ES2880353T3

ES2880353T3 - Método de producción de tejido retiniano

Info

Publication number: ES2880353T3
Application number: ES15852025T
Authority: ES
Inventors: Atsushi Kuwahara; Suguru YAMASAKI; Yasushi Hiramine; Yoshiki Sasai; Masayo Takahashi
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd; Sumitomo Chemical Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2021-11-24
Anticipated expiration: 2035-10-23
Also published as: CA2965609A1; US20170313981A1; AU2015336454A1; JP6682446B2; MY183058A; KR20170072941A; DK3211071T3; WO2016063986A1; TWI694150B; JPWO2016063986A1; TW201629213A; JP7088496B2; CN113528443B; CN107002040B; EP3211071A1; IL251856A0; KR102511192B1; US20220119764A1; CN113528443A; EP3211071A4

Abstract

Un método para producir células retinianas humanas o un tejido retiniano humano, que comprende las siguientes etapas (1) - (3): (1) una primera etapa de cultivo de células madre pluripotentes humanas en ausencia de células alimentadoras y en un medio que comprende un factor para mantener el estado indiferenciado, (2) una segunda etapa de cultivo de las células madre pluripotentes obtenidas en la primera etapa en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog para formar un agregado celular, donde la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog se selecciona del grupo que consiste en una proteína que pertenece a la familia hedgehog, agonista de receptor de Shh, SAG y purmorfamina, y (3) una tercera etapa de cultivo del agregado obtenido en la segunda etapa en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP para obtener un agregado que contiene células retinianas humanas o un tejido retiniano humano, donde la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en BMP2, BMP4, BMP7, GDF7 y un anticuerpo anti-receptor de BMP.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de producción de tejido retiniano

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir células retinianas o tejido retiniano a partir de células madre pluripotentes.

Antecedentes

Se ha reportado como método para producir un tejido neural tal como el tejido retiniano a partir de células madre pluripotentes, como método para producir tejido neural que comprende formar agregados uniformes de células madre pluripotentes en un medio libre de suero, cultivarlas en suspensión, cultivarlas en suspensión en un medio libre de suero, cultivarlas en suspensión en un medio de cultivo para la inducción de la diferenciación en presencia de un factor inductor de la diferenciación y similares, según sea apropiado para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en las células neurales deseadas (documento de patente 1 y documento no de patente 1). Por ejemplo, se conoce un método para obtener tejido retiniano multicapa a partir de células madre pluripotentes (documento no de patente 2 y documento de patente 2), y un método para obtener tejido retiniano multicapa que comprende formar agregados uniformes de células madre pluripotentes en un medio libre de suero que contiene una sustancia inhibidora de la vía de transducción de la señal Wnt, seguido de cultivo en suspensión en presencia de una preparación de membrana basal y luego cultivo en suspensión en un medio que contiene suero (documento no de patente 3 y documento de patente 3). Adicionalmente, se ha reportado también un método para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en un tejido hipotalámico (documento de patente 4 y documento no de patente 4) y un método para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en células precursoras neurales (documento no de patente 5 y 6).

Se han cultivado células madre pluripotentes como material de partida de estos métodos de producción, particularmente en el caso de células madre pluripotentes de primates, para mantener el estado indiferenciado en presencia de células alimentadoras y con la adición de un factor para mantener el estado indiferenciado. En los últimos años, se ha mejorado el cultivo para mantener el estado indiferenciado, y se ha reportado un método de cultivo de células madre pluripotentes de primates en ausencia de células alimentadoras (sin alimentador) con la adición de un factor para mantener el estado indiferenciado (documento no de patente 7, documento no de patente 8 y documento no de patente 9). Es deseable un método estable para producir células retinianas o un tejido retiniano, que use células madre pluripotentes sometidas a cultivo sin alimentador por este método como material de partida.

Lista de documentos

Documentos de patente

[documento de patente 1] WO 2009/148170

[documento de patente 2] WO 2011/055855

[documento de patente 3] WO 2013/077425

[documento de patente 4] WO 2013/065763

Documentos no de patente

[documento no de patente 1] Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008))

[documento no de patente 2] Nature, 472, 51-56 (2011)

[documento no de patente 3] Cell Stem Cell, 10 (6), 771-775 (2012)

[documento no de patente 4] Nature, 480, 57-62 (2011)

[documento no de patente 5] Nature Biotechnology, 27 (3), 275-80 (2009)

[documento no de patente 6] Proc Natl Acad Sci USA, 110 (50), 20284-9 (2013)

[documento no de patente 7] Nature Methods, 8, 424-429 (2011)

[documento no de patente 8] Scientific Reports, 4, 3594 (2014)

[documento no de patente 9] In Vitro Cell Dev Biol Anim., 46, 247-58 (2010)

Sumario de la invención

Problemas a resolver por la invención

El problema a resolver por la presente invención es la provisión de un método para producir células retinianas o tejidos retinianos a partir de células madre pluripotentes preparadas o cultivadas para mantener el estado indiferenciado en ausencia de células alimentadoras.

Medios para resolver los problemas

Los presentes inventores han llevado a cabo estudios intensivos en un intento de resolver los problemas antes mencionados y han descubierto que se puede formar con alta eficiencia un agregado celular esférico que presenta una superficie lisa y un interior denso, y que mantiene un estado indiferenciado, cultivando células madre pluripotentes (particularmente células iPS humanas) mientras se mantiene el estado indiferenciado en ausencia de células alimentadoras, y sometiendo las células madre pluripotentes obtenidas a cultivo en suspensión en un medio que contiene una sustancia que activa la vía de transducción de señales Sonic hedgehog para formar un agregado celular. Adicionalmente, los presentes inventores han descubierto que, mediante el uso de este agregado celular de alta calidad, se pueden inducir células o tejidos retinianos con alta eficacia, lo que ha dado como resultado la consecución de la presente invención.

Es decir, la presente invención se refiere a lo siguiente.

[1] Un método para producir células retinianas humanas o un tejido retiniano humano, que comprende las siguientes etapas (1) -(3):

(1) una primera etapa de cultivo de células madre pluripotentes humanas en ausencia de células alimentadoras y en un medio que comprende un factor para mantener el estado indiferenciado,

(2) una segunda etapa de cultivo de las células madre pluripotentes obtenidas en la primera etapa en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog para formar un agregado celular, donde la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog se selecciona del grupo que consiste en una proteína que pertenece a la familia hedgehog, agonista del receptor Shh, SAG y purmorfamina, y

(3) una tercera etapa de cultivo del agregado obtenido en la segunda etapa en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP para obtener un agregado que contiene células retinianas humanas o un tejido retiniano humano, donde la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en BMP2, BMP4, BMP7, GDF7 y un anticuerpo anti-receptor de BMP.

[2] El método de producción según [1], donde, en la segunda etapa, las células obtenidas en la primera etapa se dispersan y las células dispersas se cultivan en suspensión.

[3] El método de producción según [1] o [2], donde el factor para mantener el estado indiferenciado es una sustancia activante de la ruta de transducción de señales de FGF.

[4] El método de producción según [3], donde la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de FGF es bFGF.

[5] El método de producción según cualquiera de [1] a [4], donde, en la segunda etapa, la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog en el medio es una concentración correspondiente a la actividad de transducción de señales de Sonic hedgehog de SAG en 10 nM a 700 nM.

[6] El método de producción según cualquiera de [1] a [5], donde la sustancia activadora de la ruta de transducción de señales de BMP es BMP4.

[7] El método de producción según cualquiera de [1] a [6], donde, en la tercera etapa, la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP se añade al medio entre el día 2 y el día 9 después del inicio de la segunda etapa.

[8] El método de producción según cualquiera de [1] a [7], donde, en la tercera etapa, el agregado se cultiva en un medio que contiene una sustancia activante de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog a una concentración no mayor que una concentración correspondiente a la actividad de transducción de señales de Sonic hedgehog de SAG a 700 nM.

[9] El método de producción según cualquiera de [1] a [8], donde la primera etapa se realiza mediante un método de cultivo por adhesión.

[10] El método de producción según cualquiera de [1] a [9], donde las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes inducidas.

[11] El método de producción según cualquiera de [1] a [10], donde se forman agregados uniformes en la segunda etapa.

[12] El método de producción según cualquiera de [1] a [11], donde el agregado obtenido en la tercera etapa comprende una o más células seleccionadas del grupo que consiste en célula progenitora retiniana, célula progenitora retiniana neural, célula precursora fotorreceptora, célula fotorreceptora, célula fotorreceptora de bastón, célula fotorreceptora de cono, célula horizontal, célula amacrina, interneurona, célula ganglionar, célula epitelial del pigmento retiniano y célula de la zona marginal ciliar.

[13] El método de producción según cualquiera de [1] a [12], donde el cultivo en suspensión se realiza en ausencia de una preparación de membrana basal.

[14] Un método según una cualquiera de [1] a [13], que comprende además cortar el tejido retiniano del agregado celular.

Efecto de la invención

Según la presente invención, se puede producir un agregado celular de alta calidad, así como células retinianas humanas y tejidos retinianos humanos, con alta eficacia a partir de células madre pluripotentes cultivadas en ausencia de células alimentadoras.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra las condiciones de cultivo del Ejemplo comparativo 1 y el Ejemplo 1, e imágenes de campo brillante de agregados (A-D).

La Fig. 2 muestra las condiciones de cultivo del Ejemplo 1 e imágenes de tinción inmunohistoquímica de agregados para marcadores de tejido retiniano (Chx10, Rx) (A-D).

La Fig. 3 muestra las condiciones de cultivo del Ejemplo 2 e imágenes de campo brillante de agregados (A-D). La Fig. 4 muestra las condiciones de cultivo del Ejemplo 2 (sin tratamiento con BMP4) y un gráfico que cuantifica el nivel de la morfología de los agregados.

La Fig. 5 muestra las condiciones de cultivo del Ejemplo 3 e imágenes de tinción inmunohistoquímica de agregados para marcadores de tejido retiniano (Chx10, Rx) (A-D).

La Fig. 6 muestra imágenes de inmunotinción de tejidos retinianos producidas en las condiciones de cultivo del Ejemplo 4 para marcadores de tejido retiniano.

La Fig. 7 muestra imágenes de inmunotinción de tejidos retinianos producidas en las condiciones de cultivo del Ejemplo 5 para marcadores de tejido retiniano.

La Fig. 8 muestra imágenes de campo brillante de agregados producidos en las condiciones de cultivo del Ejemplo 6 (A-C) e imágenes de inmunotinción para el marcador de tejido retiniano (Chx10) (D-F).

La Fig. 9 muestra imágenes de campo brillante de agregados producidos en las condiciones de cultivo del Ejemplo 7 (A-D) y la imagen de inmunotinción para el marcador de tejido retiniano (Chx10) (E).

La Fig. 10 muestra imágenes de campo brillante de agregados producidos en las condiciones de cultivo del Ejemplo 8 (A, B) e imágenes de inmunotinción para marcadores de tejido retiniano (Chx10, Rx) (C, D).

Descripción de realizaciones

1. Definición

En la presente invención, "célula madre" significa una célula indiferenciada que tiene potencia de diferenciación y capacidad proliferativa (particularmente competencia de autorrenovación) que mantiene la potencia de diferenciación. La célula madre incluye subpoblaciones tales como célula madre pluripotente, célula madre multipotente, célula madre unipotente y similares, según la potencia de diferenciación. Célula madre pluripotente se refiere a una célula madre capaz de cultivarse in vitro y que tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier linaje celular perteneciente a tres capas germinales (ectodermo, mesodermo, endodermo) y/o tejido derivado de tejido extraembrionario (pluripotencia). Célula madre multipotente significa una célula madre que tiene la capacidad de diferenciarse en varios tipos de tejidos o células, aunque no en todos los tipos. Célula madre unipotente significa una célula madre que tiene la capacidad de diferenciarse en un tejido o célula en particular.

Se pueden inducir células madre pluripotentes a partir de óvulos fertilizados, embriones clonados, células madre germinales, células madre de un tejido, células somáticas y similares. Los ejemplos de células madre pluripotentes incluyen célula madre embrionaria (célula ES), célula EG (célula germinal embrionaria), célula madre pluripotente inducida (célula iPS), y similares. También se incluyen como células madre pluripotentes la célula de ratón (célula que soporta estrés diferenciador de múltiples linajes) obtenida a partir de células madre mesenquimales (MSC) y la célula GS producida a partir de células reproductoras (por ejemplo, testículos). La célula madre embrionaria de ratón se estableció por primera vez en 1981, y también se ha aplicado a la generación de ratones knockout desde 1989. A modo de referencia, en 1998 se estableció la célula madre embrionaria humana, que también se utiliza para medicina regenerativa. A modo de referencia, la célula ES puede producirse cultivando una masa celular interna en una célula alimentadora o en un medio que contenga LIF. A modo de referencia, los métodos de producción de células madre embrionarias se describen, por ejemplo, en los documentos de patente WO 96/22362, WO 02/101057, US 5.843.780, US 6.200.806, US 6.280.718, y similares. A modo de referencia, las células madre embrionarias están disponibles en determinadas organizaciones, o se puede comprar un producto disponible comercialmente. A modo de referencia, las células madre embrionarias humanas, KhES-1, KhES-2 y KhES-3, están disponibles en el Instituto de Ciencias Médicas de Frontera de la Universidad de Kyoto. La célula EB5, que es una célula madre embrionaria de ratón, está disponible en la Agencia Administrativa Incorporada RIKEN, y la línea celular D3, que es una célula madre embrionaria de ratón, está disponible en la ATCC.

La célula ES de transferencia nuclear no humana (célula ntES), que es una de las células ES, puede establecerse a partir de un embrión clon no humano producido trasplantando el núcleo de una célula somática no humana en un óvulo enucleado no humano.

La célula EG se puede producir cultivando una célula germinal primordial en un medio que contiene mSCF, LIF y bFGF (Cell, 70: 841-847, 1992).

La "célula madre pluripotente inducida" en la presente invención es una célula inducida para tener pluripotencia mediante la reprogramación de una célula somática mediante un método conocido y similares. Específicamente, se puede mencionar una célula inducida para tener pluripotencia reprogramando células somáticas diferenciadas tales como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica y similares mediante la expresión de una combinación de una pluralidad de genes seleccionados del grupo que consiste en genes de reprogramación que incluyen Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb y similares. Los ejemplos de combinaciones preferibles de factores de reprogramación incluyen (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 y Myc (c-Myc o L-Myc), y (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 y L-Myc (Stem Cells, 2013; 31: 458-466).

La célula madre pluripotente inducida fue establecida por Yamanaka et al. en la célula de ratón en 2006 (Cell, 2006, 126 (4), págs. 663-676). En 2007, las células madre pluripotentes inducidas también se han establecido a partir de fibroblasto humano y tienen una capacidad de pluripotencia y autorrenovación similar a las de las células madre embrionarias (Cell, 2007, 131 (5), págs. 861-872; Science, 2007, 318 (5858), págs. 1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26 (1), págs. 101-106). Además del método de producción basado en la reprogramación directa mediante expresión génica, también se pueden obtener células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas mediante la adición de un compuesto y similares (Science, 2013, 341, págs. 651 -654).

También es posible obtener células madre pluripotentes inducidas establecidas y, por ejemplo, líneas de células pluripotentes inducidas por humanos establecidas por la Universidad de Kyoto, como la célula 201B7, la célula 201B7-Ff, la célula 253G1, la célula 253G4, la célula 1201C1, la célula 1205D1, la célula 1210B2 o la célula 1231A3 y similares están disponibles en la Universidad de Kyoto y en iPS Academia Japan, Inc. Como célula madre pluripotente inducida establecida, por ejemplo, la célula Ff-I01 y la célula Ff-I14 establecidas por la Universidad de Kyoto están disponibles en la Universidad de Kyoto.

Si bien la célula somática utilizada para obtener células madre pluripotentes inducidas no está particularmente limitada, se pueden mencionar fibroblastos derivados de tejido, células de linaje sanguíneo (p. ej., células mononucleares de sangre periférica, células T), hepatocitos, células pancreáticas, células epiteliales intestinales, células de músculo liso y similares.

Cuando se produce una célula madre pluripotente inducida por reprogramación mediante la expresión de varios tipos de genes, los medios para la expresión génica no están particularmente limitados. Los ejemplos de los medios mencionados anteriormente incluyen un método de infección que usa un vector de virus (por ejemplo, vector de retrovirus, vector de lentivirus, vector de Sendaivirus, vector de adenovirus, vector de virus adenoasociado), un método de transferencia de genes que usa un vector de plásmido (por ejemplo, vector de plásmido, vector episomal) (p.ej., método de fosfato de calcio, método de lipofección, método de RetroNectin, método de electroporación), un método de transferencia génica que utiliza un vector de ARN (p.ej., método de fosfato de calcio, método de lipofección, método de electroporación), un método con inyección directa de proteína y similares.

Se puede producir una célula madre pluripotente inducida en presencia de una célula alimentadora o en ausencia de células alimentadoras (sin alimentador). Cuando se produce en presencia de una célula alimentadora, la célula madre pluripotente inducida se puede producir mediante un método conocido en presencia de un factor para mantener el estado indiferenciado. Si bien un medio para ser utilizado para producir una célula madre pluripotente inducida en ausencia de células alimentadoras no está particularmente limitado, se puede utilizar sin alimentador un medio de mantenimiento conocido para células madre embrionarias y/o células madre pluripotentes inducidas, y un medio para establecer células madre pluripotentes inducidas bajo. Los ejemplos del medio para establecer una célula madre pluripotente inducida en condiciones sin alimentador incluyen medios sin alimentador tales como medio Essential 8, medio TeSR, medio mTeSR, medio mTeSR-E8, medio StemFit y similares. Por ejemplo, se puede producir una célula madre pluripotente inducida mediante la transferencia génica de 4 factores de Oct3/4, Sox2, Klf4 y Myc a una célula somática utilizando un vector Sendaivirus en ausencia de células alimentadoras.

La célula madre pluripotente que se va a utilizar en la presente invención es preferiblemente una célula madre embrionaria o una célula madre pluripotente inducida, más preferiblemente una célula madre pluripotente inducida.

Como célula madre multipotente, se pueden mencionar células madre tisulares (también llamadas células madre en tejido, células madre específicas de tejido o células madre somáticas), tales como células madre hematopoyéticas, células madre neurales, células madre retinianas, células madre mesenquimales y similares.

Pueden producirse células madre pluripotentes modificadas genéticamente utilizando, por ejemplo, una técnica de recombinación homóloga. Los ejemplos del gen del cromosoma que se va a modificar incluyen un gen marcador celular, un gen de antígeno de histocompatibilidad, un gen relacionado con una enfermedad debida a un trastorno de la célula neural, etc. Se puede modificar un gen diana del cromosoma usando los métodos descritos en “Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual”, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); “Gene Targeting, A Practical Approach”, IRL Press en Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, “Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell”, YODOSHA CO., LTD. (1995); etc.

Para ser específicos, por ejemplo, se aísla el ADN genómico que comprende el gen diana que se va a modificar (p.ej., gen marcador celular, gen del antígeno de histocompatibilidad, gen relacionado con la enfermedad, etc.) y se produce un vector dirigido utilizado para la recombinación homóloga del gen diana utilizando el ADN genómico aislado. El vector dirigido producido se introduce en células madre y se seleccionan las células que mostraron recombinación homóloga entre el gen diana y el vector dirigido, mediante lo cual se pueden producir células madre que tienen el gen modificado en el cromosoma.

Los ejemplos del método para aislar el ADN genómico que comprende el gen diana incluyen métodos conocidos descritos en “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons (1987-1997), etc. El gen genómico que comprende el gen diana también se puede aislar usando un sistema de selección de bibliotecas de ADN genómico (fabricado por Genome Systems), Universal GenomeWalker Kits (fabricados por CLONTECH), etc. También se puede usar un polinucleótido que codifica la proteína diana en lugar del ADN genómico. El polinucleótido se puede obtener amplificando el polinucleótido correspondiente mediante el método de PCR.

La producción del vector de selección utilizado para la recombinación homóloga del gen diana y la selección eficaz de un recombinante homólogo se pueden realizar de acuerdo con los métodos descritos en “Gene Targeting, A Practical Approach”, IRL Press en Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, “Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell”, YODOSHA CO., LTD. (1995); etc. Como vector dirigido, se puede utilizar cualquiera de los tipos de sustitución o inserción. Como método de selección, pueden usarse métodos tales como la selección positiva, la selección de promotor, la selección negativa, la selección de poliA, etc.

Los ejemplos de un método para seleccionar el recombinante homólogo deseado de las líneas celulares seleccionadas incluyen el método de hibridación de Southern, el método de PCR, etc., para el ADN genómico.

El "mamífero" en la presente descripción incluye roedores, ungulados, carnívoros, primates y similares. Los roedores incluyen ratón, rata, hámster, cobaya y similares. Los ungulados incluyen cerdos, bovinos, caprinos, equinos, ovinos y similares. Los carnívoros abarcan perros, gatos y similares. Los "primates" en la presente descripción se refieren a mamíferos que pertenecen al primate, y los primates incluyen prosimios tales como lémur, loris, tupai y similares, y antropoideos tales como mono, simio, humanos y similares.

La célula madre pluripotente a utilizar en la presente invención es una célula madre pluripotente humana, más preferiblemente una célula madre pluripotente inducida por humanos (célula iPS) o una célula madre embrionaria humana (célula ES).

El "cultivo en suspensión" o el "método de cultivo en suspensión" en la presente invención se refiere a cultivar mientras se mantiene un estado en el que las células o los agregados celulares se suspenden en un medio de cultivo, y a un método para realizar el cultivo. Es decir, el cultivo en suspensión se realiza en condiciones en las que las células o los agregados celulares no se adhieren a un recipiente de cultivo y similares, y no se incluye en la categoría de cultivo en suspensión el cultivo llevado a cabo en condiciones que permiten la adhesión a un recipiente de cultivo y similares (cultivo por adhesión o método de cultivo por adhesión). En este caso, la adhesión de la célula significa que se forma una unión fuerte célula-sustrato entre una célula o un agregado celular y un recipiente de cultivo. Más particularmente, el cultivo en suspensión se refiere al cultivo en condiciones en las que no se forma una unión fuerte célula-sustrato entre una célula o un agregado celular y un recipiente de cultivo, y el cultivo por adhesión se refiere al cultivo en condiciones en las que se forma una unión fuerte célula-sustrato entre una célula o un agregado celular y un recipiente de cultivo y similares.

En un agregado celular en cultivo en suspensión, se forma una adhesión plana célula-célula. En agregados celulares en cultivo en suspensión, apenas se forma una unión célula-sustrato con un recipiente de cultivo y similares e, incluso si se forma, su contribución es pequeña. Puede haber presente una unión célula-sustrato endógena dentro del agregado, pero difícilmente se forma una unión célula-sustrato con un recipiente de cultivo y similares e, incluso si se forma, su contribución es pequeña.

La adhesión célula-célula plana (unión plana) significa que una célula se adhiere a otra célula a través de planos. Más particularmente, la adhesión célula-célula plana significa que, por ejemplo, no menos del 1%, preferiblemente no menos del 3%, más preferiblemente no menos del 5%, del área de superficie de una célula se adhiere a la superficie de otra célula. La superficie de una célula puede observarse mediante tinción con un reactivo (p.ej., DiI) que tiñe las membranas, inmunotinción de moléculas de adhesión celular (p.ej., E-cadherina y N-cadherina).

El recipiente de cultivo celular que se va a usar cuando se realiza un cultivo en suspensión no está particularmente limitado, siempre que permita el "cultivo en suspensión" y los especialistas en la técnica puedan determinarlo apropiadamente. Los ejemplos de tal recipiente de cultivo celular incluyen matraz, matraz de cultivo de tejidos, placa de cultivo (placa), placa de Petri, placa de cultivo de tejidos, placa múltiple, microplaca, placa de micropocillos, microporo, multiplaca, placa de múltiples pocillos, portaobjetos de cámara, escala, tubo, bandeja, bolsa de cultivo, matraz Erlenmeyer, matraz giratorio, botella rotatoria, etc. Para permitir el cultivo en suspensión, estos recipientes de cultivo son preferiblemente no adherentes a las células. Los recipientes de cultivo no adherentes a las células útiles incluyen recipientes de cultivo cuyas superficies no se han sometido a un tratamiento artificial para mejorar la adhesión celular (p.ej., un tratamiento de la superficie con matriz extracelular tal como preparación de membrana basal, laminina, entactina, colágeno, gelatina, etc., y similares, o tratamiento de recubrimiento con un polímero tal como polilisina, poliornitina y similares, o tratamiento de carga eléctrica positiva y similares), etc. Como recipiente de cultivo no adherente a las células, se pueden usar recipientes de cultivo cuyas superficies se hayan tratado artificialmente para disminuir la adhesión a las células (por ejemplo, un tratamiento superhidrófilo con polímero MPC y similares, un tratamiento de baja adsorción de proteínas, etc.), y similares. Se puede realizar un cultivo en rodillo usando un matraz giratorio, una botella rotatoria y similares. La superficie de cultivo del recipiente de cultivo puede ser de fondo plano o puede presentar zonas cóncavas y convexas.

Un recipiente de cultivo utilizado para el cultivo por adhesión no está particularmente limitado, siempre que se pueda realizar el "cultivo por adhesión", y los especialistas en la técnica puedan seleccionar de manera apropiada un recipiente de cultivo adecuado según la escala de cultivo, las condiciones de cultivo y el período para el cultivo. Los ejemplos de tales recipientes de cultivo incluyen matraces, matraces de cultivo de tejidos, placas de cultivo (placas), placas de cultivo de tejidos, placas múltiples, microplacas, placas de micropocillos, multiplacas, placas de múltiples pocillos, portaobjetos de cámara, escalas, tubos, bandejas, bolsas de cultivo, microportadoras, perlas, placas apilables, frascos giratorios y botellas rotatorias. Para permitir el cultivo por adhesión, estos recipientes de cultivo son preferiblemente adherentes a las células. Los recipientes de cultivo adherentes a células incluyen recipientes de cultivo cuyas superficies han sido tratadas artificialmente para mejorar la adhesión celular, y, específicamente, se puede mencionar un recipiente de cultivo procesado en la superficie, o un recipiente de cultivo cuyo interior está revestido con un agente de recubrimiento. Los ejemplos del agente de recubrimiento incluyen matriz extracelular, tal como laminina [que incluye laminina a5p1Y1 (en adelante laminina 511), laminina a1 p 1 y1 (en adelante laminina 111) y similares, y fragmento de laminina (laminina 511E8, etc.)], entactina, colágeno, gelatina, vitronectina, Synthemax (Corning Incorporated), Matrigel y similares, o polímeros tales como polilisina, poliornitina y similares. Los ejemplos de recipientes de cultivo procesados en la superficie incluyen recipientes de cultivo procesados en la superficie mediante un tratamiento de carga eléctrica positiva y similares.

El medio que se va a usar para cultivar células en la presente invención se puede preparar a partir de un medio usado generalmente para cultivar células animales como medio basal. Los ejemplos de medio basal incluyen medios que se pueden usar para cultivar células animales, tal como medio BME, medio BGJb, medio CMRL1066, medio Glasgow MEM (GMEM), medio MEM mejorado con opción de zinc, medio IMDM, medio Medium199, medio Eagle MEM, medio aMEM, medio DMEM, medio F-12, medio DMEM/F-12, medio IMDM/F12, medio Ham, medio RPMI1640, medio Fischer, y medios mixtos de los mismos, etc.

El "medio sin suero" en la presente descripción significa un medio sin suero no ajustado o no purificado. En la presente descripción, también se incluye en un medio sin suero un medio que contiene componentes derivados de sangre purificados y componentes derivados de tejido animal (por ejemplo, factor de crecimiento), a menos que contenga suero no ajustado o no purificado.

El medio sin suero puede contener un suero alternativo. Los ejemplos de suero alternativo incluyen uno que contenga de forma apropiada albúmina, transferrina, ácido graso, precursor de colágeno, oligoelemento, 2-mercaptoetanol o 3'-tiolglicerol, o equivalentes de éstos, etc., y así sucesivamente. Dicho suero alternativo puede prepararse mediante, por ejemplo, el método descrito en el documento WO98/30679. Además, el suero alternativo puede ser un producto disponible comercialmente. Los ejemplos de tales sueros alternativos disponibles comercialmente incluyen Knockout™ Serum Replacement (Life Technologies, ahora ThermoFisher: en adelante, algunas veces se indicará como KSR), concentrado de lípidos definidos químicamente (fabricado por Life Technologies) y Glutamax™ (fabricado por Life Technologies), B27 (fabricado por Life Technologies), suplemento N2 (fabricado por Life Technologies).

El medio sin suero que se utilizará para el cultivo en suspensión puede contener de manera apropiada un ácido graso o un lípido, un aminoácido (p.ej., aminoácidos no esenciales), vitamina, factor de crecimiento, citocina, antioxidante, 2-mercaptoetanol, ácido pirúvico, agente tampón, sales inorgánicas, etc.

Para evitar una preparación complicada, un medio sin suero complementado con una cantidad apropiada (p.ej., de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 30%, preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%) de KSR disponible comercialmente (fabricado por Life Technologies) se puede usar como tal medio sin suero (por ejemplo, medio de mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1 x lípido químicamente definido concentrado (CDLC) y 1-monotioglicerol 450 pM). Como producto equivalente a KSR, se puede mencionar el medio descrito en el documento JP-A-2001-508302.

El "medio que contiene suero" en la presente descripción significa un medio que contiene suero no ajustado o no purificado. El medio puede contener un ácido graso, lípido, aminoácido (p.ej., aminoácidos no esenciales), vitamina, factor de crecimiento, citocina, antioxidante, 2-mercaptoetanol, 1-monotioglicerol, ácido pirúvico, agente tamponador, sales inorgánicas, etc. Por ejemplo, se puede usar un medio de suero en la etapa de mantenimiento del tejido neural (por ejemplo, tejido retiniano) (que también se denomina cultivo maduro).

En la presente descripción, el cultivo se realiza preferiblemente en condiciones xeno-libres. "Xeno-libres" significa condiciones que eliminan componentes derivados de especies diferentes a las de la célula a cultivar.

En la presente descripción, el "medio que contiene la sustancia X" y "en presencia de la sustancia X" se refieren a un medio suplementado con una sustancia exógena X o un medio que contiene una sustancia exógena X, o en presencia de una sustancia exógena X. Es decir, cuando las células o tejidos presentes en el medio expresan, secretan o producen endógenamente la sustancia X, la sustancia endógena X se distingue de la sustancia exógena X, y se entiende que un medio libre de sustancia exógena X queda fuera de la categoría de "medio que contiene la sustancia X", incluso cuando contiene la sustancia endógena X.

Por ejemplo, un "medio que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Sonic hedgehog" es un medio suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Sonic hedgehog exógena o un medio que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Sonic hedgehog exógena.

En la presente descripción, una célula alimentadora se refiere a una célula distinta de una célula madre que coexiste cuando se cultiva la célula madre. Los ejemplos de células alimentadoras utilizadas para cultivar células madre pluripotentes mientras se mantiene el estado indiferenciado incluyen fibroblastos de ratón (MEF, etc.), fibroblastos humanos, células SNL y similares. Como células alimentadoras son preferibles las células alimentadoras que han sido sometidas a un tratamiento de supresión del crecimiento. Los ejemplos del tratamiento de supresión del crecimiento incluyen el tratamiento con un inhibidor del crecimiento (por ejemplo, mitomicina C), radiación gamma, irradiación UV y similares. Las células alimentadoras utilizadas para cultivar células madre pluripotentes mientras se mantienen el estado indiferenciado contribuyen al mantenimiento de la indiferenciación de las células madre pluripotentes mediante la secreción de un factor humoral (preferiblemente un factor para mantener el estado indiferenciado) o mediante la producción de una estructura para la adhesión celular (sustrato extracelular).

En la presente invención, la ausencia de células alimentadoras (sin alimentador) significa cultivar en ausencia de células alimentadoras. La ausencia de células alimentadoras significa, por ejemplo, condiciones libres de adición de células alimentadoras, o condiciones sustancialmente libres de células alimentadoras (por ejemplo, la relación entre el número de células alimentadoras con respecto al número total de células no es superior al 3%).

En la presente invención, un "agregado" de células se refiere a un grupo formado por el ensamblaje de células dispersas en un medio, en el que las células se adhieren entre sí. Las agrupaciones celulares, los cuerpos embrioides, las esferas y los esferoides también se incluyen en los agregados celulares. Preferiblemente, se forma una adhesión célula-célula plana en el agregado celular. Las células a veces forman una unión célula-célula y/o una adhesión celular, por ejemplo, una unión de adherencia, en algunos o en todos los agregados. El "agregado" en la presente invención incluye específicamente un agregado producido en la segunda etapa de la presente invención mencionada anteriormente [1], que está formado por células dispersas en el momento del inicio del cultivo en suspensión, y un agregado producido en la tercera etapa de la presente invención mencionada anteriormente [1], que contiene células retinianas inducidas diferenciadas de las células madre pluripotentes, y el "agregado" también incluye un agregado ya formado en el momento del inicio de la segunda etapa de la anteriormente mencionada presente invención [1] (es decir, en el momento del inicio del cultivo en suspensión). El agregado celular formado en la segunda etapa abarca el "cuerpo embrioide (EB)".

En la presente invención, "agregados uniformes" significa que el tamaño de cada agregado es constante cuando se cultiva una pluralidad de agregados, y que la varianza en la longitud del diámetro máximo es pequeña cuando el tamaño de los agregados se evalúa a través de la longitud del diámetro máximo. Más específicamente, significa que no menos del 75% de los agregados en la población total de agregados están dentro de la media ± 100%, preferiblemente dentro de la media ± 50%, más preferiblemente dentro de la media ± 20%, del diámetro máximo en la población de los agregados.

En la presente descripción, "formar agregados celulares uniformes" significa "agregar rápidamente un número dado de células dispersas" para formar agregados celulares de tamaño uniforme, cuando se reúnen las células para formar agregados celulares y se cultivan los agregados en suspensión.

La dispersión se refiere a dividir células o un tejido en coágulos de células pequeñas (no menos de 2 células y no más de 100 células, preferiblemente no más de 50 células) o células individuales mediante un tratamiento de dispersión, tal como un tratamiento enzimático, un tratamiento físico y similares. Un número dado de células dispersas es una colección de un cierto número de coágulos de células o células individuales.

Los ejemplos del método de dispersión de células madre pluripotentes incluyen un tratamiento de dispersión mecánico, un tratamiento de disolución de dispersión celular y un tratamiento de adición de agente protector celular. Estos tratamientos se pueden realizar en combinación. Preferiblemente, se realiza un tratamiento de dispersión celular y luego se realiza un tratamiento de dispersión mecánico.

Como método de tratamiento de dispersión mecánico, se puede mencionar un tratamiento de pipeteado o una operación de raspado con un raspador.

Como solución de dispersión celular que se utilizará para el tratamiento de la disolución de dispersión celular, se puede mencionar una disolución que contenga cualquiera de enzimas tales como tripsina, colagenasa, hialuronidasa, elastasa, pronasa, DNasa, papaína, etc., y un agente quelante tal como ácido etilendiaminotetraacético, etc. También se puede utilizar una disolución de dispersión celular disponible comercialmente tal como TrypLE Select (fabricado por Life Technologies) y TrypLE Express (fabricado por Life Technologies).

Cuando se dispersan las células madre pluripotentes, la muerte celular de las células madre pluripotentes puede suprimirse mediante el tratamiento con un agente protector celular. Como agente protector celular a utilizar para el tratamiento del agente protector celular, se pueden mencionar una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de FGF, heparina, una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de IGF, suero y suero alternativo. Para suprimir la muerte celular inducida por la dispersión (en particular, la muerte celular de las células madre pluripotentes humanas), se puede añadir una sustancia inhibidora de la quinasa en espiral asociada a Rho (ROCK) o una sustancia inhibidora de la miosina en el momento de la dispersión. Como sustancia inhibidora de ROCK, se pueden mencionar Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152 y similares. Como sustancia inhibidora de la miosina, se puede mencionar la blebistatina. Como agente protector celular preferible, se puede mencionar una sustancia inhibidora de ROCK.

Por ejemplo, un método para dispersar células madre pluripotentes incluye, por ejemplo, un método que implica el tratamiento de una colonia de células madre pluripotentes con una disolución de dispersión celular (T rypLE Select) en presencia de una sustancia inhibidora de ROCK como agente protector celular, y además dispersándolos pipeteando.

En el método de producción de la presente invención, es preferible formar un agregado de células madre pluripotentes reuniendo rápidamente las células madre pluripotentes. Cuando se forma un agregado de células madre pluripotentes de dicha manera, se puede formar una estructura similar a un epitelio con buena reproducibilidad en las células inducidas y diferenciadas del agregado formado. Los ejemplos de la operación experimental para formar un agregado incluyen un método que implica mantener las células en un espacio pequeño mediante el uso de una placa con pocillos pequeños (por ejemplo, una placa con pocillos que tienen un área de base de aproximadamente 0,1-2,0 cm2 cuando se calcula en términos de fondo plano), microporos, etc., un método que implica la agregación de células mediante centrifugación durante un tiempo breve utilizando un pequeño tubo de centrifugación. Como placa con pocillos pequeños se puede mencionar, por ejemplo, una placa de 24 pocillos (área de aproximadamente 1,88 cm2 cuando se calcula en términos de fondo plano), una placa de 48 pocillos (área de aproximadamente 1,0 cm2 cuando se calcula en términos de fondo plano), una placa de 96 pocillos (área de aproximadamente 0,35 cm2 cuando se calcula en términos de fondo plano, diámetro interno de aproximadamente 6 a 8 mm) y una placa de 384 pocillos. Se prefiere una placa de 96 pocillos. Como forma de la placa con pequeños pocillos, la forma de la superficie inferior cuando el pocillo se observa desde arriba es, por ejemplo, de polígono, rectángulo, elipse, círculo perfecto, preferiblemente círculo perfecto. Como forma de la placa con pozos pequeños cuando el pozo se observa desde el un lateral, la forma de la superficie del fondo puede ser una estructura de fondo plano o una estructura que tiene una circunferencia exterior alta y una zona cóncava interior baja. La forma de la superficie del fondo incluye, por ejemplo, fondo en U, fondo en V, fondo en M, preferiblemente fondo en U o fondo en V, más preferiblemente fondo en V. Como placa con pocillos pequeños, también se puede utilizar una placa de cultivo celular (p.ej., placa de 60 mm - 150 mm, matraz de cultivo) con una zona cóncava convexa o una hendidura en la superficie inferior. La superficie inferior de una placa con pocillos pequeños es preferiblemente una superficie inferior sin adhesivo celular, preferiblemente la superficie inferior revestida sin adhesivo celular mencionada anteriormente.

La formación de agregados de células madre pluripotentes o agregados de una población celular que contiene células madre pluripotentes, y la uniformidad de los mismos se puede determinar en función del tamaño de la masa agregada y del número de células que contiene, de la morfología macroscópica, la morfología microscópica mediante análisis de tinción de tejidos y de la homogeneidad del mismo, y similares. Además, la formación de una estructura de tipo epitelial en el agregado, y la uniformidad de la misma se puede determinar en base a la morfología macroscópica del agregado, de la morfología microscópica mediante análisis de tinción de tejido y de la uniformidad del mismo, de la expresión de marcadores de diferenciación e indiferenciación y de la uniformidad de los mismos, del control de expresión del marcador de diferenciación y del sincronismo del mismo, de la reproducibilidad de la eficiencia de diferenciación entre agregados, etc.

El "tejido" en la presente invención se refiere a una estructura de una población celular que tiene una estructura donde un tipo de células que tienen una morfología o propiedad uniforme, o varios tipos de células que tienen diferentes morfologías y propiedades, están dispuestas estéricamente en un patrón dado.

En la presente descripción, el "tejido neural" se refiere a un tejido constituido por células neurales que incluyen cerebro, mesencéfalo, cerebelo, médula espinal, retina, nervio periférico, prosencéfalo, rombencéfalo, telencéfalo, diencéfalo y similares en la etapa de desarrollo o en la etapa adulta. Un tejido neural a veces forma una estructura epitelial (neuroepitelio) que tiene una estructura de capas, y la cantidad de neuroepitelio en los agregados celulares puede evaluarse mediante observación de campo brillante con un microscopio óptico.

En la presente descripción, la "célula neural" se refiere a una célula distinta de la célula de linaje epidérmico en un tejido derivado de ectodermo. Es decir, incluye células tales como la célula precursora neural, la neurona (célula neuronal), la glía, la célula madre neural, la célula precursora neuronal, la célula precursora glial y similares. La célula neural también incluye la célula que constituye el tejido retiniano (célula retiniana) mencionado a continuación, la célula progenitora retiniana, la neurona específica de la capa retiniana, la célula retiniana neural y la célula epitelial del pigmento retiniano. La célula neural puede identificarse usando como marcador Nestin, TuJ1, PSA-NCAM, N-cadherina y similares.

La neurona (o célula neuronal) es una célula funcional que forma un circuito neuronal y contribuye a la transducción de señales, y se puede identificar mediante la expresión de marcadores neuronales inmaduros tales como TuJ1, Dcx, HuC/D y similares, y/o marcadores celulares neuronales maduros tales como Map2, NeuN y similares, a modo de índice.

Como glía, se pueden mencionar astrocitos, oligodendrocitos, glía de Müller y similares. Como marcador de astrocitos, se puede mencionar GFAP; como marcador de oligodendrocitos, se puede mencionar O4, y como marcador de glía de Müller, se pueden mencionar CRALBP y similares.

La célula madre neural es una célula que tiene potencia de diferenciación (multipotencia) en neuronas y células gliales, y capacidad proliferativa (a veces denominada competencia de autorrenovación) que mantiene la multipotencia. Como marcadores de células madre neurales, se pueden mencionar Nestin, Sox2, Musashi, la familia Hes, CD133 y similares; sin embargo, estos marcadores son marcadores de células progenitoras/precursoras en general y no se consideran marcadores específicos de células madre neurales. El número de células madre neurales puede evaluarse mediante ensayo de neuroesferas, ensayo clonal y similares.

La célula precursora neuronal es una célula con capacidad proliferativa, que produce neuronas y no produce células gliales. Como marcador de células precursoras neuronales, se pueden mencionar Tbr2, Ta1 y similares. Alternativamente, también puede identificarse una célula positiva para marcador neuronal inmaduro (TuJ1, Dcx, HuC/D) y positiva para marcador de crecimiento (Ki67, pH3, MCM) como una célula precursora neuronal.

La célula precursora de la glía es una célula con capacidad proliferativa, que produce células gliales y que no produce neuronas.

La célula precursora neural es un ensamblaje de células precursoras que incluyen células madre neurales, células precursoras neuronales y células precursoras gliales, y tiene capacidad proliferativa y productividad neuronal y glial. La célula precursora neural se puede identificar usando como marcadores Nestin, GLAST, Sox2, Sox1, Musashi, Pax6 y similares. Alternativamente, una célula positiva para marcador de células neurales y marcador de crecimiento (Ki67, pH3, MCM) también puede identificarse como una célula precursora neural.

En la presente invención, el "tejido retiniano" significa un tejido en el que un tipo o al menos dos o más tipos de células tales como células fotorreceptoras, células precursoras de fotorreceptores, células fotorreceptoras de bastón, células fotorreceptoras de cono, interneuronas, células horizontales, células bipolares, células amacrinas, células ganglionares de la retina (células ganglionares), células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE), células de la zona marginal ciliar, sus células progenitoras/precursoras y células progenitoras de la retina, etc., que constituyen las respectivas capas retinianas en la retina in vivo, están dispuestas estéricamente en capas. La capa retiniana que está constituida por cada célula puede confirmarse mediante un método conocido, por ejemplo, mediante la presencia o ausencia de la expresión de un marcador celular o de su nivel, etc.

La "capa retiniana" en la presente invención significa cada capa que constituye la retina. Ejemplos específicos de los mismos incluyen capa epitelial de pigmento retiniano, capa de fotorreceptores, membrana limitante externa, capa nuclear externa, capa plexiforme externa, capa nuclear interna, capa plexiforme interna, capa de células ganglionares, capa de fibras nerviosas y membrana limitante interna.

La "célula progenitora retiniana" en la presente invención se refiere a una célula progenitora capaz de diferenciarse en cualquier célula retiniana madura, incluyendo célula fotorreceptora, célula horizontal, célula bipolar, célula amacrina, célula ganglionar retiniana, célula epitelial de pigmento retiniano y similares.

En la presente invención, la "célula progenitora retiniana neural" se refiere a una célula progenitora capaz de diferenciarse en cualquiera de las células retinianas maduras o en una pluralidad de ellas, incluyendo célula fotorreceptora, célula horizontal, célula bipolar, célula amacrina, células ganglionares retinianas y similares. En general, una célula progenitora retiniana neural no se diferencia en una célula epitelial de pigmento de la retina.

La célula precursora fotorreceptora, la célula precursora de la célula horizontal, la célula precursora de la célula bipolar, la célula precursora de la célula amacrina, la célula precursora de la célula ganglionar de la retina y la célula precursora del epitelio del pigmento retiniano, se refieren a las células precursoras comprometidas a diferenciarse en célula fotorreceptora, célula horizontal, célula bipolar, célula amacrina, células ganglionares retinianas y células epiteliales pigmentarias retinianas, respectivamente.

En la presente invención, la "neurona específica de la capa de la retina" es una célula que constituye una capa de la retina y es una célula neuronal (neurona) específica de la capa de la retina. Los ejemplos de neurona específica de la capa retiniana incluyen célula bipolar, células ganglionares retinianas, célula amacrina, célula horizontal, célula fotorreceptora, célula epitelial pigmentaria retiniana, célula bastón y célula cónica.

La "célula retiniana" en la presente invención abarca las células progenitoras de la retina mencionadas anteriormente y las neuronas específicas de la capa de la retina.

Los ejemplos de marcadores de células retinianas incluyen Rx (también denominado Rax), PAX6 y Chx10 expresados en células progenitoras de la retina, Nkx2.1 expresados en células precursoras de la neurona del hipotálamo pero no expresados en células progenitoras de la retina, Sox1 expresados en el neuroepitelio del hipotálamo pero no expresados en retina, Crx, Blimp1 y similares expresados en células precursoras de células fotorreceptoras y similares. Los ejemplos del marcador de la neurona específica de la capa retiniana incluyen Chx10, PKCa y L7 expresados en células bipolares, TUJI y Brn3 expresados en células ganglionares de la retina, Calretinina expresada en células amacrinas, Calbindina expresada en células horizontales, Rodopsina y Recoverina expresadas en células fotorreceptoras maduras, Nr1 y rodopsina expresadas en células bastón, Rxr-gamma y S-Opsina expresadas en células cónicas, RPE65 y Mitf expresadas en células del epitelio pigmentario de la retina, Rdh10 y SSEA1 expresadas en la zona marginal ciliar y similares.

2. Método para producir células retinianas o un tejido retiniano.

El método de producción de la presente invención es un método para producir células retinianas humanas o un tejido retiniano humano, que comprende las siguientes etapas (1) -(3):

En la etapa (1), se cultivan células madre pluripotentes humanas en ausencia de células alimentadoras y en un medio que contiene un factor para mantener el estado indiferenciado.

Como célula madre pluripotente humana en la etapa (1), se pueden mencionar células madre pluripotentes inducidas por humanos o células madre embrionarias (células ES) humanas.

El método de producción de células madre pluripotentes inducidas no está particularmente limitado y pueden producirse mediante un método bien conocido por los especialistas en la técnica, tal como se mencionó anteriormente. También es deseable realizar una etapa para preparar células madre pluripotentes inducidas (es decir, una etapa de reprogramación de células somáticas para establecer células madre pluripotentes) en condiciones libres de alimentador.

Si bien el método de producción de células madre embrionarias (células ME) no está particularmente limitado, y puede producirse mediante un método bien conocido por los especialistas en la técnica, tal como se mencionó anteriormente, también es deseable realizar una etapa para preparar células madre embrionarias. células (células madre embrionarias) en condiciones libres de alimentador.

El cultivo de mantenimiento o el cultivo de expansión para obtener células madre pluripotentes que se utilizarán en la etapa (1) se pueden realizar mediante un método bien conocido por los especialistas en la técnica, tal como se ha mencionado anteriormente. Si bien el cultivo de mantenimiento y el cultivo de expansión de células madre pluripotentes mencionados anteriormente se pueden realizar mediante cultivo de adhesión o cultivo en suspensión, preferiblemente se realiza mediante cultivo de adhesión. Si bien la etapa mencionada anteriormente de cultivo de mantenimiento y cultivo de expansión de células madre pluripotentes se puede realizar en presencia de alimentadores o en condiciones sin alimentador, preferiblemente se realiza en condiciones sin alimentador.

La ausencia de células alimentadoras (sin alimentador) en la etapa (1) significa una condición sustancialmente libre de células alimentadoras (por ejemplo, la relación entre el número de células alimentadoras con respecto al número total de células no es superior al 3%). Preferiblemente, la etapa (1) se realiza en condiciones libres de células alimentadoras.

El medio que se utilizará en la etapa (1) no está particularmente limitado siempre que sea un medio que permita el cultivo de células madre pluripotentes para mantener el estado indiferenciado en condiciones sin alimentador (medio sin alimentador). Preferiblemente, para permitir que el cultivo mantenga el estado indiferenciado, contiene un factor para mantener el estado indiferenciado. Por ejemplo, es un medio que contiene un factor para mantener el estado indiferenciado y libre de una sustancia inhibidora de la vía de transducción de señales de la familia TGFp y una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog.

El factor para mantener el estado indiferenciado no está particularmente limitado siempre que sea una sustancia que tenga una acción para suprimir la diferenciación de células madre pluripotentes. Los ejemplos del factor para mantener el estado indiferenciado ampliamente utilizados por los especialistas en la técnica incluyen una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de FGF, una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de la familia TGFp, insulina y similares, en el caso de células madre pluripotentes cebadas (p.ej., células madre embrionarias humanas, células iPS humanas). Como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de FGF, se pueden mencionar específicamente factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, bFGF, FGF4, FGF8). Como sustancia activadora de la ruta de transducción de señales de la familia TGFp, se puede mencionar una sustancia activadora de la ruta de transducción de señales de TGFp, una sustancia activadora de la ruta de transducción de señales Nodal/Activina. Como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de TGFp, se pueden mencionar TGFp1, TGFp2. Como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Nodal/Activina, se pueden mencionar Nodal, Activina A, Activina B. Cuando se cultivan células madre pluripotentes humanas (células ES humanas, células iPS humanas), el medio de la etapa (1) contiene preferiblemente bFGF como factor para mantener el estado indiferenciado.

El factor para mantener el estado indiferenciado que se utilizará en la presente invención es generalmente un factor para mantener el estado indiferenciado en mamíferos. Los mamíferos son, por ejemplo, los mencionados anteriormente. Dado que el factor para mantener el estado indiferenciado puede tener reactividad cruzada entre especies de mamíferos, también se puede usar un factor para mantener el estado indiferenciado de cualquier mamífero, siempre que se pueda mantener el estado indiferenciado de las células madre pluripotentes a cultivar. Preferiblemente, se usa un factor para mantener el estado indiferenciado de un mamífero de la misma especie que las células a cultivar. Por ejemplo, para el cultivo de células madre pluripotentes humanas, se usa factor humano para mantener estados indiferenciados (por ejemplo, bFGF, FGF4, FGF8, EGF, Nodal, Activina A, Activina B, TGFp 1, TGFp 2, etc.). Aquí, "proteína X humana" significa que la proteína X tiene la secuencia de aminoácidos de la proteína X expresada de forma natural in vivo en humanos.

El factor para mantener el estado indiferenciado que se utilizará en la presente invención está preferiblemente aislado. Estar "aislado" significa que se ha realizado una operación para eliminar factores distintos del componente o célula pretendidos, y el componente o célula ya no se encuentra en un estado natural. Por lo tanto, la "proteína X aislada" no incluye una proteína X endógena producida a partir de las células o del tejido a cultiva, y está contenida en una célula o tejido o en el medio. La pureza de la "proteína X aislada" (porcentaje en peso de la proteína X con respecto al peso total de la proteína) generalmente no es inferior al 70%, preferiblemente no inferior al 80%, más preferiblemente no inferior al 90%, más preferiblemente no inferior al 99%, más preferiblemente al 100%. Por lo tanto, se describe una etapa para proporcionar un factor aislado para mantener un estado indiferenciado. Esto puede incluir una etapa de añadir exógenamente un factor aislado para mantener el estado indiferenciado a un medio utilizado en la etapa (1). Alternativamente, se puede añadir de antemano un factor para mantener el estado indiferenciado a un medio que se va a usar en la etapa (1).

La concentración del factor para mantener el estado indiferenciado en el medio que se utilizará en la etapa (1) es una concentración capaz de mantener el estado indiferenciado de las células madre pluripotentes que se van a cultivar, y puede ser determinada adecuadamente por los especialistas en la materia. Por ejemplo, cuando se usa bFGF como factor para mantener el estado indiferenciado en ausencia de células alimentadoras, la concentración del mismo es generalmente de aproximadamente 4 ng - 500 ng/mL, preferiblemente de 10 ng - 200 ng/mL, más preferiblemente de aproximadamente 30 ng - 150 ng/mL.

Como medio sin alimentador, se han desarrollado muchos medios sintéticos y están disponibles comercialmente, por ejemplo, se puede mencionar el medio Essential 8. El medio Essential 8 es un medio DMEM/F12 que contiene ácido L-ascórbico-2-fosfato de magnesio (64 mg/L), selenio sódico (14 pg/L), insulina (19,4 mg/L), NaHCCfe (543 mg/L), transferrina (10,7 mg/L), bFGF (100 ng/mL) y una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de la familia TGFp (TGFp 1 (2 ng/mL) o Nodal (100 ng/mL)) como aditivos (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)). Los ejemplos de medio sin alimentador disponibles comercialmente incluyen Essential 8 (fabricado por Life Technologies), S-medium (fabricado por DS Pharma Biomedical), StemPro (fabricado por Life Technologies), hESF9 (Proc Natl Acad Sci USA, 9 de septiembre de 2008; 105 (36): 13409-14), mTeSR1 (fabricado por STEMCELL Technologies), mTeSR2 (fabricado por STEMCELL Technologies) y TeSR-E8 (fabricado por STEMCELL Technologies). Además de éstos, se puede mencionar StemFit (fabricado por Ajinomoto Co., Inc.) como medio sin alimentador. La presente invención se puede llevar a cabo convenientemente usándolos en la etapa (1) mencionada anteriormente.

Aunque un recipiente de cultivo utilizado para el cultivo por adhesión no está particularmente limitado siempre que se pueda realizar un "cultivo por adhesión", es preferible un recipiente de cultivo adhesivo celular. Los recipientes de cultivo con adhesivo celular incluyen recipientes de cultivo cuyas superficies han sido tratadas artificialmente para mejorar la adhesividad celular, y específicamente, se puede mencionar el recipiente de cultivo procesado en superficie mencionado anteriormente, un recipiente de cultivo cuyo interior está revestido con un agente de revestimiento. Los ejemplos del agente de recubrimiento incluyen matriz extracelular, tal como laminina [incluyendo laminina a5p1 y1 (en adelante laminina 511), laminina a1 p1 y1 (en adelante laminina 111) y similares, y fragmento de laminina (laminina 511E8 etc.)], entactina, colágeno, gelatina, vitronectina, Synthemax (Corning Incorporated), Matrigel y similares, o polímeros tales como polilisina, poliornitina y similares, etc. También es posible utilizar un recipiente de cultivo cuya superficie se procesa mediante un tratamiento de carga eléctrica positiva y similares. Se prefiere la laminina y se prefiere aún más la laminina 511E-8. La laminina 511E-8 puede ser un producto disponible comercialmente (por ejemplo, iMatrix-511, Nippi).

Si bien el medio usado para la etapa (1) puede ser un medio que contiene suero o puede ser un medio sin suero, es preferiblemente un medio sin suero, para evitar la contaminación con componentes químicamente indefinidos.

Para evitar la contaminación con un componente químicamente indefinido, un medio que se utilizará para la etapa (1) puede ser un medio cuyos componentes estén químicamente definidos.

En la etapa (1), las células madre pluripotentes pueden cultivarse en cualquier condición de cultivo en suspensión y de cultivo por adhesión, preferiblemente de cultivo por adhesión.

Para cultivar células madre pluripotentes en condiciones sin alimentador en la etapa (1), se puede utilizar como medio el medio sin alimentador mencionado anteriormente.

Para cultivar células madre pluripotentes en condiciones sin alimentador en la etapa (1), se puede usar una matriz apropiada como una estructura para proporcionar a la célula madre pluripotente una estructura en lugar de las células alimentadoras. Las células madre pluripotentes se someten a un cultivo de adhesión en un contenedor celular cuya superficie se recubre con una matriz a modo de estructura.

Como matriz disponible como estructura, se puede mencionar laminina (Nat Biotechnol 28, 611 -615 (2010)), fragmento de laminina (Nat Commun 3, 1236 (2012)), preparación de membrana basal (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001)), gelatina, colágeno, proteoglicano de heparán sulfato, entactina, vitronectina y similares.

La "laminina" es una molécula de heterotrímero que consta de cadenas a, p, y, y de una proteína de matriz extracelular que contiene isoformas que tienen diferentes composiciones de cadena de subunidades. Específicamente, la laminina tiene aproximadamente 15 tipos de isoformas basadas en las combinaciones de heterotrímeros con 5 tipos de cadenas a, 4 tipos de cadenas p y 3 tipos de cadenas y. El nombre de la laminina se determina combinando los números respectivos de cadena a (a1-a5), cadena p (p1-p4) y cadena y (y1 -y4). Por ejemplo, una laminina que tiene una combinación de cadena a5, cadena p1, cadena y1 se denomina laminina 511. Se usa preferiblemente laminina 511 (Nat Biotechnol 28, 611 -615 (2010)).

La laminina generalmente es una laminina de mamífero. Como mamífero, se pueden citar los mencionados anteriormente. Para lograr condiciones xenolibres, se usa preferiblemente laminina de un mamífero de la misma especie que la célula a cultivar. Por ejemplo, la laminina humana (preferiblemente, laminina humana 511) se usa para cultivar células madre pluripotentes humanas.

Un fragmento de laminina a usar en la presente descripción no está limitado particularmente, siempre que presente adhesividad a las células madre pluripotentes y permita el cultivo de mantenimiento de células madre pluripotentes en condiciones libres de alimentador, y es preferiblemente un fragmento E8. El fragmento de laminina E8 se identificó como un fragmento con fuerte actividad de adhesión celular entre los fragmentos obtenidos por digestión de laminina 511 con elastasa (EMBO J., 3: 1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987). Se usa preferiblemente un fragmento E8 de laminina 511 (Nat Commun 3, 1236 (2012), Scientific Reports 4, 3549 (2014)). No se requiere que el fragmento de laminina E8 sea un producto de digestión de elastasa de laminina, y puede ser un recombinante. Para evitar la contaminación de componentes no identificados, se prefiere un fragmento de laminina recombinante. El fragmento E8 de laminina 511 está disponible comercialmente y puede adquirirse, por ejemplo, en Nippi, Inc. y similares.

Preferiblemente, se aísla la laminina o el fragmento de laminina.

La "preparación de membrana basal" en la presente descripción se refiere a una que contiene componentes que constituyen la membrana basal que tienen la función de controlar la morfología, diferenciación, crecimiento, motilidad, expresión de la función, etc., de las células, que son similares a los de las células epiteliales, cuando se pretende las células capaces de formar una membrana basal se llevan a placa y se cultivan. Por ejemplo, las células neurales y los tejidos neurales producidos mediante la presente descripción pueden dispersarse y cultivarse en presencia de una preparación de membrana basal cuando se realiza un cultivo de adhesión adicional. Aquí, los "componentes que constituyen la membrana basal" se refieren a moléculas de matriz extracelular en forma de una membrana delgada presente entre la capa de células epiteliales y la capa de células intersticiales y así sucesivamente en los tejidos animales. Se puede producir una preparación de membrana basal, por ejemplo, eliminando células capaces de formar una membrana basal, que se adhieren a un soporte a través de una membrana basal, de un soporte con una disolución capaz de disolver los lípidos de las células, una disolución alcalina, etc. Los ejemplos de preparación de membrana basal incluyen productos disponibles comercialmente como preparación de membrana basal (p.ej., Matrigel™ (fabricado por Corning Incorporated; en adelante, algunas veces denominado Matrigel)), Geltrex™ (fabricado por Life Technologies) y moléculas de matriz extracelular conocidas como componentes de membrana basal (p.ej., laminina, colágeno de tipo IV, proteoglicano de heparán sulfato, entactina, etc.).

Matrigel™ es una preparación de membrana basal extraída de sarcoma de ratón Engelbreth Holm Swarn (EHS). El componente principal de Matrigel™ es colágeno tipo IV, laminina, proteoglicano de heparán sulfato y entactina. Además de éstos, están contenidos TGF-p, FGF, activador del plasminógeno tisular y un factor de crecimiento producido naturalmente por el tumor EHS. El "producto con factor de crecimiento reducido" de Matrigel™ tiene una concentración de factor de crecimiento más baja que el Matrigel™ común, y la concentración estándar del mismo es <0,5 ng/mL para EGF, <0,2 ng/mL para NGF, <5 pg/mL para PDGF, 5 ng/mL para IGF1 y 1,7 ng/mL para TGFp.

Para evitar la contaminación de componentes no identificados, se usa preferiblemente una laminina aislada o un fragmento de laminina.

Preferiblemente, en el cultivo de células madre pluripotentes en condiciones libres de alimentador en la etapa (1), las células madre pluripotentes humanas se cultivan en un estado adherido en un recipiente de células con superficie recubierta con laminina 511 aislada o fragmento E8 de laminina 511 aislado (más preferiblemente, fragmento E8 de laminina 511).

Si bien el período para el cultivo de células madre pluripotentes en la etapa (1) no está particularmente limitado siempre que se pueda lograr el efecto de mejorar la calidad del agregado formado en la etapa (2), generalmente es de 0,5 a 144 horas, preferiblemente de 2 a 96 horas, más preferiblemente de 6 a 48 horas, más preferiblemente de 12 a 48 horas, más preferiblemente de 18 a 28 horas (por ejemplo, 24 horas). Es decir, la primera etapa se inicia 0,5 - 144 h (preferiblemente, 18 - 28 h) antes del inicio de la etapa (2), y la etapa (2) se realiza de forma continua al completar la etapa (1).

En la etapa (1), el medio se puede cambiar según corresponda. Por ejemplo, el método puede incluir un cambio de medio cada 1 o 2 días. Aquí, por ejemplo, el medio se puede cambiar por un medio libre del agente protector celular mencionado a continuación o un agente que suprime la muerte celular tal como un inhibidor de ROCK y similares.

Las condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo y la concentración de CO2 en la etapa (1) se pueden determinar de manera apropiada. Mientras que la temperatura de cultivo es, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 es, por ejemplo, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10%, preferiblemente de aproximadamente el 5%.

Las células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS humanas) pueden cultivarse en un estado adherido en ausencia de células alimentadoras y en un medio sin suero que contenga bFGF. El cultivo de adhesión se realiza preferiblemente en un recipiente de células con superficie recubierta con laminina 511, fragmento E8 de laminina 511 o vitronectina. El cultivo de adhesión se realiza preferiblemente usando Essential 8, medio TeSR, medio mTeSR, medio mTeSR-E8 o medio StemFit, más preferiblemente medio Essential 8 o StemFit, como medio sin alimentador.

Las células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS humanas) pueden cultivarse en suspensión en ausencia de células alimentadoras y en un medio sin suero que contenga bFGF. En el cultivo en suspensión, las células madre pluripotentes humanas pueden formar un agregado de células madre pluripotentes humanas.

Se explica la etapa (2) en la que las células madre pluripotentes obtenidas en la etapa (1) se cultivan en suspensión en presencia de una sustancia activante de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog para formar un agregado celular de células madre pluripotentes.

El medio que se utilizará en la etapa (2) no está particularmente limitado siempre que sea como se describe en la sección de definición mencionada anteriormente. El medio que se utilizará en la etapa (2) puede ser un medio que contenga suero o un medio sin suero. Para evitar la contaminación de componentes químicamente indefinidos, se usa preferiblemente un medio sin suero. Por ejemplo, puede usarse un medio sin suero libre de una sustancia inhibidora de la ruta de transducción de señales Wnt. Para evitar una preparación complicada, por ejemplo, se usa preferiblemente un medio sin suero suplementado con una cantidad adecuada de una alternativa de suero disponible comercialmente tal como KSR, etc. (por ejemplo, medio de una mezcla 1:1 de IMDM y F-12, que se suplementa con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 pM y concentrado de lípidos definido químicamente 1x, o medio GMEM suplementado con KSR al 5%-20%, NEAA, ácido pirúvico, 2-mercaptoetanol). La cantidad de KSR a añadir a un medio sin suero en el caso de células ES humanas es generalmente de aproximadamente 1% a aproximadamente 30%, preferiblemente de aproximadamente 2% a aproximadamente 20%.

Para la formación de un agregado, primero se realiza una operación de dispersión de las células madre pluripotentes obtenidas en la etapa (1). Las "células dispersas" obtenidas mediante la operación de dispersión se refieren a un estado en el que, por ejemplo, no menos del 70% de las células son células individuales y no más del 30% de las células son grupos de 2 a 50 células. Preferiblemente, como las células dispersas, se puede mencionar un estado en el que no menos del 80% de las células son células individuales y no más del 20% de las células son grupos de 2 a 50 células. Las células dispersas se refieren a un estado casi libre de adhesión mutua de células (p.ej., unión plana). En una parte de la realización, las células dispersas se refieren a un estado casi libre de unión célula-célula (por ejemplo, unión adhesiva).

Una operación de dispersión de las células madre pluripotentes obtenidas en la etapa (1) puede contener el tratamiento de dispersión mecánica mencionado anteriormente, el tratamiento de disolución de dispersión celular y el tratamiento de adición de agente protector celular. Estos tratamientos se pueden realizar en combinación. Preferiblemente, se realiza un tratamiento de disolución de dispersión celular simultáneamente con un tratamiento de adición de agente protector celular, y luego se realiza un tratamiento de dispersión mecánica.

Como agente protector celular para ser utilizado para el tratamiento de adición del agente protector celular, se pueden mencionar una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de FGF, heparina, una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de IGF, suero y suero alternativo. Además, para suprimir la muerte celular de las células madre pluripotentes (en particular, la muerte celular de las células madre pluripotentes humanas) inducida por la dispersión y proteger las células, se puede añadir un inhibidor de la quinasa en espiral asociada a Rho (ROCK) o un inhibidor de la miosina. Para suprimir la muerte celular de las células madre pluripotentes (en particular, las células madre pluripotentes humanas) inducida por la dispersión, se puede añadir una sustancia inhibidora de la quinasa en espiral asociada a Rho (ROCK) o un inhibidor de la miosina desde el inicio de la segunda etapa de cultivo. Como sustancia inhibidora de ROCK, se pueden mencionar Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152 y similares. Como inhibidor de la miosina, se puede mencionar la blebistatina.

Como disolución de dispersión celular que se utilizará para el tratamiento de dispersión celular, se puede mencionar una disolución que contenga cualquiera de las enzimas tripsina, colagenasa, hialuronidasa, elastasa, pronasa, ADNasa, papaína, etc., y un agente quelante, como el ácido etilendiaminotetraacético, etc. También se puede utilizar una disolución de dispersión celular disponible comercialmente tal como TrypLE Select (fabricada por Life Technologies) y TrypLE Express (fabricada por Life Technologies).

Como método de tratamiento de dispersión mecánica, se puede mencionar un tratamiento de pipeteo o raspado con un raspador.

Las células dispersas se suspenden en el medio mencionado anteriormente.

A continuación, se siembra una suspensión de las células madre pluripotentes dispersas en el recipiente de cultivo mencionado anteriormente, y las células madre pluripotentes dispersas se cultivan en una condición no adhesiva al recipiente de cultivo, mediante lo cual varias células se reúnen para formar un agregado.

En este caso, se pueden formar varios agregados de células simultáneamente en un recipiente de cultivo sembrando las células madre pluripotentes dispersas en un recipiente de cultivo comparativamente grande, tal como una placa de 10 cm. Sin embargo, el tamaño de los agregados varía en este caso. Así, por ejemplo, se coloca una cantidad determinada de células madre pluripotentes dispersas en cada pocillo de una placa de pocillos múltiples (fondo en U, fondo en V), tal como una microplaca de 96 pocillos, y se realiza un cultivo estático, mediante el cual las células coagulan rápidamente para formar un agregado en cada pocillo. Los agregados se recuperan de varios pozos, por lo que se puede obtener una población de agregados uniformes.

La concentración de las células madre pluripotentes en la etapa (2) se puede establecer de manera apropiada para que los agregados celulares se puedan formar de manera más uniforme y eficiente. Por ejemplo, cuando las células humanas (p.ej., células iPS humanas obtenidas en la etapa (1)) se cultivan en suspensión utilizando una placa de micropocillos de 96 pocillos, se prepara un líquido para lograr de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 105 células, preferiblemente alrededor de 3 x 103 a aproximadamente 5 x 104 células, más preferiblemente alrededor de 4 x 103 a aproximadamente 2 x 104 células, más preferiblemente alrededor de 4 x 103 a aproximadamente 1,6 x 104 células, más preferiblemente alrededor de 8 x 103 a aproximadamente 1,2 x 104 células por pocillo, que se añaden a los pocillos y se deja reposar la placa para que se formen los agregados.

Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura de cultivo, la concentración de CO2 , etc., de la etapa (2) se pueden determinar apropiadamente. La temperatura de cultivo es, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 es, por ejemplo, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10%, preferiblemente aproximadamente el 5%.

En la etapa (2), cuando se realiza una operación de cambio de medio, por ejemplo, se puede mencionar una operación para agregar un medio nuevo sin descartar el medio existente (operación de adición de medio), una operación para desechar aproximadamente la mitad de la cantidad del medio existente (aproximadamente el 30-90%, por ejemplo, 40-60% del volumen del medio existente) y añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de medio nuevo (30-90%, por ejemplo, aproximadamente 40-60% del volumen del medio existente ) (operación de cambio parcial de medio), y una operación para desechar aproximadamente la cantidad total del medio existente (no menos del 90% de la cantidad del medio existente) y agregar aproximadamente la cantidad total de medio nuevo (no menos del 90% de la cantidad del medio existente) (operación de cambio total de medio).

Cuando se añade un componente en particular (por ejemplo, un factor inductor de diferenciación) en un momento determinado, por ejemplo, se puede realizar una operación para calcular la concentración final, desechar aproximadamente la mitad del medio existente y añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de un medio nuevo que contenga un componente particular a una concentración superior a la concentración final (específicamente 1,5 veces - 3,0 veces la concentración final, por ejemplo, aproximadamente 2 veces la concentración final) (operación de cambio parcial de medio).

Cuando la concentración de un componente particular contenido en el medio existente se mantiene a un determinado tiempo, por ejemplo, se puede realizar una operación para desechar aproximadamente la mitad de la cantidad del medio existente y añadir aproximadamente la mitad de un medio nuevo que contiene el componente particular a una concentración igual a la del medio existente.

Cuando la concentración de un componente contenido en el medio existente debe reducirse mediante dilución en un determinado momento puntual, por ejemplo, la operación de cambio de medio se puede realizar varias veces al día, preferiblemente varias veces (por ejemplo, 2 a 3 veces) en la misma hora. Además, cuando la concentración de un componente contenido en el medio existente debe reducirse mediante dilución en un determinado momento, las células o los agregados pueden transferirse a otro recipiente de cultivo.

Si bien la herramienta utilizada para la operación de cambio de medio no está particularmente limitada, se pueden mencionar, por ejemplo, pipeta, micropipeta (PIPETMAN), micropipeta multicanal (MULTICHANNEL PIPeTm AN), dispensador continuo y similares. Por ejemplo, cuando se usa una placa de 96 pocillos como recipiente de cultivo, se puede usar una micropipeta multicanal (MULTICHANNEL PIPETMAN).

El período de cultivo en suspensión necesario para formar un agregado celular se puede determinar según sea apropiado de acuerdo con la célula madre pluripotente que se va a usar, de modo que las células se puedan agregar uniformemente. Para formar agregados de células uniformes, es deseable que el periodo sea lo más corto posible. Las etapas para que las células dispersas formen agregados celulares se pueden dividir en una etapa para recolectar células y una etapa para formar agregados celulares a partir de las células recolectadas. En una etapa de siembra de las células dispersas (es decir, en el momento del inicio del cultivo en suspensión) para recolectar las células en el caso de células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS humanas), por ejemplo, las células recolectadas se forman preferiblemente en un plazo de aproximadamente 24 horas, más preferiblemente en un plazo de aproximadamente 12 horas. El período desde el momento en que se siembran las células dispersas (es decir, en el momento del inicio del cultivo en suspensión) para formar un agregado en el caso de las células madre pluripotentes humanas (p.ej., células iPS humanas), el agregado se forma, por ejemplo, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 72 h, más preferiblemente en el plazo de aproximadamente 48 h. El período para la formación de agregados celulares se puede ajustar apropiadamente controlando las herramientas para agregar las células, las condiciones de centrifugación, etc.

La formación de agregados celulares y la uniformidad de los mismos se puede determinar en función del tamaño y número de células de los agregados, morfología macroscópica, morfología microscópica mediante análisis de tinción de tejidos y uniformidad de los mismos, expresión de marcadores de diferenciación e indiferenciación y uniformidad de los mismos, control de expresión de marcador de diferenciación y sincronismo del mismo, reproducibilidad de la eficiencia de diferenciación entre los agregados, etc.

Después de la formación del agregado, el agregado puede cultivarse continuamente tal como está. El período para el cultivo en suspensión en la etapa (2) es generalmente de aproximadamente 12 horas a 6 días, preferiblemente de aproximadamente 12 horas a 48 horas.

El medio utilizado en la etapa (2) contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog. En la etapa (1), las células madre pluripotentes se someten a cultivo de mantenimiento en condiciones sin alimentador; y en la segunda etapa, las células madre pluripotentes obtenidas en la primera etapa se cultivan en suspensión en un medio (preferiblemente medio libre de suero) que contiene una sustancia activante de la vía de transducción de señal Sonic hedgehog para mejorar la calidad del agregado, y se puede formar con una elevada eficiencia un interior esférico, de superficie suave, sin colapsar y denso dentro de los agregados de células que mantienen propiedades indiferenciadas.

La sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (en lo sucesivo algunas veces se indicará como Shh) es una sustancia capaz de mejorar la transducción de señales mediada por Shh. La sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh se selecciona de una proteína que pertenece a la familia Hedgehog (p.ej., Shh e Ihh), agonista del receptor Shh, purmorfamina (PMA; 9-ciclohexil-N- [4-(4-morfolinil)fenil]-2-(1 -naftaleniloxi)-9H-purin-6-amina) y SAG (agonista suavizado; N-metil-N'-(3-piridinilbencil)-N'-(3-clorobenzo[b]tiofeno-2-carbonilo)-1,4-diaminociclohexano). Como sustancia activadora de la ruta de transducción de señales de Shh, se prefieren, por ejemplo, SAG, purmorfamina (PMA) y proteína Shh (números de acceso de Genbank: NM_000193, NP_000184), siendo el más preferido SAG. La concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh en el medio puede determinarse apropiadamente para que esté dentro de un rango capaz de lograr los efectos antes mencionados. SAG se usa generalmente a una concentración de 1 - 2000 nM, preferiblemente 10 nM -1000 nM, preferiblemente 10 nM - 700 nM, 30 nM - 700 nM, 50 nM - 700 nM, más preferiblemente 100 nM - 600 nM, más preferiblemente 100 nM - 500 nM. Cuando se usa una sustancia activadora de la ruta de transducción de señales de Shh distinta de SAG, es deseable que se use a una concentración que confiera una actividad promotora de la transducción de señales de Shh equivalente a la de SAG a la concentración mencionada anteriormente. En el caso de PMA, por ejemplo, la concentración generalmente corresponde a 0,002-20 pM, preferiblemente 0,02-2 pM, más preferiblemente aproximadamente 0,2 pM; y en el caso de la proteína Shh, por ejemplo, la concentración generalmente corresponde a aproximadamente 10-1000 ng/mL, preferiblemente aproximadamente 10-300 ng/mL.

La concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog en el medio puede variarse durante el período de la etapa (2). Por ejemplo, la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog se proporciona para que se encuentre dentro del rango mencionado anteriormente en el momento del inicio de la etapa (2), y la concentración se puede disminuir gradual o por pasos en una proporción de 40 a 60% cada 2-4 días.

El momento de la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog al medio no está particularmente limitado, siempre que se puedan proporcionar los efectos mencionados anteriormente, pero se puede obtener un efecto mayor cuando se añade antes. Una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog se añade al medio generalmente en un plazo de 3 días, preferiblemente en un plazo de 2 días, más preferiblemente en un plazo de 1 día, desde el inicio de la etapa (2), y más preferiblemente en el momento del inicio de la etapa (2).

En una realización preferible, en la etapa (2), las células madre pluripotentes humanas obtenidas en la etapa (1) (por ejemplo, células iPS humanas) pueden someterse a cultivo en suspensión en un medio libre de suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG, proteína Shh, PMA) para formar agregados. Una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog está contenida preferiblemente en el medio desde el momento del inicio del cultivo en suspensión. También se puede añadir al medio una sustancia inhibidora de ROCK (por ejemplo, Y-27632). El período de cultivo es de 12 horas a 6 días, preferiblemente de 12 horas a 48 horas. Los agregados formados son preferiblemente agregados uniformes.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes humanas obtenidas en la etapa (1) (por ejemplo, células iPS humanas) se recuperan, se dispersan en células individuales o en un estado cercano a ellas, se suspenden en un medio libre de suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog (por ejemplo, SAG, proteína Shh, PMA) y se someten a cultivo en suspensión. El medio sin suero puede contener una sustancia inhibidora de ROCK (p.ej., Y-27632). Se siembra una suspensión de células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células iPS) en el recipiente de cultivo mencionado anteriormente y las células madre pluripotentes dispersas se cultivan en condiciones en las que no son adhesivas al recipiente de cultivo, mediante lo cual varias células madre pluripotentes se ensamblan para formar un agregado. El período de cultivo es de 12 horas a 6 días, preferiblemente de 12 horas a 48 horas. Los agregados formados son preferiblemente agregados uniformes.

Realizando la etapa (2) de esta manera, se forma un agregado de las células madre pluripotentes obtenidas en la etapa (1), o de las células derivadas de las mismas. La presente invención también proporciona un método para producir dicho agregado. El agregado obtenido en la etapa (2) tiene una calidad superior al formado por un tratamiento con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Sonic hedgehog que no se realiza en la etapa (2). Para ser específico, se puede obtener una población de agregados que tienen una alta proporción de agregados de células esféricas que tienen una superficie lisa, un interior denso y una forma sin colapsar. Cuando los agregados (por ejemplo, no menos de 100 agregados) se seleccionan al azar el día 6 desde el inicio de la segunda etapa, la suma de las proporciones de agregados no colapsados y/o agregados no quísticos es, por ejemplo, no inferior al 30%, preferiblemente no inferior al 50%.

El agregado obtenido en la etapa (2) tiene la capacidad de diferenciarse en varias células diferenciadas y tejidos diferenciados. El agregado obtenido en la etapa (2) tiene la potencia de diferenciarse en una célula retiniana o un tejido retiniano. Utilizando las células madre obtenidas en la etapa (1) y teniendo la potencia para diferenciarse en al menos una célula neural o un tejido neural (preferiblemente, tejido retiniano, célula progenitora retiniana o neurona específica de la capa retiniana) (preferiblemente, células madre positivas para Oct3/4 que tienen la capacidad de diferenciarse en al menos una célula neural o un tejido neural (preferiblemente, tejido retiniano, célula progenitora retiniana o neurona específica de la capa retiniana)) en la etapa (2), se puede obtener un agregado que contiene células madre (p.ej., células madre positivas para Oct3/4) que tienen una potencia para diferenciarse en al menos una célula neural o un tejido neural (preferiblemente, tejido retiniano, célula progenitora retiniana o neurona específica de la capa retiniana). Se pueden inducir varias células diferenciadas y tejidos diferenciados (células retinianas, etc., tejido retiniano, etc.) con alta eficacia cultivando el agregado obtenido en la etapa (2) en condiciones de diferenciación apropiadas.

El agregado obtenido en la etapa (2) contiene las células correspondientes a las células en una etapa intermedia entre las células madre pluripotentes obtenidas en la etapa (1), y las células retinianas o un tejido retiniano. Estas células expresan cualquiera de marcador de estado pluripotente Oct3/4, marcador de ectodermo (Sox1, Sox2, N-cadherina, TP63), marcador de neuroectodermo (Sox1, Sox2, Nestin, N-cadherina, Otx2) y el marcador de células neurales antes mencionado. Es decir, el agregado obtenido en la etapa (2) puede contener una mezcla de células que expresen cualquiera de marcador de estado pluripotente Oct3/4, marcador de ectodermo (Sox1, Sox2, N-cadherina, TP63), marcador de neuroectodermo (Sox1, Sox2, Nestin, N-cadherina, Otx2) y el marcador de células neurales antes mencionado. Es decir, el agregado obtenido en la etapa (2) contiene células madre que tienen la potencia de diferenciarse en al menos células retinianas o tejido retiniano, y/o células progenitoras/precursoras de una célula retiniana o tejido retiniano. Además, las células progenitoras/precursoras se caracterizan porque muestran una capacidad (competencia) para expresar el marcador de células retinianas mencionado anteriormente cuando se cultivan en condiciones de cultivo apropiadas conocidas. Por lo tanto, el agregado obtenido en la etapa (2) puede contener células madre positivas para Oct3/4 que tienen la potencia para diferenciarse en al menos una célula retiniana o tejido retiniano y/o células progenitoras/precursoras de una célula retiniana o tejido retiniano. Una parte de las células contenidas en el agregado obtenido en la etapa (2) puede expresar los marcadores de tejido retiniano antes mencionados. El agregado obtenido en la etapa (2) puede contener células positivas para Oct3/4 en una proporción no inferior al 50%, por ejemplo, no inferior al 70% del total de células.

En la etapa (2), cuando se realiza una operación de cambio de medio, por ejemplo, se puede mencionar una operación para añadir un medio nuevo sin descartar el medio existente (operación de adición de medio), una operación para desechar aproximadamente la mitad de la cantidad del medio existente (aproximadamente 30 - 90%, por ejemplo, aproximadamente 40 - 60% del volumen del medio existente) y añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de medio fresco (aproximadamente 30 - 90%, por ejemplo, aproximadamente 40 - 60% del volumen del medio existente) (operación de cambio parcial de medio), y una operación para desechar la cantidad total del medio existente (no menos del 90% de la cantidad del medio existente) y añadir aproximadamente la cantidad total de medio nuevo (no menos del 90% de la cantidad del medio existente) (operación de cambio total de medio).

Cuando se añade un componente en particular (por ejemplo, un factor inductor de diferenciación) en un momento determinado, por ejemplo, se puede realizar una operación para calcular la concentración final, descartar aproximadamente la mitad del medio existente y añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de un medio nuevo que contenga un componente particular a una concentración superior a la concentración final (específicamente 1,5 -3,0 veces la concentración final, por ejemplo, aproximadamente 2 veces la concentración final) (operación de cambio parcial de medio).

Cuando la concentración de un componente particular contenido en el medio existente se mantiene a un determinado tiempo, por ejemplo, se puede realizar una operación para descartar aproximadamente la mitad de la cantidad del medio existente y añadir aproximadamente la mitad de un medio nuevo que contiene el componente particular a una concentración igual a la del medio existente.

Cuando la concentración de un componente contenido en el medio existente debe reducirse mediante dilución en un determinado momento puntual, por ejemplo, la operación de cambio de medio se puede realizar varias veces al día, preferiblemente varias veces (por ejemplo, 2 a 3 veces) en un plazo de 1 hora. Además, cuando la concentración de un componente contenido en el medio existente debe reducirse mediante dilución en un determinado momento puntual, la célula o el agregado se puede transferir a otro recipiente de cultivo.

Si bien la herramienta utilizada para la operación de cambio de medio no está particularmente limitada, se pueden mencionar por ejemplo, pipeta, micropipeta (PIPETMAN), micropipeta multicanal (MULTICHANNEL PIPeTm AN), dispensador continuo y similares. Por ejemplo, cuando se usa una placa de 96 pocillos como recipiente de cultivo, se puede usar una micropipeta multicanal (MULTICHANNEL PIPETMAN).

Se explica la etapa (3) donde se induce un agregado que contiene células retinianas o un tejido retiniano a partir del agregado obtenido en la etapa (2).

El agregado obtenido en la etapa (2) se cultiva en suspensión en presencia o ausencia (preferiblemente en presencia) de un factor inductor de diferenciación apropiado, por lo que se puede obtener un agregado que contiene células retinianas o un tejido retiniano.

Como método para inducir un agregado de células en células retinianas o en tejido retiniano mediante cultivo en suspensión, se han publicado muchos métodos. Por ejemplo, los métodos descritos en Nature, 472, 51 -56 (2011), Cell Stem Cell, 10 (6), 771-775 (2012) y similares, aunque el método no se limita a ellos.

Como método para producir células retinianas o un tejido retiniano en ausencia de un factor inductor de la diferenciación, se puede mencionar un método que comprende inducir la diferenciación espontánea de los agregados obtenidos en la etapa (2) en células neurales que incluyen células retinianas en un que contiene suero o en un medio libre de suero. Como el medio que contiene suero o el medio libre de suero mencionados anteriormente, se puede mencionar un medio de suero o un medio libre de suero que estén libres de un factor para mantener el estado indiferenciado. Las células retinianas producidas durante el proceso de diferenciación en células neurales pueden seleccionarse y aislarse. Para la selección y el aislamiento, se puede utilizar FACS o MACS. Además, también pueden usarse las células madre pluripotentes, que producen fácilmente retina, como material de partida en la etapa (1).

Preferiblemente, el agregado obtenido en la etapa (2) se cultiva en suspensión en presencia de un factor inductor de la diferenciación para dar lugar a un agregado que contiene células retinianas o tejido retiniano.

El factor inductor de la diferenciación utilizado en la presente memoria no está particularmente limitado siempre que sea un factor que tiene actividad para inducir la diferenciación en una célula retiniana o tejido retiniano. Los ejemplos del mismo incluyen una sustancia activadora de la transducción de señales de BMP, una preparación de membrana basal, una sustancia inhibidora de la ruta de transducción de señales Wnt, una sustancia inhibidora de la ruta de transducción de señales de la familia TGFp y similares. Las respuestas a un factor inductor de la diferenciación varían según el tipo y el estado de diferenciación (competencia o potencial) de la célula, y el efecto del factor inductor de la diferenciación puede variar incluso en el proceso de inducción de la diferenciación, dependiendo de la concentración y el momento de la adición del factor inductor de la diferenciación. Asimismo, se sabe que la concentración óptima de un factor inductor de diferenciación que presenta efectos similares varía según la especie animal y, por ejemplo, se sabe que, entre célula de ratón y célula humana, la concentración óptima de célula humana es generalmente más alta (particularmente en ectodermo, endodermo). Hay muchos estudios sobre los métodos de inducción de diferenciación de células madre pluripotentes en células o tejidos particulares, y se puede seleccionar un factor de inducción de diferenciación o un método de inducción de diferenciación adecuado para la célula o tejido pretendido.

Preferiblemente, se usa una sustancia activadora de la ruta de transducción de señales de BMP como factor inductor de la diferenciación. Es decir, el agregado obtenido en la etapa (2) se cultiva en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP para dar lugar a un agregado que contiene células retinianas o tejido retiniano.

La sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es una sustancia capaz de mejorar la transducción de señales mediada por BMP. La sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es una o más de las siguientes: BMP2, BMP4, BMP7, GDF7, anticuerpo anti-receptor de BMP y un anticuerpo anti receptor de BMP. La proteína BMP2, la proteína BMP4 y la proteína BMP7 están disponibles, por ejemplo, en R&D Systems, y la proteína GDF7 está disponible, por ejemplo, en Wako Pure Chemical Industries, Ltd. La sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es preferiblemente BMP4.

El factor inductor de la diferenciación (por ejemplo, BMP4) que se utilizará en la presente invención es generalmente un factor inductor de la diferenciación de mamífero. Los ejemplos de mamífero incluyen los mencionados anteriormente. Dado que el factor inductor de la diferenciación puede tener reactividad cruzada entre las especies de mamíferos, también se puede usar el factor inductor de la diferenciación de cualquier mamífero siempre que se pueda lograr la inducción de la diferenciación de la célula madre pluripotente cultivada. Preferiblemente, se usa un factor inductor de la diferenciación de mamífero de la misma especie que la célula a cultivar. Por ejemplo, cuando se induce la diferenciación de células madre pluripotentes humanas en un tejido retiniano o una célula retiniana, se usa preferiblemente un factor inductor de diferenciación humano (por ejemplo, BMP4).

El factor inductor de la diferenciación (por ejemplo, BMP4) usado en la presente invención preferiblemente está aislado. Por lo tanto, el método puede comprender una etapa de proporcionar un factor inductor de diferenciación aislado (por ejemplo, BMP4). Por ejemplo, el método puede comprender un paso de añadir exógenamente el factor inductor de diferenciación aislado (por ejemplo, BMP4) al medio que se utilizará en la etapa (3).

El medio que se utilizará en la etapa (3) puede ser un medio sin suero o un medio que contenga suero (preferiblemente medio sin suero) suplementado con un factor inductor de la diferenciación (por ejemplo, BMP4). Dicho medio puede contener o no una preparación de membrana basal. Como preparación de membrana basal, se pueden utilizar las mencionadas anteriormente. Cuando se añade una preparación de membrana basal, la concentración de la misma es, por ejemplo, de 0,1 a 10%, más preferiblemente de 0,5% a 2%, en concentración en volumen, cuando se usa Matrigel. Para evitar la contaminación con una sustancia químicamente no identificada, no se añade una preparación de membrana basal.

Un medio sin suero o un medio que contenga suero que se utilice para tal medio no está particularmente limitado siempre que sea tal como se mencionó anteriormente. Para evitar una preparación complicada, por ejemplo, se usa preferiblemente un medio sin suero complementado con una cantidad adecuada de una alternativa de suero disponible comercialmente como KSR, etc. (por ejemplo, medio de una mezcla 1:1 de IMDM y F-12 suplementado con 10% de KSR, 1-monotioglicerol 450 pM y 1x concentrado de lípidos definido químicamente o un medio de GMEM suplementado con 5% - 20% de KSR, NEAA, ácido pirúvico, 2-mercaptoetanol). La cantidad de KSR a añadir a un medio sin suero en el caso de células ES humanas es generalmente de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%, preferiblemente de aproximadamente 2% a aproximadamente 20%.

Como medio (preferiblemente medio sin suero) que se usará en la etapa (3), se puede usar directamente el medio (preferiblemente medio sin suero) usado en la etapa (2), o se puede reemplazar con un medio nuevo (preferiblemente medio libre de suero). Cuando se usa directamente el medio sin suero usado en la etapa (2), libre de factor inductor de la diferenciación (por ejemplo, BMP4), para la etapa (3), se puede añadir al medio un factor inductor de la diferenciación (por ejemplo, BMP4).

Cuando la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de la señal Shh añadida al medio en la etapa (2) es comparativamente baja (por ejemplo, no más de 700 nM para SAG, y una concentración que confiere una actividad promotora de la transducción de la señal Shh equivalente o menor que la de SAG a la concentración mencionada anteriormente, para otras sustancias activadoras de la vía de transducción de señales de Shh), no es necesario el cambio de medio, y puede añadirse un factor inductor de diferenciación (p.ej., BMP4) al medio utilizado en la etapa (2). Por otro lado, cuando la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de la señal Shh es comparativamente alta (p.ej., superior a 700 nM o no menos de 1000 nM para SAG, y una concentración que confiere una actividad promotora de la transducción de señal Shh equivalente a la de SAG en la concentración mencionada anteriormente, para otras sustancias activadoras de la vía de transducción de señales Shh), es deseable cambiar el medio a un medio nuevo que contenga un factor inductor de diferenciación (p.ej., BMP4) para suprimir una influencia de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh restante cuando se agrega un factor inductor de diferenciación.

En una realización preferible, la concentración de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh en el medio que se utilizará en la etapa (3) es, cuando se calcula en términos de la actividad promotora de la transducción de señales Shh de SAG, no más de 700 nM, tal como no más de 300 nM, no más de 10 nM o no más de 0,1 nM. El medio puede estar libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh. El medio "libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh" también incluye un medio sustancialmente libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh, por ejemplo, un medio libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh a una concentración que imparte una influencia adversa sobre la diferenciación selectiva en una célula retiniana o un tejido retiniano. El medio "libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh" también incluye un medio sustancialmente no suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh, por ejemplo, un medio no suplementado con una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh a una concentración que imparte una influencia adversa sobre la diferenciación selectiva en una célula retiniana o en un tejido retiniano.

La concentración del factor inductor de la diferenciación (por ejemplo, sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP) en el medio puede ser una concentración a la que puede inducirse la diferenciación del agregado de células madre pluripotentes o células derivadas de las mismas en células retinianas. Por ejemplo, en el caso de BMP4 humana, se añade al medio a una concentración de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 1 pM, preferiblemente de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, más preferiblemente de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM, más preferiblemente aproximadamente 1,5 nM (55 ng/mL). Cuando se usa una sustancia activadora de la ruta de transducción de señales de BMP distinta de BMP4, se usa deseablemente a una concentración a la que se ejerce una actividad promotora de la transducción de señales de BMP equivalente a la de BMP4 a la concentración mencionada anteriormente.

La concentración del factor inductor de la diferenciación (por ejemplo, BMP4) en el medio puede variarse durante el período de la etapa (3). Por ejemplo, el factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4) se proporciona para que se encuentre dentro del rango mencionado anteriormente en el momento del inicio de la etapa (3), y la concentración puede disminuirse gradualmente o gradualmente en una proporción de 40 - 60% cada 2-4 días.

Se puede agregar un factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4) después de aproximadamente 24 horas o más desde el inicio del cultivo en suspensión en la etapa (2), y también se puede agregar al medio en un plazo de varios días (p.ej., un plazo de 15 días) desde el inicio del cultivo en suspensión. Preferiblemente, se agrega un factor inductor de diferenciación (por ejemplo, BMP4) al medio en un plazo entre el día 1 y el día 15, más preferiblemente entre el día 1 y el día 9, más preferiblemente entre el día 3 y el día 8, aún más preferiblemente, entre el día 3 y el día 6, desde el inicio del cultivo en suspensión.

Después de la adición de un factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4) al medio y el comienzo de la inducción de la diferenciación del agregado en las células retinianas, no es necesario agregar el factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4) al medio, y el medio puede intercambiarse con un medio sin suero o con un medio que contenga suero, ambos libres de un factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4). Después del inicio de la inducción de la diferenciación del agregado en células neurales, la concentración del factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4) en el medio se puede reducir de forma gradual o por pasos en una proporción de 40 - 60% cada 2 - 4 días intercambiando el medio con un medio sin suero o con un medio que contenga suero, ambos libres de un factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4). Como resultado, la concentración de un factor inductor de la diferenciación (por ejemplo, BMP4) puede diluirse gradualmente y puede limitarse el efecto y la duración de la acción del factor inductor de la diferenciación.

El medio puede intercambiarse parcial o totalmente con un medio que contenga BMP4 el día 1 al 9, preferiblemente el día 2 al 8, más preferiblemente el día 3 o 4, después del inicio del cultivo en suspensión (es decir, después del inicio de la etapa (2) mencionada anteriormente) para ajustar la concentración final de BMP4 a aproximadamente 1 - 10 nM, y las células se pueden cultivar en presencia de BMP4 durante aproximadamente 1 - 12 días, preferiblemente 2 - 9 días, más preferiblemente 2 - 5 días. Para mantener la concentración de BMP4 al mismo nivel, el medio puede intercambiarse total o parcialmente una o dos veces con un medio que contenga BMP4. Alternativamente, como se ha mencionado anteriormente, la concentración de BMP4 también se puede reducir gradualmente.

Las células en las que se ha iniciado la inducción de la diferenciación en células retinianas pueden confirmarse, por ejemplo, detectando en las células la expresión del gen marcador de células progenitoras de la retina (p.ej., Gen Rx (alias Rax), gen Pax6, gen Chx10). El agregado formado en la etapa (2) mediante el uso de células madre pluripotentes en las que un gen de la proteína indicadora de fluorescencia, como GFP, etc., se incorpora al locus del gen Rx, se cultiva en suspensión en presencia de un factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4) a una concentración necesaria para la inducción de la diferenciación en la célula retiniana, y se detecta la fluorescencia emitida por la proteína indicadora de fluorescencia expresada, por lo que se puede confirmar el momento en el que se inició la inducción de la diferenciación en la célula retiniana. En la etapa (3), puede cultivarse en suspensión el agregado formado en la etapa (2) en un medio sin suero o en un medio que contiene suero y que contenga un factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4) a una concentración necesaria para la inducción de la diferenciación en célula retiniana, hasta que comienza a aparecer una célula que expresa el gen marcador de células progenitoras retinianas (por ejemplo, gen Rx, gen Pax6, gen Chx10), obteniendo así un agregado celular que comprende células progenitoras retinianas.

En la etapa (3), cuando se realiza una operación de cambio de medio, por ejemplo, se puede mencionar la operación de adición de medio, la operación de cambio parcial de medio y la operación de cambio total de medio.

Cuando se añade un componente en particular (por ejemplo, un factor inductor de diferenciación) en un momento determinado, por ejemplo, se puede realizar una operación para calcular la concentración final, para descartar aproximadamente la mitad del medio existente y añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de un medio nuevo que contenga un componente particular a una concentración superior a la concentración final (específicamente 1,5 -3,0 veces la concentración final, por ejemplo, aproximadamente 2 veces la concentración final) (operación de cambio parcial de medio).

Cuando la concentración de un componente particular contenido en el medio existente debe mantenerse en un cierto momento, por ejemplo, se puede realizar una operación para descartar aproximadamente la mitad de la cantidad del medio existente y añadir aproximadamente la mitad de un medio nuevo que contenga un componente particular a una concentración igual a la del medio existente.

Cuando la concentración de un componente contenido en el medio existente debe reducirse mediante dilución en un determinado momento puntual, por ejemplo, la operación de cambio de medio se puede realizar varias veces al día, preferiblemente varias veces (por ejemplo, 2 a 3 veces) en un plazo de 1 hora. Además, cuando la concentración de un componente contenido en el medio existente debe reducirse mediante dilución en un determinado momento, la célula o el agregado puede transferirse a otro recipiente de cultivo.

Se pueden determinar de forma apropiada las condiciones de cultivo, tales como la temperatura de cultivo, la concentración de CO2, etc., de la etapa (3). La temperatura de cultivo es, por ejemplo, de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 es, por ejemplo, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10%, preferiblemente aproximadamente el 5%.

Mediante dicho cultivo, se induce la diferenciación de las células que forman el agregado obtenido en la etapa (2) en células progenitoras de la retina, por lo que se puede obtener un agregado que contiene las células progenitoras de la retina. La presente invención también proporciona un método para producir dicho agregado que contiene células progenitoras retinianas. El hecho de que se haya obtenido un agregado que comprende células progenitoras de la retina puede confirmarse, por ejemplo, detectando la presencia de células que expresan Rax, PAX6 o Chx10, que es un marcador de células progenitoras de la retina, en el agregado. En la etapa (3), el agregado formado en la etapa (2) puede cultivarse en suspensión en un medio sin suero o en un medio que contiene suero que contiene una sustancia activante de la vía de transducción de señales de BMP (p.ej., BMP4) a una concentración necesaria para la inducción de la diferenciación en célula retiniana, hasta que comienza a aparecer una célula que expresa el gen Rx, obteniendo un agregado que comprende células progenitoras retinianas. El cultivo de la etapa (3) se puede realizar hasta que no menos del 20% (preferiblemente, no menos del 30%, no menos del 40%, no menos del 50%, no menos del 60%) de las células contenidas en el agregado expresan Rx.

El agregado obtenido que contiene células progenitoras de la retina puede usarse tal cual como reactivo para evaluar la toxicidad o la eficacia. Un agregado que contiene células progenitoras de la retina se somete a un tratamiento de dispersión (por ejemplo, tratamiento con tripsina/EDTA o tratamiento con papaína), y las células obtenidas se someten a una selección usando FACS o MACS, por lo que también se pueden obtener células progenitoras de la retina altamente puras.

Además, el agregado que contiene tejido retiniano puede cultivarse en continuo en un medio sin suero o en un medio que contiene suero para producir células retinianas (p.ej., células progenitoras de la retina) contenidas en el tejido retiniano para diferenciarlo aún más, mediante lo cual se puede producir un tejido retiniano similar a una estructura neuroepitelial.

Un medio sin suero o un medio que contenga suero que se utilice para tal medio no está particularmente limitado siempre que sea tal como se ha mencionado anteriormente. Por ejemplo, se puede mencionar un medio que contiene suero que es un medio DMEM-F12 suplementado con suero fetal bovino al 10%, suplemento de N2, taurina 100 pM y ácido retinoico 500 nM, o un medio sin suero suplementado con una cantidad apropiada de un suero alternativo disponible tal como KSR, etc. (por ejemplo, medio de una mezcla 1:1 de IMDM y F-12 suplementada con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 pM y 1x concentrado de lípidos definidos químicamente) y similares.

Aunque el período de cultivo para inducir un tejido retiniano a partir de células progenitoras retinianas varía dependiendo de la neurona específica de la capa retiniana deseada, es, por ejemplo, de aproximadamente 7 días a aproximadamente 200 días.

El tejido retiniano existe cubriendo la superficie del agregado. Una vez completado el cultivo en suspensión, el agregado se puede fijar con un fijador como una disolución de para-formaldehído, etc., y se prepara una criosección, luego se puede confirmar la formación de un tejido retiniano que tiene una estructura de capas mediante inmunotinción y similares. Dado que las capas respectivas de un tejido retiniano están compuestas por diferentes células (célula fotorreceptora, célula horizontal, célula bipolar, célula amacrina, célula ganglionar de la retina), la formación de una estructura de capa se puede confirmar utilizando anticuerpos contra los marcadores mencionados anteriormente expresados en estas células mediante la inmunotinción. El tejido retiniano puede ser una estructura neuroepitelial positiva para Rx o Chx10.

El tejido retiniano que existe en la superficie del agregado puede cortarse físicamente del agregado usando pinzas y similares. En este caso, dado que puede formarse un tejido neural distinto del tejido retiniano en la superficie de cada agregado, una parte del tejido neural recortado del agregado puede someterse a confirmación mediante la inmunotinción mencionada a continuación y similares, por lo que se puede confirmar que el tejido es un tejido retiniano.

El agregado obtenido en la etapa (3) puede contener un tejido retiniano y está sustancialmente libre de ectodermo de cabeza no neural. En un agregado que contiene un tejido retiniano y está sustancialmente libre de ectodermo de cabeza no neural, por ejemplo, se observa tejido positivo para Rx y no se observa tejido negativo para Rx en el exterior del mismo en las imágenes de inmunotinción de la sección congelada añadida mencionada anteriormente.

El agregado obtenido en la etapa (3) puede obtenerse mediante una etapa de cultivo del agregado formado en la etapa (2) en suspensión en un medio libre de suero o en un medio que contiene suero que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP a una concentración necesaria para inducción de la diferenciación en células retinianas, hasta que una célula que expresa el gen Rx comienza a aparecer para dar lugar a un agregado que comprende células progenitoras retinianas, y posteriormente se cultiva el agregado que contiene las células progenitoras retinianas en suspensión en un medio sin suero o en un medio que contiene suero hasta que se obtiene tejido retiniano se forma, obteniendo un agregado que comprende un tejido retiniano. Cuando el agregado que contiene las células progenitoras de la retina se cultiva posteriormente en suspensión en un medio sin suero o en un medio que contiene suero hasta que se forma un tejido retiniano, la concentración de la sustancia activante de la vía de transducción de señales de BMP en el medio para inducir el progenitor retiniano las células puede disminuirse de forma gradual o escalonada en una proporción de 40 - 60% cada 2 - 4 días, intercambiando el medio con un medio sin suero o con un medio que contenga suero, ambos libres de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP. El cultivo en suspensión de un agregado que contiene células progenitoras de la retina se puede realizar hasta que no menos del 20% (preferiblemente, no menos del 30%, no menos del 40%, no menos del 50%, no menos del 60%) de las células contenidas en el agregado expresan Chx10.

En la etapa (3), el agregado obtenido en la etapa (2), o un agregado obtenido cultivando el agregado obtenido en la etapa (2) en suspensión por el método mencionado anteriormente, puede someterse a cultivo por adhesión para formar un agregado adherido. El agregado adherido se cultiva en un estado adherido en un medio sin suero o en un medio que contiene suero que contiene un factor inductor de la diferenciación (p.ej., BMP4) a una concentración necesaria para la inducción de la diferenciación en una célula retiniana, hasta que comienza a aparecer un una célula que expresa el gen Rx para dar lugar a un agregado adherido que contiene células progenitoras de la retina. El agregado que contiene las células progenitoras de la retina se cultiva en un estado adherido en un medio sin suero o en un medio que contiene suero hasta que se forma un tejido retiniano, mediante lo cual que se obtiene un agregado adherido que contiene un tejido retiniano. El cultivo de adhesión del agregado adherido que contiene células progenitoras de la retina puede realizarse hasta que no menos del 10% (preferiblemente, no menos del 20%, no menos del 30%, no menos del 40%, no menos del 50%) de las células expresan Chx10.

Mediante el método de la presente invención, se pueden obtener células retinianas humanas y un tejido retiniano humano a partir de células madre pluripotentes con alta eficacia. Dado que el tejido retiniano obtenido por el método de la presente invención contiene neuronas (células neuronales) específicas de cada una de las capas retinianas, también es posible obtener varias células que constituyen un tejido retiniano, tales como célula fotorreceptora, célula horizontal, célula bipolar, célula amacrina, célula ganglionar retiniana o una célula progenitora/precursora de las mismas, y similares. Qué célula se obtuvo del tejido retiniano obtenido puede confirmarse mediante un método conocido per se, por ejemplo, mediante la expresión de un marcador celular.

El agregado obtenido que contiene un tejido retiniano también puede usarse directamente como reactivo para evaluar la toxicidad o la eficacia. Un agregado que contiene un tejido retiniano se somete a un tratamiento de dispersión (p.ej., tratamiento con tripsina/EDTA), y las células obtenidas se someten a selección utilizando FACS o MACS, mediante lo cual también se pueden obtener células constituyentes de tejido retiniano de alta pureza, por ejemplo, fotorreceptores de alta pureza células.

Se puede producir una estructura de tipo zona marginal ciliar mediante las siguientes etapa (A) y etapa (B) a partir del agregado celular que contiene un tejido retiniano, que se obtiene mediante el método de producción de la presente invención.

La estructura de tipo zona marginal ciliar se refiere a una estructura similar a una zona marginal ciliar. Los ejemplos de la "zona marginal ciliar (CMZ)" incluyen un tejido presente en la región límite del tejido retiniano (específicamente, la retina neural) y el epitelio pigmentario de la retina in vivo, que es una región que contiene células madre de tejido retiniano (células madre retinianas). La zona marginal ciliar también se denomina margen ciliar o margen retiniano, y la zona marginal ciliar, el margen ciliar y el margen retiniano son tejidos equivalentes. Se sabe que la zona marginal ciliar desempeña un papel importante en el suministro de células progenitoras retinianas o células diferenciadas a los tejidos retinianos, en el mantenimiento de la estructura del tejido retiniano, etc. Los ejemplos del gen marcador de la zona marginal ciliar incluyen el gen Rdh10 (positivo), el gen 0tx1 (positivo), el gen Zic1 (positivo), etc.

La etapa (A) comprende cultivar un agregado celular que comprende un tejido retiniano obtenido por el método de producción 2 de la presente descripción en el que las células positivas para Chx10 están presentes en una proporción de 20% o más y de 100% o menos del tejido retiniano, en un medio sin suero o en un medio que contiene suero, cada uno de los cuales contiene una sustancia activadora de la vía de la señal Wnt y/o una sustancia inhibidora de la vía de la señal de FGF solo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65.

Como cultivo preferible de la etapa (A) aquí, se puede mencionar el cultivo en suspensión.

Como medio libre de suero a utilizar en la etapa (A), se puede mencionar un medio libre de suero que es un medio basal suplementado con N2 o KSR. Más específicamente, se puede mencionar un medio libre de suero que es un medio DMEM/F-12 suplementado con suplemento N2 (N2, fabricado por Life Technologies). Como medio que contiene suero, se puede mencionar un medio que contiene suero que es un medio basal suplementado con suero fetal bovino.

Las condiciones de cultivo de la etapa (A), tales como la temperatura de cultivo y la concentración de CO2, se pueden ajustar de forma adecuada. La temperatura de cultivo está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente, por ejemplo, aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, preferiblemente, por ejemplo, aproximadamente 5%.

En la etapa (A), la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Wnt que debe estar contenida en un medio sin suero o en un medio que contiene suero cuando el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" mencionado anteriormente se cultiva en el medio, no está particularmente limitado siempre que pueda mejorar la transducción de señales mediada por Wnt. Los ejemplos específicos de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Wnt incluyen una proteína que pertenece a la familia Wnt (p.ej., Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), un receptor de Wnt, un agonista del receptor de Wnt, un inhibidor de GSK3 (p.ej., 6-bromoindirrubina-3'-oxima (BIO), CHIR99021, Kenpaullone), etc.

La concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Wnt que debe estar contenida en un medio sin suero o en un medio que contiene suero en la etapa (A), en el caso de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Wnt común tal como CHIR99021 está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 100 pM, preferiblemente, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 30 pM, más preferiblemente, por ejemplo, aproximadamente 3 pM.

La sustancia inhibidora de la vía de transducción de señales de FGF que debe estar contenida en un medio sin suero o en un medio que contiene suero en la etapa (A) cuando el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" mencionado anteriormente se cultiva en el medio, no está particularmente limitado siempre que pueda inhibir la transducción de señales mediada por FGF. Los ejemplos de sustancias inhibidoras de la vía de transducción de señales de FGF incluyen receptor de FGF, inhibidor del receptor de FGF (p.ej., SU-5402, AZD4547, BGJ398), sustancia inhibidora de la cascada de MAP quinasa (p.ej., inhibidor de MEK, inhibidor de MAPK, inhibidor de ERK), inhibidor de quinasa PI3, inhibidor de Akt, etc.

La concentración de la sustancia inhibidora de la vía de transducción de señales de FGF contenida en un medio sin suero o en un medio que contiene suero en la etapa (A) solo necesita ser una concentración a la que se pueda inducir la diferenciación de un agregado en una estructura ciliar tipo zona marginal. Por ejemplo, en el caso de SU-5402, se añade al medio a una concentración de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 100 pM, preferiblemente de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 30 pM, más preferiblemente de aproximadamente 5 pM.

"Cultivar solo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65" en la etapa (A) significa cultivar en la totalidad o una parte del período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65. Es decir, es suficiente el cultivo en la totalidad o parte del período (cualquier período) durante el cual el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" mencionado anteriormente en el sistema de cultivo está constituido por células que no expresan sustancialmente el gen RPE65. Empleando dicho cultivo, se puede obtener un agregado celular en el que no aparece una célula que exprese el gen RPE65.

Para determinar dicho período en particular, el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" mencionado anteriormente se usa como muestra, y la presencia o ausencia de expresión del gen RPE65 contenido en la muestra o el nivel del mismo puede medirse mediante un método de ingeniería genética general o mediante un método bioquímico. Específicamente, por ejemplo, la presencia o ausencia de expresión del gen RPE65 o el nivel del mismo puede examinarse sometiendo una criosección del "agregado celular que comprende un tejido retiniano'' mencionado anteriormente a un método de inmunotinción usando un anticuerpo contra la proteína RPE65.

Como un "período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65" en la etapa (A), por ejemplo, se puede mencionar un período durante el cual la proporción de células positivas para Chx10 presentes en el tejido retiniano mencionado anteriormente disminuye respecto al momento de inicio del cultivo del agregado celular mencionado anteriormente en un medio sin suero o en un medio que contiene suero, cada uno de los cuales contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Wnt y/o una sustancia inhibidora de la vía de transducción de señales de FGF, y entra dentro del rango de 30% a 0%. Como el "agregado celular en el que no aparece una célula que exprese el gen RPE65", se puede mencionar un agregado celular en el que las células positivas para Chx10 están presentes en el tejido retiniano mencionado anteriormente en una proporción del 30% al 0% del tejido.

Si bien el número de días del "período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65" en la etapa (A) varía según el tipo de sustancia activadora de la vía de transducción de señales Wnt y/o la sustancia inhibidora de la vía de transducción de señales FGF, el tipo de medio sin suero o medio que contiene suero, otras condiciones de cultivo, etc., es, por ejemplo, un plazo de 14 días. Más específicamente, cuando se usa un medio sin suero (por ejemplo, medio sin suero que es un medio basal suplementado con N2), el período mencionado anteriormente es preferiblemente, por ejemplo, un plazo de 10 días, más preferiblemente, por ejemplo, de 3 días a 6 días. Cuando se usa un medio que contiene suero (por ejemplo, medio que contiene suero que es un medio basal suplementado con suero fetal bovino), el período antes mencionado es preferiblemente, por ejemplo, un plazo de 12 días, más preferiblemente, por ejemplo, de 6 días a 9 días.

Luego, como etapa (B), el "agregado celular en el que no aparece una célula que exprese el gen RPE65", obtenido mediante el cultivo como se mencionó anteriormente, se cultiva en un medio sin suero o en un medio que contiene suero, cada uno libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Wnt.

Como cultivo preferible en la etapa (B), se puede mencionar el cultivo en suspensión.

Como medio libre de suero en la etapa (B), se puede mencionar un medio que es un medio basal suplementado con N2 o KSR. Como medio que contiene suero, se puede mencionar un medio que es un medio basal suplementado con suero fetal bovino. Más específicamente, se puede mencionar un medio que contiene suero que es un medio DMEM/F-12 suplementado con suero fetal bovino.

El medio sin suero anterior o el medio que contiene suero en la etapa (B) puede contener un factor de crecimiento conocido, un aditivo y una sustancia química que promueve el crecimiento, etc. Los ejemplos del factor de crecimiento conocido incluyen EGF, FGF, IGF, insulina, etc. Los ejemplos del aditivo que promueve el crecimiento incluyen el suplemento n 2 (Life Technologies), el suplemento B27 (Life Technologies), KSR, etc. Los ejemplos de la sustancia química que promueve el crecimiento incluyen retinoides (por ejemplo, ácido retinoico) y taurina.

Un período preferible para el cultivo en la etapa (B) es, por ejemplo, un período para el cultivo durante el cual la proporción de células positivas para Chx10 presentes en el tejido retiniano mencionado anteriormente aumenta respecto al momento del inicio del cultivo del agregado celular mencionado anteriormente en un medio sin suero o en un medio que contiene suero, libre cada uno de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Wnt, y alcanza el 30% o más.

Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura de cultivo, la concentración de CO2 y similares, en la etapa (B) se pueden ajustar apropiadamente. La temperatura de cultivo está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente, por ejemplo, aproximadamente 37°C. La concentración de CO2 está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, preferiblemente, por ejemplo, aproximadamente 5%.

Si bien el número de días de cultivo antes mencionados hasta que se obtiene "un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar" en la etapa (B) varía según el tipo de medio sin suero o de medio que contiene suero, de otras condiciones de cultivo, etc., es, por ejemplo, un plazo de 100 días. El número anterior de días de cultivo es preferiblemente, por ejemplo, de 20 días a 70 días, más preferiblemente, por ejemplo, de 30 días a 60 días.

En un "agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar" preparado mediante las etapas (A) y (B) mencionadas antes, un epitelio pigmentario retiniano y un tejido retiniano (específicamente, retina neural) están presentes adyacentes a la estructura de tipo zona marginal ciliar en el mismo agregado celular. La estructura se puede confirmar mediante observación microscópica, etc. Específicamente, por ejemplo, la presencia de una estructura de tipo zona marginal ciliar tal como una estructura epitelial que tiene un lado de retina grueso y un lado de epitelio de pigmento retiniano delgado, que se forma entre un tejido retiniano que tiene alta transparencia y un epitelio pigmentario retiniano que muestra pigmentación, puede confirmarse mediante observación microscópica. Además, la presencia de una estructura de tipo zona marginal ciliar se puede confirmar identificando células positivas para Rdh10, positivas para Otx1 o positivas para Zic1 con inmunotinción de una sección congelada de agregado.

Se puede producir una célula epitelial de pigmento retiniano mediante la siguiente etapa (C) a partir de un agregado celular que contiene un tejido retiniano obtenido mediante el método de producción de la presente invención y similares. Se puede producir una lámina epitelial de pigmento de la retina mediante la siguiente etapa (D) a partir de una célula epitelial de pigmento de la retina obtenida mediante la siguiente etapa (C).

La "célula epitelial de pigmento de la retina" en la presente invención significa una célula epitelial presente en el exterior del tejido retiniano neural en la retina in vivo. Los especialistas en la técnica pueden confirmar si se trata de una célula epitelial pigmentaria retiniana basándose, por ejemplo, en la expresión de un marcador celular (RPE65 (célula epitelial pigmentaria retiniana madura), Mitf (célula epitelial pigmentaria retiniana madura o juvenil) y similares), la presencia de gránulos de melanina, la morfología celular característica del polígono y similares.

Primero, en la etapa (C), se cultiva un agregado celular que contiene un tejido retiniano obtenido por el método de producción 2 de la presente descripción en suspensión en un medio libre de suero o en un medio que contiene suero libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP, pero que contiene una sustancia que activa la vía de transducción de señales Wnt para dar lugar a un agregado que contiene células epiteliales de pigmento retiniano.

Como medio libre de suero a utilizar en la etapa (C), se puede mencionar un medio libre de suero que es un medio basal suplementado con N2 o KSR. Más específicamente, se puede mencionar un medio libre de suero que es un medio DMEM/F-12 suplementado con suplemento N2 (Life Technologies). Como medio que contiene suero, se puede mencionar un medio que contiene suero que es un medio basal suplementado con suero fetal bovino.

El medio sin suero que se utilizará en la etapa (C) puede contener, además de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Wnt antes mencionada, la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Nodal/activina antes mencionada y/o la sustancia inhibidora de la vía de transducción de señales de FGF antes mencionada.

Un cultivo preferible en la etapa (C) es, por ejemplo, un cultivo en suspensión.

Se explica la etapa (D) en la que se dispersa el agregado obtenido en la etapa (C) y las células obtenidas se cultivan en estado adherido.

La etapa (D) se realiza en un plazo de 60 días, preferiblemente en un plazo de 30 días, más preferiblemente 3 días, después del inicio de la etapa (C).

Como medio libre de suero o medio que contiene suero a utilizar para el cultivo por adhesión en la etapa (D), se puede mencionar el medio antes mencionado. Para evitar una preparación complicada, se usa preferiblemente un medio sin suero suplementado con una cantidad adecuada de una alternativa de suero disponible comercialmente como KSR y similares (por ejemplo, un medio de mezcla 1:1 de DMEM/F-12 y Neurobasal suplementado con 1/2 x suplemento N2, 1/2 x suplemento B27 y 2-mercaptoetanol 100 pM). La cantidad de KSR a añadir al medio sin suero es, por ejemplo, generalmente de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%, preferiblemente de aproximadamente 2% a aproximadamente 20%, en el caso de una célula derivada de una célula iPS humana.

En la etapa (D), es preferible cultivar células en el medio sin suero mencionado anteriormente o en el medio que contiene suero que contiene una sustancia inhibidora de ROCK.

En la etapa (D), es más preferible cultivar células en un medio sin suero o en un medio que contenga suero que además contenga una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en una sustancia que activa la vía de transducción de señales Wnt, una sustancia inhibidora de la vía de transducción de señales de FGF, una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de activina y una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP.

La sustancia activadora de la vía de transducción de señales de activina es una sustancia capaz de potenciar una señal mediada por activina. Los ejemplos de la sustancia activadora de la ruta de transducción de señales de la activina incluyen proteínas que pertenecen a la familia de las activinas (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina AB y similares), receptor de activina y agonista del receptor de activina.

La concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de activina que se utilizará en la etapa (D) puede ser cualquiera siempre que se pueda formar eficazmente una lámina uniformada de células epiteliales pigmentarias de la retina. Por ejemplo, la activina A recombinante humana/de ratón/de rata (R&D systems, n° 338-AC) se añade a una concentración de aproximadamente 1 ng/mL a aproximadamente 10 pg/mL, preferiblemente de aproximadamente 10 ng/mL a aproximadamente 1 pg/mL, más preferiblemente alrededor de 100 ng/mL.

Se añade una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de activina, por ejemplo, en un plazo de 18 días, preferiblemente el día 6, desde el inicio de la etapa (D).

En la etapa (D), el cultivo por adhesión se realiza preferiblemente en un recipiente de cultivo cuya superficie se trata con un sustrato de cultivo. Como sustrato de cultivo a usar para tratar el recipiente de cultivo en la etapa (D), se puede mencionar un sustrato de cultivo celular que permite el cultivo por adhesión de células derivadas de agregados y la formación de una lámina epitelial de pigmento retiniano.

3. Método para evaluar la toxicidad o la eficacia

Dado que un tejido retiniano o las células retinianas (por ejemplo, célula fotorreceptora, célula progenitora de la retina, neurona específica de la capa de la retina) producidos por el método de producción de la presente invención son útiles como material para el estudio de enfermedades, o para el descubrimiento de fármacos en un cribado de un medicamento para tratar una enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano o de células retinianas, o en la evaluación de la toxicidad, se puede utilizar como reactivo para evaluar la toxicidad o la eficacia de una sustancia de ensayo. Por ejemplo, las células iPS se producen a partir de un paciente humano con una enfermedad debida a un trastorno del tejido retiniano, particularmente una enfermedad hereditaria, y utilizando las células iPS, mediante el método de la presente invención se produce un tejido retiniano o células retinianas (p.ej., célula fotorreceptora, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana). El tejido retiniano o las células retinianas pueden reproducir el trastorno del tejido retiniano que causa la enfermedad del paciente in vitro. Por lo tanto, la presente descripción proporciona un método para evaluar la toxicidad o la eficacia de una sustancia de ensayo, que comprende poner en contacto la sustancia de ensayo con un tejido retiniano o con células retinianas (por ejemplo, célula fotorreceptora, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana) producidos mediante el método de producción de la presente invención, y detectar una influencia de la sustancia en las células o tejidos.

Por ejemplo, se cultiva un tejido retiniano o células retinianas (por ejemplo, célula fotorreceptora, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana) que presentan un trastorno particular (por ejemplo, trastorno hereditario), que se producen mediante el método de producción de la presente invención, en presencia o ausencia (control negativo) de una sustancia de ensayo. A continuación, se compara la gravedad del trastorno del tejido retiniano o de las células retinianas tratadas con la sustancia de ensayo con la del control negativo. Como resultado, se puede seleccionar una sustancia de ensayo que reduzca la gravedad del trastorno como sustancia candidata para un medicamento para tratar la enfermedad resultante del trastorno. Por ejemplo, se puede buscar como sustancia candidata para un producto farmacéutico una sustancia de ensayo que mejore la actividad fisiológica (por ejemplo, promoción de la supervivencia o maduración) de las células retinianas producidas mediante el método de producción de la presente invención. Alternativamente, de acuerdo con el método de producción de la presente invención, las células retinianas se preparan induciendo la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas que se preparan a partir de una célula somática que tiene una mutación genética que causa un trastorno particular, tal como una enfermedad acompañada de un trastorno de la retina, y similares.

Se puede buscar un candidato de una sustancia de ensayo eficaz como fármaco terapéutico o como fármaco profiláctico para el trastorno basándose en si las células retinianas tratadas con una sustancia de ensayo muestran el trastorno mencionado anteriormente, a modo de índice.

Para la evaluación de la toxicidad, se cultiva un tejido retiniano o células retinianas (p.ej., célula fotorreceptora, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana) producidos mediante el método de producción de la presente invención, en presencia o ausencia (control negativo) de una sustancia de ensayo. A continuación, se compara la gravedad de la toxicidad sobre el tejido retiniano o las células retinianas tratadas con la sustancia de ensayo con la del control negativo. Como resultado, una sustancia de ensayo que ejerce toxicidad en comparación con el control negativo puede juzgarse como una sustancia que tiene toxicidad para el tejido retiniano o las células retinianas (por ejemplo, célula fotorreceptora, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana).

Es decir, la presente descripción abarca un método para evaluar la toxicidad que comprende las siguientes etapas:

(etapa 1) una etapa de cultivo de tejido retiniano o de células retinianas producidas mediante el método de producción de la presente invención en condiciones de cultivo viables durante un tiempo dado en presencia de una sustancia de ensayo, y medir la gravedad de la lesión celular,

(etapa 2) una etapa de cultivo de tejido retiniano o de células retinianas producidas mediante el método de producción de la presente invención en condiciones de cultivo viables durante un tiempo dado en ausencia de la sustancia de ensayo o en presencia de un control positivo, y medir la gravedad de la lesión celular,

(etapa 3) una etapa de evaluación de la toxicidad de la sustancia de ensayo de la etapa 1, basado en la diferencia en los resultados medidos entre (etapa 1) y (etapa 2).

Tal como se usa en el presente documento, "en ausencia de una sustancia de ensayo" incluye añadir solo un medio de cultivo o un disolvente usado para disolver la sustancia de ensayo en lugar de añadir una sustancia de ensayo. Además, "control positivo" significa un compuesto conocido que tiene toxicidad.

Los ejemplos del método para medir la gravedad de la lesión celular incluyen un método para medir el número de células viables, por ejemplo, un método para medir la cantidad de ATP intracelular, un método para medir el número de células viables mediante tinción celular (p.ej., tinción del núcleo) y observación de la morfología y similares.

En la etapa 3, como método para evaluar la toxicidad de una sustancia de ensayo, se comparan el valor de medición en de la etapa 1 y el valor de medición del control negativo de la etapa 2, y cuando la gravedad de la lesión celular de la etapa 1 es alta, se puede considerar que la sustancia de ensayo presenta toxicidad. Adicionalmente, se comparan el valor de medición de la etapa 1 y el valor de medición del control positivo de la etapa 2, y cuando la gravedad de la lesión celular de la etapa 1 es igual o superior, se puede considerar que la sustancia de ensayo presenta toxicidad.

4. Composición farmacéutica

La presente descripción proporciona una composición farmacéutica que contiene una cantidad eficaz de tejido retiniano o de células retinianas (por ejemplo, célula fotorreceptora, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana) producidos mediante el método de producción de la presente invención.

La composición farmacéutica contiene una cantidad eficaz de tejido retiniano o de células retinianas (por ejemplo, célula fotorreceptora, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana) producidos mediante el método de producción de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como vehículo farmacéuticamente aceptable, se puede utilizar un disolvente acuoso fisiológico (solución salina, tampón, medio sin suero, etc.). Cuando sea necesario, en una terapia de trasplante, un medicamento que contiene un tejido o células a trasplantar puede contener un conservante, un estabilizador, un agente reductor, un agente isotonizante, etc., usados convencionalmente.

La composición farmacéutica de la presente descripción se puede producir como una suspensión suspendiendo tejidos retinianos o células retinianas producidas mediante el método de producción 1 o 2 de la presente descripción en un disolvente acuoso fisiológico apropiado. Cuando sea necesario, a la composición puede añadirse un crioconservante, puede criopreservarse, descongelarse para su uso, lavarse con tampón y usarse en una terapia de trasplante.

Un tejido retiniano obtenido mediante el método de producción de la presente invención también puede cortarse en un tamaño apropiado con pinzas y similares para obtener una preparación de lámina.

Las células obtenidas mediante el método de producción de la presente invención también pueden someterse a cultivo por adhesión en la etapa (3) para la inducción de diferenciación para formar células en forma de lámina para producir una preparación en lámina.

La composición farmacéutica de la presente descripción es útil como fármaco terapéutico para una enfermedad debida a un trastorno de un tejido neural o de células neurales (por ejemplo, tejido retiniano, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana).

5. Fármaco terapéutico

Un tejido retiniano o células retinianas (por ejemplo, célula fotorreceptora, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana) producidos mediante el método de producción de la presente invención, son útiles para una terapia de trasplante para una enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano o de células retinianas. Por tanto, la presente descripción proporciona un medicamento para tratar una enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano o de células retinianas, que contiene un tejido retiniano o células retinianas (por ejemplo, célula fotorreceptora, célula progenitora retiniana, neurona específica de la capa retiniana) producidos mediante el método de producción de la presente invención. Un tejido retiniano o células retinianas (incluyendo células progenitoras retinianas, neuronas específicas de la capa retiniana) producidos mediante el método de producción de la presente invención pueden usarse como medicamento para tratar la enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano o de células retinianas, o para complementar el sitio dañado correspondiente en un estado dañado de un tejido retiniano. Una enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano o de células retinianas, y un estado dañado de un tejido retiniano, se pueden tratar trasplantando un tejido retiniano o células retinianas producidas mediante el método de producción de la presente invención a un paciente con una enfermedad debida a un trastorno de un tejido retiniano o de las células retinianas, o un estado dañado de un tejido retiniano, que requiere un trasplante, para complementar las células retinianas o el propio tejido retiniano desordenado. Los ejemplos de la enfermedad debida a un trastorno del tejido o de las células de la retina incluyen desnaturalización de la retina, degeneración pigmentaria de la retina, degeneración macular relacionada con la edad, intoxicación por mercurio orgánico, retinopatía por cloroquina, glaucoma, retinopatía diabética, retinopatía de recién nacidos, y similares.

En la terapia de trasplante, el rechazo debido a la diferencia en los antígenos de histocompatibilidad a menudo plantea un problema. Sin embargo, el problema puede resolverse utilizando células madre pluripotentes (por ejemplo, células madre pluripotentes inducidas) establecidas a partir de las células somáticas del receptor del trasplante. Es decir, las células madre pluripotentes (p.ej., células madre pluripotentes inducidas) establecidas a partir de las células somáticas del receptor pueden usarse como células madre pluripotentes en el método de la presente invención, y se produce un tejido neural o células neurales, que son inmunológicamente propias para el receptor, y se trasplantan al receptor.

Además, se puede producir un tejido neural o una célula neural alogénica a partir de una célula madre pluripotente (p.ej., célula madre pluripotente inducida) establecidos a partir de una célula somática de otros individuos que sean inmunológicamente compatibles con el receptor (p.ej., compatibles de tipo HLA y tipo MHC ) y trasplantarlos al receptor.

[Ejemplos]

La presente invención se explica en detalle a continuación haciendo referencia a Ejemplos y Ejemplos farmacológicos, que no deben interpretarse como limitativos.

Ejemplo comparativo 1: Ejemplo de diferenciación de células iPS humanas sin utilizar una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh en la etapa 2

Se cultivaron células iPS humanas (cepa 1231A3, obtenida de la Universidad de Kyoto) en condiciones libres de alimentador de acuerdo con el método descrito en ''Scientific Reports, 4, 3594 (2014)". Como medio sin alimentador, se usó medio StemFit (AK03, fabricado por Ajinomoto Co., Inc.), y como estructura sin alimentador, se usó Laminina 511-E8 (fabricada por Nippi, Inc.).

Como operación de cultivo de mantenimiento específica, las células iPS humanas subconfluentes (cepa 1231A3) se lavaron primero con PBS y se dispersaron en células individuales utilizando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies). A continuación, las células iPS humanas antes mencionadas dispersas en células individuales se sembraron en una placa de cultivo de plástico recubierta con laminina 511-E8, y se realizó un cultivo sin alimentador en medio StemFit en presencia de Y27632 (sustancia inhibidora de ROCK, 10 gM). Cuando se usó una placa de 6 pocillos (fabricada por Iwaki, para cultivo celular, área de cultivo 9,4 cm2) como el plato de cultivo de plástico mencionado anteriormente, el número de células en placa para las células iPS humanas mencionadas anteriormente dispersas en células individuales se ajustó a 6 x 103. Un día después de la siembra, se cambió la cantidad total del medio con medio StemFit libre de Y27632. Posteriormente, una vez en 1 - 2 días, se cambió la cantidad total del medio por medio StemFit libre de Y27632. A continuación, 6 días después de la siembra, las células se cultivaron hasta ser subconfluentes (60% del área de cultivo cubierta con células).

Las células iPS humanas subconfluentes anteriores se trataron con una disolución de dispersión celular utilizando TrypLE Select (Life Technologies) y se dispersaron adicionalmente en células individuales mediante una operación de pipeteo. A partir de entonces, las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se suspendieron en 100 gL de un medio sin suero en una placa de cultivo de 96 pocillos sin adhesivo celular (placa de fondo PrimeSurface 96V, SUMITOMO BAKELITE) a 1,2 x 104 células por pocillo y sometidas a cultivo en suspensión a 37°C, 5% de CO2. Como medio libre de suero (gfCDM KSR) para el mismo, se usó una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 gM, 1 x concentrado de lípidos químicamente definido. Al comienzo del cultivo en suspensión (el día 0 después del comienzo del cultivo en suspensión, comienzo de la etapa 2), se añadió Y27632 (concentración final 20 gM) al medio sin suero anterior. El día 2 después del inicio del cultivo en suspensión, se formaron agregados celulares (etapa 2 completada, e inicio de la etapa 3). El día 3 después del inicio del cultivo en suspensión, se añadió un medio sin suero (50 gL) sin Y27632.

El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad del medio por un medio libre de Y27632 y que contenía o no BMP4 recombinante humana (fabricada por R&D) para ajustar la concentración final de BMP4 recombinante humana exógena a 1,5 nM. (55 ng/mL, Fig. 1B) o para dar un medio libre de BMP4 recombinante humana exógena (Fig. 1A). Como operación de cambio parcial de medio, se descartó medio volumen del medio en el recipiente de cultivo, es decir 75 gL, se añadió el medio sin suero fresco anterior (75 gL) para ajustar la cantidad total de medio a 150 gL. A continuación, se cambió la mitad de la cantidad del medio con el medio exento de suero anterior libre de Y27632 y BMP4 recombinante humana una vez cada 2 a 4 días. Los agregados celulares así preparados se sometieron a observación de campo brillante bajo un microscopio invertido (BIOREVO fabricado por KEYENCE) el día 19 después del inicio del cultivo en suspensión (Fig. 1A, B). Como resultado, se observó que, tanto en condiciones que implican la adición de BMP4 recombinante humana (Fig.1 B) como en condiciones que no implican la adición (Fig.1 A), no menos del 90% de los agregados celulares se colapsaron, y la eficiencia de formación de tejido neural fue baja.

Ejemplo 1: Ejemplo de formación de agregado celular, tejido neural y tejido retiniano preparados a partir de células iPS humanas cultivadas usando StemFit como medio sin alimentador en la etapa 1, usando una sustancia activadora de la vía de transducción Shh en la etapa 2

Se cultivaron células iPS humanas (cepa 1231A3, obtenida de la Universidad de Kyoto) en condiciones libres de alimentador de acuerdo con el método descrito en "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)". Como medio sin alimentador, se usó medio StemFit (AK03, fabricado por Ajinomoto Co., Inc.), y como estructura sin alimentador, se usó Laminina 511-E8 (fabricada por Nippi, Inc.). El cultivo de mantenimiento se realizó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo Comparativo 1.

Las células iPS humanas subconfluentes así preparadas se trataron con una disolución de dispersión celular utilizando TrypLE Select (Life Technologies) y se dispersaron adicionalmente en células individuales mediante una operación de pipeteo. A partir de entonces, las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se suspendieron en 100 gL de un medio sin suero en una placa de cultivo de 96 pocillos sin adhesivo celular (placa de fondo PrimeSurface 96V, SUMITOMO BAKELITE) a 1,2 x 104 células por pocillo y sometidas a cultivo en suspensión a 37°C, 5% de CO2. Como medio libre de suero (gfCDM KSR) para el mismo, se usó una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 gM, 1 x concentrado de lípidos químicamente definido.

Al inicio del cultivo en suspensión (el día 0 después del inicio del cultivo en suspensión, inicio de la etapa 2), se añadieron Y27632 (concentración final 20 pM) y SAG (300 nM) como sustancias activadoras de la vía de transducción de señales Shh al medio anterior libre de suero. El día 2 después del inicio del cultivo en suspensión, se formaron agregados celulares (etapa 2 completada, inicio de la etapa 3). El día 3 después del inicio del cultivo en suspensión, se añadió un medio sin suero (50 pL) libre de Y27632 y SAG. El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad del medio por un medio libre de Y27632 y que contenía o no BMP4 recombinante humana (fabricado por R&D) para ajustar la concentración final de BMP4 recombinante humana exógena a 1,5 nM. (55 ng/mL, Fig. 1D) o para dar un medio libre de BMP4 recombinante humana exógena (Fig. 1C). Como operación de cambio parcial de medio, se descartó medio volumen del medio en el recipiente de cultivo, es decir 75 pL, se añadió el medio sin suero fresco anterior (75 pL) para ajustar la cantidad total de medio a 150 pL. A continuación, se cambió la mitad de la cantidad del medio con el medio sin suero anterior libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana una vez cada 2 a 4 días. Los agregados celulares así preparados se sometieron a observación de campo brillante bajo un microscopio invertido (BIOREVO fabricado por KEYENCE) el día 19 después del inicio del cultivo en suspensión (Fig. 1C, D). Como resultado, tanto en condiciones que implicaban la adición de BMP4 recombinante humana (Fig. 1D) como en condiciones que no implicaban la adición de la misma (Fig. 1C), se mantuvieron los agregados celulares y se observó la estructura neuroepitelial. Es decir, se observó que la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh proporciona una buena forma de agregado y mejora la eficiencia de formación de tejido neural (Fig. 1A-D). A partir de los resultados se observó que, mediante la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh al comienzo del cultivo en suspensión en la etapa 2, se puede producir un tejido neural de manera eficiente a partir de células iPS humanas sometidas a cultivo sin alimentador.

Los agregados celulares anteriores el día 19 después del comienzo del cultivo en suspensión se fijaron cada uno con paraformaldehído al 4% para dar lugar a criosecciones. Estas criosecciones fueron inmunoteñidas para Chx10 (anticuerpo anti-Chx10, fabricado por Exalpha, oveja), que es uno de los marcadores de tejido retiniano, o Rx (anticuerpo anti-Rx, fabricado por TAKARA, conejillo de indias), que es uno de los marcadores de tejido retiniano. Para juzgar si el marcador anterior es positivo en el análisis de inmunotinción, se tomó como positiva una intensidad de fluorescencia que no sea menos de 2 veces mayor que la del fondo. Como resultado, se encontró que, en condiciones que implican la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh en el día 0 del cultivo en suspensión y sin adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP el día 6 del cultivo en suspensión, la proporción de células positivas para Rx en el total de células fue inferior al 3% y la proporción de células positivas para Chx10 también fue inferior al 3% (Fig. 2A, C). Por otro lado, se encontró que, en condiciones que implican la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh en el día 0 del cultivo en suspensión y la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP el día 6 del cultivo en suspensión, la proporción de células positivas para Rx en el total de células no fue inferior al 60%, y la proporción de células positivas para Chx10 tampoco fue inferior al 60% (Fig. 2B, D). Además, a partir del análisis de secciones continuas, se sugirió que, en un tejido neural que tiene una proporción alta (no menos del 95%) de células positivas para Chx10, Rx también es fuertemente positivo (Fig. 2B, D). A partir de estos resultados, se observó que se puede producir de manera eficiente un tejido retiniano a partir de células iPS humanas cultivadas sin alimentador (en lo sucesivo, a veces denominadas células iPS humanas sin alimentador), añadiendo una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh al inicio del cultivo en suspensión de la etapa 2, y añadiendo una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP como sustancia de inducción de diferenciación durante el cultivo en suspensión de la etapa 3.

Ejemplo 2: Ejemplo de producción de tejido neural a partir de células iPS humanas utilizando Essential 8 como medio sin alimentador en la etapa 1 y utilizando una sustancia activadora de la vía de transducción Shh al inicio del cultivo en suspensión

Se cultivaron células iPS humanas (cepa 1231A3, obtenida de la Universidad de Kyoto) en condiciones libres de alimentador de acuerdo con el método descrito en "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)". Como medio sin alimentador, se usó medio Essential 8 (fabricado por Life Technologies), y como estructura sin alimentador, se usó Laminina 511-E8 (fabricada por Nippi, Inc.).

Como operación de cultivo de mantenimiento específica, las células iPS humanas subconfluentes (cepa 1231A3) se lavaron primero con PBS y se dispersaron en células individuales utilizando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies). Posteriormente, las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se sembraron en una placa de cultivo de plástico recubierta con laminina 511-E8 y se sometieron a cultivo sin alimentador en medio Essential 8 en presencia de Y27632 (sustancia inhibidora de ROCK, 10 pM). Cuando se usó una placa de 6 pocillos (fabricada por Iwaki, para cultivo celular, área de cultivo 9,4 cm2) como la placa de cultivo de plástico anterior, el número de células en placa para las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se ajustó a 6 x 103. Un día después de la siembra, se cambió la cantidad total del medio por medio Essential 8 libre de Y27632. Posteriormente, una vez en 1-2 días, se cambió la cantidad total del medio por medio Essential 8 libre de Y27632. Posteriormente, las células se cultivaron hasta subconfluencia (60% del área de cultivo cubierta con células) 6 días después de la siembra.

Las células iPS humanas subconfluentes así preparadas se trataron con la disolución de dispersión celular utilizando TrypLE Select (Life Technologies), se dispersaron adicionalmente en células individuales mediante una operación de pipeteo, y las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se suspendieron en 100 pL de un medio libre de suero a 1,2 x 104 células por pocilio de una placa de cultivo de 96 pocilios sin adhesivo celular (placa de fondo PrimeSurface 96V, fabricada por SUMITOMO BAKELITE). Posteriormente, las células se sometieron a cultivo en suspensión a 37°C, 5% de CO2. Como medio libre de suero (gfCDM KSR), se usó un medio libre de suero que es una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 pM, 1 x concentrado de lípidos químicamente definido. En el momento del inicio del cultivo en suspensión (día 0 después del inicio del cultivo en suspensión, inicio de la etapa 2), se usó un medio sin suero suplementado con Y27632 (concentración final 20 pM) (Fig. 3A-D). De éstos, en determinadas condiciones, se utilizó un medio sin suero suplementado con Y27632 (concentración final 20 pM) y SAG (300 nM) como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh (Fig. 3C, D). El día 2 después del inicio del cultivo en suspensión, se formaron agregados celulares en ambas condiciones, con y sin adición de SAG (etapa 2 completada, inicio de la etapa 3). El día 3 después del inicio del cultivo en suspensión, se añadió un medio sin suero (50 pL) libre de Y27632 y SAG. El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad del medio por un medio libre de Y27632 y SAG, y que contenía o no BMP4 recombinante humana (fabricada por R&D) para establecer la concentración final de BMP4 recombinante humana exógena en 1,5 nM (Fig. 3B, D) o para producir un medio libre de BMP4 recombinante humana exógena (Fig. 3A, C). A continuación, se cambió la mitad de la cantidad de medio por el medio sin suero anterior libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana una vez cada 2 a 4 días. Los agregados celulares así preparados el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión se sometieron a observación de campo brillante bajo un microscopio invertido (BIOREVO fabricado por KEYENCE) (Fig. 3A-D). Como resultado, se observó que no menos del 80% de los agregados celulares se colapsaron y la eficiencia de formación del tejido neural fue baja tanto en condiciones de no adición de SAG al inicio del cultivo en suspensión como de no adición de BMP4 durante el cultivo en suspensión (Condición 1, Fig. 3A), como en condiciones de no adición de SAG al comienzo del cultivo en suspensión y con la adición de BMP4 durante el cultivo en suspensión (Condición 2, Fig.3B). Por otro lado, se encontró que los agregados celulares se mantuvieron y la estructura neuroepitelial se formó de manera eficiente en condiciones de adición de SAG al comienzo del cultivo en suspensión y de no adición de BMP4 durante el cultivo en suspensión (Condición 3, Fig. 3C), y en condiciones de adición de s Ag al comienzo del cultivo en suspensión y de adición de BMP4 durante el cultivo en suspensión (Condición 4, Fig. 3D).

Además, se observaron las formas de los agregados plurales el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión y se categorizaron en buena forma (Fig. 4 barra negra, buenos agregados, que contienen muchos neuroepitelios), forma de nivel moderado (Fig. 4 barra gris, buena agregados pero baja proporción de neuroepitelio), y mala forma (Fig. 4 barra blanca, agregados colapsados, libres de neuroepitelio) y se cuantificaron. Como resultado, bajo la Condición 1 (Fig. 3A), la proporción de buena forma fue menos del 3% y la proporción de mala forma fue del 71% (Fig. 4, Control). Por el contrario, en la Condición 3 (Fig. 3C), la proporción de buena forma fue del 93% y la proporción de la mala forma fue del 6% (Fig. 4, SAG).

A partir de estos resultados, se observó que, con respecto a las células iPS humanas sin alimentador cultivadas en medio Essential 8, la eficiencia de la formación de tejido neural se mejora añadiendo la sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh al comienzo del cultivo en suspensión.

Ejemplo 3: Ejemplo de producción de tejido retiniano a partir de células iPS humanas mediante el uso de Essential 8 como medio sin alimentador en la etapa 1 y el uso de una sustancia activadora de la vía de transducción Shh al inicio del cultivo en suspensión

Se cultivaron células iPS humanas (cepa 201B7, obtenida de la Universidad de Kyoto) sin alimentador de acuerdo con el método descrito en "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)". Como medio sin alimentador, se usó medio Essential 8 (fabricado por Life Technologies), y como estructura sin alimentador, se usó Laminina 511-E8 (fabricada por Nippi, Inc.).

Como operación de cultivo de mantenimiento específica, las células iPS humanas subconfluentes (cepa 201B7) se lavaron primero con PBS y se dispersaron en células individuales utilizando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies). Posteriormente, las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se sembraron en una placa de cultivo de plástico recubierta con laminina 511-E8 y se sometieron a cultivo sin alimentador en medio Essential 8 en presencia de Y27632 (sustancia inhibidora de ROCK, 10 pM). Cuando se usó una placa de 6 pocillos (fabricada por Iwaki, para cultivo celular, área de cultivo 9,4 cm2) como la placa de cultivo de plástico anterior, el número de células en placa para las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se ajustó a 6 x 103. Un día después de la siembra, se cambió la cantidad total del medio por medio Essential 8 libre de Y27632. A partir de entonces, una vez en 1 -2 días, la cantidad total de medio se cambió por medio Essential 8 libre de Y27632. Posteriormente, las células se cultivaron hasta subconfluencia (60% del área de cultivo cubierta con células) 6 días después de la siembra.

Las células iPS humanas subconfluentes así preparadas se trataron con la disolución de dispersión celular usando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies), se dispersaron adicionalmente en células individuales mediante una operación de pipeteo, y las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se suspendieron en 100 pL de un medio sin suero a 1,2 x 104 células por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos sin adhesivo celular (placa de fondo PrimeSurface 96V, SUMITOMO BAKELITE). Posteriormente, las células se sometieron a cultivo en suspensión a 37°C, 5% de CO2. Como medio libre de suero (gfCDM KSR), se usó un medio libre de suero que es una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 pM, 1 x concentrado de lípidos químicamente definido. En el momento del inicio del cultivo en suspensión (día 0 después del inicio del cultivo en suspensión, inicio de la etapa 2), se usó un medio sin suero suplementado con SAG (concentración final 300 pM) como sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh y Y27632 (20 pM) (Fig. 5A-D). El día 2 después del inicio del cultivo en suspensión, se formaron agregados celulares. El día 3 después del inicio del cultivo en suspensión, se añadió un medio sin suero (50 pL) libre de Y27632 y SAG. El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad del medio por un medio libre de Y27632 y SAG y que contenía o no BMP4 recombinante humana (fabricada por R&D) para ajustar la concentración final de BMP4 recombinante humana exógena a 1,5 nM (55 ng/mL). A continuación, se cambió la mitad de la cantidad de medio por el medio sin suero anterior libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana una vez cada 2 a 4 días. Los agregados celulares así preparados se sometieron a observación de campo brillante bajo un microscopio invertido (BIOREVO fabricado por KEYENCE) el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión. Como resultado, se encontró que se formó neuroepitelio.

Los agregados celulares el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión se fijaron con paraformaldehído al 4% para producir secciones congeladas. Estas secciones congeladas fueron inmunoteñidas para Chx10 (anticuerpo anti-Chx10, Exalpha, oveja), que es uno de los marcadores de tejido retiniano, o Rx (anticuerpo anti-Rx, fabricado por TAKARA, conejillo de indias), que es uno de los marcadores de tejido retiniano. Como resultado, se observó que, en condiciones que implican la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh en el día 0 del cultivo en suspensión y la no adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP en el día 6 del cultivo en suspensión, la proporción de células positivas para Rx en el total de células no fue superior al 3%, y la proporción de células positivas para Chx10 tampoco fue superior al 3% (Fig. 5A, C). Por otro lado, se encontró que, en condiciones que implican la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh el día 0 del cultivo en suspensión y la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP el día 6 del cultivo en suspensión, la proporción de células positivas para Rx en el total de células no fue inferior al 40%, y la proporción de células positivas para Chx10 tampoco fue inferior al 40% (Fig. 5B, D). Además, se sugirió a partir del análisis de secciones en serie que, en un tejido neural que tiene una proporción alta (no menos del 95%) de células positivas para Chx10, Rx también es fuertemente positivo (Fig. 5B, D). A partir de estos resultados, se descubrió que se puede producir un tejido retiniano de manera eficiente a partir de células iPS humanas sin alimentador, mediante la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh al comienzo del cultivo en suspensión en la etapa 2 y la adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP, como sustancia de inducción de diferenciación durante el cultivo en suspensión de la etapa 3.

Ejemplo 4: Ejemplo de producción de tejido retiniano a partir de células iPS humanas mediante el uso de una sustancia activadora de la vía de transducción Shh en la etapa 2 y mediante el uso de BMP4 en la etapa 3

Las células iPS humanas (cepa 1231A3, obtenida de la Universidad de Kyoto) se sometieron a cultivo sin alimentador de acuerdo con el método descrito en "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)". Como medio sin alimentador, se usó medio StemFit (AK03, fabricado por Ajinomoto Co., Inc.), y como estructura sin alimentador, se usó Laminina 511-E8 (fabricada por Nippi, Inc.).

Como operación de cultivo de mantenimiento específica, las células iPS humanas subconfluentes (cepa 1231A3) se lavaron primero con PBS y se dispersaron en células individuales utilizando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies). A continuación, las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se sembraron en una placa de cultivo de plástico recubierta con laminina 511-E8 y se sometieron a cultivo sin alimentador en medio StemFit en presencia de Y27632 (sustancia inhibidora de la ruta ROCK, 10 pM). Cuando se usó una placa de 6 pocillos (fabricada por Iwaki, para cultivo celular, área de cultivo 9,4 cm2) como la placa de cultivo de plástico anterior, el número de células en placa para las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se ajustó a 6 x 103. Un día después de la siembra, se cambió el medio por medio StemFit libre de Y27632. Posteriormente, una vez en 1-2 días, se cambió el medio por medio StemFit libre de Y27632. A partir de entonces, las células se cultivaron hasta subconfluencia (60% del área de cultivo cubierta con células) 6 días después de la siembra.

Las células iPS humanas subconfluentes anteriores se dispersaron en células individuales utilizando TrypLE Select (Life Technologies), y las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se suspendieron en 100 pL de un medio sin suero a 1,2 x 104 células por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos sin adhesivo celular (placa de fondo PrimeSurface 96V, SUMITOMO BAKELITE), y se sometieron a cultivo en suspensión a 37°C, 5% de CO2. Como medio libre de suero (gfCDM KSR), se usó un medio libre de suero que es una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1 -monotioglicerol 450 pM, 1 x concentrado de lípidos químicamente definido. En el momento del inicio del cultivo en suspensión (día 0 después del inicio del cultivo en suspensión, inicio de la etapa 2), se añadieron Y27632 (concentración final 20 pM) y SAG (concentración final 300 nM) al medio sin suero anterior. El día 2 después del inicio del cultivo en suspensión, se formaron agregados celulares (etapa 2 completada, inicio de la etapa 3).

Aquí, como etapa 3, el cultivo se realizó bajo las siguientes condiciones, Condición 1 y Condición 2.

En la Condición 1 (+ BMP, d3), se añadió un medio (50 pL) libre de Y27632 y SAG y que contenía BMP4 recombinante humana (fabricada por R&D) el día 3 después del inicio del cultivo en suspensión, de tal modo que la concentración final de la BMP4 recombinante humana exógena se ajustó a 1,5 nM (cantidad total de medio 150 pL). El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad del medio por el medio sin suero anterior libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana.

En la Condición 2 (+ BMP, d6), se añadió un medio sin suero (50 pL) libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana el día 3 después del inicio del cultivo en suspensión. El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad del medio por un medio libre de Y27632 y SAG y que contenía BMP4 recombinante humana (fabricada por R&D) de tal modo que la concentración final de la BMP4 recombinante humana exógena se ajustó a 1,5 nM.

El día 6 o más después del inicio del cultivo en suspensión de las células de la Condición 1 y la Condición 2, se cambió la mitad de la cantidad del medio por el medio sin suero anterior libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana una vez cada 2-4 días. El día 18 después del inicio del cultivo en suspensión, se observó la forma bajo un microscopio invertido. Se observó que los agregados celulares se mantenían, y que se formaba un tejido neural bajo la Condición 1 y la Condición 2.

Los agregados celulares así preparados el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión, producidos añadiendo SAG en la etapa 2 a partir de células iPS sin alimentador como material de partida, se fijaron con paraformaldehído al 4% para producir secciones congeladas. Estas secciones congeladas fueron inmunoteñidas para Chx10 (anticuerpo anti-Chx10, Exalpha, oveja), que es uno de los marcadores de tejido retiniano, o para Rx (anticuerpo anti-Rx, fabricado por TAKARA, conejillo de indias), que es uno de los marcadores de tejido retiniano. Estas secciones inmunoteñidas se observaron bajo un microscopio de fluorescencia invertido. Como resultado, se descubrió que la proporción de células positivas para Rx en el total de células era aproximadamente del 40%, y la proporción de células positivas para Chx10 también era aproximadamente del 40%, tanto para las células de la Condición 1 como las de la Condición 2 (Fig. 6). Además, a partir del análisis de las secciones en serie, se encontró que Rx también es fuertemente positivo en tejidos neurales que tienen una alta proporción de células positivas para Chx10 (aproximadamente 95%). A partir de estos resultados, se descubrió que se puede producir de manera eficiente un tejido retiniano a partir de células iPS humanas sin alimentador, añadiendo SAG en la etapa 2 y añadiendo una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP como sustancia de inducción de diferenciación durante el cultivo en suspensión el día 3 o 6 después del inicio del cultivo en suspensión de la etapa 3.

Ejemplo 5: Ejemplo de producción de tejido retiniano a partir de células iPS humanas mediante el uso de la sustancia activadora de la vía de transducción Shh 600 nM en la etapa 2 y mediante el uso de BMP4 en la etapa 3

Las células iPS humanas sin alimentador (cepa 1231A3) preparadas según el método descrito en el Ejemplo 4 se dispersaron en células individuales utilizando TrypLE Select (Life Technologies), y las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se suspendieron en 100 pL de un medio libre de suero a 1,2 x 104 células por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos sin adhesivo celular (placa de fondo PrimeSurface 96V, SUMITOMO BAKELITE), y se sometieron a cultivo en suspensión a 37°C, 5% de CO2. Como medio libre de suero (gfCDM KSR), se usó un medio libre de suero que es una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 pM, 1 x concentrado de lípidos químicamente definido. En el momento del inicio del cultivo en suspensión (día 0 después del inicio del cultivo en suspensión, inicio de la etapa 2), se añadieron Y27632 (concentración final 20 pM) y SAG (concentración final 600 nM) al medio sin suero anterior. El día 2 después del inicio del cultivo en suspensión, se formaron agregados celulares (etapa 2 completada, inicio de la etapa 3).

Aquí, como etapa 3, se realizó el cultivo bajo las siguientes condiciones, Condición 1 y Condición 2.

En la Condición 1 (+ BMP, d3), se añadió un medio (50 pL) libre de Y27632 y SAG y que contenía BMP4 recombinante humana (fabricada por R&D) el día 3 después del inicio del cultivo en suspensión, de tal modo que la concentración final de la BMP4 recombinante humana exógena se ajustó a 1,5 nM (cantidad total de medio 150 pL). El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad de medio por el medio sin suero anterior libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana.

En la Condición 2 (+ BMP, d6), se añadió un medio sin suero (50 pL) libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana el día 3 después del inicio del cultivo en suspensión. El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad del medio por un medio libre de Y27632 y que contenía BMP4 recombinante humana (fabricada por R&D) de tal modo que la concentración final de la BMP4 recombinante humana exógena se ajustó a 1,5 nM.

El día 6 o más después del inicio del cultivo en suspensión de las células de la Condición 1 y la Condición 2, se cambió la mitad de la cantidad de medio por el medio sin suero anterior libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana una vez cada 2-4 días. El día 18 después del inicio del cultivo en suspensión, se observó la forma bajo un microscopio invertido. Se encontró que los agregados celulares se mantenían y que se formaba un tejido neural bajo la Condición 1 y la Condición 2.

Los agregados celulares así preparados el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión, producidos añadiendo SAG en la etapa 2 a partir de células iPS sin alimentador como material de partida, se fijaron con paraformaldehído al 4% para producir secciones congeladas. Estas secciones congeladas fueron inmunoteñidas para Chx10 (anticuerpo anti-Chx10, Exalpha, oveja), que es uno de los marcadores de tejido retiniano, o para Rx (anticuerpo anti-Rx, fabricado por TAKARA, conejillo de indias), que es uno de los marcadores de tejido retiniano. Estas secciones inmunoteñidas se observaron bajo un microscopio de fluorescencia invertido. Como resultado, se descubrió que la proporción de células positivas para Rx en el total de células era aproximadamente del 40%, y la proporción de células positivas para Chx10 también era aproximadamente del 40%, tanto para las células de la Condición 1 como de la Condición 2 (Fig. 7). Además, a partir del análisis de las secciones continuas, se sugirió que Rx también es fuertemente positivo en tejidos neurales que tienen una alta proporción de células positivas para Chx10 (aproximadamente 95%). A partir de los resultados, se descubrió que se puede producir de manera eficiente un tejido retiniano a partir de células iPS humanas sin alimentador, añadiendo SAG 600 nM en la etapa 2 y añadiendo una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP como sustancia de inducción de diferenciación en el día 3 o 6 después del inicio del cultivo en suspensión en la etapa 3.

Ejemplo 6: Ejemplo de producción de tejido retiniano a partir de células iPS humanas mediante el uso de SAG, purmorfamina o proteína Shh recombinante como sustancia activadora de la vía de transducción de señales Sonic hedgehog en la etapa 2

Se cultivaron células iPS humanas (cepa 201B7, obtenida de la Universidad de Kyoto) sin alimentador de acuerdo con el método descrito en "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)". Como medio sin alimentador, se usó medio Stem Fit (AK-03; fabricado por Ajinomoto Co., Inc.), y como estructura sin alimentador, se usó Laminina 511-E8 (fabricada por Nippi, Inc.).

Como operación de cultivo de mantenimiento específica, las células iPS humanas subconfluentes (cepa 201B7) se lavaron primero con PBS y se dispersaron en células individuales utilizando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies). A partir de entonces, las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se sembraron en una placa de cultivo de plástico recubierta con laminina 511-E8 y se sometieron a cultivo sin alimentador en medio Stem Fit en presencia de Y27632 (sustancia inhibidora de la ruta ROCK, 10 pM). Cuando se usó una placa de 6 pocillos (fabricada por Iwaki, para cultivo celular, área de cultivo 9,4 cm2) como la placa de cultivo de plástico anterior, el número de células en placa para las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se ajustó a 1,3 x 104. Un día después de la siembra, se cambió la cantidad total de medio por medio Stem Fit libre de Y27632. Posteriormente, una vez en 1 - 2 días, se cambió la cantidad total de medio por medio Stem Fit libre de Y27632. Posteriormente, las células se cultivaron hasta subconfluencia (60% del área de cultivo cubierta con células) 6 días después de la siembra.

Las células iPS humanas subconfluentes así preparadas se trataron con la disolución de dispersión celular usando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies), se dispersaron adicionalmente en células individuales mediante una operación de pipeteo, y las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se suspendieron en 100 pL de un medio libre de suero a 1,0 x 104 células por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos sin adhesivo celular (placa de 96 pocillos con fondo en V SUMILON SPh Er OID PrimeSurface, SUMITOMO BAk El ITE). Posteriormente, las células se sometieron a cultivo en suspensión a 37°C, 5% de CO2. Como medio libre de suero (gfCDM KSR), se usó un medio libre de suero que es una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 pM, 1 x concentrado de lípidos químicamente definido. En el momento del inicio del cultivo en suspensión (día 0 después del inicio del cultivo en suspensión, inicio de la etapa 2), el medio sin suero anterior se suplementó con Y27632 (concentración final 20 pM) y se suplementó adicionalmente con SAG (concentración final 30 nM), se usó purmorfamina (fabricada por Wako, concentración final 0,2 pM), o Shh recombinante humana (fabricada por R&D, Recombinant N-Terminus, concentración final 50 ng/mL) como sustancia activadora de la ruta de transducción de señales Shh (Fig.8). El día 2 después del inicio del cultivo en suspensión, se formaron agregados celulares. El día 3 después del inicio del cultivo en suspensión, se añadió un medio (50 pL) libre de Y27632, SAG, purmorfamina y Shh recombinante y que contenía BMP4 recombinante humana para ajustar la concentración final de BMP4 recombinante humana exógena a 1,5 nM (55 ng/mL). El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad de medio por un medio sin suero libre de Y27632, SAG, purmorfamina, Shh recombinante y BMP4 recombinante humana. A continuación, se cambió la mitad de la cantidad de medio por el medio sin suero anterior libre de Y27632, SAG y BMP4 recombinante humana una vez cada 2 a 4 días. Los agregados celulares así preparados el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión se sometieron a observación de campo brillante bajo un microscopio invertido (BIOREVO fabricado por KEYENCE). Como resultado, se observó la formación de neuroepitelio.

Los agregados celulares el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión se fijaron con paraformaldehído al 4% para producir secciones congeladas. Estas secciones congeladas fueron inmunoteñidas para Chx10 (anticuerpo anti-Chx10, Exalpha, oveja), que es uno de los marcadores de tejido retiniano. Como resultado, se encontró que, en condiciones que implican la adición de SAG, PMA o Shh como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh el día 0 del cultivo en suspensión, y la adición de BMP4 el día 3 del cultivo en suspensión, la proporción de células positivas para Chx10 en el total de células no fue superior al 30% (Fig. 8, D - F). A partir de estos resultados, se descubrió que se puede producir de manera eficiente un tejido retiniano a partir de células iPS humanas cultivadas sin alimentador, añadiendo cualquiera de SAG, purmorfamina y Shh recombinante como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh al comienzo del cultivo en suspensión en la etapa 2, y añadiendo una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP como sustancia de inducción de diferenciación durante el cultivo en suspensión en la etapa 3.

Ejemplo 7: Ejemplo de producción de tejido retiniano a partir de células iPS humanas mediante el uso de SAG, purmorfamina o proteína Shh recombinante como sustancia activadora de la vía de transducción de señales Sonic hedgehog en la etapa 2 y mediante el uso de BMP4 en la etapa 3

Se cultivaron células iPS humanas (cepa 1231A3, obtenida de la Universidad de Kyoto) sin alimentador de acuerdo con el método descrito en "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)". Como medio sin alimentador, se usó medio Stem Fit (AK-03; fabricado por Ajinomoto Co., Inc.), y como estructura sin alimentador, se usó Laminina 511-E8 (fabricada por Nippi, Inc.).

Las células iPS humanas subconfluentes preparadas de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 6 se trataron con la disolución de dispersión celular utilizando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies), se dispersaron adicionalmente en células individuales mediante una operación de pipeteo, y las células iPS humanas anteriores dispersadas en células individuales se suspendieron en 100 pL de un medio libre de suero a 1,0 x 104 células por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos sin adhesivo celular (placa de fondo en V de 96 pocillos SUMILON SPHEROID PrimeSurface, SUMITOMO BAKELITE). Posteriormente, las células se sometieron a cultivo en suspensión a 37°C, 5% de CO2. Como medio libre de suero (gfCDM KSR), se usó un medio libre de suero que es una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1 -monotioglicerol 450 pM, 1 x concentrado de lípidos químicamente definido. En el momento del inicio del cultivo en suspensión (día 0 después del inicio del cultivo en suspensión, inicio de la etapa 2), el medio sin suero anterior se suplementó con Y27632 (concentración final 20 pM) y se suplementó adicionalmente con SAG (concentración final 30 nM), purmorfamina (PMA, fabricada por Wako, concentración final 0,2 pM), o Shh recombinante humana (fabricada por R&D, Recombinant N-Terminus, concentración final 300 ng/mL) como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh, o medio libre de suero libre de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh (Fig. 9). El día 2 después del inicio del cultivo en suspensión, se formaron agregados celulares. El día 3 después del inicio del cultivo en suspensión, se añadió un medio (50 pL) libre de Y27632, SAG, purmorfamina y proteína Shh y que contenía BMP4 recombinante humana (R&D) para ajustar la concentración final de BMP4 recombinante humana exógena a 1,5 nM ( 55 ng/mL). El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad del medio por un medio sin suero libre de Y27632, SAG, purmorfamina, proteína Shh y BMP4 recombinante humana. A continuación, se cambió la mitad de la cantidad de medio por el medio exento de suero anterior libre de Y27632, SAG, purmorfamina, Shh recombinante y BMP4 recombinante humana una vez cada 2 a 4 días. Los agregados celulares así preparados se sometieron a observación de campo brillante bajo un microscopio invertido (BIOREVO fabricado por KEYENCE) el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión. Como resultado, se encontró que el agregado celular no creció y no se formó tejido neuroepitelial en condiciones de no adición de una sustancia activadora de la vía de transducción de señal Shh exógena en la etapa 2 (Fig.9: Control), mientras que los agregados celulares crecieron y sí se formó neuroepitelio en condiciones de adición de SAG, PMA o proteína Shh recombinante en la etapa 2 (Fig. 9: SAG, PMA, Shh).

Los agregados de células el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión se fijaron con paraformaldehído al 4% para producir secciones congeladas. Estas secciones congeladas fueron inmunoteñidas para Chx10 (anticuerpo anti-Chx10, Exalpha, oveja), que es uno de los marcadores de tejido retiniano. Como resultado, se encontró que, en condiciones que implicaban la adición de PMA el día 0 del cultivo en suspensión y la adición de BMP4 el día 3 del cultivo en suspensión, la proporción de células positivas para Chx10 en el total de células no era superior al 60% (Fig. 9, PMA del panel inferior). Además, se encontró que el agregado celular contenía células positivas para Chx10 incluso en condiciones de adición de SAG o Shh en el día 0 de cultivo en suspensión. A partir de estos resultados, se descubrió que se puede producir un tejido retiniano a partir de células iPS humanas sin alimentador mediante la adición de SAG, purmorfamina y Shh recombinante como sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Shh al comienzo del cultivo en suspensión en la etapa 2, y añadiendo una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP como sustancia de inducción de diferenciación durante el cultivo en suspensión en la etapa 3.

Ejemplo 8: Ejemplo de producción de tejido retiniano sometiendo células iPS humanas establecidas usando Sendaivirus a cultivo sin alimentador, usando una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh al comienzo del cultivo en suspensión y usando BMP4 en la etapa 3

Se establecieron células iPS humanas (cepa DSPC-3, establecida por Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.) utilizando vectores de Sendaivirus disponibles comercialmente (4 factores de Oct3/4, Sox2, KLF4, c-Myc, kit CytoTune fabricado por DNAVEC (ahora ID Pharma)), medio StemFit (AK03; fabricado por Ajinomoto Co., Inc.) y Laminina 511-E8 (fabricada por Nippi, Inc.), y en base a los métodos descritos en el protocolo publicado de Life Technologies (iPS 2.0 Sendai Kit de reprogramación, número de publicación MAN0009378, revisión 1.0), y el protocolo publicado de la Universidad de Kyoto (establecimiento ■ cultivo de mantenimiento de células iPS humanas sin alimentador, CiRA_FfiPSC_protocol_jP_v140310, http://www.cira.kyoto-u.ac.jp /j/research/protocol.html).

Las células iPS humanas (cepa DSPC-3) se sometieron a cultivo sin alimentador de acuerdo con el método descrito en Scientific Reports, 4, 3594 (2014). Como medio sin alimentador, se usó medio StemFit (fabricado por Ajinomoto Co., Inc.), y como estructura sin alimentador, se usó Laminina 511-E8 (fabricada por Nippi, Inc.).

Como operación de cultivo de mantenimiento específica, las células iPS humanas subconfluentes se lavaron primero con PBS y se dispersaron en células individuales utilizando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies). A partir de entonces, las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se sembraron en una placa de cultivo de plástico recubierta con laminina 511-E8 y se sometieron a cultivo sin alimentador en medio Stem Fit en presencia de Y27632 (sustancia inhibidora de la ruta ROCK, 10 pM). Cuando se usó una placa de 6 pocillos (fabricada por Iwaki, para cultivo celular, área de cultivo 9,4 cm2) como el plato de cultivo de plástico anterior, el número de células en placa para las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se estableció en 1,3 x 104. Un día después de la siembra, se cambió la cantidad total de medio por medio Stem Fit libre de Y27632. Posteriormente, una vez en 1-2 días, se cambió la cantidad total de medio por medio Stem Fit libre de Y27632.

Posteriormente, 6 días después de la siembra, las células se cultivaron hasta subconfluencia (60% del área de cultivo cubierta con células).

Las células iPS humanas subconfluentes así preparadas se trataron con la disolución de dispersión celular usando TrypLE Select (fabricado por Life Technologies), se dispersaron adicionalmente en células individuales mediante una operación de pipeteo, y las células iPS humanas anteriores dispersas en células individuales se suspendieron en 100 pL de un medio sin suero a 1,2 x 104 células por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos sin adhesivo celular (placa de fondo en V de 96 pocillos SUMILON SPHEROID PrimeSurface, SUMITOMO Ba KELITE). Posteriormente, las células se sometieron a cultivo en suspensión a 37°C, 5% de CO2. Como medio libre de suero (gfCDM KSR), se usó un medio libre de suero que es una mezcla 1:1 de medio F-12 y medio IMDM suplementado con KSR al 10%, 1-monotioglicerol 450 pM, 1 x concentrado de lípidos químicamente definido. En el momento del inicio del cultivo en suspensión (día 0 después del inicio del cultivo en suspensión, inicio de la etapa 2), el medio sin suero anterior se suplementó con Y27632 (concentración final 20 pM) y se suplementó adicionalmente con SAG como una señal de Shh exógena. Se utilizó sustancia activadora de la vía de transducción (concentración final 300 nM), o no suplementada con SAG (concentración final 0 nM) (Fig. 10). El día 2 después del inicio del cultivo en suspensión, se formaron agregados celulares. El día 3 después del inicio del cultivo en suspensión, se añadió un medio (50 pL) libre de Y27632 y SAG, que contenía o no BMP4 recombinante humana para ajustar la concentración final de BMP4 recombinante humana exógena a 1,5 nM (55 ng/mL ) o a 0 nM. El día 6 después del inicio del cultivo en suspensión, se cambió la mitad de la cantidad de medio por un medio sin suero libre de Y27632, SAG y BMP4. A continuación, se cambió la mitad de la cantidad de medio por el medio sin suero anterior libre de Y27632, SAG y BMP4 una vez cada 2 a 4 días. Los agregados celulares así preparados se sometieron a observación de campo brillante bajo un microscopio invertido (BIOREVO fabricado por KEYENCE) el día 22 después del inicio del cultivo en suspensión. Como resultado, se encontró que la eficiencia de formación de los agregados celulares era mala en condiciones de no adición de una sustancia activadora de la ruta de transducción de señales Shh (Fig. 10, Control). Por otro lado, se observó que se mantenían los agregados celulares y sí se formaba neuroepitelio en condiciones de adición de SAG al comienzo del cultivo en suspensión (Fig. 10, SAG 300 nM).

Los agregados celulares el día 22 después del inicio del cultivo en suspensión se fijaron con paraformaldehído al 4% para producir secciones congeladas. Estas secciones congeladas fueron inmunoteñidas para Chx10 (anticuerpo anti-Chx10, Exalpha, oveja), que es uno de los marcadores de tejido retiniano, o para Rx (anticuerpo anti-Rx, fabricado por Takara, conejillo de indias), que es uno de los marcadores de tejido retiniano. Como resultado, se encontró que, en condiciones que implicaban la adición de SAG el día 0 del cultivo en suspensión y la adición de BMP4 el día 3 del cultivo en suspensión, la proporción de células positivas para Rx en el total de células era de aproximadamente el 10% y la proporción de células positivas para Chx10 en el total de células también fue aproximadamente del 10% (Fig. 10). Además, a partir del análisis de las secciones en serie, se encontró que Rx también es fuertemente positivo en tejidos neurales de células positivas para Chx10 (Fig. 10). A partir de estos resultados, se pudo confirmar que también se puede producir un tejido retiniano a partir de células iPS humanas sin alimentador establecidas con Sendaivirus, agregando una sustancia activadora de la vía de transducción de señales Shh al comienzo del cultivo en suspensión en la etapa 2 y agregando una sustancia activadora de la vía de transducción de señales BMP como sustancia de inducción de diferenciación durante el cultivo en suspensión en la etapa 3.

[Aplicabilidad industrial]

Según el método de producción de la presente invención, es posible inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en células retinianas humanas en ausencia de células alimentadoras para producir un tejido retiniano humano. El método de producción de la presente invención es útil ya que puede producir un tejido retiniano humano que se utilizará como material para la evaluación de la toxicidad y la eficacia de compuestos candidatos a productos farmacéuticos y otras sustancias químicas, para pruebas de aplicación a material de trasplante para un tratamiento de trasplante de tejido retiniana, o para tratamientos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir células retinianas humanas o un tejido retiniano humano, que comprende las siguientes etapas (1) -(3):

(2) una segunda etapa de cultivo de las células madre pluripotentes obtenidas en la primera etapa en suspensión en presencia de una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog para formar un agregado celular, donde la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog se selecciona del grupo que consiste en una proteína que pertenece a la familia hedgehog, agonista de receptor de Shh, SAG y purmorfamina, y

2. El método de producción según la reivindicación 1, en el que, en la segunda etapa, las células obtenidas en la primera etapa se dispersan y las células dispersas se cultivan en suspensión.

3. El método de producción según la reivindicación 1 o 2, en el que el factor para mantener el estado indiferenciado es una sustancia activadora de la ruta de transducción de señales de FGF.

4. El método de producción según la reivindicación 3, en el que la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de FGF es bFGF.

5. El método de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que, en la segunda etapa, la concentración de la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog en el medio es una concentración correspondiente a la actividad de transducción de señales de Sonic hedgehog de SAG a entre 10 nM y 700 nM.

6. El método de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP es BMP4.

7. El método de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que, en la tercera etapa, la sustancia activadora de la vía de transducción de señales de BMP se añade al medio entre el día 2 y el día 9 después del inicio de la segunda etapa.

8. El método de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que, en la tercera etapa, el agregado se cultiva en un medio que contiene una sustancia activadora de la vía de transducción de señales de Sonic hedgehog a una concentración no mayor que una concentración correspondiente a la actividad de transducción de señales de Sonic hedgehog de SAG a 700 nM.

9. El método de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la primera etapa se realiza mediante un método de cultivo por adhesión.

10. El método de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las células madre pluripotentes son células madre pluripotentes inducidas.

11. El método de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que se forman agregados uniformes en la segunda etapa.

12. El método de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el agregado obtenido en la tercera etapa comprende una o más células seleccionadas del grupo que consiste en célula progenitora retiniana, célula progenitora retiniana neural, célula precursora fotorreceptora, célula fotorreceptora, célula fotorreceptora de bastón, célula fotorreceptora de cono, célula horizontal, célula amacrina, interneurona, célula ganglionar, célula epitelial del pigmento retiniano y célula de la zona marginal ciliar.

13. El método de producción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el cultivo en suspensión se realiza en ausencia de una preparación de membrana basal.

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además cortar el tejido retiniano a partir del agregado celular.