CN102796198A - 抗CD3抗体Fv片段与白介素3的融合蛋白、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种抗CD3抗体Fv片段与白介素3的融合蛋白、制备方法及其用途，涉及融合蛋白抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3、其编码基因；还涉及所述强化融合蛋白的基因工程构建方法和所述强化融合蛋白的用途。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤学和生物药学领域。具体而言，本发明提供了可以靶向杀伤白血病干细胞的融合蛋白及其制备方法及其在靶向***干细胞药物中的应用。
背景技术
白血病的发生、治疗中耐药乃至白血病复发的根本原因在于患者体内存在着一群白血病干细胞(LSC)，它与正常的干细胞一样具有自我更新和分化潜能，它在全血细胞中仅占0.25-1.0％。
白血病的传统治疗方法通常是细胞毒药物的联合化疗及配合造血干细胞移植，然而这种方法选择性差，在杀伤肿瘤细胞的同时也损害体内某些类型的正常细胞，并且只能杀伤大部分已分化的肿瘤细胞而不能杀伤肿瘤干细胞，因此肿瘤治疗效果很不理想。
研究肿瘤干细胞所表达的不同于正常干细胞的表面标志是针对肿瘤干细胞靶向治疗的策略之一，针对这些表面标志的靶向治疗将有效地杀伤肿瘤干细胞而减少或避免对于正常干细胞的损伤。
对各亚型急性髓系白血病干细胞表面标志的研究发现，其具有一些不同与正常造血干细胞的表面标志如CD90(Thy-1)-、CD117(ckit)-和CD123+，CD123是IL-3受体的α链，在正常造血干细胞(CD34+、CD38-)的表达＜1％，而在急性髓系白血病干细胞的表达＞99％。
除此之外，CD123在其他白血病细胞的表面也有表达。
因此研制以CD123为靶点的小型、高效的靶向药物，将为杀伤白血病干细胞或诱导白血病干细胞凋亡进而根治白血病提供一种可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的、由抗CD3抗体Fv片段与白介素3构建的融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白用于制备治疗表达IL-3受体的白血病的药物组合物的用途。
本发明所公开的具体内容是：
1.融合蛋白，选自下述序列之一：
(a)由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列；
(b)具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的生物学功能、且与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列构成的氨基酸序列；和
(c)具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的生物学功能，且经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列。
2.核酸分子，其编码项目1的融合蛋白的基因选自下述序列之一：
(a)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所示的编码EQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的核苷酸序列；
(b)编码项目1中(b)的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)编码项目1中(c)的氨基酸序列的核苷酸序列；和
(d)因为密码子兼并性而分别与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12不同、但是编码与EQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：11所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.载体，其可操作地连接有项目2所述的核酸分子。
4.项目3的载体，所述载体是质粒。
5.宿主菌，其包含项目3所述的载体。
6.制备项目1的融合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将CD3VL和IL3通过G4S连接获得CD3VL-IL3片段，CD3VH和IL3通过G4S连接获得CD3VH-IL3片段；再将CD3VL-IL3片段和CD3VH-IL3片段连接到表达载体pAYZ中，得到重组表达质粒pAYZ抗CD3-IL3；分别以含有CD3VL*/IL3、CD3VL/IL3的中间载体pB11d1为模板，扩增编码IL3末尾八个氨基酸的密码子被删除的CD3VL*-ΔIL3、CD3VL-ΔIL3基因片段；以含有CD3VH*-IL3、CD3VH-IL3的中间载体pB11d1为模板，扩增编码IL3末尾八个氨基酸的密码子被删除的CD3VH*-ΔIL3、CD3VH-ΔIL3的基因片段；再将CD3VL*-IL3和CD3VH*-ΔIL3、CD3VL-IL3和CD3VH-ΔIL3的基因片段连接到表达载体pAYZ中，得到重组表达质粒pAYZ抗CD3*-ΔIL3和pAYZ抗CD3-ΔIL3；
(b)在大肠杆菌16C9中诱导表达融合蛋白抗CD3-IL3、抗CD3*-ΔIL3和抗CD3-ΔIL3；
(c)纯化步骤(b)中获得的融合蛋白；
(d)任选地，其还包括测定步骤(c)中纯化后的融合蛋白的生物学活性的步骤。
7.药物组合物，其中含有药学有效量的项目1所述的融合蛋白，任选地，还含有药学上允许的佐剂。
8.项目1的融合蛋白在制备用于肿瘤干细胞靶向治疗的药物中的用途。
9.项目8的用途，所述药物用于靶向杀伤白血病干细胞。
10.项目9的用途，其中的白血病干细胞是急性髓系白血病干细胞。11.项目9的用途，其包括向有此需要的受试者给予的有效量。
12.项目9的用途，所述受试者的疾病是干细胞(CD34+CD38-)中CD123+的急性髓系白血病。
13.项目9的用途，所述受试者的疾病是急性髓系白血病。
在本发明中所提及的术语均按下述定义来理解。
抗CD3指CD3的Fv片段，抗CD3*指在CD3的VL和VH间引入而二硫键以提高其稳定性。
CD3VL等同于CD3的轻链可变区，CD3VH等同于CD3的重链可变区。
本发明涉及的IL3的DNA序列是其CDS区片段。
本发明通过基因重组技术首次构建了IL-3与抗CD3抗体ScFv融合基因蛋白，人白细胞介素3(IL-3)是CD123的配体，是造血干细胞增殖分化的正性调节因子，可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化，因此又称多重集落刺激因子(multi-colony stimulating factor，multi-CSF)。IL-3受体是由与配体IL-3特异性结合的α链(CD123)和参与信号传递的β链组成。α链和β链在无配体存在时是分离的，当配体与α链低亲和力特异性结合后，α链中一个半胱氨酸与β链中Cys86和Cys91形成二硫键，这是受体活化所必需的，活化的受体成为具有高亲和力的异源二聚体，由β链负责向下游传导信号。
在进行“弹头”选择时，本发明选择了抗CD3抗体的Fv。CD3是T淋巴细胞表面特异分子，通过它可以募集具有杀伤作用的T淋巴细胞。T细胞可以通过与肿瘤细胞接触形成T细胞-肿瘤细胞突触样结构，直接对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。ScFv由抗体重链可变区VH、和轻链VL组成。由于Fv分子量小，因而免疫原性低而不易产生HAMA反应，且易穿透致密的肿瘤细胞间隙屏障，可进入实体瘤深部；同时因为缺乏Fc片段，避免了Fc介导的受体结合作用，使得其快速向靶部位集中；此外还易于在体外进行基因改造，产生靶向融合蛋白。
本发明通过基因工程方法，从含有抗CD3VL/抗CD19VH的中间载体pB11d1和抗CD3VH/抗CD19VL的中间载体pB11d1扩增得到CD3VL片段和CD3VH片段，从表达质粒载体IL3-G4S-LDP中扩增得到IL3基因片段，然后通过overlapPCR将CD3VL和IL3通过GlyGlyGlyGlySer(G4S)连接获得CD3VL-IL3片段，CD3VH和IL3通过GlyGlyGlyGlySer(G4S)连接获得CD3VH-IL3片段。再将CD3VL-IL3片段和CD3VH-IL3片段连接到表达载体pAYZ中，并将表达质粒载体转化到表达宿主菌株中，通过改变培养温度、培养基成分和培养时间优化培养条件，获得了可溶性表达的抗CD3-IL3融合蛋白。但活性检测发现该融合蛋白IL3一端的活性很低，所以本发明又对该融合蛋白进行了改造，即将该融合蛋白编码IL3末尾八个氨基酸的密码子删除(抗CD3-ΔIL3)。抗CD3-ΔIL3与抗CD3-IL3融合蛋白相比在活性上有很大提高。除此之外抗CD3-ΔIL3的产量是抗CD3-IL3融合蛋白的两倍。本发明还通过PCR在CD3VL-100位和抗CD3VH-44位引入半胱氨酸突变，获得了二硫键稳定的抗CD3-ΔIL3即抗CD3*-ΔIL3融合蛋白。
抗CD3-ΔIL3，抗CD3*-ΔIL3融合蛋白有较好的结合活性和杀伤活性，由此提供了新型的、由抗CD3抗体Fv片段与白介素3融合而成的可用于肿瘤治疗的候选靶向肿瘤干细胞治疗药物的融合蛋白。
本发明的优点与积极效果在于：应用基因重组和分子重建相结合的方法，制备了能够介导T淋巴细胞靶向杀伤肿瘤干细胞的抗CD3抗体ScFv片段与白介素3融合蛋白抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3，不仅保留了单抗对CD123抗原的结合性，还具有强烈的肿瘤细胞特异性的杀伤活性在肿瘤靶向免疫治疗药物的小型化方面达到一个新水平，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为重组表达质粒pAYZ抗CD3*-IL3、pAYZ抗CD3-IL3转化后菌体PCR产物的电泳图，其中：
1为DNA分子量标准；
2-6为16C9pAYZ抗CD3*-IL3，
7-11为16C9pAYZ抗CD3-IL3，扩增片段为CD3VH。
图2为重组表达质粒pAYZ抗CD3*-ΔIL3、pAYZ抗CD3-ΔIL3转化后菌体PCR产物的电泳图，其中，1为DNA分子量标准；2-4为pAYZ抗CD3*-ΔIL3；5-7为pAYZ抗CD3-ΔIL3，扩增片段为CD3VH。
图3-1A为表达载体pAYZ抗CD3*-IL3表达产物的SDS-PAGE分析结果，其中：
1为重组菌株16C9pAYZ抗CD3*-IL3周质腔蛋白裂解液；
2为重组菌株16C9pAYZ抗CD3*-IL3周质腔蛋白流出液；
3-5，7为重组菌株16C9pAYZ抗CD3*-IL3周质腔蛋白洗脱液(梯度洗脱)；
6为蛋白MARKER。
8为重组菌株16C9pAYZ抗CD3*-IL3浓缩流出液；
9为重组菌株16C9pAYZ抗CD3*-IL3周质腔蛋白纯化后浓缩液。
图3-1B为融合蛋白抗CD3*-IL3表达产物的Western印迹分析结果，其中：
1为重组菌株16C9pAYZ抗CD3*-IL3周质腔蛋白裂解液；
2为重组菌株16C9pAYZ抗CD3*-IL3周质腔蛋白流出液；
3-5，7为重组菌株16C9pAYZ抗CD3*-IL3周质腔蛋白梯度洗脱液；
6为蛋白MARKER；
8为重组菌株16C9pAYZ抗CD3*-IL3浓缩流出液；
9为抗CD3*-IL3蛋白梯度洗脱液加巯基乙醇被还原后。
图3-2A为融合蛋白抗CD3*-ΔIL3表达产物的SDS-PAGE分析结果。
图3-2B为融合蛋白抗CD3*-ΔIL3表达产物的Western印迹分析结果。
图3-3A为融合蛋白抗抗CD3-ΔIL3表达产物的的SDS-PAGE分析结果。
图3-3B为融合蛋白抗CD3-ΔIL3表达产物的Western印迹分析结果。
图4-1A为融合蛋白抗CD3*-ΔIL3与Jurkat细胞的结合活性。
图4-1B为融合蛋白抗CD3-ΔIL3与Jurkat的结合活性。
图4-2A为融合蛋白抗CD3*-ΔIL3与M07e细胞的的结合活性。
图4-2B为融合蛋白抗CD3-ΔIL3与M07e细胞的的结合活性。
图4-3A-B为TF1与M07e细胞表面CD123的表达情况。
图5-1为不同效靶比的PBL被500ng/ml的抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3介导的体外特异性杀伤TF1细胞的效果对比图。
图5-2A为不同效靶比的PBL被500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml的抗CD3*-ΔIL3介导的体外特异性杀伤TF1细胞的效果对比图。
图5-2B为不同效靶比的PBL被500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml的抗CD3-ΔIL3介导的体外特异性杀伤TF1细胞的效果对比图。
图5-3A效靶比为25∶1的PBL被500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml的抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3介导的体外特异性杀伤M07e细胞的效果对比图。
图5-3B效靶比为12∶1的PBL被500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml的抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3介导的体外特异性杀伤M07e细胞的效果对比图。
图5-3C效靶比为6∶1的PBL被500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml的抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3介导的体外特异性杀伤M07e细胞的效果对比图。
图5-4为不同效靶比的PBL被50ng/ml的抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3介导的体外特异性杀伤M07e细胞的效果对比图。
图5-5为不同效靶比的PBL被500ng/ml抗CD3*/ΔIL3、抗CD3-ΔIL3介导的体外特异性杀伤K562细胞的效果对比图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的具体实施方式进行阐述，所述的实施方式仅仅用来解释和说明本发明，其并不限制本发明的保护范围。任何本领域技术人员根据公知的知识和现有技术的教导能够想到的等价的变体都包含在本发明的保护范围中。
实施例1重组表达质粒pAYZ抗CD3*-IL3，pAYZ抗CD3-IL3的构建。
PCR扩增CD3*VL、CD3VL片段：
由于重组质粒pB11d1抗CD3*VL/抗CD19VH、pB11d1抗CD3VL/抗CD19VH分别含有抗CD3单抗的CD3*VL和CD3VL基因，且重组质粒pB11d1抗CD3*VL/抗CD19VH、pB11d1抗CD3VL/抗CD19VH只有VL区上游含有一个mluI酶切位点，所以本发明用含抗CD3单抗VL基因的重组质粒pB11d1抗CD3*VL/抗CD19VH、pB11d1抗CD3VL/抗CD19VH(本申请人实验室构建)作为模版，获得CD3*VL、CD3VL。PCR引物由上海英骏公司合成。
具体地，以重组质粒pB11d1抗CD3*VL/抗CD19VH、pB11d1抗CD3VL/抗CD19VH做为模板，用P1作为5’端引物，P2作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟，62℃退火40s，72℃延伸45s分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到以mluI酶切位点开头的CD3*VL、CD3VL的基因片段(约451bp)。将片段进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用宝生物工程(大连)有限公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
CD3*VL、CD3VL上游引物P1：
5’-CTTCGAGCTAGCTACCCGGGGATCCTCTAGAG-3’(SEQ ID No：13)
CD3*VL、CD3VL下游引物P2：
5’-CACCCTCCGCCACCCCG-3’(SEQ ID No：14)
PCR扩增3’端引入Nhe I酶切位点的IL3基因片段：
用含有IL3基因的表达载体PAYZIL3-G4S-LDP(本申请人实验室构建)为模板，用P3作为5’端引物，用P4作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟，62℃退火40秒，72℃延伸45秒，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到IL3的基因片段(约427bp)。将片段进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用宝生物工程(大连)有限公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
IL3上游引物P3：
5’-GGTGGCGGAGGGTCGGCTCCCATGACCCAGACAAC-3’(SEQ ID No：15)
IL3下游引物P4：
5’-GCGCGCTAGCTCAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT-3’(SEQ ID No：16)
Nhe I酶切位点
PCR扩增CD3*VH、CD3VH片段：
以重组质粒pB11d1抗CD3*VH/抗CD19VL(本申请人实验室构建)、pB11d1抗CD3VH/抗CD19VL(本申请人实验室构建)做为模板，用P5作为5’端引物，P6作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟，62℃退火40s，72℃延伸45s，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到以mluI酶切位点开头的CD3*VH、CD3VH的基因片段(约384bp)。将片段进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用宝生物工程(大连)有限公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
CD3*VH、CD3VH上游引物P5：
5’-GCGCACGCGTACGCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGT-3’(SEQ I D No：17)
CD3*VH、CD3VH下游引物P6：
5’-CCCTCCGCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTG-3’(SEQ I D No：18)
PCR扩增3’端引入SphI酶切位点和His标签的IL3基因片段：
用表达载体PAYZIL3-G4S-LDP为模板，以P3为5’端引物和P7作为3’端引物，扩增两端为G4S的IL3基因片段，再利用引物P3和P8，通过PCR扩增在IL3基因片段的末尾引入His标签和SphI的酶切位点。反应条件为：94℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟，62℃退火40s，72℃延伸45s，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到3’端引入SphI酶切位点和His标签的IL3基因片段(约433bp)。将片段进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用宝生物工程(大连)有限公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
两端为G4S的IL3基因片段下游引物P7：
5’-TGATCCGCCTCCACCAAAGATCGCGAGGCTCAAAGT-3’(SEQ ID No：19)
包含His标签和Sph I酶切位点的引物P8：
5’-GCGCGCATGCTCAATGATGGTGATGGTGATGTGATCCGCCTCCACC-3’(SEQ IDNo：20)
overlap PCR扩增CD3*VL-IL3、CD3VL-IL3，CD3*VH-IL3、CD3VH-IL3基因片段：
利用纯化的片段CD3*VL、CD3VL和片段IL3，CD3*VH、CD3VH和片段IL3(带His标签)产物进行扩增，反应条件：94℃变性1分钟，55℃退火30s分钟，72℃延伸40s，共10个循环，然后72℃再延伸10分钟，生成少量CD3*VL-IL3、CD3VL-IL3，CD3*VH-IL3、CD3VH-IL3模板。完成上步反应后，补加P1和P4引物，进行扩增，反应条件：94℃变性1分钟，62℃退火1分钟，72℃延伸1min 30s，共30个循环，72℃再延伸10分钟。得到CD3*VL-IL3、CD3VL-IL3，基因片段(约735bp)，CD3*VH-IL3、CD3VH-IL3基因片段(约804bp)。
将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用宝生物工程(大连)有限公司A型胶回收试剂盒回收纯化。将回收得到的CD3*VL-IL3或CD3VL-IL3，CD3*VH-IL3或CD3VH-IL3片段和表达载体PAYZ分别经Mlu I-NheI，NheI-Sph，Mlu I-SphI双酶切后，将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用宝生物工程(大连)有限公司A型胶回收试剂盒回收纯化。将得到的载体酶切产物与目的基因的酶切产物按1∶3∶3的比例用TransGen公司的T4连接酶室温连接15分钟后，转化感受态大肠杆菌16C9，筛选出重组克隆质粒，并进行菌液PCR及酶切鉴定后，测序，结果表明，融合基因重组表达质粒的酶切结果和测序结果与预期完全一致。菌体PCR产物的电泳图参见图1。
抗CD3-IL3的蛋白质序列包括两条链，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示，SEQ ID NO：1为CD3VL-IL3，SEQ ID NO：3为CD3VH-IL3。CD3VL-IL3：1-23位为信号肽；24-130位为轻链可变区；131-135位为G4S；136-268位为IL3。CD3VH-IL3：1-23位为信号肽；24-142为重链可变区；143-147位为G4S；148-280位为IL3。其中G4S为由4个甘氨酸和1个丝氨酸组成的连接肽。
抗CD3-IL3的DNA序列包括两条编码链如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示，SEQ ID NO：2为CD3VL-IL3DNA序列其：1-69位为信号肽基因序列，70-390位为轻链可变区基因序列，391-405位为G4S，406-804位为IL3基因序列，805-807位为终止密码子。EQ ID NO：4为CD3VH-IL3DNA序列其：1-69位为信号肽基因序列，70-426位为重链可变区基因序列，427-441位为G4S，442-840位为IL3基因序列，841-855位为G4S，856-873为His6标签，874-876位为终止密码子。
实施例2重组表达质粒pAYZ抗CD3*-ΔIL3、pAYZ抗CD3-ΔIL3的构建。
PCR扩增CD3VL *-ΔIL3、CD3VL-ΔIL3基因片段：
分别以含有CD3VL *-IL3、CD3VL-IL3的中间载体pB11d1为模板，以引物P1为5’端引物，P9作为3’端引物，扩增编码IL3末尾八个氨基酸的密码子被删除的CD3VL *-ΔIL3、CD3VL-ΔIL3基因片段。反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性1分钟，62℃退火1分钟，72℃延伸1min 30s，共30个循环，72℃再延伸10分钟。得到CD3VL *-ΔIL3(K)、CD3VL-ΔIL3(L)基因片段。将K和L片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用宝生物工程(大连)有限公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
CD3VL *-ΔIL3、CD3VL-ΔIL3基因片段下游引物P9：
5’-GCGCGCTAGCTCACTGTTGAGCCTGCGCATTCTC-3’(SEQ ID No：21)
PCR扩增CD3VH *-ΔIL3、CD3VH-ΔIL3基因片段：
分别以含有CD3VH *-IL3、CD3VH-IL3的中间载体pB11d1为模板，以引物P5为5’端引物，P10作为3’端引物，扩增编码IL3末尾八个氨基酸的密码子被删除的CD3VH *-IL3、CD3VH-IL3基因片段。反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性1分钟，62℃退火1分钟，72℃延伸1min 30s，共30个循环，72℃再延伸10分钟。再利用引物P5和P11，通过PCR扩增在IL3基因片段的末尾引入His标签和Sph I的酶切位点。反应条件同上。将引入His标签和Sph I酶切位点的CD3VH*-ΔIL3、CD3VH-ΔIL3基因片段产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用宝生物工程(大连)有限公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
CD3VH *-ΔIL3、CD3VH-ΔIL3基因片段下游引物P10：
5’-GCGCGCTAGCTCACTGTTGAGCCTGCGCATTCTC-3’(SEQ ID No：22)
包含His标签和Sph I酶切位点的引物P11：：
5’-GCGCACGCGTACGCTCATCACCATCACCATCATGGTGGAGGC-3’(SEQ ID No：23)
将回收得到的CD3VL *-ΔIL3和CD3VL-ΔIL3经Mlu I-NheI双酶切，CD3VH *-ΔIL3、CD3VH-ΔIL3经Nhe I-Sph I双酶切，表达载体PAYZ经Mlu I-Sph I双酶切后，将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用宝生物工程(大连)有限公司A型胶回收试剂盒回收纯化。将得到的载体酶切产物与目的基因的酶切产物按1∶3∶3的比例用TransGen公司的T4连接酶室温连接15分钟后，转化感受态大肠杆菌16C9，筛选出重组克隆质粒，并进行菌液PCR及酶切鉴定后，测序。结果表明，融合基因重组表达质粒的酶切结果和测序结果与预期完全一致。菌体PCR产物的电泳图参见图2。
抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3的蛋白质序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7、EQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示，均包括两条链：CD3*VL-ΔIL3和CD3*VH-ΔIL3或CD3VL-ΔIL3和CD3VH-ΔIL3。CD3*VL-ΔIL3或CD3VL-ΔIL3：1-23位为信号肽；24-130位为轻链可变区；131-135位为G4S；136-260位为IL3。CD3*VH-ΔIL3或CD3VH-ΔIL3：1-23位为信号肽；24-142为重链可变区；143-147位为G4S；148-272位为IL3。其中G4S为由4个甘氨酸和1个丝氨酸组成的连接肽。
抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3的DNA序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所示，均包括两条编码链：CD3*VL-ΔIL3和CD3*VH-ΔIL3DNA序列或CD3VL-ΔIL3和CD3VH-ΔIL3DNA序列。
CD3*VL-ΔIL3或CD3VL-ΔIL3DNA序列：1-69位为信号肽基因序列，70-390位为轻链可变区基因序列，391-405位为G4S，406-780位为IL3基因序列，781-783位为终止密码子。CD3*VH-ΔIL3或CD3VH-ΔIL3DNA序列：1-69位为信号肽基因序列，70-426位为重链可变区基因序列，427-441位为G4S，442-816位为IL3基因序列，817-831位为G4S，832-849为His6标签，850-852位为终止密码子。
实施例3pAYZ抗CD3*-IL3、pAYZ抗CD3-IL3和pAYZ抗CD3*-ΔIL3、pAYZ抗CD3-ΔIL3的表达与验证。
3.1将实施例1、2中获得的含有质粒pAYZ抗CD3-IL3、pAYZ抗CD3-IL3和pAYZ抗CD3*-ΔIL3、pAYZ抗CD3-ΔIL3的大肠杆菌16C9的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的2×YT培养基中，在恒温摇瓶箱中37℃，200rpm，振荡培养过夜；移入500ml含Amp 100μg/ml的2×YT培养基(1L的2×YT培养基含1.6％胰化蛋白胨、1.0％酵母抽提物、0.5％氯化钠，PH7.4)中，37℃，200rpm，振荡培养8h后，在低温高速真空离心机上6000rpm、4℃离心10分钟收集菌体，将菌体重悬于1000ml含氨苄青霉素100ug/ml的AP5培养基中，30℃，200rpm，振荡培养24h。在4℃低温高速真空离心机上8000rpm×10min离心，收集菌体。冷冻于-20℃冰箱备用。
将冻存的菌体化冻，加入50ml细菌周质腔蛋白提取液(三羟甲基氨基甲烷25mmol/L，乙二胺四乙酸1mmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF)0.1mmol/L，蔗糖20％(w/w，NaCl 200mmol/L，pH 7.5)，振荡混匀，置于4℃轻摇1h。12000rpm，4℃离心20分钟，取上清。将提取物用PBS透析24h后，在快速蛋白层析仪(FPLC)上进行纯化，用结合缓冲液(0.02M磷酸盐缓冲液PH7.4，0.5M NaCL，20mM咪唑)平衡亲和层析柱，上样，再用结合缓冲液冲洗基线，至基线稳定后，用洗脱缓冲液(0.02M磷酸盐缓冲液PH7.4，0.5M NaCL，0.5M咪唑)洗脱，用蛋白浓缩柱，以PBS置换洗脱液并浓缩蛋白，分装后保存于-20℃。然后用12％SDS-PAGE分析外源蛋白表达情况，结果表明，经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白，pAYZ抗CD3*-IL3(图3-1A)、pAYZ抗CD3-IL3和pAYZ抗CD3*-ΔIL3(图3-2A)、pAYZ抗CD3-ΔIL3(图3-3A)的表达产物主要存在于细菌可溶性周质腔中。
3.2用Western印迹法确认pAYZ抗CD3*-IL3、pAYZ抗CD3-IL3和pAYZ抗CD3*-ΔIL3、pAYZ抗CD3-ΔIL3。
将3.1获得的蛋白进行电泳，电泳后的凝胶在Bio-Rad电转槽中进行半干电转，条件为：恒电流0.65mA/cm2，时间为3小时。电转结束后的NC膜与用封闭液1000倍稀释的一抗即孵育，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗，进行显色分析，结果表明，重组菌株表达的抗CD3*-IL3(图3-1B)、抗CD3-IL3重组菌株表达的pAYZ抗CD3*-ΔIL3(图3-2B)、pAYZ抗CD3-ΔIL3(图3-3B)确为末端带His标签的重组融合蛋白。
但上述实验过程发现抗CD3*-IL3(图3-1B)、抗CD3-ΔIL3存在不稳定容易降解的现象。
实施例4抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3的免疫学活性。
通过流式细胞仪测定和抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3的体外免疫荧光结合活性，取终浓度为20μg/ml纯化抗CD3*-ΔIL3及抗CD3-ΔIL3抗体与1×106Jurkat细胞或终浓度为50ng/ml纯化抗CD3*-ΔIL3及抗CD3-ΔIL3抗体与1×106 M07e细胞4℃共同温育1h，300×g，4℃离心5min，弃上清，冷PBS洗细胞，重复3次。细胞再与小鼠抗His-tag单克隆抗体(1∶1000稀释)4℃共同温育1h，1500r/min，4℃离心5min，弃上清，PBS洗细胞，重复3次，将细胞重悬于20μl FITC标记的兔抗小鼠IgG多抗，4℃共同温育30min，300×g，4℃离心5min，弃上清，PBS洗细胞，重复2次，FACS测定抗CD3*-ΔIL3及抗CD3-ΔIL3与Jurkat或M07e细胞的阳性率。证明抗CD3*-ΔIL3及抗CD3-ΔIL3与Jurkat(图4-1A、B)或M07e(图4-2A、B)细胞均具有良好的靶向结合能力。通过流式细胞仪测定阳性细胞表面CD123的表达情况如图4-3A、B所示。
实施例5抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3对体外培养的肿瘤细胞的特异性的细胞毒作用。
以Calcein-AM法进行测定细胞毒作用。取对数生长期的TF1、M07e细胞计数，1×104个/孔铺于96孔板，然后加入不同浓度的药物抗CD3*-ΔIL3、抗CD3-ΔIL3，每个药物浓度按照效靶比25∶1，12.5∶1、6∶1和3∶1分别加入活化的PBL，每种实验孔设3个平行孔。同时设立靶细胞自发释放和最大释放对照组。继续培养4小时后，300g/分钟离心5分钟，各组分别取上清70μl，用FluoroskanAscent FL(Thermo)荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长为485nm，发射波长为535nm。按下式计算特异性杀伤的百分率：
结果显示，在融合蛋白存在的情况下，激活的T淋巴细胞能够特异性杀伤CD123高表达的TF1细胞，杀伤效率明显强于对照各组(P＜0.05)(图5-1)。随着抗体浓度的增高，激活的T淋巴细胞裂解杀伤靶细胞的作用逐渐增强(图5-2A、B)。当E∶T比逐渐增加时，激活的T淋巴细胞杀伤靶细胞的作用也逐渐增强(图5-1，5-2A、B)。对于CD123表达阳性的M07e种细胞，双功能抗体都有明显的介导效应(图5-3A、B、C、图5-4)，但其杀伤力最高时的浓度为50ng/ml(图5-3A、B、C).而以CD123表达阴性的K562细胞作为靶细胞时，双功能抗体相对于对照组的杀伤效果，没有统计学差异(图5-5)。
Claims (13)
1.融合蛋白，选自下述序列之一：
(a)由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列；
(b)具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的生物学功能、且与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列构成的氨基酸序列；和
(c)具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的生物学功能，且经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列。
2.核酸分子，其编码权利要求1的融合蛋白的基因选自下述序列之一：
(a)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所示的编码EQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的核苷酸序列；
(b)编码权利要求1中(b)的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)编码权利要求1中(c)的氨基酸序列的核苷酸序列；和
(d)因为密码子简并性而分别与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12不同、但是编码与EQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：11所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.载体，其可操作地连接有权利要求2所述的核酸分子。
4.权利要求3的载体，所述载体是质粒。
5.宿主菌，其包含权利要求3所述的载体。
6.制备权利要求1的融合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)将CD3VL和IL3通过G4S连接获得CD3VL-IL3片段，CD3VH和IL3通过G4S连接获得CD3VH-IL3片段；再将CD3VL-IL3片段和CD3VH-IL3片段连接到表达载体pAYZ中，得到重组表达质粒pAYZ抗CD3-IL3；分别以含有CD3VL*-IL3、CD3VL-IL3的中间载体pB11d1为模板，扩增编码IL3末尾八个氨基酸的密码子被删除的CD3VL*-ΔIL3、CD3VL-ΔIL3基因片段；以含有CD3VH*-IL3、CD3VH-IL3的中间载体pB11d1为模板，扩增编码IL3末尾八个氨基酸的密码子被删除的CD3VH*-ΔIL3、CD3VH-ΔIL3的基因片段；再将CD3VL*-IL3和CD3VH*-ΔIL3、CD3VL-IL3和CD3VH-ΔIL3的基因片段连接到表达载体pAYZ中，得到重组表达质粒pAYZ抗CD3*-ΔIL3和pAYZ抗CD3-ΔIL3；
(b)在大肠杆菌16C9中诱导表达融合蛋白抗CD3-IL3、抗CD3*ΔIL3和抗CD3-ΔIL3；
(c)纯化步骤(b)中获得的融合蛋白；
(d)任选地，其还包括测定步骤(c)中纯化后的融合蛋白的生物学活性的步骤。
7.药物组合物，其中含有药学有效量的权利要求1所述的融合蛋白，任选地，还含有药学上允许的佐剂。
8.权利要求1的融合蛋白在制备用于肿瘤干细胞靶向治疗的药物中的用途。
9.权利要求8的用途，所述药物用于靶向杀伤白血病干细胞。
10.权利要求9的用途，其中的白血病干细胞是急性髓系白血病干细胞。
11.权利要求9的用途，其包括向有此需要的受试者给予有效量的项目1的融合蛋白。
12.权利要求9的用途，所述受试者的疾病是干细胞(CD34+CD38-)中CD123+的急性髓系白血病。
13.权利要求9的用途，所述受试者的疾病是急性髓系白血病。
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