ES2749627T3 - Complejo que contiene oligonucleótido que tiene actividad inmunoestimulante y su uso - Google Patents

Complejo que contiene oligonucleótido que tiene actividad inmunoestimulante y su uso Download PDF

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ES2749627T3 ES14846493T ES14846493T ES2749627T3 ES 2749627 T3 ES2749627 T3 ES 2749627T3 ES 14846493 T ES14846493 T ES 14846493T ES 14846493 T ES14846493 T ES 14846493T ES 2749627 T3 ES2749627 T3 ES 2749627T3
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Kouji Kobiyama
Taiki Aoshi
Fumihiko Takeshita
Yuji Kasuya
Takako Niwa
Makoto Koizumi
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Daiichi Sankyo Co Ltd
National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
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Nat Inst Biomedical Innovation Health & Nutrition
Daiichi Sankyo Co Ltd
National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
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Abstract

Un complejo que comprende un oligodesoxinucleótido y ß-1,3-glucano, en el que el oligodesoxinucleótido comprende: oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado y poli desoxiadenilato, en donde el poli desoxiadenilato está colocado en el lado 3 ' del oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado, en donde el oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 1, en donde el poli desoxiadenilato tiene una longitud de 30-40 nucleótidos, y en donde el ß-1,3-glucano es lentinano.

Description

DESCRIPCIÓN
Complejo que contiene oligonucleótido que tiene actividad inmunoestimulante y su uso
Campo técnico
La presente invención se refiere a un complejo que contiene oligonucleótido que tiene una actividad inmunoestimulante, y al uso del mismo. Más particularmente, la presente invención se refiere a un complejo que comprende un oligodesoxinucleótido (ODN) CpG que tiene actividad inmunoestimulante, y p-glucano, y a su uso farmacéutico.
Antecedentes de la invención
El oligodesoxinucleótido CpG (ODN CpG) es un fragmento corto (alrededor de 20 pares de bases) de ADN sintético de cadena sencilla, que contiene el motivo CpG inmunoestimulante, un agonista potente para el receptor 9 de tipo Toll (TLR9), activa las células dendríticas (DC) y las células B para producir interferones (IFN) de tipo I y citocinas inflamatorias (documentos no de patente 1, 2), y actúa como un adyuvante para las respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales de tipo Th1, incluidas las respuestas de los linfocitos T citotóxicos (CTL) (documentos no de patente 3, 4). Por lo tanto, se ha propuesto a ODN CpG como un posible agente inmunoterapéutico contra enfermedades infecciosas, cáncer, asma y polinosis (documentos no de patente 2, 5).
Existen por lo menos cuatro tipos de ODN CpG, cada uno de los cuales tiene cadena principal, secuencia y propiedades inmunoestimulantes diferentes (documento no de patente 6). El ODN CpG de tipo D (también denominado A), típicamente comprende un motivo CpG palindrómico con una cadena principal de fosfodiéster (PO) y una cola de fosforotioato (PS) poli G, que activa las DC plasmacitoides (pDC) para producir una gran cantidad de lFN-a, pero no puede inducir la maduración de las pDC ni la activación de las células B (documentos no de patente 7, 8). Los otros tres tipos de ODN consisten en una cadena principal de PS. El CpG ODN de tipo K (también denominado B) contiene múltiples motivos CpG no palindrómicos, y activa fuertemente las células B para producir IL-6 y pDC hasta la maduración, pero raramente produce IFN-a (documentos no de patente 8, 9). Recientemente se han desarrollado ODN CpG de tipo C y P; estos contienen, respectivamente, una y dos secuencias de CpG palindrómicas, y ambos en forma de tipo K pueden activar las células B, y en forma de tipo D pueden activar las pDC, aunque los ODN CpG de tipo C inducen una producción de IFN-a más débil en comparación con los ODN CpG de tipo P (documentos no de patente 10-12). Muchos ODN CpG de tipo K superiores se describen en el documento de patente 1.
Se ha indicado que los ODN CpG de tipo D y P forman estructuras de orden superior, con apareamiento de bases de Hoogsteen para formar estructuras cuádruplex paralelas denominadas tétradas G, y apareamiento de bases de Watson-Crick entre porciones palindrómicas cis y trans, respectivamente, que son requeridas para la producción robusta de IFN-a por pDC (documentos no de patente 12-14). Aunque estas estructuras de orden superior parecen necesarias para la localización hacia los endosomas tempranos y la señalización vía TLR9, experimentan polimorfismos de producto, agregación y precipitación, lo que obstaculiza sus aplicaciones clínicas (documento no de patente 15). Por lo tanto, solo los ODN CpG de tipo K y C están disponibles generalmente como agentes inmunoterapéuticos y adyuvantes de vacunas para uso humano (documentos no de patente 16 y 17). Aunque el ODN CpG de tipo K intensifica la inmunogenicidad de vacunas dirigidas a enfermedades infecciosas y cáncer en ensayos clínicos humanos (documentos no de patente 6, 16), es necesaria la conjugación química o física entre el antígeno y el ODN CpG de tipo K para obtener efectos óptimos de adyuvante. Estos resultados indican que estos cuatro tipos de ODN CpG (K, D, P y C) tienen ventajas y desventajas, sin embargo todavía está por lograrse el desarrollo de un ODN CpG "todo en uno" que active tanto las células B como las pDC, sin agregación.
El esquizofilano (SPG), un p-1,3-glucano soluble obtenido a partir de Schizophyllum commune, es un fármaco aprobado en Japón como intensificador de radioterapia en pacientes de carcinoma cervical, durante las últimas tres décadas (documento no de patente 18). Similarmente, el lentinano (LNT), un p-1,3-glucano soluble obtenido a partir del hongo shiitake, es un medicamento aprobado en 1985 y usado en combinación con un medicamento de fluoropirimidina en pacientes de cáncer gástrico recurrente inoperable (documentos no de patente 19 y 20). Se ha indicado que el p-1,3-glucano forma un complejo con poli desoxiadenilato (dA) como una estructura de triple hélice (documento no de patente 21).
Los documentos de patente 2 a 4 divulgan el uso de un complejo soluble en agua de p-1,3-glucano que incluye esquizofilano y ácido nucleico (gen), como portador de gen. Estos documentos describen que la formación del complejo intensifica la acción antisentido del gen y una acción de resistencia de este contra la nucleasa.
El documento de patente 5 divulga el uso de polisacáridos que tienen un enlace p-1,3 como portadores (agentes de transfección) que intensifican la acción de un oligonucleótido inmunoestimulante que tiene una secuencia CpG, en donde un enlace fosfodiéster es sustituido por un enlace fosforotioato o un enlace fosforoditioato.
El documento de patente 6 divulga un complejo inmunoestimulante que consiste en un oligonucleótido inmunoestimulante y p-1,3-glucano que tiene una cadena lateral larga de enlace p-1,6-glucosídico.
Los presentes inventores demostraron previamente que ODN CpG de ratón y humanizado enlazado con poli-dA, con un enlace fosfodiéster en el extremo 5', unido en complejo con SPG, intensificaba la producción de citocina y actuaba como adyuvante de vacuna de la influenza y como agente profiláctico o terapéutico para enfermedades relacionadas con las células Th2 (documentos no de patente 22, 23, documento de patente 7). Cuando se añadió poli(dA) al extremo 5' de CpG de cada uno del tipo K y el tipo D para formar un complejo con SPG, ambos presentaron actividad incrementada pero manteniendo las propiedades del tipo K y tipo D. Sin embargo, fue difícil obtener altos rendimientos del complejo CpG-SPG para un desarrollo preclínico y también clínico más eficiente y económico. Recientemente, al enlazar poli(dA) que tiene un enlace fosforotioato al ODN CpG, la eficiencia de formación de complejo se elevó casi en 100% (documento no de patente 24). El documento no de patente 25 también describe un complejo de ODN CpG de tipo K humanizado al que se ha añadido poli(dA) en el extremo 3' del ODN CpG, y SPG. Sin embargo, no se ha realizado todavía una investigación profunda para identificar la mejor secuencia de CpG humanizada y optimizar los factores para lograr actividades "todo en uno" de los cuatro tipos de ODN CpG.
El documento de patente 8 divulga un método de producción de un complejo ternario de tipo antígeno/oligonucleótido CpG/p-1,3-glucano.
Lista de documentos
Documentos de patente
Documento de patente 1: US 8,030,285 B2
Documento de patente 2: WO 01/034207 A1
Documento de patente 3: WO 02/072152 A1
Documento de patente 4: JP-A-2004-107272
Documento de patente 5: WO 2004/100965 A1
Documento de patente 6: JP-A-2007-70307
Documento de patente 7: JP-A-2008-100919
Documento de patente 8: JP-A-2010-174107
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Hemmi, H., et al. AToll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408, 740-745 (2000).
Documento no de patente 2: Krieg, A.M. Therapeutic potential ofToll-like receptor 9 activation. Nature reviews. Drug discovery 5, 471-484 (2006).
Documento no de patente 3: Brazolot Millan, C.L., Weeratna, R., Krieg, A.M., Siegrist, C.A. & Davis, H.L. CpG DNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediated immune responses against hepatitis B surface antigen in young mice. Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America 95, 15553-15558 (1998).
Documento no de patente 4: Chu, R.S., Targoni, O.S., Krieg, A.M., Lehmann, P.V. & Harding, C.V. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. The Journal of experimental medicine 186, 1623-1631 (1997).
Documento no de patente 5: Klinman, D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nature reviews. Immunology 4, 249-258 (2004).
Documento no de patente 6: Vollmer, J. & Krieg, A.M. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists. Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009).
Documento no de patente 7: Krug, A., et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendrític cells. European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001).
Documento no de patente 8: Verthelyi, D., Ishii, K.J., Gursel, M., Takeshita, F. & Klinman, D.M. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CPG motifs. Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001).
Documento no de patente 9: Hartmann, G. & Krieg, A.M. Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells. Journal of immunology 164, 944-953 (2000).
Documento no de patente 10: Hartmann, G., et al. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine B cell activation with high IFN-alpha induction in plasmacytoid dendrític cells. European journal of immunology 33, 1633­ 1641 (2003).
Documento no de patente 11: Marshall, J.D., et al. Identification of a novel CpG DNA class and motifthat optimally stimulate B cell and plasmacytoid dendritic cell functions. Journal of leukocyte biology 73, 781-792 (2003).
Documento no de patente 12: Samulowitz, U., et al. A novel class of immune-stimulatory CpG oligodeoxynucleotides unifies high potency in type I interferon induction with preferred structural properties. Oligonucleotides 20, 93-101 (2010).
Documento no de patente 13: Kerkmann, M., et al. Spontaneous formation of nucleic acid-based nanoparticles is responsible for high interferon-alpha induction by CpG-A in plasmacytoid dendritic cells. The Journal of biological chemistry 280, 8086-8093 (2005).
Documento no de patente 14: Klein, D.C., Latz, E., Espevik, T. & Stokke, B.T. Higher order structure of short immunostimulatory oligonucleotides studied by atomicforce microscopy. Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010).
Documento no de patente 15: Puig, M., et al. Use of thermolytic protective groups to prevent G-tetrad formation in ODN CpG D type: structural studies and immunomodulatory activity in primates. Nucleic acids research 34, 6488­ 6495 (2006).
Documento no de patente 16: Bode, C., Zhao, G., Steinhagen, F., Kinjo, T. & Klinman, D.M. CpG DNA as a vaccine adjuvant. Expert review of vaccines 10, 499-511 (2011).
Documento no de patente 17: McHutchison, J.G., et al. Phase 1B, randomized, doubleblind, dose-escalation trial of CPG 10101 in patients with chronic hepatitis C virus. Hepatology 46, 1341-1349 (2007).
Documento no de patente 18: Okamura, K., et al. Clinical evaluation of schizophyllan combined with irradiation in patients with cervical cancer. A randomized controlled study. Cancer 58, 865-872 (1986).
Documento no de patente 19: Oba, K.; Kobayashi, M.; Matsui, T.; Kodera, Y.; Sakamoto, J. Individual patient based meta-analysis of lentinan for unresectable/recurrent gastric cancer. Anticancer Res., 2009, 29, 2739-2746.
Documento no de patente 20: Nakano, H.; Namatame, K.; Nemoto, H.; Motohashi, H.; Nishiyama, K.; Kumada, K. A multi-institutional prospective study of lentinan in advanced gastric cancer patients with unresectable and recurrent diseases: Effect on prolongation of survival and improvement of quality of life. Hepato-Gastroenterol., 1999, 46, 2662­ 2668.
Documento no de patente 21: Sakurai, K., Mizu, M. & Shinkai, S. Polysaccharide polynucleotide complexes. 2. Complementary polynucleotide mimic behavior of the natural polysaccharide schizophyllan in the macromolecular complexwith single-stranded RNAand DNA. Biomacromolecules 2, 641-650 (2001).
Documento no de patente 22: Shimada, N., et al. A polysaccharide carrierto effectively deliver native phosphodiester CpG DNAto antigen-presenting cells. Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007).
Documento no de patente 23: Koyama, S., et al. Plasmacytoid dendritic cells delineate immunogenicity of influenza vaccine subtypes. Science translational medicine 2, 25ra24 (2010).
Documento no de patente 24: Minari, J., et al. Enhanced cytokine secretion from primary macrophages due to Dectin-1 mediated uptake of CpG DNA/beta-1,3-glucan complex. Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011).
Documento no de patente 25: Miyamoto, H., et al. Selective delivery of oligonucleotide using a beta-1,3-glucan receptor. Cellulose communication 19, 12-16 (2012).
Breve descripción de la invención
Problemas que ha de resolver la invención
El problema que ha de resolver la presente invención es proporcionar un agente inmunoestimulante con una actividad más fuerte que la de los complejos CpG-SPG convencionales.
Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores han realizado estudios exhaustivos y han identificado un complejo novedoso que comprende ODN CpG de tipo K (K3) (SEQ ID NO: 2) que tiene una cola de poli(dA) en el extremo 3' y SPG, a saber K3-SPG. Este forma una nanopartícula de orden superior que puede ser completamente solubilizada. Similarmente, los presentes inventores también han logrado producir un nuevo complejo K3-LNT que comprende el ODN CpG de tipo K antes mencionado y lentinano (LNT). Aunque K3-SPG y K3-LNT no tienen una secuencia de ODN CpG de tipo D, tienen simultáneamente una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo K (por ejemplo, actividad para activar las células B (preferiblemente células B humanas) para producir IL-6), y una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo D (por ejemplo, actividad para activar las células dendríticas plasmocitoides para producir IFN-a). Además, K3-LNT y K3-SPG tienen una potente actividad como adyuvantes de vacuna y, cuando se inoculan juntos en un antígeno para inmunización, inducen tanto inmunidad humoral como inmunidad celular específicas de antígeno, y muestran en realidad un efecto protector muy potente contra la infección por el virus RSV y el virus influenza. Sobre la base de estos hallazgos, los presentes inventores han estudiado más y han completado la presente invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona lo siguiente.
[1] Un complejo que comprende un oligodesoxinucleótido y p-1,3-glucano, en donde el oligodesoxinucleótido comprende: oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado y poli desoxiadenilato, en donde el poli desoxiadenilato está colocado en el lado 3' del oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado, en donde el oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado consiste en la secuencia nucleotídica representada por SEQ ID NO: 1, en donde el poli desoxiadenilato tiene una longitud de 30 - 40 nucleótidos, y en donde el p-1,3-glucano es lentinano.
[2] El complejo de [1], en donde los enlaces fosfodiéster en el oligodesoxinucleótido están parcial o totalmente sustituidos por enlaces fosforotioato, preferiblemente en donde los enlaces fosfodiéster en el oligodesoxinucleótido están completamente sustituidos por enlaces fosforotioato.
[3] El complejo de [1] o [2] en donde
(i) el poli desoxiadenilato está unido en el extremo 3' del oligodesoxinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por SEQ ID NO: 1, y todos los enlaces fosfodiéster en el oligodesoxinucleótido están sustituidos por enlaces de fosforotioato;
(ii) el complejo tiene una estructura de triple hélice; y/o
(iii) el complejo tiene una actividad para activar las células B para que produzcan IL-6, y una actividad para activar las células dendríticas para para que produzcan IFN-a.
[4] El complejo de cualquiera de [1] a [3], para uso en un método de tratamiento o profilaxis de una enfermedad en un animal de sangre caliente.
[5] El complejo para uso de [4], en donde:
(i) la enfermedad es infección vírica, cáncer, una enfermedad alérgica, o infección bacteriana o protozoaria parasitaria intracelular, opcionalmente en donde la infección vírica es infección por virus RS o por virus influenza; y/o
(ii) el animal de sangre caliente es un ser humano.
[6] El complejo de cualquiera de [1] a [3], para uso en un método para inducir una reacción inmunitaria protectora en un animal de sangre caliente.
[7] Una composición farmacéutica que comprende el complejo de uno cualquiera de [1] a [3].
[8] La composición de [7], para uso en un método de profilaxis o tratamiento de infección vírica, cáncer, una enfermedad alérgica, o infección bacteriana o protozoaria parasitaria intracelular, que preferiblemente es para uso en un método de profilaxis o tratamiento de infección vírica, opcionalmente en donde la infección vírica es infección por virus RS o virus influenza.
[9] La composición de [7], que comprende:
(a) el complejo de acuerdo con cualquiera de [1] a [3], y
(b) un antígeno.
[10] La composición de [9], para uso en un método para inducir una reacción inmunitaria al antígeno, opcionalmente en donde el antígeno proviene de un patógeno, además opcionalmente en donde la composición es para uso en un método de profilaxis o tratamiento de infección con el patógeno.
[11] La composición para uso de [10], en donde el patógeno es un virus, opcionalmente en donde el virus es un virus RS o virus influenza.
[12] Un agente para inducir la producción de interferón tipo I y/o tipo II, que comprende el complejo de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3].
[13] Un agente inmunoestimulante que comprende el complejo de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3], opcionalmente que es un adyuvante de vacuna.
Efecto de la invención
La presente descripción proporciona un oligodesoxinucleótido que tiene actividad inmunoestimulante superior, y un complejo que lo contiene. En particular, el complejo de la presente invención tiene, concurrentemente, una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo K y una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo D. Además, puesto que el complejo de la presente invención tiene una fuerte actividad como adyuvante de vacuna, cuando se realiza una inmunización con el complejo de la presente invención junto con un antígeno, se estimulan tanto la inmunidad humoral como la inmunidad celular específicas de antígeno para proporcionar un efecto protector de infección muy fuerte. Por lo tanto, el complejo de la presente invención es útil como agente inmunoestimulante o adyuvante de vacuna.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra un método de formación de complejo de ODN CpG y LNT o SPG.
La Fig. 2 muestra la producción de pan-IFN-a por los PBMC.
La Fig. 3 muestra el perfil de citocina producida a partir de los PBMC humanos al ser estimulados con K3, K3-dA40 o K3-SPG.
La Fig. 4 muestra una imagen de microscopía electrónica de barrido de K3-SPG.
La Fig. 5 muestra el tamaño de partícula de K3-SPG, SPG y D35 analizado por dispersión de luz dinámica.
La Fig. 6 muestra la producción de pan-IFN-a, IFN-a2 e IFN-y por los PBMC, inducida por estimulación con K3, K3-SPG o D35.
La Fig. 7 muestra la producción de pan-IFN-a e IL-6 por los PBMC humanos, que es inducida por estimulación con K3, K3-dA40, K3-SPG, CpG21798 (ODN CpG de tipo P), CpG21889(P), CpG2395(C) o M362(C) (0.74, 2.2, 6.6 o 20 pg/ml).
La Fig. 8 muestra la 103
de K3-SPG con endosomas que contienen ODN CpG de tipo K. La barra de escala muestra 10 pm. Los resultados son representativos de al menos dos experimentos independientes.
La Fig. 9 muestra la co-localización de K3-SPG con endosomas que contienen ODN CpG de tipo D. La barra de escala muestra 10 pm.
La Fig. 10 muestra títulos de anticuerpo especifico de antígeno en el suero de ratones inmunizados con OVA en solitario, OVA+K3, u OVA+K3-SPG. *p < 0.05 (prueba U de Mann-Whitney).
La Fig. 11 muestra la producción de IFNy por esplenocitos de ratones inmunizados con OVA en solitario, OVA+K3, u OVA+K3-SPG, que fue inducida por reestimulación con el antígeno.
La Fig. 12 muestra la proporción de células T CD8 OVA-específicas inducidas por inmunización con OVA en solitario, OVA+K3, u OVA+K3-SPG. *p < 0.05 (prueba U de Mann-Whitney).
La Fig. 13 muestra la actividad de CTL in vivo OVA-especifica inducida por inmunización con OVA en solitario, OVA+K3, OVA+K3-dA40 u OVA+K3-SPG. *p < 0.05 (prueba U de Mann-Whitney).
La Fig. 14 muestra el efecto adyuvante de vacuna peptídica del K3-SPG.
La Fig. 15 muestra el efecto adyuvante dependiente de la dosis del K3-SPG.
La Fig. 16 muestra títulos de anticuerpo especifico de antígeno en el suero de ratones inmunizados con OVA en solitario, OVA+K3, u OVA+K3-SPG. La dosis de OVA en el momento de la inmunización se muestra en cada grafica. *p < 0.05 (prueba U de Mann-Whitney).
La Fig. 17 muestra la producción de IFNy por esplenocitos de ratones inmunizados con OVA en solitario, OVA+K3, u OVA+K3-SPG, que fue inducida por reestimulación con el antígeno. La dosis de OVA en el momento de la inmunización se muestra en cada grafica.
La Fig. 18 muestra la unión de SPG a transfectante vacío (vector), Dectina 1 o Dectina 2.
La Fig. 19 muestra la unión de K3 o K3-SPG al transfectante vacío (vector), Dectina 1 o Dectina 2.
La Fig. 20 muestra la producción de TNF-a por esplenocitos de ratones C57BL/6J o ratones deficientes en Dectina 1, que fue inducida por estimulación con zimosano sometido a hidrólisis básica (en lo sucesivo designado como Zymosan Depleted).
La Fig. 21 muestra la producción de TNF-a por esplenocitos de ratones C57BL/6J o ratones deficientes en Dectina 1, que fue inducida por estimulación con SPG.
La Fig. 22 muestra el efecto del Zymosan Depleted sobre la producción de IFN-a por esplenocitos de ratones C57BL/6J o ratones deficientes en Dectina 1, que fue inducida por estimulación con o Dn CpG. *p < 0.05 (prueba t). La Fig. 23 muestra el efecto de SPG sobre la producción de IFN-a por esplenocitos de ratones C57BL/6J, que fue inducida por estimulación con ODN CpG.
La Fig. 24 muestra que la producción de citocinas inducida por K3-SPG depende de TLR9. a) Producción de IFN-a por FL-DC; b) Producción de IL-6 e IL-12 p40 por esplenocitos; c) producción de IFN-a por FL-DC; d) producción de IL-6 e IL-12 p40 por esplenocitos.
La Fig. 25 muestra títulos de anticuerpo especifico de antígeno en el suero de ratones Tlr9+/+ o Tlr9-/- inmunizados con OVA+K3-SPG. *p < 0.05 (prueba U de Mann-Whitney).
La Fig. 26 muestra la producción de IFN-y por esplenocitos de ratones Tlr9+/+ o Tlr9-/- inmunizados con OVA+K3-SPG, que es inducida por reestimulación con el antígeno. *p < 0.05 (prueba U de Mann-Whitney).
La Fig. 27 muestra la proporción de células T CD8 OVA-específicas inducidas por inmunización de ratones Tlr9+/+ o Tlr9-/- con OVA+K3-SPG. *p < 0.05 (prueba U de Mann-Whitney).
La Fig. 28 muestra que el efecto adyuvante de K3-SPG no depende de Dectina 1. a) Título de anticuerpo especifico de antígeno en el suero. b) producción de IFN-y por esplenocitos debido a la reestimulación con antígeno. c) proporción de células T CD8 específicas de antígeno inducidas in vivo.
La Fig. 29 muestra títulos de anticuerpo especifico de antígeno en el suero de ratones Dectina 1+/- o Dectina 1-/-inmunizados con OVA+K3-SPG.
La Fig. 30 muestra la producción de IFN-y por esplenocitos de ratones Dectina 1+/- o Dectina 1-/- inmunizados con OVA+K3-SPG, que fue inducida por reestimulación con el antígeno.
La Fig. 31 muestra la proporción de células T CD8 OVA-específicas inducidas por inmunización de ratones Dectina 1+/- o Dectina 1-/- con o Va K3-SPG. *p < 0.05 (prueba U de Mann-Whitney).
La Fig. 32 muestra la localización de K3-SPG sobre la superficie de los iLN (ganglios linfáticos inguinales), 1 h después de la administración de Alexa 488-K3-SPG.
La Fig. 33 muestra la localización de OVA, células MARCO+ y células Siglec-1+ en los iLN, 1 hora después de la administración de DQ-OVA.
La Fig. 34 muestra los resultados del análisis, por Volocity de la co-localización de OVA con células MARCO+ o Siglec-1+ de la Fig. 33. *p < 0.05 (prueba t).
La Fig. 35 muestra la localización de K3, K3-SPG y células MARCO+ en iLN, 1 h después de la administración de Alexa 488-K3 o Alexa 488-K3-SPG.
La Fig. 36 muestra los resultados del análisis, por Volocity de la co-localización de K3 o K3-SPG con células MARCO+ de la Fig. 35. *p < 0.05 (prueba t).
La Fig. 37 muestra el protocolo del experimento de empobrecimiento con liposoma de clodronato (panel superior), título de anticuerpo especifico de antígeno en el suero (panel inferior), y producción de citocina por estimulación con antígeno. *p < 0.05 (prueba t).
La Fig. 38 muestra la expresión de CD40 en varias DC de ratones C57BL/6J o Tlr9-/- a los que se les administró K3 o K3-SPG.
La Fig. 39 muestra el título de anticuerpo especifico de antígeno en el suero de ratones inmunizados con SV, WIV o SV+K3-SPG.
La Fig. 40 muestra los cambios en el tiempo de peso corporal (izquierda) y curva de supervivencia (derecha) cuando se inmuniza con SV, WIV o SV+K3-SPG, seguido por provocación con virus influenza A/P/R8 (H1N1).
La Fig. 41 muestra los cambios en el tiempo del título de anticuerpo especifico de antígeno en el suero de Macaca fascicularis inmunizados con SV+ K3 o SV+K3-SPG. *p < 0.05 (prueba t).
La Fig. 42 muestra el título de anticuerpo especifico de antígeno en el suero de Macaca fascicularis inmunizados con SV+ K3 o SV+K3-SPG (la semana 110).
La Fig. 43 muestra una comparación del efecto adyuvante de vacuna entre K3 y K3-SPG.
La Fig. 44 muestra la producción de pan-IFN-a y la producción de IL-6 por K3, K3-LNT o K3-SPG.
La Fig. 45 muestra los títulos de anticuerpo de IgG específicos del antígeno RSV F en el suero de ratones inoculados con la vacuna de subunidad F de RSV con K3, K3-LNT o K3-SPG añadido.
La Fig. 46 muestra la producción de citocina inducida específicamente por estimulación del antígeno RSV F en ratones inoculados con la vacuna de subunidad F de RSV con K3 o K3-LNT o K3-SPG añadido.
La Fig. 47 muestra el efecto protector contra la infección por RSV en ratas algodoneras inoculadas con la vacuna de subunidad F de RSV con K3 o K3-LNT o K3-SPG añadido.
Exposición de aspectos de la descripción
1. Oligodesoxinucleótido
La presente descripción proporciona un oligodesoxinucleótido que comprende oligodesoxinucleótido CpG de tipo Ky poli desoxiadenilato (dA) (en lo sucesivo referido como el oligodesoxinucleótido de la presente descripción).
El oligodesoxinucleótido de la presente descripción incluye uno en donde los enlaces fosfodiéster están modificados (por ejemplo, una parte o todos los enlaces de fosfodiéster se han sustituido por un enlace fosforotioato).
El oligodesoxinucleótido de la presente descripción incluye sales farmacéuticamente aceptables.
En la presente memoria descriptiva, oligodesoxinucleótido y ODN significar lo mismo. Además, "oligodesoxinucleótido CpG (ODN CpG) de tipo K humanizado" y "resto de oligodesoxinucleótido CpG (ODN CpG) de tipo K humanizado" significan lo mismo, independientemente de la presencia o ausencia del término "resto" al principio, y se utilizan indistintamente. Por otra parte, poli desoxiadenilato y poli desoxiadenosina en forma ácida (resto) significan lo mismo. El término "resto" significa una estructura parcial de un compuesto que tiene un peso molecular más alto. Los expertos en la técnica pueden entender fácilmente del contexto si el "oligodesoxinucleótido CpG (ODN CpG) de tipo K humanizado" significa una molécula independiente, o una estructura parcial de un compuesto que tiene un peso molecular más alto en la presente memoria descriptiva. Lo mismo se aplica a los términos referidos a otras estructuras parciales contenidas en el oligodesoxinucleótido de la presente descripción, tal como “poli desoxiadenilato” y similares.
El CpG oligodesoxinucleótido (ODN CpG) es un ADN de monocatenario que contiene un motivo CpG no metilado inmunoestimulante, y es un agonista de TLR9. El ODN CpG incluye 4 tipos, el tipo K (también llamado tipo B), el tipo D (también llamado tipo A), el tipo C y tipo P, que son diferentes en cuanto a su cadena principal, secuencia y propiedades inmunoestimulantes (Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009)). De estos, el oligodesoxinucleótido de la presente descripción comprende ODN CpG de tipo K.
El ODN CpG de tipo K es un ODN CpG con propiedades estructurales y funcionales, que contiene típicamente motivos CpG no metilados plurales no palindrómicos, activa las células B para producir IL-6, pero apenas induce producción de IFN-a por células dendríticas plasmocitoides (PDC). El motivo CpG no metilado es una secuencia de nucleótidos corta que contiene por lo menos una secuencia de citosina (C) - guanina (G), en donde la posición de la citosina en la secuencia citosina-guanina no está metilada. En la siguiente explicación, CpG significa CpG no metilado, a menos que se indique particularmente. Por lo tanto, el oligodesoxinucleótido de la presente descripción tiene una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo K (por ejemplo, actividad para activar células B (preferiblemente células B humanas) para producir IL-6) por contener ODN CpG de tipo K. Muchos ODN CpG de tipo K humanizados son conocidos en el campo técnico pertinente (Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Journal of immunology 164, 944-953 (2000); US 8,030,285 B2).
El ODN CpG de tipo K comprendido en el oligodesoxinucleótido de la presente descripción es, preferiblemente, humanizado. “Humanizado” significa que tiene una actividad agonista sobre TLR9 humano. Por lo tanto, el oligodesoxinucleótido de la presente descripción que comprende ODN CpG de tipo K humanizado tiene una actividad inmunoestimulante para los humanos, que es única del ODN CpG de tipo K (por ejemplo, actividad para activar células B humanas para producir IL-6).
El ODN CpG de tipo K usado preferiblemente en la presente descripción tiene una longitud de no menos de 10 nucleótidos y contiene una secuencia de nucleótidos representada por la fórmula:
5'N-,N2-N3-T-CpG-WN4N5N6-3'
en donde el motivo CpG en el centro no está metilado, W es A o T, y N1 , N2 , N3 , N4, N5 y N6 pueden ser cualquier nucleótido.
En un aspecto, el ODN CpG de tipo K en la presente descripción tiene una longitud de no menos de 10 nucleótidos y contiene una secuencia de nucleótidos representada por la fórmula antes mencionada. En la fórmula antes mencionada, el motivo CpG de 4 bases (TCpGW) del centro solo necesita estar contenido en los 10 nucleótidos, y no necesita estar ubicado entre N3 y N4 en la fórmula antes mencionada. Además, N1 , N2 , N3, N4, N5 y N6 en la fórmula antes mencionada pueden ser cualquier nucleótido, y la combinación de por lo menos uno (preferiblemente uno) de N1 y N2 , N2 y N3, N3 y N4, N4 y N5, y N5 y N puede formar un motivo CpG de 2 bases. Cuando el motivo CpG antes mencionado de 4 bases no se encuentra entre N3 y N4, 2 bases continuas cualesquiera de las 4 bases del centro (bases 4a-7a ) de la fórmula antes mencionada es el motivo CpG, y las otras 2 bases pueden ser cualquier nucleótido.
El ODN CpG de tipo K utilizado preferiblemente en la presente descripción contiene una estructura no palindrómica que contiene uno o varios motivos CpG. El ODN CpG de tipo K utilizado más preferiblemente en la presente descripción consiste en una estructura no palindrómica que contiene uno o varios motivos CpG.
El ODN CpG de tipo K humanizado se caracteriza generalmente por el motivo CpG que consiste en 4 bases de TCGA o TCGT. En muchos casos, 2 o 3 de estos motivos CpG de 4 bases están contenidos en un ODN CpG de tipo K humanizado. Por lo tanto, en un aspecto preferible, el ODN CpG de tipo K contenido en el oligodesoxinucleótido de la presente descripción contiene al menos uno, preferiblemente dos o más, muy preferiblemente 2 o 3 motivos CpG de 4 bases que consisten en TCGA o TCGT. Cuando el ODN CpG de tipo K tiene 2 o 3 de los motivos CpG de 4 bases, estos motivos CpG de 4 bases pueden ser iguales o diferentes, y no están particularmente limitados siempre que tengan una actividad agonista sobre TLR9 humano.
El ODN CpG de tipo K contenido en el oligodesoxinucleótido de la presente descripción comprende más preferiblemente la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1.
Aunque la longitud del ODN CpG de tipo K no está particularmente limitada, siempre que el oligodesoxinucleótido de la presente descripción tenga actividad inmunoestimulante (por ejemplo, actividad que activa las células B (preferiblemente, las células B humanas) para producir IL-6), tiene preferiblemente no más de 100 nucleótidos de longitud (por ejemplo, una longitud de 10 a 75 nucleótidos). La longitud del ODN CpG de tipo K, más preferiblemente, es no mayor de 50 nucleótidos de longitud (por ejemplo, una longitud de 10 a 40 nucleótidos). La longitud del ODN CpG de tipo K, más preferiblemente, es no mayor de 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, una longitud de 10 a 25 nucleótidos). La longitud del ODN CpG de tipo K es lo más preferiblemente 12 a 25 nucleótidos de longitud.
Aunque la longitud del poli desoxiadenilato (dA) no está particularmente limitada siempre que sea suficiente para formar una estructura de triple hélice con la cadena de p-1,3-glucano (preferiblemente, lentinano o esquizofilano), a causa de los aspectos de formación de una estructura de triple hélice estable, por lo general es no menor de 20 nucleótidos de longitud, preferiblemente no menor de 40 nucleótidos de longitud, muy preferiblemente no menor de 60 nucleótidos de longitud. Teóricamente, el poli dA no tiene límite superior de longitud, ya que un poli dA más grande forma una estructura de triple hélice más estable con p-1,3-glucano. Sin embargo, cuando es demasiado grande, la longitud del oligodesoxinucleótido varía en la síntesis. Por lo tanto, en general es no mayor de 100, preferiblemente no mayor de 80 nucleótidos de longitud. Por otra parte, a causa de los aspectos de formación de la estructura estable de triple hélice antes mencionada, y también aumento en la cantidad de oligodesoxinucleótido de la presente descripción que se une por cantidad unitaria de p-1,3-glucano, evitación de la variabilidad de longitud en la síntesis del oligodesoxinucleótido, y eficiencia de formación de complejo, se prefiere que la longitud del poli dA sea de 20 - 60 nucleótidos (específicamente, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos de longitud), preferiblemente una longitud de 30 - 50 nucleótidos (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos de longitud), muy preferiblemente una longitud de 30 -45 nucleótidos (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 nucleótidos de longitud). En particular, cuando es no menor de 30 nucleótidos de longitud, se obtiene una buena eficacia de formación de complejo. El oligodesoxinucleótido de la presente descripción que contiene poli dA tiene una actividad para formar una estructura de triple hélice con dos cadenas de esquizofilano. Hay que señalar que el poli desoxiadenilato a veces se indica como “poli(dA)” o “poli(dA)”.
Aunque una molécula del oligodesoxinucleótido de la presente descripción puede contener varios ODN CpG de tipo K y/o poli dA, preferiblemente contiene uno de cada de ODN CpG de tipo K y poli dA, muy preferiblemente consiste en uno de cada de ODN CpG de tipo K y poli dA.
El oligodesoxinucleótido de la presente descripción se caracteriza por que el poli dA está colocado en el lado 3' del ODN CpG de tipo K. Mediante esta disposición, el complejo de la presente invención (que se describirá en detalle más adelante) llega a tener una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo K, así como una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo D.
El ODN CpG de tipo K y poli dA pueden estar directamente unidos por un enlace covalente, o unidos por medio de una secuencia espaciadora. La secuencia espaciadora significa una secuencia de nucleótidos que tiene uno o más nucleótidos por ser insertados entre dos elementos constitutivos adyacentes. Aunque la longitud de la secuencia espaciadora no está particularmente limitada, siempre que el complejo de la presente invención tenga una actividad inmunoestimulante (preferiblemente actividad para activar las células B para producir IL-6, y actividad para activar las células dendríticas para producir IFN-a), generalmente es de 1 a 10 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 1 a 5 nucleótidos de longitud, muy preferiblemente de 1 a 3 nucleótidos de longitud. Muy preferiblemente, el ODN CpG de tipo K y el poli dA están directamente unidos por un enlace covalente.
El oligodesoxinucleótido de la presente descripción tiene opcionalmente una secuencia de nucleótidos adicional en el extremo 5' o el extremo 3' del mismo, además del ODN CpG de tipo K, poli dA y la secuencia espaciadora opcional. Aunque la longitud de la secuencia de nucleótidos adicional no está particularmente limitada, siempre que el complejo de la presente invención tenga una actividad inmunoestimulante (preferiblemente actividad para activar a las células B para producir IL-6, y actividad para activar a las células dendríticas para producir IFN-a), generalmente es de 1 a 10 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 1 a 5 nucleótidos de longitud, muy preferiblemente de 1 a 3 nucleótidos de longitud.
En un aspecto preferible, el oligodesoxinucleótido de la presente descripción no contiene tal secuencia de nucleótidos adicional en el extremo 5' y/o el extremo 3'. Es decir, el oligodesoxinucleótido de la presente descripción consiste preferiblemente en ODN CpG de tipo K, poli dA y una secuencia de espaciadora opcional, más preferiblemente consiste en ODN CpG de tipo K y poli dA.
En un aspecto más preferible, el oligodesoxinucleótido de la presente descripción consiste en ODN CpG de tipo K (específicamente, por ejemplo, el oligodesoxinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 1) y poli dA, en donde el ODN CpG de tipo K está presente en el extremo 5' del oligodesoxinucleótido y poli dA está presente en el extremo 3' del mismo. Específicamente, es un oligodesoxinucleótido en donde el poli dA de 20 a 60 nucleótidos de longitud (muy preferiblemente 30 - 50 nucleótidos de longitud (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 ,43 , 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos de longitud), muy preferiblemente 30 - 45 nucleótidos de longitud (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41,42, 43, 44, 45 nucleótidos de longitud)), está unido en el extremo 3' de un oligodesoxinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, un oligodesoxinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 2, o 9 - 12.
La longitud completa del oligodesoxinucleótido de la presente descripción es por lo general de 30 a 200 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 35 a 100 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 40 a 80 nucleótidos de longitud (específicamente, de 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 6 5 , 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleótidos de longitud), preferiblemente de 50 a 70 nucleótidos de longitud (específicamente, de 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 nucleótidos de longitud), muy preferiblemente de 50 a 65 nucleótidos de longitud (específicamente, de 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 nucleótidos de longitud).
El oligodesoxinucleótido de la presente descripción puede ser modificado apropiadamente para ser resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, la degradación por exo- o endonucleasa). Preferiblemente, la modificación incluye modificación fosforotioato y modificación fosforoditioato. Es decir, una parte o todos los enlaces de fosfodiéster en el oligodesoxinucleótido de la presente descripción son sustituidos por un enlace fosforotioato o un enlace de fosforoditioato.
Preferiblemente, el oligodesoxinucleótido de la presente descripción incluye modificación de un enlace fosfodiéster, muy preferiblemente la modificación del enlace fosfodiéster es un enlace de fosforotioato (es decir, tal como se describe en WO 95/26204, uno de los átomos de oxígeno no reticulante es sustituido por un átomo de azufre). Es decir, una parte o todos los enlaces fosfodiéster en el oligodesoxinucleótido de la presente descripción son sustituidos por un enlace fosforotioato.
El oligodesoxinucleótido de la presente descripción contiene preferiblemente una modificación por un enlace fosforotioato o un enlace fosforoditioato en el ODN CpG de tipo K, muy preferiblemente todos los enlaces fosfodiéster en el ODN CpG de tipo K están sustituidos por enlaces de fosforotioato. También, el oligodesoxinucleótido de la presente descripción contiene preferiblemente un enlace fosforotioato o un enlace de fosforoditioato en el poli dA, muy preferiblemente todos los enlaces fosfodiéster en el poli dA están sustituidos por enlaces fosforotioato. Más preferiblemente, todos los enlaces de fosfodiéster del oligodesoxinucleótido de la presente descripción, que comprende el CpG oligodesoxinucleótido de tipo K humanizado y el poli desoxiadenilato, están sustituidos por enlaces de fosforotioato. Lo más preferiblemente, el oligodesoxinucleótido de la presente descripción es un oligodesoxinucleótido en donde el poli dA de 20 a 60 nucleótidos de longitud (muy preferiblemente de 30 - 50 nucleótidos de longitud (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos de longitud), muy preferiblemente 30 - 45 nucleótidos de longitud (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 42, 43, 44, 45 nucleótidos de longitud)), está unido al extremo 3' del oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) y todos los enlaces fosfodiéster contenidos en el oligodesoxinucleótido están sustituidos por enlaces fosforotioato. Debido al enlace fosforotioato, se espera que el oligodesoxinucleótido de la presente descripción muestre no solo resistencia a la degradación, sino también aumento de la actividad inmunoestimulante (por ejemplo, actividad para activar las células B para producir IL-6), y un alto rendimiento del complejo CpG-p-1,3-glucano. En la presente memoria descriptiva, el enlace fosforotioato significa lo mismo que una cadena principal de fosforotioato, y el enlace de fosfodiéster significa lo mismo que una cadena principal de fosfato.
El oligodesoxinucleótido de la presente descripción incluye cualquier sal farmacéuticamente aceptable, éster, y sales de tal éster, del oligodesoxinucleótido arriba mencionado.
Los ejemplos preferidos de las sales farmacéuticamente aceptables del oligodesoxinucleótido de la presente descripción incluyen sales de metal tales como sales de metales alcalinos (por ejemplo, sal de sodio, sal de potasio y sal de litio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, sal de calcio y sal de magnesio), sal de aluminio, sal de hierro, sal de zinc, sal de cobre, sal de níquel, sal de cobalto y similares; sales de amina tales como sales inorgánicas (por ejemplo, sal de amonio), y sales orgánicas (por ejemplo, sal de t-octilamina, sal de dibencilamina, sal de morfolina, sal de glucosamina, sal de alquil-éster de fenilglicina, sal de etilendiamina, sal de N-metilglucamina, sal de guanidina, sal de dietilamina, sal de trietilamina, sal de diciclohexilamina, sal de N,N'-dibenciletilendiamina, sal de cloroprocaína, sal de procaína, sal de dietanolamina, sal de N-bencilfenetilamina, sal de piperazina, sal de tetrametilamonio, sal de tris(hidroximetil)aminometano) y similares; sales de ácidos inorgánicos tales como sales de hidrácidos halogenados (por ejemplo, hidrofluoruro, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro), sal de nitrato, perclorato, sulfato, fosfato y similares; sales de ácidos orgánicos tales como alcanosulfonatos inferiores (por ejemplo, metanosulfonato, trifluorometanosulfonato, etanosulfonato), arilsulfonatos (por ejemplo, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato), acetato, malato, fumarato, succinato, citrato, tartrato, oxalato, maleato y similares; y sales de aminoácidos tales como sal de glicina, sal de lisina, sal de arginina, sal de ornitina, glutamato y aspartato.
Aunque el oligodesoxinucleótido de la presente descripción puede adoptarcualquierforma, de cadena sencilla, cadena doble y cadena triple, preferiblemente es de cadena sencilla.
El oligodesoxinucleótido de la presente descripción es, preferiblemente, aislado. “Aislado” significa que se ha realizado una operación para eliminar factores distintos de los componentes objetivo, y que el oligodesoxinucleótido no se encuentra en un estado de presencia natural. La pureza del “oligodesoxinucleótido aislado” (porcentaje en peso del oligodesoxinucleótido objeto con respecto al peso total del producto objetivo de evaluación) generalmente es no menor de 70%, preferiblemente no menor de 80%, preferiblemente no menor de 90%, muy preferiblemente no menor de 99%.
Dado que el oligodesoxinucleótido de la presente descripción tiene una actividad inmunoestimulante superior (por ejemplo, actividad para activar las células B (preferiblemente las células B humanas) para producir IL-6), es útil como un agente inmunoestimulante y similar. Además, como el oligodesoxinucleótido de la presente descripción tiene la propiedad de formar una estructura de triple hélice con dos p-1,3-glucanos (preferiblemente lentinano, esquizofilano o escleroglucano), es útil para la preparación del complejo de la presente invención que se menciona a continuación.
2. Complejo
La presente invención proporciona un complejo que contiene el oligodesoxinucleótido anteriormente mencionado de la presente descripción y p-1,3-glucano en donde el p-1,3-glucano es lentinano (en lo sucesivo "complejo de la presente invención").
Puesto que el oligodesoxinucleótido antes mencionado de la presente descripción contiene ODN CpG de tipo K, muestra, por sí solo, una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo K (por ejemplo, actividad para activar a las células B (preferiblemente células B humanas) para producir IL-6), y es deficiente en actividad inmunoestimulante única de ODN CpG de tipo D (por ejemplo, actividad para activar las células dendríticas plasmocitoides para producir IFN-a). Sorprendentemente, sin embargo, adquiere una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo D (por ejemplo, actividad para activar a las células dendríticas plasmocitoides para producir IFN-a) mediante la formación de un complejo con p-1,3-glucano (preferiblemente lentinano o esquizofilano), sin la necesidad de una secuencia de ODN CpG de tipo D. Es decir, el complejo de la presente invención tiene tanto una actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo K (por ejemplo, actividad para activar las células B (preferiblemente células B humanas) para producir IL-6), como una actividad inmunoestimulante única para CpG ODN tipo D (por ejemplo, actividad para activar a las células dendríticas plasmocitoides (preferiblemente células dendríticas plasmocitoides humanas) para producir IFN-a.
Ejemplos del p-1,3-glucano usado en la presente descripción incluyen lentinano, esquizofilano, escleroglucano, curdlano, paquimano, grifolano, laminarano y similares. El p-1,3-glucano es preferiblemente uno que contiene muchas ramas de 1,6-glucopiranósido (proporción de cadenas laterales de 33 - 40%) como lentinano, esquizofilano y escleroglucano, preferiblemente lentinano o esquizofilano, lo más preferiblemente lentinano.
El lentinano (LNT) es un p-1,3-1,6-glucano conocido obtenido a partir del hongo shiitake y tiene una formula molecular de (C6HiüO5 )n, y un peso molecular de aproximadamente 300,000 - 700,000. Aunque es escasamente soluble en agua, metanol, etanol (95) y acetona, es soluble en disolventes orgánicos polares (DMSO) y en solución acuosa de hidróxido de sodio.
El lentinano tiene una acción para incrementar la actividad de macrófagos activados, células T asesinas, células asesinas naturales, y la actividad citotóxica mediada por macrófagos dependiente de anticuerpos (ADMC) (Hamuro, J. et al., Immunology, 39, 551-559, 1980, Hamuro, J., et al.: Int. J. Immunopharmacol., 2, 171, 1980, Herlyn, D., et al.: Gann, 76, 37-42, 1985). En experimentos con animales, la administración combinada con un agente quimioterapéutico mostró una acción supresora de crecimiento de tumor y un efecto de prolongación de la vida sobre un tumor singénico y un tumor autólogo. Además, la administración de lentinano en solitario mostró una acción supresora del crecimiento tumoral y un efecto de prolongación de la vida. En ensayos clínicos, el uso combinado con la administración oral de tegafur prolonga el periodo de supervivencia de pacientes con cáncer gástrico inoperable o recurrente (formulario de entrevista sobre producto farmacéutico “lentinano, inyección intravenosa de 1 mg” Ajinomoto Co., Inc.), y ha sido autorizado en Japón. El efecto de la administración de lentinano en solitario no se ha confirmado hasta la fecha.
El esquizofilano (SPG) es un p-glucano soluble conocido obtenido a partir de Schizophyllum commune. El SPG consiste en la cadena principal de p-(1—3)-D-glucano, y una cadena lateral de p-(1 —^ 306)-D-glucosilo por cada 3 glucosas (Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. y Misaki A., “Carbohydr. Res.”, 1981, 89, 1, p.121-135). El SPG se ha usado en realidad durante 20 años o más como un fármaco clínico para un preparado inyectable intramuscular como terapia inmunoadyuvante de cáncer ginecologico (Shimizu, Chin, Hasumi, Masubuchi, “Biotherapy”, 1990, 4, p.1390 Hasegawa, “Oncology and Chemotherapy”, 1992, 8, p.225), y su seguridad in vivo ha sido confirmada (Theresa, M. McIntire and David, A. Brant, “J. Am. Chem. Soc.”, 1998, 120, p.6909).
En la presente memoria descriptiva, “complejo” se refiere a un producto obtenido por la asociación de varias moléculas mediante un enlace no covalente o un enlace covalente, tal como enlace electrostático, enlace de van der Waals, enlace de hidrógeno, interacción hidrofóbica y similares.
El complejo de la presente invención exhibe preferiblemente una estructura de triple hélice. En una realización preferible, de las tres cadenas que forman la estructura de triple hélice, dos son cadenas de p-1,3-glucano, y una es una cadena de poli desoxiadenilato en el oligodesoxinucleótido anteriormente mencionado de la presente descripción. El complejo puede contener una parte que no forma la estructura de triple hélice.
La relación de composición de oligodesoxinucleótido y p-1,3-glucano en el complejo de la presente invención puede variar dependiendo de la longitud de cadena de poli desoxiadenilato en el oligodesoxinucleótido, la longitud de p-1,3-glucano y similares. Por ejemplo, cuando la longitud de la cadena de p-1,3-glucano y de la cadena de poli desoxiadenilato son equivalentes, dos cadenas de p-1,3-glucano y un oligodesoxinucleótido de la presente invención pueden estar asociados para formar una estructura de triple hélice. En general, puesto que la longitud de cadena del poli desoxiadenilato es más corta que la cadena de p-1,3-glucano, varios oligodesoxinucleótidos de la presente invención pueden asociarse con dos cadenas de p-1,3-glucano por medio de poli desoxiadenilato para formar una estructura de triple hélice (ver la Fig. 1).
El complejo de la presente descripción es un complejo que contiene ODN CpG de tipo K humanizado y p-1,3-glucano (por ejemplo, lentinano, esquizofilano, escleroglucano, curdlano, paquimano, grifolano, laminarano), preferiblemente un complejo que consiste en ODN CpG de tipo K humanizado y p-1,3-glucano (por ejemplo, lentinano, esquizofilano, escleroglucano). Más preferiblemente, es un complejo que consiste en un oligodesoxinucleótido en donde un poli desoxiadenilato de 20 a 60 nucleótidos de longitud (específicamente, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos de longitud) esta enlazado en el lado 3' de un oligodesoxinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 1, y todos los enlaces de fosfodiéster están sustituidos por enlaces de fosforotioato, y p-1,3-glucano (por ejemplo, lentinano, esquizofilano) (por ejemplo, K3-dA20-60-LNT, K3-dA20-60-SPG), aún más preferiblemente, es un complejo que consiste en un oligodesoxinucleótido en donde un poli desoxiadenilato de 30 a 50 nucleótidos de longitud (específicamente, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos de longitud) está enlazado en el lado 3' de un oligodesoxinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 1, y todos los enlaces de fosfodiéster se han sustituidos por enlaces de fosforotioato, y p-1,3-glucano (por ejemplo, lentinano, esquizofilano) (por ejemplo, K3-dA30-50-LNT, K3-dA30-50-SPG), muy preferiblemente, es un complejo que consiste en un oligodesoxinucleótido en donde un poli desoxiadenilato de 30 a 45 nucleótidos de longitud (específicamente, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 nucleótidos de longitud) esta enlazado en el lado 3' de un oligodesoxinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 1 y todos los enlaces de fosfodiéster están sustituidos por enlaces de fosforotioato, y p-1,3-glucano (por ejemplo, lentinano, esquizofilano) (K3-dA30-45-LNT, K3-dA30-45-SPG).
El método de preparación del complejo de la presente invención se puede realizar bajo condiciones similares a las descritas en los documentos no de patente 21 a 24, y JP-A-2008-100919. Es decir, el p-1,3-glucano que inherentemente está presente de forma natural como una estructura de triple hélice se disuelve en un disolvente polar orgánico aprótico (dimetil sulfóxido (DMSO), acetonitrilo, acetona, etc.) o una solución acuosa alcalina (hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco, hidróxido de calcio, etc.) para desenroscarse en una sola cadena. Una solución de p-1,3-glucano de cadena sencilla obtenida de este modo y una solución (solución acuosa, solución acuosa tamponada a pH casi neutro, o solución acuosa tamponada acida, preferiblemente solución acuosa o solución acuosa tamponada a pH casi neutro) del oligodesoxinucleótido de la presente descripción se mezclan, se ajusta el pH a un valor de pH casi neutro cuando sea necesario, y la mezcla se mantiene durante un tiempo adecuado, por ejemplo durante la noche, a 5°C. Como resultado, dos cadenas de p-1,3-glucano y una cadena de poli dA del oligodesoxinucleótido forman una estructura de triple hélice por lo que puede formarse el complejo de la presente invención. El complejo resultante se puede someter a purificación por cromatografía de exclusión de tamaño, ultrafiltración, diálisis y similares para separar el oligodesoxinucleótido que no forma el complejo. Además, el complejo resultante se puede someter a purificación por cromatografía de intercambio aniónico para separar el p-1,3-glucano que no forma el complejo. El complejo puede ser purificado apropiadamente mediante los métodos arriba mencionados.
La formación del complejo de la presente invención se puede confirmar, por ejemplo, midiendo el cambio de conformación por medio del espectro de CD (dicroísmo circular), el cambio de absorción UV por medio de cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis en gel, electroforesis en microchip, electroforesis capilar, aunque el método no se limita a estos.
51 bien a partir de la razón de mezcla del oligodesoxinucleótido de la presente descripción y p-1,3-glucano se puede determinar apropiadamente considerando la longitud de la cadena de poli dA y similares, la razón en moles (SPG/ODN) es generalmente de 0.02 - 2.0, preferiblemente 0.1 - 0.5. En un aspecto adicional, la razón en moles (p-1,3-glucano (LNT etc.)/ODN) es, por ejemplo, de 0.005 - 1.0, preferiblemente de 0.020 - 0.25.
El método de preparación del complejo de la presente invención se explica tomando como ejemplo el complejo de CpG-ODN y LNT. LNT se disuelve en una solución acuosa alcalina 0.05 - 2N, preferiblemente 0.1 - 1.5N (por ejemplo, solución acuosa de hidróxido de sodio 0.25N), y la mezcla se deja reposar a 1°C - 40°C por 10 h - 4 días (por ejemplo, reposo durante la noche a temperatura ambiente) para preparar una solución acuosa de LNT de cadena sencilla (por ejemplo, solución acuosa de l Nt a 50 mg/ml). La solución acuosa de LNT antes mencionada y la solución acuosa de CpG (por ejemplo, solución acuosa de CpG 100 j M) preparadas separadamente se mezclan a una razón en moles (LNT/ODN) de 0.005 - 1.0, luego la solución acuosa de LNT antes mencionada se neutraliza con una solución acuosa tamponada ácida (por ejemplo, NaH2 PO4) y se mantiene a 1 - 40 °C durante 6 h - 4 días (por ejemplo, durante la noche a 4°C) para completar la formación del complejo. Finalmente se puede agregar la solución acuosa de LNT y mezclarse para la formación de complejo antes mencionada. La formación del complejo se puede confirmar mediante, por ejemplo, desplazamiento de ODN CpG al lado de alto peso molecular por cromatografía de exclusión de tamaño, mientras se monitoriza la absorción a 240-280 nm (por ejemplo, 260 nm).
En un aspecto, el complejo de la presente invención presenta la forma de partículas en forma de varilla. El tamaño de partícula es equivalente al de una partícula formada naturalmente por p-1,3-glucano (por ejemplo, esquizofilano), usado como material, que exhibe una estructura de triple hélice. Por lo general el tamaño promedio de partícula es de 10-100 nm, preferiblemente de 20-50 nm. El tamaño de partícula se puede medir disolviendo el complejo en agua y sometiendo la solución a un método de dispersión de luz dinámica a 80°C usando un aparato Malvern Instruments Zeta Sizer.
El complejo de la presente invención está, preferiblemente, aislado. La pureza del “complejo aislado” (porcentaje en peso del complejo objeto con respecto al peso total de los productos diana de evaluación) generalmente es no menor de 70%, preferiblemente no menor de 80%, más preferiblemente no menor de 90%, muy preferiblemente no menor de 99%.
Puesto que el complejo de la presente invención tiene una actividad inmunoestimulante superior, y tiene tanto actividad inmunoestimulante única para ODN CpG de tipo K (por ejemplo, actividad para activar las células B (preferiblemente células B humanas) para producir IL-6), como actividad inmunoestimulante única para ODN CpG tipo D (por ejemplo, actividad para activar a las células dendríticas plasmocitoides (preferentemente células dendríticas plasmocitoides humanas) para producir IFN-a, es útil como agente inmunoestimulante y similares. Por ejemplo, un complejo que contiene ODN CpG de tipo K (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 11, 12) y LNT (K3-LNT) y un complejo que contiene ODN CpG de tipo K (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) y SPG (K3-SPG), tienen la capacidad de inducir una respuesta inflamatoria (pan-IFN-a, IL-6 etc.), una acción para intensificar el título de anticuerpo IgG especifico de antígeno (IgG total, IgG2c etc.) en el suero de un individuo inoculado con virus, capacidad para producir citocinas específicas de antígeno (IFN-Y, IL2 etc.) en un individuo inoculado con el virus, y un efecto protector contra la infección por virus. K3-LNT también tiene la capacidad de aumentar la producción de citocinas de Th2 (IL-13, etc.) en un individuo inoculado con el virus. Por lo tanto, son útiles como nuevos candidatos a adyuvante de vacuna.
3. Composición farmacéutica
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el complejo antes mencionado de la presente invención. La composición farmacéutica de la presente invención se puede obtener formulando el complejo antes mencionado de la presente invención, de acuerdo con un medio convencional. La composición farmacéutica de la presente invención contiene el complejo de la presente invención y un vehículo farmacológicamente aceptable. Además, la composición farmacéutica puede contener también un antígeno. Tal composición farmacéutica se proporciona en una forma de dosis adecuada para administración oral o parenteral.
Como una composición para administración parenteral, se utilizan por ejemplo inyección, supositorios y similares, y la inyección puede abarcar formas de dosis tales como inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular, inyección de goteo y similares. Tal inyección se puede preparar de acuerdo con un método conocido. El método de preparación de la inyección incluye disolver o suspender el oligodesoxinucleótido o complejo de la presente invención arriba mencionado en un disolvente acuoso aséptico generalmente utilizado para inyección. Como disolvente acuoso para inyección se puede usar, por ejemplo, agua destilada; solución salina fisiológica; tampones tales como tampón fosfato, tampón carbonato, tampón tris, tampón acetato, y similares; y similares. El pH de tal disolvente acuoso es, por ejemplo, de 5 -10, preferiblemente 6 - 8. La inyección preparada se envasa preferiblemente en una ampolleta adecuada.
También es posible preparar una preparación en polvo del complejo de la presente invención sometiendo una suspensión del complejo de la presente invención a un tratamiento tal como secado al vacío, liofilización y similares. El complejo de la presente invención se puede utilizar conservándolo en un estado de polvo, y dispersando el polvo en un disolvente acuoso para inyección cuando se vaya a usar.
El contenido del complejo de la presente invención en una composición farmacéutica es, en general, de aproximadamente 0.1 -100 % en peso, preferiblemente de aproximadamente 1 - 99 % en peso, más preferiblemente de aproximadamente 10-90 % en peso, de la composición farmacéutica total.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener, como ingrediente activo, el complejo de la presente invención, en solitario o en combinación del complejo de la presente invención con otro ingrediente activo.
4. Uso farmacéutico
Dado que el complejo de la presente invención tienen una actividad inmunoestimulante superior, el complejo y la composición farmacéutica de la presente invención, se pueden usar como agentes inmunoestimulantes. La administración del complejo o de la composición farmacéutica de la presente invención a un mamífero (primates tales como seres humanos y similares, roedores tales como ratones y similares, etc.) puede inducir una reacción inmunitaria en el mamífero. En particular, puesto que el complejo de la presente invención tiene propiedades de activación de ODN CpG de tipo D, y estimula las células mononucleares de sangre periférica para producir grandes cantidades de interferón de tipo I (Pan-IFN-a, IFN-a2 etc.) e interferón de tipo II (IFN-y), es útil como un agente inductor de producción de interferón de tipo I, como un agente inductor de producción de interferón tipo II, o un agente inductor de producción de interferón de tipo de I y de tipo II. Puesto que el complejo de la presente invención y una composición farmacéutica que lo contiene inducen la producción de interferones tanto de tipo I como de tipo II, son útiles para la profilaxis o tratamiento de una enfermedad para la que son eficaces cualquiera de los interferones de tipo I o II, o ambos. Los ejemplos de la enfermedad para la que es eficaz el interferón de tipo I incluyen la infección por virus (por ejemplo, virus de la hepatitis C (VHC), virus del herpes, virus del papiloma, virus RS, virus influenza, etc.), cáncer y similares. Los ejemplos de la enfermedad para la que es eficaz el interferón de tipo II incluyen la enfermedad alérgica, infecciones por protozoos parásitos intracelulares (Leishmania, etc.), bacterias (Listeria, Mycobacterium tuberculosis, etc.), y similares. En cuanto a las infecciones víricas agudas con virus RS, virus influenza y similares, ya que tanto el interferón de tipo I como el interferón de tipo II intensifican las respuestas inmunitarias relacionadas con la eliminación del virus, se espera que el complejo y la composición farmacéutica que lo contiene, de la presente invención, sean eficaces para las infecciones víricas agudas.
Además, el complejo de la presente invención tiene una fuerte actividad como adyuvante de vacuna, y la administración del complejo de la presente invención, junto con un antígeno, a un mamífero, puede inducir una fuerte reacción inmunitaria al antígeno. Por lo tanto, la presente invención también proporciona una composición para uso en un método de inducir una reacción inmunitaria a un antígeno, que contiene (a) el complejo de la presente invención, y (b) el antígeno. En particular, el complejo de la presente invención induce fuertemente tanto una reacción inmunitaria humoral a un antígeno (producción de anticuerpos específicos de antígeno), como una reacción inmunitaria celular (inducción de CTL específicos de antígeno). Por lo tanto, el complejo, y la composición farmacéutica de la presente invención, son útiles como adyuvantes de vacuna.
En la presente memoria descriptiva, el adyuvante se refiere a un agente auxiliar farmacéutico que promueve respuestas inmunitarias, que es una sustancia que no intensifica de forma específica las respuestas inmunitarias a un antígeno cuando se administra con el antígeno al cuerpo vivo.
El antígeno no está particularmente limitado siempre que tenga la antigenicidad para un mamífero (primates tales como seres humanos y similares, roedores tales como ratones y similares, etc.) que va a ser el sujeto de la administración, y puede ser reconocido como antígeno por un anticuerpo o linfocito T citotóxico (CTL, células T CD8+). Puede emplearse cualquier sustancia que se convierta en un antígeno (proteína, péptido, ácido nucleico, lípido, carbohidrato, y una modificación de las sustancias antes mencionadas (por ejemplo, una modificación introducida con supresión, sustitución o adición de uno o más aminoácidos (en lo sucesivo mutación, e tc .) y similares). Como antígeno también se puede usar un antígeno obtenido a partir de un patógeno tal como protozoos, hongos, bacterias, virus y similares, y un antígeno relacionado con el cáncer o una enfermedad en particular.
En la presente memoria descriptiva, "antígeno A obtenido a partir de un patógeno X" significa que el antígeno A está contenido como un factor constituyente en el patógeno X. Por ejemplo, cuando el antígeno A es un polipéptido, significa que la secuencia de aminoácidos del polipéptido está presente en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el genoma del patógeno X.
Los ejemplos del antígeno obtenido a partir de un patógeno incluyen el propio patógeno o una parte del mismo, un mismo patógeno inactivado o atenuado o una parte del mismo, o una modificación introducida con una mutación en el mismo, etcétera, y similares.
Cuando se utiliza como antígeno un antígeno obtenido a partir de un patógeno, se induce una reacción inmunitaria al antígeno, y se construye un mecanismo para eliminar del cuerpo inmunológicamente el patógeno que contiene el antígeno. Por lo tanto, una composición que comprende (a) el complejo de la presente invención, y (b) un antígeno obtenido a partir de un agente patógeno, para inducir una reacción inmunitaria al antígeno, es útil para la profilaxis o tratamiento del patógeno.
El complejo de la presente invención induce fuertemente tanto una reacción inmunitaria humoral (producción de anticuerpos específicos de antígeno), como una reacción inmunitaria celular (inducción de CTL específicos de antígeno) para el antígeno. Por lo tanto, un antígeno obtenido a partir de un patógeno intracelular infeccioso (virus, protozoos, hongos, bacterias, etc.) que se sabe que es reconocido por los linfocitos T citotóxicos, un antígeno relacionado con las células de cáncer (por ejemplo, un antígeno tumoral) y similares, se usan preferiblemente como el antígeno.
Aunque el virus infeccioso intracelular no está particularmente limitado, los ejemplos del mismo incluyen el virus RS, el virus influenza, virus parainfluenza, virus de la hepatitis C (VHC), virus de la hepatitis A (VHA), virus de la hepatitis B (VHB), virus del ébola, citomegalovirus, adenovirus, virus de la polio, virus de la encefalitis japonesa, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de rubeola, virus de la rabia, virus de la fiebre amarilla, virus de la varicela, zostervirus, hantavirus, virus del dengue, norovirus, rotavirus, parvovirus, coronavirus, virus del moquillo, virus de la leucemia de células T del adulto (HTLV-1), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del herpes, virus del papiloma, y similares. Los ejemplos de las bacterias infecciosas intracelulares incluyen micoplasma y similares. Los ejemplos de los protozoos infecciosos intracelulares incluyen plasmodio, esquistosoma y similares. Preferiblemente el patógeno infeccioso intracelular es un virus (específicamente, virus RS o virus influenza, etc.).
Los ejemplos del antígeno relacionado con células cancerosas incluyen una proteína, cadena de azúcar, péptido, que son expresados específicamente por las células cancerosas, o variantes de las sustancias antes mencionadas (con supresión, sustitución o adición) o modificaciones de las mismas, y similares.
Puesto que el complejo de la presente invención induce fuertemente interferones tanto de tipo I como de tipo II, en una realización se selecciona un virus (por ejemplo, virus RS, virus influenza) que causa una infección vírica aguda para la cual son eficaces tanto el interferón de tipo I como de tipo II.
Por ejemplo, una composición que contiene (a) el complejo de la presente invención, y (b) un antígeno obtenido a partir de un patógeno o cáncer, para inducir una reacción inmunitaria al antígeno, puede ser administrado a un paciente con infección por patógenos o cáncer, o a un ser humano potencialmente afectado con la infección por patógenos o cáncer, para activar, de forma específica de antígeno, los linfocitos T citotóxicos (CTL) en el sujeto que ha recibido la administración, inducir la producción de anticuerpos específicos de antígeno, es decir, inducir una reacción inmunitaria protectora en el animal de sangre caliente (preferiblemente, humano), con lo cual la infección y el cáncer pueden ser prevenidos o tratados. Por consiguiente, la composición es útil como vacuna para la profilaxis o el tratamiento de las enfermedades antes mencionadas, tales como infección, cáncer y similares.
Además, puesto que el complejo de la presente invención puede inducir fuertemente tanto una reacción inmunitaria humoral (producción de anticuerpos específico de antígeno) como una reacción inmunitaria celular (inducción de CTL específicos de antígeno) a un antígeno, se puede usar como antígeno cualquiera de un antígeno de superficie y un antígeno interno de un patógeno y una célula de cáncer, y también es conveniente el uso de una mezcla de un antígeno de superficie y un antígeno interno.
Una composición que comprende (a) el complejo de la presente invención, y (b) un antígeno, para inducir una reacción inmunitaria al antígeno, se puede preparar de acuerdo con la composición farmacéutica anteriormente mencionada de la presente invención.
La presente invención se explica con más detalle a continuación haciendo referencia a ejemplos, que no deben interpretarse como limitativos.
Método
Animales y reactivos
La generación de ratones T/r9-deficientes y Dectina-1 -deficientes se ha descrito en (Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010); Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007)). Se le compraron ratones C57BL/6J a NIHON CLEA. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales del Instituto Nacional de Innovación Biomedica, y del animalario de la Universidad de Osaka. Los siguientes ODN CpG fueron sintetizados por GeneDesign, Inc. (el subrayado indica enlaces fosforotioato).
Tabla 1
K3 (5'-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-3') (SEQ ID NO: 1);
K3-dA40 (5'-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-40mero A-3') (SEQ ID NO: 2);
dA40-K3 (5'-40mero A-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-3') (SEQ ID NO: 3);
D35 (5'-GGT GCA TCG ATG CAG GGGGG-3') (SEQ ID NO: 4);
CpG21798 (5'-TCG TCG ACG ATC GGC GCG CGC CG-3') (SEQ ID NO: 5);
CpG21889 (5'-TCG TCG ACG ATC GGC GCG CGC CG-3') (SEQ ID NO: 6);
CpG2395 (5'-TCG TCG TTT TCG GCG CGC GCC G-3') (SEQ ID NO: 7);
M362 (5'-TCG TCG TCG TTC GAA CGA CGT TGA T-3') (SEQ ID NO: 8);
K3 marcado con Alexa 488;
K3-dA40 marcado con Alexa 488;
K3 marcado con Alexa 647;
K3-dA40 marcado con Alexa 647
Particularmente, la síntesis de K3-dA35 (SEQ ID NO: 12), K3-dA30 (SEQ ID NO: 11), K3- dA25 (SEQ ID NO: 10) y K3-dA20 (SEQ ID NO: 9), además del K3-dA40 antes mencionado (SEQ ID NO: 2), se describe (Tabla 2).
Tabla 2
K3-dA40:
A sT sC sG sA sC sT sC sT sC sG sA sG sC sG sT sT sC sT sC sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA sA
(Lista de secuencias, SEQ ID NO: 2)
K3-dA35 AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA sAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA
(Lista de secuencias, SEQ ID NO: 12)
K3-dA30:
A3T3C3G3A3C3T3C3TsC3G3A3G3CsG3T3TsC3T3C3A3AsAsA3AsAsA3AsA3AsAsA 3A 3A SA 3A 3A 3A 3A SA 3A 3A 3A 3A 3A 3A 3A 3A SA 3A
(Lista de secuencias, SEQ ID NO: 11)
K3-dA25:
AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA SASASASASASASASASASASASASA
(Lista de secuencias, SEQ ID NO: 10)
K3-dA20:
A3T3C3G3A3C3T3C3T3CSG3A3G3CSG3T3T3C3TSC3A3A3ASA3A3A3A3A3A3A3A3A 3A 3A3A 3A3A 3A 3ASA
(Lista de secuencias, SEQ ID NO: 9)
(En las secuencias antes mencionadas, la letra s indica que el enlace fosfodiéster entre nucleósidos está sustituido por un enlace fosforotioato).
Los oligodesoxinucleótidos se sintetizaron mediante un método convencional, el método de fosforamiditos en fase sólida (Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 3, Chemical synthesis (1990) ed. G. Michael Blackburn and Michael J. Gait. Oxford University Press).
La Tabla 3 muestra el peso molecular de los ODN CpG que se describen en la Tabla 2, y el tiempo de retención analizado por HPLC de fase inversa en las siguientes condiciones (columna: Waters, X-Bridge C182.5 pm, 4.6 x 75 mm, solución A: hexafluoroisopropanol 100 mM, trietilamina 8 mM, solución B: metanol, B%:5%^-30% (20 min, gradiente lineal); 60°C; 1 ml/min; 260 nm).
Tabla 3
Figure imgf000017_0001
La ovoalbúmina (OVA) se adquirió en Seikagaku Kogyo. DQ-OVA, Alexa488-OVA, CFSE y Lipofectamine 2000 se adquirieron en Invitrogen. Hoechst33258, zimosano, curdlano se adquirieron en SIGMA. Zymosan Depleted se adquirió en Invivogen. Liposoma de clodronato se adquirió en FormuMax. La vacuna de virus influenza fraccionado, el virus entero desactivado con formalina (WIV) y los virus influenza purificados (H1N1) se prepararon como se describió anteriormente (Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)).
Formación del complejo de ODN CpG y SPG (Fig. 1)
Se disolvieron 7.22 mg de K3-dA40 en agua (3.7mL). El SPG (15 mg, Mitsui Sugar Co., Ltd.) se disolvió en NaOH 0.25 N (1 mL). Se agregó un volumen de 1 mL de NaH2 PO4330 mM a la solución de ADN, después se agregó la solución de SPG a la solución de ADN/NaH2 PO4 y se mantuvo a 4°C durante la noche para terminar la formación del complejo. La razón en moles (MSPG/MADN) se fijó en 0.27. La formación del complejo se confirmó por medio de un aparato de electroforesis de microchip (SHIMADz U: MultiNA).
Formación del complejo de ODN CpG y LNT (Fig. 1)
Se disolvió lentinano (LNT: Ajinomoto Co., Inc., n° de lote: 2D8X1) en NaOH 0.25N a 50 mg/ml, y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante la noche. Varios ODN CpG (tablas 2, 3) se disolvieron en agua para inyección a 100 mM. La solución acuosa de LNT y varias soluciones acuosas de CpG (K3-dA20 (SEQ ID NO: 9), K3-dA25 (SEQ ID NO: 10), K3-dA30 (SEQ ID NO: 11), K3-dA35 (SEQ ID NO: 12), K3-dA40 (SEQ ID NO: 2)) se mezclaron en las proporciones mostradas en el Tabla 4, después se agregó el mismo volumen de NaH2 PO4330 mM que de LNT, y la mezcla se mantuvo a 4°C durante la noche para terminar la formación del complejo. La formación del complejo se confirmó por el desplazamiento de ODN CpG hacia el lado de peso molecular más alto por cromatografía de exclusión de tamaño, monitorizando la absorción a 260 nm. (Sistema: Agilent serie 1100, Columna: Asahipak GF7 M-HQ (Shodex), dos columnas conectadas, caudal: 0.8 mL/min, Tampón: EDTA PBS 10 mM, pH 7.4, Temperatura: 40°C).
Tabla 4
Figure imgf000017_0002
Preparación y estimulación de PBMC humanas (Figs. 2, 3, 6 y 7)
Se obtuvieron PBMC de tres hombres adultos sanos voluntarios (30-40 años de edad). Todos los experimentos donde se usan PBMC fueron aprobados por el Comité de Revisión Institucional del National Institute of Biomedical Innovation. Después de la preparación de PBMC usando Ficoll, se sembraron en placas a una concentración de 1 * 107 células/mL. Las PBMC se mantuvieron en RPMI completo (RPMI 1640 enriquecido con FCS a 10%, penicilina y estreptomicina). Las PBMC se estimularon con K3 (0.24, 0.74, 2.2, 6.6, 20 |jg/mL), K3-dA40, K3-SPG (complejo de K3-dA40), dA40-K3, SPG-K3 (complejo de dA40-K3), D35, CpG21798, CpG21889, CpG2395, o M362 durante 24 h. Los sobrenadantes se sometieron a ELISA para pan-IFN-a (Mabtech), IL-6 (R&D) y Milliplex (Millipore).
Análisis de microscopia electrónica (Fig. 4)
Antes de la tinción, las muestras se hicieron gotear sobre rejillas revestidas con formvar carbon. Para tinción negativa se puso una gota de acetato de uranilo al 2% (pH 4.0) sobre la rejilla y se dejó secar con el aire. Las rejillas se examinaron a una amplificación de x40,000 en un microscopio electrónico (Hitachi H-7650).
Dispersión de luz dinámica (Fig. 5)
El tamaño medio de las nanopartículas en una solución acuosa a 80 °C se midió usando dispersión de luz dinámica en un Malvern Instruments Zeta Sizer.
Cultivos de esplenocitos y células dendríticas (Figs. 8 y 9)
Se extirparon los bazos de ratones C57BL/6J, Tlr9-deficientes y Dectina 1-deficientes, de 6 semanas de edad. Después de suspender los esplenocitos, los eritrocitos (RBC) se lisaron con tampón de lisis ACK y las células se mantuvieron en RPMI completo. Las células se sembraron en placas a 1 x 107 células/mL. Se generaron DC derivadas de médula ósea cultivando por 7 días con 10 Flt3L humano (Peprotech) (100 ng/mL). Las células se sembraron en placas a una concentración de 1 x 107 células/mL. Se generaron BMDM cultivando por 7 días con M-CSF de ratón (Peprotech) (20 ng/mL). Estas células se mantuvieron en RPMI completo.
Distribución intracelular (Figs. 8 y 9)
Los BMDM se sembraron en placas a 5 x107 células/mL y se estimularon con Alexa 488-K3 (1 jM ) más Alexa 647-K3-SPG (1 jM ), o Alexa 488-D35 (1 jM ) más Alexa 647-K3-SPG (1 jM ) por 3 h. Las células se tiñeron con Hoechst33258 por 30 min para visualizar los núcleos; después las células se fijaron y se analizaron usando microscopia de fluorescencia.
Inmunización
A ratones C57BL/6J, Tlr9-deficientes, y Dectina 1-deficientes de seis semanas de edad, se les administró:
OVA (0.1, 1, 10, o 100 jg);
OVA (0.37, 1.1, 3.3, o 10 jg ) y K3(538 pmol);
OVA (0.37, 1.1, 3.3, o 10 jg ) y K3-dA40 (538 pmol); o
OVA (0.37, 1.1, 3.3, o 10 jg ) y K3-SPG (538 pmol)
en la base de la cola los días 0 y 10. Para los otros experimentos, a ratones C57BL/6J de 6 semanas de edad se les administró:
vacuna de virus fragmentado (0.1 jg ) sola;
vacuna de virus fragmentado más K3 (538 pmol); o
vacuna de virus fragmentado más K3-SPG (538 pmol)
los días 0 y 10 en la base de la cola. Se extrajo sangre el día 17 y los títulos de anticuerpo especifico de antígeno en el suero se midieron por ELISA (Figs. 10, 15a, 16, 25, 28a, 29 y 43a). Los bazos de los ratones se extrajeron el día 17 y los esplenocitos se prepararon mediante el método arriba mencionado. Las células se reestimularon con:
OVA257-264 (OVA257):SIINFEKL (10 jg/mL);
OVA323-339 (OVA323):ISQAVHAAHAEINEAGR (10 jg/mL);
Proteína OVA completa (OVA) (10 jg/mL);
NP260-283 (NP260):ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP (10 jg/mL); o
vacuna de virus fragmentado (10 jg/mL)
por 24 o 48 h. Los sobrenadantes se sometieron a ELISA para IFN-y de ratón (Figs. 11, 15B, 17, 26, 28b, 30 y 43b).
Para el ensayo del tetrámero, los esplenocitos se tiñeron con el tetrámero de OVA H-2Kb (MBL), anticuerpos anti-CD8a (KT15), anti-TCRp (H57-597), anti-CD62L (MEL-14), y anti-CD44 (IM7), y 7-AAD. El número de células tetrámero OVA+ CD44+ CD8a+ TCRp+ se determinó por FAc S (Figs. 12, 15c, 27, 28c y 31).
Ensayo de CTL in vitro (Fig. 13)
A ratones C57BL/6J de seis semanas de edad se les administró:
OVA (100 |jg);
OVA más K3 (3.3 jg);
OVA más K3-dA40 (3.3 jg); o
OVA con K3-SPG (3.3 jg )
en la base de la cola el día 0. Siete días después de la inmunización, los esplenocitos intactos de C57BL/6J se marcaron con diferentes concentraciones de CFSE (5 o 0.5 jM ) por 10 min a 37°C. Las células tenidas en alta concentración se impulsaron con OVA257 (10 jg/mL) por 90 min a 37°C. Después de lavar dos veces con medio, las células marcadas se mezclaron y se transfirieron a ratones inmunizados por medio de administración intravenosa. Veinticuatro horas después de la transferencia, los esplenocitos se recolectaron y el porcentaje de células marcadas con CFSE se midió por FACS.
Inmunización con el péptido
Ratones C57BL/6J se inmunizaron con:
OVA257 (10 jg);
OVA257 más K3 (10 jg);
OVA257 más K3-dA40 (10 jg); o
OVA257 más K3-SPG (10 jg).
Siete días después de la inmunización, los esplenocitos se prepararon y se tiñeron con anticuerpos del tetrámero OVA H-2Kb, anti-cD8a, anti-TCRp, anti-CD62L y anti-CD44. El número de células tetrámero OVA+ CD44+ CD8a+ TCRp+ se analizó por FACS (Fig. 14, izquierda). Los esplenocitos preparados se reestimularon in vitro con OVA257 (10 jg/mL) más Golgi Plug por 4 h. Las células se tiñeron con anticuerpos anti-IFN-Y, anti-CD8a y anti-CD3e, y el número de células IFN-Y+ CD8a+ CD3e+ se determinó por FACS (Fig. 14, derecha).
Transfección y ensayo de unión de Dectina 1 (Figs. 18 y 19)
Las células HEK293 se transfectaron con plásmidos de expresión de Dectina 1, o Dectina 2 vacíos usando Lipofectamine 2000. A las 48 h después de la transfección, las células se trataron con FITCSPG (0.5 jM ), K3-dA40 marcado con Alexa 488 (0.5 jM ), o K3-SPG marcado con Alexa 488 (0.5 jM ) por 60 min a 37°C. Después del tratamiento, las células se cosecharon y las células SPG o ODN CpG-positivas se analizaron por FACS.
Estimulación de células inmunitarias (Figs. 20, 21, 22, 23 y 24)
Esplenocitos y FL-DC de ratones C57BL/6J Tlr9-deficientes o Dectina 1-deficientes se estimularon con K3-SPG (0.014, 0.03, 0.04, 0.08, 0.12, 0.25, 0.37, 0.74, 1.1, 2.2, 3.3, 6.7, 10, o jg/mL), zimosano (3.7, 11.1, 33.3, o 100 jg/mL), curdlano, Zymosan Depleted, o SPG por 24 h. En otros experimentos, esplenocitos de ratones C57BL/6J o Dectina 1-deficientes se estimularon con Zymosan Depleted (100, 33.3, o 11.1 jg/mL) o SPG (100, 33.3, o 11.1 jg/mL), con o sin D35 (1 jM ) por 24 h. Los sobrenadantes se sometieron a ELISA para IFN-a (Pb L), IL-6 (R&D), IL-12 p40 (R&D), IL-12 p70 (R&D) and Bioplex (BIO-RAD).
Inmunohistoquímica (Fig. 32)
A ratones C57BL/6J se les administró:
DQ-OVA(10 jg);
Alexa 488-K3-SPG (10 jg);
Alexa 647-K3-SPG (10 jg); o
DQ-OVA más Alexa647-K3-SPG (10 jg )
en la base de la cola. Después de la recolección de iLN, las secciones congeladas se prepararon usando un criostato. Las secciones congeladas se fijaron con paraformaldehído al 4% por 10 min y se incubaron con anticuerpos anti-Siglec-1 (MOMA-1), anti-MARCO (ED31), anti-CD3e (145-2C11), o anti-CD11c (N418). Los resultados de imagenología se analizaron por ImageJ.
Microscopía bifotónica (Figs. 33 y 35)
A ratones C57BL/6J, Tlr9-deficientes o Dectina -1-deficientes se les administró DQ-OVA (10 |jg), Alexa 488-K3 (10 |jg), o Alexa 488-K3-SPG (10 jg ) en la base de la cola. Treinta minutos antes de la recolección de iLN a los ratones se les administraron anticuerpos anti-PE-MARCO o anti-PE-Siglec-1 en la base de la cola. Una hora después de la administración del antígeno o adyuvante, se recolectaron los iLN y se prepararon para el análisis de imagenología usando un microscopio bifotónico (Olympus). Se calculó la correlación de Pearson usando un análisis de colocalización de Volocity.
Distribución in vivo de antígeno y adyuvante (Figs. 34 y 36)
A ratones C57BL/6J se les administró:
Alexa 647-K3 (538 pmol);
Alexa 647-K3-SPG (538 pmol);
Alexa 488-OVA (10 jg);
Alexa 488-OVA más K3 (10 jg);
10 Alexa 488-OVA más K3-SPG (10 jg);
DQ-OVA (10 jg);
DQ-OVA más Alexa 647-K3 (538 pmol); o
DQ-OVA más Alexa 647-K3-SPG(538 pmol)
en la base de la cola. Veinticuatro horas después de la administración se recolectaron los iLN. Para preparar suspensiones de célula solas, los iLN se incubaron con colagenasa D (1 mg/mL) y desoxirribonucleasa I (0.1 mg/mL) por 30 min a 37°C. Las células preparadas se incubaron con anticuerpos anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD8a (56-6.7) y anti-CD11c para separar las diferentes poblaciones de DC. La captación celular de OVA y ODN CpG se analizó por FACS.
Inyección de liposoma de clodronato (Fig. 37)
A ratones C57BL/6J de seis semanas de edad se les administró liposoma de clodronato en la base de la cola, cinco o dos días antes de la inmunización. Los ratones se inmunizaron en la base de la cola con OVA más K3-SPG el día 0. El día 8 se recolecto la sangre y los bazos, y los títulos de anticuerpo en el suero y las respuestas de células T se midieron por ELISA.
Investigación de la activación de DC in vivo (Fig. 38)
A ratones C57BL/6J o Tlr9-deficientes se les administró K3 (10 jg ) o K3-SPG (10 jg ) en la base de la cola. Después de 24 de la administración se prepararon iLN mediante los métodos arriba mencionados. Las células se incubaron con anticuerpos anti-CD11c, -itip Dc A-1 (JF05-1C2.4.1), -CD8ay-CD40 (3/23), y luego se analizaron por FACS.
Investigación de la respuesta de defensa contra la infección por virus de influenza
A ratones C57BL/6J de 6 semanas de edad se les administró:
vacuna de virus fragmentado (0.1 jg);
vacuna de virus fragmentado más K3-SPG (10 jg); o
WIV (0.2 jg )
los días 0 y 14. Dos semanas después de la inmunización, los títulos de anticuerpo en el suero se midieron por ELISA (Fig. 39) y los ratones se provocaron intranasalmente con 2.3 * 103 pfu (10 LD50) de virus de influenza A/PR/8/34. Los cambios de peso corporal y mortalidad de los ratones provocados se monitorearon durante 20 días (Fig. 40). Modelo de vacuna de mono cinomolgo (Figs. 41 y 42)
A monos cinomolgo se les administró subcutáneamente vacuna de virus de influenza fragmentado (5 jg ) más K3 (5 nmol), o vacuna de virus fragmentado y K3-SPG (5 nmol)
los días 0 y 14. Se recolectaron muestras de sangre las semanas -2, 2, 4, 6, 8 y 110, y los títulos de anticuerpo se midieron por ELISA.
Análisis estadístico
El significado estadística (P < 0.05) entre los grupos se determinó usando la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney.
Resultados
1) Una partícula nanométrica en forma de varilla de K3-SPG adquiere características dobles de ODN CpG de tipo K y de tipo D.
Una mejor eficiencia de formación de complejo entre ODN CpG y SPG requiere secuencias adicionales del esqueleto de PS para poli-dA40 en los extremos 5' o 3' por medio de procedimientos de desnaturalización-renaturalización, como se muestra en la Fig. 1 (Shimada, N., et al., Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007); Minari, J., et al., Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011)). Durante la optimización de la formación de complejo por ODN CpG humanizado, los presentes inventores examinaron los impactos inmunoestimuladores de los extremos 5' y 3' de o Dn CpG. El 5'-K3-dA40-3', pero no 5'-dA40-K3-3', en complejo con SPG, activo las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas para producir una cantidad robusta de IFN-a, aunque las eficiencias de formación de complejo fueron comparables (Figs. 2 y 3). K3, K3-dA40 y dA40-K3, que son capaces de activar PBMC humanas para producir otras citocinas tales como IL-6, no pudieron producir IFN-a (Figs. 2 y 3). Estos resultados indican que el 5'-CpG es más conveniente que 3'-CpG como agonista de TLR9 novedoso.
La calificación y cuantificación de K3-SPG se realizó por microscopia de barrido electrónico (SEM) y dispersión de luz dinámica (DLS). K3-SPG tiene una estructura similar a una varilla, de forma consistente con lo observado en un informe previo (Bae, A.H., et al., Carbohydrate research 339, 251-258 (2004)) (Fig. 4). Parece ser una nanopartícula monomérica soluble con un diámetro promedio de 30 nm, comparable al SPG mismo, y más pequeña que ODN CpG de tipo D (D35) (Fig. 5) (Klein, D.C. et al., Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010); Costa, L.T., et al., Biochemical and biophysical research communications 313, 1065-1072 (2004)).
Dado que K3-SPG forma una nanopartícula, las actividades inmunoestimulantes de K3-SPG se compararon con ODN CpG de tipo C, D y P. Las PBMC estimuladas con K3-SPG produjeron una cantidad más grande de IFN-a e IFN-y, y a concentraciones mucho más bajas que las inducidas por ODN CpG de tipo D35 (Fig. 6), P y C (Fig. 7). Estos resultados sugieren que K3-SPG adquiere la característica de ODN CpG de tipo D, sin perder la del tipo K, porque se sabe que estos IFN son citocinas específicas de tipo D (Krug, A., et al., European journal of immunology 31, 2154­ 2163 (2001); Verthelyi, D. et al., Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Gursel, M. et al., Journal of leukocyte biology 71, 813-820 (2002)). Para entender las funciones dobles de ODN CpG de tipo Ky D, los presentes inventores analizaron la localización intracelular de K3-SPG en los macrófagos derivados de médula ósea. K3-SPG fue co­ localizado no solo en los endosomas que contienen ODN de tipo K, sino también en los que contienen ODN CpG de tipo D (Figs. 8 y 9) igual que ODN CpG de tipo C (Guiducci, C., et al., The Journal of experimental medicine 203, 1999­ 2008 (2006)), sugiriendo que K3-SPG puede transducir rutas de señalización inmunitaria innatas mediadas por endosoma por ODN CpG de tipo K y D. Estos resultados sugieren fuertemente que K3-SPG forma una partícula nanométrica de orden superior y completamente solubilizada, y que este K3-SPG "todo en uno" exhibe una actividad más potente que, y de características diferentes de, cualquier otro ODN CpG y complejo CpG-SPG previamente conocido.
2) K3-SPG es un adyuvante de vacuna prominente que induce potentes respuestas de CTL a antígenos de proteína sin conjugación.
Los presentes inventores compararon los efectos de adyuvante de K3, K3-dA40, y K3-SPG en un modelo de inmunización murino. Cuando unos ratones de tipo silvestre se inmunizaron con OVA sola, u OVA con cada adyuvante obtenido a partir de K3, K3-SPG indujo respuestas inmunes humorales significativamente mayores (Fig. 10), y respuestas de células T más fuertes que las inducidas por K3 (Fig. 11). Es de notar que los ensayos del tetrámero revelaron un número significativamente mayor de células T CD8 específicas de OVA (Fig. 12). También se observó una actividad in vivo muy fuerte de CTL contra antígenos de proteína coadministrados sin ninguna conjugación covalente (Fig. 13). Esta fuerte inducción de CTL por K3-SPG fue reproducida por vacunación con péptido (Fig. 14) y fue dependiente de la dosis (Fig. 15). La capacidad ahorradora de antígeno de K3-SPG fue tan potente que se obtuvieron respuestas comparables de anticuerpo y células T CD4 usando una centésima parte de la cantidad de antígeno OVA (Figs. 16 y 17). Estos resultados indican claramente que K3-SPG es un adyuvante más prominente que K3 solo.
3) SPG es un ligando de Dectina 1 soluble, pero no es un agonista de Dectina 1.
La función de Dectina 1 en la captación celular de, y después de activación por, SPG y K3-SPG, se examinó, ya que se ha indicado que Dectina 1 es un receptor de p-glucanos como zimosano (Herre, J., et al., Blood 104, 4038-4045 (2004)). Usando citometría de flujo, se encontró que las células HEK293 que expresan Dectina 1 pero no Dectina 2 o un vector de control, aumentan la captación de SPG o K3-SPG in vitro independientemente de la presencia de ODN (Figs. 18 y 19). Recientemente se ha reportado que la forma soluble de p-glucano no activa la señalización de Dectina 1 (Goodridge, H.S., et al., Nature 472, 471-475 (2011)). Adicionalmente, la señalización de Dectina 1 inhibe la producción de citocina mediada por TLR9 a través del supresor de inducción de proteína de señalización de citocina 1 (SOCS1) (Eberle, M.E. & Dalpke, A.H., Journal of immunology 188, 5644-5654 (2012)). Por lo tanto, se examinó la actividad agonista de SPG. Cuando células de bazo se estimularon con Zymosan Depleted pero no SPG, se observó la producción de TNF-a y otras citocinas, de manera dependiente de la dosis y de Dectina 1 (Figs. 20 y 21). La 10 producción de citocina por zimosano y curdlano fue independiente de Dectina 1. El Zymosan Depleted inhibió IFN-a inducido por ODN CpG, siendo esta inhibición aliviada por la deficiencia de Dectina 1 (Fig. 22). En contraste, SPG no inhibe la producción de IFN-a inducida por ODN CpG (Fig. 23). Estos resultados indican que SPG es un ligando pero no un agonista de Dectina 1; por lo tanto, SPG no interfiere en la producción de IFN-a mediada por TLR9.
4) Los efectos de adyuvante de K3-SPG son dependientes de TLR9 y parcialmente dependientes de Dectina 1.
Puesto que K3-SPG es un complejo de ODN CpG y p-glucano, la función de TLR9 (Hemmi, H., et al., Nature 408, 740-745 (2000)) y Dectina 1 (Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007)) se examinó usando ratones de receptor destruido (knockout). Cuando esplenocitos y DC derivadas de médula ósea inducidas por ligando Flt3 (FL-DCs) de ratones Tlr9-deficientes y Dectin-1-deficientes se estimularon con K3-SPG, la producción de citocina fue completamente dependiente de TLR9 pero no de Dectina 1 (Fig. 24). Consistentemente con los resultados in vitro , la inmunización en ratones Tlr9-deficientes con K3-SPG más OVA resulto en respuestas humorales y de células T disminuidas (Figs. 25 a 27). Los ratones Dectina 1-deficientes mostraron respuestas inmunes comparables con los ratones de tipo silvestre cuando los ratones se inmunizaron con OVA más 10 pg de K3-SPG (Fig. 28). Cuando los ratones Dectina 1-deficientes se inmunizaron con OVA más 1 pg de K3-SPG, los ratones exhibieron una respuesta de células T CD8 reducida de acuerdo con los ensayos detetrámero (Fig. 31), sin cambios significativos en la producción de anticuerpo y citocina de las células T (Figs. 29 y 30). Estos resultados sugieren que el efecto de adyuvante de K3-SPG depende de la señalización de TLR9. Aunque SPG y K3-SPG no estimulan la señalización de Dectina 1, el efecto de K3-SPG todavía depende parcialmente de Dectina 1 in vivo.
5) Macrófagos MARCO+, pero no Siglec-1+ en nódulos linfáticos de drenado capturan predominantemente K3-SPG con antígeno.
Dado que K3-SPG proporciona potentes efectos como adyuvante in vivo por medio de inmunización con una mezcla antigénica simple, se formuló la hipótesis de que las células que capturan tanto antígeno como K3-SPG tendrían una función critica en la mediación de los efectos de adyuvante. Para examinar la distribución in vivo de OVA y K3-SPG marcados fluorescentemente, se usó un microscopio de fluorescencia y un microscopio bifotónico. Después de una inyección en la base de la cola, tanto antígeno como adyuvante alcanzaron la superficie de los nódulos linfáticos inguinales drenantes (Figs. 32, 33 y 35). Después de 24 h, algunos K3-SPG se movieron al área de células T CD3e+ y se co-localizaron con DQ-OVA. Las células que contenían tanto K3-SPG como DQ-OVA en el área de células T del iLN eran DC CD11c+.
De manera interesante, la mayoría de las señales fluorescentes permanecieron en la superficie del iLN (Fig. 32), llevando a los investigadores a enfocarse en dos tipos de macrófagos que se sabe están distribuidos sobre la superficie del LN, macrófagos Siglec-1 (también llamados CD169 o MOMA-1)+ (también conocidos como macrófagos del seno subcapsular) y macrófagos MARCO+ (Martinez-Pomares, L. & Gordon, S., Trends in immunology 33, 66-70 (2012)). El análisis histológico usando microscopia de fluorescencia convencional no revelo adecuadamente toda la superficie del iLN; además, fue difícil aislar estos macrófagos para análisis de citometría de flujo (Aoshi, T., et al., European journal of immunology 39, 417-425 (2009); Gray, E.E. & Cyster, J.G., Journal of innate immunity 4, 424-436 (2012)). Por lo tanto, se usó un análisis de imagenología con un microscopio bifotónico para clarificar la distribución del antígeno y K3-SPG ex vivo. Después de la inyección de anticuerpos anti-MARCO y anti-Siglec-1, se visualizaron macrófagos específicos. Cuando la superficie del iLN se monitorizó por medio del microscopio bifotónico 1 h después de la inyección, OVA y K3-SPG fueron co-localizados con macrófagos MARCO+ pero no Siglec-1+ (Figs. 33 y 35). Reportes previos sugieren que el complejo inmune y el virus de influenza desactivado son capturados por los macrófagos Siglec-1+ para inducir respuestas inmunes humorales (Gonzalez, S.F., etal., Nature immunology 11,427-434 (2010); Suzuki, K. et al., The Journal of experimental medicine 206, 1485-1493 (2009)). El patrón de distribución coincide perfectamente con el de macrófagos MARCO+ en los iLN, y no se co-localiza con macrófagos Siglec-1+ como fue confirmado por análisis de co-localización de Volocity (Figs. 34 y 36). En contraste, K3 fue distribuido más difusamente entre las áreas MARCO+ y Siglec-1+ en comparación con K3-SPG (Figs. 35 y 36). Adicionalmente, ratones tanto Tlr9-deficientes como Dectin-1-deficientes mostraron localización comparable de K3-SPG. Para determinar la contribución de estos macrófagos a los efectos de adyuvante de K3-SPG, se examinó la diferente cinética de recuperación de macrófagos y DC después de una inyección de liposoma de clodronato en la base de la cola. Después de la inyección, los macrófagos se agotaron completamente por el día 2. Estas células no se recuperan durante por lo menos una semana, mientras que las DC se recuperaron mayormente por el día 5, como se había reportado previamente (Aoshi, T., et al., Immunity 29, 476-486 (2008)). Cuando se agotaron tanto los macrófagos como las DC, la respuesta inmune fue suprimida significativamente (Fig. 37; clo -d2). Solo los macrófagos, pero no las DC, se agotaron, y las respuestas inmunes fueron comparables con las de ratones no tratados (Fig. 37; Clo -d5). Esto sugeriría que aunque tanto OVA como K3-SPG fueron capturados principalmente por los macrófagos MARCO+ en los LN después de la inyección, los macrófagos inducen respuestas inmunes adaptativas. En otras palabras, el efecto de adyuvante de K3-SPG fue muy dependiente de la población de DC.
6) K3-SPG hace blanco en, y activa fuertemente, la población de DC portadora del antígeno in vivo.
Los hallazgos del presente inventor sugieren que, aunque una gran parte de nanopartículas de K3-SPG fue captada por los macrófagos MARCO+ en los iLN después de la inyección, los efectos de adyuvante parecen estar controlados por las DC. La captación de antígeno y adyuvante por parte de la población de DC en iLN fue enfocada. A las 24 h después de la inyección, la captación de antígeno y adyuvantes por la población de DC se analizó por citometría de flujo. La frecuencia de CpG-positivos en tres subgrupos de CD (pDC, DC CD8a+, y DC CD8a-) aumentó significativamente después de la inyección de K3-SPG en comparación con K3. En cambio, la frecuencia de las DC OVA-positivas fue comparable después de las inyecciones de K3 y K3-SPG. Cuando se enfocó sobre DC antígeno- y adyuvante-positivas, hubo un aumento sustancial para K3-SPG sobre K3. Tanto pDC como DC CD8a+ en los iLN fueron activadas fuertemente por K3-SPG pero no por K3, 24 h después de la infección, y esto fue totalmente dependiente de TLR9 (Fig. 38). Estos resultados indican que las pDC y DC CD8a+ capturan nanopartículas de K3-SPG preferiblemente sobre K3 no particulado para la maduración, y ejercen efectos de adyuvante.
7) K3-SPG es un potente adyuvante para la vacuna de la influenza en modelos murinos y de primates no humanos.
El efecto adyuvante de K3-SPG se examinó mediante el uso de más modelos clínicos relevantes de vacunación contra la influenza, tanto en ratones como en primates no humanos. Cuando los ratones fueron inmunizados con la vacuna fraccionada (SV) libre del virión, enriquecida con el antígeno hemaglutinina y tratada con éter, más el adyuvante indicado, K3-SPG demostró efectos adyuvantes superiores a K3 al comparar las respuestas de anticuerpo y las respuestas de células T (Fig. 43). Más importante aún, una inmunización con SV más K3-SPG resulto en una respuesta de anticuerpo 100 veces mayor, incluso en comparación con la vacunación con una vacuna entera desactivada (virión) (WIV) (0.2 pg/ratón) (Fig. 39), que contiene ARN vírica como una construcción en adyuvante (Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)). Los ratones inmunizados con SV (0.1 pg/ratón) y K3-SPG mostraron una menor pérdida de peso corporal que los ratones inmunizados con WIV (Fig. 40). Sorprendentemente, K3-SPG confirió 100% de protección contra la provocación del virus PR8 letal, a cuya dosis solo 10% de los ratones vacunados con WIV sobrevivió (Fig. 40). Estos resultados apoyan firmemente la idea de que K3-SPG funciona como un potente adyuvante para vacunas de proteína o basadas en proteína en un modelo murino, lo que llevo a los inventores a extender este hallazgo a un modelo de primate no humano utilizando el mono cinomolgo. Cada grupo de tres monos cinomolgo se inmunizó con SV más K3 o K3-SPG los días 0 y 14. Los títulos de anticuerpo en el suero se monitorizaron a continuación, durante 8 semanas. El SV más K3-SPG indujo un título de anticuerpo significativamente más alto 2 semanas después de la inmunización, y los títulos se mantuvieron altos durante al menos otras 6 semanas (Fig. 41). A los 2 años (110 semanas) después de la inmunización, el grupo de K3-SPG tenía títulos de anticuerpo significativamente más altos que el grupo de K3 (Figs. 42 y 43). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que K3-SPG es un adyuvante de vacuna prominente en un modelo de primate no humano.
8) Investigación de la capacidad inductora de respuesta de inflamación de los complejos de K3-LNT y K3-SPG usando PBMC humanas.
Usando PBMC humanas (Lonza, Cat# CC-2702, Lote # 0000396517), se evaluó la capacidad de K3 (K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40) solo, complejos de K3-LNT (K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) y complejo de K3-SPG (K3-dA40-LNT) para inducir la producción de pan-IFN-a (hlFNa) e IL-6 (hIL-6).
Los resultados se muestran en la Fig. 44. Cuando se estimula con una dosis baja, la producción de pan-IFN-a e IL-6 fue mayor con K3-SPG que es un complejo de K3 y SPG, y K3-LNT que es un complejo de K3 y LNT, en comparación con K3 solo. Además, se sugirió que la producción de citocinas inflamatorias, que es inducida por K3-LNT que tienen diferente longitud de la cola dA (DA30, dA35, DA40), posiblemente es casi equivalente. Además, cuando se comparó la producción de citocinas inflamatorias de K3-SPG y K3-LNT, se sugirió que la capacidad de producción de pan-IFN-a de K3-LNT posiblemente es superior a la de K3-SPG. Por otro lado, se encontró que K3-SPG y K3-LNT eran equivalentes en la producción de iL-6.
9) Título de anticuerpo IgG especifico del antígeno RSV F en el suero de ratones inoculados con una vacuna de la subunidad F de RSV añadida con el complejo de K3-LNT y K3-SPG.
Ratones C57BL/6 de 7 semanas de edad fueron inmunizados dos veces en la base de la cola con el antígeno RSV F (0.5 pg) y diversos adyuvantes (10 pg) (K3 solo (K3-dA30, K3-dA35, K3- dA40), complejo de K3-LNT (K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) y complejo de K3-SPG (K3-dA40-SPG), fosfato de alumbre), por ratón, a intervalos de 2 semanas. Una semana después de la inmunización final, se recuperó la sangre periférica y se preparó el suero que se usó como muestra de evaluación. El título del anticuerpo que se une al antígeno de la vacuna RSV F en el suero se midió usando el método de ELISA. Como se muestra en la Fig. 45, la inducción total de IgG especifica de antígeno se incrementó con la adición de adyuvante en comparación con el grupo de inoculación de antígeno RSV F solo (F), lo que sugiere que el efecto de adyuvante de K3 solo (F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40), K3-LNT (F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT) y complejo de K3-SPG (F+K3-dA40-SPG) y fosfato de alumbre (F+Alum) puede ser equivalente. En el grupo de ratones inoculados con fosfato de alumbre (F+Alum), que es un adyuvante de Th2, se encontró que la capacidad de inducción de la subclase IgG1 fue mayor que el antígeno RSV F en el grupo de inoculación. Por otra parte, los resultados mostraron que el grupo de inmunización inoculado con K3 solo (F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40), K3-LNT (F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT), K3-SPG (F+K3-dA40-SPG) fue más alto en el anticuerpo de la subclase IgG2c que con fosfato de alumbre (F+Alum), lo que sugiere que el complejo de K3-LNT puede ser un adyuvante de Th1 como K3-SPG.
10) Capacidad de producción de citocina especifica del antígeno RSV F en un ratón inoculado con la vacuna de la subunidad F de RSV añadida con el complejo K3-LNT y K3-SPG.
Ratones C57BL/6 de 7 semanas de edad fueron inmunizados dos veces en la base de la cola con el antígeno RSV F (0.5 |jg) y diversos adyuvantes (10 jg ) (K3 solo (K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40), K3-LNT (K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) y complejo de K3-5 SPG (K3-dA40-SPG), fosfato de alumbre), por ratón, a intervalos de 2 semanas. Una semana después de la inmunización final, el bazo se recuperó y se prepararon los esplenocitos. Los esplenocitos sembrados en una placa de cultivo de 96 pocillos se estimularon con cada uno de péptido de epítopo restringido de MHC de clase I, péptido de epítopo restringido de MHC de clase II, y la proteína antigénica de la vacuna del antígeno F de RSV, y se cultivaron durante 24 h o 48 h. La capacidad de producción de citocina especifica del antígeno F de RSV se evaluó por el método de ELISA de citocinas y usando el sobrenadante de cultivo como muestra. En esta investigación se evaluaron tres clases de citocinas (FN-g, que es una citocina de Th1, IL-2 producida a partir de células T activadas, e IL-13 que es una citocina de Th2).
Como resultado, como se muestra en la Fig. 46, se sugirió que los efectos de intensificación sobre la inducción de producción de IFN-g y producción de IL-2 específicos de antígeno pueden ser equivalentes en K3-LNT (F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT) y K3-SPG (F+K3-dA40-SPG). En el grupo de inoculación de adyuvante de fosfato de alumbre (adyuvante de Th2) (F Alum), la producción de IFN-g estuvo por debajo del límite de detección con cualquier estimulación. Por otra parte, el efecto intensificador de la producción de IL-13 fue alto en el grupo de inoculación de fosfato de alumbre (adyuvante de Th2) y bajo en el grupo de inoculación de K3-SPG (adyuvante de Th1). Deforma interesante, en el grupo de inoculación de K3-LNT (F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA 35-LNT, F+K3-dA40-LNT), el efecto intensificador sobre la producción de IL-13 fue alto en comparación con el mismo grupo de inoculación de adyuvante de Th1 (K3-SPG) (F+K3-dA40-SPG). A partir de esto se sugirió que el complejo K3-LNT tiene una capacidad intensificadora de la respuesta de Th2, además del alto efecto intensificador de la respuesta de Th1 que tiene K3-SPG.
11) Efecto protector contra la infección por RSV en ratas algodoneras inoculadas con la vacuna de la subunidad F de RSV añadida con K3-LNT y K3-SPG.
Ratas algodoneras de 6 a 7 semanas de edad fueron inmunizadas dos veces en la base de la cola con el antígeno RSV F (1 jg ) y diversos adyuvantes (10 jg ) (K3-LNT (K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) y complejo de K3-SPG (K3-dA40-SPG), fosfato de alumbre), por rata, a intervalos de 2 semanas. Dos semanas después de la inmunización final, las ratas algodoneras fueron provocadas con RSV del serotipo A (cepa Long) por medio de inoculación transnasal, y la cantidad vírica intrapulmonar se midió 3 días después. Al grupo de administración de Synagis (palivizumab) se le administró por vía intramuscular Synagis (2.5 mg/kg) un día antes de la infección de provocación, y la capacidad protectora de infección se evaluó de la misma manera que anteriormente. Se extrajeron muestras de sangre de la vena yugular de las ratas bajo anestesia inmediatamente antes de la infección de provocación y el título de anticuerpo neutralizante se investigó utilizando el suero obtenido.
Los resultados de la cantidad vírica intrapulmonar se muestran a la izquierda de la Fig. 47, y los resultados de los títulos de anticuerpos neutralizantes se muestran a la derecha de la misma. Los resultados de la cantidad vírica intrapulmonar revelan que se observa una cantidad vírica de aproximadamente 105 pfu/pulmón en el grupo de administración de PBS, mientras que se suprime a aproximadamente 100 veces menos cantidad vírica (media) en el grupo que recibió la vacuna de RSV F más fosfato de alumbre (F Alum). Por otra parte, también se observó actividad para inducir protección contra la infección en el grupo de administración de la vacuna añadida con K3-SPG (F+K3-dA40-SPG). El grupo de vacuna añadida con K3-LNT (F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT) mostró el mejor efecto protector contra la infección, sugiriendo así la posibilidad de ser un candidato novedoso de adyuvante de vacuna que contribuye a una capacidad alta de defensa contra la infección, en comparación con fosfato de alumbre y K3-SPG.
En cuanto a la capacidad de inducción de anticuerpo neutralizante, en el grupo de administración de vacuna añadida con fosfato de alumbre se encontró actividad neutralizante en la sangre equivalente al Synagis. Por otra parte, puesto que el anticuerpo neutralizante fue escasamente inducido en 3 de 4 ratas del grupo de administración de la vacuna añadida con K3-SPG, se consideró que el efecto protector contra la infección al que contribuye K3-SPG se origina de un mecanismo independiente del anticuerpo neutralizante. Además, como se encontró un título de anticuerpo neutralizante alto en el grupo de administración de K3-LNT (F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT), en comparación con K3-SPG, se sugirió que el adyuvante K3-LNT puede tener propiedades diferentes de K3-SPG, por ejemplo, una capacidad intensificadora de la respuesta de Th2.
Aplicabilidad industrial
La presente invención proporciona un complejo que comprende un oligodesoxinucleótido que tiene una actividad inmunoestimulante superior. En particular, el complejo de la presente invención tiene, concurrentemente, una actividad inmunoestimulante única de ODN CpG de tipo K y una actividad inmunoestimulante única de ODN CpG de tipo D. Además, K3-LNT tiene una fuerte actividad como adyuvante de vacuna, y la inmunización con K3-LNT junto con un

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un complejo que comprende un oligodesoxinucleótido y p-1,3-glucano, en el que el oligodesoxinucleótido comprende: oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado y poli desoxiadenilato, en donde el poli desoxiadenilato está colocado en el lado 3 ' del oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado,
en donde el oligodesoxinucleótido CpG de tipo K humanizado consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 1, en donde el poli desoxiadenilato tiene una longitud de 30-40 nucleótidos, y
en donde el p-1,3-glucano es lentinano.
2. El complejo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los enlaces fosfodiéster en el oligodesoxinucleótido están parcial o totalmente sustituidos por enlaces fosforotioato, preferiblemente en donde los enlaces fosfodiéster en el oligodesoxinucleótido están completamente sustituidos por enlaces fosforotioato.
3. El complejo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que:
(i) el poli desoxiadenilato está unido en el extremo 3' del oligodesoxinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por SEQ ID NO: 1, y todos los enlaces fosfodiéster en el oligodesoxinucleótido están sustituidos por enlaces fosforotioato;
(ii) el complejo tiene una estructura de triple hélice; y / o
(iii) el complejo tiene una actividad para activar las células B para producir IL-6, y una actividad para activar las células dendríticas para producir IFN-a.
4. El complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en un método de tratamiento o profilaxis de una enfermedad en un animal de sangre caliente.
5. El complejo para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que:
(i) la enfermedad es infección por virus, cáncer, una enfermedad alérgica o infección protozoaria parasitaria intracelular o bacteriana, opcionalmente en donde la infección por virus es infección por virus RS o virus influenza; y/o
(ii) el animal de sangre caliente es humano.
6. El complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en un método para inducir una reacción inmunitaria protectora en un animal de sangre caliente.
7. Una composición farmacéutica que comprende el complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
8. La composición de acuerdo con la reivindicación 7 para uso en un método de profilaxis o tratamiento de infección por virus, cáncer, una enfermedad alérgica o una infección protozoaria parasitaria intracelular o bacteriana, que es preferiblemente para uso en un método de profilaxis o tratamiento de infección por virus, opcionalmente en donde la infección por virus es infección por virus RS o virus de influenza.
9. La composición según la reivindicación 7, que comprende:
(a) el complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y
(b) un antígeno.
10. La composición según la reivindicación 9 para uso en un método para inducir una reacción inmunitaria al antígeno, opcionalmente en donde el antígeno deriva de un patógeno, además opcionalmente en donde la composición es para uso en un método de profilaxis o tratamiento de infección con el patógeno.
11. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el patógeno es un virus, opcionalmente en donde el virus es un virus RS o virus influenza.
12. Un agente para inducir la producción de interferón tipo I y/o tipo II, que comprende el complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
13. Un agente inmunoestimulante que comprende el complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, opcionalmente que es un adyuvante de vacuna.
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