CN107893055B - 一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途，其中，所述特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞细胞包括NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。其制备方法是将含有NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因的慢病毒和含有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因的慢病毒同时感染自然杀伤细胞。本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞通过所含的NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因共同作用，提高了该自然杀伤细胞的靶向肿瘤细胞特异杀伤性，增加了该自然杀伤细胞激活下游信号的能力，避免了肿瘤免疫的逃逸，从而增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

Description

一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备 方法和用途
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途。
背景技术
自然杀伤细胞(NK细胞)是人体先天免疫的核心组成部分，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞具有较强的非特异性直接杀伤靶细胞的能力，并且这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。NK细胞通过多种细胞表面受体(例如NKG2D，CD16)以及天然细胞毒性受体(NKp44，NKp46，NKp30)识别被感染的和恶性癌变的细胞。这些受体激活含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)结构的调控蛋白DAP10、DAP12，ITAM能启动细胞毒性颗粒蛋白的释放，并调控IFN-γ和TNF-α等细胞因子和趋化因子的分泌。脾酪氨酸激酶(Syk)是调控蛋白DAP12关键的下游蛋白酪氨酸激酶，当胞外受体与其配体相互作用时，ITAM被酪氨酸激酶磷酸化，招募Syk，进一步磷酸化下游蛋白传递活化信号，从而激活NK细胞发挥作用。
近年来，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞技术在治疗血液***肿瘤的临床应用中取得了显著的突破，在临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性。但是，最新的临床实验中发现CAR-T技术具有引起细胞因子风暴及***性神经毒性等高风险因素。另外，由于肿瘤微环境的免疫抑制及免疫逃逸作用，CAR-T细胞在实体瘤治疗方面尚未获得明确疗效。NK细胞由于其特点：发挥杀伤作用不需要预先致敏，也不受主要组织相容性复合物的限制，可以使用异体来源的NK细胞而不会在受试者(患者)体内引起排异反应；不会产生细胞因子风暴(比如，不会发生白细胞介素-6的大量释放)。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。
癌-睾丸抗原(CT)被认为最具有前景的肿瘤相关抗原之一，其特点是在多种组织来源的肿瘤细胞中表达，但在正常组织中的表达仅限于睾丸和胚胎组织。由于生殖细胞不表达HLA分子，以及血睾屏障的存在，因此针对CT抗原的肿瘤免疫治疗一般不会对正常组织细胞产生免疫毒性。NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)是CT抗原基因家族中的重要一员，由于其在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，并在多种肿瘤组织(恶性黑素瘤、肝细胞癌、卵巢癌等)中表达而在肿瘤治疗领域备受关注。
尽管如今出现了一些含有与NY-ESO-1特异结合的特异受体的转基因NK细胞，但大部分用于NK细胞中表达的CAR都是仅有T细胞CD3ζ结构域的一代CAR载体，与NK自身兼容性不高，同时增大转染后NK细胞的负荷，使得转染效率偏低；另外，由于肿瘤逃逸机制的存在，使得该转基因NK细胞激活下游信号不足，降低了当前转基因NK细胞的杀伤效果。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，旨在解决现有的转基因自然杀伤细胞由于肿瘤逃逸机制的存在，而导致该转基因自然杀伤细胞激活下游信号不足的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，包括NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。
优选地，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因设于NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段中。
优选地，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因序列参见表1。
优选地，所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列参见表2。
本发明还提出一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
将第一慢病毒和第二慢病毒同时感染NK细胞，其中，所述第一慢病毒含有NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因，所述第二慢病毒含有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。
优选地，所述第一慢病毒按照如下方法获取：
将NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段与入门载体混合，以使所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段嵌入所述入门载体，而获得带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体；
将所述带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以建立癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒；
将所述癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒与病毒包装质粒共转染293FT细胞，获得第一慢病毒。
优选地，所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的获取方法包括以下步骤：
获取NY-ESO-1抗原免疫总cDNA；
将所述NY-ESO-1抗原免疫总cDNA与NY-ESO-1抗体重链可变区VH引物及轻链可变区VL引物进行PCR，获得NY-ESO-1VH和NY-ESO-1VL基因片段；
将所述NY-ESO-1VH和NY-ESO-1VL基因片段采用连接肽连接，获得NY-ESO-1抗体scFv基因片段；
将是NY-ESO-1抗体scFv基因片段与pcDNA载体连接，获得pcDNA-NY-ESO-1/scFv质粒；
将按照CD8α、41BB及DAP12-ITAM序列基因序列设计合成嵌合抗原受体的CD8-41BB-DAP12表达框，用Hind III/XhoI酶切后克隆进pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv质粒，获得pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12质粒，EcoR I/Xho I酶切后获得NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段。
优选地，所述第二慢病毒按照如下方法获取：
获取截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列；
将截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列与入门载体混合，以使所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列嵌入所述入门载体，而获得带有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列的入门载体；
将所述带有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以得到慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk；
将所述慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk与病毒包装质粒共转染293FT细胞，获得第二慢病毒。
优选地，所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列参见表2。
本发明还提出一种肿瘤药物制剂，该肿瘤药物制剂包括本发明的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞或者由本发明的制备方法制备的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞。
本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞含有NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。其中，本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞由于含有所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因，因而具有较强的靶向肿瘤细胞特异性杀伤性，同时由于它能够过表达截短型脾酪氨酸激酶Syk基因，因而可以增加本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞激活下游信号的能力，避免肿瘤的免疫逃逸。因此，本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞具有较强的靶向肿瘤细胞特异杀伤性，能够有效避免肿瘤免疫的逃逸，增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明实施例人工构建的NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因结构示意图；
图2为本发明实施例人工构建的pLenti7.3-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12质粒示意图；
图3为本发明实施例入门克隆pENTR-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12质粒酶切产物的电泳图；
图4为本发明实施例重组慢病毒表达质粒电泳条带图；
图5为本发明实施例入门克隆pENTR-Syk质粒酶切产物的电泳结果图；
图6为本发明实施例重组慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk转化菌落PCR产物的电泳结果图；
图7为本发明实施例NK细胞体外杀伤肝癌HepG-2细胞的流式检测图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞。
在本发明实施例中，该特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞是指靶向NY-ESO-1且含有NK细胞调控蛋白DAP12免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的嵌合抗原受体基因修饰的NK细胞。在此，该特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞表示为NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12。具体而言，该特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞包括NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞由于含有靶向NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因，因而该特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞具有较高的靶向肿瘤细胞特异杀伤性，并且，所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因能够增加自然杀伤细胞激活下游信号的能力，从而可以有效避免肿瘤免疫的逃逸，增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。
在一实施例中，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因设于NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段中。具体地，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因是由含有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的病毒感染NK至细胞中，下文对所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的获取方法进行了详细介绍。
其中，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因序列如下表1所示：
表1
Figure BDA0001456255180000061
Figure BDA0001456255180000071
所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列如下表2所示：
表2
Figure BDA0001456255180000072
Figure BDA0001456255180000081
所述截短型脾酪氨酸激酶Syk氨基酸序列如下表3所示：
表3
Figure BDA0001456255180000082
本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞含有NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。其中，本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞由于含有所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因，因而具有较强的靶向肿瘤细胞特异性杀伤性，同时由于它能够过表达截短型脾酪氨酸激酶Syk基因，因而可以增加本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞激活下游信号的能力，避免肿瘤的免疫逃逸。因此，本发明特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞具有较强的靶向肿瘤细胞特异杀伤性，能够有效避免肿瘤免疫的逃逸，增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。
本发明还提出一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，用于制备上述特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞。其中，该制备方法包括以下步骤：
将第一慢病毒和第二慢病毒同时感染NK细胞，其中，所述第一慢病毒含有NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因，第二慢病毒含有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。
在一实施例中，所述第一慢病毒按照如下方法获取：
S11：将NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段与入门载体混合，以使所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段嵌入所述入门载体，而获得带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体。
S12：将所述带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以建立癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒。
S13：将所述癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒与病毒包装质粒、共转染293T细胞，获得第一慢病毒。
在步骤S11中，所述入门载体可以是pENTR 11，但不仅限于此。具体而言，在步骤S11中，所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的获取方法包括以下步骤：
S111：获取NY-ESO-1抗原免疫总cDNA；
S112：将所述NY-ESO-1抗原免疫总cDNA与NY-ESO-1抗体重链可变区VH引物及轻链可变区VL引物进行PCR，获得NY-ESO-1VH和NY-ESO-1VL基因片段；
S113：将所述NY-ESO-1VH和NY-ESO-1VL基因片段采用连接肽连接，获得NY-ESO-1抗体scFv基因片段；
S114：将是NY-ESO-1抗体scFv基因片段与pcDNA载体连接，获得pcDNA-NY-ESO-1/scFv质粒；
S115：将按照CD8α、41BB及DAP12-ITAM序列基因序列设计合成嵌合抗原受体的CD8-41BB-DAP12表达框，用Hind III/XhoI酶切后克隆进pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv质粒，获得pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12质粒，EcoR I/Xho I酶切后获得NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段。
其中，在步骤S112中，所述NY-ESO-1抗体重链可变区VH引物及所述轻链可变区VL引物可根据重链可变区VH和轻链可变区VL序列按照引物设计原则进行设计。具体地，所述重链可变区VH的引物为VH-F和VH-R，所述轻链可变区VL的引物为VL-F和VL-R，碱基序列如下：
VH-F：5'-GAA GTT CAA TTG TTA GAG TCT GGT GGC GGT-3'
VH-R：5'-GCT TGA GAC GGT GAC CGT GGA CCC TTG GCC-3'
VL-F：5'-CAG AGC GAA TTG ACT CAG CCT CGC TCA GTG-3'
VL-R：5'-GAG GAC GGT GAC GTC GGT CCC TGT CCC GAA-3'
步骤S113中的连接肽可以选用连接肽(Gly4Ser)3，其碱基序列如下：
5'-GGT GGT GGT GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGA TCT-3'。
步骤S114中的pcDNA载体可以是pcDNA载体系列中常用的载体，例如pcDNA3.1(+)。
步骤S115中的CD8α、41BB及DAP12-ITAM基因序列可以直接从基因库(Genebank(NCBI))中获取。根据CD8α、41BB及DAP12-ITAM基因序列设计合成嵌合抗原受体的Hinge-TM-41BB-DAP12表达框，包括较链区(Hinge)和跨膜区(TM)CD8α(aa135-205)、41BB胞内功能区(aa214-255)及DAP12-ITAM。因此，Hinge-TM-41BB-DAP12表达框也即是CD8-41BB-DAP12表达框。其中，DAP12-ITAM的氨基酸序列：RLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK。另外，合成Hinge-TM-41BB-DAP12表达框可以是按照常规的合成方式合成，如由南京金斯瑞生物科技有限公司合成该Hinge-TM-41BB-DAP12表达框。在一实施例中，Hinge的5’端和DAP12的3’端，可以分别添加限制性酶切位点Hind III和XhoI，因此，酶切获得NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的过程中，可以直接用Eco R I/Xho I酶进行酶切。
在步骤S12中，慢病毒质粒可以是常用的慢病毒载体，例如，pLenti7.3/V5-DEST。
在步骤S13中，病毒包装质粒可以是常用的病毒包装质粒，如选用ViraPowerTM包装质粒。
在一实施例中，所述第二慢病毒按照如下方法获取：
S21：获取截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列；
S22：将截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列与入门载体混合，以使所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列嵌入所述入门载体，而获得带有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列的入门载体。
S23：将所述带有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以得到慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk。
S24：将所述慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk与病毒包装质粒共转染293FT细胞，获得第二慢病毒。
在步骤S21中，所述入门载体可以是pENTR 11，但不仅限于此。在一实施例，截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列的两端可以分别添加限制性酶切位点EcoR I/Hind III，直接克隆进入pENTR 11载体。
在步骤S21中，通过NCBI查找SYK蛋白的功能结构域，选择SYK蛋白的N端SH2结构域、C端SH2结构域及蛋白酪氨酸激酶结构域，将相对应的基因序列连接起来，从而得到所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列。
在步骤S22中，慢病毒质粒可以是常用的慢病毒载体，例如，pLenti7.3/V5-DEST。
在步骤S23中，病毒包装质粒可以是常用的病毒包装质粒，如选用ViraP owerTM包装质粒。
另外，上述特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞制备方法中的第一慢病毒和第二慢病毒同时感染NK细胞，可以按照正常的慢病毒感染方法进行感染，在此不再赘述。
本发明提供的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方
法，通过将含有靶向癌-睾丸抗原NY-ESO-1抗原特异性嵌合抗原受体基因的第一慢病毒，以及含有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因的第二慢病毒同时感染自然杀伤细胞，使得感染得到的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞具有较强的靶向肿瘤细胞特异杀伤性，同时增加了该特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞激活下游信号的能力，避免肿瘤的免疫逃逸，增强了该特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明。
试验步骤：
1、表达NY-ESO-1抗原特异性scFv-CD8-41BB-DAP12嵌合受体的慢病毒
1.1获取NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA
利用NY-ESO-1抗原对BALB/C小鼠进行免疫，效价符合要求(1:100000以上)时，处死小鼠，取脾脏，用Trizol法提取小鼠脾脏总RNA。
采用iScript cDNA Synthesis Kit合成总cDNA，反应体系如下表4所示：
表4
试剂 体积
5×iScript reaction mix 4μl
iScript reverse transcriptase 1μl
Nuclease-free water 5μl
总RNA 10μl
总体积 20μl
反应条件：25℃5min→42℃30min→85℃5min→4℃hold。
1.2 NY-ESO-1抗体重链可变区VH及轻链可变区VL基因的获取NY-ESO-1抗体重链可变区VH及轻链可变区VL引物序列如下表5所示：
表5
Figure BDA0001456255180000121
Figure BDA0001456255180000131
PCR反应体系如下表6所示：
表6
试剂 体积
Taq DNA聚合酶 0.25μl
10×PCR Buffer 5μl
dNTPs(2.5mM) 4μl
NY-ESO-1抗原免疫小鼠总cDNA 1μl
VH-F(20μM) 1μl
VH-R(20μM) 1μl
ddH2O 补充至50μl
反应条件如下：94℃预变性5min，94℃45s，60℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min。
1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收NY-ESO-1抗体重链可变区VH及轻链可变区VL基因PCR产物。
1.3 NY-ESO-1抗体scFv片段及质粒的获取
通过多基因片段重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE-PCR)将1.2中得到的NY-ESO-1VH和NY-ESO-1VL片段用连接肽(Gly4Ser)3(碱基序列：5'-GGT GGT GGT GGT TCTGGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGA TCT-3')连接起来，得到NY-ESO-1抗体scFv片段，并在前后端分别引入酶切位点EcoR I/Hind III。OE-PCR反应条件如下：(1)步骤1：95℃预变性1min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，共7个循环，72℃延伸10min；(2)步骤2：95℃预变性5min，94℃45s，62℃1min，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min。
1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收NY-ESO-1抗体sc Fv片段，EcoR I/Hind III双酶切回收的片段和pcDNA3.1(+)载体，利用T4DNA连接酶将NY-ESO-1抗体scFv片段与pcDNA3.1(+)载体连接，获得pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv质粒。
1.4 NY-ESO-1抗原特异性scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的构建
按照Genebank(NCBI)中CD8α、41BB及DAP12-ITAM序列基因序列设计合成嵌合抗原受体的Hinge-TM-41BB-DAP12表达框，包括较链区(Hinge)和跨膜区(TM)CD8α(aa135-205)、41BB胞内功能区(aa214-255)及DAP12-ITAM(氨基酸序列如下表7所示)，在Hinge的5’端和DAP12的3’端分别添加限制性酶切位点Hind III和XhoI，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成整个表达框。
表7
Figure BDA0001456255180000141
将合成的CD8-41BB-DAP12表达框用Hind III/XhoI酶切后克隆进pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv质粒，获得pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12质粒，然后EcoRI/Xho I酶切后获得NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段，基因结构图如图1所示。
1.5 NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12入门克隆的构建
1.51 NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12入门克隆pENTR11连接反应体系如下表8：
表8
NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段 0.5μl
盐溶液 1μl
ddH2O 3.5μl
pENTR11 vector 1μl
总体积 6μl
TOPO克隆反应条件：将上述反应体系轻轻摇匀后，在室温(21-23℃)下孵育5min。孵育结束后将反应体系置于冰上以进一步转化感受态细胞，进行扩大培养并提取pENTR-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12质粒。
1.52入门克隆pENTR-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12的酶切鉴定
1.521酶切体系(EcoR I/Xho I双酶切体系)如下表9所示：
表9
Figure BDA0001456255180000151
1.522酶切条件：37℃水浴锅中酶解2h。
1.523取2μl酶解产物，用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。分析电泳条带以判断入门克隆是否正确。若入门克隆pENTR-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12正确，EcoR I/Xho I双酶切得到两条分别为1.3kb和2.3kb的片段。
1.6 pLenti7.3-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12慢病毒表达质粒的构建
1.61 LR反应
LR反应是入门克隆pENTR-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12和目的载体pLenti7.3/V5-DEST vector发生的重组反应，重组之后得到慢病毒表达质粒pLenti7.3-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12(如图2所述)。LR反应体系如下表10所示：
表10
Figure BDA0001456255180000152
Figure BDA0001456255180000161
冰上解冻
Figure BDA0001456255180000162
LR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix，吸取2μl加至上述LR反应体系中，轻柔混匀后，25℃放置1h。
加入1μl蛋白酶K至上述反应体系，37℃孵育10min。
1.62 LR反应产物的转化
1.621在冰上将一管E.coli感受态细胞(Invitrogen,Cat.No.C7373-03)解冻
1.622加入2-3μl LR反应产物至感受态细胞悬液中，轻柔混匀(切勿用移液枪吹打)。冰上孵育30min，42℃水浴中热击处理30s，将反应管转移至冰上继续孵育2min。
1.623加入225μl室温下预温的S.O.C.培养基。
1.624将反应管盖紧后置于37℃水平摇床中225rpm转速下孵育1h。
1.625取出100μl转化产物均匀涂布到预热的LB平板(含氨苄青霉素)上，37℃培养箱中孵育过夜。
1.63阳性克隆的筛选与扩增
1.631用枪头分别少量蘸取3个克隆后，将枪头置于10μl无菌水中，反复吹打。
1.632吸取1μl菌液用于PCR，反应体系和条件如下表11所示：
表11
Figure BDA0001456255180000163
Figure BDA0001456255180000171
PCR反应条件如下：
Figure BDA0001456255180000172
1.633三个克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在1.3kb处得到清晰的单一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养。
1.634用质粒DNA纯化试剂盒(Promega，Cat.No.A7500)从上述过夜培养的菌液中分离纯化质粒DNA即为慢病毒表达质粒pLenti7.3-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12，同时保存菌种。
1.7 pLenti7.3-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12慢病毒的制备
1.71 Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10ml 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
1.72 Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的
Figure BDA0001456255180000173
I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)。
1.73
Figure BDA0001456255180000174
2000复合物的制备：
1.731将1.5ml无血清的
Figure BDA0001456255180000175
I培养液加入5ml离心管中，加入9μgViraPowerTM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒pLenti7.3-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12，轻柔混合。
1.732将1.5ml无血清的
Figure BDA0001456255180000176
I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl
Figure BDA0001456255180000177
2000，轻柔混合后在室温下孵育5min。
1.733将1.731和1.732两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀。
1.734室温下孵育20min，得到
Figure BDA0001456255180000181
2000复合物。
1.74将得到的
Figure BDA0001456255180000182
2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
1.75 Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10ml DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培养箱中孵育48-72h。
1.76 Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g离心15min。
1.77吸取上清液，收集pLenti7.3-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12慢病毒，分装入1ml冻存管中，置于-80℃长期保存。
2、表达截短型Syk的慢病毒
2.1获取截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成截短型Syk基因序列，其中，截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列如表2所示。
2.2截短型Syk入门克隆的构建
2.21在截短型截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列两端分别添加EcoRI/Hind III酶切位点，直接克隆进入pENTR 11载体。
2.22入门克隆pENTR-Syk的酶切鉴定
2.221酶切体系(EcoR I/Hind III双酶切体系)如下表12所示：
表12
Figure BDA0001456255180000183
Figure BDA0001456255180000191
2.222酶切条件：37℃水浴锅中酶解2h。
2.223取2μl酶解产物，用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。分析电泳条带以判断入门克隆是否正确。若入门克隆pENTR-Syk正确，EcoR I/Hind III双酶切得到两条分别为1.4kb和2.3kb的片段。
2.3 pLenti7.3-Syk慢病毒表达质粒的构建
2.31 LR反应
LR反应是入门克隆pENTR-Syk和目的载体pLenti7.3/V5-DEST vector发生的重组反应，重组之后得到慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk。LR反应体系如下表13所示：
表13
pENTR-Syk(150ng/反应) 1-7μl
pLenti7.3/V5-DEST vector(150ng/μl) 1μl
TE Buffer，pH 8.0 加至总体积8μl
冰上解冻
Figure BDA0001456255180000192
LR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix，吸取2μl加至上述LR反应体系中，轻柔混匀后，25℃放置1h。
加入1μl蛋白酶K至上述反应体系，37℃孵育10min。
2.32 LR反应产物的转化
2.321在冰上将一管E.coli感受态细胞(Invitrogen,Cat.No.C7373-03)解冻。
2.322加入2-3μl LR反应产物至感受态细胞悬液中，轻柔混匀(切勿用移液枪吹打)。冰上孵育30min，42℃水浴中热击处理30s，将反应管转移至冰上继续孵育2min。
2.323加入225μl室温下预温的S.O.C.培养基。
2.324将反应管盖紧后置于37℃水平摇床中225rpm转速下孵育1h。
2.325取出100μl转化产物均匀涂布到预热的LB平板(含氨苄青霉素)上，37℃培养箱中孵育过夜。
2.33阳性克隆的筛选与扩增
2.331用枪头分别少量蘸取3个克隆后，将枪头置于10μl无菌水中，反复吹打。
2.332吸取1μl菌液用于PCR，反应体系和条件如下表表14所示：
表14
菌液 1μl
VH-F引物(20μM) 1μl
V5反向引物(20μM) 1μl
Bio-rad super mix 6.25μl
ddH2O 15.75μl
总体积 25μl
PCR反应条件如下：
Figure BDA0001456255180000201
2.333三个克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳反应，若在1.4kb处得到清晰的单一条带，则将鉴定出的阳性克隆挑到含氨苄青霉素的LB培养液中进行扩大培养。
2.334用质粒DNA纯化试剂盒(Promega，Cat.No.A7500)从上述过夜培养的菌液中分离纯化质粒DNA即为慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk，同时保存菌种。
2.4 pLenti7.3-Syk慢病毒的制备(表达一个DNA分子上的基因标记的细胞经常也表达另一个DNA分子携带的基因标记，这种物理上不相连的基因被整合到同一整合序列并在同一转染细胞内表达的现象叫做共转染)
2.41 Day1：取5×106个293FT细胞(Invitrogen,Cat.No.R700-07)，离心后弃上清，用10ml 37℃预热的完全培养基(D-MEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺+0.1mM非必须氨基酸+1mM丙酮酸钠+1％P/S)重悬，接种于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
2.42 Day2：弃去培养皿中的培养液，加入5ml含10％FBS的
Figure BDA0001456255180000211
I培养液(Invitrogen,Cat.No.31985-062)。
2.43
Figure BDA0001456255180000212
2000复合物的制备：
2.431将1.5ml无血清的
Figure BDA0001456255180000213
I培养液加入5ml离心管中，加入9μgViraPowerTM包装质粒混合物和3μg慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk，轻柔混合。
2.432将1.5ml无血清的
Figure BDA0001456255180000214
I培养液加入另一个5ml离心管中，加入36μl
Figure BDA0001456255180000215
2000，轻柔混合后在室温下孵育5min。
2.433将上述2.431和2.432两步得到的溶液转移到一个离心管中，轻柔混合均匀。
2.434室温下孵育20min，得到
Figure BDA0001456255180000216
2000复合物。
2.44将得到的
Figure BDA0001456255180000217
2000复合物逐滴缓慢加入到培养皿中，并轻轻地来回晃动培养皿。37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
2.45 Day3：取出培养皿，弃去培养液，加入10ml DMEM完全培养基。37℃，5％CO2培养箱中孵育48-72h。
2.46 Day5或Day6：将培养皿中的培养液转移到15ml离心管中，在4℃条件下2000g离心15min。
2.47吸取上清液，收集pLenti7.3-Syk慢病毒，分装入1ml冻存管中，置于-80℃长期保存。
3、共表达Syk的NY-ESO-1特异性CAR-NK细胞的制备及扩增
3.1分离基因分型HLA-A2+健康志愿者PBMC细胞
3.11抽取HLA-A2+的健康志愿者外周血25ml，肝素抗凝，室温离心(700g，20min)；吸取上层血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后4℃静置15min后，离心(900g，30min)，取自体血浆4℃保存备用。
3.12取上述700g，20min离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，缓慢加到装有20ml人淋巴细胞分离液的50ml离心管中，室温离心(800g，15min)。
3.13吸取白膜层细胞，加入到装有5ml RPMI 1640的50ml离心管中。
3.14 RPMI 1640洗涤两次(600g，10min离心)，收集细胞即为PBMC细胞。
3.2 CAR-NK细胞的制备
3.21用含50ng/ml CD16单抗、1000U/ml IL-2、100ng/ml IL-15和0.5％自体血浆的Alys505培养液调整PBMC细胞密度为1×106/ml，转入六孔板中，2ml/孔，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养。
3.22每3天调整细胞密度为1×106/ml，添加含1000U/ml IL-2和0.5％自体血浆的Alys505培养液。
3.23 Day7，将NK细胞分成4组，每组细胞均按1×105/孔的密度转移至24孔板中，100μl/孔，每组设三个复孔。
第1组：只转染NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因，命名为NY-ESO-1-CAR组。
第2组：只转染Syk基因，命名为Syk组。
第3组：转染NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因和Syk，命名为NY-ESO-1-CAR-Syk组。
第4组：空白对照组，命名为NC组。
3.24根据上述分组，按照MOI值＝20(此处MOI表示病毒数与细胞数量的比值)加入含有慢病毒颗粒的原液，进行分组转染，各组取慢病毒溶液加Alys505完全培养基共配制成100μl，用移液管将慢病毒溶液加至细胞中，轻轻吹打混匀。NC组加入100μl Alys-505完全培养基。
3.25每组分别加入终浓度为6μg/ml的Polybrene，来回轻轻晃动混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。
3.26第8天，各组细胞分别取出离心，弃掉含慢病毒的上清液，分别用200μl Alys-505培养液重悬，加入24孔板中。根据细胞生长状态进行补液。
3.27 Day10，收获成熟的各组细胞用于后续分析。
4、共表达Syk的NY-ESO-1特异性CAR-NK细胞体外抗肿瘤活性检测
4.1以上述各组细胞作为效应细胞，CFSE标记的肝癌HepG-2细胞作为靶细胞，按照20:1的效靶比混合效应细胞和靶细胞，轻轻混匀，置于5％CO2，37℃培养箱中孵育。
4.2 24h后，加入1μg/ml PI染液，混匀，室温避光孵育15min后，利用流式细胞仪检测CFSE+PI+细胞(死亡的HepG-2细胞)的百分率。
5、共表达Syk的NY-ESO-1特异性CAR-NK细胞动物体内抗肿瘤活性检测
取对数生长期的人肝癌HepG-2细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，将含1×107个癌细胞的悬液0.1ml于裸鼠肩胛部皮下注射。实验分组及治疗情况见下表，每日观察各组动物的饮食、活动等方面的变化，隔日测量裸鼠体重，观察体重变化情况；隔2天测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b)，观察肿瘤生长的情况，按照公式计算：瘤体积＝1/12π×a×b2。第(3)组治疗结束后第13天计算各组裸鼠的抑瘤率，抑瘤率＝(1-治疗组肿瘤平均体积/阴性对照组肿瘤平均体积)×100％。实验分组及治疗情况如下表15所示：
表15
Figure BDA0001456255180000241
其中，*FAC化疗方案：氟尿嘧啶500mg/M2；阿霉素50mg/M2；环磷酰胺500mg/M2，第一天给药，21天一个疗程。
6、实验结果
6.1构建的CAR结构图及表达质粒图谱
6.2入门克隆pENTR-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12的酶切鉴定
入门克隆pENTR-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12质粒经过EcoR I/Xho I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，分别在2.3kb和1.3kb处有清晰条带(图3)，与预期结果一致。证明NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因正确***到pENTR载体中。
6.3重组慢病毒表达质粒pLenti7.3/NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12转化菌落PCR结果
随机挑取LB平板上的三个克隆，用设计的正向引物和V5反向引物进行PCR扩增，产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，在1.3kb处出现清晰的条带(图4)，说明NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因成功***到pLenti7.3/V5-DEST表达载体中。
6.4入门克隆pENTR-Syk的酶切鉴定
入门克隆pENTR-Syk质粒经过EcoR I/Hind III双酶切后得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，分别在大约2.3kb和1.4kb处有清晰条带(图5)，与预期片结果一致。证明Syk正确***到载体中。
6.5重组慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk转化菌落PCR产物的电泳结果
随机挑取LB平板上的三个克隆，用设计的正向引物和V5反向引物进行PCR扩增，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，在1.4kb处出现清晰的条带(图6)，说明Syk成功***到pLenti7.3/V5-DEST表达载体中。
6.6NK细胞体外杀伤肝癌HepG-2细胞的流式检测结果
以各组细胞作为效应细胞，用CFSE标记肝癌HepG-2细胞，作为靶细胞，应用流式细胞术检测NK细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤效率，实验结果如图7所示，NY-ESO-1-CAR组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为41.93％，Syk组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为18.35％，NY-ESO-1-CAR-Syk组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为67.56％，NC组细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤率约为14.87％，显示共表达Syk的NY-ESO-1特异性CAR-NK细胞对肝癌HepG-2细胞的杀伤效率远远高于其余各组细胞的杀伤效率。说明本专利制备的共表达Syk的NY-ESO-1特异性CAR-NK细胞对肝癌细胞具有高效的杀伤作用。
6.7共表达Syk的NY-ESO-1特异性CAR-NK细胞体内抑制肝癌细胞的实验结果
共表达Syk的NY-ESO-1特异性CAR-NK细胞进行体内抗肿瘤实验发现，各组裸鼠均存活，以阴性对照组裸鼠为参照，化疗组裸鼠体重下降，肿瘤体积减小，但进食及活动减少。共表达Syk的NY-ESO-1特异性CAR-NK细胞治疗组裸鼠存活状况较为良好，体重无明显下降，且肿瘤体积明显较小，抑瘤率达到82.8％。体重情况和肿瘤抑制率统计结果见表16。实验结果说明本专利制备的共表达Syk的NY-ESO-1特异性CAR-NK细胞能够有效抑制体内肿瘤的生长。
表16各组裸鼠体重、肿瘤体积及抑瘤率的比较
Figure BDA0001456255180000251
Figure BDA0001456255180000261
本发明实还提供了一种肿瘤药物制剂。所述肿瘤药物制剂包括NK细胞。其中，所述NK细胞为上述特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞或由上述制备方法制备的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞。由于该肿瘤药物制剂采用了上述所有实施例的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
另外，在本发明肿瘤药物制剂中所含的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的含量或者给药剂量应该是有效剂量的，具体地，该有效剂量是指治疗有效量，是指足以对个体显示益处或临床意义的本发明的化合物的量。本领域技术人员将会理解，给药的实际量或剂量以及给药时程将取决于被治疗的疾病的性质和严重性、被治疗的受试者的年龄和一般状况以及给药方式等。
可以理解地是，在上述药用制剂中还可以包含药学上可接受的载体。在具体实施例中，该药学上可接受的载体是指本领域技术人员已知的适合于特定的给药模式的任何辅料。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司
<120> 一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途
<130> 2017.10.30
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccggaattcc ggatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 60
gcattcctcc tgatcccaga agttcaattg ttagagtctg gtggcggtct tgttcagcct 120
ggtggttctt tacgtctttc ttgcgctgct tccggattca ctttctctac ttaccagatg 180
tcttgggttc gccaagctcc tggtaaaggt ttggagtggg tttctggtat cgtttcttct 240
ggtggctcta ctgcttatgc tgactccgtt aaaggtcgct tcactatctc tagagacaac 300
tctaagaata ctctctactt gcagatgaac agcttaaggg ctgaggacac tgcagtctac 360
tattgtgcgg gggagctact tccctactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 420
gtcaccgtct caagcggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatct 480
cagagcgaat tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 540
tcctgcactg ggaccagccg tgatgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 600
cacccaggca aagcccccaa actcataatt catgatgtca tagagcggtc gtcaggggtc 660
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 720
caggctgagg atgaggctga ttattattgc tggtcatttg caggctccta ttatgtcttc 780
gggacaggga ccgacgtcac cgtcctcccc aagcttgggg cgaagcccac cacgacgcca 840
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 900
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 960
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 1020
atcacccttt acaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1080
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1140
gaaggaggat gtgaactgcg gctggtccct cgggggcgag gggctgcgga ggcagcgacc 1200
cggaaacagc gtatcactga gaccgagtcg ccttatcagg agctccaggg tcagaggtcg 1260
gatgtctaca gcgacctcaa cacacagagg ccgtattaca aaccgctcga gcgg 1314
<210> 2
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgcccttct ttttcggcaa catcacccgg gaggaggcag aagattacct ggtccagggg 60
ggcatgagtg atgggcttta tttgctgcgc cagagccgca actacctggg tggcttcgcc 120
ctgtccgtgg cccacgggag gaaggcacac cactacacca tcgagcggga gctgaatggc 180
acctacgcca tcgccggtgg caggacccat gccagccccg ccgacctctg ccactaccac 240
tcccaggagt ctgatggcct ggtctgcctc ctcaagaagc ccttcaaccg gccccaaggg 300
gtgcagccca aggaaaaaat gccttggttc catggaaaaa tctctcggga agaatctgag 360
caaattgtcc tgataggatc aaagacaaat ggaaagttcc tgatccgagc cagagacaac 420
aacggctcct acgccctgtg cctgctgcac gaagggaagg tgctgcacta tcgcatcgac 480
aaagacaaga cagggaagct ctccatcccc gagggaaaga agttcgacac gctctggcag 540
ctagtcgagc attattctta taaagcagat ggtttgttaa gagttcttac tgtcccatgt 600
caaaaaatca aagaactggg ctctggtaat tttggaactg tgaaaaaggg ctactaccaa 660
atgaaaaaag ttgtgaaaac cgtggctgtg aaaatactga aaaacgaggc caatgacccc 720
gctcttaaag atgagttatt agcagaagca aatgtcatgc agcagctgga caacccgtac 780
atcgtgcgga tgatcgggat atgcgaggcc gagtcctgga tgctggttat ggagatggca 840
gaacttggtc ccctcaataa gtatttgcag cagaacagac atgtcaagga taagaacatc 900
atagaactgg ttcatcaggt ttccatgggc atgaagtact tggaggagag caattttgtg 960
cacagagatc tggctgcaag aaatgtgttg ctagttaccc aacattacgc caagatcagt 1020
gatttcggac tttccaaagc actgcgtgct gatgaaaact actacaaggc ccagacccat 1080
ggaaagtggc ctgtcaagtg gtacgctccg gaatgcatca actactacaa gttctccagc 1140
aaaagcgatg tctggagctt tggagtgttg atgtgggaag cattctccta tgggcagaag 1200
ccatatcgag ggatgaaagg aagtgaagtc accgctatgt tagagaaagg agagcggatg 1260
gggtgccctg cagggtgtcc aagagagatg tacgatctca tgaatctgtg ctggacatac 1320
gatgtggaaa acaggcccgg attcgcagca gtggaactgc ggctgcgcaa ttactactat 1380
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcttgagacg gtgaccgtgg acccttggcc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagagcgaat tgactcagcc tcgctcagtg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaggacggtg acgtcggtcc ctgtcccgaa 30
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> (Gly4Ser)3
<400> 7
ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggtggtggtg gatct 45

Claims (6)

1.一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，包括NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因，其中，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因序列参见表1，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因设于该自然杀伤细胞中的NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段；所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列参见表2。
2.一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
将第一慢病毒和第二慢病毒同时感染NK细胞，获得如权利要求1所述的自然杀伤细胞；其中，所述第一慢病毒含有NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因，所述第二慢病毒含有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一慢病毒按照如下方法获取：
将NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段与入门载体混合，以使所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段嵌入所述入门载体，而获得带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体；
将所述带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以建立癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒；
将所述癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒与病毒包装质粒共转染293FT细胞，获得第一慢病毒。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的获取方法包括以下步骤：
获取NY-ESO-1抗原免疫总cDNA ；
将所述NY-ESO-1抗原免疫总cDNA 与NY-ESO-1抗体重链可变区VH引物及轻链可变区VL引物进行PCR，获得NY-ESO-1VH和NY-ESO-1VL基因片段；
将所述NY-ESO-1VH和NY-ESO-1VL基因片段采用连接肽连接，获得NY-ESO-1抗体scFv基因片段；
将是NY-ESO-1抗体scFv基因片段与pcDNA载体连接，获得pcDNA-NY-ESO-1/scFv质粒；
将按照CD8α、41BB及 DAP12-ITAM序列基因序列设计合成嵌合抗原受体的CD8-41BB-DAP12表达框，用Hind III/XhoI酶切后克隆进pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv质粒，获得pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12质粒，EcoR I/Xho I酶切后获得NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段。
5.如权利要求2至4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述第二慢病毒按照如下方法获取：
获取截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列；
将截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列与入门载体混合，以使所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列嵌入所述入门载体，而获得带有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列的入门载体；
将所述带有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以得到慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk；
将所述慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk与病毒包装质粒共转染293FT细胞，获得第二慢病毒。
6.一种肿瘤药物制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞或者由如权利要求2至5任一项所述的制备方法制备的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞。
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