ES2881694T3 - Procedimientos de identificación de bacterias que comprenden polipéptidos de unión - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para identificar una bacteria (i) que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana o (ii) con una mejora en la expresión, en relación con un nivel de expresión de referencia, de un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) proporcionar una bacteria que comprende una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma, en el que la mutación está en un gen que codifica la lipoproteína de membrana externa principal Lpp (Lpp), expresando la bacteria un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión candidato, en el que el polipéptido de unión candidato está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; y (c) identificar la bacteria como (i) que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a la molécula diana o (ii) que tiene una mejora en la expresión, en relación con un nivel de expresión de referencia, del polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma, en el que la bacteria permanece viable después de la etapa (c).

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos de identificación de bacterias que comprenden polipéptidos de unión
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos de identificación de bacterias que comprenden polipéptidos de unión, procedimientos de identificación de polipéptidos de unión con una mejora en la expresión, procedimientos de identificación de bacterias con una mejora en la expresión de polipéptidos de unión, bacterias genomanipuladas adecuadas para su uso en los procedimientos.
Antecedentes
La presentación de polipéptidos de unión (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos) en la superficie de bacteriófagos o células (por ejemplo, células bacterianas, de levadura o de mamífero) es un enfoque ampliamente usado para la genomanipulación de proteínas. Aunque los tiempos de replicación rápidos de las bacterias deberían ofrecer una progresión de ronda a ronda acelerada de presentación bacteriana en comparación con otras tecnologías de presentación de células, estas ventajas en general se han compensado por los compromisos necesarios para retener un polipéptido de unión candidato en la célula y mantener la accesibilidad del antígeno. La presentación de moléculas grandes como fusiones en proteínas de la membrana externa bacteriana puede ser difícil, limitando la aplicación de estos sistemas a péptidos o proteínas pequeñas. Otro enfoque es la presentación de proteínas más grandes en el periplasma. Sin embargo, en la mayoría de las condiciones, la membrana externa es impermeable a la difusión de moléculas hidrófilas que tienen un peso molecular mayor que aproximadamente 600 daltons en el periplasma (véase, por ejemplo, Decad et al. J. Bacteriology 128(1): 325-336, 1976). Los enfoques actuales de presentación periplásmica de polipéptidos de unión en ligandos más grandes implican la retirada de la membrana externa, lo que requiere anclar el polipéptido de unión al lado externo de la membrana interna (por ejemplo, usando proteínas de fusión u otros anclajes) para mantener la asociación del polipéptido de unión con la membrana interna bacteriana. Además, la destrucción de la membrana externa da como resultado la muerte celular, lo que requiere una manipulación molecular que lleva mucho tiempo entre rondas de presentación bacteriana. Por ejemplo, los documentos WO 2005/103074, WO 2005/095988, Mazor et al. Nat. Protocols 3(11):1766-1777, 2008 y Rani et al. J. Virol. 86(17):9113-9121, 2012 divulgan procedimientos de cribado, en particular el enfoque de expresión periplásmica anclada ("APeX"), en el que la membrana externa de la bacteria se rompe por medio del tratamiento con lisozima y EDTA para permitir que una molécula diana se una a los polipéptidos de unión que se anclan a la membrana interna de la bacteria. Estos procedimientos requieren una etapa intermedia de aislamiento y amplificación de ácidos nucleicos entre rondas de cribado debido a la baja viabilidad de las células tratadas con lisozima y EDTA.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de una mejora en los procedimientos para la presentación bacteriana en células vivas que sean compatibles con polipéptidos de unión de longitud completa (por ejemplo, anticuerpos) y moléculas diana (por ejemplo, antígenos) que se puedan usar, por ejemplo, para identificar variantes de proteínas que tienen características deseadas (por ejemplo, mejora en la expresión, estabilidad y/o afinidad), así como para identificar bacterias que tienen una mejora en la expresión de polipéptidos de unión.
Sumario
La presente invención se refiere a procedimientos de identificación de bacterias que albergan polipéptidos de unión deseados, procedimientos de identificación de polipéptidos de unión con una mejora en la expresión, procedimientos de identificación de bacterias con una mejora en la expresión de polipéptidos de unión, bacterias genomanipuladas adecuadas para su uso en los procedimientos de la invención.
En un aspecto, la invención muestra un procedimiento para identificar una bacteria (i) que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana o (ii) con una mejora en la expresión, en relación con un nivel de expresión de referencia, de un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) proporcionar una bacteria que comprende una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma, en el que la mutación está en un gen que codifica la lipoproteína de la membrana externa principal Lpp (Lpp), expresando la bacteria un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión candidato, en el que el polipéptido de unión candidato está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; y (c) identificar la bacteria como (i) que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a la molécula diana o (ii) que tiene una mejora en la expresión, en relación con un nivel de expresión de referencia, del polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma, en el que la bacteria permanece viable después de la etapa (c).
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el procedimiento comprende además someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa de la bacteria antes de la etapa (b). En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además resellar la membrana externa de la bacteria después de poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa de la bacteria comprende tratar la bacteria con un agente de permeabilización. En algunos modos de realización, el agente de permeabilización se selecciona del grupo que consiste en un quelante de cationes divalentes, NaCl, sacarosa, un antibiótico, un detergente, lisozima, Tris, Tris-EDTA, ascorbato, polilisina, cloruro de benzalconio, protamina, proteína bactericida e incrementadora de la permeabilidad (BPI), suero, complemento y Ca2+. En algunos modos de realización, el quelante de cationes divalentes es EDTA. En algunos modos de realización, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en un aminoglucósido, polimixina B, polimixina desacilada, octapeptina y bencilpenicilina.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, resellar la membrana externa de la bacteria comprende poner en contacto la bacteria con una sal de un catión seleccionado de Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Na+ o K+. En algunos modos de realización, el catión es Mg2+. En algunos modos de realización, la sal de Mg2+ es MgCl2.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la etapa de poner en contacto comprende además poner en contacto la bacteria con un tinte de ácido nucleico. En algunos modos de realización, el tinte de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en SYTO® 9, SYTO® 41, SYTO® 43, SYTO® 42, SYTO®44, SYTO® 40 y SYTO® 45. En algunos modos de realización, el tinte de ácido nucleico es SYTO® 9 o SYTO® 41.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la molécula diana marcada de forma detectable comprende un marcador fluorescente. En algunos modos de realización, el marcador fluorescente comprende un tinte fluorescente o un polipéptido fluorescente. En algunos modos de realización, el tinte fluorescente se selecciona del grupo que consiste en: un tinte ALEXA® o un tinte DYLIGHT®. En algunos modos de realización, el tinte ALEXA® es ALEXA FLUOR® 488 o ALEXA FLUOR® 647. En algunos modos de realización, el tinte DYLIGHT® es DYLIGHT® 649.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el procedimiento comprende además al menos una etapa de lavado que comprende resuspender la bacteria en un tampón de lavado después de poner en contacto la bacteria con la molécula diana marcada de forma detectable.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la etapa de identificación comprende citometría de flujo. En algunos modos de realización, la citometría de flujo comprende la separación de células individuales y la separación en base a la señal de la molécula diana marcada de forma detectable. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además la separación en base a la señal de un tinte de ácido nucleico. En algunos modos de realización, la citometría de flujo comprende secuencialmente (i) separación en base a la señal de un tinte de ácido nucleico; (ii) separación de células individuales; y (iii) separación en base a la señal de la molécula diana marcada de forma detectable.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la bacteria es una bacteria gramnegativa. En algunos modos de realización, la bacteria gramnegativa es una bacteria E. coli.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el polipéptido de unión se expresa en forma soluble en el periplasma de la bacteria.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el polipéptido de unión es un anticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un semianticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la etapa (a) comprende proporcionar una pluralidad de bacterias, en la que la pluralidad de bacterias comprende una colección de ácidos nucleicos, de los que cada uno codifica un polipéptido de unión candidato. En algunos modos de realización, la colección comprende una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de anticuerpo candidata comprende una alteración de residuo aminoacídico en una FR de VH o VL en comparación con un anticuerpo de referencia, en la que la alteración de residuo aminoacídico: (a) se identificó en un anticuerpo natural que tiene el mismo subtipo que el anticuerpo de referencia, y (b) está en un residuo aminoacídico que se predice que está oculto. En algunos modos de realización, la alteración de residuo aminoacídico en el anticuerpo natural se debe a hipermutación somática. En algunos modos de realización, la etapa de identificar un polipéptido de unión candidato que tiene un incremento en el nivel de expresión en base a la cantidad de la molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además la etapa de identificar un polipéptido de unión candidato que tiene un incremento en la estabilidad en base a la cantidad de la molécula diana marcada dentro del periplasma.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el procedimiento comprende además aislar el ácido nucleico después de la etapa de identificación.
En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la bacteria comprende una mutación que afecta a un gen regulador de la transcripción. En algunos modos de realización, la etapa (a) comprende proporcionar una pluralidad de bacterias, en la que la pluralidad de bacterias comprende una colección de ácidos nucleicos, de los que cada uno codifica un mutante del gen regulador de la transcripción. En algunos modos de realización, el gen regulador de la transcripción se selecciona de un factor de iniciación de la transcripción, un factor anti-sigma, una subunidad de ARN polimerasa o un factor de transcripción. En algunos modos de realización, el factor de iniciación de la transcripción es un factor sigma. En algunos modos de realización, el factor sigma es RpoD (a70). En algunos modos de realización, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en un plásmido sintético. En algunos modos de realización, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en el genoma bacteriano endógeno. En algunos modos de realización, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error, mutagénesis química, mutagénesis transposicional o mutagénesis dirigida. En algunos modos de realización, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error. En algunos modos de realización, el procedimiento identifica una bacteria que tiene una mejora en la expresión del polipéptido de unión.
En otro aspecto, la invención muestra una bacteria que comprende (i) una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma, en la que la mutación está en un gen que codifica Lpp; (ii) una construcción de expresión que codifica un polipéptido de unión; y (iii) una mutación que afecta a un gen regulador de la transcripción, en la que el gen regulador de la transcripción es RpoD (a70). En algunos modos de realización, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en un plásmido sintético. En algunos modos de realización, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en el genoma bacteriano endógeno. En algunos modos de realización, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error, mutagénesis química, mutagénesis transposicional o mutagénesis dirigida. En algunos modos de realización, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error. En algunos modos de realización, el polipéptido de unión es un anticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un semianticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2. En algunos modos de realización, la bacteria es una bacteria gramnegativa. En algunos modos de realización, la bacteria gramnegativa es una bacteria E. coli. En algunos modos de realización, el anticuerpo se expresa en forma soluble en el periplasma de la bacteria.
En otro aspecto, la divulgación muestra un anticuerpo aislado que se une específicamente a interleucina-13 (IL-13), en la que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y (b) una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
En otro aspecto, la divulgación muestra un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-13, en la que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En otro aspecto, la divulgación muestra un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-13, en la que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En otro aspecto, la divulgación muestra un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-13, en la que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En otro aspecto, la divulgación muestra un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-13, en la que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
En otro aspecto, la divulgación muestra un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-13, en la que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En otro aspecto, la divulgación muestra un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-13, en la que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la divulgación muestra un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-13, en la que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En otro aspecto, la divulgación muestra un anticuerpo aislado que se une específicamente a IL-13, en la que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En algunas divulgaciones de cualquiera de los aspectos precedentes, el anticuerpo comprende además las siguientes seis HVR: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de AYSVN (SEQ ID NO: 7); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de M IW G D G KIV YN SALKS (SEQ ID NO: 8); (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de DG YYPYAM DN (SEQ ID NO: 9); (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASKSVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 10); (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LASN LES (SEQ ID NO: 11); y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de Q Q N N E D P R T (SEQ ID NO: 12).
En algunas divulgaciones, uno cualquiera de los anticuerpos precedentes se une específicamente a IL-13 humana con una Kd de aproximadamente 1 nM o menor. En algunas divulgaciones, el anticuerpo se une específicamente a IL-13 humana con una Kd de entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 50 pM. En algunas divulgaciones, el anticuerpo se une específicamente a IL-13 humana con una Kd de entre aproximadamente 29 pM y aproximadamente 40 pM.
En algunas divulgaciones, uno cualquiera de los anticuerpos precedentes es monoclonal, humano, humanizado o quimérico. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un semianticuerpo. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a IL-13. En algunas divulgaciones, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico. En algunas divulgaciones, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico. En algunas divulgaciones, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico.
En otro aspecto, la divulgación muestra un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En otro aspecto, la divulgación muestra un vector (por ejemplo, un vector de expresión) que comprende el ácido nucleico aislado para expresar el anticuerpo. En otro aspecto, la divulgación muestra células huésped que comprenden los ácidos nucleicos y/o vectores precedentes. En algunas divulgaciones, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunas divulgaciones, la célula huésped es una célula procariota. En algunas divulgaciones, la célula procariota es una célula E. coli.
En otro aspecto, la divulgación muestra un procedimiento de producción de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores precedentes (por ejemplo, vectores de expresión) en un medio de cultivo. En algunas divulgaciones, el procedimiento comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped o el medio de cultivo.
En otro aspecto, la divulgación muestra una composición que comprende uno cualquiera de los anticuerpos precedentes. En algunas divulgaciones, la composición comprende además un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas divulgaciones, la composición es una composición farmacéutica.
En algunos aspectos, se puede usar uno cualquiera de los anticuerpos precedentes como medicamento.
En algunos aspectos, se puede usar uno cualquiera de los anticuerpos precedentes en el tratamiento de un trastorno mediado por IL-13.
En otro aspecto, la divulgación muestra un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece síntomas asmáticos que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de uno cualquiera de los anticuerpos precedentes para reducir los síntomas asmáticos.
En otro aspecto, la divulgación muestra un procedimiento para inhibir la producción de anticuerpos IgE en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de uno cualquiera de los anticuerpos precedentes. En algunas divulgaciones, la inhibición de la producción de anticuerpos IgE se destina a tratar asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis alérgica, asma bronquial, rinitis alérgica, urticaria, anafilaxia o dermatitis atópica.
En otro aspecto, la divulgación muestra un procedimiento de tratamiento de un trastorno mediado por IL-13 en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de uno cualquiera de los anticuerpos precedentes. En algunas divulgaciones, el trastorno es asma alérgica, asma no alérgica (intrínseca), rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis alérgica, eccema, urticaria, alergias alimentarias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, colitis ulcerosa, infección por VSR, uveítis, esclerodermia u osteoporosis.
En otro aspecto, la divulgación muestra un procedimiento de tratamiento de un trastorno mediado por IgE en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de uno cualquiera de los anticuerpos precedentes. En algunas divulgaciones, el trastorno mediado por IgE es asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis alérgica, urticaria, anafilaxia o dermatitis atópica.
En algunas divulgaciones de los procedimientos de tratamiento precedentes, el anticuerpo inhibe la unión de IL-13 a su receptor e inhibe una o más funciones asociadas con la unión de IL-13 a su receptor.
En algunas divulgaciones de los procedimientos de tratamiento precedentes, el anticuerpo se administra por una o más de las vías seleccionadas del grupo que consiste en intravenosa, intraperitoneal, inhalación, intramuscular, subcutánea y oral. En algunas divulgaciones, la vía es subcutánea.
En algunas divulgaciones de los procedimientos de tratamiento precedentes, el paciente es un ser humano.
En otro aspecto, la divulgación muestra una colección que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de polipéptido de unión candidata comprende una alteración de residuo aminoacídico en una FR de VH o VL en comparación con un anticuerpo de referencia, en la que la alteración de residuo aminoacídico: (a) se identificó en un anticuerpo natural que tiene el mismo subtipo que el anticuerpo de referencia, y (b) está en un residuo aminoacídico que se predice que está oculto. En algunas divulgaciones, la alteración de residuo aminoacídico en el anticuerpo natural se debe a hipermutación somática.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1A es un panel de micrografías fluorescentes que muestran tinción específica de células bacterianas que expresan anticuerpos con antígeno de IL-13. Las células que expresan un anticuerpo anti-IL-13 o un control de vector vacío (pBR322) se tiñeron con SYTO® 41 (tinte de ácido nucleico), IL-13 marcado con ALEXA FLUOR® 488 o anticuerpos anti-Fc humano F(ab')2 marcado con DYLIGHT® 649. Solo las células que expresan el anticuerpo se tiñen positivamente con el antígeno de IL-13 y el anticuerpo anti-Fc humano.
La FIG. 1B muestra imágenes de placas de medio bacteriano manchadas con diluciones en serie de células que expresan diferentes formatos de anticuerpos anti-IL-13 o un vector de control vacío (pBR322) antes ("pretinción") y después del tratamiento con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), tinción de antígeno y adición de MgCb ("postinción"). No se observó diferencia sustancial en la viabilidad entre las células no teñidas y teñidas.
La FIG. 1C es un gráfico que muestra el análisis citométrico de flujo de células que expresan diferentes formatos de un anticuerpo anti-IL-13 (IgG, semianticuerpo (Half-Ab) y Fab) o células de control transformadas con el vector de control vacío pBR322 (línea negra, sombreado) después de tinción con IL-13 marcada con fluorescencia. Todos los formatos mostraron un desplazamiento de la señal de IL-13 por encima del control pBR322.
La FIG. 1D es un diagrama esquemático de un procedimiento ejemplar de la invención. Las células se permeabilizan por tratamiento con EDTA, se incuban con antígeno marcado con fluorescencia, y la integridad de la membrana externa se restablece por adición de MgCb. Un <1 % superior de las células positivas para antígeno se separa por citometría de flujo y, o avanzan, después del recrecimiento, a una ronda posterior para enriquecimiento adicional o bien se recogen para su análisis. SSC, dispersión lateral.
La FIG. 2A muestra imágenes de placas de medio bacteriano manchadas con diluciones en serie de bacterias que llevan un plásmido que codifica un anticuerpo anti-IL-13 que confiere resistencia a carbenicilina (Carb) y tetraciclina (Tet) añadido 1:105 o 1:106 en bacterias transformadas con un plásmido que codifica un anticuerpo anti-VEGF que confiere resistencia a carbenicilina. La existencia de bacterias que expresan anti-IL-13 escasas se visualizó sembrando diluciones en serie sobre placas que contienen carbenicilina (recuento bacteriano total) y tetraciclina (bacterias que llevan solo plásmido anti-IL-13), confirmando las proporciones esperadas.
La FIG. 2B es un gráfico que muestra el porcentaje de células positivas para antígeno después de 1 o 2 rondas (Rd) de presentación bacteriana de anticuerpos (BAD). Los cultivos enriquecidos se separaron por BAD con antígeno marcado con ALEXA FLUOR® 647. Las células que presentan un anticuerpo anti-IL-13 (círculo) o anti-VEGF (cuadrado) añadidas a un grupo de células que presentan anticuerpos que no se unen en una proporción de 1:106 se enriquecen rápidamente en el transcurso de dos rondas de separación con BAD.
La FIG. 2C es una serie de gráficos que muestran el análisis citométrico de flujo del experimento de adición anti-VEGF mostrado en la fig. 2B. Una porción significativa de la población se une al antígeno de VEGF después de dos rondas de separación.
La FIG. 3A es un gráfico que muestra los niveles de expresión de variantes anti-VEGF.2 como se determina por inmunoelectrotransferencia. Se detectaron muestras solubles no reducidas con un anticuerpo anti-Fc humano y se cuantificaron usando un instrumento LI-COR ODYSSEY®. La señal se normalizó a la banda del semianticuerpo de anti-VEGF.2 WT (natural). n = 3 experimentos. Todas las variantes tienen un incremento en los niveles de expresión en comparación con WT.
La FIG. 3B es un gráfico que muestra el análisis citométrico de flujo de variantes anti-VEGF.2 individuales. Anti-VEGF.2 WT tiene un mayor desplazamiento que las células no teñidas (negro, sombreado). Todas las variantes tienen mayores desplazamientos que WT y se correlacionan con las clasificaciones de expresión como se determina por inmunoelectrotransferencia (véase la fig. 3A). Se indican anti-VEGF.2 WT, L4M.E6Q.M34I, F71Y.E6Q.M34I y S24R.E6Q.M34I.
La FIG. 3C es una serie de gráficos que muestran el enriquecimiento de las variantes de mejor expresión de un grupo de anti-VEGF.2 WT y tres variantes por BAD. La señal de citometría de flujo del grupo se desplaza en sentido más positivo durante dos rondas separando un 1 % superior de las células de unión a VEGF. El anti-VEGF.2 WT con la menor expresión y la variante con la mejor expresión S24R.E6Q.M34I se analizaron en cada ronda y se muestran para su comparación.
La FIG. 3D es una serie de gráficos de sectores que muestran el enriquecimiento de la variante anti-VEGF.2 en dos rondas de separación. Se secuenciaron 96 clones, y las variantes anti-VEGF.2 con la mayor expresión, F71Y.E6Q.M34I y S24R.E6Q.M34I, se enriquecieron después de dos rondas, mientras que las dos variantes con la menor expresión (anti-VEGF.2 WT y L4M.E6Q.M34I) se agotaron.
La FIG. 4A es una serie de gráficos que muestran el enriquecimiento por ronda de variantes estructurales anti-IL-13. Los gráficos de puntos de FACS™ superpuestos muestran que las variantes estructurales (FR) anti-IL-13 se desplazan de forma más positiva en cada ronda en comparación con anti-IL-13 WT.
La FIG. 4B es una serie de gráficos de sectores que muestran enriquecimiento por ronda de la colección anti-IL-13. Los datos presentados de la ronda 1 y ronda 2 son de la secuenciación de 186 y 226 clones, respectivamente. M4L y E6Q son las variantes más enriquecidas después de dos rondas de BAD.
La FIG. 4C es un gráfico que muestra la correlación de la expresión de variantes anti-IL-13 y sus combinaciones en células de mamífero (HEK293T) y E. coli. Se observa una mejora en la expresión en ambos sistemas huésped. Para la expresión en E. coli, se detectaron muestras de semianticuerpos solubles no reducidas con un anticuerpo anti-Fc humano y se cuantificaron usando un instrumento LI-COR ODYSSEY®. Para la expresión de HEK293T, se cuantificaron los rendimientos de IgG purificada con proteína A. Se normalizaron las expresiones a anti-IL-13 WT. n = 3 experimentos.
La FIG. 4D es un gráfico que muestra la termoestabilidad de variantes anti-IL-13 y sus combinaciones medidas por fluorimetría de barrido diferencial (DSF). Todas las variantes que contienen la mutación M4L muestran un incremento de 5 °C en la termoestabilidad independiente del sistema de expresión huésped. Para medir la termoestabilidad, se purificaron Fab e IgG a partir de células E. coli y CHO, respectivamente. Este gráfico muestra los resultados de la transición de Fab (la temperatura a la que se funde la mitad de los Fab), lo que es equivalente a la temperatura de fusión Tf. Los valores de Tf de la fusión de Fab en formatos de anticuerpos IgG y Fab fueron comparables.
La FIG. 5A es una serie de gráficos que muestran el análisis citométrico de flujo del enriquecimiento de la colección estructural anti-VEGF.3 después de cada ronda de FACS™. Estos datos muestran que después de la ronda 1, las variantes de la colección estructural (FR) anti-VEGF.3 se desplazan mejor que anti-VEGF.3 WT o células no teñidas (línea negra, sombreado), y el desplazamiento se pronunció además por la ronda 2.
La FIG. 5B es un gráfico que muestra que un subconjunto de las variantes estructurales anti-VEGF y sus combinaciones que tuvieron una mejora en la expresión en E. coli muestran un incremento correlativo en la expresión en mamífero (HEK293T) (caja delineada). Se normalizó la expresión a anti-VEGF WT y se determinó por una inmunoelectrotransferencia anti-Fc de semianticuerpo (E. coli) o IgG purificada con proteína A (HEK 293T). n = 3 experimentos.
La FIG. 5C es un gráfico que muestra que las variantes estructurales anti-VEGF.3 tienen un incremento en la termoestabilidad y que la combinación de variantes estructurales tiene un efecto aditivo. La fluorimetría de barrido diferencial muestra que las variantes estructurales individuales E6Q, V37I, V48L o V48I (caja izquierda) incrementan la termoestabilidad. Las variantes dobles (caja central) incrementaron además la termoestabilidad, y las variantes triples (caja derecha) tuvieron los mayores incrementos aditivos. Se muestran los valores de transición de Fab de la IgG, n = 3 experimentos.
La FIG. 5D es una representación de la estructura cristalina de anti-VEGF G6 en complejo con VEGF (base de datos de proteínas (PDB) RCSB, número de acceso: 2FJG). Los residuos estructurales identificados que incrementan la expresión y termoestabilidad se muestran en la estructura cristalina de rayos X de anti-VEGF G6 en complejo con VEGF (PDB: 2FJG). Se modelaron las mutaciones V37I y V48I, mientras que Q6 estaba en la estructura de anticuerpo natural. Los tres residuos se localizan dentro de un plano en el núcleo del dominio variable de la cadena pesada (VH). E6 y V48I se localizan en hebras separadas en el núcleo del cuerpo beta del dominio VH, mientras que V37I está en la interfaz oculta entre VH y el dominio variable de la cadena ligera (VL). Dominio constante de la cadena pesada (CH), dominio constante de la cadena ligera (CL).
La FIG. 6 muestra secuencias de aminoácidos de los dominios variables anti-IL-13 de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo anti-IL-13. Un dominio variable de anticuerpo se compone de tres regiones hipervariables (HVR; subrayadas) que están anidadas entre cuatro regiones estructurales (FR). La hipermutación somática puede introducir cambios tanto en FR como en HVR. Al cotejar los datos de la base de datos de Kabat, se recopilaron todos los cambios aminoacídicos que se producen por hipermutación somática dentro de la región estructural de los subtipos variable kappa 4 (Vk4) y pesada 2 (Vh2), que a continuación se redujeron a los residuos no expuestos a disolvente (indicados por residuos aminoacídicos situados bajo las secuencias de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6). Se prepararon variantes estructurales individuales de semianticuerpo anti-IL-13, 5 en la cadena ligera y 28 en la cadena pesada, y se combinaron para cribar por BAD.
La FIG. 7 es un diagrama de cinta del esqueleto de anticuerpo de cadena principal para los dominios variables del anticuerpo anti-VEGF G6 (Fuh et al. J Biol Chem. 281(10):6625-31,2006). Se marcaron las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada. De manera similar al enfoque tomado con el anticuerpo anti-IL-13 (véase la fig. 6), se examinó la base de datos de Kabat para identificar residuos introducidos por hipermutación somática que estaban en la FR de los subtipos variable kappa 1 y pesada 3 (Vk1 y Vh3, respectivamente). Las HVR se excluyeron para mantener la afinidad, mientras que los residuos ocultos (esferas) también se seleccionaron para reducir el riesgo de inmunogenicidad. Con estos criterios, se crearon variantes estructurales individuales de un semianticuerpo anti-VEGF, 47 en la cadena ligera y 36 en la cadena pesada, y estas se combinaron para cribar por BAD.
La FIG. 8 muestra imágenes de placas de medio bacteriano manchadas con las cepas bacterianas indicadas después de la expresión de anticuerpo anti-VEGF.2. Se diluyó en serie 1 DO/ml de células y se sembró sobre placas de LB/carbenicilina para visualizar la viabilidad celular. Diversas cepas de expresión natural mostraron diferentes grados de viabilidad después de la expresión de un anticuerpo anti-VEGF (panel izquierdo). La cepa 62A7 mostró un incremento 1 log en la viabilidad en comparación con la cepa 64B4. La deleción de Ipp en el acervo de cepa 64B4 dio lugar a una disminución 3 log en la viabilidad. La cepa 62A7AIpp mostró un incremento en la viabilidad en comparación con la cepa 64B4L/pp en células que expresaban anticuerpos anti-VEGF o anti-factor tisular (TF) (panel derecho).
La FIG. 9 es una serie de gráficos que muestran el análisis citométrico de flujo de células E. co lique expresan anti-VEGF.V48L teñidas con el tinte de ácido nucleico fluorescente azul indicado. Se observa un intervalo de tinción celular positiva de un 20-90 %. MFI, intensidad de fluorescencia media.
La FIG. 10 es una serie de gráficos que muestran que la concentración celular puede afectar a la presencia de dobletes celulares durante la citometría de flujo durante el cribado con BAD. Dos variantes anti-VEGF, V48L y A97T, se expresaron por separado en la cepa 62A7AIpp, y las células se marcaron con antígeno VEGF conjugado de manera fluorescente a ALEXA FLUOR® 488 y ALEXA FLUOR® 647, respectivamente. Estas células marcadas se combinaron a continuación por igual y se sometieron a análisis citométrico de flujo. Cuando se analizaron las concentraciones de 1x108 células/ml, estaban presentes células que fueron doblemente positivas para ambos tintes ALEXA FLUOR® (panel superior). Sin embargo, la disminución de la concentración celular hasta 1x106 células/ml eliminó los dobletes y solo se observaron células positivas individuales (panel inferior).
La FIG. 11 es un diagrama esquemático que muestra una estrategia de separación por citometría de flujo ejemplar para la presentación bacteriana de anticuerpos. Los anticuerpos se expresan en una cepa de expresión 62A7AIpp E. coli. Las células se seleccionan en primer lugar en base a que son positivas al tinte de ácido nucleico en comparación con un control no teñido. A continuación, las células se seleccionan usando dispersión frontal y lateral. A continuación, se implementan dos ventanas estándar que seleccionan la eliminación del doblete usando la complejidad celular (anchura y altura de dispersión lateral, SSC) y un tamaño celular pequeño (anchura y altura de dispersión frontal, FSC). Finalmente, se seleccionan células positivas para antígeno usando ventanas tomadas por encima de los desplazamientos observados con las células que expresan un anticuerpo que no se une y células no teñidas y/o un vector vacío.
La FIG. 12A es un gráfico que muestra que se pueden separar con éxito células positivas para antígeno marcadas diferencialmente usando la estrategia descrita en el ejemplo 4. Dos variantes anti-VEGF (V48L y A97T) se expresaron por separado en la cepa 62A7úIpp, y las células se marcaron con antígeno VEGF conjugado de manera fluorescente con ALEXA FLUOR® 488 y ALEXA FLUOR® 647, respectivamente. Estas células marcadas se combinaron a continuación una a una y se separaron por ser positivas para un antígeno individual (VEGF-ALEXA FLUOR® 488 o VEGF-ALEXA Fl Uo R® 647), unirse a ambos antígenos (positiva doble) o no unirse a ningún antígeno (negativa doble). La caja verde indica las células que se espera que expresen la variante V48L, mientras que la caja roja indica las células que se espera que expresen la variante A97T. Se sembraron los aportes y resultados de separación y se secuenciaron 96 colonias. El panel derecho es una tabla que muestra el número de acontecimientos separados y el porcentaje de acontecimientos que fueron positivos después del análisis, como se determina ejecutando la muestra separada en el instrumento de citometría de flujo para detectar el porcentaje positivo (% positivo) de unión a antígenos.
La FIG. 12B es una tabla que muestra los resultados del análisis de secuenciación del experimento presentado en la fig. 12A. Con un aporte 1:1 de las dos variantes anti-VEGF (V48L y A97T), cada una se pudo enriquecer por separado hasta casi un 95 % después de una ronda de separación. El número muy bajo de células positivas dobles que se pudieron separar no proporcionó ninguna colonia para secuenciación, mientras que las células negativas dobles que no se unieron a ningún antígeno marcado estaban compuestas de una combinación igual de ambas variantes de anticuerpo, lo que indica que no existió sesgo de selección.
La FIG. 13 es un diagrama de cinta del esqueleto de anticuerpo de cadena principal en base a los subtipos de los dominios variables anti-IL-13. La hipermutación somática puede introducir cambios tanto en las regiones estructurales como en regiones hipervariables. Al cotejar los datos de la base de datos de Kabat, se recopilaron todos los cambios aminoacídicos que se producen por hipermutación somática dentro de la región estructural de los subtipos variable kappa 4 (Vk4) y pesada 2 (Vh2), y a continuación se redujeron las variantes elegidas a los residuos no expuestos a disolvente (esferas). Se prepararon variantes estructurales individuales de semianticuerpo anti-IL-13, 5 en la cadena ligera y 28 en la cadena pesada, y se combinaron para cribar por BAD.
La FIG. 14 es un diagrama esquemático de la estructura de dominio del factor sigma RpoD de E. coli (a70).
Las FIGS. 15A y 15B son diagramas esquemáticos que muestran una estrategia ejemplar para la construcción de una colección de rpoD mutante por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) propensa a error. El plásmido pACYCrpoD (6006 pb) se mutagenizó por PCR propensa a error para generar un tamaño de colección de aproximadamente 106 plásmidos mutantes (fig. 15A). Tras la transformación en E. coli, cada mutante expresa un fenotipo único (indicado por las diferentes flechas presentes en cada célula en la fig. 15B).
Las FIGS. 16A y 16B son diagramas esquemáticos que muestran una estrategia ejemplar para preparar una colección de plásmidos de rpoD mutantes para el cribado con BAD. La cepa 66C4 (AIpp) se transformó con el plásmido MD169 que codifica un anticuerpo anti-IL-13 (fig. 16A). El transformante resultante se transformó además con la colección de plásmidos de rpoD mutantes, generando un grupo de colección bacteriana 66C4 que tiene una diversidad de aproximadamente 106 miembros (figs. 16A y 16B).
Las FIGS. 17A y 17B son diagramas esquemáticos que muestran una estrategia ejemplar para el cribado con BAD de un grupo bacteriano transformado con una colección de plásmidos de rpoD mutantes. El grupo de colección bacteriana 66C4 se cultivó durante 24 h en medio CRAP a 30 °C con agitación a 225 rpm. Se recogió 1 unidad DO, se permeabilizó por tratamiento con EDTA, se incubó con antígeno marcado con fluorescencia (IL-13 humana marcada con ALEXA FLUOR® 647 ("ALEXA®647-hulL-13") y una tinción de ácido nucleico (SYTO®9), y la integridad de la membrana externa se restauró por adición de MgCh. Las células se sometieron a citometría de flujo usando un dispositivo FACSARIA® usando la estrategia de selección indicada (fig. 17B). Se separaron un 1­ 3 % superior de las células en base a la intensidad de señal de ALEXA®647-hulL-13 y se cultivaron para rondas adicionales de BAD.
La FIG. 18 es un gráfico que muestra los resultados del análisis citométrico de flujo de las muestras indicadas del cribado con BAD del grupo de colección bacteriana 66C4 transformado con la colección de plásmidos de rpoD mutantes. La tabla del recuadro muestra la muestra y la intensidad de fluorescencia media ("media").
La FIG. 19 es un diagrama esquemático que muestra tres mutantes de rpoD identificados por cribado con BAD del grupo de colección bacteriana 66C4 transformado con la colección de plásmidos de rpoD mutantes. Los mutantes 1 y 2 son mutantes de truncamiento que incluyen las mutaciones puntuales indicadas relación con RpoD natural. El gráfico de sectores en la parte inferior de la figura muestra el número de mutantes indicados observados de las 96 colonias secuenciadas.
La FIG. 20 es un gráfico que muestra los resultados del análisis citométrico de flujo de las muestras indicadas (E. coli que expresa el mutante de rpoD indicado, RpoD natural o un control de vector vacío). La tabla del recuadro muestra la muestra y la intensidad de fluorescencia media ("media").
La FIG. 21A es una inmunotransferencia que muestra que la expresión de los mutantes de rpoD indicados dio como resultado un incremento en la expresión de anti-IL-13 de longitud completa en células E. coli huésped 66C4 en comparación con células que expresan RpoD natural.
La FIG. 21B es una inmunotransferencia que muestra que la expresión de los mutantes de rpoD indicados dio como resultado un incremento en la expresión de anti-IL-13 de longitud completa en células E. coli huésped 67A6 en comparación con células que expresan RpoD natural.
Descripción detallada de modos de realización de la invención
I. Definiciones
El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido para el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modos de realización que se refieren a ese valor o parámetro per se.
Una "bacteria" como se usa en el presente documento se refiere a una célula bacteriana que incluye una membrana interna (es decir, membrana citoplásmica), un periplasma y una membrana externa. La membrana externa es distinta de la membrana interna y puede comprender, por ejemplo, lipopolisacárido (LPS) y porinas. En algunas divulgaciones, una bacteria es una bacteria gramnegativa. Las especies bacterianas ejemplares incluyen especies de Escherichia (por ejemplo, E. coli), especies de Salmonella (por ejemplo, S. typhimurium y S. entérica) y otras conocidas en la técnica.
El término "polipéptido de unión" se refiere a un polipéptido que se une específicamente a una molécula diana. En algunas divulgaciones, un polipéptido de unión es un anticuerpo. En otras divulgaciones, un polipéptido de unión es, por ejemplo, un mimético de anticuerpo, un receptor de superficie celular, una citocina o un factor de crecimiento. El término "molécula diana" se refiere a una diana de unión específica de un polipéptido de unión. Una molécula diana es típicamente una pequeña molécula, polipéptido o fragmento de polipéptido. La molécula diana puede ser, por ejemplo, un antígeno si el polipéptido de unión es un anticuerpo.
Con respecto a la unión de un polipéptido de unión (por ejemplo, un anticuerpo) a una molécula diana, el término "unión específica" o "se une específicamente" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una molécula diana particular quiere decir la unión que es mensurablemente diferente de una interacción inespecífica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control. Por ejemplo, se puede determinar la unión específica por competencia con una molécula de control que sea similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, la unión específica se indica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe de forma competitiva por un exceso de diana no marcada. El término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular como se usa en el presente documento se puede presentar, por ejemplo, por una molécula que tiene una Kd para la diana de 10-4 M o menor, de forma alternativa de 10-5 M o menor, de forma alternativa de 10-6 M o menor, de forma alternativa de 10-7 M o menor, de forma alternativa de 10-8 M o menor, de forma alternativa de 10-9 M o menor, de forma alternativa de 10-10 M o menor, de forma alternativa de 10-11 M o menor, de forma alternativa de 10-12 M o menor o una Kd en el intervalo de 10-4 M a 10-6 M o de 10-6 M a 10-10 M o de 10-7 M a 10-9 M. Como se apreciará por el experto en la técnica, los valores de afinidad y de Kd están inversamente relacionados. Una alta afinidad por un antígeno se mide por un valor de Kd bajo. En una divulgación, el término "unión específica" se refiere a la unión donde una molécula se une a un polipéptido particular o epítopo en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.
Como se usa en el presente documento, "colección" se refiere a una pluralidad de secuencias de polipéptidos de unión (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo), o los ácidos nucleicos que codifican estas secuencias. Las colecciones ejemplares pueden tener un tamaño de entre aproximadamente 2 polipéptidos de unión a aproximadamente 1014 polipéptidos de unión (por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30, de aproximadamente 2 a aproximadamente 40, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50, de aproximadamente 2 a aproximadamente 60, de aproximadamente 2 a aproximadamente 70, de aproximadamente 2 a aproximadamente 70, de aproximadamente 2 a aproximadamente 80, de aproximadamente 2 a aproximadamente 100, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10-I4 de aproximadamente 2 a aproximadamente 1013, de aproximadamente 2 a aproximadamente 1012, de aproximadamente 2 a aproximadamente 1011, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10io, de aproximadamente 2 a aproximadamente 109, de aproximadamente 2 a aproximadamente 108, de aproximadamente 20 a aproximadamente 108, de aproximadamente 30 a aproximadamente 108, de aproximadamente 40 a aproximadamente 108, de aproximadamente 50 a aproximadamente 108, de aproximadamente 60 a aproximadamente 108, de aproximadamente 70 a aproximadamente 108, de aproximadamente 80 a aproximadamente 108, de aproximadamente 90 a aproximadamente 108, de aproximadamente 100 a aproximadamente 108, de aproximadamente 200 a aproximadamente 108, de aproximadamente 400 a aproximadamente 108, de aproximadamente 600 a aproximadamente 108, de aproximadamente 800 a aproximadamente 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 108, de aproximadamente 104 a aproximadamente 108, de aproximadamente 105 a aproximadamente 108, de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 o de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 polipéptidos de unión).
Una "variante" o "mutante" de un polipéptido de unión de partida o de referencia (por ejemplo, un anticuerpo de referencia), es un polipéptido de unión que (1) tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la del polipéptido de partida o de referencia y (2) se derivó del polipéptido de partida o de referencia a través de mutagénesis natural o bien artificial (sintética). Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión de interés, denominado en el presente documento "alteraciones de residuos aminoacídicos". Por tanto, una HVR variante se refiere a una HVR que comprende una secuencia variante con respecto a una secuencia polipeptídica de partida o de referencia (tal como la de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo fuente). Una alteración de residuo aminoacídico, en este contexto, se refiere a un aminoácido diferente del aminoácido en la posición correspondiente en una secuencia polipeptídica de partida o de referencia (tal como la de un anticuerpo de referencia o fragmento del mismo). Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción variante o mutante final, siempre que la construcción final posea las características funcionales deseadas (por ejemplo, afinidad, estabilidad y/o expresión).
Una secuencia "natural" o de "referencia" o la secuencia de una proteína/polipéptido "natural" o de "referencia", tal como una HVR, FR o dominio variable de un anticuerpo de referencia, puede ser la secuencia de referencia a partir de la que se derivan polipéptidos variantes a través de la introducción de mutaciones. En general, la secuencia "natural" para una proteína dada es la secuencia que es la más común en la naturaleza. De forma similar, una secuencia génica "natural" es la secuencia para ese gen que se encuentra más comúnmente en la naturaleza. Se pueden introducir mutaciones en un gen "natural" (y por tanto la proteína que lo codifica) a través de procesos naturales o bien a través de medios inducidos por el hombre. Los productos de dichos procesos son formas "variantes" o "mutantes" de la proteína o gen "natural" original.
Una "mutación" es una deleción, inserción o sustitución de un nucleótido(s) en relación con una secuencia de nucleótidos de referencia, tal como una secuencia natural.
El término "no penetrante en la membrana" se refiere a la incapacidad de una molécula (por ejemplo, un polipéptido) para difundirse a través de una membrana biológica (por ejemplo, la membrana interna y/o externa de una bacteria) o poro de canal (por ejemplo, una porina). Por el contrario, una molécula "penetrante en la membrana" se puede difundir a través de una membrana biológica. Se debe entender que en algunas condiciones, por ejemplo, a través de los procedimientos de la divulgación, las moléculas que normalmente son no penetrantes en la membrana (por ejemplo, polipéptidos) se pueden difundir en el periplasma de una bacteria, por ejemplo, si la integridad de la membrana externa está comprometida de forma permanente o transitoria.
El término "permeabilidad" como se usa en el presente documento se refiere a la tasa de difusión de una molécula a través de una membrana biológica. Una membrana biológica es "permeable" a una molécula dada si la molécula se puede difundir sustancialmente a través de la membrana. Una membrana biológica es "impermeable" a una molécula dada si la molécula no se puede difundir sustancialmente a través de la membrana. La carga, polaridad y tamaño de una molécula pueden afectar si una membrana biológica es permeable o impermeable a la molécula. Típicamente, las moléculas hidrófobas y moléculas polares no cargadas pequeñas penetran a través de una membrana biológica, mientras que la mayoría de las moléculas solubles en agua (hidrófilas) no penetran. La membrana externa de una bacteria es típicamente impermeable a la difusión de moléculas hidrófilas que tienen un peso molecular de más de aproximadamente 600 daltons (véase, por ejemplo, Decad et al. J. Bacteriology 128(1): 325-336, 1976).
Como se usa en el presente documento, "lipoproteína de membrana externa principal Lpp", también denominada en la técnica "Lpp", "lipoproteína de Braun" y "lipoproteína de mureína", se refiere a cualquier Lpp natural de cualquier fuente bacteriana, incluyendo E. coli o S. typhimurium (también conocida como IkyD), a menos que se indique de otro modo. El término engloba Lpp sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de Lpp que resulta del procesamiento en la célula. Lpp interactúa con peptidoglucano y contribuye al mantenimiento de la integridad estructural y funcional de la envoltura celular. La secuencia de aminoácidos de una Lpp de E. coli (cepa K12) se puede encontrar, por ejemplo, en UniProtKB con número de acceso P69776.
Un "periplasma" es un espacio delimitado por dos barreras selectivamente permeables (por ejemplo, membranas biológicas). En muchas especies de bacterias, incluyendo Escherichia coli, el periplasma es el espacio delimitado por la membrana interna y la membrana externa.
Un "agente de permeabilización" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia química que puede incrementar la permeabilidad de la membrana externa bacteriana, por ejemplo, a una molécula que es típicamente no penetrante en la membrana (por ejemplo, un polipéptido). Los agentes de permeabilización ejemplares incluyen, por ejemplo, quelantes, incluyendo quelantes de cationes divalentes (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; también denominado ácido edético o ácido 2-[2-[bis(carboximetil)amino]etil-(carboximetil)amino]acético), ácido 2-[2-[2-[2-[bis(carboximetil)amino]fenoxi]etoxi]-N-(carboximetil)anilino]acético (BAPTA) y ácido 2-[2-[2-[2-[bis(carboximetil)amino]etoxi]etoxi]etil-(carboximetil)amino]acético (EGTA)), NaCl (Chen et al. Nat. Biotech. 19:537-542, 2001), sacarosa, antibióticos (por ejemplo, aminoglucósidos (por ejemplo, estreptomicina y gentamicina), polimixina B, polimixina desacilada, octapeptina y bencilpenicilina), detergentes, lisozima, Tris, Tris-EDTA, ascorbato, polilisina, cloruro de benzalconio, protamina, proteína bactericida e incrementadora de la permeabilidad (BPI), suero y/o complemento, Ca2+ o combinaciones de los mismos. Véase, por ejemplo, Hancock, Ann. Rev. Microbiol. 38: 237-264, 1984. En algunas divulgaciones, el agente de permeabilización es EDTA.
"Permeabilizar" como se usa en el presente documento quiere decir incrementar la tasa de difusión de una molécula a través de una membrana biológica, por ejemplo, la tasa de difusión de una molécula que es típicamente no penetrante en la membrana (por ejemplo, un polipéptido) a través de una membrana externa bacteriana.
"Polipéptido" se refiere a un péptido o proteína que contiene dos o más aminoácidos unidos por enlaces peptídicos e incluye péptidos, oligómeros, proteínas y similares. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos naturales, modificados o sintéticos. Los polipéptidos también se pueden modificar de forma natural, tal como por procesamiento postraduccional, o químicamente, tal como acilación por amidación, reticulación y similares.
Una "pluralidad" de una sustancia, tal como un polipéptido o polinucleótido de la divulgación, como se usa en el presente documento, se refiere en general a una colección de dos o más tipos o clases de la sustancia. Existen dos o más tipos o clases de una sustancia si dos o más de las sustancias difieren entre sí con respecto a una característica particular, tal como un aminoácido variante encontrado en una posición aminoacídica particular. Por ejemplo, existe una pluralidad de polipéptidos de la divulgación si existen dos o más polipéptidos de la divulgación que son sustancialmente iguales, preferentemente idénticos, en secuencia excepto por la secuencia de una región estructural variante (FR) o excepto por un aminoácido variante en una posición aminoacídica no expuesta a disolvente particular. En otro ejemplo, existe una pluralidad de polinucleótidos de la divulgación si existen dos o más polinucleótidos de la divulgación que son sustancialmente iguales, preferentemente idénticos, en secuencia excepto por la secuencia que codifica una FR variante o excepto por la secuencia que codifica un aminoácido variante para una posición aminoacídica no expuesta a disolvente particular.
El término "resellar" como se usa en el presente documento se refiere a restablecer sustancialmente la barrera de permeabilidad de membrana de una membrana externa bacteriana. En algunas divulgaciones, resellar invierte una permeabilización previa de una membrana externa bacteriana.
El término "gen regulador de la transcripción", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier gen que afecta a la transcripción u otros aspectos de expresión (por ejemplo, traducción, transporte o estabilidad) de un gen que codifica un polipéptido de unión (por ejemplo, un anticuerpo), por ejemplo, globalmente (por ejemplo, afectando a la transcripción de una multitud de genes) o individualmente (por ejemplo, afectando a la transcripción de uno o unos pocos genes). Los genes reguladores de la transcripción ejemplares no limitantes incluyen factores de iniciación de la transcripción (por ejemplo, factores sigma), factores anti-sigma, subunidades de ARN polimerasa y factores de transcripción. En algunas divulgaciones, el factor sigma se selecciona del grupo que consiste en RpoD (a70), RpoE (a24), RpoH (a32), RpoS (a38), RpoN (a54), RpoF (a28) y Fecl (a19). En algunas divulgaciones, el factor sigma es RpoD (a70).
Una "mutación que afecta a un gen regulador de la transcripción" se refiere a cualquier mutación que afecta a la función, nivel de expresión, estabilidad o actividad de un gen regulador de la transcripción. La mutación se puede localizar, por ejemplo, en el propio gen regulador de la transcripción. En otras divulgaciones, la mutación puede residir en una secuencia de ácido nucleico reguladora, por ejemplo, un promotor o potenciador del gen regulador de la transcripción. La mutación puede ser de cualquier tipo conocido en la técnica, por ejemplo, una mutación puntual, una mutación de inserción, una mutación de deleción, una mutación de desplazamiento de marco y similares.
Una "construcción de expresión" se refiere a cualquier elemento de ácido nucleico que puede conferir la expresión de un gen (por ejemplo, un polipéptido de unión (por ejemplo, un anticuerpo) o un gen regulador de la transcripción) en bacterias. Una construcción de expresión se puede referir a un plásmido sintético transformado en una bacteria, una secuencia de ácido nucleico sintética integrada en un genoma bacteriano endógeno o cualquier otro elemento de ácido nucleico adecuado. En algunas divulgaciones, una construcción de expresión es un plásmido sintético.
Como se usa en el presente documento, los términos "mejora" e "incremento", con respecto a la expresión y/o estabilidad de un polipéptido de unión, se refieren a un incremento o potenciación en relación con un nivel de expresión de referencia del polipéptido de unión y/o una estabilidad de referencia del polipéptido de unión. En algunas divulgaciones, el nivel de expresión de referencia puede ser el nivel de expresión de un polipéptido de unión natural. En otras divulgaciones, el nivel de expresión de referencia puede ser el nivel de expresión de un polipéptido de unión variante. En algunas divulgaciones, el nivel de expresión de referencia puede ser el nivel de expresión del polipéptido de unión en una bacteria natural. En algunas divulgaciones, el nivel de expresión de referencia puede ser el nivel de expresión del polipéptido de unión en una bacteria mutante. En algunas divulgaciones, la estabilidad de referencia puede ser la estabilidad de un polipéptido de unión natural. En otras divulgaciones, la estabilidad de referencia puede ser la estabilidad de un polipéptido de unión variante.
Un "plásmido sintético" se refiere a cualquier plásmido no natural (por ejemplo, un plásmido lineal o un plásmido circular) que se puede usar con propósitos de expresión génica, por ejemplo, expresión de un gen que codifica un polipéptido de unión o un gen regulador de la transcripción. Un plásmido sintético puede incluir, por ejemplo, un promotor enlazado de forma funcional al gen de interés, marcadores de resistencia a antibióticos, múltiples sitios de clonación, origen/orígenes de replicación o cualquier otro elemento conocido en la técnica.
Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas divulgaciones, el número de cambios aminoacídicos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunas divulgaciones, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Las divulgaciones ilustrativas y ejemplares específicas para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.
Un anticuerpo con "afinidad madurada" es uno con una o más alteraciones en una o más HVR y/o regiones estructurales lo que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee dicha(s) alteración/alteraciones. Los anticuerpos con afinidad madurada preferentes tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos con afinidad madurada se producen por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Marks et al. Bio/Technology 10:779-783, 1992 describe la maduración de la afinidad por reordenamiento de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de residuos de HVR y/o región estructural se describe por: Barbas et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al. Gene 169:147-155, 1995; Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004, 1995; Jackson et al. J. Immunol. 154(7):3310-3319, 1995; y Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896, 1992.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véase la patente de EE. UU. n.° 5.641.870, ejemplo 2; Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995); moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena ligera (L) entera junto con el dominio VH de la cadena pesada (H), y el primer dominio constante de una cadena pesada (Ch1). El tratamiento con pepsina de un anticuerpo proporciona un único fragmento F(ab')2 grande que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por enlaces disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente y todavía puede reticular el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por tener unos pocos residuos adicionales en el extremo carboxílico del dominio Ch1 incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En una divulgación, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Fv" consiste en un dímero de una región variable de una cadena pesada y una ligera en estrecha asociación no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos aminoacídicos para la unión a antígeno y confieren al anticuerpo especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solo tres H específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a menudo con una afinidad menor que el sitio de unión entero.
"Fv monocatenario", también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios Vh y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños preparados construyendo fragmentos sFv (véase el párrafo precedente) con conectores cortos (de aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL de modo que se logra el emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv de "entrecruzamiento" en los que los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.
Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Determinados anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2 , IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y F, respectivamente.
Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia natural o región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían de acuerdo con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.
"Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que las Ig secretadas unidas sobre receptores Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para dicha destrucción. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch et al. Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991. Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el que se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998.
"Receptor Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferente es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferente es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas empalmadas de forma alternativa de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión M. en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234, 1997). FcR se revisan, por ejemplo, en Ravetch et al. Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Capel et al. Immunomethods 4:25-34, 1994; y de Haas et al. J. Lab. Clin. Med. 126:330-41, 1995. Otros FcR, incluyendo los que se van a identificar en el futuro, se engloban por el término "FcR" en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (véase, por ejemplo, Guyer et al. J. Immunol. 117:587, 1976; y Kim et al. J. Immunol. 24:249, 1994).
Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcyRIII y realizan la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; siendo preferentes PBMC y linfocitos NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente natural, por ejemplo, de sangre.
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la vía del complemento clásica se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada), que se unen a su antígeno análogo. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods 202:163, 1996.
Un "epítopo" es la porción del antígeno a la que el anticuerpo se une específicamente. Para un antígeno polipeptídico, el epítopo es en general una porción peptídica de aproximadamente 4-15 residuos aminoacídicos.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
El término "semianticuerpo" como se usa en el presente documento se refiere a una cadena pesada de inmunoglobulina asociada con una cadena ligera de inmunoglobulina. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que un semianticuerpo puede englobar un fragmento del mismo y también puede tener un dominio de unión a antígeno que consiste en un dominio variable único, por ejemplo, que se origina de un camélido.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos aminoacídicos que aparecen más comúnmente en una selección de secuencias estructurales de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo (también denominado en el presente documento "subtipo") de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD, vols. 1-3, 1991. En una divulgación, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa III o kappa IV como en Kabat et al. supra. En una divulgación, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar además el comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Jones et al. Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al. Nature 332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.
El término "aislado" cuando se usa para describir los diversos anticuerpos divulgados en el presente documento, quiere decir un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular a partir del que se expresó. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían típicamente con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunas divulgaciones, un anticuerpo se purifica a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por procedimientos electroforéticos (por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o fase inversa). Para una revisión de procedimientos para la evaluación de la pureza de anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et al. J. Chromatogr. B 848:79-87, 2007. En algunas divulgaciones, el anticuerpo se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna por el uso de un secuenciador de vaso giratorio, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, plata. El anticuerpo aislado incluye anticuerpos in situ dentro de células recombinantes, debido a que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. Al contrario que con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente divulgación se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.
El término "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL), donde la unidad VH-VL tiene especificidad poliepitópica (es decir, se puede unir a dos epítopos diferentes en una molécula biológica o a cada epítopo en una molécula biológica diferente). Dichos anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de longitud completa, anticuerpos que tienen dos o más dominios VL y VH, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos y triacuerpos biespecíficos, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado covalentemente o no covalentemente. "Especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la(s) misma(s) o diferente(s) diana(s). "Doble especificidad" o "biespecificidad" se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos epítopos diferentes en la(s) misma(s) o diferente(s) diana(s). Sin embargo, al contrario que los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos de doble especificidad tienen dos brazos de unión a antígeno que son idénticos en su secuencia de aminoácidos y cada brazo Fab puede reconocer a dos antígenos. La doble especificidad permite a los anticuerpos interactuar con alta afinidad con dos antígenos diferentes como una única molécula de Fab o IgG. De acuerdo con una divulgación, el anticuerpo multiespecífico en una forma IgG1 se une a cada epítopo con una afinidad de 5 |jM a 0,001 pM, de 3 |jM a 0,001 pM, de 1 |jM a 0,001 pM, de 0,5 |jM a 0,001 pM o de 0,1 |jM a 0,001 pM. "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de unirse solo a un epítopo.
Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no se conjuga con un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una composición farmacéutica.
El término "variable" se refiere al hecho de que determinados segmentos de los dominios variables difieren ampliamente en su secuencia entre anticuerpos. El dominio variable o "V" media en la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables llamados regiones estructurales (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema llamadas "regiones hipervariables" que tienen cada una 9-12 aminoácidos de longitud. El término "región hipervariable" o "HVR" cuando se usa en el presente documento se refiere a los residuos aminoacídicos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable en general comprende residuos aminoacídicos de, por ejemplo, alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (l2) y 89-97 (L3) en VL, y alrededor de aproximadamente los residuos 26-35 (H1), 49­ 65 (H2) y 95-102 (H3) en VH (en una divulgación, H1 es alrededor de aproximadamente los residuos 31-35); Kabat et al. supra) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en VL, y 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96-101 (H3) en VH; Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro FR, adoptando en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al. supra). En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
El término "numeración de residuos de dominio variable según Kabat" o "numeración de posiciones aminoacídicas según Kabat", y variaciones del mismo, se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o adicionales correspondientes a un acortamiento de o inserción en una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción aminoacídica (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada según Kabat "estándar".
El sistema de numeración de Kabat se usa en general cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al. supra). El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se usa en general cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU informado en Kabat et al. supra). El "índice EU según Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo humano IgG1 EU. A menos que se establezca de otro modo en el presente documento, las referencias a números de residuo en el dominio variable de los anticuerpos quieren decir la numeración de residuos por el sistema de numeración de Kabat. A menos que se establezca de otro modo en el presente documento, las referencias a números de residuo en el dominio constante de los anticuerpos quieren decir la numeración de residuos por el sistema de numeración EU (por ejemplo, véase la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 60/640.323, figuras para numeración EU).
Como se usa en el presente documento, "interleucina-13 (IL-13)" se refiere a cualquier IL-13 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otro modo. IL-13 es una citocina secretada por muchos tipos de células, incluyendo linfocitos T colaboradores tipo 2 (Th2). El término engloba IL-13 sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de IL-13 que resulta del procesamiento en la célula. La secuencia de aminoácidos de una IL-13 humana ejemplar se puede encontrar, por ejemplo, en UniProtKB con número de acceso P35225. IL-13 se une al receptor de IL-13, que puede incluir el receptor alfa de IL-4 (IL4Ra) en complejo con la subunidad alfa1 del receptor de IL-13 (IL13RA1) o la subunidad alfa2 del receptor de IL-13 (IL13RA2). Por ejemplo, IL-13 se puede unir a un complejo de receptor alfa de IL-4 y subunidad alfa1 del receptor de IL-13.
Los términos "anticuerpo anti-IL-13", un "anticuerpo que se une a IL-13" y "anticuerpo que se une específicamente a IL-13" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a IL-13 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a IL-13. En una divulgación, el grado de unión de un anticuerpo anti-IL-13 a una proteína distinta de IL-13 no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a IL-13 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinadas divulgaciones, un anticuerpo que se une a IL-13 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10' 8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10‘9 M a 10‘13 M). En determinadas divulgaciones, un anticuerpo anti-IL-13 se une a un epítopo de IL-13 que se conserva entre IL-13 de diferentes especies. Los anticuerpos anti-IL-13 ejemplares incluyen, pero no se limitan a, lebrikizumab, 228B/C-1, 228A-4, 227-26 y 227-43 (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 7.674.459; 8.067.199; 8.088.618; 8.318.160; y 8.734.797).
El término "factor de crecimiento endotelial vascular" o "VEGF" como se usa en el presente documento se refiere al factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 165 aminoácidos y a los factores de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 121, 189 y 206 aminoácidos relacionados, como se describe por Leung et al. Science 246: 1306, 1989 y Houck et al. Mol. Endocrin. 5: 1806, 1991, conjuntamente con las formas procesadas y alélicas naturales de los mismos. El término "VEGF" también se refiere a VEGF de especies no humanas, tales como ratón, rata o primate. A veces, el VEGF de una especie específica se indica por términos tales como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino y etc. El término "VEGF" también se usa para referirse a formas truncadas del polipéptido que comprende los aminoácidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 165 aminoácidos. La referencia a cualquiera de dichas formas de VEGF se puede identificar en la presente solicitud, por ejemplo, por "VEGF109", "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" o "VEGF165". Las posiciones aminoacídicas para un VEGF natural "truncado" se numeran como se indica en la secuencia de VEGF natural. Por ejemplo, la posición aminoacídica 17 (metionina) en VEGF natural truncado también es la posición 17 (metionina) en VEGF natural. El VEGF natural truncado tiene afinidad de unión por los receptores KDR y Flt-1 en comparación con VEGF natural. El término "variante de VEGF" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido VEGF que incluye una o más mutaciones aminoacídicas en la secuencia de VEGF natural. Opcionalmente, la una o más mutaciones aminoacídicas incluyen sustitución/sustituciones aminoacídica(s). Con el propósito de designación abreviada de variantes de VEGF descritas en el presente documento, cabe señalar que los números se refieren a la posición del residuo aminoacídico a lo largo de la secuencia de aminoácidos del supuesto VEGF natural (proporcionada en Leung et al., supra y Houck et al., supra). A menos que se especifique de otro modo, el término "VEGF" como se usa en el presente documento indica VEGF-A.
Los términos "anticuerpo anti-VEGF", un "anticuerpo que se une a VEGF" y "anticuerpo que se une específicamente a VEGF" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a VEGF con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a VEGF. En una divulgación, el grado de unión de un anticuerpo anti-VEGF a una proteína distinta de VEGF no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a VEGF como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinadas divulgaciones, un anticuerpo que se une a VEGF tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, de Í0 '8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinadas divulgaciones, un anticuerpo anti-VEGF se une a un epítopo de VEGF que se conserva entre VEGF de diferentes especies.
Los ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-VEGF incluyen, por ejemplo y sin limitación, el anticuerpo anti-VEGF "bevacizumab (BV o Bev)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®", que es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997). Bevacizumab comprende regiones estructurales de IgG1 humana mutadas y regiones determinantes de la complementariedad de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloquea la unión de VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente un 93 % de la secuencia de aminoácidos de bevacizumab, incluyendo la mayoría de las regiones estructurales, se deriva de IgG1 humana, y aproximadamente un 7 % de la secuencia se deriva del anticuerpo murino A4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149.000 daltons y está glucosilado. Otros anticuerpos anti-VEGF ejemplares incluyen, por ejemplo, los anticuerpos descritos en la patente de EE. UU. n.° 6.884.879 y el documento w O 2005/044853. Otro ejemplo incluye el anticuerpo anti-VEGF ranibizumab (anticuerpo LUCENTIS® o rhuFab V2), que es un fragmento Fab anti-VEGF humano con afinidad madurada humanizado. Ranibizumab se produce por procedimientos de tecnología recombinante estándar en el vector de expresión de E. coli y fermentación bacteriana. Ranibizumab no está glucosilado y tiene una masa molecular de ~48.000 daltons. Véanse los documentos WO 1998/45331 y US 2003/0190317.
Como se usa en el presente documento, "administrar" quiere decir un procedimiento de dar una dosificación de un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación o un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la divulgación) o una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica, por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo de la divulgación) a un sujeto. Las composiciones utilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento se pueden administrar, por ejemplo, por vía intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutánea, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intravítrea, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, intraorbital, oral, tópica, transdérmica, por inhalación, por inyección, por implantación, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada con baño de células diana directo, por catéter, por lavado, en cremas o en composiciones lipídicas. Las composiciones utilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento también se pueden administrar por vía sistémica o local. El procedimiento de administración puede variar dependiendo de diversos factores (por ejemplo, el compuesto o composición que se administra y la gravedad de la afección, enfermedad o trastorno que se trata).
"Angiogénesis" se refiere al proceso a través del que se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos preexistentes. La angiogénesis es distinta de la vasculogénesis, que es la formación de novo de células endoteliales a partir de precursores de células del mesodermo. Los trastornos asociados con angiogénesis patológica se pueden tratar por composiciones y procedimientos de la divulgación. Estos trastornos incluyen tanto trastornos no neoplásicos como trastornos de proliferación celular. Los trastornos de proliferación celular incluyen pero no se limitan a los descritos a continuación. Los trastornos no neoplásicos incluyen pero no se limitan a afecciones oculares (las afecciones oculares no limitantes incluyen, por ejemplo, retinopatía incluyendo retinopatía diabética proliferativa, neovascularización coroidea (NVC), degeneración macular senil (AMD), diabetes y otras retinopatías relacionadas con isquemia, edema macular diabético (DME), miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión de la vena retiniana (incluyendo formas central (CRVO) y ramificada (BRVO)), neovascularización corneal, neovascularización retiniana, retinopatía del prematuro (ROP), vitreorretinopatía exudativa familiar (FEVR), enfermedad de Coats, enfermedad de Norrie, síndrome de osteoporosis-pseudoglioma (OPPG), hemorragia subconjuntival y retinopatía hipertensiva), hipertrofia no deseada 0 anómala, artritis, artritis reumatoide (AR), psoriasis, placas psoriásicas, sarcoidosis, ateroesclerosis, placas ateroescleróticas, reestenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (MAV), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias tiroideas (incluyendo enfermedad de Grave), trasplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/SDRA, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, derrames pulmonares malignos, edema cerebral (por ejemplo, asociado con ictus en fase aguda/traumatismo craneoencefálico cerrado/traumatismo), inflamación sinovial, formación de paño en AR, miositis osificante, formación de hueso hipertrófico, artrosis (OA), ascitis refractaria, enfermedad de ovario poliquístico, endometriosis, enfermedades por acumulación de líquido al tercer espacio (pancreatitis, síndrome compartimental, quemaduras, enfermedad intestinal), fibromas uterinos, parto prematuro, inflamación crónica tal como EII (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), rechazo de aloinjerto renal, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome nefrótico, crecimiento de masa tisular no deseado o anómalo (no canceroso), artropatía hemofílica, cicatrices hipertróficas, inhibición del crecimiento del cabello, síndrome de Osler-Weber, granuloma piógeno, fibroplasias retrolentales, esclerodermia, tracoma, adherencias vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, derrame pericárdico (tal como el asociado con pericarditis) y derrame pleural.
Un "agente antiangiogénico" o "inhibidor de la angiogénesis" se refiere a una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhibe la angiogénesis, vasculogénesis o permeabilidad vascular indeseable, directa o bien indirectamente. Se debe entender que el agente antiangiogénico incluye los agentes que se unen y bloquean la actividad angiogénica del factor angiogénico o su receptor. Por ejemplo, un agente antiangiogénico es un anticuerpo u otro antagonista de un agente angiogénico como se define anteriormente, por ejemplo, anticuerpos para VEGF-A o para el receptor de VEGF-A (por ejemplo, receptor KDR o receptor Flt-1), inhibidores anti-PDGFR tales como GLEEVEC™ (mesilato de imatinib). Los agentes antiangiogénicos también incluyen inhibidores de angiogénesis naturales, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Véanse, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por ejemplo, la tabla 3 que enumera tratamiento antiangiogénico en melanoma maligno); Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, la tabla 2 que enumera factores antiangiogénicos conocidos); y, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por ejemplo, la tabla 1 enumera agentes antiangiogénicos usados en ensayos clínicos).
"Asma" se refiere a una enfermedad pulmonar crónica que puede implicar inflamación de las vías respiratorias, hiperreactividad y obstrucción. Fisiológicamente, la hiperreactividad de las vías respiratorias se documenta por una disminución en el flujo de aire bronquial después de broncoprovocación con metacolina o histamina. La provocación bronquial con alérgeno induce una disminución mediada por inmunoglobulina E (IgE) de fase temprana rápida del flujo de aire bronquial seguida en muchos pacientes por una reacción mediada por IgE de fase tardía con una disminución en el flujo de aire bronquial durante 4-8 horas. La respuesta temprana está provocada por la liberación aguda de sustancias inflamatorias, tales como histamina, PGD2, leucotrienos, triptasa y factor activador plaquetario (FAP), mientras que la respuesta tardía está provocada por citocinas proinflamatorias sintetizadas de novo (por ejemplo, TNFa, IL-4, IL-13) y quimiocinas (por ejemplo, MCP-1 y MIP-1a) (Busse et al. Allergy: Principles and Practice, Ed. Middleston, 1173, 1998). En pacientes asmáticos crónicos, los síntomas pulmonares persistentes están mediados por la respuesta aumentada de linfocitos Th2. Se cree que las citocinas de Th2 desempeñan un papel vital en la enfermedad (Larche et al. J. Allergy Clin. Immunol. 111:450, 2003), en particular, IL-13 e IL-4 producidas por linfocitos Th2 con fenotipo NK (NKT) en las vías respiratorias como se indica en un modelo de asma en roedores (Akbari et al. Nature Med., 9: 582, 2003). La anatomía patológica macroscópica de las vías respiratorias asmáticas presenta hiperinsuflación pulmonar, hipertrofia del músculo liso, engrosamiento de la lámina reticular, edema mucoso, desprendimiento de células epiteliales, ruptura celular ciliar e hipersecreción de la glándula mucosa. Microscópicamente, el asma se caracteriza por la presencia de un incremento en el número de eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y células plasmáticas en los tejidos bronquiales, secreciones bronquiales y moco. Inicialmente, existe un reclutamiento de leucocitos desde la circulación sanguínea a las vías respiratorias por linfocitos T CD4+ activados. Los linfocitos T activados también dirigen la liberación de mediadores inflamatorios de eosinófilos, mastocitos y linfocitos. Además, los linfocitos Th2 producen IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. IL-4, conjuntamente con IL-13, señala el cambio de anticuerpos IgM a IgE.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma pulmonar de células escamosas), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, melanoma, melanoma de extensión superficial, melanoma lentigo maligno, melanomas lentiginosos acros, melanomas nodulares, así como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no hodgkiniano (LNH) folicular/de grado bajo; LNH linfocítico pequeño (LP); LNH folicular/de grado intermedio; LNH difuso de grado intermedio; LNH inmunoblástico de grado alto; LNH linfoblástico de grado alto; LNH de células pequeñas no escindidas de grado alto; LNH voluminoso; linfoma de células de manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfocítica aguda (LLA); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo postrasplante (TLPT), así como proliferación vascular anómala asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y síndrome de Meigs.
Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que se asocian con algún grado de proliferación celular anómala. En una divulgación, el trastorno proliferativo celular es cáncer.
Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no son mutuamente excluyentes como se hace referencia en el presente documento.
"Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásicos, ya sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.
Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento, por ejemplo, con un anticuerpo terapéutico. En algunas divulgaciones, un trastorno puede ser un trastorno mediado por IL-13 o un trastorno mediado por IgE. En otras divulgaciones, un trastorno puede implicar angiogénesis anómala o patológica (por ejemplo, angiogénesis excesiva, inapropiada o incontrolada) o permeabilidad vascular. Un trastorno puede ser crónico o agudo.
Un "agente quimioterápico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (en especial bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adocelesina, carcelesina y bicelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiína; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de mecloretamina clorhidrato, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediína (por ejemplo, caliqueamicina, en especial caliqueamicina gamma II y caliqueamicina omega ll (véase, por ejemplo, Nicolaou et al. Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor de alfa-4 integrina oral; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como neocarzinostatina cromóforo y cromóforos antibióticos de cromoproteína enediína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina, inyección liposomal de doxorrubicina HCl (DOXIL®), doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina liposomal pegilada (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); combretastatina; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidracida; procarbazina; PSK® complejo polisacárido (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2'-tridorotrietilamina; tricotecenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de nanopartículas genomanipuladas con albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™), y docetaxel (TAXOTERE®, Rhome-Poulene Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®) y carboplatino; vincas, que previenen que la polimerización de tubulina forme microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano nucleósido de citosina); oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) (por ejemplo, erlotinib (TARCEVa ™)); y VEGF-A que reducen la proliferación celular; vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de tratamientos génicos, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARe LiX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteosomas (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®); CCl-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sodio (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de EGFR; inhibidores de tirosina cinasa; inhibidores de serina-treonina cinasa tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASa R™); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una politerapia de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
Los agentes quimioterápicos como se define en el presente documento incluyen "agentes antihormonales" o "tratamientos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser hormonas en sí mismas, incluyendo, pero sin limitarse a: antiestrógenos con perfil agonista/antagonista mixto, incluyendo tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, keoxifeno y moduladores de receptores de estrógenos selectivos (SERM), tales como SERM3; antiestrógenos puros sin propiedades agonistas, tales como fulvestrant (FASLODEX®) y EM800 (dichos agentes pueden bloquear la dimerización de receptores de estrógenos (ER), inhibir la unión a ADN, incrementar el recambio de ER y/o inhibir los niveles de ER); inhibidores de la aromatasa, incluyendo inhibidores de la aromatasa esteroideos, tales como formestano y exemestano (AROMASIN®) e inhibidores de la aromatasa no esteroideos, tales como anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de la aromatasa incluyen vorozol (RIVISOR®), acetato de megestrol (MEGASE®), fadrozol y 4(5)-imidazoles; agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante, incluyendo leuprorelina (LUPRON® y ELIGARD®), goserelina, buserelina y tripterelina; esteroides sexuales, incluyendo progestinas tales como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos tales como dietilestilbestrol y premarina, y andrógenos/retinoides tales como fluoximesterona, ácido holo-trans-retinoico y fenretinida; onapristona; antiprogesteronas; reguladores por disminución de receptores de estrógenos (ERD); antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de micromoléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados en el presente documento.
Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, in vitro o bien in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Los bloqueantes de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Estos agentes que interrumpen la G1 también actúan extendiéndose a la interrupción de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluoruracilo y Ara-C. Otra información se puede encontrar en Mendelsohn et al. eds., The Molecular Basis of Cancer, capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), por ejemplo, p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos antineoplásicos derivados ambos del árbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos previniendo la despolimerización, lo que da como resultado la inhibición de mitosis en células.
El término "trastorno mediado por IL-13", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier trastorno o afección mediada por, o asociada con, IL-13. En algunas divulgaciones, los trastornos mediados por IL-13 se asocian con un exceso en los niveles o actividad de IL-13 en los que los síntomas atípicos se pueden manifestar debido a los niveles o actividad de IL-13 local y/o sistémicamente en el cuerpo. Los trastornos mediados por IL-13 incluyen, por ejemplo, alergia, asma (incluyendo asma alérgica, asma atópica, asma grave y asma no alérgica (intrínseca)), enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, psoriasis, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn) u otra enfermedad inflamatoria. Por ejemplo, los trastornos mediados por IL-13 incluyen: rinitis alérgica (por ejemplo, rinitis alérgica estacional), dermatitis atópica, conjuntivitis alérgica, eccema, urticaria, alergias alimentarias, hipersensibilidad alimentaria, celiaquía, enfermedades cutáneas inmunitarias (incluyendo, por ejemplo, enfermedades cutáneas ampollosas, eritema multiforme, dermatitis de contacto), fibrosis, fibrosis hepática, fibrosis endomiocárdica, bronquitis crónica, bronquiectasia, neumonía intersticial idiopática, metaplasia de células caliciformes, trastornos inflamatorios pulmonares, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas (incluyendo, por ejemplo, fibrosis quística, fibrosis pulmonar idiopática y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)), enfermedad celíaca, enfermedad de Whipple, enfermedades inmunológicas del pulmón (incluyendo, por ejemplo, neumonía eosinofílica (por ejemplo, neumonía eosinofílica crónica), fibrosis pulmonar idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica y neumonitis por hipersensibilidad), síndrome de Churg-Strauss (periarteritis nodosa más atopia), síndrome miálgico eosinofílico, síndrome hipereosinofílico, reacciones edematosas (incluyendo, por ejemplo, angiodema episódico, esofagitis eosinofílica, gastritis eosinofílica, gastroenteritis eosinofílica, enteritis eosinofílica y colitis eosinofílica), micropoliposis nasal y poliposis, infección por VRS, uveítis, esclerodermia, osteoporosis y tumores malignos, incluyendo cánceres o tumores asociados con expresión anómala de IL-13 (incluyendo, por ejemplo, linfoma de Hodgkin).
El término "trastorno mediado por IgE", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier trastorno o afección mediada por, o asociada con, IgE. Los trastornos mediados por IgE ejemplares incluyen asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis alérgica, urticaria, anafilaxia o dermatitis atópica.
Un "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante enlazada de forma funcional en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión a ribosoma. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
El término "nivel de expresión" en general se refiere a la cantidad de un polinucleótido o un producto de aminoácido o proteína en una muestra biológica. "Expresión" en general se refiere al proceso por el que la información codificada por genes se convierte en las estructuras presentes y en funcionamiento en la célula. Por lo tanto, de acuerdo con la divulgación, la "expresión" de un gen se puede referir a la transcripción en un polinucleótido, traducción en una proteína o incluso modificación postraduccional de la proteína. Los fragmentos del polinucleótido transcrito, la proteína traducida o la proteína modificada postraduccionalmente también se considerarán expresados si se originan de un transcrito generado por empalme alternativo o un transcrito degradado, o de un procesamiento postraduccional de la proteína, por ejemplo, por proteólisis. Los "genes expresados" incluyen los que se transcriben en un polinucleótido como ARNm y a continuación se traducen en una proteína, y también los que se transcriben en ARN, pero no se traducen en una proteína (por ejemplo, a Rn de transferencia y ribosómicos).
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.
El ácido nucleico se "enlaza de forma funcional" cuando se coloca en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora se enlaza de forma funcional al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se enlaza de forma funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se enlaza de forma funcional a una secuencia codificante si se sitúa para facilitar la traducción. En general, "enlazado de forma funcional" quiere decir que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, son contiguas y están en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por fijación en sitios de restricción accesibles. Si dichos sitios no existen, se usan los conectores o adaptadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias polipeptídicas identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en el polipéptido que se está comparando, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
Las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento son secuencias de aminoácidos contiguos, a menos que se especifique de otro modo.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente de una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
El término "profármaco" como se usa en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para células tumorales en comparación con el fármaco original y se puede activar o convertir enzimáticamente en la forma original más activa. Véanse, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al. "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con aminoácidos D, profármacos glucosilados, profármacos que contienen p-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para su uso en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterápicos descritos anteriormente.
Por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad para provocar una disminución global preferentemente de un 20 % o mayor, más preferentemente de un 5o % o mayor, y lo más preferentemente de un 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o mayor. Reducir o inhibir se puede referir a los síntomas del trastorno que se trata, la presencia o tamaño de las metástasis, el tamaño del tumor primario.
Un "paciente", "sujeto" o "individuo" es un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja (tales como vacas y ovejas), animales de competición, mascotas (tales como gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas).
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto. En el caso de un trastorno mediado por IL-13, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-13) puede mejorar o tratar la enfermedad, o prevenir, reducir, mejorar o tratar síntomas asociados con la enfermedad. En el caso de un trastorno asociado con angiogénesis patológica, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) puede mejorar o tratar la enfermedad, o prevenir, reducir, mejorar o tratar síntomas asociados con la enfermedad. En el caso de una enfermedad proliferativa (por ejemplo, un tumor sólido), la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño tumoral primario; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede prevenir el crecimiento de y/o destruir células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para el tratamiento de cáncer, la eficacia in vivo se puede medir, por ejemplo, evaluando la duración de la supervivencia, tiempo transcurrido hasta la progresión de la enfermedad (t Tp ), duración de la supervivencia sin enfermedad (DFS), duración de la supervivencia sin progresión (PFS), las tasas de respuesta (RR), duración de la respuesta y/o calidad de vida.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se trata, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el trascurso de análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunas divulgaciones, se usan anticuerpos para retrasar el desarrollo de una enfermedad o ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término "vector", como se usa en el presente documento, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico a la que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden fijar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden fijar segmentos de a Dn adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores se pueden replicar de manera autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Se pueden integrar otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinado vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes" o "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar de manera intercambiable.
II. Procedimientos y composiciones
En un aspecto, la divulgación se basa, en parte, en procedimientos novedosos de identificación de bacterias que comprenden polipéptidos de unión, por ejemplo, procedimientos de cribado de bacterias que expresan anticuerpos que se unen a un antígeno marcado. Los procedimientos de la divulgación son útiles, por ejemplo, para cribar anticuerpos, por ejemplo, con una mejora en la expresión, estabilidad y/o afinidad. En otro aspecto, la divulgación se basa, en parte, en anticuerpos novedosos que se unen a IL-13 o VEGF. Los anticuerpos anti-IL-13 de la divulgación son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos mediados por IL-13. Los anticuerpos anti-VEGF descritos en el presente documento son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos asociados con angiogénesis patológica (por ejemplo, cáncer) y/o para inhibir la permeabilidad vascular.
A. Procedimientos ejemplares de la invención
La divulgación proporciona procedimientos de identificación de una bacteria que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana. La divulgación también proporciona procedimientos de identificación de una bacteria que tiene una mejora en la expresión de un polipéptido de unión. La divulgación también proporciona procedimientos de identificación de un polipéptido de unión que tiene una mejora en la expresión y/o estabilidad.
Por ejemplo, en algunos casos, la divulgación proporciona un procedimiento para identificar una bacteria que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: (a) proporcionar una bacteria que tiene una membrana externa permeable a una molécula que tiene un peso molecular mayor que aproximadamente 1 kDa (por ejemplo, aproximadamente 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa, 15 kDa, 16 kDa, 17 kDa, 18 kDa, 19 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa o mayor), expresando la bacteria un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión candidato, en el que el polipéptido de unión candidato está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; y (c) identificar la bacteria que comprende un polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunas divulgaciones, la bacteria permanece viable después de la etapa (c). En algunas divulgaciones, la molécula diana se marca usando un marcador unido covalentemente. En otras divulgaciones, la molécula diana se marca usando un marcador unido no covalentemente.
En otro ejemplo, en algunos casos, la divulgación proporciona un procedimiento para identificar una bacteria con una mejora en la expresión de un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: (a) proporcionar una bacteria que tiene una membrana externa permeable a una molécula que tiene un peso molecular mayor que aproximadamente 1 kDa (por ejemplo, aproximadamente 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa, 15 kDa, 16 kDa, 17 kDa, 18 kDa, 19 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa o mayor), expresando la bacteria un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión, en el que el polipéptido de unión está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; y (c) identificar la bacteria que tiene una mejora en la expresión del polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunas divulgaciones, la bacteria permanece viable después de la etapa (c). En algunas divulgaciones, la molécula diana se marca usando un marcador unido covalentemente. En otras divulgaciones, la molécula diana se marca usando un marcador unido no covalentemente.
En algunos casos de cualquiera de los procedimientos precedentes, el procedimiento incluye además repetir las etapas del procedimiento al menos una vez. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir además repetir las etapas del procedimiento al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces. En algunas divulgaciones, se repite al menos una etapa del procedimiento. En algunos casos, todas las etapas del procedimiento se pueden repetir al menos una vez (por ejemplo, repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces). En algunos casos, todas las etapas del procedimiento se pueden repetir secuencialmente al menos una vez (por ejemplo, repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces). En algunos casos, las etapas del procedimiento se repiten 2 veces. En algunos casos, las etapas del procedimiento se repiten 3 veces. En algunos casos, se repiten las siguientes etapas: (a) proporcionar una bacteria que tiene una membrana externa permeable a una molécula que tiene un peso molecular mayor que aproximadamente 1 kDa (por ejemplo, aproximadamente 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa, 15 kDa, 16 kDa, 17 kDa, 18 kDa, 19 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa o mayor), expresando la bacteria un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión candidato, en el que el polipéptido de unión candidato está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; y (c) identificar la bacteria que comprende un polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunos casos, el procedimiento comprende además incubar la bacteria en un medio de crecimiento antes de repetir las etapas del procedimiento. Los ejemplos de medios de crecimiento bacteriano incluyen CRAP, SOC, caldo Luria (LB) o cualquier otro medio de crecimiento bacteriano conocido en la técnica.
En algunos casos de cualquiera de los procedimientos precedentes, la molécula diana tiene un peso molecular menor que aproximadamente 500 kDa (por ejemplo, menor que aproximadamente aproximadamente 500 kDa, aproximadamente 480 kDa, aproximadamente 460 kDa, aproximadamente 440 kDa, aproximadamente 420 kDa, aproximadamente 440 kDa, aproximadamente 420 kDa, aproximadamente 400 kDa, aproximadamente 380 kDa, aproximadamente 360 kDa, aproximadamente 340 kDa, aproximadamente 320 kDa, aproximadamente 300 kDa, aproximadamente 280 kDa, aproximadamente 260 kDa, aproximadamente 250 kDa, aproximadamente 220 kDa, aproximadamente 200 kDa, aproximadamente 180 kDa, aproximadamente 160 kDa, aproximadamente 150 kDa, aproximadamente 130 kDa, aproximadamente 120 kDa, aproximadamente 110 kDa, aproximadamente 100 kDa, aproximadamente 80 kDa, aproximadamente 60 kDa, aproximadamente 40 kDa o aproximadamente 20 kDa). Las moléculas diana ejemplares tienen pesos moleculares en los intervalos de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 500 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 230 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 220 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 180 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 160 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 140 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 120 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 80 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 60 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 40 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 10 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 500 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 220 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 180 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 160 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 140 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 120 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 80 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 60 kDa, de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 40 kDa o de aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 20 kDa.
En algunos casos de cualquiera de los procedimientos precedentes, la molécula diana tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDa o mayor. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, la molécula diana tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 700 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 600 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 500 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 480 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 470 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 460 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 450 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 440 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 430 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 420 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 410 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 390 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 380 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 370 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 360 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 350 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 340 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 330 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 320 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 310 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 290 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 280 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 270 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 260 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 250 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 240 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 230 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 220 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 210 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 190 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 180 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 170 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 160 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 150 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 140 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 130 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 120 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 110 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 90 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 80 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 70 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 60 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 40 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 30 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 20 kDa o de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 15 kDa.
En algunos casos, la divulgación proporciona un procedimiento para identificar una bacteria que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: (a) proporcionar una bacteria que comprende una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma, expresando la bacteria un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión candidato, en el que el polipéptido de unión candidato está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; y (c) identificar la bacteria que comprende un polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunas divulgaciones, la bacteria permanece viable después de la etapa (c). En algunos casos, el procedimiento comprende además someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa de la bacteria antes de la etapa (b). En algunos casos, el procedimiento comprende además resellar la membrana externa de la bacteria después de poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable.
En otros casos, la divulgación proporciona un procedimiento para identificar una bacteria con una mejora en la expresión de un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: (a) proporcionar una bacteria que comprende una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma, expresando la bacteria un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión, en el que el polipéptido de unión está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; y (c) identificar la bacteria que tiene una mejora en la expresión del polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunas divulgaciones, la bacteria permanece viable después de la etapa (c). En algunos casos, el procedimiento comprende además someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa de la bacteria antes de la etapa (b). En algunos casos, el procedimiento comprende además resellar la membrana externa de la bacteria después de poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable.
En algunos casos de cualquiera de los procedimientos precedentes, el procedimiento incluye además repetir las etapas del procedimiento al menos una vez. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir además repetir las etapas del procedimiento al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces. En algunas divulgaciones, se repite al menos una etapa del procedimiento. En algunos casos, todas las etapas del procedimiento se pueden repetir al menos una vez (por ejemplo, repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces). En algunos casos, todas las etapas del procedimiento se pueden repetir secuencialmente al menos una vez (por ejemplo, repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces). En algunos casos, las etapas del procedimiento se repiten 2 veces. En algunos casos, las etapas del procedimiento se repiten 3 veces. En algunos casos, se repiten las siguientes etapas: (a) proporcionar una bacteria que comprende una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma, expresando la bacteria un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión candidato, en el que el polipéptido de unión candidato está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; y (c) identificar la bacteria que comprende un polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunos casos, el procedimiento comprende además incubar la bacteria en un medio de crecimiento antes de repetir las etapas del procedimiento.
En otros casos, la divulgación proporciona un procedimiento para identificar una bacteria que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) proporcionar una bacteria que expresa un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión candidato, en el que el polipéptido de unión candidato está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa de la bacteria; (c) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; (d) resellar la membrana externa de la bacteria después de la etapa (c) ; y (e) identificar la bacteria que comprende un polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunos casos, la bacteria permanece viable después de la etapa (e) del procedimiento.
Aún en otros casos, la divulgación proporciona un procedimiento para identificar una bacteria con una mejora en la expresión de un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) proporcionar una bacteria que expresa un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión, en el que el polipéptido de unión está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa de la bacteria; (c) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; (d) resellar la membrana externa de la bacteria después de la etapa (c); y (e) identificar la bacteria que tiene una mejora en la expresión del polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunos casos, la bacteria permanece viable después de la etapa (e) del procedimiento.
En algunos casos, el procedimiento incluye además repetir las etapas del procedimiento al menos una vez. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir además repetir las etapas del procedimiento al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces. En algunas divulgaciones, se repite al menos una etapa del procedimiento. En algunos casos, todas las etapas del procedimiento se pueden repetir al menos una vez (por ejemplo, repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces). En algunos casos, todas las etapas del procedimiento se pueden repetir secuencialmente al menos una vez (por ejemplo, repetir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces). En algunos casos, las etapas del procedimiento se repiten 2 veces. En algunos casos, las etapas del procedimiento se repiten 3 veces. En algunos casos, se repiten las siguientes etapas: (a) proporcionar una bacteria que expresa un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión candidato, en el que el polipéptido de unión candidato está presente dentro del periplasma de la bacteria; (b) someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa de la bacteria; (c) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; (d) resellar la membrana externa de la bacteria después de la etapa (c); y (e) identificar la bacteria que comprende un polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la bacteria puede tener una mejora en la expresión del polipéptido de unión en al menos aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 100 %, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 25 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 35 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 45 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces o más. En algunos casos, la bacteria puede tener una mejora en la expresión de entre 1 y 10 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 7 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 6 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 5 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 4 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 3 veces, una mejora en la expresión de entre 2 y 10 veces, una mejora en la expresión de entre 2 y 8 veces, o una mejora en la expresión de entre 2 y 6 veces. En algunas divulgaciones, la mejora es relativa al nivel de expresión del polipéptido de unión en una bacteria natural. En otras divulgaciones, la mejora es relativa al nivel de expresión del polipéptido de unión en una bacteria mutante.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la bacteria puede permanecer viable después de que se hayan realizado las etapas del procedimiento. En algunos casos, la bacteria puede experimentar división celular al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces o más después de que se hayan realizado las etapas del procedimiento. En algunos casos, la viabilidad se mide usando una tinción de viabilidad, por ejemplo, SYTOX® Green, yoduro de propidio u otras tinciones de viabilidad conocidas en la técnica. En algunos casos, la viabilidad se mide usando un kit de tinción de células vivas/muertas tal como los ensayos de viabilidad celular LIVE/DEAD® de Life Technologies. En algunos casos, la viabilidad se mide sembrando la bacteria en una placa de medio bacteriano. En algunos casos, una célula viable dará lugar a una colonia después de la siembra en una placa de medio bacteriano.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la bacteria puede comprender una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma. Las mutaciones que pueden permitir la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma (que en algunos casos también se pueden denominar mutantes con "pérdida periplásmica" o "Iky") se describen, por ejemplo, en Hancock, Ann. Rev. Microbiol. 38: 237-264, 1984, incluyendo pero sin limitarse a mutantes rugoso profundos (carentes de heptosa) de E. co liy S. typhimurium (por ejemplo, rfaD, rfaE, rfaH, y rfaRd), que pueden afectar a la composición de lipopolisacárido (LPS) en la membrana externa, mutantes env (por ejemplo, envA, envB, envM-T), y mutantes tolerantes a colicina en E. coli (por ejemplo, tolC y tolA,B). En algunos casos, la mutación es en un gen que codifica una proteína de la membrana externa y/o una proteína que afecta a la composición del lipopolisacárido (LPS). En algunos casos, la mutación está en un gen que codifica una proteína de membrana externa, por ejemplo, la lipoproteína de membrana externa principal Lpp (Lpp), una porina o TolC. En algunos casos, la proteína de membrana externa es Lpp. Se puede usar cualquier mutación adecuada en el gen que codifica Lpp. Las mutaciones de Ipp ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Ipp-1; Ipp-21; Ipp-3; Ipp5508; Ipp-6; Ipp::Tn5KAN-2; IppD70E, G, o S; IppK75S o T; IppK78R; IppR77D o L; IppS22D; IppY76C, D, E, G, N, P o S; IppY76F, H, I o L; AIpp, AIpp-254 y AIpp-752::kan, o las descritas en el presente documento. Dichas mutaciones de lpp se pueden adquirir de, por ejemplo, un depósito tal como CGSC (The Coli Genetic Stock Center). En otros casos, se puede realizar una mutación en el gen que codifica Lpp usando enfoques de genética molecular estándar. En algunas divulgaciones, la mutación es en un gen que codifica una proteína que afecta a la composición de LPS, por ejemplo, proteínas Env (por ejemplo, EnvA, EnvB y EnvM), RfaD, RfaE, RfaH, RfaRd, TolA, TolB y TolD.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, el procedimiento puede comprender someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa. En algunos casos, las condiciones que permeabilizan la membrana externa comprenden tratar la bacteria con un agente de permeabilización. En algunos casos, se selecciona un agente de permeabilización de quelantes (incluyendo quelantes de cationes divalentes (por ejemplo, EDTA, BAPTA y EGTA)), NaCl, sacarosa, antibióticos (por ejemplo, aminoglucósidos (por ejemplo, estreptomicina y gentamicina), polimixina B, polimixina desacilada, octapeptina y bencilpenicilina), detergentes, lisozima, Tris, Tris-EDTA, ascorbato, polilisina, cloruro de benzalconio, protamina, proteína bactericida e incrementadora de la permeabilidad (BPI), suero y/o complemento, Ca2+ o combinaciones de los mismos. En algunas divulgaciones, el agente de permeabilización comprende un quelante. En algunos casos, el quelante es un quelante de cationes divalentes (incluyendo, por ejemplo, EDTA, BAPTA y EGTA). En algunas divulgaciones, el quelante de cationes divalentes es EDTA. En algunos casos, la concentración del quelante, por ejemplo, EDTA, está entre aproximadamente 1 |jM y aproximadamente 15 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 |jM, 10 |jM, 100 |jM, 500 jiM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM o 15 mM. En algunos casos, la concentración de EDTA es de 5 mM. En algunos casos, el agente de permeabilización incluye además un agente tampón, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, el agente de permeabilización comprende además seroalbúmina bovina. En algunos casos, la BSA está presente de entre un 1 % (p/v) a aproximadamente un 10 % (p/v), por ejemplo, un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, el procedimiento puede comprender resellar la membrana externa de la bacteria. La membrana externa se puede resellar completamente, aunque no es necesario. El resellado parcial a un nivel que permite la viabilidad celular es suficiente para los procedimientos de la divulgación. En algunos casos, la membrana externa se resella si la barrera de permeabilidad de membrana se restablece dentro de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % en comparación con una membrana externa bacteriana de referencia o natural (por ejemplo, la membrana externa de una célula E. coli 62A7). En algunos casos, resellar sustancialmente la membrana externa de la bacteria comprende poner en contacto la bacteria con una sal de Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Na+, K+ y similares, por ejemplo, sales de los cationes precedentes con aniones tales como SO42-, F-, Cl2- , SO32-, PO43- y similares. En algunos casos, resellar sustancialmente la membrana externa de la bacteria comprende poner en contacto la bacteria con MgCh. En algunas divulgaciones, la concentración de MgCh está entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM, por ejemplo, aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la etapa de poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable puede comprender además poner en contacto la bacteria con un tinte de ácido nucleico. En algunos casos, el tinte de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en Hoechst 33342 (también denominado tinte Hoechst), 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), SYTO® 9, SYTO® 11, SYTO® 12, SYTO® 13, SYTO® 14, SYTO® 15, SYTO® 16, SYTO® 17, SYTO® 41, SYTO® 43, SYTO® 42, SYTO®44, SYTO® 40, SYTO® 45, SYTO® 59, SYTO® 60, SYTO® 61, SYTO® 62 y SYTO® 63, SYTO® 64. En algunas divulgaciones, se usa un tinte de ácido nucleico que tiñe las células bacterianas con una eficacia de al menos aproximadamente un 60 % (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más). En algunas divulgaciones, se usa un tinte de ácido nucleico que tiñe células bacterianas con una eficacia de al menos aproximadamente un 85 %.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la molécula diana marcada de forma detectable puede comprender un marcador fluorescente (también denominado fluoróforo). En algunas divulgaciones, se puede usar cualquier marcador fluorescente compatible con la detección por citometría de flujo (por ejemplo, FACS™). Por ejemplo, se puede usar cualquier marcador fluorescente con un rendimiento cuántico que permita la separación por citometría de flujo (por ejemplo, FACS™). En algunos casos, el marcador fluorescente incluye un tinte fluorescente o un polipéptido fluorescente. Diversos marcadores fluorescentes están disponibles comercialmente de una variedad de distribuidores, por ejemplo, Life Technologies. Se puede seleccionar un marcador fluorescente en base a sus perfiles de excitación y emisión.
Los ejemplos no limitantes de tintes fluorescentes que se pueden usar incluyen pero no se limitan a tintes ALEXA® (por ejemplo, ALEXA FLUOR® 488, ALEXA FLUOR® 514, ALEXA FLUOR® 532, ALEXA FLUOR® 555, ALEXA FLUOR® 546, ALEXA FLUOR® 568, ALEXA FLUOR® 594, ALEXA FLUOR® 610, ALEXA FLUOR® 633, ALEXA FLUOR® 647 ALEXA FLUOR® 660, ALEXA FLUOR® 680, ALEXA FLUOR® 700, ALEXA FLUOR® 750y ALEXA FLUOR® 790), tintes DYLIGHT® (por ejemplo, DYLIGHT® 350, DYLIGHT® 405, DYLIGHT® 488, DYLIGHT® 550, DYLIGHT® 594, DYLIGHT® 633, DYLIGHT® 650, DYLIGHT® 680, DYLIGHT® 755 y DYLIGHT® 800), tintes de cianina (por ejemplo, CY®2, CY®3 y CY®5), BODIPY, TEXAS RED®, fluoresceína y sus derivados (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, FITC) y rodamina y sus derivados (por ejemplo, tetrametilrrodamina, TRITc ). En algunos casos, el tinte fluorescente se selecciona del grupo que consiste en: ALEXA FLUOR® 488, ALEXA FLUOR® 647 y DYLIGHT ®649.
Los polipéptidos fluorescentes ejemplares que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, proteínas fluorescentes de color azul/UV (incluyendo TagBFP, mTagBFP2, Azurite, EBFP2, mKalama1, Sirius, Sapphire y T-Sapphire), proteínas fluorescentes de color cian (por ejemplo, ECFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, Midoriishi-Cyan monomérico, TagCFP y mTFP1), proteínas fluorescentes de color verde (por ejemplo, GFP, EGFP, Emerald, Superfolder GFP, Azami Green monomérico, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover y mNeonGreen), proteínas fluorescentes de color amarillo (por ejemplo, EYFP, Citrine, Venus, SYFP2 y TagYFP), proteínas fluorescentes de color naranja (por ejemplo, Kusabira-Orange monomérica, mKOk, mKO2, mOrange y mOrange2), proteínas fluorescentes de color rojo (por ejemplo, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, r Fp , TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby y mRuby2), proteínas fluorescentes de color rojo lejano (por ejemplo, mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune, NirFP), proteínas fluorescentes fotoactivables (por ejemplo, PA-GFP, PAmCherry1 y PATagRFP) y proteínas fluorescentes fotoconvertibles (por ejemplo, Kaede, KikGR1, PS-CFP2, mEos2, mEos3.2 y pSmOrange).
En algunas divulgaciones, la bacteria se pone en contacto con una molécula diana marcada de forma detectable a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, aproximadamente 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10 °C, 12 °C, 14 °C, 16 °C, 18 °C, 20 °C, 22 °C, 24 °C o 25 °C). En algunas divulgaciones, la temperatura es de aproximadamente 4 °C.
Cualquiera de los procedimientos precedentes puede incluir además al menos una etapa de lavado (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 etapas de lavado), que implica resuspender la bacteria en un tampón de lavado. En algunos casos, la al menos una etapa de lavado se realiza después de poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable. En algunos casos, el tampón de lavado incluye un agente tampón, por ejemplo, PBS. En algunos casos, el tampón de lavado comprende solución salina tamponada con fosfato. En algunos casos, el tampón de lavado comprende además MgCh. En algunos casos, el tampón de lavado comprende MgCl2 entre 1 mM y 50 mM (por ejemplo, MgCh 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la etapa de selección puede incluir además citometría de flujo (por ejemplo, FACS™). En algunos casos, la citometría de flujo incluye la separación de células individuales y la separación en base a la señal de la molécula diana marcada de forma detectable. En algunos casos, la citometría de flujo incluye la separación en base a la señal de un tinte de ácido nucleico. En algunos casos, la citometría de flujo comprende secuencialmente (i) separación en base a la señal de un tinte de ácido nucleico; (ii) separación de células individuales; y (iii) separación en base a la señal de la molécula diana marcada de forma detectable. En algunas divulgaciones, las células están a una concentración de entre aproximadamente 1x105 a aproximadamente aproximadamente 1x1012 células/ml, por ejemplo, aproximadamente 1x105 células/ml, aproximadamente 1x106 células/ml, aproximadamente 1x107 células/ml, aproximadamente 1x108 células/ml, aproximadamente 1x109 células/ml, aproximadamente 1x1010 células/ml, aproximadamente 1x1011 células/ml o aproximadamente 1x1012 células/ml.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la bacteria puede ser una bacteria que incluye una membrana interna, un periplasma y una membrana externa. En algunas divulgaciones, la bacteria es una bacteria gramnegativa. Por ejemplo, en algunos casos, la bacteria es una E. coli. Se puede usar cualquier cepa o acervo génico adecuado de E. coli. Las cepas y acervos génicos usados comúnmente de E. coli son bien conocidos en la técnica. Las cepas de E. coli ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cepas de laboratorio tales como K-12 y sus subcepas (por ejemplo, Clifton natural, W3110, DH5aE y similares), y E. coli B y sus subcepas (por ejemplo, BL21, BL21(DE3) y similares). En algunas divulgaciones, la E. coli se deriva de la cepa 62A7. En algunas divulgaciones, la E. coli se deriva de la cepa 33D3. En algunas divulgaciones, la E. coli se deriva de la cepa 66C4.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, el polipéptido de unión se puede expresar en forma soluble en el periplasma de la bacteria.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, el polipéptido de unión se puede expresar como una proteína de fusión en el periplasma de la bacteria. En algunos casos, el polipéptido de unión se expresa como una proteína de fusión con una proteína, o un fragmento de la misma, que se localiza en la cara externa de la membrana interna. Se debe entender que se pueden añadir secuencias polipeptídicas adicionales, por ejemplo, polipéptidos conectores, a la proteína de fusión. Una proteína de fusión de este tipo se puede usar para anclar el polipéptido de unión a la cara externa de la membrana interna. En algunas divulgaciones, un péptido líder y los primeros seis aminoácidos de una lipoproteína de membrana interna (por ejemplo, NlpA) se pueden incluir en la proteína de fusión. Una proteína de fusión de este tipo puede servir como un ancla N terminal del polipéptido de unión a la cara externa de la membrana interna. En algunos casos, la proteína de fusión incluye una proteína de membrana interna o fragmento de la misma seleccionado de Aas, AcrE (EnvC), AmiC, AmiD, ArtM, AraH, ArtQ, BtuC, CheY, CysT, CysW, DppB, DppC, DsbB, DsbD, ExbD, ExbB, FecC, FecD, FecR, FepD, FhuB, GlnP, HisM, HisQ, LacY, una lipoproteína, LivH, LivM, LivA, LivE, MalF, MalG, MalC, MalD, MglC, ModB, NikB, NikC, NosY, OppB, celB codificado con fagos, PhnM, PotB, PotC, PotH, Potl, ProW, PstA, PstC, pululanasa de K. pneumoniae, RbsC, SecY, TatC, TraB TolC, TonB, UgpA o UgpE. En algunas divulgaciones, cualquier lipoproteína o fragmento de la misma que incluye una secuencia señal y un aspartato en la posición aminoacídica 2 (presente en la proteína natural o bien añadida por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio) se puede incluir en la proteína de fusión. En algunas divulgaciones, se puede usar un bucle transmembranario individual de cualquier proteína citoplásmica como anclaje de membrana. La proteína de fusión puede ser una fusión N terminal o una fusión C terminal.
En algunos casos, la bacteria expresa una proteína de fusión que se localiza en la cara externa de la membrana interna que comprende un dominio o fragmento del mismo que se puede unir específicamente al polipéptido de unión. Por ejemplo, si el polipéptido de unión es un anticuerpo, se puede incluir un dominio de unión a anticuerpo o fragmento del mismo en una proteína de fusión con una proteína de membrana interna o fragmento de la misma como se describe anteriormente. En algunos casos, el dominio de unión a anticuerpo se puede derivar del alérgeno Asp fl 1, Asp fl2 o Asp fl3 de Aspergillus flavus, Fc-gamma Rl, Fc-gamma Rll, Fc-gamma Rll-a, Fc-gamma Rll-b, Fc-gamma Rll-c, FC-gamma Rlll, Fc-gamma Rlll-a, Fc-gamma Rlll-b, FcRn, proteína MRP de Streptococcus pyogenes, proteína A de S. aureus (spa), proteína B de Streptococcus agalactiae, proteína G de Streptococcus sp. grupo G (spg), proteína H de Streptococcus pyogenes o proteína sbi de S. aureus. En algunos casos, el dominio se deriva de la proteína A de S. aureus (por ejemplo, el dominio ZZ, que se une a la región Fc de IgG. Para otros polipéptidos de unión, los dominios de interacción proteína-proteína y/o marcas de epítopo que se unen al polipéptido de unión se pueden incluir en la proteína de fusión.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la etapa (a) puede incluir proporcionar una pluralidad de bacterias, en la que las bacterias incluyen una colección de ácidos nucleicos, codificando cada uno un polipéptido de unión candidato. En algunos casos, la colección de ácidos nucleicos puede incluir dos o más ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que son sustancialmente iguales, preferentemente idénticos, en secuencia excepto por la secuencia de una variante en una o más posiciones particulares. Por ejemplo, en algunos casos, la colección comprende una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de polipéptidos de unión candidatos que tienen una o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o más) alteraciones de residuos aminoacídicos en comparación con un polipéptido de unión de referencia.
Por ejemplo, en cualquiera de los procedimientos precedentes, la colección puede incluir una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de anticuerpo candidata comprende una o más alteraciones de residuos aminoacídicos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 o más) en comparación con un anticuerpo de referencia. La alteración de residuo aminoacídico puede estar en cualquier posición del anticuerpo, por ejemplo, VH y/o VL y/o un dominio constante. Por ejemplo, en algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR y/o una FR de VH y/o VL. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR (por ejemplo, HVR-H1, HVR-H2 y/o HVR-H3) y/o una FR (por ejemplo, FR-H1, FR-H2, FR-H3 y/o FR-H4) de VH. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR (por ejemplo, HVR-H1, HVR-H2 y/o HVR-H3) de VH. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una FR (por ejemplo, FR-H1, FR-H2, FR-H3 y/o FR-H4) de VH. En otros casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR (por ejemplo, HVR-L1, HVR-L2 y/o HVR-L3) y/o FR (por ejemplo, FR-L1, FR-L2, FR-L3 y/o FR-L4) de VL. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR (por ejemplo, HVR-L1, HVR-L2 y/o HVR-L3) de VL. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una FR (por ejemplo, FR-L1, FR-L2, FR-L3 y/o FR-L4) de VL. Las alteraciones de residuos aminoacídicos pueden estar en un residuo expuesto en superficie o en un residuo oculto.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la colección puede incluir una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de anticuerpo candidata comprende una alteración de residuo aminoacídico en una FR de VH o VL en comparación con un anticuerpo de referencia, en la que la alteración de residuo aminoacídico: (a) se identificó en un anticuerpo natural que tiene el mismo subtipo que el anticuerpo de referencia, y/o (b) está en un residuo aminoacídico que se predice que está oculto. Por ejemplo, en algunos casos, la colección puede incluir una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de anticuerpo candidata comprende una alteración de residuo aminoacídico en una FR de VH o VL en comparación con un anticuerpo de referencia, en la que la alteración de residuo aminoacídico: (a) se identificó en un anticuerpo natural que tiene el mismo subtipo que el anticuerpo de referencia, y (b) está en un residuo aminoacídico que se predice que está oculto. En algunos casos, la alteración de residuo aminoacídico en el anticuerpo natural se debe a hipermutación somática.
Se puede predecir y/o determinar que un residuo aminoacídico está oculto (por ejemplo, no accesible al disolvente) o expuesto en superficie (por ejemplo, accesible al disolvente) usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede predecir que un residuo aminoacídico está oculto usando cualquiera de varios algoritmos conocidos en la técnica. Preferentemente, las posiciones accesibles al disolvente se determinan usando coordenadas de un modelo tridimensional de un anticuerpo, preferentemente usando un programa informático tal como el Programa InsighfH (Accelrys, San Diego, CA). Las posiciones ocultas también se pueden predecir usando algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, Lee et al. J. Mol. Biol. 55: 379, 1971 y Connolly, J. Appl. Cryst.
16: 548, 1983). La predicción de posiciones ocultas se puede realizar usando un programa informático adecuado para el modelado de proteínas y la información estructural tridimensional obtenida de un anticuerpo. El programa informático que se puede utilizar para estos propósitos incluye el programa informático SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). En general, cuando un algoritmo (programa) requiere un parámetro de tamaño de entrada de usuario, el "tamaño" de una sonda que se usa en el cálculo se fija en aproximadamente 1,4 Angstrom o menos de radio. Además, la determinación de regiones ocultas y/o expuestas en superficie y procedimientos de área usando un programa informático para ordenadores personales se ha descrito por Pacios, Comput. Chem. 18(4): 377-386, 1994 y J. Mol. Model. 1: 46-53, 1995.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, la colección puede incluir de aproximadamente 2 polipéptidos de unión a aproximadamente 10 14 o más polipéptidos de unión (por ejemplo, aproximadamente 2 , aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 500, aproximadamente 103, aproximadamente 104, aproximadamente 105, aproximadamente 106, aproximadamente 107, aproximadamente 108, aproximadamente 109, aproximadamente 1010, aproximadamente 1011, aproximadamente 1012, aproximadamente 1013 o aproximadamente 1014 polipéptidos de unión). En algunos casos, la colección puede incluir aproximadamente 108 polipéptidos de unión.
Cualquiera de los procedimientos precedentes puede incluir una etapa de identificar un polipéptido de unión candidato que tiene un incremento en el nivel de expresión en base a la cantidad de molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunos casos, el incremento en el nivel de expresión se determina por inmunoelectrotransferencia, IHQ, espectrometría de masas, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o por otros procedimientos conocidos en la técnica. En algunos casos, el polipéptido de unión candidato tiene un incremento en la expresión de entre 1 y 20 veces, por ejemplo, un incremento en la expresión de 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces o 20 veces, en comparación con un polipéptido de unión de referencia o natural. Por ejemplo, el polipéptido de unión candidato puede tener un incremento en la expresión de entre 1 y 10 veces, un incremento en la expresión de entre 1 y 7 veces, un incremento en la expresión de entre 1 y 6 veces, un incremento en la expresión de entre 1 y 5 veces, un incremento en la expresión de entre 1 y 4 veces, un incremento en la expresión de entre 1 y 3 veces, un incremento en la expresión de entre 2 y 10 veces, un incremento en la expresión de entre 2 y 8 veces, o un incremento en la expresión de entre 2 y 6 veces. En algunas divulgaciones, el polipéptido de unión candidato tiene un incremento en la expresión tanto en células bacterianas (por ejemplo, E. coli) como de mamífero. En algunas divulgaciones, el incremento es relativo al nivel de expresión de un polipéptido de unión natural. En otras divulgaciones, el incremento es relativo al nivel de expresión de un polipéptido de unión variante.
Cualquiera de los procedimientos precedentes puede incluir una etapa de identificar un polipéptido de unión candidato que tiene un incremento en la estabilidad en base a la cantidad de molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunos casos, el incremento en la estabilidad se determina por fluorimetría de barrido diferencial, dicroísmo circular, espectroscopía u otros procedimientos conocidos en la técnica. En algunos casos, el polipéptido de unión candidato tiene un incremento en la temperatura de fusión (Tf) de entre 1 °C y 20 °C, por ejemplo, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10 °C, 11 °C, 12 °C, 13 °C, 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C o 20 °C, en comparación con un polipéptido de unión de referencia o natural. En algunos casos, el polipéptido de unión candidato tiene un incremento en la Tf de entre 1 °C y 10 °C, entre 1 °C y 9 °C, entre 1 °C y 8 °C, entre 1 °C y 7 °C, entre 1 °C y 6 °C, entre 1 °C y 5 °C, entre 1 °C y 4 °C, entre 1 °C y 3 °C, entre 1 °C y 2 °C, entre 2 °C y 10 °C, entre 2 °C y 9 °C, entre 2 °C y 8 °C, entre 2 °C y 7 °C, entre 2 °C y 6 °C, entre 2 °C y 5 °C, entre 2 °C y 4 °C o entre 2 °C y 3 °C. En algunas divulgaciones, el polipéptido de unión candidato tiene un incremento en la estabilidad tanto en células bacterianas (por ejemplo, E. coli) como de mamífero. En algunas divulgaciones, el polipéptido de unión candidato tiene tanto un incremento en la estabilidad como un incremento en la expresión. En algunas divulgaciones, el incremento es relativo al nivel de expresión de un polipéptido de unión natural. En otras divulgaciones, el incremento es relativo al nivel de expresión de un polipéptido de unión variante.
Cualquiera de los procedimientos precedentes puede incluir una etapa de identificar un polipéptido de unión candidato que tiene un incremento en la afinidad de unión a una molécula diana en base a la cantidad de molécula diana marcada dentro del periplasma. En algunas divulgaciones, el polipéptido de unión candidato puede tener un incremento en la afinidad de unión de 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 veces para la molécula diana en comparación con un polipéptido de unión de referencia. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir cribar un anticuerpo con un incremento en la afinidad en comparación con un anticuerpo de referencia.
En cualquiera de los procedimientos precedentes, el polipéptido de unión puede ser un anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo de cualquiera de los procedimientos anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En algunos casos, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otros casos, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto, un anticuerpo IgG4 intacto u otra clase de anticuerpo o isotipo como se define en el presente documento. En otra divulgación, el anticuerpo es un semianticuerpo, por ejemplo, un semianticuerpo de botón en ojal. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168 para una descripción de la tecnología botón en ojal. En cualquiera de los procedimientos precedentes, el anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo neutralizante).
En cualquiera de los procedimientos precedentes, el polipéptido de unión puede ser un mimético de anticuerpo, por ejemplo, Affibody, Affilin, Affimer, una afitina, Alphabody, Anticalin, un avímero, una proteína de repetición de anquirina diseñada (DARPin), Fynomer, un péptido de dominio de Kunitz o un monocuerpo. En otras divulgaciones, el polipéptido de unión puede ser una proteína bacteriana que se localiza en el periplasma. En otras divulgaciones, el polipéptido de unión puede ser una proteína de mamífero. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, el polipéptido de unión puede ser un receptor de superficie celular, una citocina o un factor de crecimiento.
Cualquiera de los procedimientos precedentes puede incluir además aislar el ácido nucleico después de la etapa de selección. En algunos casos, el procedimiento comprende además determinar la secuencia del ácido nucleico.
En algunos aspectos de cualquiera de los procedimientos precedentes, la bacteria puede incluir una mutación que afecta a un gen que afecta a la expresión del polipéptido de unión, por ejemplo, un gen regulador de la transcripción. En algunos casos, la etapa (a) comprende proporcionar una pluralidad de bacterias, en la que la pluralidad de bacterias comprende una colección de ácidos nucleicos, codificando cada uno un mutante del gen regulador de la transcripción. En algunos casos, el gen regulador de la transcripción se selecciona de un factor de iniciación de la transcripción, un factor anti-sigma, una subunidad de ARN polimerasa o un factor de transcripción. En algunos casos, el factor de iniciación de la transcripción es un factor sigma. En algunos casos, el factor sigma se selecciona del grupo que consiste en RpoD (a70), RpoE (a24), RpoH (a32), RpoS (a38), RpoN (a54), RpoF (a28) y Fecl (a19). En casos particulares, el factor sigma es RpoD (a70). En algunos casos, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en un plásmido sintético. En otros casos, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en el genoma bacteriano endógeno. En algunos casos, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error, mutagénesis química, mutagénesis transposicional o mutagénesis dirigida. En casos particulares, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error.
Cualquiera de los procedimientos precedentes se puede usar para identificar una bacteria que tiene una mejora en la expresión del polipéptido de unión. En algunos casos, la bacteria puede tener una mejora en la expresión del polipéptido de unión en al menos aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 100 %, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 25 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 35 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 45 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces o más. En algunos casos, la bacteria puede tener una mejora en la expresión de entre 1 y 10 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 7 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 6 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 5 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 4 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 3 veces, una mejora en la expresión de entre 2 y 10 veces, una mejora en la expresión de entre 2 y 8 veces, o una mejora en la expresión de entre 2 y 6 veces. En algunas divulgaciones, la mejora es relativa al nivel de expresión del polipéptido de unión en una bacteria natural. En otras divulgaciones, la mejora es relativa al nivel de expresión del polipéptido de unión en una bacteria mutante.
B. Colecciones
La divulgación proporciona colecciones que comprenden una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de unión. Por ejemplo, en algunos casos, la colección comprende una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de polipéptidos de unión candidatos que tienen una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 20, 30, 40, 50, 6 0 , 70, 80 o más) alteraciones de residuos aminoacídicos en comparación con un polipéptido de unión de referencia.
El polipéptido de unión candidato puede ser una variante de anticuerpo candidata. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otros casos, la variante de anticuerpo candidata es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto, un anticuerpo IgG4 intacto u otra clase de anticuerpo o isotipo como se define en el presente documento. En otra divulgación, la variante de anticuerpo candidata es un semianticuerpo, por ejemplo, un semianticuerpo de botón en ojal. En cualquiera de los procedimientos precedentes, la variante de anticuerpo candidata puede ser un anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo neutralizante).
En otros casos, el polipéptido de unión candidato puede ser un mimético de anticuerpo, por ejemplo, Affibody, Affilin, Affimer, una afitina, Alphabody, Anticalin, un avímero, una proteína de repetición de anquirina diseñada (DARPin), Fynomer, un péptido de dominio de Kunitz o un monocuerpo. En otras divulgaciones, el polipéptido de unión puede ser una proteína bacteriana que se localiza en el periplasma. En otras divulgaciones, el polipéptido de unión puede ser una proteína de mamífero. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, el polipéptido de unión puede ser un receptor de superficie celular, una citocina o un factor de crecimiento.
En algunos casos, la colección puede incluir una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de anticuerpo candidata comprende una o más alteraciones de residuos aminoacídicos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 o más) en comparación con un anticuerpo de referencia. La alteración de residuo aminoacídico puede estar en cualquier posición del anticuerpo, por ejemplo, VH y/o VL y/o un dominio constante. Por ejemplo, en algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR y/o una FR de VH y/o VL. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR (por ejemplo, HVR-H1, HVR-H2 y/o HVR-H3) y/o una FR (por ejemplo, FR-H1, FR-H2, FR-H3 y/o FR-H4) de VH. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR (por ejemplo, HVR-H1, HVR-H2 y/o HVR-H3) de VH. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una FR (por ejemplo, FR-H1, FR-H2, FR-H3 y/o FR-H4) de VH. En otros casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR (por ejemplo, HVR-L1, HVR-L2 y/o HVR-L3) y/o FR (por ejemplo, FR-L1, FR-L2, FR-L3 y/o FR-L4) de VL. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una HVR (por ejemplo, HVR-L1, HVR-L2 y/o HVR-L3) de VL. En algunos casos, la variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una FR (por ejemplo, FR-L1, FR-L2, FR-L3 y/o FR-L4) de VL. Las alteraciones de residuos aminoacídicos pueden estar en un residuo expuesto en superficie o en un residuo oculto.
En algunos casos, la colección puede incluir una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una FR de VH y/o VL en comparación con un anticuerpo de referencia, en la que la alteración de residuo aminoacídico: (a) se identificó en un anticuerpo natural que tiene el mismo subtipo que el anticuerpo de referencia, y/o (b) está en un residuo aminoacídico que se predice que está oculto. En algunos casos, la colección puede incluir una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de anticuerpo candidata incluye una o más alteraciones de residuos aminoacídicos en una FR de VH y/o VL en comparación con un anticuerpo de referencia, en la que la alteración de residuo aminoacídico: (a) se identificó en un anticuerpo natural que tiene el mismo subtipo que el anticuerpo de referencia, y (b) está en un residuo aminoacídico que se predice que está oculto. En algunos casos, cada variante de anticuerpo candidata incluye 1 alteración de un residuo aminoacídico en comparación con un anticuerpo de referencia.
Por ejemplo, en algunos casos, la colección puede incluir una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de anticuerpo candidata comprende una alteración de residuo aminoacídico en una FR de VH (por ejemplo, FR-H1, FR-H2, FR-H3 o FR-H4) en comparación con un anticuerpo de referencia, en la que la alteración de residuo aminoacídico: (a) se identificó en un anticuerpo natural que tiene el mismo subtipo que el anticuerpo de referencia, y (b) está en un residuo aminoacídico que se predice que está oculto. En otros casos, la colección puede incluir una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpos candidatas, en la que cada variante de anticuerpo candidata comprende una alteración de residuo aminoacídico en una FR (por ejemplo, FR-L1, FR-L2, FR-L3 o FR-L4) de VL en comparación con un anticuerpo de referencia, en la que la alteración de residuo aminoacídico: (a) se identificó en un anticuerpo natural que tiene el mismo subtipo que el anticuerpo de referencia, y (b) está en un residuo aminoacídico que se predice que está oculto. En algunos casos, la alteración de residuo aminoacídico en el anticuerpo natural se debe a hipermutación somática.
Los anticuerpos naturales que tienen VH y/o VL pertenecientes al mismo subtipo que un anticuerpo de referencia se pueden encontrar fácilmente en una base de datos de anticuerpos, por ejemplo, la base de datos Kabat, IMGT® (el sistema de información inmunogenética internacional), Protein Data Bank (PDB), V BASE u otros conocidos en la técnica.
En cualquiera de las divulgaciones precedentes, la colección puede incluir de aproximadamente 2 polipéptidos de unión a aproximadamente 1014 o más polipéptidos de unión (por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30, de aproximadamente 2 a aproximadamente 40, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50, de aproximadamente 2 a aproximadamente 60, de aproximadamente 2 a aproximadamente 70, de aproximadamente 2 a aproximadamente 70, de aproximadamente 2 a aproximadamente 80, de aproximadamente 2 a aproximadamente 100, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10-14 de aproximadamente 2 a aproximadamente 1013, de aproximadamente 2 a aproximadamente 1012, de aproximadamente 2 a aproximadamente 1011, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10io, de aproximadamente 2 a aproximadamente 109, de aproximadamente 2 a aproximadamente 108, de aproximadamente 20 a aproximadamente 108, de aproximadamente 30 a aproximadamente 108, de aproximadamente 40 a aproximadamente 108, de aproximadamente 50 a aproximadamente 108, de aproximadamente 60 a aproximadamente 108, de aproximadamente 70 a aproximadamente 108, de aproximadamente 80 a aproximadamente 108, de aproximadamente 90 a aproximadamente 108, de aproximadamente 100 a aproximadamente 108, de aproximadamente 200 a aproximadamente 108, de aproximadamente 400 a aproximadamente 108, de aproximadamente 600 a aproximadamente 108, de aproximadamente 800 a aproximadamente 108, de aproximadamente 103 a aproximadamente 108, de aproximadamente 104 a aproximadamente 108, de aproximadamente 105 a aproximadamente 108, de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 o de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 polipéptidos de unión). En algunos casos, la colección puede incluir aproximadamente 108 polipéptidos de unión.
C. Anticuerpos anti-IL-13 ejemplares
La divulgación proporciona anticuerpos aislados que se unen a IL-13. En algunos casos, el anticuerpo anti-IL-13 puede incluir al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de AYSVN (SEQ ID NO: 7); (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de MIWGDGKIVYNSALKS (SEQ ID NO: 8); y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de DGYYPYAMDN (SEQ ID NO: 9), o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 7-9.
En algunos casos, el anticuerpo anti-IL-13 puede incluir además una, dos, tres o cuatro de las siguientes regiones estructurales de la cadena pesada: (a) una FR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de QVTLRQSGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLS (SEQ ID NO 18) QVTLRESGPALVKPT QTLTLT CTVSGLSLS (SEQ ID NO: 19)’, QVTLRQSGPALVKPTQTLTLTCTVSGLSLS (SEQ ID NO: 20) o QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLS (SEQ ID NO: 21); (b) una FR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 22); (c) una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAG (SEQ ID NO: 23); y (d) una FR-H4 que comprende la secuencia de aminoácidos de WGQGSLVTVSS (SEQ ID NO: 24).
En algunos casos, el anticuerpo anti-IL-13 puede incluir además al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASKSVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 10); (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LASNLES (SEQ ID NO: 11); y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 12), o una combinación de una o más de las HVR anteriores y una o más variantes de las mismas que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, un 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad) con una cualquiera de SEQ ID NO: 10-12.
En algunos casos, el anticuerpo anti-IL-13 puede incluir además una, dos, tres o cuatro de las siguientes regiones estructurales de la cadena ligera: (a) una FR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de DIVLTQSPDSLSVSLGERATINC (SEQ ID NO: 13) o DIVMTQSPDSLSVSLGERATINC (SEQ ID NO: 14); (b) una FR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 15); (c) una FR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 16); y (d) una FR-L4 que comprende la secuencia de aminoácidos de FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 17).
En algunos casos, el anticuerpo anti-IL-13 comprende (a) un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, una cualquiera de SEQ ID NO: 2-5; (b) un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con, o la secuencia de, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 6; o (c) un dominio VH como en (a) y un dominio VL como en (b). Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto de la divulgación, un anticuerpo anti-IL-13 de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una divulgación, un anticuerpo anti-IL-13 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otra divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto, un anticuerpo IgG4 intacto u otra clase de anticuerpo o isotipo como se define en el presente documento. En otra divulgación, el anticuerpo es un semianticuerpo, por ejemplo, un semianticuerpo de botón en ojal. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168 para una descripción de la tecnología botón en ojal.
En otro aspecto, un anticuerpo anti-IL-13 de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones 1-7 a continuación:
1. Afinidad de anticuerpos
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd ) de < 1 |j M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, < 1 pM o < 0,1 pM (por ejemplo, 10-6 M o menos, por ejemplo, de 10-6 M a 10-9 M o menos, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M o menos).
En una divulgación, Kd se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En una divulgación, se realiza un RIA con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en solución de Fab por el antígeno equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando a continuación el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al. J. Mol. Biol.
293:865-881, 1999). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 |jg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquea con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezclan [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al. Cancer Res. 57:4593-4599, 1997). A continuación, se incuba el Fab de interés durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN®-20) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 jl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otra divulgación, Kd se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En una divulgación, se activan chips de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con clorhidrato de N-etil-W-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 jg/m l (~0,2 jM ) antes de su inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN®-20) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. Se calculan las velocidades de asociación (ka s ) y velocidades de disociación (kd is) usando un modelo de Langmuir de unión uno a uno sencillo (programa informático de evaluación de BIACORE® versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd ) como la proporción kd is/ka s . Véase, por ejemplo, Chen et al. (J. Mol. Biol.
293:865-881, 1999). Si la tasa de asociación excede 106 M' V por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medida en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
2. Fragmentos de anticuerpo
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 , Fv y scFv y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.o s 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión a receptor de rescate y que tienen un incremento en la semivida in vivo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al. Nat. Med. 9:129 134, 2003; y Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993. También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134, 2003.
Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas divulgaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).
Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
3. Anticuerpos quiméricos y humanizados
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Determinados anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con cambio de clase" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, mientras conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas divulgaciones, se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro et al. Front. Biosci. 13:1619-1633, 2008, y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al. Nature 332:323-329, 1988; Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989; patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al. Methods 36:25-34, 2005 (que describe el injerto en la región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498, 1991 (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al. Methods 36:43-60, 2005 (que describe el "reordenamiento de f R"); y Osbourn et al. Methods 36:61-68, 2005 y Klimka et al. Br. J. Cancer, 83:252-260, 2000 (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).
Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para humanización incluyen pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol.
151:2296, 1993); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285, 1992; y Presta et al. J. Immunol., 151:2623, 1993); regiones estructurales maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro et al. Front. Biosci. 13:1619-1633, 2008); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véase, por ejemplo, Baca et al. J. Biol. Chem. 272:10678-10684, 1997 y Rosok et al. J. Biol. Chem.
271:22611-22618, 1996).
4. Anticuerpos humanos
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk et al. Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74, 2001 y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459, 2008.
Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales contienen típicamente todo o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena en general se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125, 2005.
Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE®, y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®. Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.
También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol. 133:3001, 1984; Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al. J. Immunol. 147: 86, 1991). Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562, 2006. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268, 2006 (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers et al. Histology and Histopathology 20(3):927-937, 2005 y Vollmers et al. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91, 2005.
También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.
5. Anticuerpos derivados de colecciones
Se pueden aislar los anticuerpos de la divulgación cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, n J, 2001) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al. Nature 348:552-554, 1990; Clackson et al. Nature 352: 624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1992; Marks et al. en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al. J. Mol. Biol. 338(2): 299-310, 2004; Lee et al. J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093, 2004; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472, 2004; and Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132, 2004.
En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que, a continuación, se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winter et al. Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455, 1994. Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y también no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al. EMBO J. 12: 725-734, 1993. Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones HVR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom et al. J. Mol. Biol., 227: 381-388, 1992. Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos-anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: patente de EE. UU. n.° 5.750.373, y publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.
6. Anticuerpos multiespecíficos
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véanse Milstein et al. Nature 305: 537, 1983; documento WO 93/08829; y Traunecker et al. EMBO J. 10: 3655, 1991), y genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden preparar genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodímeras de Fc de anticuerpos (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, y Brennan et al. Science, 229: 81, 1985); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al. J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992); usando tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993); y usando dímeros de Fv monocatenarios (scFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al. J. Immunol. 152:5368, 1994); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60, 1991.
En el presente documento también se incluyen anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).
El anticuerpo o fragmento en el presente documento incluye también un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a IL-13 o VEGF así como otro antígeno diferente (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0069820).
7. Variantes de anticuerpo
En determinadas divulgaciones, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno, expresión y/o estabilidad.
a) Variantes de sustitución, inserción y deleción
En determinadas divulgaciones, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora en unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad, o mejora en ADCC o C D C
TABLA 1
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Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro:
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento en afinidad, reducción en inmunogenicidad) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo con afinidad madurada, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196, 2008), y/o residuos que entran en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba la variante resultante VH o VL para determinar su afinidad de unión. La maduración de la afinidad por construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al. ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001). En algunas divulgaciones de maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. A menudo se seleccionan en particular HVR-H3 y HVR-L3.
En determinadas divulgaciones, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en HVR. Dichas alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de los residuos en contacto con el antígeno en las HVR. En determinadas divulgaciones de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.
Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar para mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham et al. Science 244:1081-1085, 1989. En este procedimiento, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, Ala o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incremente la semivida en suero del anticuerpo.
b) Variantes de glucosilación
En determinadas divulgaciones, se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se une en general por un enlace N a Asn297 del dominio c H2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32, 1997. El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunas divulgaciones, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo para crear variantes de anticuerpo con una mejora en determinadas propiedades.
En una divulgación, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura carbohidratada que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración Eu de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una mejora en la función ADCC. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2003/0157108 y 2004/0093621. Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "desfucosilados" o "carentes de fucosa" incluyen: documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249, 2004; Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004. Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545, 1986; documentos US 2003/0157108; y WO 2004/056312 A1, en especial en el ejemplo 11), y líneas celulares con genes inactivados, tales como células CHO con el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, inactivado (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004; Kanda et al. Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688, 2006; y el documento WO 2003/085107).
Se proporcionan además variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una reducción en la fucosilación y/o una mejora en la función ADCC. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2003/011878; patente de EE. UU. n.° 6.602.684; y US 2005/0123546. También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una mejora en la función CDC. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.
c) Variantes de la región Fc
En determinadas divulgaciones, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc.
La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.
En determinadas divulgaciones, una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch et al. Annu. Rev. Immunol.
9:457-492, 1991. Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véanse, por ejemplo, Hellstrom et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986 y Hellstrom et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985; patente de EE. UU. n.° 5.821.337 (véase Bruggemann et al. J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y por tanto carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods 202:163, 1996; Cragg et al. Blood 101:1045-1052, 2003; y Cragg et al. Blood 103:2738-2743, 2004). La unión a FcRn y determinaciones del aclaramiento/semivida in vivo también se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova et al. Intl. Immunol. 18(12):1759-1769, 2006).
Los anticuerpos con reducción en la función efectora incluyen los de sustitución de uno o más de los residuos de región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una mejora o disminución en la unión a FcR. (Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312; y Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2 ): 6591-6604, 2001).
En determinadas divulgaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos).
En algunas divulgaciones, se realizan alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una alteración (es decir, mejora o bien disminución) en la unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184, 2000.
Los anticuerpos con un incremento en las semividas y una mejora en la unión al receptor Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al. J. Immunol. 117:587, 1976 y Kim et al. J. Immunol. 24:249, 1994), se describen en el documento US2005/0014934. Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen las de sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo de la región Fc 434 (patente de EE. UU. n.° 7.371.826).
Véanse también Duncan et al. Nature 322:738-40, 1988; patentes de EE. UU. n.os 5.648.260 y 5.624.821; y documento WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.
d) Variantes de anticuerpos genomanipulados con cisteína
En determinadas divulgaciones, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En divulgaciones particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinadas divulgaciones, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se pueden sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.
e) Derivados de anticuerpos
En determinadas divulgaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede modificar además para contener restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicolpropionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, ya sea si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otra divulgación, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En una divulgación, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605, 2005). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.
D. Composiciones y procedimientos recombinantes
Se pueden producir anticuerpos usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567. En una divulgación, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-IL-13 descrito en el presente documento. En otra divulgación, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-VEGF descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En otra divulgación, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otra divulgación, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En una divulgación de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En una divulgación, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO), célula 293 o célula linfática (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En una divulgación, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo anti-IL-13, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-IL-13 o un anticuerpo anti-VEGF, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla y se inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).
Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.648.237, 5.789.199, y 5.840.523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E.
coli.) Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.
Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross Nat. Biotech.
22:1409-1414, 2004 y Li et al. Nat. Biotech. 24:210-215, 2006.
Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et al. J. Gen Virol. 36:59, 1977); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather Biol. Reprod. 23:243-251, 1980); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células t Ri (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.
383:44-68, 1982; células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR- (Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980); y líneas celulares de mieloma tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki et al. Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268, 2003.
E. Ensayos
Cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-13 o anticuerpos anti-VEGF) se pueden identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.
1. Ensayos de unión y otros ensayos
En un aspecto, se somete a prueba cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-13 o un anticuerpo anti-VEGF) para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc.
En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con un anticuerpo anti-IL-13 de la divulgación por unirse a IL-13. En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con un anticuerpo anti-VEGF descrito en el presente documento por unirse a VEGF. En determinadas divulgaciones, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une por un anticuerpo anti-IL-13 de la divulgación. En determinadas divulgaciones, un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une por un anticuerpo anti-VEGF descrito en el presente documento. Los procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ), 1996.
En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba IL-13 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a IL-13 y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por su unión a IL-13. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba IL-13 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a IL-13, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con IL-13 inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con IL-13 inmovilizada se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a IL-13. Véase Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 1988.
En otro ensayo de competencia ejemplar, se incuba VEGF inmovilizado en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a VEGF y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por su unión a VEGF. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba VEGF inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a VEGF se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado con VEGF inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociado con VEGF inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión a VEGF.
2. Ensayos de actividad
En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-IL-13 de los mismos que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la unión a IL-13 (por ejemplo, IL-13 en la circulación sanguínea), o un fragmento peptídico de la misma, in vivo, in vitro (por ejemplo, presentado en el periplasma de una bacteria) o bien ex vivo. En otras divulgaciones, la actividad biológica puede incluir bloquear o neutralizar la IL-13, o prevenir que IL-13 se una a un ligando, por ejemplo, un receptor (por ejemplo, receptor de interleucina-13). También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro. En determinadas divulgaciones, un anticuerpo se somete a prueba para determinar dicha actividad biológica.
En otro aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-VEGF de los mismos que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la unión a VEGF (por ejemplo, VEGF en la circulación sanguínea), o un fragmento peptídico de la misma, in vivo, in vitro (por ejemplo, presentado en el periplasma de una bacteria) o bien ex vivo. En otras divulgaciones, la actividad biológica puede incluir bloquear o neutralizar VEGF, o prevenir que VEGF se una a un ligando, por ejemplo, un receptor (por ejemplo, Tie2, KDR y/o Flt-1). También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro. En determinadas divulgaciones, un anticuerpo se somete a prueba para determinar dicha actividad biológica.
F. Inmunoconjugados
La divulgación proporciona también inmunoconjugados que comprenden cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-13 o anticuerpos anti-VEGF) conjugados a uno o más agentes citotóxicos, tales como fármacos o agentes quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) o isótopos radioactivos.
En una divulgación, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, incluyendo pero sin limitarse a un maitansinoide (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.208.020, 5.416.064, y la patente europea EP 0425 235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o derivado de la misma (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001,y 5.877.296; Hinman et al. Cancer Res. 53:3336-3342, 1993; y Lode et al. Cancer Res. 58:2925-2928, 1998); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (véanse Kratz et al. Current Med. Chem. 13:477-523, 2006; Jeffrey et al. Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362, 2006; Torgov et al. Bioconj. Chem. 16:717-721, 2005; Nagy et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834, 2000; Dubowchik et al. Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532, 2002; King et al. J. Med. Chem.
45:4336-4343, 2002; y la patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
En otra divulgación, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero sin limitarse a cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
En otra divulgación, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tecnecio-99m (tc99m) o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (Rm N) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como /V-succi nimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), ciclohexano-l-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina, como se describe en Vitetta et al. Science 238:1098, 1987. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO 94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilite la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector con ácido lábil, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (véanse, por ejemplo, Chari et al. Cancer Res. 52:127-131, 1992; patente de EE. UU. n.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o CAF en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).
G. Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección
En determinadas divulgaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-IL-13 proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de IL-13 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinadas divulgaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como linfocitos T colaboradores tipo 2 (Th2), mastocitos, linfocitos B, monocitos, macrófagos y células no hematopoyéticas, incluyendo células del músculo liso, células epiteliales, células endoteliales o células de fibroblastos.
En una divulgación, se proporciona un anticuerpo anti-IL-13 para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de IL-13 en una muestra biológica. En determinadas divulgaciones, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-IL-13 como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-IL-13 a IL-13, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-IL-13 e IL-13. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. En una divulgación, se usa un anticuerpo anti-IL-13 para seleccionar sujetos idóneos para su tratamiento con un anticuerpo anti-IL-13, por ejemplo, donde IL-13 es un biomarcador para la selección de pacientes.
Los trastornos ejemplares que se pueden diagnosticar usando un anti-IL-13 de la divulgación incluyen trastornos mediados por iL-13 o trastornos mediados por IgE. En algunos casos, el trastorno mediado por IL-13 es, por ejemplo, alergia, asma (por ejemplo, asma alérgica, asma atópica, asma grave y asma no alérgica (intrínseca)), enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, psoriasis, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil y enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), enfermedad inflamatoria, rinitis alérgica (incluyendo rinitis alérgica estacional), dermatitis atópica, conjuntivitis alérgica, eccema, urticaria, alergias alimentarias, hipersensibilidad alimentaria, celiaquía, enfermedades cutáneas inmunitarias (por ejemplo, enfermedades cutáneas ampollosas, eritema multiforme, dermatitis de contacto), esclerodermia, fibrosis, fibrosis hepática, fibrosis endomiocárdica, bronquitis crónica, bronquiectasia, neumonía intersticial idiopática, metaplasia de células caliciformes, trastornos inflamatorios pulmonares, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas (por ejemplo, fibrosis quística, fibrosis pulmonar idiopática y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)), enfermedad celíaca, enfermedad de Whipple, enfermedades inmunológicas del pulmón (por ejemplo, neumonía eosinofílica (por ejemplo, neumonía eosinofílica crónica), fibrosis pulmonar idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica y neumonitis por hipersensibilidad), síndrome de Churg-Strauss (periarteritis nodosa más atopia), síndrome miálgico eosinofílico, síndrome hipereosinofílico, reacciones edematosas (por ejemplo, angiodema episódico, esofagitis eosinofílica, gastritis eosinofílica, gastroenteritis eosinofílica, enteritis eosinofílica y colitis eosinofílica), micropoliposis nasal y poliposis, infección por VRS, uveítis, osteoporosis y tumores malignos, incluyendo cánceres o tumores asociados con expresión anómala de IL-13 (por ejemplo, linfoma de Hodgkin). En algunas divulgaciones, el trastorno es asma alérgica, asma no alérgica (intrínseca), rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis alérgica, eccema, urticaria, alergias alimentarias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, colitis ulcerosa, infección por VSR, uveítis, esclerodermia u osteoporosis. En algunos casos, el trastorno mediado por IgE es asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis alérgica, urticaria, anafilaxia o dermatitis atópica.
En determinadas divulgaciones, se proporciona en el presente documento un procedimiento de diagnóstico de un trastorno asociado con VEGF (por ejemplo, incremento en la expresión de VEGF). En determinadas divulgaciones, el procedimiento comprende poner en contacto una célula de prueba con un anticuerpo anti-VEGF como se describe en el presente documento; determinar el nivel de expresión (cuantitativa o bien cualitativamente) de VEGF por la célula de prueba detectando la unión del anticuerpo anti-VEGF a VEGF; y comparar el nivel de expresión de VEGF por la célula de prueba con el nivel de expresión de VEGF por una célula de control (por ejemplo, una célula normal del mismo origen tisular que la célula de prueba o una célula que expresa VEGF a niveles comparables a una célula normal de este tipo), en el que un mayor nivel de expresión de VEGF por la célula de prueba en comparación con la célula de control indica la presencia de un trastorno asociado con un incremento en la expresión de VEGF. En determinadas divulgaciones, la célula de prueba se obtiene de un individuo sospechoso de tener un trastorno asociado con un incremento en la expresión de VEGF. En determinadas divulgaciones, el trastorno es un tumor, cáncer y/o trastorno de proliferación celular.
Los trastornos ejemplares que se pueden diagnosticar usando un anticuerpo anti-VEGF descrito en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, cáncer de células escamosas, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar de células escamosas, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer estromal gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, melanoma, melanoma de extensión superficial, melanoma lentigo maligno, melanomas lentiginosos acros, melanomas nodulares, linfoma de linfocitos B, leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfocítica aguda (LLA); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; trastorno linfoproliferativo postrasplante (TLPT), proliferación vascular anómala asociada con facomatosis, edema asociado con tumores cerebrales y síndrome de Meigs.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de detección de la presencia de VEGF en una muestra biológica. En determinadas divulgaciones, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-VEGF en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-VEGF a VEGF, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-VEGF y VEGF.
Se pueden usar anticuerpos anti-VEGF para la detección de VEGF en uno cualquiera de varios procedimientos de ensayo de detección bien conocidos. Por ejemplo, una muestra biológica se puede someter a ensayo para determinar VEGF obteniendo la muestra de una fuente deseada, mezclando la muestra con anticuerpo anti-VEGF para permitir que el anticuerpo forme un complejo anticuerpo/VEGF con cualquier VEGF presente en la mezcla y detectando cualquier complejo anticuerpo/VEGF presente en la mezcla. La muestra biológica se puede preparar para ensayo por procedimientos conocidos en la técnica que son adecuados para la muestra particular. Los procedimientos de mezcla de la muestra con anticuerpos y los procedimientos de detección del complejo anticuerpo/VEGF se eligen de acuerdo con el tipo de ensayo usado.
Los anticuerpos anti-IL-13 o anti-VEGF marcados se describen en el presente documento. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, pgalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.
H. Formulaciones farmacéuticas
Las formulaciones farmacéuticas de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-13 o anti-VEGF) se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed., 1980), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.
Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.
La composición en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un agente quimioterápico, un agente citotóxico, un agente inhibidor del crecimiento y/o un agente antihormonal, tal como los enumerados en el presente documento anteriormente). Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed., 1980.
Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
I. Procedimientos y composiciones terapéuticos
Cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-13 o anti-VEGF) se puede usar en procedimientos terapéuticos.
En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-IL-13 para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-IL-13 para su uso en el tratamiento de trastornos mediados por IL-13. En determinadas divulgaciones, se proporciona un anticuerpo anti-IL-13 para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinadas divulgaciones, se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-IL-13 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene un trastorno mediado por IL-13 que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-IL-13. En una divulgación de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores es preferentemente un ser humano.
En otro aspecto, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-IL-13 en la fabricación o preparación de un medicamento. En una divulgación, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno mediado por IL-13. En otra divulgación, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de trastorno mediado por IL-13 que comprende administrar a un individuo que tiene un trastorno mediado por IL-13 una cantidad eficaz del medicamento. En una divulgación de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores puede ser un ser humano.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar un trastorno mediado por IL-13, incluyendo, por ejemplo, alergia, asma (por ejemplo, asma alérgica, asma atópica, asma grave y asma no alérgica (intrínseca)), enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, psoriasis, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil y enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), enfermedad inflamatoria, rinitis alérgica (incluyendo rinitis alérgica estacional), dermatitis atópica, conjuntivitis alérgica, eccema, urticaria, alergias alimentarias, hipersensibilidad alimentaria, celiaquía, enfermedades cutáneas inmunitarias (por ejemplo, enfermedades cutáneas ampollosas, eritema multiforme, dermatitis de contacto), esclerodermia, fibrosis, fibrosis hepática, fibrosis endomiocárdica, bronquitis crónica, bronquiectasia, neumonía intersticial idiopática, metaplasia de células caliciformes, trastornos inflamatorios pulmonares, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas (por ejemplo, fibrosis quística, fibrosis pulmonar idiopática y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)), enfermedad celíaca, enfermedad de Whipple, enfermedades inmunológicas del pulmón (por ejemplo, neumonía eosinofílica (incluyendo, neumonía eosinofílica crónica), fibrosis pulmonar idiopática, aspergilosis broncopulmonar alérgica y neumonitis por hipersensibilidad), síndrome de Churg-Strauss (periarteritis nodosa más atopia), síndrome miálgico eosinofílico, síndrome hipereosinofílico, reacciones edematosas (por ejemplo, angiodema episódico, esofagitis eosinofílica, gastritis eosinofílica, gastroenteritis eosinofílica, enteritis eosinofílica y colitis eosinofílica), micropoliposis nasal y poliposis, infección por VRS, uveítis, osteoporosis y tumores malignos, incluyendo cánceres o tumores asociados con expresión anómala de IL-13 (por ejemplo, linfoma de Hodgkin). En algunas divulgaciones, el trastorno es asma alérgica, asma no alérgica (intrínseca), rinitis alérgica, dermatitis atópica, conjuntivitis alérgica, eccema, urticaria, alergias alimentarias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, colitis ulcerosa, infección por VSR, uveítis, esclerodermia u osteoporosis. En algunas divulgaciones, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores puede ser un ser humano.
En algunos casos, la divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece síntomas asmáticos que comprende administrar una cantidad de cualquiera de los anticuerpos anti-IL-13 de la divulgación eficaz para reducir los síntomas asmáticos.
En algunos casos, la divulgación proporciona un procedimiento para inhibir la producción de anticuerpos IgE en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de inhibición de la producción de anticuerpos IgE de cualquiera de los anticuerpos anti-IL-13 de la divulgación. En algunos casos, la inhibición de la producción de anticuerpos IgE se destina a prevenir el asma bronquial, prevenir la rinitis alérgica, prevenir la dermatitis alérgica, tratar el asma bronquial, tratar la rinitis alérgica, tratar la urticaria, prevenir la anafilaxia o tratar la dermatitis atópica.
En otros casos, la divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de un trastorno mediado por IgE en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-IL-13 de la divulgación. En algunos casos, el trastorno mediado por IgE es asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis alérgica, urticaria, anafilaxia o dermatitis atópica.
En otro aspecto, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-IL-13 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En una divulgación, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-IL-13 proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra divulgación, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-IL-13 proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Los anticuerpos anti-IL-13 de la divulgación se pueden usar solos o bien en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-13 de la divulgación se pueden utilizar de forma ventajosa en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfocinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IFN), por ejemplo, que sirven para incrementar el número o actividad de células efectoras que interactúan con los anticuerpos. Los anticuerpos de la divulgación se pueden administrar solos o en combinación con otros tipos de tratamientos, tales como inmunoterapia, broncodilatadores, moléculas anti-IgE, antihistamínicos o antileucotrienos.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o formulaciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del anticuerpo de la divulgación se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de la administración del agente o agentes terapéuticos adicionales. En una divulgación, la administración del anticuerpo anti-IL-13 y la administración de un agente terapéutico adicional se producen en aproximadamente un mes, o en aproximadamente una, dos o tres semanas, o en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí. Los anticuerpos de la divulgación también se pueden usar en combinación con radioterapia.
En un aspecto, un anticuerpo anti-VEGF para su uso como medicamento se describe en el presente documento. En otros aspectos, un anticuerpo anti-VEGF para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con angiogénesis patológica se describe en el presente documento. En determinadas divulgaciones, un anticuerpo anti-VEGF para su uso en un procedimiento de tratamiento se describe en el presente documento. En determinadas divulgaciones, un anticuerpo anti-VEGF para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene un trastorno asociado con angiogénesis patológica que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-VEGF se describe en el presente documento. En una divulgación de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores es preferentemente un ser humano.
En otro aspecto, el uso de un anticuerpo anti-VEGF en la fabricación o preparación de un medicamento se describe en el presente documento. En una divulgación, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno asociado con angiogénesis patológica. En otra divulgación, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con angiogénesis patológica que comprende administrar a un individuo que tiene un trastorno asociado con angiogénesis patológica una cantidad eficaz del medicamento. En una divulgación de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las divulgaciones anteriores puede ser un ser humano.
En otro aspecto, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-VEGF descritos en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En una divulgación, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-VEGF descritos en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra divulgación, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-VEGF descritos en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de reducción o inhibición de angiogénesis, por ejemplo, en un sujeto que tiene un trastorno asociado con angiogénesis patológica, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-VEGF descrito en el presente documento reduciendo o inhibiendo de este modo la angiogénesis en el sujeto. En determinadas divulgaciones, el trastorno asociado con angiogénesis patológica no es neoplásico. En determinadas divulgaciones, el trastorno asociado con angiogénesis patológica es cáncer. En una divulgación de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de un tumor, un cáncer o un trastorno proliferativo celular, comprendiendo el procedimiento administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-VEGF descrito en el presente documento. En una divulgación de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Los anticuerpos anti-VEGF descritos en el presente documento se pueden usar solos o bien en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF se puede coadministrar con al menos un agente adicional. En determinadas divulgaciones, un agente adicional es un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un profármaco, una citocina, un antagonista de citocina, radioterapia citotóxica, un corticoesteroide, un antiemético, una vacuna contra el cáncer, un analgésico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente apoptótico, un agente anti-tubulina u otro agente, tal como un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de tirosina cinasa), inhibidor de HER1/EGFR (por ejemplo, erlotinib (TARCEVA™), inhibidor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, GLEEVEC™ (mesilato de imatinib)), un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferón, citocina, un anticuerpo que se une a una diana distinta de VEGF u otro agente químico bioactivo u orgánico.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes en la misma composición o composiciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del anticuerpo de la divulgación se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de la administración del agente o agentes adicionales. En una divulgación, la administración del anticuerpo anti-VEGF y la administración de un agente adicional se producen en aproximadamente un mes, o en aproximadamente una, dos o tres semanas, o en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí. Los anticuerpos anti-VEGF descritos en el presente documento también se pueden usar en combinación con radioterapia.
Un anticuerpo anti-IL-13 o un anticuerpo anti-VEGF descrito en el presente documento (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo por vía intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutánea, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intravítrea, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, intraorbital, oral, tópica, transdérmica, por inhalación, por inyección, por implantación, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada con baño de células diana directo, por catéter, por lavado, en cremas o en composiciones lipídicas. Las composiciones utilizadas en los procedimientos descritos en el presente documento también se pueden administrar por vía sistémica o local. El procedimiento de administración puede variar dependiendo de diversos factores (por ejemplo, el compuesto o composición que se administra y la gravedad de la afección, enfermedad o trastorno que se trata).
Los anticuerpos se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. El anticuerpo no lo necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la divulgación (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra el anticuerpo con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, de 0,1 mg/kg a l0 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Por ejemplo, una dosis se puede administrar una vez al mes (por ejemplo, por inyección subcutánea). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Se entiende que cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores se puede llevar a cabo usando un inmunoconjugado en lugar de o además de un anticuerpo anti-IL-13 o un anticuerpo anti-VEGF.
En algunas divulgaciones, los procedimientos pueden comprender además un tratamiento adicional. El tratamiento adicional puede ser radioterapia, cirugía, quimioterapia, tratamiento génico, tratamiento con ADN, tratamiento vírico, tratamiento con ARN, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, nanoterapia, tratamiento con anticuerpos monoclonales o una combinación de los anteriores. El tratamiento adicional puede ser en forma de tratamiento posquirúrgico o prequirúrgico. En algunas divulgaciones, el tratamiento adicional es la administración de inhibidor enzimático de molécula pequeña o agente antimetastásico. En algunas divulgaciones, el tratamiento adicional es la administración de agentes limitantes de efectos secundarios (por ejemplo, agentes destinados a reducir la aparición y/o gravedad de los efectos secundarios del tratamiento, tales como agentes antieméticos, etc.). En algunas divulgaciones, el tratamiento adicional es radioterapia. En algunas divulgaciones, el tratamiento adicional es cirugía. En algunas divulgaciones, el tratamiento adicional es una combinación de radioterapia y cirugía. En algunas divulgaciones, el tratamiento adicional es irradiación gamma. En algunas divulgaciones, el tratamiento adicional puede ser una administración separada de uno o más de los agentes terapéuticos descritos anteriormente.
J. Artículos de fabricación
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la divulgación. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la divulgación; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico de otro modo. El artículo de fabricación en esta divulgación puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la divulgación en lugar de o además de un anticuerpo anti-IL-13 o un anticuerpo anti-VEGF.
K. Bacterias genomanipuladas
La divulgación proporciona bacterias genomanipuladas. Las bacterias de la divulgación se pueden usar, por ejemplo, en cualquiera de los procedimientos de la divulgación, por ejemplo, los procedimientos descritos anteriormente en la sección A o en los ejemplos de trabajo.
En un ejemplo, la divulgación proporciona una bacteria que incluye (i) una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma; y (ii) una construcción de expresión que codifica un polipéptido de unión.
En algunos casos, la mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma está en un gen que codifica una proteína de membrana externa y/o una proteína que afecta a la composición de lipopolisacárido (LPS). En algunos casos, la mutación está en un gen que codifica una proteína de membrana externa, por ejemplo, la lipoproteína de membrana externa principal Lpp (Lpp), una porina o TolC. En algunos casos, la proteína de membrana externa es Lpp. En algunas divulgaciones, la mutación es en un gen que codifica una proteína que afecta a la composición de LPS, por ejemplo, proteínas Env (por ejemplo, EnvA, EnvB y EnvM), RfaD, RfaE, RfaH, RfaRd, TolA, TolB y TolD.
En algunos casos, el polipéptido de unión puede ser un anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo de cualquiera de los procedimientos anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En algunos casos, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otros casos, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto, un anticuerpo IgG4 intacto u otra clase de anticuerpo o isotipo como se define en el presente documento. En otra divulgación, el anticuerpo es un semianticuerpo, por ejemplo, un semianticuerpo de botón en ojal. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168 para una descripción de la tecnología botón en ojal. En cualquiera de los procedimientos precedentes, el anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo neutralizante).
En otros casos, el polipéptido de unión puede ser un mimético de anticuerpo, por ejemplo, Affibody, Affilin, Affimer, una afitina, Alphabody, Anticalin, un avímero, una proteína de repetición de anquirina diseñada (DARPin), Fynomer, un péptido de dominio de Kunitz o un monocuerpo. En otras divulgaciones, el polipéptido de unión puede ser una proteína bacteriana que se localiza en el periplasma. En otras divulgaciones, el polipéptido de unión puede ser una proteína de mamífero. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, el polipéptido de unión puede ser un receptor de superficie celular, una citocina o un factor de crecimiento.
Por ejemplo, la divulgación proporciona una bacteria que incluye (i) una mutación con pérdida de función en un gen que codifica la lipoproteína de membrana externa principal Lpp (Lpp); y (ii) una construcción de expresión que codifica un anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. En algunos casos, el anticuerpo es un semianticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En algunos casos, el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2.
Cualquiera de las bacterias descritas anteriormente puede incluir cualquier mutación adecuada (por ejemplo, mutación con pérdida de función) en el gen que codifica Lpp. Las mutaciones de Ipp ejemplares incluyen, pero no se limitan a, Ipp-1; Ipp-21; Ipp-3; Ipp5508; Ipp-6; Ipp::Tn5KAN-2; IppD70E, G, o S; IppK75S o T; IppK78R; IppR77D o L; IppS22D; IppY76C, D, E, G, N, P o S; IppY76F, H, I o L; Alpp, Alpp-254 y Alpp-752::kan, o las descritas en el presente documento. Dichas mutaciones de lpp se pueden adquirir de, por ejemplo, un depósito tal como CGSC (The Coli Genetic Stock Center). En otros casos, se puede realizar una mutación en el gen que codifica Lpp usando enfoques de genética molecular estándar. En algunos casos, la mutación con pérdida de función en un gen que codifica Lpp se selecciona de una mutación puntual, una mutación por inserción o una mutación por deleción. En algunos casos, la mutación con pérdida de función es una mutación por deleción.
Cualquiera de las bacterias descritas anteriormente puede incluir una membrana interna, un periplasma y una membrana externa. En algunos casos, la bacteria es una bacteria gramnegativa. Por ejemplo, en algunos casos, la bacteria es una E. coli. Se puede usar cualquier cepa o acervo génico adecuado de E. coli. Las cepas y acervos génicos usados comúnmente de E. coli son bien conocidos en la técnica. Las cepas de E. coli ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cepas de laboratorio tales como K-12 y sus subcepas (por ejemplo, Clifton natural, W3110, DH5aE y similares), y E. coli B y sus subcepas (por ejemplo, BL21, b L21(DE3) y similares). En algunas divulgaciones, la E. coli se deriva de la cepa 62A7. En algunas divulgaciones, la E. coli se deriva de la cepa 33D3. En algunas divulgaciones, la E. coli se deriva de la cepa 66C4.
En algunos casos, cualquiera de las bacterias precedentes puede incluir una mutación que afecta a un gen regulador de la transcripción. En algunos casos, el gen regulador de la transcripción se selecciona de un factor de iniciación de la transcripción, un factor anti-sigma, una subunidad de ARN polimerasa o un factor de transcripción. En algunos casos, el factor de iniciación de la transcripción es un factor sigma. En algunos casos, el factor sigma se selecciona del grupo que consiste en RpoD (a70), RpoE (a24), RpoH (a32), RpoS (a38), RpoN (a54), RpoF (a28) y Fecl (a19). En casos particulares, el factor sigma es RpoD (a70). En algunos casos, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en un plásmido sintético. En otros casos, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en el genoma bacteriano endógeno. En algunos casos, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error, mutagénesis química, mutagénesis transposicional o mutagénesis dirigida. En algunos casos, la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error.
En algunos casos, la divulgación proporciona una pluralidad de cualquiera de las bacterias precedentes. En algunas divulgaciones, la pluralidad de bacterias puede incluir una colección de la divulgación, por ejemplo, cualquier colección descrita en el presente documento en la sección B, anterior, o en los ejemplos de trabajo. En algunos casos, la pluralidad de bacterias puede incluir una colección de ácidos nucleicos, codificando cada uno un mutante de un gen regulador de la transcripción (por ejemplo, un factor sigma, por ejemplo, RpoD (a70)).
Cualquiera de las bacterias precedentes puede tener una mejora en la expresión del polipéptido de unión (por ejemplo, anticuerpo) en al menos aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 5 % aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 100 %, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 25 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 35 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 45 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces o más. En algunos casos, la bacteria puede tener una mejora en la expresión de entre 1 y 10 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 7 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 6 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 5 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 4 veces, una mejora en la expresión de entre 1 y 3 veces, una mejora en la expresión de entre 2 y 10 veces, una mejora en la expresión de entre 2 y 8 veces, o una mejora en la expresión de entre 2 y 6 veces. En algunas divulgaciones, la mejora es relativa al nivel de expresión del polipéptido de unión en una bacteria natural. En otras divulgaciones, la mejora es relativa al nivel de expresión del polipéptido de unión en una bacteria mutante.
III. EJEMPLOS
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden practicar otros diversos modos de realización, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Ejemplo 1: desarrollo de un sistema de presentación bacteriana de anticuerpos en células vivas compatible con polipéptidos de longitud completa
Se desarrollaron procedimientos de presentación bacteriana de anticuerpos en células vivas que son compatibles con ligandos y polipéptidos de unión de longitud completa, por ejemplo, antígenos y anticuerpos de longitud completa. Para superar las limitaciones de los sistemas de presentación bacteriana previos, se desarrollaron formas novedosas para administrar el ligando (por ejemplo, el antígeno unido por un anticuerpo) pasada la membrana externa bacteriana al periplasma sin comprometer sustancialmente la viabilidad de las células bacterianas.
La deleción de la proteína de membrana externa principal (lipoproteína de mureína, Lpp) hace que la membrana externa sea semipermeable. Se utilizó EDTA para permeabilizar además la membrana externa (Leive et al. J. Biol. Chem. 243: 6384-6391, 1968; Hancock, Annu. Rev. Microbiol. 38: 237-264, 1984). El acervo génico de úlpp se ha usado para filtrar proteínas del espacio periplásmico al medio para facilitar la purificación (Kanamori et al. Gene 66: 295-300, 1988). Sin embargo, este acervo génico también se podría usar en principio para permitir que los ligandos que normalmente están excluidos por la barrera de permeabilidad de la membrana externa se difundan en el periplasma.
Para demostrar la funcionalidad de este sistema, se expresó una IgG anti-IL-13 (Spiess et al. J. Biol. Chem. 288: 26583-26593, 2013) en un acervo de ñlpp, y se usó microscopía fluorescente para determinar si las células tratadas con EDTA se pudieron unir a citocina IL-13 marcada con fluorescencia añadida de forma exógena. Solo las células que expresan el anticuerpo retuvieron el antígeno (fig. 1A), lo que indica que no se requiere un anclaje de membrana para retener eficazmente el anticuerpo en las células. Aunque el antígeno de IL-13 tiene un peso molecular de ~15 kDa, la tinción con un anti-Fc F(ab')2 indica que los antígenos que tienen un tamaño de al menos 100 kDa podrían entrar y retenerse eficazmente en el periplasma de células permeabilizadas. En otros experimentos, las células se tiñeron con éxito con un anticuerpo de longitud completa, lo que indica que las moléculas que tienen un tamaño de al menos 150 kDa pueden entrar eficazmente y retenerse en el periplasma de las células permeabilizadas. Sin embargo, el uso de EDTA para permeabilizar las células dio como resultado una disminución en la viabilidad celular. Para superar la disminución en la viabilidad, se añadió MgCh después de teñir con antígeno y EDTA, lo que restableció la viabilidad a niveles observados antes del tratamiento con EDTA (fig.
1B).
A continuación, se sometieron a prueba otros formatos de anticuerpo para determinar si se podían retener eficazmente en el periplasma para unirse al antígeno. De manera similar al anticuerpo de longitud completa, los formatos tanto de Fab como de semianticuerpo se pudieron expresar y teñir con antígeno sin afectar a la viabilidad (fig. 1B). Aunque las células de control de vector vacío (pBR322) mostraron autofluorescencia por citometría de flujo que contribuyó a una señal de fondo, todos los formatos de anticuerpos sometidos a prueba dieron una señal específica de antígeno por encima de este fondo que permitió una separación eficaz (fig. 1C). Los semianticuerpos con tecnología de Fc con botones en ojales son de interés ya que se pueden usar para generar anticuerpos biespecíficos de longitud completa (Spiess et al. Nat. Biotechnol. 31: 753-758, 2013). Para todos los experimentos de presentación siguientes, se utilizaron construcciones de semianticuerpo.
Como se describe a continuación, la tecnología (a veces denominada en el presente documento presentación bacteriana de anticuerpos o "BAD" en un sentido amplio y no limitante) supera los límites actuales de presentación bacteriana administrando antígeno de longitud completa en células vivas, permitiendo una progresión ronda a ronda rápida usando selección de citometría de flujo (por ejemplo, FACS™) (fig. 1D). Se debe entender que se puede usar BAD no solo con anticuerpos sino también con cualquier polipéptido de unión adecuado. En una primera etapa, se sometió a prueba el enriquecimiento de un anticuerpo de unión a partir de un grupo de proteínas no fijadoras usando BAD. Las células que expresan un anticuerpo anti-IL-13 se añadieron a un grupo de células que expresan anticuerpos anti-VEGF. Para rastrear las proporciones de cada anticuerpo en la mezcla, se usó un plásmido que confiere solo resistencia a carbenicilina para expresar anti-VEGF, mientras que el plásmido usado para expresar anti-IL-13 confiere resistencia tanto a carbenicilina como a tetraciclina. La exactitud de la adición se determinó inicialmente sembrando con manchas diluciones en serie del cultivo mixto en proporciones 1:105 y 1:106 en placas que contenían carbenicilina o tetraciclina, lo que confirmó que el anticuerpo anti-IL-13 se representó en el grupo con la frecuencia anticipada (fig. 2A). Para una cuantificación más exacta de los experimentos de separación que siguieron, se sembraron volúmenes más grandes y se tomaron recuentos de colonias para calcular la proporción de anti-IL-13 con respecto a anti-VEGF en cada muestra. Comenzando con una proporción 1:106 de anti-IL-13:anti-VEGF, se realizaron dos rondas de BAD separando las células positivas anti-IL-13 y se logró un enriquecimiento de 235.000 veces (fig. 2B). Para garantizar que se podía enriquecer un par de antígeno/anticuerpo separado, se realizó el experimento inverso, dando como resultado un enriquecimiento de 19.500 veces del anticuerpo anti-VEGF de unión después de dos rondas de FACS™ (fig. 2B). Este enriquecimiento correspondió a un gran desplazamiento positivo de VEGF en la población después de la segunda ronda de FACS™ (fig. 2C). Estos experimentos confirmaron que los clones de unión se pudieron enriquecer rápida y altamente por el sistema BAD.
A continuación, se sometió a prueba el sistema BAD para determinar su capacidad para enriquecer para obtener la mejor expresión o variantes de plegamiento del mismo anticuerpo. Para someter a prueba la resolución del sistema, se usó un semianticuerpo en base al anticuerpo anti-VEGF.2 junto con tres variantes que tienen diferentes niveles de expresión. Las variantes incluyeron diferentes combinaciones de mutaciones de la cadena ligera (L4M, S24R, F71Y) y cadena pesada (E6Q, M341). Se detectaron muestras solubles no reducidas con un anticuerpo anti-Fc humano por inmunoelectrotransferencia y se normalizaron los niveles de expresión al semianticuerpo anti-VEGF.2 natural (WT) (fig. 3A). Anti-VEGF.2 WT tuvo la menor expresión funcional, mientras que L4M.E6Q.M341, F71Y.E6Q.M34I y S24R.E6Q.M34I tuvieron incrementos de 3,7, 5,6 y 7,2 veces en los niveles de expresión, respectivamente. Para garantizar que la expresión y el desplazamiento de FACS™ estuvieran de acuerdo, se usó BAD para determinar los desplazamientos de FACS™ individuales para anti-VEGF.2 WT y variantes teñidas con VEGF marcado con fluorescencia (fig. 3B). Las intensidades de fluorescencia medias de FACS™ se clasificaron en el mismo orden que los niveles de expresión, teniendo L4M.E6Q.M34I, F71Y.E6Q.M34I y S24R.E6Q.M34I incrementos de 1,25 /- 0,2, 1,37 /- 0,2 y 1,4 /- 0,3 veces en comparación con anti-VEGF.2 WT. Por tanto, estos anticuerpos fueron buenos candidatos para someter a prueba si BAD podía seleccionar los anticuerpos de mejor expresión.
Se realizó un cribado con BAD combinando anti-VEGF.2 WT con las tres variantes. Se realizaron dos rondas de FACS™ y se separaron un 1 % superior de los clones de unión a VEGF en cada ronda. Se realizó un seguimiento del desplazamiento de FACS™ de los cuatro anticuerpos anti-VEGF.2 combinados durante dos rondas de separación (fig. 3C). Se observó una distribución bimodal de células en algunas de las muestras, que se atribuyó a permeabilización celular parcial y autofluorescencia de fondo de E. coli. La señal de unión de VEGF de las variantes agrupadas se superpuso después de dos rondas de separación con la mejor variante de expresión, S24R.E6Q.M34I, lo que sugiere que los anticuerpos de mejor expresión se estaban enriqueciendo. La secuenciación de aportes muestra que los cuatro anticuerpos anti-VEGF.2 estuvieron presentes al inicio de la separación, mientras que anti-VEGF.2 WT y L4M.E6Q.M34I se agotaron parcialmente después de la ronda 1 (fig.
3D). Después de la ronda 2, no se detectaron anti-VEGF.2 WT ni L4M.E6Q.M34I, y solo se enriquecieron F71Y.E6Q.M34I y S24R.E6Q.M34I. Estos datos demuestran que a pesar de las pequeñas diferencias de expresión, BAD puede enriquecer con éxito los anticuerpos de mejor expresión.
Los procedimientos descritos anteriormente son útiles en muchas aplicaciones. Con respecto a la genomanipulación de anticuerpos, se puede usar con colecciones más grandes para la genomanipulación de Fc, descubrimiento de anticuerpos o maduración de la afinidad. Más allá de los anticuerpos, el sistema BAD podría ser aplicable como herramienta de alto rendimiento general para estudiar la exportación, plegamiento o localización de proteínas en el periplasma de E. coli, ya que ofrece una lectura real en un entorno de huésped celular. Una ventaja principal de este sistema es el enfoque sin anclaje que permite el uso de un formato de proteína natural, lo que hace que los compañeros de fusión, proteínas indicadoras o anclajes de membrana sean innecesarios. Además, el enfoque de configuración de células vivas permite un cribado excepcionalmente rápido de las características de huésped deseadas, una mejora significativa sobre las tecnologías de presentación previas.
M a te r ia le s
C o n s tr u c c ió n y e x p r e s ió n d e p lá s m id o s
Se clonaron anticuerpos por técnicas de biología molecular estándar en vectores de expresión de E. coli (Simmons et al. J. Immunol. Methods 263: 133-147, 2002; Carter et al. Biotechnology (N.Y.) 10: 13-167, 1992) o vectores de expresión de mamífero (Eaton et al. Biochemistry 25: 8343-8347, 1986) como se describe previamente. Se llevó a cabo la expresión de anticuerpos usando 50 ml de cultivos celulares de E. coli (Spiess et al. J. Biol. Chem. 288: 26583-26593, 2013) o 30 ml de cultivos de transfección transitoria de CHO (Wong et al. Biotechnol. Bioeng. 106: 751-763, 2010) o células HEK293T (Bos et al. J. Biotechnol. 180: 10-16, 2014) como se describe previamente.
P u r if ic a c ió n d e a n t ic u e r p o s
Para la purificación de proteína Fab a partir de E. coli, se expresó la proteína como se describe anteriormente (Spiess et al. Nat. Biotechnol. 31: 753-758, 2013) en la cepa 64B4 (Reilly et al. Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg, pp. 331-344, 2010) con una deleción del gen Ipp cromosómico. Después del crecimiento de un cultivo CRAP de 500 ml durante 24 horas a 30 °C, se añadió EDTA, pH 8,0, hasta una concentración final de 10 mM. La incubación continuó durante 1 h a 30 °C a 200 rpm, antes de que se añadiera MgCh hasta una concentración final de 20 mM. Se retiraron los restos celulares por centrifugación (20 min, 4500 rcf, 4 °C), seguido de la adición de 400 |jg de desoxirribonucleasa I (Sigma-Aldrich, EE. UU.) antes de que se filtrara el sobrenadante a través de un filtro GF/F (Whatman, Inglaterra) y un filtro PES de 0,2 |j (Thermo Fischer Scientific, EE. UU.). Se añadieron 1,5 ml de suspensión de Protein G SEPHAROSE® (GE Healthcare, EE. UU.) a 50 ml de lisado y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Se retiraron las proteínas no unidas lavando con PBS, se eluyó la proteína Fab con 4 ml de ácido fosfórico 50 mM, pH 3, se neutralizó con 20 x PBS y se concentró con un concentrador AMICON® Ultra-4 (corte de 10.000 MW) (Merck Millipore, Irlanda).
Se purificó IgG1 humana a partir de sobrenadantes de cultivo de mamífero por MABSELECT SURE™ (GE Healthcare, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la purificación de Fab humano a partir de sobrenadantes de cultivo de mamífero, se añadió una marca FLAG al extremo C de la cadena pesada y se purificó el Fab con resina anti-FLAG de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma-Aldrich, EE. u U.). Se cuantificaron los rendimientos de proteínas determinando la absorbancia a 280 nm y usando el coeficiente de extinción específico de proteína.
A n t íg e n o s
La expresión y purificación de VEGF8-109 humano se describió previamente (Muller et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7192-7197k 1997). Se expresó IL-1333-146 humana marcada con Unizyme en E. coli, se purificó por cromatografía de Ni-NTA (Qiagen, Alemania) en condiciones de desnaturalización y se replegó. Se marcaron con fluorescencia las proteínas con éster succinimidílico de ALEXA FLUOR® 488 o ALEXA FLUOR® 647 (Invitrogen, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se obtuvo el fragmento F(ab')2 de Fc anti-IgG humana de cabra marcado DYLIGHT® 649 de Jackson Immuno Research, EE. UU.
P r e s e n ta c ió n b a c te r ia n a d e a n t ic u e r p o s y c i to m e tr ía d e f lu jo
Para la presentación bacteriana, los anticuerpos se expresaron en una deleción de Lpp (Alpp) de la cepa 62A7. Se derivó 62A7 de la cepa original 33D3 curando la resistencia a kanamicina de la cepa 33D3 (Simmons et al. J. Immunol. Methods 263: 133-147, 2002). Para experimentos de adición o experimentos con variantes estructurales individuales, se transformaron individualmente células con los respectivos plásmidos, se cultivaron durante la noche a 30 °C, se combinaron en las proporciones descritas o igualmente por volumen y se usaron en una dilución 1:100 para inocular 50 ml de cultivos CRAP. Después de 24 horas a 30 °C, se recogieron alícuotas de 1 DO y se sedimentaron por centrifugación (4 minutos, 6500 rcf). Se resuspendieron células en 100 j l de PBS, pH 7,4, con BSA al 2 % y EDTA 5 mM y se incubaron a 4 °C durante 30 minutos. Después de la incubación inicial, se añadió tinción de ácido nucleico sYt O® 41 o 9 (Molecular Probes, EE. UU.) hasta una dilución final de 1:100, y se añadió antígeno marcado con ALEXA488 o ALEXA647 hasta una concentración final de 1-2 |j M. Se continuó la incubación a 4 °C en oscuridad durante 1 hora, momento en el que se añadió MgCh hasta una concentración final de 10­ 20 mM. Se retiraron las proteínas no unidas lavando 3 veces con volúmenes de 1 ml de PBS, pH 7,4, MgCh 20 mM. Se resuspendieron las células teñidas en medio SOC (New England Biolabs, EE. UU.) hasta una concentración final de 1x107 células/ml para análisis y 1x106 células/ml para separación usando un citómetro de flujo BD FACSARIA™ II. La estrategia de selección de FACS™ incluyó células que eran positivas al tinte SYTO®. Se usaron ventanas de discriminación de dobletes para eliminar dobletes y finalmente se separaron las células positivas para antígeno. Se separaron células en medio SOC, se recuperaron a 30 °C durante la noche y se usaron para reinocular cultivos de expresión o se congelaron como reservas de glicerol.
M ic r o s c o p ía
Se realizó la expresión y tinción de células por microscopía fluorescente de manera idéntica al protocolo de presentación bacteriana descrito anteriormente. Después de las etapas de lavado de PBS con MgCh 20 mM, se resuspendieron las células en 100 j l de PBS con MgCh 20 mM y se mezclaron con gelatina al 1 % a 37 °C para la preparación de portaobjetos. Se realizó la microscopía fluorescente usando un Zeiss Axio Imager A1.
In m u n o tr a n s fe r e n c ia s
Se realizó la inmunotransferencia como se describe previamente (Spiess et al. Nat. Biotechnol. 31:753-758, 2013), excepto que los anticuerpos se expresaron en una cepa derivada de 33D3 curada de resistencia a kanamicina.
M e d ic io n e s d e e s ta b i l id a d d e p r o te ín a s p o r f lu o r im e tr ía d e b a r r id o d ife r e n c ia l
Se determinó la estabilidad de proteínas en un sistema Biorad CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, EE. UU.) con una dilución final de 1:500 de la reserva de tinte SYPRO® Orange (Molecular Probes, EE. UU.). Se registró fluorescencia de una muestra de 25 j l en PBS de 20-100 °C (incrementos de 0,2 °C, 10 segundos de retención por etapa).
E x tr a c to p e r ip lá s m ic o
Para generar el extracto periplásmico para análisis de Biacore, se sedimentaron 40 ml de caldo de expresión de E. coli, de la cepa de presentación bacteriana de anticuerpos, por centrifugación a 5.000 rpm durante 5 minutos. Se resuspendieron los sedimentos en 1,5 ml de Tris 50 mM frío, pH 8,0, EDTA 1 mM y sacarosa 500 mM y se incubaron en hielo durante 30 min con agitación. Después de la centrifugación de la muestra a 9000 rpm durante 10 min, se recogió el sobrenadante como extracto periplásmico.
R e s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f ic ia l
Se midió la cinética de unión de los anticuerpos anti-IL-13 y anti-VEGF usando resonancia de plasmón superficial en un instrumento BIACORE™ 3000 o T200 (GE Healthcare), respectivamente. Se realizaron todos los experimentos de cinética a un caudal de 30 jl/min, a 25 °C, y con un tampón de migración de HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,005 %. Para anti-IL-13, se inmovilizó una proteína fijadora de Fab del kit Human Fab Capture Kit (Ge Healthcare) en un chip sensor CM5 por medio de un acoplamiento a base de amina para capturar los semianticuerpos anti-IL-13 de extractos periplásmicos de E. coli. Se midió la unión de IL-13 humana al anticuerpo usando una serie de concentración de dos veces de citocina con un intervalo de 1,56 a 50 nM. Se registraron sensogramas para la unión de IL-13 usando un tiempo de inyección de 120 segundos seguido de 1000 segundos de tiempo de disociación y regeneración de la superficie entre ciclos con glicina, pH 2,1. Para anti-VEGF, se inmovilizó Ve Gf humano en un chip sensor CM5 por medio de acoplamiento a base de amina. Se usó una serie de concentraciones de tres veces de Fab anti-VEGF que variaban de 6,17 a 500 nM para analizar la unión a VEGF. Se registraron sensogramas de cinética de ciclo único usando un tiempo de inyección de 120 segundos seguido de 300 segundos de tiempo de disociación y regeneración de la superficie entre ciclos con HCl 20 mM. Todos los sensogramas observados para la unión de antígeno a anticuerpos se analizaron usando un modelo de unión de Langmuir 1:1 para calcular la cinética y las constantes de unión.
Ejemplo 2: optimización de separación celular usando presentación bacteriana de anticuerpos
Para maximizar la viabilidad celular durante el procedimiento de separación para facilitar la velocidad y eficacia de la separación ronda a ronda usando BAD, se comparó la viabilidad de diferentes cepas de E. coli natural después de la expresión de un anticuerpo. Las cepas de expresión de E. coli tuvieron viabilidades variables después de la expresión de un anticuerpo; por ejemplo, las células 64B4 naturales tuvieron una disminución aproximada de 1 vez en la viabilidad celular en comparación con otras cepas naturales, incluyendo células 62A7 (fig. 8). Además, las células 62A7 con deleción de Lpp (62A7úlpp) tuvieron mayor viabilidad que las células 64B4úlpp (fig. 8). Las células 62A7úlpp permanecieron viables después de la separación FACS™ después de la expresión de anticuerpo e incubación con antígeno marcado y pudieron experimentar múltiples rondas de marcado y separación. Por lo tanto, la elección del acervo de cepa es un factor que se puede usar para optimizar el procedimiento de separación celular durante BAD. En los procedimientos que usan la deleción ñlpp, el procedimiento es compatible con cualquier acervo génico natural que pueda expresar anticuerpos.
También se optimizaron las condiciones de separación por citometría de flujo para incrementar la cantidad de células recuperadas después de una separación. Se sometió a prueba una variedad de tintes de ácido nucleico para determinar su capacidad para mejorar la detección de las células E. coli durante la citometría de flujo. Se sometió a prueba un panel de seis tintes de ácido nucleico azules (tintes SYTO® 40-45) para determinar la eficacia de tinción de células que expresan un anticuerpo anti-VEGF en comparación con un control no teñido (fig. 9). Se detectaron células positivas para tinte usando cada uno de los tintes de ácido nucleico. De las tinciones sometidas a prueba, SYTO® 41 dio la mayor eficacia de tinción (aproximadamente un 90 % de las células tratadas). El uso de este tinte de ácido nucleico como parte de la estrategia de selección durante la citometría de flujo incrementó la cantidad de células recuperadas de las separaciones. SYTO® 9 es un ejemplo no limitante de un tinte que tiñe con una eficacia comparable a SYTO® 41. Para facilitar el enriquecimiento de anticuerpos que tienen diferencias en los niveles de expresión y/o estabilidad, se debe minimizar la pérdida de células positivas para antígeno durante la separación. La presencia de dobletes celulares, que son dos células que están pegadas entre sí pero se detectan como una única célula por citometría de flujo, podría perjudicar en principio el enriquecimiento de células positivas para antígeno después de una separación. En este escenario, las células positivas para antígeno se podrían adherir a células que son negativas para antígeno, reduciendo de este modo el enriquecimiento. Para someter a prueba si los dobletes celulares se producen bajo estas condiciones de separación, se marcaron las células que expresan el anticuerpo anti-VEGF anti-VEGF.V48L con VEGF-ALEXA FLUOR® 488, mientras que se marcaron las células que expresan anti-VEGF.A97T con VEGF-ALEXA FLUOR® 647. A continuación, se combinaron estas células por igual y se sometieron a citometría de flujo. En la separación de concentraciones de 1x108 células/ml, estaban presentes dobletes de células, como se indica por las células que fueron positivas para ambos antígenos (fig. 10). Para disminuir los dobletes se usó una concentración celular menor de 1x106 células/ml, que fue suficiente para eliminar los dobletes detectados por análisis citométrico de flujo.
Se sometió a prueba una estrategia de separación que combinó el uso de la cepa 62A7úlpp, separando concentraciones celulares de 1x106 células/ml y citometría de flujo que incluyó separación en base a la señal de la tinción de ácido nuclei
estándar, y selección de células positivas para antígeno (fig. 11). Para confirmar que esta estrategia de separación sería exitosa, se realizó una única ronda de BAD usando células de 62A7úlpp E. coli que expresan anti-VEGF.V48L o anti-VEGF.A97T (descrito a continuación en el ejemplo 4) que se marcaron con VEGF-ALEXA FLUOR® 488 o VEGF-ALEXA FLUOR® 647, respectivamente, y se combinaron por igual. Se separaron las células en base a la unión positiva para un antígeno individual a los antígenos marcados por separado, unión positiva doble o unión negativa doble (fig. 12A). Se detectó una combinación igual de ambas variantes anti-VEGF a partir de la secuenciación de los clones de aporte. Después de una ronda de separación, aproximadamente un 93-95 % de las células separadas como positivas para un antígeno individual expresaron la variante anti-VEGF esperada, lo que confirma la exactitud de la estrategia de separación (fig. 12B). La población negativa doble de células no tuvo un sesgo en la selección de ningún anticuerpo, ya que se encontró una población igual de ambos anticuerpos anti-VEGF (fig. 12B). Estos resultados muestran que las condiciones de separación descritas en este ejemplo son adecuadas para enriquecer clones después de una ronda individual de BAD. Las células fueron viables y se pudieron recuperar después de la separación y se sembraron, permitiendo facilitar el análisis de secuencia durante una ronda de BAD y la capacidad de progresar de ronda a ronda. Adicionalmente, los dobletes no interfirieron con las capacidades de separación del procedimiento debido a la alta tasa de éxito de la separación, que era comparable a los límites de selección inherentes al instrumento FACS™ Ariall usado para este análisis.
Ejemplo 3: generación de anticuerpos anti-IL-13 con una mejora en la expresión y estabilidad usando los procedimientos de la invención
Se utilizaron los procedimientos descritos en el ejemplo 1 para seleccionar el incremento en la expresión funcional y estabilidad de un anticuerpo anti-IL-13 terapéutico. Se han adoptado varios enfoques para incrementar los rendimientos de anticuerpos en E. coli, incluyendo mutagénesis por saturación de posiciones seleccionadas en la secuencia del anticuerpo. Sin embargo, como este enfoque da lugar predominantemente a cambios aminoacídicos que no se encuentran en el repertorio natural de anticuerpos, permanece el riesgo de introducir secuencias inmunógenas en anticuerpos de interés terapéutico.
El presente enfoque utiliza la diversidad estructural natural que se produce durante la hipermutación somática. Se examinó la base de datos Kabat de anticuerpos naturales (Kabat, supra), y se identificaron cambios aminoacídicos de la línea germinal en las regiones estructurales de los subtipos de cadena ligera kappa 4 y cadena pesada VH2, al igual que el anticuerpo anti-IL-13 (fig. 6). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, es menos probable que los residuos estructurales afecten a la afinidad que los residuos en las regiones hipervariables. Adicionalmente, los residuos ocultos en las regiones estructurales deberían contribuir a mejorar el plegamiento y estabilidad del anticuerpo, pero disminuyen el potencial de inmunogenicidad en comparación con los residuos expuestos en superficie.
Un diagrama de cinta del esqueleto de anticuerpo de cadena principal en base al subgrupo de los dominios variables anti-IL-13 se muestra en la fig. 13. La hipermutación somática puede introducir cambios tanto en las regiones estructurales como en regiones hipervariables. Al cotejar los datos de la base de datos de Kabat, se recopilaron todos los cambios aminoacídicos que se producen por hipermutación somática dentro de la región estructural de los subtipos variable kappa 4 (Vk 4, amarillo) y pesada 2 (Vh 2, gris), y a continuación se redujeron las variantes elegidas a los residuos no expuestos a disolvente (esferas) en base a un modelo de homología anti-IL-13. Se usó PyMOL para visualizar el modelo para identificar los residuos no expuestos a disolvente. Se prepararon variantes estructurales individuales de semianticuerpo anti-I L-13, 5 en la cadena ligera y 28 en la cadena pesada, y se combinaron para cribar por BAD.
Se realizó un cribado con BAD con la colección de variantes estructurales de semianticuerpo anti-I L-13. Al realizar el seguimiento de los datos de FACS™ durante dos rondas, las variantes estructurales anti-IL-13 mostraron un incremento en la unión al antígeno de IL-13 en comparación con anti-IL-13 WT (fig. 4A). Se separaron un 1 % superior de las células positivas para IL-13 en base a la señal del antígeno marcado, y se secuenciaron los resultados de separación. Anti-IL-13 WT se agotó en la ronda 2 (fig. 4B) y la variante de la cadena ligera M4L se enriqueció en gran medida (82 % de los clones secuenciados). Además, la variante de la cadena pesada E6Q (14 % de los clones secuenciados) también se enriqueció, mientras que las variantes de la cadena pesada S25Y, F27L, L29I y L45P y la variante de la cadena ligera S12A se observaron cada una en menos de un 2 % de los clones secuenciados.
Para confirmar que las variantes estructurales anti-IL-13 identificadas después de la ronda 2 incrementaron la expresión funcional, se compararon sus niveles de expresión en E. coli usando una inmunoelectrotransferencia anti-Fc humano. La variante de la cadena ligera M4L mostró el mayor incremento en la expresión, aproximadamente 2 veces mejor que anti-IL-13 WT (fig. 4C), correlacionándose con el mejor enriquecimiento por BAD. Las variantes estructurales de la cadena pesada E6Q y F27L también tuvieron mayores niveles de expresión que anti-IL-13 WT (fig. 4C), mientras que el resto de las variantes tuvieron una expresión similar a anti-IL-13 WT. Los datos de inmunoelectrotransferencia se correlacionaron con la clasificación observada con variantes estructurales individuales que se unen al antígeno de IL-13, medidos por la intensidad de fluorescencia media de FACS™. Se usaron concentraciones de antígeno muy por encima de la Kd para minimizar la contribución de las diferencias de afinidad y garantizar que los niveles de expresión estaban conduciendo a la identificación de las variantes estructurales anti-IL-13. Se obtuvieron datos cinéticos de unión y se confirmó que las variantes estructurales anti-IL-13 M4L, E6Q, F27L y anti-IL-13 WT tuvieron afinidades comparables (tabla 2).
Tabla 2. Afinidad antigénica de variantes estructurales de semianticuerpo anti-IL-13.
ka (1/Ms, E+5) kd (1/s, E-5) Kd (nM)
WT 13,0 ± 0,700 5,09 ± 1,40 0,040 ± 0,013
M4L 11,1 ± 0,603 3,16 ± 1,12 0,029 ± 0,010
E6Q 11,3 ± 1,01 4,26 ± 0,445 0,038 ± 0,007
F27L 13,0 ± 0,954 4,43 ± 0,362 0,034 ± 0,003
En informes previos, las mutaciones que incrementaron la expresión de anticuerpos en E. coli no se tradujeron en sistemas huésped eucariotas (Demarest et al. Protein Eng. Des. Sel. 19: 325-336, 2006; Schaefer et al. Protein Eng. Des. Sel. 25: 485-506, 2012). Para determinar si la estrategia de cribado había identificado variantes que se correlacionan con mayores niveles de secreción en células de mamífero, lo que permite la traducibilidad de la selección de variantes entre huéspedes de expresión, se examinaron los rendimientos de expresión de células HEK 293T de los semicuerpos anti-IL-13 que proporcionaron un incremento en la expresión en E. coli. Aunque las ganancias fueron ligeramente más pequeñas en células eucariotas, se observó una correlación casi lineal en las ganancias de expresión entre los dos huéspedes (fig. 4C). Por lo tanto, la estrategia de cribado descrita en el presente documento se puede usar para identificar variantes que muestran una mejora en la expresión tanto en E. coli como en células de mamífero.
Para someter a prueba si la mejora en la expresión se correlaciona con un incremento en la estabilidad conformacional, se realizó una fluorimetría de barrido diferencial (DSF). Las temperaturas de fusión (Tf) de Fab anti-IL-13 producidos en E. coli con mutaciones M4L, E6Q o F27L se compararon con WT (fig. 4D). La variante M4L incrementó la estabilidad térmica en aproximadamente 5 °C (Tf de 75,1 ± 0,3 °C) en comparación con anti-IL-13 WT (Tf de 69,4 ± 0,4 °C). Sin embargo, las mutaciones E6Q y F27L no proporcionaron un incremento significativo en la estabilidad termodinámica. Para verificar que el incremento en la termoestabilidad para la variante M4L es independiente del huésped, se produjeron las variantes anti-IL-13 como IgG en células c Ho . Se observó un incremento de 5 °C similar en la termoestabilidad en un huésped eucariota.
La combinación de las variantes anti-IL-13 identificadas por el cribado con BAD podría ser aditiva e incrementar además la expresión funcional. Por lo tanto, se examinaron los niveles de expresión en E. coli y células de mamífero para las combinaciones de M4L, E6Q y F27L (fig. 4C). La combinación doble M4L.E6Q muestra un incremento aditivo en los niveles de expresión en ambos huéspedes. Estas dos variantes fueron las únicas variantes altamente enriquecidas en el cribado con BAD, lo que respalda además las capacidades de selección de la presente tecnología. Adicionalmente, solo las combinaciones variantes que contienen la mutación M4L muestran un incremento de 5 °C en la estabilidad térmica (fig. 4D). Por tanto, se identificó un conjunto de variantes estructurales centrales que incrementan la expresión funcional y estabilidad térmica para mejorar además las propiedades biofísicas de un anticuerpo terapéutico anti-IL-13. Aunque se mejoraron las propiedades in vitro de la molécula, no se ha sometido a prueba la pertinencia clínica de dichas variantes.
Ejemplo 4: generación de anticuerpos anti-VEGF con una mejora en la expresión y estabilidad usando los procedimientos de la invención
Para confirmar además que la estrategia descrita en los ejemplos 1 y 3 es en general aplicable, se usó el procedimiento BAD para mejorar la expresión y estabilidad de un anticuerpo de una línea germinal diferente, el anticuerpo anti-VEGF.3. Anti-VEGF.3 tiene los subtipos de cadena ligera kappa 1 y cadena pesada VH3. De manera similar al enfoque con anti-IL-13 descrito en el ejemplo 2, se recopilaron anticuerpos naturales con estos subtipos de la base de datos Kabat, y se identificaron las posiciones estructurales con variabilidad de hipermutación somática (fig. 7). Las posiciones conocidas por ser importantes para la unión a VEGF y las que están expuestas a disolventes se excluyeron del análisis para reducir el impacto sobre la afinidad o inmunogenicidad, respectivamente.
Se realizó un cribado con BAD usando los procedimientos descritos en los ejemplos 1 y 3 con las variantes estructurales anti-VEGF.3 identificadas, combinando 47 variantes de la cadena ligera, 36 variantes de la cadena pesada y anti-VEGF.3 WT. Se separaron un 0,5 % superior de las células positivas para VEGF durante tres rondas. Se agota anti-VEGF.3 WT en la ronda 1, y las variantes estructurales mostraron un incremento en la unión al antígeno VEGF en comparación con anti-VEGF.3 WT con rondas progresivas (fig. 5A).
Después de la ronda 3, se enriquecieron los clones (fig. 5A) y se sometió a prueba la expresión y termoestabilidad de las variantes seleccionadas en BAD en E. coli y células HEK 293T. Las variantes de la cadena pesada anti-VEGF.3 E6Q, V48L y V48I (85 %, 7 % y 3 % de los clones secuenciados, respectivamente) mejoraron la expresión en aproximadamente 3-4,5 veces en E. coli (fig. 5B). Para determinar si la mejora en la expresión se correlacionó con un incremento en la estabilidad, se realizó DSF. Todas las variantes mostraron una mejora en la termoestabilidad en aproximadamente 3 °C en comparación con anti-VEGF.3 WT (fig. 5C). Las cadenas laterales de E6 y V48 (fig. 5D) se sitúan en el núcleo del cuerpo beta de VEGF-Fab de la cadena pesada variable (Fuh et al. supra). Puesto que las variantes E6Q, V48L y V48I mejoraron el plegado y proporcionan una estabilidad superior, se sugirió, sin quedar vinculado a una teoría particular, que la interfaz de lámina beta está ligeramente infraempaquetada, y la retirada de la carga o una cadena lateral más grande mejoraría el empaquetado. La variante de la cadena pesada V37I (1 % de los clones secuenciados de la ronda 3) mejoró la expresión en menor grado (2,3 veces en E. coli) e incrementó la termoestabilidad en 2 °C (fig. 5C). Al contrario que E6 y V48, V37 se encuentra en la interfaz con la cadena ligera (fig. 5D), lo que ilustra la importancia de los contactos intercatenarios así como intracatenarios para la estabilidad y plegamiento de anticuerpo.
A continuación, se combinaron las variantes estructurales para estudiar el potencial de los efectos aditivos. Todas las variantes dobles tuvieron efectos aditivos con mejoras en la expresión funcional de hasta 5,6 veces en E. coli (fig. 5B), mientras que la combinación de las tres variantes no mejoró además la expresión del anticuerpo anti-VEGF. De forma importante, se observaron afinidades similares a anti-VEGF WT para todas las variantes individuales, dobles y triples (tabla 3).
Tabla 3. Afinidad antigénica de variantes estructurales de Fab anti-VEGF.3.
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Sorprendentemente, se observaron efectos aditivos con todas las combinaciones de variantes sobre la estabilidad de proteína, y el Fab natural se estabiliza además sucesivamente hasta 7,6 °C combinando variantes en las tres posiciones (fig. 5C). Este impresionante incremento en la estabilidad térmica destaca cómo los procedimientos de la invención se pueden usar durante el desarrollo de anticuerpos terapéuticos para identificar variantes con una mejora en la estabilidad térmica.
Cuando estas variantes y combinaciones se expresaron en un sistema de mamífero, varios de los rendimientos de expresión se correlacionaron con los resultados observados en E. coli (fig. 5B). Todas las variantes individuales, excepto V37I, mejoraron la expresión en células HEK 293T en casi 2 a 3 veces. Se observó un incremento adicional en la expresión combinando las variantes E6Q y V48I, y esto se mejoró además por la variante V37I. La mejor expresión se observó con esta variante E6Q.V37i .V48I, que proporcionó incrementos de casi 4 a 6 veces en los rendimientos de anticuerpo en HEK 293T y E. coli, respectivamente.
En resumen, los estudios descritos en los ejemplos 2 y 3 demuestran que los rendimientos de expresión y la estabilidad conformacional de un anticuerpo se pueden optimizar significativamente por unos pocos cambios en la región estructural sin alterar la afinidad de antígeno. Aunque estas variantes estructurales se identificaron inicialmente en células E. coli, en muchos casos los incrementos de expresión se tradujeron a células de mamífero.
Ejemplo 5: mejora en la expresión de proteínas recombinantes en bacterias usando genomanipulación del mecanismo de transcripción global y la presentación bacteriana de anticuerpos
Además de identificar polipéptidos de unión variantes con una mejora en la unión y/o expresión, los procedimientos de la invención también se pueden usar para genomanipular bacterias para una mejora en la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, anticuerpos, semianticuerpos y fragmentos de anticuerpo). En este ejemplo, se usó genomanipulación del mecanismo de transcripción global (gTME) junto con BAD para cribar bacterias que expresan proteínas del factor sigma mutante que confieren una mejora en la expresión de un anticuerpo.
El enfoque de gTME implica mutagénesis (por ejemplo, por medio de PCR propensa a error) de genes que codifican proteínas que regulan el transcriptoma global para crear fenotipos complejos que se pueden cribar de una manera de alto rendimiento. En este ejemplo, los factores sigma se sometieron a mutagénesis por PCR propensa a error; sin embargo, en principio, se podría usar cualquier gen que afecta a la transcripción a nivel global (por ejemplo, subunidades de ARN polimerasa (por ejemplo, RpoA), factores de transcripción y similares). Los factores sigma se unen a la ARN polimerasa y están implicados en la iniciación de la transcripción. Las mutaciones en factores sigma pueden afectar a una multitud de genes y crear fenotipos complejos. La tabla 4 muestra una lista de factores sigma de E. coli. RpoD es el factor sigma principal en E. coli que se expresa durante la fase exponencial de crecimiento y se considera que controla la expresión de aproximadamente 2.000 promotores. La fig. 14 muestra un diagrama de la estructura del factor sigma RpoD (a70). La región 1 (región 1.1 y 1.2 en la fig.14) solo está presente en los factores sigma principales (RpoD y RpoS), y está implicada en garantizar que el factor sigma solo se une a la región promotora de ADN con la ARN polimerasa unida al factor sigma. Entre la región 1 y la región 2 hay una región de espaciamiento que desempeña un papel en la estabilidad térmica. La región 2 se une al elemento -10 (TATAAT) del promotor. La región 3 está en estrecha proximidad al sitio de unión de la ARN polimerasa que se retícula a ATP en el sitio de iniciación. La región 3 contiene una región de unión a ADN de hélice-giro-hélice. Finalmente, la región 4 se une al elemento -35 (TTG|ACA) del promotor. La región 4 también se une a factores antisigma. Se espera que la mutagénesis de factores sigma afecte a la transcripción de varias formas no limitantes ejemplares. El incremento en la expresión podría resultar de factores sigma mutantes que se unen más estrechamente a ADN o a la ARN polimerasa, o que se unen a factores anti-sigma y por lo tanto previenen la inhibición del factor sigma natural. La disminución en la expresión podría resultar de factores sigma mutantes que se pueden unir a la ARN polimerasa o a ADN y prevenir la transcripción.
Tabla 4: factores sigma de E . c o l i
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Se generó una colección de plásmidos que codifican proteínas RpoD mutantes por mutagénesis por PCR propensa a error (figs. 15Ay 15B). El gen rpoD y el promotor natural se amplificaron usando los cebadores F_rpoD_Aatll 5'-TATGACGTCGATTAATGCCAAAAGCGGCAGA-3 ' (SEQ ID NO: 25) y R_rpoD_Scal 5'-TATAGTACTGATTAATCGTCCAGGAAGCTAC-3 ' (SEQ ID NO: 26) y se fijaron conjuntamente con el plásmido pACYC177 (que posee el origen de replicación p15A y el marcador de resistencia a kanamicina (kan)) en los sitios AatlI y Seal usando procedimientos estándar. Los transformantes se cultivaron en placas de agar LB complementadas con 50 pg/ml de kanamicina. La construcción correcta se confirmó por la secuenciación del plásmido usando los cebadores F_rpoD_check 5'-CTATTCTCAGAATGACTTGGTTG-3' (SEQ ID NO: 27) y R_rpoD_check 5'-GATGCTTTTCTGTGACTGGTG_3 ' (SEQ ID NO: 28). La mutagénesis de fragmentos se llevó a cabo usando el kit GENEMORPH® II EZ Clone Kit (Agilent, Santa Clara, CA) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La colección de plásmidos se propagó en células NEB® Turbo y se seleccionó en placas de agar LB complementadas con 50 pg/ml de kanamicina. Se determinó la diversidad de la colección a través de secuenciación y se descubrió que la tasa de error fue de 1-4 mutaciones/kb. El tamaño estimado de la colección fue aproximadamente de 106.
A continuación, se generó una colección de bacterias que contenía una deleción del gen Lpp (Alpp) para el cribado con BAD (figs. 16A y 16B). Se transformó la cepa 66c 4 (Alpp, AfhuA, Aptr3, laclQ, lacL8, AompT(nmpc-fepE), AdegP, ilvG2096 (IIvG+; ValR)) con el plásmido MD169 que codifica HC y LC de un anticuerpo anti-IL-13 junto con el gen de resistencia a antibióticos beta lactamasa bla y el gen represor de tetraciclina (tetR). Los transformantes exitosos se seleccionaron para determinar su capacidad para crecer en agar LB complementado con 20 pg/ml de tetraciclina. A continuación, el transformante resultante (66C4 MD169) se transformó con la colección de plásmidos de rpoD mutantes descrita anteriormente que expresaban un gen de resistencia a antibiótico kanamicina y rpoD mutante único. Los transformantes exitosos se seleccionaron para determinar su capacidad para crecer en agar LB complementado con 20 pg/ml de tetraciclina y 50 pg/ml de kanamicina. Se cribó una muestra de la colección para determinar la diversidad por secuenciación. Esto dio como resultado un grupo de colección de 66C4 que expresaba tanto un mutante de rpoD como el anticuerpo anti-IL-13 con una diversidad de aproximadamente 106
A continuación, se cribó el grupo de colección de 66C4 usando BAD (figs. 17A y 17B). La colección se cultivó durante 24 h en medio CRAP a 30 °C a 225 rpm. Se recogió 1 unidad DO, se permeabilizó con EDTA, se tiñó usando un antígeno marcado con fluorescencia (IL-13 humana marcada con ALEXA FLUOR® 647; "ALEXA® 647-hulL-13") y tinción de ADN (SYTO® 9), y se volvió a sellar con MgCL, esencialmente como se describe en los ejemplos 1 y 2. Se separaron células usando un dispositivo de citometría de flujo FACSARIA®. En resumen, en primer lugar se seleccionaron las células usando SYTO® 9 para encontrar células. A continuación, se seleccionaron las células en base a la complejidad celular. Finalmente, un 1-3 % superior de las células en base a la señal de ALEXA® 647-huIL-13 se aislaron por citometría de flujo, se cultivaron y se repitió el procedimiento. El grupo de colección de 66C4 se sometió a un total de cuatro rondas de separación usando BAD.
Los resultados demostraron que cada ronda de BAD dio lugar a un incremento en la intensidad de fluorescencia en base a la unión de IL-13 en comparación con células transformadas con un vector vacío o rpoD natural (fig.18), lo que indica que el grupo de población contenía un incremento en los números de clones con alta expresión. Por el contrario, se separaron clones que se expresaban débilmente por el procedimiento de BAD. Después de la cuarta ronda, se sembraron las células y se seleccionaron y secuenciaron aleatoriamente 96 colonias. Se identificaron tres mutantes diferentes de rpoD a partir de la secuenciación (fig. 19). La secuencia de aminoácidos de rpoD natural se muestra en SEQ ID NO: 29. La secuencia de aminoácidos de mutante de rpoD 1 se muestra en SEQ ID NO: 30. La secuencia de aminoácidos de mutante de rpoD 2 se muestra en s Eq ID NO: 31. La secuencia de aminoácidos de mutante de rpoD 3 se muestra en SEQ ID NO: 32. Los mutantes 1 y 2 incluyeron truncamientos junto con mutaciones puntuales (el mutante 1 incluyó P504S y E515K, mientras que el mutante 2 incluyó Y571F), mientras que el mutante 3 incluyó 5 mutaciones puntuales (M51L, Y143H, V229I, K236N y D492V). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, se considera que los mutantes truncados se pueden unir más eficazmente a factores anti-sigma, dando como resultado una mejora en la expresión del anticuerpo recombinante. Los mutantes de rpoD analizados individualmente presentaron un incremento en la fluorescencia, lo que indica un incremento en la expresión de anticuerpos (fig. 20). El mutante con la mayor intensidad de fluorescencia media (mutante 2) también fue el más abundante entre los clones secuenciados (fig. 20). También se evaluó la expresión de anticuerpo de los tres mutantes de rpoD usando muestras solubles no reducidas de 1 DO de células para determinar la expresión de anti-IL-13 de longitud completa por inmunoelectrotransferencia (figs. 21A y 21B) usando procedimientos estándar. Los mutantes se evaluaron en primer lugar en la cepa huésped original 66C4 (fig. 21A), lo que mostró resultados similares al análisis de citometría de flujo en el que el mutante 2 dio el mayor nivel de expresión. El plásmido de expresión anti-IL-13 MD169 y los tres mutantes se transformaron individualmente en una cepa huésped diferente, 67A6 (ñfhuA, AphoA, ilvG2096 (IIvG+; Val), AmanA, Aprc, spr43H1, laclQ, AompT, AmenE742, degP210A), para evaluar la transferabilidad de los mutantes de factor sigma. Se descubrió que todos los mutantes incrementaron la expresión de anticuerpos en comparación con 67A6 que expresa la secuencia de proteína RpoD natural (fig.21 B), lo que demuestra que los mutantes se pueden transferir a otras cepas de E. coli huésped e impartir un incremento en el nivel de expresión de anticuerpos anti-IL-13 de longitud completa.
En conclusión, los procedimientos de la invención se pueden usar para genomanipular células (por ejemplo, bacterias) con una mejora en la expresión de polipéptidos recombinantes, incluyendo anticuerpos y semianticuerpos. El hecho de que las células permanezcan viables a través de múltiples rondas de separación tiene varias ventajas, en particular en el contexto de enfoques de cribado de alto rendimiento, incluyendo la identificación más rápida de bacterias que tienen mutaciones en múltiples sitios. Los procedimientos son compatibles con varios enfoques de mutagénesis de ADN transportado por plásmidos o bien ADN genómico, incluyendo mutagénesis química, mutagénesis dirigida o mutagénesis basada en transposón.
Otros modos de realización
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad de comprensión, no se deben interpretar las descripciones y ejemplos como limitantes del alcance de la invención.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para identificar una bacteria (i) que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana o (ii) con una mejora en la expresión, en relación con un nivel de expresión de referencia, de un polipéptido de unión que se une específicamente a una molécula diana, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) proporcionar una bacteria que comprende una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma, en el que la mutación está en un gen que codifica la lipoproteína de membrana externa principal Lpp (Lpp), expresando la bacteria un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión candidato, en el que el polipéptido de unión candidato está presente dentro del periplasma de la bacteria;
(b) poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; y
(c) identificar la bacteria como (i) que comprende un polipéptido de unión que se une específicamente a la molécula diana o (ii) que tiene una mejora en la expresión, en relación con un nivel de expresión de referencia, del polipéptido de unión por la presencia de la molécula diana marcada dentro del periplasma, en el que la bacteria permanece viable después de la etapa (c).
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa de la bacteria antes de la etapa (b), opcionalmente que comprende además resellar la membrana externa de la bacteria después de poner en contacto la bacteria con una molécula diana marcada de forma detectable; además opcionalmente en el que resellar la membrana externa de la bacteria comprende poner en contacto la bacteria con una sal de un catión seleccionado de Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Na+ o K+; además opcionalmente en el que el catión es Mg2+ o la sal de Mg2+ es MgCh.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que someter la bacteria a condiciones que permeabilizan la membrana externa de la bacteria comprende tratar la bacteria con un agente de permeabilización, opcionalmente en el que el agente de permeabilización se selecciona del grupo que consiste en un quelante de cationes divalentes, NaCl, sacarosa, un antibiótico, un detergente, lisozima, Tris, Tris-EDTA, ascorbato, polilisina, cloruro de benzalconio, protamina, proteína bactericida e incrementadora de la permeabilidad (BPI), suero, complemento y Ca2+; además opcionalmente en el que el quelante de cationes divalentes es EDTA o el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en un aminoglucósido, polimixina B, polimixina desacilada, octapeptina y bencilpenicilina.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que:
(i) la etapa de contacto comprende además poner en contacto la bacteria con un tinte de ácido nucleico, opcionalmente en el que el tinte de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en SYTO® 9, SYTO® 41, SYTO® 43, SYTO® 42, SYTO®44, SYTO® 40 y SYTO® 45; opcionalmente además en el que el tinte de ácido nucleico es SYTO® 9 o SYTO® 41;
(ii) la molécula diana marcada de forma detectable comprende un marcador fluorescente, opcionalmente en el que el marcador fluorescente comprende un tinte fluorescente o un polipéptido fluorescente; opcionalmente además en el que el tinte fluorescente se selecciona del grupo que consiste en: un tinte ALEXA® o un tinte DYLIGHT®, opcionalmente además en el que el tinte ALEXA® es ALEXA FLUOR® 488 o ALEXA FLUOR® 647 o el tinte DYLIGHT® es DYLIGHT® 649;
(iii) el procedimiento comprende además al menos una etapa de lavado que comprende resuspender la bacteria en un tampón de lavado después de poner en contacto la bacteria con la molécula diana marcada de forma detectable;
(iv) la etapa de identificación comprende citometría de flujo, opcionalmente en la que la citometría de flujo comprende la separación de células individuales y la separación en base a la señal de la molécula diana marcada de forma detectable; opcionalmente que comprende además la separación en base a la señal de un tinte de ácido nucleico; opcionalmente en la que la citometría de flujo comprende la separación secuencial en base a la señal de un tinte de ácido nucleico; separación de células individuales; y separación en base a la señal de la molécula diana marcada de forma detectable;
(v) la bacteria es una bacteria gramnegativa, opcionalmente en el que la bacteria gramnegativa es una bacteria E. coli;
(vi) el polipéptido de unión se expresa en forma soluble en el periplasma de la bacteria;
(vii) el procedimiento comprende además aislar el ácido nucleico después de la etapa de identificación; y/u (viii) el nivel de expresión de referencia es el nivel de expresión de un polipéptido de unión natural o el nivel de expresión del polipéptido de unión en una bacteria natural.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el polipéptido de unión es un anticuerpo, opcionalmente en el que (i) el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, opcionalmente además en el que el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo IgG; (ii) el anticuerpo es un semianticuerpo; o (iii) el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo; opcionalmente en el que el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la etapa (a) comprende proporcionar una pluralidad de bacterias, en el que la pluralidad de bacterias comprende una colección de ácidos nucleicos, codificando cada uno un polipéptido de unión candidato, opcionalmente en el que la colección comprende una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican variantes de anticuerpo candidatas, en el que cada variante de anticuerpo candidata comprende una alteración de residuo aminoacídico en una FR de VH o VL en comparación con un anticuerpo de referencia, en el que la alteración de residuo aminoacídico: (a) se identificó en un anticuerpo natural que tiene el mismo subtipo que el anticuerpo de referencia, y (b) está en un residuo aminoacídico que se predice que está oculto; opcionalmente además en el que la alteración de residuo aminoacídico en el anticuerpo natural se debe a hipermutación somática; opcionalmente en el que el procedimiento comprende además:
(i) identificar un polipéptido de unión candidato que tiene un incremento en el nivel de expresión en base a la cantidad de la molécula diana marcada dentro del periplasma; y/o
(ii) identificar un polipéptido de unión candidato que tiene un incremento en la estabilidad en base a la cantidad de la molécula diana marcada dentro del periplasma.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la bacteria comprende una mutación que afecta a un gen regulador de la transcripción, en el que el gen regulador de la transcripción es RpoD (a70), opcionalmente en el que la etapa (a) comprende proporcionar una pluralidad de bacterias, en el que la pluralidad de bacterias comprende una colección de ácidos nucleicos, codificando cada uno un mutante del gen regulador de la transcripción; además opcionalmente en el que la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en un plásmido sintético o en el genoma bacteriano endógeno; además opcionalmente en el que la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error, mutagénesis química, mutagénesis transposicional o mutagénesis dirigida; además opcionalmente en el que el procedimiento identifica una bacteria que tiene una mejora en la expresión del polipéptido de unión.
8. Una bacteria que comprende (i) una mutación que permite la difusión de moléculas no penetrantes en la membrana a través de la membrana externa al periplasma, en la que la mutación está en un gen que codifica Lpp; (ii) una construcción de expresión que codifica un polipéptido de unión; y (iii) una mutación que afecta a un gen regulador de la transcripción, en la que el gen regulador de la transcripción es RpoD (a70).
9. La bacteria de la reivindicación 8, en la que: (i) la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción está presente en un plásmido sintético o está presente en el genoma bacteriano endógeno, opcionalmente en la que la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error, mutagénesis química, mutagénesis transposicional o mutagénesis dirigida, además opcionalmente en la que la mutación que afecta al gen regulador de la transcripción se debe a mutagénesis por PCR propensa a error; y/o (ii) el polipéptido de unión es un anticuerpo, opcionalmente en la que (a) el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, además opcionalmente en la que el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo IgG; (b) el anticuerpo es un semianticuerpo; o (c) el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo; opcionalmente en la que el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2.
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