ES2849187T3 - Método para activar células T auxiliares - Google Patents
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Abstract
Un método para activar las células T auxiliares in vitro, que comprende la etapa de añadir un péptido WT1 a las células presentadoras de antígenos y de ese modo activar las células T auxiliares, en el que el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula del MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLADRB4* 0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301, donde el péptido WT1 es un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2) y donde las células presentadoras de antígeno son de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0803, un sujeto positivo para HLA-DRB3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPB1*0201 y un sujeto positivo para HLA-DPB1*0301.
Description
DESCRIPCIÓN
Método para activar células T auxiliares
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método in vitro para la activación de células T auxiliares, que incluye la etapa de activación de células T auxiliares mediante la adición de un péptido WT1 a células presentadoras de antígenos, en donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula de MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA- DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, una composición de la misma, un método para activar células T citotóxicas, una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de un cáncer mediante la activación de células T auxiliares y/o células T citotóxicas.
Técnica anterior
El gen WT1 (gen del tumor 1 de Wilms) se identificó como un gen causante de tumor de Wilms que es un cáncer de riñón en la infancia, y el gen codifica un factor de transcripción que tiene una estructura de dedo de cinc (Documentos No Relacionados con Patentes 1 y 2). Estudios posteriores mostraron que el gen anterior sirve como un gen canceroso en tumores de órganos hematopoyéticos o cánceres sólidos (Documentos No Relacionados con Patentes 3 a 6).
Se demostró que las células T citotóxicas (CTL) específicas de péptidos son inducidas por la estimulación in vitro de células mononucleares de sangre periférica utilizando un péptido que tiene una porción de una secuencia de aminoácidos que codifica la proteína WT1, y estos CTL dañan las células cancerosas de los tumores de órganos hematopoyéticos o cánceres sólidos que expresan WT1 de forma endógena. Los CTL reconocen el péptido anterior en forma de un complejo unido a una molécula del MHC de clase I, y por lo tanto el péptido difiere según los subtipos de MHC de clase I (Documentos Relacionados con Patentes 1 a 4 y Documento No Relacionado con Patentes 7).
Por otro lado, la presencia de células T auxiliares específicas para un antígeno canceroso es importante para inducir los CTL de manera efectiva (documento no de patente 8). Las células T auxiliares se inducen y activan al reconocer un complejo de una molécula de MHC de clase II con un péptido antigénico sobre las células presentadoras de antígenos. Las células T auxiliares activadas ayudan a la proliferación, diferenciación y maduración de las células B mediante la producción de citocinas tales como IL-2, iL-4, IL-5, IL-6 o interferones. Dado que tales células T auxiliares tienen la función de activar el sistema inmunitario al promover la proliferación y activación de las células B y las células T, se sugiere que la mejora de la función de las células T auxiliares a través de un péptido antigénico de unión al MHC de clase II en la inmunoterapia contra el cáncer es útil para mejorar los efectos de una vacuna contra el cáncer (Documento No Relacionado con Patentes 9).
Recientemente se ha demostrado que un péptido auxiliar promiscuo que se puede unir a múltiples moléculas MHC de clase II y activar células T auxiliares está presente entre los péptidos particulares que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos que codifica una proteína WT1 (en adelante, también denominados péptidos WT1 en la presente memoria descriptiva) (Documentos Relacionados con Patentes 5 y 6). Sin embargo, fue muy difícil verificar si los péptidos WT1 también tienen efecto o no sobre otras moléculas del MHC de clase II, debido a los muchos tipos de moléculas del MHC de clase II.
Documentos de la técnica anterior
Documentos No Relacionados con Patentes
Documento Relacionado con Patentes 1: Publicación Internacional Núm. WO 2003/106682 Documento Relacionado con Patentes 2: Publicación Internacional Núm. WO 2005/095598 Documento Relacionado con Patentes 3: Publicación Internacional Núm. WO 2007/097358 Documento Relacionado con Patentes 4: Solicitud Internacional Núm. PCT/JP2007/074146
Documento Relacionado con Patentes 5: Publicación Internacional Núm. WO 2005/045027 Documento Relacionado con Patentes 6: Publicación Internacional Núm. WO 2008/105462 Documentos No Relacionados con Patentes
Documento No Relacionado con Patentes 1: Daniel A. Haber et al., Cell. 29 de junio de 1990; 61(7): 1257-69 Documento No Relacionado con Patentes 2: Call KM et al., Cell. 9 de febrero de 1990; 60(3):509-20 Documento No Relacionado con Patentes 3: Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998; 181: 151-212. Revisión Documento No Relacionado con Patentes 4: Yamagami T et al., Blood. 1 de abril de 1996; 87(7):2878-84
Documento No Relacionado con Patentes 5: Inoue K et al., Blood. 15 de abril de 1998; 91(8):2969-76 Documento No Relacionado con Patentes 6: Tsuboi A et al., Leuk Res. Mayo de 1999; 23(5):499-505 Documento No Relacionado con Patentes 7: Oka Y et al., Immunogenetics. Febrero de 2000; 51(2):99-107 Documento No Relacionado con Patentes 8: Gao FG et al., Cancer Res. 15 de noviembre de 2002; 62(22):6438-41
Documento No Relacionado con Patentes 9: Zeng G, J Immunother. Mayo de 2001; 24(3):195-204
Descripción de la invención
Problemas a resolver por la invención
Por consiguiente, el objeto que se logrará mediante la presente invención es proporcionar un método para la activación de las células T auxiliares, un método para la activación de células T citotóxicas, mediante la aplicación de un péptido WT1 particular a un amplio rango de sujetos positivos en moléculas del MHC de clase II, un inductor de la activación de células T citotóxicas y una composición farmacéutica para tratar/prevenir un cáncer.
Medios para resolver los problemas
En estas circunstancias, los autores de la presente invención han estudiado exhaustivamente y han encontrado que un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His se une a una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HlA-Dr B1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA- DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201, y una molécula HLA-DPB1*0301 y activa las células T auxiliares y/o las células T citotóxicas. De ese modo se ha completado la presente invención.
La presente invención proporciona:
(1) Un método in vitro para la activación de células T auxiliares, que comprende la etapa de añadir un péptido WT1 a las células presentadoras de antígeno y activar así las células T auxiliares, en donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula del MHC de clase II seleccionada entre una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA -DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301, en donde el péptido WT1 es
un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2) y en el que las células presentadoras de antígeno proceden de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0803, un sujeto positivo para HLA-DRB3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPb 1*0201 y un sujeto positivo para HLA-Dp B1*0301;
(2) El método según (1), en el que el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse al menos a dos moléculas MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301;
(3) El método según (1) o (2), en el que el péptido WT1 tiene además la capacidad de unirse a una molécula h La -DRB1*0405, una molécula HLA-Dr B1*1501, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501 y/o una molécula HLA-DPB1*0901;
(4) El método según cualquiera de (1) a (3), en el que la adición de un péptido WT1 a las células presentadoras de antígeno se lleva a cabo mediante la adición de un péptido WT1, un polinucleótido que codifica el péptido WT 1, un vector de expresión que contiene el polipéptido o células que contienen el vector de expresión;
(5) El uso de una composición que contiene un péptido WT1 para la activación de células T auxiliares in vitro mediante la adición del péptido WT1 a las células presentadoras de antígenos, en el que el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula del MHC de clase II seleccionada entre una molécula HLA-d Rb 1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803 , una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301, en la que el péptido WT1 es un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2), y en el que las células presentadoras de antígeno proceden de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-Dr B1*0803, un sujeto positivo para HLA-Dr B3*0202, un sujeto positivo para HLA-d Rb4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPB1*0201 y un sujeto positivo para HLA-DPB1*0301;
(6) El uso de acuerdo con (5), en el que el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse al menos a dos moléculas m Hc de clase II de una molécula HLA-d Rb 1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301;
(7) El uso de acuerdo con (5) o (6), en el que el péptido WT1 tiene además la capacidad para unirse a una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501 y/o una molécula HLA-DPB1*0901;
(8) El uso según cualquiera de (5) a (7), en el que la adición de un péptido WT1 a las células presentadoras de antígeno se lleva a cabo mediante la adición de un péptido WT1, un polinucleótido que codifica el péptido WT1, un vector de expresión que contiene el polinucleótido o células que contienen el vector de expresión;
(9) El uso de células presentadoras de antígeno para presentar un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido WT1 con una molécula de MHC de clase II in vitro, en donde la molécula de MHC de clase II es cualquier molécula de MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA -DPB1*0301, donde el péptido WT1 es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2), y donde las células presentadoras de antígeno son de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*406, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0803, un sujeto positivo para HLA-DRB3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPB1*0201 y un sujeto positivo para HLA-DPB1*0301;
(10) El uso de células T auxiliares para activar células T citotóxicas in vitro, en el que las células T auxiliares reconocen un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido WT1 con una molécula de MHC de clase II, donde la molécula de m Hc de clase II es cualquier molécula de MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301, en la que el péptido WT1 es un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2), y donde las células T auxiliares son de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0803, un sujeto positivo para HLA-DRB3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPb 1*0201 y un sujeto positivo para HLA-Dp B1*0301;
(11) Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo con respecto a una molécula del MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-Dr B1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DPB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301, comprendiendo dicha composición, como principio activo, cualquiera de las composiciones definidas por cualquiera de (5) a (8), las células presentadoras de antígenos que presentan un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido WT1 con una molécula de MHC de clase II definida en (11), las células T auxiliares definidas en (10), o las células T citotóxicas activadas por las células T auxiliares definidas en (10);
(12) Una composición farmacéutica para su uso en la activación de células T citotóxicas, que comprende, como ingrediente activo, cualquiera de un péptido WT1, un polinucleótido que codifica el péptido WT1, un vector de expresión que contiene el polinucleótido o células que contienen el vector de expresión, y que se administra a un sujeto que tiene cualquier molécula de MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201, una molécula HLA-DPB1*0301, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202 y una molécula HLA-DRB4*0101 en la que el péptido WT1 es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2), donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula de MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301 , y donde las células T citotóxicas son de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-d Rb 1*0803, un sujeto positivo para HLA-DRB3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPB1*0201 y un sujeto positivo para HLA-DPB1*0301;
(13) Un método para determinar la presencia o cantidad de linfocitos T auxiliares específicos de WT1 en un sujeto positivo con respecto a cualquier molécula de MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, HLA-DRB1*0406, HLA-DRB1*0803, HLA-DRB3*0202, HLA-DRB4*0101, HLA-DPB1*0201 molécula y una molécula HLA-DPB1*0301, el método incluye las etapas de:
(a) estimular una muestra obtenida del sujeto usando un péptido WT1, y
(b) determinar la presencia o cantidad de citocinas o células T auxiliares, donde el aumento de la presencia o cantidad de citoquinas o células T auxiliares muestra la presencia o cantidad de células T auxiliares específicas de WT1, donde el péptido WT1 es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SeQ ID NO: 2), y donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula MHC de clase II de una molécula h LA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301.
Efectos de la invención
Según la presente invención, un método para activar células T auxiliares, una composición para las mismas, un método para activar células T citotóxicas, una composición para las mismas, una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir un cáncer mediante la activación de células T auxiliares y células T citotóxicas, se obtienen aplicando un péptido WT1 a una amplia gama de sujetos que tienen cualquier molécula MHC clase II de una
molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, lo que permite la activación de linfocitos T auxiliares y linfocitos T citotóxicos in vitro, y su uso en el tratamiento y prevención de un cáncer en sujetos que tienen una molécula de MHC de clase II.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra los resultados obtenidos midiendo la cantidad de IFN-y después de cocultivar células T inducidas a partir de PBMC derivadas del donante 1 (positivo en HlA-DRB1*0406/1201, DRB3*0101 y DRB4*0103) con PBMC derivadas de varios donantes estimulados con WT1-332. En el dibujo, las ordenadas indican la cantidad de IFN-y (pg/ml) en un líquido sobrenadante después del cocultivo. En el dibujo, la abscisa denota los tipos de moléculas HLA-DRB1, 3 y 4 que son positivas en los distintos donantes.
La Fig. 2 muestra los resultados obtenidos midiendo la cantidad de IFN-y después de cocultivar células T inducidas a partir de PBMC derivadas del donante 2 (positivas para HlA-Dr B1*0901/1101, DRB3*0202 y DRB4*0103) con PBMC derivadas de varios donantes estimulados con WT1-332. En el dibujo, las ordenadas indican la cantidad de IFN-y (pg/ml) en un líquido sobrenadante después del cocultivo. La abscisa denota los tipos de moléculas HLA-DRB1,3 y 4 que son positivas en los distintos donantes.
La Fig. 3 muestra los resultados obtenidos de medir la cantidad de IFN-y después de cocultivar células T inducidas a partir de PBMC derivadas del donante 3 (positivo para HLA-DRB1*0401/0405 y DRB4*0102/0103) con PBMC derivadas de varios donantes estimulados con WT1-332. En el dibujo, las ordenadas indican la cantidad de IFN-y (pg/ml) en un líquido sobrenadante después del cocultivo. La abscisa denota los tipos de moléculas HLA-DRB1 y 4 que son positivas en los diversos donantes positivos.
La Fig. 4 muestra los resultados obtenidos midiendo la cantidad de IFN-y después de cocultivar células T inducidas a partir de PBMC derivadas del donante 4 (positivo para HlA-Dr B1*0901/1101, DRB3*0202 y DRB4*0103) con PBMC derivadas de varios donantes estimulados con WT1-332. En el dibujo, las ordenadas indican la cantidad de IFN-y (pg/ml) en un líquido sobrenadante después del cocultivo. La abscisa denota los tipos de moléculas HLA-DRB1,3 y 4 que son positivas en los distintos donantes positivos.
La Fig. 5 muestra que las proteínas monoméricas HLA de clase II (DRB1*0101, DRB1*0405, DRB1*1501, DRB1*1502, DRB1*0803, d Rb 1*0901 y DRB4*0101) se asociaron específicamente con varios péptidos. En el dibujo, la ordenada denota el grado de desplazamiento del tiempo de retención (minuto). La abscisa indica los tipos de proteínas monoméricas HLA de clase II. Además, los gráficos de barras muestran los tipos de péptidos añadidos [desde la izquierda, control negativo (□), control positivo (■) y WT1-332 (sombreado □)].
La Fig. 6 muestra que la proporción de Th1 específico de WT1-332 (la proporción de células positivas para CD4/células positivas para IFN-y intracelulares) aumenta de manera significativa y dependiente del tiempo cuando las células T inducidas a partir de PBMC derivadas de donantes de sangre sanos (en un total de 42 donantes que tenían al menos uno de HLA-DRB1*1501, 1502, 0405, HLA-DPB1*0501 y 0901) fueron estimulados con WT1-332. En el dibujo, las ordenadas indican la proporción (%) del número de células positivas para CD4/el número de células positivas para IFN-y intracelulares en células vivas, y las abscisas indican los días de cultivo (días). Además, el símbolo "•" indica la proporción en muestras inducida por la adición de WT1-332 (grupo de inducción WT1-332), y el símbolo "O" denota la proporción en muestras inducida por la adición de un disolvente (control) (inducción de disolvente grupo).
La Fig. 7 muestra que el número de células CTL específicas de WT1-332 (la proporción de células positivas para CD8/células positivas para IFN-y) aumenta de forma significativa y dependiente del tiempo cuando las células T inducidas a partir de PBMC derivadas de donantes de sangre sanos (en un total de 42 donantes que tenían al menos uno de HLA-DRB1*1501, 1502, 0405, HLA-DPB1*0501 y 0901) fueron estimulados con WT1-332. En el dibujo, las ordenadas indican la proporción (%) del número de células positivas para CD8/el número de células positivas para IFN-y intracelulares en células vivas, y las abscisas indican los días de cultivo (días). Además, el símbolo "•" indica la proporción en muestras inducida por la adición de WT1-332 (grupo de inducción WT1-332), y el símbolo "O" denota la proporción en muestras inducida por la adición de un disolvente (control) (inducción de disolvente grupo).
La Fig. 8 muestra la restricción de HLA-DR de 17 muestras (donantes 21 a 37) en las que se indujo Th1 específico de WT1-332 en la Fig. 6 y la Fig. 7. En cada muestra, la producción de IFN-y específico de WT1-332 se reconoció cuando las células T en el día 14 después de la inducción mediante la adición de WT1-332 se estimuló con WT1-332, y la producción de IFN-y se inhibió cuando las células se cultivaron con la adición de un anticuerpo anti-HLA-DR. Esto muestra que las células T inducidas por WT1-332 están restringidas por HLA-DR. En el dibujo, la ordenada indica el número de donantes (donantes 21 a 37) y la abscisa indica la cantidad de IFN-y producida (pg/ml). Además, el símbolo "■" indica la cantidad de IFN-y producido después de la estimulación con WT1-332, el símbolo "sombreado □" denota la cantidad de IFN-y producido después de la estimulación del anticuerpo anti-HLA-DR WT1-332 , y el símbolo "□" indica la cantidad de IFN-y producida después de la estimulación con disolvente (control).
La Fig. 9 muestra que la proporción del número de células Th1 específicas de WT1-332 (células positivas para CD4/células positivas para IFN-y intracelulares) aumenta cuando las células T el día 14 después de la inducción por adición de WT1-332 se estimulan con WT1-332 en cada una de las 17 muestras (donantes 21 a 37) que tienen Th1 específico de WT1-332 restringido por HLA-DR inducido en la Fig. 6 y la Fig. 7. En el dibujo, la
ordenada indica el número de donantes (donantes 21 a 37), y la abscisa indica la proporción (%) del número de células positivas para CD4/número de células positivas para IFN-y intracelulares en células vivas. Además, el símbolo "■" indica la proporción después de la estimulación con WT1-332, y el símbolo "□" denota la proporción después de la estimulación con disolvente (control).
La Fig. 10 muestra que la proporción del número de células CTL específicas de WT1-332 (células positivas para CD8/células positivas para IFN-y intracelulares) aumenta cuando las células T el día 14 después de la inducción por adición de WT1-332 se estimulan con WT1-332 en cada una de las 17 muestras (donantes 21 a 37) que tienen Th1 específico de WT1-332 restringido por HLA-DR inducido en las figuras 6 y 7. En el dibujo, la ordenada indica el número de donantes (donantes 21 a 37 ), y la abscisa indica la proporción (%) del número de células positivas para CD8/número de células positivas para IFN-y intracelulares en células vivas. Además, el símbolo "■" indica la proporción después de la estimulación con WT1-332, y el símbolo "O" denota la proporción después de la estimulación con disolvente (control).
La Fig. 11 muestra la restricción de HLA-DP de 9 muestras (donantes 38 a 46) en las que se indujo Th1 específico de WT1-332 en la Fig. 6 y la Fig. 7. En cada muestra, la producción de IFN-y específico de WT1-332 se reconoció cuando las células T el día 14 después de la inducción mediante la adición de WT1-332 se estimularon con WT1-332, y la producción de IFN-y no se inhibió cuando las células se cultivaron con la adición de un anticuerpo anti-HLA-DR, y también cuando las células se cultivaron con la adición de un anticuerpo anti-HLA-DQ. Esto muestra que las células T inducidas por WT1-332 están restringidas por HLA-DP. En el dibujo, la ordenada indica el número de donantes (donantes 38 a 46) y la abscisa indica la cantidad de IFN-y producida (pg/ml). Además, el símbolo "■" indica la cantidad de IFN-y producido después de la estimulación con WT1-332, el símbolo "sombreado □" indica la cantidad de IFN-y producido después de la estimulación del anticuerpo anti-HLA-DR WT1-332 , el símbolo "sombreado □"" indica la cantidad de IFN-y producida después de la estimulación del anticuerpo anti-HLA-DQ WT1-332 , y el símbolo "□" denota la cantidad de IFN-y producida después de la estimulación con disolvente (control).
La Fig. 12 muestra que la proporción del número de células Th1 específicas de WT1-332 (células positivas para CD4/células positivas para IFN-y intracelulares) aumenta cuando las células T el día 14 después de la inducción por adición de WT1-332 se estimulan con WT1-332 en cada una de las 9 muestras (donantes 38 a 46) que tienen Th1 específico de WT1-332 restrictivo de HLA-DP inducido en la Fig. 6 y la Fig. 7. En el dibujo, la ordenada indica el número de donantes (donantes 38 a 46), y la abscisa indica la proporción (%) del número de células positivas para CD4/número de células positivas para IFN-y intracelulares en células vivas. Además, el símbolo "■" indica la proporción después de la estimulación WT1-332, y el símbolo "□" denota la proporción después de la estimulación con disolvente (control).
La Fig. 13 muestra que la proporción del número de células CTL específicas de WT1-332 (células positivas para CD8/células positivas para IFN-y intracelulares) aumenta cuando las células T en el día 14 después de la inducción por adición de WT1-332 se estimulan con WT1 -332 en cada una de las 9 muestras (donantes 38 a 46) que tienen Th1 específico de WT1-332 restringido por HLA-DP inducido en la Fig. 6 y la Fig. 7. En el dibujo, la ordenada indica el número de donantes (donantes 38 a 46), y la abscisa indica la proporción (%) del número de células positivas para CD8 / número de células positivas para IFN-y intracelulares en células vivas. Además, el símbolo "■" indica la proporción después de la estimulación WT1-332, y el símbolo "□" denota la proporción después de la estimulación con disolvente (control).
Modos para llevar a cabo la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para activar células T auxiliares in vitro, que incluye la etapa de activar células T auxiliares mediante la adición de un péptido WT1 a las células presentadoras de antígenos, en donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a una molécula del MHC de clase II. En la presente invención, la etapa de activación de las células T citotóxicas se lleva a cabo pasando por la etapa de activación de las células T auxiliares. Asimismo, el péptido WT1 utilizado en la presente invención es uno que tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula del MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA -DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1 * 1502, una molécula HLA-DPB1 * 0501, una molécula HLA-DPB1 * 0901, una molécula HLA-DPB1 * 0201 o una molécula HLA-DPB1 * 0301. Por otra parte, el péptido WT1 utilizado en la presente invención puede ser uno que tenga la capacidad de unirse a al menos dos o más moléculas del MHC de clase II de las moléculas del MHC de clase II anteriores. Asimismo, el péptido WT1 utilizado en la presente invención puede tener la capacidad de unirse a cualquier molécula del MHC de clase II, por ejemplo, de las moléculas HLA-DR, HLA-DQ y HLA-Dp .
En la presente invención, el péptido WT1 es un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SeQ ID NO: 2).
Además, el péptido WT1 utilizado en la presente invención puede ser una variante del péptido anterior. Las variantes pueden contener, por ejemplo, un péptido seleccionado del grupo que consiste en péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos en la que varios aminoácidos, por ejemplo, 1 a 9, preferentemente 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, más preferentemente 1 a 2 aminoácidos, además, preferentemente un aminoácido de la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 es sustituido, eliminado o añadido. La sustitución de aminoácidos en péptidos se puede llevar a cabo en cualquier posición y con cualquier tipo de aminoácido, y se prefiere la sustitución
conservativa de aminoácidos. Los ejemplos de sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen la sustitución de un residuo Glu por un residuo Asp, un residuo Phe por un residuo Tyr, un residuo Leu por un residuo Ile, un residuo Ala por un residuo Ser y un residuo His por un residuo Arg etcétera. Preferiblemente, la adición o eliminación de aminoácidos se puede llevar a cabo en el extremo N y el extremo C de los péptidos, pero se puede llevar a cabo en una secuencia interior. Los ejemplos específicos preferidos de los péptidos de acuerdo con la presente invención son aquellos que tienen SEQ ID NO: 2. A este respecto, cualquiera de los péptidos anteriores debe tener la capacidad de unirse a una molécula del MHC de clase II seleccionada entre una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA -DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, y debe activar las células T auxiliares o las células T citotóxicas (en la presente memoria también se hace referencia a ellas como CTL). En la presente memoria descriptiva, el péptido WT1 anterior también se denomina “WT1-332”. Asimismo, las moléculas del MHC humano generalmente se denominan moléculas HLA y, por lo tanto, MHC se utiliza como sinónimo de HLA en la presente memoria descriptiva.
Por otra parte, los péptidos usados en la presente invención pueden ser aquellos obtenidos modificando la secuencia de aminoácidos anterior. Los residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos anterior se pueden modificar mediante un método conocido. Tal modificación puede ser, por ejemplo, esterificación, alquilación, halogenación y fosforilación en un grupo funcional en una cadena lateral de un residuo de aminoácido. Asimismo, es posible unir varias sustancias al extremo N y/o al extremo C de un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos anterior. Por ejemplo, se pueden unir al péptido un aminoácido, un péptido, un análogo de los mismos, etc. Por ejemplo, se puede añadir una etiqueta de histidina, o se puede formar una proteína de fusión junto con una proteína tal como tiorredoxina. Alternativamente, se puede unir una marca detectable al péptido WT1. En caso de que estas sustancias se unan al péptido, se pueden tratar, por ejemplo, mediante una enzima in vivo o mediante un procedimiento tal como el procesamiento intracelular para generar finalmente un péptido que consista en la secuencia de aminoácidos anterior, que se presente sobre la superficie celular como un complejo con una molécula del MHC de clase II, pudiendo así obtener un efecto de inducción de células T auxiliares y/o células T citotóxicas. Estas sustancias pueden ser las que regulan la solubilidad del péptido de acuerdo con la presente invención, las que mejoran la estabilidad del péptido, tal como la resistencia a la proteasa, las que permiten el suministro específico del péptido de la presente invención, por ejemplo, a un tejido u órgano dados, o las que tienen una acción potenciadora de una eficacia de absorción de células presentadoras de antígenos u otra acción. Asimismo, estas sustancias pueden ser aquellas que aumentan la capacidad de inducir los CTL, por ejemplo, péptidos auxiliares distintos del péptido según la presente invención.
El péptido WT1 utilizado en la presente invención se puede sintetizar utilizando un método empleado habitualmente en la técnica o un método modificado del mismo. Tal método de síntesis se describe, por ejemplo, en Peptide Synthesis, Interscience, Nueva York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., Nueva York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; y Development of Medicines (continuación), Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Co., 1991. Asimismo, el péptido utilizado en la presente invención se puede preparar utilizando un mecanismo de ingeniería genética basado en la información de una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido. Tal mecanismo de ingeniería genética es bien conocido por los expertos en la técnica. Tal técnica se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos como los descritos en la bibliografía (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983).); DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)).
También se desvela una secuencia de polinucleótidos que codifica el péptido WT1 descrito anteriormente. La secuencia de polinucleótidos que codifica el péptido WT1 puede ser una secuencia de ADN o una secuencia de ARN. Tal secuencia de polinucleótidos se puede utilizar en lugar del péptido WT1. Tal secuencia de polinucleótidos se puede utilizar mediante la integración en un vector adecuado. El vector incluye plásmidos, vectores de fago y vectores de virus, por ejemplo, pUC118, pUC119, pBR322, pCR3, pYES2, pYEUra3, pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV, pRc/CMV, pAcSGHisNT-A, AZa PiI y Agt11. El vector puede contener, según sea necesario, factores tales como un promotor inducible por expresión, un gen que codifica una secuencia señal, un gen marcador para selección y un terminador. Los expertos en la técnica conocen un método para introducir estos genes en células u organismos y un método para expresarlos.
Las células presentadoras de antígenos utilizadas en la presente invención son aquellas que pueden presentar un péptido antigénico que contiene el péptido WT1 anterior junto con una molécula del MHC de clase II a las células T auxiliares, y pueden, por ejemplo, incluir células dendríticas y células mononucleares de sangre periférica. Por consiguiente, los sujetos de los cuales se obtienen las células presentadoras de antígenos utilizadas en la presente invención deben tener la misma molécula que una molécula del MHC de clase II a la que se puede unir el péptido WT1 añadido (por ejemplo, una o más cualesquiera de las moléculas del MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201, una molécula HLA-DPB1*0301).
En la presente invención, la adición del péptido WT1 a las células presentadoras de antígenos se puede realizar directamente mediante la adición del péptido WT1, o indirectamente mediante la adición de un polinucleótido que codifica el péptido WT1 o de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el péptido WT1 o mediante la adición de células que contienen el vector de expresión. La adición anterior se puede llevar a cabo mediante un método conocido en la técnica. El polinucleótido anterior que codifica el péptido WT1, el vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el péptido WT1 y las células que contienen el vector de expresión se pueden obtener mediante un mecanismo bien conocido por los expertos en la técnica. Específicamente, el polinucleótido utilizado en la presente invención se puede determinar basándose en una secuencia de aminoácidos del péptido WT1 anterior (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2). El polinucleótido anterior se puede preparar, por ejemplo, mediante una síntesis de a Dn o ARN y un método de PCR. Asimismo, los tipos de vectores de expresión que contienen el polinucleótido anterior, las secuencias contenidas además de la secuencia del polinucleótido anterior se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo de los propósitos y tipos de anfitriones en los que se introducen los vectores de expresión. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, vectores de fago y vectores de virus. Las células que contienen un vector de expresión se pueden preparar, por ejemplo, transformando células anfitrionas. Las células anfitrionas incluyen células de Escherichia coli, células de levadura, células de insectos y células animales. Un método para transformar células anfitrionas puede ser un método convencional, y es posible utilizar, por ejemplo, un método de fosfato de calcio, un método de DEAE-dextrano, un método de electroporación y un lípido para la transferencia de genes.
En general, las células T auxiliares se activan cuando un complejo TCR-CD3 sobre una superficie de una célula T reconoce un péptido antigénico a través de una molécula del MHC de clase II sobre una superficie de células presentadoras de antígeno, y la integrina sobre una superficie de células T es estimulada por un ligando de integrina sobre la superficie de células presentadoras de antígenos. La activación de células T auxiliares en la presente memoria descriptiva incluye no solo la activación de células T auxiliares sino también la inducción y proliferación de células T auxiliares. Asimismo, las células T auxiliares activadas de la presente invención pueden ser células T indiferenciadas (por ejemplo, células T no sometidas a tratamiento previo). Las células T auxiliares activadas tienen una función que activa el sistema inmunitario al promover la inducción, proliferación y activación de células B y células T citotóxicas. Por consiguiente, el método de la presente invención se puede utilizar como una terapia adyuvante para tratar un cáncer. Asimismo, las células T auxiliares activadas in vitro utilizando el método de la presente invención se pueden utilizar para tratar o prevenir un cáncer, o como un agente adyuvante para lo mismo. La activación de las células T auxiliares se puede evaluar, por ejemplo, midiendo la producción o la secreción de citocinas tales como los interferones (por ejemplo, interferón-Y) y las interleucinas.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición para activar células T auxiliares in vitro mediante la adición de un péptido WT1 a las células presentadoras de antígenos. En la presente invención, la activación de las células T citotóxicas se puede llevar a cabo pasando a través de la activación de las células T auxiliares. Aunque se pueden ilustrar en la composición de la presente invención un péptido WT1, un polinucleótido que codifica el péptido WT1, un vector que contiene el polinucleótido y las células que contienen el vector, se puede utilizar cualquier molécula siempre que sea un factor capaz de presentar un péptido WT1 como un péptido antigénico sobre una superficie de células presentadoras de antígenos. Estos factores se pueden obtener mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica como se describe anteriormente.
El péptido WT1 utilizado en la presente invención tiene la capacidad de unirse a cualquiera de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HlA-DRB1*0406, una molécula HlA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, como se describió anteriormente. Además, el péptido WT1 utilizado en la presente invención puede tener la capacidad de unirse a al menos dos o más moléculas del MHC de clase II de las moléculas del MHC de clase II anteriores. Además, el péptido WT1 utilizado en la presente invención puede tener la capacidad de unirse a cualquier molécula del MHC de clase II de moléculas HLA-DR, HLA-DQ o HLA-Dp .
Cuando la composición de la presente invención se administra a un sujeto que tiene una o más moléculas del MHC de clase II de una molécula HlA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA -DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, se activa el sistema inmunitario mediante la activación de células T auxiliares y/o células T citotóxicas en el sujeto. Asimismo, el gen WT1 es altamente expresado en varios cánceres y tumores, por ejemplo, en neoplasias malignas hematológicas como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno, así como en cánceres sólidos tales como cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino y cáncer de ovario, y por lo tanto, la composición de la presente invención se puede utilizar como un agente coadyuvante para el tratamiento o la prevención de un cáncer. Alternativamente, las células T auxiliares y las células T citotóxicas, que se activan utilizando la composición de la presente invención, se pueden utilizar, por ejemplo, como un agente coadyuvante para el tratamiento de los cánceres anteriores.
Además del péptido WT1 anterior, el polinucleótido que codifica el péptido WT1, el vector que contiene el polinucleótido y las células que contienen el vector, la composición de la presente invención puede contener, por ejemplo, un portador, un excipiente, un aditivo y similares. El péptido WT1 anterior y similares contenidos en la composición de la presente invención puede activar las células T auxiliares y/o las células T citotóxicas de una manera específica del péptido WT1, y por lo tanto, la composición puede contener un péptido WT1 restrictivo del MHC de clase I conocido, o se puede aplicar junto con tal péptido.
El método para aplicar la composición de la presente invención se puede seleccionar adecuadamente dependiendo de condiciones tales como el grado deseado de activación de células T auxiliares y/o células T citotóxicas, y el estado de las células presentadoras de antígenos. El método de aplicación incluye, por ejemplo, la administración a un sujeto mediante administración intradérmica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración intravenosa, administración transnasal y administración oral, o adición a un fluido de cultivo de células presentadoras de antígenos. La cantidad del péptido WT1 anterior contenido en la composición, la forma de la composición y la frecuencia de aplicación de la composición de la presente invención se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo de condiciones tales como el grado deseado de activación de células T auxiliares y/o células T citotóxicas, y el estado de las células presentadoras de antígenos.
La presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer en un sujeto, que incluye la etapa de activar las células T auxiliares o las células T citotóxicas mediante la adición de un péptido WT1 a las células presentadoras de antígenos, en donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a una molécula del MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301.. La composición de la presente invención activa el sistema inmunitario en un sujeto activando las células T auxiliares y/o las células T citotóxicas, tratando o previniendo de ese modo un cáncer en un sujeto. En el método de la presente invención, la etapa de activación de las células T citotóxicas se puede llevar a cabo pasando por la etapa de activación de las células T auxiliares. La adición del péptido WT1 a las células presentadoras de antígenos se puede realizar directamente mediante la adición del péptido WT1, o indirectamente mediante la adición de un polinucleótido que codifica el péptido WT1 o de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el péptido WT1 o mediante la adición de células que contienen el vector de expresión. El polinucleótido anterior que codifica el péptido WT1, el vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el péptido WT1 y las células que contienen el vector de expresión se pueden obtener mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica, como se describió anteriormente. Los sujetos a los que se puede aplicar la composición de la presente invención son aquellos positivos con respecto a cualquier molécula del MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HlA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA -DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301. Los cánceres a los que se puede aplicar la presente invención pueden ser cánceres e incluyen, por ejemplo, tumores de órganos hematopoyéticos tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno, así como cánceres sólidos tales como cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino y cáncer de ovario. Asimismo, la composición de la invención se puede utilizar junto con una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer comprendiendo un péptido WT1 restrictivo de moléculas del MHC de clase I.
También se describe el uso de un péptido WT1 para preparar la composición anterior, de un polinucleótido que codifica el péptido WT1, de un vector que contiene el polinucleótido y de células que contienen el vector.
También se desvela un kit que contiene el péptido WT1 anterior, un polinucleótido que codifica el péptido WT1, un vector que contiene el polinucleótido o células que contienen el vector, para activar células T auxiliares y/o células T citotóxicas añadiendo el péptido WT1 a células presentadoras de antígenos, en donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula del MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-d Rb 1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA -DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301. Preferiblemente, el kit se utiliza en el método anterior para activar células T auxiliares o células T citotóxicas. El kit puede contener, por ejemplo, un medio de obtención de células presentadoras de antígenos, un medio de evaluación de actividad de células T auxiliares y/o células T citotóxicas y similares, además del péptido WT1. En general, el kit se acompaña con un manual de instrucciones. Es posible activar eficazmente las células T auxiliares o las células T citotóxicas utilizando el kit de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de células presentadoras de antígenos para presentar un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido WT1 con una molécula del MHC de clase II. En este caso, la molécula del MHC de clase II puede ser cualquier molécula entre una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA
DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA -DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, o puede ser al menos dos o más moléculas de las moléculas de MHC de clase II anteriores. Las células presentadoras de antígenos se pueden preparar utilizando un mecanismo conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar aislando células que tienen una capacidad de presentación de antígeno de un paciente con cáncer, y a continuación pulsando las células aisladas con el péptido WT1 anterior (por ejemplo, el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2) o con un polinucleótido que codifica el péptido WT1, o introduciendo un vector de expresión que contiene el polinucleótido en las células, permitiendo así que un complejo de un péptido antigénico que contiene el péptido WT1 con una molécula del MHC de clase II se presente sobre la superficie celular (Cancer Immunol. Immunother. 46:82, 1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res., 59: p1184, 1999, Cancer Res., 56: p5672, 1996, J. Immunol., 161: p5607, 1998, J. Exp. Med., 184: p465, 1996). En la presente memoria descriptiva, las células que tienen capacidad de presentación de antígenos no están limitadas en la medida en que expresan una molécula del MHC de clase II capaz de presentar un péptido WT1 sobre la superficie celular, y se prefieren las células mononucleares de sangre periférica o las células dendríticas que tienen una alta capacidad de presentación de antígenos. Asimismo, la presencia de las células presentadoras de antígenos se confirma por un aumento de la actividad de las células T citotóxicas, que se confirma por un aumento de la cantidad de interferón-Y, como se muestra en los Ejemplos. Las células presentadoras de antígenos se utilizan eficazmente en una terapia celular (por ejemplo, terapia de células dendríticas) como ingrediente activo de una composición farmacéutica.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona el uso de células T auxiliares que reconocen un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido WT1 con una molécula del MHC de clase II para activar las células T citotóxicas in vitro. En este caso, la molécula del MHC de clase II puede ser cualquier molécula de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA -DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, o puede estar en al menos dos o más moléculas de las moléculas de MHC de clase II anteriores. Las células T auxiliares incluyen, por ejemplo, aquellas que reconocen un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 con cualquier molécula del MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA -DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301. Los expertos en la técnica pueden preparar y obtener fácilmente las células T auxiliares de la presente invención utilizando un mecanismo conocido en la técnica (Iwata, M. et al., Eur. J. Immunol, 26, 2081 (1996)).
También se desvelan células T citotóxicas que se activan mediante células T auxiliares que reconocen un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido WT1 con una molécula del MHC de clase II. Las células T citotóxicas incluyen, por ejemplo, aquellas activadas por células T auxiliares que reconocen un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID nO: 2 con cualquier molécula del MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente las células T citotóxicas utilizando una técnica conocida. Por ejemplo, se preparan aislando linfocitos de sangre periférica de un paciente y estimulándolos in vitro con un péptido (por ejemplo, un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2), un polinucleótido que codifica el péptido, o un vector de expresión que contiene el polinucleótido (Journal of Experimental Medicine 1999, 190:1669). Las células T citotóxicas así preparadas se pueden utilizar como ingrediente activo de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de un cáncer. En los ejemplos de la presente memoria descriptiva, se reconoció una actividad para inducir células T citotóxicas mediante la administración de WT-332 en una muestra derivada de un sujeto que tenía una determinada molécula de clase MHC. Esto muestra que las células presentadoras de antígeno que presentan un complejo de un péptido antigénico que consiste en un péptido WT1 con una molécula de MHC de clase II están presentes en células mononucleares de sangre periférica, y muestra la presencia de células presentadoras de antígeno que presentan el complejo de células T auxiliares que las reconoce específicamente, y las células T citotóxicas inducidas por las células T auxiliares.
También se desvela un tetrámero de HLA que tiene el péptido antigénico anterior que contiene un péptido WT1 y una molécula del MHC de clase II. La molécula del MHC de clase II puede ser cualquier molécula de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501 o una molécula HLA-DPB1*0901, o pueden ser al menos dos o más moléculas de las moléculas MHC de clase II anteriores. En la presente memoria descriptiva, el tetrámero de HLA representa un producto tetramerizado que se obtiene por biotinilación de un complejo (monómero de HLA) obtenido por asociación de una proteína HLA con un péptido, y después se une el producto biotinilado a avidina. Los tetrámeros de HLA que contienen varios péptidos antigénicos están disponibles comercialmente, y es posible
preparar el tetrámero de HLA de la presente invención fácilmente (Science 279: 2103-2106 (1998), Science 274: 94 96 (1996)). El tetrámero se marca preferiblemente con fluorescencia para que las células T auxiliares y las células T citotóxicas de la presente invención unidas puedan ser seleccionadas o detectadas fácilmente mediante un método de detección conocido tal como citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. El tetrámero de HLA no se limita a un tetrámero, y también es posible utilizar un multímero tal como un pentámero y un dendrímero, según sea necesario. En la presente memoria descriptiva, el multímero representa un producto multimerizado que se obtiene uniendo dos o más complejos (monómeros de HLA) obtenidos por asociación de una proteína de HLA con un péptido utilizando una técnica conocida.
También se desvela una composición farmacéutica para activar células T auxiliares o células T citotóxicas, que contiene, como ingrediente activo, cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, células presentadoras de antígenos, células T auxiliares, células T citotóxicas o tetrámero. La composición farmacéutica puede contener, como ingrediente activo, una o más cualesquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, células presentadoras de antígenos, células T auxiliares, células T citotóxicas o tetrámero. La composición farmacéutica de la presente invención se puede utilizar para el tratamiento o la prevención de un cáncer. La composición farmacéutica se puede aplicar a varios cánceres y tumores que expresan WT1, por ejemplo, a tumores de órganos hematopoyéticos tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno, así como a cánceres sólidos tales como cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino y cáncer de ovario. Además, la composición farmacéutica se puede usar para administrar a un sujeto que tiene una molécula del MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301. La composición farmacéutica se puede utilizar junto con otros métodos para el tratamiento o la prevención de un cáncer o una composición farmacéutica para lo mismo. Además, la composición farmacéutica puede contener un agente activador, un agente de proliferación y un agente inductor de células T auxiliares o células T citotóxicas, o puede contener un péptido WT1 restrictivo del MHC de clase I conocido.
Además de un ingrediente activo, la composición farmacéutica puede contener, por ejemplo, un portador, un excipiente y similares. El método de administración de la composición farmacéutica de la presente invención se puede seleccionar adecuadamente dependiendo de condiciones tales como el tipo de enfermedad, el estado de los sujetos y el sitio diana. El método incluye, por ejemplo, administración intradérmica, administración subcutánea, administración intramuscular, administración intravenosa, administración transnasal y administración oral. La cantidad del ingrediente activo anterior contenido en la composición farmacéutica de la presente invención, la forma de dosificación de la composición y la frecuencia de administración de la composición se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo de condiciones tales como el tipo de enfermedad, el estado de los sujetos y el sitio diana.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona el uso de cualquiera de la composición mencionada anteriormente, células presentadoras de antígenos, células T auxiliares, células T citotóxicas o tetrámero para el tratamiento o la prevención de un cáncer que comprende administrarlo a un sujeto en una cantidad eficaz, en donde el sujeto tiene cualquier molécula del MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRb 1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301. Los cánceres que se pueden tratar o prevenir mediante el método de la presente invención son varios cánceres y tumores que expresan WT1, por ejemplo, tumores de órganos hematopoyéticos tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno, así como cánceres sólidos tales como cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino y cáncer de ovario. La composición, la célula presentadora de antígeno, etcétera., se puede utilizar junto con otro método para el tratamiento o la prevención de un cáncer, por ejemplo, un método para el tratamiento o la prevención de un cáncer utilizando un péptido WT1 restrictivo de la molécula del MHC de clase I conocido.
Además, se describe el uso de cualquier composición mencionada anteriormente, células presentadoras de antígenos, células T auxiliares, células T citotóxicas o tetrámero para preparar la composición farmacéutica anterior.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al péptido WT1 o al polinucleótido que codifica el péptido WT1 anterior (en adelante, el anticuerpo también se denomina anticuerpo anti-WT1). El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Específicamente, se puede mencionar un anticuerpo que se une específicamente a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2. Ya se conoce un método para preparar dicho anticuerpo, y el anticuerpo también se puede preparar de acuerdo con tal método convencional (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (ed.), 1987, John Wiley and Sons (pub.), Sección 11.12-11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H. D. et al. (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (pub.), Nueva York, 1989). Por
ejemplo, un animal no humano tal como un conejo doméstico se inmuniza utilizando un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 como inmunógeno, y se puede obtener un anticuerpo policlonal a partir de suero del animal mediante un método convencional. Por otro lado, en el caso de un anticuerpo monoclonal, un animal no humano tal como un ratón se inmuniza utilizando el péptido usado en la presente invención (un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2), y las células de bazo y células de mieloma resultantes se fusionan para preparar células de hibridoma, a partir de las cuales se puede obtener el anticuerpo monoclonal (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (ed.), 1987, John Wiley and Sons (pub.), Sección 11.4-11.11). Asimismo, la preparación del anticuerpo anti-WT1 se puede llevar a cabo reforzando una reacción inmunológica utilizando diversos coadyuvantes dependiendo del anfitrión. Tales coadyuvantes incluyen un gel mineral (por ejemplo, coadyuvante de Freund e hidróxido de aluminio), un tensioactivo y un coadyuvante humano. El anticuerpo anti-WT1 se puede utilizar para cromatografía de afinidad y diagnóstico inmunológico. El método para el diagnóstico inmunológico se puede seleccionar adecuadamente entre inmunotransferencia, radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), medición fluorescente o luminiscente.
También se desvela un método para determinarla presencia o cantidad de un péptido WT1 en un sujeto positivo con respecto a una molécula del MHC de clase II seleccionada de una molécula h LA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3 * 0202, una molécula HLA-DRB4*0101 o una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, incluyendo el método incluye las etapas de:
(a) hacer reaccionar una muestra obtenida del sujeto con el anticuerpo anti-WT1 anterior, y a continuación (b) determinar la presencia o cantidad del anticuerpo anti-WT1 anterior contenido en la muestra.
Se puede utilizar una muestra obtenida de un sujeto que tiene una molécula del MHC clase II seleccionada entre una molécula de HLA-DRB1*0403, HLA-DRB1*0406, HLA-DRB1*0803, HLA-DRB3*0202, HLA-DRB4*0101 o HLA-DRB1*1501, una molécula de HLA-DRB1*0405, una molécula HLA -DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301 como muestra en la etapa (a) anterior. Las muestras utilizadas en la etapa (a) anterior incluyen, por ejemplo, fluido corporal y tejidos tales como sangre y linfocitos. Los expertos en la técnica pueden obtener muestras adecuadamente, hacerlas reaccionar con un anticuerpo y llevar a cabo otros procedimientos utilizando un mecanismo conocido. La etapa (b) en la presente invención incluye, por ejemplo, la determinación de la localización, el sitio y la cantidad del anticuerpo anti-WT1 anterior y, por lo tanto, se puede utilizar para el diagnóstico y el pronóstico de un cáncer. El anticuerpo anti-WT1 anterior puede estar marcado. Como marca, se pueden utilizar marcas conocidas tales como una marca fluorescente y una marca radiactiva.
Mediante el marcaje, se hace posible llevar a cabo la determinación de la presencia o cantidad de un péptido WT1 de manera simple y rápida.
También se desvela un kit para determinar la presencia o cantidad de un péptido WT1, que contiene el anticuerpo anti-WT1 anterior como constituyente esencial. El kit del puede contener, por ejemplo, medios para obtener el anticuerpo anti-WT1 y medios para evaluar el anticuerpo anti-WT1, además del anticuerpo anti-WT1 anterior. En general, el kit se acompaña de un manual de instrucciones. Al utilizar el kit, se hace posible determinar la presencia o cantidad de un péptido WT1 simple y rápidamente en el método anterior para determinar la presencia o cantidad de un péptido WT1.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o cantidad de células T auxiliares específicas de WT1 en un sujeto positivo con respecto a una molécula del MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, HLA-DRB1*0406, HLA-DRB1*0803, HLA-DRB3*0202, HLA-DRB4*0101 o HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-DPB1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, incluyendo el método las etapas de:
(a) estimular una muestra obtenida del sujeto utilizando un péptido WT1, y
(b) determinar la presencia o cantidad de citocinas o células T auxiliares, y en donde el aumento de la presencia o cantidad de citocinas o células T auxiliares muestra la presencia o cantidad de las células T auxiliares específicas de WT1.
Las muestras de la presente invención pueden ser cualquier muestra en la medida en que contengan células presentadoras de antígenos, e incluyen, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica, linfocitos invasivos, células tumorales, células de fluido ascítico, células de derrame pleural, células de líquido cefalorraquídeo, células de médula ósea y células de ganglios linfáticos. La muestra utilizada en la presente invención se puede obtener de donantes sanos o de pacientes con cáncer. Al utilizar esas células obtenidas de donantes sanos, por ejemplo, es posible diagnosticar si los donantes están afectados por un cáncer, o si los donantes tienen una predisposición a un cáncer u otras afecciones. Al utilizar esas células obtenidas de pacientes con cáncer, por ejemplo, es posible predecir si una inmunoterapia con WT1 tiene efecto en los pacientes con cáncer
u otras afecciones. En el método de la presente invención, las muestras obtenidas se pueden cultivar antes y después de la estimulación con un péptido WT1, y los expertos en la técnica pueden determinar adecuadamente las condiciones de cultivo. La estimulación de estas células con un péptido WT1 se puede llevar a cabo utilizando un mecanismo conocido, tal como la electroporación, y se puede llevar a cabo in vitro o in vivo. Mediante un método conocido se puede determinar la producción de una citocina, la presencia de una reacción de células T auxiliares o células T citotóxicas, la cantidad de una citocina producida o la cantidad de células T auxiliares o células T citotóxicas que han reaccionado.
Además, se desvela un kit para determinar la presencia o cantidad de un péptido WT1, que contiene el péptido WT1 anterior como componente esencial. El kit de la presente invención puede contener, por ejemplo, un medio de obtención de muestras, un medio de evaluación tal como citocinas, además del péptido WT1 anterior. En general, se adjunta al kit un manual de instrucciones. Al utilizar el kit, se hace posible determinar la presencia o cantidad de un péptido WT1 simple y rápidamente en el método anterior para determinar la presencia o cantidad de un péptido WT1.
La presente invención se describirá en detalle y de manera específica a modo de ejemplos. Los ejemplos no cubiertos por el alcance de las reivindicaciones son con fines ilustrativos.
Ejemplo 1
1. Inducción de células T auxiliares de tipo I específicas de WT1-332
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separaron de la sangre periférica de donantes de sangre sanos (donante 1:positivo para HLA-Dr B1*0406/1201, DRb3*0101 y DRB4*0103, donante 2: positivo para HLA-DRB1*0901/1101, DRB3*0202 y DRB4*0103, donante 3: positivo para HLA-DRB1*0401/0405, y DRB4*0102/0103, donante 4: positivo para HLA- DRB1*0901/1101, DRB3*0202 y DRB4*0103). Las PBMC separadas (1,5 x 107 células) se suspendieron en un medio compuesto por el 45 % de RPMI-1640 (SIGMA), el 45 % de AIM-V (Invitrogen) y el 10 % de suero humano tipo AB (MP Biomedicals) y se sembraron en placa de 24 pocillos a 1,5 x 106 células/pocillo (día 0). A los pocillos sembrados con PBMC, se añadió WT1-332 (un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2) a una concentración de 10 mg/ ml e IL-7 (PeproTech) a una concentración de 10 ng/ml, y las células se cultivaron a 37°C con el 5 % de CO2 durante una semana. Además, una parte de las PBMC separadas se conservó por congelación para las células presentadoras de antígeno en caso de reestimulación.
Después de una semana (el 7° día), se llevó a cabo la reestimulación. Primero, las PBMC congeladas se descongelaron, se estimularon con 10 mg/ml de WT1-332, se trataron con 50 mg/ml de mitomicina C (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) y se sembraron en una nueva placa de 24 pocillos a 1,0 x 106 a 1,6 x 106 células/pocillo. A continuación, se recuperaron las células cultivadas durante una semana y se sembraron en pocillos sembrados con células presentadoras de antígeno a razón de 1,0 x 106 a 1,6 x 106 células/pocillo. Finalmente, se añadió IL-7 a cada pocillo a una concentración de 10 ng/ml y las células se cultivaron a 37°C con el 5 % de CO2. Después de 2 días (en el 9° día), se eliminó suavemente la mitad del fluido de cultivo de cada pocillo y, en su lugar, se añadió al pocillo un medio que contenía 40 U/ml de IL-2 (PeproTech) y se continuó con el cultivo. Posteriormente, se llevó a cabo el procedimiento de sustitución de la mitad de la cantidad del fluido de cultivo cada dos días utilizando un medio que contenía 20 U/ml de IL-2, y las células se recuperaron adecuadamente entre el día 14 y el día 21 y se utilizaron para experimentos.
2. Preparación de células presentadoras de antígeno utilizadas en el experimento para la determinación del alelo restrictivo
Las PBMC se separaron de la sangre periférica de donantes de sangre sanos (donante 5: positivo para HLA-DRB1*0406/1201, DRB3*0101 y DRB4*0103, donante 6: positivo para HLA-DRB1*0403/1405, DRB3*0202 y DRB4*0103, donante 7: positivo para HLA-DRB1*0403/1201, DRB3*0101 y DRB4*0103, donante 8: positivo para HLA-DRB1*0101/0901 y DRB4*0103, donante 9: positivo para HLA-DRB1*1401/1406 y DRB3*0202, donante 10: positivo para HLA-DRB1*0803/0901 y DRB4*0103, donante 11:positivo para HLA-DRB1*1101/1502 y DRB3*0202, donante 12: positivo para HLA-Dr B1*0405/1406, DRB3*0202 y DRB4*0103, donante 13: positivo para HLA-DRB1*0401/0405 y DRB4*0102/0103, donante 14: positivo para HLA-DRB1*0401/1502 y DRB4*0102, donante 15: positivo para HLA-DRB1*0101/0405 y DRB4*0103, donante 16: positivo para HLA-DRB1*0901/1501, y DRB4*0103, donante 17: positivo para HLA-DRB1*0405/1501 y DRB4*0103, donante 18: positivo para HLA-DRB1*1401/1502 y DRB3*0202, donante 19: positivo para HLA-DRB1*1403/1502 y DRB3*0101, donante 20: positivo para HLA-DRB1*0803/1302 y DRB3*0301), y se utilizan como células presentadoras de antígeno utilizadas en experimentos para la determinación de un alelo restrictivo. Las PBMC de cada donante se conservaron por congelación a -80 °C hasta su uso.
3. Medición de IFN-y (inhibición de la reacción en presencia de anticuerpo anti-HLA-DR)
Las células T inducidas a partir de PBMC de los donantes 1 a 4 se cultivaron durante 24 h en ausencia de WT1-332,
en presencia de 10 mg/ml de WT1-332 y en presencia de 10 mg/ml de WT1-332 y 10 mg/ml de anticuerpo anti-HLA-DR (BD Co.). Después del cultivo, la cantidad de IFN-y en el sobrenadante se cuantificó mediante ELISA (BD Co.). Como resultado, se demostró que todas las células T inducidas reconocen WT1-332 y producen IFN-y, y que la reacción está restringida por moléculas de HLA-DR.
4. Medición de IFN-y (determinación del alelo restrictivo)
Las células T inducidas a partir de PBMC de los donantes 1 a 4 se hicieron reaccionar con cada una de las células presentadoras de antígeno adecuadas estimuladas con WT1-332, y se determinó un alelo restrictivo de las células T inducidas.
(4-1. Células T derivadas del donante 1)
Las células T inducidas a partir de PBMC del donante 1 se cultivaron conjuntamente durante 24 h con células presentadoras de antígeno derivadas de los donantes 5, 6, 7, 8 y 9, que se estimularon con 10 mg/ml de WT1-332. Después del cocultivo, la cantidad de IFN-y en el sobrenadante se cuantificó mediante ELISA. Los resultados se muestran en la Fig. 1. Las células T derivadas del donante 1 produjeron IFN-y cuando se cultivaron conjuntamente con células presentadoras de antígeno positivas para HLA-DR4 (DRB1*0403, 0406), que revelaron que el alelo restrictivo era HLA-DRB1*0406. Además, se demostró que HLA-d Rb 1*0403 puede presentar WT1-332 y estimular las células T.
(4-2. Células T derivadas del donante 2)
Se cultivaron conjuntamente células T inducidas a partir de PBMC del donante 2 durante 24 h con células presentadoras de antígeno derivadas de los donantes 10, 11, 12 y 9, que se estimularon con 10 mg/ml de WT1-332. Después del cocultivo, la cantidad de IFN-y en el sobrenadante se cuantificó mediante ELISA. Los resultados se muestran en la Fig. 2. Las células T derivadas del donante 2 produjeron IFN-y cuando se cultivaron conjuntamente con células presentadoras de antígeno positivas para HLA-DRB3*0202, lo que reveló que el alelo restrictivo era HLA-DRB3 * 0202.
(4-3. Células T derivadas del donante 3)
Las células T inducidas a partir de PBMC del donante 3 se cultivaron conjuntamente durante 24 h con células presentadoras de antígeno derivadas de los donantes 13, 14, 15 y 10, que se pulsaron con 10 mg/ml de WT1-332. Después del cocultivo, la cantidad de IFN-y en el sobrenadante se cuantificó mediante ELISA. Los resultados se muestran en la Fig. 3. Las células T derivadas del donante 3 produjeron IFN-y cuando se cultivaron conjuntamente con células presentadoras de antígeno positivas para HLA-DR4 (DRB1*0401, 0405), lo que reveló que tanto HLA-DRB1*0401 como 0405 pueden presentar WT1-332 y estimular las células T.
(4-4. Células T derivadas del donante 4)
Las células T inducidas a partir de PBMC del donante 4 se cultivaron conjuntamente durante 24 h con células presentadoras de antígeno derivadas de los donantes 16, 11, 17, 18, 19 y 20, que se estimularon con 10 mg/ml de WT1-332. Después del cocultivo, la cantidad de IFN-y en el sobrenadante se cuantificó mediante ELISA. Los resultados se muestran en la Fig. 4. Las células T derivadas del donante 4 produjeron IFN-y cuando se cultivaron conjuntamente con células presentadoras de antígeno positivas para HLA-DRB1*1101, lo que reveló que el alelo restrictivo era HLA-DRB1*1101.
Ejemplo 2
A continuación, para evaluar la capacidad de unión de WT1-332 con moléculas de MHC de clase II, se realizó una prueba de plegado de 7 tipos de proteínas monoméricas de HLA de clase II (DRB1*1501,0101, 0405, 0803, 0901, 1502 o DRB4*0101) con WT1-332 usando HPLC. En resumen, se preparó una solución de reacción de plegado mezclando una proteína monomérica HLA de clase II, un péptido [un péptido que se une a cada proteína (control positivo), un péptido que no se une a cada proteína (control negativo) y WT1-332], y un tampón plegable. Después de hacer reaccionar la solución a 37 ° C, se analizó el tiempo de retención usando HPLC. El plegamiento con WT1-332 se evaluó utilizando un desplazamiento del tiempo de retención debido a la unión de una proteína monomérica HLA de clase II con un péptido. Los reactivos utilizados en esta prueba se muestran en la siguiente tabla. (Tabla 1: Reactivos utilizados en la prueba)
Tabla 1
continuación
Preparación de proteínas monoméricas HLA de clase II
Las proteínas monoméricas HLA de clase II que se habían conservado por congelación a -80°C se descongelaron en hielo. Las proteínas monoméricas HLA de clase II descongeladas se ajustaron usando un tampón de dilución de modo que estuvieran contenidas en una cantidad de 0,05 mg (1 x 10"9 mol) en 83 ml.
Preparación de soluciones de péptidos
Se pesó aproximadamente 1 mg de cada péptido mediante una balanza electrónica, se transfirió a un vial de vidrio y se disolvió en DMSO para dar una concentración de 20 mg/ml.
Cálculo de la cantidad de solución peptídica en una cantidad molar de 50 veces
Se calculó la cantidad de un péptido que es una cantidad molar de 50 veces con respecto a una proteína monomérica HLA de clase II usando la siguiente fórmula de cálculo.
Cantidad de péptido requerida: 1 x 10"9 mol x 50 = 5 x 10"8 mol (cantidad de péptido requerida) 5 x 10"8 x (Peso molecular del péptido) x 1,000 = (cantidad de péptido requerida) (mg)
(Cantidad de péptido necesaria) / [pureza del péptido / 100] = (cantidad de péptido añadido) (mg)
[(Cantidad de péptido agregado) / 20 mg / ml] * 1,000 = (cantidad de solución de péptido agregada) (pi) Cálculo de la cantidad de tampón plegable agregado
Como tampón de plegado, se añadió una cantidad al 10% de una solución mixta de una proteína monomérica HLA de clase II y un péptido. La cantidad de tampón de plegado añadido se calculó usando la siguiente ecuación de cálculo.
[83 pi (cantidad de proteína monomérica HLA clase II) (cantidad de solución de péptido en 50 veces una cantidad molar)] * 0,1 = cantidad de tampón de plegado añadido
Análisis de plegado mediante HPLC
A un vial de vidrio cargado con una proteína monomérica HLA de clase II, se le añadieron una solución de péptido y un tampón de plegado en una cantidad calculada, y la mezcla se dejó reposar a 37°C durante la noche. Se inició la HPLC (módulo de separación Waters 2695) y se equilibró una columna Seperdex 200 con un tampón de equilibrio. A todas las muestras, se añadieron 300 ml del tampón equilibrado y se mezclaron bien, y se utilizó una porción de 100 ml de la mezcla como volumen de inyección de muestra para calcular el tiempo de retención. El tiempo de análisis fue de 50 min. El criterio para el plegamiento de una proteína monomérica HLA de clase II con un péptido es un cambio del tiempo de retención de no menos de 0,1 min en comparación con un control (solo disolvente). Como resultado, se descubrió que el grado de desplazamiento del tiempo de retención aumentó en no menos de 0,1 min en 7 tipos de proteínas monoméricas HLA de clase II analizadas (DRB1*1501, 0101, 0405, 0803, 0901, 1502 o DRB4*0101) (Fig. 5), por lo que quedó claro que WT1-332 se une específicamente a estas proteínas y puede presentarse como un antígeno.
Ejemplo 3
Inducción de células T específicas de WT1-332
Se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre periférica de donantes de sangre sanos (en total 42 donantes que tenían al menos uno de HLA-DRB1*1501, 1502, 0405, HLA-DPB1*0501 y 0901). Las PBMC separadas se dividieron en porciones de 1,2 x 107 células, suspendidas en un medio compuesto del 45 % de RPMI-1640 (SIGMA), 45 % de AIM-V (Invitrogen) y 10 % de suero humano tipo AB (MP Biomedicals), y sembrado en una placa de 24 pocillos a 1,5 x 106 células/pocillo (en el día 0). A los pocillos sembrados con PBMC,
se añadió WT1-332 a una concentración de 20 mg/ml e IL-7 (PeproTech) a una concentración de 10 ng/ml, y las células se cultivaron a 37 °C con el 5 % de CO2 durante una semana. Un grupo en el que se añadió un disolvente (ácido acético 10 mM) en lugar de WT1-332 a una concentración final de 10 mM (grupo de inducción del disolvente) se estableció como grupo de control. Además, una parte de las PBMC separadas se conservó por congelación para las células presentadoras de antígeno cuando se reestimuló.
Después de una semana (el séptimo día), se llevó a cabo la reestimulación. Primero, las PBMC congeladas se descongelaron, se estimularon con 20 mg/ml de WT1-332 o disolvente de ácido acético 10 mM, se trataron con 50 mg/ml de mitomicina C (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) y se sembraron en una placa de 24 pocillos a 1,0 x 106 a 1,6 x 10° células/pocillo. A continuación, se recuperaron las células cultivadas durante una semana y se sembraron en pocillos sembrados con células presentadoras de antígeno a razón de 1,0 x 106 a 1,6 x 106 células/pocillo. Finalmente, se añadió IL-7 a cada pocillo a una concentración de 10 ng/ml, y las células se cultivaron a 37°C con el 5 % de CO2. Después de 2 días (en el noveno día), se eliminó suavemente la mitad del líquido de cultivo de cada pocillo y, en su lugar, se añadió al pocillo un medio que contenía 40 U/ml de IL-2 (PeproTech) y se continuó con el cultivo. A continuación, se llevó a cabo el procedimiento de sustitución de la mitad de la cantidad del fluido de cultivo cada dos días utilizando un medio que contenía 20 U/ml de IL-2.
Las células se recuperaron el día 0, el día 7 y el día 14, y se usaron en experimentos para la medición de IFN-y. Medición de IFN-y [Tinción de citoquinas intracelulares (ICS)1
La reestimulación del antígeno se llevó a cabo sembrando PBMC el día 0 después de la preparación y las células vivas se recuperaron el día 7 y el día 14 de un grupo de inducción con WT1-332 y un grupo de inducción con disolvente en una placa de fondo en U de 96 pocillos, y añadiendo un medio que contiene WT1-332 a una concentración final de 20 mg/ml. Además, se añadió un medio que contenía disolvente a una concentración final de 10 mM como control. Después de cultivar las células a 37°C con el 5 % de CO2 durante 4 h, se añadió Brefeldin A (BioLegend) y se continuó el cultivo. Después de 6 h desde el inicio del cultivo, las células se recuperaron y se tiñeron con un anticuerpo anti-CD4 humano marcado con PE y un anticuerpo anti-CD8 humano marcado con FITC. La tinción con IFN-y intracelular se llevó a cabo utilizando el kit de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm (Becton Dickinson) y un anticuerpo anti-IFN-y humano marcado con Per-CP/Cy5.5. Para el análisis se utilizó EPICS-XL MCL (Beckman Coulter). Los resultados son visibles en los gráficos. 6 y 7. A partir de la Fig. 6, se confirmó que, en el grupo de inducción de WT1-332, el Th1 específico de WT1-332 aumentó de forma notable y dependiente del tiempo entre el séptimo día y el decimocuarto día. El aumento fue significativo en relación con el grupo de inducción con disolvente (P <0,0001). A partir de la Fig.7, se confirmó que, en el grupo de inducción de WT1-332, el CTL específico de WT1-332 aumentó de manera dependiente del tiempo entre el día 7 y el día 14, y el aumento fue significativo en relación con el grupo de inducción con disolvente (P <0,0001).
Medición de IFN-y (inhibición de la reacción en presencia de anticuerpo anti-HLA-DR y anticuerpo anti-HLA-DQ) En el día 14, se cultivaron células T inducidas a partir de PBMC de los donantes 21 a 37 durante 24 h en presencia de un disolvente 10 mM, en presencia de 20 mg/ml de WT1-332 y en presencia de 20 mg/ml de WT1-332 y 10 mg/ml de un anticuerpo anti-HLA-DR (L243 [G46-6], BD Co.). Después del cultivo, la cantidad de IFN-y en el sobrenadante se cuantificó mediante ELISA (BD Co.). Los resultados se muestran en la Fig. 8. En muestras de los donantes 21 a 37, se demostró que las células T inducidas reconocen WT1-332 y producen IFN-y, y que la reacción está restringida por moléculas de HLA-DR.
Además, en el día 14, se cultivaron células T inducidas a partir de PBMC de los donantes 38 a 46 durante 24 h en presencia de un disolvente 10 mM, en presencia de 20 mg/ml de WT1-332, y en presencia de 20 mg/ml de WT1-332 y 10 mg/ml de un anticuerpo anti-HLA-DR (L243 [G46-6], BD Co.) o 10 mg/ml de un anticuerpo anti-HLA-DQ (SPVL3, BC Co.). Después del cultivo, la cantidad de IFN-y en el sobrenadante se cuantificó mediante ELISA (BD Co.). Los resultados se muestran en la Fig. 11. En muestras de los donantes 38 a 46, las células T indujeron WT1-332 reconocido y produjeron IFN-y, y la reacción no fue inhibida por el anticuerpo anti-HLA-DR y el anticuerpo anti-HLA-DQ. Como resulta evidente a partir de estos hechos, las células T inducidas por WT1-332 derivadas de los donantes 38 a 46 están restringidas por moléculas de HLA-DP.
Inducción de células T específicas de WT1-332 (relación con un nuevo alelo)
Con respecto a cada una de las 17 muestras (donantes 21 a 37) que estaban restringidas por HLA-DR y tenían inducido Th1 específico de WT1-332, en los resultados se utilizaron donantes de sangre sanos (en total 42 donantes que tenían al menos uno de HLA-DRB1*1501, 1502, 0405, HLA-DPB1*0501 y 0901) en las Figs. 6 y 7, el resultado del día 14 se muestra en las Figs. 9 y 10. Además, el tipo de HLA clase II (tipo de alelo HLA-DRB1 y alelo HLA-DPB1) de cada una de las 17 muestras (donantes 21 a 37) se muestra en la siguiente Tabla 2. A este respecto, DRB3*0202 está en desequilibrio de ligamiento con DRB1*1101, DRB1*1401 y DRB1*1405 (alelo DRB1 denotado por el símbolo "A" en la tabla), y DRB4*0101 está en desequilibrio de ligamiento con DRb 1*0403, DRB1*0405 y DRB1*0901 (alelo DRB1 denotado por el símbolo "A" en la tabla). En la tabla, los alelos indicados con una letra en negrita y cursiva representan un nuevo alelo HLA-DRB1 compatible.
Tabla 2
A partir de la Fig. 9, Fig. 10 y Tabla 2, se reconoció la inducción de CTL específicos de WT1-332 Th1 y específicos de WT1-332 en células que tienen estos alelos HLA-DR.
Además, con respecto a cada una de las 9 muestras (donantes 38 a 46) que eran restrictivas de HLA-DP y tenían inducidos Th1 específicos de WT1-332, en los resultados se utilizaron donantes de sangre sanos (en total 42 donantes que tenían al menos uno de HLA-DRB1*1501, 1502, 0405, HLA-DPB1*0501 y 0901) en las Figs. 6 y 7, el resultado del día 14 se muestra en las Fig. 12 y 13. Además, el tipo de HLA clase II (tipo de alelo HLA-DRB1 y alelo HLA-DPB1) de cada una de las 9 muestras (donantes 38 a 46) se muestra en la siguiente Tabla 3. En la tabla, el símbolo " * "denota alelos HLA-DPB1 compatibles previamente conocidos.
Tabla 3
Claims (11)
1. Un método para activar las células T auxiliares in vitro, que comprende la etapa de añadir un péptido WT1 a las células presentadoras de antígenos y de ese modo activar las células T auxiliares, en el que el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula del MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301, donde el péptido WT1 es un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2) y donde las células presentadoras de antígeno son de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0803, un sujeto positivo para HLA-DRB3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPB1*0201 y un sujeto positivo para HLA-DPB1*0301.
2. El método según la reivindicación 1, en el que
(i) el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a al menos dos moléculas del MHC de clase II de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301; y/o
(ii) el péptido WT1 tiene además la capacidad de unirse a una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501 y/o una molécula HLA-DPB1*0901.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde la adición de un péptido WT1 a las células presentadoras de antígenos se lleva a cabo mediante la adición de un péptido WT1, un polinucleótido que codifica el péptido WT1, un vector de expresión que contiene el polipéptido o células que contienen el vector de expresión.
4. Uso de una composición que contiene un péptido WT1 para activar las células T auxiliares in vitro mediante la adición del péptido WT1 a las células presentadoras de antígeno, donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula de MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301, donde el péptido WT1 es un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (s Eq ID NO: 2), y donde las células presentadoras de antígeno son de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0803, un sujeto positivo para HLA-DRB3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPB1*0201 y un sujeto positivo para HLA-DPB1*0301.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde
(i) el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a al menos dos moléculas MHC de clase II de una molécula HLA-DRb 1*0403, una molécula HlA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301; y/o (ii) el péptido WT1 tiene además la capacidad de unirse a una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-d Rb 1*1501, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DPB1*0501 y/o una molécula HLA-DPB1*0901.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en el que la adición de un péptido WT1 a las células presentadoras de antígeno se lleva a cabo agregando un péptido WT1, un polinucleótido que codifica el péptido WT1, un vector de expresión que contiene el polinucleótido o células que contienen el vector de expresión.
7. Uso de células presentadoras de antígeno para presentar un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido WT1 con una molécula de MHC de clase II in vitro, donde la molécula de MHC de clase II es cualquier molécula de MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula de HLA-DPB1*0301, donde el péptido WT1 es un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2), y en el que las células presentadoras de antígeno son de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0803, sujeto positivo para HLA-d Rb3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA -DPB1*0201 y un sujeto positivo para HLA-DPB1*0301.
8. Uso de células T auxiliares para activar células T citotóxicas in vitro, en el que las células T auxiliares reconocen un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido WT1 con una molécula de MHC de clase II, en el que la molécula de MHC de clase II es cualquier molécula de MHC de clase II seleccionada de una molécula h LA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301, en la que el péptido WT1 es un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2), y en la que las células T auxiliares proceden de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0803, un sujeto positivo para HLA-DRB3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPB1*0201 y un sujeto positivo para HLA-DPB1*0301.
9. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer en un sujeto positivo con respecto a una molécula del MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803 , una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DPB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 y una molécula HLA-DPB1*0301, comprendiendo dicha composición, como ingrediente activo, la composición definida en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, las células presentadoras de antígeno que presentan un complejo de un péptido antigénico que contiene un péptido WT1 con una molécula MHC de clase II definida en la reivindicación 1, las células T auxiliares definidas en la reivindicación 8, o las células T citotóxicas activadas por las células T auxiliares definidas en la reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica para su uso en la activación de células T citotóxicas, que comprende, como ingrediente activo, cualquiera de un péptido WT1, un polinucleótido que codifica el péptido WT1, un vector de expresión que contiene el polinucleótido o células que contienen el vector de expresión, y que se administra a un sujeto que tiene una molécula MHC de clase II seleccionada de una molécula HLA-DPB1*0501, una molécula HLA-d Pb 1*0901, una molécula HLA-DPB1*0201, una molécula HLA-DPB1*0301, una molécula HLA-DRB1*1501, una molécula HLA-DRB1*1502, una molécula HLA-DRB1*0405, una molécula HLA-DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202 y una molécula HLA-DRB4*0101, en la que el péptido WT1 es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2), donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula de MHC de clase II de una molécula HlA-DRB1*0403, una molécula HLA-d Rb 1*0406, una molécula HlA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301, y donde las células T citotóxicas son de un sujeto seleccionado de un sujeto positivo para HLA-DRB1*0403, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0406, un sujeto positivo para HLA-DRB1*0803, un sujeto positivo para HLA-DRB3*0202, un sujeto positivo para HLA-DRB4*0101, un sujeto positivo para HLA-DPB1*0201 y un sujeto positivo para HLA-DPB1*0301.
11. Un método para determinar la presencia o cantidad de células T auxiliares específicas de WT1 en un sujeto positivo con respecto a cualquier molécula de MHC de clase II seleccionada de una molécula de HLA-DRB1*0403, HLA-DRB1*0406, HLA-DRB1*0803, HLA-DRB3*0202, HLA-DRB4*0101, HLA-DPB1*0201 y una molécula de HLA-DPB1*0301, el método comprende las etapas de:
(a) estimular una muestra obtenida del sujeto usando un péptido WT1, y
(b) determinar la presencia o cantidad de citocinas o células T auxiliares, donde el aumento de la presencia o cantidad de citocinas o células T auxiliares muestra la presencia o cantidad de células T auxiliares específicas de WT1, donde el péptido WT1 es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2), y donde el péptido WT1 tiene la capacidad de unirse a cualquier molécula MHC de clase II de una molécula HlA -DRB1*0403, una molécula HLA-DRB1*0406, una molécula HLA-DRB1*0803, una molécula HLA-DRB3*0202, una molécula HLA-DRB4*0101, una molécula HLA-DPB1*0201 o una molécula HLA-DPB1*0301.
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