ES2737990T3

ES2737990T3 - Roedores que expresan secuencias de inmunoglobulina sensibles al pH

Info

Publication number: ES2737990T3
Application number: ES13714127T
Authority: ES
Inventors: John Mcwhirter; Lynn Macdonald; Joel H Martin; Andrew J Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: CA2865645A1; CY1121864T1; SG10202107388VA; IL244098A0; EP2825037A1; KR20140135737A; RU2664473C2; JP2017131251A; CN104302171B; JP6228589B2; US20130247236A1; SG10201700360VA; MX2014011048A; IL234237B; EP3539374A1; JP6574811B2; US11224207B2; JP7011549B2; KR102459666B1; NZ629077A

Abstract

Un roedor genéticamente modificado que comprende en su línea germinal un locus de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de inmunoglobulina humana no reorganizada unida operativamente a una secuencia de región constante de inmunoglobulina, en donde la secuencia de región variable de inmunoglobulina humana no reorganizada comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina o una inserción de al menos un codón de histidina, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR), en donde el codón de histidina no está codificado por un segmento génico de línea germinal de tipo silvestre humano correspondiente.

Description

DESCRIPCIÓN

Roedores que expresan secuencias de inmunoglobulina sensibles al pH

Campo de la invención

En el presente documento se describe un animal no humano genéticamente modificado que expresa anticuerpos capaces de unirse a un antígeno de un modo dependiente del pH. Además, se describen animales no humanos genéticamente modificados que comprenden loci de inmunoglobulinas que se modifican para que contengan al menos una sustitución o inserción de un codón que codifica un aminoácido protonable. Además, se describen animales no humanos genéticamente modificados que comprenden locus de inmunoglobulina que se modifican para que contengan al menos una sustitución de histidina y/o al menos una inserción de histidina en un segmento génico V, D o J de cadena pesada de inmunoglobulina o una región VDJ de cadena pesada reorganizada o una región VJ de cadena ligera reorganizada de la misma. Además, se describen animales no humanos genéticamente modificados que expresan inmunoglobulinas que muestran sensibilidad al pH en la unión al antígeno. Además, se describen animales genéticamente modificados que comprenden poblaciones de linfocitos B que están enriquecidas respecto a los dominios variables de inmunoglobulina que comprenden al menos una histidina. Además, se describen animales no humanos genéticamente modificados que comprenden agrupaciones de dos o más histidinas presentes en forma de inserciones y/o sustituciones en un segmento génico V, D y/o J de cadena pesada de inmunoglobulina y/o un segmento génico V y/o J de cadena ligera y/o secuencias VDJ de cadena pesada reorganizadas o secuencias VJ de cadena ligera reorganizadas de la misma.

Además, se describen locus de inmunoglobulina genéticamente modificados de animales no humanos que comprenden una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina. Además, se describen animales no humanos, incluyendo roedores, por ejemplo, ratones y ratas, que comprenden un locus de inmunoglobulina genéticamente modificado en su genoma con una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina. Además, se describen animales no humanos genéticamente modificados capaces de expresar una proteína de unión a antígeno que se caracteriza por unión al antígeno dependiente de pH, reciclabilidad mejorada y/o semivida en suero mejorada.

Antecedentes

Los dominios de unión de inmunoglobulina encuentran uso terapéutico en una gran variedad de formatos, incluyendo el formato de anticuerpo tradicional de una cadena de pesada de inmunoglobulina homodimérica asociada con una cadena ligera afín. Muchos de estos formatos, incluyendo el formato tradicional, presentan características farmacocinéticas in vivo que son subóptimas, debido a una gran variedad de factores. En las últimas décadas, se han probado estrategias dispares para mejorar la farmacocinética. Estas incluyen, por ejemplo, aumentar el radio hidrodinámico para reducir la eliminación renal mediante conjugación a polímeros (por ejemplo, PEG; revisado en, por ejemplo, Duncan, R. (2006) Polymer conjugates as anticancer nanomedicines, Nat. Rev. Cancer 6:688-701); sialilación de N-glucanos (revisado en, por ejemplo, Stork, R. et al. N-glycosylation as novel strategy to improve pharmacokinetic properties of bispecific single-chain diabodies, J. Biol. Chem. 283(12):7804-7812); modificaciones de Fc para promover la unión de Fc-FcRn a pH neutro mientras que se promueve la liberación a pH endosómico y la asociación con seroalbúmina (véase, por ejemplo, Chuang et al. (2002) Pharmaceutical Strategies Utilizing Recombinant Serum Albumin, Pharm. Res. 19(5):569-577). En aplicaciones adecuadas y para formatos adecuados, cada una de estas estrategias puede ofrecer algunos beneficios.

Sin embargo, sigue habiendo la necesidad de mejorar los efectos terapéuticos y las modalidades para los agentes biofarmacéuticos, incluyendo, pero sin limitación, la manipulación de los dominios variables de inmunoglobulina para diseñar dominios variables que presenten unión dependiente de pH. Existe la necesidad de dominios variables para su uso en proteínas de unión a antígeno de diversos formatos, en donde los dominios variables (o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos) confieren a la proteína de unión a antígeno sensibilidad al pH respecto de la unión a un antígeno o receptor diana. También existe la necesidad en la técnica de sistemas y métodos para generar dominios variables de inmunoglobulina dependientes de pH y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Existe la necesidad de sistemas biológicos que puedan generar una gran variedad de dominios variables de inmunoglobulina, en donde la gran diversidad está enriquecida respecto de aminoácidos titulables que pueden conferir al dominio variable sensibilidad al pH, por ejemplo, la capacidad de unirse a un antígeno o epítopo diana a un pH (por ejemplo, un pH neutro o elevado), liberando el antígeno o epítopo diana a un segundo pH (por ejemplo, un pH bajo o endosómico).

Las cadenas ligeras de inmunoglobulina presentan retos únicos en ciertos formatos. Los anticuerpos comprenden generalmente un componente de cadena pesada homodimérico, en donde cada monómero de cadena pesada está asociado con una cadena ligera idéntica. Los anticuerpos que tienen un componente de cadena pesada heterodimérico (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) son deseables como anticuerpos terapéuticos. Sin embargo, la producción de anticuerpos biespecíficos que tienen un componente de cadena ligera adecuado que puede asociarse satisfactoriamente con cada una de las cadenas pesadas de un anticuerpo biespecífico ha resultado ser problemática.

En un enfoque, se puede seleccionar una cadena ligera mediante el estudio de las estadísticas de uso para todos los dominios variables de cadena ligera, identificando la cadena ligera empleada con más frecuencia en anticuerpos humanos y emparejando esa cadena ligera in vitro con las dos cadenas pesadas de diferente especificidad.

En otro enfoque, se podría seleccionar una cadena ligera observando secuencias de cadena ligera en una biblioteca de presentación en fagos (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos que comprende secuencias de región variable de cadena ligera humana, por ejemplo, una biblioteca de scFv humano) y seleccionando la región variable de cadena ligera más utilizada comúnmente de la biblioteca. La cadena ligera se puede probar entonces sobre las dos cadenas pesadas diferentes de interés.

En otro enfoque, podría seleccionarse una cadena ligera analizando una biblioteca de presentación en fagos de secuencias variables de cadena ligera utilizando las secuencias variables de cadena pesada de ambas cadenas pesadas de interés como sondas. Podría seleccionarse una cadena ligera que se asocia con ambas secuencias variables de cadena pesada como una cadena ligera para las cadenas pesadas.

En otro enfoque, una cadena ligera candidata podría alinearse con las cadenas ligeras afines de las cadenas pesadas, y se realizan modificaciones en la cadena ligera para que se empareje más estrechamente a las características de secuencia comunes a las cadenas ligeras afines de ambas cadenas pesadas. Si es necesario minimizar las posibilidades de inmunogenicidad, las modificaciones dan como resultado preferentemente secuencias que están presentes en secuencias de cadenas ligeras humanas conocidas, de modo que es improbable que el procesamiento proteolítico genere un epítopo de linfocitos T basándose en parámetros y métodos conocidos en la técnica para evaluar la probabilidad de inmunogenicidad (es decir, in silico así como ensayos en húmedo).

Todos los enfoques de este tipo se basan en métodos in vitro que conllevan una serie de restricciones a priori, por ejemplo, la identidad de secuencia, la capacidad de asociarse con cadenas pesadas preseleccionadas específicas, etc. Existe una necesidad en la técnica de composiciones y métodos que no se basen en la manipulación de condiciones in vitro, sino que empleen enfoques más sensatos desde el punto de vista biológico para producir proteínas de unión a epítopos humanos que incluyan una cadena ligera común.

Además, los anticuerpos terapéuticos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos terapéuticos, tienen algunas limitaciones debido a que, con frecuencia, requieren altas dosis para lograr la eficacia deseada. Esto se debe en parte al hecho de que los complejos de antígeno-anticuerpo se internalizan en el endosoma y se dirigen a la degradación lisosómica en un proceso llamado aclaramiento mediado por la diana. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos y composiciones que den lugar a un reciclaje de anticuerpos más eficaz, por ejemplo, el reciclaje de anticuerpos biespecíficos y eviten la degradación del anticuerpo promoviendo la disociación de complejos anticuerpo-antígeno en el compartimento endosómico sin comprometer la especificidad y afinidad del anticuerpo hacia el antígeno.

Los fármacos administrados al organismo, incluyendo los anticuerpos monoclonales terapéuticos, pueden verse afectados por diversos mecanismos de eliminación, incluyendo la filtración glomerular (por ejemplo, en la orina), la secreción (por ejemplo, en la bilis) y el catabolismo por las células. Mientras que las moléculas pequeñas se eliminan del organismo mediante filtración renal, la mayoría de los anticuerpos secretados (por ejemplo, IgG, que son demasiado grandes como para filtrarse a través de los glomérulos) se eliminan del organismo principalmente mediante el catabolismo mediado por células, por ejemplo, endocitosis de fase fluida (fagocitosis) o endocitosis mediada por receptor. Por ejemplo, las moléculas solubles con varios epítopos repetidos se unen a diversos anticuerpos en circulación y los grandes complejos de antígeno-anticuerpo resultantes se fagocitan rápidamente en las células para su degradación. Por otro lado, los receptores diana de la superficie celular, a los que se unen los anticuerpos (es decir, complejos de receptor-anticuerpo), sufren endocitosis mediada por la diana de una manera dependiente de la dosis, lo que ocasiona la formación de endosomas destinados a la degradación lisosómica dentro de las células. En algunos casos, los complejos de receptor-anticuerpo endocitados se unen a los receptores de Fc neonatales (FcRn) dentro de los endosomas de una manera dependiente del pH y se enrutan de vuelta a la superficie celular para su liberación al plasma o los fluidos intersticiales tras su exposición a un pH extracelular neutro (por ejemplo, pH 7,0-7,4).

Existe la necesidad en la técnica de sistemas, por ejemplo, animales no humanos, células y locus genómicos que generan proteínas de unión a antígeno con restos titulables, por ejemplo, locus genéticamente modificados que reordenan segmentos génicos de inmunoglobulina para generar dominios variables de cadena pesada que responden a cambios en el pH, por ejemplo, que donan o aceptan protones y, por ejemplo, cuyas características de unión difieren en función del estado de protonación.

También existe la necesidad en la técnica de métodos y composiciones que puedan aumentar adicionalmente la eficacia del reciclaje de proteínas de unión a antígeno endocitadas promoviendo la disociación de las proteínas de unión a antígeno de los complejos de receptor-proteína de unión a antígeno o aumentando la afinidad de las proteínas de unión a antígeno por el FcRn en un compartimento endosómico ácido sin comprometer la especificidad y afinidad de la proteína de unión a antígeno frente a un antígeno de interés.

Sumario

La presente invención proporciona un roedor genéticamente modificado que comprende en su línea germinal un locus de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de inmunoglobulina humana no reorganizada unida operativamente a una secuencia de región constante de inmunoglobulina, en donde la secuencia de región variable de inmunoglobulina humana no reorganizada comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina o una inserción de al menos un codón de histidina, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR), en donde el codón de histidina no está codificado por un segmento génico de línea germinal de tipo silvestre humano correspondiente.

La presente invención proporciona además un roedor genéticamente modificado, que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada que comprende segmentos Vh, D y Jh, en donde la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada está unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde uno o más de los segmentos génicos de Vh, D y Jh humanos comprenden al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina y/o al menos una inserción de codón de histidina, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR), en donde el codón de histidina sustituido o insertado no está codificado por un segmento génico de línea germinal humana de tipo silvestre correspondiente; y una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana no reorganizada que comprende segmentos Vl y J humanos, en donde la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana no reorganizada está unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina, en donde uno o más de los segmentos génicos de Vl y Jl comprenden al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina y/o al menos una inserción de codón de histidina, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR), en donde el codón de histidina sustituido o insertado de la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana no reorganizada no está codificada por un segmento génico de línea germinal humana de tipo silvestre correspondiente.

La presente invención también proporciona un roedor genéticamente modificado, que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada que comprende segmentos Vh, D y Jh no reorganizados, en donde la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada está unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde uno o más de los segmentos génicos de Vh, D y Jh humanos no reorganizados comprenden al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al menos una inserción de codón de histidina, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR), en donde el codón de histidina no está codificado por un segmento génico de línea germinal de tipo silvestre humano correspondiente; y una secuencia de ácido nucleico de VJ de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reorganizada individual que comprende secuencias de segmentos génicos Vl y Jl humanos, en donde la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reorganizada individual está unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina, en donde la secuencia de VJ reorganizada comprende al menos una sustitución de un codón distinto de histidina con un codón de histidina o al menos una inserción de codón de histidina, en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR), en donde el codón de histidina de la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reorganizada no está codificado por un segmento génico de línea germinal humano de tipo silvestre correspondiente.

Además, la presente invención proporciona un roedor genéticamente modificado, en donde el animal comprende en su línea germinal

al menos una inserción de un codón de histidina o al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina en una secuencia génica de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada unida operativamente a un gen de región constante de cadena pesada en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina, en donde el codón de histidina del locus de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) y no está codificado por un segmento génico de línea germinal de tipo silvestre correspondiente; y

al menos una inserción de un codón de histidina o al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina en una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizada unida operativamente a un gen de región constante de cadena ligera en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina, en donde el codón de histidina del locus de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) y no está codificado por un segmento génico de línea germinal de tipo silvestre correspondiente.

La presente invención proporciona además un método para producir un roedor que produce dominios variables de anticuerpo con histidinas codificadas mediante codones de histidina diseñados, que comprende:

modificar al roedor en su línea germinal para que comprenda al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al menos una inserción de un codón de histidina en una secuencia génica de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada que comprende segmentos génicos Vh, D y Jh humanos no reorganizados, en donde el codón de histidina se encuentra en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) y no está codificado por un segmento génico de línea germinal de tipo silvestre humano correspondiente; y/o

modificar al roedor en su línea germinal para que comprenda al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al menos una inserción de un codón de histidina, en una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana no reorganizada que comprende segmentos génicos Vl y Jl humanos no reorganizados, en donde el codón de histidina se encuentra en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) y no está codificado por un segmento génico de línea germinal de tipo silvestre humano correspondiente.

La presente invención también proporciona un método para producir un roedor que produce dominios variables de anticuerpo con histidinas codificadas mediante codones de histidina diseñados, que comprende:

modificar al roedor para que comprenda al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al menos una inserción de un codón de histidina en una secuencia génica de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada de un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizado que comprende segmentos Vh, D y Jh no reorganizados,

en donde el codón de histidina se encuentra en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) y no está codificado por un segmento génico de línea germinal de tipo silvestre correspondiente; y

modificar al roedor para que comprenda al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al menos una inserción de un codón de histidina en una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada individual que comprende secuencias de segmentos Vl and Jl reorganizadas en la línea germinal, en donde el codón de histidina se encuentra en una secuencia de ácido nucleico que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) y no está codificado por un segmento génico de línea germinal de tipo silvestre correspondiente.

La presente invención proporciona además un método para generar un anticuerpo que muestra unión dependiente del pH contra un antígeno de interés que comprende inmunizar a un roedor de acuerdo con la invención o producido mediante el método que produce un roedor que produce dominios variables de anticuerpo con histidinas codificadas mediante codones de histidina diseñados de la invención, con un antígeno de interés y seleccionar un anticuerpo que se una al antígeno de interés a un pH neutro mientras muestra una unión reducida al antígeno a un pH ácido.

Se describen composiciones y métodos para producir animales genéticamente modificados que producen dominios variables de inmunoglobulina que comprenden al menos un resto de histidina codificado por una modificación de línea germinal del animal no humano, en donde la modificación de línea germinal comprende al menos uno de la inserción de un codón de histidina en un segmento V, D o J de cadena pesada, la inserción de un codón de histidina en un segmento V o J de cadena ligera, la inserción de un codón de histidina en un gen VJ de cadena ligera reorganizado, la sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina en un segmento V, D o J de cadena pesada, la sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina en un segmento V o J de cadena ligera, la sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina en una secuencia de VJ de cadena ligera reorganizada.

También se describen composiciones y métodos para introducir agrupaciones de codones de histidina en secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de animales no humanos.

También se describen composiciones y métodos para introducir inserciones de histidina o sustituciones de codones distintos de histidina por codones de histidina, en regiones codificantes N-terminales de genes de inmunoglobulina, regiones codificantes del bucle 4 de genes de inmunoglobulina, regiones codificantes de CDR de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencias V(D)J reorganizadas o segmentos génicos V, (D), J).

Además, se describen composiciones y métodos para producir descendencia del animal no humano que comprende inserciones de codones de histidina y/o sustituciones de codones distintos de histidina por codones de histidina tanto en locus de cadena pesada de inmunoglobulina como en locus de cadena ligera de inmunoglobulina.

En un aspecto, se describe un animal no humano genéticamente modificado que comprende en su línea germinal un locus de inmunoglobulina que comprende una sustitución o una inserción en un locus variable de inmunoglobulina de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina. En un aspecto, el locus variable (por ejemplo, locus de segmentos V(D)J no reorganizado) comprende al menos una porción de un locus variable humano (segmentos V(D)J).

En un aspecto, el animal no humano genéticamente modificado comprende en su línea germinal un primer locus variable (por ejemplo, un locus de segmentos V(D)J de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizado) y un segundo locus variable (por ejemplo, una cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizada (locus de segmentos V,J; o una secuencia de VJ de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada).

En un aspecto, el animal no humano comprende un primer y un segundo locus variable, en donde al menos el primer o el segundo locus variable comprende una inserción de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina.

En un aspecto, tanto el primer como el segundo locus variable comprenden cada uno una sustitución o inserción de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina.

En un aspecto, el primer locus variable comprende al menos una porción funcional de un locus variable de cadena pesada no reorganizada (segmentos V, D, J no reorganizados).

En un aspecto, el locus variable de cadena pesada no reorganizado comprende al menos una porción de un locus humano (segmentos V, D,J no reorganizados).

En un aspecto, el locus de cadena pesada no reorganizado es un locus humano que comprende segmentos V no reorganizados, un segmento D sintético que comprende un enlazador y un segmento J humano. En un aspecto, el segmento D sintético comprende al menos un codón de histidina.

En un aspecto, el segundo locus variable comprende al menos una porción funcional de un locus de cadena pesada no reorganizado (segmentos V,J no reorganizados).

En un aspecto, el segundo locus variable comprende una secuencia génica de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada (secuencia VJ reorganizada).

En un aspecto, la sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina y/o la inserción de un codón de histidina es en una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable y la histidina se encuentra en una región seleccionada entre una región N-terminal de una cadena de inmunoglobulina, una región de bucle 4 de una cadena de inmunoglobulina, una CDR1 de una cadena pesada, una CDR2 de una cadena pesada, una CDR3 de una cadena pesada, una CDR1 de una cadena ligera, una CDR2 de una cadena ligera, una CDR3 de una cadena ligera y una combinación de las mismas.

En un aspecto, al menos uno del primer locus variable o el segundo locus variable está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico de región constante no humana endógena en un locus de inmunoglobulina no humano endógeno.

En un aspecto, el primer locus variable (segmentos V, D, J humanos no reorganizados) está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no endógena humana.

En un aspecto, el primer locus variable (segmentos V, D, J humanos no reorganizados) está unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena en un locus de inmunoglobulina no humano endógeno.

En un aspecto, el segundo locus variable (segmentos V, J no reorganizados) está unido operativamente a una secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógena.

En un aspecto, la secuencia de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógena se encuentra en un locus de inmunoglobulina no humano endógeno.

En un aspecto, la secuencia de región variable comprende una agrupación de 2, 3, 4 o 5 histidinas que son sustituciones de codones distintos de histidina y/o inserciones de codones de histidina.

En un aspecto, el locus de cadena pesada reorganizado comprende segmentos génicos D que se encuentran invertidos con respecto a la dirección de orientación del locus de cadena pesada. En un aspecto, los segmentos D invertidos son un marco de lectura hidrófilo.

En un aspecto, se describe un animal no humano genéticamente modificado, que comprende al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada (segmentos V, D, J no reorganizados) unida operativamente a una secuencia génica de región constante, en donde uno o más de los segmentos génicos V, D y J comprenden al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al menos una inserción de codón de histidina; al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana no reorganizada (segmentos V, J no reorganizados) unida operativamente a una secuencia génica de región constante, en donde uno o más de los segmentos génicos V y J comprenden al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al menos una inserción de codón de histidina; en donde el animal no humano expresa un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina y/o un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una histidina procedente de una sustitución o inserción de histidina en la línea germinal del ratón.

En un aspecto, el animal no humano es un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un roedor. En un aspecto, el roedor se selecciona entre el grupo que consiste en un ratón, una rata y un hámster.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada está unida operativamente a una secuencia de región constante no humana.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de región constante no humana unida a la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada se encuentra en un locus endógeno de inmunoglobulina no humana en la línea germinal del animal no humano.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de región constante no humana unida a la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizada se encuentra en un locus endógeno de inmunoglobulina no humana en la línea germinal del animal no humano.

En un aspecto, se describe un animal no humano genéticamente modificado, que comprende al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada (segmentos V, D, J no reorganizados) unida operativamente a una secuencia génica de región constante, en donde uno o más de los segmentos génicos V, D y J no reorganizados comprenden al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al menos una inserción de codón de histidina; una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reorganizada (secuencia VJ reorganizada) unida operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena ligera, en donde la secuencia VJ reorganizada comprende al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al menos una inserción de codón de histidina; en donde el animal no humano expresa un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina y/o un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una histidina procedente de una sustitución o inserción de histidina en la línea germinal del ratón.

En un aspecto, el animal no humano genéticamente modificado es un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un roedor. En un aspecto, el roedor se selecciona entre el grupo que consiste en un ratón, una rata y un hámster.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada está unida operativamente a una secuencia de región constante no humana. En un aspecto, la secuencia de región constante no humana unida a la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada se encuentra en un locus endógeno de inmunoglobulina no humana en la línea germinal del animal no humano. En un aspecto, la secuencia de región constante no humana unida a la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada se encuentra en un locus endógeno de inmunoglobulina no humana en la línea germinal del animal no humano.

En un aspecto, se describe un animal no humano genéticamente modificado, en donde el animal comprende una población de linfocitos B que se caracteriza por una presencia potenciada de restos de histidina en cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de la población de linfocitos B, en comparación con un animal no humano de tipo silvestre. En un aspecto, la mejora es de aproximadamente 2-4 veces. En un aspecto, la mejora es de aproximadamente 2-10 veces.

En un aspecto, se describe un animal no humano genéticamente modificado que expresa cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina que comprenden histidinas codificadas por sustituciones y/o inserciones en secuencias de inmunoglobulina de línea germinal del animal no humano.

En un aspecto, se describe un método para producir un animal no humano que produce dominios variables de anticuerpo con histidinas codificadas por codones de histidina de línea germinal, que comprende: modificar el animal no humano en su línea germinal para que comprenda al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o una inserción de un codón de histidina, en un locus variable (segmentos V, D, J no reorganizados) de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada; y, modificar el animal no humano en su línea germinal para que comprenda al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o una inserción de un codón de histidina, en un locus variable (segmentos V, J no reorganizados) de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizada.

En un aspecto, el método comprende modificar genéticamente la línea germinal del ratón para que comprenda al menos una porción de un locus variable (segmentos V, D, J) de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada y efectuar la sustitución o inserción de histidina en el locus humano variable (segmentos V, D, J no reorganizados) de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada.

En un aspecto, el método comprende modificar genéticamente la línea germinal del ratón para que comprenda al menos una porción de un locus (segmentos V, J no reorganizados) de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizada y efectuar la sustitución o inserción de histidina en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana no reorganizada.

En un aspecto del método, el animal no humano es un roedor. En un aspecto, el roedor se selecciona entre un ratón, una rata y un hámster.

En un aspecto, se describe un método para producir un animal no humano que produce dominios variables de anticuerpo con histidinas codificadas por codones de histidina de línea germinal, que comprende: modificar el animal no humano para que comprenda al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o una inserción de un codón de histidina, en un locus variable (segmentos V, D, J no reorganizados) de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada; y, modificar el animal no humano para que comprenda al menos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o una inserción de un codón de histidina, en una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada (secuencia VJ reorganizada) en la línea germinal.

En diversos aspectos, se modifica genéticamente a los animales no humanos modificando genéticamente células pluripotentes o totipotentes (por ejemplo, células madre embrionarias (ES)) y empleando las células genéticamente modificadas como células donantes con un embrión hospedador en una madre subrogada para gestar un animal procedente de las células donantes genéticamente modificadas. En diversos aspectos, se modifica genéticamente a los animales no humanos mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

Se describen métodos y composiciones para producir dominios variables de anticuerpo que muestran una unión a antígeno dependiente de pH. Se describen proteínas de unión a antígeno modificadas, así como composiciones y métodos para producirlas, que se unen al antígeno diana con baja afinidad a un pH bajo (por ejemplo, endosómico) y que se unen al mismo antígeno diana con alta afinidad a un pH más elevado (por ejemplo, extracelular) o neutro.

En un aspecto, se describe un método para producir un anticuerpo que muestra unión dependiente de pH, que comprende modificar una secuencia de un dominio variable del anticuerpo para añadir un resto de histidina o para sustituir un resto existente por un resto de histidina, para formar un dominio variable modificado con histidina. En un aspecto, la sustitución es de un resto que no es crítico para la unión al antígeno (por ejemplo, un pH neutro o extracelular).

En un aspecto, se sustituyen por histidina dos, tres, cuatro, cinco o seis o más restos. En un aspecto, los dos, tres, cuatro, cinco o seis o más restos sustituidos por histidinas se encuentran en una agrupación. En un aspecto, la agrupación comprende dos o más sustituciones de histidina consecutivas. En un aspecto, la agrupación comprende dos o más sustituciones de histidina separadas por uno o más restos distintos de histidina. En un aspecto, la agrupación tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos de longitud y todos los restos no críticos para la unión al antígeno (por ejemplo, a un pH neutro o extracelular) se modifican a histidina.

En un aspecto, el dominio variable es un dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, k o A). En un aspecto, el dominio variable se encuentra en un dominio variable de cadena pesada. En un aspecto, se modifica la secuencia de un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada.

En un aspecto, la secuencia del dominio variable es una secuencia de CDR. En un aspecto, la secuencia de CDR es una secuencia de CDR de una cadena pesada. En un aspecto, la secuencia de CDR es una secuencia de CDR de una cadena ligera. En un aspecto, la secuencia de CDR es una secuencia de CDR de una cadena pesada y una secuencia de CDR de una cadena ligera.

En un aspecto, la secuencia de CDR es una secuencia de CDR3. En un aspecto, la secuencia de CDR es una secuencia de CDR2. En un aspecto, la secuencia de CDR es una secuencia de CDR3.

En un aspecto, la secuencia de CDR es una secuencia de CDR1, de CDR2 y/o de CDR3 de una cadena ligera. En un aspecto, la secuencia de CDR es una secuencia de CDR1, de CDR2 y/o de CDR3 de una cadena pesada.

En un aspecto, la secuencia del dominio variable del anticuerpo es una secuencia del bucle 4. En un aspecto, la secuencia del bucle 4 es una secuencia de bucle 4 de cadena pesada. En un aspecto, la secuencia del bucle 4 es una secuencia de bucle 4 de cadena ligera.

En un aspecto, la secuencia del dominio variable del anticuerpo es una secuencia N-terminal. En un aspecto, la secuencia N-terminal es una secuencia N-terminal de cadena pesada. En un aspecto, la secuencia N-terminal es una secuencia N-terminal de cadena ligera.

En un aspecto, la secuencia del dominio variable del anticuerpo se selecciona entre una secuencia de CDR de una cadena pesada, una secuencia de CDR de una cadena ligera, una secuencia de bucle 4 de una cadena pesada, una secuencia de bucle 4 de una cadena ligera, una secuencia N-terminal de una cadena pesada, una secuencia N-terminal de una cadena ligera y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el dominio variable es de una cadena pesada y la secuencia del dominio variable comprende una primera secuencia CDR y una secuencia seleccionada entre una secuencia N-terminal, una secuencia de bucle 4, una segunda secuencia de CDR, una tercera secuencia de CDR y una combinación de las mismas. En un aspecto específico, la primera secuencia de CDR es una CDR3 y la secuencia del dominio variable comprende además una secuencia seleccionada entre una secuencia N-terminal, una secuencia de bucle 4, una secuencia de CDR2, una secuencia de CDR1 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el dominio variable modificado con histidina procede de una cadena pesada y la modificación con histidina es en una secuencia de bucle 4 y una secuencia seleccionada entre una CDR1 o CDR2 o CDR3, una secuencia N-terminal y una combinación de las mismas. En un aspecto específico, la modificación con histidina se encuentra en una secuencia de bucle 4 y una secuencia de CDR3. En un aspecto específico, la modificación con histidina es una secuencia de bucle 4 y una secuencia de CDR3 y una secuencia N-terminal. En un aspecto específico, la modificación de histidina se encuentra en una secuencia de bucle 4 y una secuencia N-terminal.

En un aspecto, en el presente documento se describe un dominio variable de inmunoglobulina modificado con his, en donde el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his que no se une a un antígeno de interés o que se une al antígeno de interés con una afinidad a un pH menor de 6; y se une al mismo antígeno de interés con una segunda afinidad a un pH de aproximadamente 7 o más. En un aspecto, el primer pH es menor de 5,5 o menor de 5. En un aspecto, el primer pH es de 5,75. En un aspecto, el segundo pH es de aproximadamente 7 o mayor. En un aspecto, el segundo pH es un pH extracelular de un ser humano. En un aspecto, el segundo pH es de 7,2 a 7,4. En un aspecto específico, el segundo pH es de 7,2.

En un aspecto, el dominio variable modificado con his comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis o más sustituciones con histidina en una secuencia seleccionada entre una CDR, una N-terminal, un bucle 4 y una combinación de las mismas. En un aspecto específico, el dominio variable modificado con his comprende una modificación en una CDR3. En un aspecto, el dominio variable modificado con his comprende una modificación seleccionada entre una modificación de una CDR3 en una cadena pesada, una modificación de una CDR3 en una cadena ligera y una combinación de las mismas. En un aspecto, el dominio variable modificado con his comprende al menos una sustitución en una CDR (por ejemplo, CDR3) y al menos una sustitución en una secuencia seleccionada entre una N-terminal, un bucle 4 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la CDR se selecciona entre el grupo que consiste en una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada, una CDR3 de cadena pesada, una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera, una CDR3 de cadena ligera y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la al menos una CDR comprende una CDR3 de cadena ligera. En un aspecto, la al menos una CDR comprende una CDR3 de cadena ligera y una CDR3 de cadena pesada.

En un aspecto, el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his se une a un antígeno de interés a un pH neutro o básico (por ejemplo, pH 7-7,4) con una Kd de aproximadamente 1°'6 o menor (por ejemplo, 1°'7, 1°'8, 1°'9, 10'1°, 10-11, 1°-12), en donde el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his comprende: una CDR1 en donde todos los restos de aminoácido no de unión a antígeno están sustituidos con histidina o en donde la CDR1 comprende una agrupación de sustituciones de histidina. En un aspecto, el dominio variable no se une al antígeno de interés o se une al antígeno de interés con una fuerza 102-106 veces más débil a un pH ácido (por ejemplo, pH 5-6, en un aspecto, pH 6).

En un aspecto, el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his se une a un antígeno de interés a un pH neutro o básico (por ejemplo, pH 7-7,4) con una Kd de aproximadamente 1°'6 o menor (por ejemplo, 1°'7, 1°'8, 1°'9, 1°-i°, 1° -11, 1°-12), en donde el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his comprende una CDR2, en donde todos los restos de aminoácido no de unión a antígeno están sustituidos con histidina o en donde la CDR2 comprende una agrupación de sustituciones de histidina. En un aspecto, el dominio variable no se une al antígeno de interés o se une al antígeno de interés con una fuerza 102-106 veces más débil a un pH ácido (por ejemplo, pH 5-6, en un aspecto, pH 6).

En un aspecto, el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his se une a un antígeno de interés a un pH neutro o básico (por ejemplo, pH 7-7,4) con una Kd de aproximadamente 1°'6 o menor (por ejemplo, 1°'7, 1°'8, 1°'9, 1°-i°, 1° -11, 1°-12), en donde el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his comprende una CDR3, en donde todos los restos de aminoácido no de unión a antígeno están sustituidos con histidina o en donde la CDR3 comprende una agrupación de sustituciones de histidina. En un aspecto, el dominio variable no se une al antígeno de interés o se une al antígeno de interés con una fuerza 102-106 veces más débil a un pH ácido (por ejemplo, pH 5-6, en un aspecto, pH 6).

En un aspecto, se describe un método para producir un polipéptido de unión a antígeno humano que comprende un dominio modificado con his, comprendiendo el método modificar una secuencia de nucleótidos de dominio variable de inmunoglobulina como se describe en el presente documento para que codifique dos o más histidinas para formar una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio modificado con his y fusionar la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio modificado con his (directamente o con un enlazador) a una secuencia de inmunoglobulina humana.

En un aspecto, la secuencia de inmunoglobulina humana es una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. En un aspecto específico, el dominio constante de inmunoglobulina humana codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en un Ch1, una bisagra, un Ch2, un Ch3 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, se describe una célula que expresa un dominio variable modificado con his, en donde el dominio variable modificado con his se modifica como se describe en el presente documento. En un aspecto, la célula es una célula de mamífero. En un aspecto, la célula se selecciona entre una célula HeLa, una célula DU145, una célula Lncap, una célula MCF-7, una célula MDA-MB-438, una célula PC3, una célula T47D, una célula THP-1, una célula U87, una célula SHSY5Y (neuroblastoma humano), una célula Saos-2, una célula Vero, una célula CHO, una célula GH3, una célula PC12, una célula retinal humana (por ejemplo, una célula PERC.6™) y una célula MC3T3. En un aspecto específico, la célula es una célula CHO.

En un aspecto, se describe un dominio variable de inmunoglobulina modificado con his como se describe en el presente documento, en donde el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his no se une a un antígeno de interés o se une al antígeno de interés con una primera afinidad a un pH de 5-6 (por ejemplo, 5,75) y se une al mismo antígeno de interés con una segunda afinidad a un pH de 7-7,4 (por ejemplo, 7,2), en donde al menos una CDR comprende dos o más sustituciones de histidina y al menos una secuencia distinta de CDR comprende una o más sustituciones de histidina, en donde la al menos una secuencia distinta de CDR se selecciona entre una secuencia N-terminal, una secuencia de bucle 4 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la primera afinidad se caracteriza por la falta de unión o una Kd de 10'6 o mayor (por ejemplo, 10'3) y la segunda afinidad se caracteriza por que es al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 102 veces, al menos 103 veces, al menos 104 veces, al menos 105 veces o al menos 106 veces más fuerte que la primera afinidad.

En un aspecto, la secuencia distinta de CDR se encuentra en el mismo polipéptido que la al menos una secuencia de CDR. En un aspecto, la secuencia distinta de CDR se encuentra en un polipéptido diferente al de la al menos una secuencia de CDR.

En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 de una cadena pesada y/o ligera y la CDR3 comprende una sustitución de al menos la mitad de los restos de aminoácidos no de unión a antígeno por histidina. En un aspecto específico, todos los restos de aminoácido no de unión a antígeno de la CDR3 se sustituyen por histidina.

En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 de una cadena pesada y/o ligera y la CDR3 comprende una sustitución de tres o más restos de aminoácidos no de unión a antígeno por histidina. En un aspecto, se sustituyen cuatro o más de los restos de aminoácido no de unión a antígeno por histidina.

En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 de una cadena pesada y/o ligera y la CDR3 comprende una sustitución de dos o más restos de aminoácidos no de unión a antígeno contiguos por histidina. En un aspecto, la CDR3 comprende una sustitución de tres o más restos de aminoácido no de unión a antígeno contiguos por histidina.

En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 de una cadena ligera y/o pesada y además, comprende una CDR seleccionada entre una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 de una cadena ligera y/o pesada y además, comprende una CDR seleccionada entre una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 de cadena ligera y/o pesada y la al menos una secuencia distinta de CDR es una secuencia de bucle 4, en donde la secuencia de bucle 4 comprende una o más sustituciones de histidina.

En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 de cadena ligera y/o pesada y la al menos una secuencia distinta de CDR es una secuencia N-terminal, en donde la secuencia N-terminal comprende una o más sustituciones de histidina.

En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 de una cadena ligera, la al menos una secuencia distinta de CDR comprende una secuencia N-terminal con una o más sustituciones de histidina y una secuencia de bucle 4 con una o más sustituciones de histidina.

En un aspecto, la al menos una CDR es una CDR3 de una cadena pesada, la al menos una secuencia distinta de CDR comprende una secuencia N-terminal con una o más sustituciones de histidina y una secuencia de bucle 4 con una o más sustituciones de histidina.

En un aspecto, el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his se une a un antígeno de interés a pH 7-7,4 (por ejemplo, pH 7,2) con una Kd de aproximadamente 1°'7 o menos (por ejemplo, 1°'8, 1°'9, 10'1°, 10-11, 1°'12), en donde el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his comprende una CDR1, en donde todos los restos de aminoácido no de unión a antígeno están sustituidos con histidina.

En un aspecto, el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his se une a un antígeno de interés a pH 7-7,4 (por ejemplo, pH 7,2) con una Kd de aproximadamente 1°'7 o menos (por ejemplo, 1°'8, 1°'9, 1°'1°, 1°-11, 1°'12), en donde el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his comprende una CDR2 en donde todos los restos de aminoácido no de unión a antígeno están sustituidos con histidina.

En un aspecto, el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his se une a un antígeno de interés a pH 7-7,4 (por ejemplo, pH 7.2) con una Kd de aproximadamente 1°'7 o menos (por ejemplo, 1°'8, 1°'9, 10'1°, 1°-11, 1°'12), en donde el dominio variable de inmunoglobulina modificado con his comprende una CDR3 en donde todos los restos de aminoácido no de unión a antígeno están sustituidos con histidina.

En un aspecto, se describe el uso de un método como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno humano. En un aspecto, el medicamento es un anticuerpo. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

En un aspecto, se describe el uso de un dominio variable modificado con his como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno humano. En un aspecto, el medicamento es un anticuerpo. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

En un aspecto, se describe el uso de un método o un dominio variable modificado con his como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno humano, en donde el medicamento comprende una proteína de unión a antígeno seleccionada entre un anticuerpo, un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), un scFv, un scFv biespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un V-NAR, un VHH, un Vl , un F(ab), un F(ab)2, un DVD (es decir, proteína de unión a antígeno de dominio variable dual), un SVD (es decir, proteína de unión a antígeno de dominio variable individual) o una molécula de unión a linfocitos T biespecífica (es decir, una BiTE).

En un aspecto, se emplea un método como se describe en el presente documento para crear una secuencia de región variable de cadena ligera k o A para producir una proteína de unión a antígeno humana, que comprende además fusionar secuencias de región variable modificada con his de cadena pesada y/o ligera (directamente o a través de un enlazador) a secuencias de región constante de cadena pesada y ligera para formar secuencias fusionadas, expresar las secuencias fusionadas en una célula y recuperar una proteína de unión a antígeno expresada que comprende las secuencias fusionadas. En diversos aspectos, las regiones constantes de cadena pesada humana se seleccionan entre IgM, IgD, IgA, IgE e IgG. En diversos aspectos específicos, la IgG se selecciona entre una IgG1, una IgG2, una IgG3 y una IgG4. En diversos aspectos, la región constante de cadena pesada humana se selecciona entre una secuencia que comprende una Ch1, una bisagra, un Ch2, un Ch3, un Ch4 y una combinación de los mismos. En un aspecto específico, la combinación es una Ch1, una bisagra, una Ch2 y una Ch3. En un aspecto específico, la combinación es una Ch1, una Ch2 y una Ch3. En un aspecto específico, la combinación es una bisagra, una Ch2 y una Ch3. En un aspecto específico, la combinación es una bisagra, una Ch2 y una Ch3.

En un aspecto, se describe un sistema biológico para generar un anticuerpo o un dominio variable de anticuerpo que se une a un antígeno diana a un pH neutro pero que muestra una unión reducida del mismo antígeno a un pH ácido (por ejemplo, pH 5,0-6,°). El sistema biológico comprende un animal no humano, por ejemplo, un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata) que tiene una secuencia de cadena ligera reordenada (por ejemplo, un V-J reordenado) que comprende una o más modificaciones con histidina. En diversos aspectos, la una o más modificaciones con histidina están en el codón de CDR3 de la cadena ligera. En diversos aspectos, el animal no humano comprende un locus de inmunoglobulina de cadena pesada humana o humanizada. En diversos aspectos, el animal no humano comprende un reemplazo de segmentos génicos variables de cadena pesada no humana endógenos con uno o más segmentos de Vh, Dh y Jh de cadena pesada humana, en donde los segmentos humanos están unidos operativamente a una región constante de inmunoglobulina no humana. En diversos aspectos, se describen animales no humanos con cadenas ligeras universales que comprenden dominios variables de cadena ligera con sustituciones de restos no histidina por restos de histidina. En diversos aspectos, a estos animales no humanos con cadena ligeras universales modificadas con histidina (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones) se denominan ratones de cadena ligera universal de histidina, ratones de histidina-ULC o ratones HULC.

Por lo tanto, en un aspecto, en el presente documento, se describe un animal no humano genéticamente modificado que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos Vl y Jl humanos, en donde la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada individual comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina. En un aspecto, la secuencia de la región variable de inmunoglobulina humana reordenada única está unida operativamente a una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina no humana es una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina endógena. En un aspecto, el animal no humano carece de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenada funcional. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina está en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógeno.

En un aspecto, el animal comprende además en su línea germinal un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia génica de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende segmentos de Vh, Dh y Jh humanos unidos operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia génica de región constante de cadena pesada no humana. En un aspecto, la secuencia génica de región constante de cadena pesada no humana es una secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógena. En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno.

En un aspecto, la sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina se encuentra en la secuencia de nucleótidos que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR). En un aspecto, la sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina se encuentra en la secuencia de nucleótidos que codifica una CDR3. En un aspecto, la sustitución es de uno, dos, tres, cuatro o más codones de CDR3. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprendida en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina deriva de un segmento del gen Vk1-39 o Vk3-20 humano. En un aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de una secuencia del gen Vk1-39/Jk5 o Vk3-20/Jk1 reordenada. En un aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de una secuencia del gen Vk1-39/Jk5 reordenada, y la secuencia del gen Vk1-39/Jk5 comprende un reemplazo de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina diseñado para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de los mismos. En otro aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de una secuencia del gen Vk3-20/Jk1 reordenada, y la secuencia del gen Vk3-20/Jk1 comprende un reemplazo de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina diseñado para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el animal no humano descrito en el presente documento, comprende una población de linfocitos B en respuesta a un antígeno de interés que está enriquecido para anticuerpos que muestran una disminución en la semivida disociativa (t1/2) a un pH ácido en comparación con un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En un aspecto, la disminución en t i/2 a un pH ácido en comparación con un pH neutro es de aproximadamente 30 veces o más.

En un aspecto, el animal expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana con una sustitución de al menos un resto no histidina con un resto de histidina en una posición de aminoácido codificada por el al menos un codón sustituido en la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, el animal expresa un anticuerpo que conserva una sustitución de al menos un resto de no histidina con un resto de histidina en un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana expresado, a pesar de las hipermutaciones somáticas.

En un aspecto, el animal no humano es un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un roedor, por ejemplo, una rata o un ratón. En un aspecto, el animal no humano es un ratón. Por lo tanto, en un aspecto, también se describe, en el presente documento, un ratón genéticamente modificado que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos Vl y Jl humanos, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada individual comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con una histidina. En un aspecto, el ratón carece de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenada funcional.

En un aspecto, la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada única en la línea germinal del ratón está unida operativamente a una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina se selecciona de una secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de rata o de ratón. En un aspecto, la secuencia génica de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia de ratón. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina está en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógeno.

En un aspecto adicional, el ratón también comprende en su línea germinal un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende segmentos de Vh, Dh y Jh humanos unidos operativamente a una secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto, la secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia génica de región constante de cadena pesada de rata o de ratón. En un aspecto, la secuencia génica de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia de ratón. En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina está en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno.

En un aspecto, el ratón comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina, en donde la sustitución se encuentra en la secuencia de nucleótidos que codifica una CDR. En un aspecto, la sustitución es en un codón de CDR3, por ejemplo, en uno, dos, tres, cuatro o más codones de CDR3. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina del ratón comprende la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única procedente de un segmento génico de Vk1-39 o Vk3-20 humano, por ejemplo, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada única procede de una secuencia génica de Vk1-39/Jk5 o Vk3-20/Jk1 reordenada. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada única procede de una secuencia génica de Vk1-39/Jk5 reordenada y la secuencia génica de Vk1-39/Jk5 comprende un reemplazo de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina diseñado para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de los mismos. En un aspecto, dicho reemplazo está diseñado para reemplazar las histidinas en las posiciones 105, 106, 108 y 111. En otro aspecto, dicho reemplazo está diseñado para reemplazar las histidinas en las posiciones 106, 108 y 111.

En otro aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada única deriva de una secuencia del gen Vk3-20/Jk1 reordenada, y la secuencia del gen Vk3-20/Jk1 comprende un reemplazo de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina diseñado para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de los mismos. En un aspecto, dicho reemplazo está diseñado para reemplazar las histidinas en las posiciones 105, 106, 107 y 109. En otro aspecto, dicho reemplazo está diseñado para reemplazar las histidinas en las posiciones 105, 106 y 109.

En un aspecto, el ratón descrito en el presente documento, comprende una población de linfocitos B en respuesta a un antígeno de interés que está enriquecido para anticuerpos que muestran una disminución en la semivida disociativa (t1/2) a un pH ácido en comparación con un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En un aspecto, la disminución en t i/2 a un pH ácido en comparación con un pH neutro es de aproximadamente 30 veces o más.

En un aspecto, el ratón descrito en el presente documento expresa una población de anticuerpos específicos de antígeno en respuesta a un antígeno de interés en donde todos los anticuerpos comprenden (a) dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina derivados de la misma secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina, y (b) cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden dominios variables de cadena pesada derivados de un repertorio de segmentos V, D y J de cadena pesada humana.

También se describe en el presente documento, un locus no humano, por ejemplo, locus de ratón, que comprende una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos VL y JL humanos, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina. En un aspecto, el locus está comprendido en la línea germinal de un animal no humano. En un aspecto, el locus comprende la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única derivada de un segmento del gen Vk1-39 o Vk3-20 humano, por ejemplo, derivada de una secuencia del gen Vk1-39/Jk5 o Vk3-20/Jk1 reordenada. En un aspecto, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única presente en el locus deriva de la secuencia de Vk1-39/Jk5 reordenada, la sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En otro aspecto, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única presente en el locus deriva de la secuencia de Vk3-20/Jk1 reordenada, la sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas. En diversos aspectos, los loci no humanos descritos en el presente documento, pueden generarse utilizando los métodos descritos a continuación para producir un animal no humano genéticamente modificado.

En otro aspecto más, en el presente documento se describe un método para producir un animal no humano que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina genéticamente modificado en su línea germinal, en donde el método comprende modificar un genoma de un animal no humano para eliminar o generar segmentos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina endógena no funcionales en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina, y colocar en el genoma una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina. En un aspecto, dicho método da como resultado un animal no humano genéticamente modificado que comprende una población de linfocitos B enriquecidos por anticuerpos que muestran una unión a antígeno de interés dependiente del pH. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada localizada en el genoma deriva de Vk1-39 o Vk3-20 humano, por ejemplo, una secuencia del gen Vk1-39/Jk5 o Vk3-20/Jk1 reordenada. Por lo tanto, en el aspecto en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única en el deriva de un Vk1-39/Jk5 reorganizado, la sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En un aspecto en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de un Vk3-20/Jk1 reordenado, la sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas.

En otro aspecto, en el presente documento se describe un método para generar un anticuerpo que muestra una unión a un antígeno de interés dependiente del pH que comprende (a) generar un ratón descrito en el presente documento, (por ejemplo, un ratón que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos Vl y Jl humanos y una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina en su secuencia de región variable de cadena ligera reordenada), (b) inmunizar el ratón con un antígeno de interés, y (c) seleccionar un anticuerpo que se una al antígeno de interés con una afinidad deseada a un pH neutro mientras muestra una unión reducida al antígeno a un pH ácido. En un aspecto, el método da como resultado una generación de un anticuerpo que muestra t1/2 a pH ácido y 37 °C de aproximadamente 2 minutos o menos. En un aspecto, el método da como resultado una generación de un anticuerpo que muestra una disminución en la semivida disociativa (t1/2) a un pH ácido en comparación con un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces.

En otros aspectos, en el presente documento se describen métodos adicionales para generar un anticuerpo que muestra una unión a un antígeno de interés dependiente del pH. Uno de tales métodos comprende (a) seleccionar un primer anticuerpo que se une a un antígeno de interés con una afinidad deseada, (b) modificar una secuencia de nucleótidos de cadena ligera de inmunoglobulina del primer anticuerpo para que comprenda una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina, (c) expresar una cadena pesada de inmunoglobulina del primer anticuerpo y la cadena ligera de inmunoglobulina modificada en una célula, y (d) seleccionar un segundo anticuerpo expresado en la célula que conserva una afinidad deseada por el antígeno de interés a pH neutro y presenta unión reducida al antígeno de interés a un pH ácido. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de inmunoglobulina del primer anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única. En un aspecto, el primer anticuerpo se genera en un animal no humano, por ejemplo, un ratón, comprendiendo una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina derivada de una secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única, y la modificación de la cadena ligera de inmunoglobulina se produce en la secuencia de la región variable de inmunoglobulina humana reordenada única. En un aspecto, el primer anticuerpo se genera en un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que además comprende una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina derivada de un repertorio de segmentos Vh, Dh y Jh humanos. En un aspecto, la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única se selecciona de una secuencia de los genes Vk1-39/Jk5 y Vk3-20/Jk1. En un aspecto, en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única es Vk1-39/Jk5, la modificación en la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de inmunoglobulina del primer anticuerpo se produce en el codón de CDR3 en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111, y una combinación de las mismas. En un aspecto en donde la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única es Vk3-20/Jk1, la modificación en la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de inmunoglobulina del primer anticuerpo se produce en el codón de CDR3 en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109, y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el método para generar un anticuerpo que muestra una unión a un antígeno de interés dependiente del pH descrito en el presente documento, da como resultado un anticuerpo que muestra una disminución en la semivida disociativa (t1/2) a un pH ácido en comparación con un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En un aspecto, el método de generar el anticuerpo da como resultado un anticuerpo que muestra una t-i/2 a pH ácido y 37 °C de aproximadamente 2 minutos o menos.

Se describen locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificados en el genoma de línea germinal de animales no humanos, en donde los locus de cadena pesada de inmunoglobulina comprenden una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada genéticamente modificada (por ejemplo, uno o más segmentos génicos de Vh, D y/o Jh humanos genéticamente modificados), en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada genéticamente modificada comprende al menos un codón de histidina en al menos un marco de lectura que codifica un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que comprende al menos un codón de histidina está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana o no humana (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada que codifica un isotipo de inmunoglobulina seleccionado entre IgM, IgD, IgA, IgE e IgG).

Se describen animales no humanos (mamíferos, por ejemplo, roedores, tales como ratones, ratas o hámsteres) que se diseñan genéticamente para que contengan locus genómicos de cadena pesada de inmunoglobulina en su línea germinal, en donde los locus genómicos comprenden una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada (por ejemplo, uno o más segmentos génicos Vh, D y/o Jh humanos genéticamente modificados), en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina. En diversos aspectos, el genoma de los animales no humanos comprende una modificación (i) que elimina o hace que no sean funcionales todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, D y/o Jh de inmunoglobulina endógenos (por ejemplo, mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos exógena, en el locus de inmunoglobulina o mediante una reordenación o inversión no funcional de segmentos génicos Vh, D y/o Jh endógenos); y (ii) que introduce una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada (por ejemplo, segmentos génicos Vh, D o Jh humanos genéticamente modificados), en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina. En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada está presente en un locus endógeno (es decir, donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada está ubicada en un animal no humano de tipo silvestre) o está presente de manera ectópica (por ejemplo, en un locus diferente del locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno en su genoma) o en su locus endógeno (por ejemplo, en un locus variable de inmunoglobulina, en donde el locus endógeno se coloca o mueve a una ubicación diferente en el genoma). En diversos aspectos, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana o no humana (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada que codifica un isotipo de inmunoglobulina seleccionado entre IgM, IgD, IgA, IgE e IgG).

Se describen animales no humanos genéticamente modificados que son capaces de expresar un dominio variable pesado de inmunoglobulina genéticamente modificado que comprende una o más histidinas, en donde las una o más histidinas no están codificadas por un segmento génico de línea germinal de un animal no humano de tipo silvestre correspondiente.

Se describen animales no humanos genéticamente modificados que comprenden una población de linfocitos B que se caracteriza por genes variables de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizada que codifican un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina con una o más histidinas que no están codificadas por un segmento génico de línea germinal de un animal no humano de tipo silvestre correspondiente.

Se describen métodos y composiciones para producir animales no humanos que comprenden un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado que comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada que contiene uno o más codones de histidina en al menos un marco de lectura que codifica un dominio variable de cadena pesada.

Se describen métodos y composiciones para animales no humanos que producen proteínas de unión a antígeno que muestran una unión al antígeno dependiente de pH. Se describen métodos y composiciones para producir animales no humanos que tienen poblaciones de linfocitos B o poblaciones de anticuerpos, que están enriquecidas (en comparación con animales de tipo silvestre correspondientes) con proteínas de unión a antígeno que son dependientes del pH, por ejemplo, en particular, dominios variables de cadena pesada y/o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En un aspecto, se describe un locus de inmunoglobulina genéticamente modificado en un genoma de línea germinal de un animal no humano que comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina.

En un aspecto, el animal no humano es un mamífero, incluyendo un roedor, por ejemplo, un ratón, una rata o un hámster.

En un aspecto, el codón de histidina añadido o sustituido está presente en un segmento génico de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado entre un segmento génico de Vh humano, un segmento génico D humano, un segmento génico de Jh humano y una combinación de los mismos. En un aspecto, el segmento génico de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona entre un segmento génico de Vh de línea germinal humano, un segmento génico D de línea germinal humano, un segmento génico Jh de línea germinal humano y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el segmento génico V humano (Vh) se selecciona entre el grupo que consiste en Vh1-2, Vh1-3, Vh1-8, Vh1-18, Vh1-24, Vh1-45, Vh1-46, Vh1-58, Vh1-69, Vh2-5, Vh2-26, Vh2-70, Vh3-7, Vh3-9, Vh3-11, Vh3-13, Vh3-15, Vh3-16, Vh3-20, Vh3-21, Vh3-23, Vh3-30, Vh3-30-3, Vh 3-30-5, Vh3-33, Vh3-35, Vh3-38, Vh3-43, Vh3-48, Vh3-49, Vh3-53, Vh3-64, Vh3-66, Vh3-72, Vh3-73, Vh3-74, Vh4-4, Vh4-28, Vh4-30-1, Vh4-30-2, Vh4-30-4, Vh4-31, Vh4-34, Vh4-39, Vh4-59, Vh4-61, Vh5-51, Vh6-1, Vh7-4-1, Vh7-81 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el segmento génico D se selecciona entre el grupo que consiste en D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el segmento génico J humano se selecciona entre el grupo que consiste en Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, Jh6 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el codón de histidina añadido o sustituido está presente en la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que codifica una región N-terminal, una región de bucle 4, una CDR1, una CDR2, una CDR3 o una combinación de las mismas.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, 20 o más, 21 o más, 22 o más, 23 o más, 24 o más o 25 o más, 26 o más, 27 o más, 28 o más, 29 o más, 30 o más, 31 o más, 32 o más, 33 o más, 34 o más, 35 o más, 36 o más, 37 o más, 38 o más, 39 o más, 40 o más, 41 o más, 42 o más, 43 o más, 44 o más, 45 o más, 46 o más, 47 o más, 48 o más, 49 o más, 50 o más, 51 o más, 52 o más, 53 o más, 54 o más, 55 o más, 56 o más, 57 o más, 58 o más, 59 o más, 60 o más o 61 o más de los codones de histidina.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana o no humana que codifica un isotipo de inmunoglobulina seleccionado entre IgM, IgD, IgG, IgE e IgA.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana o no humana seleccionada entre un Ch1, una bisagra, un Ch2, un Ch3 y una combinación de los mismos. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada comprende un Ch1, una bisagra, un Ch2 y un Ch3 (CH1-bisagra-CH2-CH3).

En un aspecto, una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada está presente en un locus endógeno (es decir, donde la secuencia de nucleótidos está ubicada en un animal no humano de tipo silvestre) o está presente de manera ectópica (por ejemplo, en un locus diferente del locus de cadena de inmunoglobulina endógeno en su genoma o en su locus endógeno, por ejemplo, en un locus variable de inmunoglobulina, en donde el locus endógeno se coloca o mueve a una ubicación diferente en el genoma).

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada comprende una modificación en un Ch2 o un Ch3, en donde la modificación aumenta la afinidad de una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0).

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada que comprende una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, l/r /S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un aspecto, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 2591 (por ejemplo, V259I) y una 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y una 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T, y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P), en donde la modificación aumenta la afinidad de una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0).

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de Ch2 humana que comprende al menos una modificación entre los restos de aminoácido en las posiciones 252 y 257, en donde la modificación aumenta la afinidad de la secuencia de aminoácidos de Ch2 humana por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0).

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de Ch2 humana que comprende al menos una modificación entre los restos de aminoácido en las posiciones 307 y 311, en donde la modificación aumenta la afinidad de la secuencia de aminoácidos Ch2 por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma, donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0).

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de Ch3 humana, en donde la secuencia de aminoácidos de Ch3 comprende al menos una modificación entre los restos de aminoácido en las posiciones 433 y 436, en donde la modificación aumenta la afinidad de la secuencia de aminoácidos Ch 3 por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma, donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0).

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada humana que comprende una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en M428L, N434S y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada humana que comprende una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en M428L, V259I, V308F y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada humana que comprende una mutación N434A.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada humana que comprende una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en M252Y, S254T, T256E y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada humana que comprende una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en T250Q, M248L o ambas.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada humana que comprende una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en H433K, N434Y o ambas.

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende: (1) un primer alelo, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada como se describe en el presente documento está unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada que codifica una primera secuencia de aminoácidos de CH3 de una IgG humana seleccionada entre IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas; y (2) un segundo alelo, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada como se describe en el presente documento está unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada que codifica una segunda secuencia de aminoácidos de Ch3 de una IgG humana seleccionada entre IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas y en donde la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión por la segunda secuencia de aminoácidos de CH³por la proteína A (véase, por ejemplo, el documento US 2010/0331527A1).

En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende una modificación H95R (según la numeración de exones de IMGT; H435R según la numeración de EU). En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH³comprende adicionalmente una modificación Y96F (según la numeración de exones de IMGT; H436F según la de EU). En otro aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH³comprende tanto una modificación H95R (según la numeración de exones de IMGT; H435R según la numeración de EU) como una modificación Y96F (según la numeración de exones de IMGT; H436F según la de EU).

En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 procede de una IgG1 humana modificada y comprende además una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (IMGT; D356E, L38M, N384S, K392N, V397M y V422I según EU).

En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 procede de una IgG2 humana modificada y comprende además una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en N44S, K52N y V82I (IMGT: N384S, k 392N y V422I según EU).

En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 procede de una IgG4 humana modificada y comprende además una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (IMGT: Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I según EU).

En un aspecto, la secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada es una secuencia de aminoácidos de región constante no humana y la secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada comprende uno o más de cualquiera de los tipos de modificaciones descritas anteriormente.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada es una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada humana y la secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada humana comprende uno o más de cualquiera de los tipos de modificaciones descritos anteriormente.

En un aspecto, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, D y Jh endógenos se eliminan de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina o se hacen no funcionales (por ejemplo, mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos exógena) en el locus de inmunoglobulina o mediante la reorganización no funcional o la inversión, de los segmentos Vh, D, Jh endógenos). En un aspecto, por ejemplo, aproximadamente un 80 % o más, aproximadamente un 85 % o más, aproximadamente un 90 % o más, aproximadamente un 95 % o más, aproximadamente un 96 % o más, aproximadamente un 97 % o más, aproximadamente un 98 % o más o aproximadamente un 99 % o más de todos los segmentos génicos Vh, D o Jh endógenos se eliminan o se hacen no funcionales. En un aspecto, por ejemplo, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los segmentos génicos V, D o J funcionales endógenos se eliminan o se hacen no funcionales.

En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una modificación que elimina o hace no funcionales a todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, D y Jh endógenos; y el locus genéticamente modificado comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que comprende uno o más segmentos génicos Vh, D y/o Jh humanos que tienen uno o más codones de histidina, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada está presente en una ubicación endógena (es decir, donde la secuencia de nucleótidos está ubicada en un animal no humano de tipo silvestre) o está presente ectópicamente (por ejemplo, en un locus diferente del locus de cadena de inmunoglobulina endógena en su genoma o en su locus endógeno, por ejemplo, en un locus variable de inmunoglobulina, en donde el locus endógeno se coloca o se mueve a una ubicación diferente en el genoma).

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende un gen Adam6a endógeno, un gen Adam6b o ambos y la modificación genética no afecta a la expresión y/o la función del gen Adam6b endógeno, un gen Adam6b o ambos.

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende un gen Adam6a presente ectópicamente, un gen Adam6b o ambos. En un aspecto, el gen Adam6a es un gen Adam6a no humano. En un aspecto, el gen Adam6a es un gen Adam6a humano. En un aspecto, el gen Adam6b es un gen Adam6b no humano. En un aspecto, el gen Adam6b es un gen Adam6b humano.

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende además una secuencia génica variable de cadena ligera A y/o k humana no reorganizada. En un aspecto, la secuencia génica variable de cadena ligera A y/o k no reorganizada humana está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada entre una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera A y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera k. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera A no reorganizada humana está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera A. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera A es una secuencia de ratón, rata o ser humano. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera k no reorganizada humana está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera k. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera k es una secuencia de ratón, rata o ser humano.

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una secuencia génica variable de cadena ligera no reorganizada que contiene al menos una modificación que introduce al menos un codón de histidina en al menos un marco de lectura que codifica un dominio variable de cadena ligera. En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una secuencia reorganizada (por ejemplo, secuencia de V/J A o k reorganizada) que comprende uno, dos, tres o cuatro codones para histidina en una c Dr de cadena ligera. En un aspecto, la CDR es una seleccionada entre una CDR1, CDR2, CDR3 y una combinación de las mismas. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera no reorganizada o no reorganizada es una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera A o k humana no reorganizada o no reorganizada. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera A o k humana no reorganizada o no reorganizada está presente en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógeno. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón es un locus k de ratón. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón es un locus A de ratón.

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento está presente en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de un ratón. En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado está presente en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizado en un ratón VELOCIMMUNE®.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento presenta una unión a antígeno más débil en un ambiente ácido (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) que un dominio variable de cadena pesada de tipo silvestre sin la modificación genética.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento tiene una reducción de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces en la semivida de disociación (ti/2) a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) en comparación con la semivida de disociación (t1/2) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejemplo, pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4).

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B que, tras la estimulación con un antígeno de interés, es capaz de producir proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, que comprenden un dominio variable de cadena pesada con uno o más restos de histidina. Las proteínas de unión a antígeno como se describen en el presente documento, cuando se administran a un sujeto, presentan una semivida en suero aumentada frente a una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre, que posee una secuencia de aminoácidos similar o suficientemente similar que codifica el dominio variable de cadena pesada pero que no comprende un resto de histidina en el dominio variable de cadena pesada. En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento presenta una semivida en suero aumentada que es al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces mayor que la proteína de unión a antígeno de tipo silvestre correspondiente, que posee una secuencia de aminoácidos similar o suficientemente similar que codifica el dominio variable de cadena pesada pero que no comprende un resto de histidina en el dominio variable de cadena pesada.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento se caracteriza por una reciclabilidad dependiente del pH mejorada, una semivida en suero mejorada o ambas, en comparación con una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre sin la modificación genética descrita en el presente documento.

En un aspecto, se describe un locus de inmunoglobulina genéticamente modificado en un genoma de línea germinal de un animal no humano que comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada humana comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina.

En un aspecto, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, 20 o más, 21 o más, 22 o más, 23 o más, 24 o más, 25 o más, 26 o más, 27 o más, 28 o más, 29 o más, 30 o más, 31 o más, 32 o más, 33 o más, 34 o más, 35 o más, 36 o más, 37 o más, 38 o más, 39 o más, 40 o más, 41 o más, 42 o más, 43 o más, 44 o más, 45 o más, 46 o más, 47 o más, 48 o más, 49 o más, 50 o más, 51 o más, 52 o más, 53 o más, 54 o más, 55 o más, 56 o más, 57 o más, 58 o más, 59 o más, 60 o más o 61 o más de los codones distintos de histidina endógenos se reemplazan con codones de histidina.

En un aspecto, el codón distinto de histidina endógeno codifica el aminoácido seleccionado entre Y, N, D, Q, S, W y

R.

En un aspecto, el codón distinto de histidina endógeno que se sustituye por el codón de histidina está presente en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que codifica un dominio variable de inmunoglobulina seleccionado entre una región N-terminal, una región de bucle 4, una CDR1, una CDR2, una CDR3, una combinación de las mismas.

En un aspecto, el codón de histidina sustituido está presente en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada entre una CDR1, una CDR2, una CDR3 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el codón de histidina sustituido está presente en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada que codifica una región marco (FR) seleccionada entre FR1, FR2, FR3, FR4 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende un segmento génico Vh humano genéticamente modificado, en donde uno o más codones distintos de histidina endógenos en al menos un marco de lectura del segmento génico de VH humano se ha reemplazado con un codón de histidina.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno de un segmento génico Vh humano con un codón de histidina, en donde el segmento génico Vh humano se selecciona entre el grupo que consiste en Vh1-2,

Vh1-3, Vh1-8, Vh1-18, Vh1-24, Vh1-45, Vh1-46, Vh1-58, Vh1-69, Vh2-5, Vh2-26, Vh2-70, Vh3-7, Vh3-9, Vh3-11, Vh3-13, Vh3-15, Vh3-16, Vh3-20, Vh3-21, Vh3-23, Vh3-30, Vh3-30-3, Vh 3-30-5, Vh3-33, Vh3-35, Vh3-38, Vh3-43, Vh3-48,

Vh3-49, Vh3-53, Vh3-64, Vh3-66, Vh3-72, Vh3-73, Vh3-74, Vh4-4, Vh4-28, Vh4-30-1, Vh4-30-2, Vh4-30-4, Vh4-31, Vh4-34, Vh4-39, Vh4-59, Vh4-61, Vh5-51, Vh6-1, Vh7-4-1, Vh7-81 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada comprende un segmento génico Jh humano genéticamente modificado, en donde uno o más codones distintos de histidina endógenos en al menos un marco de lectura del segmento génico de JH humano se ha reemplazado con un codón de histidina.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno de un segmento JH humano con un codón de histidina, en donde el segmento génico Jh humano se selecciona entre el grupo que consiste en Jh1, Jh2,

JH3, JH4, JH5, JH6 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el codón de histidina sustituido está presente en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada que codifica parte de una CDR3. En un aspecto, la parte de CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos procedente de un marco de lectura de un segmento génico D humano genéticamente modificado que comprende una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en el marco de lectura con un codón de histidina.

En un aspecto, el codón distinto de histidina endógeno que se sustituye con un codón de histidina codifica el aminoácido seleccionado entre Y, N, D, Q, S, W y R.

En un aspecto, el codón de histidina sustituido está presente en al menos un marco de lectura del segmento génico D humano que se observa con mayor frecuencia en ratones con inmunoglobulina humanizada VELOCIMMUNE®.

En un aspecto, el marco de lectura del segmento génico D genéticamente modificado que codifica parte de la CDR3 se selecciona entre un marco hidrófobo, un marco de parada y un marco hidrófilo.

En un aspecto, el marco de lectura es un marco hidrófobo de un segmento génico D humano.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D1-1 (GTTGT; SEQ ID NO: 88),

D1-7 (GITGT; SEQ ID NO: 89), D1-20 (GITGT; SEQ ID NO: 89) y D1-26 (GIVGAT; SEQ ID NO: 90) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D2-2 (DIWVPAAI; SEQ ID NO: 92), D2-8 (DIVLMVYAI; SEQ ID NO: 94), D2-15 (DIVVVVAAT; SEQ ID NO: 95) y D2-21 (HIWVTAI; SEQ ID NO: 97) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D3-3 (ITIFGVVII; SEQ ID NO: 98), D3-9 (ITIF*LVM; SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100), D3-10 (ITMVRGVII; SEQ ID NO: 101), D3-16 (IMITFGGVIVI; SEQ ID n O: 102) y D3-22 (ITMIVVVIT; SEQ ID NO: 103) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D4-4 (TTVT; SEQ ID NO: 105), D4-11 (TTVT; SEQ ID NO: 105), D4-17 (TTVT; SEQ ID NO: 105), D4-23 (TTVVT; SEQ ID NO: 106) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D5-5 (VDTAMV; SEQ ID NO: 107), D5-12 (VDIVATI; SEQ ID NO: 108), D5-18 (VDTAMV; SEQ ID NO: 107) y D5-24 (VEMATI; SEQ ID NO: 109) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D6-6 (SIAAR; SEQ ID NO: 111), D6-13 (GIAAAG; SEQ ID NO: 113) y D6-19 (GIAVAG; SEQ ID NO: 115) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófobo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica D7-27 (LTG) humano y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco de lectura es un marco de lectura de parada de un segmento génico D.

En un aspecto, el marco de lectura de parada del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D1-1 (VQLER; SEQ ID NO: 8), D1-7(V*LEL), D1-20(V*LER), D1-26 (V*WELL; SEQ ID NO: 12) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco de lectura de parada del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D2-2 (RIL**YQLLY; SEQ ID NO: 14), D2-8 (RILY*WCMLY; SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17), D2-15 (RIL*WW*LLL) y D2-21 (SILWW*LLF; SEQ ID NO: 19) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco de lectura de parada del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D3-3 (VLRFLEWLLY; SEQ ID NO: 21), D3-9 (VLRYFDWLL*; SEQ ID NO: 23), D3-10 (VLLWFGELL*; SEQ ID NO: 25), D3-16 (VL*LRLGELSLY; SEQ ID NO: 27) y D3-22 (VLL***WLLL; SEQ ID NO: 29) y el segmento génico D humano comprende una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco de lectura de parada del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D4-4 (*LQ*L), D4-11 (*LQ*L), D4-17 (*LR*L) y D4-23 (*LRW*L) y el segmento génico D humano comprende una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco de lectura de parada del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D5-5 (WIQLWL; SEQ ID NO: 35); D5-12 (WI*WLRL; SEQ ID NO: 37), D5-18 (WIQLWL; SEQ ID NO: 35) y D5-24 (*RWLQL; SEQ ID NO: 39) y el segmento génico D humano comprende una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco de lectura de parada del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D6-6 (V*QLV), D6-13 (V*QQLV; SEQ ID NO: 41) y D6-19 (V*QWLV; SEQ ID NO: 43) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco de lectura de parada del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica D7-27 (*LG) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno del segmento génico D humano en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco de lectura es un marco hidrófilo de un segmento génico D humano.

En un aspecto, el marco hidrófilo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D1-1 (YNWND; SEQ ID NO: 45), D1-7 (YNWNY; SEQ ID NO: 47), D1-20 (YNWND; SEQ ID NO: 45) y D1-26 (YSGSYY; SEQ ID NO: 49) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina. En un aspecto, el marco hidrófilo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el marco hidrófilo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D2-2 (GYCSSTSCYT; SEQ ID NO: 51), D2-8 (GYCTNGVCYT; SEQ ID NO: 53), D2-15 (GYCSGGSCYS; SEQ ID NO: 55) y D2-21 (AYCGGDCYS; SEQ ID NO: 57) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina. En un aspecto, el marco hidrófilo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el marco hidrófilo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D3-3 (YYDFWSGYYT; SEQ ID NO: 59), D3-9 (YYDILTGYYN; SEQ ID NO: 61), D3-10 (YYYGSGSYYN; SEQ ID NO: 63), D3-16 (YYDYVWGSYRYT; SEQ ID NO: 65) y D3-22 (YYYDSSGYYY; s Eq ID n O: 67) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina. En un aspecto, el marco hidrófilo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el marco hidrófilo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D4-4 (DYSNY; SEQ ID NO: 69), D4-11 (DYSNY; SEQ ID NO: 69), D4-17 (DYGDY; SEQ ID NO: 71) y D4-23 (DYGGNS; SEQ ID NO:73) y el segmento génico D humano comprende una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina. En un aspecto, el marco hidrófilo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el marco hidrófilo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D5-5 (GYSYGY; SEQ ID NO: 75), D5-12 (GYSGYDY; SEQ ID NO: 77), D5-18 (GYSYGY; SEQ ID NO: 75) y D5-24 (RDGYNY; SEQ ID NO: 79) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina. En un aspecto, el marco hidrófilo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el marco hidrófilo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D6-6 (EYSSSS; SEQ ID NO: 81), D6-13 (GYSSSWY; SEQ ID NO: 83) y D6-19 (GYSSGWY; SEQ ID NO: 85) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina. En un aspecto, el marco hidrófilo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 76 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, en marco hidrófilo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica D7-27 (NWG) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófilo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada que comprende una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, l/r /S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un aspecto, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 259I (por ejemplo, V259I) y una 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y una 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T, y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P), en donde la modificación aumenta la afinidad de una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0).

En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende una modificación H95R (según la numeración de exones de IMGT; H435R según la numeración de EU). En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende adicionalmente una modificación Y96F (según la numeración de exones de IMGT; H436F según la de EU). En otro aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH³comprende tanto una modificación H95R (según la numeración de exones de IMGT; H435R según la numeración de EU) como una modificación Y96F (según la numeración de exones de IMGT; H436F según la de EU).

En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH³procede de una IgG1 humana modificada y comprende además una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (IMGT; D356E, L38M, N384S, K392N, V397M y V422I según EU).

En un aspecto, el locus genéticamente modificado comprende una modificación que elimina o hace no funcional a todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, D y Jh endógenos; y el locus genómico comprende la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada genéticamente modificada que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina endógeno por un codón de histidina en al menos un marco de lectura. En un aspecto, la secuencia génica variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada genéticamente modificada está presente en una ubicación endógena (es decir, donde se ubica la secuencia de nucleótidos en un animal no humano de tipo silvestre) o está presente ectópicamente (por ejemplo, en un locus diferente del locus de cadena de inmunoglobulina endógeno en su genoma o en su locus genómico, por ejemplo, en un locus variable de inmunoglobulina, en donde el locus endógeno se coloca o se mueve a una ubicación diferente en el genoma).

En un aspecto, el locus genéticamente modificado comprende un gen Adam6a endógeno, un gen Adam6b o ambos y la modificación genética no afecta a la expresión y/o la función del gen Adam6b endógeno, un gen Adam6b o ambos.

En un aspecto, el locus genéticamente modificado comprende un gen Adam6a presente ectópicamente, un gen Adam6b o ambos. En un aspecto, el gen Adam6a es un gen Adam6a no humano. En un aspecto, el gen Adam6a es un gen Adam6a de ratón. En un aspecto, el gen Adam6a es un gen Adam6a humano. En un aspecto, el gen Adam6b es un gen Adam6b no humano. En un aspecto, el gen Adam6b es un gen Adam6b de ratón. En un aspecto, el gen Adam6b es un gen Adam6b humano.

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una secuencia génica variable de cadena ligera no reorganizada que contiene al menos una modificación que introduce al menos un codón de histidina en al menos un marco de lectura que codifica un dominio variable de cadena ligera. En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una secuencia reorganizada (por ejemplo, una secuencia de V/J A o k reorganizada) que comprende uno, dos, tres o cuatro codones para histidina en una CDR de cadena ligera. En un aspecto, la CDR es una seleccionada entre una CDR1, CDR2, CDR3 y una combinación de las mismas. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera no reorganizada o no reorganizada es una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera A o k humana no reorganizada o no reorganizada. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera A o k humana no reorganizada o no reorganizada está presente en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógeno. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón es un locus k de ratón. En un aspecto, el locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón es un locus A de ratón.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento presenta una unión a antígeno más débil en un ambiente ácido (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) que un dominio variable de cadena pesada de tipo silvestre sin la modificación genética descrita en el presente documento.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresada por el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento tiene al menos 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces de reducción en la semivida de disociación (ti/2) a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) en comparación con la semivida de disociación (ti/2) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejemplo, pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4).

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento se caracteriza por una reciclabilidad dependiente del pH mejorada, una semivida en suero mejorada o ambas, en comparación con una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre sin la modificación genética.

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B que, tras la estimulación con un antígeno de interés, es capaz de producir proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, que comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende uno o más restos de histidina. Las proteínas de unión a antígeno como se describen en el presente documento, cuando se administran a un sujeto, presentan una semivida en suero aumentada frente a una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre, que posee una secuencia de aminoácidos similar o suficientemente similar que codifica el dominio variable de cadena pesada pero que no comprende un resto de histidina en el dominio variable de cadena pesada. En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento presenta una semivida en suero aumentada que es al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces mayor que la proteína de unión a antígeno de tipo silvestre correspondiente, que posee una secuencia de aminoácidos similar o suficientemente similar que codifica el dominio variable de cadena pesada pero que no comprende un resto de histidina en el dominio variable de cadena pesada.

En un aspecto, se describe un locus de inmunoglobulina genéticamente modificado de un animal no humano que comprende un segmento génico Vh, D y Jh humano, en donde al menos uno del segmento génico D humano se ha invertido de 5' a 3' con respecto a una secuencia de tipo silvestre correspondiente y en donde al menos un marco de lectura del segmento génico D humano invertido comprende un codón de histidina.

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado está presente en un genoma de línea germinal.

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado codifica un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende uno o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, 20 o más, 21 o más, 22 o más, 23 o más, 24 o más, 25 o más, 26 o más, 27 o más, 28 o más, 29 o más, 30 o más, 31 o más, 32 o más, 33 o más o 34 o más restos de histidina.

En un aspecto, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos catorce, al menos quince, al menos dieciséis, al menos diecisiete, al menos dieciocho, al menos diecinueve, al menos veinte, al menos veintiuno, al menos veintidós, al menos veintitrés, al menos veinticuatro o todos o sustancialmente todos los segmentos D humanos funcionales tienen orientación invertida con respecto a las secuencias de tipo silvestre correspondientes.

En un aspecto, todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, D y Jh de inmunoglobulina endógenos se eliminan del locus de cadena pesada de inmunoglobulina o se hacen no funcionales (por ejemplo, mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, secuencia de nucleótidos exógena, en el locus de inmunoglobulina o mediante una reordenación no funcional o inversión de todos o sustancialmente todos los segmentos Vh, D, Jh de inmunoglobulina endógenos) y el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende segmentos génicos Vh, D y Jh humanos, en donde al menos uno del segmento D humano está presente en una orientación invertida con respecto a una secuencia de tipo silvestre correspondiente y en donde al menos un marco de lectura en el segmento génico D humano invertido comprende al menos un codón de histidina.

En un aspecto, el segmento D humano invertido está unido operativamente a un segmento génico Vh humano y/o a un segmento génico Jh humano.

En un aspecto, el segmento génico D que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente se selecciona entre el grupo que consiste en D1-1, D1-7, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-5, D5-12, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D7-27 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento génico D humano que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente es un segmento génico D1 seleccionado entre el grupo que consiste en D1-1, D1-7, D1-20, D1-26 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento D humano que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente es un segmento génico D2 seleccionado entre el grupo que consiste en D2-2, D2-8, D2-15, D2-21 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento génico D humano que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente es un segmento génico D3 seleccionado entre el grupo que consiste en D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento génico D humano que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente es un segmento génico D4 seleccionado entre el grupo que consiste en D4-4, D4-11, D4-17, D4-23 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento génico D humano que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente es un segmento génico D5 seleccionado entre el grupo que consiste en D5-5, D5-12, D5-18, D5-24 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento génico D humano que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente es un segmento génico D6 seleccionado entre el grupo que consiste en D6-6, D6-13, D6-19 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento génico D humano que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente es D7-27.

En un aspecto, el marco de lectura del segmento génico D humano se selecciona entre un marco de lectura de parada, un marco de lectura hidrófilo y un marco de lectura hidrófobo y al menos un marco de lectura del segmento génico D humano invertido comprende un codón de histidina.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que comprende el segmento génico D humano invertido está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana o no humana que codifica un isotipo de inmunoglobulina seleccionado entre IgM, IgD, IgG, IgE e IgA.

En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una modificación que elimina o hace no funcionales a todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, D y Jh endógenos; y el locus genéticamente modificado comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que comprende al menos un segmento génico D humano invertido como se describe en el presente documento, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada está presente en una ubicación endógena (es decir, donde la secuencia de nucleótidos está ubicada en un animal no humano de tipo silvestre) o está presente ectópicamente (por ejemplo, en un locus diferente del locus de cadena de inmunoglobulina endógena en su genoma o en su locus endógeno, por ejemplo, en un locus variable de inmunoglobulina, en donde el locus endógeno se coloca o se mueve a una ubicación diferente en el genoma).

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende un gen Adam6a presente ectópicamente, un gen Adam6b o ambos. En un aspecto, el gen Adam6a es un gen Adam6a no humano. En un aspecto, el gen Adam6a es un gen Adam6a de ratón. En un aspecto, el gen Adam6a es un gen Adam6a humano. En un aspecto, el gen Adam6b es un gen Adam6b no humano. En un aspecto, el gen Adam6b es un gen Adam6b de ratón. En un aspecto, el gen Adam6b es un gen Adam6b humano.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (ti/2) de menos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresada por el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento tiene al menos 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces de reducción en la semivida de disociación (t1/2) a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) en comparación con la semivida de disociación (ti/2) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejemplo, pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4).

En un aspecto, se describe un animal no humano que comprende en su genoma de línea germinal un locus de inmunoglobulina genéticamente modificado que comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina.

En un aspecto, el segmento génico Vh humano se selecciona entre el grupo que consiste en Vh1-2, Vh1-3, Vh1-8, Vh1-18, Vh1-24, Vh1-45, Vh1-46, Vh1-58, Vh1-69, Vh2-5, Vh2-26, Vh2-70, Vh3-7, Vh3-9, Vh3-11, Vh3-13, Vh3-15, Vh3-16, Vh3-20, Vh3-21, Vh3-23, Vh3-30, Vh3-30-3, Vh 3-30-5, Vh3-33, Vh3-35, Vh3-38, Vh3-43, Vh3-48, Vh3-49, Vh3-53, Vh3-64, Vh3-66, Vh3-72, Vh3-73, Vh3-74, Vh4-4, Vh4-28, Vh4-30-1, Vh4-30-2, Vh4-30-4, Vh4-31, Vh4-34, Vh4-39, Vh4-59, Vh4-61, Vh5-51, Vh6-1, Vh7-4-1, Vh7-81 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el segmento génico D se selecciona entre el grupo que consiste en D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento génico Jh humano se selecciona entre el grupo que consiste en Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, Jh6 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada está presente en una ubicación endógena (es decir, donde la secuencia de nucleótidos está ubicada en un animal no humano de tipo silvestre) o está presente ectópicamente (por ejemplo, en un locus diferente del locus de cadena de inmunoglobulina endógena en su genoma o en su locus endógeno, por ejemplo, en un locus variable de inmunoglobulina, en donde el locus endógeno se coloca o se mueve a una ubicación diferente en el genoma).

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende: (1) un primer alelo, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada como se describe en el presente documento está unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada que codifica una primera secuencia de aminoácidos de CH3 de una IgG humana seleccionada entre IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas; y (2) un segundo alelo, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizada como se describe en el presente documento está unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada que codifica una segunda secuencia de aminoácidos de Ch3 de una IgG humana seleccionada entre IgG1, IgG2, IgG4 y una combinación de las mismas y en donde la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión por la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 por la proteína A (véase, por ejemplo, el documento US 2010/0331527A1).

En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una modificación que elimina o hace no funcionales a todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, D y Jh endógenos; y el locus genéticamente modificado comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que comprende uno o más segmentos génicos Vh, D y/o Jh humanos que tienen uno o más codones de histidina, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada está presente en una ubicación endógena (es decir, donde la secuencia de nucleótidos está ubicada en un animal no humano de tipo silvestre) o está presente de manera ectópica (por ejemplo, en un locus diferente del locus de cadena de inmunoglobulina endógeno en su genoma o en su locus endógeno, por ejemplo, en un locus variable de inmunoglobulina, en donde el locus endógeno se coloca o mueve a una ubicación diferente en el genoma).

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento está presente en un locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina de un ratón. En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado está presente en un lo cus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum anizado en un ratón V E L O C IM M U N E ® .

En un aspecto, el anim al no hum ano e s heterocigoto para el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificada y el anim al no hum ano e s ca p a z de e x p re sa r un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina que com prende al m enos un resto de histidina obtenido predom inantem ente del locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificada com o se d escrib e en el presente docum ento.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento presenta una unión a antígeno m ás débil en un am biente ácido (por ejemplo, a un pH de aproxim adam ente 5,5 a aproxim adam ente 6,0) que un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de tipo silvestre sin la m odificación genética.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2 ) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d a por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento tiene al m enos 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 3 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 4 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 25 v e c e s o al m enos aproxim adam ente 30 v e c e s de reducción en la sem ivid a de d isociación (t1/2) a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6 ,0) en com paración con la sem ivid a de d isociación (ti/2 ) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 7,0 a aproxim adam ente 7,4).

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento se caracteriza por una reciclabilidad dependiente del pH m ejorada, una sem ivid a en su ero m ejorada o am bas, en com paración con una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre sin la m odificación genética.

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado descrito en el presente docum ento com prende una población de linfocitos B que, tras la estim ulación con un antígeno de interés, es ca p a z de producir proteínas de unión a antígeno, por ejem plo, anticuerpos, que com prenden un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a que com prende uno o m ás restos de histidina. Las proteínas de unión a antígeno com o se d escrib en en el presente docum ento, cuan do se adm inistran a un sujeto, presentan una sem ivid a en su ero aum entada frente a una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre, que p osee una se cu e n cia de am ino ácid os sim ilar o suficientem ente sim ilar que codifica el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a pero que no com prende un resto de histidina en el dom inio variab le de ca d e n a pesada. En algu n os aspecto s, la proteína de unión a antígeno descrita en el presente docum ento presenta una sem ivid a en suero aum entada que e s al m enos aproxim adam ente 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e c e s m ayor que la proteína de unión a antígeno de tipo silvestre correspondiente, que p o se e una s e cu e n cia de am ino ácid os sim ilar o suficientem ente sim ilar que codifica el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a pero que no com prende un resto de histidina en el dom inio variab le de ca d e n a pesada.

En un aspecto, se d escrib e un anim al no hum ano que com prende un locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado, en donde el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificada com prende una s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana no reorganizada, en donde la se c u e n c ia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a no reo rgan izad a hum ana com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina.

En un aspecto, el anim al no hum ano e s un m am ífero, incluyendo un roedor, por ejem plo, un ratón, una rata o un hámster.

En un aspecto, 2 o más, 3 o m ás, 4 o más, 5 o m ás, 6 o más, 7 o m ás, 8 o m ás, 9 o más, 10 o m ás, 11 o m ás, 12 o más, 13 o m ás, 14 o más, 15 o m ás, 16 o m ás, 17 o m ás, 18 o m ás, 19 o m ás, 20 o m ás, 21 o m ás, 22 o m ás, 23 o más, 24 o m ás, 25 o más, 26 o m ás, 27 o m ás, 28 o m ás, 29 o m ás, 30 o m ás, 31 o m ás, 32 o m ás, 33 o m ás, 34 o más, 35 o más, 36 o más, 37 o más, 38 o más, 39 o más, 40 o más, 41 o más, 42 o más, 43 o más, 44 o más, 45 o más, 46 o más, 47 o más, 48 o más, 49 o más, 50 o más, 51 o más, 52 o más, 53 o más, 54 o más, 55 o más, 56 o más, 57 o más, 58 o más, 59 o más, 60 o más o 61 o más de los codones distintos de histidina endógenos se reemplazan con codones de histidina.

R.

En un aspecto, el codón de histidina sustituido está presente en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que codifica un dominio variable de inmunoglobulina seleccionado entre una región

N-terminal, una región de bucle 4, una CDR1, una CDR2, una CDR3, una combinación de las mismas.

JH3, JH4, JH5, JH6 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D2-2 (DIVVVPAAI; SEQ ID NO: 92), D2-8 (DIVLMVYAI; SEQ ID NO: 94), D2-15 (DIVVVVAAT; SEQ ID NO: 95) y D2-21 (HIVVVTAI; SEQ ID NO: 97) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D3-3 (ITIFGVVII; SEQ ID NO: 98), D3-9 (ITIF*LVII; SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100), D3-10 (ITMVRGVII; SEQ ID NO: 101), D3-16 (IMITFGGVIVI; SEQ ID n O: 102) y D3-22 (ITMIVVVIT; SEQ ID NO: 103) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D6-6 (SI AAR; SEQ ID NO: 111), D6-13 (GIAAAG; SEQ ID NO: 113) y D6-19 (GIAVAG; SEQ ID No : 115) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de CH2 humana que comprende al menos una modificación entre los restos de aminoácido en las posiciones 252 y 257, en donde la modificación aumenta la afinidad de la secuencia de aminoácidos de CH2 humana por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6 ,0).

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de CH2 humana que comprende al menos una modificación entre los restos de aminoácido en las posiciones 307 y 311, en donde la modificación aumenta la afinidad de la secuencia de aminoácidos Ch2 por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma, donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6 ,0).

En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende una modificación H95R (según la numeración de exones de IMGT; H435R según la numeración de EU). En un aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende adicionalmente una modificación Y96F (según la numeración de exones de IMGT; H436F según la de EU). En otro aspecto, la segunda secuencia de aminoácidos de CH3 comprende tanto una modificación H95R (según la numeración de exones de IMGT; H435R según la numeración de EU) como una modificación Y96F (según la numeración de exones de IMGT; H436F según la de EU).

En un aspecto, el locus genéticamente modificado comprende una modificación que elimina o hace no funcional a todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, D y Jh endógenos; y el locus genómico comprende la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada genéticamente modificada que com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina endógeno por un codón de histidina en al m enos un m arco de lectura. En un aspecto, la s e cu e n cia g énica variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina no reo rgan izad a genéticam ente m odificada está presente en una ubicación end ógena (e s decir, donde se ubica la se cu e n cia de nucleótidos en un anim al no hum ano de tipo silvestre) o está presente ectópicam ente (por ejemplo, en un locus diferente del locus de ca d e n a de inm unoglobulina endógeno en su genom a o en su locus genóm ico, por ejem plo, en un locus v ariab le de inm unoglobulina, en donde el locus endógeno se co lo ca o se m ueve a una ubicación diferente en el genom a).

En un aspecto, el locus genéticam ente m odificado com prende un gen A dam 6 a endógeno, un gen A dam 6b o am bos y la m odificación genética no afecta a la e xpresió n y/o la función del gen A dam 6b endógeno, un gen A dam 6b o am bos.

En un aspecto, el locus genéticam ente m odificado com prende un gen A dam 6 a presente ectópicam ente, un gen A dam 6b o am bos. En un aspecto, el gen A dam 6a es un gen A dam 6 a no hum ano. En un aspecto, el gen A dam 6 a es un gen A dam 6 a de ratón. En un aspecto, el gen A dam 6 a e s un gen A dam 6 a hum ano. En un aspecto, el gen A dam 6b e s un gen A dam 6b no hum ano. En un aspecto, el gen A dam 6b e s un gen A dam 6b de ratón. En un aspecto, el gen A dam 6b e s un gen A dam 6b hum ano.

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende ad e m á s una s e cu e n cia génica variab le de ca d e n a ligera A y/o k hum ana no reorganizada. En un aspecto, la s e cu e n cia g énica variab le de ca d e n a ligera A y/o k no reo rgan izad a hum ana está unida operativam ente a una se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera de inm unoglobulina se le ccio n a d a entre una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera A y una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera k. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera A no reo rgan izad a hum ana está unida operativam ente a una se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera A. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera A e s una se cu e n cia de ratón, rata o se r hum ano. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera k no reo rgan izad a hum ana está unida operativam ente a una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera k. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera k es una s e cu e n cia de ratón, rata o s e r hum ano.

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende una s e cu e n cia g énica variab le de ca d e n a ligera no reo rgan izad a que contiene al m enos una m odificación que introduce al m enos un codón de histidina en al m enos un m arco de lectura que codifica un dom inio variab le de ca d e n a ligera. En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende una s e cu e n cia reo rgan izad a (por ejemplo, una s e cu e n cia de V /J A o k reo rgan izad a) que com prende uno, dos, tres o cuatro co d o n es para histidina en una C D R de ca d e n a ligera. En un aspecto, la C D R e s una se le ccio n a d a entre una C D R 1, C D R 2 , C D R 3 y una com binación de las m ism as. En un aspecto, la se c u e n c ia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera no reo rgan izad a o no reo rgan izad a e s una s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera A o k hum ana no reo rgan izad a o no reorganizada. En un aspecto, la se c u e n c ia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera A o k hum ana no reo rgan izad a o no reo rgan izad a está presente en un locus de ca d e n a ligera de inm unoglobulina de ratón endógeno. En un aspecto, el locus de ca d e n a ligera de inm unoglobulina de ratón es un locus k de ratón. En un aspecto, el locus de ca d e n a ligera de inm unoglobulina de ratón e s un locus A de ratón.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d a por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento tiene al m enos 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 3 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 4 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 25 v e c e s o al m enos aproxim adam ente 30 v e c e s de reducción en la sem ivid a de d isociación (t1/2) a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6 ,0) en com paración con la sem ivid a de d isociación (ti/2 ) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 7,0 a aproxim adam ente 7,4).

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado descrito en el presente docum ento com prende una población de linfocitos B que, tras la estim ulación con un antígeno de interés, es ca p a z de producir proteínas de unión a antígeno, por ejem plo, anticuerpos, que com prenden un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a que com prende uno o m ás restos de histidina. Las proteínas de unión a antígeno com o se d escrib en en el presente docum ento, cuan do se adm inistran a un sujeto, presentan una sem ivid a en su ero aum entada frente a una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre, que p osee una se cu e n cia de am ino ácid os sim ilar o suficientem ente sim ilar que codifica el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a pero que no com prende un resto de histidina en el dom inio variab le de ca d e n a pesada. En alg u n o s aspecto s, la proteína de unión a antígeno descrita en el presente docum ento presenta una sem ivid a en suero aum entada que e s al m enos aproxim adam ente 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e c e s m ayor que la proteína de unión a antígeno de tipo silvestre correspondiente, que p o se e una s e cu e n cia de am ino ácid os sim ilar o suficientem ente sim ilar que codifica el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a pero que no com prende un resto de histidina en el dom inio variab le de ca d e n a pesada.

En un aspecto, el anim al no hum ano e s heterocigoto para el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificada y el anim al no hum ano e s ca p a z de e xp re sa r el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina que com prende al m enos un resto de histidina obtenido predom inantem ente del locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificada com o se d escrib e en el presente docum ento.

En un aspecto, se d escrib e un anim al no hum ano que com prende un locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado que com prende un segm ento génico V h, D y J h hum ano, en donde al m enos uno del segm ento génico D hum ano se ha invertido de 5' a 3' con respecto a una se cu e n cia de tipo silvestre correspondiente y en donde al m enos un m arco de lectura del segm ento génico D hum ano invertido com prende un codón de histidina.

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado está presente en un genom a de línea germ inal. En un aspecto, en donde el m arco de lectura del segm ento génico D hum ano invertido com prende uno o m ás, 2 o más, 3 o m ás, 4 o m ás, 5 o m ás, 6 o m ás, 7 o m ás, 8 o más, 9 o m ás, 10 o m ás, 11 o m ás, 12 o m ás, 13 o m ás, 14 o más, 15 o m ás, 16 o más, 17 o m ás, 18 o m ás, 19 o más, 20 o m ás, 21 o m ás, 22 o m ás, 23 o m ás, 24 o m ás, 25 o más, 26 o m ás, 27 o m ás, 28 o m ás, 29 o m ás, 30 o m ás, 31 o m ás, 32 o m ás, 33 o m ás o 34 o m ás de los cod on es de histidina.

En un aspecto, al m enos dos, al m enos tres, al m enos cuatro, al m enos cinco, al m enos seis, al m enos siete, al m enos ocho, al m enos nueve, al m enos diez, al m enos once, al m enos doce, al m enos trece, al m enos catorce, al m enos quince, al m enos d iecisé is, al m enos diecisiete, al m enos dieciocho, al m enos d iecinueve, al m enos veinte, al m enos veintiuno, al m enos veintidós, al m enos veintitrés, al m enos veinticuatro o todos o sustancialm en te todos los segm ento s D hum anos fu ncio nale s tienen orientación invertida con respecto a las s e c u e n c ia s de tipo silvestre correspondientes. En un aspecto, todos o su stancialm en te todos los segm en to s gé nico s V h, D y J h de inm unoglobulina end ó g e n o s se elim inan del locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina o se hacen no fu ncio nale s (por ejem plo, m ediante la inserción de una se cu e n cia de nucleótidos, por ejem plo, s e cu e n cia de nucleótidos exógena, en el locus de inm unoglobulina o m ediante una reordenación no funcional o inversión de todos o sustancialm en te todos los segm en to s V h, D, J h de inm unoglobulina end ó g e n o s) y el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende segm ento s g énicos V h, D y J h hum anos, en donde al m enos uno del segm ento D hum ano está presente en una orientación invertida con respecto a s e c u e n c ia s de tipo silvestre correspon dientes y en donde al m enos un m arco de lectura del segm ento génico D hum ano invertido com prende al m enos un codón de histidina.

En un aspecto, el segm ento D hum ano invertido está unido operativam ente a un segm ento génico V h hum ano y/o a un segm ento génico J h hum ano.

En un aspecto, el segm ento génico D que está presente en la orientación invertida en relación con una s e cu e n cia de tipo silvestre correspondiente se se le cc io n a entre el grupo que con siste en D 1-1, D 1-7, D 1-20, D 1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D 2-21, D 3-3, D3-9, D 3-10, D 3-16, D 3-22, D4-4, D 4-11, D 4 -17, D 4-23, D5-5, D 5-12, D 5-18, D5-24, D6-6, D 6-13, D6-19, D 7 -27 y una com binación de las m ism as.

En un aspecto, el segm ento génico D hum ano que está presente en la orientación invertida en relación con una s e cu e n cia de tipo silvestre correspondiente e s un segm ento génico D1 sele ccio n ad o entre el grupo que con siste en D 1-1, D 1-7, D 1-20, D 1-26 y una com binación de las m ism as.

En un aspecto, el segm ento génico D hum ano que está presente en la orientación invertida en relación con se c u e n c ia s de tipo silvestre co rrespon dientes e s un segm ento génico D2 sele ccio n ad o entre el grupo que con siste en D2-2, D2-8, D 2-15, D2-21 y una com binación de las m ism as.

En un aspecto, el segm ento génico D hum ano que está presente en la orientación invertida en relación con una s e cu e n cia de tipo silvestre correspondiente e s un segm ento génico D 3 sele ccio n ad o entre el grupo que con siste en D 3-3, D3-9, D 3-10, D 3-16, D 3-22 y una com binación de las m ism as.

En un aspecto, el segm ento génico D hum ano que está presente en la orientación invertida en relación con una s e cu e n cia de tipo silvestre correspondiente e s un segm ento génico D4 sele ccio n ad o entre el grupo que con siste en D4-4, D 4 -11, D 4 -17, D 4 -23 y una com binación de las m ism as.

En un aspecto, el segm ento génico D hum ano que está presente en la orientación invertida en relación con una s e cu e n cia de tipo silvestre correspondiente e s un segm ento génico D 5 sele ccio n ad o entre el grupo que con siste en D 5-5, D 5-12, D 5-18, D 5-24 y una com binación de las m ism as.

En un aspecto, el segm ento génico D hum ano que está presente en la orientación invertida en relación con una s e cu e n cia de tipo silvestre correspondiente e s un segm ento génico D6 sele ccio n ad o entre el grupo que con siste en D6-6, D 6 -13, D 6 -19 y una com binación de las m ism as.

En un aspecto, el segm ento génico D hum ano que está presente en la orientación invertida en relación con una s e cu e n cia de tipo silvestre correspondiente e s D 7-27.

En un aspecto, el m arco de lectura del segm ento génico D hum ano se se le ccio n a entre un m arco de lectura de parada, un m arco de lectura hidrófilo, un m arco de lectura hidrófobo y una com binación de los m ism os, en donde al m enos un m arco de lectura del segm ento génico D hum ano invertido com prende un codón de histidina.

En un aspecto, la se cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a no reo rgan izad a que com prende el segm ento génico D hum ano invertido está unida operativam ente a una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a hum ana o no hum ana que codifica un isotipo de inm unoglobulina sele ccio n ad o entre IgM, IgD, IgG, IgE e IgA.

En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rganizad a está unida operativam ente a una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a hum ana o no hum ana se le ccio n a d a entre un C h1, una bisagra, un C h2, un C h3 y una com binación de los m ism os. En un aspecto, la se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a com prende un C h1, una bisagra, un C h2 y un C h3 (CH 1-bisagra-CH 2-CH 3).

En un aspecto, una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a está presente en una ubicación end ógena (e s decir, donde la s e cu e n cia de nucleótidos está u b icad a en un anim al no hum ano de tipo silvestre) o está presente ectópicam ente (por ejem plo, en un locus diferente del locus de ca d e n a de inm unoglobulina end ógena en su genom a o en su locus endógeno, por ejem plo, en un locus variab le de inm unoglobulina, en donde el locus endógeno se co loca o se m ueve a una ubicación diferente en el genom a).

En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a com prende una m odificación en un C h2 o un C h3, en donde la m odificación aum enta la afinidad de una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a p e sa d a por F c R n en un am biente ácido (por ejem plo, en un e nd osom a donde el pH v a ría de aproxim adam ente 5,5 a aproxim adam ente 6,0).

En un aspecto, la se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a codifica una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a p e sa d a que com prende una m odificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejem plo, L o F); 252 (por ejem plo, L /Y /F /W o T), 254 (por ejem plo, S o T ) y 256 (por ejemplo, S /R /Q /E /D o T); o una m odificación en la posición 428 y/o 433 (por ejem plo, l / r /S /P /Q o K) y/o 434 (por ejem plo, H /F o Y); o una m odificación en la posición 250 y/o 428; o una m odificación en la posición 307 o 308 (por ejem plo, 308F , V 308 F ) y 434. En un aspecto, la m odificación com prende una m odificación 428 L (por ejem plo, M 428L) y 434 S (por ejem plo, N 434S ); una m odificación 428L, 259I (por ejem plo, V 259 I) y una 308 F (por ejem plo, V 308 F ); una m odificación 433 K (por ejem plo, H 433 K ) y una 434 (por ejem plo, 434 Y ); una m odificación 252, 254 y 256 (por ejem plo, 252Y , 254T, y 256 E ); una m odificación 250 Q y 428 L (por ejem plo, T 250 Q y M 428L); y una m odificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P), en donde la modificación aumenta la afinidad de una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0).

En un aspecto, la se g u n d a s e cu e n cia de am ino ácid os de C H 3 procede de una IgG 2 hum ana m odificada y com prende ad e m á s una m utación se le ccio n a d a entre el grupo que con siste en N 44S, K52N y V 82I (IM G T : N 384S, k 392N y V422I seg ú n EU).

En un aspecto, la se g u n d a s e cu e n cia de am ino ácid os de C H 3 procede de una IgG 4 hum ana m odificada y com prende ad e m á s una m utación se le ccio n a d a entre el grupo que con siste en Q 15 R , N44S, K52N , V 57M , R 69K , E 79 Q y V82I (IM G T: Q 355 R , N 384 S , K 392N , V 397M , R 409K , E 419 Q y V 422 I segú n EU).

En un aspecto, la s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a p e sa d a e s una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante no hum ana y la s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a p e sa d a com prende uno o m ás de cu alq u ie ra de los tipos de m odificaciones d escrita s anteriorm ente.

En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a e s una se cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a p e sa d a hum ana y la s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a p e sa d a hum ana com prende uno o m ás de cu alq u ie ra de los tipos de m odificaciones descrito s anteriorm ente.

En un aspecto, todos o sustancialm en te todos los segm en to s g é n ico s V h, D y J h end ó g e no s se elim inan de un locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina o se hacen no fu ncio nale s (por ejem plo, m ediante la inserción de una se cu e n cia de nucleótidos (por ejemplo, una s e cu e n cia de nucleótidos e xó g en a) en el locus de inm unoglobulina o m ediante la reorganización no funcional o la inversión, de los segm ento s V h, D, J h end ógenos). En un aspecto, por ejemplo, aproxim adam ente un 80 % o m ás, aproxim adam ente un 85 % o m ás, aproxim adam ente un 90 % o más, aproxim adam ente un 95 % o m ás, aproxim adam ente un 96 % o m ás, aproxim adam ente un 97 % o más, aproxim adam ente un 98 % o m ás o aproxim adam ente un 99 % o m ás de todos los segm ento s gé nico s V h, D o J h end ó g e no s se elim inan o se hacen no funcio nales. En un aspecto, por ejem plo, al m enos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los segm en to s gé nico s V, D o J fu ncio nale s end ó g e no s se elim inan o se hacen no funcionales.

En un aspecto, el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende una m odificación que elim ina o h ace no fu ncio nale s a todos o sustancialm ente todos los segm ento s gé nico s V h, D y J h endógenos; y el locus genéticam ente m odificado com prende una s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a no reo rganizad a que com prende al m enos un segm ento génico D hum ano invertido com o se d escrib e en el presente docum ento, en donde la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a no reo rgan izad a está presente en una ubicación e nd ógena (e s decir, donde la s e cu e n cia de nucleótidos está ubicada en un anim al no hum ano de tipo silvestre) o está presente ectópicam ente (por ejem plo, en un locus diferente del locus de ca d e n a de inm unoglobulina end ógena en su genom a o en su locus endógeno, por ejem plo, en un locus variab le de inm unoglobulina, en donde el locus end ógeno se co lo ca o m ueve a una ubicación diferente en el genom a).

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende un gen A dam 6 a endógeno, un gen A dam 6 b o am bos y la m odificación genética no afecta a la expresió n y/o la función del gen A dam 6 b endógeno, un gen A dam 6 b o am bos.

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende un gen A dam 6 a presente ectópicam ente, un gen A dam 6 b o am bos. En un aspecto, el gen A dam 6 a e s un gen A dam 6 a no hum ano. En un aspecto, el gen A dam 6 a es un gen A dam 6 a de ratón. En un aspecto, el gen A dam 6 a e s un gen A dam 6 a hum ano. En un aspecto, el gen A dam 6 b e s un gen A dam 6 b no hum ano. En un aspecto, el gen A d a m 6 b e s un gen A dam 6 b de ratón. En un aspecto, el gen A dam 6 b e s un gen A dam 6 b hum ano.

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende ad e m á s una s e cu e n cia génica variab le de ca d e n a ligera A y/o k hum ana no reorganizada. En un aspecto, la s e cu e n cia g énica variab le de ca d e n a ligera A y/o k no reo rgan izad a hum ana está unida operativam ente a una se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera de inm unoglobulina se le ccio n a d a entre una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera A y una se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera k . En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera A no reo rgan izad a hum ana está unida operativam ente a una se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera A. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera A e s una se cu e n cia de ratón, rata o se r hum ano. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera k no reo rgan izad a hum ana está unida operativam ente a una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera k . En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera k es una s e cu e n cia de ratón, rata o s e r hum ano.

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende una s e cu e n cia g énica variab le de ca d e n a ligera no reo rgan izad a que contiene al m enos una m odificación que introduce al m enos un codón de histidina en al m enos un m arco de lectura que codifica un dom inio variab le de ca d e n a ligera. En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende una s e cu e n cia reo rgan izad a (por ejemplo, una s e cu e n cia de V /J A o k reo rgan izad a) que com prende uno, dos, tres o cuatro co d o n es para histidina en una C D R de ca d e n a ligera. En un aspecto, la C D R e s una se le ccio n a d a entre una C D R 1, C D R 2 , C D R 3 y una com binación de las m ism as. En un aspecto, la se c u e n c ia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera no reo rgan izad a o no reo rgan izad a e s una se cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera A o k hum ana no reo rgan izad a o no reorganizada. En un aspecto, la se c u e n c ia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera A o k hum ana no reo rgan izad a o no reo rganizad a está presente en un locus de ca d e n a ligera de inm unoglobulina de ratón endógeno. En un aspecto, el locus de ca d e n a ligera de inm unoglobulina de ratón es un locus k de ratón. En un aspecto, el locus de ca d e n a ligera de inm unoglobulina de ratón e s un locus A de ratón.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento presenta una unión a antígeno m ás débil en un am biente ácido (por ejemplo, a un pH de aproxim adam ente 5,5 a aproxim adam ente 6,0) que un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de tipo silvestre sin la m odificación genética. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2 ) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d a por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento tiene al m enos 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 3 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 4 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 25 v e c e s o al m enos aproxim adam ente 30 v e c e s de reducción en la sem ivid a de d isociación (t1/2) a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6 ,0) en com paración con la sem ivid a de d isociación (t1/2) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 7,0 a aproxim adam ente 7,4).

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o s e d escrib e en el presente docum ento se caracteriza por una reciclabilidad dependiente del pH m ejorada, una sem ivid a en su ero m ejorada o am bas, en com paración con una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre sin la m odificación genética.

En un aspecto, se d escrib e un anim al no hum ano que e s ca p a z de e xp re sa r una proteína de unión a antígeno con reciclabilidad dependiente de pH m ejorada y/o sem ivid a en su ero m ejorada, en donde el anim al com prende en su genom a de línea germ inal una se cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina, en donde la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a no reo rgan izad a com prende una adición de al m enos un codón de histidina o una sustitución de al m enos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina com o se d escrib e en el presente docum ento.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento presenta una unión a antígeno m ás débil en un am biente ácido (por ejem plo, a un pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) que un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de tipo silvestre sin la m odificación genética. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2 ) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d a por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento tiene al m enos 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 3 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 4 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 25 v e c e s o al m enos aproxim adam ente 30 v e c e s de reducción en la sem ivid a de d isociación (t1/2) a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6 ,0) en com paración con la sem ivid a de d isociación (ti/2 ) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 7,0 a aproxim adam ente 7,4).

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento se caracteriza por una reciclabilidad dependiente del pH m ejorada, una sem ivid a en su ero m ejorada o am bas, en com paración con una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre sin la m odificación genética.

En un aspecto, se d escrib e una construcción de direccionam iento, que com prende b razos de direccionam iento 5' y 3' hom ólogos a una región D genóm ica o a una región V y J genóm ica de un anim al no hum ano, en donde al m enos un segm ento génico V h, D o J h com prende cu alq u ie ra de las m odificaciones com o se describ en en el presente docum ento, por ejem plo, una adición de al m enos un codón de histidina, una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina endógeno en un codón de histidina y/o la inversión de al m enos un segm ento génico D funcional con respecto a una s e cu e n cia de tipo silvestre correspondiente.

En un aspecto, se d escrib e un hibridom a o cuadrom a que se deriva de una célula de cu alq u ie ra de los an im ales no hum ano s com o se describ en en el presente docum ento. En un aspecto, el anim al no hum ano e s un roedor, por ejem plo, un ratón, una rata o un hám ster.

En un aspecto, se d escrib en cé lu las m adre pluripotentes, pluripotentes ind u cid as o totipotentes procedentes de un anim al no hum ano que com prenden las d iv e rsa s m odificaciones g e n ó m icas de la invención descrita. En un aspecto específico , las cé lu las m adre pluripotentes, pluripotentes ind ucid as o totipotentes son cé lu la s m adre em brionarias (E S ) de ratón o rata. En un aspecto, las cé lu la s m adre pluripotentes, pluripotentes ind u cid as o totipotentes tienen un cariotipo X X o un cariotipo X Y . En un aspecto, las cé lu la s m adre pluripotentes o pluripotentes ind u cid as son cé lu las m adre hem atopoyéticas.

En un aspecto, tam bién se d escrib en cé lu la s que com prenden un núcleo que contiene una m odificación genética com o se describe en el presente documento, por ejemplo, una modificación introducida en una célula mediante inyección pronuclear. En un aspecto, las células madre pluripotentes, pluripotentes inducidas o totipotentes comprenden un locus genómico de inmunoglobulina genéticamente modificado, en donde el locus genómico comprende, de 5' a 3', (1) un sitio de recombinación de FRT, (2) segmentos génicos V^hhumanos, (3) un gen adam6 de ratón, (4) un sitio de recombinación de IoxP, (5) segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina, (6) segmentos génicos J^hhumanos, seguido de (7) un Ej (potenciador intrónico) de ratón y (8) una secuencia de nucleótidos de región constante de IgM de ratón.

En un aspecto, se describe un linfocito aislado de un animal no humano genéticamente modificado como se describe en el presente documento. En un aspecto, el linfocito es un linfocito B, en donde el linfocito B comprende un locus genómico de inmunoglobulina que comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada, en donde la secuencia génica variable de cadena pesada no reorganizada comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón distinto de histidina endógeno por un codón de histidina.

En un aspecto, se describe un linfocito aislado de un animal no humano genéticamente modificado como se describe en el presente documento. En un aspecto, el linfocito es un linfocito B, en donde el linfocito B comprende un locus de inmunoglobulina que comprende un segmento génico V, D y J humano, en donde al menos uno del segmento D humano se ha invertido de 5' a 3' con respecto a las secuencias de tipo silvestre y en donde al menos un marco de lectura del segmento génico D humano invertido codifica al menos un resto de histidina. En un aspecto, el linfocito B es capaz de producir una proteína de unión a antígeno que comprende el dominio variable de cadena pesada genéticamente modificado como se describe en el presente documento. En un aspecto, el dominio variable de cadena pesada genéticamente modificado como se describe en el presente documento está unido operativamente a una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada.

En un aspecto, se describe una población de linfocitos B que son capaces de expresar una proteína de unión a antígeno, en donde la proteína de unión a antígeno comprende al menos un resto de histidina en un dominio variable de cadena pesada, en donde la población de linfocitos B comprende cualquiera de las modificaciones genéticas como se describen en el presente documento. En un aspecto, el al menos un resto de histidina está presente en una CDR de cadena pesada. En un aspecto, la CDR es una seleccionada entre una CDR1, CDR2, CDR3 y una combinación de las mismas. En un aspecto, el al menos un resto de histidina está presente en la CDR3.

En un aspecto, se describe una población de linfocitos B que son capaces de expresar una proteína de unión a antígeno con semivida en suero mejorada y/o reciclabilidad dependiente de pH mejorada, en donde la población de linfocitos B comprende cualquiera de las modificaciones genéticas como se describen en el presente documento.

En un aspecto, se describe un método para producir un animal no humano que comprende un locus variable de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificada, que comprende:

(a) modificar un genoma de un animal no humano para eliminar o hacer no funcionales los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos (por ejemplo, mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos exógena, en el locus de inmunoglobulina o mediante la reorganización o inversión no funcional de segmentos Vh, D, Jh endógenos); y

(b) colocar en el genoma una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina como se describe en el presente documento.

En un aspecto, el codón distinto de histidina endógeno codifica el aminoácido seleccionado entre Y, N, D, Q, S, W y R.

En un aspecto, el codón de histidina añadido o sustituido está presente en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que codifica un dominio variable de inmunoglobulina seleccionado entre una región N-terminal, una región de bucle 4, una CDR1, una CDR2, una CDR3, una combinación de las mismas.

En un aspecto, el codón de histidina añadido o sustituido está presente en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que codifica una región determinante de la complementariedad (CDR) seleccionada entre una CDR1, una CDR2, una CDR3 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el codón de histidina añadido o sustituido está presente en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada que codifica una región marco (FR) seleccionada entre FR1, FR2, FR3, FR4 y una combinación de las mismas.

JH3, JH4, JH5, JH6 y una combinación de los mismos.

En un aspecto, el codón de histidina añadido o sustituido está presente en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada que codifica parte de una CDR3. En un aspecto, la parte de CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos procedente de un marco de lectura de un segmento génico D humano genéticamente modificado que comprende una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en el marco de lectura con un codón de histidina.

En un aspecto, el codón de histidina añadido o sustituido está presente en al menos un marco de lectura del segmento génico D humano que se observa con mayor frecuencia en ratones con inmunoglobulina humanizada VELOCIMMUNE®.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D2-2 (DIVVVPAAI; SEQ ID NO:

92), D2-8 (DIVLMVYAI; SEQ ID NO: 94), D2-15 (DIVVVVAAT; SEQ ID NO: 95) y D2-21 (HIVVVTAI; SEQ ID NO: 97) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón distinto de histidina endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el marco hidrófobo del segmento génico D humano comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en D3-3 (ITIFGVVII; SEQ ID NO: 98),

D3-9 (ITIF*LVII; SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100), D3-10 (ITMVRGVII; SEQ ID NO: 101), D3-16 (IMITFGGVIVI; SEQ

ID n O: 102) y D3-22 (ITMIVVVIT; SEQ ID NO: 103) y el segmento génico D humano comprende además una modificación que reemplaza al menos un codón endógeno en la secuencia de nucleótidos por un codón de histidina.

En un aspecto, el locus genéticamente modificado comprende un gen Adam6a endógeno, un gen Adam6b o ambos y la m odificación genética no afecta a la e xpresió n y/o la función del gen A dam 6b endógeno, un gen A dam 6b o am bos. En un aspecto, el locus genéticam ente m odificado com prende un gen A dam 6 a presente ectópicam ente, un gen A dam 6b o am bos. En un aspecto, el gen A dam 6a es un gen A dam 6 a no hum ano. En un aspecto, el gen A dam 6 a es un gen A dam 6 a de ratón. En un aspecto, el gen A dam 6 a e s un gen A dam 6 a hum ano. En un aspecto, el gen A dam 6b e s un gen A dam 6b no hum ano. En un aspecto, el gen A dam 6b e s un gen A dam 6b de ratón. En un aspecto, el gen A dam 6b e s un gen A dam 6b hum ano.

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende ad e m á s una s e cu e n cia génica variab le de ca d e n a ligera A y/o k hum ana no reorganizada. En un aspecto, la se c u e n c ia g énica variab le de ca d e n a ligera A y/o k no reo rgan izad a hum ana está unida operativam ente a una se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera de inm unoglobulina se le ccio n a d a entre una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera A y una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera k. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera A no reo rgan izad a hum ana está unida operativam ente a una se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera A. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera A e s una se cu e n cia de ratón, rata o se r hum ano. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera k no reo rgan izad a hum ana está unida operativam ente a una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera k. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a ligera k es una s e cu e n cia de ratón, rata o s e r hum ano.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento presenta una unión a antígeno m ás débil en un am biente ácido (por ejemplo, a un pH de aproxim adam ente 5,5 a aproxim adam ente 6,0) que un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de tipo silvestre sin la m odificación genética. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d a por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento tiene al m enos 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 3 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 4 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 25 v e c e s o al m enos aproxim adam ente 30 v e c e s de reducción en la sem ivid a de d isociación (t1/2) a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6 ,0) en com paración con la sem ivid a de d isociación (ti/2) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 7,0 a aproxim adam ente 7,4).

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento se caracteriza por una reciclabilidad dependiente del pH mejorada, una semivida en suero mejorada o ambas, en comparación con una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre sin la modificación genética.

(a) modificar un genoma de un animal no humano para eliminar o hacer no funcionales los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos (por ejemplo, mediante la inserción de una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos exógena) en el locus de inmunoglobulina o mediante reorganización no funcional o inversión de segmentos Vh, D, Jh endógenos); y

(b) colocar en el genoma un segmento génico Vh, D y Jh humano, en donde al menos uno del segmento génico D humano se ha invertido de 5' a 3' con respecto a una secuencia de tipo silvestre correspondiente y en donde al menos un marco de lectura del segmento génico D humano invertido comprende un codón de histidina.

En un aspecto, el segmento génico D humano que está presente en la orientación invertida en relación con las secuencias de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que consiste en D1-1, D1-7, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-5, D5-12, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D7-27 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento génico D humano que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente es un segmento génico D2 seleccionado entre el grupo que consiste en D2-2, D2-8, D2-15, D2-21 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el segmento génico D humano que está presente en la orientación invertida en relación con una secuencia de tipo silvestre correspondiente es un segmento génico D6 seleccionado entre el grupo que consiste en D6-6 , D6-13, D6-19 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el marco de lectura del segmento génico D humano se selecciona entre un marco de lectura de parada, un marco de lectura hidrófilo, un marco de lectura hidrófobo y una combinación de los mismos.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de Ch2 humana que comprende al menos una modificación entre los restos de aminoácido en las posiciones 307 y 311, en donde la modificación aumenta la afinidad de la secuencia de aminoácidos Ch 2 por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma, donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6 ,0).

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada codifica una secuencia de aminoácidos de C3 humana, en donde la secuencia de aminoácidos de CH3 comprende al menos una modificación entre los restos de aminoácido en las posiciones 433 y 436, en donde la modificación aumenta la afinidad de la secuencia de aminoácidos CH 3 por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma, donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0).

En un aspecto, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una modificación que elimina o hace no funcionales a todos o sustancialmente todos los segmentos génicos Vh, D y Jh endógenos; y el locus genéticamente modificado comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que comprende al menos un segmento génico D humano invertido como se describe en el presente documento, en donde la secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada está presente en una ubicación endógena (es decir, donde la secuencia de nucleótidos está ubicada en un animal no humano de tipo silvestre) o está presente ectópicamente (por ejemplo, en un locus diferente del locus de cadena de inmunoglobulina endógena en su genoma o en su locus endógeno, por ejemplo, en un locus variable de inmunoglobulina, en donde el locus endógeno se coloca o mueve a una ubicación diferente en el genoma).

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento está presente en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de un ratón. En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado está presente en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina hum anizado en un ratón V E L O C IM M U N E ® .

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a exp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento presenta una unión a antígeno m ás débil en un am biente ácido (por ejemplo, a un pH de aproxim adam ente 5,5 a aproxim adam ente 6,0) que un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de tipo silvestre sin la m odificación genética. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (ti/2 ) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d a por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento tiene al m enos 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 3 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 4 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 25 v e c e s o al m enos aproxim adam ente 30 v e c e s de reducción en la sem ivid a de d isociación (t1/2) a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6 ,0) en com paración con la sem ivid a de d isociación (ti/2 ) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 7,0 a aproxim adam ente 7,4).

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a exp re sa d o por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento se caracteriza por una reciclabilidad dependiente del pH m ejorada, una sem ivid a en su ero m ejorada o am bas, en com paración con una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre sin la m odificación genética.

En un aspecto, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado descrito en el presente docum ento com prende una población de linfocitos B enriqu ecid a que, tras la estim ulación con un antígeno de interés, es ca p a z de producir proteínas de unión a antígeno, por ejem plo, anticuerpos, que com prenden un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a que com prende uno o m ás restos de histidina. L a s proteínas de unión a antígeno com o se d escrib en en el presente docum ento, cuan do se adm inistran a un sujeto, presentan una sem ivid a en suero aum entada frente a una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre, que p o se e una s e cu e n cia de am ino ácid os sim ilar o suficientem ente sim ilar que codifica el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a pero que no com prende un resto de histidina en el dom inio variab le de ca d e n a pesada. En alg u n o s aspecto s, la proteína de unión a antígeno d escrita en el presente docum ento presenta una sem ivid a en suero aum entada que es al m enos aproxim adam ente 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e c e s m ayor que la proteína de unión a antígeno de tipo silvestre correspondiente, que p osee una s e cu e n cia de am ino ácid os sim ilar o suficientem ente sim ilar que codifica el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a pero que no com prende un resto de histidina en el dom inio variab le de ca d e n a pesada.

En un aspecto, se d escrib e un método para producir un anim al no hum ano que es ca p a z de producir un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina con sem ivid a en su ero m ejorada y/o reciclabilidad dependiente de pH m ejorada, que com prende (a ) m odificar un genom a de un anim al no hum ano para elim inar o h a cer no fu ncio nales los segm en to s g é n ico s V, D y J de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina end ó g e n o s (por ejem plo, m ediante la inserción de una s e cu e n cia de nucleótidos (por ejem plo, una s e cu e n cia de nucleótidos e xó g en a) en el locus de inm unoglobulina o m ediante reorganización no funcional o inversión de segm en to s V h, D, J h endógenos); y (b) co lo car en el genom a una se cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana no reorganizada, en donde la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a no reo rgan izad a com prende una adición de al m enos un codón de histidina o una sustitución de al m enos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina y en donde una proteína de unión a antígeno que com prende el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina producido por el anim al no hum ano m uestra sem ivid a en su ero m ejorada y/o reciclabilidad dependiente de pH m ejorada en com paración con un dom inio de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina de tipo silvestre.

En un aspecto, el anim al no hum ano, tras entrar en contacto con el antígeno, puede producir una población enriquecid a de repertorio de linfocitos B que e xp re sa una proteína de unión a antígeno con sem ivid a en su ero m ejorada y/o reciclabilidad dependiente de pH m ejorada, en donde la población de linfocitos B enriqu ecid a com prende cualq u iera de las m odificaciones g enéticas com o se d escrib en en el presente docum ento.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno producida por el anim al no hum ano genéticam ente m odificado se caracteriza por una afinidad suficiente a un antígeno de interés a un pH neutro (por ejemplo, pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4) y una disociación mejorada del anticuerpo de un complejo de antígeno-proteína de unión a antígeno a un pH inferior al pH neutro (por ejemplo, a un pH endosómico, por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a 6 ,0).

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (t i/2) de menos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (t1/2) de menos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (t1/2) de menos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresado por el locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado tiene una semivida de disociación (t1/2) de menos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada expresada por el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento tiene al menos 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces de reducción en la semivida de disociación (t1/2) a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0) en comparación con la semivida de disociación (t i/2) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejemplo, pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4).

En un aspecto, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B enriquecida que, tras la estimulación con un antígeno de interés, es capaz de producir proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, que comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende uno o más restos de histidina. Las proteínas de unión a antígeno como se describen en el presente documento, cuando se administran a un sujeto, presentan una semivida en suero aumentada frente a una proteína de unión a antígeno de tipo silvestre, que posee una secuencia de aminoácidos similar o suficientemente similar que codifica el dominio variable de cadena pesada pero que no comprende un resto de histidina en el dominio variable de cadena pesada. En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno descrita en el presente documento presenta una semivida en suero aumentada que es al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces mayor que la proteína de unión a antígeno de tipo silvestre correspondiente, que posee una secuencia de aminoácidos similar o suficientemente similar que codifica el dominio variable de cadena pesada pero que no comprende un resto de histidina en el dominio variable de cadena pesada.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a un antígeno de interés con una afinidad (Kd) menor de 10-6, 10-7, 10-8, 10 9, 10-10, 10-11 y 10-12 a un pH neutro (pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4).

En un aspecto, se describe un método para obtener una proteína de unión a antígeno con reciclabilidad mejorada y/o semivida en suero mejorada, que comprende: (a) inmunizar a un animal no humano que tiene un locus de inmunoglobulina genéticamente modificado como se describe en el presente documento, en donde el animal no humano comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que comprende una adición de al menos un codón de histidina o una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina; (b) permitir que el animal no humano arme una respuesta inmunitaria; (c) recoger un linfocito (por ejemplo, un linfocito B) del animal no humano inmunizado; (d) fusionar el linfocito con una célula de mieloma para formar una célula de hibridoma y (e) obtener una proteína de unión a antígeno producida por la célula de hibridoma, en donde la proteína de unión a antígeno presenta una reciclabilidad y/o estabilidad en suero mejoradas.

En un aspecto, se describe un locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado obtenible mediante cualquiera de los métodos como se describen en el presente documento.

En un aspecto, se describe un animal no humano genéticamente modificado obtenible mediante cualquiera de los métodos como se describen en el presente documento.

En diversos aspectos, el animal no humano es un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un roedor, por ejemplo, un ratón, una rata o un hámster.

En diversos aspectos, los locus de inmunoglobulina genéticamente modificados como se describen en el presente documento están presentes en el genoma de línea germinal de un animal no humano, por ejemplo, un mamífero, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón, una rata o un hámster.

Breve descripción de los dibujos

Las FIG. 1A y 1B ilustran las secuencias de aminoácidos codificadas por los tres marcos de lectura (es decir, marcos de lectura de parada, hidrófilo e hidrófobo) de segmentos génicos D humanos (D) y las secuencias de aminoácidos codificadas por los tres marcos de lectura de segmentos génicos D humanos (HD) sustituidos con histidina. La introducción de codones de histidina (indicados en negrita) en el marco de lectura hidrófilo también cambió muchos codones de parada en el marco de lectura de parada a codones de Ser (indicados en negrita) pero introdujo pocos cambios en el marco de lectura hidrófobo. El símbolo "*" representa un codón de parada y la coma entre las dos SEQ ID NO indica que hay dos secuencias de aminoácidos separadas por el codón de parada. La FIG. 2 ilustra esquemas para dirigir pLMa0174 que contiene un casete de selección de espectinomicina en el extremo 5' de MAID 1116 (etapa 1. BHR (Spec)). En la etapa 1, un casete de selección de cloranfenicol, un casete de selección de neomicina, un sitio de loxP, dos segmentos génicos Vh (Ii Vh1-3 y Ii Vh1-2), el gen Adam6 humano, todos los cuales se encuentran cadena arriba de hVH6-1, se eliminaron del clon y se reemplazaron por un casete de espectinomicina para producir el clon VI433. En la etapa 2 (BHR (Hyg Spec)), pNTu0002 que contiene un casete de higromicina flanqueado por sitios de FRT se dirigió a una región que comprende segmentos génicos D de inmunoglobulina humana. Mediante la etapa 2, se eliminaron todos los segmentos génicos D humanos de VI433 y se reemplazaron por el casete de higromicina para proporcionar MAID6011 VI 434 (clon 1).

La FIG. 3 ilustra esquemas para el ensamblaje de segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina mediante ligamiento secuencial.

La FIG. 4 ilustra la introducción de segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina preensamblados que contenían un casete de neomicina en una región entre el segmento génico Vh más próximo a D (Vh 6-1) y el segmento génico Jh más próximo a D (JH1) mediante digestión mediada por enzimas (PI-SceI y I-CeuI) y ligamiento. Este proceso elimina el casete de higromicina de MAID 6011 VI434 e introduce segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina preensamblados en el clon. Se seleccionan células bacterianas que comprenden un clon dirigido con éxito basándose en la resistencia tanto a neomicina como a espectinomicina. El clon resultante (MAID6012 VI469) comprende, de 5' a 3', (1) un casete de selección de espectinomicina, (2) un brazo de 50 kb que comprende un segmento génico Vh humano (Vh 6-1), (3) un casete de neomicina flanqueado por sitios de loxP, (4) segmentos génicos D humanos que contienen sustituciones de histidina (HD 1.1-6.6 (9586pb; SEQ ID NO: 1), HD 1.7-6.13 (9268pb; SEQ ID NO: 2), HD 1.14-6.19 (9441pb; SEQ ID NO: 3) y HD 1.20-6.25, 1.26 (11592pb; SEQ ID NO: 4)), (5) aproximadamente 25 kb de una región genómica que contiene segmentos génicos Jh humanos, (6) una secuencia E| de ratón (SEQ ID NO: 5; un potenciador intrónico que promueve la reordenación de Vh a DJH en linfocitos B en desarrollo) y (7) una secuencia de nucleótidos de región constante de IgM de ratón (mlgM exón 1; SEQ ID NO: 7).

La FIG. 5 ilustra esquemas para eliminar la región génica D de cadena pesada de inmunoglobulina humana de las células ES heterocigóticas MAID 1460 dirigiendo el cromosoma procedente de la cepa 129 de MAID 1460 het con el casete de selección de higromicina en MAID 6011 VI434.

La FIG. 6 muestra una lista de cebadores y sondas usados para confirmar una pérdida de alelo (LOA), una ganancia de alelo (GOA) o un alelo precursor (Precursor) en los ensayos de exploración para identificar MAID 6011.

La FIG. 7 ilustra esquemas para la construcción de MAID 6012 het dirigiendo a células ES heterocigóticas MAID 6011 con MAID 6012 VI469. La electroporación de la construcción MAID 6012 VI469 en las células ES heterocigóticas MAID 6011 proporcionó células ES heterocigóticas MAID 6012 en las que se modifica el cromosoma procedente de la cepa 129 para que contenga, en la dirección de 5' a 3', un sitio de FRT,, segmentos génicos de Vh humanos, una región genómica de ratón que comprende genes adam6, un casete de selección de neomicina floxado, segmentos génicos D humanos que comprenden sustituciones de histidina (HD 1.1-6.6 (9586pb; SEQ ID NO: 1), HD 1.7-6.13 (9268pb; SEQ ID NO: 2), HD 1.14-6.19 (9441pb; SEQ ID NO: 3) y HD 1.20 6.25, 1.26 (11592pb; SEQ ID NO: 4)), segmentos génicos Jh humanos, una secuencia Ej de ratón (SEQ ID NO: 5; un potenciador intrónico que promueve la reordenación de Vh a DJh en linfocitos B en desarrollo) y una secuencia de nucleótidos de región constante de IgM de ratón (mlgM exón 1; SEQ ID NO: 7).

La FIG. 8 muestra una lista de cebadores y sondas usados para confirmar una pérdida de alelo (LOA), una ganancia de alelo (GOA) o un alelo precursor (Precursor) en el ensayo de exploración para identificar MAID 6012.

La FIG. 9 ilustra esquemas para eliminar un casete de neomicina de células ES heterocigotas MAID 6012. La electroporación de un plásmido que expresa Cre en las células ES MAID 6012 da lugar a la recombinación y eliminación del casete de neomicina floxado, proporcionando células ES heterocigotas MAID 6013.

Las FIG. 10A-10E ilustran secuencias de nucleótidos de segmentos génicos D humanos con traducciones para cada uno de los seis marcos de lectura, es decir, tres marcos de lectura para la orientación directa 5' a 3' y tres marcos de lectura para la orientación invertida (orientación de 3' a 5'). El símbolo "*" representa un codón de parada y la coma entre dos SEQ ID NO indica que hay dos secuencias de aminoácidos separadas por el codón de parada.

Las FIG. 11-13 ilustran secuencias de ARNm y sus secuencias de proteína codificadas expresadas por ratones heterocigotos 6013 F0, que comprenden segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina (HD 1.1-6.6 (9586pb; SEQ ID NO: 1), HD 1.7-6.13 (9268pb; SEQ ID NO: 2), HD 1.14-6.19 (9441pb; SEQ ID NO: 3) y HD 1.20 6.25, 1.26 (11592pb; SEQ ID NO: 4)) en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina en su cromosoma procedente de la cepa 129. Las secuencias recuadradas en cada figura indican la presencia de codones de histidina en las secuencias de CDR3 procedentes del locus de cadena pesada de inmunoglobulina genéticamente modificado que comprende los segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina. FWR representa la región marco y CDR representa la región determinante de la complementariedad. En el alineamiento, el punto "." indica una secuencia idéntica a la secuencia de consulta y el guion "-" indica un hueco en la secuencia.

La FIG. 14 ilustra la frecuencia de incorporación de histidina en las secuencias de CDR3 de cadena pesada de inmunoglobulina. El eje X representa el número de codones de histidina que aparecen en cada secuencia de CDR3 y el eje Y representa la proporción correspondiente de lecturas. El "6013 F0 het" indica secuencias de CDR3 expresadas por ratones heterocigotos 6013 que comprenden segmentos génicos D sustituidos con histidina. El "VI3-Adam6" indica secuencias de CDR3 obtenidas de ratones de control que comprenden segmentos génicos Vh, D y Jh humanos sin la modificación de histidina como se describe en el presente documento. El "ASAP" indica secuencias de CDR3 obtenidas de la base de datos de anticuerpos de Regeneron, que se usó como otro control.

La FIG. 15 ilustra una alineación de aminoácidos de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39 humano de diversos anticuerpos específicos de antígeno (anticuerpos A-K). Los restos de histidina (H) ubicados dentro de cada secuencia de cadena ligera están en negrita. Varias regiones de cadena ligera (Marco y CDR) se indican sobre la alineación.

La FIG. 16 ilustra las combinaciones y ubicaciones de los restos de histidina diseñados genéticamente en la región CDR3 de las cadenas ligeras derivadas de Vk1-39 humano por mutagénesis. Se incluyen las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes. Los restos de histidina introducidos por mutagénesis y los correspondientes restos de ácido nucleico se muestran en negrita. Las posiciones de los aminoácidos (105, 106, etc.) se basan en una numeración única descrita en Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55-77, y también se pueden ver en www.imgt.org.

La FIG. 17 ilustra el nivel de expresión de anticuerpos en ng/ml detectado en los sobrenadantes de células CHO transfectadas con ácidos nucleicos que codifican cinco (1-5) cadenas pesadas diferentes y cadenas ligeras derivadas de Vk1-39 que tienen restos de histidina diseñados genéticamente en los lugares indicados (véase el eje Y) en la CDR3.

La FIG. 18 es una transferencia Western que muestra la expresión de anticuerpos humanos específicos de antígeno seleccionados que contienen cadenas ligeras diseñadas genéticamente con histidina en sobrenadantes de células CHO.

Las FIG. 19A-19J muestran la cinética de unión para cadenas pesadas seleccionadas de anticuerpos específicos de antígeno emparejados con varias cadenas ligeras diseñadas genéticamente con histidina a un pH neutro (7,4) y ácido (5,5).

Las FIG. 20A-20E muestran la cinética de unión para cadenas pesadas seleccionadas (1-5) de anticuerpos específicos de antígeno emparejados con varias cadenas ligeras diseñadas genéticamente con histidina a un pH neutro (7,4) y ácido (5,75). Se muestran diversos parámetros cinéticos que incluyen k^a, k^d, Kd y t1/2. NB = sin unión.

La FIG. 21 muestra los parámetros cinéticos (Kd y t1/2) para los anticuerpos que comprenden la cadena ligera universal precursora o la cadena ligera universal modificada con histidina emparejadas con las cadenas pesadas indicadas (2, 3 y 6). Las sustituciones de histidina conducen a una fuerte dependencia del pH en varios anticuerpos. Se efectuaron sustituciones con histidina en la CDR3 para convertir la secuencia 105QQSYSTP111 (SEQ ID NO: 3) en 105HHSYSTH111 (SEQ ID NO: 329). Obsérvese que NB = sin unión detectada (Kd > 10 micromolar).

La FIG. 22 muestra la secuencia y las propiedades (% de contenido de GC, N, % de desapareamiento, Tm) de los cebadores de mutagénesis seleccionados utilizados para diseñar restos de histidina en CDR3 de una secuencia de cadena ligera de Vk1-39/Jk5 humano reordenada. Las SEQ ID NO para estos cebadores utilizados en el Listado de Secuencias se incluyen en la Tabla a continuación. F= cebador directo, R= cebador inverso.

Las FIG. 23A - 23B muestran una estrategia general para la construcción de vectores de direccionamiento para el diseño de restos de histidina en una secuencia de región variable de cadena ligera humana reordenada derivada de la región variable de Vk1-39/Jk5 para producir un ratón genéticamente modificado que expresa anticuerpos que contienen la cadena ligera humana modificada. Las FIG. 23C-23D muestran la introducción del vector de direccionamiento para las sustituciones ULC-H105/106/108/111 en células ES y la generación de ratones heterocigotos a partir de los mismos; mientras que las FIG. 23E-23F muestran la introducción del vector de direccionamiento para sustituciones ULC-H106/108/111 en células ES y generación de ratones heterocigotos a partir de los mismos. Los diagramas no se presentan a escala. A menos que se indique otra cosa, las formas rellenas y las líneas continuas representan la secuencia del ratón, las formas vacías y las líneas dobles representan la secuencia humana.

La FIG. 24 muestra títulos de antisuero contra inmunógeno de ratones heterocigotos para la cadena ligera universal de histidina (HULC) (con 4 sustituciones de His-ratones HULC 1927; con 3 sustituciones de His - ratones HULC 1930) y animales de tipo silvestre en una segunda hemorragia.

La FIG. 25 es una comparación del número de clones positivos para el antígeno total y el número de clones positivos para el antígeno que muestran una unión a antígeno sensible al pH obtenidos de fusiones de hibridomas de ratones HULC (1927 frente a 1930) y TS. La figura incluye datos de dos ratones para cada tipo de ratón ("ratón 1" y "ratón 2").

Las FIG. 26A-26C muestran sensogramas de experimentos de unión de resonancia de plasmón superficial en los que se dejaron asociar anticuerpos monoclonales (AA, BB, CC, DD, HH, GG, NN y OO) de ratones heterocigotos HULC o TS con el inmunógeno a pH neutro (pH 7,4) seguido de un cambio a un tampón con un pH de 7,4 o 6,0 para la fase de disociación. Las líneas individuales en cada gráfico representan las respuestas de unión a diferentes concentraciones de los respectivos anticuerpos. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C. Los valores de semivida disociativa (t!^) se indican sobre los respectivos sensogramas y el múltiplo de cambio en la t 1^ se incluye a la derecha de cada sensograma. Los anticuerpos AA, BB, CC, DD, HH y GG procedían de ratones HULC 1927 que usan la cadena ligera sustituida con His, NN es de ratones HULC 1927 que usan cadenas ligeras de TS y OO es de un ratón TS (véase la tabla 5 para aclaración).

La FIG. 27 ilustra las posiciones de los restos de histidina diseñados genéticamente en la región CDR3 de las cadenas ligeras derivadas de Vk3-20 humano por mutagénesis. Los restos de histidina introducidos por mutagénesis y los correspondientes restos de ácido nucleico se muestran en negrita. Las posiciones de los aminoácidos (105, 106, etc.) se basan en una numeración única descrita en Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55-77, y también se pueden ver en www.imgt.org.

La FIG. 28 muestra la secuencia y las propiedades (% de contenido de GC, N, % de desapareamiento, Tm) de los cebadores de mutagénesis seleccionados utilizados para diseñar restos de histidina en CDR3 de una secuencia de cadena ligera de Vk3-20/Jk1 humano reordenada. Las SEQ ID NO para estos cebadores utilizados en el Listado de Secuencias se incluyen en la Tabla a continuación. F= cebador directo, R= cebador inverso.

Las FIG. 29A - 29B muestran una estrategia general para la construcción de vectores de direccionamiento para el diseño de restos de histidina en una secuencia de región variable de cadena ligera humana reordenada derivada de la región variable de cadena ligera de Vk3-20/Jk1 para producir un ratón genéticamente modificado que expresa anticuerpos que contienen la cadena ligera humana modificada. La FIG 29C muestra la introducción del vector de direccionamiento para las sustituciones ULC-Q105H/Q106H/Y107H/S109H en células ES y la generación de ratones heterocigotos a partir de los mismos; mientras que la FIG. 29D muestra la introducción del vector de direccionamiento para sustituciones ULC-Q105H/Q106H/S109H en células ES y generación de ratones heterocigotos a partir de los mismos. Los diagramas no se presentan a escala. A menos que se indique otra cosa, las formas rellenas y las líneas continuas representan la secuencia del ratón, las formas vacías y las líneas dobles representan la secuencia humana.

Descripción detallada

La presente invención no se limita a los métodos particulares y las condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones.

Salvo que se defina de otro modo, todos los términos y frases usados en el presente documento incluyen los significados que los términos y las frases han adquirido en la técnica, salvo que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se usa el término o frase. Aunque pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales particulares.

Definiciones

El térm ino "anticuerpo", com o se u sa en el presente docum ento, incluye m oléculas de inm unoglobulina que com prenden cuatro ca d e n a s polipeptídicas, dos c a d e n a s p e sa d a s (H ) y dos ca d e n a s ligeras (L) interconectadas por e n la c e s disulfuro. C a d a ca d e n a p e sa d a com prende un dom inio de región variab le de ca d e n a p e sa d a y una región constante de ca d e n a p e sa d a (C h). La región constante de ca d e n a p e sa d a com prende tres dom inios, C h1, C h2 y C h3. C a d a ca d e n a ligera com prende un dom inio de región variab le de ca d e n a ligera y una región constante de ca d e n a ligera ( C l). Los dom inios v a ria b le s de ca d e n a p e sa d a y ca d e n a ligera pueden su bd ivid irse adicionalm ente en regiones de hipervariabilidad, d en om inad as regiones determ inantes de la com plem entariedad (C D R ), intercalad as con regiones que están m ás co n se rvad as, d en om inad as regiones m arco (F R , de s u s s ig la s en inglés). C a d a dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a y ligera com prende tres C D R y cuatro F R , d isp u e stas d esd e el extrem o am ino hasta el extrem o carboxilo en el siguiente orden: F R 1, C D R 1, F R 2 , C D R 2 , F R 3 , C D R 3 , F R 4 (la s C D R de ca d e n a p e sa d a pueden ab revia rse com o H C D R 1, H C D R 2 y H C D R 3 ; las C D R de ca d e n a ligera pueden a b revia rse com o L C D R 1, l C d R 2 y L C D R 3. La expresió n "anticuerpo de alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una K d con respecto a su epítopo diana de aproxim adam ente 10 -9 M o inferior (por ejemplo, aproxim adam ente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproxim adam ente 1 x 10 -12 M). En un aspecto, K d se mide m ediante reso n an cia de plasm ón de superficie, por ejem plo, B IA C O R E ™ ; en otro aspecto, La K d se mide m ediante ELISA .

La fra se "anticuerpo biespecífico" incluye un anticuerpo ca p a z de unirse selectivam ente a dos o m ás epítopos. Los anticuerpos b iesp e cífico s generalm ente com prenden d os c a d e n a s p e sa d a s no idénticas, y ca d a ca d e n a p e sa d a se une esp e cíficam e nte a un epítopo diferente en d os m olécu las diferentes (por ejem plo, diferentes epítopos en dos inm unógenos diferentes) o en la m ism a m olécula (por ejem plo, diferentes epítopos en el m ism o inm unógeno). Si un anticuerpo b iespecífico e s ca p a z de unirse selectivam ente a dos epítopos diferentes (un prim er epítopo y un segund o epítopo), la afinidad de la prim era ca d e n a p e sa d a por el prim er epítopo generalm ente se rá de al m enos uno a dos o tres o cuatro o m ás órd en es de magnitud m ás baja que la afinidad de la prim era ca d e n a p e sa d a para el segund o epítopo, y v ice v e rsa . Los epítopos e specíficam ente unidos por el anticuerpo b iespecífico pueden estar en la m ism a diana o en una diana diferente (por ejem plo, en la m ism a proteína o en otra diferente). Los anticuerpos b iesp e cífico s e jem plares incluyen aq u ellos con una prim era ca d e n a p e sa d a e sp e cífica para un antígeno tum oral y una seg u n d a ca d e n a p e sa d a e sp e cífica para un m arcad or citotóxico, por ejem plo, un receptor de F c (por ejem plo, F c y RI, F c y RII, F c y RIII, etc.) o un m arcad or de linfocitos T (por ejem plo, C D 3, c D28, etc.). A dem ás, el seg u n d o dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a puede sustituirse con un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a que tenga una especificid ad d e se a d a diferente. P o r ejem plo, se puede em parejar un anticuerpo b iespecífico con una prim era ca d e n a p e sa d a e sp e cífica para un antígeno tum oral y una se g u n d a ca d e n a p e sa d a e sp e cífica para una toxina para sum inistrar una toxina (por ejem plo, saporina, alcaloide de la vinca, etc.) a una célula tum oral. O tros anticuerpos b iesp e cífico s ejem plares incluyen aq u e llo s con una prim era ca d e n a p e sa d a e sp e cífica para un receptor activador (por ejem plo, receptor de linfocitos B, F c y RI, F c y RIIA , F c y R IIIA , F c a R I, receptor de linfocitos T, etc.) y una se g u n d a ca d e n a p e sa d a e sp e cífica para un receptor inhibidor (por ejem plo, F c y R IIB , C D 5, C D 22 , C D 72 , C D 300 a , etc.). D ichos anticuerpos b iesp e cífico s pueden con struirse para afe ccio n e s terapéuticas a so c ia d a s con la activación ce lu lar (por ejem plo, alergia y asm a). S e pueden p reparar anticuerpos b iespecíficos, por ejem plo, m ediante la com binación de c a d e n a s p e sa d a s que reconocen diferentes epítopos del m ism o inm unógeno. P o r ejem plo, las se c u e n c ia s de ácid o s n u cleico s que codifican se c u e n c ia s variab le s de ca d e n a p e sa d a que reco nocen diferentes epítopos del m ism o inm unógeno pueden fu sio n a rse con s e c u e n c ia s de ácid o s n u cle ico s que codifican regiones con stan tes de la ca d e n a p e sa d a igu ales o diferentes, y d ichas s e c u e n c ia s pueden e x p re sa rse en una cé lu la que e xp re sa una ca d e n a ligera de inm unoglobulina. Un anticuerpo b iespecífico típico tiene dos c a d e n a s p e sa d a s, ca d a una con tres C D R de ca d e n a pesa d a , se g u id a s de un dom inio C h1 (N-term inal a C-term inal), una bisagra, un dom inio C h2 y un dom inio C h3, y una ca d e n a ligera de inm unoglobulina que no confiere especificid ad de unión a epítopo pero que puede a s o c ia rse con ca d a ca d e n a pesada, o que puede a so c ia rse con ca d a ca d e n a p e sa d a y que puede unirse a uno o m ás de los epítopos unidos por las regiones de unión al epítopo de la ca d e n a pesada, o que pueden a so c ia rse con ca d a ca d e n a p e sa d a y permitir la unión de una o am b as ca d e n a s p e sa d a s a uno o am b os epítopos.

El térm ino "célula" incluye cu alq u ie r célula que s e a a d e cu a d a para e xp re sa r una s e cu e n cia de ácido nucleico recom binante. L a s cé lu la s incluyen las de procariotas y eucariotas (de una so la célula o de m últiples célu las), cé lu las b acterian as (por ejemplo, ce p a s de E. coli, B acillu s spp., Streptom yces spp., etc.), cé lu las de m icobacterias, cé lu las fúngicas, cé lu la s de levad ura (por ejem plo, S. ce re visiae , S. pombe, P. pastoris, P. m ethanolica, etc.), cé lu las vegetales, cé lu la s de insecto s (por ejem plo, SF-9 , S F -21, cé lu la s de insecto s infectadas por baculovirus, T richoplusia ni, etc.), cé lu la s de an im a le s no hum anos, cé lu la s h u m anas o fu sio n e s de cé lu la s tales como, por ejemplo, hibridom as o cuadrom as. En alg u n o s aspecto s, la célula es una célula hum ana, de mono, simio, hám ster, rata o ratón. En algun os aspecto s, la célula e s eucariota y se se le cc io n a entre las sigu ien tes célu las: C H O (por ejemplo, C H O K1, D X B -11 c H o , V e g g ie-C H O ), C O S (por ejem plo, C O S -7), célula retiniana, Vero, C V 1, riñón (por ejem plo, H E K 293, 293 EBN A, M S R 293, M D CK, HaK, BH K), H eLa, H epG 2, W I38, M R C 5, Co lo205, HB 8065, HL-60, (por ejem plo, B H K 21), Jurkat, Daudi, A 431 (epidérm ica), c V - 1, U 937, 3 T 3 , célula L, célula C 127 , S P 2/0, NS-0, M M T 060562, célula de Sertoli, célula B R L 3A, célula H T 1080, célula de mieloma, célula tum oral y una lín ea ce lu lar derivad a de una célula anteriorm ente m encionada. En algu n os aspecto s, la célula com prende uno o m ás g e n e s v íricos, por ejemplo, una célula retiniana que e xp re sa un gen vírico (por ejem plo, una célula P E R .C 6 ™ ).

La expresió n "región determ inante de la com plem entariedad" o "C D R ", com o se u sa en el presente docum ento, incluye una s e cu e n cia de am ino ácid os codificada por una s e cu e n cia de ácido nucleico de unos g e n e s de inm unoglobulina de un organism o que norm alm ente (e s decir, en un anim al de tipo silvestre) a p a re ce entre dos regiones m arco en una región variable de una cadena ligera o pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de linfocitos T). Una CDR puede estar codificada por, por ejemplo, una secuencia de línea germinal o una secuencia reordenada y, por ejemplo, por un linfocito B o un linfocito T natural o maduro. Una CDR puede estar mutada somáticamente (por ejemplo, variar de una secuencia codificada en la línea germinal de un animal), humanizada y/o modificada con sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden estar codificadas por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico no reordenada) pero son contiguas en una secuencia de ácido nucleico de linfocitos B, por ejemplo, como resultado de cortar y empalmar o conectar las secuencias (por ejemplo, recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

El término "conservativa", cuando se usa para describir una sustitución conservativa de aminoácido, incluye la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R de la cadena secundaria con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de una región variable para unirse específicamente a un epítopo diana con una afinidad deseada. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales hidroxil alifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato y asparagina/glutamina. En algunos aspectos, una sustitución de aminoácidos conservativa puede ser una sustitución de cualquier resto natural en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, la mutagénesis por barrido de alanina. En algunos aspectos, se realiza una sustitución conservativa que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. En algunos aspectos, la sustitución es una sustitución moderadamente conservativa en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

En algunos aspectos, las posiciones de los restos en una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina difieren en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos aspectos, las posiciones de los restos en una cadena ligera de inmunoglobulina o un fragmento funcional de la misma (por ejemplo, un fragmento que permite la expresión y la secreción de, por ejemplo, por ejemplo, un linfocito B) no son idénticas a una cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos se enumera en el presente documento, pero difiere en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas.

La expresión "semivida de disociación" o 'W como se usa en el presente documento se refiere al valor calculado mediante la siguiente fórmula: t i ^/2(min)=(ln2/kd)/60, en donde k^d representa una constante de velocidad de disociación.

La frase "proteína de unión a epítopo" incluye una proteína que tiene al menos una CDR y que es capaz de reconocer selectivamente un epítopo, por ejemplo, es capaz de unir un epítopo con una Kd que es aproximadamente un micromolar o inferior (por ejemplo, una KD eso es alrededor de 1 x 10-6 M, 1 x 10'7 M, 1 x 10'9 M, 1 x 10'9 M, 1 x 10' 10 M, 1 x 10'11 M, o aproximadamente 1 x 10'12 M). Las proteínas de unión a epítopos terapéuticas (por ejemplo, anticuerpos terapéuticos) con frecuencia requieren una Kd que se encuentre en el intervalo nanomolar o picomolar.

El término "funcional", como se usa en el presente documento, por ejemplo, en referencia a un polipéptido funcional, incluye un polipéptido que conserva al menos una actividad biológica normalmente asociada con la proteína natural. En otro caso, un segmento génico de inmunoglobulina funcional puede incluir un segmento génico variable que es capaz de un reordenamiento productivo para generar una secuencia génica de inmunoglobulina reordenada.

La frase "fragmento funcional" incluye fragmentos de proteínas de unión a epítopo que pueden expresarse, secretarse y unirse específicamente a un epítopo con una Kd en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar. El reconocimiento específico incluye tener una Kd que esté al menos en el intervalo micromolar, el intervalo nanomolar o el intervalo picomolar.

La expresión "línea germinal", como se usa en el presente documento, en referencia a una secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina, incluye la referencia a secuencias de ácido nucleico que pueden pasarse a la descendencia.

La expresión “cadena pesada”, o "cadena pesada de inmunoglobulina" incluye una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos que se especifique otra cosa. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR y combinaciones de los mismos. Una cadena pesada típica tiene, siguiendo el dominio variable (de N-terminal a C-terminal), un dominio Ch1, una bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un epítopo (por ejemplo, reconocer el epítopo con una Kd en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresarse y secretarse a partir de una célula, y que com prende al m enos una C D R . Los dom inios va ria b le s de ca d e n a p e sa d a están codificados por s e c u e n c ia s de nucleótidos de región variable, que generalm ente com prenden segm en to s V h, Dh y J h procedentes de un repertorio de segm en to s V h, D h y J h presen tes en la lín ea germ inal. L a s se cu e n cia s, lo caliza cio n es y nom enclatura para los segm en to s de ca d e n a p e sa d a V, D y J para d iverso s o rgan ism os se pueden encontrar en la b a se de datos de IM GT, que se encuentra a c ce sib le a travé s de internet en la W orld W ide W eb (www) en la U R L "imgt.org."

El térm ino "identidad" cuan do se u sa en relación con la secu e n cia , incluye la identidad determ inada por una serie de algoritm os diferentes co n o cid o s en la técn ica que se pueden u sa r para m edir la identidad de s e cu e n cia de nucleótidos y/o am inoácidos. En alg u n o s asp e cto s descrito s en el presente docum ento, se determ inan las identidades usand o un alineam iento C lu sta lW v. 1.83 (lento) que em plea una penalizació n por apertura de hueco de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1, y que utiliza una matriz de similitud de G onnet (M A C V E C T O R ™ 10.0.2, M acV ector Inc., 2008). La longitud de las s e c u e n c ia s com p arad as con respecto a la identidad de las se c u e n c ia s d ep e nd e rá de las s e c u e n c ia s concretas, pero en el c a so de un dom inio constante de ca d e n a ligera, la longitud debe contener una se cu e n cia de longitud suficiente para p le garse en un dom inio constante de ca d e n a ligera que se a ca p a z de a so c ia rse consigo m ism o para form ar un dom inio constante de ca d e n a ligera canónico, por ejem plo, ca p a z de form ar d os lám inas beta que com prenden h ebras beta y c a p a c e s de interactuar con al m enos un dom inio C h1 de un se r hum ano o un ratón. En el ca so del dom inio C h1, la longitud de la s e cu e n cia debe contener una s e cu e n cia de longitud suficiente para p le garse en un dom inio C h1 que s e a ca p a z de form ar d os lám inas beta que com prendan c a d e n a s beta y que pueda interactuar con al m enos un dom inio constante de ca d e n a ligera de un ratón o un s e r hum ano.

La frase "m olécula de inm unoglobulina" incluye d os c a d e n a s p e sa d a s de inm unoglobulina y dos ca d e n a s ligeras de inm unoglobulina. L a s c a d e n a s p e sa d a s pueden se r idénticas o diferentes, y las c a d e n a s ligeras pueden s e r idénticas o diferentes.

La frase "cad e n a ligera" incluye una se c u e n c ia de ca d e n a ligera de inm unoglobulina de cu alq u ier organism o y, a m enos que se esp e cifiq u e otra cosa, incluye c a d e n a s ligeras kappa ( k) y lam bda (A) h u m anas y una V preB , a s í com o c a d e n a s ligeras sustitutas. Los dom inios va ria b le s de ca d e n a ligera incluyen generalm ente tres C D R de ca d e n a p e sa d a y cuatro ) regiones (F R , a m enos que se especifiq u e otra cosa. En general, una ca d e n a ligera de longitud com pleta incluye, d esd e el extrem o am ino hasta el extrem o carboxilo, un dom inio variab le que incluye F R 1 -C D R 1 -F R 2 -C D R 2 - F R 3 - C D R 3 - F R 4 y una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a ligera. Los dom inios variab le s de ca d e n a ligera están codificados por la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a ligera, que generalm ente com prende segm ento s g énicos V l de ca d e n a ligera y J l de ca d e n a ligera, procedentes de un repertorio de segm ento s g énicos V y J de ca d e n a ligera presen te s en la línea germ inal. L a s se cu e n cia s, u b icacio n e s y nom enclatura para los segm en to s g é n ico s V y J de ca d e n a ligera para d iverso s o rgan ism os pueden encontrarse en la b ase de datos IM GT, que se encuentra a c ce sib le a travé s de internet en la W orld W id e W eb (www) en la U R L "imgt.org." L a s c a d e n a s ligeras incluyen aquellas, por ejem plo, que no se unen selectivam ente a un prim er o segund o epítopo unido selectivam ente por la proteína de unión a epítopo en la que ap are ce n. Las ca d e n a s ligeras tam bién incluyen aq u e lla s que se unen y reconocen, o ayudan a la ca d e n a p e sa d a a unirse y el reconocer, uno o m ás epítopos unidos de form a selectiva por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. L a s c a d e n a s ligeras tam bién incluyen aq u e llas que se unen y reconocen, o ayudan a la ca d e n a p e sa d a a unirse y el reconocer, uno o m ás epítopos unidos de form a sele ctiva por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. L a s ca d e n a s ligeras co m u nes o u n ive rsales incluyen aq u e lla s d erivad as de un gen V k 1 -39 J k5 hum ano o un gen V k3 -20 J k1 hum ano, e incluyen v e rs io n e s m utadas som áticam ente (por ejem plo, m ad urad as por afinidad) de las m ism as.

La fra se "intervalo m icrom olar" pretende significar 1-999 m icromolar; la fra se "intervalo m icrom olar" pretende significar 1-999 nanom olar; la fra se "intervalo m icrom olar" pretende significar 1-999 picomolar.

"pH neutro" incluye un pH entre aproxim adam ente 7,0 y aproxim adam ente 8,0, por ejem plo, pH entre aproxim adam ente 7,0 y aproxim adam ente 7,4, por ejem plo, entre aproxim adam ente 7,2 y aproxim adam ente 7,4, por ejem plo, pH fisiológico en, por ejem plo, un ratón o un se r hum ano. "pH ácido" incluye un pH de 6,0 o inferior, por ejem plo, pH entre aproxim adam ente 5,0 y aproxim adam ente 6,0, pH entre aproxim adam ente 5 ,75 y aproxim adam ente 6,0, por ejem plo, pH de los com partim entos end osóm ico o lisosóm ico.

La expresió n "unido operativam ente" se refiere a una relación en la que los com ponentes operativam ente unidos funcionan de la m anera d ese ad a. En un ca so , una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una proteína puede unirse operativam ente a s e c u e n c ia s regu lad oras (por ejem plo, promotor, potenciador, s e cu e n cia silenciado ra, etc.) con el fin de retener la regulación de la transcripción ad ecu ad a. En un caso , una se cu e n cia de ácido nucleico de una región variab le de inm unoglobulina (o segm ento s V (D ) J ) puede unirse operativam ente a una se cu e n cia de ácido nucleico de una región constante de inm unoglobulina para permitir la recom binación a d e cu a d a entre las s e c u e n c ia s en una se cu e n cia de ca d e n a p e sa d a o ligera de inm unoglobulina.

La frase "m utado som áticam ente", com o se u sa en el presente docum ento, incluye una referencia a una se cu e n cia de ácido nucleico de un linfocito B que ha sufrido un cam bio de c la se , en donde la s e cu e n cia de ácido nucleico de una región variab le de inm unoglobulina, por ejemplo, una región variab le de ca d e n a p e sa d a (por ejemplo, un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a o que incluye una s e cu e n cia de C D R o F R de ca d e n a p e sa d a ) en el linfocito B con la c la se cam b iad a no e s idéntica a la s e cu e n cia de ácido nucleico en el linfocito B antes del cam bio de cla se , tal como, una diferencia en una s e cu e n cia de ácido nucleico de una C D R o una región m arco entre un linfocito B que no ha sufrido un cam bio de c la se y un linfocito B que ha sufrido un cam bio de c la se . La fra se "m utada som áticam ente" incluye una referencia a s e c u e n c ia s de ác id o s n u cle ico s de linfocitos B m ad urad os por afinidad que no son idénticas a las correspon dientes s e c u e n c ia s de nucleótidos de región variab le de inm unoglobulina en linfocitos B que no están m adurados por afinidad (e s decir, s e c u e n c ia s en el genom a de cé lu la s de la línea germ inal). La frase "m adurada som áticam ente" tam bién incluye una referencia a una s e cu e n cia de ácido nucleico de la región variab le de inm unoglobulina de un linfocito B d e sp u é s de la expo sición del linfocito B a un epítopo de interés, en donde la s e cu e n cia de ácido nucleico difiere de la se cu e n cia de ácido nucleico correspondiente antes de la expo sición del linfocito B al epítopo de interés. La e xpresió n "m utada som áticam ente" tam bién se refiere a se c u e n c ia s de anticuerpos que se han generad o en un anim al, por ejemplo, un ratón que tiene s e c u e n c ia s de ác id o s n u cleico s de región variab le de inm unoglobulina hum ana, en resp u esta a una expo sición a inm unógeno, y que resultan de los p ro ce so s de sele cció n inherentem ente operativos en tal un animal.

El térm ino "no reordenada", con respecto a s e c u e n c ia s de ácid o s nucleico s, incluye s e c u e n c ia s de ácid o s n u cleico s que existen en la lín ea germ inal de una célula animal.

La frase "dom inio variab le" incluye una s e cu e n cia de am ino ácid os de una ca d e n a ligera o p e sa d a de inm unoglobulina (m odificada segú n se d e se e ) que com prende las sig u ien te s regiones de am inoácidos, en s e cu e n cia de N-terminal a C-term inal (a m enos que se indique lo contrario): F R 1, C D R 1, F R 2 , C D R 2 , F R 3 , C D R 3 , FR 4.

La frase "unido operativam ente" se refiere a una yuxtaposición en donde los com ponentes descrito s de esta m anera están en una relación que les permite funcio nar de su m anera prevista. En un ca so , una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una proteína puede unirse operativam ente a s e c u e n c ia s regu lad oras (por ejem plo, promotor, potenciador, s e cu e n cia silenciado ra, etc.) con el fin de retener la regulación de la transcripción ad e cu ad a. En un caso , una s e cu e n cia de ácido nucleico de una región variab le de inm unoglobulina (o segm en to s V (D ) J ) puede unirse operativam ente a una s e cu e n cia de ácido nucleico de una región constante de inm unoglobulina para permitir la recom binación ad e cu a d a entre las s e c u e n c ia s en una s e cu e n cia de ca d e n a p e sa d a o ligera de inm unoglobulina. El térm ino "reem plazo", en referencia al reem plazo génico se refiere a co lo car m aterial genético exó gen o en un locus genético endógeno, reem plazando de esta m anera la totalidad o una porción del gen endógeno con una se cu e n cia de ácido nucleico ortóloga u hom óloga.

El térm ino "funcional", com o se u sa en el presente docum ento, por ejem plo, en referencia a un polipéptido funcional, incluye un polipéptido que co n se rv a al m enos una actividad biológica norm alm ente a so c ia d a con la proteína natural. En otro caso , un segm ento génico de inm unoglobulina funcional puede incluir un segm ento génico variab le que es ca p a z de un reordenam iento productivo para g e n e rar una s e cu e n cia g énica de inm unoglobulina reordenada.

Dominios variables con sustituciones de histidina

El d iseño de agentes terapéutico s a b ase de inm unoglobulina e s un fenóm eno bien estudiado, au n qu e sig u e habiendo ciertos problem as no resueltos en la producción de d ichos agentes terapéuticos con ca racte rísticas óptimas, por ejem plo, prolongación de la sem ivid a en su ero de d ichos agentes terapéuticos o de otro modo m ejorar su ca pacid ad para unirse a m ás d ian as por m olécula terapéutica. M uch os trabajos durante las dos últim as d é ca d a s dirigidos a ac larar la renovación de las inm unoglobulinas en suero se ha centrado en las form as para aum entar la sem ivida en su ero de anticuerpos terapéuticam ente im portantes o de agentes terapéuticos a b a se de inm unoglobulinas, m ediante la m odificación de la estructura del anticuerpo. En su m ayoría, este trabajo de m odificación se ha centrado en la interacción de los dom inios con stan tes de los anticuerpos con el receptor de F c neonatal (F cR n ). El receptor de F c neonatal en la superficie extracelu lar se une a anticuerpos circu lan tes a travé s de s u s regiones F c para form ar un com plejo de a n ticue rpo -F cR n que se incorpora o endocita, al interior de la célula donde el ligando y el anticuerpo se sep a ra n y el com plejo de an ticue rpo -F cR n sufre un proceso de ciclado que d evu e lve al anticuerpo y al F c R n a la superficie celular, donde se libera el anticuerpo y puede vo lve r a unirse a una nueva m olécula diana. El ciclado del com plejo de an ticue rpo -F cR n se convirtió en un área de gran interés d e sp u é s del descubrim iento de los m ecanism o s g e n e rales de ciclado del receptor.

El ciclado del receptor puede prod ucirse m ediante d iverso s m ecanism os. La end ocitosis m ediada por receptor proporciona una v ía end o só m ica para un reciclado regulado de receptores de la superficie ce lu lar y (en algu n os ca so s, por ejem plo, F c R n ) su s ligandos. (L a s m oléculas p inocitadas norm alm ente se transportan de otro modo a travé s de una v ía e nd osóm ica que term ina en la degradación). El descubrim iento del m ecanism o de endocitosis m ediada por receptor y la cantidad de estudio s relativos al reciclado de receptores de m em brana proporcionó una b a se para una com prensión detallada de la renovación de receptor-ligando en general (para una revisión v é a se , por ejem plo, Brown, M.S., A nd erson, R .G .W . y G oldstein, J.L. (1983 ) R ecycling R eceptors: T he R ound-T rip Itinerary of Migrant M em brane Proteins, Cell 32 :663 -667; v é a s e tam bién, G oldstein, J.L. y Brown, M.S. (2009) T he LD L Receptor, Arterioscler. Throm b. V a sc. Biol. 29 :431 -438 ; B asu , S.K . (1984 ) R eceptor-m ediated endocytosis: An overview of a dynam ic process, J. Biosci. 6 (4 ):535 -542 ). Otro trabajo a ce rca de la clasificación end o só m ica ayudó a e n m arcar ad ecu ad am en te la cuestión del destino de las inm unoglobulinas circulan tes y el fenóm eno del reciclado m ediante receptores de las inm unoglobulinas y la farm acocinética de los fárm acos a b ase de anticuerpos. Este trabajo reveló un com plejo proceso de ciclado de complejos de anticuerpo-FcRn que parece ser responsable principalmente de la relativamente larga semivida de las moléculas de IgG en suero. De hecho, estudios incluso más tempranos en esta área determinaron que los endosomas son la fuente in vivo más plena de FcRn (véase, Roberts, D.M. et al. (1990) Isolation and Characterization of the Fc Receptor from the Fetal Yolk Sac of the Rat, J. Cell. Biol. 111:1867-1876). Además, se ha observado durante largo tiempo que las fracciones endosómicas positivas a receptor en su mayoría no se dirigen a la degradación lisosomal (véase, por ejemplo, Brown, M.S. et al. (1983) Recycling Receptors: The Round-Trip Itinerary of Migrant Membrane Proteins, Cell 32:663-667; véase también, von Figura et al. (1984) Antibody to mannos 6-phosphate specific receptor induces receptor deficiency in human fibroblasts, EMBO J. 3(6):1281-1286), en ausencia de agregación (véase, por ejemplo, Dunn, K.W. et al. (1989) Iterative Fractionation of Recycling Receptors from Lysosomally Destined Ligands in an Early Sorting Endosome, J. Cell. Biol. 109(6):3303-3314). Este sistema endosómico es el que participa en un proceso de ciclado que asegura que los anticuerpos que se unen bien a FcRn en condiciones ácidas (por ejemplo, anticuerpos IgG1 humanos) persisten durante un periodo de tiempo prolongado en suero.

De acuerdo con algunos informes, el mecanismo de reciclado de endosomas que contienen FcRn es nuevo e infrecuente; no implica el acoplamiento de orgánulos completos dependiente de ubiquitina sino que se asemeja a un acoplamiento incompleto mediado por extensiones tubulares más similares a un modelo de contacto y unión prolongada (kiss-and-lean) (Gan, Z. et al. (2009) Analyses of the recycling receptor, FcRn, in live cells reveal novel pathways for lysosomal delivery, Traffic 10(5):600; véase también, Tzaban, S. et al. (2009) The recycling and transcytotic pathways for IgG transport by FcRn are distinct and display an inherent polarity, J. Cell Biol. 185(4):673-684). Por lo tanto, el modelo de ciclado de anticuerpo-FcRn parece ser distinto al de otras vías endosómicas.

El mecanismo de ciclado endosómico de anticuerpo-FcRn asegura que los anticuerpos que se unen bien a FcRn son capaces de mantener una presencia prolongada en el suero a través de un proceso protector de FcRn más o menos continuo que implica el secuestro del anticuerpo unido en un compartimento endosómico, donde se mantiene la unión del anticuerpo a FcRn, impidiendo la degradación lisosómica del anticuerpo unido a FcRn. Típicamente, las moléculas de anticuerpo circulantes se unen a FcRn en la superficie celular. Los complejos de anticuerpo-FcRn aparecen en endosomas como resultado de un proceso de endocitosis continuo. Las moléculas unidas a FcRn (por ejemplo, anticuerpos o proteínas de fusión de Fc) permanecen asociadas con FcRn en el compartimento endosómico ácido mediante una interacción Fc-FcRn estable a ácidos. Las moléculas no unidas a la superficie endosómica (mediante, por ejemplo, FcRn u otro receptor) se transportan a la vía lisosómica y se degradan, mientras que las moléculas unidas a receptor se reciclan hacia la membrana plasmática cuando el endosoma se fusiona con la membrana plasmática. Tras la fusión con la membrana plasmática, la interacción Fc-FcRn estable a ácidos se expone a un pH extracelular prácticamente neutro, donde el Fc se disocia fácilmente del FcRn. Es el diferencial de unión de pH del Fc, acoplado con una estabilidad térmica diferencial del FcRn, lo que varía el estado de protonación, lo que se considera el principal responsable de la capacidad de ciertos Fc para mantener concentraciones séricas mediante la unión a FcRn. Un punto clave en el mecanismo de ciclado endosómico es la liberación del ligando por receptores en el compartimento endosomal ácido (revisado, por ejemplo, en Brown, M.S. et al. (1983)).

Los restos de Fc de IgG1 se unen a FcRn con alta afinidad a un pH de 6,0 a aproximadamente 6,5; la unión a un pH de 7,0 a aproximadamente 7,5 es aproximadamente dos órdenes de magnitud más débil, posiblemente debido a la titulación de restos de histidina cerca de la región del Fc que se une a FcRn, los restos 310-433 y un diferencial de estabilidad térmica intramolecular de FcRn mediado por el estado de protonación (Raghaven, M. et al. (1995) Analysis of the pH dependence of the neonatal Fc receptor/immunoglobulin G interaction using antibody and receptor variants, Biochemistry 34:14649-14657; Vaughn, D.E. y Bjorkman, P.J. (1998) Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor, Structure 6:63-73); se ha demostrado que el FcRn de rata muestra un mejor perfil de estabilidad térmica a pH 6,0 que a pH 8,0 (Raghavan, M. et al. (1993) The class I MHC-related Fc receptor shows pH dependent stability differences correlating with immunoglobulin binding and release, Biochemistry 32:8654-8660).

Aunque la naturaleza ha dado lugar a estructuras de Fc que se unen de manera diferencial a FcRn, la ciencia de la modificación de Fc surgió para diseñar estructuras de Fc que podrían dar como resultado una unión más estrecha a FcRn y posiblemente, una mayor semivida en suero. Se diseñaron y evaluaron muchas de estas estructuras, demasiadas como para revisarlas en el presente documento, con diversos grados de éxito. La mutación de secuencias de región constante de inmunoglobulina para promover el reciclado de anticuerpos modificando las características de unión a FcRn tiene un historial amplio y variado. Hasta ahora, la mayoría si no todos los esfuerzos para identificar mutaciones se han centrado en restos que se consideran críticos en la unión o interacción con FcRn, es decir, restos cuya modificación afecta a la afinidad del Fc por FcRn.

Sin embargo, la unión de Fc a FcRn es una materia de por sí compleja. Los diferentes tipos de anticuerpos terapéuticos (humanizados, quiméricos y de ratón) e incluso entre tipos (por ejemplo, comparando diferentes anticuerpos humanizados entre sí, comparando anticuerpos de isotipo IgG1 entre sí, etc.), muestran constantes de disociación con respecto a FcRn que varían hasta aproximadamente el doble (véase, por ejemplo, Suzuki, T. et al. (2010) Importance of Neonatal FcR in Regulating the Serum Half-Life of Therapeutic Proteins Containing the Fc Domain of Human IgG1: A Comparative Study of the Affinity of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins to Human Neonatal FcR, J. Immunol. 184:1968-1976). Esta observación permite inferir que la estructura primaria de la región constante puede no ser totalmente responsable del comportamiento farmacocinético. Otros han supuesto que el punto isoeléctrico (pI) general de un anticuerpo, que mantiene fija la estructura primaria de la región constante, es un determinante importante de la semivida en suero, posiblemente mediante un mecanismo no dependiente de FcRn (Igawa, T. et al. (2010) Reduced elimination of IgG antibodies by engineering the variable region, Protein Engineering, Design & Selection 23(5):385-392). Según esta visión, cuanto menor sea el pI del anticuerpo, más estrecha será la unión a FcRn (cita anterior). Al menos para un anticuerpo de isotipo IgG4, un cambio en el pI de 9,2 a 7,2 se correlacionó con un aumento de 2,4 veces en la semivida y una reducción de 4,4 veces en la eliminación (cita anterior), lo que es coherente con la deducción de que una reducción no específica del pI mediante la modificación conjunta de restos en las regiones variables de cadenas tanto pesadas como ligeras puede tener un impacto significativo en el comportamiento farmacocinético. En ese informe, la modificación de restos no siguió un patrón concreto y no se sustituyó ningún resto por histidina, aunque se cambió al menos un resto en una CDR2 de cadena ligera de un resto de histidina a un resto de glutamina (cita anterior, en la fig. 5, p. 390). Además, se produce una paradoja interesante cuando se compara la unión a FcRn in vitro y la farmacocinética in vivo: para al menos un anticuerpo IgG1 clínicamente importante con múltiples sustituciones en la región Fc que interactúa con FcRn, la unión a FcRn in vitro no se correlacionó con un comportamiento farmacocinético in vivo (véase, Petkova, S.B. et al. (2006) Enhanced halflife of genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease, Int'l Immunol. 18(12):1759-1769). Finalmente, la liberación del ligando de Fc del FcRn tras la fusión con la membrana plasmática parece producirse en dos fases, una fase rápida y una fase prolongada, cuyo mecanismo se desconoce (véase, Ober R.J. et al. (2004) Exocytosis of IgG as mediated by the receptor FcRn: an analysis at the singlemolecule level, Proc. Natl Acad. Sci. USA 101:11076-11081).

Finalmente, la extensión de la semivida de anticuerpos en suero es una forma de mejorar la eficacia de la terapia con anticuerpos. Una eficacia mejorada o una disponibilidad mejorada del mismo anticuerpo o dominio variable para la unión y la eliminación de dos o tres o más moléculas diana no se aborda necesariamente mejorando la unión a FcRn y la renovación que afecta al antígeno diana. Se espera que las modificaciones que aumentan la afinidad de un Fc a FcRn aumentarán la renovación y por lo tanto, mejorarán la farmacocinética de un anticuerpo terapéutico. Los complejos de antígeno-anticuerpo se unen estrechamente a FcRn, dando como resultado el ciclado del complejo de antígeno-anticuerpo de vuelta al espacio extracelular en lugar de degradarse por una vía lisosomal. En este escenario, sin embargo, el antígeno o la diana, puede permanecer en gran medida complejado al anticuerpo y reciclarse junto con el anticuerpo en el espacio extracelular. Para anticuerpos terapéuticos, este fenómeno puede ser altamente indeseable.

Sin embargo, los anticuerpos cuya interacción con el antígeno es dependiente del pH, es decir, anticuerpos diseñados para que se unan al antígeno con menor afinidad a pH endosómico, no reciclarán el antígeno de un modo dependiente de FcRn debido a la inestabilidad del complejo antígeno-anticuerpo en el compartimento endosómico. Esto se debe a que en el ambiente ácido del endosoma, el antígeno se desacoplará del complejo anticuerpo-FcRn y el FcRn unido al anticuerpo se reciclará a la superficie de la célula, mientras que el antígeno libre desacoplado se transportará a una vía de degradación lisosómica. De esta manera, la unión a antígeno dependiente de pH puede proporcionar una eficacia y/o farmacocinética mejoradas en el contexto del ciclado mediado por FcRn (pero que no depende directamente de la interacción Fc-FcRn) liberando el antígeno ciclado para unirse a antígeno, unirse a FcRn, ciclarse a través de los endosomas y volver a entrar en el espacio extracelular para unirse a más antígeno y transportar más antígeno a una vía de degradación lisosómica.

Capitalizando la observación de que los ligandos se disociarán frecuentemente de sus receptores a un pH endosómico, se ha sugerido la búsqueda de anticuerpos que liberan eficazmente al antígeno a un pH endosómico para producir ciertas moléculas multifuncionales específicas que se dirigen a células específicas para importar toxinas al interior de células y liberar las toxinas en los endosomas (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.599.908 y la Patente de los Estados Unidos n.° 5.603.931). Pero no aborda el ciclado de antígeno-anticuerpo, en particular para agentes terapéuticos en seres humanos.

Para aprovechar al máximo la estructura del anticuerpo para transportar antígeno desacoplado en el endosoma a través de una vía lisosómica a la vez que se mantiene el ciclado dependiente de FcRn de los complejos de antígeno-FcRn, se han explorado ciertas estrategias para la unión a antígeno dependiente de pH. Dichas estrategias incluyen un barrido de histidina generalizado a lo largo de la región variable para sustituir restos con histidina y evaluar si la estrategia generalizada de reemplazo por histidina proporciona un anticuerpo con unión a antígeno dependiente de pH deseada (véase, por ejemplo, Igawa, T. et al. (2010) Antibody recycling by engineered pH-dependent antigen binding improves the duration of antigen neutralization, Nature Biotech. 28(11):1203-1208; véase también, la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2011/0111406 A1)). Una desventaja probable de esta estrategia es que es posible que la modificación de restos importantes para la unión al antígeno altere la unión a un pH ácido o neutro, lo que puede eliminar cualquier aprovechamiento debido al diferencial de pH entre el compartimento endosómico y el espacio extracelular.

En diversos aspectos, se describen composiciones y métodos para producir una o más sustituciones de histidina en unas cuantas regiones meticulosamente seleccionadas en una región variable de anticuerpo (dominio variable de cadena pesada y/o cadena ligera), proporcionando un método para producir dominios variables de anticuerpo que se unen a un antígeno diana de un modo dependiente de pH, por ejemplo, dominios variables que se unen a un antígeno de interés con una primera afinidad a un pH neutro o básico o extracelular, y aun así, se unen al mismo antígeno de interés con una se g u n d a afinidad a un pH ácido, en donde la prim era afinidad e s e leva d a y en donde la seg u n d a afinidad e s baja.

En d iverso s aspecto s, las una o m ás su stitu cio nes de histidina se encuentran en una C D R 1 , una C D R 2 , una C D R 3 , un N-terminal y/o una s e cu e n cia de bucle 4.

En algu n os aspecto s, las una o m ás su stitu cio nes de histidina s e encuentran en una C D R 1 , una C D R 2 y/o una C D R 3. En algu n os aspecto s, las una o m ás su stitu cio nes de histidina se encuentran en una C D R 3 y una se c u e n c ia de bucle 4. En un asp e cto adicional, las su stitu cio nes tam bién se encuentran en una s e cu e n cia N-terminal.

En algun os aspecto s, las una o m ás su stitu cio nes de histidina se encuentran en una C D R 3 y una s e cu e n cia N-terminal. En un aspecto adicional, las su stitu cio nes tam bién se encuentran en una s e cu e n cia de bucle 4.

En alg u n o s aspecto s, las una o m ás su stitu cio nes de histidina se encuentran en una se cu e n cia de C D R 2 y una se cu e n cia de bucle 4. En un asp e cto adicional, las su stitu cio nes tam bién se encuentran en una se c u e n c ia N-terminal. En algun os aspecto s, la s e cu e n cia de bucle 4 e s para los restos 83-88 del dom inio variab le de ca d e n a ligera A; para los restos 83-88 del dom inio variab le de ca d e n a ligera k; y para 82-88 de región variab le de ca d e n a p e sa d a (num eración de IM G T).

En alg u n o s aspecto s, la s e cu e n cia N-terminal para un dom inio variab le de ca d e n a ligera o un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a son los restos 1-26 (num eración de IM G T). En un aspecto, la se c u e n c ia N-terminal que com prende una o m ás su stitu cio nes de histidina (por ejem plo, ag ru p a d a s) en los restos 1-5, en un aspecto, los restos 1-10, en un aspecto, 1-15, en un aspecto, 1-20, en un aspecto, 1-25, en un aspecto, 5-10, en un aspecto, 10-15, en un aspecto, 15-20, en un aspecto, 20-25, en un aspecto, 5 -15, en un aspecto, 10-20, en un aspecto, 5-20. En un aspecto, las sustitucio nes de histidina son dos o m ás (por ejem plo, tres, cuatro, cinco o s e is o m ás) y se efectúan al m enos d os o m ás de las sustitucio nes de histidina en un tramo de s e cu e n cia N-terminal que tiene aproxim adam ente 3 restos, 4 restos, cinco restos o s e is restos o más. En un aspecto, se efectúa una pluralidad de su stitu cio nes de histidina en el N-terminal y las sustitucio nes de histidina com prenden ag ru p acio n e s de al m enos dos, al m enos tres o al m enos cuatro sustitucio nes de histidina. En un aspecto, al m enos una agrupació n de su stitu cio nes de histidina com prende sustitucio nes de histidina que están se p a ra d a s por una o m ás su stitu cio nes de histidina.

En algu n os aspecto s, las una o m ás sustitucio nes de histidina en la C D R son dos, tres, cuatro, cinco o se is sustitucio nes en la C D R . En un aspecto, se sustituyen con una histidina todos los restos en la C D R que no son críticos para la unión a un pH neutro. En un aspecto, los dos, tres, cuatro, cinco o s e is su stitu cio nes son contiguas; en un aspecto, una o m ás de las dos, tres, cuatro, cinco o s e is sustitucio nes están presen tes en una agrupación, en donde la agrupación com prende al m enos un resto distinto de histidina; en un aspecto, la agrupación com prende d os restos distintos de histidina; en un aspecto, la agrupación com prende tres restos distintos de histidina; en un aspecto, la agrupación com prende cuatro restos distintos de histidina.

En algu n os aspecto s, las una o m ás sustitucio nes de histidina en el N-terminal son una, dos, tres, cuatro, cinco o se is sustituciones. En un aspecto, todos los restos en el N-terminal que no reducen la unión al antígeno a pH neutro (por ejem plo, en m ás de un 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 %), se sustituyen por histidina. En un aspecto, los dos, tres, cuatro, cinco o se is su stitu cio nes son contiguas; en un aspecto, una o m ás de las dos, tres, cuatro, cinco o s e is sustitucio nes están presen te s en una agrupación, en donde la agrupación com prende al m enos un resto distinto de histidina; en un aspecto, la agrupació n com prende dos restos distintos de histidina; en un aspecto, la agrupación com prende tres restos distintos de histidina; en un aspecto, la agrupació n com prende cuatro restos distintos de histidina.

En algun os aspecto s, el método com prende m odificar un dom inio variab le para que com prenda una agrupación de sustitucio nes de histidina (por ejemplo, com o se d escrib e en el presente docum ento, contigua o interrum pida con uno o m ás restos distintos de histidina) en una región se le ccio n a d a entre una C D R 1 , una C D R 2 , una C D R 3 , una N-terminal, un bucle 4 y una com binación de las m ism as. En algu n os aspecto s, la agrupació n e s una s e cu e n cia unida ca d e n a arriba m ediante un prim er resto de histidina y ca d e n a abajo m ediante un segu nd o resto de histidina y com prende uno o m ás restos entre los restos de histidina prim ero y segundo. En un aspecto, los uno o m ás restos entre los restos de histidina prim ero y segu nd o son 1, 2, 3, 4, 5 o 6 o m ás restos distintos de histidina. En un aspecto, los uno o m ás restos entre los restos de histidina primero y segu nd o son 1, 2, 3, 4, 5 o s e is restos de histidina. En un aspecto, la agrupación e s de 3 restos, en un aspecto, de 4 restos, en un aspecto, de 5 restos, en un aspecto, de 6 restos, en un aspecto, de 7 restos, en un aspecto, de 8 restos o más.

En d iverso s aspecto s, el método com prende identificar s e c u e n c ia s en un dom inio variab le de anticuerpo (cad e n a p e sa d a y/o ligera) que son críticos para la unión al antígeno (por ejem plo, a un pH neutro, por ejem plo, pH 7-7,4 , por ejem plo, pH 7,2, por ejem plo, un pH extracelular) y sustituir uno o m ás restos dentro de la s e cu e n cia por histidina, en donde la sustitución por histidina no elim ina la unión del dom inio variab le a un antígeno diana a un pH neutro. En d iverso s aspecto s, se sustituye por restos de histidina una agrupación de d os o m ás, tres o más, cuatro o m ás o cinco o m ás restos que no son críticos para la unión a un pH neutro. En d iverso s aspecto s, la agrupación de restos de histidina se encuentra en una C D R , un bucle 4, un N-terminal o una com binación de los m ism os.

En d iverso s aspecto s, se identifica un resto que e s crítico para la unión com o un resto que, cuan do se sustituye con un am inoácido sustituto a un pH aproxim adam ente neutro (o extracelular), reduce la unión del dom inio variable, en un aspecto, en al m enos un 5 %, en un aspecto, al m enos un 10 %, en un aspecto, al m enos un 20 %, en un aspecto, al m enos un 30 %, en un aspecto, al m enos un 40 %, en un aspecto, al m enos un 50 %, en un aspecto, al m enos un 60 %, en un aspecto, al m enos un 70 %, en un aspecto, al m enos un 80 %, en un aspecto, al m enos un 90 %, en un aspecto, da com o resultado una unión no detectable. En un aspecto, el am inoácido sustituto e s una histidina. En un aspecto, el am inoácido sustituto es una alanina.

En un aspecto, se d escrib e un método para producir un dom inio variab le de anticuerpo que se une a un antígeno m ás débilm ente a un pH ácido que la unión al m ism o antígeno a un pH neutro o básico, en donde el método com prende sustituir uno o m ás restos de am ino ácid os de la región variab le con uno o m ás restos de histidina. En un aspecto, la unión al pH ácido es d esp recia b le o cero.

En un aspecto, los uno o m ás restos de am inoácido sustituidos se encuentran en una ca d e n a ligera. En un aspecto específico , los uno o m ás restos se encuentran en una región N-terminal de una ca d e n a ligera. En un aspecto específico , los restos N-term inales se sele ccio n an entre 1-26, 1-20, 1-15, 1-10, 1-6 o 1-5 (num eración de IM G T). En un aspecto, los uno o m ás restos se encuentran en el bucle 3. En un aspecto específico , los restos del bucle 4 son 83 88 en V k o VA y 82-88 en V h (num eración de IM GT).

En un aspecto, los uno o m ás restos se encuentran en una ca d e n a pesada. En un asp e cto e specífico , los uno o m ás restos se encuentran en una región N-terminal de una ca d e n a pesada. En un aspecto específico , los restos N-term inales se sele ccio n an entre 1-26, 1-20, 1-15, 1-10, 1-6 o 1-5 (num eración de IM G T). En un aspecto, los uno o m ás restos se encuentran en el bucle 4. En un asp e cto e specífico , los restos del bucle 3 se sele ccio n an entre (para V k y/o VA) 83, 84, 85, 86 , 87, 88 y una com binación de los m ism os (num eración de IM G T); o (para V h) 82,83, 84, 85, 86 , 87 , 88 y una com binación de los m ism os (num eración de IM GT); y, una com binación de las m ism as.

En un aspecto, los uno o m ás restos se encuentran en una C D R se le ccio n a d a entre una C D R 1 , una C D R 2 y una C D R 3 ; y los uno o m ás restos, cuan do se sustituyen (por ejemplo, con alanin a o con histidina) no dan com o resultado una unión reducida del antígeno diana a un pH neutro o básico. En un aspecto específico , la unión reducida del antígeno diana a pH neutro o b ásico com o resultado de la sustitución (por ejem plo, m ediante sustitución de alanin a o histidina) no e s m ayor de un 5 %, no m ayor de un 10 %, no m ayor de un 15 % o no m ayor de un 20 %, no m ayor de un 25 % o no m ayor de un 30 %, en com paración con un dom inio variab le no sustituido.

En algu n os aspecto s, el dom inio variab le m odificado con his com plejado con el antígeno diana m uestra una sem ivida de al m enos aproxim adam ente 20 m inutos a un pH elevado (por ejem plo, un pH extracelu lar o un pH de 7-7,4 , por ejem plo, pH 7,2 ) y m uestra una sem ivid a de m enos de 5 m inutos, m enos de 4 m inutos, m enos de 3 minutos, m enos de 2 m inutos o m enos de un minuto a un pH endosóm ico o un pH de, por ejem plo, pH 5-6, por ejem plo, pH 5 ,75. En un aspecto, el dom inio variab le m odificado con his com plejado con el antígeno diana m uestra una sem ivid a de al m enos aproxim adam ente 20 m inutos al pH e levado y m uestra una sem ivid a a un pH end osóm ico de m enos de 60 segu nd os, m enos de 30 seg u n d o s, m enos de 10 seg u n d o s, m enos de 5 segu nd os, m enos de 4 seg u n d o s, m enos de 3 seg u n d o s o m enos de 2 segu nd os. En un aspecto, el dom inio variab le m odificado con his com plejado con el antígeno diana m uestra una sem ivid a de al m enos aproxim adam ente 20 m inutos al pH elevado (por ejem plo, pH 7-7,4 , por ejem plo, pH 7 ,2 ) y m uestra una sem ivid a a un pH endosóm ico de m enos de aproxim adam ente un segundo, m enos de 0,5 segu nd os, m enos de 0,1 se g u n d o s o m enos de 0,05 segu nd os. En un aspecto, la sem ivid a a un pH endosóm ico se mide usand o un e n say o B IA C O R E ™ en el que el dom inio variab le m odificado con his com plejado con el antígeno diana se equilibra sob re la superficie de un chip B IA C O R E ™ a pH neutro o elevado y el tam pón a un pH endosóm ico (o, por ejem plo, un pH de 5-6, por ejem plo, pH 5 ,75 ) se hace fluir sob re el com plejo.

En d iverso s aspecto s, se d escrib e un método para producir un dom inio variab le de anticuerpo que se une a un antígeno diana con una prim era afinidad a un pH extracelu lar y no se une al antígeno diana o se une al antígeno diana con una se g u n d a afinidad a un pH endosóm ico, en donde la prim era afinidad e s de aproxim adam ente 10, 102', 103', 104', 105', 106-, 107-, 108', 109, 1010', 1011- o 1012 v e c e s (o m ás v e c e s ) que la se g u n d a afinidad. En alg u n o s aspecto s, la prim era afinidad se encuentra en el intervalo de picom olar a nanom olar (por ejemplo, la Kd e s de 10 ' 12 a 10 '9) y la seg u n d a afinidad se encuentra en el intervalo m icrom olar o su pe rio r (por ejem plo, K d = 10 '6 o mayor, por ejem plo, 10 '5, 10 '4, 10 3, 10 '2, 10-1, 1 o mayor). En alg u n o s aspecto s, la prim era afinidad se encuentra en el intervalo de aproxim adam ente K d 10 '9 a aproxim adam ente K d 10 ' 12 y la se g u n d a afinidad se encuentra en el intervalo de aproxim adam ente K d 10-3 a aproxim adam ente 1 o mayor. En un aspecto, la prim era afinidad se encuentra en el intervalo de aproxim adam ente K d 10 ' 9 a aproxim adam ente K d 10 ' 12 y la seg u n d a afinidad se ca racte riza por una K d > 1; en un aspecto e specífico , la se g u n d a afinidad se caracte riza por una K d >> 1 (por ejemplo, 10, 102, 103 o mayor). En un aspecto específico , la prim era afinidad se caracteriza por una K d de aproxim adam ente 10 '9 a aproxim adam ente 10 ' 12 y la se g u n d a afinidad se caracte riza por una incapacidad para detectar la unión sob re el fondo en un e n say o de unión B IA C O R E ™ .

S e ilustran vario s asp e cto s m ediante un c a so particular en el que se modifica una s e cu e n cia variab le de ca d e n a ligera hum ana para que contenga una o más, incluyendo una agrupación, de histidinas en una C D R 3 de ca d e n a ligera y la ca d e n a ligera se e xp re sa en una célula C H O con una ca d e n a p e sa d a afín. La identidad del antígeno al que se une el anticuerpo m odificado con histidina ca re ce de im portancia, al igual que la se cu e n cia particular del dom inio variab le de ca d e n a ligera. Los principios ilustrados en los ejem plos son ap licab les a C D R 3 , C D R 2 , C D R 1, la región N-term inal o el bucle 4. Po r ejem plo, pueden sustituirse por histidina restos en las regiones citadas, de m anera individual o en a g ru p acio n e s de 2, 3, 4 o 5, por ejem plo y puede e va lu a rse la unión dependiente de pH de los anticuerpos resultantes.

P u eden e lab o rarse m étodos para m odificar anticuerpos que son c a p a c e s de unirse a un antígeno de una m anera dependiente de pH produciendo m odificaciones de una región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina en una o m ás po sicio ne s a lo largo de la se cu e n cia de la ca d e n a ligera com o se d escrib e (por ejem plo, en una C D R 3 , C D R 2 , C D R 1, bucle 4, N-terminal). L a s histidinas se toleran en regio nes C D R ; las c a d e n a s ligeras, por lo general, m uestran una hiperm utación som ática a lo largo de la s e cu e n cia de la región variab le y, en alg u n o s ca so s, d ich as m utaciones pueden d ar com o resultado una sustitución de restos de histidina en las C D R (F IG . 15).

En los ejem plos, se han identificado sustitucio nes de histidina en una a cuatro po sicio n e s en la región C D R 3 de ca d e n a ligera, en restos no críticos para la unión al antígeno diana a un pH neutro, a partir de las cu a le s se prepararon quince con struccio n es m utantes. La ca d e n a ligera particular, con una variedad de c a d e n a s p e sa d a s diferentes pero afinas, se obtiene de una so la V k y un solo segm ento J k (V k1 -39 /J k5). C u an d o se e xp re sa n dichos m utantes, confieren al anticuerpo (junto con una ca d e n a p e sa d a afín) la propiedad de unión al antígeno dependiente de pH. S e elaboraron con struccio n es m utantes usand o dom inios va ria b le s de anticuerpo e sp e cífico s de antígeno y se evaluó su expresió n y unión a antígeno a un pH aproxim adam ente neutro y la liberación a bajo pH ("captura y liberación"). En ciertos ejem plos se m uestran las u b icacio n e s de los cuatro restos identificados (donde la m utación a histidina no e s crítica para la unión a pH neutro) que son Q 105H , Q 106H , Y 108 H y P 111 H. P ara un anticuerpo que se une a un antígeno diana diferente o para un anticuerpo que com prende una se c u e n c ia V -J reo rgan izad a diferente, los restos que pueden m utarse a his para producir un dom inio v ariab le dependiente de pH se encuentran identificando qué restos no son críticos para la unión a pH neutro, m odificando posteriorm ente uno o m ás de estos restos (por ejemplo, en ag ru p acio n e s) y e xp re sa n d o un anticuerpo que com prende las m utaciones y e valu an do la unión (y/o el tiem po de liberación, por ejem plo, t1/2) a un pH neutro (por ejem plo, un pH extracelular) y a un pH ácido (por ejem plo, un pH endosóm ico). A un q ue los datos m ostrados en este c a so son para una ca d e n a ligera V k 1 -39 /J k5, otras c a d e n a s ligeras, incluyendo aq u e lla s procedentes de una reordenación V k3 -20 /J k 1, son su sce p tib le s a la estrategia descrita en el presente docum ento, al igual que las c a d e n a s p e sa d a s.

T o d a s las co n struccio n es de ca d e n a ligera m odificadas con histidina que se prepararon en este experim ento se exp re sa ro n bien junto con las ca d e n a s p e sa d a s. A dem ás, la unión de los anticuerpos al antígeno de una m anera dependiente de pH se dem ostró a partir de los datos de un e n say o B IA C O R E ™ que m uestra la unión de antígeno aproxim adam ente a pH neutro y un pH ácido para los 15 m utantes con cinco ca d e n a s p e sa d a s diferentes que reco nocen esp e cíficam e nte el m ism o antígeno de la superficie ce lu lar (F IG .19 A -J).

Los m étodos descrito s y aq u e llo s m étodos particulares u sa d o s con fines ilustrativos en alg u n o s de los ejem plos y las figuras en el presente docum ento, son útiles para g e n e rar regio nes va ria b le s de an ticuerpo s que pueden u sa rse para producir, por ejem plo, proteínas de unión terapéuticas hum anas que unen su s d ian as por los dom inios va ria b le s de inm unoglobulina hum ana que com prenden las histidinas en una c D R 3. La unión alterada a un pH m ás bajo permitirá, en a lg u n as c ircu nstancias, una renovación m ás rápida debido a que el agente terapéutico se unirá a una diana en la superficie de la célula, se internalizará en un end osom a y se d iso ciará m ás fácilm ente o m ás rápidam ente de la diana en el endosom a, de modo que agente terapéutico se puede reciclar para unirse a otra m olécula m ás de la diana (por ejem plo, en otra célula o la m ism a célula). En d iverso s aspecto s, esto d ará com o resultado la ca pa cid ad de dosificar el agente terapéutico en una d osis m ás baja, o d osificar el agente terapéutico con m enos frecuencia. Esto es particularm ente útil cuan do no e s d e se ab le d osificar frecuentem ente, o adm inistrar por encim a de una cierta dosis, por razo n es de seguridad o toxicidad. P o r ejem plo, se aum entará con secu entem en te la sem ivid a de un anticuerpo terapéutico en el su ero de un sujeto.

Por lo tanto, en vario s asp e cto s, pueden producirse cam b ios en un gen que codifica una ca d e n a ligera reo rganizad a en las p o sicio n e s 105, 106, 108, 111 o una com binación de las m ism as. P o r ejem plo, la posición 105 junto con una o m ás de 106, 108 y 111; la posición 106 junto con una o m ás de 105, 108 y 111; la posición 108 junto con una o m ás de 105, 106 y 111 ; la posición 111 junto con una o m ás de 105, 106 y 108. En vario s a sp e cto s se incluyen po sicio ne s correspon dientes en otras c a d e n a s ligeras (e s decir, procedentes de otras reo rg an izacio n e s V-J).

Animales no humanos que expresan un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende restos de histidina

La invención descrita proporciona an im ales no hum anos genéticam ente m odificados que pueden producir proteínas de unión a antígeno con ca racte rísticas de unión a antígeno dependiente de pH. En d iverso s aspecto s, las proteínas de unión a antígeno prod ucidas por los an im ales no hum anos genéticam ente m odificados com o se d escrib en en el presente docum ento presentan una eficacia de reciclado dependiente de pH aum entada y/o una sem ivid a en suero aum entada. En particular, la invención d escrita em plea m odificaciones genéticas en el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina para introducir cod on es de histidina en una s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a y, opcionalm ente, para introducir m utaciones en una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante que codifica los dom inios C h2 y/o C H 3 que aum enta la unión de la región constante del anticuerpo a un receptor F cR n , que facilita el reciclado de la proteína de unión a antígeno. L a s proteínas de unión a antígeno que com prenden la m odificación pueden unirse de m anera m enos estre ch a a su diana en un com partim ento intracelular ácido (por ejemplo, en un end osom a donde el pH v a ría de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) que en un am biente extrace lu lar o en la superficie de una célula (por ejemplo, a un pH fisiológico, por ejem plo, un pH en el intervalo de aproxim adam ente 7 ,0 a aproxim adam ente 7 ,4 ) debido a los restos de histidina protonados u b icad os en los sitios de unión a antígeno. P o r lo tanto, las proteínas de unión a antígeno que com prenden las m odificaciones genéticas com o se describ en en el presente docum ento podrían se r c a p a c e s de recic larse de m anera m ás rápida o eficaz que las proteínas de unión a antígeno de tipo silvestre que no com prenden d ich as m odificaciones g enéticas d e sp u é s de la endocitosis m ediada por la diana. A dem ás, debido a que los restos de histidina m odificados se protonan únicam ente en un am biente ácido, pero no a un pH neutro, se e sp e ra que dicha m odificación no afecte a la afinidad y/o especificid ad de unión de la proteína de unión a antígeno hacia un antígeno de interés a un pH fisiológico.

En d iverso s aspecto s, se describ en an im a le s no hum anos que com prenden locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina que com prenden una s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana no reorganizada, en donde la se c u e n c ia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana no reo rgan izad a com prende una adición de al m enos un codón de histidina o una sustitución de al m enos un codón de distinto de histidina endógeno por un codón de histidina.

En d iverso s aspecto s, tam bién se d escrib en m étodos para producir y u sa r a los an im a le s no hum anos. C u an d o se inm unizan con un antígeno de interés, los an im ales no hum ano s genéticam ente m odificados son ca p a c e s de ge ne rar p ob laciones de linfocitos B que producen proteínas de unión a antígeno que com prenden dom inios va ria b le s de ca d e n a p e sa d a con restos de histidina, en donde las proteínas de unión a antígeno m uestran un reciclaje dependiente de pH m ejorado y/o una sem ivid a en su ero m ejorada. En d iverso s aspecto s, los an im ales no hum anos generan pob laciones de linfocitos B que e xp re sa n dom inios va ria b le s de ca d e n a p e sa d a hum ana junto con dom inios va ria b le s de ca d e n a ligera hum ana afines. En d iverso s aspecto s, los locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificados están presen te s en un genom a de lín ea germ inal del anim al no hum ano.

En d iverso s aspecto s, el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende una m odificación que elim ina o hace no fu ncio nale s a todos o sustancialm en te todos los segm ento s g é n ico s V h, D y J h endógenos; y el locus genéticam ente m odificado com prende una s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a no reo rganizad a que com prende uno o m ás segm ento s gé nico s V h, D y/o J h hum anos que tienen uno o m ás co d o n e s de histidina, en donde la se cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a no reo rganizad a está presente en una ubicación end ógena (e s decir, donde la s e cu e n cia de nucleótidos está ubicada en un anim al no hum ano de tipo silvestre) o está presente de m anera ectópica (por ejem plo, en un locus diferente del locus de ca d e n a de inm unoglobulina endógeno en su genom a o en su locus endógeno, por ejem plo, en un locus variab le de inm unoglobulina, en donde el locus endógeno se co lo ca o m ueve a una ubicación diferente en el genom a). En un aspecto, por ejem plo, aproxim adam ente un 80 % o m ás, aproxim adam ente un 85 % o m ás, aproxim adam ente un 90 % o m ás, aproxim adam ente un 95 % o m ás, aproxim adam ente un 96 % o m ás, aproxim adam ente un 97 % o más, aproxim adam ente un 98 % o m ás o aproxim adam ente un 99 % de todos los segm ento s gé nico s V, D o J de ca d e n a p e sa d a end ó g e n o s se elim inan o se hacen no funcio nales. En un aspecto, por ejem plo, al m enos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los segm ento s g é n ico s V, D o J fu ncio nale s de ca d e n a p e sa d a end ó g e no s se elim inan o se hacen no funcionales.

En un aspecto, el anim al no hum ano es un m am ífero. A un q ue se an alizan detalladam ente asp e cto s referidos a la introducción de co d o n es de histidina en una s e cu e n cia g é nica variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana no reo rganizad a en un ratón, tam bién se describ en otros an im ales no hum anos que com prenden un locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado que contiene una se cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana no reo rgan izad a que com prende una adición de al m enos un codón de histidina o una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina endógeno por un codón de histidina. D ichos anim ales no hum anos incluyen cu alq u ie ra de aq u ellos que pueden m odificarse genéticam ente para e xp re sa r el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a que contiene histidina com o se divulga en el presente docum ento, incluyendo, por ejem plo, ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejem plo, v a ca , toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primate (por ejem plo, tití com ún, m acaco), etc. Po r ejem plo, para aq u e llo s an im ales no hum anos para los que no se encuentran fácilm ente d ispo nib les cé lu la s E S genéticam ente m odificables ad e cu a d a s, se em plean otros m étodos para obtener un anim al no hum ano que com prenda la m odificación genética. D ichos m étodos incluyen, por ejem plo, m odificar el genom a de una célula no E S (por ejem plo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y em plear la transferen cia n u cle ar de cé lu la s som áticas (S C N T ) para transferir el genom a genéticam ente m odificado a una célula ad e cu ad a, por ejem plo, un ovocito d esn u cle ad o y gestar la célula m odificada (por ejem plo, el ovocito m odificado) en un anim al no hum ano en las con d icion es a d e cu a d a s para form ar un embrión. Los m étodos para m odificar un genom a anim al no hum ano (por ejem plo, un genom a de cerdo, vaca , roedor, pollo, etc.) incluyen, por ejem plo, el em pleo de una n u cle a sa de dedo de cinc (Z F N ) o una n u cle a sa efectora sim ilar a activador de la transcripción (T A L E N ) para m odificar un genom a para que incluya una se c u e n c ia de nucleótidos codificante.

En un aspecto, el anim al no hum ano e s un pequeño m amífero, por ejem plo, de la superfam ilia D ipodoidea o M uroidea. En un aspecto, el anim al genéticam ente m odificado e s un roedor. En un aspecto, el roedor se se le ccio n a entre un ratón, una rata y un hám ster. En un aspecto, el roedor se se le ccio n a de la superfam ilia M uroidea. En un aspecto, el anim al genéticam ente m odificado e s de una fam ilia se le ccio n a d a entre C a lo m yscid a e (por ejem plo, hám steres sim ilares a ratones), C ricetid ae (por ejem plo, hám ster, ratas y ratones del nuevo mundo, cam pañ oles), M uridae (ratones y ratas auténticos, jerb os, ratones e sp in o so s, ratas con cresta), N esom yidae (ratones trepadores, ratones de ab azón de las rocas, ratas co liblancas, ratas y ratones de M a d ag ascar), P latacanthom yidae (por ejem plo, lirón espin oso), y S p a la c id a e (por ejem plo, ratas topo, ratas del bambú, y zo ko re s). En un aspecto e specífico , el roedor genéticam ente m odificado se se le ccio n a de un ratón o rata auténticos (fam ilia M uridae), un jerbo, un ratón e sp in o so y una rata con cresta. En un aspecto, el ratón genéticam ente m odificado es un m iem bro de la fam ilia M uridae. En un aspecto, el anim al e s un roedor. En un aspecto específico , el roedor se se le ccio n a de un ratón y una rata. En un aspecto, el anim al no hum ano e s un ratón.

En un aspecto, el anim al no hum ano e s un roedor que e s un ratón de una ce p a C 57 B L se le ccio n a d a entre C 57B L /A , C 57B L /A n , C 57 B L /G rF a , C 57B L /K a L w N , C 57 B L /6 , C 57 B L /6 J, C 57 B L /6 B y J, C 57B L /6 N , C 57 B L /6 N J, C 57 B L /10 , C 57 B L /10 S c S n , C 57 B L /10 C r y C 57 B L /O Ia . En otro aspecto, el ratón e s una ce p a 129. En un aspecto, la ce p a 129 se se le cc io n a entre el grupo que con siste en 129 P 1, 129P 2, 129 P 3, 129 X 1, 129 S 1 (por ejem plo, 129 S 1 /S V , 129 S 1/S vlm ), 129 S 2, 129 S 4, 129 S 5, 129 S 9 /S v E v H , 129 S 6 (129 /S vE v T a c ), 129 S 7, 129S 8, 129 T 1, 129 T 2 (véa se, por ejemplo, Festing et al. (1999 ) R e v ise d nom enclature for strain 129 mice, M am m alian G en om e 10:836 , v é a s e tam bién, A uerbach et al. (2000) Establishm ent and C him era A n a ly sis of 129 /S v E v - and C 57B L /6 -D e rive d M ouse Em bryonic Stem Cell Lines). En un aspecto, el ratón genéticam ente m odificado e s una m ezcla de una ce p a 129 anteriorm ente m encionada y una ce p a C 57 B L anteriorm ente m en cion ad a (por ejem plo, una ce p a C 57 B L /6 ). En otro aspecto, el ratón es una m ezcla de las ce p a s 129 anteriorm ente m en cion ad as o una m ezcla de las ce p a s C 57 B L /6 anteriorm ente m encionadas. En un aspecto, la ce p a 129 de la m ezcla e s una ce p a 129 S 6 (129 /S vE v T a c ). En otro aspecto, el ratón e s una m ezcla de una ce p a procedente de 129 /S v E v y una C 57 B L /6. En un aspecto específico , el ratón es una m ezcla de una ce p a procedente de 129 /S v E v y una C 57 B L /6 , com o se d escrib e en A ue rb a ch et al. 2000 B io T e ch n iq u e s 29 :1024 -1032. En otro aspecto, el ratón e s una ce p a BALB, por ejem plo, ce p a BA LB /c. En otro aspecto, el ratón es una m ezcla de una ce p a B A LB (por ejem plo, ce p a B A LB /c) y otra ce p a anteriorm ente m encionada.

En un aspecto, el anim al no hum ano e s una rata. En un aspecto, la rata se se le ccio n a de una rata W istar, una ce p a LEA, una ce p a S p rag u e Dawley, una ce p a Fischer, F 344 , F6 y D ark Agouti. En un aspecto, la ce p a de rata es una m ezcla de dos o m ás de una ce p a se le ccio n a d a entre el grupo que con siste en W istar, LEA, S p rag u e Dawley, F ischer, F344, F6 y D ark Agouti.

En un aspecto, el anim al no hum ano e s un ratón. En un aspecto, el ratón e s un ratón hum anizado V E L O C IM M U N E ® .

Los ratones hum anizad os V E L O C IM M U N E ® (véa n se , por ejemplo, los docum entos U S 6.596.541, U S 7.105.348 y U S 20120322108 A 1 ), que contienen un reem plazo preciso de regiones va ria b le s de inm unoglobulina de ratón con regiones va ria b le s de inm unoglobulina hum anas en los locus end ó g e no s de ratón, presentan una similitud extraordinaria con los ratones de tipo silvestre respecto al desarrollo de linfocitos B. Los ratones hum anizad os V E L O C IM M U N E ® presentan una resp u esta de tipo silvestre e sencialm en te norm al a la inm unización que difiere únicam ente en un aspecto significativo respecto de los ratones de tipo silvestre - las regiones va ria b le s g e n e ra d a s en resp u esta a la inm unización son com pletam ente hum anas.

Los ratones hum anizad os V E L O C IM M U N E ® contienen un reem plazo preciso a gran e sca la de s e c u e n c ia s de nucleótidos de región variab le de línea germ inal de la ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina de ratón (IgH ) y la ca d e n a ligera de inm unoglobulina (por ejem plo, ca d e n a ligera k, IgK) con s e c u e n c ia s de nucleótidos de región variab le de inm unoglobulina hum ana correspondientes, en los locus e n d ógenos (vé a n se , por ejemplo, los docum entos U S 6.596.541, U S 7.105.348 y U S 20120322108 A 1 ). En total, se reem plazan aproxim adam ente s e is m e g a b a se s de locus de ratón con aproxim adam ente 1,5 m e g a b a se s de s e cu e n cia genóm ica hum ana. Este reem plazo preciso da com o resultado un ratón con locus de inm unoglobulina híbridos que producen c a d e n a s p e sa d a s y ligeras que tienen regiones variab le s h u m anas y una región constante de ratón. El reem plazo preciso de los segm en to s V h-D -J h y V k- J k de ratón dejan s e c u e n c ia s de ratón flan qu ean tes intactas y fu ncio nale s en los locus de inm unoglobulina híbridos. El sistem a inm unitario hum oral del ratón funciona com o el de un ratón de tipo silvestre. El desarrollo de linfocitos B no está im pedido en cu alq u ie r respecto significativo y se genera una rica diversidad de regiones va ria b le s h u m anas en el ratón tras la expo sición al antígeno.

Los ratones hum anizad os V E L O C IM M U N E ® son posib les debido a que los segm en to s g é n ico s de inm unoglobulina para las c a d e n a s p e sa d a s y ligeras k se reorganizan de m anera sim ilar en s e re s hum anos y ratones, lo que no equivale a d ecir que su s locus se a n igu ales o incluso que claram ente no lo son. S in em bargo, los locus son tienen una similitud suficiente com o para que pueda lograrse la hum anización del locus génico variab le de ca d e n a p e sa d a reem plazando aproxim adam ente tres m illones de pares de b a se s de s e cu e n cia de ratón contigua que contiene todos los segm ento s gé nico s V h, D y J h de ratón con aproxim adam ente un millón de b a se s de se cu e n cia genóm ica hum ana contigua que a b arca básicam ente la s e cu e n cia equivalente de un locus de inm unoglobulina hum ano.

En alg u n o s aspecto s, el reem plazo adicional de ciertas s e c u e n c ia s de nucleótidos de región constante de ratón con s e c u e n c ia s de nucleótidos de región constante hum ana (por ejem plo, reem plazo de la s e cu e n cia de nucleótidos de C h1 de ca d e n a p e sa d a de ratón con la se cu e n cia de nucleótidos de C h1 de ca d e n a p e sa d a hum ana y el reem plazo de la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera de ratón con la secuencia de nucleótidos de la región constante de cadena ligera humana) da como resultado ratones con locus de inmunoglobulina híbridos que producen

anticuerpos que tienen regiones variables humanas y regiones constantes parcialmente humanas, adecuadas para, por ejemplo, producir fragmentos de anticuerpo completamente humanos, por ejemplo, Fab completamente humanos. Los ratones con locus de inmunoglobulina híbridos muestran una reordenación de segmentos génicos variables normal, frecuencias de hipermutación somática normales y cambio de clase normal. Estos ratones muestran un sistema inmunitario humoral que es indistinguible del de ratones de tipo silvestre y presentan poblaciones de células normales en todas las etapas de desarrollo de linfocitos B y estructuras de órganos linfoides normales, incluso en los casos donde los ratones carecen de un repertorio completo de segmentos de nucleótidos de región variable humana. La inmunización de estos ratones da como resultado respuestas humorales robustas que presentan una gran diversidad de uso de segmentos génicos variables.

El reemplazo preciso de la secuencia de nucleótidos de la región variable de línea germinal de ratón permite producir ratones que tienen locus de inmunoglobulina parcialmente humanos. Debido a que los locus de inmunoglobulina parcialmente humanos se reordenan, hipermutan y cambian de clase de manera normal, los locus de inmunoglobulina parcialmente humanos generan anticuerpos en un ratón que comprende regiones variables humanas. Pueden identificarse y clonarse secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables, después se fusionan (por ejemplo, en un sistema in vitro) con cualquier secuencia de elección, por ejemplo, cualquier isotipo de inmunoglobulina adecuado para un uso particular, dando como resultado un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno procedente enteramente de secuencias humanas.

En diversos aspectos, está presente al menos un codón de histidina en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que codifica una región N-terminal, una región de bucle 4, una CDR1, una CDR2, una CDR3 o una combinación de las mismas.

En diversos aspectos, está presente al menos un codón de histidina en una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada no reorganizada que codifica una región marco (FR) seleccionada entre el grupo que consiste en FR1, FR2, FR3 y FR4.

En diversos aspectos, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una secuencia de nucleótidos en donde se ha reemplazado al menos un codón por un codón de histidina.

En diversos aspectos, el locus de inmunoglobulina genéticamente modificado comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada humana no reorganizada que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina endógeno por un codón de histidina.

Estudios anteriores acerca del uso de marcos de lectura de segmentos génicos D de inmunoglobulina humanos han demostrado que, de los tres marcos de lectura (es decir, parada, hidrófobo e hidrófilo), el marco de parada se usa de manera muy infrecuente. Aparentemente, algunos marcos de parada vuelven a procesarse y dan como resultado expresión. Sin embargo, los marcos de lectura de parada se usan con una frecuencia tan baja que a efectos del diseño de codones de histidina, es más eficiente no usar el marco de lectura de parada. En cuanto a los marcos de lectura hidrófilos e hidrófobos, parece preferirse el marco de lectura hidrófilo. Por lo tanto, en un aspecto, se diseña el marco de lectura hidrófilo de segmentos génicos D humanos para que contenga uno o más codones de histidina (en comparación con el marco de parada o con el marco hidrófobo).

Los métodos para introducir una mutación in vitro, por ejemplo, mutagénesis dirigida, son bien conocidas en la técnica. En algunos aspectos de la invención descrita, se enriquecen los codones de histidina diseñando segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina in silico (por ejemplo, mutación de codones de Y, D y N a codones de H, por ejemplo, CAT, CAC), que se sintetizan (por ejemplo, síntesis química) con sitios de enzimas de restricción (únicos) para volver a ligarlos juntos. Los segmentos génicos D sintetizados se preparan con las secuencias de señal de recombinación (RSS) adecuadas cadena arriba y cadena abajo. En un aspecto, cuando se ligan entre sí, los segmentos génicos D sustituidos con histidina sintetizados incluyen las secuencias intergénicas observadas en un ser humano entre cada segmento génico D.

Se entiende que los codones que codifican las una o más histidinas, tras su reorganización y/o hipermutación somática, pueden cambiar de tal forma que una o más de las histidinas se cambiarán a otro aminoácido. Sin embargo, esto puede no producirse para todos y ca d a uno de los co d o n es que codifican histidina, en todas y ca d a una de las reo rg an izacio ne s en el anim al no hum ano. En ca so de que se produzcan dichos cam bios, los cam b ios pueden producirse en alg u n o s pero no en todos los linfocitos B o en a lg u n as pero no tod as las s e c u e n c ia s v a ria b le s de ca d e n a pesada.

En d iverso s aspecto s, el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com prende un segm ento génico V, D y J de ca d e n a p e sa d a hum ana, en donde al m enos uno del segm ento génico D hum ano se ha invertido de 5' a 3' con respecto a una s e cu e n cia de tipo silvestre correspondiente y en donde al m enos un m arco de lectura del segm ento génico D hum ano invertido com prende un codón de histidina.

En d iverso s aspecto s, la s e cu e n cia de nucleótidos contiene uno o m ás, 2 o m ás, 3 o más, 4 o m ás, 5 o m ás, 6 o más, 7 o m ás, 8 o m ás, 9 o m ás, 10 o más, 11 o más, 12 o m ás, 13 o m ás, 14 o más, 15 o más, 16 o m ás, 17 o m ás, 18 o m ás, 19 o m ás, 20 o más, 21 o m ás, 22 o más, 23 o m ás, 24 o m ás o 25 o m ás de los co d o n es de histidina.

H ay 25 segm ento s gé nico s D hum anos fu ncio nale s en 6 fam ilias de 3-5 m iem bros ca d a una (una familia, la fam ilia D7, tiene un solo m iem bro). La recom binación directa de segm en to s g é n ico s D hum ano s es m ucho m ás frecuente que la inversión, au n qu e los m arcos de lectura invertidos m uestran m ás co d o n es de histidina. C iertos segm en to s g énicos D y m arcos de lectura se usan con m ás fre cu e n cia que otros. Los tres m arcos de lectura directos y los tres m arcos de lectura con orientación invertida para todos los segm en to s gé nico s D fu ncio nale s se presentan en las FIG . 10A -10 E . Tal com o se m uestra en las Figs. 10 A -10 E , hay m uchos m ás cod o n es de histidina en los m arcos de lectura invertidos que en los m arcos de lectura directos. M ás específicam ente, hay 34 histidinas en los m arcos de lectura invertidos y solo cuatro en los m arcos de lectura directos. A dem ás, de los cuatro m arcos de lectura directos, tres histidinas están cod ificadas por p se u d o g e n e s o presen tes en a lelo s alternos. Po r lo tanto, hay solo un m arco de lectura directo individual de un segm ento génico D hum ano de línea germ inal que contiene un codón de histidina, con co d o n es de histidina ad icio n ales posiblem ente encon trad os en a lelo s alternativos (posiblem ente en subco njunto s de la población hum ana).

L a s reo rd en acio nes de D invertidas son extrem adam ente raras. Tuaillon et al. (J. Immunol., 154 (12 ): 5453 -6465 ) dem ostró que el uso de m arcos de lectura invertidos (m edidos por P C T de dilución limitante) es muy raro, e s decir, que la relación de reo rd en acio nes directas a indirectas son, en la m ayoría de los ca so s, de 100 a 1000. En tanto que la relación de reorganización de directa a indirecta fue baja, solo se o b servó en aq u e llo s segm en to s D que m uestran un uso m uy bajo. T am bién se dem ostró que la fam ilia 7 del segm ento génico D, que está ubicada ad yacente a J1 (a distancia de otros m iem bros de la fam ilia de D) se u sa principalm ente en fetos, pero m uestra un bajo uso en adultos (S ch ro e d e r et al., Im m unology 30, 2006, 119 -135 ). P o r lo tanto, en un aspecto, las s e c u e n c ia s de la fam ilia 7 de D no están invertidas de 5' a 3'.

En un aspecto, al m enos dos, al m enos tres, al m enos cuatro, al m enos cinco, al m enos seis, al m enos siete, al m enos ocho, al m enos nueve, al m enos diez, al m enos once, al m enos doce, al m enos trece, al m enos catorce, al m enos quince, al m enos d iecisé is, al m enos diecisiete, al m enos dieciocho, al m enos d iecinueve, al m enos veinte, al m enos veintiuno, al m enos veintidós, al m enos veintitrés, al m enos veinticuatro o todos o sustancialm en te todos los segm ento s g é n ico s D hum ano s fu ncio nale s están invertidos de 5' a 3' con respecto a las s e c u e n c ia s de tipo silvestre correspondientes.

En un aspecto, el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana que com prende al m enos un resto de histidina de origen no natural presenta ca racte rísticas de unión a antígeno dependiente de pH. P o r ejem plo, un anticuerpo que com prende el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina m odificado se une a una diana con una afinidad suficiente a un pH aproxim adam ente neutro (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 7,0 a aproxim adam ente 7 ,4 ) pero o bien no se une o se une m ás débilm ente a la m ism a diana a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0). En un aspecto, el pH ácido se se le ccio n a de aproxim adam ente 5,5, aproxim adam ente 5,6, aproxim adam ente 5 ,7, aproxim adam ente 5,8, aproxim adam ente 5,9 y aproxim adam ente 6,0. En un aspecto, el pH neutro se se le ccio n a de aproxim adam ente 7,0, aproxim adam ente 7,1, aproxim adam ente 7,2, aproxim adam ente 7 ,3 y aproxim adam ente 7,4.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 2 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 25 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d o por el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado tiene una sem ivid a de d isociación (t1/2) de m enos de 1 min a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0) a 37 °C. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a e xp re sa d a por el locus de inm unoglobulina genéticam ente m odificado com o se d escrib e en el presente docum ento tiene al m enos 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 3 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 4 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 25 v e c e s o al m enos aproxim adam ente 30 v e c e s de reducción en la sem ivid a de d isociación (t1/2) a un pH ácido (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6 ,0) en com paración con la sem ivid a de disociación (ti/2) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro (por ejem plo, pH de aproxim adam ente 7,0 a aproxim adam ente 7,4).

En un aspecto, las proteínas de unión a antígeno que com prenden el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana genéticam ente m odificada son c a p a c e s de unirse esp e cíficam e nte a un antígeno de interés con una afinidad (K d) m enor de 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 o 10-10, 10-11, 10-12 a un pH neutro o fisiológico (pH de aproxim adam ente 7,0 a aproxim adam ente 7,4).

La propiedad de unión alterada del dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina a un pH ácido (por ejemplo, pH de aproxim adam ente 5,5 a aproxim adam ente 6,0) podría, en a lg u n as circu nstancias, permitir una renovación m ás rápida del anticuerpo debido a que el anticuerpo terapéutico se unirá a una diana sob re la superficie de una célula, se internalizará en un end osom a y se d iso ciará m ás fácilm ente o m ás rápidam ente de la diana en el endosom a, de tal form a que el agente terapéutico puede recic larse para unirse a otra m olécula m ás de diana presente en otra célula. Esto podría permitir la adm inistración de un anticuerpo terapéutico a una d o sis m enor o adm inistrar el anticuerpo terapéutico con m enor frecuencia. Esto e s particularm ente útil en una situación donde no e s d e se a b le adm inistrar frecuentem ente un anticuerpo terapéutico o adm inistrarlo a un nivel por encim a de una cierta d o sis por m otivos de seguridad o toxicidad.

En d iverso s aspecto s, la s e cu e n cia de nucleótidos de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana com o se d escrib e en el presente docum ento está unida operativam ente a una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a hum ana o no hum ana (por ejemplo, una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a que codifica un isotipo de inm unoglobulina sele ccio n ad o entre IgM, IgD, IgG, IgE e IgA). En d iversos aspecto s, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a hum ana o no hum ana se se le ccio n a entre el grupo que con siste en un C h1, una bisagra, un C h2, un C h3 y una com binación de los m ism os. En un aspecto, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante com prende un C h1, una bisagra, un C h2 y un C h3 (por ejemplo, C h1-bisagra-CH 2-CH 3).

En d iverso s aspecto s, la s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a está presente en un locus endógeno (e s decir, donde la s e cu e n cia de nucleótidos está u b icad a en un anim al no hum ano de tipo silvestre) o está presente de m anera ectópica (por ejemplo, en un locus diferente del locus de ca d e n a de inm unoglobulina endógeno en su genom a o en su locus endógeno, por ejem plo, en un locus variab le de inm unoglobulina, en donde el locus endógeno se coloca o m ueve a una ubicación diferente en el genom a).

El receptor de F c neonatal para IgG (F c R n ) se ha caracterizad o bien en la transferen cia de inm unidad hum oral p asiva de la m adre al feto a travé s de la placenta y el intestino delgado proxim al (R oopenian, D. y A kilesh, S., Nat. Rev. Immun., 2007, 7 :715 -725 ). F c R n se une a la porción F c de IgG en un sitio que e s distinto de los sitios de unión de los F c y R c lá sic o s o del com ponente C 1 q del com plem ento, que inicia la v ía c lá sic a de activación del com plem ento. M ás específicam ente, se ha dem ostrado que F c R n se une a la región C h2 -C h3 b isagra de anticuerpos IgG - una región de F c versátil que tam bién se une a la proteína A estafilocócica, la proteína G estreptocócica y el factor reum atoide. A diferencia de otras proteínas de unión a Fc, sin em bargo, F c R n se une a la región F c de IgG de una m anera estrictam ente dependiente de pH; a un pH fisiológico de 7,4, F cR n no se une a IgG, m ientras que al pH ácido del endosom a (por ejem plo, donde el pH v a ría de aproxim adam ente 5,5 a aproxim adam ente 6,0), F c R n m uestra una baja afinidad de m icrom olar a nanom olar por la región F c de IgG. S e ha dem ostrado que esta interacción dependiente de pH está m ediada por la titulación de restos de histidina en la región C h2 -C h3 de IgG y su posterior interacción con un resto ácido en la superficie de F c R n (R oopenian, D. y A kilesh, S., Nat. R ev. Immun., 2007, 7 :715 -725 ).

S e con ocen en la técn ica d iv e rsa s m utaciones en la región C h2 -C h3 de IgG que pueden aum entar la afinidad de la región F c por F c R n a un pH ácido. E sta s incluyen, pero sin limitación, m odificación en la posición 250 (por ejem plo, E o Q); 250 y 428 (por ejem plo, L o F); 252 (por ejem plo, L /Y /F /W o T), 254 (por ejem plo, S o T ) y 256 (por ejemplo, S /r /q /E /D o T); o una m odificación en 428 y/o 433 (por ejem plo, L /R /S /P /Q o K) y/o 434 (por ejem plo, H /F o y ); o una m odificación en 250 y/o 428; o una m odificación en 307 o 308 (por ejem plo, 308 F , V 308 F ) y 434. En otro ejem plo, la m odificación puede com prender una m odificación 428 L (por ejemplo, M 428L) y 434 S (por ejemplo, N 434S ); una m odificación 428L, 259I (por ejem plo, V 259 I) y una 308 F (por ejem plo, V 308 F ); una m odificación 433 K (por ejemplo, H 433 K ) y una 434 (por ejem plo, 434 Y ); una m odificación 252, 254 y 256 (por ejemplo, 52Y, 254T , y 256 E ); una m odificación 250 Q y 428 L o una com binación de las m ism as.

En un aspecto, la se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a codifica una s e cu e n cia de am ino ácid os de C h2 hum ana que com prende al m enos una m odificación entre los restos de am inoácido en las po sicio n e s 252 y 257, en donde la m odificación aum enta la afinidad de la s e cu e n cia de am ino ácid os de C h2 hum ana por F c R n en un am biente ácido (por ejem plo, en un e nd osom a donde el pH v a ría de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0).

En un aspecto, la se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a codifica una s e cu e n cia de am ino ácid os de CH2 hum ana que com prende al m enos una m odificación entre los restos de am inoácido en las po sicio n e s 307 y 311, en donde la m odificación aum enta la afinidad de la se cu e n cia de am ino ácid os C h 2 por F cR n en un am biente ácido (por ejem plo, en un endosom a, donde el pH v a ría de aproxim adam ente 5 ,5 a aproxim adam ente 6,0).

En un aspecto, la se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a codifica una s e cu e n cia de am ino ácid os de C h3 hum ana, en donde la s e cu e n cia de am ino ácid os de C h3 com prende al m enos una m odificación entre los restos de am inoácido en las po sicio ne s 433 y 436, en donde la m odificación aum enta la afinidad de la se cu e n cia de am ino ácid os C h 3 por F c R n en un am biente ácido (por ejemplo, en un endosom a, donde el pH v a ría de aproxim adam ente 5,5 a aproxim adam ente 6,0).

En un aspecto, la s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante hum ana codificada por la se cu e n cia de nucleótidos de región constante de ca d e n a p e sa d a d escrita en el presente docum ento com prende una m utación se le ccio n a d a entre el grupo que con siste en M 428L, N 434 S y una com binación de las m ism as. En un aspecto, la s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante hum ana com prende una m utación se le ccio n a d a entre el grupo que con siste en M 428L, V 259I, V 308 F y una com binación de las m ism as. En un aspecto, la se cu e n cia de am ino ácid os de región constante hum ana com prende una m utación N 434A . En un aspecto, la s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante hum ana com prende una m utación se le ccio n a d a entre el grupo que con siste en M 252Y, S 254 T , T 256 E y una com binación de las m ism as. En un aspecto, la s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante hum ana com prende una m utación se le ccio n a d a entre el grupo que con siste en T 250Q , M 248L o am bas. En un aspecto, la se cu e n cia de am ino ácid os de región constante hum ana com prende una m utación se le ccio n a d a entre el grupo que con siste en H 433K , N 434 Y o am bas.

Restos de Histidina Diseñados en Genes de Cadenas Ligeras de Inmunoglobulinas

En d iverso s aspecto s, se d escrib en an im a le s no hum anos genéticam ente m odificados (por ejem plo, m am íferos, por ejem plo, ratones, ratas, conejos, etc.) que com prenden en su genom a, por ejem plo, en su línea germ inal, se c u e n c ia (s ) de nucleótidos que codifican m oléculas de an ticuerpo s hum anos que m uestran unión a antígeno dependiente del pH, por ejemplo, una s e cu e n cia de nucleótidos de la ca d e n a ligera de inm unoglobulina que com prende una se cu e n cia de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a que codifica anticuerpos que m uestran unión a antígeno dependiente del pH; em briones, cé lu la s y tejidos que com prenden los m ism os; m étodos para producir los m ism os; a s í com o m étodos de uso de los m ism os.

Los inventores han d escubierto que los an im ales no hum anos que e xp re sa n anticuerpos que son ca p a c e s de unirse a un antígeno de una m anera dependiente del pH se pueden producir m ediante m odificaciones de una región variab le de la ca d e n a ligera de inm unoglobulina en una o m ás po sicio n e s a lo largo de la s e cu e n cia de la ca d e n a ligera. S e describ en m étodos para rea lizar m odificaciones en la línea germ inal de un anim al no hum ano para que el anim al e xp re se histidinas en las C D R de anticuerpos. En particular, se describ en m étodos para rea lizar m odificaciones en una se cu e n cia variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina en la línea germ inal de ratones. La s e cu e n cia de la región variable, por ejem plo, de c a d e n a s ligeras, por lo general, m uestran una hiperm utación som ática a lo largo de la se cu e n cia de la región variab le y, en alg u n o s ca so s, tales m utaciones pueden dar com o resultado una sustitución de restos de histidina (véa se, por ejem plo, F IG . 15). D ich as m utaciones pueden ocurrir incluso en regiones determ inantes de la com plem entariedad (C D R ), que son las regiones de dom inios va ria b le s re sp o n sa b le s de la unión a antígeno. En algu n os ca so s, tales m utaciones pueden d ar com o resultado anticuerpos que presentan una unión a antígeno dependiente del pH, por ejem plo, una unión reducida al antígeno a un pH ácido en com paración con la unión a antígeno a un pH neutro. D icha unión a antígeno dependiente del pH se d e se a porque puede permitir que el anticuerpo se una al antígeno fuera de la célula y, cuan do se internaliza en un endosom a, libera el antígeno y lo recicla de nuevo a la superficie para unirse a otro antígeno, evitando el aclaram iento m ediado por la diana. S e han com unicad o enfoq ues para introducir restos de histidina para lograr este efecto m ediante el uso de una m utagénesis de barrido de his aleatoria para d iseñ a r propied ades de unión depend ientes del pH en anticuerpos anti-IL-6R (U S 2011 /0111406 A 1). Sin em bargo, la m utagénesis aleatoria de los restos de anticuerpos puede d ar com o resultado una dism inución de la afinidad del anticuerpo al antígeno. Un anim al no hum ano genéticam ente m odificado para e xp re sa r una sustitución de histidina en la s e cu e n cia del anticuerpo permite la generación de anticuerpos de alta afinidad en resp u esta a un antígeno de interés que, debido a la(s) m odificación(es) con histidina, tam bién p resen taría la unión del antígeno dependiente del pH.

Por lo tanto, en vario s aspecto s, en el presente docum ento se d escrib e un anim al no hum ano genéticam ente m odificado ( por ejem plo, roedor, por ejem plo, un ratón o una rata) que com prende en su genom a, por ejem plo, su línea germ inal, una se c u e n c ia de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana que com prende m odificaciones que dan com o resultado que el anim al e xp re se anticuerpos c a p a c e s de unirse a an tígeno s de una m anera dependiente del pH. En un aspecto, el anim al no hum ano com prende m odificaciones en la s e cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana (por ejemplo, la s e cu e n cia del segm ento V l y/o J l) que com prende su stitu cio nes en al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina (en alg u n o s ca so s, tam bién puede d enom inarse "sustitución de histidina" "sustitución de codón de histidina", o sim ilares). En un aspecto, el anim al com prende al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina en una s e cu e n cia de nucleótidos de una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ; por ejem plo, C D R 1 , C D R 2 y/o C D R 3 de una ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana. En un aspecto, la sustitución e s en un codón de C D R 3. En un aspecto, la ca d e n a ligera e s una ca d e n a ligera k. En un aspecto, el anim al e xp re sa una ca d e n a ligera de inm unoglobulina, por ejem plo, una C D R de ca d e n a ligera, por ejem plo, una C D R 3 de ca d e n a ligera, que com prende una sustitución de la m enos un am inoácido con una histidina. En otro aspecto, la ca d e n a ligera es una ca d e n a ligera A. En otro aspecto m ás, el ratón com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina en am b as ca d e n a s k y A.

Un resto de histidina está codificado por dos co d o n es diferentes, C A T y C A C (resto s de ácido desoxirribonucleico). P o r lo tanto, un codón distinto de histidina puede estar sustituido con un C A T o un C A C . La sustitución se d iseñ a en un codón que en su configuración de línea germ inal (e s decir, en estado mutado no som ático) no codifica un resto de histidina.

En un aspecto, una ca d e n a ligera e s una ca d e n a ligera universal (tam bién denom inada ca d e n a ligera com ún). Com o se d escrib e en las Solicitudes de Patente de los E sta d o s U nidos n.° 13/022.759 , 13/093.156 , 13 /412.936 y 13/488.628 (P u b lica c io n e s de Solicitud de los E sta d o s U nidos n.° 2011 /0195454 , 2012 /0021409 , 2012 /0192300 y 2013/0045492 ), un anim al no hum ano (por ejem plo, un ratón) que se le ccio n a una ca d e n a ligera com ún para una pluralidad de ca d e n a s p e sa d a s tiene una utilidad práctica. En d iverso s aspecto s, los anticuerpos e xp re sa d o s en un anim al no hum ano que com prende solo una ca d e n a ligera com ún tendrán c a d e n a s p e sa d a s que pueden a so c ia rse y e xp re sa rse con una ca d e n a ligera idéntica o sustancialm en te idéntica. Esto e s particularm ente útil en la producción de anticuerpos b iespecíficos. Por ejem plo, un anim al de este tipo puede inm unizarse con un prim er inm unógeno para g e n e rar un linfocito B que e xp re sa un anticuerpo que se une e sp e cífica m e n te a un prim er epítopo. El anim al (o un anim al genéticam ente igual) se puede inm unizar con un segu nd o inm unógeno para ge ne rar un linfocito B que e xp re sa un anticuerpo que se une esp e cíficam e nte al segu nd o epítopo. L a s regiones de ca d e n a p e sa d a va ria b le s pueden clo narse a partir de linfocitos B y e x p re sa rse con la m ism a región constante de ca d e n a p e sa d a y la m ism a ca d e n a ligera (por ejem plo, una ca d e n a ligera com ún) en una célula para producir un anticuerpo biespecífico, en donde el com ponente de ca d e n a p e sa d a del anticuerpo b iespecífico ha sido se le ccio n a d o m ediante un anim al para a s o c ia rse y e xp re sa rse con el m ism o com ponente de la ca d e n a ligera. En vario s asp e cto s descritos, las regiones v a ria b le s de los ratones m odificados por ingeniería genética son regiones va ria b le s hum anas.

Por lo tanto, se diseñó un ratón que e s ca p a z de ge n e rar ca d e n a s ligeras de inm unoglobulina que se em parejarán de m anera a d e cu ad a con una fam ilia bastante diversa de c a d e n a s p e sa d a s, incluidas las c a d e n a s p e sa d a s cu y as regiones va ria b le s hum anas se sep a ra n de las se c u e n c ia s de la lín ea germ inal, por ejem plo, las regiones va ria b le s m ad urad as por afinidad o m utadas som áticam ente. En d iverso s aspecto s, el ratón está ideado para em parejar dom inios va ria b le s de ca d e n a ligera hum ana con dom inios v a ria b le s de ca d e n a p e sa d a hum ana que com prenden m utaciones som áticas, perm itiendo a s í una ruta a proteínas de unión de alta afinidad a d e cu a d a s para su uso com o agentes terapéutico s hum anos.

El ratón m odificado por ingeniería genética, a través del largo y com plejo proceso de sele cció n de anticuerpos dentro de un organism o, toma d e cisio n e s biológicam ente ap ro p ia d a s al em parejar una colección d iversa de dom inios va ria b le s de ca d e n a p e sa d a hum ana con un núm ero limitado de op cio n e s de ca d e n a ligera hum ana. C o n el fin de lograr esto, el ratón está d iseñ a d o para presen tar un núm ero limitado de o p ciones de dom inio variab le de ca d e n a ligera hum ana junto con una am plia variedad de o p ciones de dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana. Al exponerle con un inm unógeno, el ratón m axim iza el núm ero de so lu cio n es en su repertorio para d esarro llar un anticuerpo para el inm unógeno, limitado en gran parte o únicam ente por el núm ero o las o p ciones de ca d e n a ligera en su repertorio. En d iverso s aspecto s, esto incluye permitir que el ratón logre m utaciones som áticas a d e cu a d a s y com patibles del dom inio variab le de la ca d e n a ligera que, sin em bargo, serán com patibles con una variedad relativam ente grande de dom inios va ria b le s de la ca d e n a p e sa d a hum ana, incluidos en particular dom inios v a ria b le s de la ca d e n a p e sa d a hum ana m utados som áticam ente.

El ratón con ca d e n a ligera com ún d iseñ a d a descrito en las P u b lica cio n e s de Solicitud de los E sta d o s U nidos n.° 2011 /0195454 , 2012 /0021409 , 2012 /0192300 y 2013 /0045492 com pren día s e c u e n c ia s de ácido nucleico que codifican un repertorio limitado de o p cio n e s de ca d e n a ligera, por ejem plo, ca d e n a ligera com ún o universal "U L C " que com prendía no m ás de dos segm en to s V l o una so la s e cu e n cia de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rgan izad a individual. P a ra lograr tal repertorio limitado, se d iseñó un ratón para h a ce r no funcional o sustancialm ente no funcional para producir o reorganizar, un dom inio variab le de ca d e n a ligera de ratón natural. En un aspecto, esto se logró, por ejem plo, elim inando los segm ento s gé nico s de la región variab le de ca d e n a ligera del ratón. Com o se ha descrito anteriorm ente, el locus del ratón endógeno puede m odificarse d e sp u é s m ediante segm ento s gé nico s de la región variab le de la ca d e n a ligera hum ana e xó g en o s ad e cu ad o s, operativam ente unidos al dom inio constante de la ca d e n a ligera del ratón endógeno, de m anera tal que los segm en to s gé nico s de la región variab le hum ana e xó g en o s se puedan com binar con el gen de la región constante de la ca d e n a ligera de ratón exógeno y form ar un gen de ca d e n a ligera quim érico inverso reordenado (variab le hum ana, constante de ratón). En d iverso s aspecto s, la región variab le de la ca d e n a ligera e s ca p a z de s e r m utada som áticam ente. En d iverso s aspecto s, para m axim izar la ca pa cid ad de la región variab le de la ca d e n a ligera para ad quirir m utaciones som áticas, se co n servan en el ratón los potenciadores apropiados. En un aspecto, al m odificar un locus de ca d e n a ligera k de ratón para reem plazar segm ento s gé nico s de ca d e n a ligera k de ratón end ó g e n o s con segm en to s g é n ico s de ca d e n a ligera k hum ana, el potenciador intrónico k de ratón y el potenciador 3' k de ratón se m antienen, o no se interrum pen funcionalm ente.

Por lo tanto, se describió un ratón m odificado por ingeniería genética que e xp re sa un repertorio limitado de ca d e n a s ligeras qu im éricas in v e rsa s (variab le hum ana, constante de ratón) a so c ia d a s con una d iversidad de ca d e n a s p e sa d a s qu im éricas in ve rsa s (variab le hum ana, constante de ratón). En d iverso s aspecto s, los segm ento s del gen de la ca d e n a ligera k de ratón e nd ógenos se elim inan y se reem plazan con una so la (o dos) región o regiones de la ca d e n a ligera hum ana reordenada, unida operativam ente al gen C k de ratón endógeno. En asp e cto s para m axim izar la hiperm utación som ática de la región de la ca d e n a ligera hum ana reordenada, se m antienen el potenciador intrónico k de ratón y el potenciador 3' k de ratón. En d iverso s aspecto s, el ratón tam bién com prende un locus de ca d e n a ligera A no funcional, o una elim inación del m ism o o una elim inación que hace que el locus s e a in cap az de form ar una ca d e n a ligera A.

El ratón con ca d e n a ligera universal generó anticuerpos en resp u esta a d iverso s an tígeno s que eran c a p a c e s de utilizar un repertorio d iverso de se c u e n c ia s de región variab le de ca d e n a pesada, que com prende un repertorio diverso de segm en to s V h, Dh y J h. Los anticuerpos ge n e rad o s en dicho ratón U L C m odificado por ingeniería genética son útiles para d ise ñ a r an ticuerpo s terapéuticos biespecíficos; sin em bargo, com o con cu alq u ie r otro anticuerpo, ca d a anticuerpo b iespecífico solo puede unirse a una diana durante su vid a en el plasm a; el anticuerpo se internaliza en un endosom a y se dirige a degradación por lisosom as. Los estudios han dem ostrado que el receptor F cy tipo M H C de c la se I, F cR n , e s ca p a z de rescatar las inm unoglobulinas de la d egrad ación lisosóm ica al recic larlas de nuevo en la superficie ce lu lar del end osom a de clasificación. S im ister y M ostov (1989 ) An F c receptor structurally related to M H C c la ss I antigens. Nature 337 : 184-87. Com o se ha explicad o anteriorm ente, para m ejorar la eficacia del reciclaje de anticuerpos, las m odificaciones ad icio n ales a las se c u e n c ia s de anticuerpos, por ejem plo, las m odificaciones que dan com o resultado una unión a antígeno dism inuida a pH ácido (por ejem plo, el pH del endosom a), a la v e z que se co n se rv a la afinidad y especificid ad de anticuerpo-antígeno a pH neutro (por ejem plo, pH de fluidos corporales, tales com o sa n g re ) son ben eficiosas. Los an im ales no hum anos descrito s en el presente docum ento, en donde se sustituyen restos distintos de histidina por restos de histidina en la se c u e n c ia de ca d e n a ligera universal, son b en eficiosos debido a que son c a p a c e s de producir anticuerpos de alta afinidad b a sá n d o se en el formato de ca d e n a ligera universal que tam bién m uestran unión dependiente de pH, por ejem plo, presenta una unión reducida al antígeno a pH ácido frente a neutro.

Por lo tanto, en un aspecto, en el presente docum ento se d escrib e un anim al no hum ano ( por ejem plo, un roedor, por ejem plo, un ratón o una rata) que com prende en su genom a, por ejem plo, en su línea germ inal, un repertorio limitado de regiones va ria b le s de ca d e n a ligera hum ana, o una región variab le de ca d e n a ligera hum ana única, de un repertorio limitado de segm en to s g é n ico s va ria b le s de ca d e n a ligera hum ana, en donde la región o regiones va ria b le s de la ca d e n a ligera hum ana com prenden al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina. En algu n os aspecto s, los an im ales no hum anos descrito s están m odificados por ingeniería genética para incluir un solo segm ento génico de la región variab le de ca d e n a ligera hum ana no reo rd enad a (o d os segm entos gé nico s de la región variab le de ca d e n a ligera hum ana) que se reordena para form ar un gen de la región variab le de ca d e n a ligera hum ana reo rd enad a (o d os g e n e s de la región variab le de ca d e n a ligera reo rd enad a g e n e s de la región) que e xp re sa n una única ca d e n a ligera (o que e xp re sa n una o am b as c a d e n a s ligeras), en donde el o los g e n e s de la región variab le de ca d e n a ligera com prenden una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina. Los dom inios va ria b le s de ca d e n a ligera hum ana reo rd en ad os cod ificado s por esto s g e n e s de región variab le de ca d e n a ligera sustituidos con histidina son c a p a c e s de em p are jarse con una pluralidad de c a d e n a s p e sa d a s hum anas m ad urad as por afinidad se le cc io n a d a s por los anim ales, en donde las regiones va ria b le s de ca d e n a p e sa d a se unen esp e cíficam e nte a diferentes epítopos. En d iverso s aspecto s, la al m enos una sustitución de un resto de no histidina con un resto de histidina da com o resultado una ca d e n a ligera hum ana reo rd enad a que, cu an d o se e xp re sa con una ca d e n a p e sa d a afín, se une a su antígeno en una form a dependiente del pH.

S e describ en an im ales genéticam ente m odificados que e xp re sa n un repertorio limitado de dom inios va ria b le s de ca d e n a ligera hum ana, o un único dom inio variab le de ca d e n a ligera hum ana, de un repertorio limitado de se c u e n c ia s de g e n e s de región variab le de ca d e n a ligera hum ana, en donde las s e c u e n c ia s de g e n e s de región variab le com prenden al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina con un codón de histidina. En alg u n o s aspecto s, los an im ales descrito s se obtienen por ingeniería genética para incluir una única s e cu e n cia de ca d e n a ligera hum ana V /J (o dos s e c u e n c ia s V /J) que com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina y e xp re sa una región variab le de una so la ca d e n a ligera (o que e xp re sa una o las dos regiones variab les). En un aspecto, una ca d e n a ligera que com prende la s e cu e n cia variab le e s ca p a z de em p are jarse con una pluralidad de c a d e n a s p e sa d a s h u m anas m ad urad as por afinidad se le cc io n a d a s de m anera clonal por el anim al, en donde las regiones va ria b le s de ca d e n a p e sa d a se unen e specíficam ente a diferentes epítopos. En un aspecto, el anticuerpo se une a s u (s ) an tíg e n o (s) en una form a dependiente del pH. En un aspecto, la se cu e n cia de la ca d e n a ligera hum ana V /J única se se le cc io n a de V k1 -39 J k5 y V k3 -20 J k 1. En un aspecto, las dos s e c u e n c ia s V /J son V k 1 -39 J k5 y V k3-20 J k 1. En un aspecto, las s e c u e n c ia s V k 1 -39 J k5 y V k3 -20 J k 1 son s e c u e n c ia s V /J reordenadas.

En un aspecto, se d escrib e un anim al no hum ano genéticam ente m odificado que com prende un único segm ento génico V l de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana que es ca p a z de reo rd en arse con un segm ento génico J l hum ano (se le ccio n a d o de uno o una pluralidad de segm ento s J l) y codificar un dom inio variab le hum ano de un ca d e n a ligera de inm unoglobulina, en donde el segm ento génico V l de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana individual y/o el segm ento génico J l hum ano com prende una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina. En otro aspecto, se d escrib e un ratón genéticam ente m odificado que com prende no m ás de dos segm ento s g énicos VL hum anos, ca d a uno de los cu a le s es ca p a z de reo rd en arse con un segm ento génico JL hum ano (sele ccio n ad o de uno o una pluralidad de segm en to s J l) y que codifica un dom inio variab le hum ano de una ca d e n a ligera de inm unoglobulina, en donde ca d a uno de los no m ás de dos segm en to s gé nico s V l y/o el segm ento génico J l com prende una sustitución de al m enos un resto distinto de histidina por un resto de histidina.

T am bién se d escrib e en el presente docum ento un anim al no hum ano genéticam ente m odificado que com prende en su genom a, por ejem plo, en su línea germ inal, una s e cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única que com prende s e c u e n c ia s VL y JL hum anas en donde la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina. En un aspecto, la se cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única deriva de s e c u e n c ia s de g e n e s V l y J l de la línea germ inal hum ana, pero para las su stitu cio nes de histidina. En un aspecto, la ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana es una ca d e n a k de inm unoglobulina hum ana. Por lo tanto, en un aspecto, los segm en to s g énicos V l hum anos se sele ccio n an de V k 1-39 y V k3-20. En un aspecto, la s e cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reordenada com prende la se cu e n cia V k 1-39 /J o V k3-20 /J reordenada. En un aspecto, la s e cu e n cia del gen J l hum ano se se le cc io n a de J k 1, J k2, J k3, J k4 y J k5. En un aspecto, la se cu e n cia J l hum ana se se le ccio n a de J k 1 y J k5. En un aspecto, la s e cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única se se le cc io n a de V k1 -39 J k5 y V k3 -20 J k 1 (por ejem plo, pero para las sustitucio nes de histidina). En un aspecto alternativo, la ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana e s una ca d e n a A hum ana.

En un aspecto, la sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina está en la s e cu e n cia de nucleótidos que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ) del dom inio variab le de ca d e n a ligera. En un aspecto, la sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina está en la s e cu e n cia de nucleótidos que codifica C D R 1, C D R 2 o C D R 3 del dom inio variab le de ca d e n a ligera. En un aspecto específico , la sustitución está en la s e cu e n cia de nucleótidos que codifica C D R 3.

En un aspecto, la sustitución e s de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina en el codón de C D R 3 de la s e cu e n cia del gen de la región variab le de la ca d e n a ligera hum ana. En un aspecto, la sustitución e s de uno, dos, tres, cuatro o m ás co d o n es de C D R 3. En el aspecto en donde la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rgan izad a individual es una región variab le V k1 -39 J k5, el reem plazo de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina com prende un reem plazo en una posición en la s e cu e n cia del gen de la ca d e n a ligera de inm unoglobulina que codifica C D R 3 d iseñ a d o para e xp re sa r histidina en una posición se le ccio n a d a entre 105, 106, 108, 111 y una com binación de las m ism as. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las p o sicio n e s 105 y 106. En un aspecto, el reem plazo se d iseña para e xp re sa r histidina en las po sicio n e s 105 y 111. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e x p re sa r histidina en las po sicio n e s 105 y 108. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las p o sicio n e s 105, 108 y 111. En un aspecto, el reem plazo se d iseña para e xp re sa r histidina en las po sicio ne s 105, 106 y 108. En un aspecto, el reem plazo se d iseña para e xp re sa r histidina en las po sicio ne s 106 y 108. En un aspecto, el reem plazo se d iseña para e xp re sa r histidina en las po sicio ne s 106 y 111. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las po sicio ne s 108 y 111. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las po sicio n e s 106, 108 y 111. En otro asp e cto más, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las p o sicio n e s 106, 108 y 111. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las po sicio ne s 105, 106 y 111. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las po sicio ne s 105, 106, 108 y 111. Las s e c u e n c ia s de ácido nucleico y de am ino ácid os de las regiones sustituidas con histidina se representan en el alineam iento de s e c u e n c ia s de la FIG . 16 y se exponen en las S E Q ID NO: 327 -357.

En el aspecto en donde la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rganizad a individual es una región variab le V k3 -20 J k 1, el reem plazo de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina com prende un reem plazo en una posición en la s e cu e n cia del gen de la ca d e n a ligera de inm unoglobulina que codifica la región C D R 3 que está d iseñ a d o para e xp re sa r histidina en una posición se le ccio n a d a entre 105, 106, 107, 109 y una com binación de las m ism as. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las po sicio n e s 105 y 106. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las po sicio n e s 105 y 107. En un aspecto, el reem plazo se d iseña para e xp re sa r histidina en las po sicio ne s 105 y 109. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las p o sicio n e s 106 y 107. En un aspecto, el reem plazo se d iseña para e xp re sa r histidina en las po sicio n e s 106 y 109. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e x p re sa r histidina en las po sicio n e s 107 y 109. En un aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e xp re sa r histidina en las p o sicio n e s 105, 106 y 107. En un aspecto, el reem plazo se d iseña para e xp re sa r histidina en las po sicio ne s 105, 107 y 109. En un aspecto, el reem plazo se d iseña para e xp re sa r histidina en las po sicio ne s 106, 108 y 111. En un aspecto, el reem plazo se d ise ñ a para e x p re sa r histidina en las po sicio ne s 105, 106 y 109. En otro aspecto, el reem plazo se d iseñ a para e x p re sa r histidina en las po sicio ne s 105, 106, 107 y 109. Las s e c u e n c ia s de ácido nucleico y am ino ácid os de regiones sustituidas con histidina ejem plares se representan en el alineam iento de s e cu e n cia de la FIG . 27 y se exponen en las S E Q ID NO: 398 -403.

Las po sicio n e s de los am ino ácid os (105, 106, etc.) se b asan en una num eración única d escrita en Lefranc et al. (2003 ) Dev. Com p. Immunol. 27 :55 -77 , y tam bién se pueden ve r en w w w .im gt.org.

En un aspecto, el segm ento génico V l hum ano está unido operativam ente a una s e cu e n cia líder hum ana o no hum ana. En un aspecto, la s e cu e n cia líder e s una s e cu e n cia líder no hum ana. En un asp e cto e specífico , la se cu e n cia líder no hum ana e s una se cu e n cia líder V k3 -7 de ratón. En un asp e cto e specífico , la s e cu e n cia líder está unida operativam ente a un segm ento génico V l hum ano no reordenado. En un aspecto específico , la s e cu e n cia líder está unida operativam ente a una s e cu e n cia V l/ J l hum ana reordenada. P o r lo tanto, en un aspecto e specífico , la s e cu e n cia génica de la región variab le de V k1 -39 /J k5 o V k3 -20 /J k 1 reo rd enad a única que com prende al m enos una sustitución de histidina está unida operativam ente a una s e cu e n cia líder V k3 -7 de ratón.

En un aspecto, el segm ento génico V l hum ano está unido operativam ente a una s e cu e n cia promotora de inm unoglobulina. En un aspecto, la se cu e n cia promotora es una s e cu e n cia promotora hum ana. En un aspecto específico , el promotor de inm unoglobulina hum ana e s un promotor V k3 -15 hum ano. En un asp e cto e specífico , el promotor está unido operativam ente a un segm ento génico V l hum ano no reordenado. En un aspecto específico , el promotor está operativam ente unido a una s e cu e n cia V l/ J l hum ana reordenada. P o r lo tanto, en un aspecto específico, la s e cu e n cia g é nica de la región variab le de V k 1 -39 /J k5 o V k3 -20 /J k1 reo rd en ad a única que com prende al m enos una sustitución de histidina está unida operativam ente al promotor V k3 -15 hum ano.

En un aspecto, el locus de ca d e n a ligera com prende una s e cu e n cia líder flan qu e ad a en 5' (con respecto a la dirección transcripcional de un segm ento génico V l) con un promotor de inm unoglobulina hum ano y flanqueado en 3' con un segm ento génico V l hum ano que se reorganiza con un segm ento J l hum ano y codifica un dom inio variab le de una ca d e n a ligera quim érica in versa que com prende una región constante de ca d e n a ligera no hum ana end ógena (CL). En un aspecto específico , los segm ento s de los g e n e s V l y J l están en el locus V k no hum ano, y la C L no hum ana es una C k no hum ana (por ejem plo, C k de ratón). En un aspecto específico , la s e cu e n cia de la región variab le está unida operativam ente a la s e cu e n cia de la región constante no hum ana, por ejem plo, la s e cu e n cia del gen C k no hum ano. En un aspecto, el locus de la ca d e n a ligera com prende una s e cu e n cia líder 5' flan qu e ad a (con respecto a la dirección transcripcional de un segm ento génico V l) con un promotor de inm unoglobulina hum ana y 3' flan qu ead a en con una se cu e n cia de región variab le hum ana reo rd enad a (se cu e n cia V l/ J l ) y codifica un dom inio variab le de una ca d e n a ligera inversa que com prende una región constante de ca d e n a ligera no hum ana end ógena (C L). En un aspecto e specífico , la s e cu e n cia V l/ J l hum ana reo rd enad a está en el locus kappa ( k ) no hum ano y la C L no hum ana e s una C k no hum ana. En un aspecto específico , la s e cu e n cia de región variab le hum ana reo rgan izad a está unida operativam ente a la s e cu e n cia de región constante de ca d e n a ligera de inm unoglobulina no hum ana, por ejem plo, la se cu e n cia del gen C k no hum ano. En un aspecto, la s e cu e n cia de la región constante de ca d e n a ligera de inm unoglobulina no hum ana e s una se c u e n c ia no hum ana endógena. En un aspecto, el anim al no hum ano e s un ratón y la se cu e n cia del gen C k e s una s e cu e n cia del gen C k de ratón. En un aspecto, la s e cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reordenada que com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina se encuentra en el locus de la ca d e n a ligera de inm unoglobulina no hum ana (por ejem plo, ratón) endógeno (lo cus k). Los asp e cto s e je m plares del locus se presentan en las F IG S . 23 C , 23 E , 29 C y 29D.

En un aspecto, el anim al no hum ano m odificado genéticam ente e s un ratón, y el locus de la región variab le del ratón es un locus de ca d e n a ligera k y el locus de la ca d e n a ligera k com prende un potenciador intrónico k de ratón, un potenciador k 3' de ratón o tanto un potenciador intrónico com o un potenciador 3'.

En un aspecto, el anim al no hum ano (por ejem plo, un roedor, por ejemplo, una rata o un ratón) com prende un locus de ca d e n a ligera lam bda (A) de inm unoglobulina no funcional. En un asp e cto específico , el locus de la ca d e n a ligera A com prende una elim inación de una o m ás s e c u e n c ia s del locus, en donde la una o m ás d ele cio n e s hacen que el locus de la ca d e n a ligera A s e a in cap az de reo rd en arse para form ar un gen de ca d e n a ligera. En otro aspecto, se elim ina la totalidad o sustancialm en te todos los segm en to s gé nico s V l del locus de la ca d e n a ligera A. En un aspecto, el anim al no hum ano (por ejem plo, roedor, por ejem plo, ratón o rata) com prende una s e cu e n cia de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a que com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina, y ca re ce de una región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina funcional no reordenada, por ejemplo, región variable de la cadena ligera no reordenada endógena. En un aspecto, la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana sustituida con histidina reordenada, reemplaza la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina no reordenada endógena.

En un aspecto, el animal produce una cadena ligera que comprende un dominio variable mutado somáticamente derivado de una secuencia de región variable humana que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina. En un aspecto, la cadena ligera comprende un dominio variable mutado somáticamente derivado de una secuencia de región variable humana que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina y una región Ck no humana. En un aspecto, el animal no humano no expresa una cadena ligera A.

Un experto en la materia apreciaría que aunque la sustitución o sustituciones de al menos un resto de no histidina con un resto de histidina se modifica por ingeniería genética en la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana, debido a las hipermutaciones somáticas, no todos los anticuerpos que se generan en el animal no humano genéticamente modificado albergará estos restos de histidina en las posiciones diseñadas por ingeniería genética. Sin embargo, la generación de un amplio repertorio de anticuerpos en el animal no humano permitirá seleccionar los anticuerpos específicos de antígeno generados in vivo que presentan una alta afinidad por un antígeno de interés mientras conservan las modificaciones con histidina introducidas en la línea germinal y, de esta manera, muestran unión a antígeno dependiente del pH.

Por lo tanto, en un aspecto, el animal conserva al menos una sustitución de un aminoácido distinto de histidina con una histidina. En un aspecto, el animal conserva todas o sustancialmente todas las sustituciones de histidina en su dominio variable de cadena ligera somáticamente mutado que se introdujeron en su gen de región variable.

En un aspecto, el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, también comprende en su genoma, por ejemplo, su línea germinal, una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina reordenada que comprende secuencias de segmento génico Vh, Dh y Jh. En un aspecto, las secuencias de segmento génico Vh, Dh y Jh son secuencias de segmento génico Vh, Dh y Jh humano y la región de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada es una región variable de cadena pesada humana. En un aspecto, las secuencias de segmento génico Vh, Dh y Jh humanas están unidas operativamente a una secuencia de región constante de cadena pesada no humana. En un aspecto, la secuencia de la región constante de cadena pesada no humana es una secuencia endógena de la región constante de cadena pesada no humana. En un aspecto, las secuencias del segmento del gen de la cadena pesada humana están en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena. En un aspecto, la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana comprendida en un animal no humano también comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina.

En un aspecto, el animal no humano descrito en el presente documento expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región constante de cadena ligera no humana. En un aspecto, el animal no humano expresa una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región constante de cadena ligera humana.

En un aspecto, el animal no humano descrito en el presente documento expresa una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia no humana seleccionada de una secuencia Ch1, una secuencia bisagra, una secuencia Ch2, una secuencia Ch3 y una combinación de las mismas.

En un aspecto, el animal no humano expresa una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia humana seleccionada entre una secuencia Ch1, una secuencia bisagra, una secuencia Ch2, una secuencia Ch3 y una combinación de las mismas.

En el aspecto donde el animal comprende una sola región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada en la línea germinal del animal se encuentra en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógeno. En un aspecto específico, la secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina en la línea germinal del animal reemplaza todas o sustancialmente todas las secuencias de segmento génico V y J de cadena ligera no humana endógena en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina no humana endógena.

En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de segmentos génicos Vh endógenos con uno o más segmentos génicos Vh humanos, en donde los segmentos génicos Vh humanos están unidos operativamente a un gen de una región Ch no humana, de modo que el animal no humano reordena los segmentos génicos Vh humanos y expresa una cadena pesada de inmunoglobulina quimérica inversa que comprende un dominio Vh humano y una Ch no humana. En un aspecto, el 90-100% de los segmentos génicos Vh no humanos no reordenados se reemplazan con al menos un segmento génico Vh humano no reordenado. En un aspecto específico, todos o sustancialmente todos (por ejemplo, 90-100%) de los segmentos génicos Vh no humanos endógenos se reemplazan con al menos un segmento génico Vh humano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con al menos 19, al menos 39 o al menos 80 u 81 segmentos del gen Vh humano no reordenado. En un aspecto, el reemplazo es con al menos 12 segmentos funcionales del gen Vh humano no reordenado, al menos 25 segmentos funcionales del gen Vh humano no reordenado, o al menos 43 segmentos funcionales del gen Vh humano no reordenado. En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de todos los segmentos Dh y Jh no humanos con al menos un segmento Dh humano no reordenado y al menos un segmento Jh humano no reordenado. En un aspecto, el animal no humano comprende un reemplazo de todos los segmentos Dh y Jh no humanos por todos los segmentos Dh humanos no reordenados y todos los segmentos Jh humanos no reordenados.

Un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que comprende en su genoma, por ejemplo, su línea germinal, un repertorio limitado de regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana, por ejemplo, una sola región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada (por ejemplo, Vk1-39/Jk5 o Vk3-20/Jk1), con una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina y un repertorio diverso de segmentos Vh, Dh y Jh humanos no reorganizados, es capaz de generar proteínas de unión a antígeno codificadas por secuencias de región variable de cadena pesada procedentes de diversas permutaciones de segmentos Vh, Dh y Jh humanos no reordenados, en donde los segmentos Vh, Dh y Jh presentes en las secuencias variables de cadena pesada proceden de todos o sustancialmente todos los segmentos Vh, Dh y Jh humanos funcionales presentes en el genoma del animal. Varias posibilidades disponibles para secuencias de dominio variable de cadena pesada expresadas en las células, por ejemplo, linfocitos B, de los animales genéticamente modificados descritos en el presente documento (es decir, procedentes de combinaciones de diversos segmentos V, D y J humanos funcionales) se describen en las Publicaciones de Solicitud de los Estados Unidos n.° 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 y 2013/0045492. En diversos aspectos, la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reorganizada que comprende sustituciones de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina y la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana reorganizada están comprendidas en la línea germinal del animal no humano.

En un aspecto, el animal no humano comprende una copia de una o ambas de la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende una o más sustituciones de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina y la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada. En otro aspecto, el animal no humano comprende dos copias de una o ambas de la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende una o más sustituciones de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina y la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada. Por lo tanto, el animal no humano puede ser homocigoto o heterocigoto para una o ambas de la secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende una o más sustituciones de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina y la secuencia de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada.

Además de animales no humanos genéticamente modificados que comprenden en su genoma una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, una sola secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada individual) que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina (por ejemplo, en la CDR3 de la cadena ligera), en el presente documento también se describen animales no humanos modificados genéticamente que comprenden una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con una o más adiciones de codones de histidina, de manera que el dominio variable expresado comprende uno o más aminoácidos adicionales que, si no están sujetos a hipermutación somática, son una histidina.

El animal no humano genéticamente modificado que comprende una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana con una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina descrito en el presente documento puede seleccionarse de un grupo que consiste en un ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primate (por ejemplo, tití común, macaco). Para los animales no humanos cuyas células ES genéticamente modificables adecuadas no estén fácilmente disponibles, se emplean métodos distintos de los descritos en el presente documento para producir un animal no humano que comprende la modificación genética. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, modificar el genoma de una célula no ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito y gestar la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en condiciones adecuadas para formar un embrión.

En un aspecto, el animal no humano es un mamífero. En un aspecto, el animal no humano es un pequeño mamífero, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es un roedor. En un aspecto, el roedor se selecciona entre un ratón, una rata y un hámster. En un aspecto, el roedor se selecciona de la superfamilia Muroidea. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es de una familia seleccionada entre Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratones), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del nuevo mundo, campañoles), Muridae (ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirón espinoso), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas del bambú, y zokores). En un aspecto específico, el roedor genéticamente modificado se selecciona de un ratón o rata auténticos (familia Murióse), un jerbo, un ratón espinoso y una rata con cresta. En un aspecto, el ratón genéticamente modificado es un miembro de la familia Murióse. En un aspecto, el animal es un roedor. En un aspecto específico, el roedor se selecciona de un ratón y una rata. En un aspecto, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto específico, el animal no humano es un roedor que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada entre C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En otro aspecto, el ratón es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, véase también, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). En un aspecto específico, el ratón genéticamente modificado es una mezcla de una cepa 129 anteriormente mencionada y una cepa C57BL/6 anteriormente mencionada. En otro aspecto específico, el ratón es una mezcla de las cepas 129 anteriormente mencionadas, o una mezcla de las cepas BL/6 anteriormente mencionadas. En un aspecto específico, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otro aspecto, el ratón es una cepa BALB, por ejemplo, cepa BALB/c. En otro aspecto más, el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa anteriormente mencionada.

En un aspecto, el animal no humano es una rata. En un aspecto, la rata se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6 y Dark Agouti. En un aspecto, la cepa de la rata es una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.

Por lo tanto, en un aspecto, el animal no humano genéticamente modificado es un roedor. En un aspecto, el animal no humano genéticamente modificado es una rata o un ratón. En un aspecto, el animal es un ratón. Por lo tanto, en un aspecto, en el presente documento se describe un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma, por ejemplo, su línea germinal, una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de los genes V l y J l humanos, en donde la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reorganizada individual comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina. En un aspecto, el ratón carece de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina funcional no reordenada (por ejemplo, carece de secuencias de segmentos de los genes V y J no reordenados funcionales). En un aspecto, la región de cadena variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana con sustituciones de codones de histidina es una región variable V k 1 -39 /J k o V k3 -20 /J k . En un aspecto, la secuencia del segmento J se selecciona de J k 1, J k2, J k3, J k4 y J k5. En un aspecto, la secuencia del segmento J es J k1 o J k5. En un aspecto, la sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina está en la secuencia de nucleótidos que codifica una región CDR3. En un aspecto, en donde la secuencia de la región variable reordenada es la secuencia V k 1 -39 /J k5, la sustitución o sustituciones de histidina está(n) diseñada(s) para expresarse en una posición seleccionada entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En otro aspecto, en donde la secuencia de la región variable reordenada es la secuencia V k3 -20 /J k 1, la sustitución o sustituciones de histidina está(n) diseñada(s) para expresarse en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas. En un aspecto, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reordenada con uno o más codones de histidina sustituidos está unida operativamente a una secuencia génica de la región constante de inmunoglobulina de ratón endógena (por ejemplo, la secuencia del gen C k). En un aspecto, el ratón comprende además en su genoma, por ejemplo, su línea germinal, una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada que comprende de segmentos V h, D h y J h humanos. En un aspecto, los segmentos V h, D h y J h humanos están operativamente unidos a una secuencia génica de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógena. En diversos aspectos, la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada que comprende una o más sustituciones de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina y la secuencia de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada están comprendidas en la línea germinal del ratón.

En el presente documento también se describen vectores de direccionamiento para generar animales no humanos genéticamente modificados, por ejemplo, ratones, descritos en el presente documento. En un aspecto, se describe un vector de direccionamiento que comprende, de 5' a 3' en dirección transcripcional con referencia a las secuencias de los brazos de homología de ratón 5' y 3' del vector, un brazo de homología de ratón 5', un promotor de inmunoglobulina humana o de ratón, una secuencia líder humana o de ratón, una región variable humana seleccionada de un V k1-39 J k5 humano reordenado o un V k3 -20 J k 1 humano reordenado y que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina y un brazo de homología de ratón 3'. En un aspecto, los brazos de homología 5 'y 3' dirigen el vector a una secuencia 5' con respecto a una secuencia potenciadora que está presente en 5' y proximal al gen C k de ratón. En otro aspecto, el vector de direccionamiento comprende un brazo de homología de ratón 5' seguido de un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación, promotor de inmunoglobulina humana o de ratón, secuencia líder humana o de ratón, una región variable humana seleccionada de un V k1 -39 J k5 humano reordenado o un Vk3-20Jk1 humano reordenado y que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina, seguido por el brazo de homología de ratón 3' que comprende potenciadores de ratón y secuencias de región constante ( C k).

Un casete de selección es una secuencia de nucleótidos insertada en una construcción directora para facilitar la selección de células (por ejemplo, células ES) que han integrado la construcción de interés. Un número de casetes de selección adecuados son conocidos en la técnica. De manera habitual, un casete de selección permite la selección positiva en presencia de un antibiótico concreto (por ejemplo, Neo, Hyg, Pur, CM, Spec, etc.). Además, un casete de selección puede estar flanqueado por sitios de recombinación, que permiten la deleción del casete de selección tras el tratamiento con enzimas recombinasa. Los sitios de recombinación normalmente utilizados son loxP y Frt, reconocidos por las enzimas Cre y Flp, respectivamente, pero se conocen otros en la técnica.

En un aspecto, el promotor es un promotor del segmento génico de la región variable de inmunoglobulina humana. En un aspecto específico, el promotor es un promotor Vk3-15 humano. En un aspecto, la secuencia líder es una secuencia líder de ratón. En un aspecto específico, la secuencia líder de ratón es una secuencia líder Vk3-7 de ratón. Los aspectos ejemplares de los vectores de direccionamiento se presentan en las FIG. 23B y 29B.

En un aspecto, un vector de direccionamiento se describe como se describe anteriormente, pero en lugar del brazo de homología de ratón 5', el promotor humano o de ratón está 5' flanqueado con un sitio de reconocimiento de recombinasa específica de sitio (SRRS), y en lugar del brazo de homología de ratón 3', la región de Vl humano está 3' flanqueada con un SRRS.

También se describen métodos para preparar animales no humanos genéticamente modificados (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas) descritos en el presente documento. En un aspecto, el método para producir un animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento utiliza un vector de direccionamiento, producido utilizando tecnología VELOCIGENE®, introduciendo la construcción en las células ES, e introduciendo los clones de células ES dirigidas en un embrión de ratón utilizando la tecnología VELOCIMOUSE®, como se describe en los Ejemplos. Las modificaciones con histidina se pueden introducir en el vector de direccionamiento utilizando una variedad de técnicas de biología molecular, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o síntesis de novo de ADN. Tras completar el direccionamiento del gen, las células Es de los animales no humanos genéticamente modificados se analizan para confirmar la incorporación correcta de la secuencia de nucleótidos exógena de interés o la expresión del polipéptido exógeno. Los expertos en la materia conocen numerosas técnicas que incluyen (pero no se limitan a) transferencia Southern, PCR larga, la PCT cuantitativa (por ejemplo, la PCR en tiempo real usando TAQMAN®), hibridación in situ de fluorescencia, transferencia Northern, citometría de flujo, análisis Western, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, etc. En un ejemplo, los animales no humanos (por ejemplo, ratones) que contienen la modificación genética de interés pueden identificarse mediante exploración para la pérdida de alelos del ratón y/o la ganancia de alelos humanos utilizando una modificación del ensayo de alelos descrito en Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Los expertos en la materia conocen otros ensayos que identifican una secuencia de nucleótidos o aminoácidos específica en los animales genéticamente modificados.

Por lo tanto, en un aspecto, el método para generar animales no humanos genéticamente modificados comprende reemplazar una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina en el animal con una secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana (que comprende los segmentos de los genes Vl y Jl humanos) en donde la secuencia génica de la región variable de inmunoglobulina humana comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina. En un aspecto, la sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina está en la secuencia de nucleótidos que codifica una región CDR, por ejemplo, una región CDR3.

En un aspecto, el método para generar animales no humanos genéticamente modificados descrito en el presente documento comprende reemplazar una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina en el animal con una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única que comprende secuencias de segmentos de los genes Vl y Jl humanos, en donde la secuencia génica de la región variable de inmunoglobulina humana reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina. En un aspecto, la sustitución es en un codón de CDR. En un aspecto, la sustitución es de uno, dos, tres, cuatro o más codones de CDR3. En un aspecto, la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única se basa en la secuencia de la región variable de cadena ligera reordenada de la línea germinal humana seleccionada de Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. Por lo tanto, en un aspecto, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de Vk1-39Jk5, el reemplazo de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en posiciones seleccionadas entre 105, 106, 108, 111 y una combinación de las mismas. En un aspecto, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada única deriva de Vk3-20k1, el reemplazo de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina se diseña para expresar una histidina en una posición seleccionada entre 105, 106, 107, 109 y una combinación de las mismas.

En otro aspecto, el método para generar un animal no humano descrito en el presente documento (es decir, que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina genéticamente modificado descrito en este documento) comprende modificar un genoma de un animal no humano para eliminar o generar segmentos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina endógena no funcionales en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina, y colocar en el genoma una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única que comprende una sustitución de al menos un codón de no histidina con un codón de histidina. En un aspecto, el método da como resultado un animal no humano genéticamente modificado que comprende una población de linfocitos B enriquecidos por anticuerpos que muestran una unión a un antígeno de interés dependiente del pH.

En algunos aspectos, los métodos para generar animales no humanos modificados genéticamente descritos en el presente documento comprenden reemplazar una secuencia génica de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina con una secuencia humana en el animal que también comprende un reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena con una secuencia génica de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que comprende al menos uno de cada uno o un repertorio de secuencias de Vh, Dh y Jh humanas, como se ha descrito anteriormente. En un aspecto, con el fin de generar un animal no humano que comprende un reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógena con la secuencia génica de la región variable de cadena ligera humana que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina y un reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no humana endógena con una secuencia génica de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana, el animal con el reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena ligera se cruza con un animal con el reemplazo de la secuencia génica de la región variable de cadena pesada.

Los inventores describen en el presente documento animales no humanos modificados por ingeniería genética (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratas o ratones) que expresan proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, que comprenden una cadena ligera universal, por ejemplo, una cadena ligera universal humana (por ejemplo, una cadena ligera procedente de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reorganizada individual) que comprende una o más modificaciones de histidina, en donde las proteínas de unión a antígeno muestran una unión a antígeno dependiente del pH de un antígeno diana. Los animales se modifican por ingeniería genética para incluir una CDR3 de cadena ligera que comprende una o más modificaciones con histidina. En diversos aspectos, la CDR3 de cadena ligera comprende dos, tres o cuatro restos de histidina en un grupo.

En un aspecto, en el presente documento se describe un animal no humano modificado mediante ingeniería genética que comprende una población de anticuerpos específicos de antígeno que expresan restos de histidina como resultado de modificaciones de codones en la secuencia génica de la región variable de cadena ligera, y presentan una unión del antígeno diana dependiente del pH. En un aspecto, estos animales comprenden una población de linfocitos B que están enriquecidos por anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos específicos de antígeno, que presentan propiedades de unión dependientes del pH (por ejemplo, semivida disociativa disminuida (ti /2), a pH ácido frente a pH neutro) en comparación con una población de anticuerpos específicos de antígeno generados en animales que no comprenden una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina en la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina descrita en el presente documento. En un aspecto, el enriquecimiento de los anticuerpos específicos de antígeno que presentan las propiedades de unión a antígeno dependientes del pH generados en los animales modificados por ingeniería genética descritos en el presente documento en comparación con animales similares que sí comprenden sustituciones de histidina en la región variable de cadena ligera es mayor de aproximadamente 2 veces, por ejemplo, mayor de aproximadamente 5 veces, por ejemplo, mayor de aproximadamente 10 veces. Por lo tanto, los animales genéticamente modificados descritos están enriquecidos respecto de anticuerpos con propiedades de reciclaje del anticuerpo mejoradas, lo que se desea para reducir el aclaramiento mediado por la diana, así como para reducir la dosis y/o la frecuencia de dosificación de una proteína terapéutica de unión a antígeno desarrollada basándose en dicho formato de anticuerpo generado in vivo.

Por lo tanto, en el presente documento se describe una proteína de unión a antígeno, generada en animales no humanos genéticamente modificados descritos en el presente documento, en donde la proteína de unión a antígeno presenta unión a antígeno dependiente del pH. En un aspecto, la proteína de unión a antígenos es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico de antígeno. En un aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera humana derivado de un reordenamiento de los segmentos génicos variables de cadena ligera de inmunoglobulina humana donde al menos un codón distinto de histidina estaba sustituido por un codón de histidina en la secuencia del gen de la línea germinal, y en donde el anticuerpo conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de la cadena ligera humana expresada. En un aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera humana derivado de una secuencia génica de la región variable de cadena ligera humana reordenada única, en donde la secuencia génica de la región variable de cadena ligera reordenada única comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina, y en donde el anticuerpo conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En un aspecto, el anticuerpo comprende una cadena ligera procedente de una reorganización de Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1 humano, en donde la secuencia del gen Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1 humano comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina, y en donde el anticuerpo conserva al menos una sustitución de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En algunos aspectos, el anticuerpo conserva todas o sustancialmente todas las sustituciones de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado. En un aspecto, la sustitución es de tres codones de no histidina con tres codones de histidina en la secuencia de nucleótidos que codifica CDR3 de la secuencia génica de la región variable de cadena ligera, y el anticuerpo conserva las tres sustituciones de histidina en su dominio variable de cadena ligera expresado.

En un aspecto, la sustitución e s de cuatro co d o n es de no histidina con cuatro cod on es de histidina en la se cu e n cia de nucleótidos que codifica C D R 3 de la s e cu e n cia génica de la región variab le de ca d e n a ligera, y el anticuerpo co n se rv a tres o cuatro su stitu cio nes de histidina en su dom inio variab le de ca d e n a ligera expresado .

En un aspecto, la ca d e n a ligera del anticuerpo com prende ad e m á s una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a ligera no hum ana, por ejem plo, una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a ligera endógena. A dem ás, el anticuerpo, por ejem plo, el anticuerpo e sp e cífico de antígeno, generad o en un anim al no hum ano genéticam ente m odificado descrito en el presente docum ento tam bién com prende una ca d e n a p e sa d a que com prende un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana derivado de un reordenam iento de los segm en to s V, D y J de ca d e n a p e sa d a hum ana. Los segm ento s V, D y J de la ca d e n a p e sa d a hum ana pueden se le cc io n a rse de un repertorio de segm en to s de ca d e n a p e sa d a hum ana presen te s en el locus endógeno de ca d e n a p e sa d a no hum ana, por ejem plo, al m enos un segm ento V funcional, al m enos un D funcional y al m enos un J funcional, por ejem plo, hasta un repertorio com pleto de segm en to s V, D y J hum ano s funcionales. P u eden extrae rse posib les reo rg an izacio n e s e jem plares de segm ento s va ria b le s de ca d e n a p e sa d a hum ana de un listado de segm ento s V, D y J hum anos fu ncio nale s en la b ase de datos IM G T y de las P u b lica cio n e s de Solicitud de los E sta d o s U nidos n.° 2011 /0195454 , 2012 /0021409 , 2012 /0192309 y 2013/0045492. A dem ás, en un aspecto, la ca d e n a p e sa d a del anticuerpo com prende una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a p e sa d a no hum ana, por ejemplo, una s e cu e n cia de am ino ácid os de la región constante de ca d e n a p e sa d a no hum ana endógena. En un aspecto, la región constante de ca d e n a p e sa d a no hum ana com prende dom inios C h1, bisagra, C h2 y C h3. En un aspecto, el anticuerpo e s un isotipo IgG, IgE, IgD, IgM o IgA.

P o r lo tanto, en un aspecto, en el presente docum ento se d escrib e una proteína de unión gen e rad a en los an im ales no hum anos genéticam ente m odificados descrito s en el presente docum ento, en donde la proteína de unión com prende una ca d e n a ligera quim érica in versa que com prende (a) un dom inio variab le de ca d e n a ligera procedente de una reordenación V k 1 -39 J k5 que com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina, en donde la ca d e n a ligera co n se rva al m enos una sustitución de histidina en su dom inio variab le de ca d e n a ligera e xp re sa d o y (b) una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a ligera no hum ana, por ejem plo, de ratón, en donde la ca d e n a ligera está a so c ia d a con una ca d e n a p e sa d a quim érica inversa que com prende (a ) un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a derivado de un reordenam iento de los segm en to s V, D y J hum anos, en donde los segm ento s V, D y J se sele ccio n an entre un repertorio de segm en to s V, D y J hum anos presen tes en el anim al y (b) una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a p e sa d a no hum ana, por ejem plo, de ratón. En un aspecto, el repertorio de segm en to s V, D y J hum ano s com prende al m enos un segm ento V funcional, al m enos uno D funcional y al m enos uno J funcional, por ejem plo, hasta un repertorio com pleto de segm ento s V, D y J hum anos funcionales. En un aspecto, los dom inios constantes de ca d e n a p e sa d a y ligera son regiones constantes de ca d e n a p e sa d a y ligera end ógenas. En un aspecto, los dom inios con stan tes de ca d e n a p e sa d a y ligera son dom inios m utados som áticam ente. En un aspecto, el dom inio de ca d e n a ligera mutado som áticam ente co n se rv a al m enos una sustitución de histidina introducida en la s e cu e n cia de la lín ea germ inal. En alg u n o s aspecto s, el dom inio de ca d e n a ligera mutado som áticam ente co n se rva tod as o sustancialm en te tod as las su stitu cio nes de histidina introducidas en la s e cu e n cia de la línea germ inal. En un aspecto, en la proteína de unión a antígeno presenta propied ades de unión a antígeno depend ientes del pH.

En otro aspecto, en el presente docum ento se d escrib e una proteína de unión ge n e rad a en los an im a le s no hum anos genéticam ente m odificados d escrito s en el presente docum ento, en donde la proteína de unión com prende una ca d e n a ligera quim érica in versa que com prende (a ) un dom inio variab le de ca d e n a ligera procedente de una reordenación V k3 -20 J k 1 que com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina, en donde la ca d e n a ligera co n se rv a al m enos una sustitución de histidina en su dom inio variab le de ca d e n a ligera e xp re sa d o y (b) una s e cu e n cia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a ligera no hum ana, por ejemplo, de ratón, en donde la ca d e n a ligera está a so c ia d a con una ca d e n a p e sa d a quim érica in versa que com prende (a) un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a derivado de un reordenam iento de los segm en to s V, D y J hum anos, en donde los segm ento s V, D y J se sele ccio n an entre un repertorio de segm en to s V, D y J hum anos p resen tes en el anim al y (b) una se c u e n c ia de am ino ácid os de región constante de ca d e n a p e sa d a no hum ana, por ejem plo, de ratón. En un aspecto, el repertorio de segm en to s V, D y J hum ano s com prende al m enos un segm ento V funcional, al m enos uno D funcional y al m enos uno J funcional, por ejem plo, hasta un repertorio com pleto de segm en to s V, D y J hum anos funcionales. En un aspecto, las regiones con stan tes de ca d e n a p e sa d a y ligera son regiones constantes de ca d e n a p e sa d a y ligera e nd ógenas. En un aspecto, los dom inios con stan tes de ca d e n a p e sa d a y ligera son dom inios m utados som áticam ente. En un aspecto, el dom inio de ca d e n a ligera mutado som áticam ente co n se rva al m enos una sustitución de histidina introducida en la se cu e n cia de la lín ea germ inal. En algun os aspecto s, el dom inio de ca d e n a ligera mutado som áticam ente co n se rv a todas o su stancialm en te tod as las su stitu cio nes de histidina introducidas en la s e cu e n cia de la línea germ inal. En un aspecto, en la proteína de unión a antígeno presenta propied ades de unión a antígeno depend ientes del pH.

En un aspecto, tam bién se d escrib e en el presente docum ento un linfocito B del anim al genéticam ente m odificado descrito en el presente docum ento, que com prende en su lín ea germ inal una s e cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera hum ana m odificada con histidina, por ejem plo, una se cu e n cia de región variab le de ca d e n a ligera hum ana reo rgan izad a individual m odificada con histidina, d escrita en el presente docum ento y e xp re sa una proteína de unión a antígeno d escrita en el presente docum ento. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, expresado en el linfocito B conserva al menos un resto de histidina introducido en la línea germinal y presenta propiedades de unión a antígeno dependientes del pH. En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, expresado en el linfocito B conserva todos o sustancialmente todos los restos de histidina introducidos en la línea germinal y presenta propiedades de unión a antígeno dependientes del pH.

En diversos aspectos, el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana, por ejemplo, una sola secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reorganizada individual (por ejemplo, una secuencia Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1) que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina (o una adición de un codón de histidina en la secuencia de línea germinal). Estas adiciones o sustituciones dan como resultado un animal no humano que comprende una población de linfocitos B enriquecidos por proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión para sus antígenos dependientes del pH. En un aspecto, proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, generadas en los animales no humanos descritos en el presente documento en respuesta a la estimulación con antígenos presenta una unión a antígeno dependiente del pH mientras muestra una alta afinidad por el antígeno a pH neutro, por ejemplo, pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,0, por ejemplo, pH entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,4, por ejemplo, entre aproximadamente 7,2 y aproximadamente 7,4, por ejemplo, pH de los fluidos corporales, tales como sangre. En un aspecto, la afinidad de la proteína de unión a antígeno a su antígeno, expresada como una constante de disociación (Kd) a un pH neutro es menos de 10-6 M, por ejemplo, menos de 10-8 M, por ejemplo, menos de 10-9 M, por ejemplo, menos de 10-10 M, por ejemplo, menos de 10-11 M, por ejemplo, menos de 10-12 M.

En un aspecto, una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, generada en el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, muestra una unión reducida a su antígeno en pH ácido (por ejemplo, pH de 6,0 o inferior, por ejemplo, pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0, pH entre aproximadamente 5,75 y aproximadamente 6,0, por ejemplo, pH de los compartimentos endosómico o lisosómico) en comparación con el pH neutro. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, el anticuerpo, generada en el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, no muestra unión a antígeno en pH ácido, mientras conserva unión a antígeno a pH a neutro. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno generada por el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, tiene una disminución en la semivida disociativa (ti /2) a un pH ácido en comparación con la semivida disociativa (ti /2) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces o al menos aproximadamente 30 veces. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno expresada por el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, tiene una ti /2 a un pH ácido y 37 °C de aproximadamente 2 minutos o menos. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno expresada por el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento tiene una t i /2 a un pH ácido y 37 °C de menos de aproximadamente 1 min. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno expresada por el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, tiene una ti /2 a un pH ácido y 25 °C de aproximadamente 2 minutos o menos. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno expresada por el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, tiene una t i /2 a un pH ácido y 25 °C de menos de aproximadamente i min.

Los parámetros cinéticos, tales como las constantes de disociación en equilibrio (Kd) y las semividas de disociación (t1^ ) se pueden calcular a partir de la constante de velocidad cinética como: Kd (M) = kd / ka; y t 1^ (min) = ln2/(60*kd).

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, generada en los animales no humanos genéticamente modificados descritos en el presente documento, muestran una unión aumentada a la molécula FcRn. Como se ha descrito anteriormente, FcRn es un receptor presente dentro del compartimento endosómico que es capaz de unirse a las inmunoglobulinas a un pH ácido y reciclarlas de nuevo a la superficie. La exploración de las moléculas de anticuerpos en los animales no humanos genéticamente modificados descritos en el presente documento presenta una oportunidad única para seleccionar anticuerpos con tres parámetros beneficiosos: alta afinidad por un antígeno, unión a antígeno dependiente del pH ( con una unión a antígeno más débil a pH ácido) y una unión a FcRn aumentada.

En un aspecto, un animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento comprende una población de linfocitos B en respuesta a un antígeno que produce y está enriquecida por proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, que, cuando se transforman en agentes terapéuticos, muestran una semivida en suero aumentada tras la administración de una dosis terapéutica a un sujeto sobre una población de linfocitos B equivalente producida en respuesta al mismo antígeno en los mismos animales no humanos que no comprenden modificaciones con histidina en sus secuencias génicas de la región variable de cadena ligera humana. Por lo tanto, en un aspecto, una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, producida en respuesta a un antígeno de interés en un animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento, cuando se transforman en un agente terapéutico, muestra una semivida en suero aumentada tras la administración de una dosis terapéutica a un sujeto durante una semivida en suero de una proteína de unión a antígeno (cuando se transforma en un agente terapéutico y se administra a la misma dosis terapéutica) que se produjo en respuesta al mismo antígeno en una animal no humano que no comprende modificaciones con histidina en su secuencia génica de la región variable de cadena ligera humana.

En algu n os aspecto s, la sem ivid a en su ero aum entada e s aproxim adam ente 2 v e ce s, por ejem plo, aproxim adam ente 5 v e ce s, por ejem plo, aproxim adam ente 10 v e ce s, por ejem plo, aproxim adam ente 15 v e ce s, por ejemplo, aproxim adam ente 20 v e c e s o más.

En un aspecto, se d escrib e una célula pluripotente, pluripotente inducida o totipotente derivad a de un no hum ano com o se d escrib e en el presente docum ento. En un aspecto e specífico , la célula e s una célula m adre em brionaria (E S , por su s s ig la s en inglés).

En un aspecto, se d escrib e un tejido derivado de un anim al no hum ano com o se d escrib e en el presente docum ento. En un aspecto, el tejido deriva de bazo, ganglio linfático o m édula ó se a de un anim al no hum ano com o se d escrib e en el presente docum ento.

En un aspecto, se d escrib e un núcleo derivado de un anim al no hum ano com o se d escrib e en el presente docum ento. En un aspecto, el núcleo e s de una célula diploide que no es un linfocito B.

En un aspecto, se d escrib e una célula no hum ana que se a ís la de un anim al no hum ano (por ejem plo, un roedor, por ejem plo, ratón o rata) descrito en el presente docum ento. En un aspecto, la célula e s una célula ES . En un aspecto, la célula e s un linfocito. En un aspecto, el linfocito e s un linfocito B. En un aspecto, el linfocito B e xp re sa una ca d e n a p e sa d a quim érica que com prende un dom inio variab le derivado de un segm ento génico hum ano; y una ca d e n a ligera derivada de una s e cu e n cia V k 1 -39 /J hum ana reo rd enad a con una sustitución de al m enos un codón de no histidina con un codón de histidina, s e cu e n cia V k3-20 /J hum ana reo rgan izad a con una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina o una com binación de las m ism as y que ad e m á s com prende una sustitución de al m enos un am inoácido codificado en la lín ea germ inal por una histidina; en donde el dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a está fusio nado a una región constante no hum ana y el dom inio variab le de ca d e n a ligera está fusio nado a una región constante no hum ana o hum ana.

En un aspecto, se d escrib e un hibridoma, en donde el hibridom a se produce con un linfocito B de un anim al no hum ano com o se d escrib e en el presente docum ento. En un aspecto e specífico , el linfocito B e s de un ratón com o se d escrib e en el presente docum ento que se ha inm unizado con un inm unógeno que com prende un epítopo de interés, y el linfocito B e xp re sa una proteína de unión que se une al epítopo de interés, la proteína de unión tiene un dom inio de ca d e n a p e sa d a variab le hum ano mutado som áticam ente y un C h de ratón y tiene un dom inio de ca d e n a ligera variab le hum ano procedente de una V k 1 -39 J k5 hum ana reo rgan izad a con una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina o una V k3 -20 J k 1 hum ana reo rgan izad a con una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina y un C l de ratón, en donde el dom inio de la ca d e n a ligera hum ana com prende una sustitución de al m enos un am inoácido codificado en la lín ea germ inal con una histidina.

Tam bién se d escrib e una célula que e xp re sa una proteína de unión a antígeno ge n e rad a en los an im ales no hum anos descrito s en el presente docum ento. En un aspecto, la célula se se le ccio n a entre C H O , C O S , 293, H eLa y una célula retiniana que e xp re sa una s e cu e n cia de ácido nucleico vírico (por ejem plo, una célula P E R C .6 ™ ).

En un aspecto, se d escrib e un em brión no hum ano, en donde el em brión com prende una célula E S donante que deriva de un anim al no hum ano com o se d escrib e en el presente docum ento.

Los an im ales no hum anos descrito s en el presente docum ento, son útiles para g e n e rar linfocitos B que e xp re sa n anticuerpos que tienen histidinas en una C D R 3. Un anim al que coloca histidinas en una C D R 3 e s útil para producir anticuerpos en general, y en particular e s útil para d esarro llar anticuerpos que se unen a una diana con suficiente afinidad en o alreded or de un pH neutro, pero que no se unen o que se unen m ás débilm ente a la m ism a diana a un pH ácido.

El anim al no hum ano e s útil para g e n e rar regiones v a ria b le s de anticuerpos que se pueden u sa r para producir, por ejem plo, proteínas de unión terapéuticas h u m anas que unen s u s d ian as por los dom inios va ria b le s de inm unoglobulina hum ana que com prenden las histidinas en una c D R 3. La unión alterada a un pH m ás bajo permitirá, en a lgu n as circu nstancias, una renovación m ás rápida debido a que el agente terapéutico se unirá a una diana en la superficie de la célula, se internalizará en un end osom a y se d iso ciará m ás fácilm ente o m ás rápidam ente de la diana en el endosom a, de modo que agente terapéutico se puede reciclar para unirse a otra m olécula m ás de la diana (por ejem plo, en otra célula o la m ism a célula). En a lg u n as circu n sta n cia s, esto d ará com o resultado la ca pa cid ad de dosificar el agente terapéutico en una d o sis m ás baja, o d osificar el agente terapéutico con m enos frecuencia. Esto es particularm ente útil cuan do no e s d e se ab le d osificar frecuentem ente, o adm inistrar por encim a de una cierta dosis, por razo n es de seguridad o toxicidad. Com o resultado, aum entará la sem ivid a sé rica del anticuerpo terapéutico cuan do se adm inistra a un sujeto.

El anim al no hum ano, por ejem plo, roedor, por ejem plo, ratón o rata, e s útil en un método para aum entar el núm ero de linfocitos B en un anim al que m uestra una región variab le de anticuerpo que tiene una C D R 3 con una o m ás histidinas en ella. El anim al no hum ano e s útil para g e n e rar s e c u e n c ia s de anticuerpos que m ostrarán unión a antígeno dependiente del pH. El anim al no hum ano e s útil para ge ne rar un m ayor núm ero de se c u e n c ia s de anticuerpos, resultantes de una única inm unización, en donde los anticuerpos m ostrarán una unión a antígeno dependiente del pH.

Proteínas de Unión a Antígeno y Métodos para Generar las Mismas

En un aspecto, en el presente documento también se describen métodos para generar proteínas de unión a antígeno humanas, por ejemplo, anticuerpos, que muestran unión a antígeno dependiente del pH, a partir de los animales no humanos genéticamente modificados descritos en el presente documento con métodos convencionales usados en la técnica.

Se han descrito varias técnicas para la producción de anticuerpos. Por ejemplo, en diversos aspectos, se producen anticuerpos quiméricos en ratones como se describe en el presente documento. Los anticuerpos pueden aislarse directamente de los linfocitos B de un ratón inmunizado (por ejemplo, véase el documento U.S. 2007/0280945A1) y/o los linfocitos B del ratón inmunizado se pueden usar para producir hibridomas (Kohler y Milstein, 1975, Nature 256:495-497). El ADN que codifica los anticuerpos (cadenas pesadas y/o ligeras humanas) a partir de animales no humanos como se describe en el presente documento se aísla y secuencia fácilmente usando técnicas convencionales. Los hibridomas y/o linfocitos B derivados de animales no humanos como se describe en el presente documento sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que se transfectan después en células hospedadoras que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humana en lugar de las secuencias no humanas. Por lo tanto, una vez se han determinado secuencias de ácido nucleico de anticuerpos con características deseadas, por ejemplo, afinidad, epítopo, unión a antígeno dependiente de pH, etc., las secuencias de genes de la región constante no humana se reemplazan con unas secuencias de la región constante humana deseadas para generar un anticuerpo completamente humano que contiene un isotipo no IgM, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Por lo tanto, en un aspecto se describe en el presente documento un método para generar un anticuerpo que muestra propiedades de unión a antígeno dependientes del pH que comprende generar un animal no humano (por ejemplo, un ratón) como se describe en el presente documento, inmunizar un ratón con un antígeno de interés, permitir a un animal no humano montar una respuesta inmunitaria al antígeno, y seleccionar en el animal no humano un anticuerpo específico de antígeno que muestra propiedades de unión a antígeno dependientes del pH, por ejemplo, unión más débil al antígeno a un pH ácido que a neutro.

En el presente documento también se describen métodos para producir proteínas de unión a antígeno multiespecíficas, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno biespecíficas. Estas son moléculas capaces de unirse a más de un epítopo con alta afinidad. Las ventajas de la invención incluyen la capacidad de seleccionar adecuadamente cadenas de inmunoglobulinas de cadena pesada de unión elevada (por ejemplo, maduradas por afinidad), cada una de las cuales se asociará con una sola cadena ligera. Además, las ventajas de la invención incluyen la capacidad para generar una proteína de unión a antígeno multiespecífica, por ejemplo, biespecífica que muestra unión al antígeno dependiente de pH.

Debido a la naturaleza dual de los anticuerpos biespecíficos (es decir, pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana, véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244), ofrecen muchas ventajas útiles para aplicación terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden usarse para citotoxicidad redireccionada (por ejemplo, para eliminar células tumorales), como adyuvante para vacunas, para administrar agentes trombolíticos a coágulos, para convertir profármacos activados por enzimas en un sitio diana (por ejemplo, un tumor), para tratar enfermedades infecciosas, dirigir complejos inmunitarios a receptores de la superficie celular o para administrar inmunotoxinas a células tumorales.

Los anticuerpos biespecíficos descritos en el presente documento también se pueden usar en varios métodos de ensayo terapéuticos y no terapéuticos y/o de diagnóstico, tal como, inmunoensayos enzimáticos, inmunoensayos de dos sitios, inmunodiagnóstico in vitro o in vivo de diversas enfermedades (por ejemplo, cáncer), ensayos de unión competitiva, ensayos de tipo sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Otros usos para los anticuerpos biespecíficos serán evidentes para los expertos en la materia.

Se han informado varias técnicas para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos a partir de cultivos de células recombinantes. Sin embargo, la síntesis y expresión de proteínas de unión biespecíficas ha sido problemática, en parte debido a problemas asociados con la identificación de una cadena ligera adecuada que puede asociarse y expresarse con dos cadenas pesadas diferentes, y en parte debido a problemas de aislamiento. En diversos aspectos, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento proporcionan la ventaja de los anticuerpos biespecíficos de longitud completa que no requieren modificaciones especiales para mantener la estructura de inmunoglobulina tradicional al aumentar la estabilidad/interacción de los componentes. En diversos aspectos, tales modificaciones han resultado ser engorrosas y han servido como un obstáculo para el desarrollo de la tecnología de anticuerpos biespecíficos y su uso potencial en el tratamiento de enfermedades humanas. Por lo tanto, en varios aspectos, al proporcionar una estructura de inmunoglobulina natural (es decir, de longitud completa) que tiene la propiedad añadida de múltiples especificidades, los anticuerpos biespecíficos de longitud completa conservan sus funcio nes efectoras críticas de las que ca re cía n los fragm entos b iesp e cífico s anteriores y ad e m á s proporcionan agentes terapéutico s que dem uestran el importante parám etro farm acocinético de una sem ivid a m ás larga.

Los m étodos y co m p o sicio n e s descrito s en el presente docum ento, permiten que un ratón genéticam ente m odificado sele ccio ne , m ediante p ro ce so s naturales, una ca d e n a ligera a d e cu a d a que pueda a s o c ia rse y e x p re sa rse con m ás de una ca d e n a pesada, incluyendo c a d e n a s p e sa d a s que se mutan som áticam ente (por ejem plo, m ad urad as por afinidad), en donde la ca d e n a ligera confiere ad e m á s a la proteína de unión a antígeno su propiedad de unión a antígeno dependiente del pH. Las s e c u e n c ia s de la región variab le de la ca d e n a p e sa d a y ligera hum ana de linfocitos B a d e cu a d o s de ratones inm unizados com o se d escrib e en el presente docum ento que e xp re sa n anticuerpos m ad urad os por afinidad que tienen ca d e n a s p e sa d a s q u im éricas in ve rsa s (e s decir, variab le hum ana y constante de ratón) se pueden identificar y clo nar en m arco en un vecto r de expresió n con una s e cu e n cia génica de la región constante hum ana a d e cu a d a (por ejemplo, una IgG1 hum ana). S e pueden preparar dos co n struccio n es de este tipo, en donde ca d a construcción codifica un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana que se une a un epítopo diferente. U na de las regiones va ria b le s de ca d e n a ligera hum ana (por ejemplo, V k1 -39 J k5 hum ana o V k3 -20 J k 1 hum ana), que com prenden una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina, puede fu sio n a rse en m arco con un gen de región constante de ca d e n a ligera hum ana ad e cu ad o (por ejemplo, un gen constante k hum ano). E sta s tres co n stru ccio n es p e sa d a s y ligeras com pletam ente hum anas pueden co lo ca rse en una célula ad e cu a d a para la expresión. La cé lu la e xp re sa rá dos e sp e c ie s principales: una ca d e n a p e sa d a hom odim érica con la ca d e n a ligera idéntica, y una ca d e n a p e sa d a heterodim érica con la ca d e n a ligera idéntica. P ara permitir una sep a ra ció n fácil de e sta s e sp e c ie s principales, una de las c a d e n a s p e sa d a s se m odifica para omitir un determ inante de unión a la proteína A, lo que da com o resultado una afinidad diferencial de una proteína de unión hom odim érica a partir de una proteína de unión heterodim érica. Las co m p o sicio n e s y los m étodos que abordan este problem a se d escrib en en el docum ento U S S N 12 /832.838 , presentado el 25 de jun io de 2010, titulado "R ea d ily Isolated B ispecific A ntibodies with Native Im m unoglobulin Form at," publicado com o U S 2010 /0331527 A 1. U na v e z que se ha sele ccio n ad o la e sp e cie que com prende la ca d e n a p e sa d a heterodim érica con una ca d e n a ligera idéntica, puede e va lu a rse esta proteína de unión a antígeno b ie sp e cífica para confirm ar la retención de su propiedad de unión a antígeno dependiente de pH.

En un aspecto, se d escrib e una proteína de unión a epítopo com o se d escrib e en el presente docum ento, en donde las s e c u e n c ia s de la región variab le de ca d e n a ligera y ca d e n a p e sa d a hum anas proceden de an im ales descrito s en el presente docum ento que se han inm unizado con un antígeno que com prende un epítopo de interés.

En un aspecto, se d escrib e una proteína de unión a epítopo que com prende un prim er y un segu nd o polipéptido, el prim er polipéptido que com prende, d esd e el extrem o N al extrem o C, una prim era región de unión al epítopo que se une selectivam ente a un prim er epítopo, seg u id a de una región constante que com prende una prim era región C h3 de una IgG hum ana se le ccio n a d a entre IgG 1, IgG2, IgG 4 y una com binación de las m ism as; y, un segu nd o polipéptido que com prende, d esd e el extrem o N al extrem o C, una se g u n d a región de unión a epítopo que se une selectivam ente a un segu nd o epítopo, seg u id a de una región constante que com prende una se g u n d a región C h3 de una IgG hum ana se le ccio n a d a de Ig G l, IgG2, IgG 4 y una com binación de las m ism as, en donde la se g u n d a región C h3 com prende una m odificación que reduce o elim ina la unión del segu nd o dom inio C h3 a la proteína A. V a ria s de e stas m odificaciones se d escrib en en, por ejemplo, las p u b licacio n e s de solicitud de E E .U U . n.° 2010 /0331527 y 2011 /0195454.

Un método para producir una proteína de unión a epítopo que se une a m ás de un epítopo y m uestra una propiedad de unión a epítopo dependiente del pH es inm unizar a un prim er ratón de acue rd o con la invención con un antígeno que com prende un prim er epítopo de interés, en donde el ratón com prende (1 ) un locus de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina end ógena que no contiene una s e cu e n cia génica de región variab le de ca d e n a ligera de ratón end ógena que e s ca p a z de reo rd enar y form ar una ca d e n a ligera, en donde en el locus de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina de ratón endógeno se encuentra una so la región variab le de ca d e n a ligera hum ana reo rganizad a unida al gen de región constante de ca d e n a ligera endógeno de ratón y la región variab le de ca d e n a ligera hum ana reo rgan izad a se se le ccio n a entre una V k 1 -39 J k5 hum ana y una V k3 -20 J k 1 hum ana que com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina y (2) los segm en to s gé nico s V h de ratón se han reem plazado en su totalidad o en parte por segm en to s g é n ico s V h hum anos, de modo que las ca d e n a s p e sa d a s de inm unoglobulina prod ucidas por el ratón son única o sustancialm en te c a d e n a s p e sa d a s que com prenden dom inios va ria b le s hum anos y dom inios co n stan tes de ratón. C u an d o se inm unice, dicho ratón producirá un anticuerpo quim érico inverso, que com prenderá solo uno de los dos dom inios va ria b le s de ca d e n a ligera hum ana (por ejemplo, uno de V k 1 -39 J k5 hum ano o V k3 -20 J k1 hum ano, por ejem plo, que com prende una sustitución de al m enos un am inoácido con una histidina). De m anera habitual, al m enos algun os de los restos de histidina sustituidos introducidos en la s e cu e n cia de la línea germ inal se co n servarán en el anticuerpo quim érico inverso. Una v e z que se identifica un linfocito B que codifica un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a que se une al epítopo de interés y e xp re sa un anticuerpo que m uestra propied ades de unión a antígeno d epend ientes del pH, la s e cu e n cia de nucleótidos de la región variab le de ca d e n a p e sa d a (y, opcionalm ente, la región variab le de ca d e n a ligera) puede re cu p e ra rse (por ejem plo, m ediante P C R ) y clo n arse en una construcción de expresió n en m arco con una s e cu e n cia de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana ad e cu ad a. Este proceso puede repetirse para identificar un seg u n d o dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a que se une a un seg u n d o epítopo, y puede re cu p e ra rse una se g u n d a s e cu e n cia génica de región variab le de ca d e n a p e sa d a y clo narse en un vector de expresió n en m arco a una se g u n d a s e cu e n cia ad e cu a d a de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana ad e cu ad a. El prim er y el segund o dom inio constante de inm unoglobulina cod ificado s por la s e cu e n cia g énica de la región constante pueden s e r el m ism o isotipo o uno diferente, y uno de los dom inios constantes de inm unoglobulina (pero no el otro) puede m odificarse com o se describe en el presente documento o en el documento US 2010/0331527A1, y la proteína de unión a epítopo puede expresarse en una célula adecuada y aislarse en función de su afinidad diferencial por la proteína A en comparación con una proteína de unión a epítopo homodimérica, por ejemplo, como se describe en el documento US 2010/0331527A1.

Por lo tanto, en varios aspectos, después del aislamiento del ADN y la selección de la primera y la segunda secuencia de ácido nucleico que codifican el primer y segundo dominio variable de cadena pesada humana que tienen las especificidades/afinidades deseadas y una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de cadena ligera humana (una secuencia de la línea germinal reordenada o una secuencia de cadena ligera aislada de un animal no humano como se describe en el presente documento) y comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina con un codón de histidina, las tres secuencias de ácidos nucleicos que codifican las moléculas se expresan para formar el anticuerpo biespecífico utilizando técnicas recombinantes que están ampliamente disponibles en la técnica. A menudo, el sistema de expresión de elección involucrará un vector de expresión de células de mamífero y un hospedador, de modo que el anticuerpo biespecífico esté adecuadamente glicosilado (por ejemplo, en el caso de anticuerpos biespecíficos que comprenden dominios de anticuerpos que están glicosilados). Sin embargo, las moléculas también se pueden producir en sistemas de expresión procariotas. Normalmente, la célula hospedadora se transformará con el ADN que codifica el primer dominio variable de cadena pesada humana, el segundo dominio variable de cadena pesada humana, el dominio de cadena ligera humana en un solo vector o vectores independientes. Sin embargo, es posible expresar el primer dominio variable de cadena pesada humana, el segundo dominio variable de cadena pesada humana y el dominio de cadena ligera humana (los componentes del anticuerpo biespecífico) en sistemas de expresión independientes y acoplar los polipéptidos expresados in vitro. En diversos aspectos, el dominio de cadena ligera humana procedente de una secuencia de línea germinal salvo por la sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina, por ejemplo, en un codón de CDR. En diversos aspectos, el dominio de cadena ligera humana comprende no más de uno, no más de dos, no más de tres, no más de cuatro, o no más de cinco hipermutaciones somáticas dentro de la secuencia variable de cadena ligera del dominio de cadena ligera. En algunos aspectos, las hipermutaciones somáticas no alteran la presencia de al menos un resto de histidina introducido en la secuencia de la línea germinal de la región variable de cadena ligera.

En diversos aspectos, los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica las dos cadenas pesadas y la cadena ligera humana individual con una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por una histidina se inserta en un vector replicable para su clonación adicional (amplificación del ADN) y/o para su expresión. Muchos vectores están disponibles, y generalmente incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. Cada componente puede seleccionarse individualmente o basarse en una elección de célula hospedadora u otro criterio determinado experimentalmente. Se conocen varios ejemplos de cada componente en la técnica.

Los vectores de expresión y clonación generalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está operativamente unido a las secuencias de ácido nucleico que codifican cada uno o todos los componentes del anticuerpo biespecífico. Se conoce bien un gran número de promotores, reconocidos por una diversidad de células hospedadoras potenciales. Estos promotores están operativamente unidos a ADN que codifica anticuerpos biespecíficos eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector.

Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias se encuentran comúnmente disponibles desde el 5' y, ocasionalmente 3', no traducidas de ADN o ADNc eucariota o vírico. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica los componentes del anticuerpo biespecífico. Los vectores de expresión adecuados para diversos aspectos incluyen aquellos que proporcionan la expresión transitoria en células de mamíferos de ADN que codifica el anticuerpo biespecífico. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que puede replicarse de manera eficaz en una célula hospedadora, de manera que la célula hospedadora acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula hospedadora, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADN clonados, así como la exploración rápida de anticuerpos biespecíficos que tienen especificidades/afinidades de unión deseadas o las características de migración en gel deseadas en relación con los anticuerpos precursores que tienen homodímeros del primer o segundo dominio variable de cadena pesada humana.

En diversos aspectos, una vez que el ADN que codifica los componentes del anticuerpo biespecífico se ensambla en el (los) vector(es) deseado(s) como se describe anteriormente, se introducen en una célula hospedadora adecuada para la expresión y recuperación. La transfección de células hospedadoras se puede lograr utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica apropiadas para la célula hospedadora seleccionada (por ejemplo, electroporación, microinyección nuclear, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina, etc.).

Se elige una célula hospedadora, en varios aspectos, que mejor se adapte al vector de expresión que contiene los componentes y permite la producción más eficaz y favorable de las especies de anticuerpos biespecíficos. Las células hospedadoras ejemplares para la expresión incluyen aquellas de procariotas y eucariotas (unicelulares o de múltiples células), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células fúngicas, células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insecto infectadas con baculovirus, Trichoplusiani, etc.), células de animales no humanos, células humanas o fusiones celulares, tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En varios aspectos, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En varios aspectos, la célula es una célula eucariota y se selecciona entre CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de la retina, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En varios aspectos, la célula comprende uno o más genes virales, por ejemplo, una célula retiniana que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C6 ™).

Las células hospedadoras de mamíferos utilizadas para producir un anticuerpo biespecífico pueden cultivarse en diversos medios. Los medios comercialmente disponibles tales como de Ham F10 (Sigma), Medio Mínimo Esencial ((MEM, Sigma, RPMI-1640 (Sigma), medio Eagle Modificado de Dulbecco ((DMe M), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Los medios pueden completarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir otros suplementos a concentraciones apropiadas conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tal como la temperatura, pH y similares, son, en varios aspectos, las utilizadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la materia.

El anticuerpo biespecífico puede recuperarse del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse del lisado de la célula hospedadora cuando se produce directamente sin una señal secretora. Si el anticuerpo biespecífico está unido a la membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100).

Tras el aislamiento, se analiza la capacidad de un anticuerpo biespecífico que comprende dos cadenas pesadas humanas y una sola cadena ligera humana procedente de una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana seleccionada entre secuencias Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1 que comprenden una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina, para mostrar unión dependiente de pH de uno, preferentemente a sus dos antígenos. La capacidad de los anticuerpos biespecíficos para unirse a sus antígenos de manera diferente a pH neutro y ácido (por ejemplo, su capacidad para demostrar una ti /2 disminuida a pH ácido en comparación con pH neutro) puede determinarse mediante una variedad de técnicas disponibles en la técnica y descritas en los siguientes ejemplos, por ejemplo, ensayo BIACORE™.

Métodos Adicionales para Generar Proteínas de Unión a Antígeno con Unión a Antígeno Dependiente del pH

Se describen varios métodos para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH en animales no humanos genéticamente modificados descritos en el presente documento. También se describen métodos para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH in vitro. Dichos métodos pueden implicar la generación de diversos componentes de las proteínas de unión a antígeno in vivo en animales no humanos genéticamente modificados, y después modificarlos y reensamblarlos in vitro fuera de un organismo como complejos de proteínas expresados en cultivos de células de mamíferos.

En un aspecto, el método para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH utiliza una secuencia de proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una secuencia de anticuerpo, que se genera en un ratón que comprende un repertorio limitado de segmentos V y J de región variable de cadena ligera, por ejemplo, segmentos V y J de región variable de cadena ligera humana, un ratón con "cadena ligera universal" o "cadena ligera común" (ratón "ULC"), tal como el ratón descrito en las Publicaciones de Solicitud de los Estados Unidos n.° 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 y 2013/0045492. En un aspecto, el método para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes de pH utiliza una secuencia de proteína de unión a antígeno que se genera en un ratón que comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única. En un aspecto, el método utiliza una proteína de unión a antígeno generada en un ratón que comprende una secuencia génica de región variable de cadena ligera humana reordenada única seleccionada entre Vk1-39Jk5 humano y Vk3-20Jk1 humano.

En un aspecto, el método para generar una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH comprende seleccionar un primer anticuerpo que se une a un antígeno de interés (por ejem plo, se une a un antígeno de interés con una afinidad d ese ad a), m odificar una s e cu e n cia de nucleótidos de ca d e n a ligera de inm unoglobulina del prim er anticuerpo para que com prenda una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina por un codón de histidina, e xp re sa r una ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina del prim er anticuerpo y la ca d e n a ligera de inm unoglobulina m odificada en una célula, y se le ccio n a r un segu nd o anticuerpo e xp re sa d o en la célula que co n se rv a la unión a antígeno de interés ( por ejem plo, co n se rva una afinidad d e se a d a por el antígeno de interés) a pH neutro y presen ta unión reducida al antígeno de interés a un pH ácido.

En un aspecto, el método para ge ne rar una proteína de unión a antígeno, por ejem plo, un anticuerpo, con propiedades de unión a antígeno depend ientes del pH com prende se le cc io n a r una ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina de un anticuerpo (por ejem plo, obtenido de un anim al no hum ano, por ejem plo, un ratón, por ejem plo, un ratón U L C ) que com prende una ca d e n a ligera de inm unoglobulina que tiene una s e cu e n cia de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única en donde el anticuerpo se une a un antígeno de interés (por ejem plo, se une a un antígeno de interés con una afinidad d ese ad a); m odificar la s e cu e n cia de ácido nucleico de la ca d e n a ligera de inm unoglobulina de modo que la s e cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reordenada única com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina; e xp re sa r la ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina y la ca d e n a ligera de inm unoglobulina se le ccio n a d a que com prende la sustitución de al m enos un am inoácido con una histidina en su dom inio variable; y se le cc io n a r un anticuerpo que co n se rv e la unión a antígeno de interés a un pH neutro (por ejemplo, co n serve la afinidad d e se a d a al antígeno de interés) m ientras presenta una unión reducida al antígeno de interés a un pH ácido. En d iverso s aspecto s, la ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina procede de un reordenam iento de segm en to s g énicos va ria b le s de ca d e n a p e sa d a hum ana (seg m en to s V, D y J hum anos).

En un aspecto, el método para ge ne rar una proteína de unión a antígeno, por ejem plo, un anticuerpo, con propiedades de unión a antígeno d epend ientes del pH com prende (1 ) inm unizar a un anim al no hum ano, por ejem plo, un ratón, que com prende una sola s e cu e n cia g énica de región variab le de ca d e n a ligera hum ana reo rgan izad a y un repertorio de segm ento s gé nico s va ria b le s de ca d e n a p e sa d a hum ana reo rgan izad os (segm ento s V, D y J ) con un antígeno de interés y permitir que un ratón arm e una resp u esta inm unitaria contra dicho antígeno, (2) se le cc io n a r en el anim al no hum ano, por ejem plo, en el ratón, un anticuerpo que se une al an tígeno s de interés con una afinidad d ese ad a, (3) aislar, a partir del anim al no hum ano, por ejem plo, a partir del ratón, una se cu e n cia de nucleótidos de una ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina del anticuerpo que se une al antígeno de interés con una afinidad d ese ad a, (4) determ inar la s e cu e n cia de nucleótidos de dicha ca d e n a pesada, (5) m odificar una s e cu e n cia de nucleótidos de una ca d e n a ligera de inm unoglobulina que contiene la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única para com prender una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina, (6) e x p re sa r la ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina del anticuerpo que se une al antígeno de interés con la afinidad d e se a d a y la ca d e n a ligera de inm unoglobulina que com prende la m odificación con histidina en una célula, y (7 ) determ inar si el anticuerpo e xp re sa d o en la célula co n se rv a la unión a antígeno a un pH neutro m ientras presenta una unión reducida a un pH ácido. En un aspecto, el anticuerpo e xp re sa d o en la célula m uestra la afinidad d e se a d a al antígeno a pH neutro. En d iverso s aspecto s, la ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina procede de un reordenam iento de segm ento s gé nico s v a ria b le s de ca d e n a p e sa d a hum ana (segm en to s V, D y J hum anos).

En un aspecto, el ratón que com prende una s e cu e n cia g é nica de la región variab le de ca d e n a ligera hum ana reo rd enad a única e s un ratón con ca d e n a ligera universal o con ca d e n a ligera com ún "U L C " descrito en, por ejemplo, las P u b lica cio n e s de Solicitud de los E sta d o s U nidos n.° 2011 /0195454 , 2012 /0021409 , 2012 /0192300 y 2013/0045492. En un aspecto, la se cu e n cia génica de la región variab le de ca d e n a ligera de hum ana reordenada única se se le cc io n a de una s e cu e n cia de V k 1 -39 J k5 hum ano y V k3 -20 J k 1 hum ano.

En un aspecto, el antígeno de interés se se le ccio n a de un antígeno soluble, un antígeno de superficie ce lu lar (por ejem plo, un antígeno tum oral) y un receptor de superficie celular. En un asp e cto e specífico , el receptor de superficie celu lar e s un receptor de inm unoglobulina. En un aspecto e specífico , el receptor de inm unoglobulina e s un receptor de Fc.

En un aspecto, la afinidad d e se a d a de un anticuerpo para un antígeno e xp re sa d o com o una constante de d isociación (K d) a un pH neutro e s m enos de 10-6 M, por ejem plo, m enos de 10-8 M, por ejemplo, m enos de 10-9 M, por ejemplo, m enos de 10 -10 M, por ejem plo, m enos de 10-11 M, por ejem plo, m enos de 10-12 M.

Com o se ha explicado anteriorm ente, el ratón U LC, en un aspecto, com prende una s e cu e n cia g é nica variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única, y e xp re sa anticuerpos en resp u esta al antígeno, donde la afinidad de los anticuerpos al antígeno está m ediada principalm ente a través de las c a d e n a s p e sa d a s de su s anticuerpos. E sto s ratones com prenden un repertorio de segm en to s va ria b le s de ca d e n a p e sa d a hum ana (V, D y J), que se reordenan para cod ificar un dom inio variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana de un anticuerpo que tam bién com prende la ca d e n a ligera d erivad a de la s e cu e n cia variab le de ca d e n a ligera hum ana reo rd enad a única. En un aspecto, tras la expo sición con el antígeno, estos ratones utilizan el repertorio diverso de segm ento s va ria b le s de ca d e n a p e sa d a hum ana (V, D y J ) para g e n e rar un anticuerpo con afinidad y especificid ad por el antígeno. Por lo tanto, tras la reexposición al antígeno, la se cu e n cia de nucleótidos de una ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina del anticuerpo generado en los ratones U L C se puede a is la r y utilizar para ge ne rar una proteína de unión d e se a d a que tam bién com prende una ca d e n a ligera de inm unoglobulina derivad a de la se c u e n c ia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única (por ejemplo, la s e cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única con una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina).

En un asp e cto de los ratones U LC, el 90 -100 % de los segm ento s gé nico s V h no hum anos no reo rd en ad os se reem plazan con al m enos un segm ento génico V h hum ano no reordenado. En un aspecto e specífico , todos o sustancialm en te todos (por ejem plo, 90 -100 % ) de los segm en to s g é n ico s V h no hum anos end ó g e n o s se reem plazan con al m enos un segm ento génico V h hum ano no reordenado. En un aspecto, el reem plazo e s con al m enos 19, al m enos 39 o al m enos 80 u 81 segm en to s del gen V h hum ano no reordenado. En un aspecto, el reem plazo e s con al m enos 12 segm en to s fu ncio nale s del gen V h hum ano no reordenado, al m enos 25 segm ento s fu ncio nale s del gen V h hum ano no reordenado, o al m enos 43 segm en to s fu ncio nale s del gen V h hum ano no reordenado. En un aspecto, el anim al no hum ano com prende un reem plazo de todos los segm ento s D h y J h no hum anos con al m enos un segm ento D h hum ano no reordenado y al m enos un segm ento J h hum ano no reordenado. En un aspecto, el anim al no hum ano com prende un reem plazo de todos los segm en to s D h y J h no hum anos por todos los segm ento s D h hum anos no reo rd en ad os y todos los segm en to s J h hum anos no reordenados. Po r lo tanto, el ratón U L C utiliza un repertorio d iverso de segm en to s g énicos de región variab le hum ana (segm en to s V, D y J ) para g e n e rar un anticuerpo en resp u esta al antígeno de interés.

Una v e z que se determ ina la ca d e n a p e sa d a del anticuerpo que se une al antígeno de interés con la afinidad d ese ad a, la se cu e n cia de nucleótidos de la ca d e n a p e sa d a se a ís la y secu e n cia . La s e cu e n cia se clona en un vecto r para la expresió n en cé lu la s h o sp e d a d o ra s ad e cu a d a s, por ejem plo, cé lu la s eucariotas, por ejem plo, cé lu la s C H O . En un aspecto, la s e cu e n cia de una región constante de ca d e n a p e sa d a hum ana se clona ca d e n a abajo de la se cu e n cia de la región variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana ais la d a del ratón (por ejem plo, el ratón U LC).

En un aspecto, la generación de una proteína de unión a antígeno con p ropied ades de unión a antígeno dependientes del pH com prende m odificar una s e cu e n cia de nucleótidos de la ca d e n a ligera de inm unoglobulina, en particular la se cu e n cia de la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rd enad a única, para com prender una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina. S e con ocen en la técn ica d iv e rsa s técn icas para m odificar una s e cu e n cia de nucleótidos, por ejem plo, m utagénesis dirigida al sitio. A dem ás, una se cu e n cia de nucleótidos que com prende la sustitución de histidina d e se a d a puede sintetizarse de novo.

En un aspecto, la sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina com prende una sustitución que da com o resultado la expresió n de uno, dos, tres, cuatro o m ás restos de histidina. En un aspecto, la sustitución o las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de tres o cuatro restos de histidina. En un aspecto, la sustitución o las sustitucio nes se encuentran en la región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina. En un aspecto, la sustitución o su stitu cio nes son en el codón de C D R , por ejem plo, C D R 1 , C D R 3 y/o C D R 3. En un aspecto, la sustitución o su stitu cio nes son en el codón de C D R 3.

En un aspecto, en donde la s e cu e n cia del ácido nucleico de la ca d e n a ligera de inm unoglobulina com prende la se cu e n cia del gen V k 1 -39 J k5, y la sustitución o sustitucio nes están en el codón de C D R 3 , la sustitución da com o resultado la expresió n de histidina en una posición se le ccio n a d a entre 105, 106, 108, 111 y com b in a cio n es de las m ism as. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio ne s 105, 106, 108 y 111. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105 y 106. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105 y 108. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las p o sicio n e s 105 y 111. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio ne s 106 y 108. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio ne s 106 y 111. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio ne s 108 y 111. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105, 106 y 108. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105, 106 y 111. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105, 108 y 111. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las p o sicio n e s 106, 108 y 111. S e representan en la FIG . 16 s e c u e n c ia s de am ino ácid os y de ácid o s n u cleico s de regiones C D R 3 de V k1 -39 J k5 que com prenden v a ria s sustitucio nes de histidina y se incluyen en el listado de se cu e n cia s.

En un aspecto, en donde la s e cu e n cia del ácido nucleico de la ca d e n a ligera de inm unoglobulina com prende la se cu e n cia del gen V k3 -20 J k1, y la sustitución o sustitucio nes están en el codón de C D R 3 , la sustitución da com o resultado la expresió n de histidina en una posición se le ccio n a d a entre 105, 106, 107, 109 y com b in a cio n es de las m ism as. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio ne s 105, 106, 107 y 109. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105 y 106. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105 y 107. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio ne s 105 y 109. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio ne s 106 y 107. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio ne s 106 y 109. En un aspecto, las su stitu cio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio ne s 107 y 109. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105, 106 y 107. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105, 106 y 109. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las po sicio n e s 105, 107 y 109. En un aspecto, las sustitucio nes dan com o resultado la expresió n de histidinas en las p o sicio n e s 106, 107 y 109. S e representan en la FIG . 27 s e c u e n c ia s de am ino ácid os y ác id o s n u cle ico s se le cc io n a d a s de regiones C D R 3 de V k3 -20 J k 1 que com prenden v a ria s su stitu cio nes de histidina y se incluyen en el listado de se cu e n cia s.

U na v e z que la s e cu e n cia de ca d e n a ligera de inm unoglobulina, por ejem plo, el dom inio variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana, se modifica para incluir restos de histidina en las po sicio ne s d e se a d a s, la se cu e n cia de nucleótidos de la ca d e n a ligera se clona en un vector para la expresió n en cé lu la s h o sp e d a d o ra s a d e cu ad as, por ejem plo, cé lu la s eucariotas, por ejem plo, cé lu la s C H O . En un aspecto, La s e cu e n cia de una región constante de ca d e n a ligera hum ana se clona ca d e n a abajo de la s e cu e n cia de nucleótidos m odificada de la región variab le hum ana.

En un aspecto, los v e cto re s que com prenden la se c u e n c ia de nucleótidos que codifica la ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana m odificada y la ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana se le ccio n a d a se exp re sa n conjuntam ente en una célula h o spedado ra ad e cu ad a, por ejemplo, cé lu la s h o sp e d a d o ra s eucariotas, por ejemplo, cé lu la C H O , para ge ne rar una proteína de unión a antígeno. V a ria s cé lu la s h o sp e d a d o ra s que pueden u sa rse para la expresió n son co n o cid as en la técnica y se m encionan en esta m em oria descriptiva.

U na proteína de unión a antígeno, por ejem plo, un anticuerpo, gen e rad a en la célula h o spedado ra puede se cre ta rse en el sob renadante celular, que se an aliza para determ inar la expresió n y la afinidad por el antígeno original a d e cu a d a s a pH neutro. La proteína de unión a antígeno tam bién puede re cu p e ra rse del lisado ce lu lar o, si está unida a la m em brana, liberarse de la m em brana u san d o un detergente a d e cu ad o (por ejem plo, Triton-X). S e puede purificar la proteína de unión a antígeno con ca ra cte rística s d e se ad as.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno que com prende m odificación o m odificaciones con histidina co n serva la afinidad por el antígeno que e s com parab le a la afinidad por el antígeno de la m ism a proteína de unión a antígeno (original) que no com prende m odificaciones con histidina. En un aspecto, la afinidad de la proteína de unión a antígeno m odificada con histidina por el antígeno de interés e xp re sa d a com o una constante de d isociación (K d) a un pH neutro es m enos de 10-6 M, por ejem plo, m enos de 10-8 M, por ejem plo, m enos de 10-9 M, por ejemplo, m enos de 10-10 M, por ejemplo, m enos de 10 -11 M, por ejem plo, m enos de 10 -12 M.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, que com prende m odificaciones con histidina d escritas en el presente docum ento m uestra p ropied ades de unión a antígeno depend ientes del pH. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno que com prende m odificaciones con histidina p osee p ropied ades d epend ientes del pH poten ciad as sob re una proteína de unión a antígeno equivalente sin las m odificaciones con histidina (proteína de unión a antígeno de la m ism a se cu e n cia de am ino ácid os pero para las m odificaciones de histidina). En un aspecto, la proteína de unión a antígeno descrita en el presente docum ento co n se rva la unión a antígeno a pH neutro (por ejem plo, co n se rv a la afinidad d e se a d a por el antígeno a pH neutro) m ientras presenta una unión reducida a un pH ácido. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejem plo, el anticuerpo, d escrita en el presente docum ento, no m uestra unión a antígeno en pH ácido, m ientras co n se rva unión a antígeno a pH a neutro. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno descrita en el presente docum ento, tiene una dism inución en la sem ivid a disociativa (ti/2 ) a un pH ácido en com paración con la sem ivid a d isociativa (t1/2) de la proteína de unión a antígeno a un pH neutro de al m enos aproxim adam ente 2 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 3 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 4 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 5 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 10 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 15 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 20 v e ce s, al m enos aproxim adam ente 25 v e c e s o al m enos aproxim adam ente 30 v e ce s. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno descrita en el presente docum ento tiene una t1/2 a un pH ácido y 37 °C de aproxim adam ente 2 m inutos o m enos. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno d escrita en el presente docum ento tiene una ti/2 a un pH ácido y 37 °C de m enos de aproxim adam ente 1 minuto. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno descrita en el presente docum ento tiene una ti/2 a un pH ácido y 25 °C de aproxim adam ente 2 m inutos o m enos. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno descrita en el presente docum ento tiene una ti/2 a un pH ácido y 25 °C de m enos de aproxim adam ente 1 min.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno, por ejem plo, el anticuerpo, que com prende m odificaciones con histidina d escritas en el presente docum ento, m uestra una sem ivid a en su ero aum entada tras la adm inistración de una d osis terapéutica a un sujeto en com paración con una sem ivid a en su ero tras la adm inistración de una d o sis terapéutica equivalente de proteína de unión a antígeno que no com prende m odificaciones con histidina (por ejem plo, la proteína de unión a antígeno original que no com prende m odificaciones con histidina). En alg u n o s aspecto s, el aum ento en la sem ivida en su ero tras la adm inistración de una d o sis de la proteína de unión a antígeno que com prende m odificaciones con histidina d escritas en el presente docum ento durante una sem ivid a en su ero tras la adm inistración de la m ism a d osis de la proteína de unión a antígeno que no com prende m odificaciones de histidina es aproxim adam ente 2 v e ce s, por ejem plo, aproxim adam ente 5 v e ce s, por ejem plo, aproxim adam ente 10 v e ce s, por ejem plo, aproxim adam ente 15 v e ce s, por ejemplo, aproxim adam ente 20 v e c e s o m ás. En un aspecto, la sem ivid a en suero es de al m enos aproxim adam ente 1 día, por ejem plo, al m enos aproxim adam ente 2 d ías, por ejem plo, al m enos aproxim adam ente 7 días, por ejem plo, al m enos aproxim adam ente 14 días, por ejem plo, al m enos aproxim adam ente 30 días, por ejem plo, al m enos aproxim adam ente 60 días.

Además de los métodos in vitro para generar proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a antígeno dependientes del pH descritas anteriormente, también se describen en el presente documento proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, generadas por dicho método. Además, dicho método puede utilizarse para generar proteínas de unión a antígeno multiespecíficas, por ejemplo, biespecíficas, seleccionando dos cadenas pesadas de inmunoglobulina humana diferentes que se unen a una cadena ligera común (universal) en un ratón, determinando secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas, modificando la cadena ligera universal para que comprenda las sustituciones de histidina como se describe anteriormente y expresando dos cadenas pesadas humanas con una cadena ligera universal modificada con histidina única en una célula hospedadora. Varias etapas para generar una proteína de unión a antígeno descrita anteriormente pueden ser aplicables al método de generación de una proteína de unión a antígeno biespecífica. Se puede purificar la proteína de unión a antígeno biespecífica, confirmada que posee afinidad deseada para el(los) antígeno(s) y las propiedades de unión a antígeno dependientes del pH. Por lo tanto, se describen anticuerpos biespecíficos que comprenden dos cadenas pesadas humanas y una sola cadena ligera humana que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera humana codificada por un gen de región variable humano, por ejemplo, un gen de región variable Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1 que comprende una sustitución de al menos un codón distinto de histidina por un codón de histidina.

También se describen construcciones utilizadas en la producción de una proteína de unión a antígeno que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina humana y una cadena ligera de inmunoglobulina humana que comprenden sustituciones de histidina. También se describen células hospedadoras que expresan proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, descritas en el presente documento.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a aquellos expertos habituales en la materia una divulgación y descripción completas de cómo fabricar y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni pretenden representar que los experimentos, a continuación, son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o próxima.

Ejemplo 1. Construcción de locus de cadena pesada de inmunoglobulina humanizados que comprenden segmentos génicos D sustituidos con histidina

La construcción locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprenden segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina se llevó a cabo mediante una serie de reacciones de recombinación de homólogos en células bacterianas (BHR) usando ADN de cromosoma artificial de bacteria (BAC). Se generaron varias construcciones de direccionamiento para la creación de un ratón modificado por ingeniería genética que expresa un dominio variable de cadena pesada que comprende uno o más restos de histidina usando la tecnología de ingeniería genética VELOCiGe NE® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 6.586.251 y Valenzuela, D. M. et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6):652-659).

Inicialmente, se sintetizaron segmentos génicos D humanos in silico en forma de cuatro trozos (4 repeticiones) en los que los codones que codifican tirosina (Y), asparagina (N), serina (S), glicina (G) y aspartato (D) en el marco hidrófobo se sustituyeron por codones de histidina (en lo sucesivo, segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina", es decir, HD 1.1-6.6 (9586pb; SEQ ID NO: 1), HD 1.7-6.13 (9268pb; SEQ ID NO: 2), HD 1.14-6.19 (9441pb; SEQ ID NO: 3) y HD 1.20-6.25, 1.26 (11592pb; SEQ ID NO: 4) (FIG. 3 ). Las cuatro repeticiones también contenían sitios de enzimas de restricción únicos en los extremos para volver a ligarlos juntos. La ubicación específica de las sustituciones de histidina (marcadas en negrita) en cada segmento génico D humano se muestra en las FIG. 1A y 1B en la columna marcada como "Hidrófila". Como se muestra en la FIG. 1, aunque la modificación introdujo codones de histidina en el marco de lectura hidrófilo, también cambió algunos codones de parada a codones de serina en el marco de lectura de "parada". La modificación, sin embargo, efectuó pocos cambios en el marco de lectura "hidrófobo". El procedimiento detallado para ligar las cuatro repeticiones de segmento D sintetizadas se ilustra en la FIG. 3 (ligamiento secuencial). El clon resultante contenía, de 5' a 3', un brazo de homología de ratón 5', un casete de neomicina floxado, segmentos génicos D humanos que comprenden sustituciones de histidina (es decir, HD 1.1-6.6 (9586pb; SEQ ID NO: 1), HD 1.7 6.13 (9268pb; SEQ ID NO: 2), HD 1.14-6.19 (9441pb; SEQ ID NO: 3) y HD 1.20-6.25, 1.26 (11592pb; SEQ ID NO: 4)), un casete de selección de cloranfenicol y un brazo de homología 3'.

Se llevaron a cabo las seis modificaciones genéticas a continuación para reemplazar los segmentos génicos D humanos endógenos en el ratón humanizado VELOCIMMUNE® con los segmentos génicos D humanos sustituidos con histidina descritos anteriormente.

En primer lugar, pLMa0174, que contiene un casete de selección de espectinomicina y un sitio de restricción de AsiSI, se dirigió al extremo 5' del clon MAID 1116 (etapa 1. BHR (Spec); FIG. 2). Durante la etapa 1, un casete de selección de cloranfenicol, un casete de selección de neomicina, un sitio de loxP, dos segmentos génicos de Vh (Ii Vh1-3 y hVH1 2), y el gen A dam 6p hum ano, todos los cu a le s estaban u b icad os en 5' ca d e n a arriba de hVH6-1, se elim inaron del clon MAID 1116 y se reem plazaron por un ca se te de espectinom icina para producir el clon V I433.

En segu nd o lugar, en la etapa 2 (B H R (H yg Spec); F IG . 2), se dirigió pN T u0002 que contenía un ca se te de higrom icina flanqueado por sitios de F R T se dirigió a una región que com prendía segm ento s gé nico s D h de inm unoglobulina hum ana. Durante la etapa 2, se elim inaron todos los segm ento s g é n ico s D hum anos de ca d e n a p e sa d a de V I433 y se reem plazaron por el ca se te de higrom icina para proporcionar M A ID 6011 VI 434 (clon 1). La m odificación tam bién introdujo los sitios de restricción P I-S ce I e I-C eu I en el extrem o 5' y 3' del ca se te de higrom icina.

En tercer lugar, la región genóm ica que com prende segm en to s g é n ico s D hum anos sustituidos con histidina (H D 1.1 6.6 (9586pb; S E Q ID NO: 1), HD 1.7 -6.13 (9268pb; S E Q ID NO: 2), HD 1.14 -6.19 (9441pb; S E Q ID NO: 3 ) y HD 1.20 6.25, 1.26 (11592 p b ; S E Q ID NO: 4)) se introdujeron en una región entre los sitios de P -S ce I e I-CeuI de Ma ID 6011 V I434 m ediante digestión de restricción y ligam iento (1116 m odificada por ligam iento con P I-S ce l/I-C e u l (K an Spec); Fig. 4). Esto proporcionó M A ID 6012 V I469 que contenía, de 5' a 3', un ca se te de espectinom icina, aproxim adam ente 50 kb de una región genóm ica que com prende V h6-1, un ca se te de neom icina floxado, aproxim adam ente 40 kb de los segm ento s g énicos D hum anos sustituidos con histidina (H D 1.1-6.6 (9586bp; S E Q ID No : 1), HD 1.7 -6.13 (9268pb; S E Q ID NO: 2), HD 1.14 -6.19 (9441pb; S E Q ID NO: 3 ) y HD 1.20-6.25, 1.26 (11592 p b ; S E Q ID NO: 4 )) y aproxim adam ente 25 kb de una región genóm ica que contiene segm en to s g é n ico s J h hum anos, segu id o de un Ei de ratón (potenciador intrónico mIgH; S E Q ID NO: 5), una región de cam bio de ratón (S E Q ID NO: 6) y una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de IgM de ratón (m IgM exón 1; S E Q ID NO: 7). Las cé lu la s b acterian as que contenían la m odificación se sele ccio n aro n b a sá n d o se en la sele cció n con kanam icina y espectinom icina.

En cuarto lugar, se usaron com o diana cé lu la s E S de ratón heterocigotas M AID 1460 con M AID 6011 V I434 m ediante electroporación para elim inar la totalidad de los segm en to s g é n ico s D hum ano s e n d ó g e n o s del clon MAID 1460 com o se ilustra en la Fig. 5. Esto proporcionó cé lu la s E S de ratón heterocigotas M AID 6011 que com prenden en su locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina (en el crom osom a derivado de la ce p a 129), de 5' a 3', un sitio de F R T ,, segm ento s gé nico s de V h hum anos, una región genóm ica de ratón que ab arca g e n e s adam 6a/b, un ca se te de higrom icina flan quead o por sitios de F T R y segm en to s J h hum anos, segu id o de una s e cu e n cia de Ei de ratón y una se cu e n cia de nucleótidos de región constante de IgM. La m odificación genética de M AID 6011 (una pérdida de alelos, una gan an cia de a lelo s y la p resen cia de ale lo s p re cu rso re s) se confirm ó usand o las so n d a s y ce b a d o re s com o se m uestran en la Fig. 6.

En quinto lugar, se electroporaron cé lu la s E S de ratón heterocigotas M AID 6011 con M AID 6012 V I469 a fin de introducir segm en to s g é n ico s D hum ano s sustituidos con histidina (e s decir, HD 1.1-6.6 (9586pb; S E Q ID NO: 1), HD 1.7 -6.13 (9268pb; S E Q ID NO: 2), HD 1.14 -6.19 (9441pb; S E Q ID NO: 3 ) y HD 1.20-6.25, 1.26 (11592 p b ; S E Q ID NO: 4)) en M AID 6011. La etapa de direccionam iento elim inó el ca se te de sele cció n de higrom icina floxado de M AID 6011 y reem plazó la se cu e n cia con los segm ento s gé nico s D hum anos sustituidos con histidina. Esto dio lugar a cé lu la s E S heterocigotas M AID 6012 que com prendían un crom osom a procedente de C 57 B L /6 de tipo silvestre y un crom osom a procedente de la ce p a 129 genéticam ente m odificado que com prende segm ento s g é n ico s V h y J h hum anos de tipo silvestre y los segm ento s gé nico s D hum ano s sustituidos con histidina descrito s en el presente docum ento. A dem ás, las cé lu la s E S contenían una región genóm ica de ratón que ab arca b a g e n e s adam 6a/b y un ca se te de neom icina floxado entre los segm ento s V h y D (Fig. 7). La m odificación genética de MAID 6012 (u n a pérdida de alelos, una g an an cia de a lelo s y la presen cia de ale lo s p re cu rso re s) se confirm ó usand o las so n d a s y ce b a d o re s com o se m uestran en la Fig. 8.

Finalm ente, se electroporaron cé lu la s E S M AID 6012 con un plásm ido que e xp re sa una reco m b inasa C re a fin de elim inar el ca se te de sele cció n de neom icina de las cé lu la s E S M AID 6012, dando com o resultado cé lu la s E S heterocigotas M AID 6013 (Fig. 9). La célula E S heterocigota MAID 6013 ("M AID 6013 het") final contiene un crom osom a procedente de la ce p a de tipo silvestre C 57 B L /6 y un crom osom a genéticam ente m odificado procedente de la ce p a 129 que com pren día en su locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina, de 5' a 3', (1 ) un sitio de F R T ; (2) segm ento s g é n ico s VH hum anos; (3) una región genóm ica de ratón que ab arca g e n e s adam 6a/b; (4) un ca se te de sele cció n de neom icina floxado; (5 ) segm ento s gé nico s D hum anos sustituidos con histidina (H D 1.1-6.6 (9586pb; S E Q ID NO: 1), HD 1.7 -6.13 (9268pb; S E Q ID NO: 2), HD 1.14 -6.19 (9441pb; S E Q ID NO: 3 ) y HD 1.20-6.25, 1.26 (11592 p b ; S E Q ID NO: 4)); (6) segm en to s gé nico s J h hum anos; seguid o de (7 ) una se cu e n cia de Ei de ratón (potenciador intrónico mlgH; S E Q ID NO: 5), (8) una región de cam bio (S E Q ID NO: 6); y (9) una s e cu e n cia de nucleótidos de región constante de IgM de ratón (m IgM exón 1; S E Q ID NO: 7 ) com o se ilustra en la Fig. 9.

L a s cé lu las E S diana (M A ID 6013 ) d escrita s anteriorm ente se usaron com o cé lu la s E S d onantes y se introdujeron en un em brión de ratón en estadio de 8 cé lu la s m ediante el método V E L O C IM O U S E ® (véa n se , por ejem plo, los docum entos U S 7.576.259 , U S 7.659.442 , U S 7.294.754 y U S 2008 -0078000 A 1). S e identificaron ratones que portaban en locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificados que com prendían los segm ento s gé nico s de gen D de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina sustituida con histidina m ediante genotipado usand o los ce b a d o re s y las so n d a s e xp u e sta s en la Fig. 8. El ratón de F0 genéticam ente m odificado resultante se apareó con un ratón de tipo silvestre para obtener d e sce n d e n cia de F1. S e genotipó a las cría s de F1 y se sele ccio n aro n las cría s de F1 que son heterocigotas para el locus de inm unoglobulina que com prende segm ento s g é n ico s D de ca d e n a p e sa d a hum ana sustituidos con histidina para su caracterizació n adicional.

Ejemplo 2. Análisis de las secuencias de nucleótidos de región variable de cadena pesada reorganizada

A continuación, se exam inó si el ratón genéticam ente m odificado que com pren día segm en to s g é n ico s D hum anos sustituidos con histidina descrito en el presente docum ento, por ejem plo, ratón heterocigoto 6013 F0, que com prende en su línea germ inal un crom osom a procedente de 129 que com prende segm en to s gé nico s V h, J h y segm entos gé nico s D hum ano s sustituidos por histidina (H D 1.1-6.6 (9586pb; S E Q ID NO: 1), HD 1.7 -6.13 (9268pb; S E Q ID NO: 2), HD 1.14 -6.19 (9441pb; S E Q ID NO: 3 ) y HD 1.20-6.25, 1.26 (11592 p b ; S E Q ID NO: 4), podía e x p re sa r se c u e n c ia s de V (D )J de ca d e n a p e sa d a reo rg an izad as que com prenden uno o m ás co d o n es de histidina procedentes del locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente modificado.

Con este fin, se analizaron s e c u e n c ia s de A R N m a is la d a s de linfocitos B de bazo de los ratones 6013 F0 heterocigotos m ediante reacción en ca d e n a de la polim erasa de retrotranscriptasa (R T -P C R ) respecto de la p resen cia de se c u e n c ia s C D R 3 de IgM procedentes de los segm en to s g é n ico s D hum ano s sustituidos con histidina.

En resum en, se recogieron b azo s y se hom ogeneizaron en 1 x P B S (G ib co ) u sand o portaobjetos de vidrio. L a s cé lu las se sedim entaron en una centrífuga (500 xg durante 5 m inutos) y los glóbulos rojos se lisaron en tam pón de lisis A C K (G ib co ) durante 3 minutos. L a s cé lu la s se lavaron con 1 x P B S y se filtraron utilizando un tam iz de cé lu la s de 0 ,7 pm. Los linfocitos B se aislaron de cé lu la s del bazo utilizando la sele cció n positiva m agnética M A C S para C D 19 (Miltenyi Biotec). El A R N total se aisló de linfocitos B sed im en tado s utilizando el kit R N e a s y P lu s (Q iagen). S e aisló A R N m PoliA+ a partir del A R N total utilizando el mini kit de A R N m O ligotex® Direct (Q iagen).

S e preparó A D N c bicatenario a partir de A R N m de linfocitos B e sp lé n ico s m ediante 5' R A C E u san d o el kit de sín te sis de A D N c S M A R T e r™ Pico (Clontech). La transcriptasa in versa de C lontech y los d N T P se sustituyeron con S uperscript II y d N T P de Invitrogen. S e am plificaron repertorios de anticuerpo de región variab le de ca d e n a p e sa d a (V h) a partir del A D N c usand o ce b a d o re s e sp e cífico s para regiones con stan tes de igM y el ce b a d o r S M A R T e r™ 5' R A C E (tabla 1). Los productos de P C R se lim piaron con un kit de purificación de P C R Q IA q u ick ® (Q iagen). S e realizó una seg u n d a ronda de P C R utilizando el m ism o ce b a d o r 5 'R A C E y un ce b a d o r 3' anidado e sp e cífico para las regio nes constantes de IgM (tabla 2). Los productos de la se g u n d a ronda de P C R se purificaron utilizando un sistem a S iz e S e le ct™ E -g e l® (Invitrogen). S e realizó una tercera P C R con ce b a d o re s que agregaron 454 ad aptad ores y códigos de barras. Los productos de la tercera ronda de P C R se purificaron utilizando perlas A g en co u rt® A M P u re ® X P . Los productos de la P C R purificados se cuantificaron m ediante S Y B R ® -q P C R utilizando un kit de cuantificación de biblioteca K A P A (K A P A B iosystem s). L a s bibliotecas ag ru p ad as se som etieron a P C R en em ulsión (e m P C R ) utilizando el kit e m P C R Lib-A de la serie 454 G S Ju n io r Titanium (R o ch e D iagnostics) y la se cu e n cia ció n bidireccional utilizando el instrum ento R o ch e 454 G S Ju n io r seg ú n los protocolos del fabricante.

Tabla 1.

NOMBRE SECUENCIA

3' mIgM CH 1 T C T T A T C A G A C A G G G G G C T C T C (S E Q ID N O :318 ) externo

Tabla 2.

NOMBRE

3 ’ mlgM C H 1 interno G G A A G A C A T T T G G G A A G G A C T G (S E Q ID N O :319 )

Análisis bioinformático

L a s 454 s e c u e n c ia s se clasificaron b a sá n d o se en la co incid e ncia perfecta del código de b arras de la m uestra y se recortaron para m ejorar la calidad. L a s s e c u e n c ia s se anotaron b a sá n d o se en la alineación de las s e c u e n c ia s de Ig reo rd en ad as con la b ase de datos de los segm ento s V, D y J de la línea germ inal hum ana usand o la instalación local de igblast (N C B I, v2.2.25+ ). U na s e cu e n cia se m arcó com o am bigua y se eliminó del a n á lis is cuan do se detectaron m últiples m ejores éxitos con idéntica puntuación. S e desarrolló un conjunto de scripts perl para an a liza r resultados y a lm a ce n a r datos en la b ase de datos m ysql. La región C D R 3 se definió entre el codón C co n servad o y el motivo F G X G (S E Q ID NO: 320 ) para las c a d e n a s ligeras y el motivo W G X G (S E Q ID NO: 321 ) para las c a d e n a s p e sa d a s. S e determ inó la longitud de la C D R 3 usand o solo anticuerpos productivos.

Com o se m uestra en las Fig. 11-13 , los ratones heterocigotos 6013 F0 e xpresaro n un repertorio diverso de se c u e n c ia s de A R N m de región variab le de ca d e n a p e sa d a reo rgan izad a (s e c u e n c ia s V -D -J reo rg an izad as) que codifican uno o m ás co d o n es de histidina en la C D R 3. Los datos de se cu e n cia ció n sugirieron que los co d o n es de histidina que ap areciero n en la C D R 3 procedían de v a rio s segm ento s g é n ico s D hum ano s sustituidos con histidina en el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina genéticam ente m odificado de los ratones 6013 descrito s en el presente docum ento.

Ejemplo 3. Uso de histidina en cadenas ligeras humanas específicas de antígeno

S e alinearon se c u e n c ia s de am ino ácid os de c a d e n a s ligeras se le cc io n a d a s de anticuerpos hum anos e sp e cífico s de antígeno. S e identificaron m utaciones de histidina en las C D R de c a d e n a s ligeras d erivad as de V k 1-39 hum ano para un núm ero sele ccio n ad o de anticuerpos hum anos e sp e cífico s de antígeno (figura 15). Las c a d e n a s ligeras procedentes de V k1-39 hum ano se aislaron de ratones inm unizados para que contuviesen una so la ca d e n a ligera V k1-39 hum ana reo rgan izad a (v é a s e el docum ento U S 2011 /0195454 A 1 ) y soportasen hiperm utaciones som áticas g e n e ra d a s en el repertorio de anticuerpo del ratón.

Los restos de histidina se m odificaron en una ca d e n a ligera V k1 -39 hum ana reo rgan izad a u san d o técn icas de m utagénesis m olecular co n o cid as en la técnica. L a s u b icacio n e s de los restos m odificados se m uestran en la F IG . 16. S e construyeron regiones va ria b le s de ca d e n a ligera procedentes de V k1 -39 hum ana que contenían restos de histidina d ise ñ a d o s y se em parejaron con d iv e rsa s regiones v a ria b le s de anticuerpo hum ano en un formato de anticuerpo, e sp e cífico para un receptor de la superficie ce lu lar hum ana, para an aliza r la expresió n en cé lu la s CH O .

L a s cé lu la s C H O que tenían una ca d e n a p e sa d a particular y una ca d e n a ligera con las m odificaciones de his ind icad as (por ejem plo, 105, 106, 108, 111 ) se sem braron en los pocillos de una placa de 48 pocillos. Al día siguiente, se m ezclaron los A D N correspon dientes a la ca d e n a p e sa d a y la ca d e n a ligera, en un peso igual (400 ng), con reactivo de transfecció n (Lipofectin 2000), se dejó que form aran un com plejo m ediante incubación y se añadió el com plejo a las cé lu la s sem b radas. Cuatro d ía s d esp u é s, se recogió el medio. El m edio contenía el anticuerpo expresado .

L a s cé lu la s C H O que tenían diferentes c a d e n a s p e sa d a s e m p are ja d a s con la m ism a ca d e n a ligera que ten ía una o m ás su stitu cio nes de his en C D R 3 e xp re sa n bien. S e determ inó el nivel (ng/m l) de expresió n de anticuerpo en ng/ml detectado en los so b re n a d a n tes de cé lu la s C H O transfectad as con g e n e s de anticuerpo que tienen restos de histidina d ise ñ a d o s en u b icacio n e s se le cc io n a d a s en la C D R 3 de las c a d e n a s ligeras.

La expresió n en so b re n a d a n tes de cé lu la s C H O de ca d e n a s p e sa d a s e sp e cífica s de antígeno em p are ja d a s con c a d e n a s ligeras m odificadas con histidina u sand o c a d e n a s p e sa d a s se le ccio n a d a s, m edida m ediante tra n sfe ren cias de proteínas, se m uestra en la FIG . 18. U L C se refiere a una ca d e n a ligera procedente de V k 1-39 hum ana reorganizada.

S e som etió una alícuota del m edio a un a n á lis is en un instrum ento B IA C O R E ™ usand o el antígeno diana para el anticuerpo (una s e cu e n cia de receptor de la superficie celular). El anticuerpo se capturó sob re el chip. El nivel de captura del anticuerpo se m uestra en las F IG . 19 A -19 J com o UR. El anticuerpo capturado en el chip B IA C O R E ™ se som etió a flujo que contenía la s e cu e n cia del antígeno diana. S e midió la captura por el anticuerpo del antígeno diana, a s í com o una ta sa de a so ciació n y otros parám etros del modo m ostrado. S e detuvo el flujo de antígeno y se determ inó la constante de d isociación com o antígeno d esaco p lad o del anticuerpo unido.

Las con stan tes de d isociación en equilibrio (K d) (aparente) para so b re n a d a n tes de anticuerpo se le ccio n a d o s se determ inaron m ediante S P R (re so n a n cia de plasm ón su perficial) u sand o un instrum ento B IA C O R E ™ T 100 (G E H ealthcare). L a s cin éticas se midieron a pH 7,4 y a pH 5 ,75. Los resultados se m uestran en las FIG . 19 A -19 J.

C o m o se m uestra en las F IG . 19 A -19 J, los datos para la unión del anticuerpo a un receptor de la superficie celular, donde se han m odificado las c a d e n a s ligeras para codificar restos de histidina en po sicio n e s e sp e cífica s en una C D R , para c a d e n a s ligeras V k1 -30 /J k5 em p are ja d a s con las ca d e n a s p e sa d a s indicadas, dem uestra que las m odificaciones con histidina tienen una influencia directa en la unión del antígeno (por ejem plo, un receptor de la superficie celular) con diferentes afin id ad es a pH 7,4 y pH 5 ,75. L a s m odificaciones con histidina que co n servan unión a pH 7,4, pero que m uestran una unión baja o una unión no detectable a pH 5 ,75 , son d ese ab les.

Ejemplo 4. Identificación de Restos de Histidina en Cadenas Ligeras Humanas Específicas de Antígeno. La generación de un ratón de ca d e n a ligera com ún (por ejem plo, ratón de ca d e n a ligera com ún V k 1-39 o V k3-20 ) y anticuerpos e sp e cífico s de antígeno en esto s ratones se d escrib e en las Solicitud de patente de los E sta d o s U nidos n.° 13/022.759 , 13 /093.156 y 13 /412.936 (P u b lica cio n e s n.° 2011 /0195454 , 2012 /0021409 y 2012 /0192300 , respectivam ente). En resum en, el vecto r de direccionam iento de ca d e n a ligera de la línea germ inal hum ana se realizó utilizando la tecn ología V E L O C IG E N E ® (v é a se , por ejem plo, la patente de los E E .U U . N.° 6.586.251 y V a le n zu e la et al. (2003 ) High-throughput engineering of the m ouse genom e coupled with high-resolution e xp re ssio n an alysis, Nature Biotech. 21(6 ): 652 -659 ) para m odificar los clo ne s del C rom osom a Artificial B acteriano (B A C ) del genom a del ratón, y las co n struccio n es g e n ó m icas se diseñaro n genéticam ente para contener una región de ca d e n a ligera de la línea germ inal hum ana reo rd enad a única y se insertaron en un locus de ca d e n a ligera k endógeno que se modificó previam ente para elim inar la variab le k end ógena y los segm ento s gé nico s que se unen. D e sp u é s se usó A D N de B A C dirigido para som eter a electroporación cé lu la s E S de ratón para cre a r cé lu la s E S m odificadas para g e n e rar ratones quim éricos que e xp re sa n una región V k 1 -39 J k5 o V k3 -20 J k 1 de la línea germ inal hum ana reordenada. L a s cé lu la s E S dirigidas se utilizaron com o cé lu la s E S d onantes y se introdujeron en un em brión de ratón en la fa se de 8 cé lu las m ediante el m étodo V E L O C IM O U S E ® (véa se, por ejem plo, la patente de los E E .U U . n.° 7.294.754 y Poueym irou et al. (2007 ) F0 generation m ice that are e sse ntially fully derived from the donor genetargeted E S ce lls allowing im m ediate phenotypic a n a ly se s Nature Biotech. 25 (1): 91-99). V E L O C IM IC E ® que lleva independientem ente una región de ca d e n a ligera hum ana d iseñ a d a genéticam ente de V k 1 -39 J k5 o V k3 -20 J k 1 se identificó m ediante tipificación génica utilizando una m odificación del e n say o de a lelo s (V ale n zu e la et al., Supra) que detecta la p resen cia de la región de ca d e n a ligera de la línea germ inal hum ana única reordenada.

Los ratones que soportan un locus de ca d e n a ligera de la línea germ inal hum ana d iseñad o genéticam ente (ratones U L C ) se cruzaron con ratones que contienen un reem plazo del locus del gen variab le de ca d e n a p e sa d a de ratón endógeno con el locus del gen variab le de ca d e n a p e sa d a hum ana (v é a s e el docum ento U S 6 ,596 ,541; the V E L O C IM M U N E ® m ouse, R eg e n e ro n Pharm aceuticals, Inc.).

El ratón V E L O C IM M U N E ® que contiene una región de ca d e n a ligera de la línea germ inal hum ana reordenada única se expo ne con un antígeno de interés y se a ís la n y se cu e n cia n los anticuerpos que com prenden una ca d e n a ligera universal (por ejem plo, V k 1 -39 J k5). S e alinearon s e c u e n c ia s de am ino ácid os de c a d e n a s ligeras se le cc io n a d a s (A-K) de anticuerpos hum anos e sp e cífico s de antígeno en un ratón de ca d e n a ligera com ún V k 1 -39 J k5. S e identificaron m utaciones de histidina en las C D R de c a d e n a s ligeras d erivad as de V k 1-39 hum ano para un núm ero sele ccio n ad o de anticuerpos hum anos e sp e cífico s de antígeno (figura 15). La s e cu e n cia de am ino ácid os parcial del dom inio variab le V k 1 -39 J k5 de línea germ inal se m uestra por encim a de los alineam ientos y se e xpo ne en la S E Q ID NO: 325, la se cu e n cia de am ino ácid os del dom inio variab le com pleto se e xpo ne en la S E Q ID NO: 404.

Ejemplo 5. Diseño y Caracterización de Anticuerpos de Cadena Ligera Universal Humana Sustituida con Histidina

Ejemplo 5.1. Diseño de Restos de Histidina en una Cadena Ligera Reordenada Humana de la Línea Germinal Los restos de histidina se diseñaro n genéticam ente en una ca d e n a ligera de V k 1 -39 J k5 hum ano reordenada utilizando ce b a d o re s de m utagénesis dirigida al sitio esp e cíficam e nte d ise ñ a d o s genéticam ente para introducir restos de histidina d iseñ a d o s en las po sicio ne s Q 105, Q 106, Y 108 y P 111 de la ca d e n a ligera de V k 1 -39 J k5 hum ano. La m utagénesis dirigida al sitio se realizó utilizando técn icas m oleculares co n o cid as en la técn ica (por ejem plo, el kit de m utagénesis dirigida al sitio Q u ikC h ang e II XL, A gilent T echnologies). L a s lo caliza cio n es de los restos de d ise ñ a d o s genéticam ente en la C D R 3 se m uestran en la F IG . 16, las s e c u e n c ia s de ác id o s n u cleico s de las C D R 3 sustituidas con histidina rep rese ntad as en la F IG . 16 se exponen en las S E Q ID NO: 328, 330, 332 , 334 , 336 , 338 , 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354 y 356 (las s e c u e n c ia s de am ino ácid os co rrespon dientes se exponen en las S E Q ID NO: 329, 331, 333 , 335 , 337 , 339 , 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353 , 355 y 357 ). L a s se c u e n c ia s de ác id o s n u cle ico s y am ino ácid os de C D R 3 de V k 1 -39 J k5 reo rd en ad as de la lín ea germ inal se exponen en las S E Q ID NO: 326 y 327 , respectivam ente. Ejemplo 5.2. Construcción y Expresión de Cadenas Ligeras de Diseñadas Genéticamente con Histidina

S e construyeron c a d e n a s ligeras d erivad as de V k 1-39 hum ano que contenían restos de histidina d ise ñ a d o s genéticam ente en la línea germ inal producidos de acuerdo con el Ejem plo 2 y se em parejaron con v a ria s ca d e n a s p e sa d a s h u m anas (m arcad as 1-5), e sp e cífica s para un receptor de superficie ce lu lar hum ano, para an aliza r la expresió n en cé lu la s C H O . L a s cinco ca d e n a s p e sa d a s h u m anas e sp e c ífic a s para un receptor de superficie celu lar hum ano que se em parejaron con c a d e n a s ligeras d erivad as de V k 1-39 sustituidas con histidina se obtuvieron de ratones que tienen una ca d e n a ligera hum ana reo rd enad a única (una ca d e n a ligera reo rd enad a de V k 1 -39 /J k5 hum ano; v é a s e el docum ento U S 2011 /0195454 A 1 ).

Ensayo de Inmunoadsorción Ligado a Enzimas (ELISA): La secre ció n de anticuerpos a partir de las cé lu la s C H O se detectó utilizando un E L IS A de Fc, para c a d e n a s ligeras con m odificaciones de histidina ind icad as con cinco ca d e n a s p e sa d a s diferentes. L a s s e c u e n c ia s de ca d e n a ligera y p e sa d a (pero para las m odificaciones) se generaron en ratones que tienen una ca d e n a ligera hum ana reo rd enad a única (por ejem plo, una ca d e n a ligera reo rd enad a de V k 1 -39 /J k5 hum ano; v é a s e el docum ento U S 2011 /0195454 A 1 ). El anticuerpo de captura fue anti IgG hum ana de cabra y el anticuerpo de detección fue anti H R P (F c gam m a -e sp e cífico ) hum ano de cabra. Los resultados se m uestran en la FIG .

17. U LC pesada: ca d e n a p e sa d a e sp e cífica y ca d e n a ligera derivad a de V k 1-39 hum ano no m odificada. Com o se m uestra en la FIG . 17, se detectó la expresió n en todos los m utantes.

Inmunotransferencia de Proteínas. La expresió n en so b re n a d a n tes de cé lu la s C H O de ca d e n a s p e sa d a s e sp e cífica s de antígeno em p are ja d a s con c a d e n a s ligeras d ise ñ a d a s genéticam ente con histidina se an alizó adicionalm ente m ediante transferen cia W estern. L a s m uestras se ejecutaron en un gel de tris-glicina al 4 -12% . Los resultados que utilizan una ca d e n a p e sa d a se le ccio n a d a (cad e n a p e sa d a 3 ) se m uestran en la FIG . 18. U L C se refiere a una ca d e n a ligera derivad a de V k 1-39 hum ano reo rd enad a (com o se d escrib e anteriorm ente).

Ejemplo 5.3. Determinación de la Afinidad de Unión de las Cadenas Ligeras Diseñadas Genéticamente con Histidina Las con stan tes de d isociación de equilibrio (K d), las sem ivid as de d isociación (t1/2) y otros parám etros cinéticos para los so b re n a d a n tes de anticuerpos se le cc io n a d o s se determ inaron m ediante S P R (R e s o n a n c ia de P lasm ón de Su perficie) utilizando un instrum ento B IA C O R E ™ T 200 (G E H ealthcare). L a s cin éticas se m idieron a pH 7,4 y a pH 5 ,75. Los resultado s se m uestran en las FIG . 20 A - 20E.

Los v a lo re s num éricos para las propied ades de unión cinética (por ejem plo, k^a, k^d, K^d, t1^ , etc.) de anticuerpos que se unen a inmunógeno a pH neutro (pH 7,4) y a pH ácido (pH 5,75) se obtuvieron utilizando un biosensor de resonancia de plasmón de superficie en tiempo real (Biacore T200). Un chip sensor Biacore CM5 se derivatizó con un anticuerpo anti Fc humano de ratón para capturar los anticuerpos del sobrenadante. Después se inyectó una concentración única (50 nM) de inmunógeno sobre la superficie capturada por el anticuerpo a un caudal de 30 pl/min. La asociación anticuerpo-antígeno se controló durante 2,5 minutos y después la disociación del antígeno del anticuerpo capturado se controló durante 8 minutos. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a una unión 1:1 con un modelo de transporte de masa utilizando el software de evaluación Biacore T200 versión 1.0. Las constantes de disociación (Kd) y las semividas de disociación (t1^ ) en equilibrio se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: K^d (M) = k^d / k^a; y t!^ (min) = (ln2/(60*kd).

Como se muestra en la FIG. 20, en un ensayo de unión de anticuerpo a un receptor de la superficie celular, dos de cada cinco anticuerpos con cadenas ligeras comunes modificadas con histidina (CDR3 modificadas con histidina de cadenas ligeras de Vk1-39/Jk5) que se emparejaron con las cadenas pesadas humanas específicas del antígeno, mostraron unión a antígeno (por ejemplo, a un receptor de superficie celular) con diferentes afinidades a pH 7,4 y pH 5,75. Los anticuerpos con modificaciones de histidina que conservan la unión a pH 7,4, pero que muestran una unión baja o una unión no detectable a pH 5,75, son deseables. Son deseables anticuerpos con modificaciones con histidina que muestran t i /2 reducida a pH 5,75 en comparación con pH 7,4.

Los datos de unión a antígeno para tres anticuerpos que comprenden cadenas ligeras comunes modificadas con histidina y tres cadenas pesadas específicas del antígeno (marcadas como 2, 3 y 6) a diferentes pH se resumen en la FIG. 21. Estos anticuerpos mostraron una caída significativa en la unión a antígeno a pH 5,75 en comparación con el pH 7,4, como se demostró, por ejemplo, por la reducción en t1/2 o al no detectarse unión a pH 5,75.

Ejemplo 6. Diseño y Caracterización de Ratones Genéticamente Modificados que Comprenden una Cadena Ligera Universal de Vk1-39Jk5 Sustituida con Histidina

Ejemplo 6.1. Construcción del Vector de Direccionamiento para el Diseño de Restos de Histidina en una Región Variable de Cadena Ligera Humana Reordenada

Se produce un ratón genéticamente modificado que contiene un gen de cadena ligera humana reordenada que tiene restos de histidina diseñados genéticamente en una región CDR de la cadena ligera humana utilizando vectores de direccionamiento producidos mediante técnicas estándar de clonación molecular conocidas en la técnica.

En resumen, varios vectores de direccionamiento de la cadena ligera de la línea germinal humana se hacen usando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.

21 (6): 652-659) para modificar el ADN del Cromosoma Artificial Bacteriano (bAc ) genómico de ratón para que contenga una región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada única e insertada en un locus de cadena ligera k endógeno que se modificó previamente para eliminar la variable k endógena y segmentos genéticos de unión. La región de cadena ligera de la línea germinal humana reordenada se modifica en una o más posiciones de nucleótidos dentro de la secuencia de la cadena ligera para codificar los restos de histidina que normalmente no están presentes en las ubicaciones respectivas de la secuencia de la línea germinal. Los vectores de direccionamiento se someten a electroporación en células madre embrionarias (ES) de ratón para crear y confirmar mediante un ensayo de PCR cuantitativa (por ejemplo, TAQMAN ™).

Específicamente, se muestra una estrategia para construir estos vectores de direccionamiento en las Figs. 23A - 23F. Un plásmido utilizado para generar un vector de direccionamiento para un ratón de cadena ligera (universal) ("ratón UlC", descrito en, por ejemplo, el documento US2011/0195454A1), que contiene pBS FRT-Ub-Hyg-FRT líder de Vk3-7 de ratón+ Vk1-39Jk5 humano se modificó por mutagénesis dirigida al sitio (kit QuickChange II XL) para reemplazar Q105, Q106, Y108 y P111 o Q106, y 108 y P111 con restos de histidina en la región CDR3 usando cebadores de mutagénesis dirigida al sitio mostrados en la FIG. 22 (véase la FIG. 23A para esta etapa de diseño). Los vectores resultantes (H105/106/108/111 y H106/108/111) se modificaron adicionalmente y se unieron en un vector que comprende la región constante de IgK de ratón, potenciadores de ratón, un brazo de homología de ratón 3 ' y un casete SPEC (FIG. 23B). La modificación adicional implicó la unión en un vector que porta el brazo 5 ' de ratón y que comprende un casete Frt-Ub-NEO-Frt (FIG. 23B). Los vectores de direccionamiento resultantes se sometieron a electroporación en células ES que comprendían la eliminación del locus variable de IgK de ratón (que comprendía segmentos génicos K variables y de unión) (FIG. 23C-23F).

Los clones de células ES positivas se confirmaron utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al.) utilizando sondas específicas para la región de la cadena ligera de Vk1-39Jk5 diseñada genéticamente en el locus endógeno de la cadena ligera K. Los cebadores y las sondas utilizadas en el ensayo se muestran en la tabla 3 a continuación y se exponen en el Listado de Secuencias; las localizaciones de las sondas se muestran en las Figs.

23C-23F.

Tabla 3: Cebadores y Sondas Utilizados para la Exploración de Células ES

continuación

El ca se te d e sele cció n N EO introducido por la s co n stru ccio n es de direccionam iento s e eliminó m ediante la transfección d e c é lu la s E S con un plásm ido q ue e xp re sa F L P (F IG . 23 C y 23E ). O pcionalm ente, el ca se te de neom icina puede elim inarse cru zand o con ratones q u e e xp re sa n F L P reco m b in a sa (por ejem plo, el docum ento U S 6.774.279 ). O pcionalm ente, el ca se te de neom icina s e co n se rva en los ratones.

L a s c é lu la s E S dirigidas anteriorm ente d escrita s s e utilizaron com o cé lu las E S d onantes y s e introdujeron en un em brión de ratón en la fase de 8 cé lu las m ediante el método V E L O C IM O U S E ® (vé a se , por ejemplo, la patente d e los E E .U U . n.° 7.294.754 y Poueym irou et al. (2007 ) F 0 generation m ice that are essentially fully derived from the donor genetargeted E S ce lls allowing im m ediate phenotypic a n a ly s e s Nature Biotech. 25 (1):91-99. V E L O C IM IC E ® que lleva independientem ente un gen d e ca d e n a ligera hum ana d ise ñ a d o genéticam ente q ue contiene restos d e histidina m utados en una o m ás p o sicio n e s a lo largo de la s e c u e n c ia s e produjo a partir d e las c é lu la s E S dirigidas d escrita s anteriorm ente.

L a s c ría s s e genotiparon y las c r ía s heterocigotas para la ca d e n a ligera hum ana m odificada con histidina d ise ñ a d a genéticam ente s e sele ccio n aro n para ca racte rizar la e xpresió n d e la ca d e n a ligera y las ca p a cid a d e s de unión de los anticuerpo s e xp re sa d o s. Los ce b a d o re s y las so n d a s para la genotipificación d e ratones q ue com prenden esp e cífica m e n te un gen d e ca d e n a ligera universal con tres (H 106 /108 /111 ; "1930 ") o cuatro (H 105 /105 /108 /111 ; "1927 ") m odificaciones con histidina s e listan en la tabla 4 a continuación y s e exponen en el listado de se cu e n cia s. Los ratones q u e contienen m odificación con histidina en s u s c a d e n a s ligeras u n ive rsale s s e denom inan en el presente docum ento ratones "H U LC " (ratones d e ca d e n a ligera u n ive rsa le s de histidina).

Tabla 4: Cebadores Sondas Utilizados ara la Genoti ificación

Ejemplo 6.2. Análisis de la respuesta inmunitaria al antígeno en ratones con cadenas ligeras universales sustituidas con histidina

El receptor de la superficie ce lu lar ("A ntígeno A") s e usó com o inm unógeno para inm unizar ratones q u e eran heterocigotos para la e xpresió n de una ca d e n a ligera kappa hum ana preestab lecid a utilizando V k 1-39 y J k5 que tiene 4 su stitu cio nes de histidina en C D R 3 (en adelante en el presente docum ento "H U L C 1927") o heterocigotos para la e xpresió n de una ca d e n a ligera kappa hum ana p reestab lecid a utilizando V k 1-39 y J k5 q ue tiene 3 su stitu cio n e s de histidina en C D R 3 (en adelante en el presente docum ento "H U L C 1930 "), o ratones de T S hom ocigotos. El su e ro preinm une s e recogió de los ratones antes del inicio de la inm unización. El inm unógeno s e adm inistró a 2 ,35 |jg de proteína para la inm unización de ce b a d o inicial m ezclad a con 10 j g de oligonucleótido C p G com o adyuvante (In vivogen ) en un volum en d e 25 j l a tra vé s d e la alm ohadilla plantar (f.p.). Posteriorm ente, los ratones fueron reforzados por la m ism a v ía con 2 ,35 j g de A ntígeno A junto con 10 j g de C p G y 25 j g de A d ju -P h o s (B renntag) com o ad yu vantes en los d ía s 3, 6, 11, 13, 17, 20 para un total d e 6 refuerzos. Los ratones s e sang raro n los d ía s 15 y 22 d e sp u é s del 4° y 6° refuerzo, respectivam ente. Su antisuero s e an alizó para determ inar los títulos de anticuerpos frente al antígeno A.

Los títulos sé ric o s d e anticuerpo s contra el inm unógeno s e determ inaron m ediante un E L IS A convencional. P a ra realizar el E L IS A , s e recubrieron p la ca s d e m icrotitulación de 96 pocillos (Therm o Scientific) a 2 jg /m l con A ntígeno A en solució n sa lin a tam ponada con fosfato (P B S , Irvine Scientific) durante la noche a 4 °C. Al d ía siguiente, las p la ca s s e lavaron con solució n sa lin a tam ponada con fosfato q u e con tenía T w een 20 al 0 ,05% (P B S -T , S igm a-A ldrich) cuatro veces usando un lavador de placas (Molecular Devices). Las placas se bloquearon después con 250 |jl de albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA, Sigma-Aldrich) en PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después cuatro veces con PBS-T. Los sueros de ratones inmunizados y los sueros preinmunitarios se diluyeron en serie tres veces en BSA-PBS al 0,5% comenzando a 1:300 o 1:1000, se agregaron a las placas bloqueadas por duplicado y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los dos últimos pocillos se dejaron en blanco para utilizarlos como control de anticuerpos secundarios (control de fondo). Las placas se lavaron de nuevo cuatro veces con PBS-T en un lavador de placas. El anticuerpo secundario conjugado anti IgG de ratón de cabra-Fc de Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) (Jackson Immunoresearch) se añadió después a las placas a una dilución 1:5000/1:10.000 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después ocho veces con PBS-T y se desarrollaron utilizando TMB/H2O2 como sustrato. El sustrato se incubó durante 20 minutos y la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2 N (H2SO4, VWR, n.° de cat. BDH3500-1) o ácido fosfórico 1 N (JT Baker, n.° de cat. 7664-38-2). Las placas se leyeron en un espectrofotómetro (Victor, Perkin Elmer) a 450 nm. Los títulos de anticuerpos se estimaron utilizando el software Graphpad PRISM.

La respuesta inmunitaria inducida en ratones al inmunógeno inyectado se representa como títulos de anticuerpos, que se define como el recíproco de la dilución más alta del suero a la que la absorbancia de unión a antígeno es dos veces mayor que en el fondo. Por lo tanto, cuanto mayor sea el número, mayor será la respuesta inmunitaria humoral al inmunógeno. Los títulos de anticuerpos inducidos al inmunógeno fueron muy altos en ambas cepas de ratones HULC y en ratones de TS, sin que se observaran diferencias significativas entre las cepas (FIG. 24).

Ejemplo 6.3. Generación de Anticuerpos Monoclonales Sensibles al pH

Cuando se logró una respuesta inmunitaria al inmunógeno deseada en ambas cepas de ratones HULC y en ratones de TS, se recolectaron esplenocitos de cada cepa de ratón y se fusionaron con células de mieloma de ratón para generar células de hibridoma, que se dejaron crecer en placas de 96 pocillos. Después de 10 días de crecimiento, los sobrenadantes de cada pocillo que contenía células de hibridoma se seleccionaron mediante ELISA específico de inmunógeno para identificar muestras de unión a antígeno positivas. Para el ELISA, las placas de microtitulación de 96 pocillos se recubrieron con 1 ug/ml de un anticuerpo policlonal anti myc (Novus Biologicals, número NB600-34) durante la noche a 4 °C para inmovilizar el antígeno marcado con myc, seguido de un bloqueo con una solución de BSA al 0,5% (p/v) en PBS. Se lavaron las placas, las soluciones de antígeno se agregaron a las placas a una concentración de 1 jg/m l y se dejaron unir a la placa recubierta durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron sobrenadantes de células de hibridoma a los pocillos a una dilución de 1:50 y se dejaron unir durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos a la placa se detectaron utilizando un anticuerpo policlonal anti IgG de ratón conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch, número 115-035-164). Se agregaron sustratos TMB a las placas (BD Biosciences, número 51-2606KC/51-2607KC) y se desarrollaron señales colorimétricas de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. La absorbancia se registró a 450 nm en un lector de placas Victor Wallac. Las muestras de antígeno positivo definidas como que tienen una DO igual o mayor que 0,5 (con un valor inicial que tiene una DOde aproximadamente 0,1) se sometieron a un análisis de afinidad utilizando un biosensor de resonancia de plasmón de superficie en tiempo real (Biacore 4000).

Se registraron los parámetros cinéticos de unión (por ejemplo, k^a, k^d, K^d, t1^ , etc.) para determinar la unión del anticuerpo al inmunógeno a pH neutro (pH 7,4) y a pH ácido (pH 6,0). Un chip sensor Biacore CM4 se derivatizó con un anticuerpo policlonal de cabra anti Fc de ratón para capturar anticuerpos del sobrenadante. Después se inyectó una concentración única (100 nM) de inmunógeno sobre la superficie capturada por el anticuerpo a un caudal de 30 jl/min. La asociación anticuerpo-antígeno se controló durante 1,5 minutos y después la disociación del antígeno del anticuerpo capturado se controló durante 2,5 minutos. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 con un modelo de transporte masivo utilizando el software de evaluación Biacore 4000 versión 1.0. Las constantes de disociación (Kd) y las semividas de disociación (t1^ ) en equilibrio se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: K^d (M) = k^d / k^a ; y t 1^ (min) = ln2/(60*kd). Se seleccionó un conjunto de muestras que presentaban una disminución de la unión a pH 6,0 en comparación con la del pH 7,4 (sensible al pH), así como un conjunto de muestras de control que no presentaban cambios significativos en la tasa entre el pH 7,4 y el pH 6,0 (controles insensibles al pH) para producirse clonalmente. La FIG. 25 representa la comparación del número de antígeno positivos totales y el número de antígeno positivos que presentan unión a antígeno sensible al pH de ratones HULC y de TS.

Entre los antígeno positivos, se hicieron monoclonales 18 y 7 clones aislados de dos ratones HULC1927 heterocigotos y dos HULC1930 respectivamente, y 1 clon del ratón de TS. Los sobrenadantes de los hibridomas monoclonales se sometieron a un análisis de tasa de disociación (constante de disociación)del antígeno a pH neutro y bajo y los sedimentos celulares se usaron para la secuenciación del ADN del dominio variable de cadena ligera.

Ejemplo 6.4. Secuenciación e Hipermutaciones Somáticas en la Región CDR3 de Ratones de Cadena Ligera Universal de Histidina Basados en VK1-39jK5

Los sedimentos celulares de hibridomas monoclonales de ratones HULC y de TS se usaron para la secuenciación del ADN del dominio variable de cadena ligera. De los 26 clones hechos monoclonales (véase el Ejemplo 3.3 más arriba) y sometidos a secuenciación, se confirmó que 15 usaban una cadena ligera de ratón HULC o de TS (MM y NN, véase la T ab la 4). 14 clo ne s derivaron de ratones H U L C heterocigotos (ratones 1927 o 1930 ) y 1 derivó de un ratón de T S.

D e las 14 m uestras positivas para el antígeno d erivad as de ratones H U L C heterocigotos, 12 de los anticuerpos m ono clon ales utilizaron su correspondiente ca d e n a ligera H U LC , m ientras que 2 utilizaron una ca d e n a ligera de ratón de T S. T o d o s m enos uno de los H U L C que utilizan anticuerpos co n servaron todas las m utaciones de histidina introducidas com o se m uestra en la T ab la 3 (anticuerpo en cursiva). La se cu e n cia ció n del clon A A produjo 2 se c u e n c ia s H U L C diferentes, que se reflejan en d os entrad as en la tabla 5.

Tabla 5: Número de inserciones de histidina conservadas e hipermutaciones somáticas en secuencias de

Ejemplo 6.5. Unión dependiente de pH de anticuerpos monoclonales generados en ratones con cadena ligera universal de histidina basada en Vk1-39Jk5

C o n el fin de e v a lu a r adicionalm ente las ca racte rísticas de unión d epend ientes del pH de los anticuerpos m onoclonales a is la d o s de ratones H U L C y de T S, se llevaron a cabo experim entos de unión en los que la fase de aso ciació n anticuerpo/antígeno se ob servó a pH neutro y la fa se de d isociación anticuerpo/antígeno se ob servó a pH neutro o ácido.

Un chip se n so r B iacore C M 4 se derivatizó con un anticuerpo policlonal de conejo anti F c de ratón. Los so b re n a d a n tes de anticuerpos m ono clon ales se capturaron sob re la superficie del se n so r anti F c de ratón. S e inyectaron dos concentraciones, 50 nM (por duplicad o) y 16 ,7 nM, del inm unógeno sob re la superficie capturada con el anticuerpo m onoclonal a un caud al de 30 pl/min. La aso ciació n de anticuerpo-antígeno se controló a pH 7,4 durante 4 m inutos y d e sp u é s la d isociación del antígeno del anticuerpo m onoclonal capturado se m onitorizó durante 15 m inutos a pH 7,4 o 6,0. L a s con stan tes de ve locid ad de d isociación (kd) se determ inaron p rocesand o y ajustan do los datos utilizando el softw are de ajuste de cu rva s S cru b b e r ve rsió n 2.0 y se m uestran en la tabla 6. L a s sem ivid as de d isociación (t^m) se calcularon a partir de la constante de velocid ad de disociación: t i/2 (m in) = (ln2/kd)/60 y se m uestran en la tabla 6. Los se n so g ra m a s que representan las ca racte rísticas de aso ciació n /d iso ciac ió n de vario s anticuerpos enu m e rad o s en la tabla 4 en las diferentes con d icion es de pH se m uestran gráficam ente en la F IG . 26. L a s lín ea s ind ivid uales en ca d a gráfico representan las re sp u e sta s de unión a diferentes con ce n tracio n e s de los respectivos anticuerpos. T od os los experim entos se llevaron a cabo a 25 °C. Los va lo re s de sem ivid a disociativa (t1^ ) se indican sob re los respectivos sen so g ra m as. La resp u esta se mide en UR.

Ejemplo 7. Diseño de un Ratón Modificado Genéticamente que Comprende una Cadena Ligera Universal de Vk3-20Jk1 Sustituida con Histidina

S e generó un ratón que com prende una ca d e n a ligera V k3 -20 J k 1 com ún com o se d escrib e en, por ejem plo, las So licitud es de Patente de los E sta d o s Unidos n.° 13/022.759 , 13 /093.156 , 13 /412.936 y 13/488.628 (P ub licación Nos.

2011 /0195454 , 2012 /0021409 , 2012 /0192300 y 2013/0045492 , respectivam ente) y en el ejem plo 1 anterior. La se cu e n cia de am ino ácid os del dom inio variab le de la ca d e n a ligera V k3 -20 J k 1 de la línea germ inal se m uestra en la S E Q ID NO: 383.

S e introdujeron sustitucio nes de histidina en el vecto r de direccionam iento de la ca d e n a ligera universal V k3 -20 J k 1 y se generaron ratones a partir del m ism o utilizando una estrategia sim ilar a la descrita anteriorm ente en el Ejem plo 3 para ratones de ca d e n a ligera universal m odificada con histidina V k 1 -39 J k5 (H U L C 1927 y 1930).

En resum en, la estrategia para g e n e rar un vecto r de direccionam iento de ca d e n a ligera universal V k3 -20 J k 1 m odificada con histidina se resum e en las F IG S . 29A -129D . Un plásm ido utilizado para ge ne rar un vecto r de direccionam iento para un ratón de ca d e n a ligera (u n ive rsal) ("ratón ULC", descrito en, por ejem plo, el docum ento U S 2011 /0195454 A 1 ), que contiene pB S F R T -U b -H y g -F R T líder de V k3 -7 de ratón+ V k3 -20 J k 1 hum ano fue m odificado por m utagénesis dirigida al sitio (Kit Q u ick C h an g e Lightning) para reem plazar Q 105, Q 106, Y 107 y S 109 o Q 105, Q 106 y S 109 (v é a se alineación en la FIG . 27 ) con restos de histidina en la región C D R 3 u sand o los ce b a d o re s de m utagénesis dirigida al sitio m ostrados en la FIG . 28 (vé a se la FIG . 29A para esta etapa de diseño). Los vecto res resultantes (H 105 /106 /107 /109 y H 105 /106 /109 ) se m odificaron adicionalm ente y se unieron en un vector que com prendía la región constante de IgK de ratón, potenciadores de ratón, un brazo de hom ología de ratón 3 ' y un ca se te S P E C (F IG . 29B). La m odificación adicional implicó la unión en un vecto r que porta el brazo 5' de ratón y que com prende un case te Frt-U B -N EO -Frt (figura 29B). Los ve cto re s de direccionam iento resultantes se som etieron a electroporación en cé lu las E S que com prendían la elim inación del locus variab le de IgK de ratón (que com prendía segm en to s g é n ico s k v a ria b le s y de unión) (F IG . 29 C -29 D ).

Los clo n e s de cé lu las E S positivas se confirm aron utilizando una m odificación del e n sayo de alelo s (V alen zu e la et al.) utilizando so n d a s e sp e cífica s para la región de la ca d e n a ligera de V k3 -20 kJ 1 d iseñ a d a genéticam ente en el locus endógeno de la ca d e n a ligera k. Los ce b a d o re s y las so n d a s utilizadas en el e n sayo se m uestran en la tabla 7 a continuación y se exponen en el Listado de S e cu e n cia s; las lo caliza cio n es de las so n d a s se m uestran en las Figs.

29 C -29 D .

T l 7: r ^ n iliz r l Ex l r i n l l E

continuación

El casete de selección NEO introducido por las construcciones de direccionamiento se elimina mediante la transfección de células ES con un plásmido que expresa FLP (Figs. 29C y 29D). Opcionalmente, el casete de neomicina puede eliminarse cruzando con ratones que expresan FLP recombinasa (por ejemplo, el documento US 6.774.279). Opcionalmente, el casete de neomicina se conserva en los ratones.

Las células ES dirigidas anteriormente descritas se utilizan como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 7.294.754 y Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor genetargeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE®, que lleva independientemente un gen de cadena ligera humana diseñado genéticamente que contiene restos de histidina mutados en una o más posiciones a lo largo de la secuencia, se realiza a partir de las células ES dirigidas descritas anteriormente.

Los cachorros son genotipados y los cachorros heterocigotos para la cadena ligera humana modificada con histidina diseñada genéticamente se seleccionan para caracterizar la expresión de la cadena ligera y las capacidades de unión de los anticuerpos expresados. Los cebadores y las sondas para la genotipificación de ratones que comprenden específicamente un gen de cadena ligera universal con tres (H105/106/109; "6183") o cuatro (H105/105/108/111; "6181") modificaciones de histidina se enumeran en la Tabla 6 a continuación y se establecen en el Listado de secuencias. Los ratones que contienen modificación con histidina en sus cadenas ligeras universales se denominan en el presente documento ratones "HULC" (ratones de cadena ligera universales de histidina).

T l : r n iliz r l n i ifi i n

Los ratones se inmunizan con un antígeno de interés y se analiza su capacidad para generar anticuerpos con uniones dependientes del pH.

Ejemplo 8. Cría de ratones que comprenden una cadena ligera universal humana reorganizada individual sustituida con histidina (HULC)

Este ejemplo describe varias otras cepas de ratones modificadas genéticamente que pueden reproducirse con cualquiera de los ratones HULC descritos en el presente documento para crear múltiples cepas de ratones modificados genéticamente que albergan múltiples loci de inmunoglobulinas modificados genéticamente.

Supresión génica (KO) de IgA endógena. Para optimizar el uso del locus de cadena ligera diseñada genéticamente, cualquiera de los animales HULC descritos anteriormente (por ejemplo, que comprenden cadena ligera universal sustituida con histidina Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1) puede reproducirse con otro ratón que contenga una deleción en el locus de cadena ligera A endógeno. De esta manera, la progenie obtenida expresará, como su única cadena ligera, la región de cadena ligera de la línea germinal humana sustituida con histidina reordenada como se describe en los

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un roedor genéticam ente m odificado que com prende en su línea germ inal un locus de inm unoglobulina que com prende una se cu e n cia de región variab le de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a unida operativam ente a una s e cu e n cia de región constante de inm unoglobulina, en donde la s e cu e n cia de región variab le de inm unoglobulina hum ana no reo rganizad a com prende una sustitución de al m enos un codón distinto de histidina con un codón de histidina o una inserción de al m enos un codón de histidina, en una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ), en donde el codón de histidina no está codificado por un segm ento génico de lín ea germ inal de tipo silvestre hum ano correspondiente.

2. El roedor de la reivindicación 1, en donde:

(I) el roedor com prende un prim er y un segu nd o locus variab le de inm unoglobulina, en donde al m enos el prim er o el segu nd o locus v ariab le de inm unoglobulina com prende una s e cu e n cia g é nica de región variab le de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a que com prende la inserción del al m enos un codón de histidina o la sustitución del al m enos un codón distinto de histidina con el al m enos un codón de histidina; o

(II) la inserción de un codón de histidina e s en una C D R se le ccio n a d a entre una C D R 1 de una ca d e n a pesada, una C D R 2 de una ca d e n a pesada, una C D R 3 de una ca d e n a pesada, una C D R 1 de una ca d e n a ligera, una C D R 2 de una ca d e n a ligera, una C D R 3 de una ca d e n a ligera y una com binación de las m ism as; o

(III) la s e cu e n cia g é nica de región v ariab le de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a en el locus variab le de inm unoglobulina com prende una agrupació n de 2, 3, 4 o 5 histidinas que son sustitucio nes de un distinto de histidina por un codón de histidina y/o in se rc io n e s de co d o n es de histidina.

3. El roedor de la reivindicación 2(I), en donde los locus va ria b le s de inm unoglobulina tanto primero com o segu nd o com prenden ca d a uno una

s e cu e n cia génica de región variab le de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a que com prende la sustitución del al m enos un codón distinto de histidina con el al m enos un codón de histidina o la inserción del al m enos un codón de histidina.

4. El roedor de la reivindicación 3, en donde:

(I) el prim er locus variab le de inm unoglobulina es un locus variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a (segm en to s V, D, J no reo rgan izad os); o

(II) el segu nd o locus variab le de inm unoglobulina es un locus de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ano no reorganizado (segm en to s V, J no reorganizados).

5. El roedor de la reivindicación 4 (I), en donde:

(a) el locus variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ano no reorganizado com prende segm ento s V, D y J hum ano s no reorganizados;

(b) el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a com prende segm ento s V hum anos reorganizados, un segm ento D sintético que com prende un e n lazad o r y un segm ento J, opcionalm ente en donde el segm ento D sintético com prende al m enos un codón de histidina;

(c) el segu nd o locus variab le de inm unoglobulina com prende una s e cu e n cia g é nica de ca d e n a ligera de inm unoglobulina reo rgan izad a (se cu e n cia V J reorganizada); o

(d) el locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a com prende segm ento s g é n ico s D hum anos que están invertidos con respecto a la dirección de orientación del locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina.

6. El roedor de la reivindicación 2(I), en donde al m enos uno del prim er locus variab le de inm unoglobulina o el segund o locus variab le de inm unoglobulina está unido operativam ente a una s e cu e n cia de ácido nucleico de región constante de roedor e nd ógena en un locus de inm unoglobulina de roedor endógeno.

7. El roedor de la reivindicación 5(a), en donde los segm ento s V, D, J hum anos no reo rgan izad os están unidos operativam ente a una s e cu e n cia de ácido nucleico de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina no hum ana endógena, opcionalm ente unida operativam ente a la s e cu e n cia de ácido nucleico de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina de roedor end ógena en un locus de inm unoglobulina de roedor endógeno.

8. Un roedor genéticam ente modificado, que com prende

una se cu e n cia de región v ariab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a que com prende segm en to s V h, D y J h, en donde la s e cu e n cia de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a está unida operativam ente a una s e cu e n cia génica de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina, en donde uno o m ás de los segm ento s g é n ico s de V h, D y J h hum anos com prenden al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina y/o al m enos una inserción de codón de histidina, en una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ), en donde el codón de histidina sustituido o insertado no está codificado por un segm ento génico de lín ea germ inal hum ana de tipo silvestre correspondiente; y

una s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a que com prende segm ento s V l y J hum anos, en donde la s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a está unida operativam ente a una s e cu e n cia g énica de región constante de ca d e n a ligera de inm unoglobulina, en donde uno o m ás de los segm ento s g énicos de VL y JL com prenden al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina y/o al m enos una inserción de codón de histidina, en una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ), en donde el codón de histidina sustituido o insertado de la s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a no está codificada por un segm ento génico de lín ea germ inal hum ana de tipo silvestre correspondiente.

9. El roedor genéticam ente m odificado de la reivindicación 8, en donde:

(I) la s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina no reo rgan izad a está unida operativam ente a una s e cu e n cia de ácido nucleico de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina de roedor, opcionalm ente en donde la s e cu e n cia de ácido nucleico de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina de roedor unida operativam ente a la s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a se encuentra en un locus de inm unoglobulina de roedor end ógeno en la línea germ inal del roedor; y/o

(II) en donde la s e cu e n cia de ácido nucleico de región constante de ca d e n a ligera de inm unoglobulina unida operativam ente a la s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina no reo rgan izad a se encuentra en un locus de inm unoglobulina de roedor endógeno en la línea germ inal del roedor.

10. El roedor genéticam ente m odificado de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde la s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina no reo rganizad a com prende no m ás de dos segm en to s gé nico s de VL hum ano, en donde ca d a uno de los no m ás de dos segm en to s gé nico s VL hum anos com prende una sustitución de al m enos un resto distinto de histidina por un resto de histidina.

11. Un roedor genéticam ente modificado, que com prende

una se cu e n cia de región v ariab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a que com prende segm ento s V h, D y J h no reorganizados, en donde la s e cu e n cia de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a está unida operativam ente a una s e cu e n cia g é nica de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina, en donde uno o m ás de los segm en to s g é n ico s de V h, D y J h hum anos no reo rgan izad os com prenden al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al m enos una inserción de codón de histidina, en una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ), en donde el codón de histidina no está codificado por un segm ento génico de línea germ inal de tipo silvestre hum ano correspondiente; y

una s e cu e n cia de ácido nucleico de V J de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rganizad a individual que com prende s e c u e n c ia s de segm en to s g é n ico s V l y J l hum anos, en donde la se cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rgan izad a individual está unida operativam ente a una s e cu e n cia g énica de región constante de ca d e n a ligera de inm unoglobulina, en donde la s e cu e n cia de V J reo rganizad a com prende al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina con un codón de histidina o al m enos una inserción de codón de histidina, en una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ), en donde el codón de histidina de la se cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana reo rgan izad a no está codificado por un segm ento génico de línea germ inal hum ano de tipo silvestre correspondiente.

12. El roedor genéticam ente m odificado de la reivindicación 11, en donde:

(I) la s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina no reo rgan izad a está unida operativam ente a una s e cu e n cia de ácido nucleico de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina de roedor, opcionalm ente en donde la s e cu e n cia de ácido nucleico de región constante de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina de roedor unida operativam ente a la s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a se encuentra en un locus de inm unoglobulina de roedor end ógeno en la línea germ inal del roedor y/o

(II) en donde la se cu e n cia de región constante de ca d e n a ligera de inm unoglobulina unida operativam ente a la se cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina reo rgan izad a se encuentra en un locus de inm unoglobulina de roedor endógeno en la lín ea germ inal del roedor.

13. Un roedor genéticam ente modificado, en donde el anim al com prende en su línea germ inal

al m enos una inserción de un codón de histidina o al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina en una s e cu e n cia génica de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina no reo rganizad a unida operativam ente a un gen de región constante de ca d e n a p e sa d a en un locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina, en donde el codón de histidina del locus de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina e s una se cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ) y no está codificado por un segm ento génico de lín ea germ inal de tipo silvestre correspondiente; y

al m enos una inserción de un codón de histidina o al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina en una se c u e n c ia g énica de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina no reo rganizad a unida operativam ente a un gen de región constante de ca d e n a ligera en un locus de ca d e n a ligera de inm unoglobulina, en donde el codón de histidina del locus de ca d e n a ligera de inm unoglobulina e s una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ) y no está codificado por un segm ento génico de lín ea germ inal de tipo silvestre correspondiente.

14. Un método para producir un roedor que produce dom inios va ria b le s de anticuerpo con histidinas cod ificadas por co d o n es de histidina d ise ñ a d o s por ingeniería genética, que com prende:

m odificar al roedor en su línea germ inal para que com prenda al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al m enos una inserción de un codón de histidina en una se c u e n c ia g é nica de región v ariab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a que com prende segm ento s g énicos V h, D y J h hum ano s no reorganizados, en donde el codón de histidina se encuentra en una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ) y no está codificado por un segm ento génico de lín ea germ inal de tipo silvestre hum ano correspondiente; y/o

m odificar al roedor en su línea germ inal para que com prenda al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al m enos una inserción de un codón de histidina, en una s e cu e n cia génica de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana no reo rgan izad a que com prende segm ento s génicos V l y J l hum anos no reorganizados, en donde el codón de histidina se encuentra en una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ) y no está codificado por un segm ento génico de línea germ inal de tipo silvestre hum ano correspondiente.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el m étodo com prende:

(I) m odificar genéticam ente la lín ea germ inal del roedor para que com prenda una s e cu e n cia variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina no reo rgan izad a hum ana que com prende segm en to s V h, D y J h hum anos y producir la sustitución o inserción de histidina en los segm en to s V h, D y J h hum ano s no reorganizados; y/o

(II) m odificar genéticam ente la lín ea germ inal del roedor para que com prenda una se c u e n c ia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina no reo rgan izad a hum ana que com prende segm ento s génicos V l y J l hum anos y efectuar la sustitución o inserción de histidina en la s e cu e n cia de ácido nucleico de región variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina hum ana no reorganizada.

16. Un método para producir un roedor que produce dom inios va ria b le s de anticuerpo con histidinas cod ificadas por cod o n es de histidina d ise ñ a d o s por ingeniería genética, que com prende:

m odificar al roedor para que com prenda al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al m enos una inserción de un codón de histidina en una s e cu e n cia g énica de región variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina no reo rgan izad a de un locus variab le de ca d e n a p e sa d a de inm unoglobulina no reorganizado que com prende segm en to s V h, D y J h no reorganizados,

en donde el codón de histidina se encuentra en una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ) y no está codificado por un segm ento génico de línea germ inal de tipo silvestre correspondiente; y

m odificar al roedor para que com prenda al m enos una sustitución de un codón distinto de histidina por un codón de histidina o al m enos una inserción de un codón de histidina en una s e cu e n cia variab le de ca d e n a ligera de inm unoglobulina reo rgan izad a individual que com prende s e c u e n c ia s de segm ento s V l and J l reo rg an izad as en la línea germ inal, en donde el codón de histidina se encuentra en una s e cu e n cia de ácido nucleico que codifica una región determ inante de la com plem entariedad (C D R ) y no está codificado por un segm ento génico de línea germ inal de tipo silvestre correspondiente.

17. El roedor de una cu alq u ie ra de las re ivin dicacio nes 1 a 13 o producido m ediante el método de una cu alq u ie ra de las re iv in dicacio nes 14 a 16, en donde el roedor se se le ccio n a entre un ratón, una rata y un hámster.

18. Un método para g e n e rar un anticuerpo que presenta unión dependiente de pH a un antígeno de interés que com prende inm unizar a un roedor de acuerdo con una cu alq u ie ra de las re iv in dicacio nes 1 -13 o producido m ediante el método de una cu alq u ie ra de las re ivin dicacio nes 14 a 16 con un antígeno de interés y se le cc io n a r un anticuerpo que se una al antígeno de interés a un pH neutro m ientras m uestra una unión reducida al antígeno a un pH ácido.