ES2885696T3

ES2885696T3 - Proteínas heterodiméricas

Info

Publication number: ES2885696T3
Application number: ES19175124T
Authority: ES
Inventors: Gregory Moore; John Desjarlais; Rumana Rashid; Matthew J Bernett
Original assignee: Xencor Inc
Current assignee: Xencor Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2021-12-15
Anticipated expiration: 2034-03-17
Also published as: CN111138543B; WO2014145806A3; JP2020018311A; SI2951203T1; IL241431B; JP7012052B2; JP2023156361A; EP3587448B1; AU2019203977B2; AU2020294326A1; EP2951203B1; KR20210013772A; KR20220093007A; IL284301A; PL3587448T3; KR20150129685A; DK3587448T3; IL241431A0; AU2014232501C1; AU2014232501B2

Abstract

Un anticuerpo heterodimérico que comprende: a) un primer monómero que comprende: i) un scFv anti-CD3 que comprende un primer dominio pesado variable que tiene la SEQ ID NO: 397, un primer dominio ligero variable que tiene la SEQ ID NO: 398 y un conector de scFv, y ii) un primer dominio Fc; b) un segundo monómero que comprende un VH-CH1-bisagra-CH2-CH3, en el cual VH es un segundo dominio pesado variable; y CH2-CH3 es un segundo dominio Fc; y c) una cadena ligera que comprende un VL-CL, en donde VL es un segundo dominio ligero variable y CL es un dominio ligero constante, en donde el primer dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos S364K y E357Q y el segundo dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos L368D y K370S, en donde el CH1-bisagra-CH2-CH3 del segundo monómero comprende las sustituciones de aminoácidos N208D, Q295E, N384D, Q418E y N421D, en donde el primer y segundo dominios Fc comprenden cada uno las sustituciones de aminoácidos E233P, L234V, L235A, G236del y S267K, en donde el conector de scFv es (GKPGS)4 en donde el segundo dominio pesado variable y el segundo dominio ligero variable forman un dominio de unión al antígeno, y en donde la numeración es de acuerdo con la numeración EU.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas heterodiméricas

Prioridad

Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US14/11549, presentada el 14 de enero de 2014, las Solicitudes de Patente de Estados Unidos No. 14/155,334, presentada el 14 de enero de 2014, 14/205,248, presentada el 11 de marzo de 2014 y 14/207,489, presentada el 12 de marzo de 2014. Además, esta aplicación reivindica el beneficio de las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos No.

61/818,513, presentada el 1 de mayo de 2013, 61/818,344, presentada el 1 de mayo de 2013, 61/794,896, presentada el 15 de marzo de 2013, 61/818,401, presentada el 1 de mayo de 2013, 61/913,879, presentada el 9 de diciembre de 2013, 61/913,832, presentada el 9 de diciembre de 2013, 61/938,095, presentada el 10 de febrero de 2014 y 61/913,870, presentada el 9 de diciembre de 2013.

Antecedentes de la invención

Las terapias basadas en anticuerpos se han utilizado con éxito para tratar una variedad de enfermedades, que incluyen el cáncer y los trastornos autoinmunitarios/inflamatorios. Sin embargo, todavía se necesitan mejoras en esta clase de fármacos, particularmente con respecto a mejorar su eficacia clínica. Una vía que se explora es la ingeniería de sitios de unión de antígenos nuevos y adicionales en fármacos basados en anticuerpos, de modo que una sola molécula de inmunoglobulina coacopla dos antígenos diferentes. Tales formatos de anticuerpos alternativos o no nativos que acoplan dos antígenos diferentes se denominan a menudo biespecíficos. Debido a que la considerable diversidad de la región variable del anticuerpo (Fv) hace posible producir un Fv que reconoce virtualmente cualquier molécula, el enfoque típico para la generación biespecífica es la introducción de nuevas regiones variables en el anticuerpo.

Se han explorado varios formatos de anticuerpos alternativos para el direccionamiento biespecífico (Chames y Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9;Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]: 1126-1136; Kontermann, mAbs 4 (2):182 (2012). Inicialmente, los anticuerpos biespecíficos se producían al fusionar dos líneas celulares que producían cada una un único anticuerpo monoclonal (Milstein y otros, 1983, Nature 305:537-540). Aunque el hibridoma o cuadroma híbrido resultante produjo anticuerpos biespecíficos, eran solo una población menor y se requirió una purificación extensa para aislar el anticuerpo deseado. Una solución de ingeniería a esto fue el uso de fragmentos de anticuerpos para hacer biespecíficos. Debido a que tales fragmentos carecen de la estructura cuaternaria compleja de un anticuerpo de longitud completa, las cadenas variables ligera y pesada pueden unirse en construcciones genéticas únicas. Se generaron fragmentos de anticuerpos de muchas formas diferentes, que incluyen los diacuerpos, diacuerpos monocatenarios, scFv en tándem y biespecíficos Fab²(Chames y Baty, 2009, mAbs 1[6]: 1 9; Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]: 1126-116). Si bien estos formatos pueden expresarse en altos niveles en las bacterias y pueden tener beneficios de penetración favorables debido a su pequeño tamaño, se aclaran rápidamente in vivo y pueden presentar obstáculos de fabricación relacionados con su producción y estabilidad. Una causa principal de estos inconvenientes es que los fragmentos de anticuerpos carecen típicamente de la región constante del anticuerpo con sus propiedades funcionales asociadas, que incluyen un tamaño más grande, alta estabilidad y unión a varios receptores y ligandos Fc que mantienen una vida media prolongada en el suero (es decir, el receptor Fc neonatal FcRn) o sirven como sitios de unión para la purificación (es decir, a la proteína A y la proteína G).

Un trabajo más reciente intenta abordar las deficiencias de los biespecíficos basados en fragmentos mediante la ingeniería de unión dual en formatos similares a los anticuerpos de longitud completa (Wuy otros, 2007, Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297; USSN12/477,711; Michaelson y otros, 2009, mAbs 1[2]:128-141; PCT/US2008/074693; Zuo y otros, 2000, Protein Engineering 13[5]:361-367; USSN09/865,198; Sheny otros, 2006, J Biol Chem 281[16]:10706-10714; Lu y otros, 2005, J Biol Chem 280[20]:19665-19672; PCT/US2005/025472).

Estos formatos superan algunos de los obstáculos de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos, principalmente porque contienen una región Fc. Un inconveniente importante de estos formatos es que, debido a que construyen nuevos sitios de unión al antígeno en la parte superior de las cadenas constantes homodiméricas, la unión al nuevo antígeno siempre es bivalente.

Para muchos antígenos que son atractivos como codianas en un formato biespecífico terapéutico, la unión deseada es monovalente en lugar de bivalente. Para muchos receptores inmunes, la activación celular se logra mediante el entrecruzamiento de una interacción de unión monovalente. El mecanismo de entrecruzamiento está mediado típicamente por inmunocomplejos de anticuerpo/antígeno, o por medio del acoplamiento de la célula efectora a la célula diana. Por ejemplo, los receptores Fc gamma de baja afinidad (F^cyR) tales como el FcYRIIa, FcYRIIb y FcYRIIIa se unen monovalentemente a la región Fc del anticuerpo. La unión monovalente no activa las células que expresan estos F^cyR; sin embargo, tras la formación de inmunocomplejos o el contacto de célula a célula, los receptores se entrecruzan y se agrupan en la superficie celular, lo cual lleva a la activación. Para los receptores responsables de mediar la muerte celular, por ejemplo, el FcYRIIIa en las células asesinas naturales (NK), el entrecruzamiento del receptor y la activación celular se producen cuando la célula efectora se acopla a la célula diana en un formato muy ávido (Bowles y Weiner, 2005, J Immunol Methods 304:88-99).

De manera similar, en las células B, el receptor inhibidor FcYRIIb regula negativamente la activación de las células B solo cuando se une a un complejo inmune con el receptor de células B de la superficie celular (BCR), un mecanismo que está mediado por la formación de inmunocomplejos de IgG solubles con el mismo antígeno que es reconocido por el BCR (Heyman 2003, Immunol Lett 88[2]:157-161; Smith y Clatworthy, 2010, Nature Reviews Immunology 10:328-343).

Como otro ejemplo, la activación por CD3 de las células T ocurre solo cuando su receptor de células T asociado (TCR) se acopla al MHC cargado con el antígeno en las células presentadoras de antígenos en una sinapsis de célula a célula muy ávida (Kuhns y otros, 2006, Immunity 24:133-139). De hecho, el entrecruzamiento bivalente inespecífico de CD3 al utilizar un anticuerpo anti-CD3 provoca una tormenta de citocinas y toxicidad (Perruche y otros, 2009, J Immunol 183[2]:953-61; Chatenoud y Bluestone, 2007, Nature Reviews Immunology 7:622-632). Por tanto, para el uso clínico práctico, el modo preferente de acoplamiento conjunto de CD3 para la eliminación redirigida de células diana es la unión monovalente que da como resultado la activación solo tras el acoplamiento con la diana unida.

Por lo tanto, mientras que los biespecíficos generados a partir de los fragmentos de anticuerpos sufren obstáculos biofísicos y farmacocinéticos, un inconveniente de los construidos con formatos similares a los anticuerpos de longitud completa es que estos interactúan con los antígenos diana de forma multivalente en ausencia del antígeno diana primario, lo cual conlleva a una activación inespecífica y potencialmente a una toxicidad. La presente invención resuelve este problema mediante la introducción de un nuevo conjunto de formatos biespecíficos que permiten el acoplamiento conjunto multivalente de distintos antígenos diana. Además, la presente invención proporciona nuevas variantes de heterodimerización que permiten una mejor formación y purificación de proteínas heterodiméricas, que incluyen los anticuerpos.

Breve resumen de la invención

La invención proporciona un anticuerpo heterodimérico que comprende:

a) un primer monómero que comprende:

i) un scFv anti-CD3 que comprende un primer dominio pesado variable que tiene la SEQ ID NO: 397, un primer dominio ligero variable que tiene la SEQ ID NO: 398, y un conector de scFv, y

ii) un primer dominio Fc;

b) un segundo monómero que comprende un VH-CH1-bisagra-CH2-CH3, en el cual VH es un segundo dominio pesado variable; y CH2-CH3 es un segundo dominio Fc; y

c) una cadena ligera que comprende un VL-CL, en donde VL es un segundo dominio ligero variable y CL es un dominio ligero constante,

en donde el primer dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos S364K y E357Q y el segundo dominio Fc comprende las sustituciones de aminoácidos L368D y K370S,

en donde el CH1-bisagra-CH2-CH3 del segundo monómero comprende las sustituciones de aminoácidos N208D, Q295E, N384D, Q418E y N421D,

en donde el primer y segundo dominios Fc comprenden cada uno las sustituciones de aminoácidos E233P, L234V, L235A, G236del y S267K,

en donde el conector de scFv es (GKPGS)4

en donde el segundo dominio pesado variable y el segundo dominio ligero variable forman un dominio de unión al antígeno, y

en donde la numeración es de acuerdo con la numeración EU.

En algunos ejemplos, cada uno de los dominios Fc primero y segundo puede comprender además las sustituciones de aminoácidos M428L y N434S.

La invención proporciona además una composición de ácido nucleico que comprende:

a) un primer ácido nucleico que codifica el primer monómero de acuerdo con la invención;

b) un segundo ácido nucleico que codifica el segundo monómero de acuerdo con la invención; y

c) un tercer ácido nucleico que codifica la cadena ligera de acuerdo con la invención.

La invención también proporciona una composición nucleica que comprende:

a) un primer vector de expresión que comprende el primer ácido nucleico;

b) un segundo vector de expresión que comprende el segundo ácido nucleico; y

c) un tercer vector de expresión que comprende el tercer ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención proporciona una célula hospedera que comprende la composición de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Otro aspecto adicional de la invención está dirigido a un método para preparar un anticuerpo heterodimérico que comprende cultivar la célula hospedera de la invención en condiciones en las que dichos ácidos nucleicos se expresan y recuperan el anticuerpo heterodimérico.

En un aspecto, la presente descripción proporciona anticuerpos heterodiméricos que comprenden un primer monómero que comprende un primer dominio constante de cadena pesada, que comprende un primer dominio Fc variante y un primer dominio de unión al antígeno y un segundo monómero que comprende un segundo dominio constante de cadena pesada, que comprende un segundo dominio Fc variante y un segundo dominio de unión al antígeno.

En un aspecto adicional, el anticuerpo heterodimérico comprende un primer monómero que comprende una cadena pesada que comprende un primer dominio Fc y una región Fv de cadena única (scFv) que se une a un primer antígeno, en el cual el scFv comprende un conector de scFv cargado. El anticuerpo heterodimérico comprende además un segundo monómero que comprende una primera cadena pesada, que comprende un segundo dominio Fc y una primera cadena pesada variable y una primera cadena ligera. En un aspecto adicional, este conector cargado tiene una carga positiva de 3 a 8 o una carga negativa de 3 a 8 y se selecciona del grupo que consiste en los conectores representados en la Figura 9.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona composiciones de anticuerpos heterodiméricos que comprenden un primer monómero que comprende una primera secuencia de cadena pesada, que comprende un primer dominio Fc variante en comparación con un dominio Fc humano; y un primer dominio de unión al antígeno que se une a un primer antígeno; y una segunda secuencia de cadena pesada que comprende: un segundo dominio Fc variante en comparación con un dominio Fc humano; y un segundo dominio de unión al antígeno que se une a un segundo antígeno; en donde los dominios Fc variantes primero y segundo comprenden un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los conjuntos de aminoácidos representados en la Figura 3. En un aspecto adicional, la descripción proporciona composiciones de anticuerpos heterodiméricos que comprenden: un primer monómero que comprende una primera secuencia de cadena pesada que comprende un primer dominio Fc variante en comparación con un dominio Fc humano; y un primer dominio de unión al antígeno que se une a un primer antígeno; y una segunda secuencia de cadena pesada que comprende un segundo dominio Fc variante en comparación con un dominio Fc humano; y un segundo dominio de unión al antígeno que se une a CD 19. El segundo dominio de unión al antígeno comprende un dominio de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de H1.227 (SEQ ID NO: X) y una cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de L1.198 (SEQ ID NO: X) y la secuencia de aminoácidos de 1.199 (SEQ ID NO: X) como se representa en la Figura 21.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona una composición de anticuerpo heterodimérico que comprende un primer monómero que comprende una primera secuencia de cadena pesada que comprende un primer dominio Fc variante en comparación con un dominio Fc humano, un primer dominio de unión al antígeno que comprende una región variable anti-CD3, que tiene una secuencia que comprende un vhCDR1 que tiene la secuencia T-Y-A-M-Xaal, en donde Xaa1 es N, S o H (SEQ ID NO: 435), un vhCDR2 que tiene la secuencia R-I-R-S-K-Xaa1-N-Xaa2-Y-A-T-Xaa3-Y-Y-A-Xaa4-S-V-K-G, en donde Xaa1 es Y o A, Xaa2 es N o S, Xaa3 es Y o A y Xaa4 es D o A (SEQ ID NO: 436), un vhCDR3 que tiene la secuencia H-G-N-F-G-Xaa1-S-Y-V-S-W-F-Xaa2-Y, en donde Xaa1 es N, D o Q y Xaa2 es A o D (SEQ ID NO: 437), un vlCDR1 que tiene la secuencia Xaal-S-S-T-G-A-V-T-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Y-A-N, en donde Xaa1 es G, R o K, Xaa2 es T o S, Xaa3 es S o G y Xaa4 es N o H, (SEQ ID NO: 438), un vlCDR2 que tiene la secuencia Xaa1-T-N-Xaa2-R-A-Xaa3, en donde Xaa1 es G o D, Xaa2 es K o N y Xaa3 es P o S (SEQ ID NO: 439) y un vlCDR3 que tiene la secuencia Xaa1-L-W-Y-S-N-Xaa2-W-V, en donde Xaa1 es A o L y Xaa2 es L o H (SEQ ⁱD NO: 440). El anticuerpo heterodimérico comprende además un segundo monómero que comprende una segunda secuencia de cadena pesada que comprende un segundo dominio Fc variante en comparación con un dominio Fc humano; y un dominio de unión al antígeno anti-CD19 que comprende un dominio de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de H1.227 (SEQ ID NO: X) y una cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de L1.198 (SEQ ID NO: X) y la secuencia de aminoácidos de 1.199 (SeQ ID NO: X) como se representa en la Figura 21.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona un anticuerpo heterodimérico que comprende un primer monómero que comprende una cadena pesada que comprende un primer dominio Fc variante; y una región Fv de cadena única (scFv) que se une a un primer antígeno, en donde el scFv comprende un conector de scFv cargado; y un segundo monómero que comprende una primera cadena pesada que comprende un segundo dominio Fc variante y una primera cadena pesada variable y el segundo monómero también comprende una primera cadena ligera, en donde el primer y segundo dominios Fc variantes comprenden las sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las representadas en la Figura 7.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona una composición de anticuerpo heterodimérico que comprende un primer monómero que comprende un primer dominio de unión al antígeno, que comprende una región variable anti-CD3 que tiene una secuencia que comprende un vhCDR1 que tiene la secuencia T-Y-AM-Xaa1, en donde Xaa1 es N, S o H (SEQ ID NO: 435), un vhCDR2 que tiene la secuencia R-I-R-S-K-Xaa1-N-Xaa2-Y-A-T-Xaa3-Y-Y-A-Xaa4-S-V-K-G, en donde Xaa1 es Y o A, Xaa2 es N o S, Xaa3 es Y o A y Xaa4 es D o A (SEQ ID NO: 436), un vhCDR3 que tiene la secuencia H-G-N-F-G-Xaa1-S-Y-V-S-W-F-Xaa2-Y, en donde Xaa1 es N, D o Q y Xaa2 es A o D (SEQ ID NO: 437), un vlCDRl que tiene la secuencia Xaa1-S-S-T-G-A-V-T-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Y-A-N, en donde Xaa1 es G, R o K, Xaa2 es T o S, Xaa3 es S o G y Xaa4 es N o H, (SEQ ID NO: 438), un vlCDR2 que tiene la secuencia Xaa1-T-N-Xaa2-R-A-Xaa3, en donde Xaa1 es G o D, Xaa2 es K o N, y Xaa3 es P o S (SEQ ID NO: 439) y un vlCDR3 que tiene el secuencia Xaa1-L-W-Y-S-N-Xaa2-W-V, en donde Xaa1 es A o L y Xaa2 es L o H (SEQ iD NO: 440). El primer monómero también comprende una primera secuencia de cadena pesada que comprende un primer dominio Fc variante en comparación con un dominio Fc humano. El anticuerpo heterodimérico también comprende un segundo monómero que comprende un segundo dominio de unión al antígeno; y una segunda secuencia de cadena pesada que comprende un segundo dominio Fc variante en comparación con un dominio Fc humano y en donde el primer y segundo dominios Fc variantes tienen diferentes secuencias de aminoácidos. En algunas modalidades, la región variable anti-CD3 comprende un vhCDR1 que tiene la secuencia T-Y-A-M-Xaa1, en donde Xaa1 es N, S o H (SEQ ID NO: 435), un vhCDR2 que tiene la secuencia R-I-R-S-K-Xaa1-N-Xaa2-YAT-Xaa3-Y-Y-A-Xaa4-SVKG, en donde Xaa1 es Y o A, Xaa2 es N o S, Xaa3 es Y o A y Xaa4 es D o A (SEQ ID NO: 436), un vhCDR3 que tiene la secuencia H-G-N-F-G-Xaa1-S-Y-V-S-W-F-Xaa2-Y, en donde Xaa1 es N, D o Q y Xaa2 es A o D (SEQ iD NO: 437), un vlCDR1 que tiene la secuencia Xaa1-S-S-T-G-A-V-T-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Y-A-N, en donde Xaa1 es G, R o K, Xaa2 es T o S, Xaa3 es S o G y Xaa4 es N o H, (SEQ ID NO: 438), un vlCDR2 que tiene la secuencia Xaal-T-N-Xaa2-R-A-Xaa3, en donde Xaa1 es G o D, Xaa2 es K o N, y Xaa3 es P o S (SEQ ID NO: 439) y un vlCDR3 que tiene la secuencia Xaa1-L-W-Y-S-N-Xaa2-W-V, en donde Xaa1 es A o L y Xaa2 es L o H (SEQ ⁱD NO: 440).

En un aspecto adicional, la descripción proporciona proteínas heterodiméricas que comprenden un primer monómero que comprende una primera región constante de cadena pesada variante y una primera pareja de fusión; y un segundo monómero que comprende una segunda región constante de cadena pesada variante y una segunda pareja de fusión, en donde la región Fc de la primera y segunda regiones constantes comprenden un conjunto de sustituciones de aminoácidos de las Figuras 3 y 12. EN algunos casos, el primer monómero comprende una tercera pareja de fusión y, opcionalmente, el segundo monómero comprende una cuarta pareja de fusión. Las parejas de fusión se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un componente de inmunoglobulina, un péptido, una citocina, una quimiocina, un receptor inmune y un factor sanguíneo. En algunos casos, el componente de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en el Fab, VH, VL, scFv, scFv2, dAb.

En muchos aspectos, uno de los dominios Fc variantes primero y segundo comprende sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las representadas en la Figura 6, 7 y/o 12. En algunos aspectos, el primer dominio de unión al antígeno es un scFv unido covalente al primer dominio constante de la cadena pesada. En aspectos adicionales, el anticuerpo heterodimérico tiene una estructura seleccionada de las estructuras de las Figuras 1B a 1L y 2A a 2M. En aspectos adicionales, el primer y/o segundo dominio Fc del anticuerpo heterodimérico comprenden además sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 434A, 434S, 428L, 308F, 2591, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 4361 o V/434S, 436V/428L, 252Y, 252Y/254T/256E, 259I/308F/428L, 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E /330Y, 239D, 332E/330L, 236R, 328R, 236R/328R, 236N/267E, 243L, 298A y 299T. En algunos aspectos, uno de los dominios Fc variantes primero y segundo comprende las sustituciones de aminoácidos 364K/E357Q y el otro comprende las sustituciones de aminoácidos 368D/370S. Estos anticuerpos pueden comprender además sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las enumeradas en la Figura 7.

En aspectos adicionales, la presente invención proporciona los ácidos nucleicos, vectores de expresión y células hospederas que producirán las proteínas y anticuerpos heterodiméricos de la invención.

En aspectos adicionales, la invención proporciona los métodos para preparar las proteínas heterodiméricas de la invención al cultivar las células hospederas que comprenden los ácidos nucleicos que codifican las proteínas y los anticuerpos heterodiméricos de la invención, en condiciones en las que el heterodímero se produce, y recuperar el heterodímero.

En un aspecto adicional, la invención proporciona los métodos para preparar un anticuerpo heterodimérico de la invención que comprenden proporcionar un primer ácido nucleico que codifica una primera cadena pesada, que comprende una primera cadena pesada que comprende un primer dominio Fc y una región Fv de cadena única (scFv) que se une a un primer antígeno, en donde dicho scFv comprende un conector cargado; y proporcionar un segundo ácido nucleico que codifica una segunda cadena pesada que comprende un segundo dominio Fc una primera cadena pesada variable; y proporcionar un tercer ácido nucleico que comprende una cadena ligera. El método comprende adicionalmente expresar el primer, segundo y tercer ácido nucleico en una célula hospedera para producir una primera, segunda y tercera secuencia de aminoácidos, respectivamente, cargar la primera, segunda y tercera secuencias de aminoácidos en una columna de intercambio iónico; y colectar la fracción heterodimérica.

En aspectos adicionales, la descripción proporciona los métodos para tratar a un individuo que lo necesite mediante la administración de un anticuerpo o proteína heterodimérica, en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Formatos y variantes de heterodimerización

Las Figuras 1A-1M representan varios formatos de proteínas heterodiméricas, que incluyen proteínas de fusión a Fc heterodiméricas, así como anticuerpos heterodiméricos. La Figura 1A muestra el concepto básico de una región Fc dimérica con cuatro posibles parejas de fusión A, B, C y D. Las parejas A, B, C y D se seleccionan opcional e independientemente de dominio(s) de inmunoglobulina(s) (por ejemplo, Fab, vH, vL, scFv, scFv², scFab, dAb, etc.), péptido(s), citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-10, IL-12, GCSF, GM-CSF, etc.), quimiocina(s) (por ejemplo, RANTES, CXCl9, CXCL10, CXCL12, etc.), hormona(s) (por ejemplo, FSH, hormona del crecimiento), receptor(es) inmunológicos (por ejemplo, CTLA-4, TNFR1, Tn Fr II, otro Tn Fs F, otro TNFRSF, etc.) y factor(es) sanguíneo(s) (por ejemplo, el factor VII, factor VIII, factor IX, etc.). Los dominios rellenos con blanco sólido o negro sólido se diseñan con las variantes de heterodimerización como se describe en el presente documento. La Figura 1B representa el formato de "triple F" (en ocasiones también denominado como configuración de "abrebotellas" como se describe a continuación). La Figura 1C muestra una configuración de "triple F" con otro scFv unido al monómero Fab (este, junto con la Figura 1F, también tiene un mayor diferencial de peso molecular). La Figura ID representa una "triple F" con otro scFv unido al monómero scFv. La Figura 1E representa un formato de "tres scFv". La Figura 1F representa un Fab adicional unido al monómero Fab. La Figura 1G muestra un Fab conectado a uno de los monómeros scFv. Las Figuras 1H-1L muestran variedades adicionales de modalidades de "mayor multiespecificidad" del formato de "triple F", todas con un monómero que comprende un scFv (y todas las cuales tienen diferenciales de peso molecular que pueden explotarse para la purificación de los heterodímeros). La Figura 1H muestra un formato "Fab-Fv" con la unión a dos antígenos diferentes, donde la Figura 1I representa el formato "Fab-Fv" con unión a un solo antígeno (por ejemplo, la unión bivalente al antígeno 1). Las Figuras 1J y 1K representan un formato "Fv-Fab" con unión de antígeno adicional bivalente o monovalente similar. La Figura 1L representa un monómero con un CH1-CL unido al segundo scFv. La Figura 1M muestra un formato scFv dual. En algunas modalidades, no es preferente el formato triple F.

Las Figuras de la 2A a la 2U representan una amplia variedad de formatos multiespecíficos (por ejemplo, de heterodimerización) y las combinaciones de diferentes tipos de variantes de heterodimerización que pueden usarse en la presente invención (a veces se hace referencia en el presente documento como "armazones heterodiméricos"). Tenga en cuenta además que todos estos formatos pueden incluir variantes de adición en la región Fc, como se describe más detalladamente a continuación, lo cual incluye las variantes de "ablación" o "desactivación" (Figura 7), variantes de Fc para alterar la unión al FcyR (FcYRIIb, FcYRIIIa, etc.), variantes de Fc para alterar la unión al receptor FcRn, etc. La Figura 2A muestra un formato scFv-Fc doble, que, como para todos los formatos de heterodimerización en el presente documento, puede incluir variantes de heterodimerización tales como las variantes pI, botones en agujeros (KIH, también denominados en el presente documento como variantes estéricas o variantes "sesgadas"), pares de carga (un subconjunto de variantes estéricas), variantes isostéricas y cuerpo SEED ("dominio de ingeniería de intercambio de hebras"; ver Klein y otros, MAbs 4:6 653-663 (2012) y Davis y otros, Protein Eng Des Sel 2010 23:195-202), que se basan en el hecho de que los dominios CH3 de la IgG e IgA humanas no se unen entre sí. La Figura 2B representa una IgG biespecífica, nuevamente con la opción de una variedad de variantes de heterodimerización. La Figura 2C representa la versión "de un solo brazo" de DVD-Ig que utiliza dos dominios ligeros variables y pesados variables diferentes. La Figura 2D es similar, excepto que en lugar de un "brazo vacío", las cadenas pesadas y ligeras variables están en cadenas pesadas opuestas. La figura 2E se denomina generalmente "mAb-Fv". La Figura 2F representa un formato multi-scFv; como apreciarán los expertos en la técnica, de manera similar a los formatos "A, B, C, D" discutidos en el presente documento, puede haber cualquier número de scFv asociados (o, para el caso, cualquier otro ligando o funcionalidad de unión). Por tanto, la Figura 2F podría tener 1, 2, 3 o 4 scFv (por ejemplo, para biespecíficos, el scFv podría ser "cis" o "trans", o ambos en un "extremo" de la molécula). La Figura 2G representa un FabFc heterodimérico con el Fab formado por dos cadenas pesadas diferentes, una que contiene las secuencias de Fab de la cadena pesada y la otra que contiene las secuencias de Fab de la cadena ligera. La Figura 2H representa el "Fab-Fc de un solo brazo", donde una cadena pesada comprende el Fab. La Figura 21 representa un "scFv-Fc de un brazo", en donde un Fc de cadena pesada comprende un scFv y la otra cadena pesada está "vacía". La Figura 2J muestra un scFv-CH3, en donde solo se utilizan las regiones CH3 de la cadena pesada, cada una con su propio scFv. La Figura 2K representa un mAb-scFv, en donde un extremo de la molécula se acopla a un antígeno bivalentemente con un acoplamiento monovalente mediante el uso de un scFv en una de las cadenas pesadas. La Figura 2L representa la misma estructura excepto que ambas cadenas pesadas comprenden un scFv adicional, que puede unirse al mismo antígeno o diferentes antígenos. La Figura 2M muestra la estructura "CrossMab", donde el problema de la formación de múltiplex debido a dos cadenas ligeras diferentes se aborda mediante el cambio de las secuencias en la porción Fab. La Figura 2N representa un scFv, la Figura 2O es un "BiTE" o scFv-scFv unido por un conector como se describe en el presente documento, la Figura 2P representa un DART, la Figura 2Q representa un TandAb y la Figura 2R muestra un diacuerpo. Las Figuras 2S, 2T y 2U representan los formatos de armazón alternativos adicionales que encuentran un uso en la presente invención.

La Figura 3 representa una serie de variantes de heterodimerización adecuadas, que incluyen las variantes sesgadas/estéricas, variantes isostéricas, variantes de pI, variantes KIH, etc. para su uso en las proteínas heterodiméricas de la invención. Como para todas las estructuras heterodiméricas del presente documento, cada conjunto de estas variantes de heterodimerización puede combinarse, opcional e independientemente y en cualquier combinación en cualquier armazón heterodimérico. Las variantes al final de la lista de monómeros 1 son variantes de pI isostéricas, las cuales generalmente no se usan en pares o conjuntos. En este caso, un monómero está diseñado para aumentar o disminuir el pI sin alterar el otro monómero. Por tanto, aunque se muestran en la lista de "monómeros 1", estos pueden incorporarse en el monómero apropiado, de manera que se conserve el "enhebrado". Es decir, lo importante es que el "enhebrado" de los pares de monómeros permanezcan intactas, aunque las variantes enumeradas como variantes de "monómero 1" en la lista estérica puedan cruzarse con variantes de "monómero 2" en la lista pI. Es decir, cualquier conjunto puede combinarse con cualquier otro, independientemente de la lista de "monómeros" a la cual esté asociado (como se analiza con más detalle a continuación, en el caso de que los cambios en pI se utilicen para purificar las proteínas heterodiméricas, la "hebra pI" también se conserva; por ejemplo, si hay variantes sesgadas que alteran la carga, se emparejan con las variantes de pI en la hebra correcta; las variantes sesgadas que dan como resultado aumentos en pI se agregan al monómero que aumentó las variantes de pI, etc. Esto es similar a la adición de conectores de scFv cargados; en ese caso, como se describe con más detalle en el presente documento, el conector de scFv cargado correctamente se añade al monómero correcto para preservar la diferencia de pI. Además, cada par de variantes de aminoácidos (o donde hay un único monómero diseñado) puede incluirse o excluirse opcional e independientemente de cualquier proteína heterodimérica, así como combinarse opcional e independientemente.

Las Figuras 4A, 4B y 4C representan un subconjunto de variantes de heterodimerización de la Figura 3 que encuentran un uso particular en la invención.

La Figura 5 representa un subconjunto de variantes de heterodimerización de la Figura 3.

La Figura 6 representa una lista de regiones constantes de anticuerpos variantes isotípicas e isostéricas y sus respectivas sustituciones. pI_(-) indica variantes de pI más bajo, mientras que pI_(+) indica variantes de pI más alto. Estos pueden combinarse opcional e independientemente con otras variantes de heterodimerización de la invención.

La Figura 7 representa una serie de variantes de "desactivación" ("KO") adecuadas para reducir la unión a algunos o todos los receptores F^cyR. Como es cierto para muchas, si no todas las variantes de la presente invención, estas variantes de KO pueden combinarse de forma independiente y opcional, tanto dentro del conjunto descrito en la Figura 35 como con cualquier variante de heterodimerización descrita en el presente documento, incluidas las variantes estéricas y de pI. Por ejemplo, las variantes E233P/L234V/L235A/G236del pueden combinarse con cualquier otra variante simple o doble de la lista. Además, aunque es de preferencia en algunas modalidades, que ambos monómeros contengan las mismas variantes de KO, es posible combinar diferentes variantes de KO en diferentes monómeros, así como tener solo un monómero que comprenda la(s) variante(s) de KO. También se hace referencia a las Figuras y Leyendas de USSN. 61/913,870 en lo que se refiere a las variantes de "desactivación" o "ablación".

La Figura 8 representa varios disulfuros diseñados por ingeniería genética del scFv anti-CD3.

La Figura 9 representa varios conectores de scFv cargados que encuentran un uso para aumentar o disminuir el pI de las proteínas heterodiméricas que utilizan uno o más scFv como componente. Un único conector de scFv de la técnica anterior con una única carga se denomina "Whitlow", de Whitlow y otros, Protein Engineering 6 (8): 989-995 (1993). Cabe señalar que este conector se utilizó para reducir la agregación y mejorar la estabilidad proteolítica en los scFv.

Las Figuras 10A y 10B son una lista adicional de posibles variantes de heterodimerización para su uso en la presente invención, que incluye las variantes isotípicas.

La Figura 11 representa una matriz de posibles combinaciones de formatos de heterodimerización, variantes de heterodimerización (separadas en variantes de pI y variantes estéricas (que incluyen las variantes de pares de carga), variantes de Fc, variantes de FcRn y combinaciones. La leyenda A son las variantes de FcRn adecuadas: 434A, 434S, 428L, 308F, 2591, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 4361 o V/434S, 436V/428L, 252Y, 252Y/254T/256E y 259I/308F/428L. Es decir, el formato de Triple F de la Figura 1B puede tener cualquiera de estas variantes de FcRn en una o en ambas secuencias de monómeros. Para mayor claridad, como cada cadena pesada es diferente, las variantes de FcRn (así como las variantes de Fc) pueden residir en uno o ambos monómeros. La leyenda B son las variantes de Fc adecuadas: 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 236R, 328R, 236R/328R, 236N/267E, 243L, 298A y 299T. (Tenga en cuenta que las variantes de Fc adecuadas adicionales se encuentran en la Figura 41 del documento de Estados Unidos 2006/0024298). En algunos casos, como se describe en el presente documento, se utilizan variantes de "desactivación" o "ablación", como se muestra en la Figura 7, y se incluyen en la definición de variantes de Fc. En cuanto a las variantes de FcRn, las variantes de Fc pueden residir en cualquiera de las cadenas. La Leyenda C son las variantes de pI adecuadas, y estas, por brevedad, se importan a partir de las Figuras 3 y 12, de nuevo con el entendimiento de que hay unas "características de las hebras" en las variantes de pI. La leyenda D son las variantes estéricas adecuadas (que incluyen las variantes de pares de carga); de nuevo, por brevedad se importan a partir de las Figuras 3 y 12, de nuevo con el entendimiento de que hay un "enhebrado" de las variantes estéricas. La leyenda E refleja las siguientes combinaciones posibles, de nuevo, con cada variante combinada de forma independiente y opcional a partir de la Leyenda fuente apropiada: 1) variantes de pI más variantes de FcRn; 2) variantes de pI más variantes de Fc; 3) variantes de pI más variantes de FcRn más variantes de Fc; 4) variantes estéricas más variantes de FcRn; 5) variantes estéricas más variantes de Fc; 6) variantes estéricas más variantes de FcRn más variantes de Fc; 7) variantes de pI más variantes estéricas más variantes de FcRn; 8) variantes de pI más variantes estéricas más variantes de Fc; 9) variantes de pI más variantes estéricas más variantes de FcRn más variantes de Fc; y 10) variantes de pI más variantes estéricas. Tenga en cuenta que cualquiera o todas estas combinaciones pueden incluir o excluir opcionalmente las variantes de desactivación/ablación en uno o ambos monómeros.

Las Figuras de la 12A a la 12J representan los pares de variantes de heterodimerización adicionales.

Secuencias específicas de las invenciones

La Figura 13 representa las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de tipo salvaje utilizadas en la invención y la fusión IgG1/G2.

Las Figuras de la 14A a la 14YY representan las secuencias de aminoácidos de los scFv variantes anti-CD3, las secuencias pesadas variables y ligeras variables, humanizadas y optimizadas para la estabilidad. (Tenga en cuenta también que la primera secuencia es la versión etiquetada con histidina para facilitar la purificación). Los CDR están subrayados. Debe entenderse que la estabilidad aumentada de las cadenas ligeras optimizadas y variables optimizadas (así como las cadenas de los scFv) puede atribuirse a las regiones marco, así como a las CDR. Por tanto, debe entenderse que la descripción de la región variable completa incluye la descripción de las regiones marco, aunque no están numeradas por separado. Además, los conectores de scFv se muestran en gris. Cada conector de scFv puede reemplazarse con un conector de scFv cargado como se muestra en la Figura 5. Es decir, cualquier conector de scFv cargado, ya sea positivo o negativo, que incluye los representados en la Figura 5, puede sustituirse por la región resaltada en las Figuras de la 3A a la 3YY.

Las Figuras de la 15A a la 15I representan una recopilación de todas las secuencias de vhCDR1-3 y v1CDR1-3 del CD3, útiles en la presente invención. Las secuencias de las CDR de consenso se muestran al final de la Figura. La Figura 6 muestra

La Figura 16 muestra la secuencia de XENP13790, la cual es XENP12912 (scFv CD3 disulfuro) con la adición de un conector cargado.

Las Figuras 17A, 17B y 17C. La Figura 17A representa dos modalidades de Triple F diferentes. Las Figuras 17B y 17C muestran las secuencias de la modalidad de Triple F de la Figura 17A.

La Figura 18 representa las secuencias de una modalidad de preferencia de la invención. Las regiones variables están subrayadas y el conector de scFv cargado está en gris.

Las Figuras 19A y 19B. La Tm y el cambio en la Tm para los scFv variantes anti-CD19 humanizados y optimizados para la estabilidad. La numeración de los aminoácidos es la numeración de Kabat. La Figura 19A, determinada por DSF (Fluorimetría de Barrido Diferencial) de los scFvs.done de las variantes anti-CD19 humanizadas y optimizadas para la estabilidad, a una concentración de 0,2 mg/ml y la figura 19B se realizó a 0,4 mg/ml.

Las Figuras 20A-20K. Las secuencias de aminoácidos de los scFv variantes anti-CD19, las secuencias pesadas variables y ligeras variables, humanizadas y optimizadas para la estabilidad. (Tenga en cuenta también que la primera secuencia es la versión etiquetada con histidina para facilitar la purificación). Debe entenderse que la estabilidad aumentada de las cadenas ligeras optimizadas y variables optimizadas (así como las cadenas de los scFv) puede atribuirse a las regiones marco, así como a las CDR. Por tanto, debe entenderse que la descripción de la región variable completa incluye la descripción de las regiones marco, aunque no están numeradas por separado.

Figura 21. Representa las regiones estabilizadas del Fv anti-CD19.

Las Figuras 22A y 22B representan las construcciones del scFv dual (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1M).

Las Figuras 23A y 23B representan las construcciones de "abridor de botellas" (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1B).

Las Figuras 24A - 24K muestran las secuencias adicionales de la invención que incluyen las variantes de heterodimerización isostérica.

Materiales de los datos

Figura 25. Regiones variables anti-CD19 estabilizadas - unión competitiva con la IgG1 anti-CD19 marcada a 1 pg/ml.

La Figura 26 muestra la caracterización y comparación de un formato scFv-Fc doble, un par anti-CD3/anti-CD19, con el formato "BiTE", mediante el uso de los mismos scFv, pero sin la región Fc. Como se muestra, el scFv-Fc doble es menos potente que el formato BiTE, pero la adición de la región Fc aumenta 10 veces la vida media en los ratones.

La Figura 27 representa que cada una de las porciones de scFv reacciona de forma cruzada con los antígenos del mono cynomolgus en una prueba de RTCC. Es decir, la diferencia de potencia entre los formatos (scFv-Fc doble versus BiTE) se traduce en los monos cynomolgus.

La Figura 28 muestra que la diferencia de vida media entre los dos formatos también se traduce en los monos cynomolgus. El anticuerpo scFv-Fc doble se corrió a tres concentraciones diferentes como se muestra.

La Figura 29 representa la proyección de la farmacodinámica en los monos, con la duración de la concentración sérica cuando es mayor que la CE50 es más larga para el formato scFv-Fc doble que para BiTE, a las 2-3 semanas frente a los 2-3 días.

La Figura 30 muestra la eliminación extensa y prolongada de las células B con el formato biespecífico scFv-Fc doble. La PK más larga de este formato permite la eliminación prolongada de las células B hasta 14 días.

La Figura 31 representa la ingeniería de estabilidad de las porciones scFv-Fc scFv anti-CD3/anti-CD19. Al identificar y reemplazar los aminoácidos raros, identificar y reemplazar los aminoácidos con residuos de contacto inusuales, la ingeniería de los conectores y la conversión a la orientación VL-VH, se logró una estabilidad sustancialmente incrementada.

La Figura 32 representa la PK mejorada en ratones como resultado de la estabilización, la cual resultó en una duplicación de la vida media en ratones para la estabilización del anti-CD19.

La Figura 33 muestra la producción y purificación del "triple F" o "abridor de botellas" (o como se menciona en algunas de las figuras, Fab-scFv-Fc.

La Figura 34 muestra la caracterización del formato triple F anti-CD19/anti-CD3, el cual exhibe una citotoxicidad picomolar con solo la unión monovalente a los antígenos diana.

La Figura 35 muestra la mejora en la PK en ratones que resulta de reemplazar un scFv de un scFv-Fc doble con un Fab. Reemplazar el scFv anti-CD19 con un Fab duplica la vida media en los ratones BL/6 de 3 a 6 días. La Figura 36 muestra el esquema de la "plataforma enchufe y acción" para el formato de triple F. Un Fab de cualquier Ab existente puede combinarse con el formato biespecífico de scFv-Fc anti-CD3.

Las Figuras 37A y 37B representan la caracterización de una combinación "enchufe y acción" de anticuerpos existentes con el formato de triple F. La Figura 41A muestra un Fab anti-CD38 con el scFv anti-CD3 en el formato triple F, y la Figura 41B muestra la combinación Her2/CD3.

La Figura 38 representa el notable "sesgo" hacia la heterodimerización mediante el uso de las variantes de la invención. Se logró una heterodimerización de más del 95 % al utilizar un monómero con la modificación L368E/K370T y el otro con S364K en comparación con la misma molécula sin las variantes de Fc.

La Figura 39 muestra la eliminación de las células B en los nódulos linfáticos y el bazo de los monos cynomolgus, al utilizar el formato scFv doble en comparación con el formato BiTE.

Figura 40. Lista de los heterodímeros de bevacizumab, Fc solo y anti-CD19xCD3, que contienen las sustituciones de pl isostéricas, se indican los valores de pl de cada especie de proteína esperada.

Figura 41. Cromatografía de intercambio catiónico que muestra la purificación de las especies de heterodímeros de bevacizumab que contienen las regiones constantes isostéricas diseñadas.

Figura 42. Cromatografía de intercambio catiónico que muestra la purificación de las especies de heterodímeros de las variantes de Fc solo que contienen las regiones constantes isostéricas diseñadas.

Figura 43. Cromatografía de intercambio catiónico que muestra la purificación de las especies de heterodímeros de un anticuerpo biespecífico anti-CD19xCD3 que contiene las regiones constantes isostéricas diseñadas. También se muestra un gel IEF de material purificado de la proteína A, así como del heterodímero biespecífico aislado.

Figura 44. Lista de las variantes de bevacizumab y Fc solo que contienen las sustituciones de pI isostéricas, así como los valores de Tm obtenidos a partir de DSF.

Figura 45. Lista de los scFv anti-CD3 y anti-CD19 que contienen los conectores cargados positiva y negativamente. También se muestran los valores Tm por DSF.

Figura 46. Ejemplo de cromatogramas de SEC a partir de los scFv purificados con los conectores cargados positivamente.

Figura 47. Unión directa de los scFv anti-CD3 que contienen los conectores cargados positivamente, que se unen a las células T CD4+ (izquierda) o las células CD20+ de los PBMC (para verificar la unión no específica; derecha).

Figura 48. Unión directa de los scFv anti-CD3 que contienen los conectores cargados positivamente, que se unen a las células CD20+ de los PBMC (izquierda) o las células 293E (derecha).

Figura 49. Ejemplo de purificación por intercambio catiónico de XENP13124, el cual es un anticuerpo biespecífico de formato Fab-scFv-Fc dirigido a CD19 y CD3. El scFv anti-CD3 contiene el conector cargado positivamente (GKPGS) 4 para permitir la purificación.

Figura 50. Ejemplo de cromatogramas de SEC de los anticuerpos biespecíficos de formato Fab-scFv-Fc purificados, que se dirigen a CD19 y CD3, incubados a varias concentraciones. La molécula XENP13121 (izquierda) contiene el conector estándar (GGGGS) 4 mientras que la molécula XENP13124 (derecha) contiene el conector cargado (GKPGS) 4. El conector cargado tiene la propiedad inesperada de disminuir la cantidad de agregados de alto peso molecular presentes.

Figura 51. Ensayo de RTCC con los PBMC y los anticuerpos anti-CD19xCD3 biespecíficos de formato Fab-scFv-Fc que contienen los diferentes conectores de scFv. Los conectores tienen poco impacto en la actividad de RTCC, excepto por el conector altamente cargado (GKGKS)3 que tiene una actividad más baja.

Las Figuras de la 52A a la 52O muestran las secuencias de la invención que incluyen los conectores de scFv cargados, así como los controles correspondientes.

Otros materiales diversos

Figura 53. Literatura de pI de los 20 aminoácidos. Cabe señalar que los pI enumerados se calculan como aminoácidos libres; el pI real de cualquier cadena lateral en el contexto de una proteína es diferente y, por lo tanto, esta lista se usa para mostrar las tendencias de pI y no los números absolutos para los propósitos de la invención.

Figuras 54A, 54B y 54C. Lista de todas las posibles variantes de pI reducido creadas a partir de las sustituciones isotípicas de la IgG1-4. Se muestran los valores de pI para las tres especies esperadas, así como el delta pI promedio entre el heterodímero y las dos especies de homodímero presentes cuando la cadena pesada variante se transfecta con la cadena pesada de la IgG1-WT.

Figura 55. Lista de todas las posibles variantes de pI aumentadas creadas a partir de las sustituciones isotípicas de la IgG1-4. Se muestran los valores de pI para las tres especies esperadas, así como el delta pI promedio entre el heterodímero y las dos especies de homodímero presentes cuando la cadena pesada variante se transfecta con la cadena pesada de la IgG1-WT.

La Figura 56 muestra la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligeras constantes CK y CA. Los residuos que contribuyen a un pI más alto (K, R y H) o un pI más bajo (D y E) se resaltan en negrita. Las posiciones preferentes para la modificación para reducir el pI se muestran en gris. Para las armazones que contienen una o más cadenas ligeras, estos cambios pueden usarse para alterar el pI de uno o ambos monómeros, y pueden combinarse de forma independiente y opcional con todas las variantes de la cadena pesada.

Las figuras de la 57A a la 57E representan las secuencias de varias construcciones disulfuro; la primera secuencia es la construcción scFv que incluye la etiqueta His(6) por conveniencia de purificación, la segunda secuencia es la construcción scFv sin la etiqueta, la tercera secuencia es la cadena pesada variable sola y la cuarta secuencia es la secuencia ligera variable sola. Las CDR están subrayadas.

Descripción detallada de la invención

Las Figuras de la 66 a la 80 del documento WO/2013/055809, las secuencias y las leyendas que las acompañan, las Figuras de la 2 a la 111 y la leyenda que las acompaña del documento USSN 13/648951 se refieren a.

I. Introducción a las proteínas de heterodimerización

La presente invención se dirige a nuevas construcciones como se define en las reivindicaciones, para proporcionar proteínas heterodiméricas que permiten la unión a más de un antígeno o ligando, por ejemplo, para permitir la unión multiespecífica. Las construcciones de las proteínas heterodiméricas se basan en la naturaleza del autoensamblaje de los dos dominios Fc de las cadenas pesadas de los anticuerpos, por ejemplo, dos "monómeros" que se ensamblan en un "dímero". Las proteínas heterodiméricas se preparan al alterar la secuencia de aminoácidos de cada monómero, como se describe con más detalle a continuación. Por tanto, la presente descripción se dirige generalmente a la creación de proteínas heterodiméricas que incluyen anticuerpos, que pueden coacoplarse a antígenos de varias formas, y se basan en variantes de aminoácidos en las regiones constantes que son diferentes en cada cadena para promover la formación heterodimérica y/o permitir facilitar la purificación de los heterodímeros sobre los homodímeros. Como se analiza con más detalle a continuación, las proteínas heterodiméricas pueden ser variantes de anticuerpos o basarse en las proteínas de fusión a Fc. En general, los anticuerpos heterodiméricos son el foco de la discusión, pero como apreciarán los expertos en la técnica y se describirá con más detalle a continuación, la discusión se aplica igualmente a las proteínas heterodiméricas que

Por tanto, la presente descripción proporciona anticuerpos biespecíficos (o, como se discute a continuación, también pueden prepararse anticuerpos triespecíficos o tetraespecíficos). Un problema en curso en las tecnologías de los anticuerpos es el deseo de anticuerpos "biespecíficos" (y/o multiespecíficos) que se unan a dos (o más) antígenos diferentes simultáneamente, lo cual en general permite acercar los diferentes antígenos y dar como resultado nuevas funcionalidades y nuevas terapias. En general, estos anticuerpos se fabrican mediante la inclusión de genes para cada cadena ligera y pesada en las células hospederas. Esto generalmente da como resultado la formación del heterodímero deseado (AB), así como los dos homodímeros (AA y BB). Sin embargo, un obstáculo principal en la formación de anticuerpos multiespecíficos es la dificultad de purificar los anticuerpos heterodiméricos de los anticuerpos homodiméricos y/o desviar la formación del heterodímero sobre la formación de los homodímeros. Hay varios mecanismos que pueden usarse para generar los heterodímeros de la presente invención. Además, como apreciarán los expertos en la técnica, estos mecanismos pueden combinarse para asegurar una alta heterodimerización. Por tanto, las variantes de aminoácidos que conducen a la producción de heterodímeros se denominan "variantes de heterodimerización". Como se analiza a continuación, las variantes de heterodimerización pueden incluir variantes estéricas (por ejemplo, las variantes de "botones y agujeros" o "sesgadas" descritas a continuación y las variantes de "pares de carga" descritas a continuación), así como las "variantes de pI", las cuales permiten la purificación de homodímeros lejos de la de los heterodímeros.

Un mecanismo se denomina generalmente en la técnica "botones y agujeros" ("KIH") o algunas veces en el presente documento como variantes "sesgadas", el cual se refiere a la ingeniería de aminoácidos que crea influencias estéricas para favorecer la formación heterodimérica y desfavorecer la formación homodimérica, también puede opcionalmente ser usado; esto a veces se denomina "botones y agujeros"; como se describe en los documentos USSN 61/596,846 y USSN 12/875,0015, Ridgway y otros, Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell y otros, J. Mol. Biol. 1997270:26; Patente de Estados Unidos No. 8,216,805, US 2012/0149876 Las figuras identifican una serie de pares de "monómero A - monómero B" que incluyen las sustituciones de aminoácidos "botones y agujeros". Además, como se describe en Merchant y otros, Nature Biotech. 16:677 (1998), estas mutaciones de "botones y agujeros" pueden combinarse con enlaces disulfuro para sesgar la formación hacia la heterodimerización.

Un mecanismo adicional que se utiliza en la generación de heterodímeros se denomina a veces "dirección electrostática" o "pares de carga", como se describe en Gunasekaran y otros, J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010)). Esto a veces se denomina en el presente documento "pares de carga". En esta modalidad, se utilizan electrostáticos para sesgar la formación hacia la heterodimerización. Como apreciarán los expertos en la técnica, estos también pueden tener un efecto sobre el pI y, por lo tanto, sobre la purificación y, por lo tanto, en algunos casos también podrían considerarse variantes de pI. Sin embargo, como estos se generaron para forzar la heterodimerización y no se utilizaron como herramientas de purificación, se clasifican como "variantes estéricas". Estos incluyen, entre otros, D221E/P228E/L368E emparejados con D221R/P228R/K409R (por ejemplo, estos son "conjuntos correspondientes de monómeros) y C220E/P228E/368E emparejados con C220R/E224R/P228R/K.409R y otros que se muestran en las Figuras.

En la presente descripción, en algunas modalidades, las variantes de pI se utilizan para alterar el pI de uno o ambos monómeros y así permitir la purificación isoeléctrica de las proteínas diméricas A-A, A-B y B-B.

Existen varios mecanismos básicos que pueden conducir a la facilidad de purificar las proteínas heterodiméricas; uno se basa en el uso de las variantes de pI, de manera que cada monómero tiene un pI diferente, lo cual permite la purificación isoeléctrica de las proteínas diméricas A-A, A-B y B-B. Alternativamente, algunos formatos de armazones, como el formato de "triple F", también permiten la separación en función del tamaño. Como se describe con más detalle a continuación, también es posible "sesgar" la formación de los heterodímeros con respecto a los homodímeros. Por tanto, una combinación de variantes de heterodimerización estéricas y de pI o de variantes de par de carga, encuentran un uso particular en la invención. Además, como se describe con más detalle a continuación, los armazones que utilizan los scFv como el formato de Triple F pueden incluir conectores de scFv cargados (positivos o negativos), que dan un impulso adicional de pI con fines de favorecer la purificación. Como apreciarán los expertos en la técnica, algunos formatos de Triple F son útiles con solo los conectores de scFv cargados y sin ajustes de pI adicionales, aunque la invención también proporciona el uso de las variantes sesgadas con conectores de scFv cargados (y combinaciones de variantes de Fc, FcRn y KO).

En la presente descripción que utiliza el pI como un mecanismo de separación para permitir la purificación de las proteínas heterodiméricas, pueden introducirse variantes de aminoácidos en uno o ambos polipéptidos de monómeros; es decir, el pI de uno de los monómeros (denominado aquí por simplicidad como "monómero A") puede diseñarse lejos del monómero B, o cambiar tanto el monómero A como el B, de manera que el pI del monómero A aumente y el pI del monómero B disminuya. Como se describe con más detalle a continuación, los cambios del pI de uno o ambos monómeros pueden realizarse al eliminar o añadir un residuo cargado (por ejemplo, un aminoácido neutro se reemplaza por un residuo de aminoácido cargado positiva o negativamente, por ejemplo, de glicina a ácido glutámico), cambiar un residuo cargado de positivo o negativo a la carga opuesta (de ácido aspártico a lisina) o cambiar un residuo cargado a un residuo neutro (por ejemplo, la pérdida de una carga; de lisina a serina). Varias de estas variantes se muestran en las Figuras.

Por consiguiente, esta descripción proporciona la creación de un cambio suficiente en el pI en al menos uno de los monómeros, de modo que los heterodímeros puedan separarse de los homodímeros. Como apreciarán los expertos en la técnica, y como se discute más adelante, esto puede realizarse mediante el uso de una región constante de cadena pesada de "tipo salvaje" y una región variante diseñada para aumentar o disminuir su pI (wt A- B o wt A - -B), o al aumentar una región y disminuir la otra región (A -B- o A- B+).

Por tanto, en general, un componente de algunas modalidades son las variantes de aminoácidos en las regiones constantes de anticuerpos que están dirigidas a alterar el punto isoeléctrico (pI) de al menos uno, si no ambos, de los monómeros de una proteína dimérica para formar los "heterodímeros pI"(cuando la proteína es un anticuerpo, estos se denominan "anticuerpos pI") mediante la incorporación de sustituciones de aminoácidos ("variantes pI" o "sustituciones pI") en uno o ambos monómeros. Como se muestra en el presente documento, la separación de los heterodímeros de los dos homodímeros puede lograrse si los pI de los dos monómeros difieren en tan solo 0,1 unidades de pH, con 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 o más, todos usados en la presente invención.

Como apreciarán los expertos en la técnica, el número de variantes de pI que se incluirán en cada uno o ambos monómeros para obtener una buena separación dependerá en parte del pI inicial del scFv y Fab de interés. Es decir, para determinar qué monómero diseñar o en qué "dirección" (por ejemplo, más positiva o más negativa), se calculan las secuencias Fv de los dos antígenos diana y se toma una decisión a partir de ahí. Como se conoce en la técnica, los diferentes Fv tendrán diferentes pI de partida, los cuales se explotan en la presente invención. En general, como se describe en el presente documento, los pI se diseñan para dar como resultado una diferencia de pI total de cada monómero de al menos aproximadamente 0,1 logaritmos, y de preferencia de 0,2 a 0,5 como se describe en el presente documento.

Además, como apreciarán los expertos en la técnica y se describe aquí, los heterodímeros pueden separarse de los homodímeros en base al tamaño. Por ejemplo, como se muestra en las Figuras 1 y 2, los heterodímeros con dos scFv pueden estar separados por los del formato "triple F" y un Ab biespecífico. Esto puede aprovecharse aún más con una mayor valencia con la utilización de sitios de unión de antígeno adicionales. Por ejemplo, como se muestra adicionalmente, un monómero tendrá dos fragmentos Fab y el otro tendrá un scFv, lo que dará como resultado una diferencia de tamaño y, por lo tanto, de peso molecular.

Además, como apreciarán los expertos en la técnica y se describe en el presente documento, el formato descrito en el presente documento puede expandirse para proporcionar anticuerpos triespecíficos y tetraespecíficos también. En esta modalidad, algunas variaciones de las cuales se representan en la Figura 1A, se reconocerá que es posible que algunos antígenos estén unidos de forma divalente (por ejemplo, dos sitios de unión a antígeno a un antígeno único; por ejemplo, A y B podrían ser parte de una asociación bivalente típica y C y D pueden estar presentes opcionalmente y opcionalmente iguales o diferentes). Como se apreciará, cualquier combinación de Fab y scFv puede utilizarse para lograr el resultado y las combinaciones deseados.

En el caso de que se utilicen las variantes de pI para lograr la heterodimerización, mediante el uso de las regiones constantes de las cadenas pesadas, se proporciona un enfoque más modular para diseñar y purificar las proteínas multiespecíficas, que incluyen los anticuerpos. Por tanto, en algunas modalidades, las variantes de heterodimerización (que incluyen las variantes de heterodimerización sesgadas y de purificación) no se incluyen en las regiones variables, de modo que cada anticuerpo individual debe diseñarse por ingeniería genética. Además, en algunas modalidades, la posibilidad de inmunogenicidad resultante de las variantes de pI se reduce significativamente al importar las variantes de pI de diferentes isotipos de IgG de modo que el pI se cambia sin introducir una inmunogenicidad significativa. Por tanto, un problema adicional a resolver es la elucidación de los dominios constantes de pI bajo con alto contenido de secuencia humana, por ejemplo, la minimización o evitación de los residuos no humanos en cualquier posición particular.

Un beneficio secundario que puede ocurrir con esta ingeniería de pI es también la extensión de la vida media en el suero y el aumento de la unión al FcRn. Es decir, como se describe en el documento USSN 13/194,904, la reducción del pI de los dominios constantes de los anticuerpos (que incluyen los que se encuentran en los anticuerpos y las fusiones a Fc) puede conducir a una retención en el suero más prolongada in vivo. Estas variantes de pI para aumentar la vida media en el suero también facilitan los cambios del pI para la purificación.

Además, debe tenerse en cuenta que las variantes de pI de las variantes de heterodimerización brindan un beneficio adicional para el proceso de análisis y control de la calidad de los anticuerpos biespecíficos, ya que, particularmente en el caso de los anticuerpos CD3, la capacidad de eliminar, minimizar y distinguir cuando los homodímeros están presentes es significativa. De manera similar, es importante la capacidad de probar de manera confiable la reproducibilidad de la producción de las proteínas heterodimé ricas.

Además de todo o parte de un dominio constante pesado variante, uno o ambos monómeros pueden contener una o dos parejas de fusión, de modo que los heterodímeros formen las proteínas multivalentes. Como se representa generalmente en las Figuras, y específicamente en la Figura 1A, las parejas de fusión se representan como A, B, C y D, con todas las combinaciones posibles. En general, A, B, C y D se seleccionan de manera que el heterodímero sea al menos biespecífico o bivalente en su capacidad para interactuar con las proteínas adicionales.

Como apreciarán los expertos en la técnica y se discutirá con más detalle a continuación, las proteínas de fusión heterodiméricas de la presente invención pueden adoptar una amplia variedad de configuraciones, como se ilustra generalmente en las Figuras 1 y 2. Algunas figuras representan configuraciones de "un solo extremo", donde hay un tipo de especificidad en un "brazo" de la molécula y una especificidad diferente en el otro "brazo". Otras figuras representan configuraciones de "extremos dobles", donde hay al menos un tipo de especificidad en la "parte superior" de la molécula y una o más especificidades diferentes en la "parte inferior" de la molécula. Además, como se muestra, estas dos configuraciones pueden combinarse, donde puede haber especificidades triples o cuádruples basadas en la combinación particular. Por tanto, la presente descripción proporciona proteínas de unión "multiespecíficas", que incluyen los anticuerpos multiespecíficos. Por tanto, la presente descripción se dirige a nuevas composiciones de inmunoglobulinas que coacoplan al menos un primer y un segundo antígeno. El primer y segundo antígenos de la descripción se denominan en el presente documento antígeno-1 y antígeno-2, respectivamente.

Un armazón heterodimérico que encuentra un uso particular en la presente invención es el formato de armazón "triple F" o "abridor de botellas". En esta modalidad, una cadena pesada del anticuerpo contiene un Fv de cadena única ("scFv", como se define a continuación) y la otra cadena pesada es un formato de FAb "regular", que comprende una cadena pesada y una cadena ligera variables. Esta estructura a veces se denomina en el presente documento formato "triple F" (scFv-FAb-Fc) o formato de "abridor de botellas", debido a una similitud visual aproximada con un abridor de botellas (ver Figura 1B). Las dos cadenas se unen mediante el uso de variantes de aminoácidos en las regiones constantes (por ejemplo, el dominio Fc y/o la región bisagra) que promueven la formación de anticuerpos heterodiméricos como se describe con más detalle a continuación.

Hay varias ventajas distintas en el actual formato de "triple F". Como se conoce en la técnica, los análogos de anticuerpos que se basan en dos construcciones scFv a menudo tienen problemas de estabilidad y agregación, que pueden aliviarse en la presente invención mediante la adición de un apareamiento "regular" de cadenas pesadas y ligeras. Además, a diferencia de los formatos que se basan en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, no hay ningún problema con el emparejamiento incorrecto de las cadenas pesadas y ligeras (por ejemplo, el emparejamiento pesado 1 con ligero 2, etc.)

Además de todo o parte de un dominio constante pesado variante, uno o ambos monómeros pueden contener una o dos parejas de fusión, de modo que los heterodímeros formen las proteínas multivalentes. Como se muestra generalmente en la Figura 64 del documento USSN 13/648 951 con la leyenda que lo acompaña, las parejas de fusión se representan como A, B, C y D, con todas las combinaciones posibles. En general, A, B, C y D se seleccionan de manera que el heterodímero sea al menos biespecífico o bivalente en su capacidad para interactuar con las proteínas adicionales. En el contexto del presente formato "triple F", generalmente A y B son un scFv y un Fv (como se apreciará, cualquiera de los monómeros puede contener el scFv y el otro el Fv/Fab) y luego, opcionalmente, una o dos parejas de fusión adicional.

Además, como se describe en el presente documento, pueden introducirse variantes de aminoácidos adicionales en los anticuerpos biespecíficos de la invención, para añadir funcionalidades adicionales. Por ejemplo, pueden añadirse cambios de aminoácidos dentro de la región Fc (ya sea a un monómero o a ambos) para facilitar el aumento de la ADCC o CDC (por ejemplo, la unión alterada a los receptores Fcy); para permitir o aumentar el rendimiento de la adición de toxinas y fármacos (por ejemplo, para ADC), así como para aumentar la unión al FcRn y/o aumentar la vida media en el suero de las moléculas resultantes. Como se describe adicionalmente en el presente documento y como apreciarán los expertos en la técnica, cualquiera y todas las variantes descritas en el presente documento pueden combinarse opcional e independientemente con otras variantes.

De manera similar, otra categoría de variantes funcionales son las "variantes de ablación de Fcy" o las variantes de "desactivación de Fc (FcKO o KO)". En estas modalidades, para algunas aplicaciones terapéuticas, es deseable reducir o eliminar la unión normal del dominio Fc a uno o más o todos los receptores Fcy (por ejemplo, FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa, etc.) para evitar mecanismos de acción adicionales. Es decir, por ejemplo, en muchas modalidades, particularmente en el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen a CD3 de forma monovalente y a un antígeno tumoral en el otro (por ejemplo, CD19, her2/neu, etc.), generalmente es deseable eliminar la unión a FcYRIIIa para eliminar o reducir significativamente la actividad de ADCC.

Definiciones

Para que la solicitud se entienda más completamente, a continuación, se exponen varias definiciones. Dichas definiciones están destinadas a abarcar los equivalentes gramaticales.

Por "ablación" en el presente documento se entiende una disminución o eliminación de la actividad. Así, por ejemplo, "ablación de la unión a F^cyR" significa que la variante de aminoácidos de la región Fc tiene menos del 50 % de unión inicial en comparación con una región Fc que no contiene la variante específica, con menos del 70-80-90-95-98 % de pérdida la actividad de preferencia, y en general, la actividad está por debajo del nivel de unión detectable en un ensayo Biacore. De particular uso en la ablación de la unión de F^cyR lo constituyen los que se muestran en la Figura 7.

Por "ADCC" o "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos", como se usa en el presente documento, se entiende la reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan los F^cyR reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana. La ADCC se correlaciona con la unión a FcYRIIIa; el aumento de la unión a FcYRIIIa conduce a un aumento de la actividad de ADCC.

Por "ADCP" o fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos, como se usa en el presente documento, se entiende la reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan los FcyR reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente causan la fagocitosis de la célula diana.

Por "modificación" en el presente documento se entiende una sustitución, inserción y/o eliminación de aminoácidos en una secuencia polipeptídica o una alteración de una porción unida químicamente a una proteína. Por ejemplo, una modificación puede ser un carbohidrato alterado o una estructura de PEG unida a una proteína. Por "modificación de aminoácido" en el presente documento se entiende una sustitución, inserción y/o eliminación de aminoácidos en una secuencia polipeptídica. Para mayor claridad, a menos que se indique lo contrario, la modificación de aminoácidos es siempre a un aminoácido codificado por ADN, por ejemplo, los 20 aminoácidos que tienen codones en ADN y ARN.

Por "sustitución de aminoácido" o "sustitución" en el presente documento se entiende el reemplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia de un polipéptido original con un aminoácido diferente. En particular, en algunas modalidades, la sustitución es por un aminoácido que no se encuentra de forma natural en la posición particular, ni de forma natural dentro del organismo ni en ningún organismo. Por ejemplo, la sustitución E272Y se refiere a un polipéptido variante, en este caso una variante de Fc, en la cual se reemplaza el ácido glutámico en la posición 272 con la tirosina. Para mayor claridad, una proteína que se diseñó para cambiar la secuencia codificante del ácido nucleico pero no para cambiar el aminoácido inicial (por ejemplo, para intercambiar CGG (codificante de arginina) por CGA (que todavía codifica arginina) para aumentar los niveles de expresión del organismo hospedero) no es una "sustitución de aminoácidos"; es decir, a pesar de la creación de un nuevo gen que codifica la misma proteína, si la proteína tiene el mismo aminoácido en la posición particular con la que comenzó, no es una sustitución de aminoácido.

Por "inserción de aminoácidos" o "inserción", como se usa en el presente documento, se entiende la adición de un aminoácido en una posición particular en una secuencia de polipéptido original. Por ejemplo, -233E o 233E designa una inserción de ácido glutámico después de la posición 233 y antes de la posición 234. Además, -233ADE o A233ADE designa una inserción de AlaAspGlu después de la posición 233 y antes de la posición 234.

Por "eliminación de aminoácido" o "eliminación" como se usa en el presente documento se entiende la eliminación de una secuencia de aminoácido en una posición particular en una secuencia de polipéptido original. Por ejemplo, E233- o E233# o E233() designa una eliminación del ácido glutámico en la posición 233. Además, EDA233- o EDA233 # designa una eliminación de la secuencia GluAspAla que comienza en la posición 233.

Por "proteína variante”, o “variante proteica" o "variante", como se usa en el presente documento, se entiende una proteína que difiere de una proteína original en virtud de al menos una modificación de aminoácido. La variante de proteína puede referirse a la proteína en sí, a una composición que comprende la proteína o a la secuencia de aminoácidos que la codifica. Preferentemente, la variante proteica tiene al menos una modificación de aminoácidos en comparación con la proteína original, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente setenta modificaciones de aminoácidos, y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco modificaciones de aminoácidos en comparación con la proteína original. Como se describe a continuación, en algunas modalidades el polipéptido original, por ejemplo, un polipéptido original de Fc, es una secuencia humana de tipo salvaje, como la región Fc de una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, aunque las secuencias humanas con variantes también pueden servir como “polipéptidos originales", por ejemplo, el híbrido IgG1/2 de la Figura 13. La secuencia variante de la proteína de la presente invención poseerá preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de identidad con una secuencia de proteína original, y más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de identidad, más preferentemente al menos aproximadamente un 95-98-99 % de identidad. La proteína variante puede referirse a la proteína variante en sí misma, a las composiciones que comprenden la variante proteica o a la secuencia de ADN que la codifica. En consecuencia, por "variante de anticuerpo" o "anticuerpo variante" como se usa en el presente documento se entiende un anticuerpo que difiere de un anticuerpo original en virtud de al menos una modificación de aminoácido, "IgG variante" o "variante de IgG" como se usa en el presente documento significa un anticuerpo que difiere de una IgG original (de nuevo, en muchos casos, de una secuencia de IgG humana) en virtud de al menos una modificación de aminoácido, y "variante de inmunoglobulina" o "inmunoglobulina variante" como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de inmunoglobulina que difiere de la de una secuencia de inmunoglobulina original en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. El término "variante Fc" o "Fc variante", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que comprende una modificación de aminoácido en un dominio Fc. Las variantes de Fc de la presente invención se definen de acuerdo con las modificaciones de aminoácidos que las componen. Así, por ejemplo, N434S o 434S es una variante de Fc con la sustitución de serina en la posición 434, con respecto al polipéptido Fc original, en donde la numeración está de acuerdo con el índice EU. Del mismo modo, la modificación M428L/N434S define una variante de Fc con las sustituciones M428L y N434S en relación con el polipéptido Fc original. La identidad del aminoácido WT puede no estar especificada, en cuyo caso la variante mencionada anteriormente se denomina 428L/434S. Se observa que el orden en que se proporcionan las sustituciones es arbitrario, es decir, que, por ejemplo, 428L/434S es la misma variante de Fc que M428L/N434S, etc. Para todas las posiciones discutidas en la presente invención que se relacionan con anticuerpos, a menos que se indique lo contrario, la numeración de las posiciones de los aminoácidos está de acuerdo con el índice EU. El índice de EU, o el índice de EU como en Kabat o el esquema de numeración EU, se refiere a la numeración de UE del anticuerpo (Edelman y otros, 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85, incorporada en su totalidad en la presente por referencia). La modificación puede ser una adición, eliminación o sustitución. Las sustituciones pueden incluir aminoácidos naturales y, en algunos casos, aminoácidos sintéticos. Algunos ejemplos incluyen la Patente de Estados Unidos No. 6,586,207; WO 98/48032; WO 03/073238; US2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin y otros, (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, y P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, y otros, (2002), PICAS Estados Unidos de América 99:11020-11024; y, L. Wang, y P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10.

Como se usa en el presente documento, "proteína" se entiende como al menos dos aminoácidos unidos covalentemente, lo cual incluye proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. El grupo peptidilo puede comprender aminoácidos naturales y enlaces peptídicos, o estructuras peptidomiméticas sintéticas, es decir, "análogos", tales como los peptoides (ver Simon y otros, PNAS USA 89(20):9367 (1992). Los aminoácidos pueden ser naturales o sintéticos (por ejemplo, no un aminoácido codificado por el ADN); como apreciarán los expertos en la técnica. Por ejemplo, la homo-fenilalanina, citrulina, ornitina y norleucina se consideran aminoácidos sintéticos para los propósitos de la invención, y pueden utilizarse aminoácidos configurados tanto D- como L- (R o S). Las variantes de la presente invención pueden comprender modificaciones que incluyen el uso de aminoácidos sintéticos incorporados al utilizar, por ejemplo, las tecnologías desarrolladas por Schultz y otros, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos por Cropp y Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson y otros, 2004, Proc. Natl Acad Sci. Estados Unidos 101 (2):7566-71, Zhang y otros, 2003, 303(5656):371-3, y Chin y otros, 2003, Science 301(5635):964-7.

Además, los polipéptidos pueden incluir la derivatización sintética de una o más cadenas laterales o terminales, glicosilación, PEGilación, permutación circular, ciclación, conectores a otras moléculas, fusión a proteínas o dominios de proteínas y adición de etiquetas o marcadores de péptidos.

Por "residuo" como se usa en el presente documento se entiende una posición en una proteína y su identidad de aminoácido asociada. Por ejemplo, la Asparagina 297 (también denominada Asn297, también denominada N297) es un residuo en la posición 297 en el anticuerpo humano IgG1.

Por "Fab" o "región Fab", como se utiliza en el presente documento, se entienden los polipéptidos que comprenden los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, VL y CL. El Fab puede referirse a esta región en aislamiento, o esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud completa, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión a Fab. Por "Fv" o "fragmento Fv" o "región Fv" como se usa en el presente documento, se entiende un polipéptido que comprende los dominios VL y VH de un solo anticuerpo.

Por "modificación de subclase de IgG" o "modificación de isotipo" como se usa en el presente documento, se entiende una modificación de aminoácido que convierte un aminoácido de un isotipo de IgG en el aminoácido correspondiente en un isotipo de IgG alineado diferente. Por ejemplo, debido a que la IgG1 comprende una tirosina y la IgG2 una fenilalanina en la posición 296 de la UE, una sustitución F296Y en la IgG2 se considera una modificación de la subclase de la IgG.

Por "modificación de origen no natural", como se usa en el presente documento, se entiende una modificación de aminoácido que no es isotípica. Por ejemplo, debido a que ninguna de las IgG comprende una serina en la posición 434, la sustitución 434S en la IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 (o sus híbridos) se considera una modificación de origen no natural.

Por "aminoácido" e "identidad de aminoácidos", como se usa en el presente documento, se entiende uno de los 20 aminoácidos de origen natural que están codificados por el ADN y ^aRⁿ.

Por "función efectora" como se usa en el presente documento se entiende un evento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fc de un anticuerpo con un receptor Fc o ligando. Las funciones efectoras incluyen, entre otras, la ADCC, ADCP y CDC.

Por "ligando de Fc de IgG", como se usa en el presente documento, se entiende una molécula, preferentemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo IgG para formar un complejo de ligando Fc/Fc. Los ligandos de Fc incluyen, entre otros, los FcyRI, FcyRII, FcyRIII, FcRn, C1q, C3, lectina de unión a mañosa, receptor de mañosa, proteína A de estafilococo, proteína G de estreptococo y F^cyR viral. Los ligandos de Fc también incluyen homólogos del receptor de Fc (FcRH), los cuales son una familia de receptores de Fc que son homólogos a los F^cyR (Davis y otros, 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Los ligandos de Fc pueden incluir moléculas no descubiertas que se unen a Fc. Los ligandos de Fc de IgG particulares son los receptores FcRn y Fc gamma. Por "ligando de Fc", como se usa en el presente documento, se entiende una molécula, preferentemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo para formar un complejo de ligando Fc/Fc.

Por "receptor Fc gamma" o "F^cyR", como se usa en el presente documento, se entiende cualquier miembro de la familia de las proteínas que se unen a la región Fc del anticuerpo IgG y están codificadas por un gen de FcyR. En seres humanos, esta familia incluye, pero no se limita al, F^cyRI (CD64), que incluye las isoformas FcYRIa, FcYRIb y F^cyRI^c; F^cyRII (CD32), que incluye las isoformas FcYRIIa (que incluye los alotipos H131 y R131), FcYRIlb (que incluye FcyRIIb-1 y FcyRIIb-2) y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), que incluye las isoformas FcYRIIIa (que incluye los alotipos V158 y f 158) y FcyR III (que incluye los alotipos FcyRIIb-NA1 y FcyRIIb-NA2) (Jefferis y otros, 2002, Immunol Lett 82:57-65), así como cualquier F^cyR, o isoforma o alotipo de F^cyR, humano no descubierto. Un F^cyR puede ser de cualquier organismo, que incluye, pero no se limita a, humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Los F^cyR de ratón incluyen, pero no se limitan al, F^cyRI (CD64), F^cyRII (CD32), F^cyRIII (CD16) y FcyRIII-2 (CD16-2), así como cualquier FcyR, o isoforma o alotipo de FcyR, de ratón no descubierto.

Por "FcRn" o "receptor Fc neonatal", como se usa en el presente documento, se entiende una proteína que se une a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificada al menos en parte por un gen FcRn. El FcRn puede ser de cualquier organismo, que incluye, pero no se limita a, humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Como se conoce en la técnica, la proteína FcRn funcional comprende dos polipéptidos, a menudo denominados cadena pesada y cadena ligera. La cadena ligera es la beta-2-microglobulina y la cadena pesada está codificada por el gen FcRn. A menos que se indique lo contrario, en el presente documento el FcRn o una proteína FcRn se refiere al complejo de la cadena pesada de FcRn con la beta-2-microglobulina. En la Leyenda de la Figura 83 se muestra una variedad de variantes de FcRn utilizadas para aumentar la unión al receptor FcRn y, en algunos casos, para aumentar la vida media en el suero.

Por "polipéptido original", como se usa en el presente documento, se entiende un polipéptido de partida que se modifica posteriormente para generar una variante. El polipéptido original puede ser un polipéptido de origen natural, o una variante o versión diseñada por ingeniería de un polipéptido de origen natural. El polipéptido original puede referirse al propio polipéptido, a las composiciones que comprenden el polipéptido original, o a la secuencia de aminoácidos que lo codifica. Por consiguiente, por "inmunoglobulina original" como se usa en el presente documento se entiende un polipéptido de inmunoglobulina no modificado que se modifica para generar una variante, y por "anticuerpo original" como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo no modificado que se modifica para generar un anticuerpo variante. Debe señalarse que "anticuerpo original" incluye anticuerpos comerciales conocidos producidos de forma recombinante como se describe a continuación.

Por "proteína de fusión a Fc" o "inmunoadhesina", en el presente documento se entiende una proteína que comprende una región Fc, generalmente unida (opcionalmente a través de una porción conectora, como se describe en el presente documento) a una proteína diferente, tal como una porción de unión a una proteína diana, como se describe en el presente documento. En algunos casos, un monómero de la proteína heterodimérica comprende una cadena pesada de un anticuerpo (que incluye un scFv o además incluye una cadena ligera) y el otro monómero es una fusión a Fc, que comprende un dominio Fc variante y un ligando. En algunas modalidades, estas "mitad anticuerpo - mitad proteínas de fusión" se denominan "Cuerpos de fusión".

Por "posición" como se usa en el presente documento se entiende una ubicación en la secuencia de una proteína. Las posiciones pueden numerarse secuencialmente, o de acuerdo con un formato establecido, por ejemplo, el índice EU para la numeración de los anticuerpos.

Por "antígeno diana", como se usa en el presente documento, se entiende la molécula que está unida específicamente por la región variable de un anticuerpo dado. Un antígeno diana puede ser una proteína, carbohidrato, lípido u otro compuesto químico. A continuación, se describe un gran número de antígenos diana adecuados.

Por "enhebrado" en el contexto de los monómeros de las proteínas heterodiméricas de la presente invención, se entiende que, de forma similar a las dos cadenas de ADN que "coinciden", las variantes de heterodimerización se incorporan en cada monómero para preservar la capacidad de "coincidir" para formar los heterodímeros. Por ejemplo, si algunas variantes de pI se diseñan en el monómero A (por ejemplo, al hacer que el pI sea más alto), las variantes estéricas que son "pares de carga", que también pueden utilizarse no interfieren con las variantes de pI, por ejemplo, las variantes de carga que forman un pI superiores se colocan en la misma "hebra" o "monómero" para preservar ambas funcionalidades.

Por "célula diana", como se usa en el presente documento, se entiende una célula que expresa un antígeno diana. Por "región variable", como se usa en el presente documento, se entiende la región de una inmunoglobulina que comprende uno o más dominios de Ig codificados sustancialmente por cualquiera de los genes V.kappa., V.lamda., y/o VH que conforman los loci genéticos de las inmunoglobulinas kappa, lambda y la cadena pesada, respectivamente.

Por "tipo salvaje o WT" en el presente documento se entiende una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza, y que incluye las variaciones alélicas. Una proteína WT tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que no se ha modificado intencionalmente.

Los anticuerpos de la presente invención son generalmente aislados o recombinantes. El término "aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos descritos en el presente documento, significa un polipéptido previamente identificado y separado y/o recuperado a partir de una célula o cultivo celular, a partir del cual se expresó. Normalmente, un polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Un "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas.

El término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un antígeno o un epítopo particular significa una unión que es mediblemente diferente de una interacción no específica. La unión específica puede medirse, por ejemplo, al determinar la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, la cual generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica puede determinarse por la competencia con una molécula de control que sea similar a la diana. La unión específica para un antígeno particular o un epítopo puede exhibirse, por ejemplo, por un anticuerpo que tiene una KD para un antígeno o un epítopo de al menos aproximadamente de 10-4 M, al menos aproximadamente de 10-5 M, al menos aproximadamente de 10-6 M, al menos aproximadamente de 10-7 M, al menos aproximadamente de 10-8 M, al menos aproximadamente de 10-9 M, alternativamente al menos aproximadamente de 10-10 M, al menos aproximadamente de 10-11 M, al menos aproximadamente de 10-12 M, o mayor, donde KD se refiere a una tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Normalmente, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno tendrá una KD que es de 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000-, 10000- o más veces mayor para una molécula de control con respecto al antígeno o epítopo.

Además, la unión específica para un antígeno o un epítopo particular puede exhibirse, por ejemplo, por un anticuerpo que tiene una KA o Ka para un antígeno o epítopo de al menos 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5000-, 10 000- o más veces mayor para el epítopo en relación con un control, donde KA o Ka se refiere a una tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

Proteínas heterodiméricas

La presente invención se dirige a la generación de proteínas de unión multiespecíficas, particularmente biespecíficas, y en particular, a anticuerpos multiespecíficos. La presente invención generalmente se basa en el uso de dominios Fc diseñados o variantes, que pueden autoensamblarse en las células productoras para producir proteínas heterodiméricas, y los métodos para generar y purificar dichas proteínas heterodiméricas.

Anticuerpos

La presente invención se refiere a la generación de anticuerpos multiespecíficos, generalmente anticuerpos terapéuticos. Como se comenta a continuación, el término "anticuerpo" se usa generalmente. Los anticuerpos que encuentran un uso en la presente invención pueden adoptar varios formatos como se describe en el presente documento, que incluyen los anticuerpos tradicionales, así como los derivados, fragmentos y miméticos de anticuerpos, que se describen a continuación. En general, el término "anticuerpo" incluye cualquier polipéptido que incluya al menos un dominio constante, que incluye, pero no se limita al, CH1, CH2, CH3 y CL.

Las unidades estructurales de los anticuerpos tradicionales típicamente comprenden un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto típicamente por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (que típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (que típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. La presente invención se dirige a la clase IgG, que tiene varias subclases, que incluyen, pero no se limitan a, la IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Por "isotipo", como se usa en el presente documento, se entiende cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Debe entenderse que los anticuerpos terapéuticos también pueden comprender híbridos de isotipos y/o subclases. Por ejemplo, como se muestra en la Publicación de Estados Unidos 2009/0163699, la presente invención cubre la ingeniería de pI de los híbridos IgG1/G2.

La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de los antígenos, generalmente referido en la técnica como "domain Fv" o "región Fv". En la región variable, se agrupan tres lazos para cada uno de los dominios V de la cadena pesada y la cadena ligera para formar un sitio de unión al antígeno. Cada uno de los lazos se conoce como una región determinante de la complementariedad (en lo sucesivo, "CDR"), en la cual la variación en la secuencia de aminoácidos es más significativa. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de la región variable difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos. La variabilidad dentro de la región variable no se distribuye uniformemente. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes llamados regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad llamadas "regiones hipervariables" que tienen cada una de 9-15 aminoácidos de longitud o más.

Cada VH y VL se compone de tres regiones hipervariables ("regiones determinantes de la complementariedad", "CDR") y cuatro FR, organizadas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3 -FR4.

La región hipervariable generalmente abarca residuos de aminoácidos desde aproximadamente los residuos de aminoácidos 24-34 (LCDR1; "L" denota la cadena ligera), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3) en la región variable de la cadena ligera y alrededor del 31-35B (HCDR1; "H" indica la cadena pesada), del 50-65 (HCDR2) y del 95-102 (HCDR3) en la región variable de la cadena pesada; Kabat y otros, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5a Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991) y/o aquellos residuos que forman un lazo hipervariable (por ejemplo, los residuos del 26-32 (LCDR1), del 50 52 (LCDR2) y del 91-96 (LCDR3) en la región variable de la cadena ligera y del 26-32 (HCDR1), del 53-55 (HCDR2) y del 96-101 (HCDR3) en la región variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. Las CDR específicas de la invención se describen a continuación.

A lo largo de la presente especificación, el sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente, los residuos del 1-107 de la región variable de la cadena ligera y los residuos del 1-113 de la región variable de la cadena pesada) y el sistema de numeración EU para las regiones Fc (por ejemplo, Kabat y otros, supra (1991)).

Las CDR contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno, o más específicamente, al sitio de unión de los anticuerpos al epítopo. El término "epítopo" se refiere a un determinante que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Los epítopos son agrupaciones de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y generalmente tienen características estructurales específicas, así como características de carga específicas. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo.

El epítopo puede comprender residuos de aminoácidos directamente implicados en la unión (también llamado componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácidos, que no están directamente implicados en la unión, tales como los residuos de aminoácidos que son bloqueados efectivamente por el péptido que se une específicamente al antígeno; en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro de la huella del péptido que se une específicamente al antígeno.

Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante los aminoácidos yuxtapuestos espacialmente a partir de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por los residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. Los epítopos conformacionales y no conformacionales pueden distinguirse en que la unión al primero, pero no al segundo se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.

Un epítopo incluye típicamente al menos 3, y más usualmente, al menos 5 o de 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden verificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, por ejemplo, un "ensayo de secuestro".

La parte carboxilo terminal de cada cadena define una región constante que es la primariamente responsable de la función efectora. Por otra parte, Kabat y otros colectaron numerosas secuencias primarias de las regiones variables de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras. Basado en el grado de conservación de las secuencias, clasificaron las secuencias primarias individuales en las CDR y las secuencias marco y elaboraron una lista de las mismas (ver SECUENCIAS DE INTERÉS INMUNOLÓGICO, 5a edición, publicación de los NIH, No. 91-3242, EA Kabat y otros). En la subclase de inmunoglobulinas IgG, hay varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. Por "dominio de inmunoglobulina (Ig)" en el presente documento se entiende una región de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria distinta. De interés en la presente invención son los dominios de la cadena pesada, que incluyen los dominios pesados constantes (CH) y la región bisagra. En el contexto de los anticuerpos IgG, los isotipos IgG tienen cada uno tres regiones CH. Por consiguiente, los dominios "CH" en el contexto de las IgG son los siguientes: "CH1" se refiere a las posiciones de la 118-220 de acuerdo con el índice UE como en el Kabat. El domino "CH2" se refiere a las posiciones de la 237-340 de acuerdo con el índice EU como en el Kabat, y "CH3" se refiere a las posiciones de la 341-447 de acuerdo con el índice UE como en el Kabat. Como se muestra en el presente documento y se describe a continuación, las variantes de pI pueden estar en una o más de las regiones CH, así como en la región bisagra, que se describe a continuación.

Cabe señalar que las secuencias representadas en el presente documento comienzan en la región CH1, posición 118; las regiones variables no se incluyen excepto como se indica. Por ejemplo, el primer aminoácido de la SEQ ID NO: 2, aunque designado como la posición "1" en la lista de secuencias, corresponde a la posición 118 de la región CH1, de acuerdo con la numeración de la UE.

Otro tipo de dominio de Ig de la cadena pesada es la región bisagra. Por "bisagra" o "región bisagra" o "región bisagra de anticuerpo" o "región bisagra de inmunoglobulina" se entiende en el presente documento el polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y el segundo dominio constantes de un anticuerpo. Estructuralmente, el dominio CH1 de la IgG termina en la posición EU 220, y el dominio CH2 de la IgG comienza en el residuo EU 237. De este modo, para la IgG, la bisagra del anticuerpo se define en el presente documento para incluir las posiciones de la 221 (D221 en la IgG1) a la 236 (G236 en la IgG1), en donde la numeración está de acuerdo con el índice EU como en el Kabat. En algunas modalidades, por ejemplo, en el contexto de una región Fc, se incluye la bisagra inferior, y la "bisagra inferior" se refiere generalmente a las posiciones 226 o 230. Como se indica en el presente documento, también pueden prepararse las variantes de pI en la región bisagra.

La cadena ligera generalmente comprende dos dominios, el dominio ligero variable (que contiene las CDR de la cadena ligera y junto con los dominios pesados variables que forman la región Fv), y una región de la cadena ligera constante (a menudo denominada CL o C^k).

Otra región de interés para las sustituciones adicionales, descrita a continuación, es la región Fc. Por "Fc" o "región Fc", o "dominio Fc" como se usa en el presente documento, se entiende el polipéptido que comprende la región constante de un anticuerpo que excluye el primer dominio de inmunoglobulina de región constante y, en algunos casos, parte de la bisagra. Por lo tanto, el Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de la IgA, IgD e IgG, y los tres últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de la IgE e IgM, y la bisagra flexible N-terminal a estos dominios. Para la IgA e IgM, el Fc puede incluir la cadena J. Para la IgG, el dominio Fc comprende los dominios de inmunoglobulina C^y2 y C^y3 (C^y2 y C^y3) y la región bisagra inferior entre el Cy1 (Cy1) y Cy2 (Cy2). Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana se define generalmente para incluir los residuos C226 o P230 en su carboxilo terminal, en donde la numeración está de acuerdo con el índice EU como en Kabat. En algunas modalidades, como se describe más completamente a continuación, se realizan modificaciones de aminoácidos en la región Fc, por ejemplo, para alterar la unión a uno o más receptores FcyR o al receptor FcRn.

Por consiguiente, en algunas modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos heterodiméricos que se basan en el uso de dos dominios Fc variantes de la cadena pesada diferentes que se autoensamblarán para formar los anticuerpos heterodiméricos.

En algunas modalidades, los anticuerpos son de longitud completa. Por "anticuerpo de longitud completa" en el presente documento se entiende la estructura que constituye la forma biológica natural de un anticuerpo, que incluye las regiones variables y constantes, incluye una o más modificaciones como se describe en el presente documento, particularmente en los dominios Fc para permitir la formación de la heterodimerización o la purificación de los heterodímeros lejos de los homodímeros. Un anticuerpo heterodimérico de longitud completa son dos cadenas pesadas con diferentes dominios Fc y dos cadenas ligeras o una cadena ligera común.

Alternativamente, los anticuerpos pueden incluir una variedad de estructuras como se muestra generalmente que incluyen, pero no se limitan a los fragmentos de anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en el presente documento como "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (a veces denominados "conjugados de anticuerpos"), y fragmentos de cada uno, respectivamente.

En una modalidad, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, siempre que contenga al menos un dominio constante que pueda modificarse para producir heterodímeros, por ejemplo, mediante la ingeniería de pI. Otros fragmentos de anticuerpos que pueden usarse incluyen fragmentos que contienen uno o más de los dominios CH1, CH2, CH3, bisagra y Cl de la invención, que se han modificado mediante la ingeniería de pI. Por ejemplo, las fusiones a Fc son fusiones de la región Fc (CH2 y CH3, opcionalmente con la región bisagra) fusionadas con otra proteína. Se conocen en la técnica varias fusiones a Fc y pueden mejorarse mediante la adición de las variantes de heterodimerización de la invención. En el presente caso, pueden realizarse fusiones de anticuerpos que comprenden el CH1; CH1, CH2 y CH3; CH2; CH3; CH2 y CH3; CH1 y CH3, y cualquiera o todos pueden prepararse opcionalmente con la región bisagra, al utilizar cualquier combinación de variantes de heterodimerización descritas en el presente documento.

Modalidades de scFv

En algunas modalidades de la presente descripción, un monómero comprende una cadena pesada que comprende un scFV unido a un dominio Fc, y el otro monómero comprende una cadena pesada que comprende un Fab unido a un dominio Fc, por ejemplo, una cadena pesada "típica" y una cadena ligera. Por "Fab" o "región Fab", como se utiliza en el presente documento, se entienden los polipéptidos que comprenden los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, VL y CL. El Fab puede referirse a esta región en aislamiento, o esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud completa, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión a Fab. Por "Fv" o "fragmento Fv" o "región Fv" como se usa en el presente documento, se entiende un polipéptido que comprende los dominios VL y VH de un solo anticuerpo.

Varias de las modalidades de los anticuerpos heterodiméricos descritas en el presente documento se basan en el uso de uno o más dominios scFv, que comprenden las cadenas pesadas variables y ligeras variables, unidas covalentemente mediante el uso de un conector, que forman un dominio de unión al antígeno. Algunas modalidades en el presente documento usan conectores "estándar", normalmente conectores de glicina y serina, como es bien conocido en la técnica.

La presente descripción proporciona además conectores de scFv cargados para facilitar la separación en el pI entre un primer y un segundo monómero. Es decir, al incorporar un conector de scFv cargado, ya sea positivo o negativo (o ambos, en el caso de armazones que usan scFv en diferentes monómeros), esto permite que el monómero que comprende el conector cargado altere el pI sin realizar más cambios en los dominios Fc. Estos conectores cargados pueden sustituirse en cualquier scFv que contenga conectores estándar. De nuevo, como apreciarán los expertos en la técnica, los conectores de scFv cargados se utilizan en la "hebra" o monómero correcto, de acuerdo con los cambios deseados en el pI. Por ejemplo, como se discute en el presente documento, para hacer un anticuerpo heterodimérico de formato de triple F, se calcula el pI original de la región Fv para cada uno de los dominios de unión al antígeno deseados, y se elige uno para hacer un scFv, y en dependencia del pI, se eligen los conectores positivos o negativos.

Además, en el caso de las regiones scFv anti-CD3, los enlaces disulfuro pueden modificarse por ingeniería genética en las cadenas pesadas variables y ligeras variables para proporcionar una estabilidad adicional. Las secuencias de disulfuro adecuadas en el contexto de los scFv anti-CD3 se muestran en la Figura 8.

Anticuerpos quiméricos y humanizados

En algunas modalidades, el anticuerpo puede ser una mezcla de diferentes especies, por ejemplo, un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. En general, tanto los "anticuerpos quiméricos" como los "anticuerpos humanizados" se refieren a los anticuerpos que combinan las regiones de más de una especie. Por ejemplo, los "anticuerpos quiméricos" tradicionalmente comprenden la(s) región(ones) variable(s) de un ratón (o rata, en algunos casos) y la(s) región(ones) constante(s) de un humano. Los "anticuerpos humanizados" generalmente se refieren a anticuerpos no humanos que intercambiaron las regiones marco del dominio variable, por secuencias encontradas en anticuerpos humanos. En general, en un anticuerpo humanizado, el anticuerpo completo, excepto las CDR, está codificado por un polinucleótido de origen humano o es idéntico a dicho anticuerpo, excepto dentro de sus CDR. Las CDR, algunas o todas codificadas por ácidos nucleicos que se originan en un organismo no humano, se injertan en el marco de la lámina beta de una región variable de un anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad está determinada por las CDR injertadas. La creación de tales anticuerpos se describe, por ejemplo, en el documento WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen y otros, 1988, Science 239:1534-1536. La "retromutación" de los residuos del marco aceptor seleccionado a los residuos del donante correspondiente, se requiere a menudo para recuperar la afinidad que se pierde en la construcción injertada inicial (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213).

El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana, y por lo tanto comprenderá típicamente una región Fc humana. Los anticuerpos humanizados también pueden generarse al utilizar ratones con un sistema inmune modificado mediante ingeniería genética. Roque y otros, 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Una variedad de técnicas y métodos para humanizar y remodelar los anticuerpos no humanos se conocen bien en la técnica (véase Tsurushita y Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (^uS^a)).

Los métodos de humanización incluyen, entre otros, los métodos descritos en Jones y otros, 1986, Nature 321:522-525; Riechmann y otros, 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen y otros, 1988, Science, 239:1534-1536; Queen y otros, 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He y otros, 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter y otros, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta y otros, 1997, Cancer Res. 57 (20):4593-9; Gorman y otros, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor y otros, 1998, Protein Eng 11:321-8. La humanización u otros métodos para reducir la inmunogenicidad de las regiones variables de los anticuerpos no humanos pueden incluir los métodos de revestimiento, como se describe, por ejemplo, en Roguska y otros, 1994, Proc. Natl Acad Sci. USA 91:969-973

En una modalidad, el anticuerpo original maduró su afinidad, como se conoce en la técnica. Los métodos basados en la estructura pueden emplearse para la humanización y la maduración de la afinidad, por ejemplo, como se describe en el documento USSN 11/004590. Pueden emplearse métodos basados en la selección para humanizar y/o madurar la afinidad de las regiones variables de los anticuerpos, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en Wu y otros, 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca y otros, 1997, J. Biol. Chem. 272 (16):10678-10684; Rosok y otros, 1996, J. Biol. Chem. 271 (37):22611-22618; Rader y otros, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss y otros, 2003, Protein Engineering 16 (10):753-759. Otros métodos de humanización pueden involucrar el injerto de solo algunas partes de las CDR, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en el documento USSN 09/810 510; Tan y otros, 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis y otros, 2002, J. Immunol. 169:3076-3084.

Regiones constantes de la cadena pesada heterodimérica

Por consiguiente, la presente descripción proporciona proteínas heterodiméricas basadas en el uso de monómeros que contienen regiones constantes de cadena pesada variantes, y específicamente los dominios Fc, como primer dominio. Por "monómero" en el presente documento se entiende la mitad de la proteína heterodimérica. Cabe señalar que los anticuerpos tradicionales son en realidad tetraméricos (dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras). En el contexto de la presente invención, un par de cadenas pesada-ligera (si es aplicable, por ejemplo, si el monómero comprende un Fab) se considera un "monómero". De manera similar, una región de cadena pesada que comprende el scFv se considera un monómero. En el caso en el que una región Fv es una pareja de fusión (por ejemplo, los dominios variables pesados y ligeros) y una proteína que no es un anticuerpo es otra pareja de fusión, cada "mitad" se considera un monómero. Esencialmente, cada monómero comprende una suficiente región constante de la cadena pesada para permitir la ingeniería de heterodimerización, ya sea toda la región constante, por ejemplo, la Ch1-bisagra-CH2-CH3, la región Fc (CH2-CH3) o solo el dominio CH3.

Las regiones constantes de la cadena pesada variante pueden comprender toda o parte de la región constante de la cadena pesada, que incluye la construcción de longitud completa, CH1-bisagra-CH2-CH3, o porciones de la misma, que incluyen, por ejemplo, CH2-CH3 o CH3 solo. Además, la región de la cadena pesada de cada monómero puede ser el mismo esqueleto (CH1-bisagra-CH2-CH3 o CH2-CH3) o diferente. Los truncamientos y adiciones N- y C-terminales también se incluyen dentro de la definición; por ejemplo, algunas variantes de pI incluyen la adición de aminoácidos cargados al extremo C-terminal del dominio de la cadena pesada.

Por tanto, en general, un monómero de la presente construcción de "triple F" es una región scFv-bisagra-dominio Fc) y el otro es (VH-CH1-bisagra-CH2-CH3 más la cadena ligera asociada), con las variantes de heterodimerización, que incluyen las variantes estéricas, isotípicas, direccionales de carga y de pI, las variantes de Fc y FcRn, las variantes de ablación y los dominios de unión al antígeno adicionales (con conectores opcionales) incluidos en estas regiones.

Además de las variantes de heterodimerización (por ejemplo, las variantes estérica y de pI) descritas en el presente documento, las regiones de la cadena pesada también pueden contener sustituciones de aminoácidos adicionales, que incluyen los cambios para alterar la unión a FcyR y FcRn como se describe a continuación.

Además, algunos monómeros pueden utilizar conectores entre la región constante de la cadena pesada variante y la pareja de fusión. Para la porción scFv del "abridor de botellas", pueden usarse conectores estándar como se conocen en la técnica, o los conectores de scFv cargados descritos en el presente documento. En el caso de que se preparen parejas de fusión adicionales (por ejemplo, Figuras 1 y 2), pueden usarse conectores peptídicos tradicionales, que incluyen los conectores flexibles de glicina y serina, o los conectores cargados de la Figura 9. En algunos casos, los conectores para usar como componentes del monómero son diferentes de los definidos a continuación para las construcciones de ADC, y en muchas modalidades no son conectores escindibles (tales como los susceptibles a las proteasas), aunque los conectores escindibles pueden encontrar uso en algunas modalidades. Las variantes de heterodimerización incluyen varios tipos diferentes de variantes, que incluyen, pero no se limitan a, las variantes estéricas (que incluyen las variantes de carga) y las variantes de pI, que pueden combinarse opcional e independientemente con cualquier otra variante. En estas modalidades, es importante hacer coincidir el "monómero A" con el "monómero B"; es decir, si una proteína heterodimérica se basa tanto en las variantes estéricas como en las variantes de pI, estas deben coincidir correctamente con cada monómero: por ejemplo, el conjunto de variantes estéricas que funcionan (1 conjunto en el monómero A, 1 conjunto en el monómero B) se combina con los conjuntos de variantes de pI (1 conjunto en el monómero A, 1 conjunto en el monómero B), de modo que las variantes de cada monómero se diseñan para lograr la función deseada, al tener en cuenta el "enhebrado" del pI, de modo que las variantes estéricas que pueden alterar el pI se colocan en el monómero apropiado.

Es importante señalar que las variantes de heterodimerización descritas en el presente documento (por ejemplo, las que incluyen, pero no se limitan a, las variantes mostradas en las Figuras 3 y 12), pueden combinarse opcional e independientemente con cualquier otra variante y con cualquier otro monómero. Es decir, lo importante para la heterodimerización es que hay "conjuntos" de variantes, un conjunto para un monómero y un conjunto para el otro. Si estos se combinan de las Figuras 1 a 1 (por ejemplo, los listados del monómero 1 pueden ir juntos) o se cambian (las variantes de pI del monómero 1 con las variantes estéricas del monómero 2) es irrelevante. Sin embargo, como se indica en el presente documento, el "enhebrado" debe conservarse cuando se realizan las combinaciones como se indica anteriormente. Además, para las variantes de Fc adicionales (tales como para la unión al FcyR, la unión al FcRn, etc.), el monómero o ambos monómeros pueden incluir cualquiera de las variantes enumeradas, de forma independiente y opcional. En algunos casos, ambos monómeros tienen las variantes adicionales y en algunos solo un monómero tiene las variantes adicionales, o pueden combinarse.

Variantes de heterodimerización

La presente descripción proporciona las proteínas heterodiméricas, que incluyen los anticuerpos heterodiméricos en una variedad de formatos, los cuales utilizan las variantes las heterodiméricas para permitir la formación y/o purificación heterodimérica lejos de los homodímeros.

Variantes estéricas

En algunas modalidades, la formación de heterodímeros puede facilitarse mediante la adición de variantes estéricas. Es decir, al cambiar los aminoácidos en cada cadena pesada, es más probable que diferentes cadenas pesadas se asocien para formar la estructura heterodimérica que para formar homodímeros con las mismas secuencias de aminoácidos del Fc. Las variantes estéricas adecuadas se incluyen en la Figura 3 y en las Figuras 12A, 12B, 12C, 12D, 12F y 12G.

Un mecanismo se denomina generalmente en la técnica "botones y agujeros", el cual se refiere a la ingeniería de aminoácidos que crea influencias estéricas para favorecer la formación heterodimérica y desfavorecer la formación homodimérica, también puede usarse opcionalmente; esto a veces se denomina "botones y agujeros", como se describe en el documento USSN 61/596,846, Ridgway y otros, Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell y otros, J. Mol. Biol. 1997 270:26; Patente de Estados Unidos No. 8,216,805. Las Figuras identifican una serie de pares de "monómero A - monómero B" que se basan en los "botones y agujeros". Además, como se describe en Merchant y otros, Nature Biotech. 16:677 (1998), estas mutaciones de "botones y agujeros" pueden combinarse con enlaces disulfuro para sesgar la formación hacia la heterodimerización.

Un mecanismo adicional que se utiliza en la generación de heterodímeros a veces se denomina "dirección electrostática", como se describe en Gunasekaran y otros, J. Biol. Chem. 285 (25):19637 (2010). Esto a veces se denomina en el presente documento "pares de carga". En esta modalidad, se utilizan electrostáticos para sesgar la formación hacia la heterodimerización. Como apreciarán los expertos en la técnica, estos también pueden tener un efecto sobre el pI y, por lo tanto, sobre la purificación y, por lo tanto, en algunos casos también podrían considerarse variantes de pI. Sin embargo, como estos se generaron para forzar la heterodimerización y no se utilizaron como herramientas de purificación, se clasifican como "variantes estéricas". Estos incluyen, entre otras, las modificaciones D221E/P228E/L368E emparejadas con D221R/P228R/K409R (por ejemplo, estos son "conjuntos correspondientes de monómeros) y C220E/P228E/368E emparejadas con C220R/E224R/P228R/K409R.

Las variantes del monómero A y el monómero B adicionales que pueden combinarse con otras variantes, opcional e independientemente en cualquier cantidad, como las variantes de pI descritas en el presente documento u otras variantes estéricas que se muestran en la Figura 37 del documento US 2012/0149876

En algunas modalidades, las variantes estéricas descritas en el presente documento pueden incorporarse opcional e independientemente con cualquier variante de pI (u otras variantes tales como las variantes de Fc, las variantes de FcRn, etc.) en uno o ambos monómeros, y pueden incluirse o excluirse de forma independiente y opcional de las proteínas de la invención.

Variantes de pI (Punto isoeléctrico) para los heterodímeros

En general, como apreciarán los expertos en la técnica, existen dos categorías generales de las variantes de pI: las que aumentan el pI de la proteína (cambios básicos) y las que disminuyen el pI de la proteína (cambios ácidos). Como se describe en el presente documento, pueden realizarse todas las combinaciones de estas variantes: un monómero puede ser de tipo salvaje, o una variante que no muestra un pI significativamente diferente del de tipo salvaje, y el otro puede ser más básico o más ácido. Alternativamente, cada monómero se cambia, de uno a más básico y de uno a más ácido.

Las combinaciones de preferencia de las variantes de pI se muestran en la Figura 3 y 12E.

Cambios de pI de la cadena pesada

En las Figuras 54 y 55 se muestran diversas variantes de pI. Como se describe en el presente documento y se muestra en las figuras, estos cambios se muestran en relación con la IgG1, pero todos los isotipos pueden alterarse de esta manera, así como los híbridos de los isotipos. En el caso de que el dominio constante de la cadena pesada sea de IgG2-4, también pueden usarse R133E y R133Q.

Variantes de cadenas ligeras de heterodímeros de anticuerpos

En el caso de los heterodímeros basados en anticuerpos, por ejemplo, cuando al menos uno de los monómeros comprende una cadena ligera además del dominio de la cadena pesada, también pueden prepararse variantes de pI en la cadena ligera. Las sustituciones de aminoácidos para reducir el pI de la cadena ligera incluyen, pero no se limitan a, K126E, K126Q, K145E, K145Q, N152D, S156E, K169E, S202E, K207E y la adición del péptido DEDE en el extremo c-terminal de la cadena ligera. Los cambios en esta categoría basados en la cadena ligera lambda constante incluyen una o más sustituciones en R108Q, Q124E, K126Q, N138D, K145T y Q199E. Además, también puede aumentarse el pI de las cadenas ligeras.

Variantes isotípicas

Además, muchas modalidades de la descripción se basan en la "importación" de aminoácidos de pI en posiciones particulares de un isotipo de IgG a otro, lo cual reduce o elimina la posibilidad de que se introduzca inmunogenicidad no deseada en las variantes. Varios de estos se muestran en las Figuras 10A y 10B. Es decir, la IgG1 es un isotipo común para los anticuerpos terapéuticos por una variedad de razones, que incluye una función efectora alta. Sin embargo, la región constante pesada de la IgG1 tiene un pI más alto que el de IgG2 (8,10 frente a 7,31). Al introducir residuos de IgG2 en posiciones particulares en el esqueleto de la IgG1, el pI del monómero resultante disminuye (o aumenta) y, además, exhibe una vida media en suero más prolongada. Por ejemplo, la IgG1 tiene una glicina (pI 5,97) en la posición 137 y la IgG2 tiene un ácido glutámico (pI 3,22); la importación del ácido glutámico afectará al pI de la proteína resultante. Como se describe a continuación, generalmente se requieren varias sustituciones de aminoácidos para afectar significativamente el pI del anticuerpo variante. Sin embargo, debe tenerse en cuenta, como se analiza a continuación, que incluso los cambios en las moléculas de IgG2 permiten un aumento de la vida media en el suero.

En otras modalidades, se realizan cambios de aminoácidos no isotípicos, ya sea para reducir el estado de carga general de la proteína resultante (por ejemplo, al cambiar un aminoácido de pI más alto por un aminoácido de pI más bajo), o para permitir adaptaciones en la estructura para la estabilidad, etc., como se describe con más detalle a continuación.

Además, mediante la ingeniería de pI tanto de los dominios constantes pesados como ligeros, pueden verse cambios significativos en cada monómero del heterodímero. Como se analiza en el presente documento, el hecho de que los pI de los dos monómeros difieran en al menos 0,5 puede permitir la separación mediante una cromatografía de intercambio iónico o enfoque isoeléctrico u otros métodos sensibles al punto isoeléctrico.

Cálculo del pI

El pI de cada monómero puede depender del pI del dominio constante de la cadena pesada variante y del pI del monómero total, que incluye el dominio constante de la cadena pesada variante y la pareja de fusión. Por tanto, en algunas modalidades, el cambio en el pI se calcula sobre la base del dominio constante de la cadena pesada variante, al utilizar el gráfico de la Figura 53. Como se analiza en el presente documento, se decide generalmente cual monómero diseñar por el pI inherente de las regiones Fv y del armazón. Alternativamente, puede compararse el pI de cada monómero.

Proteínas de fusión a Fc heterodiméricas

Además de los anticuerpos heterodiméricos, la invención proporciona proteínas heterodiméricas que comprenden un primer monómero que comprende una región Fc variante y una primera pareja de fusión y un segundo monómero, que también comprende una región Fc variante y una segunda pareja de fusión. Las regiones Fc variantes se diseñan por ingeniería genética como en el presente documento para los anticuerpos y, por lo tanto, son diferentes y, en general, la primera y la segunda pareja de fusión también son diferentes. En algunos casos, donde un monómero está basado en un anticuerpo (por ejemplo, que comprende una cadena pesada y ligera estándar o un dominio Fc con un scFv) y el otro es una proteína de fusión a Fc, la proteína heterodimérica resultante se denomina "cuerpo de fusión".

Variantes de pI que también confieren una mejor unión a FcRn in vivo

En el caso donde la variante de pI disminuye el pI del monómero, este pueden tener el beneficio adicional de mejorar la retención en el suero in vivo.

Aunque todavía se encuentran en estudio, se cree que las regiones Fc tienen vidas medias más largas in vivo, porque la unión al FcRn a pH 6 en un endosoma secuestra el Fc (Ghetie y Ward, 1997 Immunol Today. 18 (12): 592 598). El compartimento endosómico luego recicla el Fc a la superficie celular. Una vez que el compartimento se abre al espacio extracelular, el pH más alto, ~ 7,4, induce la liberación del Fc de regreso a la sangre. En ratones, Dall 'Acqua y otros mostró que los mutantes de Fc con un aumento de la unión a FcRn a pH 6 y pH 7,4 en realidad tenían concentraciones séricas reducidas y la misma vida media que el Fc de tipo salvaje (Dall 'Acqua y otros 2002, J. Immunol. 169: 5171-5180).

Se cree que la mayor afinidad del Fc por el FcRn a pH 7,4 prohíbe la liberación del Fc de vuelta a la sangre. Por lo tanto, las mutaciones del Fc que aumentarán la vida media del Fc in vivo aumentarán idealmente la unión al FcRn a un pH más bajo mientras aún permiten la liberación del Fc a un pH más alto. El aminoácido histidina cambia su estado de carga en el rango de pH de 6,0 a 7,4. Por lo tanto, no es sorprendente encontrar residuos de His en posiciones importantes en el complejo Fc/FcRn.

Recientemente se sugirió que los anticuerpos con regiones variables que tienen puntos isoeléctricos más bajos también pueden tener vidas medias en el suero más largas (Igawa y otros, 2010 PED^s.23 (5): 385-392 incorporado en su totalidad por referencia). Sin embargo, el mecanismo de esto aún no se conoce bien. Además, las regiones variables difieren de un anticuerpo a otro. Las variantes de la región constante con un pI reducido y una vida media extendida proporcionarían un enfoque más modular para mejorar las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos, como se describe en el presente documento.

Las variantes de pI que encuentran un uso en esta modalidad, así como su uso para la optimización de la purificación, se describen en la Figura 20.

Combinación de las variantes heterodiméricas

Como apreciarán los expertos en la técnica, todas las variantes de heterodimerización enumeradas pueden combinarse opcional e independientemente de cualquier forma, siempre que conserven su "enhebrado" o "partición de monómeros". Además, todas estas variantes pueden combinarse en cualquiera de los formatos de heterodimerización.

En el caso de las variantes de pI, aunque las Figuras muestran las modalidades que encuentran un uso particular, pueden generarse otras combinaciones, al seguir la regla básica de alterar la diferencia de pI entre los dos monómeros para facilitar la purificación.

Ácidos nucleicos de la invención

La invención proporciona además composiciones de ácido nucleico que codifican las proteínas heterodiméricas de la invención. Como apreciarán los expertos en la técnica, las composiciones de ácido nucleico dependerán del formato y la armazón de la proteína heterodimérica. Así, por ejemplo, cuando el formato requiere tres secuencias de aminoácidos, como para el formato de triple F (por ejemplo, un primer monómero de aminoácido que comprende un dominio Fc y un scFv, un segundo monómero de aminoácido que comprende una cadena pesada y una cadena ligera), pueden incorporarse tres secuencias de ácido nucleico en uno o más vectores de expresión para la expresión. De manera similar, en algunos formatos (por ejemplo, los formatos scFv duales como los descritos en la Figura 1M) solo se necesitan dos ácidos nucleicos; de nuevo, pueden ponerse en uno o dos vectores de expresión.

Antígenos diana

Las proteínas heterodiméricas de la invención pueden dirigirse virtualmente a cualquier antígeno. El formato "triple F" es particularmente beneficioso para dirigirse a dos (o más) antígenos distintos. (Como se describe en el presente documento, este direccionamiento puede ser cualquier combinación de unión monovalente y divalente, en dependencia del formato). Por tanto, las inmunoglobulinas de la presente invención preferentemente se acoplan conjuntamente con dos antígenos diana, aunque en algunos casos, pueden acoplarse monovalentemente tres o cuatro antígenos. La especificidad de cada monómero puede seleccionarse de las listas siguientes. Si bien las inmunoglobulinas triple F descritas en el presente documento son particularmente beneficiosas para dirigirse a distintos antígenos, en algunos casos puede ser beneficioso dirigirse a un solo antígeno. Es decir, cada monómero puede tener la especificidad por el mismo antígeno.

Algunas aplicaciones particulares adecuadas de las proteínas heterodiméricas de la presente invención son los pares de codiana para los cuales es beneficioso o crítico acoplar cada antígeno diana de forma monovalente. Dichos antígenos pueden ser, por ejemplo, receptores inmunes que se activan tras la formación de inmunocomplejos. La activación celular de muchos receptores inmunes se produce sólo por entrecruzamiento, que se consigue típicamente mediante inmunocomplejos de anticuerpo/antígeno, o mediante el acoplamiento de la célula efectora a la célula diana. Para algunos receptores inmunes, por ejemplo, el receptor de señalización CD3 en las células T, la activación solo tras el acoplamiento con el antígeno coacoplado es fundamental, ya que el entrecruzamiento no específico en un escenario clínico puede provocar una tormenta de citocinas y toxicidad. Terapéuticamente, al acoplar tales antígenos monovalentemente en lugar de multivalentemente, mediante el uso de las inmunoglobulinas del presente documento, tal activación se produce solamente en respuesta al entrecruzamiento único en el microambiente del antígeno diana primario. La capacidad de dirigirse a dos antígenos diferentes con valencias diferentes es un aspecto nuevo y útil de la presente invención. Los ejemplos de antígenos diana para los que puede ser terapéuticamente beneficioso o necesario coacoplar monovalentemente incluyen, pero no se limitan a, los receptores de activación inmunitaria tales como el CD3, FcyR, receptores de tipo toll (TLR) tales como el TLR4 y TLR9, citocina, quimiocina, receptores de citocinas y receptores de quimiocinas. En muchas modalidades, uno de los sitios de unión al antígeno se une a CD3 y, en algunas modalidades, es el monómero que contiene el scFv.

Prácticamente cualquier antígeno puede ser diana de las inmunoglobulinas del presente documento, que incluyen, pero no se limitan a, proteínas, subunidades, dominios, motivos y/o epítopos que pertenecen a la siguiente lista de antígenos diana, que incluye tanto factores solubles como citocinas y factores unidos a la membrana, que incluyen los receptores transmembrana: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGFla, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, Receptor de Adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, Activina, Activina A, Activina AB, Activina B, Activina C, Activina RIA, Activina RIA ALK-2, Activina RIB ALK-4, Activina RIIA, Activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Addressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, antagonista alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, Artemina, anti-Id, ASPARTIC, Factor natriurético auricular, integrina av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, Estimulador de linfocitos B (BlyS), BACE, BACE- 1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bc1, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP- 7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), ^bM^p, b-NGF, B^oK, Bombesina, Factor neurotrófico derivado de hueso, BPDE, B^pDE-DNA, BTC, factor de complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, Calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno asociado a carcinoma, Catepsina A, Catepsina B, Catepsina C/DPPI, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina H, Catepsina L, Catepsina O, Catepsina S, Catepsina V, Catepsina X/Z/P, CBL, c Ci, CCK2, Cc L, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11 b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteínas p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina botulínica de Clostridium, toxina de Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCRR6, antígeno asociado a tumor citoqueratina, DcR3, DC-SIGN, factor de aceleración de la descomposición, des (1-3) -IGF-I (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnasa, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, Encefalinasa, eNOS, Eot, eotaxina1, EpCAM, Efrina B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selectina, ET-1, factor IIa, factor VII, factor VIIIc, factor IX, proteína de activación de fibroblastos (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, Ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, Fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, Hormona estimulante del folículo, Fractalkina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagón, Glut 4, glicoproteína IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, factor de liberación de la hormona del crecimiento, Hapteno (NP-cap o NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína de la envoltura gB HCMV) glicoproteína de la envoltura gH, HCMV UL, factor de crecimiento hematopoyético (HGF), Hep B gp120, heparanasa, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB del virus herpes simplex (HSV), glicoproteína gD del HSV, HGFA, antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), gp120 del VIH, lazo V3 de gp120 del VIH IIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovirus humano (HCMV), hormona del crecimiento humano (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor de IgA, IgE, IGF, proteínas de unión a IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL -13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferón (INF)-alfa, INF-beta, INF-gamma, inhibina, iNOS, Cadena A de insulina, Cadena B de insulina, Factor de crecimiento 1 de tipo insulina, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa4/beta1, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5 (alfaV), integrina alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2, interferón gamma, IP-10, I-TAC, JE, Calicreína 2, Calicreína 5, Calicreína 6, Calicreína 11, Calicreína 12, Calicreína 14, Calicreína 15, Calicreína L1, Calicreína L2, Calicreína L3, Calicreína L4, KC, KDR, Factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), lamina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 latente bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, antígeno de Lewis-Y, antígeno relacionado con el de Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteínas, LIX, LKN, Lptn, L-Selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, tensioactivo pulmonar, hormona luteinizante, receptor beta de linfotoxina, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASAS, receptor MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Muc1), MUC18, sustancia inhibidora de Muellerian, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-Caderina, NCA 90, NCAM, NCAM, Neprilisina, Neurotropina-3, -4 o -6, Neurturina, Factor de crecimiento neuronal (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, Hormona paratiroidea, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), P1GF, PLP, PP14, Proinsulina, Prorelaxina, Proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno prostático específico de membrana (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadena A de relaxina, cadena B de relaxina, renina, virus respiratorio sincitial (RSV) F, RSV Fgp, Ret, Factores reumatoides, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINA, Albúmina sérica, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína 72 asociada a tumor), TARC, TCA-3, receptores de células T (por ejemplo, el receptor de células T alfa/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatasa alcalina de tipo PLAP testicular, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan específico, TGF-beta RI (ALK-5), TGF-beta RII, TGF-beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, Trombina, Ck-1 del Timo, Hormona estimulante de la tiroides, Tie, TIMP, TIQ, factor tisular, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfa beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, DE MUERTE, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD 120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD 120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (Ligando TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK Ligando ODF, OPG Ligando), TNFSF12 (Ligando TWEAK Apo-3, Ligando DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligando LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligando GITR, ligando AITR, TL6) TNFSF1A (TConectina NF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (Ligando gp34 OX40, TXGP1), TNFSF5 (Ligando CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Ligando Fas Ligando Apo-1, Ligando APT1), TNFSF7 (Ligando CD27 CD70), TNFSF8 (Ligando CD30 CD153), TNFSF9 (Ligando 4-1BB Ligando CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferencia, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno asociado a tumor CA 125, antígeno asociado a tumor que expresa el carbohidrato relacionado con Lewis Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Urokinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Caderina, VE-cadherina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígenos virales, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina VNR, factor de von Willebrands, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD y receptores de hormonas y factores de crecimiento. Para formar los anticuerpos biespecíficos o triespecíficos de la invención, pueden prepararse anticuerpos contra cualquier combinación de estos antígenos; es decir, cada uno de estos antígenos puede incluirse o excluirse opcional e independientemente de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención.

Los antígenos de los ejemplos que pueden dirigirse específicamente por las inmunoglobulinas de la invención incluyen, pero no se limitan al: CD20, Cd 19, Her2, EGFR, EpCAM, CD3, FcYRIIIa (CD16), FcYRIIa (CD32a), FcYRIIb (CD32b), F^cyRI (CD64), Receptores de tipo Toll (TLR) como TLR4 y TLR9, citocinas como IL-2, IL-5, IL-13, IL-12, IL-23 y TNFa, receptores de citocinas como IL-2R, quimiocinas, receptores de quimiocinas, factores de crecimiento como el VEGF y HGF, y similares. Para formar los anticuerpos multiespecíficos de la invención, pueden producirse anticuerpos contra cualquier combinación de estos antígenos; es decir, cada uno de estos antígenos puede incluirse o excluirse opcional e independientemente de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención.

Las combinaciones particularmente preferentes para los anticuerpos biespecíficos son un dominio de unión a antígeno a CD3 y un dominio de unión a antígeno a CD19; un dominio de unión a antígeno a CD3 y un dominio de unión a antígeno a CD33; un dominio de unión a antígeno a CD3 y un dominio de unión a antígeno a CD38. De nuevo, en muchas modalidades, el dominio de unión a CD3 es el scFv, que tiene una secuencia de ejemplo como se muestra en las Figuras y/o CDR de CD3 como se indica.

La elección de antígenos diana y codiana adecuados depende de la aplicación terapéutica deseada. Algunas dianas que demostraron ser especialmente susceptibles a la terapia con anticuerpos son aquellas con funciones de señalización. Otros anticuerpos terapéuticos ejercen sus efectos al bloquear la señalización del receptor al inhibir la unión entre un receptor y su ligando afín. Otro mecanismo de acción de los anticuerpos terapéuticos es provocar una regulación negativa del receptor. Otros anticuerpos no funcionan mediante la señalización a través de su antígeno diana. La elección de las codianas dependerá de la biología detallada subyacente a la patología de la indicación que se trata.

La terapia con anticuerpos monoclonales se convierte en una modalidad terapéutica importante para el cáncer (Weiner y otros, 2010, Nature Reviews Immunology 10:317-327; Reichert y otros, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1073-1078:). Para el tratamiento contra el cáncer, puede ser deseable direccionar a un antígeno (antígeno-1) cuya expresión está restringida a las células cancerosas mientras se codirige a un segundo antígeno (antígeno-2) que media alguna actividad de eliminación inmunológica. Para otros tratamientos, puede ser beneficioso codirigir dos antígenos, por ejemplo, dos factores angiogénicos o dos factores de crecimiento, que se sabe que desempeñan algún papel en la proliferación del tumor. Algunas codianas de ejemplo para la oncología incluyen, pero no se limitan al, HGF y VEGF, IGF-1R y VEGF, Her2 y VEGF, CD19 y CD3, CD20 y CD3, Her2 y CD3, CD19 y FcYRIIIa, CD20 y FcYRIIIa, Her2 y FcYRIIIa. Una inmunoglobulina de la invención puede ser capaz de unirse a VEGF y fosfatidilserina; VEGF y ErbB3; VEGF y PLGF; VEGF y ROBO4; VEGF y BSG2; VEGF y CDCP1; VEGF y ANPEP; VEGF y c-MET; HER-2 y ERB3; HER-2 y BSG2; HER-2 y CDCP1; HER-2 y ANPEP; EGFR y CD64; EGFR y BSG2; EGFR y CDCP1; EGFR y ANPEP; IGF1R y PDGFR; IGFI1R y VEGF; IGF1R y CD20; CD20 y CD74; CD20 y CD30; CD20 y DR4; CD20 y VEGFR2; CD20 y CD52; CD20 y CD4; HGF y c-MET; HGF y NRP1; HGF y fosfatidilserina; ErbB3 e IGF1R; ErbB3 e IGF1,2; c-Met y Her-2; c-Met y NRP1; c-Met e IGF1R; IGF1,2 y PDGFR; IGF1,2 y CD20; IGF1,2 e IGF1R; IGF2 y EGFR; IGF2 y HER2; IGF2 y CD20; IGF2 y VEGF; IGF2 e IGF1R; IGF1 e IGF2; PDGFRa y VEGFR2; PDGFRa y PLGF; PDGFRa y VEGF; PDGFRa y c-Met; PDGFRa y EGFR; PDGFRb y VEGFR2; PDGFRb y c-Met; PDGFRb y EGFR; RON y c-Met; RON y MTSP1; RON y MSP; RON y CDCP1; VGFR1 y PLGF; VGFR1 y RON; VGFR1 y EGFR; VEGFR2 y PLGF; VEGFR2 y NRP1; VEGFR2 y RON; VEGFR2 y DLL4; VEGFR2 y EGFR; VEGFR2 y ROBO4; VEGFR2 y CD55; LPA y SIP; EPHB2 y RON; CTLA4 y VEGF; CD3 y EPCAM; CD40 e IL6; CD40 e IGF; CD40 y CD56; CD40 y CD70; CD40 y VEGFR1; CD40 y DR5; CD40 y DR4; CD40 y APRIL; CD40 y BCMA; CD40 y RANKL; CD28 y MAPG; CD80 y CD40; CD80 y CD30; CD80 y CD33; CD80 y CD74; CD80 y CD2; CD80 y CD3; CD80 y CD19; CD80 y CD4; CD80 y CD52; CD80 y VEGF; CD80 y DR5; CD80 y VEGFR2; CD22 y CD20; CD22 y CD80; CD22 y CD40; CD22 y CD23; CD22 y CD33; CD22 y CD74; CD22 y CD19; CD22 y DR5; CD22 y DR4; CD22 y VEGF; CD22 y CD52; CD30 y CD20; CD30 y CD22; CD30 y CD23; CD30 y CD40; CD30 y VEGF; CD30 y CD74; CD30 y CD19; CD30 y DR5; CD30 y DR4; CD30 y VEGFR2; CD30 y CD52; CD30 y CD4; CD138 y RANKL; CD33 y FTL3; CD33 y VEGF; CD33 y VEGFR2; CD33 y CD44; CD33 y DR4; CD33 y DR5; DR4 y CD137; DR4 e IGF1,2; DR4 e IGF1R; DR4 y DR5; DR5 y CD40; DR5 y CD137; DR5 y CD20; DR5 y EGFR; DR5 e IGF1,2; DR5 e IGFR, DR5 y HER-2, y EGFR y DLL4. Otras combinaciones de dianas incluyen uno o más miembros de la familia EGF/erb-2/erb-3.

Otras dianas (una o más) implicadas en las enfermedades oncológicas a las que pueden unirse las inmunoglobulinas del presente documento incluyen, entre otras, las seleccionadas del grupo que consiste en: CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, ILIA, IL1B, 1L2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, 1L2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1R, IL2, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENO1, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NROB1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR112, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6 pl, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, 1L2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROBO2, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB21P, DES, DNCL1, ELAC2, ENO2, ENO3, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33 pl, SLC43 pl, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB 1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB 1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL1A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-caderina), CDKN1B (p27Kip1), CDKN2A (p161NK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-catenina), CTSB (catepsina B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (Gelsolina), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (glicoproteina 130), ITGA6 (a6 integrina), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (GF), NGFR, NME1 (M23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (maspina), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (trombospondina-1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), To p2a (topoisomerasa Iia), TP53, AZGP1 (zinc-a-glicoproteina), BPAG¹(plectina), CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CLDN7 (claudina-7), CLU (clusterina), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (fibronectina), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (a6 integrina), ITGB4 (b 4 integrina), KLF5 (GC Box BP), KRT19 (Queratina 19), KRTHB6 (queratina tipo II específica del pelo), MACMa Rc KS, MT3 (metalotionectina-III), MUC1 (mucina), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mammaglobina 2), SCGB2A2 (mammaglobina 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, y TNFAIP2 (B94), RON, c-Met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, fosfatidilserina, ROBO4, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD80, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFR1, MTSP1, MSP, EPHB2, EPHA1, EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA, MAPG, FLT3, PDGFR alfa, PDGFR beta, ROR1, PSMA, PSCA, SCD1, y CD59. Para formar los anticuerpos biespecíficos o triespecíficos de la invención, pueden prepararse anticuerpos contra cualquier combinación de estos antígenos; es decir, cada uno de estos antígenos puede incluirse o excluirse opcional e independientemente de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención.

La terapia con anticuerpos monoclonales se convierte en una modalidad terapéutica importante para el tratamiento de los trastornos autoinmunitarios e inflamatorios (Chan y Carter, 2010, Nature Reviews Immunology 10:301-316; Reichert y otros, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1073-1078). Muchas proteínas estás implicadas en las respuestas autoinmunes e inflamatorias generales y, por tanto, pueden ser el blanco de las inmunoglobulinas de la invención. Las dianas autoimmunitarias e inflamatorias incluyen pero no se limitan al C5, CCL1 (1-309), CCL11 (eotaxina), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (1-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, ILIA, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (citocina activadora de Monocitos endoteliales), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVRIB, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, ILIA, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL12RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFB1, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2 y RNF110 (ZNF144). Para formar los anticuerpos biespecíficos o triespecíficos de la invención, pueden prepararse anticuerpos contra cualquier combinación de estos antígenos; es decir, cada uno de estos antígenos puede incluirse o excluirse opcional e independientemente de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención.

Algunas codianas de los ejemplos para los trastornos autoinmunes e inflamatorios incluyen, pero no se limitan a, la IL-1 y TNFalfa, IL-6 y TNF alfa, IL-6 e IL-1, IgE e IL-13, IL-1 e IL-13, IL-4 e IL-13, IL-5 e IL-13, IL-9 e IL-13, CD19 y FcyRIIb, y CD79 y FcyRIIb.

Se contemplan las inmunoglobulinas de la invención con especificidad para los siguientes pares de dianas para tratar las enfermedades inflamatorias: TNF e IL-17A; TNF y RANKL; TNF y VEGF; TNF y SOST; TNF y DKK; TNF y alphaVbeta3; TNF y NGF; TNF y IL-23p19; TNF e IL-6; TNF y SOST; TNF e IL-6R; TNF y CD-20; IgE e IL-13; IL-13 e IL23p19; IgE e IL-4; IgE e IL-9; IgE e IL-9; IgE e IL-13; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-23p19; IL-13 e IL-9; IL-6R y VEGF; IL-6R e IL-17A; IL-6R y RANKL; IL-17A e IL-1beta; IL-1beta y RANKL; IL-1beta y VEGF; RANKL y CD-20; IL-1 alfa e IL-1beta; IL-1 alfa e IL-1 beta.

Pueden determinarse algunos pares de dianas a los cuales las inmunoglobulinas descritas en el presente documento pueden unirse y ser útiles para tratar el asma. En una modalidad, tales dianas incluyen, pero no se limitan a, IL-13 e IL-1beta, ya que la IL-1beta también está implicada en la respuesta inflamatoria en el asma; la IL-13 y citocinas y quimiocinas involucradas en la inflamación, como la IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-p; IL-13 y agonista de LHR; IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; e IL-13 y ADAM8. Las inmunoglobulinas en el presente documento pueden tener especificidad por una o más dianas involucradas en el asma seleccionadas del grupo que consiste en el CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, histamina y receptores de histaminas, ILIA, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCLi, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24, CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCLi, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNF, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, y Quitinasa. Para formar los anticuerpos biespecíficos o triespecíficos de la invención, pueden prepararse anticuerpos contra cualquier combinación de estos antígenos; es decir, cada uno de estos antígenos puede incluirse o excluirse opcional e independientemente de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención.

Los pares de dianas implicados en la artritis reumatoide (AR) pueden correconocidos por la invención, los cuales incluyen, pero no se limitan al TNF e IL-18; TNF e IL-12; TNF e IL-23; TNF e IL-1beta; TNF y MIF; TNF e IL-17; y TNF e IL-15.

Los antígenos que pueden ser reconocidos por las inmunoglobulinas de la presente descripción, para tratar el lupus eritematoso sistémico (SLE) incluyen, entre otros, el CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, ^cD80, HLA-DRA, IL10, I^l2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGSI, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, ILIR2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GALI, CDIC, CHSTIO, HLA-A, HLA-DRA, y NT5E.; CTLA4, B7.1, B7.2, BlyS, BAFF, C5, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a, y TNF-a. Para formar los anticuerpos biespecíficos o triespecíficos de la invención, pueden prepararse anticuerpos contra cualquier combinación de estos antígenos; es decir, cada uno de estos antígenos puede incluirse o excluirse opcional e independientemente de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención. Las inmunoglobulinas de la presente descripción pueden dirigirse a antígenos para el tratamiento de la esclerosis múltiple (MS), que incluyen, pero no se limitan a, la IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFNgamma, GM-CSF, FGF, C5, CD52 y CCR2. Una modalidad incluye el acoplamiento conjunto de un anti-IL-12 y TWEAK para el tratamiento de la MS.

Un aspecto de la descripción se refiere a las inmunoglobulinas capaces de unirse a una o más dianas implicadas en la sepsis, en una modalidad dos dianas, seleccionadas del grupo que consiste en el TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, los receptores de tipo Toll, TLR-4, el factor tisular, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-1B, NF^kB I, PROC, TNFRSFIA, CSF3, CCR3, ILIRN, MIF, NP^kBI, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, midkina, IRAK1, NFkB2, SERPINA1, SERPINE1, y TREMI. Para formar los anticuerpos biespecíficos o triespecíficos, pueden prepararse anticuerpos contra cualquier combinación de estos antígenos; es decir, cada uno de estos antígenos puede incluirse o excluirse opcional e independientemente de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención.

En algunos casos, las inmunoglobulinas de la presente descripción pueden dirigirse contra antígenos para el tratamiento de enfermedades infecciosas.

Dominios de unión al antígeno

Como apreciarán los expertos en la técnica, existen dos tipos básicos de dominios de unión a antígenos, los que se asemejan a los dominios de unión a antígenos de los anticuerpos (por ejemplo, que comprenden un conjunto de 6 CDR) y los que pueden ser ligandos o receptores, por ejemplo, que se unen a dianas sin el uso de CDR.

Anticuerpos modificados

Además de las modificaciones descritas anteriormente, pueden realizarse otras modificaciones. Por ejemplo, las moléculas pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter y otros, 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245, incorporado por referencia en su totalidad). Además, hay una variedad de modificaciones covalentes de anticuerpos que pueden prepararse como se describe a continuación. Las modificaciones covalentes de los anticuerpos se incluyen dentro del alcance de la invención, y generalmente, pero no siempre, se realizan después de la traducción. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula al hacer reaccionar los residuos de aminoácidos específicos del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C- terminales.

Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para dar como resultado derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también pueden derivarse por una reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de 2-piridilo de metilo, disulfuro de p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol y similares.

Además, las modificaciones en las cisteínas son particularmente útiles en las aplicaciones del conjugado anticuerpofármaco (ADC), que se describen con más detalle a continuación. En algunas modalidades, la región constante de los anticuerpos puede diseñarse para que contenga una o más cisteínas que sean particularmente "reactivas al tiol", para permitir una colocación más específica y controlada de la porción del fármaco. Ver por ejemplo la Patente de Estados Unidos No. 7,521,541, incorporada por referencia en su totalidad en el presente documento.

Los residuos de histidilo se derivatizan por la reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de parabromofenacilo; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinilo y amino terminales se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar los residuos que contienen alfa-amino incluyen los imidoésteres tales como el picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y la reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.

Los residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos el fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

Puede realizarse la modificación específica de los residuos de tirosilo, con particular interés en la introducción de marcadores espectrales en los residuos de tirosilo mediante la reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan mediante el uso de 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayo, y es adecuado el método de la cloramina T descrito anteriormente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N--R'), donde R y R' son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como la 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o la 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo por la reacción con iones de amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para entrecruzar anticuerpos con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en una variedad de métodos, además de los métodos descritos a continuación. Los agentes de entrecruzamiento comúnmente usados incluyen, por ejemplo, el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen los ésteres de disuccinimidilo como el 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como el bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizantes tales como metil-3-[(p-azidofenil) ditio] propioimidato producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar un entrecruzamiento en presencia de luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua reactivas tales como los carbohidratos activados con bromuro y los sustratos reactivos descritos en los documentos Patente de Estados Unidos No. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440, todos incorporados en su totalidad como referencia, se emplean para la inmovilización de las proteínas.

Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan con frecuencia a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquiera de las formas de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de la prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de la lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman y Co., San Francisco, pp. 79-86[1983], en su totalidad), la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Además, como apreciarán los expertos en la técnica, pueden añadirse marcadores (que incluyen fluorescentes, enzimáticos, magnéticos, radiactivos, etc.) a los anticuerpos (así como a las otras composiciones de la invención).

Glicosilación

Otro tipo de modificación covalente son las alteraciones en la glicosilación. En otra modalidad, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden modificarse para incluir una o más glicoformas modificadas genéticamente. Por "glicoforma modificada", como se usa en el presente documento, se entiende una composición de carbohidrato que está unida covalentemente a un anticuerpo, en donde dicha composición de carbohidrato difiere químicamente de la de un anticuerpo original. Las glicoformas modificadas genéticamente pueden ser útiles para una variedad de propósitos, que incluyen, pero no se limitan a mejorar o reducir la función efectora. Una forma preferente de glicoforma modificada es la afucosilación, que se demostró que está correlacionada con un aumento en la función de ADCC, presumiblemente a través de una unión más estrecha al receptor FcYRIIIa. En este contexto, la "afucosilación" significa que la mayoría del anticuerpo producido en las células hospederas está sustancialmente desprovisto de fucosa, por ejemplo, el 90-95-98 % de los anticuerpos generados no tiene fucosa apreciable como un componente de la porción de carbohidrato del anticuerpo (generalmente unido a N297 en la región Fc). Definidos funcionalmente, los anticuerpos afucosilados generalmente exhiben al menos un 50 % o más de afinidad por el receptor FcyRIIIa.

Una variedad de métodos bien conocidos en la técnica pueden generar las glicoformas modificadas (Umaña y otros, 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Daviesy otros, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields y otros, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa y otros, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; el documento US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1; (Potelligent® technology[Biowa, Inc., Princeton, NJ]; tecnología de ingeniería de glicosilación GlycoMAb® [Glycart Biotechnology AG, Zürich, Suiza]). Muchas de técnicas se basan en controlar el nivel de oligosacáridos fucosilados y/o bisectados que se unen covalentemente a la región Fc, por ejemplo, al expresar una IgG en varios organismos o líneas celulares, modificadas por ingeniería genética o de otro tipo (por ejemplo, células CHO de Lec-13 o las células hibridomas de rata YB2/0), al regular las enzimas involucradas en la vía de glicosilación (por ejemplo FUT8[a1,6-fucosiltranserasa]) y/o p1-4-N-acetilglucosaminiltransferasa NI[GnTNI]), o al modificar los carbohidratos después de la expresión de la IgG. Por ejemplo, el "anticuerpo modificado con azúcar" o la "tecnología SEA" de Seattle Genetics funciona mediante la adición de sacáridos modificados que inhiben la fucosilación durante la producción; ver por ejemplo el documento 20090317869

La glicoforma modificada se refiere típicamente a los diferentes carbohidratos u oligosacáridos; por tanto, un anticuerpo puede incluir una glicoforma modificada por ingeniería genética.

Alternativamente, la glicoforma modificada puede referirse a la variante de IgG que comprende los diferentes carbohidratos u oligosacáridos. Como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácidos de glicosilación particulares, discutidos a continuación) como de la célula u organismo hospedera en el que se produce la proteína. Los sistemas de expresión particulares se analizan a continuación.

La glicosilación de los polipéptidos es típicamente unida a N- o bien a O-. Ligado a N- se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de los tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, más comúnmente la serina o treonina, aunque también puede usarse la 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente al alterar la secuencia de los aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida (para los sitios de glicosilación ligados a O). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se altera preferentemente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente al mutar el ADN que codifica el polipéptido diana en las bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio para aumentar el número de porciones de carbohidratos en el anticuerpo es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula hospedera que tiene capacidades de glicosilación para la glicosilación ligada a N y O. En dependencia del modo de acoplamiento utilizado, los azúcares pueden unirse a (a) la arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.

La eliminación de las porciones de carbohidratos presentes en el anticuerpo de partida (por ejemplo, postraduccionalmente) puede realizarse de forma química o enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o de todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja intacto el polipéptido. La desglicosilación química se describe mediante Hakimuddin y otros, 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 y por Edge y otros, 1981, Anal. Biochem. 118:131 La escisión enzimática de las porciones de los carbohidratos en los polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo y exoglicosidasas como se describe en Thotakura y otros, 1987, Meth. Enzymol. 138: 350, totalmente incorporado por referencia. La glicosilación en los sitios potenciales de glicosilación puede prevenirse mediante el uso del compuesto tunicamicina como se describe por Duskin y otros, 1982, J. Biol. Chem. 257:3105 La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glucósido.

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende unir el anticuerpo a varios polímeros no proteicos, que incluyen, pero no se limitan a, varios polioles como el polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida, por ejemplo, en el Catálogo de Nektar Therapeutics PEG 2005-2006 (disponible en el sitio web de Nektar) Patentes de Estados Unidos 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. Además, como se conoce en la técnica, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos en varias posiciones dentro del anticuerpo para facilitar la adición de los polímeros tales como el PEG. Ver, por ejemplo, la Publicación de Estados Unidos No. 2005/0114037A1.

Variantes de Fc adicionales para una funcionalidad adicional

Además de las variantes de aminoácidos de pI, hay una serie de modificaciones útiles de aminoácidos de Fc que pueden realizarse por una variedad de razones, que incluyen, pero no se limitan a, la alteración de la unión a uno o más receptores FcyR, la unión alterada a los receptores FcRn, etc.

Por consiguiente, las proteínas de la invención pueden incluir modificaciones de aminoácidos, que incluyen las variantes de heterodimerización descritas en el presente documento, que incluyen las variantes de pI y las variantes estéricas. Cada conjunto de variantes puede incluirse o excluirse de forma independiente y opcional de cualquier proteína heterodimérica particular. Variantes de FcyR

Por consiguiente, hay varias sustituciones de Fc útiles que pueden realizarse para alterar la unión a uno o más de los receptores F^cyR. Pueden ser útiles las sustituciones que dan como resultado un aumento de la unión, así como una disminución de la unión. Por ejemplo, se sabe que el aumento de la unión a Fc RIIIa generalmente da como resultado un aumento de la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos; la reacción mediada por células en la que las células citotóxicas inespecíficas que expresan los F^cyR reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana). De manera similar, la disminución de la unión a FcyRIIb (un receptor inhibidor) también puede ser beneficiosa en algunas circunstancias. Las sustituciones de aminoácidos que encuentran un uso en la presente invención incluyen las enumeradas en el documento USSN 11/124,620 (particularmente la Figura 41), 11/174,287, 11/396,495, 11/538,406. Las variantes particulares que encuentran un uso incluyen, entre otras, 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 243A, 243L, 264A, 264V y 299T.

Además, hay sustituciones de Fc adicionales que se utilizan para aumentar la unión al receptor de FcRn y aumentar la vida media en el suero, como se describe específicamente en el documento USSN 12/341,769, que incluyen, pero no se limitan a, 434S, 434A, 428L, 308F, 2591, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 4361 o V/434S, 436V/428L y 259I/308F/428L.

Conectores

La presente invención opcionalmente proporciona conectores como sea necesario, por ejemplo, en la adición de sitios de unión a antígeno adicionales, como se muestra, por ejemplo, en la Figura 2, donde "el otro extremo" de la molécula contiene los componentes de unión al antígeno adicionales. Además, como se describe a continuación, los conectores también se utilizan opcionalmente en los sistemas de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC). Cuando se usa para unir los componentes de las construcciones centrales de Ab-Fv, el conector es generalmente un polipéptido que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y se usa para unir uno o más de los componentes de la presente invención. Dichos polipéptidos conectores se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Holliger, P., y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., y otros (1994) Structure 2:1121-1123). Una variedad de conectores puede encontrar un uso en algunas modalidades descritas en el presente documento. Como apreciarán los expertos en la técnica, existen al menos tres tipos de conectores diferentes usados en la presente invención.

En el presente documento, "conector" también se denomina "secuencia conectora", "espaciador", "secuencia de unión" o equivalentes gramaticales de los mismos. Los conectores homo- o heterobifuncionales son bien conocidos (véase el catálogo de Pierce Chemical Company 1994, sección técnica sobre agentes de reticulación, páginas 155 200). Igualmente, pueden usarse varias estrategias para unir covalentemente las moléculas entre sí. Estos incluyen, pero no se limitan a, los enlaces polipeptídicos entre los extremos N- y C- de las proteínas o dominios de proteínas, la unión a través de los enlaces disulfuro y los enlaces a través de los reactivos de entrecruzamiento químico. En un aspecto de esta modalidad, el conector es un enlace peptídico, generado por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. El péptido conector puede incluir predominantemente los siguientes residuos de aminoácidos: Gly, Ser, Ala o Thr. El péptido conector debe tener una longitud adecuada para unir dos moléculas de tal manera que asuman la conformación correcta entre sí para que conserven la actividad deseada. En una modalidad, el conector tiene una longitud de aproximadamente 1 a 50 aminoácidos, por ejemplo, un conector puede tener una longitud de 1 a 30 aminoácidos. En una modalidad, pueden usarse conectores de 1 a 20 aminoácidos de longitud. Los conectores útiles incluyen polímeros de glicina-serina, que incluyen, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n y (GGGS)n, donde n es un número entero de al menos uno, polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros conectores flexibles. Alternativamente, una variedad de polímeros no proteicos, que incluyen, pero no se limitan al polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, pueden utilizarse como conectores.

Otras secuencias conectoras pueden incluir cualquier secuencia de cualquier longitud del dominio CL/CH1, pero no todos los residuos del dominio CL/CH1; por ejemplo, los primeros 5-12 residuos de aminoácidos de los dominios CL/CH1. Los conectores pueden derivarse de la cadena ligera de inmunoglobulina, por ejemplo, Ck o CA. Los conectores pueden derivarse de las cadenas pesadas de inmunoglobulina de cualquier isotipo, que incluye, por ejemplo, Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Cal, Ca2, Có, Cs y Cp. Las secuencias conectoras también pueden derivarse de otras proteínas tales como las proteínas similares a Ig (por ejemplo, TCR, FcR, KIR), secuencias derivadas de la región bisagra y otras secuencias naturales de otras proteínas.

Conjugados anticuerpo-fármaco

En algunas modalidades, los anticuerpos multiespecíficos de la invención se conjugan con fármacos para formar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). En general, los ADC se utilizan en aplicaciones oncológicas, donde el uso de los conjugados de anticuerpo-fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos permite la administración dirigida de la porción del fármaco a los tumores, lo cual puede permitir una mayor eficacia, menor toxicidad, etc. Se proporciona una descripción general de esta tecnología en Ducry y otros, Bioconjugate Chem., 21: 5- 13 (2010), Carter y otros, Cancer J. 14 (3): 154 (2008) y Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13: 235-244 (2009).

Por tanto, la invención proporciona anticuerpos multiespecíficos conjugados a fármacos. Generalmente, la conjugación se realiza mediante la unión covalente al anticuerpo, como se describe más adelante, y generalmente se basa en un conector, a menudo un enlace peptídico (que, como se describe a continuación, puede diseñarse para ser sensible a la escisión por proteasas en el sitio diana o no). Además, como se describió anteriormente, la unión de la unidad conector-fármaco (LU-D) puede realizarse mediante la unión a cisteínas dentro del anticuerpo. Como apreciarán los expertos en la técnica, el número de porciones de fármaco por anticuerpo puede cambiar, en dependencia de las condiciones de la reacción, y puede variar de 1: 1 a 10: 1, de la proporción fármaco: anticuerpo. Como apreciarán los expertos en la técnica, el número real es un promedio.

Por tanto, la invención proporciona anticuerpos multiespecíficos conjugados a fármacos. Como se describe a continuación, el fármaco del ADC puede ser cualquier número de agentes, que incluyen, pero no se limitan a, los agentes citotóxicos tales como los agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen de bacterias, hongos, plantas o animales, o fragmentos del mismo), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado), que se proporcionan. En otras modalidades, la invención proporciona además métodos para usar los ADC.

Los fármacos para su uso en la presente invención incluyen los fármacos citotóxicos, particularmente aquellos que se utilizan para la terapia del cáncer. Dichos fármacos incluyen, en general, los agentes que dañan el a Dn , antimetabolitos, productos naturales y sus análogos. Las clases de agentes citotóxicos de ejemplo incluyen los inhibidores de enzimas tales como los inhibidores de la dihidrofolato reductasa e inhibidores de la timidilato sintasa, intercaladores de ADN, escindidores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, la familia de fármacos de antraciclina, los fármacos vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, la familia de fármacos de la pteridina, diinenos, podofilotoxinas, dolastatinas, maitansinoides, inductores de la diferenciación y taxoles.

Los miembros de estas clases incluyen, por ejemplo, el metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6- mercaptopurina, citosina arabinósido, melfalán, leurosina, leurosideína, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina C, mitomicina A, caminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina y derivados de la podofilotoxina, como el etopósido o fosfato de etopósido, vinblastina, vincristina, vindesina, taxanos que incluyen el taxol, el ácido retinoico taxotero, el ácido butírico, N8-acetil espermidina, camptotecina, calicheamicina, esperamicina, enediynos, duocarmicina A, duocarmicina SA, calicheamicina, camptotecina, maitansinoides (que incluye DM1), monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF), and maitansinoides (DM4) y sus análogos.

Las toxinas pueden usarse como conjugados de anticuerpo-toxina e incluyen toxinas bacterianas como la toxina de la difteria, toxinas de plantas como la ricina, toxinas de moléculas pequeñas como la geldanamicina (Mandler y otros (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler y otros (2000) Bioorganic y Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler y otros (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu y otros, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y calicheamicina (Lode y otros (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman y otros (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión a la tubulina, la unión al ADN o la inhibición de la topoisomerasa.

Se contemplan conjugados de un anticuerpo multiespecífico y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como los maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, tricoteceno, calicheamicina y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.

Maitansinoides

Los compuestos de maitansina adecuados para su uso como restos de fármacos maitansinoides se conocen bien en la técnica y pueden aislarse de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos, producidos mediante el uso de técnicas de ingeniería genética (ver Yu y otros (2002) PNAS 99:7968-7973), o maitansinol y análogos de maitansinol preparados sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos. Como se describe a continuación, los fármacos pueden modificarse mediante la incorporación de un grupo funcionalmente activo, como un grupo tiol o amina, para la conjugación con el anticuerpo.

Ejemplos de restos de fármacos maitansinoides incluyen los que tienen un anillo aromático modificado, como: C-19-decloro (Patente de EE.UU. No. 4,256,746) (preparado por reducción con hidruro de litio y aluminio, de ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-desmetil) /- C-19-decloro (Patente de Estados Unidos No. 4,361,650 y 4,307,016) (preparado por desmetilación mediante el uso de Streptomyces o Actinomyces o decloración mediante el uso de LAH); y C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (--OCOR), /- decloro (Patente de Estados Unidos No. 4,294,757) (preparado por acilación mediante el uso de cloruros de acilo) y los que tienen modificaciones en otras posiciones

Las porciones de fármacos maitansinoides de los ejemplos también incluyen aquellos que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (Patente de Estados Unidos No. 4,424,219) (preparado por reacción de maitansinol con H2S o P2S5); C-14-alcoximetilo(demetoxi/CH2OR) (Patente de Estados Unidos No. 4,331,598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (Patente de Estados Unidos No. 4,450,254) (preparado a partir de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (Patente de Estados Unidos No. 4,364,866) (preparado mediante la conversión de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (Patente de Estados Unidos No. 4,313,946 y 4,315,929) (aislado de Trewia nudlflora); C-¹⁸-N-desmetil (Patente de Estados Unidos No. 4,362,663 y 4,322,348) (preparado por desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y 4,5-desoxi (Patente de Estados Unidos No. 4,371,533) (preparado por la reducción de maitansinol con tricloruro de titanio/LAH).

De particular uso son los DM1 (descritos en la Patente de Estados Unidos No. 5,208,020) y DM4 (descrito en la Patente de Estados Unidos No. 7,276,497). Véase también una serie de métodos y derivados de maitansinoides adicionales en los documentos 5,416,064, WO/01/24763, 7,303,749, 7,601,354, USSN 12/631,508, WO02/098883, 6,441,163, 7,368,565, WO02/16368 y WO04/1033272

Los ADC que contienen maitansinoides, los métodos para producirlos y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 5,208,020; 5,416,064; 6,441,163 y la Patente Europea EP 0425235 B1 Liu y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describieron los ADC que comprenden un maitansinoide denominado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico para las células de cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo.

Chari y otros, Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen un ADC en el que un maitansinoide se conjugó mediante un conector disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en las líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansonoide se probó in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, la cual expresa 3x105 antígenos de superficie de HER-2 por célula. El fármaco conjugado alcanzó un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría incrementarse al aumentar el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una baja citotoxicidad sistémica en ratones.

Auristatinas y Dolastatinas

En algunas modalidades, el ADC comprende un anticuerpo multiespecífico conjugado a dolastatinas o análogos y derivados peptídicos de dolostatina, las auristatinas (Patente de Estados Unidos No. 5,635,483; 5,780,588). Se demostró que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis del GTP y la división nuclear y celular (Woyke y otros (2001) Antimicrob. Agents y Chemother. 45(12):3580-3584) y tiene actividad anticancerígena (Patente de Estados Unidos No. 5,663,149) y antifúngica (Pettit y otros (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965). La porción del fármaco dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del extremo N (amino) o el extremo C (carboxilo) de la porción del fármaco peptídico (WO 02/088172).

Las modalidades de ejemplo de auristatina incluyen las porciones DE y DF del fármaco monometilauristatina unidas al extremo N, descritos en "Senter y otros, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volumen 45, Resumen Número 623, presentado el 28 de marzo de 2004 y descrito en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2005/0238648.

Una modalidad de ejemplo de auristatina es MMAE (ver la Patente de Estados Unidos No. 6,884,869).

Otra modalidad de ejemplo de auristatina es MMAF (ver US 2005/0238649, 5,767,237 y 6,124,431).

Las modalidades de ejemplo adicionales que comprenden MMAE o MMAF y varios componentes conectores (descritos más adelante en el presente documento) tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en las que Ab significa anticuerpo y la p es de ¹a aproximadamente ⁸):

Normalmente, las porciones de los fármacos basados en péptidos pueden prepararse al formar un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (ver E. Schroder y K. Lubke, "The Peptides", volumen 1, páginas. 76-136, 1965, Academic Press), que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Las porciones del fármaco auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos de: la Patente de Estados Unidos No. 5,635,483; la Patente de Estados Unidos No. 5,780,588; Pettit y otros (1989) J. Am. Chem. Soc.

111: 5463-5465; Pettit y otros (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G^ry otros, Synthesis, 1996, 719 725; Pettit y otros (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15: 859-863; y Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7): 778 784.

Calicheamicina

En otras modalidades, el ADC comprende un anticuerpo de la invención conjugado a una o más moléculas de calicheamicina. Por ejemplo, Mylotarg es el primer fármaco ADC comercial y utiliza calicheamicina y1 como carga útil (ver la Patente de los Estados Unidos No. 4,970,198,). Otros derivados de la calicheamicina se describen en las Patentes de Estados Unidos No. 5,264,586, 5,384,412, 5,550,246, 5,739,116, 5,773,001, 5,767,285 y 5,877,296. La familia de antibióticos de la calicheamicina es capaz de producir roturas en el ADN de doble cadena a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de las calicheamicinas, ver la Patente de Estados Unidos No. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todo a American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de la calicheamicina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, ^yH a2I, a2I, N-acetil-YlI, PSAG y 0I1 (Hinman y otros, Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode y otros, Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) y las patentes estadounidenses antes mencionadas de American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral con el que puede conjugarse el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto la calicheamicina como la QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por tanto, la captación celular de estos agentes a través de la interiorización mediada por anticuerpos mejora en gran medida sus efectos citotóxicos.

Duocarmicinas

El CC-1065 (ver 4,169,888) y las duocarmicinas son miembros de una familia de antibióticos antitumorales utilizados en los ADC. Estos antibióticos parecen funcionar mediante la alquilación selectiva de las secuencias de ADN en el N3 de la adenina en el surco menor, lo cual inicia una cascada de eventos que dan como resultado la apoptosis. Los miembros importantes de las duocarmicinas incluyen la duocarmicina A (Patente de Estados Unidos No.

4,923,990) y la duocarmicina SA (Patente de Estados Unidos No. 5,101,038), y un gran número de análogos como se describe en las Patentes de Estados Unidos No. 7,517,903, 7,691,962, 5,101,038; 5,641,780; 5,187,186; 5,070,092; 5,070,092; 5,641,780; 5,101,038; 5,084,468, 5,475,092, 5,585,499, 5,846,545, WO2007/089149, WO2009/017394A1, 5,703,080, 6,989,452, 7,087,600, 7,129,261, 7,498,302 y 7,507,420.

Otros agentes citotóxicos

Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos de la invención incluyen el BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como el complejo LL-E33288 descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5,053,394, 5,770,710, así como las esperamicinas (Patente de Estados Unidos No. 5,877,296).

Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no enlazantes de la toxina diftérica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Ver, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.

La presente invención contempla además un ADC formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa; DNasa). Para la eliminación selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Se encuentran disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Los radiomarcadores u otros marcadores pueden incorporarse en el conjugado de formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante la síntesis química de aminoácidos mediante el uso de precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, el flúor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores como Tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 pueden unirse mediante un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 puede unirse mediante un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker y otros (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 puede utilizarse para incorporar el yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.

Para las composiciones que comprenden una pluralidad de anticuerpos, la carga de fármaco está representada por p, el número medio de moléculas de fármaco por Anticuerpo. La carga de fármaco puede variar de 1 a 20 fármacos (D) por anticuerpo. El número medio de fármacos por anticuerpo en la preparación de las reacciones de conjugación puede caracterizarse por los medios convencionales tales como la espectroscopia de masas, el ensayo ELISA y el HPLC. También puede determinarse la distribución cuantitativa de los Conjugados de Anticuerpo-Fármaco en términos de p.

En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de los Conjugados de Anticuerpo-Fármaco homogéneos donde p es determinado valor a partir de los Conjugados de Anticuerpo-Fármaco con otras cargas de fármaco, puede lograrse por medios tales como la HPLC de fase inversa o la electroforesis. En las modalidades de ejemplo, p es 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 o una fracción de los mismos.

La generación de compuestos Conjugados de Anticuerpo-Fármaco puede lograrse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia. Brevemente, los compuestos Conjugados de Anticuerpo-Fármaco pueden incluir un anticuerpo multiespecífico como la unidad de anticuerpo, un fármaco y, opcionalmente, un conector que une el fármaco y el agente de unión.

Están disponibles varias reacciones diferentes para el acoplamiento covalente de los fármacos y/o conectores a los agentes de unión. Esto puede lograrse mediante la reacción de los residuos de aminoácidos del agente de unión, por ejemplo, la molécula de anticuerpo, que incluye los grupos amino de la lisina, los grupos de ácido carboxílico libre del ácido glutámico y aspártico, los grupos sulfhidrilo de la cisteína y las diversas porciones de los aminoácidos aromáticos. Un método no específico de unión covalente comúnmente utilizado es la reacción de carbodiimida para unir un grupo carboxi (o amino) de un compuesto a los grupos amino (o carboxi) del anticuerpo. Además, se emplean agentes bifuncionales tales como los dialdehídos o imidoésteres para unir el grupo amino de un compuesto a los grupos amino de una molécula de anticuerpo.

También está disponible para el acoplamiento de los fármacos a los agentes de unión, la reacción de base de Schiff. Este método implica la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene glicol o grupos hidroxi, lo cual forma un aldehído que luego se hace reaccionar con el agente de unión. El enlace se produce mediante la formación de una base de Schiff con los grupos amino del agente de unión. Los isotiocianatos también pueden usarse como agentes de acoplamiento para enlazar los fármacos de forma covalente a agentes de unión. El experto en la materia conoce otras técnicas y están dentro del alcance de la presente invención.

En algunas modalidades, un intermediario, que es el precursor del conector, se hace reaccionar con el fármaco en condiciones apropiadas. En otras modalidades, se usan grupos reactivos en el fármaco y/o el intermediario. El producto de la reacción entre el fármaco y el intermediario, o el fármaco derivatizado, se hace reaccionar posteriormente con un anticuerpo multiespecífico de la invención en condiciones apropiadas.

Se entenderá que también pueden realizarse modificaciones químicas al compuesto deseado con el fin de hacer que las reacciones de ese compuesto sean más convenientes para los propósitos de preparar los conjugados de la invención. Por ejemplo, un grupo funcional, dígase una amina, hidroxilo o sulfhidrilo, puede añadirse al fármaco en una posición que tenga un efecto mínimo o aceptable sobre la actividad u otras propiedades del fármaco.

Unidades conectoras del ADC

Normalmente, los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco comprenden una unidad conectora entre la unidad de fármaco y la unidad del anticuerpo. En algunas modalidades, el conector puede escindirse en condiciones intracelulares o extracelulares, de modo que la escisión del conector libera la unidad de fármaco del anticuerpo en el entorno apropiado. Por ejemplo, los tumores sólidos que secretan ciertas proteasas pueden servir como la diana del conector escindible; en otras modalidades, son las proteasas intracelulares las que se utilizan. En otras modalidades adicionales, la unidad conectora no puede escindirse y el fármaco se libera, por ejemplo, por la degradación de los anticuerpos en los lisosomas.

En algunas modalidades, el conector puede escindirse mediante un agente de escisión que está presente en el ambiente intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El conector puede ser, por ejemplo, un peptidil conector que es escindido por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, que incluye, pero no se limita a, una proteasa lisosómica o endosómica. En algunas modalidades, el conector peptidilo tiene al menos dos aminoácidos de largo o al menos tres aminoácidos de largo o más.

Los agentes de escisión pueden incluir, sin limitación, las catepsinas B y D, y la plasmina, todas las cuales son conocidas por hidrolizar los derivados de los fármacos dipéptidos, lo cual da como resultado la liberación de fármaco activo dentro de las células diana (ver, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Terapéutica 83:67-123). Los conectores de peptidilo que pueden escindirse mediante las enzimas presentes en las células que expresan CD38. Por ejemplo, puede utilizarse un conector peptidilo que puede escindirse por la proteasa catepsina-B dependiente de tiol, la cual se expresa en gran medida en el tejido canceroso (por ejemplo, un conector Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: X)). Otros ejemplos de tales conectores se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 6,214,345.

En algunas modalidades, el conector de peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un conector Val-Cit o un conector Phe-Lys (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 6,214,345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el conector val-cit).

En otras modalidades, el conector escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Normalmente, el conector sensible al pH se hidroliza en condiciones ácidas. Por ejemplo, puede usarse un conector lábil en ácido que sea hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similares). (Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville y otros, 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Dichos conectores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, como las de la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En determinadas modalidades, el conector hidrolizable es un conector tioéter (como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico mediante un enlace acilhidrazona (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No.

5,622,929).

En otras modalidades adicionales, el conector es escindible en condiciones reductoras (por ejemplo, un conector disulfuro). Se conocen en la técnica una variedad de conectores disulfuro, que incluyen, por ejemplo, los que pueden formarse al utilizar SATA (N-succinimidil-5-acetiltioacetato), SPDP (propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio)), SPDB (butirato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio)) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-d itio) tolueno)-, SPDB y SMPT. (Ver, por ejemplo, Thorpe y otros, 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak y otros, En Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (CW Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Ver también la Patente de Estados Unidos No. 4,880,935.)

En otras modalidades, el conector es un conector malonato (Johnson y otros, 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un conector maleimidobenzoilo (Lau y otros, 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), o un análogo de 3'-N-amida (Lau y otros, 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).

En otras modalidades adicionales, la unidad conectora no es escindible y el fármaco se libera por la degradación del anticuerpo. (Ver la Publicación de Estados Unidos No. 2005/0238649).

En muchas modalidades, el conector es autoinmolativo. Como se usa en el presente documento, el término "Espaciador autoinmolativo" se refiere a una porción química bifuncional que es capaz de unir covalentemente dos porciones químicas espaciadas en una molécula tripartita estable. La misma se separará espontáneamente de la segunda porción química si se escinde su enlace con la primera porción. Ver, por ejemplo, los documentos WO 2007059404A2, WO06110476A2, WO05112919A2, WO2010/062171, WO09/017394, WO07/089149, WO 07/018431, WO04/043493 y WO02/083180, que están dirigidos a los conjugados de sustrato con el fármaco escindible, donde el fármaco y el sustrato escindible están opcionalmente unidos a través de un conector autoinmolativo.

A menudo, el conector no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular. Como se usa en el presente documento, "no sustancialmente sensible al ambiente extracelular", en el contexto de un conector, significa que no más de aproximadamente un 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 3 % o no más de aproximadamente el 1 % de los conectores, en una muestra de compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco, se escinden cuando el compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco se presenta en un ambiente extracelular (por ejemplo, en el plasma).

Adicionalmente, puede determinarse si un conector no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular, por ejemplo, al incubar con el plasma el compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco durante un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, ⁸, 16 o 24 horas) y luego determinar la cantidad de fármaco libre presente en el plasma.

En otras modalidades no excluyentes entre sí, el conector promueve la internalización celular. En determinadas modalidades, el conector promueve la internalización celular cuando se conjuga con el agente terapéutico (es decir, en el medio de la porción conector-agente terapéutico del compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco, como se describe en el presente documento). En otras modalidades adicionales, el conector promueve la internalización celular cuando se conjuga tanto con el compuesto de auristatina como con los anticuerpos multiespecíficos de la invención.

Una variedad de conectores de ejemplo que pueden usarse con las presentes composiciones y métodos se describen en los documentos WO 2004-010957, Publicación de los Estados Unidos No. 2006/0074008, Publicación de Estados Unidos No. 20050238649, y la Publicación de Estados Unidos No. 2006/0024317.

Carga de fármacos

La carga del fármaco está representada por p y es el número medio de porciones de fármaco por anticuerpo en una molécula. La carga de fármaco ("p") puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más porciones (D) por anticuerpo, aunque con frecuencia el número medio es una fracción o un decimal. Generalmente, la carga del fármaco de 1 a 4 es con frecuencia útil, y también es útil de 1 a 2. Los ADC de la invención incluyen las colecciones de anticuerpos conjugados con una variedad de porciones de fármacos, de ¹a 20. El número medio de porciones de fármaco por anticuerpo en las preparaciones de ADC a partir de las reacciones de conjugación puede caracterizarse por los medios convencionales, tales como la espectroscopia de masas y el ensayo de ELISA.

También puede determinarse la distribución cuantitativa de ADC en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de los ADC homogéneos donde p es un determinado valor de ADC con otras cargas de fármaco, puede lograrse por los medios tales como la electroforesis.

Para algunos conjugados de anticuerpo-fármaco, p puede estar limitada por el número de sitios de acoplamiento en el anticuerpo. Por ejemplo, cuando el acoplamiento es un tiol de cisteína, como en las modalidades de ejemplo anteriores, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos tiol de cisteína, o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales puede unirse un conector. En determinadas modalidades, una mayor carga del fármaco, por ejemplo, p>5, puede provocar la agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de la permeabilidad celular de determinados conjugados de anticuerpo-fármaco. En determinadas modalidades, la carga del fármaco para un ADC de la invención varía de 1 a aproximadamente ⁸; de aproximadamente 2 a aproximadamente ⁶; de aproximadamente 3 a aproximadamente 5; de aproximadamente 3 a aproximadamente 4; de aproximadamente 3,1 a aproximadamente 3,9; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,8; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,7; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,6; de aproximadamente 3,3 a aproximadamente 3,8; o de aproximadamente 3,3 a aproximadamente 3,7. De hecho, se demostró que para determinados ADC, la proporción óptima de porciones de fármaco por anticuerpo puede ser menor de ⁸y puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. Ver el documento US 2005-0238649 A1.

En determinadas modalidades, menos del máximo teórico de las porciones de fármaco se conjugan con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, residuos de lisina que no reaccionan con el fármaco-conector intermediario o el reactivo conector, como se describe a continuación. Generalmente, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos, que puedan estar ligados a una porción de fármaco; de hecho, la mayoría de los residuos de tiol de cisteína en los anticuerpos existen como puentes disulfuro. En determinadas modalidades, un anticuerpo puede reducirse con un agente reductor como el ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP), en condiciones de reducción parcial o total, para generar los grupos tiol de cisteína reactivos. En determinadas modalidades, un anticuerpo se somete a condiciones de desnaturalización para revelar los grupos nucleofílicos reactivos tales como la lisina o cisteína.

La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de diferentes formas, por ejemplo: (i) al limitar el exceso molar del intermediario fármaco-conector o reactivo conector con respecto al anticuerpo, (ii) al limitar el tiempo de la reacción de conjugación o la temperatura, (iii) las condiciones reductoras parciales o limitantes para la modificación del tiol de cisteína, (iv) manipular mediante técnicas recombinantes la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de manera que el número y la posición de los residuos de cisteína se modifique para el control del número y/o posición de los acoplamientos del conector-fármaco (tales como thioMab o thioFab preparados como se describe en el presente documento y en el documento WO2006/03448).

Debe entenderse que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un reactivo conector o intermediario de fármaco-conector, seguido de un reactivo de la porción del fármaco, entonces el producto resultante es una mezcla de los compuestos ADC con una distribución de una o más porciones de fármaco unidas a un anticuerpo. El número medio de fármacos por anticuerpo puede calcularse a partir de la mezcla mediante un ensayo de anticuerpos ELISA doble, que es específico para el anticuerpo y específico para el fármaco. Las moléculas de ADC individuales pueden identificarse en la mezcla mediante la espectroscopía de masas y separarse mediante HPLC, por ejemplo, mediante una cromatografía de interacciones hidrofóbicas.

En algunas modalidades, un ADC homogéneo con un valor de carga único puede aislarse de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía.

Métodos para determinar el efecto citotóxico de los ADC

Se conocen los métodos para determinar si un fármaco o un Conjugado de Anticuerpo-Fármaco ejerce un efecto citostático y/o citotóxico sobre una célula. Generalmente, la actividad citotóxica o citostática de un Conjugado de Anticuerpo-Fármaco puede medirse mediante: la exposición de células de mamífero que expresan una proteína diana del Conjugado de Anticuerpo-Fármaco en un medio de cultivo celular; cultivar las células durante un período de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 días; y la medición de la viabilidad celular. Pueden usarse ensayos in vitro basados en células para medir la viabilidad (proliferación), la citotoxicidad y la inducción de apoptosis (activación de caspasa) del Conjugado de Anticuerpo-Fármaco.

Para determinar si un Conjugado de Anticuerpo-Fármaco ejerce un efecto citostático, puede usarse un ensayo de incorporación de timidina. Por ejemplo, las células cancerosas que expresan un antígeno diana a una densidad de 5000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos pueden cultivarse durante un período de 72 horas y exponerse a 0,5 pCi de 3H-timidina durante las 8 horas finales del período de 72 horas. La incorporación de 3H-timidina en las células del cultivo se mide en presencia y ausencia del Conjugado de Anticuerpo-Fármaco.

Para determinar la citotoxicidad, necrosis o apoptosis, puede medirse la necrosis o la apoptosis (muerte celular programada). La necrosis suele ir acompañada de una mayor permeabilidad de la membrana plasmática; hinchazón de la célula y ruptura de la membrana plasmática. La apoptosis se caracteriza típicamente por la formación de ampollas en la membrana, condensación del citoplasma y la activación de endonucleasas endógenas. La determinación de cualquiera de estos efectos sobre las células cancerosas indica que un Conjugado de Anticuerpo-Fármaco es útil en el tratamiento de cánceres.

La viabilidad celular puede medirse al determinar en una célula la absorción de un colorante como, por ejemplo, el rojo neutro, azul tripán o azul ALAMAR™ (ver, por ejemplo, Page y otros, 1993, Intl. J. Oncology 3: 473-476). En tal ensayo, las células se incuban en un medio que contiene el colorante, las células se lavan y el colorante restante, que refleja la captación celular del colorante, se mide espectrofotométricamente. El colorante de unión a las proteínas sulforrodamina B (SRB) también puede utilizarse para medir la citotoxicidad (Skehan y otros, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-12).

Alternativamente, se usa una sal de tetrazolio, como MTT, en un ensayo colorimétrico cuantitativo para la supervivencia y proliferación de las células de mamíferos mediante la detección de las células vivas, pero no muertas (ver, por ejemplo, Mosmann, 1983, J. Immunol. Métodos 65: 55-63).

La apoptosis puede cuantificarse al medir, por ejemplo, la fragmentación del ADN. Actualmente se encuentran disponibles los métodos fotométricos comerciales para la determinación cuantitativa in vitro de la fragmentación del ADN. Algunos ejemplos de tales ensayos, que incluyen el TUNEL (el cual detecta la incorporación de nucleótidos marcados en el ADN fragmentado) y los ensayos basados en el ELISA, se describen en Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).

La apoptosis también puede determinarse al medir los cambios morfológicos en una célula. Por ejemplo, como ocurre con la necrosis, la pérdida de la integridad de la membrana plasmática puede determinarse al medir la absorción de determinados colorantes (por ejemplo, un colorante fluorescente como, por ejemplo, el naranja de acridina o bromuro de etidio). Un método para medir el número de células apoptóticas ha sido descrito por Duke y Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan y otros, Eds., 1992, páginas 3.17.1-3.17.16). Las células también pueden marcarse con un colorante de ADN (por ejemplo, el naranja de acridina, bromuro de etidio o yoduro de propidio) y observar las células para determinar la condensación y la marginación de la cromatina a lo largo de la membrana nuclear interna. Otros cambios morfológicos que pueden medirse para determinar la apoptosis incluyen, por ejemplo, la condensación citoplasmática, el aumento de la formación de ampollas en la membrana y la contracción celular.

La presencia de células apoptóticas puede medirse tanto en el compartimento unido como en el "flotante" de los cultivos. Por ejemplo, ambos compartimentos pueden colectarse al eliminar el sobrenadante, tripsinizar las células unidas, combinar las preparaciones después de una etapa de lavado por centrifugación (por ejemplo, 10 minutos a 2000 rpm) y detectar la apoptosis (por ejemplo, al medir la fragmentación del ADN). (Ver, por ejemplo, Piazza y otros, 1995, Cancer Research 55: 3110-16).

In vivo, el efecto de una composición terapéutica del anticuerpo multiespecífico de la invención puede evaluarse en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, pueden usarse modelos de cáncer xenógeno, en los que se introducen explantes de cáncer o tejidos de xenoinjerto pasados en animales inmunocomprometidos, como los ratones desnudos o SCID (Klein y otros, 1997, Nature Medicine 3: 402-408). La eficacia puede medirse al usar los ensayos que miden la inhibición de la formación de tumores, la regresión o metástasis de los tumores y similares.

Las composiciones terapéuticas utilizadas en la práctica de los métodos anteriores pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el método de administración deseado. Los vehículos adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y generalmente no reacciona con el sistema inmunológico del paciente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de una serie de vehículos farmacéuticos estándar tales como las soluciones salinas tamponadas con fosfato estériles, agua bacteriostática y similares (ver, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980).

Composiciones de anticuerpos para la administración in vivo

Las formulaciones de los anticuerpos usados de acuerdo con la presente invención se preparan para el almacenamiento al mezclar un anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con los vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, citrato, acetato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (tales como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como el metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen la glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares tales como la sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteína- Zn); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (^pE^g).

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar anticuerpos con otras especificidades. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento y/o antagonista de molécula pequeña. Tales moléculas están presentes de forma adecuada en una combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ta edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones a usar para la administración in vivo pueden ser estériles o casi estériles. Esto se logra fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

Adicionalmente, pueden realizarse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, de películas o microcápsulas. Algunos ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli (alcohol vinílico)), polilactidas (Patente de Estados Unidos No.

3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato, etileno acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como el etileno acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan las proteínas durante períodos de tiempo más cortos.

Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37oC, lo que resulta en una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización en dependencia del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S--útil intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse al modificar los residuos de sulfhidrilo, realizar una liofilización a partir de las soluciones ácidas, controlar el contenido de humedad, utilizar los aditivos apropiados y desarrollar composiciones de matriz de polímeros específicos.

Modalidades administrativas

Los anticuerpos y agentes quimioterapéuticos de la invención se administran a un sujeto, de acuerdo con los métodos conocidos, tales como la administración intravenosa en forma de bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, vía intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. La administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo es de preferencia.

Modalidades de tratamiento

En los métodos de la invención, la terapia se usa para proporcionar una respuesta terapéutica positiva con respecto a una enfermedad o afección. Por "respuesta terapéutica positiva" se entiende una mejora de la enfermedad o afección y/o una mejora de los síntomas asociados a la enfermedad o afección. Por ejemplo, una respuesta terapéutica positiva se referiría a una o más de las siguientes mejoras en la enfermedad: (1) una reducción en el número de células neoplásicas; (2) un aumento de la muerte celular neoplásica; (3) inhibición de la supervivencia de las células neoplásicas; (5) inhibición (es decir, ralentizar hasta cierto punto, preferentemente detener) del crecimiento tumoral; (6) una mayor tasa de supervivencia del paciente; y (7) algún alivio de uno o más síntomas asociados a la enfermedad o afección.

Las respuestas terapéuticas positivas en cualquier enfermedad o afección dada pueden determinarse mediante los criterios de respuesta estandarizados específicos para esa enfermedad o afección. La respuesta del tumor puede evaluarse para detectar los cambios en la morfología del tumor (es decir, la carga tumoral general, el tamaño del tumor y similares) al utilizar técnicas de detección como la exploración por imágenes de resonancia magnética (MRI), la exploración por imágenes radiográficas, la tomografía computarizada (CT), la exploración ósea por imágenes, endoscopia y toma de muestras de biopsia tumoral, que incluye la aspiración de la médula ósea (BMA) y el recuento de células tumorales en la circulación.

Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto sometido a terapia puede experimentar el efecto beneficioso de una mejora en los síntomas asociados a la enfermedad.

Por tanto, para los tumores de células B, el sujeto puede experimentar una disminución de los denominados síntomas B, es decir, sudores nocturnos, fiebre, pérdida de peso y/o urticaria. Para afecciones premalignas, la terapia con un agente terapéutico multiespecífico puede bloquear y/o prolongar el tiempo antes del desarrollo de una afección maligna relacionada, por ejemplo, el desarrollo de mieloma múltiple en sujetos que padecen gammapatía monoclonal de significado indeterminado (GMSI).

Una mejora de la enfermedad puede caracterizarse como una respuesta completa. Por "respuesta completa" se entiende la ausencia de enfermedad clínicamente detectable con la normalización de cualquier estudio radiográfico previamente anormal, médula ósea y líquido cefalorraquídeo (LCR) o proteína monoclonal anormal en el caso del mieloma.

Tal respuesta puede persistir durante al menos 4 a 8 semanas, o algunas veces de 6 a 8 semanas, después del tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención. Alternativamente, una mejora en la enfermedad puede clasificarse como una respuesta parcial. Por "respuesta parcial" se entiende al menos una disminución del 50 % en toda la carga tumoral medible (es decir, el número de células malignas presentes en el sujeto, o el volumen medido de masas tumorales o la cantidad de proteína monoclonal anormal) en ausencia de nuevas lesiones, la cual pueden persistir de 4 a 8 semanas, o de 6 a 8 semanas.

El tratamiento de acuerdo con la presente invención incluye una "cantidad terapéuticamente efectiva" de los medicamentos utilizados. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado.

Una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de los medicamentos para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o la porción de anticuerpo.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" para la terapia tumoral también puede medirse por su capacidad para estabilizar la progresión de la enfermedad. La capacidad de un compuesto para inhibir el cáncer puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en los tumores humanos.

Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse al examinar la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular o para inducir la apoptosis mediante ensayos in vitro conocidos por el médico experto. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o mejorar de otro modo los síntomas en un sujeto. Un experto en la materia sería capaz de determinar tales cantidades en base a factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición particular o vía de administración seleccionada.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente de acuerdo con lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones parenterales pueden formularse en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en el presente documento, se refiere a las unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

La especificación de las formas unitarias de dosificación de la presente invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de combinar tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad de los individuos.

Las dosis eficientes y los regímenes de dosificación para los anticuerpos multiespecíficos usados en la presente invención dependen de la enfermedad o afección a tratar y pueden ser determinados por los expertos en la técnica. Un intervalo de ejemplo, no limitante para una cantidad terapéuticamente eficiente de un anticuerpo multiespecífico utilizado en la presente invención es aproximadamente de 0,1-100 mg/kg, tal como aproximadamente de 0,1-50 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente de 0,1-20 mg/kg, tal como aproximadamente de 0,1-10 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente de 0,5, aproximadamente tal como de 0,3, aproximadamente de 1 o aproximadamente de 3 mg/kg. En otra modalidad, el anticuerpo se administra en una dosis de 1 mg/kg o más, tal como una dosis de 1 a 20 mg/kg, por ejemplo, una dosis de 5 a 20 mg/kg, por ejemplo, una dosis de 8 mg/kg.

Un profesional médico que tenga una experiencia normal en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, un médico o un veterinario podría iniciar las dosis del medicamento empleado en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado.

En una modalidad, el anticuerpo multiespecífico se administra por infusión en una dosis semanal de 10 a 500 mg/kg, por ejemplo, de 200 a 400 mg/kg. Dicha administración puede repetirse, por ejemplo, de 1 a 8 veces, por ejemplo, de 3 a 5 veces. La administración puede realizarse mediante la infusión continua durante un período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas.

En una modalidad, el anticuerpo multiespecífico se administra mediante una infusión continua lenta durante un período prolongado, tal como más de 24 horas, si es necesario para reducir los efectos secundarios, que incluyen la toxicidad.

En una modalidad, el anticuerpo multiespecífico se administra en una dosis semanal de 250 mg a 2000 mg, tal como por ejemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg o 2000 mg, hasta 8 veces, tal como de 4 a 6 veces. La administración puede realizarse mediante la infusión continua durante un período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Dicho régimen puede repetirse una o más veces como sea necesario, por ejemplo, después de 6 meses o 12 meses. La dosis puede determinarse o ajustarse al medir la cantidad de compuesto de la presente invención en la sangre tras la administración, por ejemplo, al extraer una muestra biológica y utilizar los anticuerpos antiidiotípicos que se dirigen a la región de unión al antígeno del anticuerpo multiespecífico.

En una modalidad adicional, el anticuerpo multiespecífico se administra una vez a la semana durante 2 a 12 semanas, tal como durante 3 a 10 semanas, tal como durante 4 a 8 semanas.

En una modalidad, el anticuerpo multiespecífico se administra mediante una terapia de mantenimiento, tal como, por ejemplo, una vez a la semana durante un período de 6 meses o más.

En una modalidad, el anticuerpo multiespecífico se administra mediante un régimen que incluye una infusión de un anticuerpo multiespecífico seguida de una infusión de un anticuerpo multiespecífico conjugado a un radioisótopo. El régimen puede repetirse, por ejemplo, de 7 a 9 días después.

Como ejemplos no limitantes, el tratamiento de acuerdo con la presente invención puede proporcionarse como una dosis diaria de un anticuerpo en una cantidad de aproximadamente 0,1-100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en al menos uno de los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40, o alternativamente, al menos una de las semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 después del inicio del tratamiento, o cualquier combinación de los mismos, al utilizar dosis únicas o divididas de cada 24, 12, 8, 6, 4 o 2 horas, o cualquier combinación de las mismas.

En algunas modalidades, la molécula de anticuerpo multiespecífico de los mismos se usa en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, un agente quimioterapéutico. Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos que dañan el ADN incluyen los inhibidores de la topoisomerasa I (por ejemplo, irinotecán, topotecán, camptotecina y análogos o metabolitos de los mismos, y doxorrubicina); inhibidores de la topoisomerasa II (por ejemplo, etopósido, tenipósido y daunorrubicina); agentes alquilantes (por ejemplo, melfalán, clorambucilo, busulfán, tiotepa, ifosfamida, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, descarbazina, metotrexato, mitomicina C y ciclofosfamida); Intercaladores de ADN (por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino y carboplatino); Intercaladores de ADN y generadores de radicales libres tales como la bleomicina; y miméticos de nucleósidos (por ejemplo, el 5-fluorouracilo, capecitibina, gemcitabina, fludarabina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e hidroxiurea).

Los agentes quimioterapéuticos que alteran la replicación celular incluyen: el paclitaxel, docetaxel y análogos relacionados; vincristina, vinblastina y análogos relacionados; talidomida, lenalidomida y análogos relacionados (por ejemplo, el CC-5013 y CC-4047); inhibidores de la proteína tirosina quinasa (por ejemplo, el mesilato de imatinib y gefitinib); inhibidores del proteasoma (por ejemplo, bortezomib); Inhibidores de NF-kB, que incluye los inhibidores de IkB quinasa; anticuerpos que se unen a proteínas sobreexpresadas en los cánceres y, por lo tanto, regulan negativamente la replicación celular (por ejemplo, trastuzumab, rituximab, cetuximab y bevacizumab); y otros inhibidores de proteínas o enzimas que se sabe que se regulan en ascenso, se sobreexpresan o se activan en los cánceres, cuya inhibición regula en descenso la replicación celular.

En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se pueden usar antes, al mismo tiempo o después del tratamiento con Velcade® (bortezomib).

Ejemplos

A continuación, se proporcionan ejemplos para ilustrar la presente invención. Estos ejemplos no pretenden restringir la presente invención a cualquier aplicación particular o teoría de operación. Para todas las posiciones de las regiones constantes discutidas en la presente invención, la numeración se realiza de acuerdo con el índice de la UE como en Kabat (Kabat y otros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). Los expertos en la técnica de los anticuerpos apreciarán que esta convención consiste en una numeración no secuencial en regiones específicas de una secuencia de inmunoglobulina, lo que permite una referencia normalizada a las posiciones conservadas en las familias de inmunoglobulinas. Por consiguiente, las posiciones de cualquier inmunoglobulina determinada tal como se define por el índice EU no corresponderán necesariamente a su secuencia secuencial.

Ejemplo 1. Diseño de sustituciones de carga no nativas para reducir el pl

Las cadenas constantes de los anticuerpos se modificaron con un pI más bajo mediante sustituciones por ingeniería en los dominios constantes. El pI reducido puede modificarse mediante la modalidad de sustituciones de aminoácidos básicos (K o R) por aminoácidos ácidos (D o E), lo que da como resultado la mayor disminución del pI. Las mutaciones de los aminoácidos básicos en aminoácidos neutros y de aminoácidos neutros en aminoácidos ácidos también darán como resultado una disminución del pI. Adicionalmente, puede encontrarse una lista de valores de pK de aminoácidos en la Tabla 1 de Bjellqvist y otros, 1994, Electrophoresis 15: 529-539.

Elegimos explorar las sustituciones en las regiones CH1 (C^y1 ) y CL (Ckappa o CK) del anticuerpo (las secuencias se muestran en la Figura 13) porque, a diferencia de la región Fc, no interactúan con los ligandos nativos que afectan las propiedades farmacológicas del anticuerpo. Al decidir qué posiciones mutar, se tuvo en cuenta el ambiente circundante y el número de contactos que el aminoácido WT establece con sus vecinos para minimizar el impacto de una sustitución o conjunto de sustituciones en la estructura y/o la función. La accesibilidad al disolvente o la fracción expuesta de cada posición de CH1 y CK se calculó al utilizar las estructuras cristalinas relevantes de los dominios Fab del anticuerpo. Los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3 del documento USSN 13/648951 para C^y1 y CK respectivamente). El diseño se guió adicionalmente mediante el examen de los dominios CH1 y CL en busca de las posiciones isotípicas entre los isotipos de las inmunoglobulinas (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Debido a que tales variaciones ocurren naturalmente, se espera que tales posiciones sean susceptibles de sustitución. Sobre la base de este análisis, se identificaron varias sustituciones que reducen el pI, pero se prevé que tengan un impacto mínimo en las propiedades biofísicas de los dominios.

Como para todas las proteínas heterodiméricas de la presente, descripción, se construyeron genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos en el vector de expresión de mamífero pTT5. El gen de cadena constante de IgG1 humana se obtuvo a partir de clones IMAGE y se subclonó en el vector pTT5. Los genes VH y VL que codifican los anticuerpos anti-VEGF se sintetizaron comercialmente (Blue Heron Biotechnologies, Bothell WA) y se subclonaron en los vectores que codifican las cadenas constantes CL e IgG1 apropiadas. Las modificaciones de los aminoácidos se construyeron al utilizar la mutagénesis sitio-dirigida mediante el uso de los métodos de mutagénesis sitio-dirigida QuikChange® (Stratagene, La Jolla CA). Todo el ADN se secuenció para confirmar la fidelidad de las secuencias.

Los plásmidos que contienen el gen de la cadena pesada (VH-Cy1-Cy2-Cy3) se cotransfectaron con el plásmido que contiene el gen de la cadena ligera (VL-Ck) en las células 293E mediante el uso de lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad CA) y se cultivaron en medio FreeStyle 293 (Invitrogen, Carlsbad CA). Después de 5 días de crecimiento, los anticuerpos se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo por afinidad con la proteína A al utilizar una resina MabSelect (GE Healthcare). Las concentraciones de los anticuerpos se determinaron mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce).

Los mAb diseñados por ingeniería de pI se caracterizaron generalmente mediante una SDS PAGE en un Bioanalizador Agilent, mediante una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), electroforesis en gel de enfoque isoeléctrico (IEF), unión al antígeno mediante Biacore y calorimetría diferencial de barrido (DSC). Todos los mAb mostraron una alta pureza en SDS-PAGE y SEC. Los geles IEF indicaron que cada variante tenía el punto isoeléctrico diseñado. Generalmente, el análisis de unión en Biacore mostró que las variantes diseñadas por pI se unieron al antígeno con una afinidad similar a la de los anticuerpos originales, lo que indica que las sustituciones diseñadas no perturbaban la función del mAb. La DSC en las Figuras muestra cuales variantes generalmente tenían una alta termoestabilidad.

Se realizaron experimentos farmacocinéticos para determinar la vida media en el suero, de acuerdo a como correspondía, en ratones B6 que eran homocigotos para la ausencia del FcRn murino y heterocigóticos para la inserción del FcRn humano (mFcRn-/-, hFcRn+) (Petkova y otros, 2006, Int Immunol 18 (12): 1759-69), denominados en el presente documento ratones hFcRn o hFcRn+.

Se administró una única inyección intravenosa de anticuerpo en la vena de la cola (2 mg/kg) a grupos de 4-7 ratones hembra aleatorizados por peso corporal (rango de 20-30 g). Se extrajo la sangre (~ 50 ul) del plexo orbital en cada punto de tiempo, se procesó hasta extraer el suero y este se almacenó a -80 °C hasta el análisis. Las concentraciones de los anticuerpos se determinaron mediante un ensayo de ELISA. La concentración sérica del anticuerpo se midió al utilizar el antígeno recombinante como reactivo de captura y la detección se llevó a cabo con un anticuerpo anti-kappa humano biotinilado y estreptavidina marcada con europio. Se midió la señal de fluorescencia resuelta en el tiempo. Los parámetros de PK se determinaron para los ratones individuales con un modelo no compartimental al utilizar WinNonLin (Pharsight Inc, Mountain View CA). Se utilizaron tiempos nominales y dosis con ponderación uniforme de puntos.

Ejemplo 2. Enfoques de ingeniería para la ingeniería del pl de la región constante

La reducción del pI de una proteína o anticuerpo puede llevarse a cabo al utilizar una variedad de enfoques. En el nivel más básico, los residuos con altos pKa (lisina, arginina y, en cierta medida, histidina) se reemplazan con residuos neutros o negativos, y/o los residuos neutros se reemplazan con residuos de pKa bajos (ácido aspártico y ácido glutámico). Los reemplazos particulares pueden depender de una variedad de factores, que incluyen la ubicación en la estructura, el papel en la función y la inmunogenicidad.

Debido a que la inmunogenicidad es una preocupación, pueden realizarse esfuerzos para minimizar el riesgo de que una sustitución que reduzca el pI provoque inmunogenicidad. Una forma de minimizar el riesgo es minimizar la carga mutacional de las variantes, es decir, reducir el pI con el menor número de mutaciones. Las mutaciones de intercambio de carga, donde una K, R o H se reemplaza con una D o E, tienen el mayor impacto en la reducción del pI, por lo que estas sustituciones son preferentes. Otro enfoque para minimizar el riesgo de inmunogenicidad mientras se reduce el pI es utilizar sustituciones de proteínas humanas homólogas. Por tanto, para las cadenas constantes de los anticuerpos, las diferencias isotípicas entre las subclases de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) proporcionan sustituciones de bajo riesgo. Debido a que el reconocimiento inmune ocurre a un nivel de secuencia local, es decir, el MHC II y los receptores de células T reconocen epítopos típicamente de 9 residuos de longitud, las sustituciones que alteran el pI pueden ir acompañadas de sustituciones isotípicas proximales en la secuencia. De esta forma, los epítopos pueden extenderse para coincidir con un isotipo natural. Por tanto, tales sustituciones constituirían epítopos que están presentes en otros isotipos de IgG humana y, por lo tanto, se esperaría que fueran tolerados.

Un enfoque para los cambios de ingeniería en el pI es usar el cambio de isotipo, como se describe en el presente documento.

Otro enfoque para diseñar el pI más bajo en las proteínas y anticuerpos es fusionar los residuos cargados negativamente en los extremos N- o C- terminales. Así, por ejemplo, los péptidos que consisten principalmente de ácido aspártico y ácido glutámico pueden fusionarse al extremo N-terminal o C-terminal de la cadena pesada, cadena ligera o ambos del anticuerpo. Debido a que los extremos N-terminales están estructuralmente cerca del sitio de unión al antígeno, los extremos C-terminales son de preferencia.

Sobre la base de los enfoques de ingeniería descritos, se diseñaron diversas variantes para alterar el punto isoeléctrico de la cadena pesada del anticuerpo (región Fc en general) y, en algunos casos, la cadena ligera.

Ejemplo 3. Variantes de la región constante de la cadena ligera isotípicas

La homología entre CK y CA no es tan alta como entre las subclases de IgG, sin embargo, la secuencia y la homología estructural que existe se utilizó aún así para guiar las sustituciones para crear una región constante de la cadena ligera isotípica de pI bajo. En la Figura 56, las posiciones con residuos que contribuyen a un pI más alto (K, R y H) o un pI más bajo (D y E) están resaltadas en negrita. El gris indica la lisina, argininas e histidinas que pueden sustituirse, preferentemente con los ácidos aspártico o glutámico, para reducir el punto isoeléctrico. Estas variantes, solas o en cualquier combinación, pueden combinarse de forma independiente y opcional con todas las demás variantes de la cadena pesada en los armazones que tienen al menos una cadena ligera.

Ejemplo 4. Mezclas purificadoras de variantes de anticuerpos con puntos isoeléctricos modificados.

Las sustituciones que modifiquen el punto isoeléctrico del anticuerpo pueden introducirse en una o más cadenas de una variante de anticuerpo para facilitar el análisis y la purificación. Por ejemplo, los anticuerpos heterodiméricos como los descritos en el documento US2011/0054151A1 pueden purificarse al modificar el punto isoeléctrico de una cadena, de modo que las múltiples especies presentes después de la expresión y la purificación mediante proteína A, puedan purificarse mediante los métodos que separan las proteínas en función de las diferencias de carga, como la cromatografía de intercambio iónico.

A modo de ejemplo, la cadena pesada de bevacizumab se modificó mediante la introducción de sustituciones para reducir su punto isoeléctrico de modo que la diferencia de cargas entre las tres especies producida cuando se transfectaron la WT-IgG1-HC, bajo-pI-HC y WT-LC en las células 293E, era lo suficientemente grande como para facilitar la purificación mediante la cromatografía de intercambio aniónico. Los clones se crearon como se describió anteriormente, y la transfección y la purificación inicial mediante cromatografía de proteína A, también es como se describió anteriormente. Las secuencias de las tres cadenas "Cadena pesada 1 de XENP10653", "Cadena pesada 2 de XENP10653" y "Cadena ligera de XENP10653" en las Figuras. Después de la purificación mediante proteína A, se obtienen tres especies con pesos moleculares casi idénticos, pero cargas diferentes. Estos son el homodímero WT-IgG1-HC/WT-IgG1-HC (pI = 8,12), el heterodímero WT-IgG1-HC/bajo-pI-HC (pI = 6,89) y el homodímero bajo-pI-HC/bajo-pI-HC (pI = 6,20). La mezcla se cargó en una columna GE HiTrap Q HP en Tris 20 mM, pH 7,6 y se eluyó con un gradiente escalonado de NaCl que consistía en NaCl 50 mM, 100 mM y finalmente 200 mM en el mismo tampón Tris. La elución se controló mediante A280, y cada fracción se analizó en geles IEF de pH 3-10 de Invitrogen con un tampón de ejecución Novex y estos resultados se muestran en la Figura 40. El homodímero de WT-IgG1-HC/WT-IgG1-HC no se une a la columna de intercambio aniónico a pH 7,6 y, por tanto, está presente en el flujo y el lavado (carriles 1-2). El heterodímero deseado eluye con NaCl 50 mM (carril 3), mientras que el homodímero bajo en bajo-pI-HC/bajo-pI-HC se une más fuertemente a la columna y eluye a 100 mM (carril 4) y 200 mM (carril 5) de NaCl. Por tanto, la variante del heterodímero deseada, que es difícil de purificar por otros medios debido a su peso molecular similar al de las otras dos especies, se purifica fácilmente mediante la introducción de las sustituciones de pI bajo en una cadena. Este método de purificación de anticuerpos mediante ingeniería del punto isoeléctrico de cada cadena puede aplicarse a los métodos de purificación de diversas construcciones de anticuerpos biespecíficos. El método es particularmente útil cuando la especie deseada en la mezcla tiene un peso molecular similar y otras propiedades tales que las técnicas de purificación normales no son capaces de separar las especies deseadas con alto rendimiento.

Ejemplo 5. Diseño de sustituciones de carga no nativas para alterar el pl.

El pI de las cadenas constantes del anticuerpo se alteró mediante las sustituciones de ingeniería en los dominios constantes. El pI reducido puede modificarse mediante la modalidad de sustituciones de aminoácidos básicos (K o R) por aminoácidos ácidos (D o E), lo que da como resultado la mayor disminución del pI. Las mutaciones de los aminoácidos básicos en aminoácidos neutros y de aminoácidos neutros en aminoácidos ácidos también darán como resultado una disminución del pI. Por el contrario, el pI aumentado puede modificarse mediante las sustituciones de aminoácidos ácidos (D o E) por aminoácidos básicos (K o R), lo que da como resultado el mayor aumento del pI. Las mutaciones de los aminoácidos ácidos a aminoácidos neutros, y de los aminoácidos neutros a aminoácidos básicos también darán como resultado un aumento del pI. Pueden encontrarse una lista de valores de pK de aminoácidos en la Tabla 1 de Bjellqvist y otros, 1994, Electrophoresis 15:529-539.

Al decidir qué posiciones mutar, se tuvo en cuenta el ambiente circundante y el número de contactos que el aminoácido WT establece con sus vecinos para minimizar el impacto de una sustitución o conjunto de sustituciones en la estructura y/o la función. La accesibilidad al disolvente o la fracción expuesta de cada posición de la región constante se calculó al utilizar las estructuras cristalinas relevantes. Sobre la base de este análisis, se identificaron varias sustituciones que reducen o aumentan el pI, pero se prevé que tengan un impacto mínimo en las propiedades biofísicas de los dominios.

El cálculo del pI de la proteína se realizó como sigue. En primer lugar, se realizó un recuento del número de aminoácidos D, E, C, H, K, R e Y, así como del número de extremos N- y C- presentes en la proteína. Luego, se calculó el pI al identificar el pH para el cual la proteína tiene una carga total de cero. Esto se hizo al calcular la carga neta de la proteína a varios valores de pH de prueba. Los valores del pH de prueba se establecieron de manera iterativa, al aumentar desde un pH bajo de 0 a un pH alto de 14 en incrementos de 0,001 hasta que la carga de la proteína alcanzó o superó cero. La carga neta de una proteína a un pH dado se calculó mediante la siguiente fórmula:

donde qproteína (pd) es la carga neta de la proteína al pH dado, es el número de aminoácidos i (o N- o C- terminales) presentes en la proteína, y es el pK del aminoácido i (o N- o C-terminales).

Ejemplo 6. Mezclas purificadoras de variantes de anticuerpos con puntos isoeléctricos modificados.

Las variantes se purificaron primero por Proteína A y luego se cargaron en una columna de intercambio catiónico GE Healthcare HiTrap SP HP en MES 50 mM (pH 6,0) y se eluyeron con un gradiente de NaCl. Después de la elución, las fracciones de cada pico se cargaron en una placa Lonza IsoGel IEF (rango de pH 7-11) para su análisis. La separación del heterodímero de pI medio se logra en cada caso, con una separación mejorada cuando el heterodímero tiene una diferencia mayor en el pI al comparar con los homodímeros.

Ejemplo 7. Estabilidad de las variantes isostéricas de pI

Se utilizó la fluorimetría diferencial de barrido (DSF) para evaluar la estabilidad de los anticuerpos que contienen las sustituciones de pI isostéricas. Los experimentos de DSF se realizaron al utilizar un sistema de detección de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX Connect. Las proteínas se mezclaron con el colorante fluorescente SYPRO Orange y se diluyeron a 0,25 o 0,50 mg/ml en PBS. La concentración final de SYPRO Orange fue 10X. Después de un período inicial de incubación de 10 minutos a 25 °C, las proteínas se calentaron de 25 a 95 °C al emplear una velocidad de calentamiento de 1 °C/min. Se tomó una medida de fluorescencia cada 30 segundos. Las temperaturas de fusión se calcularon al utilizar el software del instrumento. Los resultados se muestran en la Figura 110. Los resultados indicaron que las variantes de pI isostérico (+) tenían menor estabilidad. Por lo tanto, hicimos más variantes para reducir el número de sustituciones en el lado del pI aumentado, pero los resultados mostraron que solo la E269Q tuvo un pequeño efecto sobre la estabilidad, mientras que E272Q y E283Q tuvieron grandes impactos negativos sobre la estabilidad.

Ejemplo 8. Diseño de conectores de scFv cargados para permitir la purificación IEX de los scFv que contienen los anticuerpos biespecíficos heterodiméricos.

Previamente, diseñamos las regiones constantes de los anticuerpos heterodiméricos para que tuvieran un pI mayor o menor al utilizar las sustituciones de carga tanto isotípicas como isostéricas. Estos métodos permiten la purificación IEX eficiente de las especies heterodiméricas, pero pueden afectar la estabilidad o la inmunogenicidad de los anticuerpos debido a las sustituciones no naturales introducidas. Para los anticuerpos biespecíficos heterodiméricos que contienen los scFv (se muestran los ejemplos en la Figura 84), otra región para introducir las sustituciones cargadas es el conector de scFv que conecta el VH y VL de las construcciones scFv. El conector más común utilizado es (GGGGS)3 o (GGGGS)4, que se demostró que es lo suficientemente flexible como para permitir la formación de scFv estables sin formación de diacuerpos. Estas secuencias ya no son naturales y contienen poca especificidad de secuencia para los probables epítopos inmunogénicos. Por lo tanto, pensamos que la introducción de sustituciones cargadas en los conectores de scFv puede ser una buena estrategia para permitir la purificación IEX de las especies biespecíficas heterodiméricas que contienen los scFv. Se diseñaron varios conectores de scFv cargados positiva y negativamente y se muestran en la Figura 85. Todos los conectores son construcciones novedosas excepto el conector "Whitlow" que fue informado por Whitlow y otros, (Whitlow M, Protein Eng. 1993 (8), 989-995.). Los conectores designados como 6paxA_1 (+A) y 3hsc_2 (-A) se tomaron de una base de datos de las regiones no estructuradas en las proteínas humanas obtenidas a partir de archivos PDB y estos conectores tienen aproximadamente la misma longitud que (GGGGS)3 y contienen cargas positivas o negativas. Otros conectores se basan en la introducción de residuos Lys o Glu repetitivos, así como motivos Lys-Pro diseñados para reducir la posibilidad de degradación proteolítica en los conectores cargados positivamente.

En primer lugar, se evaluó el comportamiento biofísico de los conectores cargados en el formato scFv-His y luego se construyeron en formato biespecífico Fab-scFv-Fc anti-CD19xCD3. Se construyeron genes que codifican el scFv de formas diseñadas del anticuerpo anti-CD3 SP34 o del anticuerpo anti-CD19 4G7 en el vector de expresión de mamífero pTT5. Para las construcciones de longitud completa, el gen de cadena constante de la IgG1 humana se obtuvo a partir de clones IMAGE y se subclonó en el vector pTT5. Los genes scFv se sintetizaron comercialmente (Blue Heron Biotechnologies, Bothell WA. Las modificaciones de los aminoácidos se construyeron al utilizar la mutagénesis sitio-dirigida mediante el uso de los métodos de mutagénesis sitio-dirigida QuikChange® (Stratagene, La Jolla CA). Todo el ADN se secuenció para confirmar la fidelidad de las secuencias.

Los plásmidos que contienen el scFv o los genes de la cadena pesada y la cadena ligera se transfectaron (o cotransfectaron para formatos de longitud completa) en las células 293E al utilizar lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad CA) y se cultivaron en medio FreeStyle 293 (Invitrogen, Carlsbad CA). Después de 5 días de crecimiento, los anticuerpos se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo por afinidad con la proteína A al utilizar la resina MabSelect (GE Healthcare) o mediante el uso de la resina Ni-NTA para los scFv etiquetados con His. Los heterodímeros se purificaron adicionalmente mediante una cromatografía de intercambio iónico (IEX) para evaluar la capacidad de las cadenas pesadas de pI alterado para permitir una purificación eficiente. En la figura 90 se muestran los ejemplos de purificaciones de IEX para un anti-CD19xCD3 biespecífico que contiene un conector cargado positivamente en el CD3 scFv. Las concentraciones de los anticuerpos se determinaron mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce).

Los scFv o los anticuerpos con el pI modificado se caracterizaron mediante una SDS-PAGE, una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), electroforesis en gel de enfoque isoeléctrico (IEF) y/o fluorimetría de barrido diferencial (DSF).

Ejemplo 9. Estabilidad y comportamiento de los scFv que contienen los conectores cargados.

Los scFv anti-CD3 y los scFv anti-CD19 que contenían los conectores cargados positiva o negativamente, respectivamente, se evaluaron para el comportamiento de la SEC, así como para la estabilidad mediante el uso de la DSF. Se utilizó una fluorimetría diferencial de barrido (DSF) para evaluar la estabilidad de los scFv que contenían los conectores cargados. Los experimentos de DSF se realizaron al utilizar un sistema de detección de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX Connect. Las proteínas se mezclaron con el colorante fluorescente SYPRO Orange y se diluyeron a 0,25 o 0,50 mg/ml en PBS. La concentración final de SYPRO Orange fue 10X. Después de un período inicial de incubación de 10 minutos a 25 °C, las proteínas se calentaron de 25 a 95 °C al emplear una velocidad de calentamiento de 1 °C/min. Se tomó una medida de fluorescencia cada 30 segundos. Las temperaturas de fusión se calcularon al utilizar el software del instrumento. Los valores de Tm para los scFv se muestran en la Figura 86. Los conectores cargados solo tuvieron impactos marginales en la estabilidad global del scFv como lo indican sus valores de Tm. Los cromatogramas de SEC obtenidos a partir de los scFv purificados se muestran en la Figura 4. Los conectores muy cargados tienen un tiempo de elución más largo y colas de picos notables que indican que demasiada carga hace que los scFv se adhieran a la resina SEC durante más tiempo de lo esperado. Los resultados de unión para los scFv anti-CD3 cargados positivamente que se unen a las células T CD4 (Figura 88) indicaron que la unión de la mayoría de los scFv era similar, con la excepción del scFv 4 muy altamente cargado (GKGKS), que mostraba una unión más débil. No se detectó la unión diferente de la diana cuando se evaluaron las células CD20+ en los PBMC. Sin embargo, cuando se evaluó la unión diferente de la diana al utilizar las células SP34, se observó cierta cantidad de unión diferente de la diana, con los conectores más cargados, a las más altas concentraciones (Figura 89).

Los conectores de scFv cargados positivamente en el scFv anti-CD3 en una construcción Fab-scFv-Fc anti-CD19xCD3, tenían la propiedad inesperada de reducir la cantidad de agregación de alto peso molecular (Figura 91). Los cromatogramas SEC de dos construcciones biespecíficas (13121-con un conector estándar (GGGGS)4) y (13124-con el conector cargado (GKPGS)4) incubados a diversas concentraciones, confirmaron este fenómeno.

Se evaluó la actividad de las construcciones anti-CD19xCD3 que contenían los conectores de scFv cargados en el scFv anti-CD3 al utilizar un ensayo RTCC con PBMC y anticuerpos anti-CD19xCD3 biespecíficos de formato FabscFv-Fc que contenían diferentes conectores de scFv (Figura 92). Los conectores tienen poco impacto en la actividad de RTCC, excepto por el conector altamente cargado (GKGKS)3 que tiene una actividad más baja.

Las secuencias para todas las construcciones se muestran en la Figura 93.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo heterodimérico que comprende:

a) un primer monómero que comprende:

i) un scFv anti-CD3 que comprende un primer dominio pesado variable que tiene la SEQ ID NO: 397, un primer dominio ligero variable que tiene la SEQ ID NO: 398 y un conector de scFv, y ii) un primer dominio Fc;

en donde el conector de scFv es (GKPGS)4

en donde la numeración es de acuerdo con la numeración EU.

2. El anticuerpo heterodimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer y segundo dominios Fc comprenden cada uno además las sustituciones de aminoácidos M428L y N434S.

3. Una composición de ácido nucleico que comprende:

a) un primer ácido nucleico que codifica el primer monómero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2;

b) un segundo ácido nucleico que codifica el segundo monómero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2; y

c) un tercer ácido nucleico que codifica la cadena ligera de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Una composición de ácido nucleico que comprende:

a) un primer vector de expresión que comprende el primer ácido nucleico de la reivindicación 3 a);

b) un segundo vector de expresión que comprende el segundo ácido nucleico de la reivindicación 3 b); y c) un tercer vector de expresión que comprende el tercer ácido nucleico de la reivindicación 3 c).

5. Una célula hospedera que comprende la composición de ácido nucleico de la reivindicación 3 o 4.

6. Un método para preparar un anticuerpo heterodimérico que comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 5 en condiciones en donde dichos ácidos nucleicos se expresan, y recuperar el anticuerpo heterodimérico.