KR102588853B1 - T 세포 집단의 개변 방법 - Google Patents

T 세포 집단의 개변 방법 Download PDF

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Abstract

레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 T 세포 집단에 첨가하는 공정을 포함하는, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 방법을 제공한다.

Description

T 세포 집단의 개변 방법{METHOD FOR MODIFYING T CELL POPULATION}
본 발명은, 면역 세포, 특히 T 세포의 분화를 조절하여 T 세포의 집단을 개변하는 방법에 관한 것이다.
면역 요법이란, 일반적으로, 환자의 면역계를 각종 방법에 의해 활성화하는 것, 또는 환자의 체외에서 활성화된 면역 세포를 환자의 체내에 도입하는 것 등에 의해 질환을 치료하는 방법을 말한다. 면역 요법으로서는, 면역 세포 요법, 펩티드 백신 요법, 사이토카인 요법, 항체 요법 등, 각종 방법이 지금까지 개발되어 있다.
근년, 암 유전자 산물 WT1 유래의 부분 펩티드(WT1 펩티드)를 사용하여 면역 세포(특히 항원 제시 세포나 T 세포)를 자극함으로써, 종양 특이적 세포 상해성 T 세포(CTL)의 유도나 헬퍼 T 세포의 활성화를 달성할 수 있음을 알아내고(특허문헌 1 내지 4 및 비특허문헌 1), WT1 펩티드 백신에 의한 암 면역 요법으로서 실용화를 향한 연구가 진행되고 있다.
그러나, 상기 WT1 펩티드 백신과 같이 임상 시험에 있어서 유효성을 보이고 있는 면역 요법은 그 수가 적다. 또한, 면역 요법은 환자에 있어서의 면역 상태(면역 제어, 면역 세포의 분화 스테이지 및 활성)에 따라서는 효과가 충분히 얻어지지 않는 경우도 있어, 면역 요법의 효과를 높이는 방법의 개발이 요망되고 있다.
국제 공개 2003/106682호 공보 국제 공개 2005/095598호 공보 국제 공개 2007/097358호 공보 국제 공개 2012/046730호 공보
Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb; 51(2):99-107
본 발명은, 대상에 있어서의 면역 상태를 개변하여, 면역 요법의 효과를 증강시킬 수 있는 물질 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 레티노이드 대사 경로 또는 레티노산 시그널 전달계를 조절함으로써, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시켜, 대상에 있어서의 면역 응답을 증강시킬 수 있음을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은
(1) 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 T 세포 집단에 첨가하는 공정을 포함하는, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 방법(이하, 「본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법」이라고도 함);
(2) 조절제가, 레티노이드 대사 경로의 저해제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 저해제인, (1)에 기재된 방법;
(3) 저해제가, 레티놀의 레티날로의 변환, 레티날의 레티노산으로의 변환, β-카로틴의 레티날로의 변환, β-카로틴의 β-아포카로테날로의 변환, 또는 β-아포카로테날의 레티날 및 레티노산으로의 변환을 저해하는 것인, (2)에 기재된 방법;
(4) 저해제가, 레티놀 데히드로게나제, 레티날 옥시다제, 레티날 데히드로게나제, β-카로틴-15,15'-모노옥시게나제 1 및 β-카로틴 옥시게나제 2로 이루어지는 군에서 선택되는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터, 해당 효소의 작용을 저해하는 화합물, 또는 해당 효소의 우성 음성 변이체 단백질인, (2) 또는 (3)에 기재된 방법;
(5) 저해제가, 레티놀 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자이며, 해당 RNA 분자가 siRNA, shRNA, miRNA, stRNA 및 안티센스 RNA로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, (4)에 기재된 방법;
(6) 저해제가, 레티놀 데히드로게나제의 작용을 저해하는 화합물인, (4)에 기재된 방법;
(7) 저해제가, 레티노산 수용체 안타고니스트, 레티노산 수용체의 우성 음성 변이체 단백질, 레티노산 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 또는 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터인, (2)에 기재된 방법;
(8) 조절제가 레티노산 시그널 전달계의 촉진제인, (1)에 기재된 방법;
(9) 촉진제가 레티노산 수용체 아고니스트인, (8)에 기재된 방법;
(10) 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 포함하는, 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료의 보조제(이하, 「본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제」라고도 함);
(11) 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 포함하는, 암의 면역 요법의 보조제(이하, 「본 발명의 암 면역 요법 보조제」라고도 함);
(12) 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 포함하는 면역력 증강제(이하, 「본 발명의 면역력 증강제」라고도 함);
(13) 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 T 세포 집단에 첨가함으로써, 해당 T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 공정을 포함하는, T 세포 집단의 제작 방법(이하, 「본 발명의 T 세포 집단 제작 방법」이라고도 함);
(14) (13)의 방법에 의해 제작되는 T 세포 집단(이하, 「본 발명의 T 세포 집단」이라고도 함);
(15) (a) 암 항원, 해당 감염증의 병원체 또는 해당 병원체의 항원, 또는 이들 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화된 면역 세포, 및 (b) 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 포함하는, 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한 키트(이하, 「본 발명의 암/감염증의 예방/치료용 키트」라고도 함);
(16) T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시키기 위한, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제;
(17) 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료에 있어서의 사용을 위한, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제;
(18) 암의 면역 요법에 있어서의 사용을 위한, (17)에 기재된 조절제;
(19) (a) 암 항원, 해당 감염증의 병원체 또는 해당 병원체의 항원, 또는 이들 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화된 면역 세포, 및 (b) 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 포함하는, 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료에 있어서의 사용을 위한 조합;
(20) 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료 방법이며, 유효량의 암 항원, 해당 감염증의 병원체 또는 해당 병원체의 항원, 또는 이들 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화된 면역 세포와, 유효량의 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법(이하, 「본 발명의 암/감염증의 예방/치료 방법」이라고도 함);
(21) 유효량의 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 감염증의 예방 및/또는 치료 방법(이하, 「본 발명의 감염증 예방/치료 방법」이라고도 함);
(22) 유효량의 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상의 면역력 증강 방법(이하, 「본 발명의 면역력 증강 방법」이라고도 함);
(23) 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 제조에 있어서의, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제의 용도; 및
(24) 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 제조에 있어서의, (a) 암 항원, 해당 감염증의 병원체 또는 해당 병원체의 항원, 또는 이들 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화된 면역 세포, 및 (b) 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제의 병용
을 제공한다.
본 발명에 있어서 사용하는 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제는, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율 증대를 통해, 대상에 있어서의 항원에 대한 면역 응답을 증강시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법, 암/감염증의 예방/치료 보조제, 암 면역 요법 보조제, 면역력 증강제, T 세포 집단 제작 방법 및 해당 방법에 의해 제작되는 T 세포 집단, 그리고 암/감염증의 예방/치료용 키트는, 암 및 감염증을 포함하는 각종 질환의 예방/치료를 위해 사용할 수 있다. 또한, 이들을 암 및 감염증을 포함하는 각종 질환에 대한 면역 요법과 조합함으로써, 해당 면역 요법의 효과를 높일 수 있다.
도 1은 T 세포의 분화 개략을 나타낸 도면이다.
도 2는 shRNA를 사용하는 레티놀 데히드로게나제 10 발현 억제의, T 세포 집단의 구성에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도 3은 레티놀 데히드로게나제 10의 발현 억제 및 고발현에 의한, T 세포의 증식 및 이펙터 기능에 대한 영향을 나타낸 도면이다. 그래프는 컨트롤(DMSO)에 대한 변화율로 나타내었다. mock는 컨트롤 벡터를 나타낸다.
도 4는 RDH10 고발현에 의한 레티노이드 대사에 대한 영향을 나타낸 도면이다. 횡축은 HPLC 분획의 프랙션 번호이다.
도 5는 RDH10 녹아웃 마우스의 제작에 사용한 구축물(construct)을 나타낸 도면이다.
도 6은 RDH10 유전자의 녹아웃에 의한 레티노이드 대사에 대한 영향을 나타낸 도면이다. 횡축은 HPLC 분획의 프랙션 번호이다. 「f/f」는 컨트롤 마우스, 「f/f cre」는 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스(conditional knockout mouse)를 나타낸다.
도 7은 RDH10 녹아웃 마우스에 있어서의 기억 T 세포의 증가를 나타낸 도면이다.
도 8은 RDH10 녹아웃 마우스에 있어서의 기억 T 세포의 증가를 나타낸 도면이다.
도 9는 RDH10 녹아웃 마우스에 있어서의 T 세포 표면 분자 및 그의 전사 인자의 발현을 나타낸 도면이다.
도 10은 RDH10 녹아웃 마우스에 있어서의 림프 기관의 세포수를 나타낸 도면이다.
도 11은 RDH10 녹아웃 마우스에 있어서의 T 세포수를 나타낸 도면이다.
도 12는 리스테리아균 감염증 모델을 사용한 RDH10 결손 T 세포의 기능 해석과 기억 T 세포 형성의 평가 시험의 개략을 나타낸 도면이다. 「f/f cre」는 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스, 「f/f」는 컨트롤 마우스를 나타낸다.
도 13은 리스테리아균 감염증 모델에 있어서의, 이입된 T 세포의 비율을 나타낸 도면이다. 「f/f cre」는 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스 유래 T 세포, 「f/f」는 컨트롤 마우스 유래 T 세포를 나타낸다.
도 14는 리스테리아균 감염증 모델에 있어서의, 이입된 T 세포의 표현형을 나타낸 도면이다. 「f/f cre」는 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스 유래 T 세포, 「f/f」는 컨트롤 마우스 유래 T 세포를 나타낸다. 우측 하단의 도면에 있어서는, 칠해지지 않은 산(山)이 RDH10 녹아웃 마우스 유래 T 세포, 칠해진 산이 컨트롤 마우스 유래 T 세포를 나타낸다.
도 15는 리스테리아균 감염증 모델에 있어서의, 이입된 T 세포의 표현형을 나타낸 도면이다. 「f/f cre」는 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스 유래 T 세포, 「f/f」는 컨트롤 마우스 유래 T 세포를 나타낸다.
도 16은 리스테리아균 감염증 모델에 있어서의, 이입된 T 세포의 증식능과 리스테리아균 배제능을 나타낸 도면이다. 「f/f cre」는 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스 유래 T 세포를 이입한 마우스, 「f/f」는 컨트롤 마우스 유래 T 세포를 이입한 마우스를 나타낸다.
도 17은 리스테리아균 감염증 모델에 있어서 평가한, RDH10 유전자 녹아웃의 효과를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 18은 비타민 A 결핍 상태에 있어서의 RDH10 결손의 영향을 나타낸 도면이다. 「f/f cre」는 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스, 「f/f」는 컨트롤 마우스를 나타낸다.
도 19는 레티노산에 의한 T 세포의 분화 촉진을 나타낸 도면이다.
도 20은 T 세포의 아포토시스 감수성에 대한 레티노산 및 RAR 안타고니스트의 영향을 나타낸 도면이다.
도 21은 T 세포의 분열능 및 증식능에 대한 레티노산 및 RAR 안타고니스트의 영향을 나타낸 도면이다.
도 22는 기억 T 세포의 비율에 대한 레티노산 및 RAR 안타고니스트의 영향을 나타낸 도면이다.
도 23은 마우스에 있어서의 T 세포 집단의 재구축에 대한 레티노산 및 RAR 안타고니스트의 영향을 나타낸 도면이다.
도 24는 WT1332 특이적 기억 T 세포의 비율 및 증식능에 대한 레티노산 및 RAR 안타고니스트의 영향을 나타낸 도면이다.
도 25는 이펙터 T 세포로부터의 기억 T 세포의 유도 실험의 개략을 나타낸 도면이다.
도 26은 이펙터 T 세포에 대한 레티노산 및 RAR 안타고니스트의 영향을 나타낸 도면이다.
도 27은 이펙터 T 세포로부터 재형성된 T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율 및 T 세포의 증식능에 대한, 레티노산 및 RAR 안타고니스트의 영향을 나타낸 도면이다.
도 28은 인간 WT1 펩티드 및 RAR 안타고니스트를 사용하는 항종양 면역 유도 실험의 개략을 나타낸 도면이다.
도 29는 인간 WT1 펩티드 및 RAR 안타고니스트를 사용하는 항종양 면역 유도 실험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 30은 각종 RAR 아고니스트에 의한 기억 T 세포의 빈도의 감소를 나타낸 도면이다. CD62L 발현량의 그래프의 종축은 평균 형광 강도(MFI)이다.
도 31은 각종 RAR 안타고니스트에 의한 기억 T 세포의 빈도의 증가를 나타낸 도면이다. CD62L 발현량의 그래프의 종축은 평균 형광 강도(MFI)이다.
도 32는 RAR 안타고니스트에 의한 CD4+ T 세포의 세포 상해 활성의 증강을 나타낸 도면이다. E/T비는, 표적 세포수에 대한 CD4+ T 세포수의 비율을 나타낸다.
도 33은 세포의 마이크로솜 분획에 포함되는 RDH10 단백질을 검출하는 웨스턴 해석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 34는 RDH10의 효소 활성의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 35는 RDH10의 효소 활성에 대한 저분자 저해제의 영향을 나타낸 도면이다.
도 36은 인 비트로(in vitro)에서의 기억 T 세포의 빈도에 대한 RDH10 저해제의 영향을 나타낸 도면이다.
도 37은 인 비트로에서의 기억 T 세포의 빈도에 대한 RDH10 저해제의 영향을 나타낸 도면이다.
도 38은 재조합 리스테리아 감염 마우스에 대한 RDH10 저해제 투여 시험의 개략을 나타낸 도면이다.
도 39는 인 비보(in vivo)에서의 기억 T 세포의 빈도에 대한 RDH10 저해제의 영향을 나타낸 도면이다.
도 40은 인 비보에서의 기억 T 세포의 빈도에 대한 RDH10 저해제의 영향을 나타낸 도면이다.
도 41은 RDH10 저해제를 사용하는 항종양 면역 유도 실험의 개략을 나타낸 도면이다.
도 42는 RDH10 저해제만을 사용하는 종양 증식 억제 실험의 개략을 나타낸 도면이다.
도 43은 RDH10 저해제를 사용하는 항종양 면역 유도 실험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 44는 RDH10 저해제만을 사용하는 종양 증식 억제 실험의 결과를 나타낸 도면이다.
T 세포는, 미분화 상태의 나이브(naive) T 세포로부터, 각종 기능을 갖는 T 세포의 서브셋으로 분화된다. 분화된 T 세포 중, 면역 응답에 있어서 큰 역할을 하는 것이 CD4 양성 T 세포(헬퍼 T 세포) 및 CD8 양성 T 세포(킬러 T 세포)이다. CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 T 세포 모두, 분화 단계에 따라 기억 세포(중심 기억 세포(central memory cell) 및 이펙터 기억 세포) 및 이펙터 세포(이펙터 세포 및 말단(terminal) 이펙터 세포)로 분류할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, CD 항원 발현의 양성을 「+」, 음성을 「-」의 기호로 나타낸다. 예를 들어, CD4 양성 T 세포는, CD4+ T 세포로 나타낸다.
이들 T 세포 서브셋은, 세포가 발현하는 표면 항원, 생산하는 사이토카인이나 인터페론 등을 동정함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는, 표면 항원 CD127 및 CD62L의 발현에 의해, 중심 기억 세포(CD127+, CD62L+), 이펙터 기억 세포(CD127+, CD62L-), 이펙터 세포(CD127-, CD62L+) 또는 말단 이펙터 세포(CD127-, CD62L-) 중 어느 것으로 분류될 수 있다. 자극받은 T 세포는, 중심 기억 세포, 이펙터 기억 세포, 이펙터 세포, 말단 이펙터 세포의 순서대로 분화된다(도 1). 이들 세포 중, 중심 기억 세포는 가장 높은 증식능을 갖고, 가장 IL-2 생산량이 많다. 말단 이펙터 세포를 향해 분화가 진행됨에 따라서 IL-2 생산량이 감소되고, IFN-γ 생산량이 증가되며, 또한 아포토시스를 일으키기 쉬워진다. 기억 T 세포의 특징으로서, 아포토시스를 일으키기 어려운 것, 및 강한 증식능을 갖는 것을 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의한 T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율 증대는, 보다 강한 면역의 달성에 기여한다.
본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법에 있어서 사용하는 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제는, 레티노이드 대사 경로의 저해제 또는 레티노산 시그널 전달계의 저해제여도 되고, 해당 대사 경로의 촉진제 또는 해당 시그널 전달계의 촉진제여도 된다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 해당 조절제는, 레티노이드 대사 경로의 저해제 또는 레티노산 시그널 전달계의 저해제이다. 다른 바람직한 형태에 있어서, 해당 조절제는 레티노산 시그널 전달계의 촉진제이다. 이들 조절제를 2종 이상 조합하여 사용해도 된다.
레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제의 T 세포 집단으로의 첨가는, 인 비트로에서 행해지는 것이어도 되고, 인 비보에서 행해지는 것이어도 된다. 인 비트로에서의 첨가의 예로서는, T 세포 집단을 배양하고 있는 배지에 해당 조절제를 첨가하는 것을 들 수 있다. 인 비보에서의 첨가의 예로서는, 대상의 체내로 해당 조절제를 주입하는 것을 들 수 있다.
레티노이드 대사 경로의 저해제
본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법에 의한, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율 증대는, 나이브 T 세포 또는 기억 T 세포로부터 이펙터 T 세포로의 분화의 억제, 및/또는 이펙터(또는 말단 이펙터) T 세포로부터의 기억 T 세포(특히 중심 기억 T 세포)의 유도를 통해 달성되는 것일 수 있다.
하나의 형태에 있어서, 본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법은, 레티노이드 대사 경로를 저해함으로써, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포, 특히 중심 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 것이다. 본 명세서에 있어서, 레티노이드 대사 경로의 저해란, 레티놀이나 β-카로틴 등의 비타민 A(레티노이드) 또는 프로비타민 A(레티노이드 전구체)로부터 레티노산이 생성되는 대사 경로 중 어느 반응을 저해하는 것을 말한다. 본 발명의 하나의 형태에 있어서, 레티노이드 대사 경로의 저해제는, 레티놀을 레티날로 변환시키는 반응, 레티날을 레티노산으로 변환시키는 반응, β-카로틴을 레티날로 변환시키는 반응, β-카로틴을 β-아포카로테날로 변환시키는 반응 및 β-아포카로테날을 레티날 및 레티노산으로 변환시키는 반응 중 어느 하나 이상을 저해하는 것이다.
본 발명의 하나의 형태에 있어서, 레티노이드 대사 경로의 저해제는, 레티노이드 대사 경로 중 어느 반응을 촉매하는 효소(이하, 「레티노이드 대사 효소」라고도 함), 예를 들어 레티놀 데히드로게나제, 레티날 옥시다제, 레티날 데히드로게나제, β-카로틴-15,15'-모노옥시게나제 1(BCMO1), β-카로틴 옥시게나제 2(BCO2) 등의 발현 또는 작용을 저해하는 것이다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 레티노이드 대사 경로의 저해제는 레티놀 데히드로게나제의 저해제이며, 보다 바람직하게는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 레티놀 데히드로게나제 10(해당 효소를 코딩하는 DNA의 서열을 서열 번호 2로서 나타냄) 또는 그의 호몰로그의 저해제이다. 여기서, 레티놀 데히드로게나제 10의 호몰로그란, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 수개, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 말한다.
본 발명의 하나의 형태에 있어서, 레티노이드 대사 경로의 저해제는, 상기 레티노이드 대사 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 및 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터 중 어느 것이다.
레티노이드 대사 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자는, 통상, 레티노이드 대사 효소를 코딩하는 mRNA를 표적으로 하여, 해당 mRNA의 분해 유도 또는 번역 저해 등에 의해 해당 대사 효소의 생산을 억제하는 것이다. 이러한 RNA 분자로서는, siRNA, shRNA, miRNA, stRNA 및 안티센스 RNA 등을 들 수 있다. 바람직한 RNA 분자의 예는, siRNA 및 shRNA이다. 하나의 형태에 있어서, 유전자 발현의 억제 대상이 되는 레티노이드 대사 효소는, 레티놀 데히드로게나제이며, 특히 레티놀 데히드로게나제 10이다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 레티놀 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자는, 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 해당 서열과 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상 또는 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DNA로부터 전사되는 mRNA를 표적으로 하여, 레티놀 데히드로게나제 10의 생산을 억제하는 것이다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 해당 RNA 분자는, 2본쇄 부분의 센스쇄가 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 해당 2본쇄 부분의 안티센스쇄가 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 siRNA 또는 shRNA, 특히 shRNA이다.
상기 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자란, 해당 RNA 분자를 직접적 또는 간접적으로 발생시키는 핵산 분자를 의미하고, 예를 들어 해당 RNA 분자에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구축물이나 재조합 레트로바이러스 RNA를 들 수 있다. 여기에 말하는 「직접적」이란, 예를 들어 DNA로부터의 전사, 또는 전구체 RNA의 프로세싱(스플라이싱(splicing)이나 에디팅(editing) 등)에 의해 목적으로 하는 RNA 분자가 발생하는 경우 등을 의미하고, 한편 「간접적」이란, 예를 들어 RNA로부터의 역전사에 의해 DNA가 발생하고, 계속해서 해당 DNA로부터의 전사에 의해 목적으로 하는 RNA 분자가 발생하는 경우 등을 의미한다.
상기 핵산 분자를 포함하는 벡터는, 목적으로 하는 RNA 분자의 일과성 발현(생산)을 가져오는 「발현 벡터」여도 되고, DNA 서열의 염색체로의 통합에 의해 목적으로 하는 RNA 분자의 안정적 발현(생산)을 가져오는 「형질 전환 벡터」여도 된다. 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 벡터의 종류로서는, 플라스미드 벡터, DNA 바이러스 벡터, RNA 바이러스 벡터 등을 들 수 있지만, 동물 세포, 예를 들어 인간 세포에 있어서 사용 가능한 벡터인 한, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 원하는 RNA 분자 및 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 구축물을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 세포에 감염시키면, 해당 RNA 구축물에 대응하는 DNA 구축물이 역전사에 의해 생성되고, 해당 DNA 구축물이 해당 세포의 염색체 중에 통합되며, 해당 통합된 DNA 구축물로부터 해당 원하는 RNA 분자가 전사된다.
레티노이드 대사 효소의 작용을 저해하는 화합물은, 저분자 화합물이어도 되고, 고분자 화합물이어도 된다. 해당 고분자 화합물로서는, 예를 들어 레티노이드 대사 효소에 결합하는 항체 및 그의 항원 결합성 단편(Fab, F(ab')2 등), 그리고 ScFv 등을 들 수 있다. 레티노이드 대사 효소의 작용을 저해하는 저분자 화합물은, 예를 들어 해당 효소의 활성에 대한 저해 작용을 지표로 한 화합물 라이브러리로부터의 스크리닝 등, 당해 기술 분야에 있어서의 공지된 방법에 의해 취득할 수 있다. 레티노이드 대사 효소에 결합하는 항체, 그의 항원 결합성 단편, ScFv 등도 또한, 효소를 항원으로서 사용하는 동물 면역이나 파지 디스플레이 등, 당해 기술 분야에 있어서의 공지된 방법에 의해 취득할 수 있다.
하나의 형태에 있어서, 레티노이드 대사 효소의 작용을 저해하는 화합물은, 레티놀 데히드로게나제의 작용을 저해하는 화합물이며, 바람직하게는 레티놀 데히드로게나제 10(서열 번호 1)의 작용을 저해하는 화합물(이하, 「RDH10 저해제」라고도 함)이다. 하나의 형태에 있어서, RDH10 저해제는, 이하의 식(I)으로 표시되는 구조를 갖는 화합물 또는 그의 염이다:
Figure 112017069035005-pct00001
[식 중, R은 H 또는 CH3이며,
Z는 HO- 또는 HOOC-Y-COO-이며,
Y는 -CH2CH2-, -CH=CH- 또는 페닐렌기이다].
바람직한 형태에 있어서, 식(I) 중의 Z는 HOOC-Y-COO-이다. 보다 바람직하게는, Y는 -CH=CH- 또는 페닐렌기이다.
또한, 식(I)로 표시되는 화합물의 염으로서는, 나트륨염, 칼륨염 등을 들 수 있고, 나트륨염이 바람직하다.
바람직하게는, RDH10 저해제는, RDHI-001, RDHI-002, RDHI-003, RDHI-004, RDHI-005, RDHI-006, RDHI-007, RDHI-008, RDHI-009, RDHI-010 및 RDHI-011로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물이다.
보다 바람직하게는, RDH10 저해제는, RDHI-001, RDHI-002, RDHI-003 및 RDHI-004로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물이다.
더욱 바람직하게는, RDH10 저해제는, RDHI-001, RDHI-002 및 RDHI-003으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물이다.
RDHI-001 내지 RDHI-011은, 각각 이하의 식으로 표시되는 화합물이다.
Figure 112017069035005-pct00002
Figure 112017069035005-pct00003
Figure 112017069035005-pct00004
Figure 112017069035005-pct00005
Figure 112017069035005-pct00006
Figure 112017069035005-pct00007
Figure 112017069035005-pct00008
Figure 112017069035005-pct00009
Figure 112017069035005-pct00010
Figure 112017069035005-pct00011
Figure 112017069035005-pct00012
본 발명에 있어서, 레티노이드 대사 효소의 우성 음성 변이체 단백질을, 레티노이드 대사 경로의 저해제로서 사용할 수도 있다. 해당 우성 음성 변이체 단백질은, 예를 들어 레티노이드 대사 효소의 변이체 단백질을 제작하고, 기질과의 결합능을 갖지만 본래의 촉매 작용을 갖지 않는 것을 선택하는 것 등에 의해 취득 가능하다. 또한, 효소의 기능 부위를 해석함으로써, 원하는 변이체 단백질의 제작 및 선택 공정을 효율화할 수 있다.
레티노이드 대사 경로의 촉진제 또는 저해제는, 소위 SBDD(Structure-Based Drug Design)의 방법에 의해 취득할 수도 있다. 예를 들어, 레티놀 데히드로게나제 10 등의 레티노이드 대사 효소를 정제하고, 결정화하고, X선 해석에 의해 입체 구조를 결정하며, 그 입체 구조에 기초하여 해당 레티노이드 대사 효소에 결합하는 화합물을 디자인하고, 해당 화합물의 활성을 시험함으로써, 레티노이드 대사 경로의 촉진제 또는 저해제로서 기능하는 화합물을 동정할 수 있다.
레티노산 시그널 전달계 및 그의 저해제
레티노산 시그널 전달계는, 레티노산(이하, 「RA」라고도 함)이, 세포의 핵 내의 레티노산 수용체(이하, 「RAR」이라고도 함)와 결합함으로써 발생하는 시그널(예를 들어, 레티노산 응답 서열을 갖는 유전자의 전사 조절 등)의 전달계를 말한다. 하나의 형태에 있어서, 본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법은, 이러한 시그널 전달계를 저해함으로써, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포, 특히 중심 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 것이다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법은, 레티노산 시그널 전달계를 저해함으로써, T 세포 집단에 있어서의 CD4 양성 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 것이다.
레티노산 시그널 전달계의 저해제로서는, 레티노산 수용체 안타고니스트, 레티노산 수용체의 우성 음성 변이체 단백질, 레티노산 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 및 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터 등을 들 수 있다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 해당 저해제는 레티노산 수용체 안타고니스트이다.
레티노산 수용체 안타고니스트로서는, LE540, LE135, LE550, BMS195614, MM11253, AGN194310, Ro41-5253, AGN193109, CD2665, BMS493 등의 화합물 및 그들의 유사체 또는 유도체, 및 레티노산과 레티노산 수용체의 결합을 차단하는 항체 등을 들 수 있다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 레티노산 수용체 안타고니스트는, LE540, LE135, BMS195614 및 MM11253, 그리고 그들의 유사체 및 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물이다. LE540, LE135, LE550, BMS195614, MM11253, AGN194310, Ro41-5253, AGN193109, CD2665 및 BMS493은, 각각 이하의 식으로 표현된다.
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레티노산 수용체 안타고니스트로서 작용하는 상기 이외의 화합물은, 레티노산이나 LE540 등과 유사한 구조를 갖는 화합물의 라이브러리로부터의 스크리닝 등, 당해 기술 분야에 있어서의 공지된 방법에 의해 취득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 레티노산 수용체의 우성 음성 변이체 단백질을, 레티노산 시그널 전달계의 저해제로서 사용할 수도 있다. 해당 우성 음성 변이체 단백질은, 예를 들어 레티노산 수용체의 변이체 단백질을 제작하고, 레티노산과의 결합능을 갖지만, 시그널을 발생시키지 않는 것을 선택하는 것 등에 의해 취득할 수 있다. 또한, 수용체의 기능 부위를 해석함으로써, 원하는 변이체 단백질의 제작 및 선택 공정을 효율화할 수 있다.
본 발명의 다른 형태에 있어서, 레티노산 수용체를 코딩하는 유전자(RAR 유전자)의 발현을 억제하는 RNA 분자를, 레티노산 시그널 전달계의 저해제로서 사용할 수 있다. RAR 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자는, 통상, RAR을 코딩하는 mRNA를 표적으로 하여, 해당 mRNA의 분해 유도 또는 번역 저해 등에 의해 RAR의 생산을 억제하는 것이다. 이러한 RNA 분자의 종류로서는, siRNA, shRNA, miRNA, stRNA 및 안티센스 RNA 등을 들 수 있다. 바람직한 RNA 분자의 예는, siRNA 및 shRNA이다.
예를 들어 인간에 있어서는, 레티노산 수용체로서 RARα, RARβ 및 RARγ의 3종의 서브타입이 알려져 있고, 각각에 대하여 복수의 아이소폼(배리언트(variant))이 보고되어 있다. 예를 들어, RARα에 대해서는 NP_000955, NP_001019980 및 NP_001138774, RARβ에 대해서는 NP_000956 및 NP_057236, RARγ에 대해서는 NP_000957, NP_001036193, NP_001230661, NP_001230659 및 NP_001230660(모두 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 액세션 번호로 나타냄)의 아미노산 서열로 이루어지는 아이소폼이 알려져 있고, 본 명세서에 있어서는, 이들 아이소폼을 코딩하는 DNA의 서열을 각각 서열 번호 5 내지 14로서 나타낸다. 따라서, 하나의 바람직한 형태에 있어서, RAR 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자는, 서열 번호 5 내지 14의 어느 뉴클레오티드 서열 또는 해당 서열과 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상 또는 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DNA로부터 전사되는 mRNA를 표적으로 하여, RARα, RARβ 및 RARγ 중 1종 이상의 생산을 억제하는 것이다.
또한, RAR 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자를 (직접적 또는 간접적으로) 발생시키는 「핵산 분자」 및 해당 핵산 분자를 포함하는 「벡터」의 정의 및 예시에 대해서는, 「레티노이드 대사 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자」를 발생시키는 핵산 분자, 및 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터에 대하여 상술한 내용과 동일하다.
레티노산 시그널 전달계의 촉진제
하나의 형태에 있어서, 본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법은, 레티노산 시그널 전달계를 촉진시킴으로써, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 것이다. 예를 들어, 나이브 T 세포에 레티노산 시그널 전달계의 촉진제를 작용시킴으로써, 효율적으로 해당 T 세포를 분화시켜, 기억 T 세포를 증가시킬 수 있다. 따라서, 하나의 형태에 있어서, 본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법은, 레티노산 시그널 전달계의 촉진제를, 나이브 T 세포를 포함하는 T 세포 집단에 첨가함으로써, 해당 T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 것이다. 이러한 형태에 있어서, 레티노산 시그널 전달계의 촉진제를 첨가하는 T 세포 집단에 있어서의 나이브 T 세포의 비율은, 바람직하게는 20％ 이상, 예를 들어 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상이다. 레티노산 시그널 전달계의 촉진제를 첨가하는 T 세포 집단은, 나이브 T 세포만으로 이루어지는 것이어도 된다.
레티노산 시그널 전달계의 촉진제로서는, 레티노산 수용체 아고니스트, 레티노산 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 등을 들 수 있고, 바람직하게는 레티노산 수용체 아고니스트이다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 레티노산 수용체 아고니스트는, 레티노산, 특히 올 트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid; ATRA)이다. 다른 바람직한 형태에 있어서, 레티노산 수용체 아고니스트는, 올 트랜스 레티노산(ATRA), LE511, AM580, AC55649 및 CD437, 그리고 그들의 유사체 및 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물이다. 올 트랜스 레티노산(ATRA), LE511, AM580, AC55649 및 CD437은, 각각 이하의 식으로 표현된다.
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레티노산 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자는, 예를 들어 레티노산 수용체를 과잉 발현시켜 레티노산 시그널 전달계를 촉진시키기 위해서, 발현 벡터 등의 당해 기술 분야에 있어서 공지된 방법을 사용하여 T 세포에 도입할 수 있다.
암/감염증의 예방/치료 보조제
본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제는, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 유효 성분으로서 포함하는 것이다. 해당 대사 경로 또는 시그널 전달계의 조절(저해 또는 촉진)에 의해, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율이 증대된다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제는, 면역 요법, 특히 암 항원 펩티드를 사용하는 면역 요법에 의한 암의 치료 효과를 증대시키는 것이다. 암 면역 요법에 사용하는 암 항원 펩티드로서는, 이들로 한정되지 않지만, 각종 WT1 펩티드, 예를 들어 인간 WT1332 (서열 번호 15, 국제 공개 2012/046730호 등에 기재), MAGE-A4278-299(서열 번호 16), 서바이빈97 -111(서열 번호 17), 및 그들과 동등한 활성을 갖는 변이 펩티드 등을 들 수 있다.
또한, 레티노이드 대사 경로 또는 레티노산 시그널 전달계의 조절(저해 또는 촉진)은, 기억 T 세포의 비율 증대뿐만 아니라, T 세포의 수 자체의 증가도 가져온다. 따라서, 레티노이드 대사 경로 또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제는, 감염증의 예방(예를 들어 백신) 및 치료(예를 들어 면역 요법)에 있어서의 보조제로서도 유효하다.
또한, 레티노산 시그널 전달계의 저해제(예를 들어 RAR 안타고니스트)는, CD4+ T 세포의 세포 상해 활성을 증강시킬 수 있다. 따라서, 레티노산 시그널 전달계의 저해제는, 암 또는 감염증의 치료, 특히 암 또는 감염증의 면역 요법에 있어서의 보조제로서 유효하다.
본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제의 적용 대상이 되는 암은, 특별히 한정되지 않고, 암종, 육종, 조혈기 종양 등을 포함한다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 해당 보조제의 적용 대상은, WT1 유전자를 발현하는 각종 암 내지 종양, 예를 들어 백혈병, 골수 이형성 증후군, 다발성 골수종, 악성 림프종 등의 조혈기 종양, 및 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 뇌종양 등의 고형암 내지 고형 종양이다.
본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제의 적용 대상이 되는 감염증은, 특별히 한정되지 않는다. 이것은, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제에 의해, T 세포수의 증가와 기억 T 세포 비율의 증대를 통해, 감염증의 종류를 막론하고 강한 면역이 얻어지기 때문이다. 하나의 형태에 있어서, 해당 보조제의 적용 대상은, 세균, 바이러스, 원생 동물 등에 의한 감염증일 수 있다.
면역력 증강제
상술한 바와 같이, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제는, 기억 T 세포의 비율 증대 및 T 세포의 수 자체의 증가를 가져온다. 따라서, 해당 조절제는, 비특이적으로 대상의 면역력을 향상시키는 면역력 증강제의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제, 암 면역 요법 보조제 및 면역력 증강제는, 유효 성분인 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제 이외에도, 예를 들어 담체, 부형제 등을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제, 암 면역 요법 보조제 및 면역력 증강제의 투여 방법은, 질환의 종류, 대상의 상태, 표적 부위 등의 조건에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 당해 방법으로서는, 예를 들어 피내 투여, 피하 투여, 근육 내 투여, 정맥 내 투여, 경비 투여, 경구 투여 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제, 암 면역 요법 보조제 및 면역력 증강제에 포함되는 상기 유효 성분의 양, 해당 보조제 및 증강제의 제형, 투여 횟수 등은, 질환의 종류, 대상의 상태, 표적 부위 등의 조건에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
T 세포 집단의 제작 방법
본 발명의 T 세포 집단 제작 방법은, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 T 세포 집단에 첨가함으로써, 통상 사용되는 T 세포의 배양법과 비교하여 기억 T 세포의 비율이 증대된 T 세포 집단을 얻는 것이다. 해당 방법에 있어서, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제의 T 세포 집단으로의 첨가는, 인 비트로 또는 인 비보에서 행할 수 있는 것이지만, 바람직하게는 인 비트로에서 행해지는 것이다. 인 비트로에서의 첨가의 예로서는, T 세포 집단을 배양하고 있는 배지에 해당 조절제를 첨가하는 것을 들 수 있다. 인 비보에서의 첨가의 예로서는, 대상의 체내에 해당 조절제를 투여하는 것을 들 수 있다.
본 발명의 T 세포 집단 제작 방법에 의해 제작되는 T 세포 집단은, 각종 질환, 바람직하게는 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료, 특히 암 또는 감염증의 면역 요법에 있어서, 해당 예방 및/또는 치료의 효과를 증대시키기 위해 사용할 수 있다.
치료 방법 및 키트
본 발명의 암/감염증의 예방/치료 방법 및 암/감염증의 예방/치료용 키트는, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제와, 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료, 특히 암 또는 감염증의 면역 요법에 있어서의 다른 유효 성분을 병용하는 것이다. 이러한 유효 성분으로서는, 예를 들어 암 항원, 감염증의 병원체 또는 해당 병원체의 항원, 이들 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화된 면역 세포 등을 들 수 있다.
암 항원이란, 암 세포 또는 종양 세포 특이적으로 발현하는 표면 항원(소위 종양 특이 항원) 및 해당 항원의 부분 펩티드를 의미하고, 예를 들어 암 유전자 WT1의 산물인 WT1 단백질, 해당 단백질의 부분 펩티드인 WT1332 등의 WT1 펩티드를 들 수 있다. 감염증의 병원체로서는, 세균, 진균, 바이러스, 원생 동물 등을 들 수 있다. 병원체의 항원으로서는, 세균, 진균, 바이러스 등의 표면에 발현하는 단백질, 당 단백질 및 당쇄 등, 및 세균 또는 진균의 세포벽 및 그의 구성 성분(리포다당 등)을 들 수 있다. 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화되는 면역 세포로서는, 항원 제시 세포(예를 들어 수지상 세포, 매크로파지 및 B 세포), 및 해당 항원 제시 세포에 의해 활성화되는 T 세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제, 암 면역 요법 보조제 및 면역력 증강제는, 각종 질환, 바람직하게는 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료, 특히 암 또는 감염증의 면역 요법에 있어서의 유효 성분과 병용할 수 있다. 이러한 유효 성분으로서는, 상기한 암 항원, 감염증의 병원체 또는 해당 병원체의 항원, 이들 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화된 면역 세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 기억 T 세포 비율 증대 방법, 암/감염증의 예방/치료 보조제, 암 면역 요법 보조제, 면역력 증강제, 암/감염증의 예방/치료용 키트, 암/감염증의 예방/치료 방법, 감염증 예방/치료 방법 및 면역력 증강 방법을 적용할 수 있는 대상은, 면역계, 특히 획득 면역계를 갖는 동물, 즉 척추 동물이라면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 대상으로서는, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 원숭이, 침팬지 등을 들 수 있다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 이러한 대상은 인간이다.
본 발명의 암/감염증의 예방/치료 방법, 감염증 예방/치료 방법 및 면역력 증강 방법에 있어서, 대상에 투여하는 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제의 유효량, 및 암 항원, 감염증의 병원체 또는 해당 병원체의 항원, 또는 이들 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화된 면역 세포의 유효량은, 질환의 종류, 대상의 상태, 표적 부위 등의 조건에 따라, 또한 당업자에게 주지된 방법(각종 비임상 및/또는 임상 시험을 포함함)을 사용하여, 적절히 결정할 수 있다. 본 발명의 암/감염증의 예방/치료 방법, 감염증 예방/치료 방법 및 면역력 증강 방법에 있어서 사용할 수 있는 암 항원, 감염증의 병원체 또는 해당 병원체의 항원, 이들 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화된 면역 세포의 예는, 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 암/감염증의 예방/치료 보조제, 암 면역 요법 보조제, 면역력 증강제, T 세포 집단 제작 방법, 암/감염증의 예방/치료용 키트, 암/감염증의 예방/치료 방법, 감염증 예방/치료 방법 및 면역력 증강 방법에 있어서도, 「기억 T 세포 비율 증대 방법」에 관하여 기재한 각종 레티노이드 대사 경로의 저해제, 레티노산 시그널 전달계의 저해제, 및 레티노산 시그널 전달계의 촉진제를, 레티노이드 대사 경로 또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제로서 사용할 수 있다.
이하에 실시예를 나타내서 본 발명을 구체적이며 또한 상세하게 설명하지만, 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안된다.
실시예
실시예 1
shRNA에 의한 레티놀 데히드로게나제 10의 발현 억제
레티놀 데히드로게나제 10을 표적으로 하는, 서열 번호 18로 표시되는 서열로 이루어지는 shRNA(RDH10 표적 shRNA)를 발현시키기 위한 구축물을, 인간 CD4+CD45RO+ T 세포에 도입하였다. 구체적으로는, 렌티바이러스 벡터의 시스템을 사용하여, 클로닝 사이트에 서열 번호 19의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DNA를 통합한 벡터와, 패키징 벡터를 패키징 세포(293T 세포주)에 공동-형질감염시켜, 생성된 재조합 바이러스를 인간 CD4+CD45RO+ T 세포에 감염시켰다. 염색체로의 shRNA 발현 구축물의 통합은, shRNA 발현 구축물의 하류에 존재하는 GFP의 발현을 리포터로서 확인하였다. 이러한 방법에 의해 RDH10 표적 shRNA를 발현시킨 T 세포 집단에 있어서는, 대조 shRNA(서열 번호 20)를 동일한 방법으로 발현시킨 T 세포 집단과 비교하여, 말단 이펙터 세포(CD127-, CD62L-)의 비율이 감소하고, 중심 기억 세포(CD127+, CD62L+)의 비율이 증대되었다(도 2).
인간 CD4+CD45RO+ T 세포에, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 상기 RDH10 표적 shRNA(sh#10-2, 서열 번호 18)나, 컨트롤로서 루시페라제를 표적으로 한 shRNA(sh-luc, 서열 번호 20)를 도입하였다. 또한, 마찬가지로, 인간 CD4+CD45RO+ T 세포에 RDH10 유전자를 통합한 렌티바이러스 벡터를 도입함으로써 RDH10 고발현 T 세포를 제작하였다.
이들 세포를 항CD3 항체와 항CD28 항체 및 IL-2의 존재 하에서, 다양한 농도의 레티놀(올 트랜스형)과 함께 일주일간 배양하고, 세포수의 측정과 함께 세포 내 사이토카인 분석으로 IFN-γ를 생산하는 세포의 빈도를 조사하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
레티놀의 존재에 의해, 레티놀 농도 의존적으로 세포수 및 IFN-γ 생산 세포가 증가하였다. 한편, RDH10의 발현 억제에 의해, 그들의 증가율이 억제되고, 또한 과잉 발현에 의해 증강되었다.
상술한 RDH10 고발현 T 세포(도 4에 있어서 #10이라고 표기) 및 컨트롤 벡터 도입 T 세포(도 4에 있어서 mock라고 표기)를 각각 5×107개씩 배양액과 함께 10cm의 배양 접시에 넣고, 3H로 표지된 올 트랜스 레티놀을 1μM의 농도로 첨가하였다. 4시간, 37℃에서 배양한 후, 세포를 회수하고, 헥산을 사용하여 세포 내의 레티노이드를 추출하였다. 추출에 사용한 헥산을 건조 원심에 의해 제거한 후, 농축된 레티노이드를 아세토니트릴에 용해시켜 HPLC를 사용하여 분획을 행하고, 각 프랙션에 포함되는 3H를 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 또한, 미리, 표준 샘플(올 트랜스 레티놀 및 올 트랜스 레티날)을 HPLC로 분리하고, 각 표준 샘플이 어떤 프랙션에 분리되는지 결정하였다. HPLC의 용매는 아세토니트릴:50mM 아세트산암모늄=75:25, 분리 칼럼은 Syhergi 4u Hydro-RP 80A(Phenomenex사제)를 사용하였다. 유속은 1.5ml/분으로 행하고, 1분간마다 프랙션을 제작하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.
RDH10 고발현 T 세포에서는, 올 트랜스 레티놀로부터 올 트랜스 레티날로의 변환이 촉진되었다.
실시예 2
레티놀 데히드로게나제 10 녹아웃 마우스에 있어서의 T 세포 집단
(1) 컨디셔널 녹아웃 마우스의 제작
타겟팅 벡터(targeting vector)를 사용하여, 염색체 상의 레티놀 데히드로게나제 10(이하, RDH10이라고도 함) 유전자가 도 5에 나타낸 구축물 A로 치환된 마우스를 제작하였다. 해당 마우스를, Flp 리컴비나제(recombinase)를 발현하는 트랜스제닉 마우스와 교배함으로써, LacZ 및 neo 유전자가 제거된 유전자 구조(도 5의 B: 이하에 있어서, 이러한 구조를 「flox 대립유전자(allele)」라고 함)를 갖는 마우스를 제작하였다. 이렇게 하여 얻어진 flox 대립유전자를 갖는 마우스와, Cre 리컴비나제를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 교배함으로써, RDH10의 엑손 2가 제거된 유전자 구조(도 5의 C)를 갖는 녹아웃 마우스를 얻었다.
(2) 녹아웃 마우스에 있어서의 레티노이드 대사
상기와 같이 제작한 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스(flox/flox cre) 및 컨트롤 마우스(flox/flox)의 비장 세포로부터 셀 소터를 사용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 분리한 CD4+ T 세포는 항CD3 항체, 항CD28 항체 및 IL-2를 사용하여 활성화 및 증식시킨 후, 각각 3×107개씩 배양액과 함께 10cm의 배양 접시에 넣고, 3H로 표지된 올 트랜스 레티놀을 1μM의 농도로 첨가하였다. 4시간, 37℃에서 배양한 후, 세포를 회수하고, 헥산을 사용하여 세포 내의 레티노이드를 추출하였다. 추출에 사용한 헥산을 건조 원심에 의해 제거한 후, 농축된 레티노이드를 아세토니트릴에 용해시켜 HPLC를 사용하여 분획을 행하고, 각 프랙션에 포함되는 3H를 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 또한, 미리, 표준 샘플(올 트랜스 레티놀 및 올 트랜스 레티날)을 HPLC로 분리하고, 각 표준 샘플이 어떤 프랙션에 분리되는지 결정하였다. HPLC의 용매는 아세토니트릴:50mM 아세트산암모늄=75:25, 분리 칼럼은 Syhergi 4u Hydro-RP 80A(Phenomenex사제)를 사용하였다. 유속은 1.5ml/분으로 행하고, 1분간마다 프랙션을 제작하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.
RDH10 녹아웃 마우스에서는, 컨트롤 마우스와 비교하여 올 트랜스 레티놀로부터 올 트랜스 레티날로의 변환이 억제되었다.
(3) 녹아웃 마우스에 있어서의 T 세포 서브셋의 동정
RDH10 유전자좌에 관해 야생형 호모(wt/wt), flox 대립유전자/야생형 헤테로(flox/wt) 또는 flox 대립유전자 호모(flox/flox)의 유전자형을 갖는 녹아웃 마우스에 Cre 리컴비나제를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 교배하여 얻어진 마우스(이하, 검정용 마우스라고도 함)에 있어서, CD44 및 CD62L의 발현을 지표로 하여 T 세포 서브셋을 동정하였다. 그 결과, RDH10 wt/wt 마우스에 비해, RDH10 flox/flox 마우스 및 RDH10 flox/wt 마우스에서는, CD4+ T 세포 집단 및 CD8+ T 세포 집단의 양방에 있어서, CD62L의 발현이 높은 기억형 T 세포의 비율이 증대되었다(도 7).
(4) 녹아웃 마우스에 있어서의 기억 T 세포의 증가
6 내지 8주령의 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스(f/f cre)와 컨트롤 마우스(f/f)의 말초 림프절에 존재하는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 CD62L 및 CD127 발현을 플로우 사이토메트리로 해석하였다. 결과를 도 8에 나타낸다. RDH10 녹아웃 마우스에서는 CD62L 및 CD127의 발현이 높아, 기억형 T 세포의 비율이 증대되어 있는 것으로 나타났다.
(5) T 세포 표면 분자 및 그의 전사 인자의 발현
상기 검정용 마우스에 있어서 T 세포 표면 분자 및 그의 전사 인자의 발현을 조사한 결과, RDH10 flox/flox 마우스에서는, RDH10 wt/wt 마우스 및 RDH10 flox/wt 마우스와 비교하여, 기억형 T 세포에 특징적인 세포 표면 분자(CD62L(Sell), S1p1(Edg1), Ccr7, IL7ra) 및 그의 발현에 관련되는 전사 인자(Klf2, Foxo1, Foxo3, Ets1, Sp1, Irf1)의 발현이 높았다(도 9).
(6) 림프 기관의 세포수 및 해당 림프 기관에 있어서의 T 세포수
상기 검정용 마우스에 있어서 림프 기관의 세포수 및 해당 림프 기관에 있어서의 T 세포수를 조사한 결과, RDH10 flox/flox 마우스 및 RDH10 flox/wt 마우스에서는, RDH10 wt/wt 마우스와 비교하여, 1차 림프 기관(흉선) 및 2차 림프 기관(림프절, 비장)의 세포수가 증가하고 있어, 림프구의 증식이 촉진되었음이 시사되었다(도 10). 또한, RDH10 flox/flox 마우스 및 RDH10 flox/wt 마우스에서는, RDH10 wt/wt 마우스와 비교하여, 림프절 및 비장에 있어서의 CD4+ T 세포수 및 CD8+ T 세포수가 모두 증가되어 있었다(도 11).
(7) 리스테리아균 감염증 모델을 사용한 RDH10 결손 T 세포의 기능 해석과 기억 T 세포 형성의 평가
[방법]
OT-I TCR 유전자가 도입되고(트랜스제닉), 또한 Rag1 유전자가 녹아웃된 마우스로부터, RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스(flox/flox cre), 및 컨트롤 마우스(flox/flox)를 제작하였다. 또한, 양자의 T 세포를 구별하기 위해서, 마커 분자인 CD45.1 및 CD45.2의 2개의 분자 마커를 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스가 갖게 하였다. 한편, 컨트롤 마우스에는 CD45.1만을 갖게 하였다. 이들 마우스로부터 T 세포(OT-I TCR만을 발현하는 CD8+ T 세포)를 얻어, 1×104개씩 1:1의 비율로 혼합한 후, CD45.2만을 갖는 야생형 마우스(C57BL/6J)에 꼬리 정맥으로부터 투여하였다.
다음날, OT-I TCR이 인식하는 OVA 펩티드를 발현하는 재조합 리스테리아 모노사이토게네스(LM-OVA)를 1×104 CFU 감염시키고, 경시적으로, 이입된 T 세포의 비율 변화 및 표현형을 비장 및 림프절을 적출하여 해석하였다.
또한, 기억 T 세포의 기능을 평가하기 위해서, 기억기(memory phase)인 감염 후 30일 이상 지난 마우스의 비장 및 림프절로부터, 이입된 RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스 유래 T 세포(CD45.1+CD45.2+) 및 컨트롤 마우스 유래 T 세포(CD45.1+CD45.2-)를 FACS 소터를 사용하여 분리하고, 각각 1×104개씩 개개의 야생형 마우스에 이입하였다. 다음날, LM-OVA를 1×106 CFU 감염시키고(2차 감염), 그 5일 후에 비장 및 간장에 존재하는 리스테리아균수와 이입된 T 세포의 세포수를 해석하였다.
상기 시험의 개략을 도 12에 나타낸다.
[결과]
LM-OVA 감염 후에 있어서의, 이입된 T 세포의 비율 변화 및 표현형을 도 13 내지 도 15에 나타낸다. 비장 및 림프절의 어느 경우에 있어서도, 컨트롤 마우스 유래 T 세포보다도, RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스 유래 T 세포의 비율이 높았다(도 13). 또한, RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스 유래 T 세포에서는, 컨트롤 마우스 유래 T 세포와 비교하여, 기억 T 세포(CD62L+ CD127+ 세포) 및 기억 전구 이펙터 세포(MPEC)(KLRG1- CD127+ 세포)의 비율이 높았다(도 14 및 15).
2차 감염 후에 있어서, RDH10 녹아웃 마우스 유래의 T 세포는, 컨트롤 마우스 유래의 T 세포와 비교하여, 강한 증식능과 강한 리스테리아균 배제능을 갖고 있음이 나타났다(도 16).
이상의 결과로부터, RDH10 녹아웃 마우스의 T 세포는, 기억 T 세포를 보다 많이 생산하고, 또한 질적으로도 기억 기능이 높은 것이 확인되었다(도 17).
(8) 비타민 A 결핍 상태에 있어서의 RDH10 결손의 영향
RDH10 결손 T 세포의 CD62L 발현 항진이, RDH10에 의한 비타민 A(레티놀)의 대사 결실이 원인인지 여부를 해석하기 위해서, RDH10 컨디셔널 녹아웃 마우스(flox/flox cre) 및 컨트롤 마우스(flox/flox)에 비타민 A 결핍식을 4주일 제공하였다. 그 후, 림프절(겨드랑이+서혜), 장간막 림프절 및 비장의 T 세포의 CD62L 및 CD127 발현을 플로우 사이토메트리로 해석하였다. 결과를 도 18에 나타낸다. 비타민 A 결핍 상태에서는 RDH10 결손 T 세포에 있어서의 CD62L 및 CD127의 발현 상승은 관찰되지 않는 점에서, RDH10이 비타민 A의 대사를 통해 이들 분자의 발현을 조절하고 있는 것이 명확해졌다.
실시예 3
T 세포의 분화 촉진 및 분화 억제
(1) 레티노산에 의한 분화 촉진
인간 CD4+CD45RO+ T 세포를 각종 방법(IL-2, 항CD3/CD28 항체, 항CD3/CD28 항체 및 IL-2)으로 자극하고, DMSO(대조) 또는 올 트랜스 레티노산의 존재 하에서 배양하였다(또한, 이하의 실시예에 있어서 사용한 레티노산은 모두 올 트랜스 레티노산임). 그 결과, 레티노산 존재 하에서 배양한 세포 집단에 있어서, 중심 기억 세포(그래프 우측 상단)의 비율이 감소하고, 말단 이펙터 세포(그래프 좌측 하단)의 비율이 증가하였다(도 19). 이러한 결과는, 레티노산에 의해 중심 기억 세포로부터 이펙터 기억 세포, 이펙터 세포, 말단 이펙터 세포로의 분화가 촉진되는 것을 나타낸다.
(2) 아포토시스 내성
DMSO(대조), 레티노산 또는 RAR 안타고니스트(LE540)의 존재 하에서 8일간 배양한 인간 CD4+CD45RO+ T 세포를 항Fas 항체(7C11)로 자극하고, 아포토시스 세포 및 생세포의 비율을 조사 해석하였다. 그 결과, 레티노산으로 T 세포의 분화를 촉진시킴으로써, 아포토시스 세포가 증가하고, 생세포가 감소하였다. 한편, RAR 안타고니스트로 분화를 억제하면, 아포토시스 세포가 감소하고, 생세포가 증가하였다(도 20).
(3) 기억 T 세포의 분열능 및 증식능
항CD3/CD28 항체로 자극하고, DMSO(대조), 레티노산 또는 RAR 안타고니스트(LE540)의 존재 하에서 8일간 배양한 인간 CD4+CD45RO+ T 세포를, 항CD3/CD28 항체 및 IL-2 또는 IL-7로 재자극 및 배양하여, 분열능 및 증식능을 평가하였다. 분열능의 평가에는 셀 트레이스(Cell Trace)(상표) 바이올렛(Violet) 세포 증식 키트(Life Technologies사제)를 사용하였다. 그 결과, 레티노산으로 T 세포의 분화를 촉진시키면 분열능 및 증식능이 모두 저하되는 한편, RAR 안타고니스트로 분화를 억제하면, 분열능 및 증식능이 모두 증가하는 것으로 판명되었다(도 21).
(4) 기억 T 세포 집단 형성능
항CD3/CD28 항체로 자극하고, DMSO(대조), 레티노산 또는 RAR 안타고니스트(LE540)의 존재 하에서 8일간 배양한 인간 CD4+CD45RO+ T 세포를, 항CD3/CD28 항체 및 IL-2 또는 IL-7로 7일간 재자극 및 배양하여, T 세포 서브셋을 동정하였다. 그 결과, RAR 안타고니스트의 존재 하에서 배양한 T 세포 집단으로부터는 다시 기억 T 세포가 고빈도로 출현한 반면, DMSO 및 레티노산 존재 하의 배양에 있어서는 기억 T 세포의 출현 빈도는 낮았다(도 22).
기억 T 세포는 다분화능과 자기 복제능을 갖고 있다. 이 자기 복제능에 의해, 기억 T 세포가 많이 포함되는 세포 집단은, 분열·증식을 반복해도, 기억 T 세포를 고빈도로 유지할 수 있다. 그 때문에, RAR 안타고니스트 존재 하에서 배양한 T 세포 집단은, 기억 T 세포를 많이 포함하는 것이 된다.
(5) 마우스 체내에 있어서의 재구축능
항CD3/CD28 항체로 자극하고, DMSO(대조), 레티노산 또는 RAR 안타고니스트(LE540)의 존재 하에서 8일간 배양한 인간 CD4+CD45RO+ T 세포를, T 세포를 제거한 인간 PBMC와 함께, T 세포, B 세포 및 NK 세포를 결손시킨 면역 부전 마우스(NOG 마우스)의 체내에 이입하고, 4주일 후에 비장에 있어서의 T 세포를 해석하였다. 그 결과, RAR 안타고니스트의 존재 하에서 배양한 인간 CD4+ T 세포는, 면역 부전 마우스 체내에 있어서의 증식능이 높고, 미분화인 것으로 나타났다(도 23).
실시예 4
RAR 안타고니스트에 의한 기억 T 세포 비율의 증대
인간 WT1332 특이적 TCR 유전자 도입 CD4+ T 세포를, 인간 WT1332로 자극하고, DMSO(대조), 레티노산 또는 RAR 안타고니스트(LE540)의 존재 하에서 배양하였다. 그 결과, RAR 안타고니스트의 존재 하에서 배양하면 기억형 CD4+ T 세포의 비율이 증대되는 것으로 나타났다(도 24). 또한, RAR 안타고니스트의 존재 하에서 배양된 T 세포 집단을, 인간 WT1332로 펄스시킨 PBMC를 사용하여 재자극 및 배양한 결과(T 세포: 30,000세포/웰, PBMC: 100,000세포/웰, IL-2: 없음), DMSO 또는 레티노산 존재 하에서 배양한 세포보다도 증식능이 높은 것으로 나타났다(도 24).
실시예 5
RAR 안타고니스트에 의한 기억 T 세포의 유도
방법:
단일 세포 유래 인간 WT1332 특이적 CD4+ T 세포 클론에 포함되는 말단 이펙터 분획을, 인간 WT1332로 펄스시킨 수지상 세포로 자극하고, DMSO(대조), 레티노산 또는 RAR 안타고니스트(LE540)의 존재 하에서 7일간 배양하였다. 계속해서, 세포를 CFSE로 표지하고, 인간 WT1332로 펄스시킨 수지상 세포로 재자극하여, DMSO(대조), 레티노산 또는 RAR 안타고니스트(LE540)의 존재 하에서 더 배양하였다. 4일 또는 6일간의 배양 후, FACS 해석 및 3H 티미딘 도입 분석(세포 증식 분석)을 행하였다. 시험의 흐름을 도 25에 나타낸다.
결과:
말단 이펙터 CD4+ T 세포를 10μM의 LE540의 존재 하에서 배양한 결과, 다시 중심 기억 CD4+ T 세포가 유도되었다(도 26). 또한, 재자극 후의 평가에 있어서도, LE540의 존재 하에서의 배양에 의해, 분열능 및 증식능이 높은 기억 T 세포가 발생하는 것이 확인되었다(도 27).
실시예 6
암 면역 요법에 있어서의 RAR 안타고니스트의 효과
방법:
WT1 단백질 및 루시페라제를 모두 발현하는 종양 세포를, NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull 마우스(NOG 마우스)의 복부측 피하에 이식하였다. 이식 3일 후, 106개의 인간 WT1332 특이적 CD4+ T 세포(GFP 양성)를 정맥 주사하였다(0일째). 해당 정맥 주사 8시간 후에, DMSO(대조), 레티노산 또는 LE540을 복강 내에 투여하였다. 정맥 주사 1일 후에, CD3+ T 세포를 제거하고, 인간 WT1332 펩티드를 펄스시킨 인간 말초혈 단핵구 2×106개를 정맥 주사하였다(1일째). 그 후, 생존 기간을 관찰함과 함께, 매주, 루시페라제의 기질인 루시페린을 투여하고, 루시페라제에 의해 유도되는 발광의 강도를 체외로부터 측정함으로써, 종양량을 측정하였다. 시험의 흐름을 도 28에 나타낸다.
결과:
마우스의 생존 곡선 및 종양량의 측정 결과(21일째)를 도 29에 나타낸다. 레티노산 투여군에 있어서는, 대조보다도 생존 기간이 단축되었다. 한편, LE540 투여군에서는, 대조보다도 생존 기간이 연장되었다. 또한, LE540 투여군에서는, DMSO군 및 레티노산군과 비교하여, 유의하게 종양의 사이즈가 작았다(0일째로부터 몇 배가 되었는지로 평가함). 이러한 결과는, WT1 펩티드 등의 암 항원 펩티드, 암 항원 펩티드 특이적 T 세포, 또는 암 항원 펩티드를 펄스시킨 항원 제시 세포 등의 투여에 의한 항종양 효과가, RAR 안타고니스트의 투여에 의해 증강되는 것을 실증하는 것이다.
실시예 7
각종 RAR 아고니스트 및 안타고니스트에 의한 T 세포 집단의 분화 조절
방법:
인간 CD4+CD45RO+ T 세포를 항CD3/CD28 항체 및 IL-2로 자극하고, DMSO를 대조로 하여, 각종 RAR 아고니스트(도 30) 또는 RAR 안타고니스트(도 31) 존재 하에서 8일간 배양하였다.
결과:
올 트랜스 레티노산(ATRA), 그리고 각각 RARα, RARβ 및 RARγ의 선택적 아고니스트인 AM580, AC55649 및 CD437의 존재 하에서 배양한 세포 집단 모두에 있어서, 기억 T 세포에 특징적인 세포 표면 분자인 CD62L의 발현이 저하되고, 기억 T 세포(CD62L+CD127+ 세포)의 비율이 감소되었다(도 30).
한편, RARα, RARβ 및 RARγ의 공통의 안타고니스트인 LE540, 그리고 각각 RARα, RARβ 및 RARγ의 선택적 안타고니스트인 BMS195614, LE135 및 MM11253의 존재 하에서 배양한 세포 집단 모두에 있어서, CD62L의 발현이 증가하고, 기억 T 세포(CD62L+CD127+ 세포)의 비율이 증대되었다(도 31).
실시예 8
RAR 안타고니스트에 의한 세포 상해 활성의 증강
방법:
렌티바이러스 벡터를 사용하여 HLA-DPB1*05:01(DP5) 구속성 WT1332 특이적 TCR을 발현시킨 CD4+ T 세포(WT1332 특이적 CD4+ T 세포)를, 올 트랜스 레티노산(ATRA), RAR 안타고니스트(LE540) 또는 대조로서의 DMSO의 존재 하에서, WT1332를 펄스시킨 말초혈 단핵구를 사용하여 자극하고, 배양하였다. 배양 개시로부터 11일 후에, WT1을 발현하지만 HLA-DPB1*05:01을 갖지 않는 백혈병 세포주 TF1(TF1은 HLA-DPB1*02:01 및 DPB1*04:01 양성)과, HLA-DPB1*05:01을 발현시킨 TF1(TF1-DP5라고 표기)을 표적 세포로 하여, 상기 3 조건에서 배양한 WT1332 특이적 CD4+ T 세포의 세포 상해 활성을 측정하였다.
결과:
TF1 및 TF1-DP5의 어느 표적 세포에 대해서도, RAR 안타고니스트 존재 하에서의 CD4+ T 세포의 배양에 의해, 해당 CD4+ T 세포의 세포 상해 활성이 증강되었다(도 32).
실시예 9
레티놀 데히드로게나제 10의 저분자 저해제
(1) RDH10 단백질의 검출
293T 세포(1×106), RDH10 유전자를 도입한 293T 세포(1×106), 및 활성화 인간 CD4+ T 세포(1×107)를 PBS로 잘 세정한 후, 600μl의 0.25M 수크로오스·0.1M 인산 Na 버퍼(pH 7.4)에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 균질화하고, 10,000g, 10분, 4℃의 조건에서 원심시킨 후, 상청을 100,000g, 1시간, 4℃의 조건에서 원심시킴으로써 마이크로솜 분획을 얻었다. 마이크로솜 분획은 20μl의 0.1M 인산 Na 버퍼(pH 7.4)에 현탁시켜 웨스턴 블롯에 사용하였다.
마이크로솜 분획에 포함되는 RDH10 단백은, SDS-PAGE로 분리한 후, PVDF 멤브레인에 전사하고, 블로킹을 행한 후, 1차 항체로서 항RDH10 항체(ab87586), 2차 항체로서 항토끼 IgG-HRP 항체와 반응시켜, Luminata Forte Western HRP Substrate(밀리포어사제)를 사용하여 검출하였다.
그 결과, RDH10 유전자 도입 293T 세포와 활성화 인간 CD4+ T 세포의 마이크로솜 분획에 RDH10 단백이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 33).
(2) RDH10의 효소 활성의 측정
반응 버퍼(reaction buffer)(90mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), 40mM KCl)에 올 트랜스 레티놀, BSA 및 조효소로서 NAD(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)를 각각 최종 농도 10μM, 10μM 및 1mM이 되도록 첨가하였다. 이 혼합액을 200μl씩 실리콘화 튜브에 취하고, 293T 세포 및 RDH10 발현 293T 세포로부터 분리한 마이크로솜 분획을 10μl씩 개개의 튜브에 가하고, 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응을 정지시키기 위해 메탄올을 200μl 첨가한 후, 헥산을 사용하여 레티노이드를 추출하고, 농축시켰다. 농축시킨 레티노이드를 150μl의 아세토니트릴에 용해 후, HPLC를 사용하여 분리하고, 파장 350nm의 자외광 흡수를 검출함으로써, 기질(올 트랜스 레티놀)과 생성물(올 트랜스 레티날)을 검출하였다. 또한, 미리, 표준 샘플(올 트랜스 레티놀 및 올 트랜스 레티날)을 HPLC로 분리하고, 각 표준 샘플의 유지 시간을 결정하였다. HPLC의 용매는 아세토니트릴:50mM 아세트산암모늄=75:25, 분리 칼럼은 Syhergi 4u Hydro-RP 80A(Phenomenex사제)를 사용하였다. 유속은 2.0ml/분으로 행하였다.
그 결과, 293T 세포주 유래 마이크로솜에서는 올 트랜스 레티놀로부터 올 트랜스 레티날이 생성되지 않은 것에 비해, RDH10 유전자 도입 293T 세포주 유래 마이크로솜에서는, 올 트랜스 레티날이 생성되었다(도 34).
(3) 저분자 저해제에 의한 RDH10의 효소 활성의 저해
반응 버퍼(90mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), 40mM KCl)에 올 트랜스 레티놀, BSA 및 조효소로서 NAD(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)를 각각 최종 농도 10μM, 10μM 및 1mM이 되도록 첨가하였다. 이 혼합액을 200μl씩 실리콘화 튜브에 취하고, RDH10 발현 293T 세포로부터 분리한 마이크로솜 분획을 10μl씩 개개의 튜브에 가하였다. 각각의 튜브에 DMSO에 용해시킨 RDH10 저해제(RDHI-001 내지 011)를 최종 농도 20μM이 되도록 첨가하고, 또한 컨트롤 튜브에는 DMSO를 동량 첨가하였다. 37℃에서 15분간 반응시키고, 메탄올을 200μl 첨가한 후, 헥산을 사용하여 레티노이드를 추출하고, 농축시켰다. 농축시킨 레티노이드를 150μl의 아세토니트릴에 용해 후, HPLC를 사용하여 분리하고, 파장 350nm의 자외광 흡수를 검출함으로써, 기질(올 트랜스 레티놀)과 생성물(올 트랜스 레티날)을 검출하였다. 또한, 미리, 표준 샘플(올 트랜스 레티놀 및 올 트랜스 레티날)을 HPLC로 분리하고, 각 표준 샘플의 유지 시간을 결정하였다. HPLC의 용매는 아세토니트릴:50mM 아세트산암모늄=75:25, 분리 칼럼은 Syhergi 4u Hydro-RP 80A(Phenomenex사제)를 사용하였다. 유속은 2.0ml/분으로 행하였다.
효소 활성은, 반응하지 않은 기질(올 트랜스 레티놀)의 파형(波形) 면적에 대한 생성물(올 트랜스 레티날)의 파형 면적으로서 구하고, 컨트롤에 있어서의 효소 활성에 대한 상대값을 그래프로 정리하였다(도 35).
(4) 인 비트로에서의 RDH10 저해제에 의한 기억 T 세포의 증폭
인간 CD4+CD45RO+ T 세포(1×105/웰)를, 항CD3 항체(2μg/ml), 항CD28 항체(2μg/ml) 및 IL-2(20IU/ml)의 존재 하에서, DMSO(대조) 또는 RDH10 저해제(10μM)와 함께 8일간 배양한 후, FACS 해석에 의해 기억 T 세포의 빈도를 구하였다.
그 결과, RDH10 저해제(RDHI-001 내지 004)의 존재 하에서의 배양에 의해, 기억 T 세포(CD62L+CD127+)의 빈도가 증대되는 것이 나타났다(도 36). 또한, 기억 T 세포의 빈도에 대한 RDH10 저해제 농도의 영향을 도 37에 나타낸다.
(5) 인 비보에서의 RDH10 저해제에 의한 기억 T 세포의 증폭
RDH10 저해제 투여군 및 콘유 투여 컨트롤군의 B6 마우스에, OVA 단백을 발현하는 재조합 리스테리아 모노사이토게네스(LM-OVA)를 꼬리 정맥으로부터 1×105cfu(콜로니 형성 단위) 감염시켜, RDH10 저해제(200μg/일)를 감염 전날(day-1)로부터 감염 후 7일째(day 7)까지 연속 투여하였다. 경시적(감염 후 5, 7, 10 및 14일째)으로 꼬리 정맥으로부터 채혈하고, 말초혈에 포함되는 OVA 특이적 CD8+ T 세포를 테트라머법으로 해석하였다. 이러한 시험의 개략을 도 38에 나타낸다.
해석의 결과, RDH10 저해제(RDHI-001 내지 003)의 투여에 의해, 기억형(CD62L+CD127+)의 OVA 특이적 CD8+ T 세포의 빈도가 증대되는 것이 나타났다(도 39 및 40).
실시예 10
암 면역 요법에 있어서의 레티놀 데히드로게나제 10 저해제의 효과
방법:
EG7 종양 세포(OVA 단백을 발현하고 있는 EL4 세포) 2×106개를 피하 주사에 의해, B6 마우스의 복부 피하에 이식하였다(0일째). 이식 후 5일째에, 이식 세포의 생착율을 높이기 위해 마우스에 방사선(3Gy)을 조사한 후, OT-ICD8+ T 세포(OVA 특이적 CD8+ T 세포) 2×105개를 정맥 주사하였다. 계속해서, 이식 후 6일째, 8일째 및 10일째에, RDH10 저해제(RDHI-001, RDHI-002 또는 RDHI-003) 100μg/마우스를 정맥 주사하였다. 컨트롤로서, RDH 저해제의 용제인 DMSO(DMSO 50μl+PBS 150μl/마우스)를 정맥 주사하였다. 종양 체적을 노기스를 사용하여 긴 직경, 짧은 직경 및 높이를 측정하고, 긴 직경×짧은 직경×높이÷2의 계산식을 사용하여 계시적(繼時的)으로 측정하였다. 실험의 흐름을 도 41에 나타낸다.
또한, 상기 종양 이식 마우스에, OT-ICD8+ T 세포를 이입하지 않고, 이식 5일 전, 0일째 및 7일 후에, RDH10 저해제만(RDHI-001, RDHI-002 또는 RDHI-003) 100μg/마우스를 복강 내 주사하였다. 컨트롤로서, 콘유(100μg/100μl/마우스)를 복강 내 주사하였다. 상기와 마찬가지로, 종양 체적을 경시적으로 측정하였다. 실험의 흐름을 도 42에 나타낸다.
결과:
마우스의 경시적 종양 체적의 측정 결과를 도 43에 나타낸다. RDH10 저해제 RDHI-001, RDHI-002, RDHI-003의 3종류 모두, 종양의 증식을 억제하였다. 실시예 9(5)에서는, 이들 저해제의 투여로, 이입된 OT-ICD8+ T 세포(OVA 특이적 CD8+ T 세포)가 마우스 말초혈에서 현저하게 증가하였다. 한편, OT-ICD8+ T 세포를 이입하지 않고, 저해제만의 투여에서는, 종양 증식 억제 효과는 보이지 않았다(도 44). 따라서, RDH10 저해제에 의한 종양 증식 억제 효과는, OT-ICD8+ T 세포의 증폭을 통해 일어나는 것으로 생각된다.
본 발명에 의해, 레티노이드 대사 경로의 조절제 및/또는 레티노산 시그널 전달계의 조절제를 사용하여 T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 방법, 해당 조절제를 포함하는 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료 보조제, 해당 조절제를 포함하는 면역력 증강제 등이 제공된다. 이들은, 의약품 등의 분야, 예를 들어 암 및 감염증을 포함하는 각종 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 개발 및 제조, 및 해당 질환의 치료 방법, 특히 면역 요법의 개발 등의 분야에 있어서 이용 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> INTERNATIONAL INSTITUTE OF CANCER IMMUNOLOGY, INC. <120> METHOD FOR MODIFYING T CELL POPULATION <130> 672671 <150> JP 2014-263398 <151> 2014-12-25 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Ile Val Val Glu Phe Phe Val Val Thr Phe Lys Val Leu Trp 1 5 10 15 Ala Phe Val Leu Ala Ala Ala Arg Trp Leu Val Arg Pro Lys Glu Lys 20 25 30 Ser Val Ala Gly Gln Val Cys Leu Ile Thr Gly Ala Gly Ser Gly Leu 35 40 45 Gly Arg Leu Phe Ala Leu Glu Phe Ala Arg Arg Arg Ala Leu Leu Val 50 55 60 Leu Trp Asp Ile Asn Thr Gln Ser Asn Glu Glu Thr Ala Gly Met Val 65 70 75 80 Arg His Ile Tyr Arg Asp Leu Glu Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Gln 85 90 95 Ala Gly Asn Gly Glu Glu Glu Ile Leu Pro His Cys Asn Leu Gln Val 100 105 110 Phe Thr Tyr Thr Cys Asp Val Gly Lys Arg Glu Asn Val Tyr Leu Thr 115 120 125 Ala Glu Arg Val Arg Lys Glu Val Gly Glu Val Ser Val Leu Val Asn 130 135 140 Asn Ala Gly Val Val Ser Gly His His Leu Leu Glu Cys Pro Asp Glu 145 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cacacacaaa cacacacaca ctggacagta 3007 gatgggccga cacacacttg gcccgagttc ctccatttcc ctggcctgcc ccccaccccc 3067 aacctgtccc acccccgtgc cccctcctta ccccgcagga cgggcctaca ggggggtctc 3127 ccctcacccc tgcaccccca gctgggggag ctggctctgc cccgacctcc ttcaccaggg 3187 gttggggccc cttcccctgg agcccgtggg tgcacctgtt actgttgggc tttccactga 3247 gatctactgg ataaagaata aagttctatt tattctaaaa aaaaaaaaaa aaaa 3301 <210> 6 <211> 3494 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (687)..(2060) <400> 6 ctcggttccc tgcgtttctc ccgctgcagc cggacgcgcc gggaatgggt taagccaggg 60 gcggtgcctg gacggggcgg ggcggtggaa agggggtggt gcccggaggg gagggggcgc 120 gcagagctgg ggtggggggg ccgtggcgcg taccaccaga gaccgagcga gtcgccagct 180 gcccctggcc tggcgggggc ggaaccgcgc gggatcccca cccccacccg gaatcctcgc 240 cacggagaat ccctggagaa gccccggatc cccggctggg aggaggaagt gctcgttgac 300 ccccagcccc gcgctgatcc cgcccccggc ctgcggactt ggggagccgc tgtactctgc 360 ctcggacgcc acgagactct agacgggagt cccctcgagg tgaagccgct gagttcccgg 420 gccccgccag gcttccctgg gagagccgac 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Leu Pro Arg Ile Tyr Lys Pro Cys Phe Val Cys Gln Asp Lys 75 80 85 tcc tca ggc tac cac tat ggg gtc agc gcc tgt gag ggc tgc aag ggc 1001 Ser Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Ser Ala Cys Glu Gly Cys Lys Gly 90 95 100 105 ttc ttc cgc cgc agc atc cag aag aac atg gtg tac acg tgt cac cgg 1049 Phe Phe Arg Arg Ser Ile Gln Lys Asn Met Val Tyr Thr Cys His Arg 110 115 120 gac aag aac tgc atc atc aac aag gtg acc cgg aac cgc tgc cag tac 1097 Asp Lys Asn Cys Ile Ile Asn Lys Val Thr Arg Asn Arg Cys Gln Tyr 125 130 135 tgc cga ctg cag aag tgc ttt gaa gtg ggc atg tcc aag gag tct gtg 1145 Cys Arg Leu Gln Lys Cys Phe Glu Val Gly Met Ser Lys Glu Ser Val 140 145 150 aga aac gac cga aac aag aag aag aag gag gtg ccc aag ccc gag tgc 1193 Arg Asn Asp Arg Asn Lys Lys Lys Lys Glu Val Pro Lys Pro Glu Cys 155 160 165 tct gag agc tac acg ctg acg ccg gag gtg ggg gag ctc att gag aag 1241 Ser Glu Ser Tyr Thr Leu Thr Pro Glu Val Gly Glu Leu Ile Glu Lys 170 175 180 185 gtg cgc aaa gcg cac cag gaa acc ttc cct gcc ctc tgc cag ctg 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gcc aac cag ctg ctg ccc 1625 Gly Pro Leu Thr Asp Leu Val Phe Ala Phe Ala Asn Gln Leu Leu Pro 300 305 310 ctg gag atg gat gat gcg gag acg ggg ctg ctc agc gcc atc tgc ctc 1673 Leu Glu Met Asp Asp Ala Glu Thr Gly Leu Leu Ser Ala Ile Cys Leu 315 320 325 atc tgc gga gac cgc cag gac ctg gag cag ccg gac cgg gtg gac atg 1721 Ile Cys Gly Asp Arg Gln Asp Leu Glu Gln Pro Asp Arg Val Asp Met 330 335 340 345 ctg cag gag ccg ctg ctg gag gcg cta aag gtc tac gtg cgg aag cgg 1769 Leu Gln Glu Pro Leu Leu Glu Ala Leu Lys Val Tyr Val Arg Lys Arg 350 355 360 agg ccc agc cgc ccc cac atg ttc ccc aag atg cta atg aag att act 1817 Arg Pro Ser Arg Pro His Met Phe Pro Lys Met Leu Met Lys Ile Thr 365 370 375 gac ctg cga agc atc agc gcc aag ggg gct gag cgg gtg atc acg ctg 1865 Asp Leu Arg Ser Ile Ser Ala Lys Gly Ala Glu Arg Val Ile Thr Leu 380 385 390 aag atg gag atc ccg ggc tcc atg ccg cct ctc atc cag gaa atg ttg 1913 Lys Met Glu Ile Pro Gly Ser Met Pro Pro Leu Ile Gln Glu Met Leu 395 400 405 gag aac tca gag ggc ctg gac act ctg agc gga cag ccg ggg ggt ggg 1961 Glu Asn Ser Glu Gly Leu Asp Thr Leu Ser Gly Gln Pro Gly Gly Gly 410 415 420 425 ggg cgg gac ggg ggt ggc ctg gcc ccc ccg cca ggc agc tgt agc ccc 2009 Gly Arg Asp Gly Gly Gly Leu Ala Pro Pro Pro Gly Ser Cys Ser Pro 430 435 440 agc ctc agc ccc agc tcc aac aga agc agc ccg gcc acc cac tcc ccg 2057 Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg Ser Ser Pro Ala Thr His Ser Pro 445 450 455 tga ccgcccacgc cacatggaca cagccctcgc cctccgcccc ggcttttctc 2110 tgcctttcta ccgaccatgt gaccccgcac cagccctgcc cccacctgcc ctcccgggca 2170 gtactgggga ccttccctgg gggacgggga gggaggaggc agcgactcct tggacagagg 2230 cctgggccct cagtggactg cctgctccca cagcctgggc tgacgtcaga ggccgaggcc 2290 aggaactgag tgaggcccct ggtcctgggt ctcaggatgg gtcctggggg cctcgtgttc 2350 atcaagacac ccctctgccc agctcaccac atcttcatca ccagcaaacg ccaggacttg 2410 gctcccccat cctcagaact cacaagccat tgctccccag ctggggaacc tcaacctccc 2470 ccctgcctcg gttggtgaca gagggggtgg gacaggggcg gggggttccc cctgtacata 2530 ccctgccata ccaaccccag gtattaattc tcgctggttt tgtttttatt ttaatttttt 2590 tgttttgatt tttttaataa gaattttcat tttaagcaca tttatactga aggaatttgt 2650 gctgtgtatt ggggggagct ggatccagag ctggaggggg tgggtccggg ggagggagtg 2710 gctcggaagg ggcccccact ctcctttcat gtccctgtgc cccccagttc tcctcctcag 2770 ccttttcctc ctcagttttc tctttaaaac tgtgaagtac taactttcca aggcctgcct 2830 tcccctccct cccactggag aagccgccag cccctttctc cctctgcctg accactgggt 2890 gtggacggtg tggggcagcc ctgaaaggac aggctcctgg ccttggcact tgcctgcacc 2950 caccatgagg catggagcag ggcagagcaa gggccccggg acagagtttt cccagacctg 3010 gctcctcggc agagctgcct cccgtcaggg cccacatcat ctaggctccc cagcccccac 3070 tgtgaagggg ctggccaggg gcccgagctg cccccacccc cggcctcagc caccagcacc 3130 cccatagggc ccccagacac cacacacatg cgcgtgcgca cacacacaaa cacacacaca 3190 ctggacagta gatgggccga cacacacttg gcccgagttc ctccatttcc ctggcctgcc 3250 ccccaccccc aacctgtccc acccccgtgc cccctcctta ccccgcagga cgggcctaca 3310 ggggggtctc ccctcacccc tgcaccccca gctgggggag ctggctctgc cccgacctcc 3370 ttcaccaggg gttggggccc cttcccctgg agcccgtggg tgcacctgtt actgttgggc 3430 tttccactga gatctactgg ataaagaata aagttctatt tattctaaaa aaaaaaaaaa 3490 aaaa 3494 <210> 7 <211> 3122 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (591)..(1688) <400> 7 ctgctccgta ccctccgccc cttcagtctg gggctccggg taaagtttca gcctccgcac 60 gtgactcgct atggccgctg ccatcgcccc gcgcccctga gccgcggccc cctggacggc 120 tcctctcccg ggaccccgca ccctgatgcc gagcagcacc agggcgccgg gttagggcag 180 acgctgtgct cgctggcacc ccgaacgggt tgcttccccc gctgcgagca tcacaggaca 240 tggccccctc agccacctag ctggggccca tctaggagtg gcatcttttt tggtgccctg 300 aaggccagct ctggaccttc ccaggaaaag tgccagctca cagaactgct tgaccaaagg 360 accggctctt gagacatccc ccaacccacc tggcccccag ctagggtggg ggctccagga 420 gactgagatt agcctgccct ctttggacag cagctccagg acagggcggg tgggctgacc 480 acccaaaccc catctgggcc caggccccat gccccgagga ggggtggtct gaagcccacc 540 agagccccct gccagactgt ctgcctccct tctgactgtg gccgcttggc atg gcc 596 Met Ala 1 agc aac agc agc tcc tgc ccg aca cct ggg ggc ggg cac ctc aat 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Asn Ser Ser Glu Gln Arg Val Ser Leu Asp Ile Asp Leu Trp Asp Lys 115 120 125 130 ttc agt gaa ctc tcc acc aag tgc atc att aag act gtg gag ttc gcc 1028 Phe Ser Glu Leu Ser Thr Lys Cys Ile Ile Lys Thr Val Glu Phe Ala 135 140 145 aag cag ctg ccc ggc ttc acc acc ctc acc atc gcc gac cag atc acc 1076 Lys Gln Leu Pro Gly Phe Thr Thr Leu Thr Ile Ala Asp Gln Ile Thr 150 155 160 ctc ctc aag gct gcc tgc ctg gac atc ctg atc ctg cgg atc tgc acg 1124 Leu Leu Lys Ala Ala Cys Leu Asp Ile Leu Ile Leu Arg Ile Cys Thr 165 170 175 cgg tac acg ccc gag cag gac acc atg acc ttc tcg gac ggg ctg acc 1172 Arg Tyr Thr Pro Glu Gln Asp Thr Met Thr Phe Ser Asp Gly Leu Thr 180 185 190 ctg aac cgg acc cag atg cac aac gct ggc ttc ggc ccc ctc acc gac 1220 Leu Asn Arg Thr Gln Met His Asn Ala Gly Phe Gly Pro Leu Thr Asp 195 200 205 210 ctg gtc ttt gcc ttc gcc aac cag ctg ctg ccc ctg gag atg gat gat 1268 Leu Val Phe Ala Phe Ala Asn Gln Leu Leu Pro Leu Glu Met Asp Asp 215 220 225 gcg gag acg ggg ctg ctc agc gcc atc tgc ctc atc tgc gga gac cgc 1316 Ala Glu Thr Gly Leu Leu Ser Ala Ile Cys Leu Ile Cys Gly Asp Arg 230 235 240 cag gac ctg gag cag ccg gac cgg gtg gac atg ctg cag gag ccg ctg 1364 Gln Asp Leu Glu Gln Pro Asp Arg Val Asp Met Leu Gln Glu Pro Leu 245 250 255 ctg gag gcg cta aag gtc tac gtg cgg aag cgg agg ccc agc cgc ccc 1412 Leu Glu Ala Leu Lys Val Tyr Val Arg Lys Arg Arg Pro Ser Arg Pro 260 265 270 cac atg ttc ccc aag atg cta atg aag att act gac ctg cga agc atc 1460 His Met Phe Pro Lys Met Leu Met Lys Ile Thr Asp Leu Arg Ser Ile 275 280 285 290 agc gcc aag ggg gct gag cgg gtg atc acg ctg aag atg gag atc ccg 1508 Ser Ala Lys Gly Ala Glu Arg Val Ile Thr Leu Lys Met Glu Ile Pro 295 300 305 ggc tcc atg ccg cct ctc atc cag gaa atg ttg gag aac tca gag ggc 1556 Gly Ser Met Pro Pro Leu Ile Gln Glu Met Leu Glu Asn Ser Glu Gly 310 315 320 ctg gac act ctg agc gga cag ccg ggg ggt ggg ggg cgg gac ggg ggt 1604 Leu Asp Thr Leu Ser Gly Gln Pro Gly Gly Gly Gly Arg Asp Gly Gly 325 330 335 ggc ctg gcc ccc ccg cca ggc agc tgt agc ccc agc ctc agc ccc agc 1652 Gly Leu Ala Pro Pro Pro Gly Ser Cys Ser Pro Ser Leu Ser Pro Ser 340 345 350 tcc aac aga agc agc ccg gcc acc cac tcc ccg tga ccgcccacgc 1698 Ser Asn Arg Ser Ser Pro Ala Thr His Ser Pro 355 360 365 cacatggaca cagccctcgc cctccgcccc ggcttttctc tgcctttcta ccgaccatgt 1758 gaccccgcac cagccctgcc cccacctgcc ctcccgggca gtactgggga ccttccctgg 1818 gggacgggga gggaggaggc agcgactcct tggacagagg cctgggccct cagtggactg 1878 cctgctccca cagcctgggc tgacgtcaga ggccgaggcc aggaactgag tgaggcccct 1938 ggtcctgggt ctcaggatgg gtcctggggg cctcgtgttc atcaagacac ccctctgccc 1998 agctcaccac atcttcatca ccagcaaacg ccaggacttg gctcccccat cctcagaact 2058 cacaagccat tgctccccag ctggggaacc tcaacctccc ccctgcctcg gttggtgaca 2118 gagggggtgg gacaggggcg gggggttccc cctgtacata ccctgccata ccaaccccag 2178 gtattaattc tcgctggttt tgtttttatt ttaatttttt tgttttgatt tttttaataa 2238 gaattttcat tttaagcaca tttatactga aggaatttgt gctgtgtatt ggggggagct 2298 ggatccagag ctggaggggg tgggtccggg ggagggagtg gctcggaagg ggcccccact 2358 ctcctttcat gtccctgtgc cccccagttc tcctcctcag ccttttcctc ctcagttttc 2418 tctttaaaac tgtgaagtac taactttcca aggcctgcct tcccctccct cccactggag 2478 aagccgccag cccctttctc cctctgcctg accactgggt gtggacggtg tggggcagcc 2538 ctgaaaggac aggctcctgg ccttggcact tgcctgcacc caccatgagg catggagcag 2598 ggcagagcaa gggccccggg acagagtttt cccagacctg gctcctcggc agagctgcct 2658 cccgtcaggg cccacatcat ctaggctccc cagcccccac tgtgaagggg ctggccaggg 2718 gcccgagctg cccccacccc cggcctcagc caccagcacc cccatagggc ccccagacac 2778 cacacacatg cgcgtgcgca cacacacaaa cacacacaca ctggacagta gatgggccga 2838 cacacacttg gcccgagttc ctccatttcc ctggcctgcc ccccaccccc aacctgtccc 2898 acccccgtgc cccctcctta ccccgcagga cgggcctaca ggggggtctc ccctcacccc 2958 tgcaccccca gctgggggag ctggctctgc cccgacctcc ttcaccaggg gttggggccc 3018 cttcccctgg agcccgtggg tgcacctgtt actgttgggc tttccactga gatctactgg 3078 ataaagaata aagttctatt tattctaaaa aaaaaaaaaa aaaa 3122 <210> 8 <211> 3142 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS 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gaa ctc gtc cca agc ccc cca tct cca ctt 605 Gln Ser Thr Ser Ser Glu Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Ser Pro Leu 60 65 70 cct ccc cct cga gtg tac aaa ccc tgc ttc gtc tgc cag gac aaa tca 653 Pro Pro Pro Arg Val Tyr Lys Pro Cys Phe Val Cys Gln Asp Lys Ser 75 80 85 tca ggg tac cac tat ggg gtc agc gcc tgt gag gga tgt aag ggc ttt 701 Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Ser Ala Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe 90 95 100 ttc cgc aga agt att cag aag aat atg att tac act tgt cac cga gat 749 Phe Arg Arg Ser Ile Gln Lys Asn Met Ile Tyr Thr Cys His Arg Asp 105 110 115 120 aag aac tgt gtt att aat aaa gtc acc agg aat cga tgc caa tac tgt 797 Lys Asn Cys Val Ile Asn Lys Val Thr Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys 125 130 135 cga ctc cag aag tgc ttt gaa gtg gga atg tcc aaa gaa tct gtc agg 845 Arg Leu Gln Lys Cys Phe Glu Val Gly Met Ser Lys Glu Ser Val Arg 140 145 150 aat gac agg aac aag aaa aag aag gag act tcg aag caa gaa tgc aca 893 Asn Asp Arg Asn Lys Lys Lys Lys Glu Thr Ser Lys Gln Glu Cys Thr 155 160 165 gag agc tat gaa atg aca gct gag ttg gac gat ctc aca gag aag atc 941 Glu Ser Tyr Glu Met Thr Ala Glu Leu Asp Asp Leu Thr Glu Lys Ile 170 175 180 cga aaa gct cac cag gaa act ttc cct tca ctc tgc cag ctg ggt aaa 989 Arg Lys Ala His Gln Glu Thr Phe Pro Ser Leu Cys Gln Leu Gly Lys 185 190 195 200 tac acc acg aat tcc agt gct gac cat cga gtc cga ctg gac ctg ggc 1037 Tyr Thr Thr Asn Ser Ser Ala Asp His Arg Val Arg Leu Asp Leu Gly 205 210 215 ctc tgg gac aaa ttc agt gaa ctg gcc acc aag tgc att att aag atc 1085 Leu Trp Asp Lys Phe Ser Glu Leu Ala Thr Lys Cys Ile Ile Lys Ile 220 225 230 gtg gag ttt gct aaa cgt ctg cct ggt ttc act ggc ttg acc atc gca 1133 Val Glu Phe Ala Lys Arg Leu Pro Gly Phe Thr Gly Leu Thr Ile Ala 235 240 245 gac caa att acc ctg ctg aag gcc gcc tgc ctg gac atc ctg att ctt 1181 Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Ala Cys Leu Asp Ile Leu Ile Leu 250 255 260 aga att tgc acc agg tat acc cca gaa caa gac acc atg act ttc tca 1229 Arg Ile Cys Thr Arg Tyr Thr Pro Glu Gln Asp Thr Met Thr Phe Ser 265 270 275 280 gac ggc ctt acc cta aat cga act cag atg cac aat gct gga ttt ggt 1277 Asp Gly Leu Thr Leu Asn Arg Thr Gln Met His Asn Ala Gly Phe Gly 285 290 295 cct ctg act gac ctt gtg ttc acc ttt gcc aac cag ctc ctg cct ttg 1325 Pro Leu Thr Asp Leu Val Phe Thr Phe Ala Asn Gln Leu Leu Pro Leu 300 305 310 gaa atg gat gac aca gaa aca ggc ctt ctc agt gcc atc tgc tta atc 1373 Glu Met Asp Asp Thr Glu Thr Gly Leu Leu Ser Ala Ile Cys Leu Ile 315 320 325 tgt gga gac cgc cag gac ctt gag gaa ccg aca aaa gta gat aag cta 1421 Cys Gly Asp Arg Gln Asp Leu Glu Glu Pro Thr Lys Val Asp Lys Leu 330 335 340 caa gaa cca ttg ctg gaa gca cta aaa att tat atc aga aaa aga cga 1469 Gln Glu Pro Leu Leu Glu Ala Leu Lys Ile Tyr Ile Arg Lys Arg Arg 345 350 355 360 ccc agc aag cct cac atg ttt cca aag atc tta atg aaa atc aca gat 1517 Pro Ser Lys Pro His Met Phe Pro Lys Ile Leu Met Lys Ile Thr Asp 365 370 375 ctc cgt agc atc agt gct aaa ggt gca gag cgt gta att acc ttg aaa 1565 Leu Arg Ser Ile Ser Ala Lys Gly Ala Glu Arg Val Ile Thr Leu Lys 380 385 390 atg gaa att cct gga tca atg cca cct ctc att caa gaa atg ctg gag 1613 Met Glu Ile Pro Gly Ser Met Pro Pro Leu Ile Gln Glu Met Leu Glu 395 400 405 aat tct gaa gga cat gaa ccc ttg acc cca agt tca agt ggg aac aca 1661 Asn Ser Glu Gly His Glu Pro Leu Thr Pro Ser Ser Ser Gly Asn Thr 410 415 420 gca gag cac agt cct agc atc tca ccc agc tca gtg gaa aac agt ggg 1709 Ala Glu His Ser Pro Ser Ile Ser Pro Ser Ser Val Glu Asn Ser Gly 425 430 435 440 gtc agt cag tca cca ctc gtg caa taa gacattttct agctacttca 1756 Val Ser Gln Ser Pro Leu Val Gln 445 aacattcccc agtaccttca gttccaggat ttaaaatgca agaaaaaaca tttttactgc 1816 tgcttagttt ttggactgaa aagatattaa aactcaagaa ggaccaagaa gttttcatat 1876 gtatcaatat atatactcct cactgtgtaa cttacctaga aatacaaact tttccaattt 1936 taaaaaatca gccatttcat gcaaccagaa actagttaaa agcttctatt ttcctctttg 1996 aacactcaag attgcatggc aaagacccag tcaaaatgat ttacccctgg ttaagtttct 2056 gaagactttg tacatacaga agtatggctc tgttctttct atactgtatg tttggtgctt 2116 tccttttgtc ttgcatactc aaaataacca tgacaccaag gttatgaaat agactactgt 2176 acacgtctac ctaggttcaa aaagataact gtcttgcttt catggaatag tcaagacatc 2236 aaggtaagga aacaggacta ttgacaggac tattgtacag tatgacaaga taaggctgaa 2296 gatattctac tttagttagt atggaagctt gtctttgctc tttctgatgc tctcaaactg 2356 catcttttat ttcatgttgc ccagtaaaag tatacaaatt ccctgcacta gcagaagaga 2416 attctgtatc agtgtaactg ccagttcagt taatcaaatg tcatttgttc aattgttaat 2476 gtcactttaa attaaaagtg gtttattact tgtttaatga cataactaca cagttagtta 2536 aaaaaaattt ttttacagta atgatagcct ccaaggcaga aacacttttc agtgttaagt 2596 ttttgtttac ttgttcacaa gccattaggg aaatttcatg ggataattag caggctggtc 2656 taccacctgg accatgtaac tctagtgtcc ttcctgattc atgcctgata ttgggatttt 2716 tttttccagc cttcttgatg ccaaggggct aattaatatt aacaactccc aaagaaacag 2776 gcatagaatc tgcctccttt gaccttgttc aatcactatg aagcagagtg aaagctgtgg 2836 tagagtggtt aacagataca agtgtcagtt tcttagttct catttaagca ctagtggaat 2896 tttttttttt tgatatatta gcaagtctgt gatgtacttt cactggctct gtttgtacat 2956 tgagattgtt tgtttaacaa tgctttctat gttcatatac tgtttacctt tttccatgga 3016 gtctcctggc aaagaataaa atatatttat tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3076 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3136 aaaaaa 3142 <210> 9 <211> 2865 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (449)..(1459) <400> 9 gtgacagaag tagtaggaag tgagctgttc agaggcagga gggtctattc tttgccaaag 60 gggggaccag aattccccca tgcgagctgt ttgaggactg ggatgccgag aacgcgagcg 120 atccgagcag ggtttgtctg ggcaccgtcg gggtaggatc cggaacgcat tcggaaggct 180 ttttgcaagc atttacttgg aaggagaact tgggatcttt ctgggaaccc cccgccccgg 240 ctggattggc cgagcaagcc tggaaaatgc aattgaaaca cagagcacca gctctgagga 300 actcgtccca agccccccat ctccacttcc tccccctcga gtgtacaaac cctgcttcgt 360 ctgccaggac aaatcatcag ggtaccacta tggggtcagc gcctgtgagg gatgtaaggg 420 ctttttccgc agaagtattc agaagaat atg att tac act tgt cac cga gat 472 Met Ile Tyr Thr Cys His Arg Asp 1 5 aag aac tgt gtt att aat aaa gtc acc agg aat cga tgc caa tac tgt 520 Lys Asn Cys Val Ile Asn Lys Val Thr Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys 10 15 20 cga ctc cag aag tgc ttt gaa gtg gga atg tcc aaa gaa tct gtc agg 568 Arg Leu Gln Lys Cys Phe Glu Val Gly Met Ser Lys Glu Ser Val Arg 25 30 35 40 aat gac agg aac aag aaa aag aag gag act tcg aag caa gaa tgc aca 616 Asn Asp Arg Asn Lys Lys Lys Lys Glu Thr Ser Lys Gln Glu Cys Thr 45 50 55 gag agc tat gaa atg aca gct gag ttg gac gat ctc aca gag aag atc 664 Glu Ser Tyr Glu Met Thr Ala Glu Leu Asp Asp Leu Thr Glu Lys Ile 60 65 70 cga aaa gct cac cag gaa act ttc cct tca ctc tgc cag ctg ggt aaa 712 Arg Lys Ala His Gln Glu Thr Phe Pro Ser Leu Cys Gln Leu Gly Lys 75 80 85 tac acc acg aat tcc agt gct gac cat cga gtc cga ctg gac ctg ggc 760 Tyr Thr Thr Asn Ser Ser Ala Asp His Arg Val Arg Leu Asp Leu Gly 90 95 100 ctc tgg gac aaa ttc agt gaa ctg gcc acc aag tgc att att aag atc 808 Leu Trp Asp Lys Phe Ser Glu Leu Ala Thr Lys Cys Ile Ile Lys Ile 105 110 115 120 gtg gag ttt gct aaa cgt ctg cct ggt ttc act ggc ttg acc atc gca 856 Val Glu Phe Ala Lys Arg Leu Pro Gly Phe Thr Gly Leu Thr Ile Ala 125 130 135 gac caa att acc ctg ctg aag gcc gcc tgc ctg gac atc ctg att ctt 904 Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Ala Cys Leu Asp Ile Leu Ile Leu 140 145 150 aga att tgc acc agg tat acc cca gaa caa gac acc atg act ttc tca 952 Arg Ile Cys Thr Arg Tyr Thr Pro Glu Gln Asp Thr Met Thr Phe Ser 155 160 165 gac ggc ctt acc cta aat cga act cag atg cac aat gct gga ttt ggt 1000 Asp Gly Leu Thr Leu Asn Arg Thr Gln Met His Asn Ala Gly Phe Gly 170 175 180 cct ctg act gac ctt gtg ttc acc ttt gcc aac cag ctc ctg cct ttg 1048 Pro Leu Thr Asp Leu Val Phe Thr Phe Ala Asn Gln Leu Leu Pro Leu 185 190 195 200 gaa atg gat gac aca gaa aca ggc ctt ctc agt gcc atc tgc tta atc 1096 Glu Met Asp Asp Thr Glu Thr Gly Leu Leu Ser Ala Ile Cys Leu Ile 205 210 215 tgt gga gac cgc cag gac ctt gag gaa ccg aca aaa gta gat aag cta 1144 Cys Gly Asp Arg Gln Asp Leu Glu Glu Pro Thr Lys Val Asp Lys Leu 220 225 230 caa gaa cca ttg ctg gaa gca cta aaa att tat atc aga aaa aga cga 1192 Gln Glu Pro Leu Leu Glu Ala Leu Lys Ile Tyr Ile Arg Lys Arg Arg 235 240 245 ccc agc aag cct cac atg ttt cca aag atc tta atg aaa atc aca gat 1240 Pro Ser Lys Pro His Met Phe Pro Lys Ile Leu Met Lys Ile Thr Asp 250 255 260 ctc cgt agc atc agt gct aaa ggt gca gag cgt gta att acc ttg aaa 1288 Leu Arg Ser Ile Ser Ala Lys Gly Ala Glu Arg Val Ile Thr Leu Lys 265 270 275 280 atg gaa att cct gga tca atg cca cct ctc att caa gaa atg ctg gag 1336 Met Glu Ile Pro Gly Ser Met Pro Pro Leu Ile Gln Glu Met Leu Glu 285 290 295 aat tct gaa gga cat gaa ccc ttg acc cca agt tca agt ggg aac aca 1384 Asn Ser Glu Gly His Glu Pro Leu Thr Pro Ser Ser Ser Gly Asn Thr 300 305 310 gca gag cac agt cct agc atc tca ccc agc tca gtg gaa aac agt ggg 1432 Ala Glu His Ser Pro Ser Ile Ser Pro Ser Ser Val Glu Asn Ser Gly 315 320 325 gtc agt cag tca cca ctc gtg caa taa gacattttct agctacttca 1479 Val Ser Gln Ser Pro Leu Val Gln 330 335 aacattcccc agtaccttca gttccaggat ttaaaatgca agaaaaaaca tttttactgc 1539 tgcttagttt ttggactgaa aagatattaa aactcaagaa ggaccaagaa gttttcatat 1599 gtatcaatat atatactcct cactgtgtaa cttacctaga aatacaaact tttccaattt 1659 taaaaaatca gccatttcat gcaaccagaa actagttaaa agcttctatt ttcctctttg 1719 aacactcaag attgcatggc aaagacccag tcaaaatgat ttacccctgg ttaagtttct 1779 gaagactttg tacatacaga agtatggctc tgttctttct atactgtatg tttggtgctt 1839 tccttttgtc ttgcatactc aaaataacca tgacaccaag gttatgaaat agactactgt 1899 acacgtctac ctaggttcaa aaagataact gtcttgcttt catggaatag tcaagacatc 1959 aaggtaagga aacaggacta ttgacaggac tattgtacag tatgacaaga taaggctgaa 2019 gatattctac tttagttagt atggaagctt gtctttgctc tttctgatgc tctcaaactg 2079 catcttttat ttcatgttgc ccagtaaaag tatacaaatt ccctgcacta gcagaagaga 2139 attctgtatc agtgtaactg ccagttcagt taatcaaatg tcatttgttc aattgttaat 2199 gtcactttaa attaaaagtg gtttattact tgtttaatga cataactaca cagttagtta 2259 aaaaaaattt ttttacagta atgatagcct ccaaggcaga aacacttttc agtgttaagt 2319 ttttgtttac ttgttcacaa gccattaggg aaatttcatg ggataattag caggctggtc 2379 taccacctgg accatgtaac tctagtgtcc ttcctgattc atgcctgata ttgggatttt 2439 tttttccagc cttcttgatg ccaaggggct aattaatatt aacaactccc aaagaaacag 2499 gcatagaatc tgcctccttt gaccttgttc aatcactatg aagcagagtg aaagctgtgg 2559 tagagtggtt aacagataca agtgtcagtt tcttagttct catttaagca ctagtggaat 2619 tttttttttt tgatatatta gcaagtctgt gatgtacttt cactggctct gtttgtacat 2679 tgagattgtt tgtttaacaa tgctttctat gttcatatac tgtttacctt tttccatgga 2739 gtctcctggc aaagaataaa atatatttat tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2799 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2859 aaaaaa 2865 <210> 10 <211> 2992 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (493)..(1857) <400> 10 aggttggggg gggggtgggg agggagaaaa agaaagaaaa tattttccgt gtccccgcct 60 gcagagtcag tgtgcggttt gggagaaaat gtgtcggata ttttggggcg gtcacgtggg 120 cgggcgggct ccgagaggcc ccgggacagt cccagcctag agccgtgccc ccccaggagc 180 cccccagtac ggcgagcccc ggacattgcg acgctccatc caagagactg cccgacgccg 240 ggacctcggg gctccgccgc ctcccttccc cctcccactc cagcagctac ggcccagttc 300 cctcaacctg 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Tyr Lys Pro Cys Phe Val Cys 80 85 90 aat gac aag tcc tct ggc tac cac tat ggg gtc agc tct tgt gaa ggc 819 Asn Asp Lys Ser Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Ser Ser Cys Glu Gly 95 100 105 tgc aag ggc ttc ttt cgc cga agc atc cag aag aac atg gtg tac acg 867 Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Ile Gln Lys Asn Met Val Tyr Thr 110 115 120 125 tgt cac cgc gac aaa aac tgt atc atc aac aag gtg acc agg aat cgc 915 Cys His Arg Asp Lys Asn Cys Ile Ile Asn Lys Val Thr Arg Asn Arg 130 135 140 tgc cag tac tgc cgg cta cag aag tgc ttc gaa gtg ggc atg tcc aag 963 Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln Lys Cys Phe Glu Val Gly Met Ser Lys 145 150 155 gaa gct gtg cga aat gac cgg aac aag aag aag aaa gag gtg aag gaa 1011 Glu Ala Val Arg Asn Asp Arg Asn Lys Lys Lys Lys Glu Val Lys Glu 160 165 170 gaa ggg tca cct gac agc tat gag ctg agc cct cag tta gaa gag ctc 1059 Glu Gly Ser Pro Asp Ser Tyr Glu Leu Ser Pro Gln Leu Glu Glu Leu 175 180 185 atc acc aag gtc agc aaa gcc cat cag gag act ttc ccc tcg ctc tgc 1107 Ile Thr Lys Val Ser Lys Ala His Gln Glu Thr Phe Pro Ser Leu Cys 190 195 200 205 cag ctg ggc aag tat acc acg aac tcc agt gca gac cac cgc gtg cag 1155 Gln Leu Gly Lys Tyr Thr Thr Asn Ser Ser Ala Asp His Arg Val Gln 210 215 220 ctg gat ctg ggg ctg tgg gac aag ttc agt gag ctg gct acc aag tgc 1203 Leu Asp Leu Gly Leu Trp Asp Lys Phe Ser Glu Leu Ala Thr Lys Cys 225 230 235 atc atc aag atc gtg gag ttt gcc aag cgg ttg cct ggc ttt aca ggg 1251 Ile Ile Lys Ile Val Glu Phe Ala Lys Arg Leu Pro Gly Phe Thr Gly 240 245 250 ctc agc att gct gac cag atc act ctg ctc aaa gct gcc tgc cta gat 1299 Leu Ser Ile Ala Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Ala Cys Leu Asp 255 260 265 atc ctg atg ctg cgt atc tgc aca agg tac acc cca gag cag gac acc 1347 Ile Leu Met Leu Arg Ile Cys Thr Arg Tyr Thr Pro Glu Gln Asp Thr 270 275 280 285 atg acc ttc tcc gac ggg ctg acc ctg aac cgg acc cag atg cac aat 1395 Met Thr Phe Ser Asp Gly Leu Thr Leu Asn Arg Thr Gln Met His Asn 290 295 300 gcc ggc ttc ggg ccc ctc aca gac ctt gtc ttt gcc ttt gct ggg cag 1443 Ala Gly Phe Gly Pro Leu Thr Asp Leu Val Phe Ala Phe Ala Gly Gln 305 310 315 ctc ctg ccc ctg gag atg gat gac acc gag aca ggg ctg ctc agc gcc 1491 Leu Leu Pro Leu Glu Met Asp Asp Thr Glu Thr Gly Leu Leu Ser Ala 320 325 330 atc tgc ctc atc tgc gga gac cgc atg gac ctg gag gag ccc gaa aaa 1539 Ile Cys Leu Ile Cys Gly Asp Arg Met Asp Leu Glu Glu Pro Glu Lys 335 340 345 gtg gac aag ctg cag gag cca ctg ctg gaa gcc ctg agg ctg tac gcc 1587 Val Asp Lys Leu Gln Glu Pro Leu Leu Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Ala 350 355 360 365 cgg cgc cgg cgg ccc agc cag ccc tac atg ttc cca agg atg cta atg 1635 Arg Arg Arg Arg Pro Ser Gln Pro Tyr Met Phe Pro Arg Met Leu Met 370 375 380 aaa atc acc gac ctc cgg ggc atc agc act aag gga gct gaa agg gcc 1683 Lys Ile Thr Asp Leu Arg Gly Ile Ser Thr Lys Gly Ala Glu Arg Ala 385 390 395 att act ctg aag atg gag att cca ggc ccg atg cct ccc tta atc cga 1731 Ile Thr Leu Lys Met Glu Ile Pro Gly Pro Met Pro Pro Leu Ile Arg 400 405 410 gag atg ctg gag aac cct gaa atg ttt gag gat gac tcc tcg cag cct 1779 Glu Met Leu Glu Asn Pro Glu Met Phe Glu Asp Asp Ser Ser Gln Pro 415 420 425 ggt ccc cac ccc aat gcc tct agc gag gat gag gtt cct ggg ggc cag 1827 Gly Pro His Pro Asn Ala Ser Ser Glu Asp Glu Val Pro Gly Gly Gln 430 435 440 445 ggc aaa ggg ggc ctg aag tcc cca gcc tga ccagggcccc tgacctcccc 1877 Gly Lys Gly Gly Leu Lys Ser Pro Ala 450 gctgtggggg ttggggcttc aggcagcaga ctgaccatct cccagaccgc cagtgactgg 1937 gggaggacct gctctgccct ctccccaccc cttccaatga gctccttgtt tttgccaaag 1997 tttctagggg tgcctctgtg ttcatcccct tcctgatcta accggctccc tcgccagtcc 2057 cgggggcctg ccctgctccc accaggagag agggcaaagg gatgagcctg ggtttggact 2117 ctaaaatctc agcactgccc catgggtcct agacttccca gggcaagagg aagaccctgc 2177 cattccacag ccccttcctc tgccaggtgc ttggctctct gagagcaaac aggaacacta 2237 gagaccaaaa aggggacaaa ggagaagggc tgagcccacc ttcttgctcc tacccttggt 2297 gcctaatgct gtgtgatgca cctgcagggt gtgtgctagc ctctgtgccc cgtccttgtg 2357 ccaggtcaag gtgggggcag gctgggccct gcatttctgg ggcaggaaca gagggtgaaa 2417 gggacagata gatgcaggtc cattctgcac ctcttggctc gggtgcagag ttcaccctgt 2477 gccctccgtt ataagtccct cccccagccc tgtcatgtgc cttgggctcc tcctgccctc 2537 catctcagcc attggggcag ggaccctcct acactacaga ggggccaggg gatccctctc 2597 tccctagtgc cttccaccct ttactcccca gagcagcttg gcccagggag gggggatgct 2657 gcttagctga tcccgccctg acccagagga agcctctatt tatttattag cttttgttta 2717 caccgtggaa ttgacccctt cctccagggg tcttgggtgg gggagcccag ggcccctgtg 2777 acccctcctt tcttcctcca atccccagtt tgtatttagc tgccaaataa gattcccatt 2837 ggctccctgt gttctcttgg ggggtcaggg tgctgtcccc tcccctctgt ttacatctcc 2897 cctctacccc gctgtatcgc atattgctga gttttctatt tttgcaaaat aaagtgatgg 2957 aaactcatga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2992 <210> 11 <211> 2780 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (314)..(1645) <400> 11 caagccccac cccccacccc tccaggcttc gcttttaaaa aaggtctccc cagtgctagc 60 tgccgaagca cccagataag agctggacgg aggctaaagc ggcagcccca gcttcgcgcc 120 ccgcccagtc cctttcccct gctggggatc ccccctcttc cccgcccacc ccttacccgc 180 atgcagccca gcgccctatg ctagccctcc ccctcccccc ctgctggagc ggggcgccgc 240 cgggggagga gggggaatcg gctgcgggtc cttggtgttt ccagcaccca gtttcccttc 300 aagccgggtc gcg atg tac gac tgt atg gaa acg ttt gcc ccg ggt ccg 349 Met Tyr Asp Cys Met Glu Thr Phe Ala Pro Gly Pro 1 5 10 cga cgg ctg tac ggg gcg gcc ggg ccc ggg gcc ggc ttg ctg cgc aga 397 Arg Arg Leu Tyr Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ala Gly Leu Leu Arg Arg 15 20 25 gcc acc ggc ggc tcc tgt ttc gcc gga ctt gaa tct ttt gcc tgg ccg 445 Ala Thr Gly Gly Ser Cys Phe Ala Gly Leu Glu Ser Phe Ala Trp Pro 30 35 40 caa ccc gcc agc ctg caa tcg gtg gag aca cag agc acc agc tca gag 493 Gln Pro Ala Ser Leu Gln Ser Val Glu Thr Gln Ser Thr Ser Ser Glu 45 50 55 60 gag atg gtg ccc agc tcg ccc tcg ccc cct ccg cct cct cgg gtc tac 541 Glu Met Val Pro Ser Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Arg Val Tyr 65 70 75 aag cca tgc ttc gtg tgc aat gac aag tcc tct ggc tac cac tat ggg 589 Lys Pro Cys Phe Val Cys Asn Asp Lys Ser Ser Gly Tyr His Tyr Gly 80 85 90 gtc agc tct tgt gaa ggc tgc aag ggc ttc ttt cgc cga agc atc cag 637 Val Ser Ser Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Ile Gln 95 100 105 aag aac atg gtg tac acg tgt cac cgc gac aaa aac tgt atc atc aac 685 Lys Asn Met Val Tyr Thr Cys His Arg Asp Lys Asn Cys Ile Ile Asn 110 115 120 aag gtg acc agg aat cgc tgc cag tac tgc cgg cta cag aag tgc ttc 733 Lys Val Thr Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln Lys Cys Phe 125 130 135 140 gaa gtg ggc atg tcc aag gaa gct gtg cga aat gac cgg aac aag aag 781 Glu Val Gly Met Ser Lys Glu Ala Val Arg Asn Asp Arg Asn Lys Lys 145 150 155 aag aaa gag gtg aag gaa gaa ggg tca cct gac agc tat gag ctg agc 829 Lys Lys Glu Val Lys Glu Glu Gly Ser Pro Asp Ser Tyr Glu Leu Ser 160 165 170 cct cag tta gaa gag ctc atc acc aag gtc agc aaa gcc cat cag gag 877 Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Lys Val Ser Lys Ala His Gln Glu 175 180 185 act ttc ccc tcg ctc tgc cag ctg ggc aag tat acc acg aac tcc agt 925 Thr Phe Pro Ser Leu Cys Gln Leu Gly Lys Tyr Thr Thr Asn Ser Ser 190 195 200 gca gac cac cgc gtg cag ctg gat ctg ggg ctg tgg gac aag ttc agt 973 Ala Asp His Arg Val Gln Leu Asp Leu Gly Leu Trp Asp Lys Phe Ser 205 210 215 220 gag ctg gct acc aag tgc atc atc aag atc gtg gag ttt gcc aag cgg 1021 Glu Leu Ala Thr Lys Cys Ile Ile Lys Ile Val Glu Phe Ala Lys Arg 225 230 235 ttg cct ggc ttt aca ggg ctc agc att gct gac cag atc act ctg ctc 1069 Leu Pro Gly Phe Thr Gly Leu Ser Ile Ala Asp Gln Ile Thr Leu Leu 240 245 250 aaa gct gcc tgc cta gat atc ctg atg ctg cgt atc tgc aca agg tac 1117 Lys Ala Ala Cys Leu Asp Ile Leu Met Leu Arg Ile Cys Thr Arg Tyr 255 260 265 acc cca gag cag gac acc atg acc ttc tcc gac ggg ctg acc ctg aac 1165 Thr Pro Glu Gln Asp Thr Met Thr Phe Ser Asp Gly Leu Thr Leu Asn 270 275 280 cgg acc cag atg cac aat gcc ggc ttc ggg ccc ctc aca gac ctt gtc 1213 Arg Thr Gln Met His Asn Ala Gly Phe Gly Pro Leu Thr Asp Leu Val 285 290 295 300 ttt gcc ttt gct ggg cag ctc ctg ccc ctg gag atg gat gac acc gag 1261 Phe Ala Phe Ala Gly Gln Leu Leu Pro Leu Glu Met Asp Asp Thr Glu 305 310 315 aca ggg ctg ctc agc gcc atc tgc ctc atc tgc gga gac cgc atg gac 1309 Thr Gly Leu Leu Ser Ala Ile Cys Leu Ile Cys Gly Asp Arg Met Asp 320 325 330 ctg gag gag ccc gaa aaa gtg gac aag ctg cag gag cca ctg ctg gaa 1357 Leu Glu Glu Pro Glu Lys Val Asp Lys Leu Gln Glu Pro Leu Leu Glu 335 340 345 gcc ctg agg ctg tac gcc cgg cgc cgg cgg ccc agc cag ccc tac atg 1405 Ala Leu Arg Leu Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Pro Ser Gln Pro Tyr Met 350 355 360 ttc cca agg atg cta atg aaa atc acc gac ctc cgg ggc atc agc act 1453 Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Ile Thr Asp Leu Arg Gly Ile Ser Thr 365 370 375 380 aag gga gct gaa agg gcc att act ctg aag atg gag att cca ggc ccg 1501 Lys Gly Ala Glu Arg Ala Ile Thr Leu Lys Met Glu Ile Pro Gly Pro 385 390 395 atg cct ccc tta atc cga gag atg ctg gag aac cct gaa atg ttt gag 1549 Met Pro Pro Leu Ile Arg Glu Met Leu Glu Asn Pro Glu Met Phe Glu 400 405 410 gat gac tcc tcg cag cct ggt ccc cac ccc aat gcc tct agc gag gat 1597 Asp Asp Ser Ser Gln Pro Gly Pro His Pro Asn Ala Ser Ser Glu Asp 415 420 425 gag gtt cct ggg ggc cag ggc aaa ggg ggc ctg aag tcc cca gcc tga 1645 Glu Val Pro Gly Gly Gln Gly Lys Gly Gly Leu Lys Ser Pro Ala 430 435 440 ccagggcccc tgacctcccc gctgtggggg ttggggcttc aggcagcaga ctgaccatct 1705 cccagaccgc cagtgactgg gggaggacct gctctgccct ctccccaccc cttccaatga 1765 gctccttgtt tttgccaaag tttctagggg tgcctctgtg ttcatcccct tcctgatcta 1825 accggctccc tcgccagtcc cgggggcctg ccctgctccc accaggagag agggcaaagg 1885 gatgagcctg ggtttggact ctaaaatctc agcactgccc catgggtcct agacttccca 1945 gggcaagagg aagaccctgc cattccacag ccccttcctc tgccaggtgc ttggctctct 2005 gagagcaaac aggaacacta gagaccaaaa aggggacaaa ggagaagggc tgagcccacc 2065 ttcttgctcc tacccttggt gcctaatgct gtgtgatgca cctgcagggt gtgtgctagc 2125 ctctgtgccc cgtccttgtg ccaggtcaag gtgggggcag gctgggccct gcatttctgg 2185 ggcaggaaca gagggtgaaa gggacagata gatgcaggtc cattctgcac ctcttggctc 2245 gggtgcagag ttcaccctgt gccctccgtt ataagtccct cccccagccc tgtcatgtgc 2305 cttgggctcc tcctgccctc catctcagcc attggggcag ggaccctcct acactacaga 2365 ggggccaggg gatccctctc tccctagtgc cttccaccct ttactcccca gagcagcttg 2425 gcccagggag gggggatgct gcttagctga tcccgccctg acccagagga agcctctatt 2485 tatttattag cttttgttta caccgtggaa ttgacccctt cctccagggg tcttgggtgg 2545 gggagcccag ggcccctgtg acccctcctt tcttcctcca atccccagtt tgtatttagc 2605 tgccaaataa gattcccatt ggctccctgt gttctcttgg ggggtcaggg tgctgtcccc 2665 tcccctctgt ttacatctcc cctctacccc gctgtatcgc atattgctga gttttctatt 2725 tttgcaaaat aaagtgatgg aaactcatga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2780 <210> 12 <211> 2631 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (198)..(1496) <400> 12 caagccccac cccccacccc tccaggcttc gcttttaaaa aaggtctccc cagtgctagc 60 tgccgaagca cccagataag agctggacgg aggctaaagc ggcagcccca gcttcgcgcc 120 ccgcccagtc cctttcccct gctggggatc ccccctcttc cccgcccacc ccttacccgc 180 atgcagccca gcgccct atg cta gcc ctc ccc ctc ccc ccc tgc tgg agc 230 Met Leu Ala Leu Pro Leu Pro Pro Cys Trp Ser 1 5 10 ggg gcg ccg ccg ggg gag gag ggg gaa tcg gct gcg ggt cct tgg tgt 278 Gly Ala Pro Pro Gly Glu Glu Gly Glu Ser Ala Ala Gly Pro Trp Cys 15 20 25 ttc cag cac cca gtt tcc ctt caa gcc ggg tcg cga tgt acg act gta 326 Phe Gln His Pro Val Ser Leu Gln Ala Gly Ser Arg Cys Thr Thr Val 30 35 40 tgg aaa cgt ttg ccc cgg gtc cgc gac ggc tgt acg ggg cgg ccg ggc 374 Trp Lys Arg Leu Pro Arg Val Arg Asp Gly Cys Thr Gly Arg Pro Gly 45 50 55 ccg ggg ccg gct tgc tgc gca gag cca ccg gcg gct cct gtt tcg ccg 422 Pro Gly Pro Ala Cys Cys Ala Glu Pro Pro Ala Ala Pro Val Ser Pro 60 65 70 75 gac ttg aat ctt ttg cct ggc cgc aac ccg cca gcc tgc aat ggc ttc 470 Asp Leu Asn Leu Leu Pro Gly Arg Asn Pro Pro Ala Cys Asn Gly Phe 80 85 90 ttt cgc cga agc atc cag aag aac atg gtg tac acg tgt cac cgc gac 518 Phe Arg Arg Ser Ile Gln Lys Asn Met Val Tyr Thr Cys His Arg Asp 95 100 105 aaa aac tgt atc atc aac aag gtg acc agg aat cgc tgc cag tac tgc 566 Lys Asn Cys Ile Ile Asn Lys Val Thr Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys 110 115 120 cgg cta cag aag tgc ttc gaa gtg ggc atg tcc aag gaa gct gtg cga 614 Arg Leu Gln Lys Cys Phe Glu Val Gly Met Ser Lys Glu Ala Val Arg 125 130 135 aat gac cgg aac aag aag aag aaa gag gtg aag gaa gaa ggg tca cct 662 Asn Asp Arg Asn Lys Lys Lys Lys Glu Val Lys Glu Glu Gly Ser Pro 140 145 150 155 gac agc tat gag ctg agc cct cag tta gaa gag ctc atc acc aag gtc 710 Asp Ser Tyr Glu Leu Ser Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Lys Val 160 165 170 agc aaa gcc cat cag gag act ttc ccc tcg ctc tgc cag ctg ggc aag 758 Ser Lys Ala His Gln Glu Thr Phe Pro Ser Leu Cys Gln Leu Gly Lys 175 180 185 tat acc acg aac tcc agt gca gac cac cgc gtg cag ctg gat ctg ggg 806 Tyr Thr Thr Asn Ser Ser Ala Asp His Arg Val Gln Leu Asp Leu Gly 190 195 200 ctg tgg gac aag ttc agt gag ctg gct acc aag tgc atc atc aag atc 854 Leu Trp Asp Lys Phe Ser Glu Leu Ala Thr Lys Cys Ile Ile Lys Ile 205 210 215 gtg gag ttt gcc aag cgg ttg cct ggc ttt aca ggg ctc agc att gct 902 Val Glu Phe Ala Lys Arg Leu Pro Gly Phe Thr Gly Leu Ser Ile Ala 220 225 230 235 gac cag atc act ctg ctc aaa gct gcc tgc cta gat atc ctg atg ctg 950 Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Ala Cys Leu Asp Ile Leu Met Leu 240 245 250 cgt atc tgc aca agg tac acc cca gag cag gac acc atg acc ttc tcc 998 Arg Ile Cys Thr Arg Tyr Thr Pro Glu Gln Asp Thr Met Thr Phe Ser 255 260 265 gac ggg ctg acc ctg aac cgg acc cag atg cac aat gcc ggc ttc ggg 1046 Asp Gly Leu Thr Leu Asn Arg Thr Gln Met His Asn Ala Gly Phe Gly 270 275 280 ccc ctc aca gac ctt gtc ttt gcc ttt gct ggg cag ctc ctg ccc ctg 1094 Pro Leu Thr Asp Leu Val Phe Ala Phe Ala Gly Gln Leu Leu Pro Leu 285 290 295 gag atg gat gac acc gag aca ggg ctg ctc agc gcc atc tgc ctc atc 1142 Glu Met Asp Asp Thr Glu Thr Gly Leu Leu Ser Ala Ile Cys Leu Ile 300 305 310 315 tgc gga gac cgc atg gac ctg gag gag ccc gaa aaa gtg gac aag ctg 1190 Cys Gly Asp Arg Met Asp Leu Glu Glu Pro Glu Lys Val Asp Lys Leu 320 325 330 cag gag cca ctg ctg gaa gcc ctg agg ctg tac gcc cgg cgc cgg cgg 1238 Gln Glu Pro Leu Leu Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Ala Arg Arg Arg Arg 335 340 345 ccc agc cag ccc tac atg ttc cca agg atg cta atg aaa atc acc gac 1286 Pro Ser Gln Pro Tyr Met Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Ile Thr Asp 350 355 360 ctc cgg ggc atc agc act aag gga gct gaa agg gcc att act ctg aag 1334 Leu Arg Gly Ile Ser Thr Lys Gly Ala Glu Arg Ala Ile Thr Leu Lys 365 370 375 atg gag att cca ggc ccg atg cct ccc tta atc cga gag atg ctg gag 1382 Met Glu Ile Pro Gly Pro Met Pro Pro Leu Ile Arg Glu Met Leu Glu 380 385 390 395 aac cct gaa atg ttt gag gat gac tcc tcg cag cct ggt ccc cac ccc 1430 Asn Pro Glu Met Phe Glu Asp Asp Ser Ser Gln Pro Gly Pro His Pro 400 405 410 aat gcc tct agc gag gat gag gtt cct ggg ggc cag ggc aaa ggg ggc 1478 Asn Ala Ser Ser Glu Asp Glu Val Pro Gly Gly Gln Gly Lys Gly Gly 415 420 425 ctg aag tcc cca gcc tga ccagggcccc tgacctcccc gctgtggggg 1526 Leu Lys Ser Pro Ala 430 ttggggcttc aggcagcaga ctgaccatct cccagaccgc cagtgactgg gggaggacct 1586 gctctgccct ctccccaccc cttccaatga gctccttgtt tttgccaaag tttctagggg 1646 tgcctctgtg ttcatcccct tcctgatcta accggctccc tcgccagtcc cgggggcctg 1706 ccctgctccc accaggagag agggcaaagg gatgagcctg ggtttggact ctaaaatctc 1766 agcactgccc catgggtcct agacttccca gggcaagagg aagaccctgc cattccacag 1826 ccccttcctc tgccaggtgc ttggctctct gagagcaaac aggaacacta gagaccaaaa 1886 aggggacaaa ggagaagggc tgagcccacc ttcttgctcc tacccttggt gcctaatgct 1946 gtgtgatgca cctgcagggt gtgtgctagc ctctgtgccc cgtccttgtg ccaggtcaag 2006 gtgggggcag gctgggccct gcatttctgg ggcaggaaca gagggtgaaa gggacagata 2066 gatgcaggtc cattctgcac ctcttggctc gggtgcagag ttcaccctgt gccctccgtt 2126 ataagtccct cccccagccc tgtcatgtgc cttgggctcc tcctgccctc catctcagcc 2186 attggggcag ggaccctcct acactacaga ggggccaggg gatccctctc tccctagtgc 2246 cttccaccct ttactcccca gagcagcttg gcccagggag gggggatgct gcttagctga 2306 tcccgccctg acccagagga agcctctatt tatttattag cttttgttta caccgtggaa 2366 ttgacccctt cctccagggg tcttgggtgg gggagcccag ggcccctgtg acccctcctt 2426 tcttcctcca atccccagtt tgtatttagc tgccaaataa gattcccatt ggctccctgt 2486 gttctcttgg ggggtcaggg tgctgtcccc tcccctctgt ttacatctcc cctctacccc 2546 gctgtatcgc atattgctga gttttctatt tttgcaaaat aaagtgatgg aaactcatga 2606 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2631 <210> 13 <211> 2666 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (383)..(1531) <400> 13 aggttggggg gggggtgggg agggagaaaa agaaagaaaa tattttccgt gtccccgcct 60 gcagagtcag tgtgcggttt gggagaaaat gtgtcggata ttttggggcg gtcacgtggg 120 cgggcgggct ccgagaggcc ccgggacagt cccagcctag agccgtgccc ccccaggagc 180 cccccagtac ggcgagcccc ggacattgcg acgctccatc caagagactg cccgacgccg 240 ggacctcggg gctccgccgc ctcccttccc cctcccactc cagcagctac ggcccagttc 300 cctcaacctg acccagtatg tagaagccag tctctgcagg cggccagcgg cggtggagac 360 acagagcacc agctcagagg ag atg gtg ccc agc tcg ccc tcg ccc cct ccg 412 Met Val Pro Ser Ser Pro Ser Pro Pro Pro 1 5 10 cct cct cgg gtc tac aag cca tgc ttc gtg tgc aat gac aag tcc tct 460 Pro Pro Arg Val Tyr Lys Pro Cys Phe Val Cys Asn Asp Lys Ser Ser 15 20 25 ggc tac cac tat ggg gtc agc tct tgt gaa ggc tgc aag ggc ttc ttt 508 Gly Tyr His Tyr Gly Val Ser Ser Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe 30 35 40 cgc cga agc atc cag aag aac atg gtg tac acg tgt cac cgc gac aaa 556 Arg Arg Ser Ile Gln Lys Asn Met Val Tyr Thr Cys His Arg Asp Lys 45 50 55 aac tgt atc atc aac aag gtg acc agg aat cgc tgc cag tac tgc cgg 604 Asn Cys Ile Ile Asn Lys Val Thr Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg 60 65 70 cta cag aag tgc ttc gaa gtg ggc atg tcc aag gaa gct gtg cga aat 652 Leu Gln Lys Cys Phe Glu Val Gly Met Ser Lys Glu Ala Val Arg Asn 75 80 85 90 gac cgg aac aag aag aag aaa gag gtg aag gaa gaa ggg tca cct gac 700 Asp Arg Asn Lys Lys Lys Lys Glu Val Lys Glu Glu Gly Ser Pro Asp 95 100 105 agc tat gag ctg agc cct cag tta gaa gag ctc atc acc aag gtc agc 748 Ser Tyr Glu Leu Ser Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Lys Val Ser 110 115 120 aaa gcc cat cag gag act ttc ccc tcg ctc tgc cag ctg ggc aag tat 796 Lys Ala His Gln Glu Thr Phe Pro Ser Leu Cys Gln Leu Gly Lys Tyr 125 130 135 acc acg aac tcc agt gca gac cac cgc gtg cag ctg gat ctg ggg ctg 844 Thr Thr Asn Ser Ser Ala Asp His Arg Val Gln Leu Asp Leu Gly Leu 140 145 150 tgg gac aag ttc agt gag ctg gct acc aag tgc atc atc aag atc gtg 892 Trp Asp Lys Phe Ser Glu Leu Ala Thr Lys Cys Ile Ile Lys Ile Val 155 160 165 170 gag ttt gcc aag cgg ttg cct ggc ttt aca ggg ctc agc att gct gac 940 Glu Phe Ala Lys Arg Leu Pro Gly Phe Thr Gly Leu Ser Ile Ala Asp 175 180 185 cag atc act ctg ctc aaa gct gcc tgc cta gat atc ctg atg ctg cgt 988 Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Ala Cys Leu Asp Ile Leu Met Leu Arg 190 195 200 atc tgc aca agg tac acc cca gag cag gac acc atg acc ttc tcc gac 1036 Ile Cys Thr Arg Tyr Thr Pro Glu Gln Asp Thr Met Thr Phe Ser Asp 205 210 215 ggg ctg acc ctg aac cgg acc cag atg cac aat gcc ggc ttc ggg ccc 1084 Gly Leu Thr Leu Asn Arg Thr Gln Met His Asn Ala Gly Phe Gly Pro 220 225 230 ctc aca gac ctt gtc ttt gcc ttt gct ggg cag ctc ctg ccc ctg gag 1132 Leu Thr Asp Leu Val Phe Ala Phe Ala Gly Gln Leu Leu Pro Leu Glu 235 240 245 250 atg gat gac acc gag aca ggg ctg ctc agc gcc atc tgc ctc atc tgc 1180 Met Asp Asp Thr Glu Thr Gly Leu Leu Ser Ala Ile Cys Leu Ile Cys 255 260 265 gga gac cgc atg gac ctg gag gag ccc gaa aaa gtg gac aag ctg cag 1228 Gly Asp Arg Met Asp Leu Glu Glu Pro Glu Lys Val Asp Lys Leu Gln 270 275 280 gag cca ctg ctg gaa gcc ctg agg ctg tac gcc cgg cgc cgg cgg ccc 1276 Glu Pro Leu Leu Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Pro 285 290 295 agc cag ccc tac atg ttc cca agg atg cta atg aaa atc acc gac ctc 1324 Ser Gln Pro Tyr Met Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Ile Thr Asp Leu 300 305 310 cgg ggc atc agc act aag gga gct gaa agg gcc att act ctg aag atg 1372 Arg Gly Ile Ser Thr Lys Gly Ala Glu Arg Ala Ile Thr Leu Lys Met 315 320 325 330 gag att cca ggc ccg atg cct ccc tta atc cga gag atg ctg gag aac 1420 Glu Ile Pro Gly Pro Met Pro Pro Leu Ile Arg Glu Met Leu Glu Asn 335 340 345 cct gaa atg ttt gag gat gac tcc tcg cag cct ggt ccc cac ccc aat 1468 Pro Glu Met Phe Glu Asp Asp Ser Ser Gln Pro Gly Pro His Pro Asn 350 355 360 gcc tct agc gag gat gag gtt cct ggg ggc cag ggc aaa ggg ggc ctg 1516 Ala Ser Ser Glu Asp Glu Val Pro Gly Gly Gln Gly Lys Gly Gly Leu 365 370 375 aag tcc cca gcc tga ccagggcccc tgacctcccc gctgtggggg ttggggcttc 1571 Lys Ser Pro Ala 380 aggcagcaga ctgaccatct cccagaccgc cagtgactgg gggaggacct gctctgccct 1631 ctccccaccc cttccaatga gctccttgtt tttgccaaag tttctagggg tgcctctgtg 1691 ttcatcccct tcctgatcta accggctccc tcgccagtcc cgggggcctg ccctgctccc 1751 accaggagag agggcaaagg gatgagcctg ggtttggact ctaaaatctc agcactgccc 1811 catgggtcct agacttccca gggcaagagg aagaccctgc cattccacag ccccttcctc 1871 tgccaggtgc ttggctctct gagagcaaac aggaacacta gagaccaaaa aggggacaaa 1931 ggagaagggc tgagcccacc ttcttgctcc tacccttggt gcctaatgct gtgtgatgca 1991 cctgcagggt gtgtgctagc ctctgtgccc cgtccttgtg ccaggtcaag gtgggggcag 2051 gctgggccct gcatttctgg ggcaggaaca gagggtgaaa gggacagata gatgcaggtc 2111 cattctgcac ctcttggctc gggtgcagag ttcaccctgt gccctccgtt ataagtccct 2171 cccccagccc tgtcatgtgc cttgggctcc tcctgccctc catctcagcc attggggcag 2231 ggaccctcct acactacaga ggggccaggg gatccctctc tccctagtgc cttccaccct 2291 ttactcccca gagcagcttg gcccagggag gggggatgct gcttagctga tcccgccctg 2351 acccagagga agcctctatt tatttattag cttttgttta caccgtggaa ttgacccctt 2411 cctccagggg tcttgggtgg gggagcccag ggcccctgtg acccctcctt tcttcctcca 2471 atccccagtt tgtatttagc tgccaaataa gattcccatt ggctccctgt gttctcttgg 2531 ggggtcaggg tgctgtcccc tcccctctgt ttacatctcc cctctacccc gctgtatcgc 2591 atattgctga gttttctatt tttgcaaaat aaagtgatgg aaactcatga aaaaaaaaaa 2651 aaaaaaaaaa aaaaa 2666 <210> 14 <211> 2517 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (381)..(1382) <400> 14 aggttggggg gggggtgggg agggagaaaa agaaagaaaa tattttccgt gtccccgcct 60 gcagagtcag tgtgcggttt gggagaaaat gtgtcggata ttttggggcg gtcacgtggg 120 cgggcgggct ccgagaggcc ccgggacagt cccagcctag agccgtgccc ccccaggagc 180 cccccagtac ggcgagcccc ggacattgcg acgctccatc caagagactg cccgacgccg 240 ggacctcggg gctccgccgc ctcccttccc cctcccactc cagcagctac ggcccagttc 300 cctcaacctg acccagtatg tagaagccag tctctgcagg cggccagcgg ggcttctttc 360 gccgaagcat ccagaagaac atg gtg tac acg tgt cac cgc gac aaa aac tgt 413 Met Val Tyr Thr Cys His Arg Asp Lys Asn Cys 1 5 10 atc atc aac aag gtg acc agg aat cgc tgc cag tac tgc cgg cta cag 461 Ile Ile Asn Lys Val Thr Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln 15 20 25 aag tgc ttc gaa gtg ggc atg tcc aag gaa gct gtg cga aat gac cgg 509 Lys Cys Phe Glu Val Gly Met Ser Lys Glu Ala Val Arg Asn Asp Arg 30 35 40 aac aag aag aag aaa gag gtg aag gaa gaa ggg tca cct gac agc tat 557 Asn Lys Lys Lys Lys Glu Val Lys Glu Glu Gly Ser Pro Asp Ser Tyr 45 50 55 gag ctg agc cct cag tta gaa gag ctc atc acc aag gtc agc aaa gcc 605 Glu Leu Ser Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Lys Val Ser Lys Ala 60 65 70 75 cat cag gag act ttc ccc tcg ctc tgc cag ctg ggc aag tat acc acg 653 His Gln Glu Thr Phe Pro Ser Leu Cys Gln Leu Gly Lys Tyr Thr Thr 80 85 90 aac tcc agt gca gac cac cgc gtg cag ctg gat ctg ggg ctg tgg gac 701 Asn Ser Ser Ala Asp His Arg Val Gln Leu Asp Leu Gly Leu Trp Asp 95 100 105 aag ttc agt gag ctg gct acc aag tgc atc atc aag atc gtg gag ttt 749 Lys Phe Ser Glu Leu Ala Thr Lys Cys Ile Ile Lys Ile Val Glu Phe 110 115 120 gcc aag cgg ttg cct ggc ttt aca ggg ctc agc att gct gac cag atc 797 Ala Lys Arg Leu Pro Gly Phe Thr Gly Leu Ser Ile Ala Asp Gln Ile 125 130 135 act ctg ctc aaa gct gcc tgc cta gat atc ctg atg ctg cgt atc tgc 845 Thr Leu Leu Lys Ala Ala Cys Leu Asp Ile Leu Met Leu Arg Ile Cys 140 145 150 155 aca agg tac acc cca gag cag gac acc atg acc ttc tcc gac ggg ctg 893 Thr Arg Tyr Thr Pro Glu Gln Asp Thr Met Thr Phe Ser Asp Gly Leu 160 165 170 acc ctg aac cgg acc cag atg cac aat gcc ggc ttc ggg ccc ctc aca 941 Thr Leu Asn Arg Thr Gln Met His Asn Ala Gly Phe Gly Pro Leu Thr 175 180 185 gac ctt gtc ttt gcc ttt gct ggg cag ctc ctg ccc ctg gag atg gat 989 Asp Leu Val Phe Ala Phe Ala Gly Gln Leu Leu Pro Leu Glu Met Asp 190 195 200 gac acc gag aca ggg ctg ctc agc gcc atc tgc ctc atc tgc gga gac 1037 Asp Thr Glu Thr Gly Leu Leu Ser Ala Ile Cys Leu Ile Cys Gly Asp 205 210 215 cgc atg gac ctg gag gag ccc gaa aaa gtg gac aag ctg cag gag cca 1085 Arg Met Asp Leu Glu Glu Pro Glu Lys Val Asp Lys Leu Gln Glu Pro 220 225 230 235 ctg ctg gaa gcc ctg agg ctg tac gcc cgg cgc cgg cgg ccc agc cag 1133 Leu Leu Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Pro Ser Gln 240 245 250 ccc tac atg ttc cca agg atg cta atg aaa atc acc gac ctc cgg ggc 1181 Pro Tyr Met Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Ile Thr Asp Leu Arg Gly 255 260 265 atc agc act aag gga gct gaa agg gcc att act ctg aag atg gag att 1229 Ile Ser Thr Lys Gly Ala Glu Arg Ala Ile Thr Leu Lys Met Glu Ile 270 275 280 cca ggc ccg atg cct ccc tta atc cga gag atg ctg gag aac cct gaa 1277 Pro Gly Pro Met Pro Pro Leu Ile Arg Glu Met Leu Glu Asn Pro Glu 285 290 295 atg ttt gag gat gac tcc tcg cag cct ggt ccc cac ccc aat gcc tct 1325 Met Phe Glu Asp Asp Ser Ser Gln Pro Gly Pro His Pro Asn Ala Ser 300 305 310 315 agc gag gat gag gtt cct ggg ggc cag ggc aaa ggg ggc ctg aag tcc 1373 Ser Glu Asp Glu Val Pro Gly Gly Gln Gly Lys Gly Gly Leu Lys Ser 320 325 330 cca gcc tga ccagggcccc tgacctcccc gctgtggggg ttggggcttc 1422 Pro Ala aggcagcaga ctgaccatct cccagaccgc cagtgactgg gggaggacct gctctgccct 1482 ctccccaccc cttccaatga gctccttgtt tttgccaaag tttctagggg tgcctctgtg 1542 ttcatcccct tcctgatcta accggctccc tcgccagtcc cgggggcctg ccctgctccc 1602 accaggagag agggcaaagg gatgagcctg ggtttggact ctaaaatctc agcactgccc 1662 catgggtcct agacttccca gggcaagagg aagaccctgc cattccacag ccccttcctc 1722 tgccaggtgc ttggctctct gagagcaaac aggaacacta gagaccaaaa aggggacaaa 1782 ggagaagggc tgagcccacc ttcttgctcc tacccttggt gcctaatgct gtgtgatgca 1842 cctgcagggt gtgtgctagc ctctgtgccc cgtccttgtg ccaggtcaag gtgggggcag 1902 gctgggccct gcatttctgg ggcaggaaca gagggtgaaa gggacagata gatgcaggtc 1962 cattctgcac ctcttggctc gggtgcagag ttcaccctgt gccctccgtt ataagtccct 2022 cccccagccc tgtcatgtgc cttgggctcc tcctgccctc catctcagcc attggggcag 2082 ggaccctcct acactacaga ggggccaggg gatccctctc tccctagtgc cttccaccct 2142 ttactcccca gagcagcttg gcccagggag gggggatgct gcttagctga tcccgccctg 2202 acccagagga agcctctatt tatttattag cttttgttta caccgtggaa ttgacccctt 2262 cctccagggg tcttgggtgg gggagcccag ggcccctgtg acccctcctt tcttcctcca 2322 atccccagtt tgtatttagc tgccaaataa gattcccatt ggctccctgt gttctcttgg 2382 ggggtcaggg tgctgtcccc tcccctctgt ttacatctcc cctctacccc gctgtatcgc 2442 atattgctga gttttctatt tttgcaaaat aaagtgatgg aaactcatga aaaaaaaaaa 2502 aaaaaaaaaa aaaaa 2517 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His 1 5 10 15 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu His Val Val Arg 1 5 10 15 Val Asn Ala Arg Val Arg 20 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1 5 10 15 <210> 18 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> shRNA 5' to 3' <220> <221> misc_feature <222> (22)..(31) <223> loop <400> 18 guacacuucu gggccacuga acuuccuguc auuuaguggu ccagaagugu gc 52 <210> 19 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> coding sequence for shRNA <400> 19 gtacacttct gggccactga acttcctgtc atttagtggt ccagaagtgt gc 52 <210> 20 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> shRNA 5' to 3' <220> <221> misc_feature <222> (22)..(31) <223> loop <400> 20 gguuguggca gcauugcaug acuuccuguc auuaugcagu gcugccauaa cc 52

Claims (15)

  1. 레티노이드 대사 경로의 저해제를 T 세포 집단에 첨가하는 공정을 포함하는, T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 방법이며, 상기 저해제는 레티놀 데히드로게나제 10의 저해제인 방법으로서, 상기 저해제가, 레티놀 데히드로게나제 10을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 하기 식 (I)을 갖는 레티놀 데히드로게나제 10의 작용을 저해하는 화합물 또는 이의 염인, 방법.

    (여기서 R은 H 또는 CH3이고,
    Z는 HO- 또는 HOOC-Y-COO-이며,
    Y는 -CH2CH2-, -CH=CH- 또는 페닐렌기이다)
  2. 제1항에 있어서, 상기 저해제가, 레티놀 데히드로게나제 10을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자이며, 해당 RNA 분자가 siRNA, shRNA, miRNA, stRNA 및 안티센스 RNA로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 방법.
  3. 레티노이드 대사 경로의 저해제를 포함하는, 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료의 보조제이며, 상기 저해제는 레티놀 데히드로게나제 10의 저해제인 보조제로서, 상기 저해제가, 레티놀 데히드로게나제 10을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 하기 식 (I)을 갖는 레티놀 데히드로게나제 10의 작용을 저해하는 화합물 또는 이의 염인, 보조제.

    (여기서 R은 H 또는 CH3이고,
    Z는 HO- 또는 HOOC-Y-COO-이며,
    Y는 -CH2CH2-, -CH=CH- 또는 페닐렌기이다)
  4. 레티노이드 대사 경로의 저해제를 포함하는, 암의 면역 요법의 보조제이며, 상기 저해제는 레티놀 데히드로게나제 10의 저해제인 보조제로서, 상기 저해제가, 레티놀 데히드로게나제 10을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 하기 식 (I)을 갖는 레티놀 데히드로게나제 10의 작용을 저해하는 화합물 또는 이의 염인, 보조제.

    (여기서 R은 H 또는 CH3이고,
    Z는 HO- 또는 HOOC-Y-COO-이며,
    Y는 -CH2CH2-, -CH=CH- 또는 페닐렌기이다)
  5. 레티노이드 대사 경로의 저해제를 포함하는 면역력 증강제이며, 상기 저해제는 레티놀 데히드로게나제 10의 저해제인 면역력 증강제로서, 상기 저해제가, 레티놀 데히드로게나제 10을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 하기 식 (I)을 갖는 레티놀 데히드로게나제 10의 작용을 저해하는 화합물 또는 이의 염인, 증강제.

    (여기서 R은 H 또는 CH3이고,
    Z는 HO- 또는 HOOC-Y-COO-이며,
    Y는 -CH2CH2-, -CH=CH- 또는 페닐렌기이다)
  6. 레티노이드 대사 경로의 저해제를 T 세포 집단에 첨가함으로써, 해당 T 세포 집단에 있어서의 기억 T 세포의 비율을 증대시키는 공정을 포함하는, T 세포 집단의 제작 방법이며, 상기 저해제는 레티놀 데히드로게나제 10의 저해제인 방법으로서, 상기 저해제가, 레티놀 데히드로게나제 10을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 하기 식 (I)을 갖는 레티놀 데히드로게나제 10의 작용을 저해하는 화합물 또는 이의 염인, 방법.

    (여기서 R은 H 또는 CH3이고,
    Z는 HO- 또는 HOOC-Y-COO-이며,
    Y는 -CH2CH2-, -CH=CH- 또는 페닐렌기이다)
  7. (a) 암 항원, 감염증의 병원체 또는 해당 병원체의 항원, 또는 이들 항원 또는 병원체에 의해 자극 또는 활성화된 면역 세포, 및
    (b) 레티노이드 대사 경로의 저해제
    를 포함하고,
    여기서 상기 저해제는 레티놀 데히드로게나제 10의 저해제인, 암 또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한 키트이며, 여기서 상기 저해제가, 레티놀 데히드로게나제 10을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 RNA 분자, 해당 RNA 분자를 발생시키는 핵산 분자, 해당 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 하기 식 (I)을 갖는 레티놀 데히드로게나제 10의 작용을 저해하는 화합물 또는 이의 염인, 키트.

    (여기서 R은 H 또는 CH3이고,
    Z는 HO- 또는 HOOC-Y-COO-이며,
    Y는 -CH2CH2-, -CH=CH- 또는 페닐렌기이다)
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