ES2846811T3 - Composiciones de células T mejoradas - Google Patents

Composiciones de células T mejoradas Download PDF

Info

Publication number
ES2846811T3
ES2846811T3 ES15802488T ES15802488T ES2846811T3 ES 2846811 T3 ES2846811 T3 ES 2846811T3 ES 15802488 T ES15802488 T ES 15802488T ES 15802488 T ES15802488 T ES 15802488T ES 2846811 T3 ES2846811 T3 ES 2846811T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
cell
car
akt
pi3k
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15802488T
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin Friedman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bluebird Bio Inc
Original Assignee
Bluebird Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54767459&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2846811(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bluebird Bio Inc filed Critical Bluebird Bio Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2846811T3 publication Critical patent/ES2846811T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

Un método in vitro o ex vivo para la producción de células T que comprende: (a) activar una población de células T y estimular la población de células T para que proliferen, en donde las etapas de activación y estimulación se realizan en presencia de un inhibidor de PI3K; (b) transducir las células T con un vector viral que comprende un receptor de células T (TCR) modificado o un receptor de antígeno quimérico (CAR); y (c) cultivar las células T transducidas para que proliferen; en donde las etapas de activación y estimulación realizadas en presencia del inhibidor de PI3K dan como resultado el mantenimiento de la proliferación y la diferenciación decreciente de las células T transducidas en comparación con la proliferación y la diferenciación de las células T transducidas que se activaron y se estimularon en ausencia del inhibidor de PI3K.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de células T mejoradas
Antecedentes
Campo Técnico
La presente descripción se refiere a las composiciones de células T mejoradas y los métodos para la producción de células T. Más particularmente, la invención se refiere a los métodos de producción de células T que dan como resultado las inmunoterapias adoptivas de células T con supervivencia, expansión y persistencia mejoradas in vivo. Descripción de la técnica relacionada
La inmunoterapia adoptiva es la transferencia de linfocitos T a un sujeto para tratar una enfermedad. La inmunoterapia adoptiva tiene todavía un potencial si explotar para tratar una amplia variedad de enfermedades, que incluyen el cáncer, las enfermedades infecciosas, las enfermedades autoinmunitarias, las enfermedades inflamatorias y la inmunodeficiencia. Sin embargo, la mayoría, si no todas las estrategias de la inmunoterapia adoptiva requieren las etapas de activación y expansión de células T para generar una dosis terapéutica clínicamente eficaz de células T. Las tecnologías actuales para generar las dosis terapéuticas de células T, incluidas las células T modificadas, permanecen limitadas por los engorrosos procesos de producción de células T. Por ejemplo, la expansión de células T a menudo requiere una clonación costosa y laboriosa, y/o múltiples rondas de activación/expansión para lograr números de células T terapéuticamente relevantes. Además, los métodos de activación/expansión de células T existentes normalmente se combinan con una diferenciación sustancial de células T y generalmente dan como resultado efectos de corta duración, incluida la supervivencia de corta duración y la falta de persistencia y la falta de expansión in vivo de las células T transferidas. Por tanto, los procesos de producción de células T existentes producen un producto de células T inferior que es propenso al agotamiento y a la pérdida de la función de las células efectoras inmunitarias. Hasta la fecha, la eficacia clínica de las inmunoterapias adoptivas de células T modificadas está limitada por la expansión deficiente de células T y la persistencia después de la infusión en los pacientes. Por lo tanto, tales terapias no son adecuadas para un uso clínico generalizado. Por consiguiente, existe una necesidad insatisfecha persistente de mejoras en la producción de células T y las composiciones de células T terapéuticas que sobreviven, se expanden y persisten in vivo.
Breve resumen
En un primer aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro o ex vivo para la producción de células T como se define en la reivindicación 1.
La presente descripción proporciona generalmente las inmunoterapias adoptivas de células T que comprenden las composiciones de células T antitumorales persistentes y potentes y los métodos para preparar las mismas.
La presente descripción se refiere a las composiciones de células T mejoradas y los métodos para la producción de células T. Más particularmente, la invención se refiere a los métodos de producción de células T que dan como resultado una supervivencia, expansión y persistencia mejoradas in vivo.
Se describe un método para la producción de células T que comprende: (a) aislar una población de células T, por ejemplo, los linfocitos T citotóxicos infiltrantes de tumores (TI L), de un sujeto; (b) activar la población de células T y estimular la población de células T para que proliferen, en donde las etapas de activación y estimulación se realizan en presencia de un inhibidor de la vía AKT/mTOR; (c) cultivar las células T para que proliferen; en donde las etapas de activación y estimulación realizadas en presencia del inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR dan como resultado el mantenimiento de la proliferación de las células T en comparación con la proliferación de las células T que se activaron y estimularon en ausencia del inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR.
Se describe un método para la producción de células T que comprende: (a) activar una población de células T y estimular la población de células T para que proliferen, en donde las etapas de activación y estimulación se realizan en presencia de un inhibidor de la vía AKT/mTOR; (b) transducir las células T con un vector viral que comprende un receptor de células T (TCR) modificado o un receptor de antígeno quimérico (CAR); (c) cultivar las células T transducidas para que proliferen; en donde las etapas de activación y estimulación realizadas en presencia del inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR dan como resultado el mantenimiento de la proliferación de las células T transducidas en comparación con la proliferación de las células T transducidas que se activaron y estimularon en ausencia del inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR.
En modalidades particulares, los métodos que se contemplan en la presente descripción comprenden aislar las células mononucleares de la sangre periférica como fuente de células T.
En determinadas modalidades, la activación de las células T comprende poner en contacto las células T con un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a CD3 de este.
En modalidades adicionales, la estimulación de las células T comprende poner en contacto las células T con un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a CD28 de este, B7-1 o un fragmento de unión a CD28 de este, o B7-2 o un fragmento de unión a CD28 de este.
En algunas modalidades, las células se transducen con el vector viral antes de la proliferación de células T.
En determinadas modalidades, las células se transducen con el vector viral después de la proliferación de células T. En modalidades particulares, el vector es un vector retroviral.
En modalidades adicionales, el vector es un vector lentiviral.
En otras modalidades particulares, las células comprenden un receptor de antígeno quimérico (CAR).
En modalidades particulares, el CAR comprende: un dominio extracelular que se une a un antígeno que se selecciona del grupo que consiste en: receptor alfa de folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, CMV, EBV, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM y VEGFR2; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: CD8a; CD4, CD28, CD45, PD-1 y CD152; uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelular que se seleccionan del grupo que consiste en: CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1) y CD278 (ICOS); y un dominio de señalización de CD3Z.
En modalidades adicionales, el dominio extracelular comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une al antígeno.
En determinadas modalidades, el dominio transmembrana se deriva de CD8a o CD28.
En modalidades adicionales, el uno o más dominios de señalización coestimuladora se seleccionan del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137.
En modalidades adicionales, el CAR comprende un polipéptido de la región bisagra.
En modalidades particulares, el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de IgG1 o CD8a. En modalidades particulares, el CAR comprende un péptido señal.
En algunas modalidades, el péptido señal comprende un polipéptido señal de la cadena pesada de IgG1 o un polipéptido señal de CD8a.
En algunos ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR se selecciona del grupo que consiste en: BEZ235, LY294002, GDC-0941, BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, IPI-145, MK-2206, GSK690693, GDC-0068, A-674563, CCT128930, AZD8055, INK128, rapamicina, PF-04691502, everolimus, BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK, AT7867, NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75, ZSTK474 y PP-121.
En modalidades particulares, el inhibidor de PI3K es un inhibidor de pan-PI3K que se selecciona del grupo que consiste en: BEZ235, LY294002 y GDC-0941.
En otras modalidades particulares, el inhibidor de PI3K es un inhibidor selectivo de PI3K que se selecciona del grupo que consiste en: BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101 y IPI-145.
En otras modalidades particulares, el inhibidor de PI3K es ZSTK474.
En ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de pan-AKT que se selecciona del grupo que consiste en: MK-2206, GSK690693 y GDC-0068.
En ejemplos adicionales, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es el inhibidor selectivo de AKT1 A-674563.
En determinados ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es el inhibidor selectivo de AKT2 CCT128930.
En determinados ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR inhibe la activación de AKT por ADN-PK.
En otros ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR inhibe la activación de AKT por PDK-1.
En ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR inhibe la activación de AKT por mTORC2.
En ejemplos adicionales, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR inhibe la activación de AKT por HSP.
En otros ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de pan-mTOR que se selecciona del grupo que consiste en: AZD8055, INK128 y rapamicina.
En determinados ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor selectivo de mTORC1 que se selecciona del grupo que consiste en: PF-04691502 y everolimus.
En ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de la quinasa s6 que se selecciona del grupo que consiste en: BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK y AT7867.
En ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de ADN-PK que se selecciona del grupo que consiste en: NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 y PP-121.
En algunas modalidades, la población de células T activadas y estimuladas en presencia de un inhibidor de PI3K tiene un mayor número de células T que expresan uno o más marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127 en comparación con una población de células T activadas y estimuladas en ausencia del inhibidor de PI3K.
En modalidades adicionales, la población de células T activadas y estimuladas en presencia de un inhibidor de PI3K no expresa CD57 o KLRG1 o expresa menos CD57 o KLRG1 en comparación con una población de células T activadas y estimuladas en ausencia del inhibidor de PI3K.
En la presente descripción se describe un método para mantener la proliferación y disminuir la diferenciación de las células T reestimuladas que expresan un TCR o CAR modificado que comprende: (a) poner en contacto la totalidad o una parte de una población de células T proliferadas que comprenden un TCR o CAR modificado con un anticuerpo anti-CD3 o fragmento de unión a CD3 de este, y un anticuerpo anti-CD28 o fragmento de unión a CD28 de este, que estimula una molécula accesoria de CD28 en la superficie de las células T, mediante la reestimulación de este modo de las células T activadas para que proliferen; en donde las células T reestimuladas han mantenido la proliferación y la diferenciación disminuida en comparación con la proliferación de células T que se estimularon o reestimularon en ausencia del inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR.
En ejemplos particulares, las células comprenden un TCR modificado.
En determinados ejemplos, las células comprenden un CAR.
En otros ejemplos particulares, las células comprenden un vector viral que codifica un TCR o CAR modificado. En ejemplos adicionales, el vector es un vector retroviral.
En ejemplos adicionales, el vector es un vector lentiviral.
En ejemplos particulares, el CAR comprende: un dominio extracelular que se une a un antígeno que se selecciona del grupo que consiste en: receptor alfa de folato, 5T4, integrina avp6, Bc Ma , B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, 'Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM y VEGFR2; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: CD8a; CD4, CD28, CD45, PD-1 y CD152; uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelular que se seleccionan del grupo que consiste en: CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1) y CD278 (ICOS); y un dominio de señalización de CD3Z.
En algunos ejemplos, el dominio extracelular comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une al antígeno.
En determinados ejemplos, el dominio transmembrana se deriva de CD8a o CD28.
En ejemplos adicionales, uno o más dominios de señalización coestimuladora se seleccionan del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137.
En ejemplos particulares, el CAR comprende un polipéptido de la región bisagra.
En otros ejemplos, el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de IgG1 o CD8a.
En ejemplos adicionales, el CAR comprende un péptido señal.
En otros ejemplos particulares, el péptido señal comprende un polipéptido señal de la cadena pesada de IgG1 o un polipéptido señal de CD8a.
En ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR se selecciona del grupo que consiste en: BEZ235, LY294002, GDC-0941, BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, IPI-145, MK-2206, GSK690693, GDC-0068, A-674563, CCT128930, AZD8055, INK128, rapamicina, PF-04691502, everolimus, BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK, AT7867, NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75, ZSTK474 y PP-121.
En ejemplos adicionales, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de pan-PI3K que se selecciona del grupo que consiste en: BEZ235, LY294002 y GDC-0941.
En otros ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor selectivo de PI3K que se selecciona del grupo que consiste en: BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101 y IPI-145.
En otros ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es el inhibidor de PI3K ZSTK474.
En determinados ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de pan-AKT que se selecciona del grupo que consiste en: MK-2206, GSK690693 y GDC-0068.
En ejemplos particulares, en donde el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es el inhibidor selectivo de AKT1 A-674563. En ejemplos adicionales, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es el inhibidor selectivo de AKT2 CCT128930. En algunos ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR inhibe la activación de AKT por ADN-PK.
En ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR inhibe la activación de AKT por PDK-1.
En determinados ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR inhibe la activación de AKT por mTORC2.
En ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR inhibe la activación de AKT por HSP.
En ejemplos adicionales, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de pan-mTOR que se selecciona del grupo que consiste en: AZD8055, INK128 y rapamicina.
En ejemplos adicionales, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor selectivo de mTORC1 que se selecciona del grupo que consiste en: PF-04691502 y everolimus.
En algunos ejemplos, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de la quinasa s6 que se selecciona del grupo que consiste en: BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK y AT7867.
En otros ejemplos particulares, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de ADN-PK que se selecciona del grupo que consiste en: NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 y PP-121.
En ejemplos particulares, la población de células T activadas reestimuladas en presencia de un inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR tiene un mayor número de células T que expresan uno o más marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127 en comparación con una población de células T activadas y estimuladas en ausencia del inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR.
En ejemplos adicionales, la población de células T activadas reestimuladas en presencia de un inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR no expresa CD57 o KLRG1 o expresa menos CD57 o KLRG1 en comparación con una población de células T activadas y estimuladas en ausencia del inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR.
En diversos ejemplos, se proporciona una población de células T que comprende un vector que comprende un TCR o CAR modificado, en donde las células se han activado y estimulado para proliferar en presencia de un inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR.
En diversos ejemplos particulares, se proporciona una población de células T que comprende un vector que comprende un TCR o CAR modificado, en donde las células se han activado y estimulado para proliferar en presencia de un inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR y se han reestimulado al poner en contacto la totalidad o una parte de una población de células efectoras inmunitarias proliferadas con un anticuerpo anti-CD3 o fragmento de unión a CD3 de este, y un anticuerpo anti-CD28 o fragmento de unión a CD28 de este, que estimula una molécula accesoria de CD28 en la superficie de las células efectoras inmunitarias.
En determinados ejemplos, las células efectoras inmunitarias comprenden las células T.
En un ejemplo, las células efectoras inmunitarias son los TIL.
En diversos ejemplos, se proporciona una composición que comprende una población de células efectoras inmunitarias que se contemplan en la presente descripción y un excipiente fisiológicamente aceptable.
En diversos ejemplos determinados, se proporciona un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad de efecto terapéutico de una composición de células T que se contempla en la presente descripción.
En ejemplos particulares, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en tumor de Wilms, sarcoma de Ewing, un tumor neuroendocrino, un glioblastoma, un neuroblastoma, un melanoma, cáncer de piel, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer biliar, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma medular de tiroides, cáncer de ovario, glioma, linfoma, leucemia, mieloma, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin y cáncer de vejiga urinaria.
En un ejemplo, el cáncer está asociado o es provocado por una infección viral, por ejemplo, la infección por CMV, HPV o EBV.
En ejemplos adicionales, el cáncer es cáncer de páncreas y el dominio de unión extracelular se une a un epítopo de PSCA o MUC1.
En algunos ejemplos, el cáncer es cáncer de vejiga y el dominio de unión extracelular se une a un epítopo de PSCA o MUC1.
En ejemplos adicionales, el cáncer es glioblastoma multiforme y el dominio de unión extracelular se une a un epítopo de EPHA2, EGFRvIII o CSPG4.
En ejemplos particulares, el cáncer es cáncer de pulmón y el dominio de unión extracelular se une a un epítopo de PSCA o GD2.
En determinados ejemplos, el cáncer es cáncer de mama y el dominio de unión extracelular se une a un epítopo de CSPG4 o HER2.
En ejemplos adicionales, el cáncer es melanoma y el dominio de unión extracelular se une a un epítopo de CSPG4 o GD2.
En ejemplos particulares, el cáncer es una neoplasia maligna de células B y el dominio de unión se une a un epítopo de BCMA.
En diversos ejemplos, se proporciona un método para tratar una neoplasia maligna hematológica en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad de efecto terapéutico de una composición de células T que se contempla en la presente descripción.
En determinados ejemplos, la neoplasia maligna hematológica es una neoplasia maligna de células B que se selecciona del grupo que consiste en: mieloma múltiple (MM), leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfoma no Hodgkin (NHL).
En ejemplos particulares, el MM se selecciona del grupo que consiste en: mieloma múltiple sintomático, mieloma múltiple asintomático, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma IgD, mieloma osteosclerótico, plasmocitoma óseo solitario y plasmocitoma extramedular.
En determinados ejemplos, el NHL se selecciona del grupo que consiste en: linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño (CLL/SLL), linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B y linfoma de células del manto.
Breve descripción de varias vistas de los dibujos
La Figura 1 muestra un ejemplo representativo del mantenimiento de la proliferación de células T en las células T tratadas con un inhibidor de AKT. Las células T se cultivaron con diversas concentraciones del inhibidor de AKT, MK-22067 hasta siete días. Los paneles situados más a la derecha muestran el porcentaje de células T divididas de los cultivos de células T iniciados a partir de seis muestras de PBMC de donantes normales. Cada símbolo en el panel situado más a la derecha representa un cultivo único realizado en paralelo con una dosis titulada de MK-2206. Los paneles situados más a la izquierda muestran un ejemplo representativo de estos experimentos. A) Después de tres días de cultivo con MK-2206, la proliferación de células T solo disminuyó ligeramente en comparación con el control sin tratamiento. B) Después de 7 días de cultivo con MK-2206, la proliferación de células T no fue sustancialmente diferente en comparación con el control sin tratamiento.
La Figura 2 muestra un ejemplo representativo de la expresión de CD62L de células T tratadas con un inhibidor de AKT. Las células T se cultivaron con diversas concentraciones del inhibidor de AKT, MK-22067 hasta siete días. Los paneles situados más a la derecha muestran el porcentaje de células T que expresan CD62L de los cultivos de células T iniciados a partir de seis muestras de PBMC de donantes normales. Cada símbolo en el panel situado más a la derecha representa un cultivo único realizado en paralelo con una dosis titulada de MK-2206. Los paneles situados más a la izquierda muestran un ejemplo representativo de estos experimentos. A) Después de tres días de cultivo con MK-2206, la expresión de CD62L en las células T tratadas con MK-2206 no fue sustancialmente diferente en comparación con el control sin tratamiento. B) Después de 7 días de cultivo, las células T tratadas con MK-2206 mostraron niveles significativamente más altos de expresión de CD62L en comparación con el control sin tratamiento.
La Figura 3 muestra la expresión de CD62L en células T con CAR anti-BCMA evaluadas por citometría de flujo al final del cultivo con m K-2206, TCN o ZSTK474. MK-2206 y ZSTK474 tenían una expresión de CD62L significativamente mayor en comparación con los cultivos de células T con CAR tratadas con IL-2 sola o con TCN. La Figura 4 muestra el volumen tumoral medio de los tumores de mieloma múltiple en ratones tratados con células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-2, IL-7 e IL-15, MK-2206, ZST747 o TCN. Las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-7 e IL-15, MK-2206 o ZST747 mostraron niveles similares de actividad antitumoral en comparación con las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-2 estándar. Las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con TCN no mostraron una respuesta antitumoral.
La Figura 5 muestra la actividad antitumoral de las células T con CAR anti-BCMA tratadas con IL-2, IL-7/15, MK-2206, TCN o ZSTK474 en un modelo de tumor Daudi. La progresión del tumor Daudi no se vio afectada después del tratamiento con células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-2 o IL7/15. Las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con MK-2206 o ZST474 provocaron una regresión tumoral completa.
La Figura 6 muestra la persistencia de las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con ZSTK474 en animales tratados con células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-2, MK-2206 o ZSTK474 que habían retrocedido completamente un tumor RPMI-8226 de 100mm3 Los animales se volvieron a estimular 13 días después con RPMI-8226 en el flanco opuesto. Los animales tratados con células T con CAR cultivadas con IL-2 no pudieron prevenir el crecimiento tumoral. Ninguno de los animales tratados con células T con CAR anti-BCMA cultivadas con ZSTK474 tenía ninguna evidencia de injerto tumoral.
Descripción detallada
A. Visión general
La invención en general se refiere a los métodos mejorados para la producción de composiciones de células T. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, los métodos inventivos que se contemplan en la presente descripción desacoplan la proliferación de células T de la diferenciación para producir células T que tienen propiedades superiores, por ejemplo, mayor supervivencia, expansión y persistencia in vivo junto con una disminución concomitante en la diferenciación, en comparación con las composiciones de células T existentes en la técnica. Por consiguiente, las composiciones de células T que se contemplan en la presente descripción comprenden las células T potentes, que tienen características de poblaciones de células T jóvenes o vírgenes, que son capaces de múltiples rondas de expansión con poca diferenciación. Además, las células expandidas pueden diferenciarse posteriormente y proporcionar las funciones de células efectoras inmunitarias.
En diversas modalidades, se proporciona un método para la producción de células T que mantiene o reduce mínimamente la proliferación de células T y reduce, disminuye o mitiga la diferenciación de células T durante la expansión de células T. En modalidades preferidas particulares, se produce una composición de células T modificadas mediante los métodos que se contemplan en la presente descripción, que pueden aumentar adicionalmente la eficacia de una inmunoterapia adoptiva de células T. Las composiciones de células T producidas que se contemplan en la presente descripción son útiles en el tratamiento o la prevención de numerosas afecciones que incluyen, pero no se limitan a, el cáncer, la enfermedad infecciosa, la enfermedad autoinmunitaria, la enfermedad inflamatoria y la inmunodeficiencia. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, el presente inventor ha descubierto de manera sorprendente e inesperada que la modulación de las vías de señalización celular en las células T, cuyas vías están normalmente asociadas con la proliferación en las células cancerosas, da como resultado el mantenimiento sustancial o la reducción insustancial de la proliferación de células T y la disminución de la diferenciación de células T durante la expansión de células T en comparación con las células T donde las vías de señalización celular no están moduladas.
En un ejemplo, un método de producción de células T modificadas comprende poner en contacto las células T con un agente que inhibe una vía PI3K/AKT/mTOR en las células. Las células pueden ponerse en contacto antes, durante y/o después de la activación y la expansión. Las composiciones de células T modificadas conservan suficiente potencia de células T de modo que pueden experimentar múltiples rondas de expansión sin un aumento sustancial en la diferenciación.
En consecuencia, los métodos y las composiciones que se contemplan en la presente descripción representan una mejora cuantitativa en comparación con las inmunoterapias adoptivas de células existentes.
La práctica de la invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, los métodos convencionales de química, bioquímica, química orgánica, biología molecular, microbiología, las técnicas de ADN recombinante, genética, inmunología y biología celular que están dentro de la técnica, muchos de los cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra Edición, 2001); Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da Edición, 1989); Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado en julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach y W. Strober, eds., 1991); Annual Review o f Immunology; así como también las monografías en revistas como Advances in Immunology.
B. Definiciones
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que se entiende habitualmente en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, en la presente descripción se describen las modalidades preferidas de las composiciones, los métodos y los materiales. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.
Los artículos "un", "una" y "el/la" se usan en la presente descripción para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % con relación a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En modalidades particulares, los términos "aproximadamente" o "alrededor de" cuando preceden a un valor numérico indican el valor más o menos un intervalo de 15 %, 10 %, 5 % o 1 %.
Como se usa en la presente descripción, el término "sustancialmente" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En una modalidad, "sustancialmente igual" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que produce un efecto, por ejemplo, un efecto fisiológico, que es aproximadamente el mismo que una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
A lo largo de esta descripción, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, se entenderá que las palabras "comprende", "comprenden" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos mencionados son indispensables u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "consiste esencialmente en" se entiende que incluye todos los elementos mencionados después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren o no contribuyen a la actividad o la acción especificada en la descripción de los elementos mencionados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son indispensables u obligatorios, pero que ningún otro elemento es opcional y puede estar presente o no dependiendo de si afectan o no a la actividad o la acción de los elementos enumerados.
La referencia a lo largo de esta descripción a "una modalidad", "una modalidad particular', "una modalidad relacionada", "una determinada modalidad", "una modalidad adicional" u "otra modalidad" o las combinaciones de estas significa que una característica, estructura o rasgo particular descrito en relación con la modalidad se incluye en al menos una modalidad de la presente invención. Por lo tanto, las apariciones de las frases anteriores en diversos lugares a lo largo de esta descripción no se refieren necesariamente a la misma modalidad. Además, las características, las estructuras o los rasgos particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más modalidades.
Como se usa en la presente descripción, los términos "producción de células T" o "métodos de producción de células T" o los términos comparables se refieren al proceso de producción de una composición terapéutica de células T, dichos métodos de producción pueden comprender uno o más de, o todas las etapas siguientes: cosecha, estimulación, activación y expansión.
Los términos "células T" o "linfocitos T" son reconocidos en la técnica y están destinados a incluir los timocitos, los linfocitos T vírgenes, los linfocitos T inmaduros, los linfocitos T maduros, los linfocitos T en reposo o los linfocitos T activados. La célula T puede ser una célula T colaboradora (Th), por ejemplo, una célula T colaboradora 1 (Th1) o una célula T colaboradora 2 (Th2). La célula T puede ser una célula T colaboradora (HTL; célula T CD4+) célula T CD4+, una célula T citotóxica (CTL; célula T CD8+), una célula T citotóxica infiltrante de tumor (TIL; célula T CD8+), célula T CD4+ CD8+, célula T CD4- CD8- o cualquier otro subconjunto de células T. Otras poblaciones ilustrativas de células T adecuadas para el uso en las modalidades particulares incluyen las células T vírgenes y las células T de memoria. "Células T potentes" y "células T jóvenes" se usan indistintamente en las modalidades particulares y se refieren a los fenotipos de células T en donde la célula T es capaz de la proliferación y una disminución concomitante en la diferenciación. En modalidades particulares, la célula T joven tiene el fenotipo de una "célula T virgen". En diversas modalidades, los métodos de producción que se contemplan en la presente descripción producen células T jóvenes; células donde la proliferación de células T se ha desacoplado de la diferenciación de células T durante la estimulación, la activación y la expansión de células T. Sin desear estar ligado a ninguna teoría particular, las células T potentes producidas con las composiciones y los métodos que se contemplan poseen una mayor eficacia antitumoral después de la transferencia adoptiva. En modalidades particulares, las células T jóvenes comprenden uno o más de, o todos, los siguientes marcadores biológicos: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127. En una modalidad, las células T jóvenes comprenden uno o más de, o todos, los siguientes marcadores biológicos: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127 y carecen de expresión de CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3.
Como se usa en la presente descripción, el término "proliferación" se refiere a un aumento en la división celular, ya sea división simétrica o asimétrica de las células. En modalidades particulares, la "proliferación" se refiere a la división simétrica o asimétrica de las células T. Un "aumento de la proliferación" ocurre cuando hay un incremento en el número de células en una muestra tratada en comparación con las células en una muestra no tratada.
Como se usa en la presente descripción, el término "diferenciación" se refiere a un método para disminuir la potencia o la proliferación de una célula o mover la célula a un estado más restringido en el desarrollo. En modalidades particulares, las células T diferenciadas adquieren las funciones de células efectoras inmunitarias.
Una "célula efectora inmunitaria" es cualquier célula del sistema inmunitario que tiene una o más funciones efectoras (por ejemplo, actividad citotóxica para matar células, secreción de citocinas, inducción de ADCC y/o CDC). Las células efectoras inmunitarias ilustrativas que se contemplan en la presente descripción son los linfocitos T, en particular las células T citotóxicas (CTL; células T CD8+) y células T colaboradoras (HTL; células T CD4+).
Las "células T modificadas" se refieren a las células T que se han modificado mediante la introducción de un polinucleótido que codifica un CAR o TCR modificado que se contempla en la presente descripción. Las células T modificadas incluyen las modificaciones genéticas y no genéticas (por ejemplo, episomales o extracromosómicas). Como se usa en la presente descripción, el término "diseñado genéticamente" o "modificado genéticamente" se refiere a la adición de material genético adicional en forma de ADN o ARN en el material genético total en una célula.
Los términos "células modificadas genéticamente", "células modificadas" y "células redirigidas" se usan indistintamente.
Como se usa en la presente descripción, el término "terapia génica" se refiere a la introducción de material genético adicional en forma de ADN o ARN en el material genético total en una célula que restaura, corrige o modifica la expresión de un gen, o con el fin de expresar un polipéptido terapéutico, por ejemplo, un TCR o CAR y/o una o más citocinas. En modalidades particulares, las células T se modifican para expresar un CAR o TCR modificado sin modificar el genoma de las células, por ejemplo, mediante la introducción de un vector episomal que expresa el TCR o CAR en la célula.
El término "ex vivo" se refiere generalmente a las actividades que tienen lugar fuera de un organismo, tales como la experimentación o las mediciones realizadas en o sobre el tejido vivo en un ambiente artificial fuera del organismo, preferentemente con una alteración mínima de las condiciones naturales. En modalidades particulares, los procedimientos "ex vivo" implican las células o los tejidos vivos tomados de un organismo y cultivados o modulados en un aparato de laboratorio, generalmente en condiciones estériles, y típicamente durante unas pocas horas o hasta aproximadamente 24 horas, pero que incluyen hasta 48 o 72 horas, según las circunstancias. En determinadas modalidades, tales tejidos o células pueden recogerse y congelarse, y después descongelarse para su tratamiento ex vivo. Los experimentos o los procedimientos de cultivo de tejidos que duran más de unos pocos días mediante el uso de células o tejidos vivos se consideran típicamente "in vitro", aunque en determinadas modalidades, este término puede usarse indistintamente con ex vivo.
El término "in vivo" se refiere generalmente a las actividades que tienen lugar dentro de un organismo, tales como la autorrenovación celular y la expansión de las células. En un ejemplo, el término "expansión in vivo" se refiere a la capacidad de una población celular de aumentar su número in vivo.
El término "estimulación" se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando correspondiente lo que media de este modo un evento de transducción de señales que incluye, pero no se limita a, la transducción de señales a través del complejo TCR/CD3. Una "molécula estimuladora" se refiere a una molécula en una célula T que se une específicamente con un ligando estimulador correspondiente.
Un "ligando estimulador", como se usa en la presente descripción, significa un ligando que cuando está presente en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, una célula dendrítica, una célula B y similares) puede unirse específicamente con una pareja de unión correspondiente (referida en la presente descripción como una "molécula estimuladora") en una célula T, lo que media de este modo una respuesta primaria de la célula T, que incluye, pero no se limita a, la activación, la iniciación de una respuesta inmunitaria, la proliferación y similares. Los ligandos estimulantes incluyen, pero no se limitan a, ligandos CD3, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 y ligandos CD2, por ejemplo, anticuerpo anti-CD2, y péptidos, por ejemplo, péptidos de CMV, HPV, EBV.
El término "activación" se refiere al estado de una célula T que se ha estimulado suficientemente para inducir una proliferación celular detectable. En modalidades particulares, la activación también puede estar asociada con la producción inducida de citocinas y las funciones efectoras detectables. El término "células T activadas" se refiere, entre otras cosas, a las células T que proliferan. Las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación completa de la célula T y también se requieren una o más señales secundarias o coestimuladoras. Por lo tanto, la activación de células T comprende una señal de estimulación primaria a través del complejo TCR/CD3 y una o más señales coestimuladoras secundarias. La coestimulación puede evidenciarse por la proliferación y/o la producción de citocinas por las células T que han recibido una señal de activación primaria, como la estimulación a través del complejo CD3/TCR o a través de CD2.
Una "señal coestimuladora" se refiere a una señal que, en combinación con una señal primaria, como la unión de TCR/CD3, conduce a la proliferación de células T, la producción de citocinas y/o la regulación positiva o negativa de moléculas particulares (por ejemplo, CD28).
Un "ligando coestimulador" se refiere a una molécula que se une a una molécula coestimuladora. Un ligando coestimulador puede ser soluble o proporcionarse en una superficie. Una "molécula coestimuladora" se refiere a la pareja de unión correspondiente en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador (por ejemplo, anticuerpo anti-CD28).
"Autólogo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células de este sujeto.
"Alogénico", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de la misma especie que difieren genéticamente de la célula en comparación.
"Singénico", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células de un sujeto diferente que son genéticamente idénticas a la célula en comparación.
"Xenogénico", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células de una especie diferente a la célula en comparación. En modalidades preferidas, las células de la invención son alogénicas.
Como se usa en la presente descripción, los términos "individuo" y "sujeto" a menudo se usan indistintamente y se refieren a cualquier animal que presente un síntoma de cáncer que pueda tratarse con los vectores de terapia génica, los productos terapéuticos basados en células y los métodos descritos en otra parte de la presente descripción. Los sujetos adecuados (por ejemplo, los pacientes) incluyen los animales de laboratorio (tales como ratones, ratas, conejos o conejillos de Indias), los animales de granja y los animales domésticos o mascotas (tales como gatos o perros). Se incluyen los primates no humanos y, preferentemente, los pacientes humanos. Los sujetos típicos incluyen los pacientes humanos que tienen cáncer, se han diagnosticado con cáncer o están en riesgo o tienen cáncer.
Como se usa en la presente descripción, el término "paciente" se refiere a un sujeto que se ha diagnosticado con una indicación particular que puede tratarse con los vectores de terapia génica, los productos terapéuticos basados en células y los métodos descritos en otra parte en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción "tratamiento" o "tratar", incluye cualquier efecto beneficioso o conveniente sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o afección patológica, y puede incluir incluso las reducciones mínimas en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o la afección que se está tratando, por ejemplo, un cáncer. El tratamiento puede incluir opcionalmente la reducción o la mejora de los síntomas de la enfermedad o la afección, o el retraso de la progresión de la enfermedad o la afección. El "tratamiento" no indica necesariamente la erradicación o la cura completa de la enfermedad o la afección, o los síntomas asociados de esta.
Como se usa en la presente descripción, "prevenir" y las palabras similares como "prevenido", "que previene", etc., indican un enfoque para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de la aparición o la recurrencia de una enfermedad o afección, por ejemplo, un cáncer. También se refiere a retrasar el inicio o la recurrencia de una enfermedad o afección o retrasar la aparición o la recurrencia de los síntomas de una enfermedad o afección. Como se usa en la presente descripción, "prevención" y las palabras similares incluyen además reducir la intensidad, el efecto, los síntomas y/o la carga de una enfermedad o afección antes del inicio o la recurrencia de la enfermedad o la afección.
Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad" se refiere a "una cantidad eficaz" o "una cantidad efectiva" de una célula terapéutica modificada genéticamente, por ejemplo, una célula T, para lograr un resultado profiláctico o terapéutico beneficioso o deseado, que incluye los resultados clínicos.
Una "cantidad con eficacia profiláctica" se refiere a una cantidad de una célula terapéutica modificada genéticamente que es eficaz para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad con eficacia profiláctica es menor que la cantidad con eficacia terapéutica.
Una "cantidad con eficacia terapéutica" de una célula terapéutica modificada genéticamente puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de las células T para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad con eficacia terapéutica es también aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos compensan los efectos tóxicos o perjudiciales del virus o las células terapéuticas transducidas. El término "cantidad con eficacia terapéutica" incluye una cantidad que es eficaz para "tratar" a un sujeto (por ejemplo, un paciente). Cuando se indica una cantidad terapéutica, un médico puede determinar la cantidad precisa de las composiciones de la presente descripción a administrar teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o las metástasis y el estado del paciente (sujeto).
Como se usa en la presente descripción, el término "cáncer" se refiere generalmente a una clase de enfermedades o afecciones en las que las células anormales se dividen sin control y pueden invadir los tejidos cercanos.
Como se usa en la presente descripción, el término "maligno" se refiere a un cáncer en el que un grupo de células tumorales muestra uno o más de crecimiento incontrolado (es decir, división más allá de los límites normales), invasión (es decir, intrusión y destrucción de tejidos adyacentes), y metástasis (es decir, propagación a otros lugares del cuerpo a través de la linfa o la sangre). Como se usa en la presente descripción, el término "metástasis" se refiere a la propagación del cáncer de una parte del cuerpo a otra. Un tumor formado por células que se han diseminado se denomina "tumor metastásico" o "metástasis". El tumor metastásico contiene células que son similares a las del tumor original (primario).
Como se usa en la presente descripción, el término "benigno" o "no maligno" se refiere a tumores que pueden crecer más pero no se propagan a otras partes del cuerpo. Los tumores benignos son autolimitados y generalmente no invaden ni hacen metástasis.
Una "célula cancerosa" o "célula tumoral" se refiere a una célula individual de crecimiento o tejido canceroso. Un tumor se refiere generalmente a una hinchazón o lesión formada por un crecimiento anormal de células, que puede ser benigno, premaligno o maligno. La mayoría de los cánceres forman tumores, pero algunos, por ejemplo, la leucemia, no necesariamente forman tumores. Para aquellos cánceres que forman tumores, los términos cáncer (célula cancerosa) y tumor (célula tumoral) se usan indistintamente. La cantidad de un tumor en un individuo es la "carga tumoral" que puede medirse como el número, el volumen o el peso del tumor.
Una "enfermedad infecciosa" se refiere a una enfermedad que puede transmitirse de persona a persona o de organismo a organismo, y es provocada por un agente microbiano (por ejemplo, el resfriado común). Las enfermedades infecciosas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, la hepatitis, las enfermedades de transmisión sexual (por ejemplo, Clamidia, gonorrea), la tuberculosis, el VIH/SIDA, la difteria, la hepatitis B, la hepatitis C, el cólera y la gripe.
Una "enfermedad autoinmunitaria" se refiere a una enfermedad en la cual el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (es decir, del sistema inmunitario) a algún componente de su propio tejido. En otras palabras, el sistema inmunitario pierde su capacidad de reconocer algunos tejidos o sistemas dentro del cuerpo como "propios" y los detecta y ataca como si fueran extraños. Las enfermedades autoinmunitarias pueden clasificarse en aquellas en las que se afecta un órgano de manera predominante (por ejemplo, la anemia hemolítica y la tiroiditis autoinmunitaria), y aquellas en las que el proceso de la enfermedad autoinmunitaria se difunde a través de muchos tejidos (por ejemplo, el lupus eritematoso sistémico). Por ejemplo, se cree que la esclerosis múltiple es provocada por las células T que atacan las vainas que rodean las fibras nerviosas del cerebro y la médula espinal. Esto resulta en la pérdida de coordinación, debilidad y visión borrosa. Las enfermedades autoinmunitarias se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, la tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad de Grave, el lupus, la esclerosis múltiple, la artritis reumatoide, la anemia hemolítica, la tiroiditis autoinmunitaria, el lupus eritematoso sistémico, la enfermedad celíaca, la enfermedad de Crohn, la colitis, la diabetes, la esclerodermia, la psoriasis y similares.
Una "inmunodeficiencia" significa el estado de un paciente cuyo sistema inmunitario se ha deprimido por una enfermedad o por la administración de productos químicos. Esta afección hace que el sistema tenga deficiencia en la cantidad y el tipo de células sanguíneas necesarias para defenderse de una sustancia extraña. Las afecciones o las enfermedades de inmunodeficiencia se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, el SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida), la SCID (enfermedad de inmunodeficiencia combinada severa), la deficiencia selectiva de IgA, la inmunodeficiencia variable común, la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, la enfermedad granulomatosa crónica, el síndrome de hiper-IgM y la diabetes.
Por "mejorar" o "promover', o "aumentar' o "expandir' se refiere generalmente a la capacidad de una composición que se contempla en la presente descripción para producir, provocar o causar una mayor respuesta fisiológica (es decir, efectos posteriores) en comparación con la respuesta provocada ya sea por un vehículo o una molécula/composición de control. Una respuesta fisiológica medible puede incluir un aumento en la expansión, la activación, la persistencia de células T y/o un aumento en la capacidad de muerte de las células cancerosas, entre otros evidentes a partir de la comprensión de la técnica y la descripción en la presente descripción. Una cantidad "aumentada" o "mejorada" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluidos todos los números enteros y decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, etc.) la respuesta producida por el vehículo o una composición de control.
Por "disminuir", "aminorar', "atenuar', "reducir" o "mitigar' se refiere generalmente a la capacidad de la composición que se contempla en la presente descripción para producir, provocar o causar una respuesta fisiológica menor (es decir, efectos posteriores) en comparación a la respuesta provocada por el vehículo o una molécula/composición de control. Una cantidad "disminuida" o "reducida" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir una disminución que es 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluidos todos los números enteros y decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, etc.) la respuesta (respuesta de referencia) producida por el vehículo, una composición de control o la respuesta en un linaje celular particular.
Por "mantener' o "preservar' o "mantenimiento" o "sin cambio" o "sin cambio sustancial" o "sin disminución sustancial" se refiere generalmente a la capacidad de una composición que se contempla en la presente descripción para producir, provocar o causar una respuesta fisiológica menor (es decir, efectos posteriores) en una célula, en comparación con la respuesta provocada por un vehículo, una molécula/composición de control o la respuesta en un linaje celular particular. Una respuesta comparable es aquella que no es diferente significativamente o diferente cuantitativamente de la respuesta de referencia.
Los términos "afinidad de unión específica" o "se une específicamente" o "unido específicamente" o "unión específica" o "dirigido específicamente" como se usa en la presente descripción, describen la unión de una molécula a otra con una mayor afinidad de unión que la unión de fondo. Un dominio de unión (o un CAR que comprende un dominio de unión o una proteína de fusión que contiene un dominio de unión) "se une específicamente" a una molécula objetivo si se une o se asocia con una molécula objetivo con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) de, por ejemplo, mayor o igual que aproximadamente 105 M-1. En determinadas modalidades, un dominio de unión (o una proteína de fusión de este) se une a un objetivo con una Ka mayor o igual que aproximadamente 106 M-1107 M-1108 M-1109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 o 1013 M-1. Los dominios de unión de "alta afinidad" (o proteínas de fusión de cadena sencilla de estos) se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 1013 M-1 o mayor.
Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación en equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, 10-5 M a 10-13 M, o menos). Las afinidades de los polipéptidos del dominio de unión y las proteínas CAR de acuerdo con la presente descripción pueden determinarse fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales, por ejemplo, mediante ELISA competitivo (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), o mediante asociación de unión, o ensayos de desplazamiento mediante el uso de ligandos marcados, o mediante el uso de un dispositivo de resonancia de plasmones de superficie como el Biacore T100, que está disponible de Biacore, Inc., Piscataway, NJ, o tecnología de biosensores ópticos como el sistema EPIC o EnSpire que están disponibles de Corning y Perkin Elmer respectivamente (ver también, por ejemplo, Scatchard y otros (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; y las patentes de los Estados Unidos núms. 5,283,173; 5,468,614, o el equivalente). En una modalidad, la afinidad de la unión específica es aproximadamente 2 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 5 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 10 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 20 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 50 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 100 veces mayor que la unión de fondo, o aproximadamente 1000 veces mayor que la unión de fondo o más.
Un "antígeno (Ag)" se refiere a un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de células T en un animal, incluidas las composiciones (como una que incluye una proteína específica del tumor) que se inyectan o se absorben en un animal. Un antígeno reacciona con los productos de la inmunidad humoral o celular específica, incluidos los inducidos por los antígenos heterólogos, como los antígenos descritos. Un "antígeno objetivo" o "antígeno objetivo o de interés " es un antígeno para el cual se diseña un dominio de unión de un CAR, que se contemplan en la presente descripción, para unirse a él.
Un "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a la región de un antígeno al que se une un agente de unión. Un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado" y similares, como se usa en la presente descripción, se refieren al aislamiento y/o la purificación in vitro de un péptido o molécula de polipéptido de un entorno celular, y de la asociación con otros componentes de la célula, es decir, no está asociado significativamente con las sustancias in vivo. De manera similar, una "célula aislada" se refiere a una célula que se ha obtenido de un tejido u órgano in vivo y está sustancialmente libre de matriz extracelular.
Como se usa en la presente descripción, un "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que se ha purificado de las secuencias que lo flanquean en un estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento. Un "polinucleótido aislado" también se refiere a un ADN complementario (ADNc), un ADN recombinante u otro polinucleótido que no existe en la naturaleza y que se ha elaborado por la mano del hombre.
C. Métodos de producción de células T
Las células T producidas mediante los métodos que se contemplan en la presente descripción proporcionan las composiciones mejoradas de inmunoterapia adoptiva. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que las composiciones de células T producidas por los métodos que se contemplan en la presente descripción están imbuidas de propiedades superiores, que incluyen mayor supervivencia, expansión en ausencia relativa de la diferenciación y persistencia in vivo. En un ejemplo, un método de producción de células T comprende poner en contacto las células con uno o más agentes que modulan una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR. En diversas modalidades, las células T pueden obtenerse de cualquier fuente y ponerse en contacto con el agente durante las fases de activación y/o expansión del proceso de producción. Las composiciones de células T resultantes están enriquecidas en células T potentes para el desarrollo que tienen la capacidad de proliferar y expresar uno o más de los siguientes biomarcadores: CD62L, CCR7, CD28, Cd 27, CD 122 y CD 127.
En una modalidad, se producen células T modificadas que comprenden niveles mantenidos de proliferación y diferenciación disminuida. En un ejemplo particular, las células T se producen estimulando las células T para que se activen y proliferen en presencia de una o más señales estimulantes y un agente que es un inhibidor de una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR.
A continuación, las células T pueden modificarse para expresar uno o más TCR o CAR modificados. En una modalidad, las células T se modifican mediante la transducción de las células T con un vector viral que comprende un TCR o CAR modificado. En cierto ejemplo, las células T se modifican antes de la estimulación y activación en presencia de un inhibidor de una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR. En otro ejemplo, las células T se modifican después de la estimulación y la activación en presencia de un inhibidor de una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR. En un ejemplo particular, las células T se modifican dentro de las 12 horas, 24 horas, 36 horas o 48 horas de estimulación y activación en presencia de un inhibidor de una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR. Una vez que se activan las células T, las células se cultivan para que proliferen. Las células T pueden cultivarse durante al menos 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, al menos 2 semanas, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses o más con 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más rondas de expansión.
En diversos ejemplos, las composiciones de células T se producen en presencia de uno o más inhibidores de la vía PI3K/AKT/mTOR. Los inhibidores pueden dirigirse a una o más actividades en la vía o una sola actividad. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, se contempla que el tratamiento o el contacto de las células T con uno o más inhibidores de la vía PI3K/AKT/mTOR durante las fases de estimulación, activación y/o expansión del proceso de producción aumenta preferentemente las células T jóvenes, lo que produce de este modo las composiciones terapéuticas superiores de células T.
En una modalidad particular, se proporciona un método para aumentar la proliferación de células T que expresan un receptor de células T modificado. Dichos métodos pueden comprender, por ejemplo, recoger una fuente de células T de un sujeto, estimular y activar las células T en presencia de uno o más inhibidores de la vía PI3K/AKT/mTOR, la modificación de las células T para expresar un TCR o CAR, y expandir las células T en el cultivo.
En una determinada modalidad, un método para producir las poblaciones de células T enriquecidas para la expresión de uno o más de los siguientes biomarcadores: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127. En una modalidad relacionada, se proporciona un método para aumentar las células T que expresan CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127 y que no expresan o expresan niveles bajos de CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3. Como se discutió en otra parte en la presente descripción, los niveles de expresión de los biomarcadores de las células T jóvenes son relativos a los niveles de expresión de dichos marcadores en las células T más diferenciadas o las poblaciones de células efectoras inmunitarias.
En una modalidad, las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se usan como fuente de células T en los métodos de producción de células T que se contemplan en la presente descripción. Las PBMC forman una población heterogénea de linfocitos T que pueden ser CD4+, CD8+ o CD4+ y CD8+ y pueden incluir otras células mononucleares tales como monocitos, células B, células NK y células NKT. Puede introducirse un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un TCR o CAR modificado que se contempla en la presente descripción en una población de células T de donantes humanos, células NK o células NKT. Las células T transducidas con éxito que portan el vector de expresión pueden clasificarse mediante el uso de la citometría de flujo para aislar las células T CD3 positivas y luego propagarse para aumentar el número de las células T modificadas además de la activación celular mediante el uso de los anticuerpos anti-CD3 o los anticuerpos anti-CD28 e IL-2, IL-7 y/o IL-15 o cualquier otro método conocido en la técnica como se describe en otra parte en la presente descripción.
Los métodos de producción que se contemplan en la presente descripción pueden comprender además la crioconservación de las células T modificadas para el almacenamiento y/o la preparación para el uso en un sujeto humano. Las células T se crioconservan de modo que las células permanezcan viables tras la descongelación. Cuando sea necesario, las células efectoras inmunitarias transformadas crioconservadas pueden descongelarse, cultivarse y expandirse para obtener más células de este tipo. Como se usa en la presente descripción, la "crioconservación" se refiere a la conservación de las células por enfriamiento a temperaturas bajo cero, como (típicamente) 77 K o -196 °C. (el punto de ebullición del nitrógeno líquido). Los agentes crioprotectores se usan a menudo a temperaturas bajo cero para evitar que las células se preserven del daño debido al congelamiento a bajas temperaturas o al calentamiento a temperatura ambiente. Los agentes crioconservantes y las velocidades de enfriamiento óptimas pueden proteger contra el daño celular. Los agentes crioprotectores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, dimetilsulfóxido (DMSO) (Lovelock y Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina. (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576) y polietilenglicol (Sloviter y Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). La velocidad de enfriamiento preferida es de 1° C/minuto a 3 °C/minuto. Después de al menos dos horas, las células T han alcanzado una temperatura de -80 °C y se pueden colocar directamente en nitrógeno líquido (-196 °C) para su almacenamiento permanente, como en un recipiente de almacenamiento criogénico a largo plazo.
1. Células T
La presente invención contempla la producción de las composiciones de células T mejoradas. Las células pueden ser autólogas/autogénicas ("propias") o no autólogas ("no propias", por ejemplo, alogénicas, singénicas o xenogénicas). En modalidades preferidas, las células T se obtienen de un sujeto mamífero. En una modalidad más preferida, las células T se obtienen de un sujeto primate. En la modalidad más preferida, las células T se obtienen de un sujeto humano.
Las células T pueden obtenerse de varias fuentes que incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de la sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinadas modalidades, las células T pueden obtenerse a partir de una unidad de sangre recolectada de un sujeto mediante el uso de cualquier número de técnicas conocidas por el experto, tales como la sedimentación, por ejemplo, separación con FICOLL™. En una modalidad, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, que incluyen los linfocitos T, los monocitos, los granulocitos, las células B, otros glóbulos blancos nucleados, los glóbulos rojos y las plaquetas. En una modalidad, las células obtenidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un amortiguador o medio apropiado para el procesamiento posterior. Las células pueden lavarse con PBS o con otra solución adecuada que carezca de calcio, magnesio y la mayor parte, o todos los demás, cationes divalentes. Como apreciarán los expertos en la técnica, una etapa de lavado puede realizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como mediante el uso de una centrífuga de flujo continuo semiautomatizada. Por ejemplo, el procesador de celda Cobe 2991, el Baxter CytoMate o similares. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de amortiguadores biocompatibles u otra solución salina con o sin amortiguador. En determinadas modalidades, los componentes indeseables de la muestra de aféresis pueden eliminarse en el medio de cultivo resuspendido directamente de la célula.
En modalidades particulares, se usa una población de células que comprenden las células T, por ejemplo, las PBMC, en los métodos de producción que se contemplan en la presente descripción. En otras modalidades, se usa una población aislada o purificada de células T en los métodos de producción que se contemplan en la presente descripción. Las células pueden aislarse de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) mediante la lisis de los glóbulos rojos y la reducción de los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™. En algunas modalidades, después del aislamiento de las PBMC, los linfocitos T citotóxicos y colaboradores pueden clasificarse en subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y efectoras antes o después de la activación, expansión y/o modificación genética.
Una subpoblación específica de células T que expresan uno o más de los siguientes marcadores: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127 y HLA-Dr pueden aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. En una modalidad, una subpoblación específica de células T, que expresa uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127 se aísla adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. En diversas modalidades, las composiciones de células T producidas no expresan o no expresan sustancialmente uno o más de los siguientes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3.
En una modalidad, la expresión de uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127 aumenta al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de células T activadas y expandidas sin un inhibidor de PI3K/AKT/mTOR.
En una modalidad, la expresión de uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3 se reduce al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de células T activadas y expandidas con un inhibidor de PI3K/AKT/mTOR.
En una modalidad, los métodos de producción que se contemplan en la presente descripción aumentan el número de células T que comprenden uno o más marcadores de las células T vírgenes o potentes para el desarrollo. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que el tratamiento de una población de células que comprenden células T con uno o más inhibidores de PI3K/AKT/mTOR desacopla las señales de proliferación y diferenciación de células T y, por lo tanto, da como resultado un aumento y expansión de las células T potentes para el desarrollo y proporciona una inmunoterapia adoptiva más robusta y eficaz que las terapias con células T existentes.
Los ejemplos ilustrativos de los marcadores de las células T vírgenes o potentes para el desarrollo aumentadas en células T producidos mediante el uso de los métodos que se contemplan en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD95, CD122 y CD127. En modalidades particulares, las células T vírgenes no expresan, no expresan o no expresan sustancialmente uno o más de los siguientes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3 y LAG3.
Con respecto a las células T, las poblaciones de células T resultantes de las diversas metodologías de expansión que se contemplan en la presente descripción pueden tener una variedad de propiedades fenotípicas específicas, dependiendo de las condiciones empleadas. En diversas modalidades, las poblaciones de células T expandidas comprenden uno o más de los siguientes marcadores fenotípicos: CCR7, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD62L, CD95, CD122, CD127 y HLA-DR.
En una modalidad, dichos marcadores fenotípicos incluyen una expresión mejorada de uno o más de, o todos, CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127. En modalidades particulares, se expanden los linfocitos T CD8+ caracterizados por la expresión de los marcadores fenotípicos de las células T vírgenes, que incluyen CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127.
En modalidades particulares, se expanden las células T caracterizadas por la expresión de los marcadores fenotípicos de las células T de memoria central que incluyen CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122 y CD127 y negativas para granzima B. En algunas modalidades, las células T de memoria central son células T CD45RO+, CD62L+, CD8+.
En determinadas modalidades, se expanden los linfocitos T CD4+ caracterizados por la expresión de los marcadores fenotípicos de las células CD4+ vírgenes que incluyen CD62L y negativos para la expresión de CD45RA y/o CD45RO.
En algunas modalidades, las células CD4+ se caracterizan por la expresión de los marcadores fenotípicos de las células CD4+ de memoria central que incluyen CD62L y CD45RO positivas. En algunas modalidades, las células CD4+ efectoras son CD62L positivas y CD45RO negativas.
En determinados ejemplos, las células T se aíslan de un individuo y se modifican sin manipulación adicional ex vivo o in vitro. Después dichas células pueden volverse a administrar directamente al individuo. En modalidades adicionales, las células T se activan primero y se estimulan para que proliferen in vitro antes de modificarlas genéticamente para expresar un CAR o TCR modificado. A este respecto, las células T pueden cultivarse antes y/o después de ser modificadas genéticamente (es decir, transducidas o transfectadas para expresar un CAR o TCR modificado que se contempla en la presente descripción).
2. Activación y expansión
Con el fin de lograr las dosis terapéuticas suficientes de las composiciones de células T, las células T a menudo se someten a una o más rondas de estimulación, activación y/o expansión. Las células T pueden activarse y expandirse generalmente mediante el uso de los métodos como se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos núms. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514 y 6,867,041. Las células T modificadas para expresar un TCR o CAR diseñado mediante ingeniería pueden activarse y expandirse antes y/o después de que se modifiquen las células T. Además, las células T pueden ponerse en contacto con uno o más agentes que modulan la vía de señalización celular PI3K/AKT/mTOR antes, durante y/o después de la activación y/o expansión. En un ejemplo, las células T producidas mediante los métodos que se contemplan en la presente descripción se someten a una, dos, tres, cuatro o cinco o más rondas de activación y expansión, cada una de las cuales puede incluir uno o más agentes que modulan la vía señalización celular PI3K/AKT/mTOR.
En una modalidad, se presenta un ligando coestimulador en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, célula dendrítica, célula B y similares) que se une específicamente a una molécula coestimuladora correspondiente en una célula T, lo que proporciona de este modo una señal que, además a la señal primaria proporcionada, por ejemplo, por la unión de un complejo TCR/CD3, media una respuesta deseada de las células T. Los ligandos coestimuladores adecuados incluyen, pero no se limitan a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L 1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor beta de linfotoxina, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3.
En una modalidad particular, un ligando coestimulador comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en una célula T, que incluye, pero no se limita a, CD27, Cd 28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, 1COS, antígeno 1 asociado a la función linfocítica (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83.
Los ligandos coestimuladores adecuados incluyen además los antígenos objetivo, que pueden proporcionarse en forma soluble o expresarse en APC o aAPC, que se unen a TCR o CAR modificados expresados en las células T modificadas.
En diversas modalidades, un método para la producción de células T que se contempla en la presente descripción comprende activar una población de células que comprenden las células T y expandir la población de células T. La activación de las células T puede lograrse al proporcionar una señal de estimulación primaria a través del complejo TCR/CD3 de las células T o mediante la estimulación de la proteína de superficie CD2 y al proporcionar una señal de coestimulación secundaria a través de una molécula accesoria, por ejemplo, CD28.
El complejo TCR/CD3 puede estimularse al poner en contacto la célula T con un agente de unión a CD3 adecuado, por ejemplo, un ligando de CD3 o un anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos CD3 incluyen, pero no se limitan a, OKT3, G19-4, BC3 y 64.1.
En otra modalidad, puede usarse un agente de unión a CD2 para proporcionar una señal de estimulación primaria a las células T. Los ejemplos ilustrativos de agentes de unión a CD2 incluyen, pero no se limitan a, ligandos de CD2 y anticuerpos anti-CD2, por ejemplo, el anticuerpo T11.3 en combinación con el anticuerpo T11.1 o T11.2 (Meuer, S.C. y otros (1984) Cell 36:897-906) y el anticuerpo 9.6 (que reconoce el mismo epítopo que TI 1.1) en combinación con el anticuerpo 9-1 (Yang, S.Y. y otros (1986) J. Immunol. 137:1097-1100). También pueden usarse otros anticuerpos que se unen a los mismos epítopos que cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Pueden prepararse e identificarse anticuerpos adicionales, o combinaciones de anticuerpos, mediante las técnicas estándar como se describe en otra parte en la presente descripción.
Además de la señal de estimulación primaria proporcionada a través del complejo TCR/CD3, o mediante CD2, la inducción de las respuestas de las células T requiere una segunda señal coestimuladora. En modalidades particulares, puede usarse un agente de unión a CD28 para proporcionar una señal coestimuladora. Los ejemplos ilustrativos de los agentes de unión a CD28 incluyen, pero no se limitan a: ligandos naturales de CD 28, por ejemplo, un ligando natural para CD28 (por ejemplo, un miembro de la familia de proteínas B7, tales como B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86); y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 o fragmento de este que puede unirse a la molécula CD28, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 y EX5.3D10.
En una modalidad, la molécula que proporciona la señal de estimulación primaria, por ejemplo, una molécula que proporciona la estimulación a través del complejo TCR/CD3 o CD2, y la molécula coestimuladora están acopladas a la misma superficie.
En determinadas modalidades, los agentes de unión que proporcionan las señales estimuladoras y coestimuladoras se localizan en la superficie de una célula. Esto puede lograrse al transfectar o transducir una célula con un ácido nucleico que codifica el agente de unión en una forma adecuada para su expresión en la superficie celular o, alternativamente, acoplar un agente de unión a la superficie celular.
En otra modalidad, la molécula que proporciona la señal de estimulación primaria, por ejemplo, una molécula que proporciona la estimulación a través del complejo TCR/CD3 o CD2, y la molécula coestimuladora se muestran en las células presentadoras de antígeno.
En una modalidad, la molécula que proporciona la señal de estimulación primaria, por ejemplo, una molécula que proporciona la estimulación a través del complejo TCR/CD3 o CD2, y la molécula coestimuladora se proporcionan en superficies separadas.
En una determinada modalidad, uno de los agentes de unión que proporcionan las señales estimuladoras y coestimuladoras es soluble (en solución) y el (los) otro(s) agente(s) se proporciona(n) en una o más superficies. En una modalidad particular, los agentes de unión que proporcionan las señales estimuladoras y coestimuladoras se proporcionan en forma soluble (en solución).
En diversas modalidades, los métodos para producir las células T que se contemplan en la presente descripción comprenden activar las células T con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28.
Las composiciones de células T producidas mediante los métodos que se contemplan en la presente descripción comprenden las células T activadas y/o expandidas en presencia de uno o más agentes que inhiben una vía de señalización celular PI3K/AKT/mTOR. Las células T modificadas para expresar un TCR o CAR diseñado mediante ingeniería pueden activarse y expandirse antes y/o después de que se modifiquen las células T. En modalidades particulares, una población de células T se activa, se modifica para expresar un CAR o TCR modificado, y después se cultiva para su expansión.
En una modalidad, las células T producidas mediante los métodos que se contemplan en la presente descripción comprenden un número aumentado de células T que expresan los marcadores indicativos de un alto potencial proliferativo y la capacidad de autorrenovarse, pero que no expresan o expresan los marcadores sustancialmente indetectables de la diferenciación de células T. Estas células T pueden activarse y expandirse repetidamente de una manera robusta y, por lo tanto, proporcionar una composición de células T terapéutica mejorada.
En un ejemplo, una población de células T activadas y expandidas en presencia de uno o más agentes que inhiben una vía de señalización celular PI3K/AKT/mTOR se expande al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 250 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces o más en comparación con una población de células T activadas y expandidas sin un inhibidor de PI3K/AKT/mTOR.
En un ejemplo, una población de células T caracterizada por la expresión de los marcadores, las células T jóvenes se activan y se expanden en presencia de uno o más agentes que inhiben una vía de señalización celular PI3K/AKT/mTOR se expande al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 250 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces o más en comparación con la población de células T activadas y expandidas sin un inhibidor de PI3K/AKT/mTOR.
En una modalidad, expandir las células T activadas por los métodos que se contemplan en la presente descripción comprende además cultivar una población de células que comprenden las células T durante varias horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 7 días a aproximadamente 28 días o cualquier valor entero intermedio de forma horaria. En otra modalidad, la composición de células T puede cultivarse durante 14 días. En una modalidad particular, las células T se cultivan durante aproximadamente 21 días. En otra modalidad, las composiciones de células T se cultivan durante aproximadamente 2-3 días. También pueden desearse varios ciclos de estimulación/activación/expansión de modo que el tiempo de cultivo de las células T pueda ser de 60 días o más.
En modalidades particulares, las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Minimal Essential Media o RPMI Media 1640 o X-vivo 15, (Lonza)) y uno o más factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, que incluyen, pero no se limitan a, suero (por ejemplo, suero bovino fetal o humano), interleucina-2 (IL -2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualquier otro aditivo adecuado para el crecimiento de las células conocido por el experto en la técnica.
Otros ejemplos ilustrativos de los medios de cultivo celular incluyen, pero no se limitan a, RPMI 1640, Clicks, AIMV, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con adición de amino ácidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o complementados con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocinas suficiente para el crecimiento y expansión de las células T.
Los ejemplos ilustrativos de otros aditivos para la expansión de células T incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, piasmanato, amortiguadores de pH como HEPES y agentes reductores como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los antibióticos, por ejemplo, la penicilina y la estreptomicina, se incluyen solo en los cultivos experimentales, no en los cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células objetivo se mantienen en las condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37 °C) y atmósfera (por ejemplo, aire más 5 % de CO2) apropiadas.
En modalidades particulares, las PBMC o las células T aisladas se ponen en contacto con un agente estimulador y un agente coestimulador, tales como los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente unidos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citoquinas apropiadas, tales como IL-2, IL-7, y/o IL-15.
En otras modalidades, la APC artificial (aAPC) puede modificarse en células K562, U937, 721.221, T2 y C1R para dirigir la expresión y secreción estables de una variedad de moléculas coestimuladoras y citocinas. En una modalidad particular, las aAPC K32 o U32 se usan para dirigir la presentación de una o más moléculas estimuladoras basadas en anticuerpos en la superficie celular de las AAPC. Las poblaciones de células T pueden expandirse mediante las aAPC que expresan una variedad de moléculas coestimuladoras que incluyen, pero no se limitan a, CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L) y/o CD80 o CD86. Finalmente, las aAPC proporcionan una plataforma eficiente para expandir las células T modificadas genéticamente y para mantener la expresión de CD28 en las células T CD8. Las aAPC se proporcionan en los documentos núms. WO 03/057171 y US2003/0147869.
3. Agentes
En diversos ejemplos, se proporciona un método para la producción de células T que expande las células T indiferenciadas o potentes para el desarrollo que comprende poner en contacto las células T con un agente que modula una vía PI3K/AKT/mTOR en las células. Las células pueden ponerse en contacto antes, durante y/o después de la activación y la expansión. Las composiciones de células T retienen suficiente potencia de células T de modo que pueden sufrir múltiples rondas de expansión sin un aumento sustancial en la diferenciación.
Como se usa en la presente descripción, los términos "modular", "modulador" o "agente modulador" o un término comparable se refieren a la capacidad de un agente para provocar un cambio en una vía de señalización celular. Un modulador puede aumentar o disminuir una cantidad, la actividad de un componente de la vía o aumentar o disminuir un efecto o salida deseada de una vía de señalización celular. En un ejemplo, el modulador es un inhibidor. En otro ejemplo, el modulador es un activador.
Un "agente" se refiere a un compuesto, molécula pequeña, por ejemplo, molécula orgánica pequeña, ácido nucleico, polipéptido o un fragmento, isoforma, variante, análogo o derivado de este usado en la modulación de una vía PI3K/AKT/mTOR.
Una "molécula pequeña" se refiere a una composición que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD, menos de aproximadamente 4 kD, menos de aproximadamente 3 kD, menos de aproximadamente 2 kD, menos de aproximadamente 1 kD o menos de aproximadamente 0,5 kD. Las moléculas pequeñas pueden comprender ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, peptoides, carbohidratos, lípidos, componentes de estos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. Las bibliotecas de las mezclas químicas y/o biológicas, tales como los extractos de hongos, bacterias o algas, se conocen en la técnica y pueden seleccionarse con cualquiera de los ensayos de la descripción. Pueden encontrarse ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares en: (Carell y otros, 1994a; Carell y otros, 1994b; Cho y otros, 1993; DeWitt y otros, 1993; Gallop y otros, 1994; Zuckermann y otros, 1994). Un "análogo" se refiere a un compuesto orgánico pequeño, un nucleótido, una proteína o un polipéptido que posee una actividad o función similar o idéntica a la del compuesto, nucleótido, proteína o polipéptido o compuesto que tiene la actividad deseada de la presente invención, pero no necesita comprender necesariamente una secuencia o estructura que sea similar o idéntica a la secuencia o estructura de la modalidad preferida.
Un "derivado" se refiere a un compuesto, una proteína o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido original que se ha alterado por la introducción de sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos, o un ácido nucleico o nucleótido que se ha modificado mediante la introducción de sustituciones o deleciones, adiciones o mutaciones de nucleótidos. El ácido nucleico, nucleótido, proteína o polipéptido derivado posee una función similar o idéntica a la del polipéptido original.
En diversos ejemplos, el agente que modula una vía PI3K/AKT/mTOR activa un componente de la vía. Un "activador" o "agonista" se refiere a un agente que promueve, aumenta o induce una o más actividades de una molécula en una vía PI3K/AKT/mTOR que incluye, pero no se limita a, una molécula que inhibe una o más actividades de una PI3K, una Akt o una mTOR (o complejo mTORC1, mTORC2).
En diversos ejemplos, el agente que modula una vía PI3K/AKT/mTOR inhibe un componente de la vía. Un "inhibidor" o "antagonista" se refiere a un agente que inhibe, disminuye o reduce una o más actividades de una molécula en una vía PI3K/AKT/mTOR que incluye, pero no se limita a, una Pl3K, una Akt o una mTOR (o complejo mTORCI, mTORC2). En una modalidad, el inhibidor es un inhibidor de molécula dual. En una modalidad, el inhibidor evita la formación de los complejos de proteínas, tales como mTORCI o los complejos relacionados. En una modalidad particular, el inhibidor puede inhibir una clase de moléculas que tienen actividades iguales o sustancialmente similares (un inhibidor pan) o puede inhibir específicamente la actividad de una molécula (un inhibidor selectivo o específico). La inhibición también puede ser irreversible o reversible.
En una modalidad, el inhibidor tiene una IC50 de al menos 1 nM, al menos 2 nM, al menos 5 nM, al menos 10 nM, al menos 50 nM, al menos 100 nM, al menos 200 nM, al menos 500 nM, al menos 1 j M, al menos 10 j M, al menos 50 |jM, o al menos 100 j M. Las determinaciones de IC50 pueden realizarse mediante el uso de cualquier técnica convencional conocida en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse una IC50 mediante la medición de la actividad de una enzima determinada en presencia de un intervalo de concentraciones del inhibidor en estudio. Los valores de actividad enzimática obtenidos experimentalmente se representan a continuación frente a las concentraciones del inhibidor usadas. La concentración del inhibidor que muestra un 50 % de actividad enzimática (en comparación con la actividad en ausencia de cualquier inhibidor) se toma como el valor "IC50". De manera análoga, pueden definirse otras concentraciones inhibidoras mediante las determinaciones apropiadas de la actividad.
En diversos ejemplos, las células T se ponen en contacto o se tratan o se cultivan con uno o más moduladores de una vía PI3K/AKT/mTOR a una concentración de al menos 1 nM, al menos 2 nM, al menos 5 nM, al menos 10 nM, al menos 50 nM, al menos al menos 100 nM, al menos 200 nM, al menos 500 nM, al menos 1 j M, al menos 10 j M, al menos 50 j M, al menos 100 j M o al menos 1 M.
En ejemplos particulares, las células T pueden ponerse en contacto o tratarse o cultivarse con uno o más moduladores de una vía PI3K/AKT/mTOR durante al menos 12 horas, 18 horas, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, al menos 2 semanas, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses o más con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más rondas de expansión. a. Vía PI3K/AKT/mTOR
La vía fosfatidil-inositol-3 quinasa/Akt/diana de rapamicina en células de mamífero (PI3K/Akt/mTOR) sirve como un conducto para integrar la señalización del factor de crecimiento con la proliferación, diferenciación, metabolismo y supervivencia celular. Las PI3K son una familia de quinasas de lípidos intracelulares altamente conservadas. Las PI3K de clase IA se activan por las tirosina quinasas receptoras del factor de crecimiento (RTK), ya sea directamente o mediante la interacción con la familia del sustrato del receptor de insulina de moléculas adaptadoras. Esta actividad da como resultado la producción de fosfatidil-inositol-3,4,5-trifosfato (PIP3), un regulador de la serina/treonina quinasa Akt. La mTOR actúa a través de la vía canónica PI3K a través de 2 complejos distintos, cada uno caracterizado por diferentes parejas de unión que confieren distintas actividades. La mTORC1 (mTOR en complejo con PRAS40, raptor y mLST8/GbL) actúa como un efector descendente de la señalización de PI3K/Akt, vinculando las señales del factor de crecimiento con la traducción de proteínas, el crecimiento celular, la proliferación y la supervivencia. La mTORC2 (mTOR en complejo con rictor, mSIN1, protor y mLST8) actúa como un activador ascendente de Akt.
Tras la activación de PI3K mediada por el receptor del factor de crecimiento, la Akt se recluta en la membrana a través de la interacción de su dominio de homología de pleckstrina con PIP3, exponiendo de este modo su bucle de activación y permitiendo la fosforilación en la treonina 308 (Thr308) por la proteína quinasa 1 dependiente de fosfoinosítido (PDK1) constitutivamente activa. Para una activación máxima, la Akt también se fosforila por mTORC2, en la serina 473 (Ser473) de su motivo hidrófobo C-terminal. También se ha demostrado que la DNA-Pk y HSP son importantes en la regulación de la actividad de Akt. La Akt activa mTORC1 a través de la fosforilación inhibidora de TSC2, que junto con TSC1, regula negativamente mTORC1 al inhibir la Rheb GTPasa, un regulador positivo de mTORC1. La mTORC1 tiene 2 sustratos bien definidos, p70S6K (en lo adelante S6K1) y 4E-BP1, los cuales regulan críticamente la síntesis de proteínas. Por tanto, mTORC1 es un importante efector descendente de PI3K, que vincula la señalización del factor de crecimiento con la traducción de proteínas y la proliferación celular.
b. Inhibidores de mTOR
Los términos "inhibidor de mTOR" o "agente que inhibe mTOR" se refieren a un ácido nucleico, péptido, compuesto o molécula orgánica pequeña que inhibe al menos una actividad de una proteína mTOR, tal como, por ejemplo, la actividad de la serina/treonina proteína quinasa en al menos uno de sus sustratos (por ejemplo, p70S6 quinasa 1, 4E-BP1, AKT/PKB y eEF2). Los inhibidores de mTOR pueden unirse directamente e inhibir mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2.
La inhibición de la actividad de mTORC1 y/o mTORC2 puede determinarse mediante una reducción en la transducción de señales de la vía PI3K/Akt/mTOR. Puede usarse una amplia variedad de lecturas para establecer una reducción de la salida de dicha vía de señalización. Algunas lecturas ilustrativas no limitantes incluyen (1) una disminución en la fosforilación de Akt en los residuos, que incluyen, pero no se limitan a, 5473 y T308; (2) una disminución en la activación de Akt como se evidencia, por ejemplo, por una reducción de la fosforilación de los sustratos de Akt que incluyen, pero no se limitan a, Fox01/O3a t 24/32, GSK3a/p; S21/9 y TSC2 T1462; (3) una disminución en la fosforilación de las moléculas de señalización en la vía descendente de mTOR, que incluyen, pero no se limitan a, S6 S240/244, 70S6K T389 y 4EBP1 T37/46 ribosomal; y (4) la inhibición de la proliferación de las células cancerosas. En un ejemplo, los inhibidores de mTOR son inhibidores del sitio activo. Estos son inhibidores de mTOR que se unen al sitio de unión de ATP (también denominado bolsillo de unión de ATP) de mTOR e inhiben la actividad catalítica de mTORCI y mTORC2. Una clase de inhibidores del sitio activo adecuados para el uso en los métodos de producción de células T que se contemplan en la presente son los inhibidores de especificidad dual que se dirigen e inhiben directamente tanto PI3K como mTOR. Los inhibidores de especificidad dual se unen al sitio de unión de ATP de mTOR y PI3K. Los ejemplos ilustrativos de tales inhibidores incluyen, pero no se limitan a: imidazoquinazolinas, wortmanina, LY294002, PI-103 (Cayman Chemical), SF1126 (Semafore), BGT226 (Novartis), XL765 (Exelixis) y NVP-BEZ235 (Novartis).
Otra clase de inhibidores del sitio activo de mTOR adecuados para el uso en los métodos que se contemplan en la presente descripción inhiben selectivamente la actividad de mTORCI y mTORC2 en relación con una o más fosfatidilinositol 3-quinasas de tipo I, por ejemplo, PI3 quinasa a, p, y o 8. Estos inhibidores del sitio activo se unen al sitio activo de mTOR, pero no a PI3K. Los ejemplos ilustrativos de dichos inhibidores incluyen, pero no se limitan a: pirazolopirimidinas, Torinl (Guertin y Sabatini), PP242 (2-(4-amino-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)-1H-indol-5-ol), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth) y AZD8055 (Liu y otros, Nature Review, 8, 627-644, 2009). I
En un ejemplo, un inhibidor selectivo de mTOR se refiere a un agente que exhibe una concentración inhibidora del 50 % (IC50) con respecto a mTORC1 y/o mTORC2, que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o más, menor que la IC50 del inhibidor con respecto a una, dos, tres o más PI3-quinasas de tipo I o a todas las PI3-quinasas de tipo I.
Otra clase de inhibidores de mTOR para uso en la presente descripción se denominan en la presente descripción "rapálogos". Como se usa en la presente descripción, el término "rapálogos" se refiere a los compuestos que se unen específicamente al dominio FRB de mTOR (dominio de unión a rapamicina FKBP), están estructuralmente relacionados con la rapamicina y retienen las propiedades inhibidoras de mTOR. El término rapálogos excluye la rapamicina. Los rapálogos incluyen ésteres, éteres, oximas, hidrazonas e hidroxilaminas de rapamicina, así como también los compuestos en los que los grupos funcionales de la estructura del núcleo de la rapamicina se han modificado, por ejemplo, por reducción u oxidación. Las sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos también se consideran derivados de rapamicina. Los ejemplos ilustrativos de los rapálogos adecuados para el uso en los métodos que se contemplan en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) y OSI-027 (OSI).
En un ejemplo, el agente es el inhibidor de mTOR rapamicina (sirolimus).
Los inhibidores de mTOR ilustrativos para el uso en la presente descripción inhiben mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nM o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 |jM, 50 |jM, 25 |jM, 10 |jM, 1 |jM o menos. En un aspecto, un inhibidor de mTOR para uso en la presente descripción inhibe mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nM, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Los inhibidores de mTOR ilustrativos inhiben PI3K y mTORC1 o mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 y PI3K con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nM o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 jiM, 50 jiM, 25 jiM, 10 jiM, 1 jiM o menos. En un aspecto, un inhibidor de mTOR para uso en la presente descripción inhibe PI3K y mTORC1 o mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 y PI3K con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nM, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores de mTOR adecuados para el uso en los ejemplos particulares que se contemplan en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, AZD8055, INK128, rapamicina, PF-04691502 y everolimus.
Se ha demostrado que mTOR muestra una actividad catalítica sólida y específica hacia las proteínas del sustrato fisiológico, la proteína quinasa I ribosómica p70 S6 (p70S6K1) y la proteína 1 de unión a eIF4E (4EBP1) medida por anticuerpos específicos de fósforo en electrotransferencia.
En un ejemplo, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de quinasa s6 que se selecciona del grupo que consiste en: BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK y AT7867.
c. Inhibidores de PI3K
Como se usa en la presente descripción, el término "inhibidor de PI3K" se refiere a un ácido nucleico, péptido, compuesto o molécula orgánica pequeña que se une e inhibe al menos una actividad de PI3K. Las proteínas PI3K pueden dividirse en tres clases, PI3K de clase 1, PI3K de clase 2 y PI3K de clase 3. Las PI3K de clase 1 existen como heterodímeros que consisten en una de las cuatro subunidades catalíticas de p110 (p110a, p110p, p1105 y p110Y) y una de las dos familias de subunidades reguladoras. Un inhibidor de PI3K de la presente invención se dirige preferentemente a los inhibidores de PI3K de clase 1. En una modalidad, un inhibidor de PI3K mostrará selectividad por una o más isoformas de los inhibidores de PI3K clase 1 (es decir, selectividad por p110a, p110p, p1105 y p110Y o uno o más de p110a, p110p, p1105 y p110Y). En otro aspecto, un inhibidor de Pl3K no mostrará selectividad de isoforma y se considerará un "inhibidor de pan-PI3K". En una modalidad, un inhibidor de PI3K competirá por unirse con ATP al dominio catalítico de PI3K.
En determinadas modalidades, un inhibidor de PI3K puede, por ejemplo, dirigirse a PI3K así como también a las proteínas adicionales en la vía PI3K-AKT-mTOR. En modalidades particulares, un inhibidor de PI3K que se dirige tanto a mTOR como a PI3K puede denominarse inhibidor de mTOR o inhibidor de PI3K. Un inhibidor de PI3K que solo se dirige a PI3K puede denominarse inhibidor selectivo de PI3K. En una modalidad, puede entenderse que un inhibidor selectivo de PI3K se refiere a un agente que exhibe una concentración inhibidora del 50 % con respecto a PI3K que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o más, menor que la IC50 del inhibidor con respecto a mTOR y/u otras proteínas en la vía.
En una modalidad particular, los inhibidores de PI3K ilustrativos inhiben PI3K con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nM o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 jiM, 50 jiM, 25 jiM, 10 jiM, 1 jiM o menos. En una modalidad, un inhibidor de PI3K inhibe PI3K con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nM, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Los ejemplos ilustrativos de los inhibidores de PI3K adecuados para el uso en los métodos de producción de células T que se contemplan en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, BKM120 (inhibidor de PI3K clase 1, Novartis), XL147 (inhibidor de PI3K clase 1, Exelixis), (inhibidor de pan-PI3K, GlaxoSmithKline) y PX-866 (inhibidor de PI3K de clase 1; isoformas p110a, p110p y p110Y, Oncothyreon).
Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores selectivos de PI3K incluyen, pero no se limitan a, BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474 y IPI-145.
Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores de pan-PI3K incluyen, pero no se limitan a, BEZ235, LY294002, GSK1059615 y GDC-0941.
d. Inhibidores de AKT
Como se usa en la presente descripción, el término "inhibidor de AKT" se refiere a un ácido nucleico, péptido, compuesto o molécula orgánica pequeña que inhibe al menos una actividad de AKT. Los inhibidores de AKT pueden agruparse en varias clases, que incluyen los inhibidores basados en lípidos (por ejemplo, los inhibidores que se dirigen al dominio de homología de pleckstrina de AKT que evita que AKT se localice en las membranas plasmáticas), los inhibidores competitivos de ATP y los inhibidores alostéricos. En un ejemplo, los inhibidores de AKT actúan mediante la unión al sitio catalítico de AKT. En un ejemplo particular, los inhibidores de Akt actúan mediante la inhibición de la fosforilación de dianas de AKT posteriores, como mTOR. En otro ejemplo, la actividad de AKT se inhibe mediante la inhibición de las señales de entrada para activar Akt por la inhibición, por ejemplo, la activación de AKT por ADN-PK, la activación de AKT por PDK-1 y/o la activación de Akt por mTORC2.
Los inhibidores de AKT pueden dirigirse a las tres isoformas de AKT, AKT1, AKT2, AKT3 o pueden ser selectivos de isoformas y dirigirse solo a una o dos de las isoformas de AKT. En un ejemplo, un inhibidor de AKT puede dirigirse a AKT, así como también a las proteínas adicionales en la vía PI3K-AKT-mTOR. Un inhibidor de AKT que solo se dirige a AKT puede denominarse inhibidor selectivo de AKT. En un ejemplo, puede entenderse que un inhibidor selectivo de AKT se refiere a un agente que presenta una concentración inhibidora del 50 % con respecto a AKT que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces o más por debajo de la IC50 del inhibidor con respecto a otras proteínas en la vía.
En un ejemplo particular, los inhibidores de AKT ilustrativos inhiben AKT con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente de aproximadamente 100 nM o menos, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 jiM, 50 jiM, 25 jiM, 10 jiM, 1 jiM o menos. En un ejemplo, una AKT inhibe la AKT con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nM, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Los ejemplos ilustrativos de los inhibidores de AKT para el uso en combinación con los conjugados de fármaco-anticuerpo basados en auristatina incluyen, por ejemplo, perifosina (Keryx), MK2206 (Merck), VQD-002 (VioQuest), XL418 (Exelixis), GSK690693, GDC-0068 y PX316 (PROLX Pharmaceuticals).
Un ejemplo ilustrativo, no limitante de un inhibidor selectivo de Akt1 es A-674563.
Un ejemplo ilustrativo, no limitante de un inhibidor selectivo de Akt2 es CCT128930.
En un ejemplo particular, la activación de Akt por ADN-PK del inhibidor de Akt, la activación de Akt por PDK-1, la activación de Akt por mTORC2 o la activación de Akt por HSP.
Los ejemplos ilustrativos de los inhibidores de ADN-PK incluyen, pero no se limitan a, NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 y PP-121.
D. Receptores de células t modificados y receptores de antígeno quiméricos
Los métodos de producción de células T que se contemplan son particularmente útiles para expandir las células T modificadas para expresar los receptores de células T de alta afinidad (TCR modificados) o los receptores de antígeno quiméricos (CAR) sin un incremento concomitante en la diferenciación de estas células T modificadas. En una modalidad, la célula T se modifica genéticamente para expresar uno o más CAR o TCR modificados. Como se usa en la presente descripción, las células T modificadas para expresar un CAR o TCR modificado que se contemplan en la presente descripción pueden denominarse "células T redirigidas específicas al antígeno".
1. TCR modificados
Los receptores de células T de origen natural comprenden dos subunidades, una subunidad a y una subunidad p, cada una de las cuales es una proteína única producida por un evento de recombinación en el genoma de cada célula T. Las bibliotecas de TCR pueden seleccionarse por su selectividad a antígenos objetivo particulares. De esta manera, los TCR naturales, que tienen una gran avidez y reactividad hacia los antígenos objetivo, pueden seleccionarse, clonarse y posteriormente introducirse en una población de células T usadas para la inmunoterapia adoptiva.
En una modalidad, las células T se modifican mediante la introducción de un polinucleótido que codifica una subunidad de un TCR que tiene la capacidad de formar los TCR que confieren especificidad a las células T para las células tumorales que expresan un antígeno objetivo. En modalidades particulares, las subunidades tienen una o más sustituciones, deleciones, inserciones o modificaciones de aminoácidos en comparación con la subunidad natural, siempre que las subunidades conserven la capacidad de formar los TCR que confieran a las células T transfectadas la capacidad de dirigir a las células objetivo, y participar en la señalización de citocinas de importancia inmunológica. Los TCR modificados también se unen preferentemente a las células objetivo que muestran el péptido asociado al tumor de interés con alta avidez, y opcionalmente median la destrucción eficiente de las células objetivo que presentan el péptido de interés in vivo.
Los ácidos nucleicos que codifican los TCR modificados se aíslan preferentemente de su contexto natural en un cromosoma (natural) de una célula T, y pueden incorporarse en vectores adecuados como se describe en otra parte en la presente descripción. Tanto los ácidos nucleicos como los vectores que los comprenden pueden transferirse de manera útil a una célula, dicha célula es preferentemente una célula T. Las células T modificadas pueden entonces expresar ambas cadenas de un TCR (y preferentemente dos cadenas) codificado por el ácido nucleico o ácidos nucleicos transducidos. En modalidades preferidas, el TCR modificado es un TCR exógeno porque se introduce en las células T que normalmente no expresan el TCR en particular. El aspecto esencial de los TCR modificados es que tienen una gran avidez por un antígeno tumoral presentado por un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) o un componente inmunológico similar. A diferencia de los t Cr modificados, los CAR se diseñan para unirse a los antígenos objetivo de manera independiente del MHC.
La proteína codificada por los ácidos nucleicos puede expresarse con los polipéptidos adicionales unidos a la parte amino terminal o carboxilo terminal de la cadena a o la cadena p de un TCR siempre que el polipéptido adicional unido no interfiera con la capacidad de la cadena a o la cadena p para formar un receptor de células T funcional y el reconocimiento del antígeno dependiente de MHC.
Los antígenos que se reconocen por los TCR modificados que se contemplan en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, los antígenos de cáncer, incluidos los antígenos tanto en cánceres hematológicos como en tumores sólidos. Los antígenos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, receptor alfa de folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIlI, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM y VEGFR2.
2. Receptores de antígeno quiméricos (CAR)
Los métodos de producción de células T que se contemplan en la presente descripción incluyen la modificación de las células T para expresar uno o más CAR como se contemplan en la presente descripción. En diversas modalidades, los métodos de la presente invención proporcionan las células T modificadas genéticamente con los vectores diseñados para expresar los CAR que redirigen la citotoxicidad hacia las células tumorales. Los CAR son moléculas que combinan la especificidad basada en anticuerpos para un antígeno objetivo (por ejemplo, el antígeno tumoral) con un dominio intracelular que activa el receptor de células T para generar una proteína quimérica que exhibe una actividad inmunitaria celular antitumoral específica. Como se usa en la presente descripción, el término "quimérico" describe estar compuesto de partes de diferentes proteínas o ADN de diferentes orígenes.
Los CAR que se contemplan en la presente descripción comprenden un dominio extracelular que se une a un antígeno objetivo específico (también denominado dominio de unión o dominio de unión específico al antígeno), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. La característica principal de los CAR es su capacidad para redirigir la especificidad de las células efectoras inmunitarias, lo que desencadena la proliferación, la producción de citocinas, la fagocitosis o la producción de moléculas que pueden mediar la muerte celular de la célula que expresa el antígeno objetivo de manera independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), explotando las capacidades de los anticuerpos monoclonales, ligandos solubles o correceptores específicos de células de lograr un direccionamiento específico a células.
En modalidades particulares, un CAR comprende un dominio de unión extracelular que incluye, pero no se limita a, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, un ligando unido o el dominio extracelular de un correceptor, que se une específicamente a un antígeno objetivo que se selecciona del grupo que consiste en: receptor alfa de folato, 5T4, integrina avPa, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIlI, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM y VEGFR2; uno o más dominios de bisagra o dominios espaciadores; un dominio transmembrana que incluye, pero no se limita a, dominios transmembrana de CD8a, CD4, c D45, PD-1 y CD152; uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares que incluyen, pero no se limitan a, dominios de señalización coestimuladores intracelulares de CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1) y CD278 (ICOS); y un dominio de señalización primario de CD3Z o FcRy.
a. Dominio de unión
En modalidades particulares, los CAR que se contemplan en la presente descripción comprenden un dominio de unión extracelular que se une específicamente a un polipéptido objetivo, por ejemplo, un antígeno objetivo, expresado en células tumorales. Como se usa en la presente descripción, los términos "dominio de unión", "dominio extracelular", "dominio de unión extracelular", "dominio de unión específico al antígeno" y "dominio de unión extracelular específico al antígeno" se usan indistintamente y proporcionan un CAR con la capacidad para unirse específicamente al antígeno objetivo de interés. Un dominio de unión puede comprender cualquier proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido que posea la capacidad de reconocer específicamente y unirse a una molécula biológica (por ejemplo, un receptor de la superficie celular o proteína tumoral, lípido, polisacárido u otra molécula objetivo de la superficie celular, o componente de estos). Un dominio de unión incluye cualquier pareja de unión natural, sintética, semisintética o producida de manera recombinante, de una molécula biológica de interés.
En modalidades particulares, el dominio de unión extracelular de un CAR comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este. Un "anticuerpo" se refiere a un agente de unión que es un polipéptido que comprende al menos una región variable de la cadena ligera o la cadena pesada de la inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a un epítopo de un antígeno objetivo, tal como un péptido, lípido, polisacárido o ácido nucleico que contiene un determinante antigénico, como los reconocidos por una célula inmunitaria. Los anticuerpos incluyen los fragmentos de unión de estos. El término también incluye las formas modificadas genéticamente, tales como los anticuerpos quiméricos (por ejemplo, los anticuerpos murinos humanizados), los anticuerpos heteroconjugados (tales como los anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de unión al antígeno de estos. Ver además, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3ra Ed., W. H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.
En modalidades particulares, el antígeno objetivo es un epítopo de un receptor alfa de folato, 5T4, integrina ayp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIlI, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM o polipéptido de VEGFR2.
Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las CDR pueden definirse o identificarse por métodos convencionales, tales como por la secuencia de acuerdo con Kabat y otros (Wu, TT y Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. y Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (ver Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991), o por la estructura de acuerdo con Chothia y otros (Choithia, C. y Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Choithia, C. y otros, Nature, 342: 877 - 883 (1989)).
Las secuencias de las regiones marco de las diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie, como los seres humanos. La región marco de un anticuerpo, que son las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en el espacio tridimensional. Las CDR son las principales responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan típicamente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N-terminal, y también se identifican típicamente por la cadena en la que se encuentra la CDR particular. Por lo tanto, las CDR ubicadas en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3, mientras que las CDR ubicadas en el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo se denominan CDRL1, CDRL2, y CDRL3. Los anticuerpos con diferentes especificidades (es decir, diferentes sitios de combinación para diferentes antígenos) tienen diferentes CDR. Aunque son las CDR las que varían de un anticuerpo a otro, solo un número limitado de posiciones de aminoácidos dentro de las CDR están directamente involucradas en la unión al antígeno. Estas posiciones dentro de las CDR se denominan residuos determinantes de la especificidad (SDR). Las referencias a "Vh" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción. Las referencias a "Vl" o "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, que incluye la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción.
Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado los genes de la cadena ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante la producción de células híbridas formadoras de anticuerpos a partir de una fusión de células de mieloma con células inmunitarias del bazo. Los anticuerpos monoclonales incluyen los anticuerpos monoclonales humanizados.
Un "anticuerpo quimérico" tiene los residuos del marco de una especie, como la humana, y las CDR (que generalmente confieren unión al antígeno) de otra especie, como un ratón. En modalidades preferidas particulares, un CAR que se contempla en la presente descripción comprende un dominio de unión específica al antígeno que es un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión al antígeno de este.
En determinadas modalidades preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado (tal como un anticuerpo monoclonal humanizado) que se une específicamente a una proteína de superficie en una célula tumoral. Un anticuerpo "humanizado" es una inmunoglobulina que incluye una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de ratón, rata o sintética). Los anticuerpos humanizados pueden construirse mediante ingeniería genética (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,585,089).
En modalidades particulares, el dominio de unión extracelular de un CAR comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, que incluye, pero no se limitan a, una Ig de camello (un anticuerpo de camélido (VHH)), Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv de cadena sencilla ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, nanocuerpo).
"Ig de camello" o "VHH de camélido", como se usa en la presente descripción, se refiere a la unidad de unión al antígeno más pequeña conocida de un anticuerpo de cadena pesadas (Koch-Nolte, y otros, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). Un "anticuerpo de cadenas pesadas" o un "anticuerpo de camélido" se refiere a un anticuerpo que contiene dos dominios VH y no contiene cadenas ligeras (Riechmann L. y otros, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); documentos núms. WO94/04678; WO94/25591; patente de los Estados Unidos núm. 6,005,079).
"IgNAR", de las siglas en inglés de "nuevo receptor de antígeno de inmunoglobulina", se refiere a una clase de anticuerpos del repertorio inmunitario de tiburones que consiste en homodímeros de un dominio variable del nuevo receptor de antígeno (VNAR) y cinco dominios constantes del nuevo receptor de antígeno (CNAR).
La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el carboxilo terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente descripción para Fab' en la que el (los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de unión al antígeno. En una especie de Fv de cadena sencilla (scFv), un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera pueden unirse covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv de dos cadenas.
El término "diacuerpos" se refiere a los fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y generar dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos núms. EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson y otros, Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger y otros, PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y los tetracuerpos también se describen en Hudson y otros, Nat. Med. 9:129-134 (2003).
"Anticuerpo de dominio único" o "sdAb" o "nanocuerpo" se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en la región variable de una cadena pesada de anticuerpo (dominio VH) o la región variable de una cadena ligera de anticuerpo (dominio VL) (Holt, L., y otros, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única y en cualquier orientación (por ejemplo, VL-VH o VH-VL). Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), págs. 269-315.
En modalidades preferidas, un CAR que se contempla en la presente descripción comprende un dominio de unión específico al antígeno que es un scFv (un scFv murino, humano o humanizado) que se une a un antígeno expresado en una célula cancerosa. En una determinada modalidad, el scFv se une a un receptor alfa de folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, 'Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM y VEGFR2.
b. Enlazadores
En determinadas modalidades, los CAR que se contemplan en la presente descripción pueden comprender los residuos del enlazador entre los diversos dominios, por ejemplo, entre los dominios Vh y Vl, añadidos para el espaciado y la conformación apropiados de la molécula. Los CAR que se contemplan en la presente descripción pueden comprender uno, dos, tres, cuatro o cinco o más enlazadores. En modalidades particulares, la longitud de un enlazador es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 aminoácidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos, o cualquier longitud intermedia de aminoácidos. En algunas modalidades, el enlazador es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más aminoácidos de longitud.
Los ejemplos ilustrativos de los enlazadores incluyen los polímeros de glicina (G)n; los polímeros de glicina-serina (G i-5Si-5)n, donde n es un número entero de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco; los polímeros de glicina-alanina; los polímeros de alanina-serina; y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un enlace neutro entre los dominios de las proteínas de fusión tales como los CAR descritos en la presente descripción. La glicina accede significativamente más espacio phi-psi que incluso la alanina, y es mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (ver Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). El experto en la técnica normalmente reconocerá que el diseño de un CAR en las modalidades particulares puede incluir los enlazadores que son total o parcialmente flexibles, de modo que el enlazador puede incluir un enlazador flexible, así como también una o más partes que confieren una estructura menos flexible para proporcionar una estructura deseada del CAR.
Otros enlazadores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, las siguientes secuencias de aminoácidos: GGG; DGGGS (SEQ ID NO: X); TGEKP (SEQ ID NO: X) (véase, por ejemplo, Liu y otros, PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: X) (Pomerantz y otros, 1995, más arriba); (GGGGS)n en donde = 1,2, 3, 4 o 5 (SEQ ID n O: X) (Kim y otros, PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: X) (Chaudhary y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: X) (Bird y otros, 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO:X); LRQRDGERP (SEQ ID NO: X); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: X); LRQKd(GGGS)2 ERP (SEQ ID NO: X). Alternativamente, los enlazadores flexibles pueden diseñarse racionalmente mediante el uso de un programa informático capaz de modelar tanto los sitios de unión al ADN como los péptidos mismos (Desjarlais y Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994) o los métodos de presentación en fagos.
En modalidades particulares, un CAR comprende un scFV que comprende además una secuencia de unión de la región variable. Una "secuencia de unión de la región variable" es una secuencia de aminoácidos que conecta una región variable de la cadena pesada a una región variable de la cadena ligera y proporciona una función espaciadora compatible con la interacción de los dos subdominios de unión para que el polipéptido resultante conserve una afinidad de unión específica con la misma molécula objetivo que un anticuerpo que comprende las mismas regiones variables de la cadena ligera y pesada. En una modalidad, la secuencia de unión de la región variable es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más aminoácidos de longitud. En una modalidad particular, la secuencia de unión de la región variable comprende un polímero de glicina-serina (G1-5S1-5)n, donde n es un número entero de al menos 1,2, 3, 4 o 5. En otra modalidad, la secuencia de unión de la región variable comprende un enlazador de aminoácidos (G4S)3.
c. Dominio espaciador
En modalidades particulares, el dominio de unión del CAR está seguido por uno o más "dominios espaciadores", que se refiere a la región que aleja el dominio de unión al antígeno de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto apropiado célula/célula, la unión al antígeno y la activación (Patel y otros, Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). El dominio espaciador puede derivarse de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. En determinadas modalidades, un dominio espaciador es una parte de una inmunoglobulina, que incluye, pero no se limitan a, una o más regiones constantes de la cadena pesada, por ejemplo, CH2 y CH3. El dominio espaciador puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada.
En una modalidad, el dominio espaciador comprende el CH2 y CH3 de IgG1.
d. Dominio bisagra
El dominio de unión del CAR generalmente está seguido por uno o más "dominios bisagra", que desempeñan un papel en el posicionamiento del dominio de unión al antígeno lejos de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto apropiado célula/célula, la unión al antígeno y la activación. Un CAR generalmente comprende uno o más dominios bisagra entre el dominio de unión y el dominio transmembrana (TM). El dominio bisagra puede derivarse de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. El dominio bisagra puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada.
Los dominios bisagra ilustrativos adecuados para el uso en los CAR descritos en la presente descripción incluyen la región bisagra derivada de las regiones extracelulares de las proteínas de membrana de tipo 1, tales como CD8a, CD4, CD28 y CD7, que pueden ser regiones bisagra de tipo salvaje de estas moléculas o pueden estar alteradas. En otra modalidad, el dominio bisagra comprende una región bisagra de CD8a.
e. Dominio transmembrana (TM)
El "dominio transmembrana" es la parte del CAR que fusiona la parte de unión extracelular y el dominio de señalización intracelular y ancla el CAR a la membrana plasmática de la célula efectora inmunitaria. El dominio TM puede derivarse de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante.
Los dominios TM ilustrativos pueden derivarse (es decir, comprender al menos la(s) región(es) transmembrana) de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3 épsilon, CD3 zeta, Cd 4, CD5, CD9, CD 16, CD22, Cd 27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152 y CD154.
En una modalidad, los CAR que se contemplan en la presente descripción comprenden un dominio TM derivado de CD8a. En otra modalidad, un CAR que se contempla en la presente descripción comprende un dominio TM derivado de CD8a y un enlazador oligo- o polipeptídico corto, preferentemente entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud que une el dominio TM y el dominio de señalización intracelular del CAR. Un enlazador de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado.
f. Dominio de señalización intracelular
En modalidades particulares, los CAR que se contemplan en la presente descripción comprenden un dominio de señalización intracelular. Un "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de un CAR que participa en la transducción del mensaje de la unión eficaz del CAR a un antígeno objetivo en el interior de la célula efectora inmunitaria para provocar la función de la célula efectora, por ejemplo, la activación, la producción de citocinas, la proliferación y la actividad citotóxica, que incluye la liberación de factores citotóxicos contra la célula objetivo unida al CAR, u otras respuestas celulares provocadas con la unión del antígeno al dominio extracelular del CAR.
El término "función efectora" se refiere a una función especializada de la célula. La función efectora de la célula T, por ejemplo, puede ser una actividad citolítica o colaboradora o una actividad que incluye la secreción de una citocina. Por lo tanto, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de la función efectora y que dirige a la célula a realizar una función especializada. Aunque generalmente puede emplearse todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar todo el dominio. En la medida en que se usa una parte truncada de un dominio de señalización intracelular, dicha parte truncada puede usarse en lugar del dominio completo siempre que transduzca la señal de la función efectora. El término dominio de señalización intracelular se destina a incluir cualquier parte truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora.
Se sabe que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación completa de la célula T y que también se requiere una señal secundaria o coestimuladora. Por lo tanto, puede decirse que la activación de las células T está mediada por dos clases distintas de dominios de señalización intracelular: los dominios de señalización primaria que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) y los dominios de señalización coestimuladora que actúan en una manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. En modalidades preferidas, un c A r que se contempla en la presente descripción comprende un dominio de señalización intracelular que comprende uno o más "dominios de señalización coestimuladora" y un "dominio de señalización primaria".
Los dominios de señalización primaria regulan la activación primaria del complejo TCR, ya sea de forma estimuladora o inhibitoria. Los dominios de señalización primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener los motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina del inmunorreceptor o ITAM.
Los ejemplos ilustrativos de ITAM que contienen los dominios de señalización primarios que son de uso particular en la invención incluyen los derivados de TCRZ, FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En modalidades preferidas particulares, un CAR comprende un dominio de señalización primaria de CD3Z y uno o más dominios de señalización coestimuladora. Los dominios de señalización primaria intracelular y de señalización coestimuladora pueden estar unidos en cualquier orden en tándem al carboxilo terminal del dominio transmembrana. Los CAR que se contemplan en la presente descripción comprenden uno o más dominios de señalización coestimuladora para mejorar la eficacia y la expansión de las células T que expresan los receptores CAR. Como se usa en la presente descripción, el término "dominio de señalización coestimuladora" o "dominio de coestimulación" se refiere a un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora.
Los ejemplos ilustrativos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS (CD278), CTLA4, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, TRIM, LCK3, SLAM, DAP10, LAG3, HVEM y NKD2C y CD83. En una modalidad, un CAR comprende uno o más dominios de señalización coestimuladora que se seleccionan del grupo que consiste en CD28, CD137 y CD134, y un dominio de señalización primaria de CD3Z. En una modalidad, un CAR comprende un scFv que se une a un receptor alfa de folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM o polipéptido de VEGFR2; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: CD8a; CD4, CD45, PD-1 y CD152; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelular que se seleccionan del grupo que consiste en: CD28, CD54, CD134, CD137, CD152, CD273, CD274 y CD278; y un dominio de señalización primaria de CD3Z
En otra modalidad, un CAR comprende un scFv que se une a un receptor alfa de folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIlI, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM o VEGFR2; un dominio bisagra que se selecciona del grupo que consiste en: bisagra de IgG1/CH2/CH3 y CD8a, y CD8a; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: CD8a; CD4, CD45, PD-1 y CD152; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelular que se seleccionan del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137; y un dominio de señalización primaria de CD3Z
En otra modalidad más, un CAR comprende un scFv, que comprende además un enlazador, que se une a un receptor alfa de folato, 5T4, integrina avpa, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIlI, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM o polipéptido de VEGFR2; un dominio bisagra que se selecciona del grupo que consiste en: bisagra de IgG1/CH2/CH3 y CD8a, y CD8a; un dominio transmembrana que comprende un dominio TM derivado de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: CD8a; CD4, CD45, PD-1 y CD152, y un enlazador oligo- o polipeptídico corto, preferentemente entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud que une el dominio TM al dominio de señalización intracelular del CAR; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelular que se seleccionan del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137; y un dominio de señalización primaria de c D3Z.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv que se une a un receptor alfa de folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM o polipéptido de VEGFR2; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de CD8a; un dominio transmembrana de CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 aminoácidos; uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelular que se seleccionan del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137; y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
E. Polipéptidos
La presente descripción contempla, en parte, los polipéptidos de CAR y TCR modificados y los fragmentos de estos, las células y las composiciones que los comprenden, y los vectores que expresan los polipéptidos. "Polipéptido", "fragmento de polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente, a menos que se especifique lo contrario, y de acuerdo con el significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos no se limitan a una longitud específica, por ejemplo, pueden comprender una secuencia de proteína de longitud completa o un fragmento de una proteína de longitud completa, y pueden incluir modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como también otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural. En diversas modalidades, los polipéptidos que se contemplan en la presente descripción comprenden una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige la transferencia de la proteína de manera cotraduccional o postraduccional. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias señal adecuadas útiles en la presente descripción descrita incluyen, pero no se limitan a, la secuencia señal de la cadena pesada de IgG1 y la secuencia señal CD8a. Los polipéptidos pueden prepararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas de síntesis y/o recombinantes bien conocidas. Los polipéptidos que se contemplan en la presente descripción abarcan específicamente los CAR de la presente descripción, o las secuencias que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de un polipéptido como se contempla en la presente descripción.
Los polipéptidos incluyen las "variantes de polipéptidos". Las variantes de polipéptidos pueden diferir de un polipéptido natural en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Dichas variantes pueden ser de origen natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, mediante la modificación de una o más de las secuencias de polipéptidos anteriores. Por ejemplo, en modalidades particulares, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de los CAR o TCR modificados mediante la introducción de una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Preferentemente, los polipéptidos de la invención incluyen los polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 9o %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de aminoácidos con estos.
Los polipéptidos incluyen los "fragmentos de polipéptidos". Los fragmentos de polipéptidos se refieren a un polipéptido, que puede ser monomérico o multimérico, que tiene una deleción amino terminal, una deleción carboxilo terminal y/o una deleción o sustitución interna de un polipéptido producido de forma natural o recombinante. En determinadas modalidades, un fragmento de polipéptido puede comprender una cadena de aminoácidos de al menos 5 a aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Se apreciará que, en determinadas modalidades, los fragmentos son de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de longitud.
El polipéptido también puede fusionarse en marco o conjugarse con un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, la purificación o la identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para mejorar la unión del polipéptido a un soporte sólido.
Como se señaló anteriormente, los polipéptidos de la invención pueden alterarse de diversas maneras, que incluyen las sustituciones, las deleciones, los truncamientos y las inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones de la secuencia de nucleótidos se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel y otros, (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), la patente de los Estados Unidos núm. 4,873,192, Watson, J. D. y otros, (Molecular Biology of the Gene, cuarta edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California, 1987) y las referencias citadas allí. Puede encontrarse orientación sobre las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff y otros, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
En determinadas modalidades, una variante contendrá las sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambien sustancialmente. Pueden realizarse las modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y los polipéptidos de la presente invención y todavía obtener una molécula funcional que codifique un polipéptido variante o derivado con características convenientes.
Las variantes de polipéptidos incluyen además las formas glucosiladas, los conjugados agregativos con otras moléculas y los conjugados covalentes con restos químicos no relacionados (por ejemplo, las moléculas pegiladas). Las variantes covalentes pueden prepararse mediante la unión de grupos funcionales a grupos que se encuentran en la cadena de aminoácidos o en el residuo N o C-terminal, como se conoce en la técnica. Las variantes incluyen además las variantes alélicas, las variantes de especies y las muteínas. Los truncamientos o las deleciones de las regiones que no afectan la actividad funcional de las proteínas también son variantes.
En una modalidad, donde se desea la expresión de dos o más polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos que los codifican pueden separarse mediante una secuencia IRES como se analiza en otra parte en la presente descripción. En otra modalidad, dos o más polipéptidos pueden expresarse como una proteína de fusión que comprende una o más secuencias de polipéptidos autoescindibles.
Los polipéptidos de la presente invención incluyen los polipéptidos de fusión. En modalidades preferidas, se proporcionan los polipéptidos de fusión y los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de fusión. Los polipéptidos de fusión y las proteínas de fusión se refieren a un polipéptido que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o más segmentos de polipéptidos. Los polipéptidos de fusión están típicamente unidos del C-terminal al N-terminal, aunque también pueden estar unidos del C-terminal al C-terminal, del N-terminal al N-terminal o del N-terminal al C-terminal. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden o en un orden específico. Los polipéptidos de fusión o las proteínas de fusión también pueden incluir las variantes modificadas de forma conservadora, las variantes polimórficas, los alelos, los mutantes, las subsecuencias y los homólogos entre especies, siempre que se mantenga la actividad transcripcional deseada del polipéptido de fusión. Los polipéptidos de fusión pueden producirse por métodos de síntesis química o por enlace químico entre los dos restos o generalmente pueden prepararse mediante el uso de otras técnicas estándar. Las secuencias de ADN ligadas que comprenden el polipéptido de fusión están operativamente unidas a elementos de control transcripcionales o traduccionales adecuados como se analiza en otra parte en la presente descripción.
En una modalidad, una pareja de fusión comprende una secuencia que ayuda a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) con rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Pueden seleccionarse otras parejas de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína se dirija a los compartimentos intracelulares deseados o para facilitar el transporte de la proteína de fusión a través de la membrana celular.
Los polipéptidos de fusión pueden comprender además una señal de escisión de polipéptidos entre cada uno de los dominios de polipéptidos descritos en la presente descripción. Además, el sitio del polipéptido puede ponerse en cualquier secuencia peptídica enlazadora. Las señales de escisión de polipéptidos ilustrativas incluyen los sitios de reconocimiento de escisión de polipéptidos, tales como los sitios de escisión de proteasas, los sitios de escisión de nucleasas (por ejemplo, los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción raras, los sitios de reconocimiento de ribozimas de autoescisión) y los oligopéptidos virales de autoescisión (ver deFelipe y Ryan, 2004. Traffic, 5 (8); 616-26).
Los sitios de escisión de proteasas adecuados y los péptidos de autoescisión son conocidos por el experto (véase, por ejemplo, en Ryan y otros, 1997. J. Gener. Virol 78, 699-722; Scymczak y otros (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Los sitios de escisión de proteasa ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, los sitios de escisión de proteasas NIa de potyvirus (por ejemplo, la proteasa del virus del grabado del tabaco), proteasas HC de potyvirus, proteasas P1 de potyvirus (P35), proteasas NIa de byovirus, proteasas codificadas por ARN-2 de byovirus, proteasas L de aftovirus, proteasas 2A de enterovirus, proteasas 2A de rinovirus, proteasas 3C de picorna, proteasas 24K de comovirus, proteasas 24K de nepovirus, proteasa similar a 3C del RTSV (virus esférico del tungro del arroz), proteasa similar a 3C del PYVF (virus de la mancha amarilla de la chirivía), heparina, trombina, factor Xa y enteroquinasa. Debido a su alta rigurosidad de escisión, se prefieren los sitios de escisión de proteasas de TEV (virus del grabado del tabaco) en una modalidad, por ejemplo, EXXYXQ(G/S) (SEQ ID NO:), por ejemplo, ENLYFQG (SEQ ID NO:) y ENLYFQS (SEQ ID NO:), en donde X representa cualquier aminoácido (la escisión por TEV ocurre entre Q y G o Q y S).
En una modalidad particular, los péptidos autoescindibles incluyen aquellas secuencias de polipéptidos obtenidas a partir de los péptidos 2A de potyvirus y cardiovirus, FMDV (virus de la fiebre aftosa), virus de la rinitis equina A, virus de Thosea asigna y teschovirus porcino.
En determinadas modalidades, el sitio de autoescisión del polipéptido comprende un sitio, secuencia o dominio 2A o de tipo 2A (Donnelly y otros, 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041).
F. Polinucleótidos
En modalidades particulares, se proporcionan los polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos de CAR o TCR modificados que se contemplan en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a ARN mensajero (ARNm), ARN, ARN genómico (ARNg), ARN de cadena positiva (ARN(+)), ARN de cadena negativa (ARN(-)), A d N genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc) o ADN recombinante. Los polinucleótidos incluyen los polinucleótidos monocatenarios y bicatenarios. Preferentemente, los polinucleótidos de la invención incluyen los polinucleótidos o las variantes que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de referencia descritas en la presente descripción (véase, por ejemplo, el Listado de secuencias), típicamente donde la variante mantiene al menos una actividad biológica de la secuencia de referencia. En diversas modalidades ilustrativas, la presente invención contempla, en parte, los polinucleótidos que comprenden los vectores de expresión, los vectores virales y los plásmidos de transferencia, y las composiciones, y las células que los comprenden.
En modalidades particulares, esta invención proporciona los polinucleótidos que codifican al menos aproximadamente 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 o más residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido de la invención, así como también todas las longitudes intermedias. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tales como 6, 7, 8, 9, etc., 101, 102, 103, etc.; 151, 152, 153, etc.; 201, 202, 203, etc.
Como se usa en la presente descripción, los términos "variante polinucleotídica" y "variante" y similares se refieren a los polinucleótidos que muestran una identidad de secuencia sustancial con una secuencia de polinucleótidos de referencia o los polinucleótidos que hibridan con una secuencia de referencia en condiciones rigurosas que se definen a continuación. Estos términos incluyen los polinucleótidos en los que se han agregado o eliminado uno o más nucleótidos, o se han reemplazado con diferentes nucleótidos en comparación con un polinucleótido de referencia. A este respecto, se entiende bien en la técnica que pueden realizarse determinadas alteraciones que incluyen mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones a un polinucleótido de referencia mediante lo cual el polinucleótido alterado retiene la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia.
Las frases "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprende una "secuencia 50 % idéntica a", como se usa en la presente descripción, se refieren al grado en que las secuencias son idénticas sobre la base de cada nucleótido o aminoácido a lo largo de una ventana de comparación. Por lo tanto, puede calcularse un "porcentaje de identidad de secuencia" al comparar dos secuencias alineadas óptimamente en la ventana de comparación, al determinar el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) ocurre en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Se incluyen los nucleótidos y los polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de referencias descritas en la presente descripción, típicamente donde la variante de polipéptido mantiene al menos una actividad biológica del polipéptido de referencia.
Los términos usados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen la "secuencia de referencia", la "ventana de comparación", la "identidad de secuencia", el "porcentaje de identidad de secuencia" y la "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene una longitud de al menos 12 pero con frecuencia de 15 a 18 y, a menudo, de al menos 25 unidades monoméricas, incluidos los nucleótidos y los residuos de aminoácidos. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una parte de la secuencia completa de polinucleótidos) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente mediante la comparación de las secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, generalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más generalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se compara una secuencia con una secuencia de referencia de este número de posiciones contiguas después que las dos secuencias están alineadas de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de aproximadamente el 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede llevarse a cabo mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, Estados Unidos) o por inspección y la mejor alineación (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología en la ventana de comparación) se genera por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También puede hacerse referencia a la familia de programas BLAST como se describe por ejemplo por Altschul y otros, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Puede encontrarse un estudio detallado del análisis de secuencia en la Unidad 19.3 de Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.
Los polinucleótidos de la presente invención, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores y/o potenciadores, regiones no traducidas (UTR), secuencias de Kozak, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, múltiples sitios de clonación, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), sitios de reconocimiento de recombinasas (por ejemplo, sitios LoxP, FRT y Att), codones de terminación, señales de terminación transcripcional y polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles, etiquetas de epítopos, como se describe en otra parte en la presente descripción o como se conoce en la técnica, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que pueda emplearse un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, de manera que la longitud total preferentemente está limitada por la facilidad de preparación y el uso en el protocolo previsto de ADN recombinante.
Los polinucleótidos pueden prepararse, manipularse y/o expresarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas, conocidas y disponibles en la técnica. Para expresar un polipéptido deseado, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido puede insertarse en el vector apropiado. Los ejemplos de los vectores son los plásmidos, las secuencias de replicación autónoma y los elementos transponibles. Los vectores ilustrativos adicionales incluyen, pero no se limitan a, los plásmidos, los fagémidos, los cósmidos, los cromosomas artificiales tales como el cromosoma artificial de levadura (YAC), el cromosoma artificial bacteriano (BAC) o el cromosoma artificial derivado de P1 (PAC), los bacteriófagos tales como el fago lambda o el fago M13, y los virus animales. Los ejemplos de categorías de virus animales útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus (incluidos los lentivirus), adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple), poxvirus, baculovirus, papilomavirus y papovavirus (por ejemplo, SV40). Los ejemplos de vectores de expresión son los vectores pClneo (Promega) para la expresión en células de mamíferos; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ y pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) para la transferencia y expresión génica mediada por lentivirus en células de mamíferos. En modalidades particulares, las secuencias codificantes de las proteínas quiméricas descritas en la presente descripción pueden ligarse en dichos vectores de expresión para la expresión de la proteína quimérica en células de mamífero.
Los "elementos de control" o las "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector: origen de replicación, casetes de selección, promotores, potenciadores, señales de iniciación de la traducción (secuencia de Shine Dalgarno o secuencia de Kozak) intrones, una secuencia de poliadenilación, regiones no traducidas en 5' y 3', que interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden variar en su resistencia y especificidad. Según el sistema de vectores y del huésped usado, puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluidos los promotores ubicuos y los promotores inducibles.
En modalidades particulares, un vector para el uso en la práctica de la invención que incluye, pero no se limitan a, los vectores de expresión y los vectores virales, incluirá secuencias de control exógenas, endógenas o heterólogas, tales como los promotores y/o los potenciadores. Una secuencia de control "endógena" es aquella que está naturalmente ligada a un gen dado en el genoma. Una secuencia de control "exógena" es aquella que se coloca en yuxtaposición a un gen mediante la manipulación genética (es decir, las técnicas de biología molecular) de modo que la transcripción de ese gen se dirige por el potenciador/promotor vinculado. Una secuencia de control "heteróloga" es una secuencia exógena que es de una especie diferente a la célula que está siendo manipulada genéticamente.
El término "promotor", como se usa en la presente descripción, se refiere a un sitio de reconocimiento de un polinucleótido (ADN o ARN) al que se une una ARN polimerasa. Una ARN polimerasa inicia y transcribe los polinucleótidos operativamente unidos al promotor. En modalidades particulares, los promotores operativos en células de mamífero comprenden una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases hacia el extremo secuencia arriba del sitio donde se inicia la transcripción y/u otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases hacia el extremo secuencia arriba del inicio de la transcripción, una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido.
El término "potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene las secuencias capaces de proporcionar una transcripción mejorada y en algunos casos puede funcionar independientemente de su orientación con respecto a otra secuencia de control. Un potenciador puede funcionar de forma cooperativa o aditiva con promotores y/u otros elementos potenciadores. El término "promotor/potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene las secuencias que pueden proporcionar las funciones tanto de promotor como de potenciador.
El término "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. En una modalidad, el término se refiere a una unión funcional entre una secuencia de control de la expresión del ácido nucleico (tal como un promotor y/o potenciador) y una segunda secuencia de polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido de interés, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de control de expresión constitutiva" se refiere a un promotor, potenciador o promotor/potenciador que permite continuamente la transcripción de una secuencia unida operativamente. Una secuencia de control de expresión constitutiva puede ser un promotor, potenciador o promotor/potenciador "ubicuos" que permite la expresión en una amplia variedad de tipos de células y tejidos o un promotor, potenciador o promotor/potenciador "específico de célula", "específico de un tipo de célula", "específico de un linaje celular" o "específico de tejido" que permite la expresión en una variedad restringida de tipos de células y tejidos, respectivamente.
Las secuencias de control de expresión ubicuas ilustrativas adecuadas para el uso en las modalidades particulares de la invención incluyen, pero no se limitan a, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), uno de virus de simio 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), un promotor LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), un LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor (de timidina quinasa) del virus del herpes simple (HSV), promotores H5, P7.5 y P11 del virus vaccinia, un promotor del factor de alargamiento 1-alfa (EF1a), respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), factor de iniciación de la traducción eucariota 4A1 (EIF4A1), proteína 5 de choque térmico de 70 kDa (HSPA5), proteína beta de choque térmico de 90 kDa, miembro 1 (HSP90B1), proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70), p-kinesina (p-KIN), el locus ROSA 26 humano (Irions y otros, Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), un promotor de Ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (pGk ), un potenciador de citomegalovirus/promotor de p-actina de pollo (CAG), un promotor de p-actina y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido con sitio de unión a cebador de dl587rev (MND) (Challita y otros, J Virol. 69(2):748-55 (1995)).
En una modalidad particular, puede ser conveniente expresar un polinucleótido que comprende un CAR o TCR modificado a partir de un promotor que proporcione una expresión estable y a largo plazo en las células T y en niveles suficientes para redirigir las células T a las células que expresan el antígeno objetivo. En una modalidad preferida, el promotor es un promotor de EF1a o un promotor de MND.
Como se usa en la presente descripción, "expresión condicional" puede referirse a cualquier tipo de expresión condicional que incluye, pero no se limitan a, expresión inducible; expresión reprimible; expresión en células o tejidos que tienen un estado fisiológico, biológico o patológico particulares, etc. Esta definición no pretende excluir la expresión específica de tejido o del tipo de célula. Determinadas modalidades de la invención proporcionan la expresión condicional de un polinucleótido de interés, por ejemplo, la expresión se controla al someter a una célula, tejido, organismo, etc., a un tratamiento o condición que hace que el polinucleótido se exprese o que provoque un aumento o disminución en la expresión del polinucleótido codificado por el polinucleótido de interés.
Los ejemplos ilustrativos de promotores/sistemas inducibles incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles con esteroides, tales como promotores para genes que codifican receptores de glucocorticoides o estrógenos (inducibles por tratamiento con la hormona correspondiente), promotor de metalotionina (inducible por tratamiento con diversos metales pesados), promotor de MX-1 (inducible por interferón), el sistema regulable de mifepristona "GeneSwitch" (Sirin y otros, 2003, Gene, 323:67), el interruptor génico inducible por cumato (documento núm. WO 2002/088346), sistemas reguladores dependientes de tetraciclina, etc.
La expresión condicional también puede lograrse mediante el uso de una recombinasa de ADN específica de un sitio. De acuerdo con determinadas modalidades de la invención, el vector comprende al menos un sitio o sitios (típicamente dos) para la recombinación mediada por una recombinasa específica de un sitio. Como se usa en la presente descripción, los términos "recombinasa" o "recombinasa específica de un sitio" incluyen proteínas, enzimas, cofactores o proteínas asociadas de escisión o integradoras que están involucradas en las reacciones de recombinación que implican uno o más sitios de recombinación (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, siete, diez, doce, quince, veinte, treinta, cincuenta, etc.), que pueden ser proteínas de tipo salvaje (véase Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), o mutantes, derivados (por ejemplo, proteínas de fusión que contienen las secuencias de proteínas de recombinación o fragmentos de estas), fragmentos y variantes de estos. Los ejemplos ilustrativos de recombinasas adecuadas para el uso en modalidades particulares de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, OC31, Cin, Tn3 resolvasa, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCEl, y ParA.
G. Vectores virales
En modalidades particulares, una célula (por ejemplo, una célula T) se transduce con un vector retroviral, por ejemplo, un vector lentiviral, que codifica un CAR o TCR modificado como se contempla en la presente descripción. Las células T transducidas provocan una respuesta de células T estable, a largo plazo y persistente.
Como se usa en la presente descripción, el término "retrovirus" se refiere a un virus de ARN que transcribe inversamente su ARN genómico en una copia lineal de ADN de doble cadena y posteriormente integra covalentemente su ADN genómico en un genoma del huésped. Los retrovirus ilustrativos adecuados para el uso en modalidades particulares incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV), virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), virus de la leucemia felina (FLV), spumavirus, virus de la leucemia murina de Friend, virus de células madre murinas (MSCV) y virus del sarcoma de Rous (RSV) y lentivirus.
Como se usa en la presente descripción, el término "lentivirus" se refiere a un grupo (o género) de retrovirus complejos. Los lentivirus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: VIH (virus de la inmunodeficiencia humana; que incluye VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus visna-maedi (VMV); virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); virus de la inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de la inmunodeficiencia en simios (SIV). En una modalidad, se prefieren las cadenas principales de vectores basados en VIH (es decir, elementos de secuencia del VIH que actúan en cis).
El término "vector' se usa en la presente descripción para referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transferir o transportar otra molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico transferido está generalmente unido a, por ejemplo, insertado en, la molécula del vector de ácido nucleico. Un vector puede incluir las secuencias que dirigen la replicación autónoma en una célula, o puede incluir las secuencias suficientes para permitir la integración en el ADN de la célula huésped. Los vectores útiles incluyen, por ejemplo, los plásmidos (por ejemplo, los plásmidos de ADN o los plásmidos de a Rn ), los transposones, los cósmidos, los cromosomas artificiales bacterianos y los vectores virales. Los vectores virales útiles incluyen, por ejemplo, los retrovirus y los lentivirus defectuosos en la replicación.
Como será evidente para un experto en la técnica, el término "vector viral" se usa ampliamente para referirse a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido de transferencia) que incluye elementos de ácido nucleico derivados de virus que típicamente facilitan la transferencia de la molécula de ácido nucleico o la integración en el genoma de una célula o en una partícula viral que media la transferencia del ácido nucleico. Las partículas virales típicamente incluirán diversos componentes virales y, a veces, también componentes de la célula huésped además del (de los) ácido(s) nucleico(s).
El término vector viral puede referirse a un virus o partícula viral que puede transferir un ácido nucleico a una célula o al propio ácido nucleico transferido. Los vectores virales y los plásmidos de transferencia contienen los elementos genéticos estructurales y/o funcionales que se derivan principalmente de un virus. El término "vector retroviral" se refiere a un vector viral o plásmido que contiene los elementos genéticos estructurales y funcionales, o las partes de estos, que se derivan principalmente de un retrovirus. El término "vector lentiviral" se refiere a un vector viral o plásmido que contiene los elementos genéticos estructurales y funcionales, o las partes de estos, que incluyen las LTR que se derivan principalmente de un lentivirus. El término "vector híbrido" se refiere a un vector, LTR u otro ácido nucleico que contiene tanto secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, como secuencias virales no lentivirales. En una modalidad, un vector híbrido se refiere a un vector o plásmido de transferencia que comprende las secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, para la transcripción inversa, la replicación, la integración y/o el empaquetamiento.
En modalidades particulares, los términos "vector lentiviral", "vector de expresión lentiviral" pueden usarse para referirse a los plásmidos de transferencia lentivirales y/o las partículas lentivirales infecciosas. Cuando se hace referencia en la presente descripción a los elementos tales como los sitios de clonación, los promotores, los elementos reguladores, los ácidos nucleicos heterólogos, etc., se debe entender que las secuencias de estos elementos están presentes en forma de ARN en las partículas lentivirales de la invención y están presentes en forma de ADN en los plásmidos de ADN de la invención.
En cada extremo del provirus hay estructuras llamadas "repeticiones terminales largas" o "LTR". El término "repetición terminal larga (LTR)" se refiere a los dominios de pares de bases ubicados en los extremos de los ADN retrovirales que, en su contexto de secuencia natural, son repeticiones directas y contienen regiones U3, R y U5. Las LTR generalmente proporcionan las funciones fundamentales para la expresión de los genes retrovirales (por ejemplo, la promoción, la iniciación y la poliadenilación de transcritos génicos) y para la replicación viral. La LTR contiene numerosas señales reguladoras que incluyen los elementos de control de la transcripción, las señales de poliadenilación y las secuencias necesarias para la replicación y la integración del genoma viral. La LTR viral se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. La región U3 contiene los elementos potenciadores y promotores. La región U5 es la secuencia entre el sitio de unión del cebador y la región R y contiene la secuencia de poliadenilación. La región R (repetición) está flanqueada por las regiones U3 y U5. La LTR se compone de regiones U3, R y U5 y aparece en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Adyacente a la LTR 5' hay secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del cebador de ARNt) y para el empaquetamiento eficiente del ARN viral en partículas (el sitio Psi).
Como se usa en la presente descripción, el término "señal de empaquetamiento" o "secuencia de empaquetamiento" se refiere a las secuencias ubicadas dentro del genoma retroviral que se requieren para la inserción del a Rn viral en la cápside o partícula viral, véase, por ejemplo, Clever y otros, 1995. J. of Virology, vol. 69, núm. 4; pp. 2101-2109. Varios vectores retrovirales usan la señal de empaquetamiento mínima (también conocida como la secuencia psi [V]) necesaria para la encapsidación del genoma viral. Por lo tanto, como se usa en la presente descripción, los términos "secuencia de empaquetamiento", "señal de empaquetamiento", "psi" y el símbolo "V" se usan en referencia a la secuencia no codificante requerida para la encapsidación de las cadenas de ARN retrovirales durante la formación de las partículas virales.
En diversas modalidades, los vectores comprenden LTR 5' y/o LTR 3' modificadas. Cualquiera o ambas de las LTR pueden comprender una o más modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, una o más deleciones, inserciones o sustituciones. Las modificaciones de la LTR 3' a menudo se realizan para mejorar la seguridad de los sistemas lentivirales o retrovirales al hacer que los virus sean defectuosos en la replicación. Como se usa en la presente descripción, el término "defectuoso en la replicación" se refiere a un virus que no puede llevar a cabo una replicación completa y efectiva de modo que no se produzcan viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral con replicación defectuosa). El término "competente en la replicación" se refiere a un virus de tipo salvaje o un virus mutante que puede replicarse, de modo que la replicación viral del virus puede producir viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral competente en la replicación).
Los vectores "autoinactivadores" (SIN) se refieren a los vectores defectuosos en la replicación, por ejemplo, los vectores retrovirales o lentivirales, en los que la región potenciadora-promotora de LTR (3') derecha, conocida como región U3, se ha modificado (por ejemplo, por eliminación o sustitución) para evitar la transcripción viral más allá de la primera ronda de la replicación viral. Esto se debe a que la región U3 de LTR derecha (3') se usa como molde para la región U3 de LTR izquierda (5') durante la replicación viral y, por lo tanto, la transcripción viral no puede llevarse a cabo sin el promotor-potenciador de U3. En una modalidad adicional de la invención, la LTR 3' se modifica de modo que la región U5 se reemplaza, por ejemplo, con una secuencia de poli(A) ideal. Debe señalarse que las modificaciones a las LTR, tales como las modificaciones a la LTR 3', la LTR 5', o ambas LTR 3' y 5', también se incluyen en la invención.
Se proporciona una mejora de seguridad adicional al reemplazar la región U3 de la LTR 5'con un promotor heterólogo para impulsar la transcripción del genoma viral durante la producción de las partículas virales. Los ejemplos de los promotores heterólogos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, los promotores del virus de simio 4o (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), de citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, temprano inmediato), del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), del virus del sarcoma de Rous (RSV) y del virus del herpes simple (HSV) (de timidina quinasa). Los promotores típicos pueden conducir a altos niveles de la transcripción de una manera independiente de Tat. Este reemplazo reduce la posibilidad de la recombinación para generar virus competentes en la replicación porque no hay una secuencia U3 completa en el sistema de producción de virus. En determinadas modalidades, el promotor heterólogo tiene ventajas adicionales para controlar la manera en que se transcribe el genoma viral. Por ejemplo, el promotor heterólogo puede ser inducible, de modo que la transcripción de todo o parte del genoma viral ocurrirá solo cuando los factores de inducción estén presentes. Los factores de inducción incluyen, pero no se limitan a, uno o más compuestos químicos o las condiciones fisiológicas tales como la temperatura o el pH, en las que se cultivan las células huésped.
En algunas modalidades, los vectores virales comprenden un elemento TAR. El término "TAR" se refiere al elemento genético de "respuesta de transactivación" ubicado en la región R de las LTR lentivirales (por ejemplo, VIH). Este elemento interactúa con el elemento genético transactivador lentiviral (tat) para mejorar la replicación viral. Sin embargo, este elemento no se requiere en las modalidades en las que la región U3 de la LTR 5' se reemplaza por un promotor heterólogo.
La "región R" se refiere a la región dentro de las LTR retrovirales que comienzan al inicio del grupo de protección (es decir, el inicio de la transcripción) y terminan inmediatamente antes del comienzo del segmento de poli A. La región R también se define como flanqueada por las regiones U3 y U5. La región R desempeña un papel durante la transcripción inversa al permitir la transferencia del ADN naciente de un extremo del genoma al otro.
Como se usa en la presente descripción, el término "elemento FLAP" se refiere a un ácido nucleico cuya secuencia incluye el segmento central de polipurinas y las secuencias de terminación central (cPPT y CTS) de un retrovirus, por ejemplo, VIH-1 o VIH-2. Los elementos FLAP adecuados se describen en la patente de los Estados Unidos núm.
6,682,907 y en Zennou, y otros, 2000, Cell, 101:173. Durante la transcripción inversa del VIH-1, la iniciación central del ADN de cadena positiva en el segmento central de polipurinas (cPPT) y la terminación central en la secuencia de terminación central (CTS) conducen a la formación de una estructura de ADN de tres cadenas: el pliegue (flap) de ADN central del VIH-1. Sin desear estar atados por ninguna teoría, el pliegue de ADN puede actuar como un determinante cis-activo de la importación nuclear del genoma lentiviral y/o puede aumentar el título del virus. En modalidades particulares, las cadenas principales de los vectores retrovirales o lentivirales comprenden uno o más elementos FLAP hacia el extremo secuencia arriba o hacia el extremo secuencia abajo de los genes heterólogos de interés en los vectores. Por ejemplo, en modalidades particulares, un plásmido de transferencia incluye un elemento FLAP. En una modalidad, un vector de la invención comprende un elemento FLAP aislado de VIH-1.
En una modalidad, los vectores de transferencia retrovirales o lentivirales comprenden uno o más elementos de exportación. El término "elemento de exportación" se refiere a un elemento regulador postranscripcional, que actúa en cis, que regula el transporte de un transcrito de ARN desde el núcleo al citoplasma de una célula. Los ejemplos de elementos de exportación de ARN incluyen, pero no se limitan a, el elemento de respuesta rev (RRE) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (véase, por ejemplo, Cullen y otros, 1991. J. Virol. 65: 1053; y Cullen y otros, 1991. Cell 58: 423), y el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE). En general, el elemento de exportación de ARN se coloca dentro de la UTR 3' de un gen, y puede insertarse como una o múltiples copias.
En modalidades particulares, la expresión de las secuencias heterólogas en los vectores virales se incrementa mediante la incorporación de los elementos reguladores postranscripcionales, los sitios de poliadenilación eficientes y, opcionalmente, las señales de terminación de la transcripción en los vectores. Una variedad de elementos reguladores postranscripcionales puede aumentar la expresión de un ácido nucleico heterólogo a la proteína, por ejemplo, el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de marmota (WPRE; Zufferey y otros, 1999, J. Virol., 73:2886); el elemento regulador postranscripcional presente en el virus de la hepatitis B (HPRE) (Huang y otros, Mol. Cell. Biol., 5:3864); y similares (Liu y otros, 1995, Genes Dev., 9:1766). En modalidades particulares, los vectores de la invención comprenden un elemento regulador postranscripcional tal como un WPRE o HPRE
En modalidades particulares, los vectores de la invención carecen o no comprenden un elemento regulador postranscripcional tal como un WPRE o HPRE porque en algunos casos estos elementos aumentan el riesgo de transformación celular y/o no aumentan sustancial o significativamente la cantidad de transcrito de ARNm o aumentan la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, en algunas modalidades, los vectores de la invención carecen o no comprenden un WPRE o HPRE como una medida de seguridad adicional.
Los elementos que dirigen la terminación eficiente y la poliadenilación de los transcritos del ácido nucleico heterólogo aumentan la expresión génica heteróloga. Las señales de terminación de la transcripción se encuentran generalmente hacia el extremo secuencia abajo de la señal de poliadenilación. En modalidades particulares, los vectores comprenden una secuencia de poliadenilación 3' de un polinucleótido que codifica un polipéptido a expresar. El término "sitio de poliA" o "secuencia de poliA", como se usa en la presente descripción, denota una secuencia de ADN que dirige tanto la terminación como la poliadenilación del transcrito de ARN naciente por la ARN polimerasa II. Las secuencias de poliadenilación pueden promover la estabilidad del ARNm mediante la adición de una cola de poliA al extremo 3' de la secuencia codificante y, por lo tanto, contribuir a una mayor eficiencia traduccional. La poliadenilación eficiente del transcrito recombinante es conveniente ya que los transcritos que carecen de una cola de poliA son inestables y se degradan rápidamente. Los ejemplos ilustrativos de las señales de poliA que pueden usarse en un vector de la invención incluyen una secuencia de poliA ideal (por ejemplo, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), una secuencia de poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGHpA), una secuencia de poliA de p-globina de conejo (rpgpA), u otra secuencia de poliA heteróloga o endógena adecuada conocida en la técnica.
En diversas modalidades, los vectores de la invención comprenden un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de CAR o TCR modificado. Los vectores pueden tener una o más LTR, en donde cualquiera de las LTR comprende una o más modificaciones, tales como una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos. Los vectores pueden comprender además uno de más elementos accesorios para aumentar la eficiencia de la transducción (por ejemplo, un cPPT/FLAP), empaque viral (por ejemplo, una señal de empaque Psi (V), RRE) y/u otros elementos que aumentan la expresión del gen terapéutico (por ejemplo, las secuencias de poli(A)), y opcionalmente pueden comprender un WPRE o HPRE. El experto en la técnica apreciará que pueden formarse muchas otras modalidades diferentes a partir de las modalidades existentes de la invención.
Una "célula huésped" incluye las células transfectadas, infectadas o transducidas in vivo, ex vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la presente descripción. Las células huésped pueden incluir las células de empaquetamiento, las células productoras y las células infectadas con vectores virales. En modalidades particulares, las células huésped infectadas con un vector viral de la presente descripción son adecuadas para la administración a un sujeto que necesita la terapia. En determinadas modalidades, el término "célula objetivo" se usa indistintamente con célula huésped y se refiere a las células transfectadas, infectadas o transducidas de un tipo de célula deseado. En las modalidades, la célula objetivo es una célula T.
La producción de partículas virales a gran escala es a menudo necesaria para lograr un título viral razonable. Las partículas virales se producen al transfectar un vector de transferencia en una línea celular de empaquetamiento que comprende genes virales estructurales y/o accesorios, por ejemplo, genes gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx o nef u otros genes retrovirales.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector de empaquetamiento" se refiere a un vector de expresión o vector viral que carece de una señal de empaquetamiento y comprende un polinucleótido que codifica uno, dos, tres, cuatro o más genes estructurales y/o accesorios virales. Típicamente, los vectores de empaquetamiento se incluyen en una célula de empaquetamiento, y se introducen en la célula mediante la transfección, la transducción o la infección. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de transfección, transducción o infección. Puede introducirse un vector de transferencia retroviral/lentiviral de la presente invención en una línea celular de empaquetamiento, mediante la transfección, la transducción o la infección, para generar una célula o línea celular productora. Los vectores de empaquetamiento de la presente descripción pueden introducirse en células o líneas celulares humanas mediante métodos estándar que incluyen, por ejemplo, la transfección con fosfato de calcio, la lipofección o la electroporación. En algunos ejemplos, los vectores de empaquetamiento se introducen en las células junto con un marcador de selección dominante, tal como neomicina, higromicina, puromicina, blastocidina, zeocina, timidina quinasa, DHFR, Gln sintetasa o ADA, seguido de la selección en presencia del fármaco apropiado y el aislamiento de clones. Un gen marcador de selección puede unirse físicamente a los genes codificados por el vector de empaquetamiento, por ejemplo, por IRES o péptidos virales autoescindibles.
Las proteínas de la envoltura viral (env) determinan la variedad de células huésped que finalmente pueden infectarse y transformarse por los retrovirus recombinantes generados a partir de las líneas celulares. En el caso de los lentivirus, como VIH-1, VIH-2, SIV, FIV y EIV, las proteínas env incluyen gp41 y gp120. Preferentemente, las proteínas env virales expresadas por las células de empaquetamiento de la descripción se codifican en un vector separado de los genes gag y pol virales, como se ha descrito previamente.
Los ejemplos ilustrativos de genes env derivados de retrovirus que pueden emplearse en la invención incluyen, pero no se limitan a: envolturas de MLV, envoltura 10A1, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, Ébola, Sendai, FPV (virus de la peste de las aves), y envolturas del virus de la gripe. De manera similar, pueden usarse los genes que codifican las envolturas de los virus de ARN (por ejemplo, las familias de los virus de ARN de Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) así como también de los virus de ADN (familias de Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae e Iridoviridae). Los ejemplos representativos incluyen FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, Rabia, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 y EIAV.
En otras modalidades, las proteínas de la envoltura para pseudotipar un virus de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes virus: influenza A tales como H1N1, H1N2, H3N2 y H5N1 (gripe aviar), influenza B, virus de la influenza C, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D, virus de la hepatitis E, rotavirus, cualquier virus del grupo del virus Norwalk, adenovirus entéricos, parvovirus, virus de la fiebre del dengue, viruela del mono, mononegavirales, Lyssavirus tales como el virus de la rabia, virus del murciélago de Lagos, virus de Mokola, virus de Duvenhage, virus de murciélago europeo 1 y 2 y virus de murciélago australiano, efemerovirus, vesiculovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus del herpes tales como el virus del herpes simple tipos 1 y 2, varicela zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Bar (EBV), virus del herpes humano (HHV), virus del herpes humano tipo 6 y 8, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma, virus del gammaherpes murino, arenavirus tales como el virus de la fiebre hemorrágica argentina, virus de la fiebre hemorrágica boliviana, virus de la fiebre hemorrágica asociada a Sabia, virus de la fiebre hemorrágica venezolana, virus de la fiebre de Lassa, virus de Machupo, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), Bunyaviridiae como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, hantavirus, virus causante de la fiebre hemorrágica con síndrome renal, virus de la fiebre del Valle del Rift, Filoviridae (filovirus), incluida la fiebre hemorrágica del Ébola y la fiebre hemorrágica de Marburgo, Flaviviridae, incluido el virus de la enfermedad del bosque de Kaysanur, el virus de la fiebre hemorrágica Omsk, el virus causante de la encefalitis transmitida por garrapatas y el Paramyxoviridae, como el virus Hendra y el virus Nipah, la variola mayor y la variola menor (viruela), alfavirus como el virus de la encefalitis equina venezolana, el virus de la encefalitis equina del este, el virus de la encefalitis equina del oeste, el coronavirus asociado al SARS (SARS-CoV), el virus del Nilo Occidental, cualquier virus causante de encefalitis.
La presente descripción proporciona las células de empaquetamiento que producen retrovirus recombinantes, por ejemplo, lentivirus, pseudotipados con la glucoproteína VSV-G.
Los términos "pseudotipo" o "pseudotipado", como se usan en la presente descripción, se refieren a un virus cuyas proteínas de la envoltura viral se han sustituido con las de otro virus que posee características preferibles. Por ejemplo, el VIH puede pseudotiparse con proteínas de la envoltura de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), lo que permite que el VIH infecte una gama más amplia de células porque las proteínas de la envoltura del VIH (codificadas por el gen env) normalmente dirigen el virus a las células presentadoras CD4+. En una modalidad preferida de la invención, las proteínas de la envoltura lentivirales se pseudotipan con VSV-G. La presente descripción proporciona las células de empaquetamiento que producen retrovirus recombinantes, por ejemplo, lentivirus, pseudotipados con la glicoproteína de la envoltura VSV-G.
Como se usa en la presente descripción, el término "líneas celulares de empaquetamiento" se usa en referencia a líneas celulares que no contienen una señal de empaquetamiento, pero que expresan de manera estable o transitoria las proteínas estructurales virales y las enzimas de replicación (por ejemplo, gag, pol y env) que son necesarias para el correcto empaquetamiento de las partículas virales. Puede emplearse cualquier línea celular adecuada para preparar las células de empaquetamiento de la presente descripción. En general, las células son células de mamífero. En un ejemplo particular, las células usadas para producir la línea celular de empaquetamiento son células humanas. Las líneas celulares adecuadas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células MDCK, células C3H 10T1/2, células FLY, células Psi-2, células BOSC 23, células PA317, células WEHI, células COS, células BSC 1, células BSC 40, células BMT 10, células VERO, células W138, células MRC5, células A549, células HT1080, células 293, células 293T, células B-50, células 3T3, células NIH3T3, células HepG2, células Saos-2, Células Huh7, células HeLa, células W163, células 211 y células 211A. En ejemplos preferidos, las células de empaquetamiento son las células 293, las células 293T o las células A549.
Como se usa en la presente descripción, el término "línea celular productora" se refiere a una línea celular que es capaz de producir partículas retrovirales recombinantes, que comprende una línea celular de empaquetamiento y un constructo de vector de transferencia que comprende una señal de empaquetamiento. La producción de partículas virales infecciosas y soluciones madre virales puede llevarse a cabo mediante el uso de técnicas convencionales. Los métodos para preparar las soluciones madre virales se conocen en la técnica y se ilustran, por ejemplo, en Y. Soneoka y otros (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, y N. R. Landau y otros (1992) J. Virol. 66:5110-5113. Las partículas virales infecciosas pueden recogerse de las células de empaquetamiento mediante el uso de técnicas convencionales. Por ejemplo, las partículas infecciosas pueden recogerse por lisis celular, o la colección del sobrenadante del cultivo celular, como se conoce en la técnica. Opcionalmente, las partículas virales recogidas pueden purificarse si se desea. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de purificación adecuadas.
El suministro de uno o más genes u otra secuencia de polinucleótidos mediante el uso de un vector retroviral o lentiviral mediante la infección viral en lugar de mediante la transfección se denomina "transducción". En una modalidad, los vectores retrovirales se transducen a una célula a través de la infección y la integración de provirus. En determinadas modalidades, una célula T, es "transducida" si comprende un gen u otra secuencia de polinucleótidos suministrados a la célula por infección mediante el uso de un vector viral o retroviral. En modalidades particulares, una célula transducida comprende uno o más genes u otras secuencias de polinucleótidos suministradas por un vector retroviral o lentiviral en su genoma celular.
En ejemplos particulares, las células huésped transducidas con un vector viral de la descripción que expresa uno o más polipéptidos, son adecuadas para la administración a un sujeto para tratar y/o prevenir una neoplasia maligna de células B. Pueden encontrarse otros métodos relacionados con el uso de los vectores virales en la terapia génica, que pueden usarse de acuerdo con determinados ejemplos, por ejemplo, en Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. y Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. y otros (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. y otros (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. y Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. y Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. y Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; y Lee, H. C. y otros (2000) Nature 408:483-8.
H. Composiciones y formulaciones
Las composiciones que se contemplan en la presente descripción pueden comprender uno o más polipéptidos, polinucleótidos, vectores que los comprenden y composiciones de células T, como se contempla en la presente descripción. Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, las composiciones farmacéuticas. Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición formulada en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para la administración a una célula o un animal, ya sea sola o en combinación con una o más de otras modalidades de terapia. También se entenderá que, si se desea, las composiciones de la descripción también pueden administrarse en combinación con otros agentes, tales como, por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, moléculas pequeñas, quimioterapéuticos, profármacos, fármacos, anticuerpos, u otros diversos agentes farmacéuticamente activos. Prácticamente no hay límite para otros componentes que también pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten negativamente la capacidad de la composición para suministrar la terapia prevista.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente descripción para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para usar en contacto con los tejidos de los seres humanos y los animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable.
Como se usa en la presente descripción, "portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye, pero no se limitan a, cualquier adyuvante, portador, excipiente, deslizante, agente edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador del sabor, tensioactivo, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, estabilizador, agente isotónico, disolvente, tensioactivo o emulsionante que se ha aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos como aceptable para usar en los seres humanos o los animales domésticos. Los portadores farmacéuticamente aceptables ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto; malta; gelatina; talco; manteca de cacao, ceras, grasas animales y vegetales, parafinas, siliconas, bentonitas, ácido silícico, óxido de zinc; aceites, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones amortiguadoras de fosfato; y cualquier otra sustancia compatible empleada en las formulaciones farmacéuticas.
Las composiciones de la presente descripción comprenden una cantidad de células T modificadas producidas por los métodos que se contemplan en la presente descripción. En ejemplos preferidos, las composiciones farmacéuticas de células T comprenden células T potentes que tienen uno o más de, o todos, los siguientes marcadores: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD 122 y CD 127.
En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprende las células T producidas por los métodos que se contemplan en la presente descripción puede administrarse a una dosis de 102 a 1010 células/kg de peso corporal, de 105 a 109 células/kg de peso corporal, de 105 a 108 células/kg de peso corporal, de 105 a 107 células/kg de peso corporal, de 107 a 109 células/kg de peso corporal, o de 107 a 108 células/kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros dentro de esos intervalos. El número de células dependerá del uso final para el que está destinada la composición, al igual que el tipo de células incluidas en el mismo. Para los usos proporcionados en la presente descripción, las células están generalmente en un volumen de un litro o menos, puede ser de 500 ml o menos, incluso de 250 ml o 100 ml o menos. Por lo tanto, la densidad de las células deseadas es típicamente mayor que 106 células/ml y generalmente es mayor que 107 células/ml, generalmente 108 células/ml o mayor. La cantidad clínicamente relevante de células inmunitarias puede distribuirse en múltiples infusiones que acumulativamente igualan o exceden 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 o 1012 células. En algunos aspectos de la presente descripción, particularmente dado que todas las células infundidas serán redirigidas a un antígeno objetivo particular (por ejemplo, BCMA), menor número de células, en el intervalo de 106/kilogramo (106-1011 por paciente) puede administrarse. Las células T modificadas para expresar un TCR o CAR modificado pueden administrarse múltiples veces en las dosis dentro de estos intervalos. Las células pueden ser alogénicas, singénicas, xenogénicas o autólogas para el paciente sometido a terapia. Si se desea, el tratamiento también puede incluir la administración de mitógenos (por ejemplo, PHA) o linfocinas, citocinas y/o quimiocinas (por ejemplo, IFN-y, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, TNF-alfa, IL-18 y TNF-beta, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1a, etc.) como se describe en la presente descripción para mejorar el injerto y la función de las células T infundidas.
Generalmente, las composiciones que comprenden las células activadas y expandidas como se describe en la presente descripción pueden usarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos inmunodeprimidos. En particular, las composiciones que comprenden las células T modificadas producidas por los métodos que se contemplan en la presente descripción se usan en el tratamiento del cáncer. Las células T modificadas de la presente descripción pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica en combinación con portadores, diluyentes, excipientes y/o con otros componentes, tales como IL-2, IL-7 y/o IL-15 u otras citocinas o poblaciones celulares. En ejemplos particulares, las composiciones farmacéuticas que se contemplan en la presente descripción comprenden una cantidad de células T modificadas genéticamente, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden las células T modificadas que se contemplan en la presente descripción pueden comprender además amortiguadores, tales como solución salina amortiguada neutra, solución salina amortiguada con fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente descripción se formulan preferentemente para administración parenteral, por ejemplo, administración intravascular (intravenosa o intraarterial), intraperitoneal o intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir uno o más de los siguientes: DMSO, diluyentes estériles, tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos, tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; amortiguadores, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples fabricadas de vidrio o plástico. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.
En un ejemplo particular, las composiciones que se contemplan en la presente descripción comprenden una cantidad eficaz de una composición de células T modificadas y expandidas, sola o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. Por lo tanto, las composiciones de células T pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos conocidos contra el cáncer, tales como la radioterapia, la quimioterapia, el trasplante, la inmunoterapia, la terapia hormonal, la terapia fotodinámica, etc. Las composiciones también pueden administrarse en combinación con antibióticos. Dichos agentes terapéuticos pueden aceptarse en la técnica como un tratamiento estándar para un estado patológico particular como se describe en la presente descripción, tal como un cáncer particular. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se contemplan incluyen citocinas, factores de crecimiento, esteroides, AINE, DMARD, antiinflamatorios, quimioterapéuticos, radioterapéuticos, anticuerpos terapéuticos u otros agentes activos y auxiliares.
En determinados ejemplos, las composiciones que comprenden las células T que se contemplan en la presente descripción pueden administrarse junto con cualquier número de agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos ilustrativos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, que incluyen altretamina, trietilenomelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glucósido; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de elliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína); ONTAK™ (denileukin diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores como los antiestrógenos, que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Puede usarse una variedad de otros agentes terapéuticos junto con las composiciones descritas en la presente descripción. En un ejemplo, la composición que comprende las células T se administra con un agente antiinflamatorio. Los agentes o los fármacos antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, esteroides y glucocorticoides (que incluyen betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que incluyen aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato.
Otros AINE ilustrativos se eligen del grupo que consiste en ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 tales como VIOXX® (rofecoxib) y CELEBREX® (celecoxib) y sialilatos. Los analgésicos ilustrativos se eligen del grupo que consiste en paracetamol, oxicodona, tramadol de clorhidrato de proporxifeno. Los glucocorticoides ilustrativos se eligen del grupo que consiste en cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica ilustrativos incluyen las moléculas dirigidas contra los marcadores de la superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), los inhibidores de citocinas, tales como los antagonistas del TNF (por ejemplo, etanercept (ENb Re L®), adalimumab (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®)), los inhibidores de quimiocinas y los inhibidores de las moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen los anticuerpos monoclonales, así como también las formas recombinantes de las moléculas. Los DMARD ilustrativos incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, oro (oral (auranofín) e intramuscular) y minociclina.
Los ejemplos ilustrativos de los anticuerpos terapéuticos adecuados para la combinación con las células T modificadas con CAR que se contemplan en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, abagovomab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, arcitumomab, bavituximab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, cantuzumab, catumaxomab, cetuximab, citatuzumab, cixutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeximab, elotuzumab, ensituximab, ertumaxomab, etaracizumab, farietuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuximab, ganitumab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuximab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moxetumomab, namatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomab, ocaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, radretumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuximab, simtuzumab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituximab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49 y 3F8.
En determinados ejemplos, las composiciones descritas en la presente descripción se administran junto con una citocina. Por "citocina", como se usa en la presente descripción, se entiende un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas, quimiocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen las hormonas de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana N-metionil y la hormona de crecimiento bovina; la hormona paratiroidea; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; larelaxina; la prorelaxina; las hormonas glicoproteicas tales como la hormona estimulante de folículos (FSH), la hormona estimulante de la tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placentario; el factor de necrosis tumoral alfa y beta; la sustancia inhibidora mulleriana; el péptido asociado a gonadotropina de ratón; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento vascular endotelial; la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento nervioso como NGF-beta; el factor de crecimiento plaquetario; los factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; el factor de crecimiento similar a la insulina I y II; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductores; los interferones tales como el interferón alfa, beta y gamma; los factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y el ligando de kit (KL). Como se usa en la presente descripción, el término citocina incluye las proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activas de las citocinas de secuencia nativa.
I. Células objetivo y antígenos
La presente descripción contempla, en parte, las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente redirigidas a una célula objetivo, por ejemplo, una célula tumoral o cancerosa, y que comprenden los receptores de células T modificados o CAR que tienen un dominio de unión que se une a los antígenos objetivo en las células. Las células cancerosas también pueden propagarse a otras partes del cuerpo a través de los sistemas sanguíneo y linfático. Existen varios tipos principales de cáncer. El carcinoma es un cáncer que comienza en la piel o en los tejidos que recubren o cubren los órganos internos. El sarcoma es un cáncer que comienza en huesos, cartílago, grasa, músculo, vasos sanguíneos u otro tejido conectivo o de soporte. La leucemia es un cáncer que comienza en el tejido formador de sangre, como la médula ósea, y hace que se produzcan grandes cantidades de células sanguíneas anormales que ingresan a la sangre. El linfoma y el mieloma múltiple son cánceres que comienzan en las células del sistema inmunitario. Los cánceres del sistema nervioso central son cánceres que comienzan en los tejidos del cerebro y la médula espinal.
En una modalidad, la célula objetivo expresa un antígeno, por ejemplo, el antígeno objetivo, que no se encuentra sustancialmente en la superficie de otras células normales (deseadas). En una modalidad, la célula objetivo es una célula parenquimatosa pancreática, una célula del conducto pancreático, una célula hepática, una célula del músculo cardíaco, una célula del músculo esquelético, un osteoblasto, un mioblasto esquelético, una neurona, una célula endotelial vascular, una célula pigmentaria, una célula de músculo liso, una célula glial, un adipocito, una célula ósea, un condrocito, una célula de islote pancreático, una célula del SNC, una célula del SNP, una célula hepática, una célula adiposa, una célula renal, una célula pulmonar, una célula de la piel, una célula de ovario, una célula folicular, una célula epitelial, una célula inmunitaria o una célula endotelial.
En determinadas modalidades, la célula objetivo es parte de un tejido pancreático, tejido neural, tejido cardíaco, médula ósea, tejido muscular, tejido óseo, tejido de la piel, tejido hepático, folículos pilosos, tejido vascular, tejido adiposo, tejido pulmonar y tejido renal.
En una modalidad particular, la célula objetivo es una célula tumoral. En otra modalidad particular, la célula objetivo es una célula cancerosa, tal como una célula en un paciente con cáncer. Las células ilustrativas que pueden eliminarse con los métodos descritos incluyen las células de los siguientes tumores: un tumor líquido como una leucemia, que incluye leucemia aguda (como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (como leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas).
En otra modalidad, la célula es una célula de un tumor sólido, tal como sarcomas y carcinomas, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma (por ejemplo, adenocarcinoma de páncreas, colon, ovario, pulmón, mama, estómago, próstata, cuello uterino o esófago), carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de vejiga, tumores del SNC (tales como glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma).
En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en tumor de Wilms, sarcoma de Ewing, un tumor neuroendocrino, un glioblastoma, un neuroblastoma, un melanoma, cáncer de piel, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer renal, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer biliar, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma medular de tiroides, cáncer de ovario, glioma, linfoma, leucemia, mieloma, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin y cáncer de vejiga urinaria.
En una modalidad, la célula objetivo es una célula maligna del hígado, páncreas, pulmón, mama, vejiga, cerebro, hueso, tiroides, riñón, piel y sistema hematopoyético. En otra modalidad, la célula objetivo es una célula en un cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de hueso, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de piel o cáncer hematológico.
En una modalidad, la célula objetivo es una célula, por ejemplo, una célula cancerosa infectada por un virus, que incluye, entre otros, CMV, VPH y EBV.
En una modalidad, el antígeno objetivo es un epítopo del receptor alfa de folato, 5T4, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, CMV, EBV, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, HPV, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Muc1, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM o VEGFR2.
J. Métodos terapéuticos
Las células T modificadas producidas por los métodos que se contemplan en la presente descripción proporcionan una inmunoterapia adoptiva mejorada para usar en el tratamiento de diversas afecciones que incluyen, pero no se limitan a, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria e inmunodeficiencia. En modalidades particulares, la especificidad de una célula T primaria se redirige a las células tumorales o cancerosas mediante la modificación genéticamente de la célula T primaria con un CAR o TCR modificado que se contempla en la presente descripción. La presente descripción incluye un tipo de terapia celular en la que las células T se modifican para expresar un CAR o TCR modificado que se dirige a las células cancerosas que expresan un antígeno objetivo, y la célula T modificada se infunde a un receptor que lo necesite. La célula infundida puede matar las células tumorales en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, las células T modificadas con CAR o TCR modificados pueden replicarse in vivo; lo que contribuye así a la persistencia a largo plazo que puede conducir a una terapia sostenida contra el cáncer.
En un ejemplo, las células T con CAR y TCR modificados producidas por los métodos de la invención pueden experimentar una sólida expansión de células T in vivo y pueden persistir durante un período de tiempo prolongado. En otro ejemplo, las células T con CAR o TCR modificados producidas por los métodos de la invención evolucionan a las células T de memoria específica que pueden reactivarse para inhibir cualquier formación o crecimiento tumoral adicional.
En ejemplos particulares, las composiciones que comprenden una célula efectora inmunitaria modificada genéticamente con un vector que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica un CAR se usan en el tratamiento de tumores o cánceres sólidos que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de huesos, cáncer de tiroides, cáncer de riñón o cáncer de piel.
En ejemplos particulares, las composiciones que comprenden una célula efectora inmunitaria modificada genéticamente con un vector que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica un CAR o TCR modificado que comprende un dominio de unión específico al antígeno que se une a un epítopo de PSCA o MUC1 se usan en el tratamiento de diversos tipos de cáncer, que incluyen, pero no se limitan a, pancreático, de vejiga y de pulmón.
En ejemplos particulares, las composiciones que comprenden una célula efectora inmunitaria modificada genéticamente con un vector que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica un CAR o TCR modificado se usan en el tratamiento de tumores líquidos, que incluyen, pero no se limitan a, una leucemia, que incluye leucemia aguda (por ejemplo, ALL, AML y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (por ejemplo, CLL, SLL, CML, HCL), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y enfermedad de las cadenas pesadas.
En ejemplos particulares, las composiciones que comprenden una célula efectora inmunitaria modificada genéticamente con un vector que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica un CAR o TCR modificado se usan en el tratamiento de las neoplasias malignas de células B, que incluyen, pero no se limitan a, el mieloma múltiple (MM), el linfoma no Hodgkin (NHL) y la leucemia linfocítica crónica (CLL).
El mieloma múltiple es una neoplasia maligna de células B de la morfología de células plasmáticas maduras caracterizada por la transformación neoplásica de un solo clon de este tipo de células. Estas células plasmáticas proliferan en la BM y pueden invadir el hueso adyacente y, a veces, la sangre. Las formas variantes de mieloma múltiple incluyen mieloma múltiple sintomático, mieloma múltiple asintomático, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma IgD, mieloma osteosclerótico, plasmacitoma óseo solitario y plasmacitoma extramedular (ver, por ejemplo, Braunwald, y otros (Eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 15a edición (McGraw-Hill 2001)).
El linfoma no Hodgkin abarca un gran grupo de cánceres de linfocitos (glóbulos blancos). Los linfomas no Hodgkin pueden ocurrir a cualquier edad y a menudo están marcados por ganglios linfáticos que son más grandes de lo normal, fiebre y pérdida de peso. Existen muchos tipos diferentes de linfoma no Hodgkin. Por ejemplo, el linfoma no Hodgkin puede dividirse en tipos agresivos (de crecimiento rápido) e indolentes (de crecimiento lento). Aunque los linfomas no Hodgkin pueden derivarse de células B y células T, como se usa en la presente descripción, el término "linfoma no Hodgkin" y "linfoma no Hodgkin de células B" se usan indistintamente. Los linfomas no Hodgkin de células B (NHL) incluyen el linfoma de Burkitt, la leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño (CLL/SLL), el linfoma difuso de células B grandes, el linfoma folicular, el linfoma inmunoblástico de células grandes, el linfoma linfoblástico de precursores B y el linfoma de células del manto. Los linfomas que ocurren después del trasplante de la médula ósea o de las células madre suelen ser linfomas no Hodgkin de células B.
La leucemia linfocítica crónica (CLL) es un cáncer indolente (de crecimiento lento) que provoca un aumento lento en los glóbulos blancos inmaduros denominados linfocitos B, o células B. Las células cancerosas se diseminan a través de la sangre y la médula ósea, y también pueden afectar los ganglios linfáticos u otros órganos tales como el hígado y el bazo. La CLL eventualmente hace que la médula ósea falle. A veces, en etapas posteriores de la enfermedad, la enfermedad se denomina linfoma linfocítico pequeño.
En ejemplos particulares, se proporcionan los métodos que comprenden administrar una cantidad con eficacia terapéutica de células T modificadas que se contemplan en la presente descripción o una composición que comprende las mismas, a un paciente que lo necesite, solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. En determinados ejemplos, las células producidas por los métodos de la invención se usan en el tratamiento de pacientes en riesgo de desarrollar un cáncer. Por lo tanto, la presente descripción proporciona los métodos para el tratamiento o la prevención de un cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad con eficacia terapéutica de las células T modificadas de la descripción.
En un ejemplo, un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesita comprende administrar una cantidad eficaz, por ejemplo, una cantidad con eficacia terapéutica de una composición que comprende células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente que se contemplan en la presente descripción. La cantidad y la frecuencia de administración estarán determinadas por factores tales como la afección del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque los ensayos clínicos pueden determinar las dosis apropiadas.
En un ejemplo, la cantidad de células T en la composición administrada a un sujeto es al menos 0,1 x 105 células, al menos 0,5 x 105 células, al menos 1 x 105 células, al menos 5 x 105 células, al menos 1 x 106 células, al menos 0,5 x 107 células, al menos 1 x 107 células, al menos 0,5 x 108 células, al menos 1 x 108 células, al menos 0,5 x 109 células, al menos 1 x 109 células, al menos 2 x 109 células, al menos 3 x 109 células, al menos 4 x 109 células, al menos 5 x 109 células o al menos 1 x 1010 células. En ejemplos particulares, de aproximadamente 1 x 107 células T con CAR a aproximadamente 1 x 109 células T con CAR, de aproximadamente 2 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,9 x 109 células T con CAR, de aproximadamente 3 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,8 x 109 células T con CAR, de aproximadamente 4 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,7 x 109 células T con CAR, de aproximadamente 5 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,6 x 109 células T con CAR, o de aproximadamente 5 x 107 células T con CAR a aproximadamente 0,5 x 109 células T con CAR T se administran a un sujeto.
En un ejemplo, la cantidad de células T en la composición administrada a un sujeto es al menos 0,1 x 104 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 x 104 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 104 células/kg de peso corporal, al menos 5 x 104 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 105 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 x 106 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 106 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 x 107 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 107 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 x 108 células/kg de peso corporal, al menos 1 x 108 células/kg de peso corporal, en al menos 2 x 108 células/kg de peso corporal, al menos 3 x 108 células/kg de peso corporal, al menos 4 x 108 células/kg de peso corporal, al menos 5 x 108 células/kg de peso corporal, o al menos 1 x 109 células/kg de peso corporal. En ejemplos particulares, de aproximadamente 1 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a aproximadamente 1 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, de aproximadamente 2 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a aproximadamente 0,9 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, de aproximadamente 3 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a aproximadamente 0,8 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, de aproximadamente 4 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a aproximadamente 0,7 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a aproximadamente 0,6 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal, o de aproximadamente 5 x 106 células T con CAR/kg de peso corporal a aproximadamente 0,5 x 108 células T con CAR/kg de peso corporal se administran a un sujeto.
Un experto en la técnica reconocerá que pueden requerirse múltiples administraciones de las composiciones de la descripción para efectuar la terapia deseada. Por ejemplo, una composición puede administrarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces durante un período de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 5 años, 10 años o más.
En determinados ejemplos, puede ser conveniente administrar las células T activadas a un sujeto y después volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar las células T a partir de ellas de acuerdo con la presente invención y reinfundir al paciente con estas células T activadas y expandidas. Este proceso puede llevarse a cabo varias veces cada pocas semanas. En determinados ejemplos, las células T pueden activarse a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En determinados ejemplos, las células T se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 100 cc, 150 cc, 200 cc, 250 cc, 300 cc, 350 cc o 400 cc o más. Sin estar limitados a la teoría, el uso de este protocolo de extracción de sangre múltiple/reinfusión múltiple puede servir para seleccionar determinadas poblaciones de células T.
La administración de las composiciones que se contemplan en la presente descripción puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, que incluye por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. En un ejemplo preferido, las composiciones se administran por vía parenteral. Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" tal como se usan en la presente descripción se refieren a los modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluyen, pero no se limitan a, inyección e infusión intravascular, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intratumoral, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal. En un ejemplo, las composiciones que se contemplan en la presente descripción se administran a un sujeto mediante la inyección directa en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.
En un ejemplo, a un sujeto que lo necesita se le administra una cantidad eficaz de una composición para aumentar la respuesta inmunitaria celular a un cáncer en el sujeto. La respuesta inmunitaria puede incluir las respuestas inmunitarias celulares mediadas por células T citotóxicas capaces de matar las células infectadas, las células T reguladoras y las respuestas de las células T colaboradoras. También pueden inducirse las respuestas inmunitarias humorales, mediadas principalmente por las células T colaboradoras capaces de activar las células B, lo que conduce a la producción de anticuerpos. Puede usarse una variedad de técnicas para analizar el tipo de respuestas inmunitarias inducidas por las composiciones de la presente descripción, que se describen bien en la técnica; por ejemplo, Current Protocols in Immunology, editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, Nueva York.
En el caso de la muerte mediada por células T, la unión ligando-CAR inicia la señalización de CAR a la célula T, lo que resulta en la activación de una variedad de vías de señalización de las células T que inducen a la célula T a producir o liberar las proteínas capaces de inducir apoptosis de las células objetivo por diversos mecanismos. Estos mecanismos mediados por células T incluyen (pero no se limitan a) la transferencia de los gránulos citotóxicos intracelulares de la célula T a la célula objetivo, la secreción de células T de citocinas proinflamatorias que pueden inducir la muerte de las células objetivo directamente (o indirectamente a través del reclutamiento de otras células efectoras asesinas), y una regulación positiva de los ligandos de receptores de la muerte (por ejemplo, FasL) en la superficie de las células T que inducen la apoptosis de las células objetivo después de la unión a su receptor de muerte correspondiente (por ejemplo, Fas) en la célula objetivo.
La presente descripción proporciona un método para tratar a un sujeto diagnosticado con un cáncer, que comprende retirar las células efectoras inmunitarias del sujeto, modificar genéticamente dichas células efectoras inmunitarias con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR o TCR modificado como se contempla en la presente descripción, para producir de este modo una población de células efectoras inmunitarias modificadas, y administrar la población de células efectoras inmunitarias modificadas al mismo sujeto. En un ejemplo preferido, las células efectoras inmunitarias comprenden las células T.
La presente descripción también proporciona los métodos para estimular una respuesta inmunomoduladora mediada por las células efectoras inmunitarias a una población de células objetivo en un sujeto, que comprende las etapas de administrar al sujeto una población de células efectoras inmunitarias que expresan un constructo de ácido nucleico que codifica una molécula de TCR o CAR modificado.
Los métodos para administrar las composiciones de células descritas en la presente descripción incluyen cualquier método que sea eficaz para dar como resultado la reintroducción de células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente ex vivo que expresen directamente un CAR o TCR modificado en el sujeto o la reintroducción de los progenitores modificados genéticamente de las células efectoras inmunitarias que al introducirse en un sujeto se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras que expresan el CAR o TCR modificado. Un método comprende transducir las células T de la sangre periférica ex vivo con un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la invención y devolver las células transducidas al sujeto.
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad para su comprensión, será evidente para un experto en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que pueden hacerse determinados cambios y modificaciones a la misma. Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían modificarse o cambiarse para producir resultados esencialmente similares.
Ejemplos
Ejemplo 1
Proliferación de células T cultivadas con un inhibidor de AKT
El propósito de este experimento fue determinar el efecto de los inhibidores de AKT sobre la proliferación de células T. El impacto de MK-2206 (Selleckchem) sobre la proliferación de células T se evaluó mediante la medición de la división de las células T.
Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) son una población celular heterogénea que contiene células T. Se recolectaron las PBMC de donantes normales y se marcaron con un colorante fluorescente (CellTrace® Violet, Molecular Probes), cuya intensidad se diluye progresivamente en un factor de dos con cada división celular. Las PBMC marcadas se usaron como fuente de células para la expansión de las células T. Las células T se activaron y se expandieron al cultivar las PBMC marcadas con anticuerpos CD3 y CD28 (Miltenyi Biotec) en un medio que contenía IL-2 (CellGenix).
El impacto de MK-2206 en la división celular se evaluó mediante la evaluación de la dilución de CellTrace Violet con citometría de flujo después de la adición de 0,025 jiM, 0,074 jiM, 0,222 jiM, 0,67 jiM o 2,0 jiM, MK-2206 a los cultivos T en el día 0. Se añadió el medio de cultivo fresco basado en XVIVO-15 que contenía IL-2 y MK-2206 a los cultivos de células T cada dos o tres días durante un total de siete días para permitir el crecimiento y la expansión de las células T. El tratamiento con MK-2206 no disminuyó sustancialmente la división de las células T tres días después del inicio del cultivo (Figura 1A). Además, las células T cultivadas en presencia de MK-2206 durante siete días no mostraron diferencias estadísticamente significativas en la división de las células T en comparación con el vehículo o los controles no tratados (Figura IB). Se realizó una prueba t por pares en todos los cultivos del día siete; (cada concentración de MK-2206 se comparó con MK-22060 j M: los cultivos no fueron estadísticamente diferentes al nivel de p<0,05).
Ejemplo 2
Expresión de CD62L en células T tratadas con MK-2206
El propósito de este experimento fue determinar el efecto de los inhibidores de Akt sobre los marcadores de células T para la potencia de las células T. El impacto de MK-2206 (Selleckchem) sobre la potencia de las células T se evaluó mediante la medición de la expresión de CD62L en los cultivos de células T producidos en el Ejemplo 1.
Los modelos de ratón han demostrado que la expresión de CD62L identifica las células T potentes; las células T con mayor eficacia antitumoral tras la transferencia adoptiva. Sin embargo, se ha demostrado que las células T cultivadas con IL-2 in vitro reducen la expresión de CD62L y, por lo tanto, se correlacionan con una potencia antitumoral reducida de las células T específicas de tumores. Sorprendentemente, el presente inventor ha descubierto que el inhibidor de AKT MK-2206 aumenta significativamente la expresión de CD62L a todas las concentraciones de MK-2206 evaluadas después de siete días de cultivo y en presencia de IL-2. Figura 2. Se realizó una prueba T por pares en todos los cultivos del día siete (cada concentración de MK-2206 se comparó con MK-22060 j M: *p<,05, **p<,01).
Ejemplo 3
Expresión de CD62L en células T con CAR tratadas con MK-2206 o ZSTK474
Se cultivaron las células T con CAR con MK-2206 o fosfato de triciribina - TCN (inhibidores de AKT) o ZSTK474 (inhibidor de PI3K). En este conjunto de experimentos se usaron las células T con CAR específicas para el antígeno de maduración de células B (BCMA). Los cultivos de células T con CAR se realizaron mediante el uso de un sistema directamente escalable a grandes procesos de producción clínicos. Brevemente, se cultivaron las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) en matraces estáticos en medios que contenían IL-2 (CellGenix) y anticuerpos específicos para CD3 y CD28 (Miltenyi Biotec). Se añadieron 2x108 unidades de transducción de lentivirus que codifica los CAR anti-BCMA un día después del inicio del cultivo. Las células T con CAR anti-BCMA se mantuvieron en fase logarítmica mediante la adición del medio fresco que contenía IL-2 y una dosis optimizada de un inhibidor durante un total de diez días de cultivo. Al final del cultivo, se interrogó el fenotipo de las células T con CAR anti-BCMA.
La expresión de CD62L en las células T con CAR anti-BCMA se evaluó mediante citometría de flujo al final del cultivo. Las células T con CAR anti-BCMA se identificaron específicamente mediante el uso de BCMA-IgG Fc recombinante humana conjugada con PE. La expresión de CD62L se determinó con una tinción conjunta mediante el uso de un anticuerpo específico para CD62L. Las células T con CAR anti-BCMA de tres donantes normales cultivadas con IL-2 y MK2206 tenían una expresión de CD62L significativamente mayor en comparación con los cultivos con IL-2 sola. La transducción lentiviral para expresar los CAR anti-BCMA no redujo el fenotipo mejorado provocado por MK2206. Se observó una mejora similar mediante el uso de ZST474 durante el cultivo, pero no con TCN. (Figura 3).
Ejemplo 4
Las células T con CAR tratadas con MK-2206 o ZSTK474 muestran una actividad terapéutica mejorada
Se probaron las células T con CAR anti-BCMA tratadas con MK-2206, TCN o ZSTK474 como se describe en el Ejemplo 3 para evaluar si el aumento de la expresión de CD62L estaba asociado con el aumento de la actividad antitumoral. Se generaron las células T que expresan los CAR anti-BCMA después del cultivo con IL-2 y MK2206, TCN o ZSTK474. También se cultivó una alícuota de las células T con CAR en un medio suplementado con IL-7 e IL-15 a dosis previamente demostradas para mejorar la eficacia terapéutica de las células T con CAR. Los animales con tumores de mieloma múltiples subcutáneos de 100 mm3 (RPMI-8226) se infundieron con dosis de las células T con CAR equivalentes (1x106 células CAR positivas).
Las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-2 fueron suficientes para provocar una regresión tumoral completa. Las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-7 e IL-15, MK-2206 o ZST747 mostraron niveles similares de actividad antitumoral en comparación con las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-2 estándar en este modelo animal de mieloma múltiple. Por el contrario, las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con TCN abolieron por completo cualquier respuesta antitumoral. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 4.
Ejemplo 5
Las células T con CAR tratadas con MK-2206 o ZSTK474 muestran una actividad terapéutica mejorada en un modelo de tumor agresivo
Se usó un modelo tumoral más agresivo y difícil de tratar para determinar la actividad antitumoral de las células T con CAR tratadas con IL-2, MK-2206, TCN, ZSTK474, IL7/15 o vehículo. Las células tumorales Daudi expresan un nivel bajo de proteína BCMA y pueden tratarse eficazmente mediante el uso de las células T con CAR anti-BCMA. La progresión del tumor Daudi no se vio afectada después del tratamiento con células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-2 o IL7/15. Sorprendentemente, las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con MK-2206 o ZST474 provocaron una regresión tumoral completa. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 5. Ejemplo 6
Las células T con CAR tratadas con MK-2206 o ZSTK474 muestran una persistencia mejorada
Los datos clínicos en los pacientes tratados con las células T con CAR sugieren que la persistencia se asocia con respuestas tumorales objetivas. La persistencia de las células T con CAR anti-BCMA se evaluó al volver a estimular los tumores en ratones que tenían regresión completa. Los animales tratados con las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con IL-2, MK-2206 o ZSTK474 que habían retrocedido completamente los tumores RPMI-8226 de 100 mm3 se volvieron a estimular 13 días después con RPMI-8226 en el flanco opuesto. Los animales tratados con células T con CAR cultivadas con IL-2 no pudieron prevenir el crecimiento tumoral. Por el contrario, ninguno de los animales tratados con las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con ZSTK474 tenía ninguna evidencia de injerto tumoral. Estos datos muestran que las células T con CAR anti-BCMA terapéuticamente activas persisten en las células T con CAR anti-BCMA cultivadas con ZSTK474. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 6.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro o ex vivo para la producción de células T que comprende:
(a) activar una población de células T y estimular la población de células T para que proliferen, en donde las etapas de activación y estimulación se realizan en presencia de un inhibidor de PI3K;
(b) transducir las células T con un vector viral que comprende un receptor de células T (TCR) modificado o un receptor de antígeno quimérico (CAR); y
(c) cultivar las células T transducidas para que proliferen;
en donde las etapas de activación y estimulación realizadas en presencia del inhibidor de PI3K dan como resultado el mantenimiento de la proliferación y la diferenciación decreciente de las células T transducidas en comparación con la proliferación y la diferenciación de las células T transducidas que se activaron y se estimularon en ausencia del inhibidor de PI3K.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde
(a) la fuente de las células T son las células mononucleares de la sangre periférica;
(b) la activación de las células T comprende poner en contacto las células T con un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a CD3 de este;
(c) la estimulación de las células T comprende poner en contacto las células T con un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a CD28 de este, B7-1 o un fragmento de unión a CD28 de este, o B7-2 o un fragmento de unión a CD28 de este;
(d) las células T se transducen con el vector viral antes de la proliferación de células T; o
(e) las células T se transducen con el vector viral después de la proliferación de células T.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde:
(a) el vector viral es un vector retroviral;
(b) el vector viral es un vector lentiviral; o
(c) las células T comprenden un CAR.
4. El método de acuerdo con 3, en donde el CAR comprende
(a) un dominio extracelular que se une a un antígeno que se selecciona del grupo que consiste en: BCMA, receptor alfa de folato, 5T4, integrina avp6, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, Cd 22, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD79a, CD79b, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EGP2, EGP40, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, AchR fetal, FRa, GD2, GD3, Gliplicano-3 (GPC3), HLA-A1+MAGE1, HLA-A2+MAGE1, HLA-A3+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, HLA-A2+NY-ESO-1, HLA-A3+NY-ESO-1, IL-11Ra, IL-13Ra2, Lambda, Lewis-Y, Kappa, Mesotelina, Mucl, Muc16, NCAM, ligandos de NKG2D, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, Survivina, TAG72, TEM y VEGFR2;
(b) un dominio transmembrana que se deriva de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: CD8a; CD4, CD28, CD45, PD-1 y CD152;
(c) uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelular que se seleccionan del grupo que consiste en: CD28, CD54 (ICAM), CD134 (OX40), CD137 (41BB), CD152 (CTLA4), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1) y CD278 (ICOS); y
(d) un dominio de señalización de CD3Z.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde:
(a) el dominio extracelular comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se une al antígeno;
(b) el dominio transmembrana se deriva de CD8a o CD28;
(c) uno o más dominios de señalización coestimuladora seleccionados del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137;
(d) el c A r comprende además un polipéptido de la región bisagra;
(e) el CAR comprende además un polipéptido de la región bisagra que comprende una región bisagra de IgG1 o CD8a;
(f) el CAR comprende además un péptido señal;
(g) el CAR comprende además un péptido señal que comprende un polipéptido señal de la cadena pesada de IgG1 o un polipéptido señal de CD8a.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en donde el inhibidor de PI3K es:
(a) un inhibidor de pan-PI3K que se selecciona del grupo que consiste en: BEZ235, LY294002 y GDC-0941; (b) un inhibidor selectivo de PI3K que se selecciona del grupo que consiste en: BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101 y IPI-145; o
(c) ZSTK474.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la población de células T activadas y estimuladas en presencia de un inhibidor de PI3K tiene un mayor número de células T que expresan uno o más marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en: CD62L, CCR7, CD28, CD27, c D122 y CD127 en comparación con una población de células T activadas y estimuladas en ausencia del inhibidor de PI3K.
8. El método de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 7, en donde la población de células T activadas y estimuladas en presencia de un inhibidor de PI3K no expresa CD57 o KLRG1 o expresa menos CD57 o KLRG1 en comparación con una población de células T activadas y estimuladas en ausencia del inhibidor de PI3K.
ES15802488T 2014-06-06 2015-06-05 Composiciones de células T mejoradas Active ES2846811T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462008957P 2014-06-06 2014-06-06
PCT/US2015/034515 WO2015188119A1 (en) 2014-06-06 2015-06-05 Improved t cell compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2846811T3 true ES2846811T3 (es) 2021-07-29

Family

ID=54767459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15802488T Active ES2846811T3 (es) 2014-06-06 2015-06-05 Composiciones de células T mejoradas

Country Status (25)

Country Link
US (3) US10479975B2 (es)
EP (2) EP3151672B1 (es)
JP (2) JP6663359B2 (es)
KR (2) KR102485855B1 (es)
CN (2) CN111394317A (es)
AU (3) AU2015269197B2 (es)
BR (1) BR112016028644B1 (es)
CA (1) CA2951044C (es)
CY (1) CY1123823T1 (es)
DK (1) DK3151672T3 (es)
ES (1) ES2846811T3 (es)
HR (1) HRP20210116T1 (es)
HU (1) HUE053101T2 (es)
IL (1) IL249313A0 (es)
LT (1) LT3151672T (es)
MX (2) MX2016016076A (es)
NZ (1) NZ726989A (es)
PL (1) PL3151672T3 (es)
PT (1) PT3151672T (es)
RS (1) RS61406B1 (es)
RU (1) RU2719030C2 (es)
SG (3) SG11201610170SA (es)
SI (1) SI3151672T1 (es)
WO (1) WO2015188119A1 (es)
ZA (2) ZA201608378B (es)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8193182B2 (en) 2008-01-04 2012-06-05 Intellikine, Inc. Substituted isoquinolin-1(2H)-ones, and methods of use thereof
NZ587051A (en) 2008-01-04 2012-12-21 Intellikine Llc Isoquinolinone derivatives, compositions and methods of inhibiting phosphatidyl inositol-3 kinase (pi3 kinase)
WO2011130249A2 (en) * 2010-04-13 2011-10-20 Immunovative Therapies, Ltd. Methods and compositions for inhibition of treg cells
CN103648499B (zh) 2011-01-10 2017-02-15 无限药品股份有限公司 用于制备异喹啉酮的方法及异喹啉酮的固体形式
US8828998B2 (en) 2012-06-25 2014-09-09 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of lupus, fibrotic conditions, and inflammatory myopathies and other disorders using PI3 kinase inhibitors
WO2015160975A2 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies
HUE048898T2 (hu) 2014-04-25 2020-09-28 Bluebird Bio Inc MND promoter kiméra antigén receptorok
KR102485855B1 (ko) 2014-06-06 2023-01-09 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 개선된 t 세포 조성물
JP2017528433A (ja) * 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
US20160051669A1 (en) * 2014-08-21 2016-02-25 Georgia Regents University Research Institute, Inc. Compositions and methods for selectively modulating tregs
DK3230321T3 (da) 2014-12-12 2019-10-28 Bluebird Bio Inc Kimære bcma-antigenreceptorer
US10576076B2 (en) 2015-05-20 2020-03-03 Novartis Ag Pharmaceutical combination of everolimus with dactolisib
WO2017070042A1 (en) * 2015-10-20 2017-04-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing t cell populations using akt inhibitors
EP3702447A1 (en) 2015-10-20 2020-09-02 Kite Pharma, Inc. Methods of preparing t cells for t cell therapy
AU2016349482A1 (en) * 2015-11-05 2018-05-24 City Of Hope Methods for preparing cells for adoptive T cell therapy
WO2017099712A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Bluebird Bio, Inc. Improved t cell compositions
CN108473959B (zh) 2016-01-20 2023-04-21 菲特治疗公司 用来在过继性免疫疗法中进行免疫细胞调节的组合物和方法
WO2017127755A1 (en) * 2016-01-20 2017-07-27 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
WO2017130223A2 (en) * 2016-01-29 2017-08-03 Virocan Therapeutics Pvt. Ltd. A chimeric antigen receptor specific to b-cell maturation antigen, a recombinant expression vector and a method thereof
US20170216355A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-03 Augusta University Research Institute, Inc. Methods and Compositions for Enhancing T Cell Function and Survival
WO2017133175A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered mammalian cells for cancer therapy
US20200063157A9 (en) * 2016-02-26 2020-02-27 Poseida Therapeutics, Inc. Transposon system and methods of use
BR112018067679A2 (pt) * 2016-03-04 2019-01-15 Novartis Ag células que expressam múltiplas moléculas do receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso
JP6980683B2 (ja) * 2016-03-17 2021-12-15 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 細胞分泌物の分析のための装置及び方法
WO2017176932A1 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Emory University Methods of treating cancer and infectious diseases using cell based therapies
HRP20230457T1 (hr) * 2016-04-15 2023-07-21 Novartis Ag Pripravci i postupci za selektivnu ekspresiju kimernih antigenskih receptora
CN105907790A (zh) * 2016-06-21 2016-08-31 林志国 特异性识别EGFRvⅢ的含CD70嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法
WO2017223422A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies
JP7109789B2 (ja) * 2016-08-02 2022-08-01 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を使用したｔｃｒの再プログラム化のための組成物及び方法
CA3034094A1 (en) 2016-08-16 2018-02-22 Bluebird Bio, Inc. Il-10 receptor alpha homing endonuclease variants, compositions, and methods of use
CN106222201B (zh) * 2016-08-27 2017-11-28 北京艺妙神州医疗科技有限公司 一种制备car‑t细胞的方法以及制得的car‑t细胞及其应用
CA3044355A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Novartis Ag Methods of enhancing immune response with everolimus, dactolisib or both
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
US11932870B2 (en) 2016-12-05 2024-03-19 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
WO2018106958A1 (en) * 2016-12-07 2018-06-14 Transtarget, Inc. Methods and compositions for vaccinating and boosting cancer patients
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
WO2018143454A1 (ja) * 2017-02-06 2018-08-09 国立研究開発法人国立がん研究センター 新規ｔ細胞受容体
CA3056439A1 (en) * 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Truncated nkg2d chimeric receptors and uses thereof in natural killer cell immunotherapy
WO2018177967A1 (en) * 2017-03-27 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved antigen binding receptor formats
CA3056591A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
US11596655B2 (en) * 2017-04-27 2023-03-07 Washington University Activation of natural cytotoxicity receptor 2 (NCR2)
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2019103857A1 (en) * 2017-11-22 2019-05-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
CN107236762A (zh) * 2017-06-19 2017-10-10 河北浓孚雨生物科技有限公司 一种微环dna转染t细胞制备临床级car‑t细胞制剂的方法
US20200179451A1 (en) * 2017-07-19 2020-06-11 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
CN109306013B (zh) * 2017-07-26 2020-09-25 重庆精准生物技术有限公司 抗cd20抗原的嵌合抗原受体及其应用
IL272909B2 (en) 2017-09-07 2024-01-01 Univ Res Inst Inc Augusta A specific AKT3 activator and its uses
EP3688143A4 (en) * 2017-09-26 2021-09-22 Longwood University PD1 SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AS IMMUNOTHERAPY
BR112020007576A2 (pt) 2017-10-18 2020-09-24 Novartis Ag composições e métodos para degradação de proteína seletiva
US20210030793A1 (en) * 2017-10-26 2021-02-04 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Methods and compositions for treating cd33+ cancers and improving in vivo persistence of chimeric antigen receptor t cells
US20210254000A1 (en) * 2017-11-01 2021-08-19 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing a t cell composition
CN107893055B (zh) * 2017-11-03 2020-07-17 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途
AU2018369883A1 (en) 2017-11-15 2020-05-28 Novartis Ag BCMA-targeting chimeric antigen receptor, CD19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
EP3717907A1 (en) 2017-11-30 2020-10-07 Novartis AG Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
JP2021505207A (ja) * 2017-12-05 2021-02-18 セリアド エス．アー．Ｃｅｌｙａｄ Ｓ．Ａ． Ｎｋｇ２ｄベースの受容体を発現する免疫細胞のフラトリサイドの減少
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
US10561686B2 (en) * 2018-01-12 2020-02-18 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
CA3090249A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
KR20200130709A (ko) 2018-03-06 2020-11-19 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 전립선-특이 막 항원 car 및 이의 사용 방법
CN110272481A (zh) * 2018-03-14 2019-09-24 中国科学院广州生物医药与健康研究院 识别mage1抗原短肽的t细胞受体
US11246890B2 (en) 2018-04-03 2022-02-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systemic targeting of inflammatory sites and enhanced immunomodulatory function by introducing the chimeric antigen receptor (CAR) into mesenchymal stem cells for inflammatory and autoimmune diseases
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
US20220226374A1 (en) * 2018-06-14 2022-07-21 2seventy bio, Inc Cd79b chimeric antigen receptors
AU2019291627A1 (en) * 2018-06-19 2020-10-08 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered cells and uses thereof
US20220348682A1 (en) 2018-08-30 2022-11-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
US20210171909A1 (en) 2018-08-31 2021-06-10 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
CA3109959A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
KR20210056377A (ko) * 2018-09-07 2021-05-18 소티오, 엘엘씨 세포내 락테이트 농도를 조절하는 트랜스 대사 분자와 조합된 키메라 수용체 폴리펩타이드 및 이의 치료 용도
WO2020102701A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Rapa Therapeutics, Llc Methods for the manufacture of th1/tc1 phenotype t cells
US10918667B2 (en) 2018-11-20 2021-02-16 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof
US20220016167A1 (en) * 2018-11-30 2022-01-20 The Medical College Of Wisconsin, Inc. T-Rapa Cells as Novel Effector Cell Type for Chimeric Antigen Receptor Therapy
CN109694884A (zh) * 2019-01-09 2019-04-30 上海美丽人生医疗科技有限公司 用于在结肠癌治疗中应用的car-t载体的制备及其构建方法
AU2020229806A1 (en) 2019-02-25 2021-07-29 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
WO2020191316A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
WO2020206061A1 (en) * 2019-04-05 2020-10-08 Bluebird Bio, Inc. Manufacturing anti-bcma car t cells
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20220251152A1 (en) 2019-04-24 2022-08-11 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
US11850266B2 (en) * 2019-06-06 2023-12-26 President And Fellows Of Harvard College Cardiomyocytes and compositions and methods for producing the same
CN110229236B (zh) * 2019-06-13 2023-06-09 郑州大学第一附属医院 诱导肿瘤细胞上调抗原muc1表达用car及其应用
CN114761037A (zh) 2019-11-26 2022-07-15 诺华股份有限公司 结合bcma和cd19的嵌合抗原受体及其用途
KR102539610B1 (ko) * 2020-01-22 2023-06-02 한국생명공학연구원 메모리 b 세포 특이적 분화 유도 방법 및 이의 활용
CA3173394A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2021173995A2 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
KR102387595B1 (ko) * 2020-03-23 2022-04-15 연세대학교 산학협력단 면역 세포의 면역 기능 향상을 위한 방법 및 이에 따른 면역 세포주
GB202005617D0 (en) * 2020-04-17 2020-06-03 Adaptimmune Ltd Improved t cell manufacturing process
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
US20230190804A1 (en) * 2020-06-17 2023-06-22 Tiziana Life Sciences Plc Compositions and methods for augmenting chimeric antigen receptor (car) t cell therapies
CN116348477A (zh) 2020-07-20 2023-06-27 英安塔制药有限公司 作为抗病毒剂的功能化肽
EP4199960A2 (en) 2020-08-21 2023-06-28 Novartis AG Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
CN114426952A (zh) * 2020-10-29 2022-05-03 中国科学技术大学 用于白血病的car t细胞疗法的t细胞增效剂及获得增效t细胞的方法
US11352363B1 (en) 2020-11-23 2022-06-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11976084B2 (en) 2020-11-23 2024-05-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11384090B2 (en) 2020-11-23 2022-07-12 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
WO2022229853A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
CA3217738A1 (en) 2021-05-05 2022-05-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding prame
US11319325B1 (en) 2021-05-11 2022-05-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11339170B1 (en) 2021-07-23 2022-05-24 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11325916B1 (en) 2021-07-29 2022-05-10 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
TW202323521A (zh) 2021-08-20 2023-06-16 瑞士商諾華公司 製備表現嵌合抗原受體的細胞之方法
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
DE3843571A1 (de) 1988-01-09 1989-07-20 Asta Pharma Ag 1,2-bis(aminomethyl)cyclobutan-platin-komplexe
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7479269B2 (en) 1988-11-23 2009-01-20 Genetics Institute, Llc Methods for selectively enriching TH1 and TH2 cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
DK1087013T3 (da) 1992-08-21 2009-05-11 Univ Bruxelles Immunoglobuliner uden lette kæder
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
DE4415263C1 (de) 1994-04-15 1995-11-30 Asta Medica Ag Cis-[trans-1,2-Cyclobutanbis(methylamin)-N,N']-[(2S)-lactato-O·1·, O·2·]-platin(II)-trihydrat (Lobaplatin-Trihydrat), seine Herstellung und arzneiliche Verwendung
US6632789B1 (en) * 1994-04-29 2003-10-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for modulating T cell responses by manipulating intracellular signal transduction
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
AU726198B2 (en) 1996-03-04 2000-11-02 Targeted Genetics Corporation Modified rapid expansion methods ("modified-REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US20020177125A1 (en) 1997-03-04 2002-11-28 Kamb Carl Alexander Human rhinovirus assays, and compositions therefrom
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
FR2777909B1 (fr) 1998-04-24 2002-08-02 Pasteur Institut Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex
JP2004500095A (ja) 2000-02-24 2004-01-08 エクサイト　セラピーズ，　インコーポレイテッド 細胞の同時の刺激および濃縮
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
EP2301971A1 (en) 2001-02-20 2011-03-30 ZymoGenetics, L.L.C. Antibodies that bind both BCMA and TACI
EP1385946B1 (en) 2001-05-01 2009-12-23 National Research Council Of Canada A system for inducible expression in eukaryotic cells
DE10132502A1 (de) 2001-07-05 2003-01-23 Gsf Forschungszentrum Umwelt Angriff auf Tumorzellen mit fehlender, niedriger oder anormaler MHC-Expression durch kombinieren von nicht MHC-Restringierten T-Zellen/NK-Zellen und MHC-Restringierten Zellen
WO2003057171A2 (en) 2002-01-03 2003-07-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform
US20050032725A1 (en) * 2002-10-09 2005-02-10 Toerrx, Inc. Molecules preferentially associated with effector T cells or regulatory T cells and methods of their use
GB0224442D0 (en) 2002-10-21 2002-11-27 Molmed Spa A delivery system
JP2006524991A (ja) 2003-05-08 2006-11-09 エクサイト セラピーズ インコーポレーティッド 抗原特異的ｔ細胞の作製および単離の方法
EP3363907A1 (en) 2004-05-27 2018-08-22 The Trustees of the University of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
FR2872170B1 (fr) 2004-06-25 2006-11-10 Centre Nat Rech Scient Cnrse Lentivirus non interactif et non replicatif, preparation et utilisations
WO2006039500A2 (en) 2004-09-29 2006-04-13 California Institute Of Technology Multi-element phased array transmitter with lo phase shifting and integrated power amplifier
GB0503936D0 (en) * 2005-02-25 2005-04-06 San Raffaele Centro Fond Method
US20080274091A1 (en) 2005-05-20 2008-11-06 Virxsys Corporation Autologous T Cell Manufacturing Processes
WO2007018318A1 (ja) 2005-08-10 2007-02-15 National University Corporation Kanazawa University 小脳星状細胞及び／又は籠細胞特異的な遺伝子発現方法
WO2008071974A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Medical Research Council Use of pi3k m-tor and akt inhibitors to induce f0xp3 expression and generate regulatory t cells
AU2008262487B2 (en) 2007-05-23 2013-10-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increased transgene expression
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
PL3006459T3 (pl) 2008-08-26 2022-01-17 City Of Hope Sposób i kompozycje dla wzmocnionego działania efektorowego komórek t przeciw guzowi nowotworowemu
ES2536465T3 (es) 2008-10-01 2015-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Composición de péptidos tumor-asociados y relacionados con la vacuna contra el cáncer para el tratamiento de glioblastoma (GBM) y otros cánceres
JP6061469B2 (ja) 2009-03-10 2017-01-25 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 抗ｂｃｍａ抗体
US8465743B2 (en) 2009-10-01 2013-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
PL2496698T3 (pl) 2009-11-03 2019-07-31 City Of Hope Skrócony receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFRt) do selekcji transdukowanych komórek T
US8999398B2 (en) 2009-11-06 2015-04-07 Transtarget Inc. Polyclonal bispecific antibody compositions and method of use
GB201004200D0 (en) 2010-03-15 2010-04-28 Univ Basel Spirocyclic compounds and their use as therapeutic agents and diagnostic probes
EP3467101A3 (en) 2010-09-08 2019-06-19 Baylor College of Medicine Immunotherapy of brain tumor using geneticially engineered gd2-specific t cells
CN106220739A (zh) * 2010-12-09 2016-12-14 宾夕法尼亚大学董事会 嵌合抗原受体‑修饰的t细胞治疗癌症的用途
BR112013018311A2 (pt) * 2011-01-18 2017-03-21 Univ Pennsylvania sequência de ácido nucleico isolada, receptor de antígeno quimérico isolado, célula t geneticamente modificada, vetor, e, uso de uma célula t geneticamente modificada.
US20160002601A1 (en) 2011-03-03 2016-01-07 Stempeutics Research Pvt. Ltd. Methods of upscaling mesenchymal stromal cell production, compositions and kit thereof
KR101976882B1 (ko) 2011-03-23 2019-05-09 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 세포 면역요법용 방법 및 조성물
CN103502439B (zh) 2011-04-13 2016-10-12 因缪尼卡姆股份公司 用于抗原特异性t细胞增殖的方法
RS64791B1 (sr) 2011-05-27 2023-11-30 Glaxo Group Ltd Bcma (cd269/tnfrsf17) - vezujući proteini
CA2838749A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Bluebird Bio, Inc. Gene therapy vectors for adrenoleukodystrophy and adrenomyeloneuropathy
JP5802510B2 (ja) * 2011-09-30 2015-10-28 富士フイルム株式会社 パターン形成方法、感電子線性又は感極紫外線性樹脂組成物、及び、レジスト膜、並びに、これらを用いた電子デバイスの製造方法
US20140322216A1 (en) 2011-11-08 2014-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
JP2015513399A (ja) * 2012-02-22 2015-05-14 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 癌の治療のために有用なｔ細胞の存続的集団を作製するための組成物および方法
US9765342B2 (en) * 2012-04-11 2017-09-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting B-cell maturation antigen
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
AU2013204923A1 (en) 2012-06-21 2014-01-16 Anthrogenesis Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
BR112015000505A2 (pt) 2012-07-13 2017-06-27 Univ Pennsylvania método de analisar uma célula t geneticamente modificada para detectar um contaminante
IL293944A (en) 2012-08-20 2022-08-01 Hutchinson Fred Cancer Res Method and preparations for cellular immunotherapy
CN104769103B (zh) 2012-09-04 2018-06-08 塞勒克提斯公司 多链嵌合抗原受体和其用途
EP2711418B1 (en) 2012-09-25 2017-08-23 Miltenyi Biotec GmbH Method for polyclonal stimulation of T cells by flexible nanomatrices
WO2014055442A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
KR102198058B1 (ko) * 2012-10-02 2021-01-06 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 면역치료용 조성물 및 방법
US9598489B2 (en) 2012-10-05 2017-03-21 The Trustees Of The Univeristy Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
ES2824024T3 (es) 2012-10-10 2021-05-11 Sangamo Therapeutics Inc Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
WO2014099671A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
UY35340A (es) 2013-02-20 2014-09-30 Novartis Ag Marcaje efectivo de leucemia humana usando células diseñadas con un receptor quimérico de antígeno anti-cd123
US9745368B2 (en) 2013-03-15 2017-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
EP4215603A1 (en) * 2014-02-04 2023-07-26 Kite Pharma, Inc. Methods for producing autologous t cells useful to treat b cell malignancies and other cancers and compositions thereof
EP3104866A4 (en) 2014-02-14 2017-08-02 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for activating t cells using an inducible chimeric polypeptide
CA2945620C (en) 2014-04-14 2022-12-06 Cellectis Bcma (cd269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
HUE049514T2 (hu) 2014-04-25 2020-09-28 Bluebird Bio Inc Javított eljárások adoptív sejtterápiák kialakítására
EP3134434A4 (en) 2014-04-25 2017-10-25 Bluebird Bio, Inc. Kappa/lambda chimeric antigen receptors
HUE048898T2 (hu) 2014-04-25 2020-09-28 Bluebird Bio Inc MND promoter kiméra antigén receptorok
KR102485855B1 (ko) 2014-06-06 2023-01-09 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 개선된 t 세포 조성물
US10174095B2 (en) 2014-07-21 2019-01-08 Novartis Ag Nucleic acid encoding a humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor
AU2015292590B2 (en) 2014-07-24 2020-01-16 2Seventy Bio, Inc. BCMA chimeric antigen receptors
DK3230321T3 (da) 2014-12-12 2019-10-28 Bluebird Bio Inc Kimære bcma-antigenreceptorer
US10881711B2 (en) 2015-04-06 2021-01-05 The General Hospital Corporation Anti-CSPG4 reagents and methods of treating cancer
WO2017099712A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Bluebird Bio, Inc. Improved t cell compositions

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201901336B (en) 2022-01-26
AU2018274888C1 (en) 2021-11-25
HUE053101T2 (hu) 2021-06-28
US20170218337A1 (en) 2017-08-03
SI3151672T1 (sl) 2021-03-31
SG10201810723VA (en) 2018-12-28
CN111394317A (zh) 2020-07-10
CN106793780B (zh) 2020-05-26
US10479975B2 (en) 2019-11-19
RU2020111566A (ru) 2020-05-19
RU2719030C2 (ru) 2020-04-16
US20200109365A1 (en) 2020-04-09
AU2015269197A1 (en) 2016-12-22
JP6663359B2 (ja) 2020-03-11
KR20230008915A (ko) 2023-01-16
EP3151672A1 (en) 2017-04-12
CN106793780A (zh) 2017-05-31
WO2015188119A1 (en) 2015-12-10
RS61406B1 (sr) 2021-03-31
RU2017100003A3 (es) 2018-11-14
KR102485855B1 (ko) 2023-01-09
HRP20210116T1 (hr) 2021-03-05
JP6869390B2 (ja) 2021-05-12
KR20170007527A (ko) 2017-01-18
CY1123823T1 (el) 2022-05-27
SG11201610170SA (en) 2017-01-27
BR112016028644A2 (pt) 2017-08-22
NZ726989A (en) 2020-08-28
PL3151672T3 (pl) 2021-05-31
MX2021002877A (es) 2021-06-04
DK3151672T3 (da) 2021-02-01
CA2951044C (en) 2023-10-03
AU2015269197B2 (en) 2018-10-04
EP3151672B1 (en) 2020-11-04
ZA201608378B (en) 2019-06-26
AU2018274888B2 (en) 2019-12-05
MX2016016076A (es) 2017-08-02
EP3828265A1 (en) 2021-06-02
IL249313A0 (en) 2017-02-28
CA2951044A1 (en) 2015-12-10
RU2017100003A (ru) 2018-07-16
JP2017518052A (ja) 2017-07-06
SG10202108458XA (en) 2021-09-29
EP3151672A4 (en) 2018-01-17
US11560547B2 (en) 2023-01-24
LT3151672T (lt) 2021-02-10
JP2020072756A (ja) 2020-05-14
AU2020201489A1 (en) 2020-03-19
BR112016028644B1 (pt) 2019-12-03
US20230193202A1 (en) 2023-06-22
PT3151672T (pt) 2021-02-02
AU2020201489B2 (en) 2021-10-21
AU2018274888A1 (en) 2018-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11560547B2 (en) Methods of making T cell compositions
ES2750725T3 (es) Receptores de antígeno quiméricos BCMA
RU2708311C2 (ru) Химерные антигенные рецепторы с mnd-промотором
ES2800906T3 (es) Métodos mejorados para producir terapias celulares adoptivas
US11479755B2 (en) T cell compositions
ES2911015T3 (es) Receptores quiméricos de antígeno anti-sialil Tn
WO2017156479A1 (en) Ror1 chimeric antigen receptors
RU2813668C2 (ru) Способ производства t-клеток
WO2022221737A1 (en) T cell therapy in patients who have had prior stem cell transplant