaciones E/T durante 2 h a 37 ºC. Después las muestras se lavaron una vez en tampón FACS. Se determinó la lisis espontánea de células diana, en muestras que contenían solamente células diana marcadas. Se añadieron 250 µl de solución de yoduro de propidio (1 µg/ml) a las muestras poco antes de la medición. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto (BD Biosciences). El porcentaje de células diana muertas se determinó usando el software FACSDiVa (BD Biosciences).

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