ES2824167T3 - Anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD123 y anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CD3 y/o CD123 - Google Patents

Anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD123 y anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CD3 y/o CD123 Download PDF

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Wulf-Dirk Leuschner
Ercole Rao
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Abstract

Una proteína de unión de tipo anticuerpo que se une a CD3 y a al menos a otro antígeno diana que es CD123, que comprende dos cadenas polipeptídicas que forman dos sitios de unión a antígeno, en la que un primer polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [I]: VD1-L1-VD2-L2-CL [I] y un segundo polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [II]: VD3-L3-VD4-L4-CH1 [II] en las que: VD1 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina; VD2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina; VD3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina; VD4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina; CL es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina; CH1 es un dominio constante de cadena pesada CH1 de una inmunoglobulina; L1, L2, L3, y L4 son conectores de aminoácidos; y en la que el primer y el segundo polipéptido forman un par entrecruzado cadena ligera-cadena pesada, y en la que VD1 y VD2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y VD3 y VD4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si VD1 y VD2 son dominios variables de cadenas ligeras, o VD3 y VD4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si VD1 y VD2 son dominios variables de cadenas pesadas, en la que dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD3 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia "KVS" y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; y en la que la otra de dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 381, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 384, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, CDR2-L de secuencia "WAS" y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 379.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD123 y anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CD3 y/o CD123
La presente invención se refiere a una proteína de unión de tipo anticuerpo que se une específicamente a CD3 y se une específicamente a al menos un antígeno adicional que es CD123. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención, y a su uso para tratar el cáncer.
La primera generación de anticuerpos biespecíficos se desarrolló hace más de 20 años. Desde entonces, varios estudios clínicos han ensayado anticuerpos biespecíficos diseñados para atacar los antígenos de superficie de las células cancerosas. Este grupo de proteínas de fusión contra el cáncer contiene dos o más dominios funcionales que localizan las células efectoras inmunológicas en la proximidad de las células cancerosas seleccionadas, para lograr la actividad contra el cáncer.
A medida que se desarrolló la tecnología de anticuerpos biespecíficos, se generó un grupo diferente de proteínas de fusión denominadas acopladores biespecíficos de células T (BiTE) conectando solo dos regiones variables monocatenarias (scFv) de anticuerpos (no se incluyeron segmentos de aminoácidos Fc) con un conector flexible, una scFv se une a las células seleccionadas como dianas y la otra se une a CD3 en la superficie de las células T. Un BiTE, blinatumomab, con actividades de unión biespecífica de CD19xCD3 mostró resultados prometedores en ensayos clínicos de Fase II para pacientes con enfermedad residual mínima en linfoblásticos agudos de linaje B.
CD123 (la cadena alfa del receptor de interleucina-3 IL-3Ra) es un antígeno tumoral sobreexpresado en una variedad de neoplasias hematológicas. La mayoría de los blastos de AML expresan CD123 de superficie, y esta expresión no varía según el subtipo de AML. Se ha dado a conocer que una mayor expresión de CD123 en la AML en el momento del diagnóstico se asocia con un pronóstico más precario. Se ha dado a conocer que CD123 se expresa en células madre leucémicas (LSCs). Existe una creciente evidencia que sugiere que la AML surge de estas células madre leucémicas (LSCs) que se ha demostrado que son inactivas y relativamente resistentes a la quimioterapia que daña el ADN.
El aumento de la expresión de CD123 en las LSCs en comparación con las células madre hematopoyéticas (HSCs) presenta así una oportunidad para seleccionar terapéuticamente como diana a AML-LSCs.
Se ha demostrado previamente que el anticuerpo monoclonal (MAb) 7G3, producido contra CD123, inhibe la proliferación y activación mediadas por IL-3 de tanto de líneas celulares leucémicas como de células primarias (Patente US n° 6.177.078). Sin embargo, no ha quedado claro si la selección de CD123 puede afectar funcionalmente a las AML-LSCs.
El uso de la proteína de unión de tipo anticuerpo CD123xCD3 conduce a la muerte de las células tumorales, como muestran los inventores en el presente documento.
La idea de producir una proteína de unión biespecífica de tipo anticuerpo con actividades de unión biespecífica de CD123xCD3 ya ha sido propuesta y descrita en la solicitud de patente internacional WO2013/173820.
Además, una molécula basada en anticuerpos biespecíficos de reorientación de doble afinidad (DART) CD123 x CD3 de MacroGenics entró en ensayos clínicos de fase I en 2014.
Sin embargo, como lo muestran los inventores, la molécula basada en anticuerpos biespecíficos de reorientación de doble afinidad (DART) CD123xCD3 de MacroGenics, por ejemplo, tiene una activación del 82% de células T que expresan CD4+ y del 83% de células T que expresan CD8+ en ausencia de células diana. La activación inapropiada de las células T puede provocar efectos secundarios graves, tal como el síndrome de liberación de citocinas. El síndrome de liberación de citocinas se refiere a la liberación de citocinas por las células T activadas que producen un tipo de respuesta inflamatoria sistémica similar a la encontrada en infecciones graves y caracterizada por hipotensión, pirexia y escalofríos. Se han dado a conocer muertes debido al síndrome de liberación de citocinas, por ejemplo, para OKT3.
La solicitud de patente internacional publicada como WO2013173820, y el artículo de Kuo y Liu, Protein Engineering, Design & Selection vol. 25 no. 10 p. 561 -569, 2012, describen una inmunofusión de scFv biespecífica que comprende un dominio Fv monocatenario (scFv) anti-CD 123 fusionado en el término N de bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana, y un scFv anti-CD3 fusionado en el término C (CD123xCD3 Blf).
Por lo tanto, a pesar de estos avances en la tecnología de anticuerpos biespecíficos, sigue existiendo la necesidad de terapias contra el cáncer adicionales, particularmente aquellas que se dirigen y destruyen de manera eficiente las células cancerosas, ya sea directa o indirectamente.
Los inventores han tenido éxito en generar, cribar y seleccionar anticuerpos anti-CD3 de rata específicos que muestran una alta afinidad tanto por la proteína CD3 humana como de Macaca fascicularis.
Los inventores desarrollaron proteínas de unión de tipo anticuerpo que tienen especificidad biológica e inmunológica para el antígeno CD3 y al menos un antígeno diana adicional. En un ejemplo, para demostrar el uso de estos anticuerpos anti-CD3 en la generación de proteínas de unión de tipo anticuerpo biespecíficas, los inventores generaron proteínas de unión de tipo anticuerpo anti-CD3/anti-CD123 y demostraron el uso terapéutico de las mismas. Esas proteínas de unión de tipo anticuerpo anti-CD3/anti-CD123 biespecíficas tienen una activación de células T baja, como se ha observado para el anticuerpo anti-CD3 solo. Sin embargo, una vez que las células diana que expresan CD123, tales como las células THP-1, están presentes, la proteína de unión biespecífica de tipo anticuerpo anti-CD3/anti-CD123 muestra una alta activación de las células T. Por consiguiente, el anticuerpo anti-CD3 de la invención definido anteriormente es particularmente útil para la preparación de proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención.
La invención es como se define por las reivindicaciones.
Definiciones
A lo largo de la presente solicitud, el término “y/o” es una conjunción gramatical que debe interpretarse como que abarca que pueden ocurrir uno o más de los casos que conecta. Por ejemplo, la frase “tales proteínas de secuencia nativa se pueden preparar usando métodos recombinantes y/o sintéticos estándar” indica que las proteínas de secuencia nativa se pueden preparar usando métodos recombinantes y sintéticos estándar o que se pueden preparar proteínas de secuencia nativa usando métodos recombinantes estándar o se pueden preparar proteínas de secuencia nativa usando métodos sintéticos.
Además, a lo largo de la presente solicitud, la expresión “que comprende” debe interpretarse como que abarca todas las características mencionadas específicamente, así como las opcionales, adicionales, no especificadas. Como se usa aquí, el uso de la expresión “que comprende” también describe la realización en la que no están presentes características distintas de las características específicamente mencionadas (es decir, “que consiste en”). Además, el artículo indefinido “un” o “una” no excluye una pluralidad. El mero hecho de que se mencionen determinadas medidas en reivindicaciones dependientes diferentes entre sí no indica que una combinación de estas medidas no pueda usarse ventajosamente.
El termino “gen” significa una secuencia de ADN que codifica, o corresponde a, una secuencia particular de aminoácidos que comprende todo o parte de una o más proteínas o enzimas, y puede o no incluir secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias promotoras, que determinan, por ejemplo, las condiciones bajo las cuales se expresa el gen. Algunos genes, que no son genes estructurales, pueden transcribirse de ADN a ARN, pero no se traducen en una secuencia de aminoácidos. Otros genes pueden funcionar como reguladores de genes estructurales o como reguladores de la transcripción del ADN. En particular, el término gen puede estar destinado a la secuencia genómica que codifica una proteína, es decir, una secuencia que comprende secuencias reguladoras, promotoras, intrónicas y exónicas.
Una secuencia “al menos 85% idéntica a una secuencia de referencia” es una secuencia que tiene, en toda su longitud, 85% o más, en particular 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con toda la longitud de la secuencia de referencia.
En el contexto de la presente solicitud, el “porcentaje de identidad” se calcula usando un alineamiento global por pares (es decir, las dos secuencias se comparan en toda su longitud). Los métodos para comparar la identidad de dos o más secuencias son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar el programa «needle», que usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453) para encontrar el alineamiento óptimo (incluyendo los espacios) de dos secuencias cuando se considera su longitud completa. El programa needle está disponible, por ejemplo, en el sitio World Wide Web ebi.ac.uk. El porcentaje de identidad entre dos polipéptidos, según la invención, se calcula usando el programa EMBOSS: needle (global) con un parámetro “Gap Open” igual a 10,0, un parámetro “Gap Extend” igual a 0,5, y una matriz Blosum62.
Las proteínas que consisten en una secuencia de aminoácidos “al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica” a una secuencia de referencia pueden comprender mutaciones tales como supresiones, inserciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia de referencia. En caso de sustituciones, la proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de referencia puede corresponder a una secuencia homóloga derivada de otra especie que la secuencia de referencia.
Las “sustituciones de aminoácidos” pueden ser conservativas o no conservativas. Preferiblemente, las sustituciones son sustituciones conservativas, en las que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido con propiedades estructurales y/o químicas similares. La sustitución corresponde preferiblemente a una sustitución conservativa como se indica en la tabla siguiente.
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Un “anticuerpo”, también denominado “inmunoglobulina”, puede ser un anticuerpo natural o convencional en el que dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces de disulfuro, y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera por un enlace de disulfuro. Hay dos tipos de cadenas ligeras, lambda (I) y kappa (k). Hay cinco clases principales de cadenas pesadas (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios o regiones, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados colectivamente CH). Las regiones variables de las cadenas tanto ligera (VL) como pesada (VH) determinan el reconocimiento de la unión y la especificidad por el antígeno. Los dominios de la región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren propiedades biológicas importantes tales como la asociación de cadenas de anticuerpos, secreción, movilidad trans-placentaria, unión al complemento, y unión a receptores de Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina, y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios de combinación de anticuerpos están formados por restos que son principalmente de las regiones determinantes de complementariedad o hipervariables (CDRs). Ocasionalmente, los restos de regiones marco o no hipervariables (FR) influyen en la estructura general del dominio y, por lo tanto, en el sitio de combinación. Las regiones determinantes de complementariedad o CDRs se refieren a secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad de unión y la especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDRs, denominadas CDR1 -L, CDR2-L, CDR3-L y CDR1 -H, CDR2-H, CDR3-H, respectivamente. Un sitio de unión a antígeno de anticuerpo convencional, por lo tanto, incluye seis CDRs, que comprenden el conjunto de CDRs de cada una de una región V de cadena pesada y ligera.
En el contexto de la invención, el anticuerpo o inmunoglobulina es una IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.
Las “regiones marco” (FRs) se refieren a secuencias de aminoácidos interpuestas entre CDRs, es decir, a aquellas porciones de regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina que están relativamente conservadas entre diferentes inmunoglobulinas en una sola especie. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una cuatro FRs, denominadas FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, y FR1-H, f R2-H, FR3-H, FR4-H, respectivamente. En consecuencia, el dominio variable de la cadena ligera se puede denominar así (FR1 -L)-(CDR1 -L)-(FR2-L) )-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L) (FR4-L) y FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H, y de este modo el dominio variable de la cadena pesada se puede denominar ((FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H).
Conociendo la secuencia de aminoácidos de las CDRs, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las regiones marco FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L y/o FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.
Como se usa aquí, una “región marco humana” es una región marco que es sustancialmente idéntica (alrededor de 85%, o más, en particular 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) a la región marco de un anticuerpo humano natural.
En el contexto de la invención, la definición de CDR/FR en una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina se determinará basándose en la definición de IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).
Como se usa aquí, el término “anticuerpo” denota anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos, así como anticuerpos de dominio único y fragmentos de los mismos, en particular anticuerpos de cadena pesada variable de dominio único, y anticuerpos quiméricos, humanizados, biespecíficos o multiespecíficos.
Como se usa aquí, el anticuerpo o inmunoglobulina también incluye “anticuerpos de dominio único” que se han descrito más recientemente y que son anticuerpos cuyas regiones determinantes de la complementariedad son parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos naturalmente desprovistos de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio único derivados de anticuerpos de cuatro cadenas convencionales, anticuerpos de dominio único manipulados. Los anticuerpos de dominio único pueden derivar de cualquier especie, incluyendo, pero sin limitarse a, ratón, ser humano, camello, llama, cabra, conejo, bovino. Los anticuerpos de dominio único pueden ser anticuerpos de dominio único de origen natural conocidos como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. En particular, la especie Camelidae, por ejemplo, camello, dromedario, llama, alpaca y guanaco, producen anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera. Los anticuerpos de cadena pesada de camélidos también carecen del dominio CH1.
La cadena pesada variable de estos anticuerpos de dominio único desprovistos de cadenas ligeras se conoce en la técnica como “VHH” o “nanocuerpo”. Al igual que los dominios VH convencionales, los VHHs contienen cuatro FRs y tres CDRs. Los nanocuerpos tienen ventajas sobre los anticuerpos convencionales: son alrededor de diez veces más pequeños que las moléculas de IgG y, como consecuencia, los nanocuerpos funcionales correctamente plegados pueden producirse mediante expresión in vitro mientras se logra alto rendimiento. Además, los nanocuerpos son muy estables y resistentes a la acción de las proteasas. Las propiedades y producción de nanocuerpos han sido revisadas por Harmsen y De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 nov; 77(1 ):13-22).
El termino “anticuerpo monoclonal” o “mAb”, como se usa aquí, se refiere a una molécula de anticuerpo de una composición de un solo aminoácido que está dirigida contra un antígeno específico, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Un anticuerpo monoclonal puede ser producido por un solo clon de células B o hibridoma, pero también puede ser recombinante, es decir, producido por ingeniería de proteínas.
El termino “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo manipulado que, en su sentido más amplio, contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos. En particular, un anticuerpo quimérico comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano, en asociación con un dominio CH y un dominio CL de otro anticuerpo, en particular un anticuerpo humano. Como animal no humano, se puede usar cualquier animal tal como ratón, rata, hámster, conejo, o similar. Un anticuerpo quimérico también puede indicar un anticuerpo multiespecífico que tiene especificidad por al menos dos antígenos diferentes.
La expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que es total o parcialmente de origen no humano y que ha sido modificado para reemplazar ciertos aminoácidos, en particular en las regiones marco de las cadenas pesada y ligera, con el fin de evitar o minimizar una respuesta inmune en seres humanos. Los dominios constantes de un anticuerpo humanizado son la mayoría de las veces dominios CH y CL humanos.
Se conocen en la técnica numerosos métodos para la humanización de una secuencia de anticuerpo; véase, por ejemplo, la revisión por Almagro y Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633. Un método comúnmente usado es el injerto de CDRs, o remodelación de anticuerpos, que implica el injerto de las secuencias de CDRs de un anticuerpo donante, generalmente un anticuerpo de ratón, en el armazón estructural de un anticuerpo humano de diferente especificidad. Dado que el injerto de CDRs puede reducir la especificidad y afinidad de unión, y de este modo la actividad biológica, de un anticuerpo no humano injertado con CDRs, pueden introducirse mutaciones inversas en posiciones seleccionadas del anticuerpo injertado con CDRs para retener la especificidad y afinidad de unión del anticuerpo parental. La identificación de posiciones para posibles mutaciones inversas se puede realizar usando la información disponible en la bibliografía y en las bases de datos de anticuerpos. Los restos de aminoácidos que son candidatos para mutaciones inversas suelen ser los que se encuentran en la superficie de una molécula de anticuerpo, mientras que los restos que están enterrados o que tienen un bajo grado de exposición superficial normalmente no se alterarán. Una técnica de humanización alternativa al injerto de CDRs y la mutación inversa es la remodelación de la superficie, en la que se retienen los restos de origen no humano no expuestos a la superficie, mientras que los restos de la superficie se alteran a restos humanos. Otra técnica alternativa se conoce como “selección guiada” (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899), y puede usarse para derivar de, por ejemplo, un anticuerpo murino o de rata un anticuerpo completamente humano que conserva el epítopo y las características de unión del anticuerpo parental. Otro método de humanización es la denominada humanización 4D. El protocolo de humanización 4D se describe en la solicitud de patente US20110027266 A1 (documento WO2009032661A1) y se ejemplifica a continuación aplicando la humanización 4D para humanizar los dominios ligeros (VL) y pesados (VH) variables del anticuerpo de rata. En un ejemplo, se realizó un modelo de homología de anticuerpo de rata con software típicamente MOE (v. 2011.10-Chemical Computing Group, Quebec, Canadá) usando como moldes estructuras PDB (Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242) y posteriormente se minimizó la energía usando los procedimientos estándar implementados en MOE. Después se realizó una simulación de dinámica molecular (MD) en el modelo de homología 3D minimizado (realizado con el software MOE) de anticuerpo de rata y se comparó con, por ejemplo, 49 modelos humanos derivados de las siete cadenas ligeras representativas (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) y las siete cadenas pesadas representativas (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) diseñadas por LGCR/SDI y disponibles en MOE. Por ejemplo, para la “humanización 4D”, se ha seleccionado un modelo de acoplamiento de cadenas (Vkx-Vhx) con los mejores componentes hidrófobos, electrostáticos e identidad de secuencia fuera de CDR. Para la asociación por pares entre el dominio variable del anticuerpo de rata y el modelo seleccionado, las secuencias se alinearon basándose típicamente en la superposición 3D óptima de los carbonos alfa de los modelos de homología correspondientes. Entonces se consideraron y se mutaron los motivos no deseados. Finalmente, las secuencias humanizadas resultantes se analizaron para determinar la similitud de secuencias con, por ejemplo, la base de datos IEDB (http://www.immuneepitope.org; versión 2012/01/30 accesible localmente) para garantizar que ninguna de las secuencias contenga ningún epítopo de células B o T conocido enumerado.
Para los anticuerpos quiméricos, la humanización implica típicamente la modificación de las regiones marco de las secuencias de la región variable.
Los restos de aminoácidos que forman parte de una CDR normalmente no se alterarán en relación con la humanización, aunque en ciertos casos puede ser deseable alterar los restos de aminoácidos de la CDR individuales, por ejemplo, para eliminar un sitio de glicosilación, un sitio de desamidación o un resto cisteína no deseado. La glicosilación enlazada mediante N se produce mediante la unión de una cadena de oligosacárido a un resto de asparagina en la secuencia de tripeptídica Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro. La eliminación de un sitio de N-glicosilación se puede lograr mutando el resto Asn o Ser/Thr por un resto diferente, en particular mediante sustitución conservativa. La desamidación de los restos de asparagina y glutamina puede ocurrir dependiendo de factores tales como el pH y la exposición de la superficie. Los restos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor grado en otras secuencias dipeptídicas tales como Asn-Ala. Cuando un sitio de desamidación de este tipo, en particular Asn-Gly, está presente en una secuencia de CDR, puede ser deseable por lo tanto eliminar el sitio, típicamente mediante sustitución conservativa para eliminar uno de los restos implicados. La sustitución en una secuencia de CDR para eliminar uno de los restos implicados también está destinada a estar incluida en la presente invención.
“Fragmentos” de anticuerpos (convencionales) comprenden una porción de un anticuerpo intacto, en particular la región de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Un fragmento de un anticuerpo convencional también puede ser un anticuerpo de dominio único, tal como un anticuerpo de cadena pesada o VHH.
El termino “Fab” denota un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de alrededor de 50.000 y actividad de unión a antígeno, en el que alrededor de la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L completa, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con una proteasa, papaína, están unidos a través de un enlace de disulfuro.
El termino “F(ab’)2” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de alrededor de 100.000 y una actividad de unión a antígeno, que es ligeramente mayor que el Fab unido mediante un enlace de disulfuro de la región bisagra, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con una proteasa, pepsina.
El termino “Fab’” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de alrededor de 50.000 y actividad de unión a antígeno, que se obtiene cortando un enlace de disulfuro de la región bisagra del F(ab’)2.
Un polipéptido Fv monocatenario (“scFv”) es un heterodímero VH::VL enlazado covalentemente que normalmente se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican VH y VL enlazados por un conector que codifica un péptido. El fragmento scFv humano incluye CDRs que se mantienen en la conformación apropiada, en particular usando técnicas de recombinación de genes. Los fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes pueden formarse espontáneamente por asociación de scFv monovalentes, o pueden generarse acoplando scFv monovalentes mediante un conector peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente. “dsFv” es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace de disulfuro. “(dsFv)2” denota dos dsFv acoplados por un conector peptídico.
La expresión “anticuerpo biespecífico” o “BsAb” normalmente denota un anticuerpo, que combina los sitios de unión al antígeno de dos anticuerpos dentro de una sola molécula. De este modo, los BsAbs pueden unirse a dos antígenos diferentes simultáneamente. La ingeniería genética se ha usado con una frecuencia creciente para diseñar, modificar y producir anticuerpos o derivados de anticuerpos con un conjunto deseado de propiedades de unión y funciones efectoras como se describe, por ejemplo, en el documento EP 2050 764 A1.
La expresión “anticuerpo multiespecífico” denota un anticuerpo que combina los sitios de unión al antígeno de dos o más anticuerpos dentro de una sola molécula.
El termino “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno.
El termino “hibridoma” indica una célula, que se obtiene sometiendo una célula B preparada inmunizando un mamífero no humano con un antígeno a la fusión celular con una célula de mieloma derivada de un ratón o similar que produce un anticuerpo monoclonal deseado que tiene una especificidad por el antígeno.
Por “purificado” y “aislado” se quiere decir, cuando se hace referencia a un polipéptido (es decir, el anticuerpo de la invención) o una secuencia nucleotídica, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término “purificado”, como se usa aquí, significa en particular que están presentes al menos el 75%, 85%, 95% o 98% en peso de macromoléculas biológicas del mismo tipo. Una molécula de ácido nucleico “aislada” que codifica un polipéptido particular se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido en cuestión; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales, que no afectan negativamente a las características básicas de la composición.
El término “antígeno” o “antígeno diana”, como se usa aquí, se refiere a una molécula o una porción de una molécula que es capaz de unirse a un anticuerpo o una proteína de unión de tipo anticuerpo. El término se refiere además a una molécula o una porción de una molécula que puede ser usada en un animal para producir anticuerpos que sean capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno diana puede tener uno o más epítopos. Con respecto a cada antígeno diana reconocido por un anticuerpo o por una proteína de unión de tipo anticuerpo, la proteína de unión de tipo anticuerpo es capaz de competir con un anticuerpo intacto que reconoce el antígeno diana.
“Afinidad” se define, en teoría, por la asociación de equilibrio entre el anticuerpo completo y el antígeno. La afinidad puede expresarse, por ejemplo, en la concentración media máxima eficaz (EC50) o la constante de disociación de equilibrio (KD).
“Concentración efectiva media máxima” también denominada “EC50”se refiere a la concentración de un fármaco, anticuerpo o tóxico que induce una respuesta a medio camino entre la línea de base y el máximo después de un tiempo de exposición específico. EC50 y la afinidad están inversamente relacionadas, cuanto menor es el valor de EC50 mayor es la afinidad del anticuerpo.
“Kd” es la constante de disociación en el equilibrio, una relación de koff/kon, entre el anticuerpo y su antígeno. Kd y la afinidad están inversamente relacionadas. El valor de Kd se relaciona con la concentración de anticuerpo, y cuanto menor es el valor de KD y mayor es la afinidad del anticuerpo. La afinidad se puede evaluar experimentalmente mediante una variedad de métodos conocidos, tal como midiendo las constantes de asociación y disociación con resonancia de plasmones superficiales o midiendo la EC50 en un ensayo inmunoquímico (ELISA, FACS). El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es un ensayo bioquímico que usa un inmunoensayo enzimático en fase sólida para detectar la presencia de una sustancia, generalmente un antígeno, en una muestra líquida o húmeda. Los antígenos de la muestra se adhieren a una superficie. Después, se aplica otro anticuerpo específico sobre la superficie para que pueda unirse al antígeno. Este anticuerpo se une a una enzima, y, en la etapa final, se añade una sustancia que contiene el sustrato de la enzima. La reacción subsiguiente produce una señal detectable, más comúnmente un cambio de color en el sustrato. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) proporciona un método para clasificar una mezcla heterogénea de células biológicas en dos o más recipientes, una célula a la vez, basándose en las características específicas de dispersión de luz y fluorescencia de cada célula. En estos ensayos, la EC50 es la concentración del anticuerpo que induce una respuesta a medio camino entre la línea de base y el máximo después de un tiempo de exposición específico en una concentración definida de antígeno por ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) o célula que expresa el antígeno por FACS (clasificación celular activada por fluorescencia). La resonancia de plasmones superficiales es un método sin marcadores en el que la unión de una molécula en la fase soluble (el “analito”) se mide directamente a una molécula “ligando” inmovilizada sobre una superficie sensora. En el dispositivo sensor, la unión del ligando se monitoriza mediante un fenómeno óptico denominado plasmón de superficie. En particular, cuando la molécula “analito” se disocia de la molécula “ligando”, se observa una disminución en la señal de SPR (expresada en unidades de resonancia, RU). Las constantes de asociación (“constante on”, ka) y de disociación (“constante off”, kd) se obtienen a partir de la señal obtenida durante la asociación y disociación, y la constante de disociación en el equilibrio (“constante de unión”, Kd) se puede calcular a partir de ellas. La señal dada en unidades de resonancia (RU) depende del tamaño del ligando presente en el analito; sin embargo, en caso de que las condiciones experimentales sean las mismas, es decir, el ligando es la misma molécula en las mismas condiciones, la RU obtenida puede indicar afinidad, en la que cuanto mayor sea la señal obtenida en RU, mayor será la unión.
Un anticuerpo monoclonal que se une al antígeno 1 (Ag1) “reacciona de manera cruzada” con el antígeno 2 (Ag2) cuando las EC50s están en un intervalo similar para ambos antígenos. En la presente solicitud, un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 tiene reactividad cruzada con Ag2 cuando la relación de afinidad de Ag2 a la afinidad de Ag1 es igual o menor que 10 (en particular 5, 2, 1 o 0,5), midiéndose las afinidades con el mismo método para ambos antígenos.
Un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 es “no reacciona significativamente de forma cruzada” con Ag2 cuando las afinidades son muy diferentes para los dos antígenos. La afinidad por Ag2 puede no ser medible si la respuesta de unión es demasiado baja. En la presente solicitud, un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 no presenta una reacción cruzada significativa con Ag2, cuando la respuesta de unión del anticuerpo monoclonal a Ag2 es menor que 5% de la respuesta de unión del mismo anticuerpo monoclonal a Ag1 en el mismo entorno experimental y a la misma concentración de anticuerpo. En la práctica, la concentración de anticuerpo usada puede ser la EC50 o la concentración requerida para alcanzar la meseta de saturación obtenida con Ag1.
Como se usa aquí, “especificidad” denota la capacidad de un anticuerpo para discriminar la secuencia peptídica diana a la que se une (“epítopo”) de secuencias peptídicas estrechamente relacionadas y altamente homólogas.
Un anticuerpo monoclonal “se une específicamente” a Ag1 cuando no tiene una reacción cruzada significativa con Ag2.
Un “dominio” puede ser cualquier región de una proteína, generalmente definida sobre la base de homologías de secuencia y, a menudo, relacionada con una entidad estructural o funcional específica.
Una molécula “recombinante” es aquella que ha sido preparada, expresada, creada o aislada por medios recombinantes.
Como se usa aquí, el término “sujeto” indica un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. En particular, un sujeto según la invención es un ser humano.
Anticuerpos anti CD3
“CD3” denota un antígeno que se expresa en las células T como parte del complejo de receptor de células T multimolecular y que consiste en al menos tres cadenas diferentes CD3e, CD38 y CD3g. CD38 y CD3g tienen una baja identidad de secuencia y/o similitud con la CD3e humana (la similitud e identidad es inferior al 20%). CD3e y CDR38 pueden formar juntos un complejo, denominado aquí “complejo CD3e/8“. CD3e también forma un complejo con CDR3y, el denominado “complejo CD3e/y\ La agrupación de CD3 en las células T, por ejemplo, mediante anticuerpos anti-CD3 inmovilizados, conduce a la activación de las células T similar al acoplamiento del receptor de las células T pero independiente de su especificidad típica de clon. “CD3e“ comprende tres dominios, un dominio intracelular, un dominio transmembrana y un dominio extracelular.
La mayoría de los anticuerpos anti-CD3 de la técnica anterior reconocen la cadena CD3e. Uno de tales anticuerpos anti-CD3 de la técnica anterior es OKT3. La técnica anterior ha ejemplificado sucesos de activación de células T empleando moléculas de anticuerpo, por ejemplo, empleando la molécula de anticuerpo OKT3. El anticuerpo anti-CD3 y sus variantes se han descrito en la técnica anterior (documentos US 4.361.549; US 4.361.549; US 5.885.573; US 5.929.212; y WO 98/52975 o US 5.955.358). OKT3 se ha usado además como un potente agente inmunosupresor en trasplantes clínicos para tratar el rechazo de aloinjertos (Thistlethwaite 1984, Transplantation 38, 695-701; Woodle 1991, Transplantation 51, 1207-1212; Choi 2001, Eur. J. Immunol. 31(1), 94-106).
Los principales inconvenientes de esta terapia son la activación de las células T que se manifiesta en la liberación de citocinas debido al entrecruzamiento entre las células T y las células que portan FcyR y la respuesta del anticuerpo humano anti-ratón (HAMA). Varias publicaciones han descrito alteraciones, tal como la humanización de OKT3, para reducir estos efectos secundarios: documentos US 5.929.212; US 5.885.573 y otros. Por otro lado, OKT3 u otros anticuerpos anti-CD3 pueden usarse como agentes inmunopotenciadores para estimular la activación y proliferación de células T (documentos US 6.406.696 Bluestone; US 6.143.297 Bluestone; US 6.113.901 Bluestone; Yannelly 1990, J. Immunol. Meth. 1,91-100). Los anticuerpos anti-CD3 también se han descrito como agentes usados en combinación con anticuerpos anti-CD28 para inducir la proliferación de células T (documento US 6.352.694). El OKT3 se ha usado además por sí mismo o como un componente de un anticuerpo biespecífico para dirigir células T citotóxicas contra células tumorales o células infectadas por virus (Nitta 1990, Lancet 335, 368-376; Sanna 1995, Bio/Technology 13, 1221 -1224; documento WO 99/54440).
Los enfoques hasta ahora que usan anticuerpos como agentes para el reclutamiento de células T se han visto obstaculizados por varios hallazgos. Primero, los anticuerpos naturales o manipulados que tienen una alta afinidad de unión por células T a menudo no activan las células T a las que están unidas. En segundo lugar, los anticuerpos naturales o modificados genéticamente que tienen una baja afinidad de unión por las células T a menudo también son ineficaces con respecto a su capacidad para desencadenar la lisis celular mediada por células T.
Una secuencia de referencia de la proteína CD3e humana de longitud completa, que incluye el péptido señal, está disponible en la base de datos de Uniprot con el número de acceso P07766, y se adjunta aquí bajo SEQ ID NO: 1 (disponible el 12 de diciembre de 2014).
Una secuencia de referencia de proteína de CD3e de Macaca fascicularis de longitud completa, que incluye el péptido señal, está disponible en la base de datos de Uniprot con el número de acceso Q95LI5, y se adjunta aquí bajo la SEQ ID n O: 2 (disponible el 12 de diciembre de 2014).
Una secuencia de proteínas de fusión Fc etiquetadas con His de CD3e humanas maduras, clonadas por los inventores a partir de ADN genómico, se describe bajo SEQ ID NO: 3. Dicha proteína de fusión Fc etiquetada con His CD3e humana madura comprende los aminoácidos 23 a 126 de la proteína CD3e humana de longitud completa, y de este modo comprende el dominio extracelular de CD3e humana.
Una secuencia de proteína de fusión Fc CD3e de Macaca fascicularis madura, clonada por los inventores a partir de ADN genómico, se describe bajo SEQ ID NO: 4. Dicha proteína de fusión Fc CD3e de Macaca fascicularis madura comprende los aminoácidos 23 a 117 de la proteína CD3e de Macaca fascicularis de longitud completa, y de este modo comprende el dominio extracelular de CD3e de Macaca fascicularis o humana, que contiene un intercambio de alanina a valina en la posición de aminoácido 35 en comparación con la posición de aminoácido 57 de la secuencia de tipo salvaje.
La organización de los dominios de CD3e humana y de Macaca fascicularis es el siguiente (basado en la secuencia de Uniprot P07766 (humana) y la secuencia de Uniprot Q95LI5 (Macaca fascicularis)):
Figure imgf000009_0001
En consecuencia, el dominio extracelular de CD3e humana consiste en aminoácidos en las posiciones 23-126 de SEQ ID NO: 1, y el dominio extracelular de CD3e de Macaca fascicularisconsiste en aminoácidos en las posiciones 22-117 de SEQ ID NO: 2.
Los inventores han conseguido generar, cribar y seleccionar anticuerpos anti-CD3 de ratón y rata específicos. Estos anticuerpos anti-CD3 muestran una alta afinidad por la proteína CD3 tanto humana como de Macaca fascicularis y, sin embargo, tienen una baja activación de células T en ausencia de células diana.
Los inventores han determinado la secuencia de cadenas ligeras y pesadas variables de dichos anticuerpos monoclonales, los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “12D2-E5”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “18H11-F10”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “3G5-E10”, “9D7-F3”, “8C2-F7”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “6C9-C9”, “3E8-G1”, “3H6-D2” y “8H2”.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “20G6-F3” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTKAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKSNS YATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGVYYALSPFDYWGQGVM VTVSS (SEQ ID NO: 5, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSN RFSGFSDRFSGSGSGTDFTLKISRVDPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 9, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “4B4-D7” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGRLVQPGRSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKARSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQGVM VTVSS (SEQ ID NO: 12, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 14, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 15, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQRPGQSPQVLIYKVSN RFSGTSDRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 16, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “4E7-C9” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKSNN YATYYAESLKGRFTISRDDPKRSIYLQMNSLREEDTAIYYCRYVHYGIGYAMDAWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 18, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 20, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLEHNNGNTYLSWYLOKPGOSPQPLIYKVSN RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGPGTKLELK (SEQ ID NO: 21, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 22, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “18F5-H10” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTNAWMHWVRRSPEKOLEWVAQIKDKSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVHYRFAYALDAWGRGT SVSVSS (SEQ ID NO: 23, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 24, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 25, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVLMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHTNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSNR LSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 26, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 27, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “12D2-E5” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVKLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNFYAYWMGWVRQAPGKGLEWIGEIKKDGTTI NYTPSLKDRFTISRDNAQNTLYLQMTKLGSEDTALYYCAREERDGYFDYWGQGVMVTV SS (SEQ ID NO: 29, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 30, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 31, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 32, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia QFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRSTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRPDG VPDRFSGSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGIVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 33, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 34, una CDR2-L que consiste en la secuencia “RDD”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 35.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “11D7-C3” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQFVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTATYYCRGLYYGLSPSDYWGQGV MVTVSS (SEQ ID NO: 36, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 38, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSN RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 39; con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “11H3-E5” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTYYAYKPFDYWGQGV MVTVSS (SEQ ID NO: 40, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 41, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGQSPQVLIYKVSN RFSGTSDRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 42, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “13H2-C2” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EEELVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPDKQLEWVAQIKAKSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLKEEDTAIYYCRYVHYGLAPMDAWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 43, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 44, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKAGQSPQLLIYKVSN RFSGISDRFSGSGSGTDFILKISRVEPDDLGVFYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 45, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “13C1-F6” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGTLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKTSVYLQLNSLREEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGQGV MVTVSS (SEQ ID NO: 46, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 47, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQSPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQRSGQSPQLLIYKVSN RLSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRIEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTRLEIK (SEQ ID NO: 48, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “18H11 -F10” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSDYYMAWVRQAPKKGLEWVATISISGSRTY YPDSVKGRFTVSRDNAKSSLYLQMNSLKSEDTATYYCATNNPGGWFVYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 49, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 50, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 51, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 52, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia NIQMTQSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNINNDLAWYQQKLGEAPRLLIYNANSLQTGIPS RFSGSGSGADFTLTISSLQPEDVATYFCQQYSSGDTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 53, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 54, una CDR2-L que consiste en la secuencia “NAN”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 55.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “1E6-C9” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSYAWMHWVRQSPDKQLQWVAQIKAKSNN YATYYAESVEGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRGVYYGLLGLDAWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 56, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 57, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 58, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVRLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWFLQKPGQSPQLLIYKVSN RFSGISDRFSGSASGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 59, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “10F4-C10” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGSLVQPGKSLKITCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNNY ATYYAESVKGRFTISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRAVNYGNYPLDYWGQGVMV TVSS (SEQ ID NO: 60, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 61, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWCLQKPGQSPQLLIYKVSN RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 62, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “10E6-G6” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGGLVQSGKSLKLTCATSGFTVTNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNN YETYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGQGV MVTVSS (SEQ ID NO: 63, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 64, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 65, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 47, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTOSPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGYTYLSWYLQKPGQSPQVFIYKVSN
RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRIEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 66, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 67, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “18G9-H11 ” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGSLVOPGKSLKLTCATSGFTFSNAWIQWVROSPEKQLEWVAQIKAKSNNY ATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLOMNSLKEEDTALYYCTWRHYYSSHTMDAWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 68, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 69, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DWMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSN RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVAPTDLGVVYCGQGSQVPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 70, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 71.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “11F3-B9” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGSLVQPGKSLTLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVNYGLAPMDVWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 72, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 84, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWYLQKPGOSPQLLIYKVSN RFSGFSDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 73, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “12G3-E8” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVRWETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSLAWMHWVRQSPEKKLEWVAQIKDKANN YATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNRLKEEDTAIYYCRGVYYGFSMTPFDYWGQ GVMVTVSS (SEQ ID NO: 74, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 75, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7 6 , y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 77, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVAMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQVLIYKVSN RFSGISDRFSGSGSGADFTLKISRVEPDDLGVYYCGQSTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 78, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “5B1-G2” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFSFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKANN YATYYAESVKGRFTISRDDSKGSIYLQMNSLKEEDTAVYYCRGLYYGLFPSDYWGQGV MVTVSS (SEQ ID NO: 79, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 80, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 76, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 81, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTOTPVSLSVSLGGOVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLLKPGOSPOLLIYKVSNR FSGISDRFSGGGSGTDFTLKISRLEPDDLGIYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 82, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “16F8-A7” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia VETGGNLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNNYATY YAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVNYGLAPMDVWGQGTSVTV SS (SEQ ID NO: 83, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 84, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSN RFSGFSDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 85, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “11F9-F8” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGTLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKTSVYLQLNSLREEDTAIYYCRGTQYGYNPFDYWGQGV MVTVSS (SEQ ID NO: 46, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 47, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVLTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWSLQKPGQSPQVLIYKVSNR FSGISNRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGAHYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 87, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 88.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “3G5-E10” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVKLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFNFNVYWMGWVRQAPGKGLEWIGEIKKDSNSI NYTPSLKEKFTISRDNAQNTLYLQVNKLGSEDTAIYYCAREERDGYFDYWGQGVMVTVS S (SEQ ID NO: 89, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 90, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 91, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 32, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGV PDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGVSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 92, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 93, una CDR2-L que consiste en la secuencia “GAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 94.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “9D7-F3” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia AVQLVESGGGLVQPKESLKISCAASGFTFSNAAMYWVRQAPGKGLEWVARIRTKPNNY ATYYADSVTGRFIISRDDSRSMVYLQMDNLQTEDTAMYYCTALISTAMAAWGQGTSVT VSS (SEQ ID NO: 95, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 96, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 97, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 98, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPSFLSASVGDRVTINCKASQNINKYLNWYHQMLGEAPKLVISNTNNLQAGIPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCLQHRSGYTFGLGTKLELK (SEQ ID NO: 99, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 100, una CDR2-L que consiste en la secuencia “Nt N”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 101.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “8C2-F7” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QIQLVQSGPELKKPGESVKISCKASGYTFTDFAMNWVKQAPGNGLKWMGWINTQTGK PTYADGFKQRFVFSLETSASTIYLQINNLNIEDTATYFCTRGALASVGQGVLVTVSS (SEQ ID NO: 102, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 103, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 104, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 105, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGSHVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQPLIYKVSN RFSGISDRFSGSGSGTDFTLEINRVEPDDLGVYYCGQGAQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 106, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “20E5-F10” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGENLVQPGKSLRLTCATSGFSFSNAWMHWIRQSPEKQLEWVAQIKDKSNNY ATYYAESVNGRFTISRDDSKSSIYLHMQNLKEEDSAIYYCRYVHVGVRFFVTMDVWGOG TSVTVSS (SEQ ID NO: 107, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 80, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 108, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGDQVSISCRPSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPHPLIYKVSN RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 109, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “20B5-F10” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKAKSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSISSVYLQMNNLKEEDTAIYYCRGVYYGFLGMDAWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 110, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 111, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQRLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLVYKVSN RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTEYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 112, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 113, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 114.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “6C9-C9” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia AVQLVESGGGLVRPKESLKISCAASGFTFRNAAMYWVRQAPGKGLEWVARIRTQPNNY AKYYADSVKDRFTISRDDSKSMVYLQMDNLKTEDTAMYYCTGLVVTAMDAWGQGTSV TVSS (SEQ ID NO: 115, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 116, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 117, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 118, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPSFLSASVGDRVTINCKASQNINKYLNWYQQKLGEAPKLLIYVTNNLQTGIPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCLQHRSMYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 119, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ Id NO: 100, una CDR2-L que consiste en la secuencia “VTN”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 120.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “3E8-G1” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQVVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSNYYMDWVRQAPKKGLEWVATITASGSRI YYPDSVKGRFTISRDNAKSSLYLLMNSLKSEDTATYYCARERTDAYFDYWGQGVMVTV SS (SEQ ID NO: 121, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 122, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 123, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 124, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia QFILTQPNSVSTILGSTVKLSCKRSTGNIGTNYVSWYQHHEGRSPTTMIYRDDKRPDGV PDRFSGSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYISGLNPVFGGGSKLTVL (SEQ ID NO: 125, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 126, una CDR2-L que consiste en la secuencia “RDD”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 127.
El denominado anticuerpo anti-CD3 “3H6-D2” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVETGGRLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVAQIKDKSNN YATYYAESVKGRFTISRDDSKSIIYLQMNSLKEEDTAIYYCRALTYYGYKRDAMDGWGH GTSVTVSS (SEQ ID NO: 128, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 129, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSN RFSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 130, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11.
El anticuerpo anti-CD3 denominado “8H2” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QIQLVQSGPELKKPGESVKISCKASGYTFTDFAMNWVKQAPGNGLKWMGWINTQTGK
PTYADGFKQRFVFSLETSASTIYLQINNLNIEDTATYFCTRGALASVGQGVMVTVSS (SEQ ID NO: 131, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 103, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 104, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 105, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DWMTQTPVSLSVAIGQPASISCKSSQSLVGTSGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLD SGIPDRFSGSGSETDFTLKISRVETDDLGVYYCLQGSHFPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 132, con las CDRs mostradas en negrita y subrayadas) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 133, una CDR2-L que consiste en la secuencia “LVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 134.
En una realización, el anticuerpo anti-CD3 se une a CD3 humana. En otra realización, el anticuerpo anti-CD3 se une además a CD3 de Macaca fascicularis. En particular, el anticuerpo anti-CD3 se une al dominio extracelular de CD3 humana, o de CD3 tanto humana como de Macaca fascicularis. Más específicamente, el anticuerpo se une a CD3e. Más específicamente, el anticuerpo anti-CD3 se une al dominio extracelular humano y de Macaca fascicularis de CD3e. El anticuerpo anti-CD3 se une a CD3e cuando está presente en forma de un complejo, tal como un complejo CD3e/8, o cuando está presente como proteína única, indistintamente si se expresa en forma aislada, o está presente en un dominio extracelular soluble o CD3e anclada a la membrana de longitud completa, como está presente, por ejemplo, en células T.
El anticuerpo anti-CD3 es específico para la proteína CD3 humana de superficie, o para proteínas CD3 tanto humana como de Macaca fascicularis, en particular para CD3e.
En una realización, el anticuerpo anti-CD3 tiene una relación de afinidad por CD3 de Macaca fascicularis a afinidad por CD3 humana (KD(Macaca fascicularis)/KD(humana)) que es <10, en particular <6, <5, <4, <3, por ejemplo <2, <1 o <0,5. Tal polipéptido se puede usar en estudios toxicológicos realizados en monos El perfil de toxicidad observado en monos es relevante para anticipar posibles efectos adversos en seres humanos.
En particular, el anticuerpo anti-CD3 no se une a, o no reacciona significativamente de forma cruzada con la proteína o proteínas CD3g y/o CD38.
En particular, el anticuerpo no se une o no reacciona significativamente de forma cruzada con el dominio extracelular de la o las proteínas CD3g y/o CD38 humanas y de Macaca fascicularis mencionadas anteriormente.
La secuencia de la proteína CD38 humana de longitud completa está disponible en la base de datos Uniprot con el número de acceso P04234 (SEQ ID NO: 86, disponible el 14 de diciembre de 2014). El dominio extracelular de CD38 humana consiste en aminoácidos en las posiciones 22-105 de SEQ ID NO: 86.
La secuencia de la proteína CD3g humana de longitud completa está disponible en la base de datos Uniprot con el número de acceso P09693 (SEQ ID NO: 185, disponible el 14 de diciembre de 2014). El dominio extracelular de CD3g humana consiste en aminoácidos en las posiciones 23-116 de SEQ ID NO: 185.
Además, el anticuerpo anti-CD3 tiene afinidad (KD) por CD3 humana o CD3 de Macaca fascicularis, o por ambas, que es <90 nM, <50 nM o < 30nM, por ejemplo, < 20nM, < 10nM, < 8nM, < 6nM, < 4nM o < 2nM, por ejemplo, una afinidad de 0,1 nM a 10 nM, en particular de 0,1 nM a 8 nM, o de 0,1 nM a 4 nM.
La afinidad por CD3 humana o por CD3 de Macaca fascicularis se determina como el valor KD con resonancia de plasmones superficiales usando, como antígeno de captura, el complejo CD3e/8 recombinante soluble de ser humano y de Macaca fascicularis.
En un ejemplo, las afinidades de unión de un anticuerpo anti-CD3 se miden mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando, por ejemplo, un instrumento Biacore3000 (GE Healthcare). El amortiguador de ensayo es, por ejemplo, HBS-EP (BR-1001 -88, GE Healthcare). Como antígeno, se pueden usar, por ejemplo, los constructos del dominio extracelular de la subunidad CD3e humana y CD38 humana, incluyendo el péptido señal, en forma de proteínas de fusión Fc como se describe en los ejemplos. Alternativamente, se puede hacer uso, como antígeno, de los constructos del dominio extracelular de la subunidad CD3e de Macaca fascicularis y CD38 de Macaca fascicularis, incluyendo el péptido señal, en forma de proteínas de fusión de Fc como se describe en los ejemplos. La captura las proteínas de fusión Fc de CD3e/8 humana o de Macaca fascicularis se logra usando, por ejemplo, el kit de captura de anticuerpos humanos (GE Healthcare). Por ejemplo, el anticuerpo de captura se puede acoplar a chips CM5 (BR-1001 -88, GE Healthcare) hasta, por ejemplo, aprox. 12.000 RU usando, por ejemplo, el kit de acoplamiento de amina (BR-100-50, GE Healthcare). Las proteínas de fusión de CD3e/8-Fc se capturan a 10 ml/min hasta aprox. 70 RU para producir valores Rmax de 30 RU. La cinética de unión para un anticuerpo anti-CD3 puede medirse, por ejemplo, a 30 ml/min durante 240 s y 600 s para la fase de asociación y de disociación, respectivamente. Por ejemplo, pueden usarse diluciones al doble de un anticuerpo anti-CD3 de 3 a 400 nM en el amortiguador de ensayo. La regeneración de la superficie de captura se puede realizar con, por ejemplo, una inyección de 1 minuto de, por ejemplo, disolución 3 M de MgCl2 a 30 ml/min. Para el análisis de datos, por ejemplo, se puede usar el software de evaluación BIA v.4.1 (GE Healthcare). Los datos se pueden ajustar globalmente usando un modelo Langmuir 1:1 con transferencia de masa.
En una realización, el anticuerpo anti-CD3 también tiene una EC50 aparente como, por ejemplo, se determina mediante análisis de FACS en células T humanas, que es < 60 nM, por ejemplo < 50 nM, < 40 nM, < 30 nM, < 20 nM 0 < 15 nM. Normalmente, la EC50 aparente está dentro del intervalo de 1 a 60 nM, en particular 1 a 30 nM, por ejemplo 1 a 20 nM.
En una realización, el anticuerpo anti-CD3 tiene una activación de células T que es menor que 10%, menor que 8%, menor que 6%, menor que 4%, menor que 2%, menor que 1 %, por ejemplo menor que 0,5% en ausencia de células diana.
La expresión “activación de células T” se refiere aquí a desencadenar la señalización de CD3 que implica la fusión de gránulos citotóxicos, la liberación transitoria de citocinas, y la proliferación. La proteína de unión de tipo anticuerpo y el anticuerpo anti-CD3 de la invención se dirigen a CD3e y activan las células T en presencia de células diana; esta actividad también se conoce como “efecto de participación de las células T”. El efecto de participación de las células T induce citotoxicidad en la célula diana.
Como saben los expertos en la técnica, la activación de las células T induce la expresión de marcadores de superficie tales como CD69 y CD25. De este modo, la activación de las células T puede medirse detectando y midiendo la expresión de células T CD4+/CD25+, CD4+/CD69+, CD8+/CD25+, o CD8+/CD69+. Los expertos en la técnica conocen métodos para medir la activación de células T.
Un método para medir la activación de las células T se describe además en la sección de ejemplos (Ejemplo 3.3). En consecuencia, en el contexto de la invención, la activación de las células T se mide como el porcentaje de células que expresan CD69 en % del número total de células, o como el porcentaje de células que expresan CD4 y CD69 en % del número total de células, o como el porcentaje de células que expresan CD8 y CD69 en % del número total de células.
“Activación baja de células T”, en el contexto del anticuerpo anti-CD3 de la invención, se refiere a la activación de células T menor que 10%, menor que 8%, menor que 6%, menor que 4%, menor que 2%, menor que 1 %, por ejemplo menor que 0,5% en ausencia de células diana.
Se realizaron alineamientos de las secuencias de las regiones VH y VL de los anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “12D2-E5”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “18H11-F10”, “1E6-G9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “3G5-E10”, “9D7-F3”, “8C2-F7”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “6C9-C9”, “3E8-G1”, “3H6-D2” y “8H2”. La comparación de las secuencias de c Dr -H y CDR-L tiende a indicar que, estructuralmente, “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20E5-F10”, “20B5-F10” y “3H6-D2” están estrechamente relacionados, uniéndose dichos anticuerpos probablemente al mismo epítopo. La comparación de las secuencias de CDR-H y CDR-L de dichos anticuerpos relacionados se presenta en las Figuras 1 y 2, respectivamente. Se identificaron posiciones de CDR que se conservan estrictamente entre los anticuerpos, y que de este modo se supone que son importantes para la especificidad, mientras que otras posiciones podrían soportar la sustitución.
En consecuencia, el anticuerpo comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR1 -H que consiste en la secuencia GFX1X2X3X4AW (SEQ ID NO: 331) en la que X1 es T o S, X2 es F o V, X3 es S o T y X4 es N, K, L o Y, o cualquier combinación de los mismos; y
- una CDR2-H que consiste en la secuencia IKX1X2X3NX4YX5T (SEQ ID NO: 332) en la que X1 es A o D, X2 es K o R, X3 es S o A, X4 es N o S y X5 es A o E, o cualquier combinación de los mismos; y
- una CDR3-H que consiste en la secuencia TWRHYYSSHTMDA (SEQ ID NO: 69) o RALTYYGYKRDAMDG (SEQ ID NO: 129) o RX1X2X3YX4X5X6X7X8X9X10X11DX12 (SEQ ID NO: 333) en la que X1 es Y, G o A, X2 es V, T o L, X3 es H, N, Y o Q, X4 es G, R o A, X5 es F o V o ningún aminoácido, X6 es R o ningún aminoácido, X7 es F, S o I o ningún aminoácido, X8 es F, L, N, M, Y, S, A o G, X9 es Y, A, K, S, N, T, F o L, X10 es A, P, G o T, X11 es M, L, F o S y X12 es A, V o Y, o cualquier combinación de los mismos, y
- un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR1-L que consiste en la secuencia QX1LX2HX3NGX4TY (SEQ ID NO: 334) en la que X1 es R o S, X2 es V o E, X3 es N, D o T, y X4 es N o Y, o cualquier combinación de los mismos; y
- una CDR2-L que consiste en la secuencia “KVS”; y
- una CDR3-L que consiste en la secuencia GQGX1X2YPFT (SEQ ID NO: 335) en la que X1 es T, A o S y X2 es H, E o Q, o cualquier combinación de los mismos.
Según una realización, el anticuerpo anti-CD3 comprende las secuencias de CDR de las cadenas pesadas y/o ligeras de uno de los 28 denominados anticuerpos anti-cD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “12D2-E5”, “11D7C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “18H11-F10”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “3G5-E10”, “9D7-F3”, “8C2-F7”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “6C9-C9”, “3E8-G1”, “3H6-D2” y “8H2” enumerados anteriormente.
Por lo tanto, se describe un anticuerpo anti-CD3, que comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 6 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 7 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 8 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 142 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 142 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
b) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 14 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 14 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 15 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 15 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 184 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 184 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
c) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 19 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 20 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 20 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 22 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 22 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
d) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 24 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 24 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 19 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 25 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 25 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 27 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 27 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 28 en una sustitución de aminoácido; o
e) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 30 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 30 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 31 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 31 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 32 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 32 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 34 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 34 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “RDD” o una secuencia que difiere de la secuencia “RDD” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 35 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 35 en una sustitución de aminoácido; o
f) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 38 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 38 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 28 en una sustitución de aminoácido; o
g) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 41 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 41 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 17 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
h) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 44 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 44 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
i) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 47 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 47 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
j) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 50 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 50 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 51 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 51 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 52 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 52 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 54 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 54 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “NAN” o una secuencia que difiere de la secuencia “NAN” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 55 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 55 en una sustitución de aminoácido; o
k) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 57 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 57 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 58 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 58 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 28 en una sustitución de aminoácido; o
l) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 61 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 61 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
m) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 64 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 64 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 65 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 65 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 47 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 47 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 67 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 67 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 28 en una sustitución de aminoácido; o
n) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 69 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 69 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 71 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 71 en una sustitución de aminoácido; u
o) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 84 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 84 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 17 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
p) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 75 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 75 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 76 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 76 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 77 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 77 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
q) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 80 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 80 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 76 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 76 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 81 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 81 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
r) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 84 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 84 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
s) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 47 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 47 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 88 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 88 en una sustitución de aminoácido; o
t) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 90 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 90 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 91 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 91 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 32 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 32 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 93 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 93 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “GAS” o una secuencia que difiere de la secuencia “GAS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 94 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 94 en una sustitución de aminoácido; o
u) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 96 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 96 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 97 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 97 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 98 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 98 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 100 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 100 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “NTN” o una secuencia que difiere de la secuencia “NTN” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 101 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 101 en una sustitución de aminoácido; o
v) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 103 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 103 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 104 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 104 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 105 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 105 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
w) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 80 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 80 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 19 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 108 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 108 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
x) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 37 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 111 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 111 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 113 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 113 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 114 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 114 en una sustitución de aminoácido; o
y) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 116 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 116 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 117 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 117 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 118 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 118 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 100 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 100 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “VTN” o una secuencia que difiere de la secuencia “VTN” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 120 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 120 en una sustitución de aminoácido; o
z) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 122 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 122 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 123 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 123 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 124 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 124 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 126 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 126 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “RDD” o una secuencia que difiere de la secuencia “RDD” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 127 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 127 en una sustitución de aminoácido; o
aa) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 13 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 19 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 129 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 129 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 10 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “KVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “KVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 11 en una sustitución de aminoácido; o
bb) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 103 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 103 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 104 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 104 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 105 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 105 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 133 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 133 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “LVS” o una secuencia que difiere de la secuencia “LVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 134 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 134 en una sustitución de aminoácido.
Uno o más aminoácidos individuales se pueden alterar por sustitución, en particular por sustitución conservativa, en una o más de las secuencias de CDR anteriores. Tal alteración puede estar destinada, por ejemplo, a eliminar un sitio de glicosilación o un sitio de desamidación, en relación con la humanización del anticuerpo.
Basado en los alineamientos de las secuencias de las regiones VH y VL de los “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20E5-F10”, “20B5-F10” y “3H6-D2”, se identificaron diferentes sustituciones de aminoácidos. Por lo tanto, en una realización, se sustituye un aminoácido:
- en CDR1-H en una o más posiciones 3 a 6, por ejemplo, en la posición 3, 5 o 6 de CDR1-H de secuencia GFTFSNAW (SEQ ID NO: 13) o por ejemplo en la posición 4 y 5 de CDR1-H de secuencia GFTFSNAW (SEQ ID NO: 13); y/o
- en CDR2-H, en una o más posiciones 3 a 5, 7 y 9, por ejemplo, en las posiciones 3, 4, 5, 7 o 9 de CDR2-H de secuencia iKa KSNNYAT (SEQ ID NO: 37), o por ejemplo en las posiciones 3 y 5 o 3 y 7 de CDR2-H de secuencia IKAKSNNYAT (SEQ ID NO: 37); y/o
- en CDR3-H, en una o más posiciones 2 a 4, 7 a 10 y 12, por ejemplo en las posiciones 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 y 10 o en las posiciones 2, 4, 6, 8, 10 y 12 o en las posiciones 2, 3, 7 y 8 de CDR3-H de secuencia r Gv y Ya LSPFDY (SEQ ID No :8), o en la posición 7 y 8 de CDR3-H de secuencia r GlYYGLSPSDY (SEQ ID NO: 38), o en las posiciones 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 y 10 de CDR3-H de secuencia RGLYYGLSPSDY (SEQ ID NO: 38); y/o
- en CDR1-L, en una o más posiciones 2, 4, 6, y 9, por ejemplo en la posición 6 de CDR1-L de secuencia QSLVHDNGNTY (SEQ ID NO: 17) o QSLVHTNGNTY (SEQ ID NO: 27) o en la posición 2 de CDR1 -L de secuencia QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO: 10) o QRLVHNNGNTY (SEQ ID NO: 113) o en la posición 4, 6 y 9 de CDR1 -L de secuencia QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO: 10); y/o
- en CDR3-L, en una o más posiciones 4 y 5, por ejemplo en la posición 4 de CDR3-L de secuencia GQGSQYPFT (SEQ ID NO: 71) o GQGTQYPFT (SEQ ID NO: 11), o en la posición 4 y 5 de CDR3-L de secuencia GQGAHYPFT (SEQ ID NO: 88) o posición 5 de CDR3-L de secuencia GQGTHYPFT (SEQ ID NO: 28) o GQGTEYPFT (SEQ ID NO: 114).
El anticuerpo anti-CD3 es en particular un anticuerpo convencional, en particular un anticuerpo monoclonal convencional, o un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico.
El anticuerpo anti-CD3 en particular comprende o consiste en una IgG, o un fragmento de la misma.
También se describe un anticuerpo anti-CD3, que comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
b) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 14, CDR3-H de secuencia s Eq ID NO: 15 y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 184, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
c) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, CDR3-H de secuencia s Eq ID NO: 20 y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 22, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ iD NO: 11; o
d) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 24, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, CDR3-H de secuencia s Eq ID NO: 25 y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 27, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ iD NO: 28; o
e) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 30, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 31, CDR3-H de secuencia s Eq ID NO: 32 y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 34, CDR2-L de secuencia “RDD” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 35; o
f) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 38 y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ iD NO: 28; o
g) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia s Eq ID NO: 41 y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ iD NO: 11; o
h) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia s Eq ID NO: 44 y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ iD NO: 11; o
i) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 47 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
j) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 50, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 51, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 52 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 54, CDR2-L de secuencia “NAN” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 55; o
k) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 57, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 58 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28; o
l) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 61 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
m) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 64, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 65, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 47 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 67, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28; o
n) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 69 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 71; u
o) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 84 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
p) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 75, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 76, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 77 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
q) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 80, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 76, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 81 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
r) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 84 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
s) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 47 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 88; o
t) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 90, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 91, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 32 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 93, CDR2-L de secuencia “GAS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 94; o
u) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 96, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 97, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 98 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 100, CDR2-L de secuencia “NTN” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 101; o
v) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 103, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 104, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 105 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
w) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 80, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 108 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
x) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 37, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 111 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 113, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 114; o
y) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 116, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 117, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 118 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 100, CDR2-L de secuencia “VTN” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 120; o
z) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 122, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 123, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 124 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 126, CDR2-L de secuencia “RDD” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 127; o
aa) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 129 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
bb) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 103, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 104, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 105; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 133, CDR2-L de secuencia “LVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 134.
La descripción también proporciona un anticuerpo anti-CD3 que comprende al menos el dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera de uno de los denominados anticuerpos anti-CD enumerados anteriormente.
Así, se describe en particular un anticuerpo anti-CD3, que comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 5 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 9, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
b) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 12 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 16, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
c) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 18 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 21, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
d) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 23 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 26, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
e) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 29 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 33, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
f) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 36 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 39, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
g) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 40 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 42, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
h) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 43 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 45, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
i) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 46 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 48, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
j) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 49 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 53, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
k) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 56 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 59, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
l) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 60 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 62, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
m) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 63 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 66, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
n) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 68 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 70, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; u
o) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 72 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 73, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
p) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 74 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 78, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
q) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 79 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 82, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
r) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID NO: 83 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 85, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
s) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 46 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 87, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
t) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 89 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 92, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
u) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 95 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 99, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
v) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 102 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 106, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
w) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 107 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 109, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
x) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 110 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 112, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
y) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 115 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 119, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
z) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 121 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 125, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
aa) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 128 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 130, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
bb) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 131 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 132, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella.
Por ejemplo, la secuencia del dominio variable de la cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21, 23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132, según corresponda, mediante una o más sustituciones de aminoácidos, en particular mediante una o más sustituciones de aminoácidos conservativas y/o sustituciones con restos canónicos. En particular, la secuencia del dominio variable de la cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21,23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131, 132, mediante sustitución o sustituciones de aminoácidos conservativas, solamente.
Las alteraciones de secuencia en comparación con la secuencia SEQ ID NO: 5, 9, 12, 16, 18, 21,23, 26, 29, 33, 36, 39, 40, 42, 43, 45, 46, 48, 49, 53, 56, 59, 60, 62, 63, 66, 68, 70, 72, 73, 74, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 92, 95, 99, 102, 106, 107, 109, 110, 112, 115, 119, 121, 125, 128, 130, 131,132 estarán presentes en particular esencialmente en una o más de las regiones marco, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L y/o FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.
Sin embargo, también son posibles las sustituciones de aminoácidos en una o más CDRs. En particular, la secuencia del dominio variable de la cadena ligera puede diferir de la secuencia SEQ ID NO: 9 al menos por una sustitución de S a R en la posición 28 de SEQ ID NO: 9 (en CDR1 -L), y/o al menos por una sustitución de V a E en la posición 30 de SEQ ID NO: 9 (en CDR1-L), y/o al menos por una sustitución de N a D o T en la posición 33 de SeQ ID NO: 9 (en CDR1 -L), y/o al menos por una sustitución de N a Y en la posición 35 de la SEC ID NO: 9 (en CDR1 -L), y/o la secuencia del dominio variable de la cadena ligera puede diferir de la secuencia SEC ID NO: 9 al menos por una sustitución de T a S o A en la posición 97 de SEQ ID NO: 9 (en CDR3-L), y/o al menos por una sustitución de Q a H o E en la posición 98 de SEQ ID NO: 9 (en CDR3-L), y/o el dominio variable de la cadena pesada puede diferir de la secuencia SEQ ID NO: 5 al menos por una sustitución de T a N o S en la posición 28 de SEQ ID NO: 5 (en CDR1-H), y/o al menos por una Sustitución de F a V en la posición 29 de SEQ ID NO: 5 (en CDR1-H), o al menos por una sustitución de T a N o Y en la posición 30 de SEQ ID NO: 5 (en CDR1-H), o al menos por una sustitución de K a L o Y en la posición 31 de SEQ ID NO: 5 (en CDR1 -H), y/o el dominio variable de cadena pesada puede diferir de la secuencia SEQ ID NO: 5 al menos por una sustitución de D a A en la posición 53 de SEQ ID NO: 5 (en CDR2-H), o al menos por una sustitución de K a R en la posición 54 de SEQ ID NO: 5 (en CDR2-H), o al menos por una sustitución de S a A en la posición 55 de SEQ ID NO: 5 (en CDR2-H), o al menos por una sustitución de S a N en la posición 57 de SEQ ID NO: 5 (en CDR2-H), o al menos por una sustitución de A a E en la posición 59 de SEQ ID NO: 5 (en CDR2-H), y/o el dominio variable de la cadena pesada puede diferir de la secuencia SEQ ID NO: 5 al menos por una sustitución de G a A en la posición 100 de SEQ ID NO: 5 (en CDR3-H), y/o al menos por una sustitución de T a V en la posición 101 de SEQ ID NO: 5 (en CDR3-H), al menos por una sustitución de Q a Y en la posición 102 de SEQ ID n O: 5 (en CDR3-H).
En una realización, el anticuerpo anti-CD3 y un fragmento del mismo es, respectivamente, un anticuerpo de rata y un fragmento de un anticuerpo de rata.
En un aspecto de la invención, el anticuerpo anti-CD3 también puede ser un anticuerpo quimérico, y en particular un anticuerpo de rata/humano, por ejemplo un anticuerpo que comprende dominios variables de rata de cadenas ligeras y pesadas y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano.
En un aspecto adicional, el anticuerpo anti-CD3 también puede ser un anticuerpo humanizado o un fragmento de un anticuerpo humanizado obtenido, por ejemplo, por injerto de CDRs o por el método 4D (documento US20110027266).
Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo anti-CD3 es un anticuerpo humanizado que comprende
a) un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, o
b) un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 182.
Según una realización adicional, el anticuerpo anti-CD3 es un anticuerpo humanizado que comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 138 y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 143; o
b) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 171 y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 158; o
c) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 176 y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 164.
En una realización, el anticuerpo anti-CD3 comprende las tres secuencias de CDR o el dominio variable de la cadena pesada, o las seis secuencias de CDR o los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de uno de los denominados anticuerpos anti-CD3 enumerados anteriormente.
La invención se refiere además a un fragmento del anticuerpo anti-CD3 humanizado como se definió anteriormente. En una realización, el anticuerpo anti-CD3 humanizado descrito anteriormente es un anticuerpo quimérico.
El anticuerpo anti-CD3 también puede ser un anticuerpo de dominio único o un fragmento del mismo. En particular, un fragmento de anticuerpo de dominio único puede consistir en una cadena pesada variable (VHH) que comprende las CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H de uno de los anticuerpos descritos anteriormente. El anticuerpo anti-CD3 también puede ser un anticuerpo de cadena pesada, es decir, un anticuerpo desprovisto de cadena ligera, que puede contener o no un dominio CH1.
El anticuerpo de dominio único o un fragmento del mismo también puede comprender las regiones marco de un anticuerpo de dominio único de camélido, y opcionalmente el dominio constante de un anticuerpo de dominio único de camélido.
El anticuerpo anti-CD3 también puede ser un fragmento de anticuerpo, en particular un fragmento de anticuerpo humanizado, seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, y diacuerpos.
Por consiguiente, el anticuerpo anti-CD3 es un Fab que comprende, o consiste en
a) la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada SEQ ID NO: 186 y/o la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera SEQ ID NO: 187; o
b) la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada SEQ ID NO: 188 y/o la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera SEQ ID NO: 189; o
c) la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada SEQ ID NO: 190 y/o la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera SEQ ID NO: 191; o
d) la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada SEQ ID NO: 192 y/o la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera SEQ ID NO: 193.
En una realización, el anticuerpo CD3 es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico formado a partir de al menos un fragmento de anticuerpo o al menos un dominio variable de los anticuerpos anti-CD3 como se describe aquí. Los anticuerpos multiespecíficos son complejos de proteínas polivalentes como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 2050 764 A1 o US 2005/0003403 A1.
Los anticuerpos CD3 biespecíficos o multiespecíficos según la invención tienen especificidad para (a) el dominio extracelular de CD3 humana o de Macaca fascicularis, seleccionado como diana por uno de los anticuerpos anti-CD3 descritos anteriormente, y (b) al menos otro antígeno que es CD123. Por consiguiente, el anticuerpo biespecífico resultante es un anticuerpo biespecífico CD3/CD123. Los anticuerpos biespecíficos convencionales pueden producirse mediante técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos anti-CD3 según la invención pueden usarse en una forma aislada (por ejemplo, purificada) o contenido en un vector, tal como una membrana o vesícula lipídica (por ejemplo, un liposoma).
En una descripción adicional, el anticuerpo anti-CD3 se usa para la preparación de la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención definida adicionalmente en la sección “proteína de unión de tipo anticuerpo”.
Cualquier combinación de las realizaciones anteriores de la invención forma parte de la invención.
Anticuerpos anti CD123
“CD123” (Clúster de Diferenciación 123) también se conoce como “receptor de interleucina 3, alfa (IL3RA)” o “IL3R”, “IL3RX”, “IL3RY”, “IL3RAY”, “hIL-3Ra”, y denota una subunidad específica de interleucina 3 de un receptor de citocina heterodimérico. El receptor de interleucina 3 funcional es un heterodímero que comprende una cadena alfa específica (IL-3A; CD123) y la cadena beta del receptor de IL-3 (Pü; CD 131) que se comparte con los receptores para el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y la interleucina 5 (IL-5). CD123 es una proteína transmembrana integral de tipo I con un peso molecular deducido de alrededor de 43 kDa que contiene un dominio extracelular implicado en la unión de IL-3, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática corta de alrededor de 50 aminoácidos. El dominio extracelular se compone de dos regiones: una región N-terminal de alrededor de 100 aminoácidos, cuya secuencia muestra similitud con regiones equivalentes de las cadenas alfa del receptor de GM-CSF e IL-5; y una región próxima al dominio transmembrana que contiene cuatro restos de cisteína conservados y un motivo WSXWS, común a otros miembros de esta familia de receptores de citocinas. El dominio de unión de IL-3 comprende motivos del receptor de citocinas (CRMs) de alrededor de 200 de restos de aminoácidos formados por dos dominios de plegamiento de tipo Ig. El dominio extracelular de CD123 está altamente glicosilado, siendo necesaria la N-glicosilación tanto para la unión del ligando como para la señalización del receptor. La familia de proteínas reúne a tres miembros: IL3RA (CD123A), CSF2RA e IL5RA. La estructura general está bien conservada entre los tres miembros, pero las homologías de secuencia son muy bajas. Hasta ahora se ha descubierto una isoforma de CD123 de 300 aminoácidos de longitud, pero solo a nivel de ARN que es accesible en la base de datos Getentry con el número de acceso ACM24116.1.
La patente US n° 6.177.078 describe el anticuerpo monoclonal 7G3 anti-cadena alfa del receptor de IL-3 (IL-3Ra, CD123), y la capacidad de 7G3 para unirse al dominio N-terminal, específicamente los restos de aminoácidos 19-49, de IL-3Ra. La patente US n° 6.733.743 describe un método para dañar una célula progenitora de cáncer hematológico que expresa CD123 pero no expresa CD131 de manera significativa, al poner en contacto la célula con una composición de un anticuerpo y un agente citotóxico (seleccionado de un agente quimioterapéutico, una toxina o un radioisótopo emisor de alfa) por lo que la composición se une selectivamente a CD123 en una cantidad eficaz para provocar la muerte celular. Sin embargo, no ha quedado claro si la selección de CD123 puede afectar funcionalmente a las AML-LSCs.
Una secuencia de referencia de la proteína CD123 humana de longitud completa, incluyendo el péptido señal, está disponible en la base de datos del NCBI con el número de acceso NP_002174.1 y con el número de acceso de Uniprot P26951 y se describe aquí bajo la SEQ ID NO: 194 (disponible el 14 de diciembre de 2014). Una secuencia de referencia de la proteína CD123 de Macaca fascicularis de longitud completa, incluyendo el péptido señal, está disponible en la base de datos de GenBank con el número de acceso EHH61867.1 y con el número de acceso de Uniprot G8F3K3 y se describe aquí bajo la SEC ID NO: 195 (disponible el 14 de diciembre de 2014).
Una secuencia de una proteína de fusión Fc etiquetada con Strep-II de CD123 humana madura, clonada por los inventores a partir de ADN genómico, se describe bajo SEQ ID NO: 196. Dicha proteína de fusión Fc de CD123 humana madura comprende los aminoácidos 19 a 305 de la proteína CD123 humana de longitud completa, y de este modo comprende el dominio extracelular de CD123 humana.
Una secuencia de una proteína de fusión Fc etiquetada con Strep-II de CD123 de Macaca fascicularis madura, clonada por los inventores a partir de ADNc, se describe bajo SEC ID NO: 197. Dicha proteína de fusión Fc de CD123 de Macaca fascicularis madura comprende los aminoácidos 19 a 305 de la proteína CD123 de Macaca fascicularis de longitud completa, y de este modo comprende el dominio extracelular de CD123 de Macaca fascicularis.
La organización de los dominios de CD123 humana y de Macaca fascicularis es el siguiente (basado en la secuencia de CD123 humana accesible en la base de datos de NCBI bajo el acceso NP_002174.1 (SEQ ID NO: 194) y basado en la secuencia de CD123 de Macaca fascicularis accesible en la base de datos de Uniprot con el número de acceso G8F3K3, SEQ ID NO: 195):
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Por consiguiente, el dominio extracelular de CD123 humana consiste en aminoácidos en las posiciones 19 - 305 de SEQ ID NO: 194.
CD123 (la cadena alfa del receptor de interleucina-3, IL-3Ra) es un antígeno tumoral sobreexpresado en una variedad de neoplasias hematológicas. La mayoría de los blastos de AML expresan CD123 de superficie, y esta expresión no varía según el subtipo de AML. Se ha dado a conocer que una mayor expresión de CD123 en la AML en el momento del diagnóstico se asocia con un pronóstico más precario. La expresión de CD123 se ha dado a conocer en otras neoplasias hematológicas, incluyendo mielodisplasia, mastocitosis sistémica, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), ALL y leucemia de células pilosas.
CD123 se expresa en células madre leucémicas de AML, y las evidencias crecientes sugieren que la AML surge de estas LSCs, que se ha demostrado que son inactivas y relativamente resistentes a la quimioterapia que daña el ADN. Se plantea la hipótesis de que la persistencia de las LSCs apuntala la recaída después de la remisión inicial, y de este modo la erradicación de las LSCs puede considerarse un requisito para la curación, y un objetivo terapéutico importante.
“Células madre leucémicas (LSCs)” son células cancerosas que poseen características asociadas con las células madre normales, es decir, la propiedad de autorrenovación y la capacidad de desarrollar múltiples linajes. Se propone que tales células persistan en cánceres hematológicos tal como AML como poblaciones distintas. Las LSCs presentes en pacientes con AML se denominan “AML-LSCs”.
“Leucemia mielógena aguda (AML)” es un trastorno clonal que se presenta clínicamente como un aumento de la proliferación de blastos mieloides heterogéneos e indiferenciados. La jerarquía leucémica se mantiene mediante una pequeña población de LSCs (AML-LSCs), que tienen la capacidad distintiva de autorrenovación, y pueden diferenciarse en progenitores leucémicos. Estos progenitores generan un gran número de blastos leucémicos fácilmente detectables en los pacientes en el momento del diagnóstico y la recaída, lo que conduce en última instancia a la mortalidad. Las AML-LSCs se han descrito comúnmente como células inactivas, en contraste con los progenitores clonogénicos de división rápida. Esta propiedad de las AML-LSCs hace menos eficaces a las sustancias quimioterapéuticas convencionales que se dirigen contra células en proliferación, lo que podría explicar la experiencia actual en la que una alta proporción de pacientes con AML entran en remisión completa, pero casi invariablemente recaen, sobreviviendo <30% de los adultos durante más de 4 años. Además, la aparición de enfermedad residual mínima y la mala supervivencia se han atribuido a una alta frecuencia de LSC en el diagnóstico en pacientes con AML.
En consecuencia, es imperativo para el manejo a largo plazo de la AML (y de manera similar, otras afecciones de cáncer hematológico mencionadas anteriormente) que se desarrollen nuevos tratamientos para eliminar específicamente las LSCs.
Se ha dado a conocer sobreexpresión de CD123 en blastos de AML y en AML-LSCs CD34+/CD38 con respecto a células hematopoyéticas normales.
De este modo, CD123 proporciona una diana terapéutica importante para la terapia del cáncer, en particular para la terapia del cáncer en pacientes con mal pronóstico.
Los inventores han tenido éxito en generar, cribar y seleccionar anticuerpos anti-CD123 de ratón y rata específicos que muestran una alta afinidad por la proteína CD123 tanto humana como de Macaca fascicularis, y que no tienen una reacción cruzada significativa con las proteínas CSF2RA e IL5RA humanas, y con proteínas CD3 de Macaca fascicularis.
Los inventores han determinado la secuencia de cadenas ligeras y pesadas variables de dichos anticuerpos monoclonales, los denominados anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, y “9F6-G3”.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “3E3-D3” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVROPPGKGLEWMGRIQNGGIT DYNSALKSRLIISRDTSKSQVFLKMNSVQTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 226, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 227, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 228, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 229, o
un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVRQPPGKGLEWMGRIQNAGIT DYNSALKSRLIISRDTSKSQVFLKMNSVQTEPTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 277, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 227, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO:353, y una c Dr 3-H de secuencia SEQ ID NO: 229, o
un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVRQPPGKGLEWMGRIQDGGIT DYNSALKSRLIISRDTSKSQVFLKMNSVQTEDTAMYFCAKTGSYFYAFDHWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 278, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 227, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 279, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 229, y un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia QFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRNTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRPD GVPDRFSGSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGINIIFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 230, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 231, una CDR2-L que consiste en la secuencia “RDD”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 232.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “1E1-G5” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKAFGYTFTDHIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSGGT NYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSEDSAICYCALNYGSYYAMDAWGQGTSV TVSS (SEQ ID NO: 198, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 199, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 200, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201 y
un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia d iq m t q s p a s l s a s l g q t v t ie c r p s e d jy s n l a w f q q k p g s s p q l l iy d a n n l a d g v p
SRFSGSGSGTOYSLKINSLOSEDVASYFCQQYNKYPYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 202, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 203, una CDR2-L que consiste en la secuencia “DAN”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 204.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “2B8-F3” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSDYNMAWVRQAPKKGLEWVATILYDGG RTYYRGSVKGRFTISRDNAKSTLYLRMDSLRSEDTATYYCATHSRGTDYFDYWGQGV MVTVSS (SEQ ID NO: 205, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 206, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 207, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 208 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia EIVLTQSPTSMTASPGEQVTITCRASSSINYMHWYQQKPGASPRPWIYETSKLASGVP
DRFSGSASGTSYSLTINNMEAEDAATYYCQQWNYPSWTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: 209, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 210, una CDR2-L que consiste en la secuencia “ETS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 211.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “2F8-D6” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia OVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKGLEWIATISSAGSTY YDLVLKSRLSITRDTSKSQVFLKVHSLQTEDTAIYLCARDAPVFNYGSYNAMDSWGQG TSVTVSS (SEQ ID NO: 212, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 213, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 214, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 215 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPSFLSATVGDRVTINCKASQNINKYLNWYQQKLGEAPKRLIYNTNSLQTGIP SRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCLQHKSGLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 216, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 217, una CDR2-L que consiste en la secuencia “NTN”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO:218.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “3B10-E6” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQQSGPELRRPGSSVRLSCKASGYRIKDFLIHWIKNRPEHGLEWIGWIDPEDGET KYAQKFQTKATLTADTSSNTAYMOLSSLTSEDTATYFCARWGDVYYGLMRGHVMDA WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 219, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 220, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 221, y una c Dr 3-H de secuencia SEQ ID NO: 222 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DVLMTQTPVSLPVSLGGQVSISCRSSQSLVHSDGDTYLHWYLQKPGOSPOLLIYRVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPEDLGLYYCLQTTHFPPWTFGGGTKLEMK (SEQ ID NO: 223, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 224, una CDR2-L que consiste en la secuencia “RVS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 225.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “5A5-B4” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QIQIVQSGSDVTSTCNGCGTCYFSGFSLSTTGICVSWIRQPSGKGQEWLADFCWDDG KGYNPSLKNRLSISKDTSNNQVFLKITSVDTADTATYYCARRRVYYGIYFDYWGQGVM VTVSS (SEQ ID NO: 233, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 234, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 235, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 236 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIVMTQSPALAVSPGERVSISCRASNSVSTRMHWYQQKPGQQPKLLIYGASNLESGVP ARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDIATYFCQQSWNDPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 237, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 238, una CDR2-L que consiste en la secuencia “GAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 239.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “6B10-E4” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSHYNMAWVRQAPKKGLEWVATITYDDHS TYYRDSVKGRFTISRDTAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCARLVNYAFAYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 240, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 241, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 242, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 243 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia NIVMTOSPKSMSISVGDRVTMNCKASQTVGNNIAWYQQKPGLSPQLLIDYASNRYTGV PNRFTGGGYGTDFILTINSVQAEDAAFYYCQRMYNSPTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: 244, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 245, una CDR2-L que consiste en la secuencia “YAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 246.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “6C10-C4” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVKLQESGPSLVQPSETLSLTCTVSGFSLTSYSVHWVRQHSGKSLEWMGRMWNDGD TSYNSAFTSRLSISRDTSKGQVFLKMNSLQTEDTGTYYCARGHRTPFDYWGQGVMVT VSS (SEQ ID NO: 247, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 248, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 249, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 250 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIVMTQSPSSLAVSAGETVTINCKSSQSFLSSGDERNYVAWYQHKPGQSPKLLIYWAS TRHSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQQYYDTPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 251, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 252, una CDR2-L que consiste en la secuencia “WAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 253.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “6D6-B8” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKASAYTFTDNIIHWVKQSHGKSLDWIGYINPYSGGT NYNGWFRSKATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSDDSAIYYCALNYGSYYAMDAWGQGTS VTVSS (SEQ ID NO: 254, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 255, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 200, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPASLSASLGETVTIDCRPSEDIFNNLAWYQQKPGNSPQLLIYDANSLADGVP SRFSGSGSGTaYSLMIIRLQSEDVASYFCHQYNIYPYTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 256, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 257, una CDR2-L que consiste en la secuencia “DAN”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 258.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “8B11-B7” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQESGPTLVNPGDSVKMSCKASGYTFTDHIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSGGA NYNGKFKSKATLTIDKSSSTAYMEFSRLTSGDSAIYYCALNYGSYYAMDAWGQGTSVT VSS (SEQ ID NO: 259, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 199, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 260, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRTSKDIYSNLAWFQQEPGNSPQLLIYDASNLADGVP SRFSGSGSGTQYSLQINNLQSEDVASYFCHQYNNYPYTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 261, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 262, una CDR2-L que consiste en la secuencia “DAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 263.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “9B8-G6” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVKLQESGPSLVQSSQTLSLTCTVSGFSLTSYHIHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDGD TSYSSALKSRLSISRDTSQSQVFLKMNSLQTEDTATYYCARGDYSSYIYLWFAYWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 264, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 265, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 266, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 267 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIVMTQSPSSLAVSAGETVTINCKSSQSFLSSGDERNYVAWYQHKPGQSPKLLIYWAS TRHSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQQYYDTPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 251, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 252, una CDR2-L que consiste en la secuencia “WAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 253.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “9D7-C8” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVKLQESGPSLVQSSQTLSLTCTVSGFSLTSYHIHWVRQTPGKGLEWMGVMWSDGD TSYNSALKSRLSISRDTSQSQVFLKMNSLQTEDTATYYCARGYYSSYLYLWFAYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 268, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 265, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 266, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 269 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIVMTQSPSSLAVSEGETVTINCKSSQSFLSSGDGKNYVAWYQYKPGOSPKLLIYWAS TRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISTVQAEDLAIYYCQQYYDTPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 270, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 271, una CDR2-L que consiste en la secuencia “WAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 253.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “9F6-G3” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia QVQLQESGPTLVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPYSDGT NYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMEFSRLTSEDSAIYFCALNYGSYYAMDAWGQGTSV TVSS (SEQ ID NO: 272, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 273, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 274, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRPSEDIHSNVAWYQQKPGNSPQLLIYDASNLADGVP SRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCHQYNIYPYTFGSGTKLELK (SEQ ID NO: 275, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 276, una CDR2-L que consiste en la secuencia “DAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 258.
En un aspecto, el anticuerpo anti-CD123 se une a CD123 humana. En otra realización, el anticuerpo anti-CD123 se une además a CD123 de Macaca fascicularis. En particular, el anticuerpo anti-CD123 se une al dominio extracelular de CD123 humana, o de CD123 tanto humana como de Macaca fascicularis. Más específicamente, el anticuerpo anti-CD123 se une al resto distal de CD123, por ejemplo, a los aminoácidos en la posición 19 a 49 de CD123 humana de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 194. El anticuerpo anti-CD123 se une a CD123, indistintamente si se expresa en forma aislada, o si está presente en un dominio extracelular soluble o CD123 anclada a la membrana de longitud completa como está presente en células que expresan CD123 tales como células AML o células transfectadas con CD123. El anticuerpo anti-CD123 es específico de células que expresan proteínas CD123 humana y de Macaca fascicularis en su superficie, por ejemplo, células cancerosas que expresan CD123.
El anticuerpo anti-CD123 tiene una relación de afinidad por CD123 de Macaca fascicularis sobre la afinidad por CD123 humana (KD (Macaca fascicularis)/KD (humana) que es S10, en particular <6, <5, <4, <3, <2, <1 o <0,5. De este modo, el polipéptido puede usarse en estudios toxicológicos realizados en monos, con el perfil de toxicidad observado en monos relevante para anticipar posibles efectos adversos en seres humanos.
En particular, el anticuerpo anti-CD123 no se une a las proteínas CSF2RA e IL5RA, o no reacciona de forma cruzada de forma significativa con ellas.
En particular, el anticuerpo no se une o no reacciona significativamente de forma cruzada con el dominio extracelular de las proteínas CSF2RA e IL5RA humanas y de Macaca fascicularis mencionadas anteriormente.
Además, el anticuerpo anti-CD123 tiene afinidad (KD) por CD123 humana o CD123 de Macaca fascicularis, o por ambas, de < 50nM, < 40nM, < 30 nM, por ejemplo < 20 nM, < 15 nM, < 10 nM, s 8 nM, < 6 nM, < 4 nM, <2 nM, < 1 nM o < 0,5 nM, por ejemplo una afinidad de 0,1 nM a 20 nM, por ejemplo 0,1 nM a 10 nM, en particular de 0,1 nM a 2 nM, o de 0,1 nM a 1 nM.
En un ejemplo, la afinidad por CD3 humana o por CD3 de Macaca fascicularis se determina como el valor KD con resonancia de plasmones superficiales usando como antígeno de captura proteína CD123 recombinante de ser humano y de Macaca fascicularis, por ejemplo, con proteína de fusión Fc de CD123 humana y de Macaca fascicularis.
Como antígeno puede usarse, por ejemplo, el dominio extracelular de CD123 humana o de Macaca fascicularis, incluyendo la secuencia señal correspondiente a la secuencia de aminoácidos desde la posición M1 a R305 de la proteína de tipo salvaje (SEQ ID NO: 194 (humana), SEQ ID NO: 195 (Macaca fascicularis)). La secuencia de aminoácidos resultante para la proteína madura CD123 humana o de Macaca fascicularis se enumera como SEQ ID NO: 196 y SEQ ID NO: 197, respectivamente. Las medidas de Biacore son conocidas por los expertos en la técnica. En el presente ejemplo, la medida de Biacore puede realizarse como se describe en la sección “anticuerpos anti CD3” anterior.
El anticuerpo anti-CD123 también puede tener una constante de afinidad aparente (KD aparente), como se determina, por ejemplo, mediante análisis FACS en células que expresan CD123 tales como células HEK293 transfectadas con CD123 usando anticuerpo anti-CD123 no purificado en sobrenadante de hibridoma, que es < 20 nM, por ejemplo < 15 nM, < 10 nM, < 6 nM, < 5 nM, < 4 nM, < 3 nM, < 2 nM o < 1 nM. Normalmente, la KD aparente está dentro del intervalo 0,1 a 20 nM, en particular 0,1 a 10 nM, por ejemplo 0,1 a 5 nM.
Alineamientos de las secuencias de las regiones VH y VL de los denominados anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1 E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3”. La comparación de las secuencias de CDR-H y CDR-L tiende a indicar que, estructuralmente, los anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7” y “9F6-G3”, por un lado, y Los anticuerpos anti-CD123 “6C10-C4”, 9B8-G6”, “9D7-C8”, por otro lado, están estrechamente relacionados, uniéndose dichos anticuerpos probablemente al mismo epítopo. El alineamiento de los denominado anticuerpos anti-CD123 1E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7” y “9F6-G3” y los anticuerpos anti-CD123 “6C10-C4”, 9B8-G6”, “9D7-C8” se muestran en las figuras 3 y 4, respectivamente. La comparación de las secuencias de CDR-H y CDR-L identifica además las posiciones de las CDRs que están estrictamente conservadas entre los dos grupos de anticuerpos y que, por lo tanto, se supone que son importantes para la especificidad, mientras que otras posiciones podrían soportar la sustitución.
En consecuencia, el anticuerpo comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR1 -H que consiste en la secuencia X1YTFTDX2 I (SEQ ID NO: 336) en la que X1 es G o A y X2 es H, Y o N, o cualquier combinación de los mismos; y
una CDR2-H que consiste en la secuencia INPYSX1GX2 (SEQ ID NO: 337) en la que Xi es G o D y X2 es T o A, o cualquier combinación de los mismos; y
una CDR3-H que consiste en la secuencia ALNYGSYYAMDA (SEQ ID NO 201), y
un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR1-L que consiste en la secuencia X1DIX2X3N (SEQ ID NO: 338) en la que X1 es E o K, X2 es F, H o Y y X3 es N o S, o cualquier combinación de los mismos; y
una CDR2-L que consiste en la secuencia “DAN” o “DAS”; y
una CDR3-L que consiste en la secuencia X1QYNX2YPYT (SEQ ID NO: 339) en la que X1 es H o Q y X2 es I, K o N, o cualquier combinación de los mismos; o
b) un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR1 -H que consiste en la secuencia GFSLTSYX1 (SEQ ID NO: 340) en la que X1 es H o S; y
una CDR2-H que consiste en la secuencia MWX1DGDT (SEQ ID NO: 341) en la que X1 es S o N; y
una CDR3-H que consiste en la secuencia ARGX1X2X3X4X5X6X7X8X9 FX10Y (SEQ ID NO: 342) en la que X1 es D, Y o H, X2 es Y o R, X3 es S o T, X4 es S o P, X5 es Y o sin aminoácido, X6 es L, I o sin aminoácido, X7 es Y o sin aminoácido, X8 es L o sin aminoácido, X9 es W o sin aminoácido, X10 es A o D, o cualquier combinación de los mismos, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR1-L que consiste en la secuencia QSFLSSGDX1X2NY (SEQ ID NO: 343) en la que X1 es E o G y X2 es R o K, o cualquier combinación de los mismos; y
una CDR2-L que consiste en la secuencia “WAS”; y
una CDR3-L que consiste en la secuencia QQYYDTPLT (SEQ ID NO: 253).
Según una realización, el anticuerpo anti-CD123 comprende las secuencias de CDR de las cadenas pesada y/o ligera de uno de los 13 denominados anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, y “9F6-G3” enumerados anteriormente.
Por lo tanto, se describe un anticuerpo anti-CD123, que comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 227 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 227 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 228 o SEQ ID NO: 353 o SEQ ID NO: 279 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 228 o SEQ ID NO: 353 o SEQ ID NO: 279 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 229 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 229 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 231 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 231 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “RDD” o una secuencia que difiere de “RDD” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 232 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 232 en una sustitución de aminoácido; o
b) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 199 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 199 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 200 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 200 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 201 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 203 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 203 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “DAN” o una secuencia que difiere de “DAN” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 204 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 204 en una sustitución de aminoácido; o
c) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 206 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 206 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 207 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 207 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 208 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 208 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 210 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 210 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “ETS” o una secuencia que difiere de “ETS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 211 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 211 en una sustitución de aminoácido; o
d) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 213 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 213 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 214 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 214 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 215 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 215 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 217 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 217 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “NTN” o una secuencia que difiere de “NTN” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 218 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 218 en una sustitución de aminoácido; o
e) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 220 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 220 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 221 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 221 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 222 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 222 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 224 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 224 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “RVS” o una secuencia que difiere de “RVS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 225 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 225 en una sustitución de aminoácido; o
f) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 234 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 234 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 235 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 235 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 236 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 236 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 238 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 238 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “GAS” o una secuencia que difiere de “GAS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 239 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 239 en una sustitución de aminoácido; o
g) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 241 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 241 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 242 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 242 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 243 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 243 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 245 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 245 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “YAS” o una secuencia que difiere de “YAS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 246 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 246 en una sustitución de aminoácido; o
h) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 248 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 248 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 249 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 249 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 250 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 250 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 252 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 252 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “WAS” o una secuencia que difiere de “WAS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 253 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 253 en una sustitución de aminoácido; o
i) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 255 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 255 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 200 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 200 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 201 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 257 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 257 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “DAN” o una secuencia que difiere de “DAN” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 258 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 258 en una sustitución de aminoácido; o
j) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 199 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 199 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 260 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 260 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 201 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 262 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 262 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “DAS” o una secuencia que difiere de “DAS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 263 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 263 en una sustitución de aminoácido; o
k) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 265 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 265 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 266 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 266 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 267 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 267 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 252 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 252 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “WAS” o una secuencia que difiere de “WAS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 253 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 253 en una sustitución de aminoácido; o
l) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 265 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 265 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 266 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 266 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 269 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 269 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 271 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 271 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “WAS” o una secuencia que difiere de “WAS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 253 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 253 en una sustitución de aminoácido; o
m) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 273 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 273 en una sustitución de aminoácido; CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 274 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 274 en una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 201 en una sustitución de aminoácido; y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 276 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 276 en una sustitución de aminoácido; CDR2-L de secuencia “DAS” o una secuencia que difiere de “DAS” en una sustitución de aminoácido y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 258 o una secuencia que difiere de SEQ ID NO: 258 en una sustitución de aminoácido.
Uno o más aminoácidos individuales se pueden alterar por sustitución, en particular por sustitución conservativa, en una o más de las secuencias de CDR anteriores. Tal alteración puede estar destinada, por ejemplo, a eliminar un sitio de glicosilación o un sitio de desamidación, en relación con la humanización del anticuerpo.
En base a los alineamientos de las secuencias de las regiones VH y VL de los anticuerpos anti-CD123 “1 E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9F6-G3”, se identificaron diferentes sustituciones de aminoácidos. Por lo tanto, en una realización, se puede sustituir un aminoácido:
- en CDR1-H en una o más posiciones 1 y 7, por ejemplo, en la posición 7 de CDR1-H de secuencia GYTFTDHI (SEQ ID NO:199) o GYTFTDYI (SEQ iD n O:273) por ejemplo en la posición 1 y 5 de CDR1-H de secuencia AYTFTDNI (SEQ ID NO: 255); y/o
- en CDR2-H, en una o más posiciones 6 y 8, por ejemplo, en las posiciones 6 y/o 8 de CDR2-H de secuencia INPYSGGT (SEQ ID NO: 200) o INPYSDGT (SEQ ID NO: 274) o INPYSGGA (SEQ ID NO: 260); y/o
- en CDR1 -L, en una o más posiciones 1, 4 y 5, por ejemplo, en la posición 1 o 1, 4 y 5 de CDR1 -L de secuencia KDIYSN (SEQ ID NO: 262) o EDIFNN (SEQ ID NO: 257); y/o
- en CDR2-L, en las posiciones 3 de secuencia “DAN” o “DAS”; y/o
- en CDR3-L, en una o más posiciones 1 y 5, por ejemplo, en la posición 1 y/o 5 de CDR3-L de secuencia HQYNIYPYT (SEQ ID NO: 258) o QQYNKYPYT (SEQ ID NO: 204) o HQYNNYPYT (SEQ ID NO: 263).
En una realización adicional, se sustituye un aminoácido:
- en CDR1-H en la posición 8, por ejemplo, en la posición 8 de CDR1-H de secuencia GFSLTSYH (SEQ ID NO:
265) o GFSLTSYS (SEQ ID NO: 248); y/o
- en CDR2-H en las posiciones 3, por ejemplo, en las posiciones 3 de CDR2-H de secuencia MWSDGD (SEQ ID NO: 265) o MWNDGD (SEQ ID NO: 248); y/o
- en CDR3-H en las posiciones 4 y 9, por ejemplo en las posiciones 4 y 9 de CDR3-H de secuencia ARGDYSSYIYLWFAY (SEQ ID NO: 267) o ARGYYSSYLYLWFAY(SEQ ID NO: 269); y/o
- en CDR1-L, en una o más posiciones 9 y 10, por ejemplo, en la posición 9 y 10 de CDR1-L de secuencia QSFLSSGDERNY (SEQ ID NO: 252) o QSFLSSGDGKNY (SEQ ID NO: 271).
Según una realización, el anticuerpo comprende
a) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 227, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 279, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 229, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 231, CDR2-L de secuencia “RDD” y CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 232; o
n) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 199, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 200, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 203, CDR2-L de secuencia “DAN” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 204; u
o) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 206, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 207, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 208, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 210, CDR2-L de secuencia “ETS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 211; o
p) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 213, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 214, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 215, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 217, CDR2-L de secuencia “NTN” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 218; o
q) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 220, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 221, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 222, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 224, CDR2-L de secuencia “RVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 225; o
r) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 234, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 235, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 236, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 238, CDR2-L de secuencia “GAS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 239; o
s) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 241, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 242, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 243, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 245, CDR2-L de secuencia “YAS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 246; o
t) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 248, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 249, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 250, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 252, CDR2-L de secuencia “WAS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 253; o
u) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 255, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 200, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 257, CDR2-L de secuencia “DAN” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 258; o
v) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 199, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 260, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 262, CDR2-L de secuencia “DAS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 263; o
w) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 265, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 266, CDR3-H de secuencia SeQ ID NO: 267, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 252, CDR2-L de secuencia “WAS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 253; o
x) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 265, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 266, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 269, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 271, CDR2-L de secuencia “WAS" y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 253; o
y) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 273, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 274, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 201, y
un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 276, CDR2-L de secuencia “DAS" y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 258.
El anticuerpo anti-CD123 es en particular un anticuerpo convencional, en particular un anticuerpo monoclonal convencional, o un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico.
El anticuerpo anti-CD123 en particular comprende o consiste en una IgG, o un fragmento de la misma.
La descripción también proporciona un anticuerpo anti-CD123 como se define anteriormente, que comprende además al menos el dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera de uno de los denominados anticuerpos anti-CD123 enumerados anteriormente.
De este modo, se describe en particular un anticuerpo anti-CD123, que comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 226 o SEQ ID NO: 277 o SEQ ID NO: 278 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 230, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
b) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 198 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 202, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
c) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 205 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 209, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
d) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 212 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 216, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
e) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 219 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 223, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
f) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 233 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 237, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
g) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 240 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 244, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
h) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 247 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 251, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
i) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 254 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 256, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
j) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 259 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 261, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
k) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 264 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 251, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
l) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 268 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 270, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
m) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 272 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 275, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella.
Por ejemplo, la secuencia del dominio variable de cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEQ ID NO: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251,254, 256, 259, 261, 264, 251, 268, 270, 272 o 275, según corresponda, por una o más sustituciones de aminoácidos, en particular por una o más sustituciones de aminoácidos conservativas y/o sustituciones con restos canónicos. En particular, la secuencia del dominio variable de la cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEQ ID NO: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251, 254, 256, 259, 261, 264, 251,268, 270, 272 o 275 por sustitución o sustituciones de aminoácidos conservativas, solamente.
Las alteraciones de secuencia en comparación con la secuencia SEQ ID NO: 226, 277, 278, 230, 198, 202, 205, 209, 212, 216, 219, 223, 233, 237, 240, 244, 247, 251,254, 256, 259, 261,264, 251,268, 270, 272 o 275 estarán presentes en particular esencialmente en una o más de las regiones marco, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L y/o FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.
En una realización, el anticuerpo anti-CD123 y un fragmento del mismo es, respectivamente, un anticuerpo de rata y un fragmento de un anticuerpo de rata.
El anticuerpo anti-CD123 también puede ser un anticuerpo quimérico, y en particular un anticuerpo de rata/humano, por ejemplo un anticuerpo que comprende dominios variables de rata de cadenas ligeras y pesadas y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano. El polipéptido puede ser un fragmento de dicho anticuerpo. El anticuerpo anti-CD123 también puede ser un anticuerpo humanizado o un fragmento de un anticuerpo humanizado obtenido por injerto de CDR o por el método 4D (documento US20110027266).
Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo anti-CD123 es un anticuerpo humanizado que comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 301 y SEQ ID NO: 302; y
b) un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304 y SEQ ID NO: 305.
En una realización, el anticuerpo anti-CD123 comprende las tres secuencias de CDR o el dominio variable de la cadena pesada, o las seis secuencias de CDR o los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de uno de los denominados anticuerpos anti-CD123 enumerados anteriormente.
La descripción se refiere además a un fragmento del anticuerpo anti-CD123 humanizado como se definió anteriormente. En una realización, el anticuerpo anti-CD123 humanizado descrito anteriormente es un anticuerpo quimérico.
El anticuerpo anti-CD123 también puede ser un anticuerpo de dominio único o un fragmento del mismo. En particular, un fragmento de anticuerpo de dominio único puede consistir en una cadena pesada variable (VHH) que comprende las CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H de uno de los anticuerpos descritos anteriormente. El anticuerpo CD123 también puede ser un anticuerpo de cadena pesada, es decir, un anticuerpo desprovisto de cadena ligera, que puede contener o no un dominio CH1.
El anticuerpo de dominio único o un fragmento del mismo también puede comprender las regiones marco de un anticuerpo de dominio único de camélido y, opcionalmente, el dominio constante de un anticuerpo de dominio único de camélido.
El anticuerpo anti-CD123 también puede ser un fragmento de anticuerpo, en particular un fragmento de anticuerpo humanizado, seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, y diacuerpos.
El anticuerpo CD123 también puede ser un anticuerpo biespecífico o multiespecífico formado a partir de al menos un fragmento de anticuerpo o al menos un dominio variable del anticuerpo anti-CD123 de la invención. Los anticuerpos multiespecíficos son complejos de proteínas polivalentes como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 2050 764 A1 o US 2005/0003403 A1.
Los anticuerpos CD123 biespecíficos o multiespecíficos pueden tener especificidad para (a) el dominio extracelular de CD123 humana o de Macaca fascicularis seleccionado como diana por uno de los anticuerpos anti-CD123 descritos anteriormente, y (b) al menos otro antígeno.
Según la invención, el otro antígeno es CD3 y, por consiguiente, el anticuerpo biespecífico resultante es un anticuerpo biespecífico CD3/CD123. Los anticuerpos biespecíficos convencionales pueden producirse mediante técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden usarse en forma aislada (por ejemplo, purificados) o contenidos en un vector, tal como una membrana o vesícula lipídica (por ejemplo, un liposoma).
En una realización adicional, el anticuerpo anti-CD123 se usa para la preparación de la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención definida adicionalmente en la sección “proteína de unión de tipo anticuerpo”.
Cualquier combinación de las realizaciones anteriores forma parte de la invención.
Proteínas de unión de tipo anticuerpo
Los inventores han generado varias proteínas de unión de tipo anticuerpo, las denominadas proteínas de unión de tipo anticuerpo “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4”, “7G3x18F5”, “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4”, “hz4B4x3E3” “hz20G6x7G3-TL4” y “hz20G6xhz7G3”, en las que el término “hz” indica anticuerpos humanizados. Estas proteínas de unión de tipo anticuerpo tienen un diseño CODV, en particular un diseño CODV-Fab o CODV-Ig.
El “formato CODV”, en el contexto de la presente invención, se refiere a la configuración variable dual cruzada (CODV) de anticuerpos biespecíficos o anticuerpos multiespecíficos. El formato CODV permite una intercambiabilidad de dominios variables con retención de plegamiento y afinidad de unión final.
El formato CODV se ha descrito previamente en la solicitud de patente internacional WO2012/135345. En consecuencia, en una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención está en el formato CODV como se describió previamente en la solicitud de patente internacional WO2012/135345.
La invención se refiere a una proteína de unión de tipo anticuerpo en formato CODV-Fab. Por consiguiente, la invención se refiere a una proteína de unión de tipo anticuerpo que se une específicamente a CD3e humana y a al menos a otro antígeno diana que es CD123, que comprende dos cadenas polipeptídicas que forman dos sitios de unión a antígeno, en la que un primer polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [I]:
VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
y un segundo polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [II]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1 [II]
en las que:
VD1 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
VD2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
VD3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
VD4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
CL es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
CH1 es un dominio constante de cadena pesada CH1 de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , y L4 son conectores de aminoácidos;
y en la que el primer y el segundo polipéptido forman un par entrecruzado cadena ligera-cadena pesada, y en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas ligeras, o Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas pesadas,
en la que dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo que se une al dominio extracelular de la proteína CD3e humana y que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 11; y
en la que la otra de dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 381, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 384, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, CDR2-L de secuencia “WAS" y CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 379. La adición de un dominio Fc a la proteína de unión de tipo anticuerpo en el CODV-Fab estabiliza aún más la proteína de unión de tipo anticuerpo. Más precisamente, añadir un dominio Fc al polipéptido de fórmula (II) de la proteína de unión de tipo anticuerpo en el CODV-Fab aumenta la vida media de la proteína de unión de tipo anticuerpo, y de este modo mejora el perfil farmacocinético de la proteína de unión de tipo anticuerpo. La adición de una región Fc al CODV-Fab da como resultado la dimerización de polipéptidos que contienen el dominio Fc, y la proteína de unión de tipo anticuerpo resultante es una proteína de unión de tipo anticuerpo en el formato CODV-Ig.
Por lo tanto, la invención se refiere además a una proteína de unión de tipo anticuerpo en el formato CODV-Ig. Por lo tanto, la invención se refiere además a una proteína de unión de tipo anticuerpo que comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman cuatro sitios de unión a antígeno, en la que dos cadenas polipeptídicas tienen una estructura representada por la fórmula [I]:
Vdi-Li -Vd2-L2-Cl [I]
y dos cadenas polipeptídicas tienen una estructura representada por la fórmula [III]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]
en las que:
Vd1 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
Vd2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
Vd3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
Vd4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de cadena pesada Ch1 de una inmunoglobulina;
Fc es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , y L4 son conectores de aminoácidos;
y en la que los polipéptidos de fórmula I y los polipéptidos de fórmula III forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada, y
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas ligeras, o Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas pesadas,
en la que dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo que se une al dominio extracelular de la proteína CD3e humana y que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia “KVS" y CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 11; y
en la que la otra de dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 381, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 384, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, CDR2-L de secuencia “WAS" y CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 379. En dicho formato CODV-Ig, las dos cadenas polipeptídicas que tienen una estructura representada por la fórmula [III] se dimerizan a través de sus dominios Fc.
En una realización adicional, un primer dominio Fc se añade al polipéptido de fórmula [II] de CODV-Fab de la proteína de unión de tipo anticuerpo, y un segundo dominio de Fc (denominado Fc2) se añade al polipéptido de fórmula [I] del CODV-Fab de la proteína de unión de tipo anticuerpo. Además, en la misma realización, un conector L5 está presente entre Cl y el dominio Fc2 de las cadenas polipeptídicas de fórmula [I] dando como resultado las cadenas polipeptídicas de fórmula [IV].
Por consiguiente, la invención se refiere además a una proteína de unión de tipo anticuerpo que comprende dos cadenas polipeptídicas que forman dos sitios de unión a antígeno, en la que una cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula [IV]:
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2 [IV]
y una cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula [III]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]
en las que:
Vd1 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
Vd2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
Vd3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
Vd4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de cadena pesada Ch1 de una inmunoglobulina;
Fc es la región bisagra de la inmunoglobulina, y Ch2, Ch3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
Fc2 es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2 , CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , L4 y L3 son conectores de aminoácidos;
y en la que el polipéptido de fórmula [IV] y el polipéptido de fórmula [III] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada, y
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas ligeras, o Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas pesadas,
en la que dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo que se une al dominio extracelular de la proteína CD3e humana y que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 11; y
en la que la otra de dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 381, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 384, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, CDR2-L de secuencia “WAS” y CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 379. Este formato CODV, en el que las cadenas polipeptídicas representadas por las fórmulas [III] y [IV] se dimerizan a través de sus regiones Fc2 y Fc respectivas, se denomina aquí CODV-Fab-TL.
En otra realización del CODV-Fab, un primer dominio Fc se añade a la cadena polipeptídica representada por la fórmula [II] (que da como resultado la fórmula [III]), y la proteína de unión de tipo anticuerpo comprende una tercera cadena polipeptídica que comprende, o consiste en, un segundo dominio Fc (denominado Fc3).
La invención se refiere además a una proteína de unión de tipo anticuerpo que comprende tres cadenas polipeptídicas que forman dos sitios de unión a antígeno, en la que
un primer polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [I]:
VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
un segundo polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [III]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc (III)
un tercer polipéptido Fc3 (también denominado “muñón Fc”), que es la región bisagra de inmunoglobulina y CH2 , CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
en las que
Vd1 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
Vd2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
Vd3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
Vd4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de cadena pesada Ch1 de una inmunoglobulina;
Fc es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , y L4 son conectores de aminoácidos;
y en la que el polipéptido de fórmula [I] y el polipéptido de fórmula [III] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada, y
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas ligeras, o Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas pesadas;
en la que dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo que se une al dominio extracelular de la proteína CD3e y que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; y
en la que la otra de dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 381, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 384, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, CDR2-L de secuencia “WAS” y CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 379.
y en la que el polipéptido de fórmula [III] se heterodimeriza con el tercer polipéptido a través de su dominio Fc.
En consecuencia, en dicha realización, el denominado “muñón Fc” (Fc3) se heterodimeriza con la región Fc del polipéptido según la fórmula III. Este formato CODV se denomina aquí CODV-Fab-OL. Este constructo evita que el CODV-Fab forme agregados.
En una realización del CODV-Fab-OL, tanto Fc como Fc3 son variantes de inmunoglobulina en las que se ha modificado el dominio CH3: cada uno de Fc y Fc3 ha sido modificado genéticamente en la interfaz CH3-CH3 para promover la formación de heteromultímeros según la denominada tecnología “botón en ojal” que se ha descrito en las patentes US5731168 y US8216805, en particular.
Por consiguiente, en una realización, el dominio CH3 de uno de Fc y Fc3 contiene las mutaciones Y349C, T366S, L368A, e Y407V, mientras que el dominio CH3 del otro de Fc y Fc3 contiene las mutaciones S354C y T366W (indicándose la posición de los aminoácidos mediante referencia a una secuencia de IgG1).
Ejemplos de pares Fc y Fc3 adecuados incluyen el par SEQ ID NO: 396 (Fc) y SEQ ID NO: 397 (Fc3), y el par SEQ ID NO: 394 (Fc) y SEQ ID NO: 398 (Fc3).
La primera inmunoglobulina o la segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD3 como se define en la sección «anticuerpos anti-CD3» anterior.
La primera inmunoglobulina o la segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 como se define en la sección «anticuerpos anti-CD123» anterior.
Según una realización de la invención, Vd1 y Vd2 del polipéptido de fórmula I o fórmula [IV] son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y VD3 y VD4 del polipéptido II o III son ambos dominios variables de cadenas pesadas o de cadenas ligeras. Esta intercambiabilidad también se denomina “permutabilidad”, y de este modo determina la configuración variable dual cruzada (CODV) de las proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención.
Según la definición anterior, Vdi y Vd4 son dominios variables de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina, y Vd2 y Vd3 son dominios variables de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina, por lo tanto Vd1 y Vd4 deben considerarse dominios afines, así como Vd2 y Vd3.
En consecuencia, el término “cruce” se refiere al alineamiento permutado de Vd1 o Vd2 del polipéptido de fórmula [I] o fórmula [IV] con respecto a su dominio variable afín Vd4 o Vd3 de polipéptido de fórmula [II] o fórmula [III].
En una realización particular, Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadena ligera, y Vd3 y Vd4 son dominios variables de cadena pesada.
Las proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención se pueden preparar usando dominios o secuencias obtenidas o derivadas de cualquier anticuerpo humano o no humano, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos humanos, de rata, o humanizados.
En una realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina IgG.
Por consiguiente, en una realización, Cl es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina IgG. En una realización adicional, Ch1 es un dominio Ch1 constante de cadena pesada de una inmunoglobulina IgG.
La proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención puede prepararse usando dominios o secuencias del anticuerpo anti-CD3 y del anticuerpo anti-CD123 descritos aquí.
El termino “conector”, como se usa aquí, se refiere a uno o más restos de aminoácidos insertados entre dominios de inmunoglobulina para proporcionar suficiente movilidad para que los dominios de las cadenas ligeras y pesadas se plieguen en las inmunoglobulinas con región variable dual cruzada. En algunas realizaciones, un conector consiste en 0 aminoácidos, lo que significa que el conector está ausente. Un conector se inserta en la transición entre dominios variables o entre dominios variables y constantes, respectivamente, a nivel de secuencia. La transición entre dominios se puede identificar debido a que se conoce bien el tamaño aproximado de los dominios de inmunoglobulina. La ubicación precisa de una transición de dominio se puede determinar localizando tramos de péptidos que no forman elementos estructurales secundarios tales como láminas beta o hélices alfa, como lo demuestran los datos experimentales o como puede suponerse mediante técnicas de modelado o predicción de estructuras secundarias. Los conectores descritos en el contexto de la invención son los conectores L1, L2 , L3 , L4 y L5. L1 se encuentra entre el dominio Vd1 N-terminal y el dominio Vd2 ; L2 se encuentra entre el dominio Vd2 y el Cl C-terminal. Los conectores L3 y L4 están localizados en el polipéptido definido según la fórmula II o III de las proteínas de tipo anticuerpo. Más precisamente, L3 se encuentra entre los dominios Vd3 N-terminal y Vd4, y L4 se encuentra entre los dominios Vd4 y Ch1-Fc C-terminal. L5 se encuentra entre Cl y Fc2 N-terminal. Los conectores L1, L2 , L3 , L4 y L5 son independientes, pero en algunas realizaciones tienen la misma secuencia y/o longitud.
En algunas proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, la longitud de L3 es al menos dos veces la longitud de L1. En otras proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, la longitud de L4 es al menos dos veces la longitud de L2. En algunas proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, la longitud de L1 es al menos dos veces la longitud de L3. En otras proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, la longitud de L2 es al menos dos veces la longitud de L4.
En una realización, el conector L1, L2 , L3 y L4 comprende 0 a 20 aminoácidos. En una realización, L5 comprende 0 a 10 aminoácidos.
En algunas proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, L1 tiene 3 a 12 restos de aminoácidos de longitud, L2 tiene 3 a 14 restos de aminoácidos de longitud, L3 tiene 1 a 8 restos de aminoácidos de longitud, y L4 tiene 1 a 3 restos de aminoácidos de longitud. En otras proteínas de unión de tipo anticuerpo, L1 tiene 5 a 10 restos de aminoácidos de longitud, L2 tiene 5 a 8 restos de aminoácidos de longitud, L3 tiene 1 a 5 restos de aminoácidos de longitud, y L4 tiene 1 a 2 restos de aminoácidos de longitud. En una proteína de unión de tipo anticuerpo preferida, L1 tiene 7 restos de aminoácidos de longitud, L2 tiene 5 restos de aminoácidos de longitud, L3 tiene 1 resto de aminoácido de longitud, y L4 tiene 2 restos de aminoácidos de longitud.
En algunas proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, L1 tiene 1 a 3 restos de aminoácidos de longitud, L2 tiene 1 a 4 restos de aminoácidos de longitud, L3 tiene 2 a 15 restos de aminoácidos de longitud, y L4 tiene 2 a 15 restos de aminoácidos de longitud. En otras proteínas de unión de tipo anticuerpo, L1 tiene 1 a 2 restos de aminoácidos de longitud, L2 tiene 1 a 2 restos de aminoácidos de longitud, L3 tiene 4 a 12 restos de aminoácidos de longitud, y L4 tiene 2 a 12 restos de aminoácidos de longitud. En una proteína de unión de tipo anticuerpo preferida, L1 tiene 1 resto de aminoácido de longitud, L2 tiene 2 restos de aminoácidos de longitud, L3 tiene 7 restos de aminoácidos de longitud, y L4 tiene de 5 restos aminoácidos de longitud.
En algunas proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, L1, L3 , o L4 pueden ser igual a cero. Sin embargo, en proteínas de unión de tipo anticuerpo en las que L3 o L4 es igual a cero, el conector de transición correspondiente entre la región variable y la región constante o entre los dominios variables duales en la otra cadena no puede ser cero. En algunas realizaciones, L1 es igual a cero y L3 tiene 2 o más restos de aminoácidos, L3 es igual a cero y L1 es igual a 1 o más restos de aminoácidos, o L4 es igual a 0 y L2 tiene 3 o más restos de aminoácidos.
En algunas proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, al menos uno de los conectores seleccionados del grupo que consiste en L2 , L3 , y L4 contiene al menos un resto de cisteína.
Los ejemplos de conectores adecuados incluyen un solo resto de glicina, treonina o serina; un dipéptido tal como un péptido de diglicina, péptido de histidina-treonina o dipéptido de glicina-serina; un tripéptido con tres glicinas, el tripéptido Thr-His-Thr, el tripéptido Gly-Gly-Ser; un péptido con cuatro restos de glicina; un péptido con cinco restos de glicina; un péptido con seis restos de glicina; un péptido con siete restos de glicina; un péptido con ocho restos de glicina. Se pueden usar otras combinaciones de restos de aminoácidos tales como el péptido Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 354), el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 344), el péptido Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ iD NO: 355), el péptido Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SeQ ID NO: 356), el péptido Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 357), el péptido Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SeQ ID NO: 358), y el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 345). Otros conectores adecuados incluyen un único resto Ser y Val; el dipéptido Arg-Thr, Gin-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, y Ser-Leu; Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 359); Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 360); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser (SeQ ID NO: 361); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 362); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 363); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro (SeQ ID NO: 364); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 365); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 366); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 367); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 368); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 369); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 370); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 371); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 372); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 373); Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 374); Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 346), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 347), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: 348); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 349), Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser (SEQ ID NO: 350), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 307), Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 309), His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO: 351), y Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 389). Los ejemplos enumerados anteriormente no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera, y los conectores que comprenden aminoácidos seleccionados aleatoriamente, seleccionados del grupo que consiste en valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, glicina y prolina, se ha demostrado que son adecuados en las proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención.
La identidad y secuencia de los restos de aminoácidos en el conector pueden variar dependiendo del tipo de elemento estructural secundario necesario para conseguirlo en el conector. Por ejemplo, la glicina, la serina y la alanina son mejores para conectores que tienen la máxima flexibilidad. Alguna combinación de glicina, prolina, treonina y serina es útil si se necesita un conector más rígido y extendido. Cualquier resto de aminoácido puede considerarse como un conector en combinación con otros restos de aminoácidos para construir conectores peptídicos más grandes según sea necesario dependiendo de las propiedades deseadas.
En una realización, el conector L1 es de secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 307), el conector L2 es de secuencia Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 309), el conector L3 es de secuencia “S”, y el conector L4 es de secuencia “RT”.
En una realización adicional, las secuencias de conectores L1, L2 , L3 , y L4 se seleccionan del grupo que consiste en treonina; un dipéptido tal como un péptido de histidina-treonina; el tripéptido Thr-His-Thr, Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 359); Lys-Thr-His-Thr-Ser (SeQ ID NO: 360); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser (SEQ ID NO: 361); Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 362); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro (SEQ ID NO: 363); Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro (SeQ ID NO: 364); Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 365); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 366); Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID n O: 367); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 368); Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 369); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly (SEQ ID NO: 370); Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 371); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly (SEQ ID NO: 372); Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 373) y Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 374). En una realización, la secuencia del conector L5 se selecciona del grupo que consiste en un único resto de serina, un dipéptido tal como un dipéptido de glicina-serina; un tripéptido Gly-Gly-Ser, el péptido Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 354), el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 344), el péptido Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SeQ ID NO: 355), el péptido Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 356), el péptido Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID n O: 357), el péptido Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SeQ ID n O: 358), el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 345), y el péptido Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 389).
La expresión “dominio Fc”, como se usa aquí, abarca Fc nativo y variantes de Fc y secuencias como se definieron anteriormente. Al igual que con las moléculas de variantes de Fc y de Fc nativo, la expresión “dominio Fc” incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas a partir de anticuerpos completos o producidas por otros medios.
La expresión “fc nativo”, como se usa aquí, se refiere a una molécula que comprende la secuencia de un fragmento que no se une al antígeno resultante de la digestión de un anticuerpo o producido por otros medios, ya sea en forma monomérica o multimérica, y puede contener la región bisagra. La fuente de inmunoglobulina original del Fc nativo es, en particular, de origen humano, y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se prefieren IgG1 e IgG2. Las moléculas de Fc nativo están formadas por polipéptidos monoméricos que pueden unirse en formas diméricas o multiméricas mediante asociación covalente (es decir, enlaces de disulfuro) y no covalente. El número de enlaces de disulfuro intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativo oscila de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA e IgE) o subclase (por ejemplo, IgGI, IgG2, IgG3, IgAI e IgGA2). Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero unido por enlaces de disulfuro resultante de la digestión con papaína de una IgG. La expresión “Fc nativo”, como se usa aquí, es genérica para las formas monomérica, dimérica y multimérica.
La expresión “variante de Fc”, como se usa aquí, se refiere a una molécula o secuencia que se modifica a partir de un Fc nativo pero que aún comprende un sitio de unión para el receptor de rescate, FcRn (receptor de Fc neonatal). Las variantes de Fc ejemplares y su interacción con el receptor de rescate se conocen en la técnica. De este modo, la expresión “variante de Fc” puede comprender una molécula o secuencia que se humaniza a partir de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende regiones que pueden eliminarse debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son requeridas para las proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención. De este modo, la expresión “variante de Fc” comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o restos de Fc nativo, o en la que uno o más sitios o restos de Fc se han modificado, que afectan o están involucrados en: (1) formación de enlaces de disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula hospedante seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal tras la expresión en una célula hospedante seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con el complemento, (6) unión a un receptor Fc que no sea un receptor de rescate, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
En algunas realizaciones, cuando la proteína de unión de tipo anticuerpo contiene dos dominios Fc, es decir, en el CODV-Ig (Fc y Fc2), CODV-Fab-TL (dos dominios Fc) y CODV-Fab-OL (Fc y Fc3), las dos dominios Fc son del mismo isotipo de inmunoglobulina o subclase de isotipo. En consecuencia, en algunas realizaciones tanto Fc como Fc2 de CODV-Ig, o ambos dominios Fc de CODV-Fab-TL, o tanto Fc como Fc3 de CODV-Fab-OL son de la subclase IgG1, o de la subclase IgG2, o de la subclase IgG3, o de la subclase IgG4.
Todas las proteínas de unión de tipo anticuerpo como se describen aquí no tienen función efectora. Esto significa que cuando la proteína de unión de tipo anticuerpo contiene uno o más dominios Fc (es decir, Fc en la fórmula [III], Fc2 en la fórmula [IV] y/o Fc3) de la subclase IgG 1, dicho uno o más dominios Fc del esqueleto de IgG1 contienen una mutación doble L234A y L235A (denominada “mutación LALA”) que anula la función efectora de Fc. El mutante doble de Fc L234A y L235A no se une a FcgR o C1q, y las funciones tanto ADCC como CDC del dominio Fc de la subclase IgG 1 están abolidas (Hezareh, M. et al., J Virol. 2001 Dec; 75(24): 12161-12168)
En un ejemplo, la región Fc comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 394 o SEQ ID NO: 396. En una realización, la región Fc2 comprende dos intercambios de aminoácidos dentro del dominio CH3 H435R e Y436F, como se describe en Jendeberg, L. et al. (1997, J. Immunological Meth. 201: 25-34). En consecuencia, en una realización, la región Fc2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 327. En otra realización, la región Fc2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 392.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6” comprende:
- un polipéptido según la fórmula I de la secuencia de aminoácidos DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSL VHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSN RFSGFSDRFSGSGSGTDFTLKISRVDPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLE IKGQPK AAPDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK TKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 306, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende VD1 de secuencia SEQ ID NO: 9, L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 308, L2 de secuencia SEQ ID NO: 309 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, y
- un polipéptido según la fórmula II de la secuencia de aminoácidos EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGA TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGT LVTVSASEVQLVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTKAWMHWVRQSPEKQLEWVAQ IKDKSNSYATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGVYYALSPFDY WGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 311, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 312, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 5, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT” y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x4E7” comprende:
- un polipéptido según la fórmula I de la secuencia de aminoácidos DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLEHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQPLIYKVSN RFSGISDFLFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGPGTKLELKGQPK AAPDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK TKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 314, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 21, L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, Vd2 de secuencia s Eq ID n O: 308, L2 de secuencia SEQ ID NO: 309 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, y
- un polipéptido según la fórmula II de la secuencia de aminoácidos EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGA TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGT LVTVSASEVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVA QIKDKSNNYATYYAESLKGRFTISRDDPKRSIYLQMNSLREEDTAIYYCRYVHYGIGYA MDAWGQGTSVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 315, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 312, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 18, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT” y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x4B4” comprende:
- un polipéptido según la fórmula I de la secuencia de aminoácidos DVVMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQRPGQSPQVLIYKVS NRFSGTSDRFTGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKLEIKGQP KAAPDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLL IYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEI KTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 316, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 16, L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, Vd2 de secuencia s Eq ID n O: 308, L2 de secuencia SEQ ID NO: 309 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, y
- un polipéptido según la fórmula II de la secuencia de aminoácidos EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGA TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGT LVTVSASEVQLVETGGRLVQPGRSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKQLEWVA QIKARSNNYATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLKEEDTAIYYCRGTYYASKPF DYWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 317, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 312, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 12, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT” y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x18F5” comprende:
- un polipéptido según la fórmula I de la secuencia de aminoácidos DVLMTQTPVSLSVSLGGQVSISCRSSQSLVHTNGNTYLSWYLOKPGOSPOLLIYKVSN RLSGISDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPDDLGVYYCGQGTHYPFTFGAGTKLELKGQPK AAPDFVMTOSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK TKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 318, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende VD1 de secuencia SEQ ID NO: 26, L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 308, L2 de secuencia SEQ ID NO: 309 y CL de secuencia SEQ ID NO: 310, y
- un polipéptido según la fórmula II de la secuencia de aminoácidos EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGA TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGT LVTVSASEVQVVETGGSLVQPGKSLKLTCATSGFTFTNAWMHWVRRSPEKQLEWVA QIKDKSNNYATYYAESVKGRFTISRDDSKSSIYLQMNSLKEEDTAIYYCRYVHYRFAYAL DAWGRGTSVSVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 319, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 312, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 23, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT” y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6x7G3” comprende:
- un polipéptido según la fórmula I de la secuencia de aminoácidos DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKGQ PKAAPDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEI KTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 320, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 308, L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 143, L2 de secuencia SEQ ID NO: 309 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, y
- un polipéptido según la fórmula II de la secuencia de aminoácidos QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSN SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQ GTLVTVSSSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWI GDIIPSNGATFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWF AYWGQGTLVTVSARTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 321, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 312, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT” y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3xhz4B4” comprende:
- un polipéptido según la fórmula I de la secuencia de aminoácidos DVVMTQTPVSLSVSVGGRVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGKSPKVLIYKVSN RFSGVSSRFTGSGSGTDFTLKISSVQPDDLGVYYCGOGTOYPFTFGSGTKLEIKGQPK AAPDFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCONDYSYPYTFGGGTKLEIK TKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 322, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 158, L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 308, L2 de secuencia SEQ ID NO: 309 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, y
- un polipéptido según la fórmula II de la secuencia de aminoácidos EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGA TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGT LVTVSASQVQLVETGGGLVKPGQSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKGLEWVA QIKARSNNYATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLTPEDTAIYYCRGTYYASKPFD YWGQGVMVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 323, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 312, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 171, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT” y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz4B4x3E3” comprende:
- un polipéptido según la fórmula I de la secuencia de aminoácidos QFVLTQPNSVSTNLGSTVKLSCKRNTGNIGSNYVNWYQQHEGRSPTTMIYRDDKRPD GVPDRFSGSIDRSSNSALLTINNVQTEDEADYFCQSYSSGINIIFGGGTKLTVLGQPKA APDVVMTQTPVSLSVSVGGRVSISCRSSQSLVHDNGNTYLSWSLQKPGKSPKVLIYKV SNRFSGVSSRFTGSGSGTDFTLKISSVQPDDLGVYYCGQGTOYPFTFGSGTKLEIKTK GPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 324, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 230, L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, Vd2 de secuencia SeQ ID NO: 158, L2 de secuencia SEQ ID NO: 309 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, y
- un polipéptido según la fórmula II de la secuencia de aminoácidos QVQLVETGGGLVKPGQSLKLTCATSGFTFSNAWMHWVRQSPEKGLEWVAQIKARSN NYATYYAESVKGRFTISRDDSKSTIYLQMNSLTPEDTAIYYCRGTYYASKPFDYWGQG VMVTVSSSQVQLQESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTTYDVHWVRQPPGKGLEWM GRIQNGGITDYNSALKSRLIISRDTSKSQVFLKMNSVQTEDT AMYFCAKTGSYFYAFDH WGQGTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 325, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 171, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 226, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT” y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” comprende:
- un polipéptido según la fórmula [I] consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGS GSSGSGGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQ SLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTK VEIKGGSGSSGSGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO: 388, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385, L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, y
- un polipéptido según la fórmula [II] consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSN SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQ GTLVTVSSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWM GDIIPSSGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWF AYWGQGTMVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO: 390) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383 (en cursiva y subrayado), L4 es 0 aminoácidos y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
En un ejemplo, los polipéptidos según la fórmula II de las denominados proteínas de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4”, “7G3x18F5”, “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4”, “hz4B4x3E3” y “hz20G6xhz7G3” comprenden además la secuencia EPKSCDKTHTHHHHHH (SEQ ID NO: 352) correspondiente a una secuencia bisagra y una etiqueta His usada, por ejemplo, para la purificación.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6x7G3-TL4” (también denominada CODV-Fab-TL4 “hz20G6x7G3”) comprende:
- un polipéptido según la fórmula [IV] consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKGQ PKAAPDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQSLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEI KTKGPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECESK YGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 326, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 308, L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 143, L2 de secuencia SEQ ID NO: 309, Cl de secuencia SEQ ID NO: 310 y Fc2 (subrayado) de secuencia SEQ ID NO: 327, y
- un polipéptido según la fórmula [III] de la secuencia de aminoácidos QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSN SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQ GTLVTVSSSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWI GDIIPSNGATFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWF AYWGQGTLVTVSARTASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES KYGPPGPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 328, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 312, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT”, y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 329, y Fc de secuencia SEQ ID NO: 330.
En la proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-TL4 “hz20G6x7G3” anterior, el Fc de secuencia SEQ ID NO: 330 y Fc2 de secuencia SEQ ID NO: 327 son de un esqueleto de IgG4. Dicha proteína de unión de tipo anticuerpo tiene un formato CODV-Fab-TL, y contiene o consiste en un polipéptido de fórmula III y un polipéptido de fórmula IV.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3” comprende:
- un polipéptido según la fórmula IV de la secuencia de aminoácidos DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGS GSSGSGGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQ SLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTK VEIKGGSGSSGSGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRG ECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 391, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende VD1 de secuencia SEQ ID NO: 385, L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389, Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, L5 que contiene 0 aminoácidos y Fc2 (subrayado) de secuencia SEQ ID NO: 392; y
- un polipéptido según la fórmula III de la secuencia de aminoácidos QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSN SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQ GTLVTVSSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWM GDIIPSSGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWF AYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 393) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383 (en cursiva), L4 es 0 aminoácidos, Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313, y Fc (subrayado) de secuencia SEQ ID NO: 394.
En la proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-TL1 “hz20G6x7G3”, el Fc de secuencia SEQ ID NO: 394 y el Fc2 de secuencia SEQ ID NO: 392 son de un esqueleto de IgG1. Dicha proteína de unión de tipo anticuerpo está en formato CODV-Fab-TL. Contiene o consiste en un polipéptido de fórmula IV y un polipéptido de fórmula III.
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1 “hz20G6xhz7G3” comprende:
- un polipéptido según la fórmula I de la secuencia de aminoácidos DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIKGGS GSSGSGGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQ SLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTK VEIKGGSGSSGSGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO: 388, los conectores están indicados en negrita y subrayados) que comprende VD1 de secuencia SEQ ID NO: 385, L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389, y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310; y
un polipéptido según la fórmula III de la secuencia de aminoácidos QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSN SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQ GTLVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWM GDIIPSSGAJFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCAPSHLLPASWF AYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 395) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383 (en cursiva y subrayado), L4 es 0 aminoácidos, Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313, y Fc (subrayado) de secuencia SEQ ID NO: 396;
y en la que la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1 “hz20G6xhz7G3” comprende además un muñón Fc (Fc3) de la secuencia de aminoácidos: GSDKTHTCPPCPAPFAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTGVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 397), y que se heterodimeriza con la región Fc del polipéptido según la fórmula III.
Dicha proteína de unión de tipo anticuerpo está en formato CODV-Fab-OL, es decir, contiene o consiste en un polipéptido de fórmula I, un polipéptido de fórmula III, y un muñón Fc. Sus secuencias Fc y Fc3 se han manipulado mediante ingeniería según la tecnología “botón en ojal”, y contienen además la doble mutación L234A y L235A.
La secuencia Fc de secuencia SEQ ID NO: 396 se ha diseñado para contener restos RF en las posiciones 200-221 (en negrita arriba), en lugar de restos HY que de otro modo habrían estado presentes en estas posiciones de la región Fc. La mutación HY > RF (es decir, H435R e Y436F en el dominio CH3 como se describe por Jendeberg, L. et al.
1997, J. Immunological Meth., 201: 25-34) es ventajosa para fines de purificación, ya que elimina la unión a la proteína A. En el caso de CODV-Fab-OL1 “hz20G6xhz7G3”, el muñón Fc de secuencia s EQ ID NO: 397 comprende restos HY en las posiciones 217-218 (en negrita arriba).
La denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1 a “hz20G6xhz7G3” comprende:
- un polipéptido según la fórmula I de la secuencia de aminoácidos DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYVCQNOVSVPYTFGOGTKLEIKGGS GSSGSGGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQ SLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTK VEIKGGSGSSGSGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO: 388) que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385, L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389, y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310;
- un polipéptido según la fórmula III de la secuencia de aminoácidos: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDKSN SYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQ GTLVTVSSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWM GDIIPSSGATFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWF AYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 399) que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383 (en cursiva y subrayado), L4 es 0 aminoácidos, Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313, y Fc (subrayado) de secuencia SEQ ID NO: 400;
- y en la que la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1a “hz20G6xhz7G3” comprende además un muñón Fc (Fc3) de la secuencia de aminoácidos: GSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 398) que se heterodimeriza con la región Fc del polipéptido según la fórmula III.
El Fc de secuencia SEQ ID NO: 400 comprende restos HY en las posiciones 200-221 (en negrita arriba), mientras que el muñón Fc de secuencia SEQ ID NO: 398 comprende restos RF en las posiciones 217-218 (en negrita arriba).
Dicha proteína de unión de tipo anticuerpo está en un formato CODV-Fab-OL, es decir, contiene o consiste en un polipéptido de fórmula I, un polipéptido de fórmula III, y un muñón Fc. Sus secuencias Fc y Fc3 se han manipulado según la tecnología “botón en ojal”, y contienen la doble mutación L234A y L235A.
La primera inmunoglobulina o la segunda inmunoglobulina puede ser un anticuerpo anti-CD123 seleccionado de los denominados anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, y “9F6-G3”, o una forma humanizada de los mismos, o el anticuerpo anti-CD123 “7G3” descrito aquí a continuación, por ejemplo los anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3” o “7G3”, o una forma humanizada de los mismos.
La primera inmunoglobulina o la segunda inmunoglobulina puede ser un anticuerpo anti-CD3 seleccionado de los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “12D2-E5”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “18H11-F10”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “3G5-E10”, “9D7-F3”, “8C2-F7”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “6C9-C9”, “3E8-G1”, “3H6-D2”, y “8H2”, o una forma humanizada de los mismos, por ejemplo los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, y “hz20G6”, por ejemplo los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”.
En consecuencia, Vd1 y Vd4, o Vd2 y Vd3 son los dominios variables de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 puede comprender:
a) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
b) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 14, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 15 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 184, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
c) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 20 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 22, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; o
d) un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 24, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 19, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 25 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 27, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 28, y
en la que Vd1 es el dominio variable de la cadena pesada como se definió anteriormente si Vd4 es el dominio variable de la cadena ligera, o Vd1 es el dominio variable de la cadena ligera como se definió anteriormente si Vd4 es el dominio variable de la cadena pesada, o Vd2 es el dominio variable de la cadena pesada como se definió anteriormente si Vd3 es el dominio variable de la cadena ligera, o Vd2 es el dominio variable de la cadena ligera como se definió anteriormente si Vd3 es el dominio variable de la cadena pesada.
En una descripción adicional, Vd1 y Vd4 o Vd2 y Vd3 son los dominios variables de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 es un anticuerpo humanizado y comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 138, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 143, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
b) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 171, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 158, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
c) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 176, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 164, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella; o
en la que Vd1 es el dominio variable de cadena pesada como se definió anteriormente si Vd4 es el dominio variable de cadena ligera, o Vd1 es el dominio variable de la cadena ligera como se definió anteriormente si Vd4 es el dominio variable de la cadena pesada, o
Vd2 es el dominio variable de cadena pesada como se definió anteriormente si Vd3 es el dominio variable de cadena ligera, o Vd2 es el dominio variable de la cadena ligera como se definió anteriormente si Vd3 es el dominio variable de la cadena pesada.
En dicha secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 176, o SEQ ID NO: 164, las secuencias de las 6 CDRs no cambian en comparación con las 6 CDRs presentes en la secuencia de referencia SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 176, o SEQ ID NO: 164.
La proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención se une al CD3 humana. En otra realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención se une además a CD3 de Macaca fascicularis. En particular, la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención se une al dominio extracelular de CD3 humana, o de CD3 tanto humana como de Macaca fascicularis. Más específicamente, el anticuerpo se une a CD3e. Más específicamente, la proteína de unión de tipo anticuerpo se une al dominio extracelular de CD3e humana o y de Macaca fascicularis. La proteína de unión de tipo anticuerpo se une a CD3e cuando está presente en forma de un complejo, tal como un complejo CD3e/8, o cuando está presente como una sola proteína, indistintamente si se expresa en forma aislada, o está presente en un dominio extracelular soluble o CD3e anclada a la membrana de longitud completa, como está presente, por ejemplo, en células T. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención es específica para la proteína CD3 humana de superficie, o para proteínas CD3 tanto humana como de Macaca fascicularis, en particular para CD3e.
La unión de tipo anticuerpo según la invención tiene una relación de afinidad por CD3 de Macaca fascicularis a afinidad por CD3 humana (KD(Macaca fascicularis)/KD(humana) que es <10, en particular <6, <5, <4, <3, <2, <1 o <0,5. De este modo, la proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención puede usarse en estudios toxicológicos realizados en monos, con el perfil de toxicidad observado en monos relevante para anticipar posibles efectos adversos en seres humanos.
Además, la proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención tiene una afinidad (KD) por CD3 humana o CD3 de Macaca fascicularis, o por ambas, que es <50 nM, <40 nM, o <30 nM, por ejemplo < 20 nM, por ejemplo una afinidad de 0,1 nM a 30 nM, en particular de 0,4 nM a 20 nM, o de 0,4 nM a 15 nM.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención tiene una activación de células T que es menor que 20%, menor que 18%, menor que 16%, menor que 14%, menor que 12%, menor que 10% en ausencia de células diana.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención tiene una activación de células T que es mayor que 55%, mayor que 60%, mayor que 62%, mayor que 64%, mayor que 66%, mayor que 68%, mayor que 70% en presencia de células diana.
“Activación baja de células T”, en el contexto de las proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, se refiere a una activación de células T menor que 20%, menor que 18%, menor que 16%, menor que 14%, menor que 12%, menor que 10%.
“Células diana” se refiere aquí a células que expresan el segundo antígeno, en un ejemplo, las células diana se refieren aquí a células que expresan CD123 tales como células THP-1.
“Activación alta de células T” se refiere aquí a una activación de células T mayor que 50%, mayor que 55%, mayor que 60%, mayor que 62%, mayor que 64%, mayor que 66%, mayor que 68%, mayor que 70%.
La proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención tiene un efecto de participación de células T. Este efecto de participación de células T induce citotoxicidad en la célula diana. En una realización, la célula diana es una célula que expresa CD123, tal como una célula cancerosa que expresa CD123, por ejemplo THP-1 o TF-1.
Por consiguiente, en una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención es capaz de acoplarse a células T primarias y lisar células diana in vitro, en la que la (EC50) es <40 pM, <35 pM, por ejemplo <30 pM.
“Citotoxicidad” se refiere aquí a la calidad de un compuesto, tal como la proteína de unión de tipo anticuerpo o un anticuerpo anti-CD123 de la invención, para que sea tóxico para las células. La citotoxicidad puede ser inducida por diferentes mecanismos de acción, y de este modo puede dividirse en citotoxicidad mediada por células, apoptosis, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
“Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos” o “ADCC” se refiere a un mecanismo de defensa inmunitaria mediada por células mediante el cual una célula efectora del sistema inmunológico lisa activamente una célula diana, cuyos antígenos de la superficie de la membrana se han unido mediante anticuerpos específicos.
“Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC”, en el contexto de la invención, se refiere a la lisis de una célula diana en presencia de proteínas del sistema del complemento.
“Citotoxicidad mediada por células” se refiere a la citólisis de una célula diana por linfocitos efectores, tales como linfocitos T citotóxicos o células asesinas naturales, y de este modo puede distinguirse en citotoxicidad mediada por células T y citotoxicidad por células NK.
En una realización, la citotoxicidad se refiere aquí a citotoxicidad mediada por células, por ejemplo citotoxicidad mediada por células T.
Además, en una realización, la citotoxicidad mediada por células se refiere a la citotoxicidad mediada por células por las células T.
Por consiguiente, la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención induce citotoxicidad mediada por células en la célula diana mediada por células T.
Los métodos para medir la citotoxicidad son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen el uso de un ensayo de liberación de cromo 51 (Cr), tinción de células vivas/muertas de células diana que incluye yoduro de propidio, 7-AAD y otras tinciones que son conocidas por los expertos en la técnica, detección de moléculas líticas liberadas por células T, incluyendo granzima y perforina, mediante citometría de flujo o ELISA, detección de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada en el medio a partir de células dañadas como un biomarcador para citotoxicidad y citólisis celulares, detección de la movilización de CD107a en la superficie celular, tinción con Anexina V (proteínas de unión a fosfolípidos dependientes de calcio) de células diana apoptóticas, y, por ejemplo, detección de caspasa-3 activada (CASP3). Además, los expertos en la técnica pueden distinguir entre los diferentes mecanismos de citotoxicidad en base al ensayo seleccionado y en base a la configuración experimental.
En un ejemplo, la citotoxicidad mediada por células puede medirse, por ejemplo, usando CFSE para marcar células diana y 7-AAD para marcar células muertas, como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 3.2.
La proteína de unión de tipo anticuerpo es capaz de unirse a CD3 y a al menos otra diana antigénica que es CD123.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo es capaz de inhibir la función de esta diana de antígeno CD123 adicional.
En un aspecto de la invención, la proteína de unión de tipo anticuerpo se une a CD123 humana. En otra realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo se une además a CD123 de Macaca fascicularis. En particular, la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención se une al dominio extracelular de CD123 humana, o de CD123 tanto humana como de Macaca fascicularis. Más específicamente, la proteína de unión de tipo anticuerpo se une al resto distal de CD123, por ejemplo, a los aminoácidos que parten de la posición 19 a 49 de la CD123 humana de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 104. La proteína de unión de tipo anticuerpo se une a CD123, indistintamente si se expresa en forma aislada, o si está presente en un dominio extracelular soluble o CD123 anclada a membrana de longitud completa como está presente en células que expresan CD123 tales como células AML o células transfectadas con CD123. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención es específica de células que expresan proteínas CD123 humana y de Macaca fascicularis en su superficie, por ejemplo, células cancerosas que expresan CD123.
Por consiguiente, la proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención tiene afinidad (KD) por CD123 humana o CD123 de Macaca fascicularis, o por ambas, que es <20 nM, <15 nM o <10 nM, por ejemplo < 5 nM, por ejemplo, una afinidad de 0,01 nM a 5 nM, en particular de 0,1 nM a 5 nM.
Según la descripción, la primera inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD3 seleccionado de los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “12D2-E5”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “18H11 -F10”, “1 E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11 ”, “11 F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “3G5-E10”, “9D7-F3”, “8C2-F7”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “6C9-C9”, “3E8-G1”, “3H6-D2”, y “8H2”, o una forma humanizada de los mismos, por ejemplo los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “hz4B4” y “hz20G6”, y la segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 seleccionado de los denominados anticuerpos anti-CD3 “3E3-D3”, “1E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, y “9F6-G3”
Según la descripción, la segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD3 seleccionado de los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “12D2-E5”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “18H11 -F10”, “1 E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11 ”, “11 F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “3G5-E10”, “9D7-F3”, “8C2-F7”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “6C9-C9”, “3E8-G1”, “3H6-D2”, y “8H2”, o una forma humanizada de los mismos, por ejemplo los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “hz4B4” y “hz20G6”, y la primera inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 seleccionado de los denominados anticuerpos anti-CD3 “3E3-D3”, “1E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, y “9F6-G3”.
Según la descripción, los Vd1 y Vd4 o Vd2 y Vd3 comprenden un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de ellos definido por tres secuencias de CDR o por secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de uno de los 13 denominados anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, y “9F6-G3” como se definieron anteriormente,
en la que VD1 y VD4 comprenden ambos las tres secuencias de CDR de las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-CD123 como se definió anteriormente, si Vd2 y Vd3 comprenden ambas tres secuencias de CDR de secuencias de dominio variable de cadena ligera y pesada de uno de los anticuerpos anti-CD3 como se definió anteriormente, o
en la que VD2 y VD3 comprenden ambos las tres CDRs de las secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-CD123 como se definió anteriormente, si Vd1 y Vd4 comprenden secuencias de CDR de secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de uno de los anticuerpos anti-CD3 como se definió anteriormente.
Según la descripción, Vd1 y Vd4 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11, y Vd2 y Vd3 son el dominio variable de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1 -G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que VD1 y VD2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si VD3 y VD4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la descripción, Vd2 y Vd3 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11, y VD1 y VD4 son el dominio variable de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1 -G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que VD1 y VD2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si VD3 y VD4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o VD1 y VD2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si VD3 y VD4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la descripción, VD1 y VD4 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 14, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 15 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 184, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11, y Vd2 y Vd3 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1 -G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que VD1 y VD2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si VD3 y VD4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la descripción, Vd1 y Vd4 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID No : 13, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 14, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 15 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 184, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11, y Vd2 y Vd3 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1 -G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que VD1 y VD2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si VD3 y VD4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o VD1 y VD2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si VD3 y VD4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la descripción, VD1 y VD4 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3 humanizado, en la que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende una cadena pesada variable, un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 138, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 143, y Vd2 y Vd3 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que VD1 y VD2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si VD3 y VD4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la descripción, Vd2 y Vd3 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3 humanizado, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende una cadena pesada variable, un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 138, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 143, y Vd1 y Vd4 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la descripción, Vd1 y Vd4 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3 humanizado, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende una cadena pesada, un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 171, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 158, y Vd2 y Vd3 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1 E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la descripción, Vd2 y Vd3 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3 humanizado, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende una cadena pesada, un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 171, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 158, y Vd1 y Vd4 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1 E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la descripción, Vd1 y Vd4 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3 humanizado, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende una cadena pesada, un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 176, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 164, y Vd2 y Vd3 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1 E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la descripción, Vd2 y Vd3 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3 humanizado, en el que dicho anticuerpo anti-CD3 comprende una cadena pesada, un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 176, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 164, y Vd1 y Vd4 son el dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD123 seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD123 “3E3-D3”, “1 E1-G5”, “2B8-F3”, “2F8-D6”, “3B10-E6”, “5A5-B4”, “6B10-E4”, “6C10-C4”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9B8-G6”, “9D7-C8”, “9F6-G3” como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”,
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas, o Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras.
Según la invención, la primera o segunda inmunoglobulina es el anticuerpo anti-CD123 7G3. Según la descripción, Vd1 y Vd4 o Vd2 y Vd3 comprenden un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera como se define por secuencias de CDR de secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo 7G3 como se define aquí a continuación. En una realización Vd1 y Vd4, o Vd2 y Vd3 comprenden un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 7G3 como se describe en la solicitud de patente WO2013/173820.
El denominado anticuerpo anti-CD123 “7G3” como se usa aquí comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGA TFYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCTRSHLLRASWFAYWGQGT LVTVSA (SEQ ID NO: 312, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 375, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 376, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 377 y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DFVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNOKNYLTWYLQKPGQPPKLLIYWA STRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 308, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, una CDR2-L de secuencia “WAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 379.
Según la invención, el anticuerpo 7G3 es un anticuerpo humanizado o un fragmento de un anticuerpo humanizado. El anticuerpo 7G3 humanizado puede comprender
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSNGA TFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGT MVTVSS (SEQ ID NO: 380, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 381, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 377, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, o
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYYMKWARQMPGKGLEWMGDIIPSSGA TFYNQKFKGQVTISADKSISTTYLQWSSLKASDTAMYYCARSHLLRASWFAYWGQGT MVTVSS (SEQ ID NO: 383, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 381, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 384, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, o
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNOKNYLTWYQQKPGOPPKPLIYWAS TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLE IK (SEQ ID NO: 385, con las CDRs mostradas en negrita) que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, una CDR2-L de secuencia “WAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 379.
Según la descripción, la proteína de unión de tipo anticuerpo que se une específicamente a CD3e humana y CD123 humana comprende
a) un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (Vd1) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena ligera de una segunda inmunoglobulina (Vd2) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 308 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena pesada de la segunda inmunoglobulina (Vd3) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 312 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VD4) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, o
b) un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (Vd1) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena ligera de una segunda inmunoglobulina (Vd2) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 308 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena pesada de la segunda inmunoglobulina (Vd3) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 312 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (Vd4) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, o
c) un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (Vd1) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena ligera de una segunda inmunoglobulina (Vd2) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 308 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena pesada de la segunda inmunoglobulina (Vd3) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 312 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (Vd4) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 12 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, o
d) un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (Vd1) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena ligera de una segunda inmunoglobulina (Vd2) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 308 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena pesada la segunda inmunoglobulina (Vd3) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 312 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (Vd4) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, o
e) un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (Vd1) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 308 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena ligera de una segunda inmunoglobulina (Vd2) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 143 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena pesada de la segunda inmunoglobulina (Vd3) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 138 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (Vd4) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 312 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, o
f) un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (Vd1) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 158 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena ligera de una segunda inmunoglobulina (Vd2) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 308 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena pesada de la segunda inmunoglobulina (Vd3) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 312 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y un dominio variable de cadena pesada de una primera inmunoglobulina (Vd4) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 171 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella,
g) un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (Vd1) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 230 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena ligera de una segunda inmunoglobulina (Vd2) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 158 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena pesada de la segunda inmunoglobulina (Vd3) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 171 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (Vd4) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 226 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella,
h) un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (Vd1) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 385 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena ligera de una segunda inmunoglobulina (Vd2) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 141 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, un dominio variable de cadena pesada de la segunda inmunoglobulina (Vd3) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 138 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (Vd4) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 383 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella.
En dicha secuencia anterior al menos 85% idéntica a una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 383 o SEQ ID NO: 385), las secuencias de las 6 CDRs no cambian en comparación con las 6 CDRs presentes en la secuencia de referencia.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo según cualquiera de las definiciones a) a g) comprende además el conector L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, L2 de secuencia SEQ ID NO: 309, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT” y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo según cualquiera de las definiciones a) a g) comprende además Fc2 de secuencia SEQ ID NO: 327.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo según la definición h) comprende además el conector L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389, L3 y L4 que consiste en 0 aminoácidos, y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo según la definición h) comprende además Fc2 de secuencia SEQ ID NO: 392.
En una realización, L5 de la proteína de unión de tipo anticuerpo según cualquiera de las definiciones a) a h) contiene 0 aminoácidos.
En una realización adicional, la proteína de unión de tipo anticuerpo según cualquiera de las definiciones a) a g) comprende además el conector L1 de secuencia SEQ ID NO: 307, L2 de secuencia s Eq ID NO: 309, L3 de la secuencia de aminoácidos “S”, L4 de la secuencia de aminoácidos “RT”, Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 329 y Fc de secuencia SEQ ID NO: 330.
En una realización adicional, la proteína de unión de tipo anticuerpo según la definición h) comprende además el conector L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389, L3 y L4 que consiste en 0 aminoácidos, Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313 y Fc de secuencia SEQ ID NO: 394.
En una realización adicional, la proteína de unión de tipo anticuerpo según la definición h) comprende además un muñón Fc de secuencia SEQ ID NO: 397 o SEQ ID NO: 398, o una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 397 o SEQ ID NO: 398.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo que se une específicamente a CD3e humana y CD123 humana comprende, o consiste esencialmente en:
a) un polipéptido de formula [I] que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 388 (Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385, L1 de secuencia SEQ ID NO: 3 8 9 , Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310),
o una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 388 que comprende las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO: 378, “WAS" y SEQ ID NO: 379 del dominio variable de cadena ligera de hz7G3 (Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385), y las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO:142, “KVS" y SEQ ID NO:11 del dominio variable de cadena ligera de hz20G6 (Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141); y
b) un polipéptido de formula [II] que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 390 (Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383, L4 es 0 aminoácidos y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313), o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 390 que comprende las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:384, y SEQ ID NO: 382 del dominio variable de cadena pesada de hz7G3 (Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383), y las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 del dominio variable de cadena pesada de hz20G6 (Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138);
y en la que el polipéptido de fórmula [I] y el polipéptido de fórmula [II] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo que se une específicamente a CD3e humana y CD123 humana comprende, o consiste esencialmente en:
a) un polipéptido según la fórmula [IV] de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 391 (Vd1 de secuencia SEQ iD NO: 3 8 5 , L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389, Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, L5 que contiene 0 aminoácidos, y Fc2 de secuencia SEQ ID NO: 392), o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 391 que comprende las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO: 378, “WAS" y SEQ ID NO: 379 del dominio variable de cadena ligera de hz7G3 (Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385), y las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO:142, “KVS" y SEQ ID NO:11 del dominio variable de cadena ligera de hz20G6 (Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141); y
b) un polipéptido según la fórmula [III] de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 393 (Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383, L4 es 0 aminoácidos, Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313, y Fc de secuencia SEQ ID NO: 394), o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 393 que comprende las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:384, y SEQ ID NO: 382 del dominio variable de cadena pesada de hz7G3 (Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383), y las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 del dominio variable de cadena pesada de hz20G6 (Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138);
y en la que el polipéptido de fórmula [IV] y el polipéptido de fórmula [III] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada.
En dicha proteína de unión de tipo anticuerpo, las cadenas polipeptídicas representadas por las fórmulas [III] y [IV] se dimerizan a través de sus respectivas regiones Fc2 y Fc.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo que se une específicamente a CD3e humana y CD123 humano comprende, o consiste esencialmente en:
a) un polipéptido según la fórmula [I] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 388 (Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385, L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310) o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 388 que comprende las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO: 378, “WAS" y SEQ ID NO: 379 del dominio variable de cadena ligera de hz7G3 (Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385), y las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO:142, “KVS" y SEQ ID NO:11 del dominio variable de cadena ligera de hz20G6 (Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141); y
b) un polipéptido según la fórmula [III] de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 395 (Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383, L4 es 0 aminoácidos, Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313, y Fc de secuencia SEQ ID NO: 396), o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 395 que comprende las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:384, y SEQ ID NO: 382 del dominio variable de cadena pesada de hz7G3 (Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383), y las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 del dominio variable de cadena pesada de hz20G6 (Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138); y
c) un muñón Fc (polipéptido Fc3) de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 397, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, en la que dicho muñón Fc3 o la secuencia al menos 85% idéntica a ella se heterodimeriza con la región Fc del polipéptido según la fórmula [III];
y en la que el polipéptido de fórmula [I] y el polipéptido de fórmula [III] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada.
En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo que se une específicamente a CD3e humana y CD123 humana comprende, o consiste esencialmente en:
a) un polipéptido según la fórmula [I] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 388 (Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385, L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389 y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310) o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 388 en la que las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO: 378, “WAS" y SEQ ID NO: 379 del dominio variable de cadena ligera de hz7G3 (Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385), y las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO:142, “KVS" y SEQ ID NO:11 del dominio variable de cadena ligera de hz20G6 (Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141) están inalteradas;
b) un polipéptido según la fórmula [III] de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 399 (Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383, L4 es 0 aminoácidos, Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313, y Fc de secuencia SEQ ID NO: 400), o
una secuencia al menos 85% idéntica a ella que comprende las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:384, y SEQ ID NO: 382 del dominio variable de cadena pesada de hz7G3 (Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383), y las 3 CDRs de secuencias SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 del dominio variable de cadena pesada de hz20G6 (Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138); y
c) un muñón Fc (polipéptido Fc3) de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 398, o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, en la que dicho muñón Fc3 o la secuencia al menos 85% idéntica a ella se heterodimeriza con la región Fc del polipéptido según la fórmula [III];
y en la que el polipéptido de fórmula [I] y el polipéptido de fórmula [III] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada.
Inmunoconjugados
En una realización, el anticuerpo anti-CD123 de la invención se conjuga o se une a un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico, o una enzima activadora de profármacos. En particular, los anticuerpos anti-CD123 de la invención son de hecho útiles para dirigir dicho agente inhibidor del crecimiento, agente citotóxico o un profármaco a las células cancerosas que expresan o sobreexpresan CD123 en su superficie.
Ácidos nucleicos, vectores y células hospedantes recombinantes
Una descripción adicional se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que codifica un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD123, o una proteína de unión de tipo anticuerpo como se definió anteriormente.
Normalmente, dicho ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN, que puede incluirse en cualquier vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago, o vector viral.
Los términos “vector", “vector de clonación" y “vector de expresión" significan el vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extraño) en una célula hospedante, para transformar al hospedante y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida.
Así, un objeto adicional se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de la invención.
Dichos vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador, y similares, para provocar o dirigir la expresión de dicho polipéptido tras la administración a un sujeto. Ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresión para células animales incluyen promotor temprano y potenciador de SV40 (Mizukami T. et al. 1987), promotor LTR y potenciador del virus de la leucemia de ratón de Moloney (Kuwana Y et al. 1987), promotor (Mason 10 et al. 1985) y potenciador (Gillies SD et al. 1983) de la cadena H de inmunoglobulina, y similares.
Se puede usar cualquier vector de expresión para células animales, siempre que se pueda insertar y expresar un gen que codifique la región C del anticuerpo humano. Ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107 (Miyaji H et al.
1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O’Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990), y similares. Otros ejemplos de plásmidos incluyen plásmidos replicantes que comprenden un origen de replicación, o plásmidos integradores, tales como, por ejemplo, pUC, pADNc, pBR, y similares.
Otros ejemplos de vector viral incluyen vectores adenovirales, retrovirales, herpesvirus y AAV. Dichos virus recombinantes pueden producirse mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como transfectando células de empaquetamiento o mediante transfección transitoria con plásmidos auxiliares o virus. Los ejemplos típicos de células de empaquetamiento de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Se pueden encontrar protocolos detallados para producir tales virus recombinantes de replicación defectuosa, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96/22378, US 5.882.877, US 6.013.516, US 4.861.719, US 5.278.056 y WO 94/19478.
Otro objeto se refiere a una célula que ha sido transfectada, infectada o transformada por un ácido nucleico y/o un vector según la invención.
El termino “transformación” significa la introducción de un gen “extraño” (es decir, extrínseco), secuencia de ADN o de ARN a una célula hospedante, de modo que la célula hospedante expresará el gen o secuencia introducida para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen o secuencia introducida. Una célula hospedante que recibe y expresa ADN o ARN introducido se ha “transformado”.
Los ácidos nucleicos se pueden usar para producir un anticuerpo recombinante de la invención en un sistema de expresión adecuado. La expresión “sistema de expresión” significa una célula hospedante y un vector compatible en condiciones adecuadas, por ejemplo, para la expresión de una proteína codificada por ADN extraño transportado por el vector e introducido en la célula hospedante.
Los sistemas de expresión comunes incluyen células hospedantes de E. coli y vectores plasmídicos, células hospedantes de insectos y vectores de baculovirus, y células hospedantes y vectores de mamíferos. Otros ejemplos de células hospedantes incluyen, sin limitación, células procariotas (tales como bacterias) y células eucariotas (tales como células de levadura, células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. coli, levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces, líneas celulares de mamíferos (por ejemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.) así como cultivos de células de mamíferos primarios o establecidos (por ejemplo, producidos a partir de linfoblastos, fibroblastos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Los ejemplos también incluyen la célula SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC CRL1581), la célula P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC CRL1580), la célula c Ho en la que un gen de dihidrofolato reductasa (en lo sucesivo denominado “gen DHFR”) es defectuoso (Urlaub G et al; 1980), la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC CRL1662, en lo sucesivo denominada “célula YB2/0”), y similares. Se prefiere la célula YB2/0, ya que la actividad ADCC de los anticuerpos quiméricos o humanizados aumenta cuando se expresa en esta célula.
En particular, para la expresión de un anticuerpo humanizado o una proteína de unión de tipo anticuerpo, el vector de expresión puede ser de un tipo en el que existe un gen que codifica una cadena pesada de anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera de anticuerpo en vectores separados, o de un tipo en que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de anticuerpos humanizados y de proteínas de unión de tipo anticuerpo, la facilidad de introducción en células animales, y el equilibrio entre los niveles de expresión de las cadenas H y L del anticuerpo en células animales, se prefiere el vector de expresión de anticuerpos humanizados del tipo tándem (Shitara K et al. J Immunol Methods. 1994 Jan. 3; 167(1-2):271-8). Ejemplos de vector de expresión de anticuerpos humanizados de tipo tándem incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18, y similares.
También se describe un método para producir una célula hospedante recombinante que expresa un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD123, o una proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico recombinante o un vector como se describe anteriormente en una célula hospedante competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula hospedante recombinante obtenida, y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o segregan dicho anticuerpo.
Dichas células hospedantes recombinantes se pueden usar para la producción de anticuerpo anti-CD3, al menos un anticuerpo anti-CD123, o al menos una proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención.
Métodos para producir proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención
También se proporciona un método para obtener una proteína de unión de tipo anticuerpo que comprende dos cadenas polipeptídicas que forman dos sitios de unión a antígeno, en la que un primer polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [I]:
VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
y un segundo polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [II]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1 [II]
en las que:
Vdi es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
Vd2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
Vd3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
Vd4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de cadena pesada Ch1 de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , y L4 son conectores de aminoácidos;
y en la que el primer y el segundo polipéptido forman un par entrecruzado cadena ligera-cadena pesada, y en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas ligeras, o Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas pesadas.
La descripción proporciona un método para obtener una proteína de unión de tipo anticuerpo que comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman cuatro sitios de unión a antígeno, en la que dos cadenas polipeptídicas tienen una estructura representada por la fórmula [I]:
VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
y dos cadenas polipeptídicas tienen una estructura representada por la fórmula (III):
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]
en las que:
Vd1 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
Vd2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
Vd3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
Vd4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de cadena pesada Ch1 de una inmunoglobulina;
Fc es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , y L4 son conectores de aminoácidos;
y en la que los polipéptidos de fórmula I y los polipéptidos de fórmula III forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada, y
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas ligeras, o Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas pesadas.
En una realización adicional, la invención proporciona un método para obtener una proteína de unión de tipo anticuerpo que comprende cuatro cadenas polipeptídicas que forman cuatro sitios de unión a antígeno, en la que dos cadenas polipeptídicas tienen una estructura representada por la fórmula [IV]:
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2 [IV]
y dos cadenas polipeptídicas tienen una estructura representada por la fórmula [III]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]
en las que:
Vdi es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
Vd2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
Vd3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
Vd4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de cadena pesada Ch1 de una inmunoglobulina;
Fc es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
Fc2 es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2 , CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , L4 y L5 son conectores de aminoácidos;
y en la que los polipéptidos de fórmula I y los polipéptidos de fórmula III forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada, y
en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas ligeras, o Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas pesadas.
En un aspecto, la primera inmunoglobulina o la segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD3 como se define en la sección «anticuerpos anti-CD3» anterior.
En otro aspecto, la primera inmunoglobulina o la segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 como se define en la sección «anticuerpos anti-CD123» anterior.
Un anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD123 y/o proteínas de unión de tipo anticuerpo se pueden producir mediante cualquier técnica conocida en la técnica, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, ya sea sola o en combinación.
Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la técnica puede producir fácilmente dichos anticuerpos o cadenas de inmunoglobulinas, mediante técnicas estándar para la producción de polipéptidos. Por ejemplo, se pueden sintetizar usando un método en fase sólida bien conocido, en particular usando un aparato de síntesis de péptidos disponible comercialmente (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, los anticuerpos, las cadenas de inmunoglobulina y las proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención se pueden sintetizar mediante técnicas de ADN recombinante como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, estos fragmentos se pueden obtener como productos de expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican el (poli)péptido deseado en vectores de expresión y de la introducción de dichos vectores en hospedantes eucariotas o procariotas adecuados que expresarán el polipéptido deseado, a partir del cual pueden ser posteriormente aislados usando técnicas bien conocidas.
En particular, la descripción se refiere además a un método para producir anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD123 y/o proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención, método el cual comprende las etapas que consisten en: (i) cultivar una célula hospedante transformada según la invención; (ii) expresar dicho anticuerpo o polipéptido; y (iii) recuperar el anticuerpo o polipéptido expresado.
Los anticuerpos anti-CD3, los anticuerpos anti-CD123 y/o las proteínas de unión de tipo anticuerpo se separan adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
En una realización particular, los anticuerpo anti-CD3 y/o anti-CD123 quiméricos humanizados se puede producir obteniendo secuencias nucleicas que codifiquen dominios VL y VH humanizados como se describió previamente, construyendo un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano al insertarlas en un vector de expresión para célula animal que tiene genes que codifican CH del anticuerpo humano y CL del anticuerpo humano, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresión en una célula animal. De manera análoga a esto, una proteína de unión de tipo anticuerpo humanizado se puede obtener usando para el dominio variable de la cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina humanizada (Vd1), para el dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina humanizada (Vd2), para el dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina (Vd3), y para el dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de dos anticuerpos humanizados.
Como el dominio CH de un anticuerpo quimérico humano o el dominio CH de la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención, puede ser cualquier región que pertenezca a cadenas pesadas de inmunoglobulina humana, pero son adecuadas aquellas de la clase IgG, y también se puede usar una cualquiera de las subclases que pertenecen a la clase IgG, tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Además, como CL de un anticuerpo quimérico humano o CL de una proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención, puede ser cualquier región que pertenezca a las cadenas ligeras de inmunoglobulina humana, y se pueden usar las de clase kappa o lambda.
Los métodos para producir anticuerpos humanizados o quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección génica que son bien conocidas en la técnica (véanse Morrison SL. et al. (1984) y documentos de patente US5.202.238; y US5.204.244).
Los métodos para producir anticuerpos humanizados basados en técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección génica son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985). Los anticuerpos se pueden humanizar usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, la técnica descrita en la solicitud WO2009/032661, injerto de CDRs (documento EP 239.400; publicación PCT WO91/09967; patentes U.S. nos 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), revestimiento o remodelación de la superficie (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)), y barajado de cadenas (patente U.S. n° 5.565.332). También se conoce la tecnología de ADN recombinante general para la preparación de tales anticuerpos (véase la Solicitud de Patente Europea EP 125023 y Solicitud de Patente Internacional WO 96/02576).
El Fab se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con CD3 o CD123 con una proteasa, tal como la papaína. También, el Fab se puede producir insertando secuencias de ADN que codifican ambas cadenas del Fab del anticuerpo en un vector para la expresión procariota, o para la expresión eucariota, e introduciendo el vector en células procariotas o eucariotas (según corresponda) para expresar el Fab.
El F(ab’)2 se puede obtener tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con CD3 o CD123 con una proteasa, pepsina. También, el F(ab’)2 se puede producir uniendo el Fab’ descrito a continuación mediante un enlace de tioéter o un enlace de disulfuro.
El Fab’ puede obtenerse tratando F(ab’)2 que reacciona específicamente con CD3 o CD123 con un agente reductor, tal como ditiotreitol. También, el Fab’ puede producirse insertando secuencias de ADN que codifican cadenas Fab’ del anticuerpo en un vector para la expresión procariota, o un vector para la expresión eucariota, e introduciendo el vector en células procariotas o eucariotas (según corresponda) para realizar su expresión.
El scFv puede producirse tomando secuencias de las CDRs o dominios VH y VL como se describió anteriormente, construyendo un ADN que codifica un fragmento scFv, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o eucariota, e introduciendo entonces el vector de expresión en células procariotas o eucariotas (según corresponda) para expresar el scFv. Para generar un fragmento scFv humanizado, se puede usar una tecnología bien conocida denominada injerto de CDRs, que implica seleccionar las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) según la invención, e injertarlas en un marco de fragmento scFv humano de estructura tridimensional conocida (véanse, por ejemplo, los documentos WO98/45322; WO 87/02671; US5.859.205; US5.585.089; US4.816.567; EP0173494).
Modificación de los anticuerpos de la invención
Se contemplan modificación o modificaciones de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos o proteínas de unión de tipo anticuerpo como se describe aquí. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo o de la proteína de unión de tipo anticuerpo. Por ejemplo, se sabe que cuando se produce un anticuerpo humanizado simplemente injertando solo CDRs en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en FRs de VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de unión al antígeno se puede reducir en comparación con el del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Se considera que varios restos de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo no humano, no solo en las CDRs sino también en las FRs, pueden estar asociados directa o indirectamente con la actividad de unión al antígeno. Por lo tanto, la sustitución de estos restos de aminoácidos por diferentes restos de aminoácidos derivados de las FRs de VH y VL del anticuerpo humano reduciría la actividad de unión. Para resolver el problema, en los anticuerpos humanos injertados con CDRs no humanas, se debe intentar identificar, entre las secuencias de aminoácidos de la FR del VH y VL de los anticuerpos humanos, un resto de aminoácido que está directamente asociado con unión del anticuerpo, o que interactúa con un resto de aminoácido de una CDR, o que mantiene la estructura tridimensional del anticuerpo y que está directamente asociado con la unión al antígeno. La actividad de unión al antígeno reducida podría incrementarse reemplazando los aminoácidos identificados por restos de aminoácidos del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Una proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención puede comprender las regiones variables de un anticuerpo humanizado, y por lo tanto se aplican aquí igualmente las consideraciones mencionadas a las proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención.
Se pueden realizar modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente invención, y en las secuencias de ADN que los codifican, y aún así dar como resultado un anticuerpo funcional, proteína de unión de tipo anticuerpo o polipéptido con características deseables.
Al realizar los cambios en las secuencias de aminoácidos del polipéptido, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se comprende generalmente en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a su hidrofobia y características de carga, estas son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato -3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Un objeto adicional de la presente invención también incluye variantes de función conservativa de los polipéptidos de los anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD123 y proteínas de unión de tipo anticuerpo de la presente invención.
Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura proteica sin una pérdida apreciable de actividad. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen su actividad funcional biológica, se pueden realizar ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia de proteína, y por supuesto en su secuencia codificante de ADN, obteniendo no obstante una proteína con propiedades similares. De este modo, se contempla que se pueden realizar diversos cambios en las secuencias de anticuerpos de la invención, o en las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos polipéptidos, sin una pérdida apreciable de su actividad biológica.
Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía dan como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía obtienen una proteína biológica funcionalmente equivalente. También es posible usar tecnologías bien establecidas, tales como enfoques de barrido de alanina, para identificar, en un anticuerpo o polipéptido de la invención, todos los aminoácidos que pueden sustituirse sin una pérdida significativa de unión al antígeno. Dichos restos se pueden calificar como neutros, ya que no participan en la unión al antígeno ni en el mantenimiento de la estructura del anticuerpo. Una o más de estas posiciones neutras pueden ser sustituidas por alanina o por otro aminoácido sin cambiar las características principales del anticuerpo o polipéptido de la invención.
Como se indicó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones ejemplares que toman en consideración varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
También puede ser deseable modificar el anticuerpo anti-CD3, el anticuerpo anti-CD123 y la proteína de unión de tipo anticuerpo de la presente invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para potenciar o reducir la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo, también denominadas aquí variantes Fc en contexto con las proteínas de unión de tipo anticuerpo de la presente invención. Alternativa o adicionalmente, se pueden introducir restos de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces de disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada o reducida y/o una mayor destrucción celular mediada por el complemento y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Caron PC. et al. 1992; y Shopes B. 1992).
Otro tipo de modificación de aminoácidos del anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD123 y proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención puede ser útil para alterar el patrón de glicosilación original del anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD123 y proteína de unión de tipo anticuerpo, es decir, eliminando uno o más restos de hidratos de carbono que se encuentran en el anticuerpo anti-CD3, el anticuerpo anti-CD123 y la proteína de unión de tipo anticuerpo, y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD123 y proteína de unión de tipo anticuerpo. La presencia de cualquiera de las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, crea un sitio de glicosilación potencial. La adición o supresión de sitios de glicosilación al anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD123 y proteína de unión de tipo anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación enlazados mediante N).
Otro tipo de modificación implica la eliminación de secuencias identificadas, ya sea in silico o experimentalmente, que dan como resultado potencialmente productos de degradación o heterogeneidad de las preparaciones de anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD123 y de proteínas de unión de tipo anticuerpos. Por ejemplo, la desamidación de restos de asparagina y glutamina puede ocurrir dependiendo de factores tales como el pH y la exposición de la superficie. Los restos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor grado en otras secuencias dipeptídicas tales como Asn-Ala. Cuando un sitio de desamidación de este tipo, en particular Asn-Gly, está presente en un anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD123 y proteína de unión de tipo anticuerpo o polipéptido de la invención, puede ser deseable por lo tanto eliminar el sitio, típicamente mediante sustitución conservativa para eliminar uno de los restos implicados. También se pretende que dichas sustituciones en una secuencia para eliminar uno o más de los restos implicados estén incluidas en la presente invención.
Otro tipo de modificación covalente implica el acoplamiento químico o enzimático de glucósidos con el anticuerpo anti-CD3, el anticuerpo anti-CD123 y la proteína de unión de tipo anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD123 o proteína de unión de tipo anticuerpo en una célula hospedante que tiene capacidades de glicosilación para la glicosilación enlazada mediante N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Por ejemplo, tales métodos se describen en el documento WO87/05330.
La eliminación de cualquier resto de hidrato de carbono presente en el anticuerpo anti-CD3, el anticuerpo anti-CD123 o la proteína de unión de tipo anticuerpo se puede lograr de forma química o enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición del anticuerpo anti-CD3, el anticuerpo anti-CD123 o la proteína de unión de tipo anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o de todos los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando intacto el anticuerpo. La desglicosilación química está descrita por Sojahr H. et al. (1987) y por Edge, AS. et al. (1981). La escisión enzimática de los restos de hidratos de carbono en los anticuerpos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas, como se describe por Thotakura, NR. et al. (1987).
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD123 o proteína de unión de tipo anticuerpo comprende unir el anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes US nos 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.
Composiciones farmacéuticas
El anticuerpo anti-CD3, el anticuerpo anti-CD123 y/o la proteína de unión de tipo anticuerpo se pueden combinar con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas.
De este modo, otro objeto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también se refiere a una proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención, para uso como medicamento. La invención también se refiere a una composición farmacéutica de la invención para uso como medicamento.
Las expresiones “composición farmacéutica” o “composición terapéutica”, como se usan aquí, se refieren a un compuesto o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra correctamente a un paciente.
Dichas composiciones terapéuticas o farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión de tipo anticuerpo o conjugados de fármacos de la misma, mezclados con un agente de formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptable seleccionado por su idoneidad con el modo de administración.
“Farmacéuticamente” o “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción adversa cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según corresponda. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga sólida, semisólida o líquida no tóxica, diluyente, material encapsulante o auxiliar de formulación de cualquier tipo.
Como se usa aquí, “vehículos farmacéuticamente aceptables” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen uno o más de agua, aminoácidos, disolución salina, disolución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, y similares, así como una combinación de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, polialcoholes o cloruro de sodio en la composición, y la formulación también puede contener un antioxidante tal como triptamina y un agente estabilizador tal como Tween 20.
La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen dependen naturalmente de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso, y el sexo del paciente, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, o intraocular, y similares.
En particular, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de inyectarse. Estas pueden ser en particular disoluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, y similares, o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que tras la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o suero fisiológico, permiten la constitución de disoluciones inyectables.
Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse en función de diversos parámetros, y en particular en función del modo de administración usado, de la patología relevante, o alternativamente, de la duración deseada del tratamiento.
Para preparar composiciones farmacéuticas, se puede disolver o dispersar una cantidad eficaz del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete, o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua mezclada de manera adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Una proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención se puede formular en una composición en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, glicina, histidina, procaína, y similares.
El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado a vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una disolución previamente filtrada de forma estéril del mismo.
También se contempla la preparación de disoluciones más concentradas o altamente concentradas para inyección directa, en las que se prevé que el uso de DMSO como disolvente dé como resultado una penetración extremadamente rápida, liberando altas concentraciones de los agentes activos a una pequeña área del tumor.
Tras la formulación, las disoluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de disoluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se pueden emplear cápsulas de liberación de fármacos, y similares.
Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución debe amortiguarse adecuadamente si es necesario, y el diluyente líquido debe hacerse primero isotónico con suficiente disolución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán los medios acuosos estériles que pueden emplearse a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 ml de disolución isotónica de NaCl, y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, “Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente se producirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.
En una realización, una proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención se formula dentro de una mezcla terapéutica para comprender alrededor de 0,01 a 100 miligramos, por dosis más o menos.
Además de la proteína de unión de tipo anticuerpo formulada para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación prolongada; y cualquier otra forma usada actualmente.
En determinadas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartículas para la introducción de polipéptidos tales como anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD123 o proteína de unión de tipo anticuerpo en células hospedantes. Los expertos en la técnica conocen la formación y el uso de liposomas y/o nanopartículas.
Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, tales partículas ultrafinas (de un tamaño de alrededor de 0,1 pm) se diseñan generalmente usando polímeros que pueden degradarse in vivo. Las nanopartículas biodegradables de polialquil-cianoacrilato que cumplen estos requisitos se contemplan para uso en la presente invención, y tales partículas se pueden preparar fácilmente.
Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapa concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas multilaminares (MLVs)). Las MLVs generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 pm. La sonicación de MLVs da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilaminares (SUVs) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Á, que contienen una disolución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.
Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, se puede almacenar en viales estériles como disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para uso, o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiera reconstitución antes de la administración.
Métodos y usos terapéuticos
Los inventores han demostrado para varios compuestos biespecíficos de la invención, tales como “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4”,”hz4B4x3E3” y “hz20G6x7G3-TL4”, citotoxicidad mediada por células T en un modelo de línea de células tumorales positivas para CD123. Además, los inventores demostraron la capacidad de varios compuestos biespecíficos de la invención para activar las células T en presencia de células diana que conducen a la citotoxicidad de las células tumorales. Los inventores demostraron además la baja activación de las células T en ausencia de activación de las células T en ausencia de células diana.
Es bien sabido que los anticuerpos monoclonales anti-CD123 terapéuticos pueden conducir al agotamiento de las células que portan el antígeno específicamente reconocido por el anticuerpo. Este agotamiento puede estar mediado por al menos tres mecanismos: citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) e inhibición antitumoral directa del crecimiento tumoral a través de señales dadas a través del antígeno seleccionado como diana por el anticuerpo. En una realización, los anticuerpos anti-CD123 de la invención inducen citotoxicidad en una célula que expresa CD123 mediante citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
“Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento a los anticuerpos que se unen a su antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al. (1997).
“Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que los anticuerpos segregados unidos sobre los receptores Fc (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora antígeno, y subsiguientemente exterminen a la célula diana. Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente US n° 5.500.362 o 5.821.337.
Como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD3”, los anticuerpos anti-CD3 de la invención tienen una baja activación de células T, por lo que tienen un potencial terapéutico en un sujeto para uso como agente inmunosupresor.
Además, una proteína de unión de tipo anticuerpo como se define anteriormente tiene como objetivo mejorar la respuesta inmune del paciente a los tumores dirigiendo las células T a las células tumorales. En una realización, la proteína de unión de tipo anticuerpo como se define anteriormente se dirige a la subunidad CD3e del receptor de células T (TCR) en la superficie de la célula T, y el otro brazo se dirige a una célula cancerosa que expresa CD123, en el que el acoplamiento conjunto de las células T y las células tumorales mediante el constructo biespecífico conduce a la formación de una sinapsis citolítica que induce la activación de las células T y da como resultado la muerte de las células tumorales. La muerte de las células tumorales puede estar mediada por al menos dos mecanismos: la muerte mediante perforina/granzima y la muerte mediante FasL/Fas, por ejemplo, la muerte mediante perforina/granzima.
Por lo tanto, la descripción proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD123, una proteína de unión de tipo anticuerpo, o una composición farmacéutica de la invención como se define anteriormente en la sección “Composición farmacéutica”.
La descripción se refiere además al uso de un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD123, una proteína de unión de tipo anticuerpo, o una composición farmacéutica de la invención para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto. En una realización, la invención se refiere al uso de una proteína de unión de tipo anticuerpo o una composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto.
El término “sujeto” o “individuo” se usan indistintamente, y pueden ser, por ejemplo, un mamífero humano o no humano. Por ejemplo, el sujeto es un murciélago; un hurón; un conejo; un felino (gato); un canino (perro); un primate (mono), un equino (caballo); un ser humano, incluyendo el hombre, la mujer y el niño. En una realización, un “sujeto” se refiere a un ser humano.
En el contexto de la invención, el término “tratar” o “tratamiento”, se refiere a un uso terapéutico (es decir, en un sujeto que tiene una enfermedad determinada), y significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de uno o más síntomas de tal trastorno o afección. Por lo tanto, el tratamiento no solo se refiere a un tratamiento que conduce a una cura completa de la enfermedad, sino también a tratamientos que ralentizan la progresión de la enfermedad y/o prolongan la supervivencia del sujeto.
Por “prevenir” se quiere decir un uso profiláctico (es decir, en un sujeto susceptible de desarrollar una enfermedad determinada).
En una realización, una “enfermedad” o “trastorno” es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo anti-CD123 o la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención. En una realización, esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos, incluyendo aquellas afecciones patológicas que predisponen al sujeto al trastorno en cuestión. La expresión “que necesita tratamiento” se refiere a un sujeto que ya tiene el trastorno, así como a aquellos en los que se debe prevenir el trastorno.
En una realización, una “enfermedad” o “trastorno” es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo anti-CD3 de la invención. Por lo tanto, en una realización, esto incluye enfermedades o trastornos caracterizados por respuestas inmunes patológicas.
Una “respuesta inmune patológica”, en el contexto de la invención, es una respuesta inmune inflamatoria.
En una realización, la enfermedad, caracterizada por una respuesta inmunitaria patológica, es una enfermedad autoinmune, una enfermedad relacionada con el trasplante, o una enfermedad asociada con la inflamación.
La enfermedad autoinmune es, por ejemplo, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, y la diabetes tipo 1, o una enfermedad relacionada con el trasplante, tal como la enfermedad de injerto contra hospedante (GVHD).
Por lo tanto, en una realización, se ha diagnosticado que el sujeto padece una enfermedad o trastorno caracterizado por una respuesta inmunitaria patológica.
En una realización, se ha diagnosticado que el sujeto padece una enfermedad autoinmune.
En otra realización, el trastorno se refiere a cáncer.
En una realización adicional, el cáncer se refiere a cáncer hematológico, en particular a cáncer hematológico asociado con la expresión de CD123.
En una realización, la expresión de CD123 por células cancerosas se analiza fácilmente por ejemplo usando un anticuerpo anti-CD123 según la invención, como se describe en la siguiente sección “Usos diagnósticos”.
“Cánceres hematológicos asociados con la expresión de CD123” incluye leucemias (tales como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica, leucemia de células pilosas, y síndrome de mielodisplasia) y afecciones linfoproliferativas malignas, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), mastocitosis sistémica, incluyendo linfomas (tales como mieloma múltiple, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, y linfoma folicular de células pequeñas y células grandes).
Como se describió anteriormente en la sección “anticuerpos anti-CD123”, las LSCs expresan CD123.
De este modo, en una realización relacionada, el cáncer se refiere a cáncer hematológico asociado con las células madre leucémicas.
Las afecciones de cáncer hematológico asociadas con células madre leucémicas (LSCs) que se van a tratar según la presente invención incluyen leucemias (tales como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica, y síndrome de mielodisplasia) y afecciones linfoproliferativas malignas, incluyendo los linfomas (tales como mieloma múltiple, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, y linfoma folicular de células pequeñas y de células grandes).
En un aspecto de la invención, el cáncer hematológico es leucemia mielógena aguda (AML).
En una realización, se ha diagnosticado que el sujeto padece AML.
En una realización adicional, el sujeto ya ha sido tratado con quimioterapia hasta la remisión completa, pero recayó.
La “recaída” se define como la reaparición de la AML después de la remisión completa.
“Remisión completa” o “CR” se define como sigue: valores normales para neutrófilos (>1,0*109/l), nivel de hemoglobina de 10 g/dl, y recuento de plaquetas (>100*109/l) e independencia de la transfusión de glóbulos rojos; células blásticas menor que 5%, sin agrupaciones o colecciones de blastos, y ausencia de bastones de Auer en el examen de la médula ósea; y maduración normal de las células sanguíneas (morfología; mielograma) y ausencia de leucemia extramedular.
En una realización, el anticuerpo anti-CD3, el anticuerpo anti-CD123 o la proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención se usa solo o en combinación con cualquier agente inhibidor del crecimiento adecuado.
Por una “cantidad terapéuticamente eficaz” del polipéptido de la invención se quiere decir una cantidad suficiente del polipéptido para tratar dicha enfermedad cancerosa, con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los polipéptidos y composiciones de la presente invención se decidirá por el médico tratante dentro del alcance de un juicio médico sólido. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; actividad del polipéptido específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, y la dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración, y la velocidad de excreción del polipéptido específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o coincidentemente con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, es bien conocido dentro de la experiencia en la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado.
En una realización, la eficacia del tratamiento con un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD123 o una proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención o inmunoconjugado según la invención se evalúa fácilmente in vivo, por ejemplo, en un modelo de cáncer de ratón, y midiendo, por ejemplo, cambios en el volumen del tumor entre los grupos tratados y de control.
Usos diagnósticos
Se ha dado a conocer que CD123 se sobreexpresa en la superficie de una variedad de neoplasias hematológicas.
Por lo tanto, CD123 constituye un marcador de cáncer y, por lo tanto, tiene el potencial de usarse para indicar la eficacia de una terapia anticancerosa o detectar la recurrencia de la enfermedad.
En un aspecto, el anticuerpo anti-CD123 se usa como componente de un ensayo en el contexto de una terapia dirigida a tumores que expresan CD123, con el fin de determinar la susceptibilidad del paciente al agente terapéutico, monitorizar la efectividad de la terapia contra el cáncer, o detectar la recurrencia de la enfermedad después del tratamiento. En particular, el mismo anticuerpo anti-CD123 de la invención se usa como componente del agente terapéutico y como componente del ensayo de diagnóstico.
De este modo, otro objeto se refiere a un anticuerpo anti-CD123 para uso detectar in vivo la expresión de CD123 en un sujeto, o para uso para detectar ex vivo la expresión de CD123 en una muestra biológica de un sujeto. En un aspecto, dicha detección está destinada, en particular, a:
a) diagnosticar la presencia de un cáncer en un sujeto, o
b) determinar la susceptibilidad de un paciente que tiene cáncer a un agente terapéutico dirigido a CD123, en particular un anticuerpo anti-CD123 o una proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención, o c) monitorizar la eficacia de la terapia del cáncer anti-CD123 o detectar la recaída del cáncer después de la terapia del cáncer anti-CD123, en particular para la terapia con un anticuerpo anti-CD123 o una proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención; detectando la expresión de la proteína de superficie CD123 en células tumorales. En un aspecto, el anticuerpo está destinado para uso in vitro o ex vivo. Por ejemplo, CD123 se detecta in vitro o ex vivo en una muestra biológica obtenida de un sujeto, usando un anticuerpo anti-CD123. El uso también puede ser un uso in vivo. Por ejemplo, se administra al sujeto un anticuerpo anti-CD123 o una proteína de unión de tipo anticuerpo, y se detectan y/o cuantifican los complejos anticuerpo-células, por lo que la detección de dichos complejos es indicativa de un cáncer.
La descripción se refiere además a un método para detectar in vitro o ex vivo la presencia de un cáncer en un sujeto, que comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo anti-CD123 según la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c) detectar la presencia de un cáncer comparando el nivel medido de anticuerpo unido con un control, siendo indicativo de un cáncer un nivel aumentado de anticuerpo unido en comparación con el control.
La descripción también se refiere a un método para determinar in vitro o ex vivo la susceptibilidad de un paciente que tiene cáncer a un agente terapéutico dirigido a CD123, en particular a un anticuerpo anti-CD123 o proteína de unión de tipo anticuerpo según la invención, método el cual comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer con un anticuerpo anti-CD123 según la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c) comparar el nivel medido de anticuerpo unido a dicha muestra biológica con el nivel de anticuerpo unido a un control;
en el que un nivel aumentado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica en comparación con el control es indicativo de un paciente susceptible a un agente terapéutico dirigido a al menos CD123.
En los métodos anteriores, dicho control puede ser una muestra biológica normal, no cancerosa, del mismo tipo, o un valor de referencia determinado como representativo del nivel de unión del anticuerpo en una muestra biológica normal del mismo tipo.
En una realización, el anticuerpo anti-CD123 es útil para diagnosticar cánceres hematológicos asociados con la expresión de CD123, incluyendo leucemias (tales como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica, leucemia de células pilosas, y síndrome de mielodisplasia) y afecciones linfoproliferativas malignas, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), mastocitosis sistémica, incluyendo linfomas (tales como mieloma múltiple, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, y linfoma folicular de células pequeñas y células grandes).
La invención se refiere además a un método in vitro o ex vivo para monitorizar la eficacia de la terapia contra el cáncer anti-CD123, que comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto sometido a terapia de cáncer anti-CD123, con una proteína de unión de tipo anticuerpo anti-CD123 según la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c) comparar el nivel medido de anticuerpo unido con el nivel de anticuerpo unido a un control;
en el que un nivel reducido de anticuerpo unido a dicha muestra biológica en comparación con el control es indicativo de la eficacia de dicha terapia contra el cáncer anti-CD123.
En dicho método, un nivel aumentado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica en comparación con el control es indicativo de la ineficacia de dicha terapia contra el cáncer anti-CD123.
Dicho control es en particular una muestra biológica del mismo tipo que la muestra biológica sometida a análisis, pero que se obtuvo del sujeto previamente en el tiempo, durante el transcurso de la terapia contra el cáncer anti-CD123.
La invención se refiere además a un método in vitro o ex vivo para detectar la recaída del cáncer después de la terapia contra el cáncer anti-CD123, que comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto que ha completado la terapia contra el cáncer anti-CD123, con una proteína de unión de tipo anticuerpo anti-CD123 según la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c) comparar el nivel medido de anticuerpo unido con el nivel de anticuerpo unido a un control;
en el que un nivel aumentado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica en comparación con el control es indicativo de una recaída del cáncer después de la terapia contra el cáncer anti-CD123.
Dicho control es, en particular, una muestra biológica del mismo tipo que la muestra biológica sometida a análisis, pero que se obtuvo del sujeto previamente en el tiempo, al finalizar o después de la terapia contra el cáncer anti-CD123.
Dicha terapia contra el cáncer anti-CD123 es en particular una terapia que usa un anticuerpo anti-CD123 o una proteína de unión de tipo anticuerpo o inmunoconjugado según la invención. Dicha terapia contra el cáncer anti-CD123 se dirige a un cáncer que expresa CD123, en particular cánceres hematológicos asociados con la expresión de CD123, que incluyen leucemias (tales como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica, leucemia de células pilosas, y síndrome de mielodisplasia) y afecciones linfoproliferativas malignas, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), mastocitosis sistémica, incluyendo linfomas (tales como mieloma múltiple, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, y linfoma folicular de células pequeñas y células grandes).
En una realización, el anti-CD123 se marca con una molécula o sustancia detectable, tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva, o cualquier otro marcador conocido que proporcione (directa o indirectamente) una señal.
Como se usa aquí, el término “marcado”, con respecto al anticuerpo anti-CD123 según la invención, pretende abarcar el marcaje directo del anticuerpo anti-CD123 mediante el acoplamiento (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable, tal como un agente radiactivo o un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5)) al polipéptido, así como marcaje indirecto del polipéptido por reactividad con una sustancia detectable.
En una realización adicional, un anticuerpo anti-CD123 se marca con una molécula radiactiva mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las moléculas radiactivas incluyen, pero no se limitan a, un átomo radiactivo para estudios gammagráficos, tales como I123, I124, In111, Re186, Re188, Tc99. En un ejemplo, los polipéptidos de la invención también están marcados con un marcador de espín para formación de imágenes mediante resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como formación de imágenes mediante resonancia magnética, MRI), tales como yodo-123, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Una “muestra biológica” abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto, y se puede usar en un ensayo de diagnóstico o monitorización. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras tisulares sólidas tales como una muestra de biopsia o cultivos o células tisulares derivados de ella, y la progenie de los mismos. Por lo tanto, las muestras biológicas abarcan muestras clínicas, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico, y muestras de tejido, en particular muestra tumoral.
La descripción también se refiere a un método in vivo para detectar la presencia de un cáncer en un sujeto, que comprende las etapas que consisten en:
a) administrar un anticuerpo según la invención marcado de forma detectable a un paciente;
b) detectar la localización de dicho anticuerpo marcado de forma detectable en el paciente mediante formación de imágenes.
En una realización, los anticuerpos de la invención son útiles para la estadificación del cáncer (por ejemplo, en formación de radioimágenes). Se usan, por ejemplo, solos o en combinación con otros marcadores de cáncer.
Los términos “detección” o “detectado”, como se usan aquí, incluyen detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medida) con o sin referencia a un control.
En el contenido de la invención, el término “diagnosticar”, como se usa aquí, significa la determinación de la naturaleza de una afección médica destinada a identificar una patología que afecta al sujeto a partir de una serie de datos recopilados.
En dicho método, el cáncer es un cáncer que expresa CD123 como se definió anteriormente.
Kits
Finalmente, la descripción también proporciona kits que comprenden al menos un anticuerpo anti-CD3, al menos un anticuerpo anti-CD123 o al menos una proteína de unión de tipo anticuerpo de la invención. Los kits que contienen anticuerpos anti-CD123 o anti-CD3 de la invención encuentran uso para detectar la proteína de superficie CD123 o CD3, o en ensayos terapéuticos o de diagnóstico. Los kits de la invención pueden contener un polipéptido o anticuerpo anti-CD3, al menos un anticuerpo anti-CD123 o al menos una proteína de unión de tipo anticuerpo acoplada a un soporte sólido, por ejemplo, una placa de cultivo tisular o perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Se pueden proporcionar kits que contienen anticuerpos para la detección y cuantificación de la proteína de superficie CD123 o CD3 in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. En una realización, dicho anticuerpo es útil para la detección, y se proporciona con un marcador tal como un marcador fluorescente o radiactivo.
En un aspecto, la descripción abarca kits para producir una unidad de administración de dosis única. Cada uno de los kits puede contener tanto un primer recipiente que tiene una proteína seca como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. También se incluyen dentro del alcance de esta invención los kits que contienen jeringas precargadas de una o varias cámaras (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas).
A lo largo de la presente solicitud, la expresión “que comprende” debe interpretarse como que abarca todas las características mencionadas específicamente, así como las opcionales, adicionales, no especificadas. Como se usa aquí, el uso de la expresión “que comprende” también describe la realización en la que no están presentes características distintas de las características mencionadas específicamente (es decir, “que consiste en”). Además, el artículo indefinido “un” o “una” no excluye una pluralidad. El mero hecho de que determinadas medidas se mencionen en reivindicaciones dependientes diferentes entre sí no indica que una combinación de estas medidas no pueda usarse ventajosamente.
La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a las siguientes figuras y ejemplos. Aunque la invención se ha ilustrado y descrito en detalle en la descripción anterior, los ejemplos deben considerarse ilustrativos o ejemplares y no restrictivos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína CD3e humana, que incluye el péptido señal, como está disponible de la base de base de datos de Uniprot bajo el número de acceso P07766.
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína CD3e de Macaca fascicularis, que incluye el péptido señal, como está disponible de la base de base de datos de Uniprot bajo el número de acceso Q95LI5.
La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la fusión Fc etiquetada con His de CD3e humana madura que comprende los aminoácidos 23 a 126 de la proteína CD3e humana de tipo salvaje de longitud completa.
La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la fusión Fc de CD3e de Macaca fascicularis madura que comprende los aminoácidos 23 a 117 de la proteína CD3e de Macaca fascicularis de tipo salvaje de longitud completa (SEQ ID NO: 2) que contiene un intercambio Ala a Val en la posición de aminoácido 35 en comparación con la posición de aminoácido 57 de la secuencia de tipo salvaje.
La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo “20G6-F3”.
Las SEQ ID NO: 6, 7 y 8 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1 -H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo “20G6-F3”.
La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo “20G6-F3”.
La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1-L de los denominados anticuerpos “20G6-F3”, “11D7-C3”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1E6-C9, “10F4-C10”, “18G9-H11”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “8C2-F7”, “20E5-F10” y “3H6-D2”.
La SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-L de los denominado anticuerpos “20G6-F3”, “4B4-D7”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “10F4-C10”, “4E7-C9”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “20E5-F10” y “3H6-D2”.
La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo “4B4-D7”.
La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1-H de los denominados anticuerpos “4B4-D7”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “10F4-C10”, “18G9-H11”, “4E7-C9”, “11F3-B9”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20B5-F10” y “3H6-D2”.
Las SEQ ID NO: 14 y 15 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo “4B4-D7”.
La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo “4B4-D7”.
La SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1-L de los denominados anticuerpos “4B4-D7”, “11H3-E5” y “11F3-B9”.
La SEQ ID NO: 18 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo “4E7-C9”.
La SEQ ID NO: 19 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR2-H de los denominados anticuerpos “4E7-C9”, “18F5-H10”, “20E5-F10” y “3H6-D2”.
La SEQ ID NO: 20 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo “4E7-C9”. La SEQ ID NO: 21 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo “4E7-C9”.
La SEQ ID NO: 22 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1 -H del denominado anticuerpo “4E7-C9”. La SEQ ID NO: 23 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo “18F5-H10”.
La SEQ ID NO: 24 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1 -H del denominado anticuerpo “18F5-H10”. La SEQ ID NO: 25 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo “18F5-H10”. La SEQ ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo “18F5-H10”.
La SEQ ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1-L del denominado anticuerpo “18F5-H10” anti-CD3.
La SEQ ID NO: 28 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-L de los denominados anticuerpos anti-CD3 “18F5-H10”, “11 D7-C3”, “1 E6-C9” y “10E6-G6”.
La SEQ ID NO: 29 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “12D2-E5”.
Las SEQ ID NO: 30 y 31 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1 -H y CDR2-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “12D2-E5”.
La SEQ ID NO: 32 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H de los denominados “12D2-E5” y “3G5-E10”. La SEQ ID NO: 33 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “12D2-E5”.
Las SEQ ID NO: 34 y 35 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1 -H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “12D2-E5”.
La SEQ ID NO: 36 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “11D7-C3”.
La SEQ ID NO: 37 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR2-H de los denominados anticuerpos anti-CD3 “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “16F8-A7”, “11F9-F8” y “20B5-F10”.
La SEQ ID NO: 38 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “11 D7-C3”.
La SEQ ID NO: 39 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “11D7-C3”.
La SEQ ID NO: 40 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “11H3-E5”.
La SEQ ID NO: 41 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “11H3-E5”.
La SEQ ID NO: 42 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “11H3-E5”.
La SEQ ID NO: 43 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “13H2-C2”.
La SEQ ID NO: 44 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “13H2-C2”.
La SEQ ID NO: 45 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “13H2-C2”.
La SEQ ID NO: 46 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de los denominados anticuerpos anti-CD3 “13C1-F6” y “11F9-F8”.
La SEQ ID NO: 47 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H de los denominados anticuerpos anti-CD3 “13C1-F6”, “10E6-G6” y “11 F9-F8”.
La SEQ ID NO: 48 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “13H2-C2”.
La SEQ ID NO: 49 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “18H11 -F10”.
Las SEQ ID NO: 50, 51 y 52 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “18H11 -F10”.
La SEQ ID NO: 53 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “18H11 -F10”.
Las SEQ ID NO: 54 y 55 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1 -L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD3 “18H11-F10”.
La SEQ ID NO: 56 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “1E6-C9”.
Las SEQ ID NO: 57 y 58 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1 -H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “1 E6-C9”.
La SEQ ID NO: 59 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “1E6-C9”.
La SEQ ID NO: 60 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “10F4-C10”.
La SEQ ID NO: 61 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “10F4-C10”.
La SEQ ID NO: 62 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “10F4-C10”.
La SEQ ID NO: 63 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “10E6-G6”.
Las SEQ ID NO: 64 y 65 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1 -H y CDR2-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “10E6-G6”.
La SEQ ID NO: 66 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “10E6-G6”.
La SEQ ID NO: 67 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1 -L del denominado anticuerpo anti-CD3 “10E6-G6”.
La SEQ ID NO: 68 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “18G9-H11”.
La SEQ ID NO: 69 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “18G9-H11 ”.
La SEQ ID NO: 70 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “18G9-H11”.
La SEQ ID NO: 71 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD3 “18G9-H11 ”.
La SEQ ID NO: 72 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “11F3-B9”.
La SEQ ID NO: 73 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “11F3-B9”.
La SEQ ID NO: 74 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “12G3-E8”.
Las SEQ ID NO: 75, 76 y 77 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “12G3-E8”.
La SEQ ID NO: 78 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “12G3-E8”.
La SEQ ID NO: 79 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “5B1-G2”.
Las SEQ ID NO: 80 y 81 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1 -H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “5B1-G2”.
La SEQ ID NO: 82 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “5B1-G2”.
La SEQ ID NO: 83 muestra la secuencia de aminoácidos de una parte del dominio variable de la cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “16F8-A7”.
La SEQ ID NO: 84 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H de los denominados anticuerpos anti-CD3 “16F8-A7” y “11F3-B9”.
La SEQ ID NO: 85 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “16F8-A7”.
La SEQ ID NO: 86 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína CD38 humana de longitud completa, que incluye el péptido señal, como está disponible de la base de base de datos de Uniprot bajo el número de acceso P04234.
La SEQ ID NO: 87 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “11F9-F8”.
La SEQ ID NO: 88 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD3 “11F9-F8”.
La SEQ ID NO: 89 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “3G5-E10”.
Las SEQ ID NO: 90 y 91 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H y CDR2-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “3G5-E10”.
La SEQ ID NO: 92 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “3G5-E10”.
Las SEQ ID NO: 93 y 94 muestran las secuencias de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD3 “3G5-E10”.
La SEQ ID NO: 95 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “9D7-F3”.
Las SEQ ID NO: 96, 97 y 98 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “9D7-F3”.
La SEQ ID NO: 99 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “9D7-F3”.
Las SEQ ID NO: 100 y 101 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD3 “9D7-F3” y “6C9-C9”.
La SEQ ID NO: 102 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “8C2-F7”.
Las SEQ ID NO: 103, 104 y 105 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “8C2-F7”.
La SEQ ID NO: 106 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “8C2-F7”.
La SEQ ID NO: 107 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “20E5-F10”.
La SEQ ID NO: 108 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “20E5-F10”.
La SEQ ID NO: 109 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “20E5-F10”.
La SEQ ID NO: 110 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “20B5-F10”.
La SEQ ID NO: 111 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “20B5-F10”.
La SEQ ID NO: 112 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “20B5-F10”.
Las SEQ ID NO: 113 y 114 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD3 “20B5-F10”.
La SEQ ID NO: 115 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “6C9-C9”.
Las SEQ ID NO: 116, 117 y 118 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “6C9-C9”.
La SEQ ID NO: 119 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “6C9-C9”.
La SEQ ID NO: 120 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD3 “6C9-C9”.
La SEQ ID NO: 121 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “3E8-G1”.
Las SEQ ID NO: 122, 123 y 124 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “3E8-G1”.
La SEQ ID NO: 125 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “3E8-G1”.
Las SEQ ID NO: 126 y 127 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD3 “3E8-G1”.
La SEQ ID NO: 128 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “3H6-D2”.
La SEQ ID NO: 129 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD3 “3H6-D2”.
La SEQ ID NO: 130 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “3H6-D2”.
La SEQ ID NO: 131 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD3 “8H2”.
La SEQ ID NO: 132 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD3 “8H2”.
Las SEQ ID NO: 133 y 134 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD3 “8H2”.
La SEQ ID NO: 135 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1a del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 136 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1b del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 137 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1c del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 138 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1d del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 139 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1a del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 140 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1b del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 141 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1c del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 142 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1-L de la variante VL1c del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 143 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1d del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 144 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH2a del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 145 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH2b del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 146 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH2c del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 147 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH2d del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 148 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2a del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 149 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2b del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 150 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2c del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 151 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2d del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 152 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH3a del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 153 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH3b del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 154 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL3a del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 155 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL3b del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 156 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL3c del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 157 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL3d del anticuerpo anti-CD3 humanizado “20G6”.
La SEQ ID NO: 158 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1A del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 159 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1B del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 160 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2A del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 161 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2B del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 162 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1Cmodif1 anticuerpo anti-CD3 del humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 163 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1Cmodif2 del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 164 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1Cmodif3 del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 165 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1Amodif1 del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 166 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1Amodif2 del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 167 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1Amodif3 del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 168 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2C del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 169 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2D del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 170 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2F del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 171 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1A del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 172 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1B del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 173 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH2A del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 174 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH2B del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 175 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH6Bmodif1 del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 176 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH6Bmodif2 del humanizado “4B4” anticuerpo anti-CD3.
La SEQ ID NO: 177 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH6Amodif1 del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 178 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH6Amodif2 del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 179 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH6Amodif3 del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 180 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH6C del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 181 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH6D del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 182 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL D7-VK3mut del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 183 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH D7-VH1 mut del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 184 muestra la secuencia de aminoácidos de las variantes CDR1-L VL1B, VL2B, VL1Cmodif3 y VL2F del anticuerpo anti-CD3 humanizado “4B4”.
La SEQ ID NO: 185 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína CD3g humana de longitud completa, que incluye el péptido señal, como está disponible de la base de base de datos de Uniprot bajo el número de acceso P09693.
La SEQ ID NO: 186 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Fab del denominado anticuerpo anti-CD3 “20G6-F3”.
La SEQ ID NO: 187 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab del denominado anticuerpo anti-CD3 “20G6-F3”.
La SEQ ID NO: 188 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Fab del denominado anticuerpo anti-CD3 “4E7-C9”.
La SEQ ID NO: 189 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab del denominado anticuerpo anti-CD3 “4E7-C9”.
La SEQ ID NO: 190 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Fab del denominado anticuerpo anti-CD3 “4B4-D7”.
La SEQ ID NO: 191 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab del denominado anticuerpo anti-CD3 “4B4-D7”.
La SEQ ID NO: 192 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Fab del denominado anticuerpo anti-CD3 “18F5-H10”.
La SEQ ID NO: 193 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab del denominado anticuerpo anti-CD3 “18F5-H10”.
La SEQ ID NO: 194 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína CD123 humana de longitud completa, que incluye el péptido señal, como está disponible de la base de datos de NCBI bajo NP_002174.1 y de la base de base de datos de Uniprot bajo P26951.
La SEQ ID NO: 195 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de CD123 de Macaca fascicularis de longitud completa, que incluye el péptido señal, como está disponible de la base de datos de GenBank bajo EHH61867.1 y de la base de base de datos de Uniprot bajo G8F3K3.
La SEQ ID NO: 196 muestra la secuencia de aminoácidos de la fusión Fc etiquetada con Strep-II de CD123 humana madura que comprende aminoácidos 22 a 305 de la proteína CD123 humana de longitud completa (SEQ ID NO: 194).
La SEQ ID NO: 197 muestra la secuencia de aminoácidos de la fusión Fc etiquetada con Strep-II de CD123 de Macaca fascicularis madura que comprende aminoácidos 22 a 305 de la proteína CD123 de Macaca fascicularis de longitud completa (SEQ ID NO: 195).
La SEQ ID NO: 198 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “1E1-G5”.
La SEQ ID NO: 199 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1 -H de los denominados anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5” y “8B11-B7”.
La SEQ ID NO: 200 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR2-H de los denominados anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5” y “6D6-B8”.
La SEQ ID NO: 201 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR3-H de los denominados anticuerpos anti-CD123 “1 E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7” y “9F6-G3”.
La SEQ ID NO: 202 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “1E1-G5”.
Las SEQ ID NO: 203 y 204 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “1E1-G5”.
La SEQ ID NO: 205 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “2B8-F3”.
Las SEQ ID NO: 206, 207 y 208 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “2B8-F3”.
La SEQ ID NO: 209 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “2B8-F3”.
La SEQ ID NO: 210 y 211 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “2B8-F3”.
La SEQ ID NO: 212 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “2F8-D6”.
Las SEQ ID NO: 213, 214 y 215 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “2F8-D6”.
La SEQ ID NO: 216 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “2F8-D6”.
Las SEQ ID NO: 217 y 218 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “2F8-D6”.
La SEQ ID NO: 219 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “3B10-E6”.
Las SEQ ID NO: 220, 221 y 222 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “3B10-E6”.
La SEQ ID NO: 223 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “3B10-E6”.
Las SEQ ID NO: 224 y 225 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “3B10-E6”.
La SEQ ID NO: 226 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “3E3-D3”.
Las SEQ ID NO: 227, 228 y 229 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “3E3-D3”.
La SEQ ID NO: 230 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “3E3-D3”.
Las SEQ ID NO: 231 y 232 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “3E3-D3”.
La SEQ ID NO: 233 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “5A5-B4”.
Las SEQ ID NO: 234, 235 y 236 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “5A5-B4”.
La SEQ ID NO: 237 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “5A5-B4”.
Las SEQ ID NO: 238 y 239 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “5A5-B4”.
La SEQ ID NO: 240 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “6B10-E4”.
Las SEQ ID NO: 241, 242 y 243 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “6B10-E4”.
La SEQ ID NO: 244 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “6B10-E4”.
Las SEQ ID NO: 245 y 246 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “6B10-E4”.
La SEQ ID NO: 247 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “6C10-C4”.
Las SEQ ID NO: 248, 249 y 250 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “6C10-C4”.
La SEQ ID NO: 251 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de los denominados anticuerpos anti-CD123 “6C10-C4” y “9B8-G6”.
La SEQ ID NO: 252 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1 -L de los denominados anticuerpos anti-CD123 “6C10-C4” y “9B8-G6”.
La SEQ ID NO: 253 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-L de los denominados anticuerpos anti-CD123 “6C10-C4”, “9B8-G6” y “9D7-G3”.
La SEQ ID NO: 254 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “6D6-B8”.
La SEQ ID NO: 255 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “6D6-B8”.
La SEQ ID NO: 256 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “6D6-B8”.
Las SEQ ID NO: 257 y 258 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “6D6-B8”.
La SEQ ID NO: 259 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “8B11-B7”.
La SEQ ID NO: 260 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR2-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “8B11-B7”.
La SEQ ID NO: 261 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “8B11-B7”.
Las SEQ ID NO: 262 y 263 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “8B11-B7”.
La SEQ ID NO: 264 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “9B8-G6”.
Las SEQ ID NO: 265 y 266 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H y CDR2-H de los denominados anticuerpos anti-CD123 “9B8-G6” y “9D7-C8”.
La SEQ ID NO: 267 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “9B8-G6”.
La SEQ ID NO: 268 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “9D7-C8”.
La SEQ ID NO: 269 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR3-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “9D7-C8”.
La SEQ ID NO: 270 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “9D7-C8”.
La SEQ ID NO: 271 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “9D7-C8”.
La SEQ ID NO: 272 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo anti-CD123 “9F6-G3”.
Las SEQ ID NO: 273 y 274 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H y CDR2-H del denominado anticuerpo anti-CD123 “9F6-G3”.
La SEQ ID NO: 275 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo anti-CD123 “9F6-G3”.
La SEQ ID NO: 276 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR1-L del denominado anticuerpo anti-CD123 “9F6-G3” .
La SEQ ID NO: 277 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH_G45A del anticuerpo anti-CD123 “3E3”.
La SEQ ID NO: 278 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VHmDG del anticuerpo anti-CD123 “3E3”.
La SEQ ID NO: 279 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR2-H de la variante VHmDG del anticuerpo anti-CD123 “3E3” y CDR2-H de la variante VH1 Fm2DG del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 280 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1A del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 281 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1B del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 282 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1C del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 283 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1D del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 284 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1E del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 285 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1F del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 286 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1G del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 287 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1Fm1 del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 288 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1 Fm2 del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 289 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1 Fm2DG del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 290 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1 Dm1 del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 291 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH1 Em1 del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 292 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1A del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 293 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1B del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 294 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1C del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 295 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1D del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 296 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1E del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 297 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1F del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 298 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1G del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 299 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1 Fm1 del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 300 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL1 Fm2 del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 301 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH2A del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 302 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VH VH3A del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 303 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2A del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 304 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2Am1 del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 305 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante VL VL2Am2 del anticuerpo anti-CD123 humanizado “3E3”.
La SEQ ID NO: 306 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula I de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”.
La SEQ ID NO: 307 muestra la secuencia de aminoácidos del conector L1 de las denominadas proteínas de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4”, “7G3x18F5”, “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4”, “hz4B4x3E3” y CODV-Fab “hz20G6x7G3-TL4”.
La SEQ ID NO: 308 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de 7G3 que representa el dominio Vd1 o Vd2 de las denominadas proteínas de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4”, “7G3x18F5”, “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4” y CODV- Fab “hz20G6x7G3-TL4”.
La SEQ ID NO: 309 muestra la secuencia de aminoácidos del conector L2 de las denominadas proteínas de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4”, “7G3x18F5”, “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4”, “hz4B4x3E3” y CODV-Fab “hz20G6x7G3-TL4”.
La SEQ ID NO: 310 muestra la secuencia de aminoácidos CL de las denominadas proteínas de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4”, “7G3x18F5”, “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4” y “hz4B4x3E3”.
La SEQ ID NO: 311 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula II de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”.
La SEQ ID NO: 312 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de 7G3 que representa aquí el dominio VH1 o VH2 de las denominadas proteínas de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4”, “7G3x18F5”, “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4” y CODV-Fab “hz20G6x7G3-TL4”.
La SEQ ID NO: 313 muestra la secuencia de aminoácidos Ch1 de las denominadas proteínas de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4”, “7G3x18F5”, “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4”, “hz4B4x3E3”.
La SEQ ID NO: 314 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3 x 4E7”.
La SEQ ID NO: 315 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula I de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x4E7”.
La SEQ ID NO: 316 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x4B4”.
La SEQ ID NO: 317 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula I de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x4B4”.
La SEQ ID NO: 318 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x18F5”.
La SEQ ID NO: 319 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula I de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x18F5”.
La SEQ ID NO: 320 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6x7G3”.
La SEQ ID NO: 321 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula I de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6x7G3”.
La SEQ ID NO: 322 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab 7G3xhz4B4”.
La SEQ ID NO: 323 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula I de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3xhz4B4”.
La SEQ ID NO: 324 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz4B4x3E3”.
La SEQ ID NO: 325 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula I de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz4B4x3E3”.
La SEQ ID NO: 326 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6x7G3 TL4”.
La SEQ ID NO: 327 muestra la secuencia de aminoácidos Fc2 de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6x7G3-TL4”.
La SEQ ID NO: 328 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula III de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6x7G3-TL4”.
La SEQ ID NO: 329 muestra la secuencia de aminoácidos CH1 de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6x7G3-TL4”.
La SEQ ID NO: 330 muestra la secuencia de aminoácidos Fc de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6x7G3-TL4”.
La SEQ ID NO: 331 muestra una secuencia de consenso para CDR1-H de los denominado anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “3H6-D2” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 332 muestra una secuencia de consenso para CDR2-H de los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “3H6-D2” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO:333 muestra una secuencia de consenso para CDR3-H de los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “3H6-D2” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 334 muestra una secuencia de consenso para CDR1-L de los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “3H6-D2” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 335 muestra una secuencia de consenso para CDR3-L de los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “11D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”, “18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “3H6-D2” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 336 muestra una secuencia de consenso para CDR1 -H de los denominado anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9F6-G3” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 337 muestra una secuencia de consenso para CDR2-H de los denominados anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9F6-G3” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 338 muestra una secuencia de consenso para CDR1-L de los denominados anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9F6-G3” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 339 muestra una secuencia de consenso para CDR3-L de los denominados anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9F6-G3” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 340 muestra una secuencia de consenso para CDR1-H de los denominados anticuerpos anti-CD123 “6C10-C4”, “9B8-G6”, “9D7-C8” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 341 muestra una secuencia de consenso para CDR2-H de los denominados anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9F6-G3” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 342 muestra una secuencia de consenso para CDR3-H de los denominados anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9F6-G3” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 343 muestra una secuencia de consenso para CDR1 -L de anticuerpos anti-CD123 “1E1-G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “9F6-G3” basado en el alineamiento de secuencias.
La SEQ ID NO: 344 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser). La SEQ ID NO: 345 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).
La SEQ ID NO: 346 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Thr-Val-Ala-Ala-Pro). La SEQ ID NO: 347 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gln-Pro-Lys-Ala-Ala). La SEQ ID NO: 348 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gln-Arg-Ile-Glu-Gly). La SEQ ID NO: 349 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser).
La SEQ ID NO: 350 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser).
La SEQ ID NO: 351 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys).
La SEQ ID NO: 352 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora y de etiqueta His añadida C-terminalmente al polipéptido según la fórmula II de las denominadas proteínas de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4”, “7G3x18F5”, “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4” y “hz4B4x3E3” que corresponde a una secuencia bisagra y una etiqueta His usada, por ejemplo, para purificación.
La SEQ ID NO: 353 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR2-H de una variante del denominado anticuerpo anti-CD123 “3E3”.
La SEQ ID NO: 354 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Gly-Gly-Ser).
La SEQ ID NO: 355 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Ser-Gly-Gly-Gly-Ser).
La SEQ ID NO: 356 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).
La SEQ ID NO: 357 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).
La SEQ ID NO: 358 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser).
La SEQ ID NO: 359 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Lys-Thr-His-Thr).
La SEQ ID NO: 360 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Lys-Thr-His-Thr-Ser). La SEQ ID NO: 361 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser). La SEQ ID NO: 362 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro).
La SEQ ID NO: 363 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro).
La SEQ ID NO: 364 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro).
La SEQ ID NO: 365 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser).
La SEQ ID NO: 366 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser).
La SEQ ID NO: 367 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro).
La SEQ ID NO: 368 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro).
La SEQ ID NO: 369 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly).
La SEQ ID NO: 370 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly).
La SEQ ID NO: 371 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly).
La SEQ ID NO: 372 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly)
La SEQ ID NO: 373 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly).
La SEQ ID NO: 374 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Gly-Gly-Glu-Pro-Lys-Ser-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Gly-Gly-Gly)
Las SEQ ID NO: 375, 376 y 377 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H del denominado anticuerpo “7G3”.
Las SEQ ID NO: 378 y 379 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo “7G3”.
La SEQ ID NO: 380 muestra la secuencia de aminoácidos de una variante del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo humanizado “7G3”.
Las SEQ ID NO: 381 y 382 muestran la secuencia de aminoácidos de CDR1-H y CDR3-H del denominado anticuerpo humanizado “7G3”.
La SEQ ID NO: 383 muestra la secuencia de aminoácidos de una variante adicional del dominio variable de cadena pesada del denominado anticuerpo humanizado “7G3”.
La SEQ ID NO: 384 muestra la secuencia de aminoácidos de CDR2-H de uno del denominado anticuerpo humanizado “7G3”.
La SEQ ID NO: 385 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del denominado anticuerpo humanizado “7G3”.
La SEQ ID NO: 386 muestra la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 como se muestra en el documento WO2015026892.
La SEQ ID NO: 387 muestra la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 como se muestra en el documento WO2015026892.
La SEQ ID NO: 388 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula I de las denominadas proteínas de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6xhz7G3”, CODV-Fab-OL1 “hz20G6xhz7G3” y CODV-Fab-OL1a “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 389 muestra la secuencia de aminoácidos de una secuencia conectora (Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly).
La SEQ ID NO: 390 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula II de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 391 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula IV de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 392 muestra la secuencia de aminoácidos de la región Fc2 de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 393 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula III de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 394 muestra la secuencia de aminoácidos de la región Fc del denominado CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 395 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula II de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1 “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 396 muestra la secuencia de aminoácidos de la región Fc de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1 “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 397 muestra la secuencia de aminoácidos del muñón Fc (Fc3) de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1 “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 398 muestra la secuencia de aminoácidos del muñón Fc (Fc3) de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1a “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 399 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la fórmula II de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1 a “hz20G6xhz7G3”.
La SEQ ID NO: 400 muestra la secuencia de aminoácidos del muñón Fc (Fc3) de la denominada proteína de unión de tipo anticuerpo CODV-Fab-OL1a “hz20G6xhz7G3”.
FIGURAS
Figura 1: Alineamientos de secuencia de las regiones VH de los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “11 D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1 E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”,
“18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “3H6-D2”.
Figura 2: Alineamientos de secuencia de las regiones VL de los denominados anticuerpos anti-CD3 “20G6-F3”, “4B4-D7”, “4E7-C9”, “18F5-H10”, “11 D7-C3”, “11H3-E5”, “13H2-C2”, “13C1-F6”, “1 E6-C9”, “10F4-C10”, “10E6-G6”,
“18G9-H11”, “11F3-B9”, “12G3-E8”, “5B1-G2”, “16F8-A7”, “11F9-F8”, “20E5-F10”, “20B5-F10”, “3H6-D2”.
Figura 3: Alineamientos de secuencia de las regiones VH y VL de los denominados anticuerpos anti-CD123 “1E1 -G5”, “6D6-B8”, “8B11-B7”, “, “9F6-G3”.
Figura 4: Alineamientos de secuencia de las regiones VH y VL de los denominados anticuerpos anti-CD123 “6C10-C4”, 9B8-G6”, “9D7-C8”.
Figuras 5 y 7: CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3” completamente humano IV Q3d en presencia de células T humanas inhibe el crecimiento del tumor Molm13 en todo el cuerpo a todas las dosis ensayadas.
Figuras 6 y 8: CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3” completamente humano IV Q3d en presencia de células T humanas está asociada con la regresión tumoral en huesos largos a todas las dosis ensayadas.
Figuras 9 y 11: CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” completamente humano IV en presencia de células T humanas inhibió el crecimiento tumoral.
Figuras 10 y 12: CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” completamente humano IV en presencia de células T humanas se asoció con la regresión tumoral en huesos largos.
Figuras 13 y 15: CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” completamente humano CIP en presencia de células T humanas inhibió el crecimiento tumoral en todo el cuerpo a una dosis de 0,13 nmol/kg/día o superior.
Figuras 14 y 16: CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” completamente humano CIP en presencia de células T humanas inhibió el crecimiento tumoral en huesos largos a una dosis de 0,13 nmol/kg/día o superior.
Figura 17: Representación esquemática de la estructura de CODV-Ig, CODV-Fab-TL y CODV-Fab-OL (que muestra además mutaciones LALA (cuando se usa Fc de la estructura principal de IgG1) y mutaciones botón en ojal).
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos
1.1 Construcción del plásmido de expresión de fusión hCD3e/8-hFc (CD3ed-Fc)
Usando plásmidos que contienen ADNc como molde, se generaron proteínas de fusión CD3e y CD8 humanas y de Macaca fascicularis, como se describe a continuación en detalle, en el marco de lectura con la región constante de la cadena pesada que incluye la región bisagra, los dominios CH2 y CH3 de la inmunoglobulina humana IgG que porta adicionalmente una etiqueta 8 x His o Strep-II para la purificación en tándem opcional.
Usando ADN genómico humano como molde, se amplificaron los dominios extracelulares de la subunidad CD3e humana y CD8 humana, incluyendo la secuencia señal. Los productos de PCR escindidos y purificados amplificados resultantes se combinaron mediante PCR de ligación y se ligaron en el vector de expresión de mamífero pXL mediante el método InFusion usando el sitio NheI e HindIII. Cada subunidad se clonó en un plásmido. La secuencia de la proteína de fusión Fc etiquetada de CD3e humana madura resultante se describe aquí bajo SEQ ID NO: 3. Los aminoácidos 1 a 104 de SEQ ID NO: 3 corresponden a los aminoácidos 23 a 126 de la proteína CD3e humana de longitud completa de tipo salvaje (aquí descrita bajo SEQ ID NO: 1, disponible en la base de datos Uniprot con el número de acceso P07766), y de este modo al dominio extracelular de CD3e humana.
Usando ADN genómico de macaco como molde, se amplificaron los dominios extracelulares de CD3e y de CD38 de Macaca fascicularis, incluyendo la secuencia señal. Los productos de PCR escindidos y purificados amplificados resultantes se combinaron mediante PCR de ligación y se ligaron en el vector de expresión de mamífero pXL mediante el método InFusion usando NheI e HindIII. Cada subunidad se clonó en un plásmido. Las secuencias resultantes para la proteína de fusión Fc de CD3e de Macaca fascicularis madura se describe bajo SEQ ID NO: 4. Los aminoácidos 1 a 95 de SEQ ID NO: 3 corresponden a los aminoácidos 23 a 117 de la proteína CD3e de Macaca fascicularis de longitud completa, y de este modo comprenden el dominio extracelular CD3e de Macaca fascicularis de longitud completa de tipo salvaje (descrito aquí bajo SEQ ID NO: 2, disponible en la base de datos Uniprot con el número de acceso Q95LI5). La proteína de fusión clonada contiene además un intercambio de alanina a valina en la posición de aminoácido 35 en comparación con la posición de aminoácido 57 de la secuencia de tipo salvaje.
1.2 Expresión y purificación de CD3ed-Fc humana y de macaco
Se transfectaron transitoriamente con el plásmido de expresión células HEK293 Freestyle que crecen en cultivo en suspensión libre de suero F17 (Life). La cotransfección de ambos plásmidos que representan la subunidad del dominio extracelular (ECD) de CD3e y CD38 se realizó usando el reactivo de transfección Cellfectin (Life). Las células se cultivaron a 37°C durante 7 días. El sobrenadante del cultivo que contenía proteína recombinante se recogió mediante centrifugación y se aclaró mediante filtración (0,22 pm).
Para la purificación, las variantes de la proteína de fusión Fc se capturaron en una matriz de proteína A (GE) y se eluyeron mediante cambio de pH. Después de pulir la proteína mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) usando una Superdex 200 (GE) y una etapa final de concentración de ultrafiltración, la proteína se usó para ensayos adicionales.
El heterodímero humano se aplicó adicionalmente en una columna His-Trap (GE) después de la captura en la proteína A, y se desaló. La proteína eluida se aplicó a una columna de estreptavidina (GE) y se eluyó con d-destiobiotina antes del pulido final mediante SEC usando una Superdex 200 (GE). Esta estrategia se utilizó para aislar heterodímeros de homodímeros.
1.3 Generación de anticuerpos anti-CD3 de reacción cruzada de ser humano/macaco
Se clonaron ADNc de CD3e y CD38 humanas y de Macaca fascicularis en vectores de inmunización patentados por Aldevron (pB8 y VV8) respectivamente, y se usaron para la inmunización genética de ratas. Las ratas del grupo de inmunización MR12-266 (“CD3-cyno”) se inmunizaron inicialmente con ADNc de CD3e y CD38 humanas, seguido de dos inmunizaciones adicionales con una mezcla de ADNc CD3e y CD38 humanas y de Macaca fascicularis. El suero inmune se tomó el día 24 del protocolo de inmunización, después de 4 aplicaciones genéticas (IS24d-4). Los sueros, diluidos en PBS con 1% de BSA, se ensayaron mediante citometría de flujo usando células de mamíferos transfectadas transitoriamente con los ADNc diana en experimentos de cotransfección para obtener complejos de TCRs de CD3e y CD38 humanas y de Macaca fascicularis. Además, los sueros inmunes se analizaron en las siguientes líneas celulares: Jurkat E6-1 (que expresa TCR humano), Jurkat-RT-T3.5 (negativa para TCR) y HSC-F de macaco (que expresa TCR de macaco); no se disponía de una línea celular negativa para el TCR de macaco. Como anticuerpo secundario, se usó un conjugado anti-IgG de rata de cabra con R-ficoeritrina (Southern Biotech, n° 3030-09), a 10 mg/ml.
La reactividad específica de los sueros inmunes, especialmente contra células transfectadas con combinaciones de ADNc de CD3e y CD38, se pudo detectar en los animales inmunizados en comparación con células transfectadas con un ADNc irrelevante. Lo mismo es válido para el ensayo en la línea celular Jurkat positiva para TCR (E6-1), en comparación con la línea celular negativa para TCR (RT-T3.5), se detectaron señales mucho menores pero aún señales significativas en la línea celular HSC-F de macaco (véase tabla 1).
Tabla 1: Detección de la reactividad específica de los sueros inmunes frente al complejo de TCR en cada animal por citometría de flujo. Los datos se presentan como medias geométricas de las intensidades de fluorescencia relativas
(rfu).
Figure imgf000089_0001
Se inmunizaron conjuntamente ratas del grupo de inmunización MR12-265 (“CD3-hum”) con ADNc de CD3e y CD38 humanas clonado en los correspondientes vectores de expresión. El suero inmune se tomó el día 24 del protocolo de inmunización, después de 4 aplicaciones genéticas (IS24d-4). Los sueros, diluidos en PBS con 1% de BSA, se ensayaron mediante citometría de flujo usando células de mamífero transfectadas transitoriamente con los ADNc diana mencionados anteriormente en experimentos de cotransfección para obtener complejos de TCR de CD3e y CD38 humanas y de Macaca fascicularis. Se usó un conjugado de anti-IgG de rata de cabra con R-ficoeritrina (Southern Biotech, n° 3030-09) a 10 mg/ml como anticuerpo secundario. Además, los sueros inmunes se analizaron en las siguientes líneas celulares: Jurkat E6-1 (que expresa TCR humano), Jurkat-RT-T3.5 (negativa para TCR) y cyno HSC-F (que expresa cyno TCR); no se disponía de una línea celular negativa para el cyno TCR. Se usó un conjugado de anti-IgG de rata de cabra con R-ficoeritrina (Southern Biotech, n° 3030-09) a 10 mg/ml como anticuerpo secundario.
La reactividad específica de los sueros inmunes, especialmente contra células transfectadas con combinaciones de ADNc de CD3e y CD38, se pudo detectar en los animales inmunizados en comparación con células transfectadas con un ADNc irrelevante. Lo mismo es válido para el ensayo en la línea celular Jurkat positiva para TCR (E6-1), en comparación con la línea celular negativa para TCR (RT-T3.5), pero se detectaron señales mucho menores (sin embargo, en las ratas positivas siguen siendo significativas) en la línea celular cyno HSC-F (véase tabla 2).
Tabla 2: Detección de la reactividad específica de los sueros inmunes frente al complejo de TCR en cada animal por citometría de flujo. Los datos se presentan como medias geométricas de las intensidades de fluorescencia relativas
(rfu).
Figure imgf000090_0001
Se sacrificaron ratas con sueros positivos, y las células B se fusionaron con células de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se cribaron en células HEK293 transfectadas con plásmidos de expresión de CD3e y CD38 humanas o de macaco, en Jurkat E6.1 (CD3+) y Jurkat T3.5 (CD3-) mediante citometría de flujo. Se usó sobrenadante de clones de hibridoma para evaluar mediante resonancia de plasmones superficiales la cinética de un solo punto frente al complejo de CD3e/8 humanas y de Macaca fascicularis fijando el analito a 25 nM (datos presentados en la tabla 3).
Tabla 3: Detección de la reactividad específica de diferentes sobrenadantes de clones de hibridoma mediante citometría de flujo y análisis Biacore. Los sobrenadantes se ensayaron en diferentes líneas celulares (Jurkat E6-1, Jurkat-RT-T3.5 y cyno HSC-F). El análisis de Biacore se realizó contra complejos de CD3e/d de ser humano y de macaco, respectivamente.
Figure imgf000090_0002
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Los clones positivos se expandieron, y los ADNc respectivos para las cadenas ligeras y pesadas variables se aislaron mediante RT-PCR. Las secuencias VH y VL se clonaron en vectores de expresión en fusión con el CH1 humano, el esqueleto de IGHG1 o la cadena kappa, para expresar fragmentos Fab así como las IgGs completas.
1.4 Expresión de IgGs y fragmentos Fab
Los plásmidos de expresión que codifican la cadena ligera y pesada de las IgGs y los fragmentos Fab se propagaron en E. coli NEB 10-beta (derivado DH10B). Los plásmidos usados para la transfección se prepararon a partir de E. coli usando el kit QIAGEN Plasmid Plus (n° de cat.: 12991).
Se transfectaron células HEK 293-FS que crecían en Medio Freestyle (Invitrogen) con los plásmidos LC y HC indicados que codifican las cadenas pesadas y ligeras usando el reactivo de transfección 293fectin (Invitrogen) como se describe por el fabricante. Las células se cultivaron a 37°C en una incubadora agitadora Kuhner ISF1-X a 110 rpm con 8% de CO2. Después de 7 días de cultivo, las células se eliminaron por centrifugación, se añadió Tris HCl 1 M al 10% vol/vol pH 8,0, y el sobrenadante se filtró mediante un filtro de tapa de botella de 0,2 pM, para eliminar las partículas. Los constructos de CODV-IgG1 se purificaron mediante cromatografía de afinidad en columnas de Proteína A (columnas HiTrap Protein A HP, GE Life Sciences). Tras la elución de la columna con citrato 0,1 M, pH 3,0, los constructos CODV-IgG1 se desalaron usando columnas de desalación HiPrep 26/10, formuladas en PBS (Gibco 14190-136).
Los constructos CODV-Fab biespecíficas se purificaron mediante columnas HisTrap High Performance (GE Healthcare, n° de Cat.: 17-5248-02). Después de la elución de la columna (amortiguador de elución: fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 500 mM, pH 7,4), las fracciones que contenían proteína se combinaron y desalaron usando columnas de desalación HiPrep 26/10, formuladas en PBS (Gibco 14190-136).
Para separar los monómeros de los agregados, se realizó una etapa de fraccionamiento de alta resolución en PBS (Gibco 14190-136) para ambos constructos, el CODV-IgG y el CODV-fragmento Fab, usando una columna HiLoad Superdex 200 26/60 de 320 ml (GE Healthcare n° de Cat.: 29-9893-36). Las fracciones monoméricas se reunieron y concentraron hasta 1 mg/ml, usando columnas de centrifugación Vivaspin 20 (VS2002 Sartorius Stedim biotech) y se filtraron usando una membrana de 0,22 pm (Millex® Syringe Filters SLGV033RS). La concentración de proteína se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm. Cada lote se analizó mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras, para determinar la pureza y el peso molecular de cada subunidad y del monómero.
1.5 Evaluación de afinidades de los anticuerpos anti-CD3
1.5.1 Evaluación de afinidades de CD3e/8 tanto humanas como de Macaca fascicularis
Las afinidades de unión de Fabs anti-CD3 o CODV-Fabs se midieron mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un instrumento Biacore3000 (GE Healthcare). El amortiguador de ensayo fue HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). La captura de proteínas de fusión CD3e/8-Fc se logró usando el kit de captura de anticuerpos humanos (GE Healthcare). El anticuerpo de captura se acopló a chips CM5 (BR-1001-88, GE Healthcare) a aprox.
12.000 RU usando el kit de acoplamiento de amina (BR-100-50, GE Healthcare). Las proteínas de fusión CD3e8-Fc se capturaron a 10 pl/min a aprox. 70 RU para producir valores Rmax de 30 RU. La cinética de unión con los Fabs anti-CD3 o CODV-Fabs se midió a 30 pl/min durante 240 s y 600 s para la fase de asociación y disociación, respectivamente. Se usaron diluciones de dos veces de Fabs, de 3 a 400 nM en amortiguador de ensayo. Todas las concentraciones de Fab se procesaron por duplicado junto con blancos de amortiguador duplicados para una doble referencia. La regeneración de la superficie de captura se realizó con una inyección durante 1 min de disolución de MgCl23M a 30 pl/min. Para el análisis de datos, se utilizó el software BIAevaluation v.4.1 (GE Healthcare). Los datos se ajustaron globalmente usando un modelo de Langmuir 1:1 con transferencia de masa.
La medida de las afinidades de unión de las IgGs anti-CD3 y proteínas CODV-Fc se realizó de forma análoga al ensayo de unión para Fabs y CODV-Fabs, con la excepción del anticuerpo de captura. En este caso, se usó e1His Capture Kit (28-9950-56, GE Healthcare) para capturar la proteína CD3-Fc humana a través de la etiqueta His. Para el ensayo de unión con CD3-Fc de Macaca fascicularis, se utilizó el anticuerpo clásico Strep-MAB (2-1507-001, IBA) como anticuerpo de captura. En este caso, la disolución de regeneración fue amortiguador de glicina 10 mM pH 2,0.
Tabla 4: Afinidades de anticuerpos CD3 seleccionados contra complejos de CD3e/8 humanas y de Macaca fascicularis medidas por Biacore.
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1.5.2 Unión de anticuerpos anti-CD3 a huCD3e, huCD38 y huCD3e/8 expresadas en la superficie de las células HEK293F mediante citometría de flujo
Para analizar la unión de anticuerpos a CD3e humana y CD38 humana expresadas en la superficie de las células, se transfectaron células HEK293F con ambos constructos, ya sea solos o en cotransfección, y las señales se midieron mediante citometría de flujo. Para el procedimiento de transfección, se utilizó el reactivo de transfección FuGENE HD (Promega, n° E2311) según el protocolo del fabricante.
Se sembraron células HEK293F en medio Freestyle293 (Gibco) a razón de 6E6 células por tubo en tubos Cellstar Cellreactor de 50 ml con filtro (Greiner bio-one). Las transfecciones se realizaron según el protocolo FuGENE. La preparación del complejo se realizó en OptiMEM sin rojo fenol (Gibco) a una relación 3:1 (Protocolo para la transfección de células 293F cultivadas en 8.000 pl de medio en matraces T-25 usando una relación de FuGENE®HD:ADN de 3,0:1, http://www.promega.com/techserv/tools/FugeneHdTool/default.aspx).
Las células se incubaron en un agitador a 37°C y CO2 al 5%. Las células se recogieron en el día uno a tres después de la transfección, y la unión de los anticuerpos se analizó mediante citometría de flujo.
Los anticuerpos para la tinción se sembraron a 1 pg en 50 pl por pocillo de Amortiguador de Tinción con FBS (BD Pharmingen) en placas de cultivo en suspensión con fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one). Las células transfectadas recolectadas se resuspendieron en Amortiguador de Tinción con FBS, y se añadieron a 50 pl por pocillo a los anticuerpos. Las células se incubaron a 4°C en la oscuridad durante 30 min y se lavaron dos veces. 0,5 pg de anticuerpo secundario F(ab’)2 de cabra anti-IgG humana conjugado con FITC (Beckman Coulter, #732598) o F(ab’)2 de cabra anti-kappa humana conjugado con PE (Southern Biotech, #206209), respectivamente, en combinación con 0,5 pg de 7-AAD por pocillo se añadieron en 100 pl de Amortiguador de Tinción con FBS. Las células se incubaron a 4°C en la oscuridad durante 15 min y se lavaron dos veces. Para la medida, las células se resuspendieron en 200 pl de Amortiguador de Tinción con f Bs . Las células se midieron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi Biotec) o LSRII (BD), respectivamente. Se realizaron más análisis de datos usando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). La lectura fue el porcentaje de células individuales negativas para 7-AAD positivas para la tinción con anticuerpos (datos presentados en la tabla 5).
1.5.3 Unión de Fabs anti-CD3 a huCD3e/8 y huCD3e/g mediante SPR
La unión se ensayó mediante SPR usando un instrumento BIAcore3000 con amortiguador de HBS-EP. Se capturaron proteínas huCD3 recombinantes (e/8 (PB01226), e/g (PB01225)) a 10 pl/min vía etiqueta de Fc mediante anticuerpo de captura anti-Fc humano MAB1302 (Millipore) inmovilizado en un chip sensor CM5. Se usaron Fabs anti-CD3 como analitos a 100 nM con tiempos de asociación y disociación de 240 s y 300 s, respectivamente, a 30 pl/min. Después de cada ciclo, las superficies se regeneraron mediante un pulso de 2 min de amortiguador de glicina 10 mM, pH 2,5.
Cuando solo se expresó huCD38 en la superficie de las células HEK293F, no se pudo detectar ninguna señal mediante citometría de flujo. Por el contrario, casi todos los anticuerpos se pudieron unir a células transfectadas con huCD3e exclusivamente o en cotransfección con huCD38, lo que indica que huCD3e es necesaria como epítopo. En los ensayos de Biacore se mostró la unión a huCD3e independientemente de si se usó la cadena 8 o g para la proteína recombinante, lo que sugiere que huCD3e es suficiente como antígeno. El anticuerpo 12D2 se unió de forma excepcional solamente a huCD3e cuando estaba presente una co-cadena. Puede haber un efecto indirecto de la coexpresión de la cadena g o d con respecto a la estructura conformacional de la proteína para mostrar el epítopo para este anticuerpo. Se mostró el mismo efecto para el anticuerpo publicado OKT3. Se describe que este anticuerpo interactúa con un epítopo conformacional formado después de la asociación de huCD3e con huCD38 o g, respectivamente (Salmeron et al., 1991, The Journal de Immunology). También se demostró que se une exclusivamente a la subunidad huCD3e (Kjer-Nielsen et al., 2004, PNAS). Debido al comportamiento similar de 12D2 y OKT3, es posible suponer una interacción con huCD3e para 12D2. En conjunto, huCD3e parece ser la estructura antigénica para todos los anticuerpos analizados (datos presentados en la tabla 5).
Tabla 5: Afinidades de anticuerpos CD3 seleccionados contra complejos huCD38, huCD3e, huCD3e/8 y huCD3e/g medidas por citometría de flujo y Biacore.
Figure imgf000095_0001
1.6 Unión de Fab anti-CD3 a células T humanas
La capacidad de unión de los CD3-Fabs se determinó mediante citometría de flujo. Se usaron células T humanas primarias como células diana. Por lo tanto, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) a partir de 200 ml de sangre periférica de donantes sanos tratada con EDTA mediante centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll. Se precargaron 15 ml de Histopaque (Sigma-Aldrich) en un Leucosep-Tube de 50 ml (Greiner bioone). La sangre se diluyó con amortiguador de enjuague autoMACS 1% de BSA (Miltenyi Biotec), y se cargó en la membrana de un total de diez tubos preparados. Los tubos se centrifugaron sin freno durante 10 min a 1000xg. Las PBMCs se recogieron y lavaron con amortiguador de enjuague autoMACS 1% de BSA, tres veces. Finalmente, las PBMCs se resuspendieron en autoMACS Running Buffer (Miltenyi Biotec) para el aislamiento de linfocitos T mediante la tecnología autoMACSpro usando el kit de aislamiento de células Pan T (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. La pureza de las células T separadas se analizó mediante citometría de flujo MACSQuant usando el kit de inmunofenotipado de 7 colores humano (Miltenyi Biotec). Células T aisladas se resuspendieron en Amortiguador de Tinción con FBS (BD Pharmingen), y se sembraron 1E5 células en 100 pl por pocillo en placas de cultivo en suspensión de 96 pocillos con fondo en U (Greiner bio-one). Los anticuerpos Fab se diluyeron 1:3 en serie en PBS (Invitrogen), y se añadieron 5 pl de cada uno a las células a una concentración máxima final de 30000 ng/ml. El ensayo se incubó durante 45 min a 4°C. Las células se lavaron dos veces con Amortiguador de Tinción con FBS, y se añadió 1 pg de anticuerpo secundario F(ab’)2 de cabra anti-kappa humana conjugado con FITC (Beckman Coulter, n° 732621) por pocillo en 100 pl de Amortiguador de Tinción con FBS por pocillo. El ensayo se incubó durante 20 min a 4°C, y después se lavó dos veces. Las células se resuspendieron en 150 pl de Amortiguador de Tinción con FBS por pocillo, y se midieron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi Biotec) o LSRII (BD). Se realizaron más análisis de datos usando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). La lectura fue el porcentaje de células positivas para la unión de anticuerpos. Se usaron células tratadas solo con el anticuerpo secundario pero sin el primario para establecer los agrupamientos de nubes de puntos. Las curvas de EC50 se calcularon mediante XLfit (Algorithm 205), los valores de EC50 se calcularon como punto de inflexión de la pendiente (los datos se muestran en la tabla 6).
Tabla 6: Afinidades de CD3 Fab por células T humanas medidas por citometría de flujo. Se presentan los valores medios de EC50 calculados a partir de curvas.
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1.7 Seguridad de CD3 Fab
1.7.1 Seguridad de CD3 Fab medida por la expresión de CD25+ y CD69+ en células T humanas
El efecto de los anticuerpos CD3 Fab sobre el estado de activación de las células T como lectura de seguridad se analizó mediante la detección basada en citometría de flujo de la expresión de los marcadores de activación CD25 y CD69 en la superficie de células T humanas primarias.
Linfocitos T humanos primarios aislados se resuspendieron en RPMI GlutaMAX I (Gibco) 10% de FCS (Invitrogen), y se sembraron 2,5E5 células en placas de cultivo en suspensión con fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one) en 100 ml por pocillo.
Se añadieron 5 ml de anticuerpos Fab CD3 a las células a una concentración final de 30000 ng/ml. El ensayo se incubó durante 20 h a 37°C en 5% de CO2.
Después del tiempo de incubación, las células se centrifugaron y se tiñeron durante 15 min a 4°C en 100 ml de Amortiguador de Tinción con FBS (BD Pharmingen) por pocillo con los siguientes anticuerpos marcados: CD25-V450, CD69-APC.
Las células se lavaron dos veces después de la tinción, se resuspendieron en 150 ml de Amortiguador de Tinción con FBS, y se midieron 5000 células usando el citómetro de flujo LSRII (BD). Se realizaron más análisis de datos usando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). La lectura fue el porcentaje de células T CD25pos y CD69pos (tabla 7).
Tabla 7: Seguridad de CD3 Fab medida por la expresión de CD25+ y CD69+ en células T humanas
Figure imgf000097_0001
1.7.2 Seguridad de CD3 Fab medida por la expresión de CD4+/CD69+, CD4+/CD25+, CD8+/CD69+ y CD8+/CD25+ en células T humanas
El efecto de los anticuerpos CD3 Fab sobre el estado de activación de las células T como lectura de seguridad se analizó mediante la detección basada en citometría de flujo de la expresión del marcador de activación CD25 y CD69 en la superficie de las células T humanas primarias. Linfocitos T humanos primarios aislados se resuspendieron en RPMI GlutaMAX I (Gibco) 10% de FCS (Invitrogen), y se sembraron 2,5E5 células en placas de cultivo en suspensión con fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one) en 50 pl por pocillo. O bien las células T se analizaron exclusivamente, y los pocillos se rellenaron con 50 pl de RPMI GlutaMAX I 10% de FCS, o bien se añadieron células diana (es decir, la línea celular THP-1) a 2,5E4 células por pocillo en 50 pl de RPMI GlutaMAX I 10% de FCS. Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron 1:3 en serie en PBS (Invitrogen), y se añadieron 5 pl de cada uno a las células a una concentración máxima final de 30000 ng/ml. El ensayo se incubó durante 20 h a 37°C en 5% de CO2. Después del tiempo de incubación, las células se centrifugaron y se tiñeron durante 15 min a 4°C en 100 pl de Amortiguador de Tinción con FBS (BD Pharmingen) por pocillo con los siguientes anticuerpos marcados: CD4-PE, CD8-APC-Cy7, CD25-APC, CD69-PE-Cy7. Como control de Fluorescencia Menos Uno (FMO), las células T activadas se tiñeron como se describe anteriormente, pero se reemplazó CD25 por su isotipo (Isotipo APC-IG1k) en un tubo, y se reemplazó CD69 por su isotipo (Isotipo PE-Cy7-IG1k) en un segundo tubo. Las células se lavaron dos veces después de la tinción, se resuspendieron en 150 pl de Amortiguador de Tinción con FBS, y se midieron 5000 células usando el citómetro de flujo LSRII (BD). Se realizaron más análisis de datos usando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). La lectura fue el porcentaje de células T CD4posCD25pos, CD4posCD69pos, CD8posCD25pos, y CD8posCD69pos. Los agrupamientos de nubes de puntos se ajustaron según los controles de FMO (véase la tabla 8).
Tabla 8: Seguridad de CD3 Fab medida por la expresión de CD4+/CD69+, CD4+/CD25+, CD8+/CD69+ y CD8+/CD25+ en células T humanas
Figure imgf000098_0001
Ejemplo 2: Secuencias de CD123
2.1 Construcción de plásmidos de expresión de fusión CD123 (IL3RA)-hFc (CD123-Fc)
Usando plásmidos que contienen ADNc como molde, se generaron proteínas de fusión de CD123 humana y de Macaca fascicularis en el marco de lectura con una región constante de cadena pesada que incluye un conector GS (usado en la proteína de Macaca), la región bisagra, los dominios CH2 y CH3 de la inmunoglobulina humana IgG que además porta una etiqueta Strep-II (solo en la versión de proteína humana).
Usando ADN genómico humano como molde, se amplificó el dominio extracelular de CD123 humana (IL3RA), incluyendo la secuencia señal. Los productos de PCR escindidos y purificados amplificados resultantes se combinaron mediante PCR de ligación y se ligaron en el vector de expresión de mamífero pXL mediante el método InFusion usando el sitio NheI e HindIII. La secuencia de la proteína de fusión Fc etiquetada con Strep-II de CD123 humana madura resultante se describe en SEQ ID NO: 196. Los aminoácidos 1 a 284 corresponden a los aminoácidos 22 a 305 de la proteína CD123 humana de tipo salvaje de longitud completa (descrita aquí bajo SEQ ID NO: 194, disponible en la base de datos de NCBI con el número de acceso NP_002174.1), y de este modo del dominio extracelular de CD123 humana.
Para clonar CD123 de Macaca fascicularis, se obtuvo ADNc a partir de sangre de una población de Macaca fascicularis. Usando como molde este ADNc aislado, se amplificó el dominio extracelular de CD123 de Macaca (IL3ra), incluyendo la secuencia señal. Los productos de PCR escindidos y purificados amplificados resultantes se combinaron mediante PCR de ligación y se ligaron en el vector de expresión de mamífero pXL mediante el método InFusion usando NheI e HindIII. La secuencia de la proteína de fusión Fc etiquetada con Strep-II de CD123 humana madura resultante se describe bajo SEC ID NO: 197. Los aminoácidos 1 a 284 corresponden a los aminoácidos 22 a 305 de la proteína CD123 de Macaca fascicularis de tipo salvaje de longitud completa (descrita aquí bajo SEQ ID NO: 195, disponible en la base de datos de NCBI con el número de acceso NP_002174.1), y de este modo del dominio extracelular de CD123 humana.
2.2 Expresión y purificación CD123-Fc humana y de Macaca fascicularis
Se transfectaron transitoriamente células HEK293 Freestyle que crecen en cultivo en suspensión libre de suero F17 (Life) con el plásmido de expresión. La transfección se realizó usando reactivo de transfección Cellfectin (Life). Las células se cultivaron a 37°C durante 7 días. El sobrenadante del cultivo que contenía proteína recombinante se recogió mediante centrifugación y se aclaró mediante filtración (0,22 pm).
Para la purificación, las variantes de la proteína de fusión Fc se capturaron en una matriz de proteína A (GE) y se eluyeron por cambio de pH. Después de pulir la proteína por SEC en PBS usando una Superdex 200 (GE) y una etapa final de concentración por ultrafiltración, la proteína se usó para ensayos posteriores.
2.3 Evaluación de afinidades por IgGs de rata CD123 tanto humana como de Macaca fascicularis a partir de hibridoma
El cribado de IgGs de rata anti-CD123 para determinar las afinidades de unión a CD123 humana, y las reactividades cruzadas con cyno CD123 se realizó con sobrenadantes de hibridoma usando un Proteon XPR36 (Biorad) en un enfoque de cinética de un solo disparo. Se estableció un ensayo de captura usando IgG anti-rata de cabra (112-005­ 071, Jackson Immuno Research). El anticuerpo de captura se revistió sobre chips GLC (176-5011, Biorad) hasta aprox. 8000 RU en dirección vertical usando el kit de acoplamiento de amina (176-2410, Biorad). La captura de las IgGs de rata a aprox. 200 RU en dirección vertical dio como resultado valores Rmax de hasta 100 RU para CD123-Fc. La cinética de unión con proteína de fusión CD123-Fc humana y macaco se midió a 100 pl/min en la dirección horizontal con 120 s y 600 s para la asociación y disociación, respectivamente. Las proteínas CD123-Fc se usaron en diluciones dobles de 6 nM a 100 nM. Se usó amortiguador PBSET (176-2730, Biorad) como amortiguador de ensayo. La regeneración se logró mediante la inyección de amortiguador de glicina 10 mM pH 1,5 durante 18 s a 30 pl/min. El procesamiento y análisis de datos se realizó con el software ProteonManager v3.0. El ajuste de los sensogramas se realizó con un modelo Langmuir 1:1. Los clones se seleccionaron basándose en las afinidades por CD123 humana con KD <1 nM y reactividad cruzada con cyno CD123.
Fabs y CODV-Fabs
Las afinidades de unión de los Fabs de unión anti-CD123 o los CODV-Fabs se midieron usando un instrumento Biacore3000 (GE Healthcare). El amortiguador de ensayo fue HBS-EP (BR-1001-88, GE Healthcare). La captura de proteínas de fusión CD123-Fc se logró usando el kit de captura de anticuerpos humanos (GE Healthcare). El anticuerpo de captura se acopló a chips CM5 (BR-1001-88, GE Healthcare) a aprox. 12.000 RU usando el kit de acoplamiento de amina (BR-100-50, GE Healthcare). Las proteínas de fusión de CD123-Fc se capturaron a 10 pl/min a aprox. 70 RU para producir valores Rmax de 30 RU. La cinética de unión con los Fabs anti-CD123 o los CODV-Fabs se midió a 30 pl/min durante 240 s y 600 s para la fase de asociación y disociación, respectivamente. Se usaron diluciones dobles de Fabs de 3 a 200 nM en amortiguador de ensayo. Todas las concentraciones de Fabs se procesaron por duplicado junto con blancos de amortiguador duplicados para una doble referencia. La regeneración de la superficie de captura se realizó con una inyección durante 1 min de disolución de MgCl2 3M a 30 pl/min. Para el análisis de datos se utilizó el software BIAevaluation v.4.1 (GE Healthcare). Los datos se ajustaron globalmente usando un modelo de Langmuir 1:1 con transferencia de masa.
IgGs y proteínas CODV-Fc
La medida de las afinidades de unión de las IgGs anti-CD123 y de las proteínas CODV-Fc se realizó de forma análoga al ensayo de unión para Fabs y CODV-Fabs, con la excepción del anticuerpo de captura. En este caso, se utilizó el anticuerpo clásico Strep-MAB (2-1507-001, IBA) para capturar CD123-Fc humana a través de su etiqueta StrepII. Aquí la disolución de regeneración fue amortiguador de glicina 10 mM pH 2,0.
2.4 Generación de anticuerpos anti-CD123 humanos y de Macaca fascicularis de reactividad cruzada
Los ADNc de CD123 humano y de Macaca fascicularis se clonaron en vectores de inmunización patentados por Aldevron (pB8 y VV8), respectivamente. Se inmunizaron tres ratas del grupo de inmunización MR13-296 con el vector de inmunización IL3RA-hum.-ECD (aa19-305). El suero inmune se tomó el día 24 del protocolo de inmunización, después de 4 aplicaciones genéticas (IS24d-4). Los sueros, diluidos en PBS con 3% de FBS, se ensayaron mediante citometría de flujo usando células de mamífero transfectadas transitoriamente con las variantes de ADNc de IL3RA humana y cyno, IL3RA-hum.ECD e IL3RA-hum.D3.
La reactividad específica de los sueros inmunes contra las células transfectadas con pB1 -IL3RA-hum.ECD, así como con IL3RA-cyno (pFF1262), y las células THP-1 se pudo detectar en todos los animales inmunizados en comparación con las células transfectadas con un ADNc irrelevante.
Las ratas con sueros positivos se sacrificaron, y las células B se fusionaron con células de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se cribaron en células HEK293 transfectadas con plásmidos de expresión de CD123 humana o de macaco, en diferentes líneas celulares que expresan CD123 mediante citometría de flujo (datos mostrados en la tabla 10).
Las células diana se sembraron en 5E4 células en 50 pl de Amortiguador de Tinción con FBS (BD Pharmingen) por pocillo en placas de cultivo en suspensión con fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one). Los sobrenadantes de hibridoma se diluyeron 1:3 en serie en PBS (Invitrogen), y se añadieron 50 pl de cada uno a las células a una concentración máxima final de 1 pg/ml. El ensayo se incubó durante 45 min a 4°C.
Las células se lavaron dos veces con Amortiguador de Tinción con FBS, y se añadió 1 pg de anticuerpo secundario anti-IgG (H+L) de rata de cabra-Alexa Fluor 488 (Invitrogen-Life Technologies, n° MH10520) en 100 pl de Amortiguador de Tinción con FBS por pocillo. El ensayo se incubó durante 15 min a 4°C y después se lavó dos veces.
Las células se resuspendieron en 200 pl de Amortiguador de Tinción con FBS por pocillo y se midieron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi Biotec) o LSRII (BD). Se realizaron más análisis de datos usando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). La lectura fue el porcentaje de células positivas para la unión de anticuerpos. Se usaron células tratadas solo con el anticuerpo secundario pero sin el primario para establecer los agrupamientos de nubes de puntos. Las curvas se calcularon mediante XLfit (Algorithm 205).
La unión específica de clones a CD123 se pudo mostrar en la superficie de HEK293 transfectadas en comparación con células HEK293 no transfectadas, en las que no se pudo detectar ninguna señal (datos no mostrados). La unión de los anticuerpos dependía de la concentración con un valor de EC50 que oscila entre 0,4 y 17,7 ng/ml (tabla 9).
Tabla 9: La unión específica a CD123 de clones de IgG de rata en sobrenadantes de hibridoma detectada por citometría de flujo. La unión de anticuerpos dependiente de la concentración se midió usando HEK293 transfectadas con CD123 como células diana y un anticuerpo secundario anti-IgG (H+L)de rata de cabra-Alexa Fluor 488. Se presentan los valores EC50 calculados de las curvas.
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Tabla 10: Datos de unión de anticuerpos CD123 a células que expresan CD123 y CD123 recombinante. Datos de unión que muestran las afinidades de los anticuerpos CD123 contra la proteína CD123 recombinante procedente de ser humano y de macaco. La unión en la superficie celular se detectó mediante citometría de flujo. SP2 se refiere a la célula que expresa la variante N-terminal truncada (región D1) de CD123. Los anticuerpos se ensayaron por Proteon XPR36 en cuanto a su capacidad para competir con la unión de IL3 a CD123.
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2.5 Humanización de secuencias de anticuerpos de rata anti-CD123
La humanización de anticuerpos de rata se realizó mediante injerto de CDRs o mediante el método 4D (documento US20110027266). Para el anticuerpo de rata anti-CD3 3E3, la secuencia de línea germinal de Rattus más cercana identificada fue iGh V2S48*01 e Ig Hj 3*01 para la región variable de cadena pesada, e IGLV3S2*01 e IGKJ3*01 para la región variable de cadena ligera. El índice de germinalidad de rata calculado (secuencias marco solamente) es 94,51% para VH y 98,9% para VL.
Se verificaron los posibles restos problemáticos expuestos, y se modificó un resto en CDRH2.
Usando el método de injerto, se generaron una variedad de variantes humanizadas basadas en las secuencias de línea germinal humana más cercanas identificadas: IGHV4-59*05 e IGHJ4*01 para VH (índice de germinalidad en los marcos: 75,82%); IGLV6-57*01 e IGLJ3*01 para VL (índice de germinalidad en los marcos: 72,22%).
Además del injerto de CDRs, el se utilizó protocolo de humanización 4D (documento US20110027266) para humanizar los dominios variables de cadena ligera (VL) y de cadena pesada (VH) de 3E3 de rata anti-CD123. Se realizó una simulación de dinámica molecular (MD) en el modelo de homología 3D minimizado (realizado con MOE; PDB usado: 1FLR) de 3E3 de rata anti-CD123, y se comparó con los 49 modelos humanos derivados de las siete cadenas ligeras representativas (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) y las siete cadenas pesadas representativas (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) diseñadas por LGCR/SDI y disponibles dentro del Mo E.
Se han seleccionado dos modelos para la “humanización 4D”: VI3-vh4 y VL3-VH2 con los mejores componentes tanto hidrófobos como electrostáticos y la mejor identidad de secuencia fuera de las CDRs. Para la asociación por pares entre el dominio variable de 3E3 de rata anti-CD123 y los dos modelos seleccionados, las secuencias se alinearon basándose en la superposición 3D óptima de los carbonos alfa de los modelos de homología correspondientes.
Ejemplo 3: Anticuerpos en formato CODV-Fab biespecífico
3.1 Clonación de secuencias de CD3 seleccionadas en combinación con mAb anti-CD123 7G3 en el formato CODV-Fab biespecífico para estudiar su actividad de participación de células T
Las secuencias de anticuerpos CD3 seleccionadas, tales como I2C, mAb2 (Macrogenics) y los denominados “20G6-F3”, “4E7-C9”, “4B4-D7” y “18F5-H10” se expresaron como Fabs anti-CD3 monoespecíficos. Dichas secuencias seleccionadas también se expresaron como CD3xCD123 CODV-Fabs biespecíficos usando secuencias del anticuerpo monoclonal 7G3, dando como resultado los constructos CODV-Fab “I2Cx7G3” y los denominados “7G3x20G6”, “7G3x4E7”, “7G3x4B4” y “7G3x18F5”, como se describe adicionalmente en la sección “proteínas de unión de tipo anticuerpo” aquí anteriormente. Se usaron proteínas purificadas en un ensayo Biacore para comparar la afinidad contra los complejos CD3e/8 (datos presentados en la tabla 11). No se pudieron detectar cambios en las afinidades mediante el análisis de Biacore cuando se introdujeron secuencias de CD3 en el formato CODV-Fab biespecífico.
Tabla 11: Comparación de afinidades entre fragmentos Fab y CODV-Fabs contra complejos CD3e/8 de ser humano y de macaco
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3.2 Los CODV-Fabs biespecíficos dirigidos contra CD123 y CD3 median la potente destrucción de células T redirigida
Dichos CODV-Fabs biespecíficos tienen la capacidad de localizar una célula T (uniendo dicha célula T a la porción de unión a CD3 de un CODV-Fab de unión a CD3) hacia la ubicación de una célula tumoral (uniendo dicha célula cancerosa a la porción CD123 del CODV-Fab). La célula T localizada puede mediar entonces la destrucción de la célula tumoral en un proceso denominado aquí destrucción “redirigida”. Se construyeron CODV-Fabs biespecíficos específicos para CD123 y CD3 que tienen los dominios variables anti-CD123 del anticuerpo monoclonal 7G3 y los dominios variables anti-CD3 de los anticuerpos CD3 seleccionados generados en el ejemplo 1.
Por lo tanto, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de 200 ml de sangre periférica de donantes sanos tratada con EDTA mediante centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll. Se precargaron 15 ml de Histopaque (Sigma-Aldrich) en un Leucosep-Tube de 50 ml (Greiner bio-one). La sangre se diluyó con amortiguador de enjuague autoMACS 1% de BSA (Miltenyi Biotec), y se cargó en la membrana de un total de diez tubos preparados. Los tubos se centrifugaron sin freno durante 10 min a 1000 xg. Las PBMCs se recogieron y lavaron con amortiguador de enjuague autoMACS 1% de BSA tres veces. Finalmente, las PBMCs se resuspendieron en autoMACS Running Buffer (Miltenyi Biotec) para el aislamiento de linfocitos T mediante la tecnología autoMACSpro usando el kit de aislamiento de células Pan T (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. La pureza de las células T separadas se analizó mediante citometría de flujo MACSQuant usando el kit de inmunofenotipado de 7 colores humano (Miltenyi Biotec).
El efecto de participación de células T de los anticuerpos biespecíficos se analizó mediante un ensayo citotóxico basado en citometría de flujo. Las células diana (es decir, la línea celular THP-1) se tiñeron durante 15 min a 37°C con CFSE 1 mM en 1 ml de RPMI GlutaMAX I (Gibco) por 1E7 células. Posteriormente, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en RPMI GlutaMAX I 10% de FCS (Invitrogen). Se sembraron 2,5E4 células diana en placas de cultivo en suspensión de fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one) en 50 ml de medio por pocillo.
Los linfocitos T humanos primarios aislados se resuspendieron en RPMI GlutaMAX I 10% de FCS, y se añadieron a la relación indicada de efector a diana en 50 ml por pocillo a las células diana (en general E:T = 10:1).
Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron 1:3 en serie en PBS (Invitrogen), y se añadieron 5 ml de cada uno a las células a una concentración máxima final de 3000 ng/ml. El ensayo se incubó durante 20 h a 37°C en 5% de CO2.
Para detectar células diana muertas, todas las células se tiñeron con 7-AAD. Por lo tanto, se añadieron a cada pocillo 5 mg/ml de 7-AAD diluido en Amortiguador de Tinción con FBS (BD Pharmingen), y se incubaron durante 15 min a 4°C en la oscuridad. Las células se midieron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi Biotec) o LSRII (BD), respectivamente. Se realizaron más análisis de datos usando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). La lectura fue el porcentaje de células doblemente positivas para CFSE y 7-AAD.
Los resultados de estas investigaciones que se muestran, por ejemplo, en las tablas 20 a 22 demuestran la capacidad de los CD123xCD3 CODV-Fabs para mediar en la destrucción redirigida de células tumorales.
3.3 Evaluación de la seguridad de la destrucción de células T redirigida
El efecto de los anticuerpos biespecíficos sobre el estado de activación de las células T como lectura de seguridad se analizó mediante la detección basada en citometría de flujo de la expresión del marcador de activación CD25 y CD69 en la superficie de las células T humanas primarias.
Se resuspendieron linfocitos T humanos primarios aislados en RPMI GlutaMAX I (Gibco) 10% de FCS (Invitrogen), y se sembraron 2,5E5 células en placas de cultivo en suspensión con fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one) en 50 ml por pocillo.
O bien células T se analizaron exclusivamente y los pocillos se rellenaron con 50 ml de RPMI GlutaMAX I 10% de FCS, o bien las células diana (es decir, la línea celular THP-1) se añadieron a 2,5E4 células por pocillo en 50 ml de RPMI GlutaMAX I 10% de FCS.
Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron 1:3 en serie en PBS (Invitrogen), y se añadieron 5 ml de cada uno a las células a una concentración máxima final de 30000 ng/ml. El ensayo se incubó durante 20 h a 37°C en 5% de CO2.
Después del tiempo de incubación, las células se centrifugaron y se tiñeron durante 15 min a 4°C en 100 ml de Amortiguador de Tinción con FBS (BD Pharmingen) por pocillo con los siguientes anticuerpos marcados: CD4-PE, CD8-APC-Cy7, CD25-APC, CD69-PE-Cy7.
Como control de Fluorescencia Menos Uno (FMO), las células T activadas se tiñeron como se describe anteriormente, pero CD25 se reemplazó por su isotipo (Isotipo APC-IG1k) en un tubo, y CD69 se reemplazó por su isotipo (Isotipo PE-Cy7-IG1k) en un segundo tubo.
Las células se lavaron dos veces después de la tinción, se resuspendieron en 150 ml de Amortiguador de Tinción con FBS, y se midieron 5000 células usando el citómetro de flujo LSRII (BD). Se realizaron más análisis de datos usando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). La lectura fue el porcentaje de células T CD4posCD25pos, CD4posCD69pos, CD8posCD25pos, y CD8posCD69pos. Los agrupamientos de nubes de puntos se establecieron según los controles de FMO (véase tabla 12).
Tabla 12: Actividad de CD123 x CD3 CODV-Fabs medida en un ensayo citotóxico, y seguridad medida por la expresión de CD69
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3.4 Humanización de secuencias de anticuerpos de rata anti-CD3 y anticuerpos biespecíficos
La humanización de anticuerpos de rata se realizó mediante injerto de CDRs o mediante el método 4D (documento US20110027266).
Para el anticuerpo de rata anti-CD3 “20G6”, las secuencias de la línea germinal de Rattus más cercanas se identificaron como IGHV6S17*01 e IGHJ2*01 (para la región variable de cadena pesada, e IGKV1S21*01 e IGKJ4*01 para la región variable de cadena ligera). El índice de germinalidad de rata calculado (secuencias marco solamente) es 97,80% para VH y 95,5% para VL.
Se generaron una variedad de variantes humanizadas usando el método de injerto basado
1) en las secuencias de la línea germinal humana más cercanas identificadas IGHV3-30-01_IGHJ4-01 para VH, con un índice de germinalidad en el marco del 77%; IGK2D-29-02_IGKJ4-01 para VL, con un índice de germinalidad en el marco de 80%), o
2) o basado en la secuencia de la línea germinal más cercana identificada que tiene un PI IGVH3-48*02-IGHJ4-01 más bajo para VH, con un índice de germinalidad en el marco de 75%; IGKV2-28*01-IGKJ4-01 para VL, con un índice de germinalidad en el marco de 77,5%, o
3) que consiste en una secuencia germinal humana más distante (cambio de ciado de línea germinal) (IGVH1-46*01-IGHJ4*01 para VH, con un índice de germinalidad en el marco de 56%; IGKV4*01-IGKJ4*01, para VL con un índice de germinalidad en el marco de 67,5%).
Las secuencias humanizadas se introdujeron entonces en el formato CODV-Fab del denominado CODV-Fab “7G3 x 20G6” en combinación con la secuencia anti-CD123 del anticuerpo 7G3 como se describió anteriormente. Se usaron CD123 x CD3 CODV-Fabs purificados en un ensayo Biacore para evaluar la afinidad por CD3e/8 (véase tabla 13).
Tabla 13: Afinidad de variantes humanizadas seleccionadas del anticuerpo anti-CD3 20G6 por el complejo CD3e/8 recombinante.
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Para el anticuerpo de rata anti-CD3 4B4-D7, la secuencia de la línea germinal de Rattus más cercana se identificó como IGHV6S17 IGHV6S17*01 (identidad de 93%) e IGH121*01 (identidad de 87,5%) para la región variable de la cadena pesada, e IGKV1S21*01 (identidad de 93%) e IGKJ4*01 (identidad de 100%) para la región variable de la cadena ligera.
El porcentaje calculado de identidad de las secuencias V de Rattus identificadas con la germinalidad humana (secuencias marco solamente) es 79% para VH y 77,53% para VL.
Se generó una variedad de pares de variantes humanizadas para VH y VL mediante injerto con ingeniería de secuencia adicional, usando las secuencias de la línea germinal humana más cercanas (IGHV3-30*01_IGHJ6*02; IGKV2-30*02/IGKV2D-39*02_IGKJ2*01). Los porcentajes calculados de germinalidad humana (4 secuencias marco de IMGT solamente) para las secuencias V humanizadas se enumeran en la tabla 14.
Tabla 14: Porcentajes de germinalidad humana para secuencias V humanizadas obtenidas mediante injerto del denominado anticuerpo “B4-D7”. Los porcentajes se calcularon basándose únicamente en las 4 secuencias marco de IMGT.
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Además del injerto de CDRs, el protocolo de humanización 4D como se describe en la solicitud de patente US US20110027266 se utilizó para humanizar los dominios variables ligero (VL) y pesado (VH) de 4B4-D7 de rata anti-CD3. Se realizó una simulación de dinámica molecular (MD) en el modelo de homología 3D minimizado (realizado con MOE; PDB usado: 1FLR) de 4B4-D7 de rata anti-CD3, y se comparó con los 49 modelos humanos derivados de las siete cadenas ligeras representativas (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) y las siete cadenas pesadas representativas (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) diseñadas por LGCR/SDI y disponibles dentro del MOE.
Se seleccionaron dos modelos para la “humanización 4D” vk1-vh6 con la mayor similitud 4D, tanto con componentes hidrófobos como electrostáticos. vk2-vh3 con la identidad de secuencia más alta fuera de CDR. Para la asociación por pares entre el dominio variable de 4B4-D7 de rata anti-CD3 y los dos modelos seleccionados, las secuencias se alinearon basándose en la superposición 3D óptima de los carbonos alfa de los modelos de homología correspondientes. Se optimizaron aún más una variedad de otros pares de variantes humanizadas para VH y VL.
Los porcentajes calculados de germinalidad humana (4 secuencias marco de IMGT solamente) para las secuencias V humanizadas se enumeran en la Tabla 15:
Tabla 15: Porcentajes de germinalidad humana para secuencias V humanizadas obtenidas por humanización 4D del denominado anticuerpo “B4-D7”. Los porcentajes se calcularon basándose únicamente en las 4 secuencias marco de IMGT.
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Las secuencias humanizadas se expresaron como fragmentos Fab y se purificaron, seguido de un ensayo Biacore para evaluar la afinidad por CD3e/8 (datos mostrados en la tabla 16).
Tabla 16: Afinidad de variantes humanizadas seleccionadas del anticuerpo anti-CD3 4B4-D7 por el complejo CD3e/8 recombinante.
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3.5 Unión de CODV hu-Fab CD123 x CD3 a células THP-1 y TF-1
Se clonaron secuencias de anticuerpos CD123 seleccionados en el formato CODV-Fab en combinación con una secuencia de unión a CD3, y las proteínas se expresaron y purificaron.
Su capacidad de unión a las células que expresan naturalmente CD123 se determinó mediante citometría de flujo. La línea celular THP-1 o la línea celular TF-1 se usaron como células diana.
Las células diana se bloquearon con FcR-Blocker (Sigma). Por lo tanto, las células diana se resuspendieron en Amortiguador de Tinción con FBS (BD Pharmingen) y se bloquearon con 100 ml de reactivo de bloqueo por ml durante 1 h a 4°C. Las células se llenaron con Amortiguador de Tinción con FBS, y se sembraron 1E5 células en 50 ml por pocillo en placas de cultivo en suspensión con fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one).
Los anticuerpos se añadieron a 3 mg en 50 ml de Amortiguador de Tinción con FBS por pocillo. El ensayo se incubó durante 30 min a 4°C.
Las células se lavaron dos veces con Amortiguador de Tinción con FBS, y se añadió 1 mg de anticuerpo secundario F(ab’)2 de cabra anti-kappa humana conjugado con FITC (Beckman Coulter, n° 732621) por pocillo en 100 ml de Amortiguador de Tinción con FBS por pocillo. El ensayo se incubó durante 20 min a 4°C, y después se lavó dos veces. Las células se resuspendieron en 150 ml de Amortiguador de Tinción con FBS por pocillo, y se midieron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi Biotec) o LSRII (BD). Se realizaron más análisis de datos usando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). La lectura fue el porcentaje de células positivas para la unión de anticuerpos. Se usaron células tratadas solo con el anticuerpo secundario pero sin el primario para establecer los agrupamientos de nubes de puntos.
Se mostró la unión de CD123xCD3 CODV-Fabs a CD123 con dos líneas celulares diferentes que expresan CD123, ya sea con coexpresión de CD131 en la línea celular TF-1 o sobre la superficie de células THP-1 que carecen de la expresión de CD131. A modo de ejemplo, se muestran cinco clones diferentes que se unen a las células diana. Como control negativo (control de especificidad), se utilizó una CD19xCD3 CODV-Fab, y una CD123xCD3 CODV-Fab de referencia como control positivo (tabla 17).
Tabla 17: Unión específica de secuencias dirigidas contra CD123 clonadas en el esqueleto de CODV-Fab en combinación con una secuencia de unión de CD3 a líneas celulares THP-1 y TF-1. La unión de anticuerpos se detectó usando como células diana THP-1 y TF-1 que expresan CD123. Se añadieron 3 mg de anticuerpo y se detectaron mediante un anticuerpo secundario de cabra anti-kappa humana-FITC. Se muestran los porcentajes de células diana positivas para anticuerpos.
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3.6 Efecto citotóxico para las células THP-1 mediado por CODV-Fab CD123 x CD3
Los efectos de participación de células T de anticuerpos biespecíficos que consisten en una nueva secuencia de CD123 generada y la misma secuencia de unión a CD3 se analizaron mediante un ensayo citotóxico basado en citometría de flujo. Las células efectoras eran células T primarias aisladas de sangre completa de donantes sanos. Se usaron células THP-1 como células diana que expresan CD123.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) procedentes de 200 ml de sangre periférica de donantes sanos tratada con EDTA mediante centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll. Se precargaron 15 ml de Histopaque (Sigma-Aldrich) en un Leucosep-Tube de 50 ml (Greiner bio-one). La sangre se diluyó con amortiguador de enjuague autoMACS 1% de BSA (Miltenyi Biotec), y se cargó en la membrana de un total de diez tubos preparados. Los tubos se centrifugaron sin freno durante 10 min a 1000 xg. Las PBMCs se recogieron y lavaron con amortiguador de enjuague autoMACS 1% de BSA tres veces. Finalmente, las PBMCs se resuspendieron en autoMACS Running Buffer (Miltenyi Biotec) para el aislamiento de linfocitos T mediante la tecnología autoMACSpro usando el kit de aislamiento de células Pan T (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. La pureza de las células T separadas se analizó mediante citometría de flujo MACSQuant usando el kit de inmunofenotipado de 7 colores humano (Miltenyi Biotec).
Las células diana (es decir, la línea celular THP-1) se tiñeron durante 15 min a 37°C con CFSE 1 mM en 1 ml de RPMI GlutaMAX I 10% de FCS (Invitrogen). Se sembraron 2,5E4 células diana en placas de cultivo en suspensión de fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one) en 50 ml de medio por pocillo.
Los linfocitos T humanos primarios aislados se resuspendieron en RPMI GlutaMAX I 10% de FCS, y se añadieron a la relación indicada de efector a diana en 50 ml por pocillo a las células diana (en general E:T = 10:1).
Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron 1:3 en serie en PBS (Invitrogen), y se añadieron 5 ml de cada uno a las células a una concentración máxima final de 3000 ng/ml. El ensayo se incubó durante 20 h a 37°C en 5% de CO2.
Para detectar células diana muertas, todas las células se tiñeron con 7-AAD. Por lo tanto, se añadieron a cada pocilio 5 mg/ml de 7-AAD diluido en Amortiguador de Tinción con FBS (BD Pharmingen), y se incubaron durante 15 min a 4°C en la oscuridad. Las células se midieron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi Biotec) o LSRII (BD), respectivamente. Se realizaron más análisis de datos usando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). La lectura fue el porcentaje de células doblemente positivas para CFSE y 7-AAD. Las curvas se calcularon mediante XLfit (Algorithm 205).
Como se muestra a modo de ejemplo en la tabla 18, los anticuerpos biespecíficos fueron capaces de comprometer células T primarias y lisar células diana THP-1 in vitro. Después de 20 h de co-incubación, se pudo detectar un aumento dependiente de la concentración de anticuerpos en las células diana muertas. Para los anticuerpos que se muestran aquí, se calcularon valores de EC50 que oscilan entre 12,2 y 429,3 ng/ml.
Tabla 18: Efecto de participación de células T de CODV-Fab CD123 x CD3 biespecífico detectado en ensayos citotóxicos basados en citometría de flujo. Se presentan los valores medios de EC50 calculados a partir de curvas.
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El clon 3E3 CD123 se combinó con una variante humanizada del anticuerpo 4B4 anti-CD3 en el formato CODV-Fab. Se analizó Su efecto de participación de las células T y su capacidad para activar las células T in vitro.
Los ensayos citotóxicos se realizaron como se describió anteriormente. El efecto lítico de las células T humanas primarias sobre la célula diana THP-1 mediada por estos constructos se muestra de forma ejemplar en la tabla 20 mediante CODV-Fab hz4B4(4D_A)x3E3. La actividad citotóxica se pudo inducir de forma fiable con un efecto dependiente de la concentración con células T aisladas de siete donantes sanos diferentes (tabla 19).
Tabla 19: Efecto de participación de células T de CODV-Fab biespecífico hz4B4(4D_A) x 3E3 detectado en un ensayo citotóxico basado en citometría de flujo. Se presentan los valores medios de EC50 calculados a partir de curvas.
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3.7 Efecto activador de células T de CD123xCD3 CODV-Fab o DART
El efecto de los anticuerpos biespecíficos sobre el estado de activación de las células T como lectura de seguridad se analizó mediante la detección basada en citometría de flujo de la expresión del marcador de activación CD25 y CD69 en la superficie de las células T humanas primarias, como se describió anteriormente. La comparación incluyó el diacuerpo biespecífico CD123 x CD3 monocatenario en formato DART (denominado aquí “MGD006”) que se describió en el documento WO2015026892 que comprende una primera cadena polipeptídica de secuencia SEQ ID NO: 386 (que es SEQ ID NO: 1 como se muestra en el documento WO2015026892) y una segunda cadena polipeptídica de secuencia SEQ ID NO: 387 (que es SEQ ID NO: 3 como se muestra en el documento WO2015026892) enlazadas convalentemente entre sí mediante un enlace de disulfuro.
Cuando las CODV-Fabs se incubaron con células T aisladas solas, no pudo detectarse ningún aumento significativo en la expresión del marcador de activación tardía CD25 en la superficie de las células T CD4 positivas y CD8 positivas (datos no mostrados). Igualmente, no hubo un aumento dependiente de la concentración en el nivel de expresión del marcador de activación temprana CD69 en ambos subconjuntos de células T (tabla 20). Por lo tanto, el constructo se evaluó como inactivo (NA). Por el contrario, se pudo medir un enorme aumento en el nivel de expresión de ambos marcadores cuando se añadieron células diana THP-1 (datos de CD25 no mostrados, tabla 21 de datos de CD69).
Tabla 20: Efecto de CD123 x CD3 CODV-Fab biespecífico o DART sobre el estado de activación de las células T detectado mediante el nivel de expresión de CD69 en un ensayo basado en citometría de flujo. Se presentan los porcentajes medios de células T CD8 y CD4 activadas a una concentración de anticuerpo de 100 nM y la concentración mínima de efecto en ensayos con células T exclusivamente.
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Los resultados mostrados en la Tabla 20 indican que el anticuerpo monocatenario (DART) provoca significativamente más activación de células T en ausencia de células diana en las condiciones ensayadas.
Tabla 21: Efecto de CODV-Fab biespecífico hz4B4(4D_A) x 3E3 sobre el estado de activación de las células T detectado por el nivel de expresión de CD69 en un ensayo basado en citometría de flujo. Se muestran los porcentajes medios de células T CD8 y CD4 activadas a la concentración máxima de anticuerpo (Cmax) y a la concentración de anticuerpo a la EC50 en el ensayo citotóxico. Los ensayos se realizaron con la co-incubación de células diana THP-1 y células T.
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Tabla 22: Efecto de 7G3 biespecífico completamente humanizado que contiene moléculas CODV y de Dart monocatenario sobre el estado de activación de las células T detectado por el nivel de expresión de CD69 en un ensayo basado en citometría de flujo. Se muestran los valores de EC50 de ensayos representativos de células T CD8 y CD4 activadas en un ensayo citotóxico. Los ensayos se realizaron con la co-incubación de células diana THP-1 y células T.
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Para evaluar los efectos citotóxicos de los nuevos anticuerpos CD123 con partes de CD3 humanizadas, se generaron los CODV-Fabs “hz20G6x7G3”, “7G3xhz4B4”, “hz4B4x3E3” que contienen diferentes combinaciones de Fvs. También se generó una variante que contenía Fc, estando el CODV-Fab “hz20G6x7G3-TL4” etiquetado con Fc en la cadena ligera para formar heterodímeros de Fc con la cadena pesada correspondiente (variante TL4). Las afinidades por el complejo CD3e/8 y CD123 del constructo biespecífico se midieron mediante Biacore. Además, se realizó un ensayo citotóxico como se describió anteriormente, y se midió la activación de CD4+ y la activación de CD8+.
Tabla 23: Afinidades y actividades de moléculas CODV CD123 x CD3 biespecíficas.
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También se evaluaron los efectos citotóxicos de los CODV-Fab “hz20G6xhz7G3”, CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3”, CODV-Fab-OL1 “hz20G6xhz7G3” y el Dart monocatenario MGD006. Las afinidades por el complejo CD3e/8 y CD123 de cada constructo biespecífico se midieron mediante Biacore. Además, se realizó un ensayo citotóxico como se describió anteriormente, y se midieron la activación de CD4+ y la activación de CD8+.
Tabla 24: Afinidades y actividades de moléculas CODV CD123 x CD3 biespecíficas y DART (MGD006)
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Para evaluar el potencial de las moléculas para desencadenar la activación de las células T en presencia (deseada) y ausencia (no deseada) de células diana, se implementó un nuevo ensayo. Se incubaron células Jurkat NFAT-RE-luc2 (células de Promega n° CS176403) con células T humanas recién aisladas en una relación efector:diana de 1:1 a 37°C y 5% de CO2 en RPMI 1640, con 2 g/l (11 mM) de glucosa, con GlutaMAX, con HEPES 25 mM en placas de 386 pocilios. Después de 5 h, se detuvo la incubación y se midió la luminiscencia usando el sistema de ensayo de luciferasa Bio-Glo, Promega n° G7940 en un lector de microplacas HTS de luminiscencia.
Tabla 25: Activación de células T como activación inducida por moléculas CODV CD123 x CD3 y MGD006 medida en la línea celular informadora Jurkat-NFAT-Luc.
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Los resultados mostrados en la Tabla 25 indican que todos los anticuerpos inducen la activación de las células informadoras con valores de EC50 por debajo de nM en presencia de células diana. Para los enfoques de participación de las células T, la activación de las células T debe restringirse a la presencia de células diana. Esto se observa para las moléculas CODV, ya que no hay una señal luminiscente significativa en ausencia de células diana. Por el contrario, la molécula DART monocatenaria induce una mayor activación de la línea celular indicadora en ausencia de células diana. Estos resultados están de acuerdo con los resultados obtenidos con células T primarias.
3.8 Actividad antitumoral in vivo CODV-Fab-TL1 biespecífico CD123xCD3 y CODV-Fab biespecífico CD123xCD3
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de células T y PBMC humanas de sangre completa
Las PBMCs se aislaron de la sangre completa de donantes humanos sanos con centrifugación con gradiente de Ficoll. La sangre completa se diluyó 1:1 en disolución salina amortiguada con fosfato estéril (PBS). Después, se colocaron dos volúmenes de treinta y cinco ml de sangre diluida en dos tubos Falcon de 50 ml en presencia de Ficoll-Paque de 15 ml. Los tubos se centrifugaron a 200 g durante 40 minutos a temperatura ambiente sin freno. Las dos capas de capa leucocitaria se recuperaron y se colocaron en seis tubos Falcon de 50 ml con 45 ml de PBS estéril, y se centrifugaron tres veces (entre cada centrifugación, se desechó el sobrenadante, y se añadieron 45 ml de PBS) a 100 g durante diez minutos a temperatura ambiente sin freno. Después de la última centrifugación, los dos peletes se juntaron en un volumen final de 50 ml completado por PBS en un tubo Falcon de 50 ml. El número total de PBMCs viables se definió mediante recuento de Vicell. A continuación, el pelete se recuperó en amortiguador de ejecución Automacs de Myltenyi Biotech (130-091 -221), y las células T se aislaron a partir de PBMCs usando el KIT de selección negativa de Miltenyi Biotech (130-091-156) y Automacs según las instrucciones del fabricante. Las células T purificadas se recuperaron y se pusieron en cultivo en medio Xvivo-15 5% HIS peni-strepto1X a una concentración de 2,5 x10E 6 células/ml.
Amplificación de células T humanas
La población de células T enriquecidas humanas se activó y expandió in vitro durante 14 días usando el kit de activación/expansión de células T de Miltenyi Biotech (130-091-441).
Preparación de células T humanas para administración in vivo
Las células y el medio de cultivo celular se centrifugaron durante 10 minutos a 400g. El pelete se recuperó a una concentración de 2x10E+7 células/ml en PBS estéril. La eliminación de las perlas activantes a partir de las células T amplificadas se realizó usando el separador MACsiMAG de Myltenyi Biotech (130-092-168) según las instrucciones del fabricante. Las poblaciones de células T enriquecidas se contaron mediante recuento de Vicell y se recuperaron en 25 ml de PBS estéril en un tubo Falcon de 50 ml. Después de una etapa de centrifugación a 400g durante 10 minutos a temperatura ambiente, el pelete celular se recuperó en un volumen adecuado de PBS estéril para obtener una concentración final de 5x10E+7 células/ml.
Modelo de tumor
Las células de leucemia mieloide aguda humana Molm-13 que expresan CD123 se obtuvieron de la colección alemana DSMZ de microorganismos y cultivos celulares del instituto Leibniz (DSMZ Braunshweig, Alemania). Las células se cultivaron en cultivo (37°C, 5% de CO2 , 95% de humedad) en medio RPMI1640 Glutamax (completado con suero fetal de vaca al 20%). Las células Molm-13 se infectaron con un vector de luciferasa (SV40-PGL4-Puro - es decir, vector de luciferasa que consiste en el promotor del virus de simio 40 unido a las secuencias de casete de luciferasa 2 y resistencia a puromicina) portado por un lentivirus no replicativo.
Las células tumorales Molm13-luc+ se inyectaron por vía intravenosa (IV) en ratones NSG NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (10E+6 células por animal en 200 pl de suspensión de PBS). Veinticuatro horas más tarde, se administraron intraperitonealmente (IP) 10E+7 células T humanas a los mismos ratones en un volumen de 0,2 ml de PBS estéril.
Se realizaron imágenes de bioluminiscencia basales en el tercer día después de la implantación del tumor usando el generador de imágenes IVIS100 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) con el software de adquisición Living Image 3.2 (Perkin-Elmer, Waltham, M, USA). Se inyectó IP a los animales con disolución 120 mg/kg de sal potásica de luciferina de escarabajo (lote 316019, Promega, Lyon, Francia) en PBS 15 minutos antes de la obtención de la imagen. Los ratones se anestesiaron con ketamine®/Xylazine® (120 mg/kg; 6 mg/kg IM, 5 ml/kg) 5 minutos antes de la obtención de la imagen.
Los tratamientos con CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3”, CODV-Fab “hz20G6xhz7G3”, con el competidor DART biespecífico CD123xCD3 (formato DART de anticuerpo monocatenario MGD006 o un análogo cercano denominado aquí “herramienta DART”) o con PBS, mediante vía intravenosa (IV) o infusión intraperitoneal continua (CIP), comenzaron el día cuatro después de la implantación del tumor en tumores establecidos ya detectables en los huesos, como se describe en la tabla 26 (CODV-Fab-TL1 “hz20G6xhz7G3”), tabla 27 (CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” IV) y tabla 28 (CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” CIP).
Tabla 26: Diseño del estudio de evaluación intravenosa (IV) de CODV-Fab-TL1 biespecífico CD123xCD3
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Tabla 27: Diseño del estudio de evaluación intravenosa (IV) de CODV-Fab biespecífico CD123xCD3
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Tabla 28: Diseño del estudio de evaluación de infusión intraperitoneal continua (CIP) de CODV-Fab biespecífica de
CD123xCD3
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Recogida de datos y criterios de eficacia
El peso corporal del animal se monitorizó desde el día 3 hasta el final del ensayo para seguir el impacto de la terapia. Se consideró una dosis excesivamente tóxica una dosis que producía una pérdida de peso del 20% o una pérdida de peso del 15% durante 3 días consecutivos o un 10% o más de muertes relacionadas con el fármaco. Los pesos corporales de los animales incluyeron los pesos de los tumores.
La carga tumoral se siguió mediante formación de imágenes por bioluminiscencia no invasiva (BLI). La BLI de referencia se realizó el día tres después de la implantación del tumor, 24 horas antes del inicio de los tratamientos. Los animales se distribuyeron en diferentes grupos según la señal de bioluminiscencia de todo el cuerpo. El crecimiento del tumor se siguió en todo el cuerpo y en los huesos largos de las patas posteriores mediante medidas de la señal de BLI en los días 7, 10 y 14 después de la implantación del tumor. La señal de los huesos largos se midió por segmentación, y pudo verse influida por la señal locorregional cercana (por ejemplo, señal residual en tejidos blandos en puntos de tiempo tardíos). Los grupos tratados se compararon con animales de control que portan tumor diseminado Molm13-luc+ y células T humanas.
Los criterios de valoración de la eficacia primarios fueron la relación de cambios en la señal tumoral desde el valor de referencia entre los grupos tratados y de control (dT/dC), el número de regresiones tumorales parciales (PR) y el número de regresiones tumorales completas (CR).
El crecimiento tumoral basado en curvas de señal de bioluminiscencia (expresadas en Fot/s) en el tiempo se monitorizó para cada animal de cada grupo de tratamiento, y se representó como curva de la mediana ± MAD, tanto para las señales de todo el cuerpo como señales segmentadas de huesos. Los cambios en la señal de bioluminiscencia del tumor se calculan para cada animal de control (C) o tratado (T) y para cada día restando la señal del tumor en el día del primer tratamiento (día de estadificación) de la señal del tumor en el día de observación especificado. La mediana de T se calcula para el grupo tratado, y la mediana de C se calcula para el grupo de control.
Después, la relación T/C se calcula y se expresa como un porcentaje:
dT/dC = [(mediana de T en el día de la observación - mediana de T en el día 3)/(mediana C en el día de la observación - mediana de C en el día)] 3 x 100
La dosis se considera terapéuticamente activa cuando dT/dC al final del experimento (día 14) es menor que 42%, y muy activa cuando dT/dC es menor que 10%.
El porcentaje de regresión tumoral se define como el % de disminución de la señal del tumor en el grupo tratado en un día de observación específico en comparación con su señal en el primer día de tratamiento. En un momento específico y para cada animal, el porcentaje de regresión se calcula como:
Señal 10 - Señalt
% de regresión (a t) = -------- S ------------L x100
eñalt 0
Dado el riesgo de variabilidad de la señal debido a la cinética de luciferina y una posible inyección IP incorrecta, la regresión de la señal para un animal se considera como una verdadera regresión tumoral solo cuando se observa al menos en dos puntos de tiempo consecutivos.
Regresión parcial (PR): Las regresiones se definen como parciales si la señal del tumor disminuye por debajo de la señal al inicio del tratamiento durante dos puntos de tiempo consecutivos, permaneciendo uno de ellos mayor que 50% de la señal de referencia.
Regresión completa (CR): Las regresiones se definen como completas si la señal del tumor disminuye más del 50% por debajo de la señal al inicio del tratamiento durante dos puntos de tiempo consecutivos.
Análisis estadístico
Evaluación de compuestos por vía IV
La señal de bioluminiscencia individual de cada grupo de tratamiento se comparó con otras usando el ajuste de Bonferroni-Holm para comparaciones por pares de multiplicidad siguiendo anova de dos vías con medidas repetidas por día: p>0,05: NS, 0,05 > p > 0,01: *, p<0.01: **. El análisis estadístico se realiza tanto para las señales de bioluminiscencia de todo el cuerpo como para las señales de bioluminiscencia de huesos largos.
Evaluación de compuestos por vía CIP
La evaluación por vía CIP de CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” da como resultado la agregación de datos de dos estudios independientes (1er estudio sobre compuestos a altas dosis, 2° estudio para dosis bajas, incluyendo ambos estudios un grupo de control de vehículo y un grupo de control positivo CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” 1,3 nmol/kg IV Qd). El análisis estadístico de la señal de bioluminiscencia de cada ratón cada día se realizó después de la normalización de los datos por la media de la señal de bioluminiscencia del grupo de vehículo en el mismo día del mismo experimento (controles de vehículo agrupados n = 19; controles positivos agrupados n = 20). La señal de bioluminiscencia normalizada individual de cada grupo de tratamiento se comparó con otros grupos mediante el ajuste de Bonferroni-Holm para comparaciones por pares de multiplicidad siguiendo el anova de dos vías con medidas repetidas por día: p>0,05: NS, 0,05 > p > 0,01: *, p<0,01: **. El análisis estadístico se realiza tanto para las señales de bioluminiscencia de todo el cuerpo como para las señales de bioluminiscencia de huesos largos.
RESULTADOS
CODV-Fab-TL1 biespecífico CD123xCD3 “hz20G6xhz7G3” IV
El CODV-Fab-TL1 completamente humano “hz20G6xhz7G3” IV Q3d, en presencia de células T humanas, inhibió el crecimiento del tumor Molm13 a todas las dosis ensayadas (1,3, 0,13 y 0,013 nmol/kg Q3d), con dT/dC de 20%, 14% y 38% respectivamente en todo el cuerpo (Figuras 5 y 7), y se asoció con la regresión tumoral en huesos largos a todas las dosis ensayadas, con 4/7 CR, 6/8 CR y 2/6 CR respectivamente (Figuras 6 y 8).
Se obtuvo una respuesta máxima de CODV-Fab-TL1 completamente humano “hz20G6xhz7G3” en todo el cuerpo y en el hueso a 0,13 nmol/kg Q3d. A esta dosis, la actividad no fue estadísticamente diferente de DART 1,3 nmol/kg IV Qd (dT/dC para todo el cuerpo 29% con 1/7CR y 1/7PR en huesos largos), y equivalente a CODV-Fab “hz20G6xhz7G3” 1,3 nmol/kg IV Qd (dT/dC para todo el cuerpo 23% con regresión tumoral 1/8CR y 1/8PR en huesos largos). Los datos se confirmaron por análisis de histopatología terminal (no mostrado).
Las diferencias observadas entre todo el cuerpo y los huesos largos están relacionadas con el crecimiento tumoral residual en los ovarios y la grasa abdominal consecutiva a la diseminación del tumor extramedular después de la IV.
CODV-Fab biespecífico CD123xCD3 “hz20G6xhz7G3” IV

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión de tipo anticuerpo que se une a CD3 y a al menos a otro antígeno diana que es CD123, que comprende dos cadenas polipeptídicas que forman dos sitios de unión a antígeno, en la que un primer polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [I]:
VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
y un segundo polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [II]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1 [II]
en las que:
VD1 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
VD2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
VD3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
VD4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
CL es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de cadena pesada Ch1 de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , y L4 son conectores de aminoácidos;
y en la que el primer y el segundo polipéptido forman un par entrecruzado cadena ligera-cadena pesada, y en la que Vd1 y Vd2 son ambos dominios variables de cadenas ligeras o dominios variables de cadenas pesadas, y Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas pesadas si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas ligeras, o Vd3 y Vd4 son ambos dominios variables de cadenas ligeras si Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadenas pesadas,
en la que dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD3 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 6, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 142, CDR2-L de secuencia “KVS” y CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 11; y
en la que la otra de dicha primera o segunda inmunoglobulina es un anticuerpo anti-CD123 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 381, CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 384, CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, CDR2-L de secuencia “WAS” y CDR3-L de secuencia SeQ ID NO: 379.
2. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 1, en la que el polipéptido de fórmula [II] comprende además un dominio Fc.
3. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, que comprende dos cadenas polipeptídicas que forman dos sitios de unión al antígeno, en la que una cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula [I]:
VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
y una cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula [III]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]
en las que:
VD1 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
VD2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
VD3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
VD4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
CL es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de cadena pesada Ch1 de una inmunoglobulina;
Fc es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , y L4 son conectores de aminoácidos;
y en la que el polipéptido de fórmula I y el polipéptido de fórmula III forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada.
4. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 2 o 3, en la que el polipéptido de fórmula [I] comprende además un dominio Fc (Fc2).
5. La proteína de unión de tipo anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, que comprende dos cadenas polipeptídicas que forman dos sitios de unión al antígeno, en la que una cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula [IV]:
VD1-L1-VD2-L2-CL-L5-Fc2 [IV]
y una cadena polipeptídica tiene una estructura representada por la fórmula [III]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc [III]
en las que:
VD1 es un dominio
Figure imgf000353_0001
variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
VD2 es un dominio
Figure imgf000353_0002
variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
VD3 es un dominio
Figure imgf000353_0003
variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
VD4 es un dominio
Figure imgf000353_0004
variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
CL es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
CH1 es un dominio constante de cadena pesada CH1 de una inmunoglobulina;
Fc es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2 , CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
Fc2 es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2 , CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , L4 y L5 son conectores de aminoácidos;
y en la que el polipéptido de fórmula [IV] y el polipéptido de fórmula [III] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada.
6. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 2 o 3, que comprende una tercera cadena polipeptídica que comprende un dominio Fc (Fc3).
7. La proteína de unión de tipo anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 o 6, que comprende tres cadenas polipeptídicas que forman dos sitios de unión a antígeno, en la que
un primer polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [I]:
VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
un segundo polipéptido tiene una estructura representada por la fórmula [III]:
VD3-L3-VD4-L4-CH1-Fc (III)
un tercer polipéptido Fc3 que es la región bisagra de inmunoglobulina y CH2 , CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
en las que
VD1 es un dominio
Figure imgf000353_0005
variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina;
VD2 es un dominio
Figure imgf000353_0006
variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina;
VD3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha segunda inmunoglobulina;
Vd4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de dicha primera inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de cadena ligera de una inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de cadena pesada Ch1 de una inmunoglobulina;
Fc es la región bisagra de la inmunoglobulina, y CH2, CH3 son los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina de una inmunoglobulina;
L1, L2 , L3 , y L4 son conectores de aminoácidos;
y en la que el polipéptido de fórmula [I] y el polipéptido de fórmula [III] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada, y
y en la que el polipéptido de fórmula [III] se heterodimeriza con el tercer polipéptido a través de su dominio Fc.
8. La proteína de unión de tipo anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que Vd1 y Vd2 son dominios variables de cadena ligera, y Vd3 y Vd4 son dominios variables de cadena pesada.
9. La proteína de unión de tipo anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que
Vd1 comprende una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, una CDR2-L de secuencia “WAS”, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 379;
Vd2 comprende una CDR4-L de secuencia SEQ ID NO: 142, una CDR5-L de secuencia “KVS”, y una CDR6-L de secuencia SEQ ID NO: 11;
Vd3 comprende una CDR1 -H de secuencia SEQ ID NO: 6, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 7, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 8; y
Vd4 comprende una CDR4-H de secuencia SEQ ID NO: 381, una CDR5-H de secuencia SEQ ID NO: 384, y una CDR6-H de secuencia SEQ ID NO: 382.
10. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 9, en la que proteína de unión de tipo anticuerpo comprende Vd1 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 385 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, Vd2 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 141 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, Vd3 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 138 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella, y Vd4 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 383 o una secuencia al menos 85% idéntica a ella.
11. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 10, que comprende el conector L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389, L3 y L4 que consisten en 0 aminoácidos, y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313.
12. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 11, que comprende además el conector L5 que consiste en 0 aminoácidos, Fc de secuencia SEQ ID NO: 394, o Fc2 de secuencia SEQ ID NO: 392.
13. La proteína de unión de tipo anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 4 o 6-12, que comprende: a) un polipéptido según la fórmula [I] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 388 que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385, L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, Vd2 de secuencia SEQ ID No : 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389, y Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 388 que comprende una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, una CDR2-L de secuencia “WAS”, una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 379, una CDR4-L de secuencia SeQ ID NO: 142, una CDR5-L de secuencia “KVS”, y una CDR6-L de secuencia SEQ ID NO: 11; y
b) un polipéptido según la fórmula [II] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 390 que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383, L4 es 0 aminoácidos, y Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313, o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 390 que comprende una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 381, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 384, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, y una CDR4-H de secuencia SEQ ID NO: 6, una CDR5-H de secuencia SEQ ID NO: 7, y una CDR6-H de secuencia SEQ ID NO: 8; y en la que el polipéptido de fórmula [I] y el polipéptido de fórmula [II] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada.
14. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 13, que comprende un polipéptido según la fórmula [I] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 388 y un polipéptido según la fórmula [II] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 390.
15. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 5, que comprende:
a) un polipéptido según la fórmula [IV] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 391 que comprende Vd1 de secuencia SEQ ID NO: 385, L1 de secuencia SEQ ID NO: 389, Vd2 de secuencia SEQ ID NO: 141, L2 de secuencia SEQ ID NO: 389, Cl de secuencia SEQ ID NO: 310, L5 que contiene 0 aminoácidos, y Fc2 de secuencia SEQ ID NO: 392, o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 391 que comprende una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO: 378, una CDR2-L de secuencia “WAS", una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO: 379, una CDR4-L de secuencia SEQ ID NO: 142, una CDR5-L de secuencia “KVS", y una CDR6-L de secuencia SEQ ID NO: 11; y
b) un polipéptido según la fórmula [III] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 393 que comprende Vd3 de secuencia SEQ ID NO: 138, L3 es 0 aminoácidos, Vd4 de secuencia SEQ ID NO: 383, L4 es 0 aminoácidos, Ch1 de secuencia SEQ ID NO: 313, y Fc de secuencia SEQ ID NO: 394, o
una secuencia al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 393 que comprende una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO: 381, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO: 384, una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO: 382, una CDR4-H de secuencia SEQ ID NO: 6, una CDR5-H de secuencia SEQ ID NO: 7, y una CDR6-H de secuencia SEQ ID NO: 8;
y en la que el polipéptido de fórmula [IV] y el polipéptido de fórmula [III] forman un par entrecruzado cadena ligeracadena pesada.
16. La proteína de unión de tipo anticuerpo según la reivindicación 15, que comprende un polipéptido según la fórmula [IV] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 391 y un polipéptido según la fórmula [III] que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 393.
17. Una proteína de unión de tipo anticuerpo que comprende un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 391 y un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 393, en la que el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 391 y el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 393 forman un par entrecruzado cadena ligera-cadena pesada.
18. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión de tipo anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. Una proteína de unión de tipo anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18 para uso como un medicamento.
20. Una proteína de unión de tipo anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o una composición farmacéutica según la reivindicación 18, para uso en el tratamiento del cáncer.
21. Una proteína de unión de tipo anticuerpo o composición farmacéutica para uso según la reivindicación 20, en la que el cáncer es un cáncer hematológico.
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