CN110229236B - 诱导肿瘤细胞上调抗原muc1表达用car及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR及其应用专利申请事宜。该嵌合抗原受体为一若干蛋白片段连接的氨基酸序列，具体为：依次连接的人CD8a分子信号肽、人源化MUC1单链抗体、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区；优选设计中，人CD3z分子胞内区进一步通过连接序列与IL22 CDS区序列进行连接，以进一步通过IL‑22这一细胞因子来促进MUC1的表达。本申请通过对于CAR的进一步结构优化，对于有效诱导肿瘤细胞表面抗原MUC1表达、减少脱靶效应的发生，以及提高CAR‑T细胞的应用效果都表现出良好的技术效果。

Description

诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达用CAR及其应用
技术领域
本申请属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR（Chimeric Antigen Receptor，嵌合抗原受体）及其应用专利申请事宜。
背景技术
CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体T细胞）作为肿瘤免疫治疗的一种有效治疗方式，已在2017年8月30日被美国食品和药物管理局(FDA)批准上市用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)，其以CD19为靶点可以有效的清除CD19+肿瘤细胞，在临床前和临床实验中表现出了令人鼓舞的结果，并且已经证明他们在具有难治性和复发性的b-前体急性淋巴细胞性白血病儿童和青少年中进行的有效抗白血病效应是安全可行的，所有的毒性可逆并且没有发生持续的B细胞发育不全。但是其在实体瘤中的应用目前尚不尽人意，还有许多问题需要解决，主要原因是在于实体瘤中没有类似于CD19的有效的肿瘤特异性抗原以及肿瘤微环境的抑制作用。
慢病毒属于逆转录病毒科的一种RNA病毒，其中最为人所知的是人类免疫缺陷病毒(HIV-1)。HIV-1直径约120nm，含两条正链 RNA，可有效的进入细胞核中，对***期细胞及非***期细胞均具有很高的感染效率。慢病毒感染细胞后可将所携带的基因整合到细胞基因组中，并且长时间持续稳定表达，同时能够随细胞***稳定遗传下去，因此成为导入外源基因的有效工具。慢病毒载体是一种以 HIV-1为基础改造而成的基因治疗载体，通过去除致病基因，同时减少辅助质粒与载体质粒的同源性，使改造后的慢病毒具有了滴度更高、生物安全性更好、导入外源片段的能力更强等特性。目前慢病毒***已经广泛应用到基因过表达、RNA 干扰、miRNA 研究及基因敲除等功能研究的细胞和动物实验中。
MUC1（Mucin1，黏蛋白1）是一种大分子跨膜糖蛋白，广泛且高表达于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、***癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌等恶性肿瘤细胞中，且相对于正常细胞，肿瘤细胞表面的MUC1具有不同的糖基化结构。理论而言，基于MUC1的表达特点，可以较好用于肿瘤细胞和非肿瘤细胞的区分，而过表达和糖基化异常也使得MUC1可成为各种免疫治疗尤其是CAR-T治疗的理想靶点，但实际应用中，受限于MUC1表达量等原因，目前尚未见到较好的应用效果。
发明内容
本申请目的在于提供一种能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR，从而为相关CAR-T在实体瘤的治疗中奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR，该嵌合抗原受体为一若干蛋白片段连接的氨基酸序列，以MUC1-41BB-CD3z命名，具体为：依次连接的人CD8a分子信号肽（CMV）、人源化MUC1单链抗体（scFV.MUC1）、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB）、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），即：CMV—scFV.MUC1—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）；
优选设计中，人CD3z分子胞内区（CD3Zeta）进一步通过连接序列（具体例如采用TA2连接序列（T2A））与IL22 CDS区序列（IL22）进行连接，以进一步通过IL-22这一细胞因子来促进MUC1的表达，即总体结构为：CMV—scFV.MUC1—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）—T2A—IL22，该优选设计以MUC1-41BB-CD3z-IL22命名；
所述人CD8a分子信号肽（CMV），包括21个氨基酸，序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
MALPVTALLLPLALLLHAARP；
所述人源化MUC1单链抗体（scFV.MUC1），包括244个氨基酸，序列如SEQ ID No.2所示，具体为：
EVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSE；
所述人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB），包括人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区两个部分，其中：
人CD8分子跨膜区，包括71个氨基酸，序列如SEQ ID No.3所示，具体为：
LETTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；
41BB分子胞内区，包括42个氨基酸，序列如SEQ ID No.4所示，具体为：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
所述人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），包括112个氨基酸，序列如SEQ ID No.5所示，具体为：
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
所述TA2连接序列（T2A），包括18个氨基酸，序列如SEQ ID No.6所示，具体为：
EGRGSLLTCGDVEENPGP；
所述IL22 CDS区序列（IL22），包括179个氨基酸，序列如SEQ ID No.7所示，具体为：
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI；
因此，优选的MUC1-41BB-CD3z-IL22氨基酸序列，包括730个氨基酸，序列如SEQ IDNo.8所示，具体为：
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEMALPVTALLLPLALLLHAARPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI。
利用所述能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR所构建的慢病毒表达质粒，具体包括如下步骤：
（1）按照中心法则，采用现有技术获得所述CAR的编码序列DNA；
（2）以Lenti-2G质粒为表达载体，对其进行BsrGI、Not I双酶切，然后利用T4 DNA连接酶将步骤（1）中的编码序列DNA整合重组进入Lenti-2G质粒中；
（3）将步骤（2）中的连接产物转化STABL3感受态细胞，筛选、扩大培养后进一步提取质粒，即可获得可表达MUC1-41BB-CD3z或MUC1-41BB-CD3z-IL22的重组后慢病毒表达质粒（分别命名为：Lenti-2G-MUC1-41BB-CD3z、Lenti-2G-MUC1-41BB-CD3z-IL22）。
所述慢病毒表达质粒在制备抗肿瘤药剂中的应用，所述肿瘤具体例如为HNSCC癌（头颈部鳞状细胞癌，主要指鼻腔、鼻窦、口腔、扁桃体、咽部和喉部等组织部位的细胞癌变）相关肿瘤，进一步例如为人舌鳞癌细胞系CAL33、人口咽鳞癌细胞系HN4等相关的肿瘤；应用时，通过转染制备成CAR-T细胞进行应用，用于提高肿瘤细胞的MUC1表达量；
具体应用步骤包括如下步骤：
（1）慢病毒包装；具体可参考如下操作：
以293T细胞作为待转染目的细胞，首先进行铺板孵育24h；
然后将所构建获得的慢病毒表达质粒与包装质粒混合，利用脂质体转染试剂对待转染的目的细胞293T细胞进行转染48h；
转染结束后，收集上清，备用，以准备用于T细胞的感染；
（2）制备纯化的T细胞
首先，从人外周血分离获得单个核细胞（具体例如采用密度梯度离心方法）；
然后，分离获得纯化的CD3+T细胞（具体例如采用T细胞分离磁珠进行分离纯化），
最后，加入适量CD3/CD28磁珠活化2天备用；
（3）T细胞感染
在步骤（2）中活化2天后的细胞中，加入步骤（1）中所收集的病毒上清与polybrene（聚凝胺，又名为溴化己二甲铵），孵育过夜以进行感染；
（4）扩增T细胞并检测
对步骤（3）中孵育感染后T细胞，离心清洗（一般不少于3次）后，加入含1000U IL-2与5％胎牛血清的RPMI1640培养基，以进一步扩增T细胞；
对扩增后T细胞可利用流式细胞技术以对T细胞表面CAR的表达情况、或者细胞增殖进行检测判定，根据检测结果进一步回输后即可用于刺激提高肿瘤细胞的MUC1表达情况。
IL-22是一种主要由Th22细胞分泌的细胞因子，属于IL-10超家族，现有研究认为IL-22可以增强机体固有免疫，保护机体细胞免受损伤并促进组织细胞的再生修复，并且参与多种疾病和验证的调控；并且有研究报道认为IL-22可促进肿瘤细胞表面抗原MUC1表达上调。而本申请以肿瘤抗原MUC1作为靶点，通过对CAR结构优化，尤其是通过串联IL22分子，进一步有效增强了肿瘤抗原MUC1在肿瘤细胞表面的表达情况，对于改善CAR-T细胞对于肿瘤细胞的识别、提高靶向肿瘤细胞的能力，进而提高CAR-T细胞对MUC1阳性的肿瘤细胞的杀伤效果奠定了良好的技术基础。
总体上，鉴于现有CAR-T细胞在实体瘤治疗中的脱靶问题及肿瘤的免疫逃逸问题，本申请通过对于CAR的进一步结构优化，对于有效诱导肿瘤细胞表面抗原MUC1表达、减少脱靶效应的发生，以及提高CAR-T细胞的应用效果都表现出良好的技术效果，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。
附图说明
图1为MUC1-41BB-CD3z（上图）、MUC1-41BB-CD3z-T2A-IL22（下图）的CAR结构示意图；
图2为Lenti-2G-MUC1-41BB-CD3z-T2A-IL22结构示意图；
图3为流式细胞术检测CAR-T转染效率图；
图4为转染后细胞增殖培养情况统计结果；
图5~图7为CAR-T细胞对不同肿瘤细胞的杀伤效率结果图；其中图5为针对OME细胞，图6为针对Cal33细胞，图7为针对HN4细胞；
图8为不同效靶比（E/T）情况下不同肿瘤细胞效果汇总；
图9为流式细胞术检测IL-22可以诱导肿瘤细胞MUC1上调；
图10为IL 22分泌表达情况；
图11为活体成像技术监测肿瘤生长及荧光情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验材料、实验仪器等情况简要介绍说明如下。
实验材料：
非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（nod/scid）小鼠，6-8周的雌性小鼠，购自北京维通利华有限公司（中国北京），无菌环境培养；
人舌鳞癌细胞系（CAL33）、人口咽鳞癌细胞系（HN4），购自上海交通大学医学院上海市第九人民医院；
相关细胞系在Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM-F12)中培养，该培养基中含有10%胎牛血清（FBS，HyClone，Chicago, IL, USA）和100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）；
实验开始前，用含荧光素酶-GFP的病毒上清液转染肿瘤细胞，用FACS AriaTM细胞分选仪(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)对GFP通道进行分选，最终获得稳定表达荧光素酶-绿色荧光蛋白(GFP)的细胞株HN4（DMED-F12培养基培养）；
永生化细胞系OME是hTERT过表达的口腔粘膜上皮细胞系，该细胞系为MUC1阴性，DMED-F12培养基中培养。
实施例1
在现有CAR研究基础上，为提高CAR-T细胞治疗效果，减少目前CAR-T细胞治疗的脱靶效应，发明人对于CAR结构进行了进一步地优化改造，为确定优化改造后CAR技术效果，发明人制备了两种CAR，具体结构示意图如图1所示。
具体而言：
MUC1-41BB-CD3z为：依次连接的人CD8a分子信号肽（CMV）、人源化MUC1单链抗体（scFV.MUC1）、人CD8a分子柔性片段（CD8aTM）、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB）、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），即：CMV—scFV.MUC1—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）；
MUC1-41BB-CD3z-IL22为：依次连接的人CD8a分子信号肽（CMV）、人源化MUC1单链抗体（scFV.MUC1）、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB）、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta）、TA2连接序列（T2A）、IL22 CDS区序列（IL22）；即：CMV—scFV.MUC1—41BB—CD3Zeta（CD3ζ）—T2A—IL22。
所述人CD8a分子信号肽（CMV），包括21个氨基酸，序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
MALPVTALLLPLALLLHAARP。
所述人源化MUC1单链抗体（scFV.MUC1），包括244个氨基酸，序列如SEQ ID No.2所示，具体为：
EVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSE。
所述人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区（41BB），包括人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区两个部分，其中：
人CD8分子跨膜区，包括71个氨基酸，序列如SEQ ID No.3所示，具体为：
LETTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
41BB分子胞内区，包括42个氨基酸，序列如SEQ ID No.4所示，具体为：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
所述人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），包括112个氨基酸，序列如SEQ ID No.5所示，具体为：
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
所述TA2连接序列（T2A），包括18个氨基酸，序列如SEQ ID No.6所示，具体为：
EGRGSLLTCGDVEENPGP。
所述IL22 CDS区序列（IL22），包括179个氨基酸，序列如SEQ ID No.7所示，具体为：
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI。
MUC1-41BB-CD3z氨基酸序列，包括490个氨基酸，具体序列为：
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSELETTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
MUC1-41BB-CD3z-IL22氨基酸序列，包括730个氨基酸，序列如SEQ ID No.8所示，具体为：
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEMALPVTALLLPLALLLHAARPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI。
实施例2
在实施例1基础上，发明人进一步构建了慢病毒表达载体，具体构建过程可参考如下步骤。
（1）按照中心法则，采用现有技术获得所述CAR的编码序列DNA；
（2）以Lenti-2G质粒（Lenti-2G-MCS-conGFP）为表达载体，对其进行BsrGI、Not I双酶切，然后利用T4 DNA连接酶将步骤（1）中的编码序列DNA整合重组进入Lenti-2G质粒中；
（3）将步骤（2）中的连接产物转化STABL3感受态细胞，筛选、扩大培养后进一步提取质粒，即可获得可表达MUC1-41BB-CD3z或MUC1-41BB-CD3z-IL22的重组后慢病毒表达质粒（分别命名为：Lenti-2G-MUC1-41BB-CD3z、Lenti-2G-MUC1-41BB-CD3z-IL22）。所构建的Lenti-2G-MUC1-41BB-CD3z-IL22质粒结构示意图如图2所示。
需要说明的是，本实施例中所采用质粒由：PPL (Public Protein/PlasmidLibrary, China)公司按照上述步骤制备提供。
实施例3
在实施例2基础上，发明人进一步将所构建的慢病毒表达质粒通过转染制备成CAR-T细胞进行了初步实验，具体过程简要介绍如下。
（一）慢病毒包装
以293T细胞作为待转染目的细胞，首先六孔板铺板孵育24h以培养293T细胞(DMEM完全培养基37℃)；
转染时将培养基更换为OPTI-MEM（用量2ml），然后将所构建获得的慢病毒表达质粒1.5g，包装质粒psPAX2与Pmd2.G分别1.5g和1g，脂质体转染试剂8ul，进行混合，以对对待转染的目的细胞293T细胞进行转染；
12小时后更换为正常的DMEM培养基；
继续培养48小时后收取病毒上清，1500rpm离心10分钟，取上清-80℃保存备用，以用于感染T细胞。
（二）制备纯化的CD3+T细胞
首先，从人外周血分离获得单个核细胞（具体采用密度梯度离心方法）；
然后，分离获得纯化的CD3+T细胞（具体采用T细胞分离磁珠进行分离纯化）；
再后，将纯化得到的T细胞在24孔细胞培养板中用含有IL-2(100 IU/ml，PeproTech, Suzhou, Jiangsu, China)和L-谷氨酰胺(2 mM ,Gibco/Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)的RPMI-1640进行培养；
最后，使用前，将T细胞用CD3/CD28活化抗体(1 ul / 107 cells)进行刺激活化2天。
（三）T细胞感染
利用24孔细胞培养板，每孔（106/孔）加入步骤（2）中活化2天后的T细胞，同时每孔加入步骤（1）中所收集的病毒上清1ml与polybrene（8μg/mL），孵育过夜以进行感染；
24小时后，更换为正常的含有IL-2(100 IU/ml，PeproTech, Suzhou, Jiangsu,China)和L-谷氨酰胺(2 mM ,Gibco/Life Technologies/Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA)的RPMI-1640进行培养。
（四）扩增T细胞并检测
对步骤（3）中孵育感染后T细胞，离心清洗（3次）后，加入含1000U IL-2与5％胎牛血清的RPMI1640培养基（每2-3天更换一次培养基），以进一步扩增T细胞，所制备的细胞分别记为：MUC1-T（含有慢病毒载体质粒MUC1-41BB-CD3z）、MUC1-IL22-T（含有可刺激MUC1表达的慢病。
需要说明的是，作为对照，参考上述操作，发明人将含有GFP的Lenti-2G质粒包装成慢病毒后直接感染T细胞，将所制备细胞记为：GFP-T（相当于仅表达GFP的空白对照T细胞组）。
（五）实验检测
（1）病毒包装情况检测及对T细胞增殖情况评价
对T细胞感染5天后，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测。结果如图3所示，可以看出：CAR表达阳性率达到50%~70%，这一结果表明所构建的CAR表达质粒被成功包装成慢病毒颗粒，并且转染成功。
对细胞增殖情况进行统计，结果如图4所示。分析可以看出，GFP-T组细胞增殖最为缓慢，而其余两个实验组细胞增殖均较快，但由于均受到慢病毒转染影响，因此随着增殖时间的延长，各处理组的细胞数量均是逐渐减少的；换言之，从细胞增殖效率角度而言，增殖培养5天左右的细胞增殖量是最高的。
（2）对不同肿瘤细胞凋亡情况检测
将CAR-T细胞扩增15天后，以不同MUC1表达情况的肿瘤细胞作为实验对象，以检测评价肿瘤细胞凋亡情况，具体实验设置为：
分别用高表达MUC1的口腔癌肿瘤细胞Cal33、HN4和MUC1阴性的永生化口腔粘膜上皮细胞OME作为靶细胞，以不同处理的T细胞作为效应细胞(GFP-T、MUC1-T、MUC1-IL22-T)，按照不同的效靶比(1：1、10：1、20：1)将T细胞与靶细胞按照于96孔板中共孵育6小时，每组设置三个复孔。
收集细胞共孵育后的上清液，将细胞沉淀物用Annexin V- binding buffer(BioLegend, San Diego, CA, USA)重悬，将1ul CD326 antibody和1ul Annexin Vantibody (BioLegend)分别加入细胞悬液中，在4℃的避光环境中孵育15分钟；Propidium(碘化丙碇，Sigma)在上机前加入细胞悬液中；所有样本均使用FACSCanto II或C6流式细胞仪(Becton Dickinson)进行分析，数据使用FlowJo软件(FlowJo, LLC, Ashland,Covington, KY, USA)进行分析。
结果如图5、图6、图7、图8所示，可以看出：即使针对不同的肿瘤细胞，相比于GFP-T细胞，MUC1-T细胞均可以有效的特异性杀伤MUC1阳性的肿瘤细胞，而在相同比例下MUC1-IL22-T细胞的杀伤效果比MUC1-T细胞更好，这一结果说明MUC1-IL22-T细胞对于肿瘤细胞的清除效果更好。例如：在效靶比为20：1情况下，其差异效果更为明显，MUC1-T细胞对MUC1阳性的肿瘤细胞的清除效果在50-60%，而MUC1-IL22-T细胞对MUC1阳性的肿瘤细胞的清除效果可达到90%以上。
（3）IL22分泌及MUC1表达情况检测
在上述（2）不同肿瘤细胞凋亡情况检测评价过程中，发明人进一步对IL22分泌及MUC1表达情况进行了检测分析。
需要说明的是，MUC1表达检测方法具体参考如下：
首先，用TRIzol试剂(Invitrogen)分别肿瘤样品中提取mRNA；
然后，使用TaKaRa公司的PrimeScript RT试剂试剂盒将RNA逆转录成cDNA；
最后，采用SYBR预混料Ex Taq II (TaKaRa)在安捷伦Mx3005P上进行qRT-PCR分析，具体分析MUC1时，引物设计如下:
正向：5’-TTTCCAGCCCGGGATACCTA-3’,
反向：5’ -AGAGGCTGCTGCCACCATTA-3’；
以甘油醛3-磷酸氢酶(GAPDH)作为内参，利用2-△△Ct对数据进行分析。
实验过程中，为验证外源IL22对肿瘤细胞表面MUC1表达的刺激作用，发明人将不同口腔癌肿瘤细胞及永生化口腔粘膜上皮细胞在六孔细胞培养板培养时加入IL22(20ng/ml)共孵育72小时后，用流式细胞术检测MUC1表达。
具体结果如图9所示。可以看出，肿瘤细胞表面MUC1明显上调，而永生化口腔粘膜上皮细胞OME表面MUC1表达无明显变化，这一结果说明，IL22可以有效且特异性诱导肿瘤细胞表面抗原MUC1表达上调，对其他细胞无明显作用。
进一步地，对不同效靶比情况下、不同效应T细胞组对Cal33细胞细胞处理后的IL22、MUC1表达情况进行检测和统计，结果如图10所示。
结果统计及分析可以看出：E/T比值越小，T细胞的细胞毒性功能越弱，T细胞增殖越慢，同时分泌功能性细胞因子的能力越弱，而分泌IL22的CAR-T细胞相较其他细胞具有较强的细胞毒性作用，因此，通过增强IL22的分泌表达量来提高T细胞毒性是一种较为可行的途径。与此结果向对应的，Cal33细胞的MUC1表达由原来的70%上调至95%左右，也进一步表明，通过偶联IL-22基因，通过提高IL-22表达量来上调MUC1的表达是可行的。
（4）小鼠肿瘤生长情况检测
在上述实验基础上，发明人进一步进行了小鼠动物实验，具体过程简要介绍如下。
利用NOD/SCID免疫缺陷小鼠，皮下接种PBS重悬的106 HN4-fluc 细胞(100ul)，构建小鼠皮下荷瘤模型，12天后，经尾静脉分别注射5×106个不同组别的T细胞(PBS、GFP-T、MUC1-T、MUC1-IL22-T)进行治疗（每组5只）。
实验过程中分别用电子秤和游标卡尺检测小鼠体重、肿瘤体积变化以及利用小动物活体成像设备检测肿瘤表达的荧光变化（每10天拍摄一次生物发光照片，第40天处死小鼠进行分析）。
利用小动物活体成像设备检测肿瘤表达的荧光变化时，首先用3%异氟醚(RWD生命科学，深圳，中国)在诱导室内麻醉小鼠；然后每只小鼠用注射器腹腔注射100ul 的d -荧光素溶液(0.15mg/ml, Yeasen Biotech Co.，Ltd.，Shanghai, China)，10分钟后利用动物活体成像设备IVIS Lumina, Series Ⅲ spectrometer (Caliper Life Science) 检测荧光，最后利用live image 4.3.1 software (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)进行分析。
实验结果如图11所示。结果统计（基于第40天最后一次的测量结果）及分析可以看出：
肿瘤荧光强度方面：在PBS和GFP-T治疗组中，小鼠的肿瘤荧光都在109级别，两者没有差异，而经过CAR-MUC1-T细胞治疗的小鼠肿瘤荧光降到108级别，经过CAR-MUC1-IL22-T细胞治疗的小鼠肿瘤荧光降到107级别，各组之间进行对比，前两组之前没有差异，后两组与前两组有明显差异，荧光明显降低，而CAR-MUC1-IL22-T细胞治疗组相对于CAR-MUC1-T细胞治疗组荧光进一步下降一个数量级，差异明显；
肿瘤体积方面：前两组的肿瘤体积都在1500mm3左右，CAR-MUC1-T细胞治疗组的小鼠肿瘤体积降到350mm3，而经过CAR-MUC1-IL22-T细胞治疗的小鼠肿瘤体积降低到150mm3，即：CAR-MUC1-IL22-T细胞治疗组对小鼠肿瘤有明显的清除和抑制作用，且作用效果明确强于前三组。
综上实验结果可以看出，CAR-T细胞治疗的效果与肿瘤细胞表面抗原的表达有关，本发明正对目前现有的靶向MUC1的CAR结构进行优化，优化的CAR-MUC1-IL22结构经过慢病毒包装及T细胞感染构建的CAR-MUC1-IL22-T细胞能有有效的诱导肿瘤细胞表面MUC1的表达上调从而起到更好的杀伤和控制肿瘤的作用，能够有效的避免脱靶效应的出现。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达用CAR及其应用
<130> none
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 2
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
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Tyr Cys Thr Phe Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
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Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala
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Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His
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Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
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Leu Gly Ser Glu
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Leu Glu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
35 40 45
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
50 55 60
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
65 70
<210> 4
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
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1 5 10 15
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<213> Homo sapiens
<400> 5
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1 5 10 15
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
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1 5 10 15
Gly Pro
<210> 7
<211> 179
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu
1 5 10 15
Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala
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Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln
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Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn
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Ala Cys Ile
<210> 8
<211> 730
<212> PRT
<213> 人工设计
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu
20 25 30
Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu
35 40 45
Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu
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Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp
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Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg
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Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Asp Ile Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
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725 730

Claims (6)

1.一种能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR，其特征在于，该嵌合抗原受体为一若干蛋白片段连接的氨基酸序列，以MUC1-41BB-CD3z命名，具体为：依次连接的人CD8a分子信号肽CMV、人源化MUC1单链抗体scFV.MUC1、人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区41BB、人CD3z分子胞内区CD3Zeta，即：CMV—scFV.MUC1—41BB—CD3Zeta；
所述人CD8a分子信号肽CMV，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：MALPVTALLLPLALLLHAARP；
所述人源化MUC1单链抗体scFV.MUC1，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：
EVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSE；
所述人CD8分子跨膜区与41BB分子胞内区41BB，其中人CD8分子跨膜区氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：
LETTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；
41BB分子胞内区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；
所述人CD3z分子胞内区CD3Zeta，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，具体为：
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
2.如权利要求1所述能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR，其特征在于，人CD3z分子胞内区CD3Zeta进一步通过连接序列与IL22 CDS区序列IL22进行连接；
所述IL22 CDS区序列IL22，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，具体为：
MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI。
3.如权利要求2所述能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR，其特征在于，所述连接序列为TA2连接序列T2A；
所述TA2连接序列T2A，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，具体为：
EGRGSLLTCGDVEENPGP；
因此，所构成的CAR总体结构为：CMV—scFV.MUC1—41BB—CD3Zeta—T2A—IL22，以MUC1-41BB-CD3z-IL22命名；
该MUC1-41BB-CD3z-IL22，氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，具体为：
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEMALPVTALLLPLALLLHAARPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI。
4.利用权利要求1~3任一项所述能诱导肿瘤细胞上调抗原MUC1表达的CAR所构建的慢病毒表达质粒，其特征在于，具体通过如下步骤制备而成：
（1）按照中心法则，获得所述CAR的编码序列DNA；
（2）以Lenti-2G质粒为表达载体，对其进行BsrGI、Not I双酶切，然后利用T4 DNA连接酶将步骤（1）中的编码序列DNA整合重组进入Lenti-2G质粒中；
（3）将步骤（2）中的连接产物转化STABL3感受态细胞，筛选、扩大培养后进一步提取质粒，获得重组后慢病毒表达质粒。
5.权利要求4所述慢病毒表达质粒在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，应用时，通过转染制备成CAR-T细胞进行应用，用于提高肿瘤细胞的MUC1表达量；
所述肿瘤具体为HNSCC癌，所述HNSCC癌具体为人舌鳞癌细胞系CAL33或人口咽鳞癌细胞系HN4相对应癌症；
具体应用步骤包括如下步骤：
（1）包装制备成慢病毒；
（2）获得纯化的CD3+T细胞；
（3）T细胞感染，在步骤（2）中活化CD3+T细胞中，加入步骤（1）中所病毒与polybrene，孵育过夜以进行感染；
（4）扩增T细胞并检测备用，对步骤（3）中孵育感染后T细胞，回收清洗后，加入培养基，以进一步扩增T细胞；对扩增后T细胞检测合格后备用，或者进一步回输后即可用于刺激提高肿瘤细胞的MUC1表达情况。
6.如权利要求5所述慢病毒表达质粒在制备抗肿瘤药剂中的应用，其特征在于，步骤（1）中，包装制备慢病毒时，以293T细胞作为待转染目的细胞。
CN201910525834.7A 2019-06-13 2019-06-13 诱导肿瘤细胞上调抗原muc1表达用car及其应用 Active CN110229236B (zh)

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