ES2713505T3 - Anticuerpos anti-TGF-beta modificados genéticamente y fragmentos de unión a antígeno - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a y neutraliza TGFβ1, TGFβ1 y TGFβ3 humanos, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con una sustitución seleccionada del grupo que consiste en S30A, S30H, S30W, E74A, E74C, E74D, E74F, E74G, E74H, 5 E74L, E74P, E74Q, E74R, E74S, E74T, E74W, y E74Y; y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Description
DESCRIPCION
Anticuerpos anti-TGF-p modificados geneticamente y fragmentos de union a antfgeno
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que ha sido presentado por via electronica en formato ASCII y se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 7 de marzo de 2014, se denomina 209262-0001-00-W0-(509735)_SL.txt, y tiene un tamano de 10.335 bytes.
Campo tecnico
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos estan modificados geneticamente para unirse al Factor p de Crecimiento Transformante (TGF-P). Se proporcionan composiciones que comprenden los anticuerpos o fragmentos de los mismos, y metodos de uso de los mismos para el tratamiento de enfermedades que implican la actividad de TGF-p.
Antecedentes
Muchas enfermedades graves estan relacionadas con el mal funcionamiento de la ruta de senalizacion inducida por TGF-p. Se cree que un aumento del nivel en los tejidos de TGF-p es un factor en el desarrollo de la fibrosis pulmonar idiopatica y de la fibrosis miocardica, por ejemplo. Ademas, los elevados niveles tisulares locales de TGF-p pueden permitir el mantenimiento y la progresion de algunos tipos de celulas cancerosas. La disminucion de la senalizacion de TGF-p, por lo tanto, puede reducir la viabilidad de dichas celulas tumorales.
Las isoformas de TGF-p son moleculas de ~25 kDa homodimericas con un marco estructural similar, en el que dos monomeros estan enlazados covalentemente a traves de un puente de disulfuro. Las isoformas de mamfferos comparten una identidad de secuencia de 70-82%, pero tienen actividades no solapantes en el desarrollo vascular y la regulacion de la funcion de las celulas inmunitarias. Tres isoformas de TGFp estan presentes en los seres humanos: TGFp1, TGFp2 y TGFp3 (numeros de acceso Swiss Prot P01137, P08112, y P10600, respectivamente). TGFp1 y TGFp3 desencadenan una cascada de senalizacion celular tras la union a los dominios extracelulares de dos receptores transmembranicos, conocidos como receptores de TGFp tipos I y II. Se cree tambien que la union de TGFp2 implica los receptores de TGFp tipos I y II, asf como el receptor de TGFp tipo III.
Se han generado moleculas de anticuerpo que pueden unirse a TGFp1, TGFp2, y TGFp3 (por ejemplo, patente U.S. n° 7.723.486 de Genzyme). Grutter et al. (2008) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 105(51): 20251-56, por ejemplo, describen GC1008, un anticuerpo monoclonal (MAb) IgG4 humano en desarrollo clfnico para el tratamiento de neoplasias y enfermedades fibroticas. GC1008 es un anticuerpo neutralizante de TGFp “pan-especffico”, ya que puede neutralizar las tres isoformas de TGFp humanas. GC1008 se une a TGFp1, TGFp2, y TGFp3 humanos con afinidades similares. El epftopo de TGFp reconocido por GC1008 se solapa en el sitio de union de TGFp para los receptores de TGFp tipos I y II, lo que se cree que subyace a la capacidad neutralizante de GC1008. Grutter et al. describen la estructura tridimensional de un fragmento Fab de GC1008 en un complejo con TGFp3 a una resolucion de 3,1A. El complejo consiste en un homodfmero de TGFp3 flanqueado por dos fragmentos Fab de GC1008. Vease tambien la entrada 3eo0 de Proteopedia, “Structure of the Transforming Growth Factor-Beta Neutralizing Antibody GC-1008”, en Internet en proteopedia.org/wiki/index.php/3eo0 (modificada por ultima vez el 20 de octubre de 2012); y la entrada 3eo1 de Proteopedia, “Structure of the Fab Fragment of GC-1008 in Complex with Transforming Growth Factor-Beta 3”, en Internet en proteopedia.org/wiki/index.php/3eo1 (modificada por ultima vez el 20 de octubre de 2012). En el documento W02006/086469 se describen otros anticuerpos humanos que se unen a TGFp1, TGFp2 y TGFp3.
Sumario
Se describen anticuerpos de union a TGFp o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. Los anticuerpos de union a TGFp o fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden ser pan-especfficos para todas las isoformas de TGFp (TGFp1, TGFp2 y TGFp3). Tales anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden neutralizar todas las isoformas de TGFp. Alternativamente, o ademas, los anticuerpos de union a TGFp o fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden unirse selectivamente a TGFp1 humano, en comparacion con TGFp2 humano y TGFp3 humano, o unirse selectivamente a TGFp3 humano, en comparacion con TGFp1 humano y TGFp2 humano. Los antagonistas especfficos de las isoformas de TGFp pueden presentar menores efectos secundarios potenciales. El diseno de anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos se ve facilitado por una estructura co-cristalina de un fragmento Fab recombinante del anticuerpo monoclonal GC1008, GC1008(Fab) en la presente memoria, unido a TGFp2, y por otra estructura co-cristalina de la version scFv de GC1008, conocida como GC1009 o GC1009(scFv) en la presente memoria, unido a TGFp1.
Un anticuerpo aislado o fragmento de union a antfgeno del mismo puede comprender una variante de un dominio de la cadena pesada variable (VH) de PET1073G12 (SEQ ID NO: 1) que tiene un paratopo de TGFp y restos no paratopicos,
y un dominio de la cadena ligera variable (VL) de PET1073G12 (SEQ ID NO: 2) que tiene un paratopo de TGFpi y restos no paratopicos,
en el que el dominio VH comprende hasta 20 sustituciones de restos paratopicos y hasta 20 sustituciones de restos no paratopicos;
en el que el dominio VL comprende hasta 20 sustituciones de restos paratopicos y hasta 20 sustituciones de restos no paratopicos; y
en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo es capaz de unirse a TGFp humano (TGFp1, TGFP2 y TGFP3).
El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede ser capaz de unirse a las tres isoformas de TGFp humano, incluyendo TGFp1 humano, TGFp2 humano, y TGFp3 humano. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se puede unir a las tres isoformas de TGFp humano con una afinidad de dos veces, 2,4 veces, tres veces, cinco veces, diez veces, o mas, que GC1008 (Fab) o GC1009(scFv). El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo pueden comprender una sustitucion del resto Y27, S30, S31, N32, I52, I54, V55, D56, N59, E74 y/o G101. Y27 puede ser sustituido por Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val o Trp. S30 puede ser sustituido por Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Tyr o Trp. S31 puede ser sustituido por Ala, Glu, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Thr, Val o Trp. N32 puede ser sustituido por Ala, Asp, Glu, Gly, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr. 152 puede ser sustituido por Val. 154 puede ser sustituido por Ala, Phe, His, Leu, Met, Pro, Thr, Val o Trp. v 55 puede ser sustituido por Phe o Gly. D56 puede ser sustituido por Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Tyr o Val. N59 puede ser sustituido por Arg o Tyr. E74 puede ser sustituido por Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp, o Tyr. G101 puede ser sustituido por Tyr. El dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender hasta 19 sustituciones de restos paratopicos. Preferiblemente, el dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender hasta sustituciones de restos paratopicos. Una sustitucion en el paratopo se puede seleccionar de las sustituciones indicadas en la TABLA 5. El dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender hasta 18 sustituciones de restos no paratopicos. Preferiblemente, el dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender hasta 12 sustituciones de restos no paratopicos.
Como alternativa, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede ser capaz de unirse selectivamente a TGFp1 humano, en comparacion con TGFp2 humano y TGFp3 humano. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede unirse selectivamente a TGFp1 con una afinidad de dos veces, 2,4 veces, tres veces, cinco veces, diez veces, o mas, que GC1008(Fab) o GC1009(scFv). El dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender hasta 20 sustituciones de restos paratopicos, preferiblemente hasta 19 sustituciones de restos paratopicos, y mas preferiblemente hasta 12 sustituciones de restos paratopicos. Una sustitucion en el paratopo se puede seleccionar de las sustituciones indicadas en la TABLA 5. El dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender hasta 20 sustituciones de restos no paratopicos, preferiblemente hasta 18 sustituciones de restos no paratopicos, y mas preferiblemente hasta a 12 sustituciones de restos no paratopicos.
Como alternativa, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede ser capaz de unirse selectivamente a TGFp3 humano, en comparacion con TGFp1 humano y TGFp2 humano. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede unirse selectivamente a TGFp3 con una afinidad dos veces, 2,4 veces , tres veces, cinco veces, diez veces, o mas, que GC1008(Fab) o GC1009(scFv). El dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender hasta 20 sustituciones de restos paratopicos, preferiblemente hasta 19 sustituciones de restos paratopicos, y mas preferiblemente hasta 12 sustituciones de restos paratopicos. Una sustitucion en el paratopo se puede seleccionar de las sustituciones indicadas en la TABLA 5. El dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender hasta 20 sustituciones de restos no paratopicos, preferiblemente hasta 18 sustituciones de restos no paratopicos, y mas preferiblemente hasta a 12 sustituciones de restos no paratopicos.
En cualquier caso anterior, el anticuerpo puede ser un anticuerpo IgG1, IgG2, o IgG4, por ejemplo una variante del anticuerpo monoclonal GC1008. El fragmento de union a antfgeno del mismo puede ser un scFv, por ejemplo una variante de GC1009(scFv), o un di-scFv, por ejemplo. Como alternativa, el dominio VH puede comprender adicionalmente un dominio constante de la cadena pesada humana, por ejemplo un dominio constante de IgG1, IgG2, o IgG4, y el dominio VL puede comprender adicionalmente un dominio constante de la cadena ligera humana, por ejemplo un dominio constante de cadena ligera k . El dominio constante de la cadena pesada puede tener la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 3, y el dominio constante de la cadena ligera puede tener la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 4. El fragmento de union a antfgeno en esta realizacion puede ser un Fab, un Fab', o un F(ab')2, por ejemplo una variante de GC1008 (Fab).
Un acido nucleico aislado puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. El acido nucleico aislado puede ser un ADNc. Una celula hospedante puede comprender el acido nucleico aislado. Un metodo de fabricacion de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede comprender cultivar la celula hospedante en condiciones adecuadas para producir el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo producido por este metodo se pueden purificar.
Una composicion puede comprender uno de los anticuerpos mencionados anteriormente o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. La composicion puede ser una composicion farmaceutica. La composicion farmaceutica puede comprender una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. La composicion puede comprender adicionalmente uno o mas componentes biologicamente activos.
Un metodo para tratar una enfermedad o afeccion que resulta directa o indirectamente de la actividad de TGFp en un ser humano puede comprender administrar una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. La enfermedad o afeccion se puede seleccionar del grupo que consiste en una enfermedad fibrotica, cancer, o una enfermedad mediada por el sistema inmunitario. Un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se puede utilizar en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en enfermedad fibrotica, cancer, o una enfermedad mediada por el sistema inmunitario. El tratamiento de la enfermedad o trastorno puede comprender neutralizar TGFpi, TGFp2, y/o TGFp3. El tratamiento de la enfermedad o trastorno puede comprender inhibir la senalizacion de TGFpi, TGFp2, y/o TGFp3. El tratamiento de la enfermedad o trastorno puede comprender inhibir la produccion de fibronectina mediada por TGFpi, TGFp2, y/o TGFp3, la produccion de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la proliferacion de celulas epiteliales, la proliferacion de celulas endoteliales, la proliferacion de celulas del musculo liso, o la inmunosupresion. El tratamiento de la enfermedad o trastorno puede comprender aumentar la actividad de las celulas asesinas naturales.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La FIG. 1 representa la estructura co-cristalina de GC1008(Fab) y TGFp2 humano (SEQ ID NO: 6).
La FIG. 2 representa la estructura co-cristalina de GC1009(scFv) y TGFp1 humano (SEQ ID NO: 5).
La FIG. 3 representa una porcion de la estructura co-cristalina del dominio VH de GC1009(scFv) (SEQ ID NO: 1) y TGFp1 humano (SEQ ID NO: 5).
La FIG. 4 representa una porcion de la estructura co-cristalina del dominio VH de GC1008(Fab) (SEQ ID NO: 1) y TGFp3 humano (SEQ ID NO: 7).
La FIG. 5 representa una porcion de la estructura co-cristalina de GC1008(Fab) y TGFp humano. El analisis de mapa termico de la TABLA 7 se visualiza con respecto a los restos Y27, S30, s 31, N32, I52, P53, I54, V55, D56, N59, E74, G101, V103 y L104 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 1), y el resto A93 de la cadena ligera (SEQ ID NO: 2).
Descripcion detallada
El alcance de la invencion se define por las reivindicaciones. Los anticuerpos de la invencion se unen a, y neutralizan, TGF p1, TGF p2 y TGF p3 humanos, que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 con una sustitucion seleccionada del grupo que consiste en S30A, S30H, S30W, E74A, E74C, E74D, E74F, E74G, E74H, E74L, E74P, E74Q, E74R, E74S, E74T, E74W, y E74Y; y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2. Los presentes anticuerpos de union a TGFp o fragmentos de union a antfgeno de los mismos son variantes que comprenden un dominio VH modificado del anticuerpo GC1008, en los que las variantes comprenden una sustitucion de aminoacidos del dominio VH y/o VL (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente). Por ejemplo, los anticuerpos para TGFp o los fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden comprender un dominio VH con una sustitucion de aminoacidos que confiere una union comparable o mejor a TGFp humano (TGFp1, TGFp2 y TGFp3) que la observada con el anticuerpo GC1008. Los anticuerpos selectivos de la isoforma de TGFp, o los fragmentos de union a antfgeno de los mismos, se pueden unir selectivamente a TGFp1 humano, en comparacion con TGFp2 humano y TGFp3 humano, o se pueden unir selectivamente a TGFp3 humano, en comparacion con TGFp1 humano y TGFp2 humano. Se puede lograr una union selectiva mediante la sustitucion de uno o mas aminoacidos de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos que comprenden un dominio VH (SEQ ID NO: 1).
“Union selectiva” significa que el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo (i) se puede unir a una isoforma especffica de TGFp humano con una afinidad mayor que un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que comprende un dominio VH no modificado del anticuerpo GC1008, y/o (ii) se puede unir a las otras isoformas de TGFp con una menor afinidad que un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que comprende un dominio VH no modificado del anticuerpo GC1008. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que se une selectivamente a la isoforma TGFp1 se puede unir a TGFp1 con una afinidad mayor que GC1008(Fab) o GC1009(scFv), por ejemplo dos veces, tres veces, cinco veces, diez veces mayor, o mas. Como alternativa, o ademas, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se puede unir a TGFp2 y TGFp3 con una menor afinidad que GC1008(Fab) o GC1009(scFv), por ejemplo dos veces, tres veces, cinco veces, diez veces menor, o mas.
Como se utiliza en la presente memoria, un primer elemento “y/o” un segundo elemento significa una descripcion especffica del primer o segundo elementos por separado, o el primer y segundo elementos combinados. Las formas
singulares "un”, "uno”, "una” y "el” y "la” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos que comprenden un dominio VH modificado del anticuerpo GC1008 incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos completos, por ejemplo IgG, tales como IgG1, IgG2, o IgG4, o fragmentos de union a antfgeno del mismo, por ejemplo polipeptidos F(ab’)2, scFv, Fab, o dAb. Los fragmentos de union a antfgeno monovalentes pueden incluir Fab, Fv, scFv, y di-scFv, que son dos moleculas scFv unidas por un conector peptfdico. Los fragmentos de union a antfgeno pueden ser multivalentes, por ejemplo dirigidos a TGFp y a otro antfgeno. Los fragmentos multivalentes incluyen F(ab’)2 y di-scFv, en los que los dos componentes de scFv se componen de diferentes dominios variables dirigidos contra antfgenos separados. El presente anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, por ejemplo, puede ser un GC1008 modificado (un anticuerpo IgG4 humano completo), GC1008(Fab) (un fragmento Fab de GC1008), o GC1009(scFv) (una version scFv de GC1008). GC1009(scFv) es un fragmento de union a antfgeno producido de forma recombinante que comprende un dominio VH de PET1073G12 de cadena pesada humana (SEQ ID NO: 1) y un dominio VL de PET1073G12 de cadena ligera humana (SEQ ID NO: 2) unidos por un conector peptfdico, que permite que los dos dominios se asocien en un sitio de union a antfgeno. GC1008 y GC1009 se describen con mas detalle en la patente U.S. n° 7.723.486 y Grutter (2008). La secuencia de aminoacidos de GC1009(scFv) se expone a continuation, en la que el conector peptfdico del motivo (Gly4/Ser)n (SEQ ID NO: 10) esta en negrita y en cursiva, y el peptido senal esta destacado en color gris:
KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYT
FSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTS
TTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSG
GGGSGGGGSALETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQ
QKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVY
YCQQYADSPITFGQGTRLEIKRHHHHHH (SEQ ID NO: 9).
Un dominio variable "modificado” o "variante” comprende sustituciones de aminoacidos, en comparacion con la secuencia de referencia. Un "dominio VH variante del anticuerpo GC1008”, por ejemplo, puede comprender sustituciones de aminoacidos en comparacion con el dominio VH de PET1073G12 con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 1.
El dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender hasta 20 sustituciones de restos paratopicos, preferiblemente hasta 19 sustituciones de restos paratopicos, y mas preferiblemente hasta 12 sustituciones de restos paratopicos. Por ejemplo, uno de los dos dominios puede comprender una sustitucion de un resto del paratopo, mientras que el otro dominio no esta modificado, o ambos dominios pueden comprender sustituciones de restos paratopicos. Una sustitucion del paratopo se puede seleccionar de las sustituciones indicadas en la TABLA 5. Las sustituciones del paratopo pueden hacer que el anticuerpo modificado o fragmento de union a antfgeno se unan a una isoforma de TGFp selectivamente, o las sustituciones pueden preservar la union pan-especffica del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno a las isoformas de TGFp. Tambien se pueden realizar dos tipos de sustituciones en el paratopo. Por ejemplo, una sustitucion en el paratopo puede hacer que el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno se unan a una isoforma de TGFp selectivamente, mientras se realiza otra sustitucion en el paratopo que conserva la union pan-especffica para desinmunizar el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno. La desinmunizacion se puede realizar de acuerdo con el metodo de Harding et al. (2010) mAbs 2:256-265, por ejemplo.
El dominio VH y/o el dominio VL pueden comprender como alternativa o adicionalmente hasta 20 sustituciones de restos no paratopicos, preferiblemente hasta 18 sustituciones de restos no paratopicos, y mas preferiblemente hasta 12 sustituciones de restos no paratopicos. Los restos no paratopicos pueden ser sustituidos, por diversas razones, por ejemplo para aumentar la termoestabilidad de un fragmento de union a antfgeno, para eliminar un resto de aminoacido que es susceptible de oxidation o desamidacion, para anadir un aminoacido que puede ser facilmente conjugado con un farmaco o moleculas de PEG, por ejemplo, o para eliminar un sitio potencial de carboxilacion.
Las modificaciones tambien pueden incluir deleciones de aminoacidos. Por ejemplo, uno o dos aminoacidos que no estan en el paratopo se pueden eliminar de un dominio VH y/o VL variante. Los aminoacidos suprimidos pueden ser de los extremos carboxilo- o amino-terminales de los dominios VL y/o VH.
Un dominio variable de los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), cada una de las cuales esta flanqueada por una region estructural (FW). Por ejemplo, un dominio VH puede comprender un conjunto de tres CDR de cadena pesada, HCDR1, HCDR2, y HCDR3. Un dominio VL puede comprender un conjunto de tres CDR de cadena ligera, LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Un conjunto de HCDR descrito en la presente memoria puede ser proporcionado en un dominio VH que se utiliza combinado con un dominio VL. Un dominio VH puede proporcionarse con un conjunto de HCDR como se describe en la presente memoria, y si semejante dominio VH esta emparejado con un dominio VL, en ese caso el dominio VL puede estar provisto de un conjunto de LCDR descrito en la presente memoria. Las estructuras y ubicaciones de las regiones CDR y FW del dominio variable de la inmunoglobulina se determinan en la presente
memoria mediante la referenda a Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a ed., U.S. Department of Health and Human Services.
Los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos contienen restos de aminoacidos “paratopicos” y “no paratopicos”. Un aminoacido del “paratopo” de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de la presente memoria tiene un nucleo atomico dentro de los 4 A de un nucleo atomico de la isoforma de TGFp humano. Debido a que cada isoforma de TGFp humano forma un complejo estructuralmente diferente con los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, los restos paratopicos pueden ser diferentes para cada isoforma. Un “resto del paratopo de TG Fpi”, por ejemplo, tiene un nucleo atomico dentro de los 4 A de un nucleo atomico de TGFpi humano. La TABLA 3 muestra los restos paratopicos de los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos para cada una de las isoformas TG Fpi, TGFp2, y TGFp3 humanas. Un resto del “paratopo de TGFp” tiene un nucleo atomico dentro de los 4 A de un nucleo atomico de las tres isoformas de TGFp humano.
Un resto se denomina resto del paratopo independientemente de la ubicacion dentro de una region CDR o FW, como se define por medio de la nomenclatura de Kabat. Muchos restos de paratopos se encuentran dentro de las regiones CDR, como se muestra en la TABLA 4, por ejemplo. Sin embargo, algunos restos de paratopos se encuentran dentro de las regiones FW. Un aminoacido “no paratopico” es cualquier aminoacido del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que no es un aminoacido del “paratopo”, independientemente de si el resto se encuentra en una region CDR o FW.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden comprender sustituciones de aminoacidos en la cadena pesada y la cadena ligera seleccionadas de diferentes lfneas germinales humanas. Por ejemplo, se puede introducir un conjunto de HCDR en un repertorio de dominios variables que carecen de CDR usando la tecnologfa de ADN recombinante. Los marcos de la lfnea germinal incluyen secuencias de la cadena pesada de la lfnea germinal DP-10 (Vh 1-69) humana o DP-88 (Vh 1-e) humana de la familia de Vh-1. Las secuencias de la cadena ligera pueden ser de la familia Vk3 humana, por ejemplo DPK-22 (A27) humana. Las secuencias de aminoacidos del dominio variable de la lfnea germinal humana son descritas por VBASE2 en Internet en vbase2.org/vbstat.php, por ejemplo. Por ejemplo, un conjunto de HCDR y un conjunto de LCDR se pueden emparejar juntos para los anticuerpos PET1073G12, PET1074B9, o PET1287A10. El anticuerpo por lo tanto puede ser una molecula de anticuerpo IgG4 que comprende un dominio VH PET1073G12 modificado y/o un dominio v L PET1073G12, por ejemplo. Las secuencias de aminoacidos de los dominios de PET1073G12, PET1074B9, o PET1287A10, incluyendo los conjuntos de HCDR y LCDR, se describen en la Patente U.S. n° 7.723.486.
Los fragmentos de union a antfgeno pueden comprender adicionalmente regiones constantes del anticuerpo o porciones de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL puede estar unido en su extremo C-terminal a dominios constantes de la cadena ligera de anticuerpo, incluyendo las cadenas Ck o C humanas. Del mismo modo, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que comprende un dominio VH puede comprender adicionalmente unido en su extremo C-terminal la totalidad o parte de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio CH1) derivado de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM, o cualquiera de las sub-clases de isotipo, concretamente IgG1, IgG2, o IgG4. Se prefiere IgG4 para algunas aplicaciones, ya que no se une al complemento y no crea funciones efectoras. Cuando se desea una funcion efectora, se prefiere IgG1. En todos los casos, las regiones constantes del anticuerpo o las porciones de las mismas pueden ser secuencias humanas.
Se pueden realizar modificaciones en las regiones constantes de los anticuerpos para mejorar diversas propiedades de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. Por ejemplo, se pueden utilizar modificaciones de aminoacidos recombinantes para disminuir la homogeneidad estructural de los polipeptidos expresados. Un ejemplo representativo es Peters et al. (2012) J. Biol. Chem. 287(29): 24525-33, que describe sustituciones de Cys a Ser en la region bisagra de IgG4 que reducen la heterogeneidad del enlace disulfuro y aumentan la estabilidad termica del dominio Fab. Del mismo modo, Zhang et al. (2010) Anal. Chem. 82: 1090-99 describen la modificacion genetica de la region de bisagra de IgG2 para limitar la aleatorizacion de enlaces disulfuro y la formacion de isomeros estructurales en las aplicaciones terapeuticas. Las modificaciones de aminoacidos a un dominio CH3 tambien se pueden utilizar para eliminar restos Lys carboxi terminales para disminuir el numero de variantes de carga. Las modificaciones de aminoacidos tambien se pueden utilizar para mejorar la funcion farmacologica de los anticuerpos recombinantes o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. Cuando los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno comprenden una region Fc, por ejemplo, se pueden utilizar modificaciones de aminoacidos para aumentar la activacion del complemento, mejorar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) aumentando la union a FcyRIIIA o disminuyendo la union a FcyRIIIB, y/o aumentar la vida media en suero mediante el aumento de la union a FcRn. Tales modificaciones de aminoacidos se revisan en Beck et al. (2010) Nature 10: 345-52, por ejemplo.
La siguiente TABLA 1 muestra las secuencias de aminoacidos del dominio VH no modificado de PET1073G12 (SEQ ID NO: 1); el dominio CH1 (SEQ ID NO: 3); el dominio VL de PET1073G12 (SEQ ID NO: 2); y el dominio Ck (SEQ ID NO: 4), que estan presentes en GC1008(Fab). Las diversas regiones CDR y marco (FW) estan marcadas; tambien se destacan los restos de CDR.
TABLA 1
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden ser mono-especfficos para TGFp humano, o pueden ser bi-especfficos. Los anticuerpos bi-especfficos o los fragmentos de union a antfgeno de los mismos se pueden fabricar en una variedad de maneras, como describen, por ejemplo, Holliger et al. (1993) Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449. Los ejemplos de anticuerpos biespecfficos incluyen los de la tecnologfa de IgG de dominio variable dual (DvD-IgG) o de la tecnologfa BiTE™, en la que los dominios de union de dos anticuerpos con diferente especificidad se pueden utilizar y conectar directamente a traves de peptidos cortos flexibles.
Dominios VH y/o VL modificados recombinantemente
El dominio variable de cadena pesada y/o cadena ligera de los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos puede ser modificado de manera recombinante para alterar la secuencia de aminoacidos de una secuencia de la lfnea germinal. Por ejemplo, una o mas de las CDR del conjunto de CDR de la cadena pesada pueden ser modificadas, una o mas de las CDR del conjunto de CDR de la cadena ligera pueden ser modificadas, y/o una de las regiones marco de los dominios VH y/o VL puede ser modificada. Las sustituciones se pueden realizar para aminoacidos del paratopo, por ejemplo, que refuerzan o debilitan la afinidad de union a una isoforma de TGFp, o pueden dejar la afinidad de union relativamente inalterada. Se pueden realizar otras sustituciones para los restos de aminoacido que no estan en el paratopo para conferir diversas caracterfsticas a los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, por ejemplo, mejorando la estabilidad o introduciendo un grupo reactivo de la superficie del dominio que se puede modificar covalentemente. Por consiguiente, las siguientes cuatro categorfas de sustituciones de aminoacidos para el dominio VH y/o VL de los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos se encuentran entre las contempladas en la presente memoria: (1) sustituciones que confieren la union selectiva a una isoforma de TGFp humano; (2) sustituciones que mantienen la union pan-especffica a las tres isoformas de TGFp humano; (3) sustituciones de los aminoacidos que no estan en el paratopo; y (4) multiples sustituciones de aminoacidos. Estas categorfas de sustituciones de aminoacidos no son mutuamente excluyentes.
1. Sustituciones que confieren union selectiva.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos selectivos de isoformas de TGFp pueden comprender una sustitucion de aminoacidos dentro del dominio VH (SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos se pueden unir selectivamente a TGFp1 humano, en comparacion con TGFp2 humano y TGFp3 humano, o se pueden unir selectivamente a TGFp3 humano, en comparacion con TGFpi humano y TGFp2 humano. La union selectiva se puede lograr sustituyendo uno o mas aminoacidos del paratopo.
La prediction de como afectara una sustitucion de aminoacido a la capacidad de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para interaccionar con una isoforma de TGFp se ve facilitada por una estructura co-cristalina con cada una de las isoformas de TGFp. La estructura co-cristalina de GC1008(Fab) y TGFp3 es descrita por Grutter (2008). La estructura co-cristalina de GC1008(Fab) y TGFpi se representa en la FIG. 1. La estructura co-cristalina de GC1009(scFv) y TGFp1 se representa en la FIG. 2.
La TABLA 2 representa la secuencia de aminoacidos de las isoformas TGFp1, TGFp2, y TGFp3 humanas. La comparacion de las estructuras co-cristalinas revela diferencias en los paratopos entre las tres isoformas. Los restos de TGFp en cada isoforma que interaccionan con GC1008 estan en negrita en la TABLA 2.
TABLA2
La siguiente TABLA 3 enumera restos paratopicos del dominio VH (SEQ ID NO: 1) y el dominio VL (SEQ ID NO: 2), segun se determina por medio de las estructuras co-cristalinas con cada isoforma de TGFp humano. Los restos paratopicos de GC1008 en negrita son compartidos entre las tres isoformas de TGFp. Tres regiones del epftopo de TGFp se designan como “punta”, “parche hidrofobo”, y “helice tres”. Los restos del dominio VH y VL que tienen nucleos atomicos dentro de los 4 A de un nucleo atomico en el “parche hidrofobo” de TGFp, que tiene la secuencia L28GWKW32 (SEQ ID NO: 8), se conservan para las tres isoformas. Los restos de GC1008 que interaccionan con las regiones de la “punta” y la “helice tres”, sin embargo, muestran una mayor variabilidad. Mediante la comparacion de las tres estructuras co-cristalinas, es evidente que GC1008 cambia la orientation y ajusta las posiciones de bucle de CDR y las conformaciones de la cadena lateral para dar cabida a las tres isoformas de TGFp con una afinidad similar. Veanse la FIG. 1 y la FIG. 2. Por ejemplo, Grutter (2008) describio que GC1008 mostraba afinidades similares para las tres isoformas: valores de CI5o de 1 ± 2 nM, 14 ± 5 nM, y 7 ± 2 nM contra TGFp1, TGFp2, y TGFp3, respectivamente en un ensayo de proliferation de celulas epiteliales de pulmon de vison (MLEC). Sin embargo, los restos 67 y 68 de las tres isoformas de TGFp difieren en sus interacciones con el resto Y27 del paratopo de VH. El resto de VH Y27 presenta interacciones de enlaces de hidrogeno con los restos de TGFp1 Q67 y H68. Por el contrario, el resto de VH Y27 presenta interacciones hidrofobas con T67 e Y50 de TGFp2 y TGFp3. Esto provoca un reordenamiento del bucle de HCDR1 en el complejo de TGFp1, en comparacion con los complejos de TGFp2 y TGFp3.
TABLA 3
La information de la TABLA 3 se vuelve a formatear en la TABLA 4 para indicar los restos de los dominios VH y VL que estan dentro de los 4 A de un nucleo atomico de TGFp3 en el co-cristal. Los restos paratopicos estan en negrita. La mayorfa, pero no todos, los restos paratopicos se encuentran dentro de las HCDR.
Una comparacion de las estructuras co-cristalinas puede guiar las sustituciones de los restos de los dominios VH y/o VL para alterar la afinidad de GC1008 para las isoformas de TGFp. En particular, las sustituciones de aminoacidos pueden estar basadas en la localizacion de cada resto de VH y/o VL en las tres estructuras cristalinas, teniendo en cuenta si el resto interacciona con el antfgeno o esta implicado en interacciones con otras CDR o elementos estructurales que estabilizan los bucles de CDR. Por ejemplo, I97 en LCDR3 no interactua directamente con TGFp en cualquiera de las tres estructuras; sin embargo, I97 se enfrenta al interior del anticuerpo y en un bolsillo hidrofobo que tambien se compone de V103 y L104 de la HCDR3. Puesto que V103 y L104 son paratopos importantes para la union a TGFp, la sustitucion de I97 por restos debilmente polares o hidrofobos medianos o pequenos podrfa ser tolerada sin cambiar significativamente la afinidad hacia TGFp, por ejemplo, mas de diez veces.
La region helice 3 muestra la mayor variabilidad en la secuencia del epftopo. La lisina y la arginina en la posicion 60 de TGFp1 y TGFp1 causan una rotacion de GC1008 unido a TGFp1 y TGFp2 en comparacion con TGFp3. En los restos 67 y 68, TGFp1 tiene glutamina e histidina, respectivamente, en lugar de treonina e isoleucina/leucina como en TGFp2 y TGFp3 (Figura 3). Cuando S30 se muta a restos hidrofobos tales como A, W, se favorecen interacciones hidrofobas adicionales con L64 de TGFp conservado, y por lo tanto aumenta la afinidad por los tres TGFp. Este aumento de afinidad es mas pronunciado para TGFp 2 y 3, debido a la treonina e isoleucina/leucina mencionadas anteriormente como en TGFp2 y TGFp3 en los restos 67 y 68, lo que favorece restos hidrofobos por encima de Q y H de TGFp1. En TGFp1 y TGFp2, las cadenas laterales cargadas positivamente en la posicion 60 presentan interacciones ionicas con E74 en la cadena pesada. La sustitucion de E74 con restos cargados positivamente es menos favorecida para la union de GC1008 a TGFp1, pero mas favorecida para TGFp3, que tiene una treonina en la posicion 60 (Figura 4). Debido al pequeno tamano de la cadena lateral de T60 de TGFp3, se pueden tolerar la mayorfa de las mutaciones en E74 en la cadena pesada. Debido a la naturaleza parcialmente hidrofoba de T60, las sustituciones hidrofobas en E74 tambien pueden aumentar drasticamente la afinidad de union a TGFp3, conduciendo a menudo a una mejora de mas del doble en las razones kdvar:kdw t.
Para seleccionar rapidamente en busca de anticuerpos contra TGFp o fragmentos de union a antfgeno de los mismos con mayores afinidades para una isoforma de TGFp concreta o con una selectividad para una isoforma sobre las otras, las posiciones enumeradas en la TABLA 3 pueden ser asignadas al azar a los otros 19 aminoacidos. Esto se puede lograr por medio de presentacion in vitro de GC1009(scFv), fragmento Fab de GC1008, o bibliotecas de GC1008 usando mecanismos bien conocidos en la tecnica (Bradbury et al. (2011) Nature Biotechnol. 29(3): 245-254). Sin las estructuras cristalinas de TGFp1 y TGFp2 formando complejo con Fab de GC1009 y de GC1008, respectivamente, los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos con mayores afinidades solo para TGFp3 pueden ser identificados usando esta tecnologfa de presentacion in vitro basada en los aminoacidos que contactan con TGFp3 derivados de la estructura compleja de TGFp3 descrita por Grutter (2008). Con el nuevo TGFp1 y TGFp2 formando
complejo con las estructuras de Fab de GC1009 y GC1008 que los autores de la presente invencion han determinado, los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos con afinidades mas altas para TGFp1 y TGFp2 tambien se pueden identificar rapidamente por medio de la tecnologfa de presentacion. Por otra parte, contar con informacion sobre las tres estructuras permite elaborar bibliotecas mas orientadas para identificar variantes selectivas de las isoformas. Las bibliotecas orientadas a TGFp1 por ejemplo, solo requerinan la aleatorizacion de las posiciones 27 y 30 del dominio VH (SEQ ID NO: 1). Los 322 (1024) posibles mutantes senan abarcados por las bibliotecas de fagos con un tamano de la biblioteca de solo ~ 105 especies. (Los 20 aminoacidos pueden estar representados por 32 codones con una secuencia de NNG/C, con cualquiera de los cuatro acidos nucleicos en las dos primeras posiciones y G o C en la tercera posicion). Sin las estructuras cristalinas de TGFp1 y TGFp1 formando complejo con GC1009/GC1008, habna que aleatorizar los 14 aminoacidos que contactan con TGFp3 derivados de la estructura compleja de TGFp3 descrita por Grutter (2008). Una biblioteca de fagos con una diversidad de 3214 (1021) no estana representada plenamente ni siquiera en la mejor de cualquiera de las bibliotecas conocidas, que no presentan mas de aproximadamente -1011 especies. Por lo tanto, los datos de estructura proporcionados en la presente memoria permitinan el rapido escrutinio e identificacion de antagonistas selectivos de TGFp.
2. Sustituciones que mantienen la union pan-espedfica.
Las sustituciones se pueden realizar de manera que no alteren significativamente la afinidad de union hacia una isoforma de TGFp. Una sustitucion que no “altera significativamente” la afinidad de union hacia una isoforma TGFp no aumenta la razon de la tasa de disociacion de la variante (kdvar) en comparacion con la tasa de disociacion del tipo salvaje (kd * 1) en mas de 2,4 (es decir, kdvar/kdwt es menor o igual a 2,4). Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos que presentan “union pan-espedfica” para este proposito pueden tener una constante de union aparente para TGFp (TGFp1, TGFp2 y TGFp3) de al menos 10 nM, 30 nM, o 100 nM. La afinidad para las isoformas de TGFp se puede medir usando cualquier mecanismo apropiado en la tecnica, por ejemplo, el ensayo de proliferacion de MLEC descrito por Grutter (2008) o un ensayo de union Biacore® 3000 (Ge Healthcare). Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos que presentan una “union pan-espedfica” para este proposito pueden tener una afinidad de union aparente (kdvar:kdw t) para TGFp (TGFp1, TGFp2 y TGFp3) menor o igual a 2,4 veces, menor o igual a 3 veces, menor o igual a 5 veces, o menor o igual a 10 veces en comparacion con el tipo salvaje, preferiblemente menor o igual a 2,4 veces en comparacion con el tipo salvaje (kdvar:kdwt). Estas sustituciones pueden ser guiadas por las tres estructuras co-cristalinas entre GC1008/GC1009 y las tres isoformas de TGFp. Vease Oberlin et al. (2012) J. Chem. Inf. Model. 52: 2204-2214.
Se espera que las sustituciones que mantienen una union pan-espedfica con TGFp no creen ningun impedimento esterico con los restos de aminoacidos de TGFp ni tengan un efecto perjudicial significativo sobre la estabilidad de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. Las sustituciones que tienen un efecto perjudicial significativo en la estabilidad pueden promover la agregacion y la inactivacion de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, causando un desplegamiento o un mal plegamiento local. Los anticuerpos, agregados desestabilizados o fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden inducir inmunogenicidad, porque el sistema inmunitario del paciente puede reconocer tales agregados como moleculas foraneas.
Un ejemplo de una sustitucion que mantiene la union pan-espedfica es R24 en LCDR1. R24 se orienta lejos del sitio de union a TGFp y esta expuesto sobre la superficie de dominio VL. Esta posicion puede albergar una sustitucion con la mayona de los restos polares excepto Pro y Cys, que generalmente se evitan. Por otro lado, I52 en HCDR2 presenta una interaccion hidrofoba estrecha con el “parche hidrofobo” de TGFp (L28GWKW32 (SEQ ID NO: 8)), de modo que las sustituciones I52 se limitan a restos hidrofobos de tamano mediano, con la posibilidad de una sustitucion por Val, mientras que una sustitucion por restos hidrofobos mas grandes podna crear un impedimento esterico en el complejo unido.
La TABLA 5 proporciona ejemplos no limitantes de sustituciones de aminoacidos del dominio VL del SEC ID NO: 2 (TABLA 5A) y el dominio VH del SEC ID NO: 1 (TABLA 5B). En algunos casos se pueden realizar sustituciones de aminoacidos en los restos del marco dentro del paratopo, por ejemplo, el resto Y50 de VL en la region FW2. Se espera que los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno con una o mas de las sustituciones siguientes tengan una pan-especificidad similar y una afinidad mejor hacia TGFp que GC1008/GC1009, es decir, para unirse a todas las isoformas de TGFp con isoformas con una afinidad de union (kdvar:kdw t) menor o igual a 2,4 veces, menor o igual a 3 veces, menor o igual a 5 veces, o menor o igual a 10 veces en comparacion con el tipo salvaje.
TABLA 5A
TABLA 5B
3. Sustituciones de restos de aminoacidos que no estan en el paratopo.
Los aminoacidos que no estan en el paratopo pueden ser sustituidos de forma recombinante para elaborar un dominio ligero o pesado variable con propiedades similares o alteradas en comparacion con el dominio variable de la linea germinal. Los dominios variables “modificados” tambien incluyen deleciones de aminoacidos, asf como sustituciones. Por ejemplo, el resto de aminoacido N-terminal o C-terminal se puede eliminar en un dominio variable modificado.
Se pueden elaborar sustituciones de aminoacidos que no estan en el paratopo, por ejemplo, para aumentar la estabilidad y/o disminuir la tendencia a agregarse. La escasa estabilidad puede afectar a la capacidad de un fragmento de union al antfgeno, por ejemplo, para plegarse correctamente cuando se expresa de forma recombinante, lo que da como resultado que una fraccion de los fragmentos expresados no sean funcionales. Los anticuerpos de baja estabilidad o fragmentos de union a antfgeno de los mismos tambien pueden ser propensos a formar agregados potencialmente inmunogenicos o pueden presentar una avidez o una vida util deterioradas. Los polipeptidos scFv en particular pueden mostrar problemas con la estabilidad, solubilidad, expresion, agregacion, productos de degradacion, y capacidad de fabricacion global en sistemas de expresion tanto bacterianos como de mamfferos. Las sustituciones de aminoacidos en el marco que se espera que aumenten la estabilidad y/o disminuyan la tendencia a agregarse de un dominio VH y/o VL, por ejemplo, en un polipeptido scFv, se describen en el documento WO 2007/109254, por ejemplo. De manera similar se espera que las sustituciones en los correspondientes restos en los presentes dominios Vh y VL aumenten la estabilidad y/o disminuyan la tendencia a agregarse.
Se espera que las sustituciones que pueden ser toleradas incluyan aquellas que reemplazarfan un aminoacido que no esta en el paratopo del SEQ ID NO: 1 o 2 por un aminoacido correspondiente que existe en otra secuencia de la linea germinal de un dominio VH o VL humano. En la actualidad, se conocen en la tecnica aproximadamente 40 secuencias de la linea germinal pesadas variables, como se conocen aproximadamente 40 secuencias de la linea germinal kappa variables y aproximadamente 30 secuencias de la linea germinal lambda variables. Se espera que una sustitucion de un aminoacido que no esta en el paratopo por un aminoacido que existe cualquiera de estas secuencias de la linea germinal sea tolerada. Por ejemplo, un resto de un dominio VH del SEC iD NO: 1 podrfa ser sustituido por un aminoacido que aparece en una posicion correspondiente en cualquier secuencia de la linea germinal VH, por ejemplo, la secuencia de la linea germinal de DP-10 (Vh 1-69) o DP-88 (Vh 1-e). Las posiciones correspondientes en este caso son determinadas por un alineamiento de secuencias entre las diferentes secuencias de la linea germinal, utilizando mecanismos de alineamiento bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, ClustalW.
Las sustituciones adicionales que se espera que sean toleradas son las realizadas en un aminoacido con la mayor parte de su cadena lateral expuesta al disolvente, tal como se determina por medio de analisis de las tres estructuras co-cristalinas. El area de superficie accesible al disolvente de un resto se puede estimar usando mecanismos bien conocidos en la tecnica. Ademas, se espera que las sustituciones de aminoacidos sepultados dentro de los dominios variables sean mejor toleradas si la cadena lateral del aminoacido no crea un impedimento esterico con los restos adyacentes. Por esta razon, los aminoacidos sepultados generalmente son sustituidos por aminoacidos con cadenas laterales de tamano similar o mas pequeno. Por ejemplo, se espera que una sustitucion de un resto de Ile sepultado por Leu, Val, Ala, o Gly sea tolerada. El posible impedimento esterico creado por una sustitucion se puede predecir mediante el analisis de las tres estructuras co-cristalinas. Otras sustituciones que se espera que sean toleradas son las que mantienen las interacciones electrostaticas existentes dentro de los dominios variables, por ejemplo, interacciones dipolo-dipolo, interacciones dipolo inducido, enlaces de hidrogeno o enlaces ionicos.
Las sustituciones de aminoacidos adicionales de los dominios variables incluyen aquellas que se espera que confieran nuevas propiedades utiles a los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. Por ejemplo, los supuestos sitios de N-glicosilacion en los dominios VH y/o VL se pueden eliminar para prevenir o reducir la formacion de N-glicoformas. El resto amino-terminal puede estar sustituido por un resto de Gln para causar la piroglutamilacion, lo que puede disminuir el numero de variantes de carga. Las sustituciones de aminoacidos se pueden utilizar para
disminuir el punto isoelectrico, lo que puede disminuir la tasa de eliminacion de los anticuerpos polipeptfdicos IgG, por ejemplo.
Los restos superficiales de los dominios variables pueden estar sustituidos por restos de Cys o Lys, por ejemplo, que pueden ser modificados a continuacion de forma covalente y acoplados a moleculas que confieren caracterfsticas utiles a los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, por ejemplo, una marca detectable, toxina, radical de direccionamiento, o protefna. Por ejemplo, el resto de Cys se puede acoplar a un farmaco citotoxico para formar un producto conjugado con farmaco. Los restos de Cys tambien pueden ser acoplados a moleculas que aumentan la vida media en suero, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o albumina de suero. Tales modificaciones de aminoacidos son revisadas por Beck et al. (2010) Nature 10: 345-52, por ejemplo.
Las marcas detectables incluyen radiomarcas tales como 131I o 99Tc, que se pueden unir a anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos utilizando metodos conocidos en la tecnica. Las marcas tambien incluyen marcas enzimaticas tales como peroxidasa de rabano picante. Las marcas incluyen adicionalmente radicales qufmicos tales como biotina que pueden ser detectados por medio de la union a un radical detectable cognado especffico, por ejemplo, avidina marcada. Se pueden unir otros radicales que faciliten la purificacion. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden estar etiquetados con His utilizando metodos bien conocidos de modificacion y expresion recombinantes.
4. Sustituciones multiples de aminoacidos en los dominios variables
Se pueden realizar multiples sustituciones de aminoacidos en los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. Como regla general, se espera que los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos mantengan la estabilidad y la funcionalidad despues de al menos varias sustituciones de aminoacidos seleccionadas al azar. Vease, por ejemplo, Wells, Biochemistry 29: 8509-17 (1990). Sin embargo, cuantas mas sustituciones se introducen al azar en un dominio variable, por ejemplo, la estabilidad global del dominio puede disminuir, su tendencia a agregarse puede aumentar, su afinidad hacia TGFp puede disminuir, y su posible inmunogenicidad puede aumentar. Por lo tanto, cuando se realizan multiples sustituciones de aminoacidos, las sustituciones preferidas se seleccionan entre las descritas anteriormente, que se espera que mantengan la estabilidad y funcionalidad. La funcionalidad de los dominios variables modificados se puede someter a ensayo utilizando metodos de rutina conocidos en la tecnica, incluyendo pero no limitados al ensayo de proliferacion de MLEC descrito por Grutter (2008).
Acidos nucleicos y metodos para elaborar anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno
Un aspecto adicional de la presente invencion proporciona acidos nucleicos que codifican anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos descritos en la presente memoria. El acido nucleico aislado puede ser un ADN sintetico, un ARNm de origen no natural, o un ADNc, por ejemplo. El acido nucleico se puede insertar dentro de un plasmido, un vector, o un casete de transcripcion o expresion. Una celula hospedante recombinante puede comprender uno o mas de los constructos anteriores. Un acido nucleico “aislado” (o anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo) se retira de su entorno natural, y puede estar adicionalmente en una forma sustancialmente pura, por ejemplo, al menos puro en 90%, u homogenea.
Los metodos para preparar anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos comprenden expresar el acido nucleico codificante en una celula hospedante en condiciones que producen los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, y la recuperacion de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. El procedimiento de recuperacion de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos puede comprender el aislamiento y/o purificacion de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. El metodo de produccion puede comprender la formulacion de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos en una composicion que incluye al menos un componente adicional, tal como un excipiente farmaceuticamente aceptable.
Los vectores adecuados que comprenden un acido nucleico que codifica los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos se pueden elegir o construir, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilacion, secuencias intensificadoras, genes marcadores y otras secuencias segun sea apropiado. Los vectores pueden ser plasmidos, fagos, fagemidos, adenovirales, AAV, lentivirales, por ejemplo. Los mecanismos y protocolos para la manipulacion de acido nucleico, por ejemplo en la preparacion de constructos de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduccion de ADN en celulas y expresion genica, son bien conocidos en la tecnica.
La introduccion de tales acidos nucleicos en una celula hospedante se puede realizar utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica. Para las celulas eucariotas, los mecanismos adecuados pueden incluir transfeccion con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporacion, transfeccion mediada por liposomas, y transduccion utilizando retrovirus u otros virus, por ejemplo. Para las celulas bacterianas, los mecanismos adecuados pueden incluir transformacion con cloruro de calcio, electroporacion, y transfeccion usando bacteriofagos. La introduccion puede estar seguida de, causar o permitir la expresion a partir del acido nucleico, por ejemplo, mediante el cultivo de celulas hospedantes en condiciones para la expresion del gen. En una realizacion, el acido nucleico de la invencion se integra
en el genoma, por ejemplo, cromosoma, de la celula hospedante. La integracion puede ser promovida por la inclusion de secuencias que promueven la recombinacion con el genoma, de acuerdo con tecnicas convencionales.
Los sistemas para la clonacion y expresion de un polipeptido en una variedad de diferentes celulas hospedantes son bien conocidos. Las celulas hospedantes adecuadas incluyen bacterias, celulas de mamffero, celulas vegetales, celulas de insectos, hongos, levaduras y plantas, y animales transgenicos. Las lfneas celulares de mamffero disponibles en la tecnica para la expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, celulas de rinon de crfa de hamster, celulas de melanoma de raton, celulas de mieloma de rata, celulas de rinon embrionarias humanas, celulas de retina embrionarias humanas, y muchas otras. La expresion de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en celulas procariotas, tales como E. coli, esta bien establecida en la tecnica. Para una revision, vease, por ejemplo, Pluckthun Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresion en celulas eucariotas en cultivo tambien esta disponible para los expertos en la tecnica, tal como fue revisado por Andersen et al. (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13: 117-23, por ejemplo.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden estar glicosilados, bien de forma natural o bien mediante la eleccion de las celulas hospedantes de expresion, por ejemplo, CHO o NSO (ECACC 85110503), o pueden estar no glicosilados, por ejemplo si se producen mediante expresion en una celula procariota. La glicosilacion tambien se puede alterar intencionadamente, por ejemplo mediante la inhibicion de la fucosilacion, con el fin de aumentar la actividad ADCC del anticuerpo resultante.
Metodos de utilizacion de anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos
Los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos se pueden usar en un metodo de tratamiento o diagnostico del organismo humano o animal, tal como un metodo de tratamiento (que puede incluir el tratamiento profilactico) de una enfermedad o trastorno en un paciente humano, que comprende la administracion de una cantidad eficaz al paciente. Las afecciones tratables incluyen cualquiera en la que el TGFp juegue un papel, por ejemplo, enfermedad fibrotica, cancer, una enfermedad mediada por el sistema inmunitario, y cicatrizacion de heridas.
Los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos son utiles para tratar una enfermedad y afeccion que resulta directa o indirectamente de la actividad de TGFp. Los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos pueden inhibir selectivamente la actividad de una isoforma de TGFp humano in vitro o in vivo. Las actividades de las isoformas de TGFp incluyen, pero no se limitan a, la senalizacion mediada por TGFp, el deposito en la matriz extracelular (ECM), la inhibicion de la proliferacion de celulas epiteliales y endoteliales, la promocion de la proliferacion del musculo liso, la induccion de la expresion de colageno de Tipo III, la induccion de la expresion de TGFp, fibronectina, VEGF, e IL-11, la union al Peptido Asociado con la Latencia, la inmunosupresion inducida por tumores, la promocion de la angiogenesis, la activacion de miofibroblastos, la promocion de la metastasis, y la inhibicion de la actividad de las celulas NK. Por ejemplo, los presentes anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos son utiles para tratar la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GEFS), la fibrosis hepatica (FH), el infarto agudo de miocardio (IAM), la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI), la esclerodermia (ScS), y el Sfndrome de Marfan.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos son utiles para tratar enfermedades y afecciones, incluyendo, pero no limitadas a, enfermedades fibroticas (tales como la glomerulonefritis, la cicatrizacion neural, la cicatrizacion dermica, la fibrosis pulmonar, fibrosis del pulmon, la fibrosis inducida por la radiacion, la fibrosis hepatica, la mielofibrosis), quemaduras, enfermedades mediadas por el sistema inmunitario, enfermedades inflamatorias (incluyendo artritis reumatoide), rechazo de trasplantes, cancer, contractura de Dupuytren, y ulceras gastricas. Tambien son utiles para tratar, prevenir y reducir el riesgo de aparicion de insuficiencias renales incluyendo pero no limitadas a: nefropatfa diabetica (tipo I y tipo II), nefropatfa inducida por radiacion, nefropatfa obstructiva, esclerosis sistemica difusa, fibrosis pulmonar, rechazo de aloinjertos, enfermedad renal hereditaria (por ejemplo, enfermedad poliqufstica del rinon, rinon esponjoso medular, rinon en herradura), glomerulonefritis, nefroesclerosis, nefrocalcinosis, lupus eritematoso sistemico, sfndrome de Sjogren, enfermedad de Berger, hipertension sistemica o glomerular, nefropatfa tubulointersticial, acidosis tubular renal, tuberculosis renal e infarto renal. En particular, son utiles cuando se combinan con antagonistas del sistema renina-angiotensina-aldosterona, incluyendo, pero no limitados a: inhibidores de la renina, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (ACE), antagonistas del receptor de Ang II (tambien conocidos como “bloqueadores del receptor de Ang II”), y antagonistas de aldosterona. Los metodos para el uso de anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos combinados con tales antagonistas se exponen en el documento WO 2004/098637, por ejemplo.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos tambien son utiles para tratar enfermedades y afecciones asociadas con el deposito de ECM, incluyendo, esclerosis sistemica, adherencias postoperatorias, cicatrizacion queloide e hipertrofica, vitreorretinopatfa proliferativa, cirugfa de drenaje del glaucoma, lesion corneal, cataratas, enfermedad de Peyronie, sfndrome de dificultad respiratoria del adulto, cirrosis del hfgado, cicatrizacion post-infarto de miocardio, restenosis post-angioplastia, cicatrizacion despues de hemorragia subaracnoidea, esclerosis multiple, fibrosis despues de laminectomfa, fibrosis despues de reparacion de tendon y otras reparaciones, cicatrices debido a la eliminacion de tatuajes, cirrosis biliar (incluyendo colangitis esclerosante), pericarditis, pleuresfa, traqueotomfa, lesion penetrante del sistema nervioso central, sfndrome mialgico eosinofilo, restenosis vascular, enfermedad veno-oclusiva, pancreatitis y artropatfa psoriasica.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos ademas son utiles para promover la reepitelizacion en enfermedades y afecciones, tales como ulceras venosas, ulceras isquemicas (llagas por presion), ulceras diabeticas, sitios de injertos, sitios donantes de injertos, abrasiones y quemaduras, enfermedades del epitelio bronquial, tales como el asma, SDRA, enfermedades del epitelio intestinal, tales como la mucositis asociada con el tratamiento citotoxico, ulceras esofagicas (enfermedad de reflujo), ulceras de estomago, lesiones del intestino delgado y del intestino grueso (enfermedad inflamatoria intestinal).
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos tambien se pueden usar para promover la proliferacion de celulas endoteliales, por ejemplo, en la estabilizacion de las placas ateroscleroticas, la promocion de la cicatrizacion de las anastomosis vasculares, o para inhibir la proliferacion de las celulas del musculo liso, tal como en la enfermedad arterial, la restenosis y el asma.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos son utiles para mejorar la respuesta inmunitaria a las infecciones mediadas por macrofagos. Tambien son utiles para reducir la inmunosupresion causada, por ejemplo, por tumores, SIDA o enfermedades granulomatosas. Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos son utiles para tratar enfermedades hiperproliferativas, tales como canceres, incluyendo, pero no limitados a, mama, prostata, ovario, estomago, rinon, pancreatico, colorrectal, de piel, de pulmon, canceres de cuello uterino y de vejiga, glioma, mesotelioma, asf como varias leucemias y sarcomas, tales como el sarcoma de Kaposi, y son utiles para tratar o prevenir las recurrencias o metastasis de dichos tumores. Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos tambien son utiles para inhibir la metastasis mediada por ciclosporina.
En el contexto de la terapia del cancer, “tratamiento” incluye cualquier intervencion medica que da como resultado la ralentizacion del crecimiento del tumor o la reduccion en las metastasis tumorales, asf como la remision parcial del cancer con objeto de prolongar la esperanza de vida de un paciente.
Los metodos de tratamiento comprenden la administracion de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo o composiciones farmaceuticas que comprenden el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se puede usar en la fabricacion de un medicamento para su administracion. Por ejemplo, un metodo de fabricacion de un medicamento o composicion farmaceutica comprende formular un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo con un excipiente farmaceuticamente aceptable. Una composicion se puede administrar sola o combinada con otros tratamientos, ya sea simultaneamente o secuencialmente dependiendo de la afeccion que se vaya a tratar.
La administracion se lleva a cabo preferiblemente en una “cantidad terapeuticamente eficaz” suficiente para mostrar un beneficio a un paciente. Dicho beneficio puede ser al menos la mejorfa de al menos un sfntoma de una enfermedad o afeccion concreta. La cantidad real administrada, y la velocidad y el curso temporal de la administracion, dependeran de la naturaleza y la gravedad de la enfermedad o afeccion que este siendo tratada. La prescripcion del tratamiento, por ejemplo las decisiones sobre la dosificacion, etc., se puede determinar basandose en estudios preclfnicos y clfnicos cuyo diseno esta dentro del nivel del experto en la tecnica.
La dosis precisa dependera de numerosos factores, incluyendo si el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo es para el diagnostico o para el tratamiento, el tamano y la ubicacion del area a tratar, la naturaleza precisa del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento Fab o scFv, y la naturaleza de cualquier marca detectable u otra molecula unida al anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. Una dosis tfpica de un anticuerpo completo, por ejemplo, puede estar en el intervalo de 100 pg a 1 g para aplicaciones sistemicas, y 1 pg a 1 mg para aplicaciones topicas. La dosis para un solo tratamiento de un paciente adulto puede ser ajustada proporcionalmente para ninos y bebes, y tambien se puede ajustar a otros formatos de anticuerpo en proporcion al peso molecular y la actividad. Los tratamientos se pueden repetir a diario, dos veces por semana, semanalmente, mensualmente u otros intervalos, a discrecion del medico. El tratamiento puede ser periodico, y el perfodo entre las administraciones es de aproximadamente dos semanas o mas, preferiblemente aproximadamente tres semanas o mas, mas preferiblemente aproximadamente cuatro semanas o mas, o aproximadamente una vez al mes.
Se espera que niveles de dosis de aproximadamente 0,1, 0,3, 1, 3, 10, o 15 mg por kg de peso corporal del paciente sean utiles y seguros. Por ejemplo, 0,5 - 5 mg/kg en rata y raton ha sido una dosis eficaz en un entorno agudo. Por lo tanto, para la dosificacion a largo plazo, se pueden administrar de 0,3 - 10 mg/kg a los seres humanos, basandose en una vida media esperada de 21 dfas. Las dosis pueden ser suficientes para la eficacia, a la vez que suficientemente bajas como para facilitar la administracion optima. Por ejemplo, una dosis de menos de 50 mg facilita la administracion subcutanea. La administracion intravenosa se puede utilizar como ruta de liberacion para enfermedades graves, donde pueden ser necesarias dosis altas y largos intervalos de tiempo de dosificacion. La inyeccion subcutanea puede aumentar el potencial de respuesta inmunitaria a un producto. La administracion local para la enfermedad localizada puede reducir la cantidad de producto administrado y aumentar la concentracion en el sitio de accion, lo que puede mejorar la seguridad.
Se pueden administrar un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo por medio de inyeccion, por ejemplo, por via subcutanea, intravenosa, intracavitaria (por ejemplo, despues de la reseccion del tumor), intralesional, intraperitoneal, o intramuscular. Tambien se pueden administrar un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del
mismo por medio de inhalacion o por via topica (por ejemplo, intraocular, intranasal, rectal, en las heridas, en la piel), o por via oral.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos por lo general se administraran en forma de una composicion farmaceutica, que puede comprender al menos un componente ademas del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. Por lo tanto, composiciones farmaceuticas pueden comprender excipientes, portadores, amortiguadores, estabilizadores, u otros materiales bien conocidos por los expertos en la tecnica, farmaceuticamente aceptables. Tales materiales no deben ser toxicos y no deben interferir en la eficacia del ingrediente activo. Tales materiales podrfan incluir, por ejemplo, cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y agentes que retrasan la absorcion. Algunos ejemplos de portadores farmaceuticamente aceptables son agua, disolucion salina, disolucion salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asf como combinaciones de los mismos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composicion. Los ejemplos adicionales de sustancias farmaceuticamente aceptables son los agentes humectantes o las sustancias coadyuvantes, tales como agentes emulsionantes, conservantes o amortiguadores, que aumentan la vida util o la eficacia.
La naturaleza precisa del portador u otro material dependera de la ruta de administracion. Para la inyeccion intravenosa, o la inyeccion en el sitio de la afliccion, el ingrediente activo estara en forma de una disolucion acuosa parenteralmente aceptable que esta libre de pirogenos y tiene un pK, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Los expertos relevantes en la tecnica son bien capaces de preparar disoluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehfculos isotonicos tales como inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer, e inyeccion de Ringer con lactato anadido. Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, amortiguadores, antioxidantes y/u otros aditivos.
Un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se puede formular en formas lfquidas, semisolidas o solidas, tales como disoluciones lfquidas (por ejemplo, disoluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administracion, de la aplicacion terapeutica, de las propiedades ffsico-qufmicas de la molecula, y de la ruta de suministro. Las formulaciones pueden incluir excipientes, o combinaciones de excipientes, por ejemplo: azucares, aminoacidos y agentes tensioactivos. Las formulaciones lfquidas pueden incluir una amplia gama de concentraciones de anticuerpo y pH. Las formulaciones solidas se pueden producir mediante liofilizacion, secado por pulverizacion, o secado mediante tecnologfa de fluidos supercrfticos, por ejemplo.
Las composiciones terapeuticas se pueden formular en forma de una disolucion, microemulsion, dispersion, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentracion de farmaco. Las disoluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo a un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersion alcalino y otros ingredientes de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son el secado a vacfo y la liofilizacion que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolucion previamente filtrada en condiciones esteriles del mismo. La fluidez apropiada de una disolucion se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula de una dispersion, o mediante el uso de tensioactivos. Se puede facilitar una absorcion prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato de gelatina.
En ciertas realizaciones, el compuesto activo se puede preparar con un portador que protegera el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo frente a la liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos, y sistemas de liberacion microencapsulados. Se pueden utilizar polfmeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhfdridos, poli(acido glicolico), colageno, poliortoesteres, y poli(acido lactico). Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la tecnica.
Un metodo de utilizacion de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo puede comprender causar o permitir la union a TGFp. Tal union puede tener lugar in vivo, por ejemplo, despues de la administracion de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo a un paciente, o puede tener lugar in vitro, por ejemplo, en ELISA, transferencia Western, inmunocitoqufmica, inmunoprecipitacion, cromatograffa de afinidad, o ensayos basados en celulas, o metodos terapeuticos ex vivo, por ejemplo, metodos en los que se ponen en contacto celulas o fluidos corporales ex vivo con un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo y luego se administran a un paciente.
Se proporciona un kit que comprende un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se puede marcar para permitir la determinacion de su reactividad en una muestra. Los kits pueden ser empleados en ensayo de diagnostico, por ejemplo. Un kit puede contener instrucciones para el uso de los componentes. Se pueden incluir en el kit materiales coadyuvantes para ayudar en o para permitir la realizacion de un procedimiento de semejante metodo.
La reactividad de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo en una muestra se puede determinar por medio de cualquier metodo apropiado, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA). El antfgeno marcado radiactivamente se puede mezclar con el antfgeno no marcado (la muestra de ensayo) y se deja que se una al anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. El antfgeno unido se separa ffsicamente del antfgeno no unido y se determina la cantidad de antfgeno radiactivo unido al anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo. Tambien se puede utilizar un ensayo de union competitiva con antfgeno no radiactivo, utilizando un antfgeno o un analogo ligado a una molecula informadora. La molecula informadora puede ser un fluorocromo, fosforo, o colorante. Los fluorocromos adecuados incluyen fluorescefna, rodamina, ficoeritrina y Rojo Texas. Los colorantes cromogenicos adecuados incluyen diaminobencidina.
Otros informadores incluyen partfculas coloidales macromoleculares o materiales particulados tales como cuentas de latex que estan coloreadas, magneticas o paramagneticas, y agentes biologicamente o qufmicamente activos que pueden causar directamente o indirectamente senales detectables para ser observadas visualmente, detectadas electronicamente o registradas de otro modo. Estas moleculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones que desarrollan o cambian los colores o causan cambios en las propiedades electricas, por ejemplo. Pueden ser excitables molecularmente, de tal manera que las transiciones electronicas entre estados de energfa dan como resultado absorciones o emisiones espectrales caracterfsticas. Pueden incluir entidades qufmicas utilizadas junto con biosensores. Se pueden emplear sistemas de deteccion de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina. Las senales generadas por los productos conjugados de anticuerpo- informador se pueden utilizar para obtener datos absolutos o relativos cuantificables de la union del anticuerpo relevante en las muestras.
La presente invencion tambien proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo para medir los niveles de antfgeno en un ensayo de competicion. Una posibilidad es la conexion de una molecula informadora al anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de manera que se produzca un cambio ffsico u optico en la union. La molecula informadora puede generar directa o indirectamente senales detectables, y preferiblemente medibles. La union de las moleculas informadoras puede ser directamente o indirectamente, covalentemente, por ejemplo, mediante un enlace peptfdico, o no covalentemente. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo y una protefna informadora pueden estar unidos por un enlace peptfdico y ser expresados de forma recombinante como una protefna de fusion.
Otros aspectos y realizaciones de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica a la luz de la presente descripcion, incluyendo la siguiente ilustracion experimental.
EJEMPLO 1
Se puede preparar un Fv de cadena sencilla (scFv) anti-TGFp de acuerdo con el siguiente ejemplo no limitante descrito en el Ejemplo 1 de la Patente U.S. n° 7.723.486. Las potencias de neutralizacion para TGFpi, TGFp2, y/o TGFp3 se pueden aumentar utilizando la mutagenesis y/o tecnicas combinatorias. El scFv con potencias mejoradas para TG Fpi, TGFp2, y/o TGFp3 puede ser generado por medio de seleccion y escrutinio de bibliotecas de anticuerpos en fagos tal como se describe en el Ejemplo 1 de la Patente U.S. n° 7.723.486. Los scFv generados en ese ejemplo se compararon con 1D11.16, que se describe en la Patente U.S. n° 7.723.486, en el ensayo de proliferacion de MLEC.
En el Ejemplo 1 de la Patente U.S. n° 7.723.486, se encontro que lfneas germinales concretas estaban altamente representadas en la poblacion de scFv neutralizadores de TGFp de alta potencia. Estas fueron DP-10/1-69 y DP-88/1-e (ambas miembros de la familia de la lfnea germinal de VH1) para la cadena pesada, y DPK22/A27 (familia Vk3) para la cadena ligera. Estas lfneas germinales parecen proporcionar un marco estructural especialmente adecuado para los anticuerpos pan-neutralizadores de TGFp de alta potencia. Los scFv de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 mostraron potencias que se aproximaban a o superaban las de 1D11.16 en las tres isoformas de TGFp en el ensayo de proliferacion de MLEC.
Las secuencias de aminoacidos derivadas de los segmentos genicos de VH y VL de PET1073G12, PET1074B9, y PET1287A10 se alinearon con las secuencias de lfneas germinales humanas conocidas en la base de datos VBASE (Tomlinson, directorio de secuencias V-BASE, MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido, en el protocolo de transferencia de hipertexto vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk (1997)), y la lfnea germinal humana mas cercana fue identificada por la similitud de secuencia. El gen de la lfnea germinal humana mas cercano para el segmento genico de VH de PET1073G12 y PET1074B9 fue identificado como DP-10/1-69 (familia de la lfnea germinal de VH1), y el gen de la lfnea germinal humana mas cercano para el segmento genico de VH de PET1287A10 fue identificado como DP-88/1-e (familia de la lfnea germinal de VH1). El gen de la lfnea germinal humana mas cercano para el segmento genico de VL de PET1073G12, PET1074B9, y PET1287A10 fue identificado como DPK22/A27 (familia de la lfnea germinal de Vk3). Se utilizo la mutagenesis dirigida al sitio para sustituir los restos del marco que diferfan de la lfnea germinal para el resto de la lfnea germinal, siempre que tales cambios no produjeran una perdida de potencia en el ensayo de proliferacion de MLEC de mas de tres veces en el anticuerpo resultante en cualquier isoforma de TGFp. Si se observaba semejante perdida de potencia, el aminoacido que no era del marco de la lfnea germinal se mantuvo en el anticuerpo final.
En PET1073G12 convertido a la lfnea germinal y PET1074B9 convertido a la lfnea germinal, todos los restos del marco son de la lfnea germinal a excepcion de dos restos de VH y un resto de VL. Las secuencias de aminoacidos para
PET1073G12 convertido a la linea germinal se describen en SEQ ID NO: 2 para VH y en SEQ ID NO: 7 para VL de la Patente U.S. n° 7.723.486. Las secuencias de aminoacidos para PET1074B9 convertido a la linea germinal se describen en SEQ ID NO: 12 para VH y en SEQ ID NO: 17 para VL de la Patente U.S. n° 7.723.486. En PET1287A10 convertido a la linea germinal, todos los restos del marco de VH y VL son de la linea germinal. Las secuencias de aminoacidos para PET1287A10 convertido a la linea germinal se describen en SEQ ID NO: 22 para VH y en SEQ ID NO: 27 para VL de la Patente U.S. n° 7.723.486.
EJEMPLO 2A
La potencia de neutralizacion de los anticuerpos anti-TGFp o fragmentos de union a antfgeno del mismo se puede analizar utilizando el ensayo de proliferacion de MLEC dependiente de TGFp descrito en el Ejemplo 4 de la Patente U.S. n° 7.723.486. El ensayo de proliferacion de MLEC se basa en un ensayo descrito por Danielpour et al., J. Cell. Physiol., 138:79-86 (1989). Este ensayo trabaja sobre el principio de que TGFp1, TGFp2, o TGFp3 anadidos a celulas epiteliales de pulmon de vison inhiben la proliferacion celular inducida por suero. Los anticuerpos se analizaron para determinar la neutralizacion de TGFp1, TGFp2, o TGFp3 que da como resultado la restauracion de la proliferacion celular. La proliferacion se midio mediante la absorcion de [3H]-timidina. La potencia del anticuerpo se definio como la concentracion del anticuerpo que neutralizaba una sola concentracion de TGFp1, TGFp2, o TGFp3 a un nivel de 50% (CI50) en nM.
Protocolo del ensayo de proliferacion de MLEC: la linea MLEC se obtuvo de la American Type Culture Collection (Num. de Cat. CCL-64.). Las celulas se hicieron crecer en Medio Esencial Mfnimo (MEM, Gibco) que contenfa suero bovino fetal al 10% (FBS) (Gibco), penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco) y MEM con disolucion de aminoacidos no esenciales al 1% (Gibco). Las celulas confluentes de los matraces T-175 se disociaron del matraz, se centrifugaron, se lavaron y se resuspendieron en medio de ensayo de MLEC que se elaboro con MEM que contenfa FBS al 1%, penicilina/estreptomicina al 1% y disolucion de aminoacidos no esenciales en MEM al 1%. Una alfcuota de las celulas se marco a continuacion con azul de tripano, se contaron en un hemocitometro, y la disolucion de partida celular se diluyo a 1,75 x 105 celulas por ml utilizando medio de ensayo. 100 pl de esta suspension se anadieron a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante 3 a 5 horas.
Preparacion de disoluciones de TGFp/anticuerpo: las disoluciones de trabajo de TGFp1, TGFp2 o TGFp3 a 6 ng/ml (seis veces la concentracion final del ensayo) y los anticuerpos (incluyendo controles tales como 1D11.16) a tres veces la concentracion final de ensayo maxima se prepararon en medio de ensayo MLEC. La concentracion final de TGFp en el ensayo (1 ng/ml o 40 pM) correspondio a la concentracion que inducfa una inhibicion de aproximadamente 80% de la proliferacion celular en comparacion con el control sin TGFp (es decir, valor CE80).
Entorno de la placa de dilucion: se titularon las muestras de anticuerpos de ensayo y de control en etapas de dilucion a la tercera parte en medio de ensayo MLEC y se incubaron en presencia y ausencia de TGFp1, TGFp2 o TGFp3. Todos los controles relevantes se incluyeron en cada experimento: el ensayo del anticuerpo 1D11.16 y/o de referencia segun sea apropiado y la realizacion de las titulaciones de TGFp1, TGFp2, o TGFp3. Las placas completadas se dejaron en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada durante 1 hora ± 15 minutos.
Adicion de disoluciones de TGFp/anticuerpo a las celulas cultivadas en placa: despues de los tiempos de incubacion apropiados, se transfirieron 100 pl de cada pocillo de las placas de dilucion a MLEC cultivadas en placa y las placas se devolvieron a la incubadora durante 44 ± 2 horas. Se anadieron 25 pl de [3H]-timidina de 10 pCi/ml diluida en disolucion salina amortiguada con fosfato (PBS) a cada uno de los pocillos (0,25 pCi/pocillo). Las placas se devolvieron a la incubadora durante 4 horas ± 30 minutos.
Recoleccion de celulas: se anadieron 100 pl de tripsina-EDTA (0,25%, Gibco) a cada pocillo, las placas se incubaron durante 10 minutos en la incubadora, y las celulas se recogieron usando un cosechador celular de 96 pocillos Tomtec o Packard.
Acumulacion de datos y analisis: los datos de las celulas recolectadas se leyeron usando un lector de placas beta (TopCount, Packard). Se analizaron los datos para obtener la CI50 y los valores de desviacion tfpica. Los valores de CI50 se obtuvieron utilizando el soporte logico Prism 2.0 (GraphPad).
Resultados: Las IgG4 PET1073G12, PET1074B9, y PET1287A10 purificadas convertidas a la linea germinal se sometieron a ensayo junto con 1D11.16 en el ensayo de proliferacion de MLEC. Las IgG4 se produjeron como se describe en el Ejemplo 3 de la Patente U.S. n° 7.723.486. Los datos de la CI50 media para las IgG4 de PET1073G12 y PET1287A10 demostraron que estos anticuerpos tienen potencias similares o cercanas a las de 1D11.16 sobre TGFp1, TGFp2 y TGFp3.
Los datos de la CI50 media sugieren que la IgG4 de PET1074B9 es mas potente sobre TGFp1, aunque no se obtuvo una curva completa de respuesta a la dosis en el ensayo MLEC. Como comparacion, 1D11.16 mostro 12% de neutralizacion en TGFp1 a una concentracion de 91 pM, y PET1074B9 mostro una neutralizacion de 78% a una concentracion similar de 92 pM.
EJEMPLO 2B
Adicionalmente, se midio la afinidad de union a las isoformas de TGFp del anticuerpo GC1008 usando un aparato Biacore® 3000 (GE Healthcare). Se diluyeron TGFp1 y TGFp2, de produccion propia, a ~ 1 pg/ml en acetato 10 mM, pH 4,5, y TGFp3 (R & D Systems) se diluyo a ~ 2 pg/ml en acetato 10 mM, pH 4,0. Las celdas de flujo 2, 3, y 4 de un chip sensor CM5 se inmovilizaron covalentemente con 50 a 100 UR de TGFp1, TGFp2, y TGFp3, respectivamente, utilizando el kit de acoplamiento de amina convencional de GE Healthcare. La celda de flujo 1 se utilizo como una superficie de control. Para el ensayo de union cinetica, GC1008 se diluyo seriadamente 1:3 de 33,3 nM a 1,2 nM en amortiguador HBS-EP y se inyecto por triplicado a las cuatro celdas de flujo durante 5 min., seguido de 5 min. de disociacion en amortiguador a un caudal de 30 pl/min. La superficie se regenero con dos inyecciones de 30 s de HCl 40 mM a 75 pl/min. Los sensogramas se ajustaron utilizando un modelo de union 1:1 despues de la sustraccion del amortiguador y el cambio en el fndice de refraccion de la celda de flujo de control con BIA Evaluation Software Kit (GE Healthcare). Las Kd mostradas en la TABLA 6 son un promedio de mas de 25 ensayos independientes.
TABLA 6
EJEMPLO 3
La eficacia biologica de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos para el tratamiento de la enfermedad renal cronica y otras indicaciones clfnicas se puede determinar usando el modelo de obstruccion ureteral unilateral (OUU) de rata expuesto en el Ejemplo 7 de la Patente U.S. n° 7.723.486. Ratas Sprague Dawley (Taconic Farms, Germantown, NY) adultas que pesaban de 250- 280 gramos (aproximadamente 6 semanas) fueron alojadas en un entorno con aire, temperatura y luz controlados. Las ratas sometidas a OUU recibieron una pequena incision abdominal en la lfnea media ventral para exponer el rinon izquierdo y el ureter superior. El ureter se ligo a nivel del polo inferior del rinon con sutura de seda y una segunda vez aproximadamente 0,2 cm por debajo de la primera. Las ratas con cirugfa simulada recibieron el mismo protocolo quirurgico, pero sin ligadura ureteral.
Las ratas obstruidas fueron tratadas con PBS, un anticuerpo monoclonal murino pan-neutralizador (1D11), un anticuerpo de control de isotipo coincidente (13C4), o un anticuerpo monoclonal para TGF-p pan-neutralizador humano como se describe en la Patente U.S. n° 7.723.486. Los anticuerpos se administraron a las ratas por via intraperitoneal comenzando el dfa de la ligadura ureteral durante un transcurso de 3 semanas. Se administraron 13C4 y 1D11 a 5 mg/kg (3 veces/semana), y el anticuerpo pan-neutralizador humano se administro a las ratas a 5 mg/kg (cada 5 dfas). Al final de 3 semanas, se sacrificaron las ratas, los rinones fueron perfundidos con PBS durante 3 minutos, y los rinones perfundidos fueron cosechados para el analisis del ARNm, la determinacion del contenido de colageno, y el examen histologico.
Para evaluar el grado de fibrosis del tejido, se determino el contenido total de colageno del tejido mediante analisis bioqufmico de hidroxiprolina en extractos hidrolizados de acuerdo con Kivirikko et al. Tambien se llevo a cabo un ensayo de colageno Sircol para determinar el contenido total de colageno. El ensayo de colageno Sircol mide la cantidad de colagenos solubles en acido/pepsina totales basandose en la union especifica de colorante rojo Sirius con la cadena lateral del colageno tisular.
Las ratas UUO tratadas con el anticuerpo monoclonal pan-neutralizador humano mostraron una reduccion de 43,4% en el contenido de hidroxiprolina (1,98 ± 0,26 pg/mg de tejido seco) cuando se comparo con el grupo tratado con PBS (3,5 ± 0,3 pg/mg de tejido seco, p <0,05). La disminucion en la fibrosis renal fue apoyada ademas por la reduccion de colageno solubilizado total en los rinones afectados, segun lo determinado por un ensayo basado en colorante rojo Sirius (simulado: 18,5 ± 2,6, PBS: 69,3 ± 3,8, y anticuerpo monoclonal pan-neutralizador humano: 35,6 ± 5,2 pg/100 mg de tejido, p <0,05 vs. PBS).
Tambien se evaluo la capacidad de un anticuerpo monoclonal anti-TGF-p pan-neutralizador humano para reducir la fibrosis del tejido por medio de examen inmunohistoqufmico. En los animales de control, la obstruccion ureteral durante tres semanas causo la interrupcion generalizada de la arquitectura tubular renal con distension marcada, atrofia celular y necrosis/apoptosis, inflamacion de los tejidos y expansion tubulointersticial con fibrosis evidente. Hubo poca evidencia de dano glomerular. Las ratas tratadas con 1D11 o anticuerpo monoclonal pan-neutralizador humano, por otra parte, mostraron preservacion de la arquitectura renal a juzgar por la dilatacion y la desorganizacion tubulares atenuadas, la reduccion de productos infiltrados inflamatorios (celularidad) y la disminucion de la expansion y la fibrosis tubulointersticiales.
Tambien se midio el efecto del tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-TGF-p pan-neutralizador humano sobre la expresion de genes regulados por TGF-p. El ARNm de TGF-P1 se redujo en los animales UOO tratados con anticuerpo monoclonal pan-neutralizador humano en comparacion con los animales tratados con PBS o tratados con anticuerpo de control 13C4. Tambien se observo una disminucion significativa en los niveles de ARNm de colageno de tipo III en los rinones obstruidos tratados con los anticuerpos anti-TGF-p humano y murino en comparacion con los tratados con PBS o 13C4 que indicaba una disminucion en la sfntesis de colageno.
La eficacia de un anticuerpo monoclonal anti-TGF-p pan-neutralizador humano para reducir la sfntesis de TGF-p auto-inducida se confirmo ademas mediante la medicion de la protefna TGF-P1 renal total. En comparacion con los animales con cirugfa simulada, los rinones obstruidos exhibieron un marcado aumento en el TGF-P1 tisular total. Las ratas obstruidas con dosis de anticuerpo monoclonal pan-neutralizador humano, sin embargo, mostraron una reduccion de 75% de los niveles de TGF-P1 tisular, por debajo de los niveles registrados para los dos grupos de control. En comparacion, el anticuerpo murino 1D11 redujo los niveles de TGF-P1 tisular en 45%, en comparacion con los grupos de control. Los resultados anteriormente descritos demuestran que la neutralizacion de TGF-P con un anticuerpo monoclonal anti-TGF-P pan-neutralizador humano interrumpio el bucle de la regulacion autocrina de TGF-P concomitante con la prevencion de la produccion de TGF-P1 y la expresion de ARNm de colageno III.
Se determino adicionalmente el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-TGF-P pan-neutralizador humano sobre la expresion de la actina de musculo liso (a-SMA) como un indicador indirecto de la inhibicion de TGF-P. La expresion de la actina del musculo liso es un indicador de miofibroblastos activados, que estan asociados con la fibrosis del tejido y producen tejido conjuntivo fibroso. El TGF-P es un inductor de la activacion y la transformacion fenotfpica de los fibroblastos del estroma y las celulas epiteliales residentes en celulas miofibroblasticas. La protefna a-SMA se detecto por medio de ensayo de transferencia Western convencional.
Cuando se compararon con los animales con cirugfa simulada, las ratas con rinones obstruidos mostraron una regulacion al alza drastica en la protefna a-SMA medida por la transferencia Western de productos homogeneizados de tejido. Las ratas obstruidas que recibieron dosis de anticuerpo monoclonal anti-TGF-P pan-neutralizador humano mostraron una reduccion significativa (75% en comparacion con los controles de PBS) en la expresion medible de a-SMA.
Estos resultados demuestran la eficacia de un anticuerpo monoclonal anti-TGF-P pan-neutralizador humano en la reduccion del deposito de colageno en los rinones fibroticos, indicando claramente que el anticuerpo es un potente inhibidor de la produccion y el deposito de colageno renal en este modelo de lesion renal grave y fibrosis tubulointersticial. Debido a que el proceso de fibrosis tisular en organos tales como el pulmon, el hfgado o el rinon posee mecanismos o vfas comunes, el experto en la tecnica apreciara que el anticuerpo es util en el tratamiento de enfermedades renales cronicas, asf como otras indicaciones clfnicas caracterizadas por fibrosis patogenica.
EJEMPLO 4
La estructura del complejo GC1008(Fab)-TGFP2 se determino como sigue. Se expreso transitoriamente GC1008(Fab) recombinante con una etiqueta His6 C-terminal (SEQ ID NO: 11) en celulas HEK293FS y se purifico sobre resina de afinidad de nfquel-NTA, seguido de cromatograffa de exclusion por tamano. GC1008(Fab) purificado se mezclo con homodfmero de TGFP2 y el complejo se aislo usando la cromatograffa de exclusion por tamano. El complejo de GC1008(Fab)-TGFP2 se cristalizo en PEG400 al 35%, acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico 100 mM (pH 6,0) a 20°C, y adicionalmente se optimizo mediante siembra y optimizacion del pH. El conjunto de datos final se recogio a 2,83 A en el grupo espacial P 2 ^ 2 , y la estructura se resolvio utilizando el reemplazo molecular con la estructura GC1008(Fab)-TGFP3 descrito por Grutter (2008). La estructura del complejo de GC1008(Fab)-TGFP2 se representa en la FIG. 1.
EJEMPLO 5
La estructura del complejo de GC1009(scFv)-TGFP1 se determino como sigue. GC1009(scFv) recombinante con una etiqueta His6 C-terminal (SEQ ID NO: 11) se expreso en exceso en E. coli y se purifico sobre una resina de afinidad de nfquel-NTA, seguido de cromatograffa de exclusion por tamano. GC1009(scFv) purificado se mezclo con homodfmero de TGFP1, y el complejo se aislo usando cromatograffa de exclusion por tamano. El complejo de GC1009(scFv)-TGFP1 se cristalizo en PEG 4K al 16%, citrato 0,1 M (pH 5,0), 2-propanol al 4% a 21°C. La estructura se determino a 3,00 A en el grupo espacial C2, y la estructura se resolvio utilizando el reemplazo molecular con la estructura GC1008(Fab)-TGFP2 determinada en el EJEMPLO 4. La estructura del complejo de GC1009(scFv)-TGFP1 se representa en la FIG. 2.
EJEMPLO 6
Los plasmidos que codifican cualquiera de la cadena pesada o la cadena ligera de GC1008 fueron utilizados como molde en las reacciones de mutagenesis basadas en PCR. Se realizaron mutaciones en el ADN codificante para crear 155 sustituciones de aminoacidos individuales de la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada codificada y una unica sustitucion de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera codificada. Se utilizo un kit
QuikChange® Lightning Site-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies, Santa Clara CA) segun las instrucciones del fabricante para crear mutaciones de ADN utilizando un conjunto de cebadores directos e inversos, ya sean disenados para un aminoacido especffico o para los 20 aminoacidos con un codon degenerado (NNK). Despues de la confirmacion de la secuenciacion, el ADN mutante identificado fue emparejado con ADN de cadena pesada o ligera de tipo salvaje para la transfeccion en una suspension de celulas hospedantes Expi293F™ (Life Techonologies Corp., Grand Island, NY). A los 4 dfas de la transfeccion, el medio acondicionado (1 ml) se recogio y se purifico usando una columna PhyTip® con Protefna A de 1 ml (PhyNexus, Inc., San Jose, CA) y una pipeta de 12 canales Purespeed™ (Rainin Instrument LLC, Oakland, CA). Se analizaron las muestras de anticuerpo variante purificadas por duplicado en un Biacore® 3000 (GE Healthcare) a concentraciones de 50 nM, usando superficies con TGFp1,2, y 3 inmovilizados a un nivel de 100 UR. La velocidad de disociacion (kd) de las variantes se dividio entre la kd del control de tipo salvaje para obtener el factor de cambio en la kd . Se indico un aumento en la afinidad si (kdvar/kdwt) era de menos de 1, y se indico una reduccion, si el valor era mayor que 1. Se genero un mapa termico para visualizar los resultados. Las variantes que perdieron por completo la afinidad por TGFp se muestran en negro sin numeros. Los resultados se muestran en las TABLAS 7A, 7B y 7C.
TABLA 7A
Claims (17)
1. Un anticuerpo humano aislado o fragmento de union a antfgeno del mismo que se une a y neutraliza TG Fpi, TGFpi y TGFp3 humanos, que comprende
un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 con una sustitucion seleccionada del grupo que consiste en S30A, S30H, S30W, E74A, E74C, E74D, E74F, E74G, E74H, E74L, E74P, E74Q, E74R, E74S, E74T, E74W, y E74Y; y
un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo humano comprende ademas una region constante de IgG humana.
3. El anticuerpo de la reivindicacion 2, en el que la region constante de IgG es una region constante de IgG4 humana.
4. El anticuerpo de la reivindicacion 3, en el que el anticuerpo comprende ademas una region constante k humana.
5. El anticuerpo de la reivindicacion 4, en el que la region constante de IgG4 humana comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3, y la region constante k humana comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4.
6. El fragmento de union a antfgeno de la reivindicacion 1, en el que el fragmento de union a antfgeno comprende un Fab, Fab', F(ab')2 , scFv, o di-scFv.
7. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humano o fragmento de union a antfgeno del mismo que se une a y neutraliza TGFp1, TGFp2 y TGFp3 humanos, en el que el anticuerpo o fragmento comprende
un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 con una sustitucion seleccionada del grupo que consiste en S30A, S30H, S30W, E74A, E74C, E74D, E74F, E74G, E74H, E74L, E74P, E74Q, E74R, E74S, E74T, E74W, y E74Y; y
un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
9. Un vector que comprende el acido nucleico aislado de la reivindicacion 8.
10. Una celula hospedante que comprende el vector de la reivindicacion 9.
11. Un metodo para obtener el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende
proporcionar una celula hospedante que comprende secuencias nucleotfdicas que codifican la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno, y
cultivar la celula hospedante en condiciones que permitan la expresion de las secuencias nucleotfdicas.
12. Un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de un paciente que necesita la inhibicion de uno o mas de TGFp1, TGFp1 y TGFp3.
13. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun la reivindicacion 12, en el que el paciente tiene una enfermedad fibrotica, cancer, o una enfermedad mediada inmunitariamente.
14. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun la reivindicacion 12, en el que el paciente tiene insuficiencia renal.
15. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun la reivindicacion 12, en el que el paciente tiene glomeruloesclerosis segmentaria y focal.
16. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun la reivindicacion 12, en el que el paciente tiene fibrosis pulmonar idiopatica.
17. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun la reivindicacion 12, en el que el paciente tiene esclerosis sistemica.
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