CN113348243A - 人视网膜祖细胞分离及培养方法 - Google Patents

人视网膜祖细胞分离及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了通过施用视网膜祖细胞用于以下的组合物以及方法：治疗、减轻或预防视网膜疾病或病况；改善明视(日光)视力；改善矫正视力敏锐度；改善黄斑功能；改善视野；或改善暗视(夜间)视力。

Description

人视网膜祖细胞分离及培养方法
相关申请
本申请主张2018年9月27日申请的美国临时专利申请案序号62/737,622的优先权权益，其内容以引用方式全文并入本文中。
技术领域
本文中所描述的主题一般涉及干细胞生物学及再生医学的领域。在替代性实施方案中，本文中提供分离得自或分离自人样本的初代视网膜细胞的方法。在替代性实施方案中，提供用于通过施用视网膜祖细胞而治疗、减轻或预防视网膜疾病或病况，改善明视(日光)视力；改善视力敏锐度；改善黄斑功能；改善视野；或改善暗视(夜间)视力或再生黄斑及/或暗视视力功能的组合物及方法。
背景技术
视网膜变性指由视网膜的感光细胞持续地及不可逆地衰退及死亡所造成的恶化或退化。感光细胞的死亡可导致失明。因此，本领域中存在有对于有效治疗修复创伤及失去的感光细胞与修复视力功能的需求。
发明内容
本公开内容提供一种分离从人样本获得或已获得的初代视网膜细胞的方法，所述方法包括：(a)处理或已处理获得的人视网膜组织样本，(b)机械解离所得样本，(c)测定从样本所得初代视网膜细胞的存活力及数量，及(d)确认或已经确认所得初代视网膜细胞的形态以产生细胞及细胞簇的经解离的悬浮液。
本公开内容方法的一些实施方案中，人视网膜组织系得自于一个或一对人眼球。本公开内容方法的一些实施方案中，眼球具有正常形态，包含完整球体、透明角膜及/或正常形状。在一些实施方案中，将胎儿眼球(含有人视网膜组织)储存于具有L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基，且从供体收集器官后立即储存在冰上。在任何这些方法中，储存的人视网膜组织是在收集后确定的一段时间内递送及使用。在各种实施方案中，将人视网膜组织置于冰上运输且在输送窗期间内递送。通过非限制实例的方式，输送窗可为约1至约26小时或更多小时(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、或26小时)，例如约4.5至约21.5小时(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、或21.5)或约7至约26小时(例如，7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、或26小时)。
在本公开内容方法的一些实施方案中，步骤(a)处理所得样本包括：(i)收集器官后，从RPMI-1640培养基移出眼球且用补充抗生素的冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗1至5次(例如，1、2、3、4或5次)，(ii)从眼球移出视神经及间质组织以移出所有眼外细胞，(iii)用补充抗生素的冰冷PBS洗涤眼球，(iv)用针于角膜缘穿刺球体，(v)用显微手术剪刀沿角膜缘周向切割，(vi)移出晶状体、角膜及相连的玻璃体，(vii)从视网膜色素上皮(RPE)层解离视网膜以产生经分离的视网膜，(viii)将经分离的视网膜置于含有补充抗生素的冰冷培养基或PBS的培养皿中。
在本公开内容方法的一些实施方案中，在步骤(b)的机械解离包括经由以下步骤机械解离步骤(a)所得视网膜：(i)将视网膜转移至锥形管，(ii)机械解离视网膜以产生经解离的视网膜，(iii)用补充抗生素的无血清培养基洗涤培养皿且将含有任何残留的经解离的视网膜的培养基转移至含有经解离的视网膜的锥形管，(iv)经由离心使经解离的视网膜沉淀成粒，及(v)移出上清液。在一些实施方案中，机械解离视网膜是经由使用无菌移液管粉碎(trituration)进行。在一些实施方案中，经由在1至50℃及约10至约1000x g离心约0至约30分钟时段使经解离的视网膜沉淀成粒。
在本公开内容方法的一些实施方案中，(c)测定初代视网膜细胞的存活力及数量的步骤包含：(i)将步骤(b)沉淀成粒的视网膜组织再悬浮于冰冷的补充抗生素的无血清培养基，(ii)测定从机械解离视网膜组织所得的视网膜细胞及视网膜细胞簇的数量及存活力，(iii)将细胞接种于包被纤连蛋白的含有补充抗生素的无血清培养基的细胞培养瓶或培养板，(iv)在10至50℃培育含有视网膜细胞的培养瓶或培养板。在一些实施方案中，通过NC-200细胞计数器测量细胞的数量及存活力。在一些实施方案中，细胞计数为约1至约1,000,000,000个细胞。在一些实施方案中，存活细胞计数百分比为约10至约100。在一些实施方案中，对培养瓶或培养板接种约1至约1,000,000,000个细胞。在一些实施方案中，含有视网膜细胞的培养瓶或培养板是在37℃及0至30％CO2及0至50％O2培育。
在本公开内容方法的一些实施方案中，步骤(d)包含确认接种至细胞培养瓶或培养板中的视网膜细胞由包含约1至约100个细胞的视网膜细胞簇组成。
在本公开内容方法的一些实施方案中，用于补充PBS或无血清培养基的抗生素为庆大霉素(Gentamycin)。在一些实施方案中，所用抗生素浓度为约0至约10,000μg/mL。
本公开内容提供一种从人样本分离初代视网膜细胞的方法，其包含：(a)从人样本分离包含多个初代视网膜细胞的视网膜样本，(b)机械解离在步骤(a)分离的视网膜样本中的多个初代视网膜细胞而未使用蛋白酶消化所述多个初代视网膜细胞，从而产生细胞及细胞簇的经解离的悬浮液，及(c)测定来自所述视网膜样本的初代视网膜细胞的存活力、数量及形态，其中产生至少30x106个存活的初代视网膜细胞。
在本公开内容方法的一些实施方案中，人样本为一个或一对人眼球。在一些实施方案中，眼球具有正常形态，包含完整球体、透明角膜、正常形状或其任何组合。在一些实施方案中，在步骤(a)之前在从人供体收集人样本后，将人样本置于输送细胞培养基中。在一些实施方案中，输送细胞培养基包含具有L-谷氨酰胺的RPMI-1640或Advanced DMEM/F12。在一些实施方案中，输送细胞培养基包含约0.5至50微克/毫升(mL)庆大霉素，任选地，输送细胞培养基包含约50微克/毫升庆大霉素。在一些实施方案中，人样本在置放于输送细胞培养基中之后立即储存在约1至8℃，例如通过置放在冰上。
在本公开内容方法的一些实施方案中，人样本是在从人供体收集后约7至约26小时内使用。
在本公开内容方法的一些实施方案中，步骤(a)从人样本分离视网膜样本包含：(i)从输送培养基移出一个或一对人眼球，(ii)用约1-8℃补充抗生素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗一个或一对人眼球，(iii)从一个或一对人眼球移出视神经及间质组织，(iv)用约1-8℃补充抗生素的PBS洗涤一个或一对人眼球，(v)使用针于角膜缘穿刺一个或一对人眼球的每一个的球体，(vi)沿一个或一对人眼球的角膜缘周向切割，(vii)从一个或一对人眼球移出晶状体、角膜及相连的玻璃体，(viii)从视网膜色素上皮(RPE)层解离视网膜以产生经分离的视网膜或一对经分离的视网膜，及(ix)将经分离的视网膜或一对经分离的视网膜置于约1-8℃的培养基或PBS中，其中对培养基或PBS补充抗生素。在一些实施方案中，重复步骤(ii)1-5次，或3次。在一些实施方案中，步骤(iii)移出一些或所有眼外细胞。
在本公开内容方法的一些实施方案中，步骤(b)机械解离多个初代视网膜细胞包含：(i)将视网膜样本转移至试管，(ii)机械解离视网膜样本以产生多个经解离的初代视网膜细胞，(iii)经由离心使多个经解离的初代视网膜细胞沉淀成粒，及(iv)移出上清液。在一些实施方案中，机械解离视网膜是在使用无菌移液管经由粉碎进行。在一些实施方案中，进行粉碎2至50次、2至10次，或4至8次。在一些实施方案中，多个经解离的初代视网膜细胞经由在4℃、约140xg离心约3分钟而沉淀成粒。在一些实施方案中，该方法包含在步骤(ii)之后且在步骤(iii)之前用补充抗生素的培养基或PBS洗涤多个经解离的初代视网膜细胞。
在本公开内容方法的一些实施方案中，多个经解离的初代视网膜细胞包含单个细胞及细胞簇。
在本公开内容方法的一些实施方案中，步骤(c)测定初代视网膜细胞存活力、数量及形态包含：(i)将来自步骤(b)的沉淀成粒的初代视网膜细胞再悬浮于约1-8℃的补充抗生素的培养基，(ii)将多个经解离的视网膜细胞接种一或多个经包被的含有培养基的细胞培养瓶或培养板，任选地其中细胞培养基补充抗生素，(iii)在10至50℃培育多个经解离的视网膜细胞，任选地其中在37℃进行培育，及(iv)测定初代视网膜细胞及视网膜细胞簇的数量及存活力。在一些实施方案中，初代视网膜细胞的数量及存活力系通过NC-200细胞计数器使用聚集(aggregate)细胞计数方法、血球计或台盼蓝)测量。在一些实施方案中，存活的初代视网膜细胞的数目为约20x106至约1x109存活的初代视网膜细胞，或约73-147x106存活的初代视网膜细胞。在一些实施方案中，存活的经计数细胞的百分比为约10％至约100％，或约68％至约85％。
在本公开内容方法的一些实施方案中，步骤(ii)中培养瓶或培养板被接种约1至约1,000,000,000个细胞。
在本公开内容方法的一些实施方案中，多个经解离的视网膜细胞在以下条件培育：(1)约37℃、0至30％CO2及0至50％O2；(2)约37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于20％O2；或(3)约37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于3％O2。在一些实施方案中，多个经解离的视网膜细胞在37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于3％O2培育。
在本公开内容方法的一些实施方案中，步骤(c)测定初代视网膜细胞的存活力、数量及形态包含(i)用显微镜目视检查多个经解离的视网膜细胞，及(ii)确认接种至细胞培养瓶或培养板中的多个视网膜细胞包含由约2至约1000个细胞组成的视网膜细胞簇。
在本公开内容方法的一些实施方案中，无血清培养基包含：(a)Advanced DMEM/F12、(b)N-2补充物、(c)EGF(重组人表皮生长因子)、(d)bFGF(碱性纤维母细胞生长因子)、及/或(e)GlutaMAX I。
在本公开内容方法的一些实施方案中，培养基为无血清。在一些实施方案中，培养基包含完全培养基。在一些实施方案中，培养基包含Dulbecco氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)DMEM/F12、Advanced DMEM/F12、Knockout DMEM/F12、Neurobasal培养基、ReNcell或Ultraculture培养基。在一些实施方案中，培养基包含Advanced DMEM/F12。在一些实施方案中，培养基包含N-2补充物及GlutaMAX-I。在一些实施方案中，培养基包含B27、B27 xeno-free或Stempro。在一些实施方案中，培养基包含支持细胞生存或生长的补充物或添加物。在一些实施方案中，支持细胞生存或生长的补充物或添加物选自由以下组成的组：L-谷氨酰胺、重组人表皮生长因子(EGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、其他生长因子及其组合。在一些实施方案中，抗生素包括浓度约0.5至约50μg/mL的庆大霉素，任选地其中庆大霉素浓度为约30μg/mL。
本公开内容提供一种培养经分离的初代人视网膜细胞以产生非永生的人视网膜祖细胞的群体的方法，其包含：(a)在标准氧气浓度之下，在包被无异源纤连蛋白、鸟胺酸、聚赖胺酸或层粘连蛋白的培养瓶或培养板中的无血清培养基中培养经分离的初代视网膜细胞悬浮物约4至6代，(b)接着在低氧气浓度之下培养无血清培养基中的悬浮物约额外3至6代，其中细胞以40％至90％汇合继代，在每一次继代用酶处理以解离细胞且添加新鲜培养基，及(c)接着冷冻保存细胞，从而制得非永生的人视网膜祖细胞的群体。
在本公开内容方法的一些实施方案中，在低氧气浓度之下后续培养悬浮液后，细胞被允许在标准氧气浓度不继代地生长一段时间。在一些实施方案中，继代之间的时间段为3至5天(例如，3、4或5天)。
在本公开内容方法的一些实施方案中，用于解离细胞的酶溶液包含胰蛋白酶或胰蛋白酶等效物。在一些实施方案中，在第一继代使用包含约1：4之比的胰蛋白酶或胰蛋白酶等效物与EDTA的酶溶液解离细胞。在一些实施方案中，在第一继代，胰蛋白酶或等效物与EDTA的比为约1：3、1：3.1、1：3.2、1：3.3、1：3.4、1：3.5、1：3.6、1：3.7、1：3.8、1：3.9、1：4.0、1：4.1、1：4.2、1：4.3、1：4.4、1：4.5、1：4.6、1：4.7、1：4.8、1：4.9或1：5.0。在一些实施方案中，在第一继代使用包含比约1：1：3的胰蛋白酶或胰蛋白酶等效物、EDTA与DPBS的酶溶液解离细胞。在一些实施方案中，在第一继代，胰蛋白酶或等效物、EDTA与DPBS的比为约1：1：2、1：1：2.1、1：1：2.2、1：1：2.3、1：1：2.4、1：1：2.5、1：1：2.6、1：1：2.7、1：1：2.8、1：1：2.9、1：1：3.0、1：1：3.1、1：1：3.2、1：1：3.3、1：1：3.4、1：1：3.5、1：1：3.6、1：1：3.7、1：1：3.8、1：1：3.9或1：1：4.0。在一些实施方案中，在第一继代在约37℃解离细胞6-10分钟。在一些实施方案中，在第二继代使用包含1：1：3之比的胰蛋白酶或等效物、EDTA与DPBS的酶溶液解离细胞。在一些实施方案中，在第二继代，胰蛋白酶或等效物、EDTA与DPBS的比约1：1：2、1：1：2.1、1：1：2.2、1：1：2.3、1：1：2.4、1：1：2.5、1：1：2.6、1：1：2.7、1：1：2.8、1：1：2.9、1：1：3.0、1：1：3.1、1：1：3.2、1：1：3.3、1：1：3.4、1：1：3.5、1：1：3.6、1：1：3.7、1：1：3.8、1：1：3.9或1：1：4.0。在一些实施方案中，在第二继代使用包含约1：1之比的胰蛋白酶或等效物及EDTA的酶溶液解离细胞。在一些实施方案中，在第二继代，胰蛋白酶或等效物与EDTA的比约1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、或1：1.5。在一些实施方案中，在第二继代在约37℃解离细胞4至8分钟。在一些实施方案中，在第三继代、所有进一步继代使用包含比约1：1的胰蛋白酶或等效物与EDTA的酶溶液解离细胞。在一些实施方案中，在第三及所有进一步继代，胰蛋白酶或等效物与EDTA的比约1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、或1：1.5。在一些实施方案中，在第三及所有进一步继代，在37℃解离细胞4至8分钟。在一些实施方案中，胰蛋白酶或等效物包括TrypLE，例如TrypLEExpress或TrypLE Select。在一些实施方案中，添加过量DMEM或PBS使解离停止。在一些实施方案中，在解离后测定细胞计数及存活力。在一些实施方案中，经由NC-200细胞计数器测定细胞计数及存活力。
本公开内容提供一种培养经分离的初代人视网膜细胞以产生非永生的人视网膜祖细胞的群体的方法，该方法包含：(a)在第一继代将通过本文所述方法产生的多个初代视网膜细胞接种于一或多个含有培养基的经包被的培养瓶或培养板，以产生多个经培养的视网膜细胞；(b)在第二继代将第一继代产生的多个经培养的视网膜细胞接种于一或多个含有培养基的经包被的培养瓶或培养板；(c)在第三继代将第二继代产生的多个经培养的视网膜细胞接种于一或多个含有培养基的经包被的培养瓶或培养板；及(d)冷冻保存多个经培养的视网膜细胞，其中一或多个经包被的培养瓶或培养板以约1x104个细胞/平方厘米(cm2)至约2x106个细胞/cm2的密度接种，在第一继代的接种密度大于在第二继代的接种密度，且在第二继代的接种密度大于在第三继代的接种密度，从而产生非永生的人视网膜祖细胞的群体。
在本公开内容方法的一些实施方案中，该方法进一步包含在一或多个进一步继代将前一次继代产生的多个经培养的视网膜细胞接种于一或多个含有培养基的经包被的培养瓶或培养板。
在本公开内容方法的一些实施方案中，培养瓶或培养板被包被无异源纤连蛋白、鸟胺酸、聚赖胺酸、层粘连蛋白或其组合。
在本公开内容方法的一些实施方案中，多个初代或经培养的视网膜细胞在以下条件培养：(1)约37℃、0至30％CO2及0至50％O2，(2)约37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于20％O2；或(3)约37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于3％O2。在一些实施方案中，多个初代或经培养的视网膜细胞在约37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于3％O2培养。在一些实施方案中，二个次序上紧邻的继代之间的时间段为2至8天、3至6天、4至5天或3至4天。在一些实施方案中，二个次序上紧邻的继代之间的时间段为3至4天。
在本公开内容方法的一些实施方案中，多个初代视网膜细胞在第一继代用第一酶溶液解离，该第一酶溶液包含：(1)胰蛋白酶或等效物，及乙二胺四乙酸(EDTA)，或(2)胰蛋白酶或等效物、EDTA及DPBS。在一些实施方案中，其中胰蛋白酶等效物为TrypLE。在一些实施方案中，(1)第一酶溶液中TrypLE与EDTA的比为1：4，或(2)TrypLE、EDTA与DPBS的比为1：1：3。在一些实施方案中，多个初代视网膜细胞在约37℃被解离约5-20分钟、约6-10分钟，或约7-8分钟。在一些实施方案中，多个初代视网膜细胞在约37℃被解离约7-8分钟。
在本公开内容方法的一些实施方案中，多个经培养的视网膜细胞在第二继代被第二酶溶液解离，该第二酶溶液包含：(1)胰蛋白酶或等效物、EDTA及DPBS，或(2)胰蛋白酶或等效物及DPBS。在一些实施方案中，胰蛋白酶等效物为TrypLE。在一些实施方案中，(1)第二酶溶液中TrypLE、EDTA与DPBS的比为1：1：3，或(2)第二酶溶液中TrypLE与DPBS的比为1：1。在一些实施方案中，多个经培养的视网膜细胞在约37℃被解离约5-20分钟、约6-10分钟或约7-8分钟。在一些实施方案中，多个经培养的视网膜细胞在约37℃被解离约5-6分钟。
在本公开内容方法的一些实施方案中，多个经培养的视网膜细胞在至少第三继代或进一步继代被包含胰蛋白酶或等效物及DPBS的第三酶溶液解离。在一些实施方案中，胰蛋白酶等效物包含TrypLE。在一些实施方案中，第三酶溶液中TrypLE与DPBS的比为1：1。在一些实施方案中，在至少第三继代或进一步继代，多个经培养的视网膜细胞在约37℃被解离约5-10分钟或约5至7分钟。在一些实施方案中，至少第三继代或进一步继代包括3至5次继代。
在本公开内容方法的一些实施方案中，该方法包含在第二继代后在解离多个经培养的视网膜细胞之后测定细胞计数及存活力。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的细胞存活。
在本公开内容方法的一些实施方案中，细胞在第一继代以约0.5x106至约3.0x106个细胞/cm2的密度、在第二继代以约0.1x106至约0.5x106个细胞/cm2的密度、在第三继代密度以约0.03x106至约0.2x106个细胞/cm2的密度，及在第四继代及进一步继代以约10,000至约60,000个细胞/cm2的密度被接种于培养瓶或培养板。
本公开内容提供一种冷冻保存使用本公开内容方法产生的视网膜祖细胞的方法，其包含：(i)使用胰蛋白酶酶解离细胞，(ii)用过量的培养基或Advanced DMEM/F12停止解离，(iii)经由于10xg至10,000xg离心使细胞离心1至30分钟，(iv)使细胞再悬浮于培养基且测定总细胞计数及存活力，(v)添加冷冻保存介质以达到最终二甲基亚砜(DMSO)浓度为5至30％，(vi)将多个细胞等分于各冷冻管，(vii)使用控制速率冷冻机冷冻各冷冻管，及(viii)将各冷冻管的细胞置于液态N2中。
在本公开内容方法的一些实施方案中，冷冻保存步骤如以下所述进行：(a)使用1：1的胰蛋白酶或等效物与DPBS酶解离细胞，(b)使用过量DMEM或PBS停止解离，(c)经由10至10,000g离心达1至30分钟使细胞沉淀成粒，(d)使细胞再悬浮于无血清培养基且测定总细胞计数及存活力，(e)添加冷冻保存介质以达到DMSO终浓度为5至30％，(f)将0.2至100x106个细胞等分于各冷冻管，(g)在-80℃冷冻各冷冻管达6至72小时，及(h)将各冷冻管的细胞置于液态N2中。
在本公开内容冷冻保存方法的一些实施方案，步骤(i)的胰蛋白酶等效物包含TrypLE。在一些实施方案中，冷冻保存介质包含培养基及10％DMSO。在一些实施方案中，步骤(vi)的多个细胞为每个冷冻管约0.5x106至50x106个细胞，或每毫升培养基及DMSO为约0.5x106至约20x106个细胞。
在本公开内容方法的一些实施方案中，细胞及/或细胞簇与支持细胞生存或生长的补充物或添加物一起培养。在一些实施方案中，支持细胞生存或生长的补充物或添加物选自由以下组成的组：L-谷氨酰胺、人重组型生长因子(由EGF及bFGF(Invitrogen)组成)及其他生长因子。
在替代性实施方案中，提供医药组合物，其包含通过前述任何权利要求的方法分离的视网膜祖细胞，或群体或多个非永生的人视网膜祖细胞，以及也任选地包含医药可接受赋形剂。
在替代性实施方案中，本文提供的试剂盒包含通过前述任何权利要求的方法分离的视网膜祖细胞，或群体或多个非永生的人视网膜祖细胞。
在替代性实施方案中，提供的方法用于：治疗、减轻或预防视网膜疾病或病况、改善明视(日光)视力、改善矫正视力敏锐度、改善黄斑功能、改善视野或改善暗视(夜间)视力，该方法包含：(a)施用或已施用通过前述任何权利要求的方法分离的视网膜祖细胞，或群体或多个非永生的人视网膜祖细胞至需要的个体；或(b)(i)提供或已提供通过前述任何权利要求的方法分离的视网膜祖细胞，或群体或多个非永生的人视网膜祖细胞；及(ii)施用或已施用视网膜祖细胞，或群体或多个非永生的人视网膜祖细胞至需要的个体。
在替代性实施方案中，提供通过前述任何权利要求的方法分离的视网膜祖细胞，或群体或多个非永生的人视网膜祖细胞在制备用于治疗、减轻或预防视网膜疾病或病况、改善明视(日光)视力、改善矫正视力敏锐度、改善黄斑功能、改善视野或改善暗视(夜间)视力的药物中的用途。
在替代性实施方案中，提供通过前述任何权利要求的方法分离的视网膜祖细胞或群体或多个非永生的人视网膜祖细胞，其用于治疗、减轻或预防视网膜疾病或病况、改善明视(日光)视力、改善矫正视力敏锐度、改善黄斑功能、改善视野或改善暗视(夜间)视力。
任何上述方面可与本发明公开内容的任何其他方面结合。
附图简单说明
图1为描述每一次继代视网膜祖细胞细胞平均数目的线图。使用方案A或方案B从眼球样本分离视网膜祖细胞，并且在同一天(7小时，8小时)或在隔夜运输后(24小时)处理。P表示代数；d表示天数。数据点代表使用相同方案分离及在相同条件下培养的所有视网膜祖细胞的平均数目的理论计算值。
图2为叙述使用方案B的实验条件及继代条件及与先前培养方法(方案A)作比较的表。P表示代数；d表示天数；T表示TrypLE Select(Invitrogen)；E表示EDTA(Invitrogen)；P表示Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水或DPBS(Invitrogen)。
具体实施方式
当胎儿眼球(及相关联视网膜组织)在冰上长距离输送时，输送时间可能十分长。在那段时间，视网膜组织变得越来越脆弱，组成细胞的潜在存活力逐渐降低。当必须在远处取得组织，这对组织制造细胞带来了挑战，因为最终产物产量(在培养的任何设定时间内)会受到每个所得视网膜存活细胞数目影响。然而，可以利用增加的组织脆性并不用原本用于分离视网膜细胞的某些步骤。尤其是，可以避免使用胰蛋白酶分解视网膜组织，因为只需要轻轻地粉碎即可分解组织。这更容易于进行，并且缩短从组织到培养器的时间。此外，在早期传代期间使用EDTA也可以降低在此关键期间对细胞的应力，因为它们会在培养中恢复。经由在连续传代过程将视网膜分解成逐渐变小的块料，并且直到该过程后期才尝试分解成单个细胞，能进一步提高存活力，并使进行过程风险降低。随着细胞存活力改善，胰蛋白酶可以***性导入继代过程而不会对产量产生负面影响。
特别地，当起始组织经受比先前情况显著更长的运输时间，期望细胞产量可能受到不利影响。虽然可能难以直接解决组织变化，但可以修改分离及早期细胞培养方案以消除细胞损失的来源，从而提高最终产量。
当取得组织与开始培养组织间存在长时间间隔时，本文所述分离视网膜细胞的方法比先前方法具有多项好处。本文所述方法具有的好处包括但不限于：(1)提高了产量；(2)因为免除酶步骤而容易操作；(3)降低细胞裂解及DNA挤出以及相关细胞损失的风险，(4)从组织分离到培养器更快的过程，以及(5)提高早期继代期间的细胞存活力。
定义
为了有助于本公开的理解，以下定义一些术语。本文中的术语被用来描述本文中所描述的主题的实施方案。但是除了在申请权利要求中列出的之外，他们的用法不界定主题。
本文所述任何方面及实施方案可与本文公开内容其他方面或实施方案结合。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域中本领域技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述相似或等效的其他探针、组合物、方法及试剂盒可用于实施在本公开内容，本文描述示例性材料及方法。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体方面的目的而不是限定性的。
本公开内容中，包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“含有”、“具有”以及其类似物可具有美国专利法赋予它们的意义并且可意谓“包含(include)”、“包含(including)”以及其类似者。术语“基本上由...组成”或“基本上组成”同样的具有美国专利法赋予它们的意义，并且这些术语为开放式，只要所述基本的或新颖的特征不被多于所述特征的存在所改变，则允许多于所述特征的存在，但是排除现有技术的实施方案。
除非具体陈述或从上下文明显得知，当用于本文中时，术语“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”被理解为单数或复数。
除非具体陈述或从上下文明显得知，当用于本文中时，术语“或”被理解为包含的。
当用于本文其他上下文中时，除非另有指示，术语“约”意指所述数值，例如量、剂量、温度、时间、百分比等，+/-10％、+/-9％、+/-8％、+/-7％、+/-6％、+/-5％、+/-4％、+/-3％、+/-2％或+/-1％。
当用于本文中时，术语“病人(病患)”或“个体”以及类似物在本文中被互换地使用以指代任何哺乳类动物，包含人、驯养的及农场动物与动物园、运动及宠物动物，例如狗、马、猫与农业使用的动物，包含牛、绵羊、猪及山羊。实例性哺乳类动物为人，包含成人、孩童及年长者。个体亦可为宠物动物，包含狗、猫及马。例示性农业动物包含牛及山羊。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”以及类似物当用于本文中时，除非另有指示，意指治愈、反转、减弱、缓和、使减至最小、抑制其过程、阻止、暂停以及/或预防该术语应用的疾病、病症或病况或者此些疾病、病症或病况的一或多个(例如不必然为全部)症状，且包括施用本文中所描述的任何组合物、药物组合物或剂型以阻止疾病、病况或病症的症状或并发症的发作、减轻症状或并发症、减弱疾病、病况或病症的进展以及/或消除疾病、病况或病症。在替代性实施方案中，治疗为治愈的治疗或减轻的治疗。
当用于本文中时，“预防(preventing)”或“防止(prophylaxis)”意谓整体或部分地减轻或控制或减少或停止待阻止的例如疾病、病症或病况的事情或事件的发生。
当用于本文中时，术语“纯化的”、“富集的”或类似物指示细胞或细胞群体从其正常组织环境中被移除并以相较于正常组织环境更高的浓度存在。因此，“纯化的”或“富集的”细胞群进一步包含除了视网膜祖细胞之外的细胞类型并且可包含其他组织组分，且术语“纯化的”或“富集的”不必然指示仅祖细胞存在或者排除其他类型的细胞存在。
在一些实施方案中，视网膜祖细胞群当用于本文中时可为至少5％的纯度、至少10％的纯度、至少15％的纯度、至少20％的纯度、至少25％的纯度、至少30％的纯度、至少35％的纯度、至少40％的纯度、至少45％的纯度、至少50％的纯度、至少55％的纯度、至少60％的纯度、至少65％的纯度、至少70％的纯度、至少75％的纯度、至少80％的纯度、至少85％的纯度、至少90％的纯度、至少95％的纯度、至少96％的纯度、至少97％的纯度、至少98％的纯度、至少99％的纯度或在介于5％至99％的纯度的任何增量(例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的视网膜祖细胞)。
“标记”意指可被观察的或可被检测的任何分子。举例而言，标记可包括，但不受限于，例如特定基因的核酸诸如转录物、基因的多肽产物、非基因产物的多肽、醣蛋白、碳水化合物、醣脂类、脂类、脂蛋白或小分子(举例而言，具有小于10,000道尔顿的分子量的分子)。在替代性实施方案中，视网膜祖细胞可通过可在细胞群体内的细胞表面(“细胞表面标记”)、在细胞群体内的细胞内部(即在细胞的细胞核或细胞质中)表达以及/或在RNA或蛋白质水平作为“遗传”标记表达的一或多个标记的存在被表征。
术语“表达(express)”以及“表达(expression)”当用于本文中时意指在宿主细胞内的核酸序列的转录以及/或翻译。在宿主细胞中目标期望产物/蛋白质；例如标记之表达程度可依据存在于细胞内的对应的mRNA的量或如本实例中选择的序列编码的目标期望多肽/蛋白质的量来确定或“筛选”。举例而言，从选择的序列转录的mRNA可通过RNA印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA的原位杂交、微阵列分析或反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)来定量或检测。选择的序列编码的蛋白质可通过各种抗体检测方法，例如利用ELISA、蛋白质印迹术、放射免疫分析、免疫沉淀、对蛋白质的生物活性之分析、蛋白质的免疫染色(包括例如免疫组织化学染色法以及免疫细胞化学)、流式细胞术或荧光激发细胞分选(FACS)分析或均相时间分辨荧光(HTRF)分析来检测或定量。
视网膜祖细胞(RPC)
哺乳动物的视网膜祖细胞的分离、表征以及使用如在其全部内容于此并入作为参考的WO 2012/158910中详细描述。
在脊椎动物的胚胎发育中，视网膜与视神经源自发育的脑部的延伸物，所以视网膜被视为是中枢神经***(CNS)的一部分且实际上为脑部组织。视网膜系具有通过突触相互连接之神经的数个层的层状结构。离玻璃体最接近至最远的，即从最接近头的前侧外部朝向头部的内部与后侧，视网膜层包含包括米勒细胞足板的内限制膜(1)；包含神经节细胞核轴突的神经纤维层(2)；神经节细胞层，其包含神经节细胞的细胞核，其轴突成为视神经纤维(3)；内丛状层，含有在双极细胞轴突与神经节及无长突神经细胞的树突之间的突触(4)；含有双极细胞的核及周围细胞体(核周体)的内核层(5)；含有分别以杆状小球和锥形椎弓根结束之杆状和锥状突起的外丛状层(6)；含有杆状及锥状细胞体的外核层(7)；自其细胞核分离光感受器的内节部分的外限制膜(8)；光感受器层(9)；以及为单层立方细胞的视网膜色素上皮层(RPE)(10)。直接感光的神经元为光感受器细胞，其主要包括两种类型：杆状及锥状。杆状主要在昏暗光线下作用并提供黑-白视力，而锥状供应白天视力与对颜色的感知。第三种类型的光感受器为光敏感的祖细胞，其对于明亮的日光之反射反应为重要的。
供体胎儿视网膜细胞(例如本文中所述之视网膜祖细胞)可对宿主视网膜，特别是包含宿主锥状细胞提供营养影响。这种营养作用不仅具有神经保护作用，而且通过改善的视觉功能判定其对残留的宿主视网膜细胞还具有快速的再生作用。经由细胞分化，供体细胞能够整合于视网膜内并取代光感受器(其可为有限的数量)。整体的影响为以临床上显著的程度快速及持续地修复并保留视网膜的视觉功能，而若不快速及持续地修复并保留则视网膜的视觉功能将注定完全失败而让病人完全失明。因此，本文中所描述的任何的组合物及方法可被用来以临床上显著的程度快速及持续地修复并保留例如人的哺乳类动物的视网膜的视觉功能。举例而言，本文中所描述的任何的组合物及方法可对患病的视网膜提供临床上显著的营养影响或者对黄斑以及/或暗视视觉功能提供再生影响。
本文中所描述的组合物与群体中的细胞是密切相关的细胞，而不是经分离的单个细胞类型。
虽然这些细胞本身不是干细胞(因为它们不符合真正干细胞的定义)，它们是不成熟的以及/或可塑的。然而，这些细胞不能(在缺少额外的操纵下)产生胚层以及/或不能(在缺少额外的操纵下)产生所有的三个胚层。
此外，这些细胞被预先指定来制造视网膜组织或者细胞。因而，这些细胞可表达祖细胞标记与视网膜标记。
视网膜祖细胞不是多能的并可显出为多潜能的(multipotent)。然而，因为细胞从未以多能的状态培养，所以它们是较安全的。然而，在一些实施方案中，哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞可从多能细胞系人工获得。它们选择性地不含有其余的多能细胞类型的群体。
本文中所描述的细胞为不同于神经祖细胞以及/或神经干细胞(NSC)的视网膜祖细胞(RPC)。具体而言，此种哺乳动物胎儿视网膜或RPC细胞是多潜能的但并不等同于NSC。举例而言，哺乳动物胎儿视网膜或RPC细胞不是来自脑部，而是来自视网膜。此外，哺乳动物胎儿视网膜或RPC细胞产生光感受器而自脑衍生的祖细胞不能很好地产生光感受器。同样地，不像NSC，哺乳动物胎儿视网膜或RPC细胞是多潜能的(在缺少额外的操纵下)但不产生寡树突细胞。举例而言，哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞产生(分化成)包含光感受器的视网膜细胞而不是寡树突细胞。
哺乳动物胎儿视网膜或RPC细胞系自哺乳动物胎儿神经视网膜取得(或可取得)，而非取得(或可取得)自睫状缘、睫状体上皮或RPE。此外，哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞不是源自分化的米勒胶质、不是有丝***后前驱物本身、不是干细胞本身以及/或不是经单一的经分离的细胞类型本身。
哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞未在早期胚胎(例如囊胚)中发现。此外，未在正常成熟的哺乳动物(例如人)中发现任何有用丰度的哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞。
此外，视网膜祖细胞不会持续存留于生物的生命中。然而，这些哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞以其自然丰度存在发育的(胎儿)哺乳动物(例如人)视网膜中。
虽然，当在增殖情形下生长时，哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC大部分是有丝***的，少数有丝***后细胞的混合物亦可被包含在本文中所述的任何的组合物与群体。
哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞在例如人的不相关哺乳动物中作为眼同种异体移植物而免疫耐受。因而，当放置在眼睛时，RPC具有低免疫原性。通过非限制性实例，这些哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞可被移植至玻璃体腔或在视网膜下空间，以用于哺乳动物的或人的视觉或视网膜疾病治疗性治疗以及/或预防性治疗。
在替代性实施方案中，哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞不伴随肿瘤形成或其它不想要的细胞增殖的任何风险(或无实质上的风险)。
哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞以球状或贴附的单层、或者以球状然后单层以及/或以球状与单层的结合物来被培养。然而，球状不是必需的，而且在一些实施方案中，细胞以经解离的细胞而非球状或以经解离的细胞与球状之混合物移植。哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞含有在玻璃体内聚结并选择性可变成球状的移植细胞。
在替代性实施方案中，视网膜祖细胞与含有其的细胞群体不是永生的且也不允许它们永生化或者被强制永生化。虽然细胞不无限地增殖，本文中所述的示例性细胞培养方法可改善增殖速率与期间以及/或对于给定的组织捐赠可显著地改善供体细胞产量。如本文中所用者，“永生的”细胞系为可以无限***的细胞系，而“非永生的”细胞系能够***有限数目的世代。例如，非永生的视网膜祖细胞可能可以***1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多代。
RPC可为非基因改造的细胞或它们可使用发明所属技术领域中任何方法基因改造(例如稳定地、暂时地或诱导性转化)。举例而言，视网膜祖细胞可被基因改造以表达一或多个目标异源或外源核酸序列。核酸序列可为“外源的”意指对导入载体的细胞而言它是外来的，或者序列对细胞内的序列而言为同源的，但在该序列所在之宿主细胞核酸内的位置通常没被发现。核酸序列包含质粒、扩增子、cDNA、mRNA、反义RNA、siRNA，但不受限于这些实例。术语“基因”意指编码功能性蛋白质、多肽或肽的核酸单位。如将被发明所属技术领域中本领域技术人员所理解的，此功能性术语包括表达或可被改编以表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融和蛋白与突变体的基因组序列、cDNA序列与较小的工程基因片段。
可用发明所属技术领域中所已知的任何方法学基因地改变细胞。一个示例性的方法为以重组病毒载体将基因***至组织的细胞中。可使用发明所属技术领域中所知之很多不同的载体中之任一种，诸如病毒载体、质粒载体、线型DNA等，来导入编码治疗剂的外源的核酸片段至标靶细胞以及/或组织。举例而言，这些载体可使用任何的感染、转导、转染、磷酸钙介导转染、DEAE-葡聚糖介导转染、电穿孔、脂质粒介导转染、生物粒子基因递送(biolistic gene delivery)、使用融合且阴离子脂质体的脂质体基因递送(此为使用阳离子脂质体的替代方案)、直接注射、受体介导摄取、磁穿孔、超声以及如发明所属技术领域中所知之其他方法被***。
如本文所使用的，“载体”意指核酸分子可被***其中以用来导入其可被复制的细胞中的载运核酸分子。载体包含质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物性病毒以及植物性病毒)与人工染色体(例如YACs)。发明所属技术领域中本领域技术人员将很好地通过描述在Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.；Ausubel et al.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePubl.Assoc.&Wiley-Intersciences之标准重组技术构建载体。除了编码修饰的多肽以外，载体可编码诸如标签或标靶分子之非修饰的多肽。编码该融合蛋白质的有用的载体包含pIN载体、编码组胺酸串的载体以及pGEX载体，以用于产生用于后续的纯化与分开或切割的谷胱甘肽S-转移酶(GST)可溶融合蛋白质。
载体可被主要设计为用来导入异源核酸分子进入细胞，诸如“可操作地连接的”或者在一或多个控制序列的控制之下之基因。“启动子”意指聚集在RNA聚合酶II以及其他转录活化蛋白质的起始位点周围的一或多个转录控制模块。任何启动子/增强子结合(按照真核启动子数据库EPDB)也可用来驱动目标核酸分子(即组成性的、诱导的、可抑制的与组织特异性)表达。再者，载体可含有可选择的标记以帮助其在体外或离体的操作。载体亦可含有可从人生长激素(hGH)基因、牛生长激素(BGH)基因或者SV40取得的多腺苷酸化信号。此外，载体亦可含有用于生产多基因或多顺反子信使的内部核糖体结合位点(IRES)组件。IRES组件能够绕过5-甲基化帽依赖型翻译(5-methylated cap-dependent translation)的核糖体扫描模型并且在内部位点开始翻译(Pelletier,J.and Sonenberg,N.(1988)Nature 334(6180):320-325)。IRES组件可被连接于异源开放阅读框。各被IRES组件分开的多个开放阅读框可被一起转录，产生多顺反子信使。通过IRES组件，核糖体可读取每一个开放阅读框以有效的翻译。多重基因可使用单一启动子/增强子来转录单一信使以有效地表达。
在一些实施方案中，载体为病毒载体。发明所属技术领域中已知的病毒载体包含，但不限于腺病毒载体、反转录病毒载体、牛痘病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、多瘤病毒载体、α病毒载体、棒状病毒载体、慢病毒载体、Epstein-Barr病毒载体、小核糖核酸病毒载体或疱疹病毒载体。病毒载体为AAV载体的那些实施方案中，可以使用本领域已知的任何AAV载体血清型。例如，AAV载体可为AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8或AAV9。AAV可为假型化(pseudotyped)，混合衣壳蛋白与来自不同病毒血清型的病毒基因组(例如来自一种AAV血清型的末端反向重复序列及来自不同血清型的衣壳)。
在其他实施方案中，核酸序列可被包埋在脂质体或脂质制剂内。脂质体是具有磷脂双层膜与内部水介质的特征的囊泡结构。多层脂质体具有被水介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发性地形成。脂质组分在形成封闭结构之前(Ghosh,P.C.and Bachhawat,B.K.(1991)Targeted Diagn.Ther.4:87-103)进行自我重排并包埋水分与的在脂质双层之间溶解的溶质。商品上可获得的脂质体或脂质制剂中的一个实例为Lipofectamine(Invitrogen)。其他实例包括FuGENE(Promega)、PromoFectin(PromoKine)、Affectene(Qiagen)、Polyfect(Qiagen)、Superfect(Qiagen)与TransMessenger(Qiagen)。
初代视网膜细胞的分离
本文提供一种从样本分离、培养及/或使用胎儿视网膜细胞(例如人初代视网膜细胞)的经解离的悬浮物的方法。在各种实施方案中，胎儿视网膜细胞悬浮物不包含组织或骨架。也提供用于分离及表征视网膜祖细胞的方法及含有此种从供体组织收集的细胞、在培养物中生长及配制以施用给个体或病患的组合物。
本文所述用于从人样本分离初代视网膜细胞的方法不需要使用蛋白酶来消化多个初代视网膜细胞，其相较于使用蛋白酶或机械解离与蛋白酶消化的组合的方法，导致更大数目的存活的初代视网膜细胞。
一个方面中，本公开内容提供一种从人样本分离初代视网膜细胞的方法，其包含：(a)从人样本分离包含多个初代视网膜细胞的视网膜样本，(b)机械解离步骤(a)分离的视网膜样本中的多个初代视网膜细胞，从而产生细胞及细胞簇的经解离的悬浮液，及(c)测定来自视网膜样本的初代视网膜细胞的存活力、数量、形态或其组合。人样本为从人供体分离。在一些实施方案中，本文所述分离初代视网膜细胞的方法产生至少30x106个存活的初代视网膜细胞，然后经培养而产生视网膜祖细胞。
在一些实施方案中，样本为自哺乳动物分离的一只眼睛或一对眼睛，例如小鼠、大鼠、兔子、猫、狗、猴子，非人灵长类动物或人。在一些实施方案中，样本来自农业动物，例如马、牛或绵羊。
用于分离及/或培养细胞群体的样本可以从健康的个体(即，未含有视网膜疾病的单个个体)、从生病的个体收集并且不仅可包含新鲜的视网膜细胞群体还可包含冷冻的视网膜细胞群体。来源包含，但不限于，自非人胚胎、非人胎儿、儿童或成人的组织取得的全眼或视网膜组织或其他来源。本文中所描述的方法包含通过对其他视网膜祖细胞特异性标记的正相选择的进一步的富集或纯化程序或细胞分离步骤。视网膜祖细胞与细胞群体可从任何哺乳动物物种或个体，例如人、灵长类动物、马、牛、猪、犬科、猫科、雪貂、兔、啮齿动物，例如大鼠、小鼠及仓鼠等取得或收集。
在一些实施方案中，细胞在视网膜形成之后，但在光感受体外段在整个视网膜完全地形成之前并且在视网膜血管形成完成或基本上完成之前的阶段从哺乳动物胎儿视网膜收集。对于来自较大的哺乳动物的非人细胞，诸如猫科或猪的视网膜祖细胞，该阶段通常介于约3周至约11周的胎儿孕龄(例如约3、4、5、6、7、8、9、10或11周)。举例而言，参见Anand-Apte,B.与Hollyfield,J.G."Developmental Anatomy of the Retinal and ChoroidalVasculature."In The Retina and Its Disorders,Besharse,J.and Bok,D.,AcademicPress,(2001)。然而，细胞亦可从产后或新生儿的哺乳动物组织收集。
在一些实施方案中，样本为人样本。在一些实施方案中，人样本为来自人供体的一个或一对眼球。在一些实施方案中，使用较窄的供体年龄范围可改善制造期间视网膜祖细胞最终产量的一致性。
在一些实施方案中，样本为一个或一对人胎儿眼球。在一些实施方案中，眼球具有正常形态。正常形态可经由目视检测诸如完整球体、透明角膜、正常形状特征或这些特征的任何组合而测定。
在一些实施方案中，人视网膜组织可在输送窗内在冰上运输及递送。输送窗可包括将细胞在目的地或出发点保持一段时间，例如在冰上或在冰箱中约1-8℃或在约4℃温度。在一些实施方案中，输送窗为约1至40小时、约7至40小时、约1至34小时、约7至34小时、约1至26小时、约4至26小时、约7至26小时、约8至26小时、约4至18小时、约7至18小时或约8至18小时。在一些实施方案中、输送窗为约1小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时或约26小时。通过非限制实例的方式，输送窗可为约1至约26(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、或26)，例如约4.5至约21.5小时(例如，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、或21.5)或约7至约26小时(例如，7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5或26小时)。
在一些实施方案中，从供体收集后将样本置入哺乳动物细胞培养基。样本输送期间可用的哺乳动物细胞培养基包含基础细胞培养基及复杂细胞培养基二种。输送期间所用基础细胞培养基的非限制实例包含但不限于最低必要培养基(Minimum EssentialMedium)Eagle、ADC-1、LPM(无牛血清白蛋白)、F10(Ham)、F12(Ham)、DCCM1、DCCM2、RPMI1640、BGJ培养基(有与没有Fitton-Jackson的改良)、基本培养基Eagle(BME—有添加Earle氏盐基)、Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM—没有血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy氏5A培养基、培养基M199(M199E—有Earle氏盐基)、培养基M199(M199H—有Hank氏盐基)、最低必要培养基Eagle(MEM-E—有Earle氏盐基)、最低必要培养基Eagle(MEM-H—有Hank氏盐基)以及最低必要培养基Eagle(MEM-NAA有非必要氨基酸)，许多其他培养基，包含培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams'G、Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153与Ultraculture。在一些实施方案中，用于输送的细胞培养基包含RPMI-1640。在一些实施方案中，用于输送的细胞培养基包含补充L-谷氨酰胺的RPMI1640。在一些实施方案中，用于输送的细胞培养基包含AdvancedDMEM/F-12。在一些实施方案中，用于输送的细胞培养基包含完全培养基。例如，用于输送的细胞培养基包含补充N-2补充物、B27 xeno-free、B27、StemPro、表皮生长因子(EGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)或GlutaMAX I中的一或多种的基础培养基。在一些实施方案中，用于输送的细胞培养基包含一或多种抗生素。例如，用于输送的细胞培养基包含约30至100微克(μg)/毫升(mL)或约0.5至约50μg/mL的庆大霉素。在一些实施方案中，用于输送的细胞培养基包含约50μg/mL的庆大霉素。
在一些实施方案中，人样本置入输送细胞培养基后立即被储存在约1至8℃。在一些实施方案中，人样本置入输送细胞培养基后立即被储存在约4℃。例如，人样本置入输送细胞培养基后立即储存在冰上。
本公开内容提供一种从人样本，例如包含一个或一对来自人供体的眼球的样本，分离包含多个初代视网膜细胞的视网膜样本的方法。
在组织样本的处理之后或同时，视网膜祖细胞可从其他组织组分纯化。举例而言，祖细胞可在组织样本已在适合细胞生长的条件下培养一段足够让细胞去贴附培养皿的时间之后，从其他细胞与组织组分纯化。在一些实施方案中，细胞的纯化涉及在培养期间取得从组织样本迁移且出现在培养基或者松散地贴附在纤连蛋白或其他基质或者饲养层细胞层(feeder cell layer)的细胞。这些细胞可通过常规方法取得，诸如：移除与离心培养基以使其中的细胞沉淀成粒，以及以诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Hanks平衡盐溶液之溶液清洗残留在培养皿的细胞以移除作为贴壁细胞层松散地黏贴的那些细胞。这个清洗溶液也可接着离心以取得细胞。视网膜祖细胞与细胞群体的纯化可进一步涉及从一些不溶的组织组分，包含诸如脂质的残留组织物质分离细胞。细胞可通过发明所属技术领域中已知与可获得的任何方法，从其他组织组分中分离，前述之方法包含例如使用密度梯度、离心、通过流式细胞仪或磁性细胞分离(MACS)分拣以及过滤或其结合。纯化细胞的特定方法的实例在领域中为已知且载于，例如：在美国专利案No.6,777,231。也可用负分离方法来移除一或多个特定类型的细胞。
组织也可被处理或「经解离」。例如，组织诸如一个或一对眼球可被处理或解剖以分离视网膜，且视网膜经解离以产生多个初代视网膜细胞及细胞簇。然后，这些初代视网膜细胞及细胞簇如本文所述经培养以产生多个视网膜祖细胞。
因此，本公开内容提供一种从人样本分离包含多个初代视网膜细胞的视网膜样本的的方法。人样本包含，例如一个或一对来自人供体的眼球。在一些实施方案中，该方法包含：(i)从输送培养基移出一个或一对人眼球，(ii)用约1-8℃补充抗生素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗一个或一对人眼球，(iii)从一个或一对人眼球移出视神经及间质组织，(iv)用约1-8℃补充抗生素的PBS洗涤一个或一对人眼球，(v)使用针于角膜缘穿刺一个或一对人眼球的每一个的球体，(vi)例如使用一对微剪刀，沿一个或一对人眼球之角膜缘周向切割，(vii)从一个或一对人眼球移出晶状体、角膜及相连的玻璃体，(viii)从视网膜色素上皮(RPE)层解离视网膜以产生经分离的视网膜或一对经分离的视网膜，及(ix)将经分离的视网膜或一对经分离的视网膜置于约1-8℃的培养基或PBS中，其中培养基或PBS补充抗生素。各步骤可重复1-5次或更多次样本的清洗(或洗涤)。例如，样本可被清洗1、2、3、4或5次。在一些实施方案中，本文所述方法产生的视网膜样本不含或基本上不含眼外细胞细胞。
在一些实施方案中，使用本文所述方法分离的视网膜样本经解离以产生经分离的的视网膜细胞及视网膜细胞簇，其经培养以产生视网膜祖细胞。在一些实施方案中，机械解离视网膜样本。在一些实施方案中，解离包含(i)将视网膜样本转移至试管，(ii)机械解离视网膜样本以产生多个经解离的初代视网膜细胞，(iii)经由离心使多个经解离的初代视网膜细胞沉淀成粒，及(iv)移出上清液。机械解离可通过为本领域已知的任何方式完成，包含但不限于，用无菌移液管粉碎。在一些实施方案中，进行粉碎多次，例如2至50次，2至10次，或2至8次，或直到视网膜样本分解为合适尺寸的细胞簇。在一些实施方案中，进行粉碎4至8次。
在一些实施方案中，视网膜样本的解离包含用蛋白酶消化。在一些实施方案中，视网膜样本的解离包含用蛋白酶及机械解离消化。在一些实施方案中，蛋白酶为胰蛋白酶。合适的胰蛋白酶组合物为此发明所属技术领域中本领域技术人员已知且包含，但不限于，TrypLE(Thermo Fisher Scientific)、TrypLE Select(Invitrogen)及TrypLE Express(Invitrogen)。例如，经分离的视网膜可在未稀释的TrypLE Express中吸放。蛋白酶诸如胰蛋白酶活性可被通过添加过量的无蛋白酶的培养基以停止反应中和。例如，5x、10x、15x或20x过量的培养基可加入包含经解离的视网膜的混合物。
解离可通过物理解离以及/或通过曝露于有助使细胞从其他组织组分释出以产生细胞以及/或细胞簇的“经解离的悬浮液”的酶制品中来进行。该酶的实例包含，但不限于，基质金属蛋白酶、梭菌蛋白酶(clostripain)、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、类胰蛋白酶、胃蛋白酶、类胃蛋白酶、中性蛋白酶以及胶原酶。适合的蛋白水解酶描述在美国专利案No.5,079,160、6,589,728、5,422,261、5,424,208以及5,322,790中。举例而言，酶制品可仅包含胰蛋白酶或者结合一或多个其它的酶。酶促解离可与通过例如切碎(mincing)、吸放(pipetting)、剁碎(chopping)、均质化、磨碎(grinding)、冻融、渗透冲击(osmoticallyshocking)之物理解离结合执行以移除不想要的细胞或连接的组织而最终产生单一细胞簇或可包含可通过尺寸例如“小”、“中”以及“大”来定义的细胞簇。细胞簇尺寸是主观的且在实施本文所公开的主题中可所有变动。本文所述分离的初代视网膜细胞包含经分离的细胞及细胞簇。经分离的初代视网膜细胞簇可为约2-5000个细胞、2-4000个细胞、2-3000个细胞、2-2000个细胞、2-1000个细胞、2-100个细胞、50-5000个细胞、50-4000个细胞、50-3000个细胞、50-2000个细胞、50-1000个细胞、50-100个细胞、500-5000个细胞或500-1000个细胞。
包含多个经分离的初代视网膜细胞的组合物可经由离心沉淀成粒以使细胞浓缩、洗涤或清洗细胞或改变细胞培养基。例如，多个经解离的初代视网膜细胞可经培养基或PBS，任选地补充抗生素洗涤。多个经解离的初代视网膜细胞可经由约100xg(离心力)至约1000xg、约100xg至约500xg、约140xg至约300xg的离心而沉淀成粒。在一些实施方案中，多个经解离的初代视网膜细胞经约140xg离心沉淀成粒。在一些实施方案中，多个经解离的初代视网膜细胞经由约300xg的离心而沉淀成粒。可离心约1分钟至30分钟。例如，包含多个经分离的初代视网膜细胞的组合物可离心约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30分钟。离心可在维持细胞存活力所需要的任何温度进行。在一些实施方案中，包含多个经分离的初代视网膜细胞的组合物在约0℃至50℃离心。在一些实施方案中，包含多个经分离的初代视网膜细胞的组合物在约4℃离心。在一些实施方案中，包含多个经分离的初代视网膜细胞的组合物在约18-24℃离心。在一些实施方案中，包含多个经分离的初代视网膜细胞组合物在约37℃离心。
在方法本文所述一些实施方案中，该方法包含(i)将经解离的、沉淀成粒的初代视网膜细胞再悬浮于约1-8℃的补充抗生素的培养基，(ii)将多个经解离的视网膜细胞接种于一或多个经包被的含有培养基的细胞培养瓶或培养板中，任选地其中细胞培养基补充抗生素，(iii)在约10至50℃培育多个经解离的视网膜细胞，任选地其中在约37℃培育，及(iv)测定初代视网膜细胞及视网膜细胞簇的数量及存活力。培养瓶或培养板可被接种任何合适的密度。例如，培养瓶或培养板可被接种约1至约1,000,000,000个细胞。可替代的，培养瓶或培养板可被接种约10,000至约5x106个细胞/平方厘米(cm2)。另一种选择，培养瓶或培养板可被接种约0.50x106至约2.5x106个细胞/平方厘米(cm2)。另一种选择，培养瓶或培养板可被接种约0.82x106至约2.06x106个细胞/平方厘米(cm2)。另一种选择，培养瓶或培养板可被接种约0.1x106至约20x106个个细胞/cm2，约1x106至约20x106个细胞/cm2，约2x106至约20x106个细胞/cm2，约3x106至约20x106个细胞/cm2，约4x106至约20x106个细胞/cm2，约5x106至约20x106个细胞/cm2，约6x106至约20x106个细胞/cm2，约7x106至约20x106个细胞/cm2，约8x106至约20x106个细胞/cm2，约9x106至约20x106个细胞/cm2，约10x106至约20x106个细胞/cm2，约0.2x106至约10x106个细胞/cm2，约0.2x106至约5x106个细胞/cm2，约0.2x106至约4x106个细胞/cm2，约0.2x106至约3x106个细胞/cm2，约0.2x106至约2x106个细胞/cm2，约0.5x106至约10x106个细胞/cm2，约0.5x106至约5x106个细胞/cm2，约0.5x106至约4x106个细胞/cm2，约0.5x106至约3x106个细胞/cm2或约0.5x106至约2.5x106个细胞/cm2。
在一些实施方案中，本文所述方法产生约20x106至约1x109个存活的初代视网膜细胞，约20x106至约1x108个存活的初代视网膜细胞，约20x106至约1x107个存活的初代视网膜细胞，约30x106至约1x109个存活的初代视网膜细胞，约30x106至约1x108个存活的初代视网膜细胞，约30x106至约1x107个存活的初代视网膜细胞，约20x106至约147x106个存活的初代视网膜细胞，约20x106至约100x106个存活的初代视网膜细胞或约73x106至约147x106个存活的初代视网膜细胞。在一些实施方案中，本文所述方法产生至少约20x106个存活的初代视网膜细胞。在一些实施方案中，本文所述方法产生至少约30x106个存活的初代视网膜细胞。在一些实施方案中，本文所述方法产生至少约35x106个存活的初代视网膜细胞。在一些实施方案中，本文所述方法产生至少约30x106个存活的初代视网膜细胞。在一些实施方案中，本文所述方法产生至少约45x106个存活的初代视网膜细胞。在一些实施方案中，本文所述方法产生至少约50x106个存活的初代视网膜细胞。在一些实施方案中，本文所述方法产生至少约20x106个存活的初代视网膜细胞，至少约30x106个存活的初代视网膜细胞，至少约40x106个存活的初代视网膜细胞，至少约50x106个存活的初代视网膜细胞，至少约60x106个存活的初代视网膜细胞，至少约70x106个存活的初代视网膜细胞，至少约80x106个存活的初代视网膜细胞，至少约90x106个存活的初代视网膜细胞，至少约100x106个存活的初代视网膜细胞，至少约120x106个存活的初代视网膜细胞，至少约140x106个存活的初代视网膜细胞，至少约145x106个存活的初代视网膜细胞，至少约147x106个存活的初代视网膜细胞，至少约150x106个存活的初代视网膜细胞，至少约170x106个存活的初代视网膜细胞，至少约190x106个存活的初代视网膜细胞或至少约200x106个存活的初代视网膜细胞。
细胞形态、数目及存活力
本文提供一种用于测定视网膜样本的初代视网膜细胞的存活力、数量及形态的方法以及测定由初代视网膜细胞产生的视网膜祖细胞的存活力、数量及形态的方法。
使用任何合适的方法、经由光学显微镜可以测定细胞形态。合适的光学显微镜方法为发明所属技术领域中本领域技术人员所已知，且包含，但不限于，微分干涉相位差显微镜、Nomarski、Hoffman调控相位差显微镜及其变体、荧光显微镜及共聚焦显微镜。任选地，可以使用供一或多个经分离的初代视网膜细胞标记使用的组织化学染色。
使用NC200 Automated细胞计数器(Chemometec)及聚集细胞计数方法可以测量细胞数目及存活力。可替代的，或额外的，使用台盼蓝或血球计可以测量细胞数目及存活力。
在一些实施方案中，存活的经计数细胞之百分比为约10％至约100％或约68％至约85％。
例如本文中所描述的，哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞定量地表达不同的基因谱；或者它们定量地表达不同的可溶性因子谱；或者它们定量地表达不同的表面标记谱。而且哺乳动物胎儿视网膜细胞或RPC细胞具有不固定的、不变的或不可变的基因谱。相反地，他们具有在培养中随着时间定量地动态改变的基因谱。
本文所公开的主题系有关于含有根据定义的细胞培养方法所分离的并且表达特征标记的哺乳动物视网膜祖细胞的细胞群体。细胞群体可为从哺乳动物分离并且在体外生长的细胞培养物。举例而言，培养物可包括培养在培养板、培养皿、培养瓶或生物反应器中的细胞悬浮液或者贴壁细胞。样本可为均质或异质，可通过如本文所定义之一或多个标记的表达来判定。本文所公开的细胞群体为混合的细胞群体并且可含有未分化以及分化的细胞之混合物。本文所定义的视网膜祖细胞的标记特征的相对表达量可在群体中的细胞之间变动。
视网膜祖细胞可通过它们分子标记的表达而表征，包含细胞表面的标记与非表面的(基因的)标记。然而，在本领域中常见的是，对于特定的标记将细胞称为“阳性”或“阴性”，真正的表达量系定量地判定的。在细胞表面(或位在其他地方)上的分子数目可相差几个对数地变动，仍被表征为“阳性”。亦被发明所属技术领域中本领域技术人员所理解的是，对染色为阴性，即标记特异性试剂的结合量与例如同型匹配对照的对照无可测得差异的细胞可表达微量的标记。标识的“染色”量之表征容许在细胞群体之间的细微差异。细胞的染色强度可通过流式细胞仪来监控，其激光检测荧光染料(正比于被例如抗体的特异性试剂所结合的细胞表面的标记的量)的量化浓度。流式细胞仪或FACS亦可用以依照结合于专一试剂的强度以及诸如细胞尺寸与光线散射之其他参数，来分开细胞群体。虽然染色的绝对量可随特定的荧光染色剂与试剂制品而不同，但数据可以对照来标准化。
为了以对照来标准化分布，每一个细胞被记录成具有特定的染色强度的数据点。这些数据点可根据对数尺度显示，测量的单位为任意的染色强度。通过实例的方式，样本中最亮的染色细胞的强度可较未染色的细胞强多至4个对数。当以此方式表示时，落在染色强度的最高对数的细胞为明亮的，而那些在最低强度的细胞为阴性的。低的阳性的染色细胞具有高于同型匹配对照的亮度的染色量但是不如正常在群体中发现的最明亮的染色的细胞一样强。低阳性的细胞可具有异于样本中阴性与明亮的染色阳性细胞的独特特性。替代性对照可利用表面上具有定义的标记密度的基质，举例而言，建造的珠或细胞系，提供强度的阳性对照。
在从其中获得视网膜祖细胞与细胞群体的视网膜组织之培养的期间，标记的表达可受到改变。举例而言，标记表达之差异可受诸如氧气浓度(即，大气的氧气条件或含氧量正常的条件或者低氧气条件，也就是所知的缺氧条件)的培养的条件的影响。通过非限制实例的方式，低氧气条件可包含0.5％-10％氧气(即，0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10％)。在一些实施方案中，低氧气条件可为约0.5％-5％、约1％-5％或约1％-3％。发明所属技术领域中本领域技术人员将知道的是，视网膜祖细胞与细胞群体的标记表达不是静态的并可随着一或多个培养条件(即培养基、氧气浓度、代数及培养时间等)的作用而改变。
视网膜祖细胞与细胞群体可表达一或多个、二或多个、三或多个、四或多个、五或多个、六或多个、七或多个、八或多个、九或多个、十或多个、十一或多个、十二或多个、十三或多个、十五或多个、十六或多个、十七或多个、十八或多个、十九或多个、二十或多个、二十五或多个、三十或多个本文中所定义的标记或者介于高达五十或多个标记的任何增量。
培养初代视网膜细胞及视网膜祖细胞(RPC)
本文提供一种培养初代视网膜细胞及视网膜祖细胞的方法以产生用于移植及治疗应用的视网膜祖细胞群体。
本文所述方法可产生大量存活细胞。例如，本文所述方法在收集时可产生约十亿个或以上的视网膜祖细胞。在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％细胞存活。
在一些实施方案中，供体细胞可不用抗生素培养以避免改变细胞。此外，在不用抗生素情况下，因为可排除潜隐性微生物污染，所以可以使用非常低代细胞。在替代性实施方案中，使用低代细胞具有低转化及/形成肿瘤风险。此外，使用低代细胞最接近存在于发育视网膜中的天然细胞。
在一些实施方案中，使用抗生素培养初代视网膜细胞及视网膜祖细胞。合适的抗生素包含，但不限于，青霉素、链霉素及庆大霉素。在一些实施方案中，抗生素包含庆大霉素。在一些实施方案中，庆大霉素浓度为约0.5至50μg/mL，例如，约0.5至40μg/mL，约5至50μg/mL或约5至35μg/mL。在一些实施方案中，庆大霉素浓度为约50μg/mL。在一些实施方案中，庆大霉素浓度为约30μg/mL。
任何适合的基本培养基可用于RPC的生长与培养。细胞培养描述细胞生长在控制的条件下之过程，一般在其自然环境之外。细胞群体可在领域中已知的任何细胞培养基中生长或培养。术语“基本培养基”意指可支持细胞生长的任何培养基。基本培养基提供标准的无机盐类，诸如锌、铁、镁、钙与钾、维生素、葡萄糖、缓冲***以及主要氨基酸。可用于本发明的基本培养基包含，但不限于，最低必要培养基Eagle、ADC-1、LPM(无牛血清白蛋白)、F10(Ham)、F12(Ham)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(有与没有Fitton-Jackson的修饰)、基本培养基Eagle(BME—有添加Earle氏盐基)、Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM—没有血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy氏5A培养基、培养基M199(M199E—有Earle氏盐基)、培养基M199(M199H—有Hank氏盐基)、最低必要培养基Eagle(MEM-E—有Earle氏盐基)、最低必要培养基Eagle(MEM-H—有Hank氏盐基)以及最低必要培养基Eagle(MEM-NAA有非必要氨基酸)，许多其他培养基，包含培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams'G、Neuman&Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB411、MDBC 153与Ultraculture。在替代性实施方案中，用于培养本文中所描述的视网膜祖细胞的培养基为Advanced DMEM/F12与Ultraculture。这些培养基中的一些被总结在Methods in Enzymology,Volume LVIII,"Cell Culture,"pp.62-72。
在一些实施方案中，培养基包含Dulbecco氏改良Eagle培养基DMEM/F12、AdvancedDMEM/F12、Knockout DMEM/F12、Neurobasal培养基、ReNcell或Ultraculture培养基。在一些实施方案中，培养基包含DMEM/F12。
“条件培养基”意指相较于基础或基本培养基为有改变的培养基。举例而言，培养基的调节可导致诸如营养物以及/或生长因子的分子相较于在基本培养基所存在的原始浓度增加或减小。培养基可通过允许特定类型的细胞在特定条件下在培养基生长或维持持续一特定期间来调节。举例而言，培养基可通过允许视网膜祖细胞扩增、分化或维持在被定义组成的培养基在被定义的温度下持续被定义的时数来被调节。如本领域技术人员所领会的是，细胞、培养基类型、持续时间与环境条件的数种结合可被用于产生几乎无限数组的条件培养基。
细胞培养补充物或添加物的实例包含，但不限于，以部分或全部取代在支持细胞存活或生长中的血清的作用的成分。举例而言，补充物可包含胰岛素、过渡金属蛋白(transmetalloprotein)、微量元素、维生素或其他因子。这些因子一般未包含在基本培养基中但被一般用于培养细胞的血清所提供。补充物或添加物可包含支持细胞生长的下列组分中至少一或多个：一或多个胰岛素或其取代物、一或多个过渡金属蛋白质或其取代物、一或多个微量元素(例如：硒、铁、锌、铜、钴、铬、碘、氟化物、镁、钼、钒、镍、锡)、一或多个维生素(例如：维生素C、维生素E、维生素A、维生素B群)、一或多个盐类(例如：钠盐、镁盐、钙盐或磷酸盐)、一或多个缓冲液(例如：磷酸盐缓冲溶液、HEPES缓冲液)、一或多个氨基酸(例如：L-谷氨酰胺)、一或多个激素、类激素化合物或生长因子(诸如，例如：运铁蛋白、EGF、NGF、ECGF、PDGF、FGF、IGF、LIF、白细胞介素、干扰素、TGF以及/或VEGF、胰高血糖素、皮质类固醇、血管加压素或***素及其他生长因子)、血清白蛋白或其取代物、一或多个糖类(葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、核糖、糖降解代谢物)、一或多个抗生素以及/或抗真菌剂(例如青霉素、链霉素、二性霉素B(Fungizone))以及一或多个脂质(游离及结合蛋白质的脂肪酸、甘油三酯、磷脂质、胆固醇或乙醇胺)。例示性补充物包含N-2(N2)补充物。诸如剔除血清替代物(KnockOut Serum Replacement，KOSR)、N2、B27、StemPro(有时在本文中称为Stempro)、胰岛素-运铁蛋白-硒补充物(ITS)与G5之许多商品化血清取代添加物对发明所属技术领域中本领域技术人员而言为已知且容易获得的。这些添加物通过被定义好的成分表征，所以其组分浓度可依照其在培养基中的比例来判定。在一些实施方案中，培养基包含人表皮生长因子(EGF)，以及碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)。
通过非限制实施方案之方式，细胞以及/或小细胞簇被培养在不含血清的培养基或含有血清的培养与抗生素及抗真菌剂或者无抗生素或抗真菌剂之无菌环境不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或者更多代。细胞以及/或小细胞簇被培养在基本培养基中(例如Dulbecco氏改良Eagle培养基：Nutrient Mixture F-12TM(DMEM/F12TM)培养基或ADVANCEDDMEM/F12TM培养基(Gibco-Invitrogen-Life Technologies,Carlsbad Calif.))或者ULTRACULTURE TM培养基(BioWhittaker-Lonza Walkersville,Inc.,Walkersville,Md.)，选择性地搭配N2补充物(Invitrogen)或B27或无异源B27(Invitrogen)、L-谷氨酰胺或GlutaMax或GlutaMAX-I(Invitrogen)以及包含例如EGF与bFGF(Invitrogen)之人重组生长因子，或其他生长因子。举例而言，用于人细胞之DMEM/F12TM培养基以及用于猫科或犬科细胞的ULTRACULTURE TM培养基。
在一些实施方案中，细胞及/或细胞簇被培养至少1、2、3、4或5代。在一些实施方案中，细胞及/或细胞簇被培养5代以上。在一些实施方案中，培养基包含Dulbecco氏改良Eagle培养基DMEM/F12、Advanced DMEM/F12、Knockout DMEM/F12、Neurobasal培养基、ReNcell及Ultraculture。在一些实施方案中，培养基包含Advanced DMEM/F12。
在一些实施方案中，培养基包含Advanced DMEM/F12、N-2补充物、GlutaMAX I、重组型人表皮生长因子(EGF)以及碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)。在一些实施方案中，培养基进一步包含B27、B27 xeno-free或StemPro。在一些实施方案中，培养基包含浓度为约30μg/mL的庆大霉素。
培养基亦可选择性地添加白蛋白或者人或猫科或犬科的白蛋白、或者重组的白蛋白或白蛋白。通过非限制实施方案之方式，白蛋白可以具有约1.0mg/ml的起始浓度的量加入。
可在含有减少的或没有血清的培养基中产生哺乳动物的视网膜祖细胞的培养物。血清的实施方案包含胎牛血清、小牛血清、新生牛血清、山羊血清、马血清、人血清、兔血清、大鼠血清、小鼠血清等等。在特定培养条件下，血清浓度可在约0.05％v/v至约20％v/v的范围内(例如：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、1、1.5、2、2.5、3、3.5、5、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20％)。举例而言，在一些分化的过程中，培养基的血清浓度可小于约0.05％(v/v)、小于约0.1％(v/v)、小于约0.2％(v/v)、小于约0.3％(v/v)、小于约0.4％(v/v)、小于约0.5％(v/v)、小于约0.6％(v/v)、小于约0.7％(v/v)、小于约0.8％(v/v)、小于约0.9％(v/v)、小于约1％(v/v)、小于约2％(v/v)、小于约3％(v/v)、小于约4％(v/v)、小于约5％(v/v)、小于约6％(v/v)、小于约7％(v/v)、小于约8％(v/v)、小于约9％(v/v)、小于约10％(v/v)、小于约15％(v/v)或小于约20％(v/v)。在一些实施方案中，视网膜祖细胞与包含视网膜祖细胞的细胞群体在没有血清(无血清)、没有血清取代物以及/或没有任何添加物的条件下生长。
视网膜祖细胞或包含视网膜祖细胞的细胞群体在无异源条件之下培养。“无异源(Xeno-free或xenogen-free)”意指其中特定物种的细胞(例如：人细胞)在仅有人产物或补充物(例如：人血清白蛋白、人血清)而无其他物种的产物的存在下生长或培养的条件。此对于用来移植到人的细胞尤其重要。已经曝露于各种未被定义的动物衍生产物的细胞因为移植排斥、免疫反应、与病毒或细菌的感染、朊病毒颗粒以及尚未被定义的人畜共通传染病的风险增加而使得其在临床应用上为不可取的。而且，为了包含人的使用或非人的哺乳动物(例如兽医的使用)的使用的所有哺乳动物的使用，对细胞筛选正常核型或者被例如支原体、革兰氏阴性菌(例如内毒素试验)、真菌类及其类似物的感染或污染的存在。细胞亦可通过端粒酶活性分析、hTERT基因表达、及在软琼脂的生长或在裸鼠的肿瘤形成来针对致肿瘤性或向癌性表型的转化筛选。所述分析为本领域已知的并且为发明所属技术领域中的本领域技术人员的范围内。
视网膜祖细胞或包含视网膜祖细胞的细胞群体可被培养在饲养层细胞层(例如：胚胎的或成人的纤维母细胞)或者在细胞外基质骨架或基质，诸如胶原蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、明胶或Matrigel的存在下。举例而言，
Figure GDA0003170202000000341
胶原蛋白已知作为所有胶原蛋白的纯度(＞99.9％的胶原蛋白含量)、功能、并且可得的最像天然的胶原蛋白的标准。
Figure GDA0003170202000000351
胶原蛋白为接近97％的I型胶原蛋白且其余部分由III型胶原蛋白组成，并且适合用来表面涂布、提供用来培养细胞的薄膜制备物或用作为固体胶。本领域所已知的骨架或基质的另一实例为细胞startTM(Invitrogen)。
在一些实施方案中，细胞培养条件可涉及细胞在设定于37℃与5％CO2的培养箱中的生长。初代视网膜细胞、视网膜祖细胞或包含其的细胞群体可被培养在含氧量正常的或大气条件(约20％氧气)下，并且可生长在接近怀孕期间发育中的胎儿视网膜的氧气浓度的条件下，即“低的”或“缺氧的”条件，例如：0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％氧气或者介于其间的任何增量。在一些实施方案中，细胞培养条件可涉及细胞在设定如下的培养箱中生长：(1)37℃，在0至30％CO2及0至50％O2、(2)7℃，在小于或等于5％CO2及小于或等于20％O2；或(3)37℃，小于或等于5％CO2及小于或等于3％O2。
铺板接种密度意指每单位体积的培养基中的细胞数目或者在贴壁培养物(adherent culture)中每cm2的细胞数目。文中相似的术语为“汇合”，其通常用作为细胞培养皿或瓶中细胞数目的测量并且意指培养皿或瓶被细胞覆盖的覆盖率。举例而言，100％汇合意谓培养皿被细胞完全地覆盖，且因此没有多的空间给细胞生长；而50％汇合意谓大约一半的培养皿被覆盖并且还有空间给细胞生长。
在一些实施方案中，该方法包含第一继代，第一继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约0.5x106至约3.0x106个细胞/平方厘米(cm2)、约0.5x106至约5.0x106个细胞/cm2、约0.55x106至约4.0x106个细胞/cm2、约0.55x106至约3.0x106个细胞/cm2、约0.55x106至约2.5x106个细胞/cm2或约0.55x106至约2.1x106个细胞/cm2的细胞。在一些实施方案中，第一继代包含在培养瓶或培养板接种密度约0.5x106至约3.0x106个细胞/cm2的细胞。在一些实施方案中，第一继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约0.59x106至约2.29x106个细胞/cm2的细胞。
在一些实施方案中，该方法包含第二继代，第二继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约0.05x106至约1x106个细胞/cm2的细胞、约0.07x106至约0.80x106个细胞/cm2、约0.10x106至约0.5x106个细胞/cm2、约0.10x106至约0.4x106个细胞/cm2、约0.13x106至约0.35x106个细胞/cm2，或约0.14x106至约0.32x106个细胞/cm2。在一些实施方案中，第二继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约0.1x106至约0.5x106个细胞/cm2细胞。在一些实施方案中，第二继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约0.14x106至约0.43x106个细胞/cm2的细胞。
在一些实施方案中，该方法包含第三继代，第三继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约0.01x106至约0.5x106个细胞/cm2、约0.02x106至约0.45x106个细胞/cm2、约0.03x106至约0.40x106个细胞/cm2、约0.04x106至约0.30x106个细胞/cm2、约0.05x106至约0.20x106个细胞/cm2或约0.05x106至约0.10x106个细胞/cm2的细胞。在一些实施方案中，第三继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约0.03x106至约0.2x106个细胞/cm2的细胞。在一些实施方案中，第三继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约0.05x106至约0.1x106个细胞/cm2的细胞。
在一些实施方案中，该方法包含第四继代及任选地更多进一步继代，该第四继代及任选地更多进一步继代包含在培养瓶或培养板接种细胞密度为约10,000至约60,000个细胞/cm2、约10,000至约50,000个细胞/cm2、约10,000至约40,000个细胞/cm2、约20,000至约60,000个细胞/cm2、约20,000至约50,000个细胞/cm2、或约20,000至约40,000个细胞/cm2的细胞。在一些实施方案中，第四继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约10,000至约60,000个细胞/cm2的细胞。在一些实施方案中，第四继代包含在培养瓶或培养板接种密度为约20,000至约40,000个细胞/cm2的细胞。
在一些实施方案中，该方法包含在培养瓶接种细胞，在较早代数接种较高密度，在较晚代数接种较低密度。不希望受到理论束缚，认为在前几代中细胞从细胞簇转变为单个细胞，此种细胞簇至单个细胞的逐渐转变有助于本文所述方法增加细胞存活力。后来代数以单个细胞形式接种，接种密度快速下降，然后成为一致。作为非限制实例，在第一继代，在培养瓶或培养板接种密度约0.5x106至约3.0x106个细胞/cm2的细胞，在第二继代，密度约0.1x106至约0.5x106个细胞/cm2，在第三继代，密度约0.03x106至约0.2x106个细胞/cm2，及在第四继代及进一步继代，密度约10,000至约60,000个细胞/cm2。进一步非限制实例，在第一继代，在培养瓶或培养板接种密度约0.59x106至约2.29x106个细胞/cm2的细胞，在第二继代，密度约0.14x106至约0.32x106个细胞/cm2，在第三继代，密度约0.05x106至约0.1x106个细胞/cm2，及在第四继代及进一步继代，密度约20,000至约40,000个细胞/cm2。
在一些实施方案中，次序上紧邻的继代之间的时间段为2至8天、3至6天、4至5天或3至4天。在一些实施方案中，继代之间的时间段为4天。在一些实施方案中，次序上紧邻的继代之间的时间段为3天。
在一些实施方案中，继代方案包含存活细胞数目的目标阈值，如果未符合这些目标阈值则终止细胞培养。例如，如果产生的存活细胞小于90百万、100百万、110百万、120百万、130百万、140百万或150百万，可在第3代(P3)末终止细胞培养。进一步实例，如果产生的存活细胞小于200百万、小于250百万、小于300百万、小于350百万、小于400百万、小于450百万或小于500百万，可在第4代(P4)末终止细胞培养。
继代(也称为传代培养或***细胞)涉及移动少数的细胞到新的器皿。如果定期地***细胞，细胞可被培养较长的时间，由于其避免由长期的高细胞密度所引起的衰老。悬浮液培养易于通过以大体积的新鲜培养基稀释含有少许的细胞的小量的培养物传代。就贴壁培养而言，细胞首先需要去贴壁。此通常以酶诸如胰蛋白酶-EDTA或胰蛋白酶等效物及EDTA的混合物或如细胞解离缓冲液的非酶溶液的混合物来完成，然而，可获得各种用于此目的的酶或非酶混合或制剂。少量的去贴壁的细胞可接着被用来接种新的培养物。
在一些实施方案中，细胞经包含不同于第一继代、第二继代及第三继代的胰蛋白酶或等效物的溶液处理。在例示性方案中，在第一继代，细胞经包含TrypLE与乙二胺四乙酸(EDTA)的比为1：4的第一酶溶液处理，在第二继代，细胞经包含TrypLE、EDTA与Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)的比为1：1：3的第二酶溶液处理，在第三及每一个后续代，细胞经包含TrypLE与DPBS的比为1：1的第三酶溶液处理。在进一步例示性方案中，在第一继代，细胞经包含TrypLE、EDTA与PBS的比为1：1：3的第一酶溶液处理，在第二继代，细胞经包含TrypLE与DPBS的比为1：1的第二酶溶液处理，在第三及每一个后续代，细胞经包含TrypLE与DPBS的比为1：1的第三酶溶液处理。细胞可经胰蛋白酶或等效物溶液处理约5-20分钟、约6-10分钟、约5-10分钟、约7-8分钟或约5-7分钟。细胞存活力、数目及/或形态可在任何代测定。例如，细胞存活力及数目可在第三及第四继代测定以决定是否终止细胞培养，或测定细胞接种密度。大部分初代细胞培养物寿命有限，且不会无限地增殖。经过一定数目群体倍增(称为Hayflick限度)后，细胞经历衰老过程及停止***，同时通常维持存活力。在一些实施方案中，视网膜祖细胞及细胞群体可被培养不多于10代，例如，继代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。在一些实施方案中，在标准氧气条件下，RPC经继代约4-6(例如，4、5或6)次，且任选地，随后在低氧气条件下培养约1-10(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)代。
在替代性实施方案中，细胞可被继代(标准氧气条件下、低氧气条件下及/或其任何组合)多于5次，诸如，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多代。在特定实施方案中，视网膜祖细胞及细胞群体被培养约5-32(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32)代。发明所属技术领域中本领域技术人员会体认到此技术领域中其他方法可用于培养细胞多于32代(即，33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多代)。
使用本文所述方法，任何合适的容器诸如培养瓶、培养板或细胞堆可用于继代细胞。例示性培养瓶包含T25及T75培养瓶。细胞堆(CellStack，CS)为堆栈式培养室，例如来自Corning。在一些实施方案中，培养瓶、培养板或细胞堆可经包被。培养瓶、培养板及细胞堆可经稀释于Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)的纤连蛋白、鸟胺酸、聚赖胺酸或层粘连蛋白包被。在一些实施方案中，培养瓶、培养板或细胞堆可经纤连蛋白包被。在一些实施方案中，纤连蛋白为无异源。任选地，在将细胞置入之前可用培养基清洗培养瓶、培养板或细胞堆。
各种实施方案中，筛选细胞样本是否存在病原体、细菌、内毒素、真菌、支原体、病毒、肝炎病毒或HIV病毒。也可以筛选细胞样本是否存在正常核型；存活力；及/或致肿瘤性。任选地，细胞样本未表现提高的端粒酶活性。
在如本文所提供这些方法中的任何方法中，视网膜细胞以及/或视网膜组织可在分离、选择以及/或培养之前或之后被冷冻。可使用在本领域中普遍使用的任何冷冻保存剂以及/或技术完成细胞冷冻。在使用之前，被冷冻的细胞可使用任何在本领域中已知的方案解冻。
细胞的存活力可在他们用于本文所述任何方法之前检测。在替代性实施方案中，通过非限制实例，在冷冻保存之前，至少70％(例如，70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)的细胞是具存活力的。在解冻后，在替代性实施方案中，至少70％(例如，71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)的细胞是具存活力的。同样地，一旦细胞培养恢复，在替代实施方案中至少70％(例如，70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)的细胞是具存活力的。在任何阶段具存活力的细胞的数目的确定是在发明所属技术领域中常规技能水平之内。
因此，本公开内容提供一种冷冻保存使用本文所述分离及培养方法产生的多个视网膜祖细胞的方法。在一些实施方案中，该方法包含(i)使用胰蛋白酶或等效物酶解离细胞，(ii)用过量的培养基或Advanced DMEM/F12停止解离，(iii)经10xg及10,000xg离心1至30分钟使细胞离心，(iv)使细胞再悬浮于培养基且测定总细胞计数及存活力，(v)添加冷冻保存介质以达到最终二甲基亚砜(DMSO)浓度为5至30％，(vi)将多个细胞等分于各冷冻管，(vii)使用控制速率冷冻机冷冻各冷冻管，及(viii)将各冷冻管的细胞置于液态N2中。可以使用发明所属技术领域已知的任何合适的冷冻方法。例如，可使用置于-80℃冰箱的Cryo1C冷冻容器冷冻细胞。在一些实施方案中，胰蛋白酶等效物为TrypLE，诸如TrypLE Express或TrypLE Select(例如ThermoFisher或Invitrogen)。在一些实施方案中，冷冻保存介质包含培养基及20％DMSO。在一些实施方案中，将冷冻保存介质加入细胞与细胞培养基(比例为1：1)以达到10％DMSO的最终浓度。在一些实施方案中，多个视网膜祖细胞以每个冷冻管约0.5x106至50x106个细胞被等分及冷冻。在一些实施方案中，多个视网膜祖细胞以每mL培养基(介质)(例如培养基加上10％DMSO)约0.5x106至约40x106个细胞、每mL培养基约0.5x106至约20x106个细胞、每mL培养基约0.5x106至约10x106个细胞、每mL培养基约1x106至约40x106个细胞、每mL培养基约1x106至约20x106个细胞、每mL培养基约1x106至约10x106个细胞、每mL培养基约10x106至约30x106个细胞、每mL培养基约10x106至约20x106个细胞、每mL培养基约2x106至约10x106个细胞、每mL培养基约2x106至约8x106个细胞、或每mL培养基约2x106至约5x106个细胞被等分且冷冻。在一些实施方案中，多个视网膜祖细胞以每mL培养基约0.5x106至约20x106个细胞被等分及冷冻。在一些实施方案中，多个视网膜祖细胞以每mL培养基约2x106至约8x106个细胞被等分及冷冻。在一些实施方案中，多个视网膜祖细胞以每mL培养基约10x106个细胞被等分及冷冻。在一些实施方案中，冷冻管包含约1mL、约2mL、约3mL、约4mL、约5mL、约6mL、约7mL、约8mL、约9mL或约10mL冷冻保存介质(例如，培养基加上DMSO)及视网膜祖细胞。在一些实施方案中，冷冻管包含约1mL培养基及视网膜祖细胞。在一些实施方案中，冷冻管包含约5mL培养基及视网膜祖细胞。
在特定的实施方案中，最终产物制剂已展现保存在冰上(即在0-4℃)时维持最佳的存活力(即至少85％)长达4小时或更久(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更久)。此将反过来允许细胞制品地方性地运输至区域性临床位点。
在低氧气条件之下细胞的进一步扩增可用来大幅地增加每次捐赠的细胞产率。举例而言，在一些实施方案中，细胞总共可被继代5-12(即5、6、7、8、9、10、11或12)或更多次。通过非限制实例的方式，在一实施方案中，此可包含发生在标准氧气条件下的4-6代(即4、5或6)之后的3-6代(即3、4、5或6)的第二低氧气扩增。然而，将被发明所属技术领域中本领域技术人员认知的是，继代的总数目可为约1-32或更多继代(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或更多)。此可包含1-20或更多继代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)的第二低氧气扩增。所有继代的适当的数目与低氧气继代的数目的判定是在发明所属技术领域中的常规技能水平之中。该第二低氧气培养继代的使用大幅扩张来自hRPC(诸如通过在标准氧气条件下培养获得的那些)的工作库(working bank)的产率。举例而言，从标准正常氧气库来的细胞可被解冻并在低氧气条件下进一步扩增额外的1-20(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)代。
当可能使用较少的低氧气细胞继代时，所得到的产率可能较低。而且，当可能使用较多的低氧气细胞继代时，此将潜在地具有增加所得产品由于伴有功效丧失的潜在的表型漂变以及/或不想要的遗传异常的累积导致为有缺陷的风险。
在一些实施方案中，第二低氧气培养继代之后，视网膜祖细胞经过“恢复期”，其中他们被允许在标准氧气条件下生长1小时至高达5天的短暂期间(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、24、36、48、60、72、84、96、108或120小时)。在替代性实施方案中，在此恢复期内，细胞被允许在没有经过任何进一步的继代下生长。
因此，在一非限制实施方案中，用于本文中所描述的任何的组合物与方法的视网膜祖细胞可使用“杂和”方法产生，其包括(a)在标准氧气条件下培养数代，接着(b)在低氧气条件下培养数代，任选地接着(c)在标准氧气条件下培养一设定的时间段而没有任何更进一步的继代。在标准氧气条件下以及/或低氧气条件下适当的继代数与恢复期的适当的持续时间的判定是在发明所属技术领域中本领域技术人员的常规技能水平之内。
使用此新的培养方法学产生的所得细胞产物已在体外与动物中检测。其结果类似于在以那些没有经过第二低氧气培养的细胞产物观察到的。
将被发明所属技术领域中本领域技术人员认知的是，此第二低氧气成分加入于整个过程中是有益于自动化制造方法，因为不需要诸如初始分解与平板接种的复杂的程序并且继代进行将以强烈增殖的细胞被完全标准化。
经由存在的RPC的诱导性多能干细胞(iPS)转化后在更原始的、增殖的状态的扩增，RPC可被额外地产生。使用本领域中已知的任何方法iPS可接着再分化回RPC。在此情形中，以RPC形式赋予的先前的表观遗传学印记(epigenetic imprinting)有助于将细胞重新定向回它们的原始状态，从而增加RPC产率以及/或促进高产率同种异体产物的安全性(即通过避免多能细胞的污染)。此扩增方法学可提供非常大的及潜在地无限的“非老化性(non-senescing)”RPC的来源，所述RPC从临床上已证实的RPC样本所衍生，而不需要重复胎儿组织取得。
RPC可从多能细胞系(从上述RPC衍生的一个此种细胞系或非此种细胞系)额外地制造。此种衍生可包含部分分化成含有从其中可收集、纯化并进一步扩增RPC的原始的视网膜结构的“类胚体”，即眼杯衍生物。
可使用其中用于iPS的供体细胞从睫状体上皮或从虹膜取得的自体细胞来进行类似的方法，因为这些组织均可被外科医师获得并具有与视网膜的重叠(但不完全相同)发展的印记。
组合物及制剂
本文中所述的视网膜祖细胞与细胞群体可被配制为通过任何或各种方式来施用的组合物，包含口服、胃肠外的、雾化吸入(inhalation spray)、鼻腔的、局部的、鞘内的、大脑内的、硬膜外的、颅内的或直肠的。本文中所述组合物与制剂可含有医药上或兽医学上可接受的液体、载体、助剂以及媒介物并且可为液体、片剂、胶囊、移植物、气溶胶、凝胶、脂质体、纳米粒子等型式。
视网膜祖细胞与细胞群体可以医药上或兽医学上的组合物来施用个体。词组“医药上可接受的”意指当施用给动物或人时，不产生有害的、过敏的或其他不良的反应的分子实体与组合物。当用于本文中时，“医药上可接受的载体”包含任何与所有水性载体溶液与非性载体，其包含水、乙醇、多元醇类(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇以及类似物)以及其适合的混合物、诸如橄榄油的植物油与诸如油酸乙酯之可注射的有机酯。
医药上可接受的载体可选择性地包含白蛋白(例如人白蛋白)，其为在制剂中能改善细胞存活的蛋白质。
同样地，本文中所公开的任何之组合物与制剂亦可包含赋形剂
Figure GDA0003170202000000431
(HTS-FRS)(BioLife Solutios,Inc.)，其为商业上可得到的低温储存溶液/制剂，被设计以调解经受长期低温(2℃-10℃)保存的细胞储存后坏死和凋亡的水平(参见，例如美国专利案No.6,921,633、美国专利案No.6,632,666以及WO 2005/009766)。
白蛋白以及/或HTS的添加可用来延长视网膜祖细胞在本文中所公开的任何的制剂中的存活时间，高达约24小时(即：约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个小时)。
举例而言，适宜的流动性可通过诸如卵磷脂的的使用、在分散液的情况下维持要求的粒径以及表面活性剂的使用来维持。这些组合物还可以含有诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂的助剂。通过灭菌程序以及通过包含例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸及其类似物的各种抗细菌剂及抗真菌剂可保证避免微生物的存在。在组合物中包含诸如糖、氯化钠及其类似物等渗透剂也是期望的。此外，可通过包含诸如单硬脂酸铝及明胶的推迟吸收的试剂来实现可注射的医药上型态的延长吸收。在制造与储存条件下，其必需为稳定的，并且必需抗如细菌及真菌的微生物的污染而保存。用于医药上活性的物质的此种媒介与试剂的使用为本领域中已已知的。
必需施用至个体的有效量的视网膜祖细胞或细胞群体。“有效量”或“治疗有效量”意指产生想要的效果的组合物的量。举例而言，有效量将依据，部分依据经由被递送的分子或试剂(在此指视网膜祖细胞或细胞群体)、待使用治疗剂的适应症、施用的途径以及个体或患者的尺寸(身体重量、身体表面或器官尺寸)以及状态(年龄以及一般健康)。因此，临床医师或内科医生可滴定剂量并修改施用途径以获得优化疗效。用于具体目的的特定的试剂的有效量可使用发明所属技术领域中本领域技术人员已已知的方法来判定。就本文中所定义的任何组合物而言，有效量可在细胞培养分析或诸如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴的动物模式初步估算。动物模式也可用来判定适当的浓度范围与施用途径。这些信息然后可用于确定对人有用的剂量与施用途径。
本文所描述的组合物的有效量的实例包含细胞悬浮液以下的体积：5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、400μl、450μl、500μl或在至高达5000μl(5ml)之间的任何增量(例如：500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950或5000μl)。
体积的上限及下限被递送***及/或方法所限制。参见，例如Kayikcuiglu,O.R.etal,(2006)Retina 26(9):1089-90。举例而言，当在没有玻璃体切除术的情况下，由于增加的眼压，给药的体积上限为大约200μl。当在有玻璃体切除术的情况下给药予玻璃体腔时，体积的上限由璃体腔的体积所限制并且可以含有高达5ml或更多。由于视网膜剥离，视网膜下注射的上限可高达200μl。在替代性实施方案中，这些体积包含每剂量介于1000至10百万个细胞或每剂量1000至2000个细胞、每剂量2000至3000个细胞、每剂量3000至4000个细胞、每剂量400至5000个细胞、每剂量5000至6000个细胞、每剂量6000至7000个细胞、每剂量7000至8000个细胞、每剂量8000至9000个细胞、每剂量9000至10,000个细胞、每剂量10,000至15,000个细胞、每剂量15,000至20,000个细胞、每剂量20,000至25,000个细胞、每剂量25,000至30,000个细胞、每剂量30,000至35,000个细胞、每剂量35,000至40,000个细胞、每剂量40,000至45,000个细胞、每剂量45,000至50,000个细胞、每剂量50,000至55,000个细胞、每剂量55,000至60,000个细胞、每剂量60,000至65,000个细胞、每剂量65,000至70,000个细胞、每剂量70,000至75,000个细胞、每剂量75,000至80,000个细胞、每剂量80,000至85,000个细胞、每剂量85,000至90,000个细胞、每剂量90,000至95,000个细胞、每剂量95,000至100,000个细胞、每剂量100,000至125,000个细胞、每剂量125,000至150,000个细胞、每剂量150,000至200,000个细胞、每剂量200,000至250,000个细胞、每剂量250,000至300,000个细胞、每剂量300,000至350,000个细胞、每剂量350,000至400,000个细胞、每剂量400,000至450,000个细胞、每剂量450,000至500,000个细胞、每剂量500,000至550,000个细胞、每剂量550,000至600,000个细胞、每剂量600,000至650,000个细胞、每剂量650,000至700,000个细胞、每剂量700,000至750,000个细胞、每剂量750,000至800,000个细胞、每剂量800,000至850,000个细胞、每剂量850,000至900,000个细胞、每剂量900,000至950,000个细胞、每剂量950,000至1,000,000个细胞或者每剂量介于1000个细胞至高达10百万个细胞之间的任何增量。当然，剂量可根据给药频率与持续时间而变动。在替代性实施方案中，本文所描述的组合物的细胞剂量含有在小体积中高数目的细胞；举例而言，诸如每100μl 0.5百万个细胞。细胞数目可通过在本领域中所已知的任何方法来计算，诸如通过血球计、分光光度法、库氏计数器(Coulter counter)、流式细胞测量术等。剂量可施用一次或可经过数个治疗的疗程施用。
组合物还可被配制成用于通过以下方式胃肠外施用至眼睛(尤其是玻璃体腔或视网膜下空间)、玻璃体腔或者视网膜下空间或视网膜、脑部、神经或CNS：通过巩膜或通过在本领域中所已知的任何方法或方案，例如：包含如在美国专利案No.7,585,517所述的巩膜递送、如在美国专利案No.7,883,717所述用来递送至病人眼睛内部之持续释放递送装置、如在美国专利案No.5,378,475或5,466,233所述的用来***眼睛的玻璃体区的装置或者通过例如使用如在美国专利申请公开案No.20110112470或20100256597(描述用于对病人的眼睛的标靶给药的微针)所述的皮下注射的注射筒或角度***途径、或者经由例如如在美国专利申请公开案No.20100209478所述的经由具有穿过泪点尺寸的亲水性聚合物水凝胶或例如如在美国专利申请公开案No.20100191176所述的提供进入人眼睛的视网膜下空间的装置。前房穿刺术也可在经由发明所属技术领域中本领域技术人员所决定时进行。方法在尤其是对于玻璃体内的放置的程序之间、及/或之后，不需要缝合球体。然而，对于利用玻璃体切除术的方法而言，此可能为必需的，举例而言，当在视网膜下空间放置细胞时。
本文所公开的组合物还可配制为用于鞘内、脑内硬膜外、皮下的、静脉内的、肌肉内的以及/或动脉内的给药；例如美国专利申请公开案No.200500480021所述的；通过注射途径但也包含各种注入技术。给药可透过例如导管或泵进行，例如鞘内泵或者植入式医疗装置。在替代性实施方案中，方法可涉及含有本文所公开的视网膜祖细胞、细胞群体或组合物的植入物与人工器官、生物反应器***、细胞培养***、板、培养皿、试管、瓶与烧瓶及其类似物的施用或移植，诸如那些在美国专利案No.7,388,042、7,381,418、7,379,765、7,361,332、7,351,423、6,886,568、5,270,192与美国专利申请公开案No.20040127987、20080119909、20080118549、20080020015、20070254005、20070059335、20060128015所述的。
含有视网膜祖细胞或细胞群体的组合物选择性地与一或多个药物共同给药。药物的非限制实例可包含诸如血管抑素、醋酸阿奈可他(anecortave acetate)、血小板反应蛋白(thrombospondin)、VEGF受体酪胺酸激酶抑制剂之抗血管生成剂；以及诸如乐舒晴(ranibizumab)以及贝伐单抗(bevacizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、舒尼替尼(sunitinib)以及索拉菲尼(sorafenib)之抗血管内皮生长因子(抗-VEGF)药物与具有抗血管生成效果之任何各种已知的小分子与转录抑制剂；已知的眼科药物的种类，包含：诸如肾上腺素拮抗剂的青光眼药剂，包含，举例而言，诸如醋丁洛尔(acetbutolol)、阿替洛尔(atenolol)、毕索洛尔(bisoprolol)、卡维地洛(carvedilol)、艾司洛尔(asmolol)、拉贝洛尔(labetalol)、纳多洛尔(nadolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、***(propranolol)、美托洛尔(metipranolol)、倍他洛尔(betaxolol)、卡替洛尔(carteolol)、左倍他洛尔(levobetaxolol)、左布诺洛尔(levobunolol)以及第莫洛(timolol)之β阻断剂；诸如肾上腺素、地匹福林(dipivefrin)、可乐定(clonidine)、亚泊可尼丁(aparclonidine)以及溴莫尼定(brimonidine)之肾上腺素促效剂或拟交感神经药剂；诸如毛果芸香碱、卡巴可(carbachol)、碘化磷(phospholine iodine)、以及毒扁豆碱(physostigmine)、水杨酸、氯化乙酰胆碱、依色林(eserine)、氟磷酸二异丙酯、地美溴铵(demecarium bromide)之拟副交感神经药剂或胆碱性促效剂；毒蕈碱类药物；包含局部及/或全身的药剂，举例而言，乙酰偶氮胺(acetozolamide)、布尔左胺(brinzolamide)、多佐胺(dorzolamide)及甲氮酰胺(methazolamide)、乙氧苯噻唑胺(ethoxzolamide)、丹木斯(diamox)以及双氯非那胺(dichlorphenamide)之碳酸酐酶抑制剂；诸如阿托品(atropine)、环喷托酯(cyclopentolate)、琥珀酰胆碱、后马托品(homatropine)、脱氧肾上腺素(phenylephrine)、东莨菪碱以及托平卡胺(tropicamide)之散瞳-睫状肌麻痹剂；诸如***素F2α、抗***素、***素前躯物之***素类药物；或者诸如百马前列素(bimatoprost)、拉坦***素(latanoprost)、曲伏***素(travoprost)及/或乌诺***酮(unoprostone)之类***素药剂。
药物的其他实施方案还可包含，但不限于，包含例如醣皮质素类的抗炎剂以及皮质类固醇激素(corticosteroids)，诸如：贝他每松(betamethasone)、皮质酮(cortisone)、***(dexamethasone)、特塞隆21-磷酸(dexamethasone 21-phosphate)、甲基培尼皮质醇(methylprednisolone)、培尼皮质醇21-磷酸(prednisolone 21-phosphate)、乙酸培尼皮质醇(prednisolone acetate)、培尼皮质醇(prednisolone)、氟美皮质醇(fluroometholone)、氯替泼诺(loteprednol)、甲羟松(medrysone)、丙酮氟洛皮质醇(fluocinolone acetonide)、丙酮特安皮质醇(triamcinolone acetonide)、特安皮质醇(triamcinolone)、丙酮特安皮质醇(triamcinolone acetonide)、倍氯米松(beclomethasone)、亚丁皮质醇(budesonide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟美皮质醇(fluorometholone)、氟替卡松(fluticasone)、氟氢可地松(fludrocortisone)、氢化皮质酮(hydrocortisone)、乙酸氢化可体松(hydrocortisone acetate)、氯替泼诺(loteprednol)、利美索龙(rimexolone)以及非类固醇抗炎药包含，举例而言，阿司匹林(aspirin)、待克菲奈(diclofenac)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、溴芬酸(bromfenac)、奈帕芬胺(nepafenac)以及酮咯酸(ketorolac)、水杨酸、美西辛(indomethacin)、萘克洛芬(naxopren)、吡罗昔康(piroxicam)以及那别敏二氟尼柳(nabumetone diflunisal)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacine)、酮基布洛芬(ketoprofen)、甲氯芬那(meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、奥沙普 (oxaprozin)、吡罗昔康、双水杨酯(salsalate)、舒林达酸(sulindac)以及托美丁(tolmetin)；COX-2抑制剂，像是：来考昔(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)以及伐地考昔(Valdecoxib)；抗感染剂或抗微生物剂，诸如：抗生素包含，举例而言，四环素、氯四环素、枯草杆菌素、新霉素、多黏菌素、短杆菌素、头孢力欣、土霉素、氯霉素、利福平、塞普沙辛、妥布霉素(tobramycin)、庆大霉素、红霉素、青霉素、磺酰胺、磺胺嘧啶、乙酰磺胺、磺胺甲基噻唑(sulfamethizole)、磺胺异 唑、硝糠腙、丙酸钠、胺基糖苷类，诸如：庆大霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素(amikacin)以及链霉素；氟喹啉酮类，诸如：塞普沙辛、加替沙星(gatifloxacin)、左旋氧氟沙星、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星、氧氟沙星(ofloxacin)、枯草杆菌素、红霉素、梭链孢酸、新霉素、多黏菌素B、短杆菌肽、曲美普林以及乙酰磺胺；真菌剂，诸如：双性霉素B、抗卡泊芬凈(caspofungin)、克霉唑(clotrimazole)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、伏立康唑(voriconazole)、特比萘芬(terbinafine)、制霉菌素(nystatin)以及咪康唑(miconazole)；抗疟疾剂，诸如：氯奎(chloroquine)、阿托奎酮(atovaquone)、盐酸甲氟喹(mefloquine)、普来马昆(primaquine)、奎尼丁(quinidine)以及奎宁(quinine)；抗分枝杆菌剂，诸如：孟表多(ethambutol)、异烟碱酰胺(isoniazid)、吡酰胺(pyrazinamide)、雷发平(rifampin)以及利福布丁(rifabutin)及/或抗寄生虫剂，诸如：阿苯达唑(albendazole)、甲苯达唑(mebendazole)、噻苯达唑(thiobendazole)、甲硝唑(metronidazole)、吡喃泰(pyrantel)、阿托奎酮、双碘喹啉(iodoquinaol)、伊维菌素(ivermectin)、嘌呤霉素(paromycin)、帕芝奎(praziquantel)以及三甲曲沙(trimatrexate)。
药物的其他实例还可包含，但不限于，诸如：碘苷三氟胸苷(idoxuridinetrifluorothymidine)、阿昔洛韦(acyclovir)、西多福韦(cidofovir)、法昔洛韦(famciclovir)、更昔洛韦(gancyclovir)、伐昔洛韦(valacyclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、阿糖腺苷(vidarabine)、曲氟尿苷(trifluridine)以及膦甲酸(foscarnet)之抗病毒剂；诸如：利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、洛匹那韦(lopinavir)、茚地那韦(indinavir)、阿扎那韦(atazanavir)、安普那韦(amprenavir)以及奈非那韦(nelfinavir)之蛋白酶抑制剂(蛋白酶inhibitors)；诸如：阿巴卡韦(abacavir)、ddl、3TC、d4T、ddC、替诺福(tenofovir)以及恩曲他滨(emtricitabine)、地拉韦啶(delavirdine)、依发韦仑(efavirenz)以及奈韦拉平(nevirapine)之核苷酸/核苷/非核苷酸反转录酶抑制剂；诸如：干扰素、雷巴威林(ribavirin)以及曲氟尿苷(trifluridiene)之其他抗病毒剂；包含碳青霉烯(cabapenems)，像是厄他培南(ertapenem)、亚胺培南(imipenem)以及美罗培南(meropenem)之抗细菌剂；诸如：安泛霉素(cefadroxil)、西华乐林(cefazolin)、头孢地尼(cefdinir)、头孢托伦(cefditoren)、头孢胺芣(cephalexin)、西华克乐(cefaclor)、头孢吡肟(cefepime)、头孢酮(cefoperazone)、西弗士林(cefotaxime)、头孢替坦(cefotetan)、头孢甲氧霉素(cefoxitin)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢齐定(ceftaxidime)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢呋辛(cefuroxime)以及氯碳头孢(loracarbef)之头孢菌素抗生素(cephalosporins)；诸如：阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)以及替利霉素(telithromycin)之其他的巨环内酯(macrolides)以及酮内酯类(ketolide)；包含阿莫西林(amoxicillin)、安比西林(ampicillin)、匹胺青霉素(pivampicillin)、双氯西林(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、哌拉西林(piperacillin)以及替卡西林(ticarcillin)之青霉素(具有以及没有拉维酸(clavulanate))；诸如：多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)以及四环霉素之四环霉素；及/或诸如胺曲南(aztreonam)、氯霉素、克林霉素(clindamycin)、利奈唑胺(linezolid)、呋喃妥因(nitrofurantoin)以及万古霉素(vancomycin)的其他抗细菌剂。
药物的其他实例还可包含，但不限于，举例而言，诸如：包含色甘酸钠(sodiumchromoglycate)、安他唑啉(antazoline)、美舍吡啉(methapyriline)、氯芬尼拉明(chlorpheniramine)、西替利 (cetrizine)、吡拉明(pyrilamine)、苯吡丙胺(prophenpyridamine)、阿地白介素(aldesleukin)、阿达木单抗(adalimumab)、氮杂硫代嘌呤(azathioprine)、巴西利马伯(basiliximab)、达可利诸伯(daclizumab)、恩塔臬西伯(etanercept)、羟氯奎宁(hydroxychloroquine)、英夫利昔单抗(infliximab)、来氟米特(leflunomide)、胺甲蝶呤(methotrexate)、霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil)以及柳氮磺吡啶(sulfasalazine)的抗过敏剂之免疫调节剂(immune-modulating agents)；诸如：氮卓斯汀(azelastine)、依美斯汀(emedastine)、氯雷他定(loratadine)、地氯雷他定(desloratadine)、西替利 (cetirizine)、苯海拉明(diphenhydramine)、氯菲安明(chlorpheniramine)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、氯马斯汀(clemastine)、赛庚啶(cyproheptadine)、非索非那定(fexofenadine)、羟 (hydroxyzine)、异丙(promethazine)以及左卡巴斯汀(levocabastine)之抗组织胺剂；免疫药物(诸如：疫苗以及免疫刺激物)；诸如：色甘酸钠(cromolyn sodium)、可多替芬(ketotifen)、洛度沙胺(lodoxamide)、内多克丽米尔(nedocrimil)、奥洛他定(olopatadine)以及诸如：全达霉素(gentimicin)以及西多福韦(cidofovir)之吡嘧司特(pemirolast)睫状体消溶剂之MAST细胞稳定剂；以及诸如：维替波吩(verteporfin)、丙美卡因(proparacaine)、四卡因(tetracaine)、环孢霉素(cyclosporine)以及匹鲁卡品(pilocarpine)之其他眼科药剂；细胞表面糖蛋白受体抑制剂；诸如：脱羟肾上腺素(phenylephrine)、萘甲唑啉(naphazoline)、四胼林(tetrahydrazoline)之解充血剂、脂质或低血压脂质；诸如：喹吡罗(quinpirole)、非诺多泮(fenoldopam)以及异波帕胺(ibopamine)之多巴胺促效剂及/或拮抗剂；血管痉孪抑制剂；血管扩张剂；抗高血压剂、血管紧缩素转化酶(ACE)抑制剂；诸如：奥美沙坦(olmesartan)之血管紧缩素-1受体拮抗剂；微管抑制剂；分子马达(molecularmotor)(动力蛋白(dynein)以及/或驱动蛋白)抑制剂；肌动蛋白细胞骨架调节剂，诸如：细胞松弛素(cyctchalasin)、拉特润枯林(latrunculin)、海洋苔藓素A(swinholide A)、埃酒克林酸(ethacrynic acid)、H-7以及Rho激酶抑制剂(Rho-kinase，ROCK，inhibitors)；重塑抑制剂(remodeling inhibitors)；诸如：叔-丁基氢-喹啉酮以及AL-3037A之细胞外基质的调节物；诸如N-6-环己基腺苷(N-6-cylclophexyladenosine)以及(R)-苯异丙基腺苷((R)-phenylisopropyladenosine)之腺苷受体促效剂及/或拮抗剂；血清素促效剂；诸如：***、***、助孕素、孕酮、胰岛素、降钙素、副甲状腺素、肽以及血管加压素下视丘释放因子之激素药剂；举例而言，包含表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、血小板衍生性生长因子、转化生长因子β、生长激素(somatotrapin)、纤连蛋白、***生长因子、骨型态发生蛋白(BMP)、脑源神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、类胰岛素生长因子(IGF)及神经生长因子(NGF)之生长因子拮抗剂或生长因子；以及/或诸如：白细胞介素、CD44、科格林(cochlin)、骨桥蛋白、多效生长因子(pleotrophin)、中期因子、血管内皮生长因子(VEGF)以及诸如：血清类淀粉蛋白A的血清类淀粉蛋白的细胞介素。
其他治疗剂可包含，但不限于，诸如：芦贝鲁唑(lubezole)、尼莫地平(nimodipine)及相关化合物的神经保护剂以及包含血流增强剂、钠离子通道阻断剂、诸如美金刚(memantine)的麸胺酸抑制剂、神经营养因子、一氧化氮合成酶抑制剂；自由基捕捉剂或抗氧化剂；螯合化合物；凋亡相关蛋白酶抑制剂；减少新蛋白质合成之化合物；放射线治疗剂；光动力治疗剂；基因治疗剂；基因调节剂以及诸如：环孢霉素A、缓和剂(delmulcents)以及玻尿酸钠的干眼药物；诸如：多沙唑 (doxazosin)、哌唑 (prazosin)以及特拉唑 (terazosin)之α阻断剂；诸如：胺氯地平(amlodipine)、苄普地尔(bepridil)、地尔硫卓(diltiazem)、非洛地(felodipine)、依拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼索地平(nisoldipine)以及维拉帕米(verapamil)之钙离子通道阻断剂；诸如：可尼丁(clonidine)、二氮 (diazoxide)、非诺多泮(fenoldopan)、联胺肼(hydralazine)、敏乐定(minoxidil)、硝普盐(nitroprusside)、酚苄胺(phenoxybenzamine)、依前列醇(epoprostenol)、妥拉苏林(tolazoline)、曲前列环素(treprostinil)以及基于硝酸盐的药剂之其他抗高血压剂；包含诸如：肝素、达肝素(dalteparin)、依诺肝素(enoxaparin)、亭扎肝素(tinzaparin)以及方达帕林(fondaparinux)的肝素以及类肝素(heparinoid)之抗凝血剂；诸如水蛭素、蛋白脢抑制剂(aprotinin)、阿加曲班(argatroban)、比伐卢定(bivalirudin)、地西卢定(desirudin)、来匹卢定(lepirudin)、苯甲香豆醇(warfarin)以及希美加群(ximelagatran)之其他抗凝血药物；以及/或诸如：阿昔单抗(abciximab)、氯吡格雷(clopidogrel)、双嘧达莫(dipyridamole)、依替巴肽(optifibatide)、噻氯匹定(ticlopidine)以及替罗非班(tirofiban)的抗血小板剂。
其他治疗剂可包含，但不限于，诸如：前列地尔(alprostadil)、卡前列素(carboprost)、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)以及伐地那非(vardenafil)之***素PDE-5抑制剂以及其他***素药剂；凝血酶抑制剂(thrombin inhibitors)；抗凝血剂；抗血小板聚集剂；血栓溶解剂(thrombolytic agents)；及/或诸如：阿帖普酶(alteplase)、阿尼普酶(anistreplase)、瑞替普酶(reteplase)、链激酶(streptokinase)、替奈普酶(tenecteplase)以及尿激酶(urokinase)之纤维蛋白溶解剂；诸如：西罗莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)、依维莫司(everolimus)、佐他莫司(zotarolimus)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)以及霉酚酸(mycophenolic acid)之抗增殖剂；包含左旋甲状腺素(levothyroxine)、氟羟***(fluoxymestrone)、甲基睪固酮(methyltestosterone)、诺龙(norandrolone)、氧雄龙(oxandrolone)、睪固酮、***、雌酮、雌酮硫酸酯哌 (estropipate)、克罗米芬(clomiphene)、***类、羟孕酮、左炔诺孕酮(levonorgestrel)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、米非司酮(mifepristone)、炔诺酮(norethindrone)、缩宫素(oxytocin)、孕酮、雷洛昔芬(raloxifene)以及他莫昔芬(tamoxifen)之激素相关剂；包含诸如：卡莫司汀环己亚硝(carmustine lomustine)、氮芥***酸(melphalan)、顺铂(cisplatin)、3-氟尿嘧啶(fluorouracil3)以及诸如博莱霉素(bleomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、埃达鲁比辛(idarubicin)、丝裂霉素(mitomycin)以及普卡霉素(plicamycin)的类甲基苄肼(procarbazine)抗生素剂之烷化剂之抗赘生物剂；抗增殖剂(诸如：1,3-顺视黄酸、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、雷帕霉素(rapamycin)、丝裂霉素C以及顺铂)；诸如：阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、羟基脲、巯嘌呤以及5-氟尿嘧啶(，5-FU)之抗代谢剂；诸如：阿地白介素(aldesleukin)、甲磺酸依麦替尼布(imatinib)、利妥昔单株抗体(rituximab)以及托西莫单株抗体(tositumomab)之免疫调节剂；有丝***抑制剂：多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、长春花碱(vinblastine)以及长春新碱(vincristine)；诸如：锶-89之放射性药剂；以及/或诸如：伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)以及米托坦(mitotan)的其他抗肿瘤剂。
RPC的施用与治疗方法
本文还提供被配制成细胞悬浮液的并作为用来治疗具有视网膜疾病的患者的同种异体移植物的经培养的视网膜祖细胞的用途与方法。举例而言，本文所提供了基于细胞的疗法，其包括或由以下组成：使用来自未成熟的例如人的哺乳动物的视网膜的经培养的异质细胞群体。
通过各种不同的方式，本文中所描述的细胞群体与相关的组合物可被提供予个体或病人。通过非限制实例之方式，它们可局部地提供，例如提供于真正的或潜在的创伤或疾病部位。在一些实施方案中，他们在可能的或真正的创伤或疾病的位点使用注射筒或注射针注射组合物来提供。在其他实施方案中，他们被全身性地提供，即静脉地或动脉内注射地被施用于血流中。特定的施用途径，大部分，将依据将被治疗或预防的疾病或创伤的位置与性质来决定。因此，本文所描述之方法包含透过任何已知与可获得的方法或途径来提供细胞群体或组合物，包含但不受限于眼内的、口服、胃肠外的、静脉内的、动脉内的、鼻内的与肌肉内的施用。
依照本领域中已知并被内科医师获得的信息，可轻易地完成适合的剂量与治疗方案确定。
通过非限制实例的方式，细胞的剂量可介于约0.3至约0.5百万个细胞(例如：0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、或0.5百万个细胞)或介于0.5-3百万个细胞(例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或3百万个细胞)。
介于两个剂量范围之间观察到的功效结果大约相似。然而，如果病人的眼睛具有弱的悬韧带，则随着更大的剂量(例如：2-9百万个细胞)的细胞有可能增加存留在视轴、黏在水晶体后囊以及/或进入眼前房(假性眼前房积脓，pseudo-hypopyon)的风险。而且，将被发明所属技术领域中本领域技术人员认知的是，移植物存活的持续期间可能可与剂量成正比，因而，可与原本移植物的尺寸成正比。
在玻璃体腔中同种异体hRPC的给药频率将是重要的。在各种实施方案中，后续的剂量(即再给给药剂量(redoses))可被施予于病人的同一个眼睛或另一个眼睛。在动物模型与数个病人中，已进行再次给药于另一个眼睛而没有后续的免疫后遗症。因此，提出再次给药将是双侧良好耐受的(并假设在同一个眼睛，已在动物上进行高达3次)。
移植物可在RP病人身上存活一年或更久。然而，它们倾向于在大约1-1.5年之后从玻璃体消失，此表明在大约1至2年的时间范围之内的再次给药可能不会太过激进并且事实上可能在多数案例中成为未来的常态。
在本文所公开的任何方法中，治疗可涉及单次治疗或多次(例如，2、3、4、5、6、或更多)治疗。特别的是，为了预防目的，在某些实施方案中，期望在可能潜在地引起视网膜损伤的应激之后施用纯化的细胞群体。
在一实施方案中，细胞群体及组合物可作为对个体的玻璃体腔或视网膜下空间的单一注射而局部地施用。
虽然本文中所描述之组合物及方法不受限于动作的任何特定机制，动作的例示性机构是扩散性的以及/或与营养有关的。证据与垂死的宿主锥细胞之营养重编程(trophicreprogramming)之概念一致，导致从细胞凋零轨迹到光处理能力的再生的转换。此可为直接的或间接的。不排除其他眼组织的参与。此机制允许将胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的移植物放置在玻璃体或视网膜下空间中。
玻璃体放置增强基于扩散的治疗效果。此机制可允许胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的移植物取代视轴，但仍治疗病人的黄斑。而且，玻璃体放置被用来大幅地简化治疗，因为此例示性治疗对世界各地有需求的病人可增加可用性。此外，玻璃体放置可通过远离脉管***而有助于免疫耐受。本领域技术人员认知的是，玻璃体放置避免视网膜下手术的潜在并发症、避免全身麻醉的风险、不需要在视网膜上进行穿孔(视网膜切开术，retinotomy)(这会增加视网膜脱离、出血的风险)以及/或不需对病人的视网膜进行局灶性脱离(focal detachment)(局灶性脱离可导致光感受器损伤或丢失、视网膜撕裂、出血、全面性视网膜剥离，并且在RP中，薄的、萎缩的和粘附的视网膜的脱离将是困难/危险的程序)。
在一些实施方案中，使用适合的注射针尺寸与长度，放置细胞在玻璃体腔。理想地，为了增强递送效率与避免由于留滞在注射筒所致产品损失，注射筒具有最小的(即1微升)残留空间(dead space)。短注射针(例如具有5/16英寸长的31G(规格)或具有1/2英寸长的30G)的使用允许最大的便利性(即适用于临床上或诊疗室环境)。然而，长注射针(例如具有5/8英寸长的27G或25G)的使用允许在玻璃体中更后部(后区)，更靠近黄斑，的优化的放置(在操作范围内使用)。适当的注射针尺寸与长度的判定是在发明所属技术领域中本领域技术人员的常规技能水平之中。当挑选适当的注射针尺寸与长度时，重要的是，在细胞通过针头后，细胞的存活力保持在期望的阈值之上。
细胞放置是在前玻璃体之内，其是简单且允许最大的安全性与便利性。相反地，放置是在后玻璃体(接近晶状体后极)，这需要直接观察针尖以避免视网膜的穿透性损伤。然而，此可增强整体治疗效果与可代表优化放置与功效。
虽视网膜细胞取代是可能的，但它不是临床疗效所必需的。同样地，供体细胞迁移到视网膜是可能的，但它不是临床疗效所必需的；供体细胞整合到视网膜回路中是可能的，但它不是临床疗效所必需的；供体细胞整合到宿主视网膜的外核层/黄斑是可能的，但它不是临床疗效所必需的；以及/或供体细胞整合到视网膜是可能的，但它不是移植物持续存活所必需的。
在一些实施方案中，RPC细胞可被注入玻璃体腔，其中选择性地不需要玻璃体切除术或视网膜下手术。然而，一些实施方案可涉及选择性的使用玻璃体切除术、核心玻璃体切除术以及/或玻璃体溶解物质中之一或多个，以移除玻璃体凝胶以及优化注射细胞向后玻璃体(例如，靠近眼后极的最佳位置)的移动性和穿透性。在一些情形中，使用玻璃体切除手术可增强在眼睛的细胞放置。
细胞还可被植入(例如注射入)视网膜下空间，或者它们可使用任何标准的眼内的注射程序，例如使用皮下注射的或角度***通路，被植入(例如注射入)眼睛。在一些情形中，不需要视网膜切开术或眼内气体或不需要硅油。
替代性地，依据如在发明所属技术领域中本领域技术人员所判定的情况可选择性地进行前房穿刺术。在一些实施方案中，在手术之间以及/或之后不需要球体的缝合。
本文所公开的任何方法可包含将组合物在局部麻醉下直接施用至玻璃体腔，不需要对个体进行全身免疫抑制。此外，虽然移植物的组织分型与对病人或个体的匹配不是必需的，但若需要的话其可进行，例如使用本领域技术人员所已知的任何组织分型与匹配技术。
如所注意的，在本文所述的任何方法中，可仅使用表面麻醉，例如未使用局部、区域或全身麻醉。然而，在一些案例中，给药期间可额外的或替代性使用局部、区域或全身麻醉。适合用来使用在本文中所公开的方法中适合的局部麻醉的实例包含，但不限于美卡卡因(mepricaine)、丙美卡因(proparacaine)、丙胺卡因(prilocaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、苯佐卡因(benzocaine)、普宁卡因(bupivacaine)、苦味酸胺苯丁酯(butamben picrate)、氯普鲁卡因(chlorprocaine)、***(***e)、袋布卡因(dibucaine)、奎尼卡因(dimethisoquin)、达可隆(dyclonine)、依铁卡因(etidocaine)、己卡因(hexylcaine)、***(ketamine)、利多卡因(lidocaine)、甲派卡因(mepivacaine)、丙吗卡因(pramoxine)、丙卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、水杨酸及其衍生物、酯、盐以及其混合物。
在特定实施方案中，不需要消炎以及/或免疫抑制(即全身免疫抑制)。而且，临床经验支持不需要，因为在一些案例中，可看到移植物的存活超过数个月，举例而言，包含且超过1年。
然而，如果需要的话，可包含为术后滴眼液的消炎以及/或免疫抑制治疗。举例而言，如果在临床上指出治疗后炎症持续的证据，则病人可在注射后以一周或者选择性地，高达两周后逐渐减量地用局部类固醇滴眼液治疗。
在替代性实施方案中，没有强制卧床休息、脸朝下的姿势的术后嘱咐以及/或需要。这些方法可在门诊手术中进行并且可能不要求任何过夜住院。
在一些实施方案中，在给药期间，病人的头部尽可能接近水平地从倾斜的坐姿向后倾斜，以最大化地将注射细胞安置在玻璃体凝胶内朝向眼睛的后极这对于视觉而言是视网膜最重要的部分。当病人能忍受时，病人应该维持此姿势持续大约30分钟或更久。此外，给药后病人也应该花时间在家以背躺下脸朝上。
本文中所述的任何涉及或使用胎儿神经视网膜细胞(例如视网膜祖细胞)的异质混合物的组合物与方法被用来治疗、减轻、或者预防视网膜疾病或状态，例如：Usher氏病、视网膜色素病变(RP)、视网膜退化性病变、老年性黄斑部病变(AMD)、湿式AMD或干式AMD、地图状萎缩、视网光感受器疾病、糖尿病视网膜病变、黄斑囊样水肿、葡萄膜炎、视网膜剥离、视网膜损伤、黄斑裂孔、黄斑毛细血管扩张症、创伤性或医源性视网膜损伤、神经节细胞或视神经细胞疾病、青光眼或视神经病变、血性视网膜疾病，例如早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞或缺血性视神经病变；或者改善明视(日光)视力；或改善矫正视力敏锐度；或改善黄斑功能；或改善视野；或改善暗视(夜间)视力。
同样地，本文中所述的任何组合物与方法可可用来提供快速效果、增加最佳矫正视力敏锐度、改善黄斑功能以及/或保留或恢复中心注视的可能。
使用或实现本文中所公开的任何的组合物与方法导致各种***性的好处，例如：可能因为有关于在光对昼夜节律、垂体功能、激素的释放、血管紧张度等影响之身体改善而对治疗中个体外观上的改变；提高视觉能力；改善走动独立性；改善幸福感；和/或改善日常生活活动。
在替代性实施方案中，使用或实现本文中所公开的任何之组合物与方法不导致例如肿瘤的想要的细胞生长；感染，例如无眼内炎-眼内手术的风险；疾病的散布(然而，普利昂病或狂牛病难以排除)；葡萄膜炎；以及/或急性移植物排斥之发展；升高的眼压；隅角闭锁；低眼压；视网膜剥离；以及/或新血管形成。
在本文中所述的使用与方法可快速地与持续地修复以及/或保留哺乳动物个体的视网膜视觉功能的临床上显著的程度，包含，但不受限于，改善明视(日光)视力；增加最佳矫正视力敏锐度；改善黄斑功能；保留或恢复中心注视、改善视野、改善暗视(夜间)视力、声音灵敏度的增加或改善与异侧眼的视力之改善。其他的改变可包含各种***性的好处，例如：可能因为有关于在光对昼夜节律、垂体功能、激素的释放、血管紧张度之影响之身体改善而对治疗中个体外观上的改变；提高视觉能力；改善走动独立性；改善幸福感；和/或改善日常生活活动。此些视觉的改变可通过本领域已知的方法测量。
视觉益处可快速地并可在治疗后的第一周之内发生，但也可能在较长时间周期内作为增量收益发生。可发生视网膜细胞取代以及/或供体细胞迁移到视网膜、视网膜回路或外核层或黄斑，但是它不是临床疗效所必需的。供体细胞可能迁移到视网膜，但是它不是临床疗效所必需的。
包含以本文中所公开的视网膜祖细胞组合物的治疗所致的视力改善的视觉改变的测量可使用标准的眼科检查技术来达成，其包含，但不受限于，眼底检查、最佳矫正视力(BCVA)、IOP、裂隙灯检查、荧光血管摄影术(FA)、光同调断层扫描(OCT)、立体眼底摄影术、视网膜电描记术(ERG)、锥状频闪细胞视网膜电描记术(cone flickerelectroretinography)、视野检查(视野)、微视野检查、黑暗适应力、迷宫通过能力、视动/视动反应(optokinetic/optomotor response)、瞳孔反应、视觉诱发电位(VIP)以及适应性光学扫描激光眼底检查法(adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy，AOSLO)。
体内动物数据也已表明玻璃体内RPC是影响患病视网膜中多种细胞类型的一种手段，包含，但不受限于，米勒细胞(增强视网膜退化的活化以及/或增加麸胺酰胺合成酶(GS)的局部表达)、糖尿病视网膜病变的血管腔隙(血管通透性(泄露)较低以及/或基于视网膜内的VEGF浓度降低的缺血较少)、增强视网膜退化中之巨噬细胞的募集、增加视网膜退化中之bFGF(神经营养因子)的局部表达、降低半胱天冬酶3(caspase 3)的表达(表示较少的视网膜细胞死亡)。因而，RPC的施用在其他视网膜疾病、病症与病况的范围内亦可有效。
此外，已观察到在未注射的对侧眼中的功效指标方面的交叉治疗效果的初步证据。明确地，此在RCS大鼠(光感受器的组织学拯救与ERG纪录)可看到出且亦可在病人的子集(视力敏锐度测验)中看到，且其似乎是可超越被注射眼睛的局限之体液的治疗的效果之证据。这种作用可能是细胞介素以及/或胞外体经过血液循环、免疫调节或者两者的扩散的结果。
同样地，动物中的体内数据表明，骨桥蛋白(OPN)的单一玻璃体内注射重复一些，但并非全部，由hRPC所提供的治疗效果。然而，就视网膜细胞群体的时间与特异性反应而言，单一剂量的多效蛋白(PTN)以及/或中期因子之效果异于使用OPN所观察的效果。
动物中的体内数据也表明，RPC衍生的胞外体的单一玻璃体内注射在一定程度上复制由hRPC所提供的治疗效果。
试剂盒与说明书
还提供试剂盒，其含有适合用于本文所公开的任何方法(例如：治疗视网膜疾病或状态或制造或分离胎儿神经视网膜细胞的异质混合物)任何组合物(例如：胎儿神经视网膜细胞的异质混合物)，包含其使用说明书。还提供试剂盒，其含有细胞的组合物、制品或混合物或培养物(例如：胎儿神经视网膜细胞的异质混合物)，其中试剂盒还选择性地包含用来实现本文所述任何方法的说明书。
试剂盒还可包含含有本文所述哺乳动物视网膜祖细胞的细胞群体，不管细胞以培养、新鲜或冷冻提供或者被制备为用来给药予个体的组合物。同样地，试剂盒进一步包含用来实现本文所述之方法的说明书。在一些实施方案中，此试剂盒可额外地含有与本文所述视网膜祖细胞的一或多个标记结合的试剂(例如：抗体或寡聚核苷酸引物)以及/或基本或条件培养基。例如，适合的试剂盒可包含含有对一或多个标记具特异性的抗体的第一容器与含有基本或条件培养基的第二个容器，其中所述抗体适用于例如通过与荧光标记物或磁珠结合进行分离或检测。试剂盒进一步包含用于制备本发明的细胞群体的一或多个其他试剂，诸如：细胞培养基、细胞外基质涂布的细胞培养皿以及/或适合用于组织处理的酶。试剂盒还可含有关其用于分离、纯化、以及/或扩增从组织样本取得的视网膜祖细胞或细胞群体的说明书。同样地，试剂盒进一步包含用来从病人或捐赠者取得组织样本的工具以及/或用来盛装取得的组织样本的容器。
兽医学上的应用
本文所描述的任何组合物与方法还可用于兽医学上的应用。举例而言，猫的RPC的生长与营养不良的猫及其他动物的视网膜的治疗应用，其他动物为例如，任何哺乳类宠物、常见的驯养的及罕见野生哺乳动物物种、动物园动物、农场动物、运动动物(例如赛狗或赛马)以及其类似动物。
有许多驯养动物携带由于大量近亲繁殖导致失明的基因。这些包含猫、狗、马，可能还有其他物种。
同样地，在野生及驯养的动物中发生的视网膜疾病和损伤将受益于使用本文所述的组合物和方法的治疗。
制品、植入物与人工器官
还提供包含本文所描述含有胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的一或多个组合物的植入物、人工器官、生物反应器***、细胞培养***、皿、盘、试管、瓶、及烧瓶以及类似物。
通过非限制实施例的方式，本文额外提供含有胎儿神经视网膜细胞的异质混合物的生物反应器、植入物、支架、人工器官或相似的装置；举例而言，植入物类似或如美国专利案No.7,388,042、7,381,418、7,379,765、7,361,332、7,351,423、6,886,568、5,270,192所描述的，以及美国专利申请案公告No.20040127987、20080119909(描述耳的植入物)、20080118549(描述眼的植入物)、20080020015(描述生物活性伤口敷料)、20070254005(描述心脏瓣膜生物假体、血管移植物、半月板植入物)、20070059335、20060128015(描述肝植入物)
列举的实施方案
本发明可通过参考以下列举的例示性实施方案而定义：
1.一种分离从人样本所得初代视网膜细胞的方法，包括以下步骤：
a)处理从人供体所得人样本视网膜组织，
b)机械解离所得样本，
c)测定从样本所得的初代视网膜细胞的存活力及数量，及
d)确认所得初代视网膜细胞的形态以产生经解离的细胞及细胞簇的悬浮液。
2.实施方案1的方法，其中该人视网膜组织得自一个或一对人眼球。
3.实施方案2的方法，其中该眼球具有正常形态，包含完整球体、透明角膜、正常形状或其任何组合。
4.实施方案1的方法，其中该人视网膜组织是储存于含有L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中且在从人供体收集组织后立即储存在冰上。
5.实施方案1-4中任一方法，其中该储存人视网膜组织是在收集后确定的一段时间内运送及使用。
6.实施方案5的方法，其中该确定的一段时间包含约7至约26小时。
7.实施方案1的方法，其中步骤(a)包含：
a)收集组织后，从RPMI-1640培养基移出眼球且用补充抗生素的冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗1至5次，
b)从眼球移出视神经及间质组织以移出所有眼外细胞，
c)用补充抗生素的冰冷PBS洗涤眼球，
d)用针于角膜缘穿刺球体，
e)用显微手术剪刀沿角膜缘周向切割，
f)移出晶状体、角膜及相连的玻璃体，
g)从视网膜色素上皮(RPE)层解离视网膜以产生经分离的视网膜，
h)将经分离的视网膜置于含有补充抗生素的冰冷培养基或或PBS的培养皿。
8.实施方案1的方法，其中步骤(b)包含机械解离步骤(a)所得视网膜，所述方法通过步骤：
a)将视网膜转移至锥形管，
b)机械解离视网膜以产生经解离的视网膜，
c)用补充抗生素的无血清培养基洗涤培养皿，并将含有任何残留的经解离的视网膜的培养基转移至含有经解离的视网膜的锥形管，
d)经由离心使经解离的视网膜沉淀成粒，及
e)移出上清液。
9.实施方案8的方法，其中该视网膜机械解离为通过使用无菌移液管粉碎进行。
10.实施方案8的方法，其中该经解离的视网膜在1至50℃经由在10至1000g离心0与30分钟而沉淀成粒。
11.实施方案1的方法，其中步骤(c)包含：
a)使来自步骤(b)的沉淀成粒的视网膜组织再悬浮于冰冷的补充抗生素的无血清培养基，
b)测定从视网膜组织机械解离所得视网膜细胞及视网膜细胞簇的数量及存活力，
c)将细胞接种入包被纤连蛋白的含有补充抗生素的无血清培养基的细胞培养瓶，
d)在10至50℃培育含有视网膜细胞的培养瓶。
12.实施方案11的方法，其中通过NC-200细胞计数器测量细胞的数量及存活力。
13.实施方案11的方法，其中细胞的计数数目为约1与约1,000,000,000。
14.实施方案11的方法，其中存活的经计数细胞的百分比为约10与约100。
15.实施方案11的方法，其中培养瓶被接种约1至约1,000,000,000个细胞。
16.实施方案11的方法，其中含有视网膜细胞的培养瓶的培育是在37℃及0至30％CO2及0至50％O2之下。
17.实施方案1的方法，其中步骤(d)包含确认接种入细胞培养瓶的视网膜细胞由包含约1至约100个细胞的视网膜细胞簇组成。
18.实施方案1-17中任一方法，其中用于补充PBS或无血清培养基的抗生素为庆大霉素。
19.实施方案1-18中任一方法，其中抗生素的使用浓度为约0至约10,000μg/mL。
20.实施方案1-19中任一方法，其中无血清培养基包含：
a)Advanced DMEM/F12、
b)N-2补充物、
c)EGF(重组人表皮生长因子)、
d)bFGF(碱性纤维母细胞生长因子)、及
e)GlutaMAX I。
21.一种培养经分离的初代人视网膜细胞以产生非永生的人视网膜祖细胞的群体的方法，包含：
a)在标准氧气浓度之下，对包被无异源纤连蛋白、鸟胺酸、聚赖胺酸或层粘连蛋白的培养瓶或培养板中无血清培养基中的经分离的初代视网膜细胞悬浮物培养约4至6代，
b)接着在低氧气浓度之下培养无血清培养基中的悬浮物约额外3至6代，其中细胞在40％至90％汇合时继代，在每一次继代用酶处理以解离细胞且添加新鲜培养基，及
c)接着冷冻保存细胞，
从而制得非永生的人视网膜祖细胞的群体。
22.实施方案21的方法，其中，在低氧气浓度之下后续培养悬浮液后，细胞被允许在标准氧气浓度之下不继代地成长一段时间。
23.实施方案21的方法，其中继代之间的时间段为3至5天。
24.实施方案21的方法，其中用于解离细胞的酶溶液包含胰蛋白酶或等效物。
25.实施方案21的方法，其中在第1继代使用包含胰蛋白酶或等效物与EDTA的比为1：4的酶溶液在37℃将细胞解离6-10分钟。
26.实施方案21的方法，其中在第2继代使用包含胰蛋白酶或等效物与DPBS的比为1：1：3的酶溶液在37℃将细胞解离4至8分钟。
27.实施方案21的方法，其中在第3继代及所有进一步继代使用包含胰蛋白酶或等效物、EDTA与DPBS的比为1：1的酶溶液在37℃将细胞解离4至8分钟。
28.实施方案21的方法，其中通过添加过量的DMEM或PBS而停止解离。
29.实施方案21的方法，其中在解离之后测定细胞计数及存活力。
30.实施方案21的方法，其中通过NC-200细胞计数器测定细胞计数及存活力。
31.实施方案21的方法，其中步骤(c)冷冻保存系通过以下步骤进行：
a)使用1：1胰蛋白酶或等效物与DPBS酶解离细胞，
b)使用过量的DMEM或PBS停止解离，
c)经由10至10,000g离心1至30分钟使细胞沉淀成粒，
d)使细胞再悬浮于无血清培养基及测定总细胞计数及存活力，
e)添加冷冻保存介质以达到5与30％的最终DMSO浓度，
f)将0.2至100x106个细胞等分至各冷冻管，
g)使各冷冻管在-80℃冷冻6至72小时，及
h)将各冷冻管的细胞置于液态N2中。
32.实施方案21的方法，其中细胞及/或细胞簇与支持细胞生存或生长的补充物或添加物一起培养。
33.实施方案32的方法，其中支持细胞生存或生长的补充物或添加物选自由以下组成的组：L-谷氨酰胺、由EGF及bFGF(Invitrogen)组成的人重组型生长因子及其他生长因子。
实施例
实施例1：初代视网膜细胞的分离：方案A
依照专门针对4.5至21.5小时输送期间优化的方案进行初代人视网膜细胞的分离，其中输送期间的测量从收集组织的时间至接收供体组织的时间。
1. 15ml试管中装有含有L-谷氨酰胺(BioWhittaker)的RPMI-1640培养基的1个或1对眼球在冰上被运送且在4.5至21.5小时内递送。收到时，检视眼球是否总体上有异常：球体完整、角膜清晰、眼球形状正常。使用消毒技术在层流净化罩中进行步骤2-8。
2.用40ml含有抗生素的冷PBS(50ml试管中)清洗整个眼球3次(3个不同试管中)。
3.移除视神经及剩余的间质组织。采取这种方案是为了避免视网膜分离物受到脑衍生性细胞的污染。用含有抗生素的冷PBS再清洗一次。
4.在解剖显微镜下，使用带有255/8针头的1ml注射器在角膜边缘穿刺整个部位，用显微手术剪刀沿角膜缘切割以周向打开眼球，移出角膜、晶状体及相连的玻璃体。小心地从RPE取下视网膜，收集至含有～2ml冷DMEM/F12的小培养皿。
5.使用1mL移液管尖以手动方式将培养皿内的视网膜破碎成小块(2至5次)，转移至15mL冷的锥形底试管，用1mL冷PBS清洗培养皿2至3次，加入15mL试管，以1000rpm(179xg)的转速短暂离心5分钟，用10mL移液管完全移除上清液及抛光玻璃移液管。
6.在室温下，于40秒内添加0.8mL未稀释的TrypLE Express(Invitrogen)，使用1mL移液管尖轻轻缓慢吸取(约10次)，添加10mL冷的新鲜培养基(无血清)至经中和的TrypLE Express，以1000rpm(179g)的转速短暂离心4分钟，移除上清液，使用1.5ml冷的新鲜培养基(SM)让沉淀粒再悬浮，使用抛光的玻璃移液管吸取约10次，添加额外的6.5mL培养基，细胞存活力及细胞数目通过由台盼蓝(Invitrogen)染色测定、通过Countess(Invitrogen)或由人计数，约1.3×106个细胞/ml，约92％存活，约10×106个细胞簇/总体，约80％为小/中丛。将细胞接种于经包被纤连蛋白的2T75(详见实施例5)，接着在37℃及5％CO2，3％或20％O2培育(任选地在37℃，5％-10％CO2，1％-20％O2培育)。
注记：定义细胞计数。
·单个细胞：～6-8um，含有1个细胞。
·小丛：～15-40um，含有～2-30个细胞。
·中丛：～40-100um，含有～30-80个细胞。
·大丛：～100-150um，含有>80个细胞。
所得细胞群体中：～80-90％为小或中丛，～9-18％单个细胞，～1-2％大丛。
若小/中丛为计数为"1"，总细胞数目为～10×106。
若单个细胞计数为"1"，总细胞数目为～240×106。
7.总体流程：45分钟～1小时10分钟。(任选地在2小时内)。
8.～1.5小时后，90％细胞已沉到底部(若组织为新鲜的，诸如在冰上运送4.5小时，若不是，诸如在冰上运送21.5小时，～6小时沉到底部)，90％为小块料，10％为单个细胞。通过IncuCyte评估，大致而言90％为存活(优良)，细胞密度将为>10％汇合(～20％较佳)。拍照。
实施例2：初代视网膜细胞的分离：方案B
依照专门针对7至26小时输送期间优化的方案进行初代人视网膜细胞的分离，其中输送期间的测量从收集组织的时间至收到供体组织的时间。
1.来自组织供给的1个或1对眼球在装有含有L-谷氨酰胺(BioWhittaker)的RPMI-1640培养基的15ml试管中在冰上被运送且在7-26小时内递送。该方案也可用于更广的输送窗。收到时，检视眼球是否总体上有异常：球体完整、角膜清晰、眼球形状应正常。将50μg/mL的庆大霉素加至RPMI-1640及L-谷氨酰胺输送培养基以避免潜在的组织污染。使用消毒技术在层流生物安全柜中进行步骤2-8。
2.用40ml含有抗生素的冷PBS(50ml试管中)清洗完整眼球3次(3个不同试管中)。使用30μg/mL的庆大霉素。使用庆大霉素取代青霉素或链霉素以避免排除对抗生素过过敏的病患。
3.从眼球移除视神经及剩余间质组织以避免视网膜分离物可能被眼外细胞细胞污染。用含有抗生素的冷PBS额外清洗一次。
4.在解剖显微镜下，使用带有255/8针头的1ml注射器穿刺球体角膜缘，用显微手术剪刀沿角膜缘切割以周向打开眼球，移出并丢弃角膜、晶状体及相连的玻璃体。小心地从RPE层取下视网膜，转移至含有约2ml含有庆大霉素(庆大霉素30μg/ml)冷的完全培养基的小培养皿。
5.将视网膜转移至15mL锥形管。使用经由1ml移液管尖轻轻粉碎(4至8次)将视网膜切成小块。若培养皿仍有残留视网膜组织，使用1mL含有庆大霉素的冷完全培养基清洗培养皿1至2次，添加至含有视网膜组织的15ml试管。将15mL试管移至离心机，在4℃以140xg的转速短暂离心3分钟，吸出并完全移除上清液。
6.用1mL移液管尖将沉淀粒再悬浮于含有庆大霉素的1.0mL冷新鲜培养基，轻轻吸放悬浮物4至5次，添加额外的15mL培养基。经由NC-200使用聚集细胞计数方法测定细胞存活力及细胞数目。此方法可得到正确细胞数目同时维持细胞簇，这对初始细胞培养及将组织转化成细胞可能很重要。期望细胞存活力落在68-85％范围，期望存活细胞计数为约73-147x106。将细胞接种入先前经纤连蛋白包被的3x T25(或1-2T75)培养瓶(详见实施例5)，接着在37℃及5％CO2，20％O2培育(注意：步骤1用20％：组织至种子库，也可以在低氧下完成。然而，此处目标为保持新产物尽可能接近先前产物(在20％氧气生长的)。步骤2：种子库至制造库，为使用低氧3％培养，以延长细胞增殖)。
7.在显微镜下检查细胞：期望培养物主要由小至中型尺寸细胞簇再加上一些单个细胞(后者更可能为非存活)组成。
8.总分离流程期间：约30至60分钟(此方案专门省略酶，比基于酶的分离方案显著更快速、简易)。
实施例3：细胞培养：方案A
从实施例1所述方法分离的视网膜细胞培养人视网膜祖细胞：
1.改变培养基：每2天更换一次，更换90％培养基。
2.继代：在60-80％(任选地40-90％)汇合时，细胞被继代，其通过稀释2倍(等效物0.125％)的TrypLE Express(Invitrogen)，任选地胰蛋白酶或等效物，或TRYP-LE EXPRESS或等效物，在37℃培育5-6分钟。通过添加旧培养基或冷PBS(10ml)停止解离。通过台盼蓝(Invitrogen)染色测定细胞存活力及细胞数目，通过Countess(Invitrogen)或由人计数，细胞存活力>90％。将细胞接种于新的经包被纤连蛋白的烧瓶/盘，接种密度为1-6.7x104/cm2(较早代数6.7x104丛/cm2)，较晚代数：2x104/cm2)。
3.冷冻细胞：收集细胞，通过稀释2倍(等于0.125％)的TrypLE Express(Invitrogen)、任选地胰蛋白酶或等效物或TRYP-LE EXPRESS或等效物，在37℃培育5-6分钟。通过添加旧培养基或冷PBS(10ml)停止解离。以1000rpm(179xg)的转速短暂离心5分钟，将细胞再悬浮于新鲜培养基或冷PBS。通过台盼蓝(Invitrogen)染色测定细胞存活力及细胞数目，通过Countess(Invitrogen)或由人计数。以1000rpm(179xg)短暂离心5分钟，将细胞再悬浮于细胞冷冻培养基，将0.5-5x106个细胞等分于各冷冻管(Greiner)。放入Cryo 1℃冷冻容器(NALGENE)，置于-80℃冰箱隔夜(或更久，<2周)，转移至液态氮罐中。
4.解冻细胞：从液态氮取出细胞，置入37℃水浴中2-3分钟，直到结晶消失，立即使用1ml移液管尖转移至一根冷的15ml锥形底试管，用冷新鲜培养基清洗冷冻管2次，将12ml冷新鲜培养基缓慢加入15ml试管，第一次逐滴加1ml，轻轻摇动。在800rpm(115g)的转速短暂离心3分钟。丢弃上清液，使细胞沉淀粒再悬浮于新鲜培养基，如上所述测定细胞数目及存活力。在新的经包被的烧瓶中接种且在以上所述条件下培育。
制备用于移植的细胞：收集细胞，通过稀释2倍的(等于0.125％)TrypLE Express(Invitrogen)、任选地胰蛋白酶或等效物或TRYP-LE EXPRESS或等效物，在37℃培育5-6分钟。通过添加10ml旧培养基或冷PBS停止解离。以1000rpm(179xg)的转速短暂离心5分钟，将细胞再悬浮于10ml冷HBSS中，通过台盼蓝(Invitrogen)染色测定细胞存活力及细胞数目，通过Countess(Invitrogen)或人力计数。以1000rpm(179xg)的转速短暂离心5分钟，将细胞再悬浮于冷HBSS中，制成用于移植的细胞悬浮物，0.5x106个细胞(100ul HBSS中)用于患者，30,000个细胞(2ul HBSS中)用于大鼠。
实施例4：细胞培养：方案B
从实施例2所述方法分离的视网膜细胞培养人视网膜祖细胞：
1.更换培养基：除了第0天至第3天，每2天更换一次，更换100％培养基。开放***、封闭***及半封闭***都可以用于更换培养基及继代细胞。任选地，可以每天更换培养基。
2.继代：每4-5天在15-95％汇合(任选地40-95％汇合)时继代细胞。方法因代数而异。细胞也可以每3-4天，或每3-5天继代。
第1继代：1：4的TrypLE Select(Invitrogen)+EDTA(Invitrogen)，在37℃培育7-8分钟。
第2继代：1：1：3的TrypLE Select(Invitrogen)+EDTA(Invitrogen)+DPBS(Invitrogen)，在37℃培育5-6分钟。
第3继代及之后的继代：1：1的TrypLE select(Invitrogen)+DPBS，在37℃培育5-7分钟。
任选地，可以使用稀释2倍(等于0.125％)的TrypLE Express、胰蛋白酶或等效物或TRYP-LE EXPRESS或等效物。通过添加DMEM或PBS(10ml)停止丛的解离。经由NC-200测定细胞存活力及细胞数目。期望细胞存活力>70％。将细胞接种入新的经包被纤连蛋白的培养瓶/培养板，接种密度为3-67x104/cm2(早代数67x104/cm2，晚代数：3x104/cm2)。
3.冷冻保存：使用稀释2倍(等于0.125％)的TrypLE Select/Express(Invitrogen)、任选地胰蛋白酶或等效物或TRYP-LE EXPRESS或等效物收集细胞，在37℃培育5-7分钟。经由添加DMEM或PBS停止解离。然后短暂离心。50ml试管在490xg短暂离心7分钟，500ml锥形底在700xg短暂离心8分钟，使细胞再悬浮于新鲜培养基。使用NC200测定细胞存活力及细胞数目。添加相同量的2x冷冻保存介质(20％DMSO)以达到最终用于细胞悬浮物的10％DMSO。将0.5-10x106个细胞等分至各冷冻管(Themofisher或类似者)。放入Cryo 1℃冷冻容器(NALGENE)，置于-80℃冰箱中隔夜(或更久，<2周)，转移至液态氮罐。
4.解冻细胞：从液态氮取出细胞，置入37℃水浴中2-3分钟，直到结晶消失，然后立即使用1ml移液管尖转移至一根冷的15ml锥形底试管，用冷的新鲜培养基清洗冷冻管1-2次，将9-12ml冷新鲜培养基缓慢加入15ml试管，以1200rpm(300g)的转速短暂离心5分钟。丢弃上清液，使细胞沉淀粒再悬浮于新鲜培养基，如上所述测定细胞数目及存活力。在新的经包被的培养瓶中接种且在以上所述条件下培育。
5.制备用于移植的细胞：通过稀释2倍(等于0.125％)的TrypLE Express(Invitrogen)，任选地胰蛋白酶或等效物、或TRYP-LE EXPRESS或等效物收集细胞，在37℃培育5-6分钟。通过添加DMEM停止解离。以300g使细胞悬浮物短暂离心5分钟，然后使细胞再悬浮于0.5-3ml的冷BSS Plus(或BSS/DPBS/HBSS)。使用台盼蓝(Invitrogen)测定细胞存活力及细胞数目，经由Countess(Invitrogen)或由人力或NC200计数。以300g短暂离心5分钟，使细胞再悬浮于冷BSS Plus(或BSS/DPBS/HBSS)以产生合适的剂量供移植用。
实施例5：试剂及细胞器皿的制备
完全培养基的制备(无血清)
使用以下组分制备培养人视网膜祖细胞的培养基：
·Advanced DMEM/F12(Invitrogen)，
ο任选地DMEM/F12(Invitrogen或其他品牌)或KnockOutDMEM/F12(Invitrogen或其他品牌)或neurobasal(Invitrogen)或UltraCULTURE(Lonza)或ReNcell(Chemicon)，或其他等效物培养基。
·N-2补充物(Invitrogen)，
ο任选地B27(Invitrogen或其他品牌)无异源或B27非无异源或Stempro(Invitrogen)或其他等效物。
·EGF(重组人表皮生长因子)：Invitrogen，任选地其他品牌
·bFGF(碱性纤维母细胞生长因子)：Invitrogen，任选地其他品牌
·GlutaMAX I：Invitrogen，任选地L-谷氨酰胺(Invitrogen或其他品牌)
·用于分离及第一继代(～4-5天)的庆大霉素(Invitrogen)
继代酶：
·Versene溶液：Thermo Fisher(Life tech)如上所述用于第1继代及第2继代。Versene为作为温和非酶细胞解离试剂使用的EDTA溶液。
Figure GDA0003170202000000721
Versene溶液(0.48mM)经配制为每升磷酸盐缓冲盐水(PBS)0.2gEDTA(Na4)。
冷冻保存介质的制备
制备用于经培养的人视网膜祖细胞的冷冻保存的介质，其含有：
·90％完全培养基
·10％DMSO
包被培养瓶
人血浆纤连蛋白(Invitrogen)，任选的地鸟胺酸、聚赖胺酸、层粘连蛋白或Matrigel，稀释于DPBS，浓度：1-5μg/cm2，允许在室温净化橱中包被1-3小时，在4℃储存隔夜或达2周。使用前以Advanced DMEM/F12清洗。
实施例6：细胞培养方案B的另外版本
从实施例2所述方法分离的视网膜细胞培养人视网膜祖细胞：
1.更换培养基：每2天更换一次，更换100％培养基。开放***、封闭***及半封闭***都可以用于更换培养基及继代细胞。任选地，可以每天更换培养基。
2.继代：每4-5天在15-95％汇合(任选地40-95％汇合)时继代细胞。方法因代数而异。也可以每3-4天，或每3-5天继代细胞。
第1继代：1：4的TrypLE Select(Invitrogen)+EDTA(Invitrogen)，在37℃培育7-8分钟。
第2继代：1：1：3的TrypLE Select(Invitrogen)+EDTA(Invitrogen)+DPBS(Invitrogen)，在37℃培育5-6分钟。
第3继代及之后的继代：1：1的TrypLE select(Invitrogen)+DPBS，在37℃培育5-7分钟。
任选地可以使用稀释2倍(等于0.125％)的trypLE Express、胰蛋白酶或等效物，或TRYP-LE EXPRESS或等效物。通过添加DMEM或PBS(10ml)停止丛解离。
3.解离：通过添加Advanced DMEM或PBS(10ml)停止细胞簇解离。经由NC-200测定细胞存活力及细胞数目。期望细胞存活力>70％。将细胞接种入经新的经包被纤连蛋白的培养瓶或细胞堆(CS)，密度为1-200x104/cm2(早代数2x106/cm2，后代数：1x104/cm2)。
4.冷冻保存：通过使用稀释2倍(等于0.125％)的TrypLE Select/Express(Invitrogen)、任选地胰蛋白酶或等效物，或TRYP-LE EXPRESS或等效物收集细胞，在37℃培育5-7分钟。通过添加DEME或PBS停止解离，然后对细胞短暂离心。50ml试管以490xg离心细胞7分钟。500ml锥形底试管以700xg离心细胞8分钟。使细胞再悬浮于新鲜培养基。使用NC200测定细胞存活力及细胞数目。加入同量的2x冷冻保存介质(20％二甲基亚砜(DMSO))以达成用于细胞悬浮物的最终10％DMSO。将0.5-10x106个细胞等分于各冷冻管(Themofisher或类似物)。此为每mL培养基+10％DMSO约10x106至约40x106个细胞。将细胞放入Cryo 1℃冷冻容器(NALGENE)，并且将容器置入-80℃冰箱隔夜(或更久，<2周)，然后转移至液态氮罐。可替代地，在转移至液态氮之前，可使用控制速率冷冻机冷冻细胞。
5.解冻细胞：从液态氮取出细胞，置入37℃水浴中2-3分钟，直到结晶消失，然后立即使用1ml移液管尖转移至一根冷的15ml锥形底试管，用冷的新鲜培养基清洗冷冻管1-2次，然后将9-12ml冷新鲜培养基加入15ml试管，以1200rpm(300g)的转速短暂离心5分钟。丢弃上清液，使细胞沉淀粒再悬浮于新鲜培养基，如上实施例2所述测定细胞数目及存活力。在新的经包被的培养瓶或细胞堆中接种胞且在以上所述条件下培育。
6.制备用于移植的细胞：通过稀释2倍(等于0.125％)的TrypLE Express(Invitrogen)、任选地胰蛋白酶或等效物、或TRYP-LE EXPRESS或等效物收集细胞，在37℃培育5-6分钟。藉添加完全培养基、DMEM或PBS停止解离。以300g使细胞悬浮物短暂离心5分钟，然后使细胞再悬浮于0.5-3ml的冷BSS Plus(或BSS/DPBS/HBSS)。使用台盼蓝(Invitrogen)测定细胞存活力及细胞数目，经由Countess(Invitrogen)或由人或NC200计数。以300g短暂离心细胞5分钟，使细胞再悬浮于冷BSS Plus(或BSS/DPBS/HBSS)以产生合适的剂量供移植用。
试剂/细胞器皿的制备：
完全培养基制备(无血清)：
·Advanced DMEM/F12(Invitrogen)用于此方案。任选地，可以使用DMEM/F12(Invitrogen或其他品牌)、KnockOut DEMEM/F12(Invitrogen或其他品牌)或neurobasal(Invitrogen)、UltraCULTURE(Lonza)、ReNcell(Chemicon)或其他等效物培养基。
·N-2补充物(Invitrogen)，任选地B27(Invitrogen或其他品牌)无异源、非无异源的B27或Stempro(Invitrogen)或其他等效物。
·EGF(重组人表皮生长因子)：Invitrogen，任选地其他品牌。
·bFGF(碱性纤维母细胞生长因子)：Invitrogen，任选地其他品牌。
·GlutaMAX I：Invitrogen，任选地L-谷氨酰胺(Invitrogen或其他品牌)
·用于分离及第一继代的庆大霉素(Invitrogen)(约4天，虽然庆大霉素可使用更久)。
继代酶：
·Versene溶液：Thermo Fisher(Life tech)如上所述用于第1继代及第2继代。Versene作为温和非酶细胞解离试剂的EDTA溶液。
Figure GDA0003170202000000751
Versene溶液(0.48mM)经配制为每升磷酸盐缓冲盐水(PBS)0.2g EDTA(Na4)。
冷冻保存介质的制备：
·90％新鲜完全培养基。
·10％DMSO(二甲基亚砜)(Sigma，任选地其他品牌)。
包被培养瓶：
·使用人血浆纤连蛋白(Invitrogen)。任选地鸟胺酸、聚赖胺酸、层粘连蛋白或Matrigel可作为替代物。
·将纤连蛋白稀释于DPBS。
ο浓度：1-5μg/cm2，允许在4℃包被隔夜至达2周或在室温净化橱中包被1-3小时。
ο使用前用Advanced DMEM/F12清洗。
ο烧瓶也可以在未用Advanced DMEM/F12清洗而使用。
等同物
在以上的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。虽然与本文描述的类似或等同的任何方法和材料看用于实施或测试本发明，但现在描述示例性的方法和材料。
已提供的前述描述，仅用于说明的目的并且不意欲将本发明限制在所公开的精确形式，而是将本发明以所述的权利要求限制。
在不脱离本发明的基本方面的情况下，可以对前述内容进行修改。虽然已经参考一个或多个特定实施方案对本发明进行了详细描述，但是所属领域中本领域技术人员将体认到，可以对本申请具体公开的实施方案进行改变，这些修改及改良仍在本发明的范围及精神内。本文例示性叙述的本发明可在不存在本文未特定公开的任何元素下合适地实施。因此，例如，在本文中每一情况下，术语"包含"、"基本上由...组成"及"由...组成"中任何一者可由其他二术语中任一者取代。因此，已用的术语及表达方式系作为叙述使用而不构成限制，不排除所显示及所述的特征或其部分的等同物，且应认识到各种改良也在本发明的范围内。以下权利要求叙述了本发明的实施方案。

Claims (58)

1.一种从人样本分离初代视网膜细胞的方法，其包含：
(a)从该人样本分离包含多个初代视网膜细胞的视网膜样本，
(b)机械解离在步骤(a)分离的该视网膜样本中的所述多个初代视网膜细胞而未使用蛋白酶消化所述多个初代视网膜细胞，从而产生细胞及细胞簇的经解离的悬浮液，及
(c)测定得自所述视网膜样本的所述初代视网膜细胞的存活力、数量、及形态，其中产生至少30x106个存活的初代视网膜细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人样本为一个或一对人眼球。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述眼球具有正常形态，包含完整球体、透明角膜、正常形状、或其任何组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前在从所述人供体收集人样本后，将所述人样本置于输送细胞培养基中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述输送细胞培养基包括含有L-谷氨酰胺的RPMI-1640或Advanced DMEM/F12。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述输送细胞培养基包含约0.5至50微克/毫升的庆大霉素，任选地其中所述输送细胞培养基包含50微克/毫升的庆大霉素。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述人样本在置放于所述输送细胞培养基中之后立即储存在约1至8℃。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述人样本是在从所述人供体收集后约7至约26小时内使用。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(a)中从所述人样本分离所述视网膜样本包括：
(i)从所述输送培养基移出所述一个或一对人眼球，
(ii)用约1-8℃补充抗生素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗所述一个或一对人眼球，
(iii)从所述一个或一对人眼球移出视神经及间质组织，
(iv)用约1-8℃补充抗生素的PBS洗涤所述一个或一对人眼球，
(v)使用针在角膜缘穿刺所述一个或一对人眼球的每一个的球体，
(vi)沿所述一个或一对人眼球的角膜缘周向切割，
(vii)从所述一个或一对人眼球移出晶状体、角膜及相连的玻璃体，
(viii)从视网膜色素上皮(RPE)层解离视网膜以产生经分离的视网膜或一对经分离的视网膜，及
(ix)将所述经分离的视网膜或所述对经分离的视网膜置于约1-8℃的培养基或PBS中，其中所述培养基或PBS补充有抗生素。
10.根据权利要求9所述的方法，其中重复步骤(ii)1-5次或3次。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中步骤(iii)移出一些或所有眼外组织及细胞。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：
(i)将所述视网膜样本转移至试管，
(ii)机械解离所述视网膜样本以产生多个经解离的初代视网膜细胞，
(iii)经由离心使所述多个经解离的初代视网膜细胞沉淀成粒，及
(iv)移出上清液。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述视网膜的所述机械解离是经由用无菌移液管粉碎进行。
14.根据权利要求13所述的方法，其中进行所述粉碎2至50次、2至10次、或4至8次。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述多个经解离的初代视网膜细胞经由在4℃、约140xg离心约3分钟的时间段而沉淀成粒。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其包括在步骤(ii)之后且在步骤(iii)之前用补充抗生素的培养基或PBS洗涤所述多个经解离的初代视网膜细胞。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述多个经解离的初代视网膜细胞包含单个细胞及细胞簇。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括：
(i)将来自步骤(b)的沉淀成粒的初代视网膜细胞再悬浮于约1-8℃的补充抗生素的培养基，
(ii)将所述多个经解离的视网膜细胞接种于一或多个含有培养基的包被细胞培养瓶或培养板中，任选地其中所述细胞培养基补充有抗生素，
(iii)在10至50℃培育所述多个经解离的视网膜细胞，任选地其中在37℃进行所述培育，及
(iv)测定初代视网膜细胞及视网膜细胞簇的数量及存活力。
19.根据权利要求18所述的方法，其中通过NC-200细胞计数器使用聚集细胞计数方法、血球计或台盼蓝测定初代视网膜细胞的数量及存活力。
20.根据权利要求19所述的方法，其中存活的初代视网膜细胞的数目为约20x106至约1x109个存活的初代视网膜细胞，或约73-147x106个存活的初代视网膜细胞。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中存活的经计数细胞的百分比为约10％至约100％，或约68％至约85％。
22.根据权利要求18-21任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中所述培养瓶被接种约1至约1,000,000,000个细胞。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述多个经解离的视网膜细胞在以下条件下培育：
(1)37℃、0至30％CO2及0至50％O2；
(2)37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于20％O2；或
(3)37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于3％O2。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括：
(i)用显微镜目视检查所述多个经解离的视网膜细胞，及
(ii)确认接种至细胞培养瓶或培养板中的多个所述视网膜细胞包含由约2至约1000个细胞组成的视网膜细胞簇。
25.一种培养经分离的初代人视网膜细胞以产生非永生的人视网膜祖细胞的群体的方法，所述方法包括：
(a)在第一继代时将通过根据权利要求1至24中任一项所述的方法产生的多个初代视网膜细胞接种于一或多个含有培养基的经包被的培养瓶或培养板，以产生多个经培养的视网膜细胞；
(b)在第二继代时将所述第一继代产生的多个经培养的视网膜细胞接种于一或多个含有培养基的经包被的培养瓶或培养板；
(c)在第三继代时将所述第二继代产生的多个经培养的视网膜细胞接种于一或多个含有培养基的经包被的培养瓶或培养板；及
(d)冷冻保存所述多个经培养的视网膜细胞；
其中：
以约0.5x104个细胞/平方厘米(cm2)至约5x106个细胞/cm2的密度接种所述一或多个经包被的培养瓶，
在所述第一继代时的接种密度大于在所述第二继代时的接种密度，且
在所述第二继代时的接种密度大于在所述第三继代时的接种密度，
从而产生非永生的人视网膜祖细胞的群体。
26.根据权利要求25所述的方法，进一步包括在一或多个进一步继代时将前一次继代产生的多个经培养的视网膜细胞接种于一或多个含有培养基的经包被的培养瓶或培养板。
27.根据权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述培养瓶或培养板被无异源纤连蛋白、鸟胺酸、聚赖胺酸、层粘连蛋白、或其组合包被。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述多个初代或经培养的视网膜细胞在以下条件下培养：
(1)在37℃、0至30％CO2及0至50％O2，
(2)在37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于20％O2；或
(3)在37℃、小于或等于5％CO2及小于或等于3％O2。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中继代之间的时间段为2至8天、3至6天、4至5天或3至4天。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述多个初代视网膜细胞在所述第一继代时被第一酶溶液解离，所述第一酶溶液包含：
(1)胰蛋白酶或胰蛋白酶等效物、及乙二胺四乙酸(EDTA)，或
(2)胰蛋白酶或胰蛋白酶等效物、EDTA及DPBS。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述胰蛋白酶等效物为TrypLE。
32.根据权利要求31所述的方法，其中(1)所述第一酶溶液中TrypLE与EDTA的比为1：4，或其中(2)TrypLE、EDTA与DPBS的比为1：1：3。
33.根据权利要求25-32中任一项所述的方法，其中所述多个初代视网膜细胞在约37℃被解离约5-20分钟、约6-10分钟，或约7-8分钟。
34.根据权利要求25-33中任一项所述的方法，其中所述多个经培养的视网膜细胞在所述第二继代时被第二酶溶液解离，所述第二酶溶液包含：
(1)胰蛋白酶或胰蛋白酶等效物、EDTA及DPBS，或
(2)胰蛋白酶或胰蛋白酶等效物及DPBS。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述胰蛋白酶等效物为TrypLE。
36.根据权利要求35所述的方法，其中(1)所述第二酶溶液中TrypLE、EDTA与DPBS的比为1：1：3，或其中(2)所述第二酶溶液中TrypLE与DPBS的比为1：1。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述多个经培养的视网膜细胞在约37℃被解离约5-20分钟、约6-10分钟或约7-8分钟。
38.根据权利要求26-37中任一项所述的方法，其中所述多个经培养的视网膜细胞在第三继代或进一步的继代时被包含胰蛋白酶或胰蛋白酶等效物及DPBS的第三酶溶液解离。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述胰蛋白酶等效物包括TrypLE。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述第三酶溶液中TrypLE与DPBS的比为1：1。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述多个经培养的视网膜细胞在至少第三继代或进一步继代时在约37℃被解离约5-10分钟或约5至7分钟。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述进一步继代包括两次继代。
43.根据权利要求25-42中任一项所述的方法，其包括在所述第二继代后在解离所述多个视网膜细胞之后测定细胞计数及存活力。
44.根据权利要求43所述的方法，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的细胞是存活的。
45.根据权利要求25-43中任一项所述的方法，其中以下密度将细胞接种于培养瓶或培养板中：在所述第一继代时以约0.5x106至约3.0x106个细胞/cm2的密度、在所述第二继代时以约0.1x106至约0.5x106个细胞/cm2的密度、在所述第三继代时以约0.03x106至约0.2x106个细胞/cm2的密度，及在第四继代及进一步继代时以约10,000至约60,000个细胞/cm2的密度。
46.根据权利要求25-45中任一项所述的方法，其中步骤(d)的所述冷冻保存包括：
(i)使用胰蛋白酶或胰蛋白酶等效物酶解离所述细胞，
(ii)用过量的培养基或Advanced DMEM/F12停止该解离，
(iii)经由10xg至10,000xg离心1至30分钟离心所述细胞，
(iv)使所述细胞再悬浮于培养基中并测定总细胞计数及存活力，
(v)添加冷冻保存介质以达到最终二甲基亚砜(DMSO)浓度为5至30％，
(vi)将多个细胞等分于各冷冻管，
(vii)使用控制速率冷冻机冷冻各冷冻管，及
(viii)将各冷冻管的细胞置于液态N2中。
47.根据权利要求8-46中任一项所述的方法，其中所述培养基为无血清。
48.根据权利要求8-47中任一项所述的方法，其中所述培养基包含完全培养基。
49.根据权利要求8-47中任一项所述的方法，其中所述培养基包括Dulbecco氏改良Eagle培养基DMEM/F12、Advanced DMEM/F12、Knockout DMEM/F12、Neurobasal培养基、ReNcell或Ultraculture培养基。
50.根据权利要求8-47中任一项所述的方法，其中所述培养基包括Advanced DMEM/F12。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中所述培养基包括N-2补充物及GlutaMAX-I。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述培养基包含B27、无异源B27、或StemPro。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述培养基包含支持细胞生存或生长的补充物或添加物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述支持细胞生存或生长的补充物或添加物选自由以下组成的组：L-谷氨酰胺、重组人表皮生长因子(EGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、其他生长因子、及其组合。
55.根据权利要求8-54中任一项所述的方法，其中所述抗生素包括浓度约0.5至约50μg/mL的庆大霉素，任选地其中庆大霉素浓度为约30μg/mL。
56.根据权利要求46所述的方法，其中步骤(i)中的胰蛋白酶等效物包括TrypLE。
57.根据权利要求46-56中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存介质包含培养基及10％DMSO。
58.根据权利要求46-57中任一项所述的方法，其中步骤(vi)中的所述多个细胞包含每mL培养基及DMSO约0.5x106至约20x106个细胞。
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