ES2927297T3 - Anticuerpos IgG modificados que se unen al factor de crecimiento transformante-beta1 con alta afinidad, avidez y especificidad - Google Patents

Anticuerpos IgG modificados que se unen al factor de crecimiento transformante-beta1 con alta afinidad, avidez y especificidad Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo IgG modificado se une y neutraliza el TGFß1 de forma selectiva y con gran afinidad y avidez. El anticuerpo IgG modificado comprende cuatro cadenas polipeptídicas y puede comprender modificaciones en las regiones del codo de las cadenas polipeptídicas. El anticuerpo IgG modificado puede comprender los mismos dominios VH y VL o regiones CDR que metelimumab. El anticuerpo IgG modificado es útil en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos IgG modificados que se unen al factor de crecimiento transformante-p1 con alta afinidad, avidez y especificidad
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
Anticuerpos IgG modificados, que comprenden cada uno una primera, una segunda, una tercera y una cuarta cadena polipeptídica, que presentan alta afinidad y avidez por el factor de crecimiento transformante-p1 (TGFp1), pero no por TGFp2 o TGFp3. Se proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos IgG modificados y métodos de uso de los mismos para el tratamiento de enfermedades que implican actividad de TGFp1.
Muchas enfermedades graves están ligadas a disfunciones de la ruta de señalización inducida por TGFp. Por ejemplo, se cree que un nivel aumentado en el tejido de TGFp es un factor en el desarrollo de fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis miocárdica. Además, niveles locales en el tejido altos de TGFp pueden permitir el mantenimiento y progresión de algunos tipos de células cancerosas. La regulación por disminución de la señalización de TGFp, por lo tanto, puede reducir la viabilidad de dichas células tumorales.
Las isoformas de TGFp son moléculas homodiméricas de ~25 kDa con un entramado estructural similar en que dos monómeros se unen covalentemente mediante un puente disulfuro. Las isoformas de mamífero comparten una identidad de secuencia de un 70-82 %, pero tienen actividades no solapantes en el desarrollo vascular y la regulación de la función de los inmunocitos. Se ha informado de tres isoformas de TGFp en seres humanos: TGFp1, TGFp2 y TGFp3 (números de acceso a Swiss Prot P01137, P08112 y P10600, respectivamente). TGFp1 y TGFp3 desencadenan una reacción en cadena de señalización celular tras la unión a los dominios extracelulares de dos receptores transmembranarios, conocidos como receptores de TGFp de tipo I y II. TGFp2 puede unirse a los receptores de TGFp de tipo I y II, así como el receptor de TGFp de tipo III.
Anticuerpos que se unen a TGFp1, TGFp2 y TGFp3 humano se han ensayado para uso clínico. Por ejemplo, Grütter et al. divulgaron GC1008, un anticuerpo monoclonal IgG4 humano (Mab; es decir, GC1008) en desarrollo clínico para tratar neoplasias y enfermedades fibróticas. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 105(51): 20251-56 (2008). GC1008 es un anticuerpo neutralizante de TGFp "panespecífico", porque puede neutralizar las tres isoformas de TGFp humano. Se divulgan anticuerpos que neutralizan selectivamente TGFp1, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 6.492.497 y la patente de Estados Unidos n.° 7.151.169. Metelimumab, también conocido como CAT192 (IgG4), es un anticuerpo monoclonal IgG4 humano que neutraliza selectivamente TGF-p1. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.492.497. Metelimumab se ensayó para el tratamiento de esclerosis generalizada cutánea difusa, también conocida como esclerodermia, pero demostró eficacia insuficiente. El documento WO 00/66631 divulga un anticuerpo anti-TGF-p1 (SL15A) que comprende cuatro cadenas polipeptídicas (2 cadenas pesadas y 2 ligeras), en el que el dominio VH y el VL comprenden las siguientes CDR: SYGMH (HCDR1), VISYDGSIKYYADSVKG (HCDR2), TGEYSGYDTDPQYS (HCDR3), RASQGIGDDLG (LCDR1), GTSTLQS (LCDR2) y LQDSNYPLT (LCDR3). La secuencia de liga VL y CL, por lo tanto, es LEIKTVA, y la secuencia que liga VH y CH1 es TVSSAST.
Breve sumario de la invención
La presente divulgación proporciona una proteína de unión aislada que se une a TGFp1 de acuerdo con la reivindicación 1. Se proporcionan particularmente anticuerpos IgG modificados que se unen a TGFp1 que pueden unirse selectivamente y neutralizar TGFp1 humano. Los anticuerpos IgG modificados divulgados derivan de metelimumab. Los dominios VH y VL de los anticuerpos IgG modificados presentan una afinidad de unión y avidez por TGFp1 y capacidad neutralizante de TGFp1 similares a las de metelimumab. En muchos casos, los anticuerpos divulgados ofrecen afinidad, avidez y capacidad de neutralización mejoradas sobre metelimumab. Los anticuerpos IgG modificados contienen dos cadenas polipeptídicas que comprenden cada una un dominio VL ligado a un dominio CL, y dos cadenas polipeptídicas que comprenden cada una un dominio VH ligado a un dominio CH1, una región de bisagra y una Fc. Se divulgan aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención en las reivindicaciones adjuntas.
Los anticuerpos IgG modificados de la presente invención comprenden un dominio variable que puede unirse a TGFp1. Los anticuerpos IgG modificados divulgados pueden comprender una proteína de unión que presenta una Kd por TGFp1 humano al menos un 50 % menor que la Kd de la misma proteína de unión por TGFp2 humano, medida por resonancia de plasmones superficiales.
La primera y segunda cadena polipeptídica pueden tener la fórmula de, del extremo N al extremo C:
(dominio VL)-(conector1)-(dominio CL),
en la que el dominio VL comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera variable (LCDR1), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera variable (LCDR2) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera variable (LCDR3). Como alternativa, la tercera y cuarta cadena polipeptídicas tienen la fórmula de, del extremo N al extremo C:
(dominio VH)-(conector2)-(dominio CH1)-(bisagra)-(región Fc),
en la que el dominio VH comprende una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada variable (HCDR1), una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada variable (HCDR2) y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada variable (HCDR3).
Si están presentes, el conector1 y el conector2 pueden comprender un residuo aminoacídico o secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en G, GG, GGS, GGGS y GGGGS.
El dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
El dominio VL de la proteína de unión divulgada comprende las secuencias del dominio V k humano expuestas en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, cada polipéptido del dímero puede comprender el dominio VH expuesto en SEQ ID NO: 1 y el dominio Vk expuesto en SEQ ID NO: 3, que son los dominios VH y VL presentes en metelimumab, respectivamente.
La región Fc se conecta al dominio CH1 mediante una bisagra. La bisagra puede comprender secuencias de aminoácidos derivadas de una región de bisagra de IgG1 o IgG4 humana. Por ejemplo, la bisagra puede comprender la secuencia de aminoácidos PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO: 5), o una variante de la misma, que tiene hasta cinco modificaciones aminoacídicas. En una realización, la longitud de la bisagra puede variar de 1-15 aminoácidos.
Puede realizarse mutagénesis dirigida al sitio sobre las regiones de codo de Fab CAT192 para mejorar la afinidad de unión por TGFp1. Se inserta de uno a cinco aminoácidos (G, GG, GGS, GGGS y GGGGS) en la región de codo de la cadena ligera para aumentar la flexibilidad de la bisagra, que pueden requerirse para presentar un parátopo de unión funcional a partir de las dos cadenas. Los medios acondicionados de una transfección de Expi293 muestran buena expresión y mejora significativa en la unión a TGFp1 por Octet. Los mutantes se purifican mediante Ni-NTA y las altas afinidades de unión a TGFp se confirman usando Biacore. Los mutantes CAT192 con 1 a cinco aminoácidos insertados en la región de codo de LC vuelven a adquirir la unión de alta afinidad de scFv a TGFp1. Estos mutantes de inserción en el codo manipulados también conservan la selectividad de isoforma y pueden servir como antagonistas específicos de TGFp1.
El dominio VH puede contener una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada variable (HCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada variable (HCDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada variable (HCDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ iD NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 15.
El dominio VL puede contener una región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera variable (LCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera variable (LCDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera variable (LCDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
La molécula IgG de unión a TGFp1 preferiblemente se une selectivamente a TGFp1, pero no se une a TGFp2 o TGFp3 a un grado significativo.
En otra realización, se divulga un polinucleótido aislado que puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica los anticuerpos IgG modificados divulgados en este documento. El polinucleótido aislado puede ser un ADNc, un ADN recombinante o un ADN sintético. Una célula hospedadora puede comprender el ácido nucleico aislado. La célula hospedadora puede ser una célula humana, tal como una célula de riñón embrionario humano 293 (HEK293) y líneas celulares derivadas de la misma, o puede ser una célula de ovario de hámster chino (CHO). Un método de preparación de los anticuerpos IgG modificados puede incluir cultivar la célula hospedadora en condiciones adecuadas para producir los anticuerpos IgG modificados. Los anticuerpos IgG modificados pueden purificarse. El grado de pureza puede ser un 90 %, 95 %, 99 %, 99,5 % o más.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos IgG modificados de la presente invención pueden ser un elemento de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos IgG modificados. La composición puede comprender además uno o más componentes biológicamente activos, excipientes o diluyentes.
También se divulga un método de tratamiento de una enfermedad o afección resultante directa o indirectamente de la actividad de TGFp1 en un ser humano, que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos IgG modificados. La enfermedad o afección puede seleccionarse del grupo que consiste en una enfermedad fibrótica, cáncer o una enfermedad mediada por el sistema inmunitario, por ejemplo, esclerosis generalizada cutánea difusa, enfermedad del remodelado óseo, nefropatía y/o una combinación de las mismas. Los anticuerpos IgG modificados pueden usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en una enfermedad fibrótica, cáncer o una enfermedad mediada por el sistema inmunitario, por ejemplo, esclerosis generalizada cutánea difusa, enfermedad del remodelado óseo, nefropatía y/o una combinación de las mismas. El tratamiento de la enfermedad o trastorno puede comprender neutralizar TGFp1 o inhibir la señalización de TGFp1. El tratamiento de la enfermedad o trastorno puede comprender inhibir la producción de fibronectina mediada por TGFp1, la producción de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), la proliferación de células epiteliales, la proliferación de células endoteliales, la proliferación de células de músculo liso y/o la inmunosupresión. El tratamiento de la enfermedad o trastorno puede comprender aumentar la actividad de los linfocitos citolíticos naturales.
Breve descripción de las varias vistas de los dibujos
Los dibujos presentados en este documento son con fines ilustrativos y no deben usarse para limitar el alcance de la presente invención.
La figura 1 representa los resultados de un ensayo de unión a TGFp1 Biacore que mostró la pérdida de afinidad cuando el scFv (CAT191) se convertía en una molécula IgG4 de longitud completa (CAT192).
La figura 2 representa elementos estructurales de un scFv, un Fab, una molécula IgG y las regiones de codo que se manipularon para restablecer la afinidad.
La figura 3 muestra los resultados de un gel de SDS-PAGE de variantes de IgG purificadas con aminoácidos adicionales en las regiones de codo de la cadena pesada y ligera. La SDS-PAGE muestra la pureza de las variantes de IgG purificadas en condiciones reductoras y no reductoras.
La figura 4 muestra un ensayo de unión Biacore de variantes de IgG purificadas con aminoácidos adicionales en las regiones de codo de la cadena pesada y ligera. El resultado del ensayo Biacore demuestra la unión selectiva de isoforma y de alta afinidad por las variantes.
La figura 5 muestra un bioensayo celular A549 de variantes de IgG purificadas con aminoácidos adicionales en las regiones de codo de la cadena ligera. El ensayo de A549 compara los efectos inhibidores mediante diversas construcciones de anticuerpo sobre la producción de IL-11 estimulada por TGFp1, que muestra que las variantes manipuladas en el codo son muy potentes en este ensayo de potencia basado en células.
La figura 6 representa un ensayo Biacore de unión a TGFp1 que muestra que se vuelve a lograr unión de alta afinidad cuando se insertan aminoácidos adicionales en la región de codo tanto de la cadena pesada como de la ligera de Fab CAT192.
La figura 7 muestra los resultados de un análisis de fluorimetría diferencial de barrido (DSF) de la termoestabilidad de los mutantes de Fab CAT192.
La figura 8 muestra los resultados de un análisis de fluorimetría diferencial de barrido (DSF) de la termoestabilidad de los mutantes de IgG4 CAT192.
La figura 9 muestra las estructuras cristalinas resueltas para las variantes de Fab CAT192.
Descripción detallada de la invención
Los anticuerpos IgG modificados divulgados se unen a y neutralizan TGFp1 selectivamente y con alta afinidad y avidez. Los anticuerpos IgG modificados pueden estar compuestos de los mismos dominios VH y VL que en metelimumab. Los anticuerpos IgG modificados ventajosamente muestran mayor eficacia en neutralizar TGFp1 que cuando se usan los dominios variables en otros formatos.
Como se usa en este documento, un primer elemento "y/o" un segundo elemento significa una divulgación específica del primer o segundo elemento por separado, o el primer y segundo elemento en combinación. Las formas singulares "un/o", "una", y "el/la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario.
Un polinucleótido (o ácido nucleico) o proteína "aislada" se retira y/o altera de su forma natural usando tecnologías de ingeniería genética. Un ácido nucleico o proteína "purificada" puede ser sustancialmente pura, por ejemplo, al menos un 90 % pura, o en forma homogénea.
"Unión selectiva" o "que se une selectivamente" a TGFp1 humano, significa que la proteína de unión (por ejemplo, dímero de scFv-Fc) puede unirse a TGFp1 humano con una afinidad mayor que la unión a TGFp2 humano o TGFp3 humano, por ejemplo, con una constante de disociación con TGFp1 humano al menos un 50 % menor que su constante de disociación con TGFp2 humano o TGFp3 humano, medida por resonancia de plasmones superficiales.
Los dominios variables de los presentes anticuerpos IgG modificados pueden comprender regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las CDR divulgadas en la patente de Estados Unidos n.° 6.492.497 (por ejemplo, SEQ ID NO: 11-19 de la patente de Estados Unidos n.° 6.492.497). Las regiones CDR se enumeran a continuación:
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
Sorprendentemente, se revela un motivo de unión HCDR3 consenso, que tiene la secuencia:
En la que:
X1 puede ser cualquier aminoácido (preferiblemente E o F), o estar ausente,
X2 puede ser cualquier aminoácido (preferiblemente S, D o P), o estar ausente,
X3 puede ser cualquier aminoácido (preferiblemente G, P o A), o estar ausente,
X4 puede ser cualquier aminoácido (preferiblemente V, Q o S), o estar ausente,
X5 puede ser cualquier aminoácido (preferiblemente E, Y o P), o estar ausente,
X6 puede ser cualquier aminoácido (preferiblemente L, S o D), o estar ausente.
El dominio VH de cada una de la tercera y cuarta cadena polipeptídica comprende una HCDR1 que tiene la secuencia de
SEQ ID NO: 7, una HCDR2 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8 y una HCDR3 que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 15. Las secuencias de CDR pueden estar separadas en cualquier lugar de uno a cuatro regiones flanqueantes, en orden desde el extremo N: FW1 - CDR1 - FW2 - CDR2 - FW3 - CDR3 - FW4. Las regiones flanqueantes del dominio VH pueden seleccionarse de una secuencia de la línea germinal de la cadena pesada variable. Las secuencias de la región FW pueden seleccionarse de la misma secuencia de la línea germinal de la cadena pesada variable humana. Las regiones flanqueantes del dominio VL pueden seleccionarse de una secuencia de la línea germinal lambda o kappa variable, por ejemplo, de la misma secuencia de la línea germinal lambda o kappa variables humana. Actualmente, se conocen aproximadamente 40 secuencias de la línea germinal de la cadena pesada variable en la técnica, así como aproximadamente 40 secuencias de la línea germinal kappa variable y aproximadamente 30 secuencias de la línea germinal lambda variable, por ejemplo, Vh 3, Vk 1, Vh 1-69 y Vh 1-e.
Pueden generarse dominios VH o VL compuestos usando las secuencias de CDR divulgadas en este documento. Por ejemplo, pueden usarse estructuras cristalinas de los dominios VH o VL como guía para generar un dominio compuesto usando secuencias de CDR de un anticuerpo y usando las regiones FW de la línea germinal de otro anticuerpo. Pueden encontrarse más detalles en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20020099179; y Homes y Foote, J Immunol. 1 de marzo de 1997; 158(5) :2192-201.
Los presentes anticuerpos IgG modificados pueden estar compuestos de los mismos dominios VH y VL que en metelimumab, que tienen las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. El dominio VH puede remplazarse por el dominio VH que tiene las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 2; el dominio VL puede remplazarse por el dominio VL que tiene las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 4. Estos dominios VH y VL se divulgan en la patente de Estados Unidos n.° 6.492.497 (por ejemplo, SEQ ID NO: 4, 6, 8, y 10 de la patente de Estados Unidos n.° 6.492.497).
Un "dominio variable" (VD) se refiere a un dominio de unión hipervariable de una inmunoglobulina, o un dominio de unión a ligando de un receptor, implicado en la unión de antígeno/ligando como es sabido por los expertos en la materia. Los dominios variables se denominan de forma rutinaria por su ubicación u origen dentro de una inmunoglobulina; por ejemplo, dominios variables de la cadena ligera de una inmunoglobulina (VL), dominios variables de la cadena pesada de una inmunoglobulina (VH), dominios variables de la cadena pesada de una inmunoglobulina de camélido (VHH).
Un dominio variable "variante" comprende adiciones, sustituciones y/o eliminaciones aminoacídicas, en comparación con la secuencia de referencia. Una "variante" de los dominios VH o VL puede tener hasta cuatro de dichas modificaciones aminoacídicas. Por ejemplo, uno de los dos dominios puede comprender una sustitución aminoacídica, mientras que el otro dominio está sin modificar, o ambos dominios pueden comprender sustituciones aminoacídicas. Pueden hacerse modificaciones que añaden o eliminan residuos aminoacídicos en el extremo N o extremo C del dominio VH o VL. Por ejemplo, puede eliminarse el residuo N terminal del dominio VH.
Para los fines de esta divulgación, los términos "entre", "de", "a" y "al menos" son inclusivos. Por ejemplo, un número entero "de 0 a 5" significa cualquier número entero igual a o mayor de 0, pero igual a o menor de 5.
Pueden hacerse hasta cinco sustituciones aminoacídicas para desinmunizar los anticuerpos IgG modificados. Las desinmunización puede realizarse de acuerdo con el método de Harding etal. (2010) mAbs 2: 256-265, por ejemplo.
Los residuos flanqueantes de los dominios VH y/o VL, por ejemplo, pueden sustituirse para aumentar la estabilidad de los anticuerpos IgG modificados y/o disminuir su tendencia a agregarse. La mala estabilidad puede afectar a la capacidad de los anticuerpos IgG modificados expresados de plegarse apropiadamente cuando se expresan de forma recombinante, provocando que una fracción de los anticuerpos expresados no sean funcionales. Los anticuerpos de baja estabilidad también pueden ser propensos a formar agregados potencialmente inmunógenos o pueden tener avidez o vida útil alterada. Las sustituciones de aminoácidos flanqueantes que se espera que aumenten la estabilidad y/o disminuyan la tendencia a agregarse de un dominio VH y/o VL, por ejemplo, en un anticuerpo IgG modificado, se divulgan en el documento WO 2007/109254, por ejemplo. Asimismo, se espera que sustituciones en residuos correspondientes en los presentes dominios VH y VL aumenten la estabilidad y/o disminuyan la tendencia de los anticuerpos IgG modificados a agregarse.
Se espera que las sustituciones que pueden tolerarse incluyan las que remplazarían un aminoácido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 con un aminoácido correspondiente que aparece en otra secuencia de la línea germinal del dominio VH o VL humano. Puede tolerarse una sustitución de un aminoácido flanqueante con un aminoácido que existe en cualquiera de estas secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, un residuo de un dominio VH de SEQ ID NO: 1 puede sustituirse con un aminoácido que aparece en una posición correspondiente en cualquier secuencia de la línea germinal de VH, por ejemplo, la secuencia de la línea germinal de DP-10 (Vh 1 -69) o DP-88 (Vh 1-e). Las posiciones correspondientes en este caso se determinan mediante una alineación de secuencias entre las diversas secuencias de la línea germinal, usando técnicas de alineación bien conocidas en la técnica, por ejemplo, ClustalW.
Sustituciones adicionales que se espera que se toleren son las realizadas en un aminoácido con la mayor parte de su cadena lateral expuesta al disolvente, como se determina por análisis de las tres estructuras cocristalinas. El área superficial accesible al disolvente de un residuo puede estimarse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Además, se espera que sustituciones en aminoácidos enterrados dentro de los dominios variables se tolerarán mejor si la cadena lateral del aminoácido no crea impedimento estérico con los residuos colindantes. Por esta razón, los aminoácidos enterrados en general se sustituyen con aminoácidos con cadenas laterales de tamaño similar o más pequeño. Por ejemplo, una sustitución de un residuo de Ile enterrado con una Leu, Val, Ala o Gly se espera que se tolere. Pueden predecirse posibles impedimentos estéricos creados por una sustitución por análisis de las tres estructuras cocristalinas. Sustituciones adicionales que se espera que se toleren son las que mantienen interacciones electrostáticas existentes dentro de los dominios variables, por ejemplo, interacciones de dipolo-dipolo, interacciones de dipolo inducido, enlaces de hidrógeno o enlaces iónicos.
Sustituciones aminoacídicas adicionales de dominios variables incluyen las que se espera que confieran nuevas propiedades útiles a los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Por ejemplo, pueden eliminarse supuestos sitios de N-glucosilación en los dominios VH y/o VL para evitar o reducir la formación de N-glucoformas. El residuo aminoterminal puede sustituirse con un residuo de Gln para provocar piroglutamilación, que puede disminuir el número de variantes de carga. Las sustituciones aminoacídicas pueden usarse para reducir el punto isoeléctrico, que puede disminuir la tasa de eliminación de anticuerpos de polipéptido de IgG, por ejemplo.
Los residuos superficiales de los dominios variables pueden sustituirse con residuos de Cys o Lys, por ejemplo, que entonces pueden modificarse covalentemente y acoplarse a moléculas que confieren características útiles a los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, un marcador detectable, toxina, resto de dirección o proteína. Por ejemplo, puede acoplarse un residuo de Cys a un fármaco citotóxico para formar un conjugado de fármaco. También pueden acoplarse residuos de Cys a moléculas que aumentan la semivida en suero, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o seroalbúmina. Dichas modificaciones aminoacídicas se revisan en Beck et al. (2010) Nature 10: 345-52, por ejemplo.
Los marcadores detectables incluyen radiomarcadores tales como 131I o 99Tc, que pueden fijarse a los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos usando métodos conocidos en la técnica. Los marcadores también incluyen marcadores enzimáticos tales como peroxidasa de rábano rusticano. Los marcadores incluyen además restos químicos tales como biotina, que pueden detectarse mediante unión a un resto detectable afín específico, por ejemplo, avidina marcada. Pueden fijarse otros restos que facilitan la purificación. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden marcarse con His usando métodos bien conocidos de modificación recombinante y expresión.
Los dominios VL de los anticuerpos IgG modificados se ligan a los dominios CL mediante un conector, denominado conector1 en este documento. Los dominios VH de los anticuerpos IgG modificados se ligan opcionalmente a los dominios CH1 mediante un segundo conector, denominado conector2 en este documento. Los conectores adecuados para preparar anticuerpos IgG modificados son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science, 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Esto puede realizarse fusionando los ácidos nucleicos codificantes dentro del marco de lectura y expresando la proteína de fusión en una célula hospedadora adecuada, por ejemplo.
El conector1 y conector2, cuando están presentes, comprenden el residuo aminoacídico o secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en G, GS, GGS, GGGS y GGGGS.
Se inserta una bisagra entre el dominio CH1 y la región Fc de los anticuerpos IgG modificados. La región de bisagra puede ser un dominio flexible que une opcionalmente la parte CH1 a la región Fc. La flexibilidad de la región de bisagra en moléculas de IgG puede permitir que los brazos Fab adopten una amplia gama de ángulos, permitiendo la unión a epítopos espaciados en distancias variables. Una región de bisagra adecuada puede incluir, por ejemplo, la región de bisagra de IgG1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO: 5). Esta secuencia corresponde a una parte de la bisagra superior de IgG 1 humana, la bisagra media y una parte N terminal del dominio CH2 , como se divulga en la figura 4B de la patente de Estados Unidos n.° 8.048.421, por ejemplo.
Las regiones Fc adecuadas de los anticuerpos IgG modificados contienen dos o tres regiones constantes. Las regiones Fc pueden incluir las de IgG 1 humana, como se expone en SEQ ID NO: 6, o IgG4, como se expone en los dominios CH2 y CH3 de SEQ ID NO: 17. La región Fc de un anticuerpo media su semivida en suero y las funciones efectoras, tales como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP).
Pueden hacerse modificaciones a la región de bisagra y Fc para mejorar diversas propiedades de los anticuerpos IgG modificados. Por ejemplo, puede modificarse uno, dos, tres, cuatro, cinco o hasta diez aminoácidos de una región Fc humana de origen natural, además de modificaciones de la región de bisagra. Por ejemplo, la región Fc puede modificarse para aumentar la semivida en suero de los anticuerpos IgG modificados. La semivida de una IgG depende de su unión dependiente del pH al receptor FcRn. FcRn, que se expresa en la superficie de células endoteliales, se une a la IgG de una manera dependiente del pH y la protege de la degradación. Se ha demostrado que mutaciones ubicadas en la superficie de contacto entre los dominios CH2 y CH3 , por ejemplo, aumentan la afinidad de unión a FcRn y la semivida de IgG 1 in vivo. Dichas modificaciones se revisan en Strohl WR., 2009. Optimization of Fc-mediated effector functions of monoclonal antibodies. Curr Opin Biotechnol. 20(6):685-91; y Vaccaro C. et al., 2005. La manipulación de la región Fc de inmunoglobulina G modula los niveles de anticuerpos in vivo. Nat Biotechnol. 23(10): 1283-8, por ejemplo.
Otras modificaciones a la región de bisagra y/o Fc pueden aumentar o reducir funciones efectoras. Los cuatro isotipos de IgG humana se unen a los receptores de Fcy activadores (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa), el receptor FcyRIIb inhibidor y el primer componente del complemento (C1q) con diferentes afinidades, provocando diferentes funciones efectoras. La unión de IgG a los FcyR o C1q, por ejemplo, depende de residuos localizados en la región de bisagra y el dominio CH2 de IgG. Sustituciones aminoacídicas individuales o múltiples de estos residuos pueden afectar a la función efectora modulando la interacción de IgG con FcyR o C1q. Se sabe que otras sustituciones afectan a la función efectora. Estas modificaciones se revisan en Strohl (2009) "Optimization of Fc-mediated effector functions of monoclonal antibodies", Curr. Opin. Biotechnol. 20:685-91, por ejemplo.
Se resumen modificaciones representativas de la región de bisagra y/o Fc en la tabla 1.
Tabla 1: Modificaciones representativas de la región de bisagra y Fc
Figure imgf000007_0001
1. Hinton etal. (2004) J. Biol. Chem. 279(8):6213-16.
2. Vaccaro et al. (2005) Nature Biotechnol. 23(10): 1283-88.
3. Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29(8):2613-24.
4. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-604.
5. Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164(8):4178-84.
6. Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166(4):2571-75.
7. Lazar et al. (2006) Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 103(11): 4005-10.
8. Ryan et al. (2007) Mol. Cancer Ther. 6: 3009-18.
9. Datta-Mannan et al. (2007) DrugMetab. Dispos. 35: 86-94.
10. Steurer et al. (1995) J. Immunol. 155(3):1165-74.
11. Richards et al. (2008) Mol. Cancer Ther. 7(8):2517-27.
12. Labrijn et al. (2009) Nature Biotechnol. 27(8):767-71.
Además, pueden usarse modificaciones aminoacídicas recombinantes para disminuir la homogeneidad estructural de los polipéptidos expresados. Un ejemplo representativo es Peters et al. (2012) J. Biol. Chem. 287(29): 24525-33, que divulga sustituciones de Cys a Ser en la región de bisagra de IgG4 que reducen la heterogeneidad de los enlaces disulfuro y aumentan la estabilidad térmica de dominio Fab. Asimismo, Zhang et al. (2010) Anal. Chem. 82: 1090-99 divulgan la manipulación de la región de bisagra de IgG2 para limitar la mezcla de enlaces disulfuro y la formación de isómeros estructurales en aplicaciones terapéuticas. También pueden usarse modificaciones aminoacídicas en un dominio CH3 para eliminar los residuos de Lys carboxiterminales para disminuir el número de variantes de carga. También pueden usarse modificaciones aminoacídicas para mejorar la función farmacológica de anticuerpos recombinantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Por ejemplo, pueden usarse modificaciones aminoacídicas para aumentar la activación del complemento, potenciar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) aumentando la unión a FcyRIIIA o disminuyendo la unión a FcyRIIIB, y/o aumentar la semivida en suero aumentando la unión a FcRn. Dichas modificaciones aminoacídicas se revisan en Beck et al. (2010) Nature 10: 345-52, por ejemplo.
Ácidos nucleicos y métodos de preparación de anticuerpos IgG modificados
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos IgG modificados de la invención. El ácido nucleico aislado puede ser un ADN sintético, un ARNm que no es de origen natural o un ADNc, por ejemplo. Ejemplos incluyen los ácidos nucleicos que codifican los dominios VH y VL expuestos en SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9 de la patente de Estados Unidos n.° 6.492.497. Una célula hospedadora recombinante puede comprender una o más construcciones anteriores. Los métodos de preparación de anticuerpos IgG modificados comprenden expresar el ácido nucleico codificante en una célula hospedadora en condiciones para producir los anticuerpos IgG modificados, y recuperar los anticuerpos. El proceso de recuperar los anticuerpos puede comprender el aislamiento y/o purificación de los anticuerpos. El método de producción puede comprender formular los anticuerpos en una composición que incluye al menos un componente adicional, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se usa en este documento, pretende hacer referencia a una célula en que se ha introducido ADN exógeno. Debe entenderse que se pretende que dichas expresiones se refieran no solamente a la célula en cuestión particular, sino también a la descendencia de dicha célula. Como pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero aún se incluye dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" como se usa en este documento. Preferiblemente, las células hospedadoras incluyen células procarióticas y eucarióticas seleccionadas de cualquiera de los reinos de seres vivos. Células eucarióticas preferidas incluyen células de protistas, fúngicas, vegetales y animales. Más preferiblemente, las células hospedadoras incluyen, aunque sin limitación, la línea celular procariótica E. coli; líneas celulares de mamífero CHO, HEK 293 y COS; la línea celular de insecto Sf9; y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.
Pueden elegirse o construirse vectores adecuados que comprenden un ácido nucleico que codifica anticuerpos IgG modificados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según lo apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, fagos, fagómidos, adenovíricos, AAV, lentivíricos, por ejemplo. Las técnicas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, son bien conocidos en la técnica.
El término "vector", como se usa en este documento, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula hospedadora en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de la célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están unidos de forma funcional Dichos vectores se denominan en este documento "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. También se divulgan dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.
La introducción de dichos ácidos nucleicos en una célula hospedadora puede realizarse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Para células eucarióticas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos. La introducción puede estar seguida por provocar o permitir la expresión desde el ácido nucleico, por ejemplo, cultivando las células hospedadoras en condiciones para la expresión del gen. Por ejemplo, el ácido nucleico de la invención puede integrarse en el genoma, por ejemplo, cromosoma, de la célula hospedadora. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas convencionales.
Los sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una diversidad de diferentes células hospedadoras son bien conocidos. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, células vegetales, células de insecto, hongos, levaduras y plantas y animales transgénicos. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de melanoma de ratón, células de mieloma de rata, células de riñón embrionario humano, por ejemplo, células HEK293, células de retina embrionaria humana y muchas otras. La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en células procarióticas, tales como E. coli, está bien establecida en la técnica. Para una revisión, véase, por ejemplo, Plückthun Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresión en células eucarióticas cultivadas también está disponible para los expertos en la materia, como se revisa en Andersen et al. (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13: 117-23, por ejemplo.
Los anticuerpos IgG modificados divulgados pueden glucosilarse, de forma natural o por la elección del hospedador de expresión, por ejemplo, células CHO, HEK293 o NSO (ECACC 85110503), o pueden ser aglucosilados, por ejemplo, si se producen por la expresión en una célula procariótica. La glucosilación también puede alterarse intencionadamente, por ejemplo, inhibiendo la fucosilación, para aumentar la actividad ADCC de los anticuerpos IgG modificados resultantes.
Métodos de uso de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos
Los anticuerpos IgG modificados pueden usarse en un método de tratamiento o diagnóstico del cuerpo humano o animal, tal como un método de tratamiento (que puede incluir tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en un paciente humano, que comprende administrar una cantidad eficaz para tratar al paciente. Las afecciones tratables incluyen cualquiera en que TGFp1 desempeñe una función, por ejemplo, una enfermedad fibrótica, cáncer, una enfermedad mediada por el sistema inmunitario y curación de heridas, por ejemplo, esclerosis generalizada difusa, enfermedad del remodelado óseo, nefropatía y/o una combinación de las mismas.
Los anticuerpos específicos para TGFp1 humano han demostrado ser eficaces en modelos animales para el tratamiento de glomerulonefritis por TGFp1 (Border et al. (1990) Nature 346: 371-374), cicatrización neural (Logan et al. (1994) Eur. J. Neurosci. 6: 355-363), cicatrización dérmica (Shah et al. (1992) Lancet 339: 213-214; Shah et al. (1994) J. Cell Science 107: 1137-1157; Shah et al. (1995) J. Cell Science 108: 985-1002) y fibrosis pulmonar (Giri et al. (1993) Thorax 48: 959-966). Además, los anticuerpos contra TGFp1,2 y 3 han demostrado ser eficaces en modelos de fibrosis pulmonar, fibrosis inducida por radiación (patente de Estados Unidos n.° 5.616.561.), mielofibrosis, quemaduras, contractura de Dupuytren, úlceras gástricas y artritis reumatoide (Wahl et al. (1993) Exp. Medicine 177: 225-230).
Los anticuerpos IgG modificados son útiles para tratar una enfermedad y afección resultante directa o indirectamente de la actividad de TGFp1. Los anticuerpos IgG modificados pueden inhibir selectivamente la actividad de una isoforma TGFp1 humana in vitro o in vivo. Las actividades de isoformas TGFp1 incluyen, aunque sin limitación, señalización mediada por TGFp, depósito de la matriz extracelular (ECM), inhibición de proliferación de células epiteliales y endoteliales, promoción de la proliferación de músculo liso, inducción de la expresión de colágeno de tipo III, inducción de la expresión de TGF-p, fibronectina, VEGF e IL-11, unión del péptido asociado a latencia, inmunosupresión inducida por tumor, promoción de angiogénesis, activación de miofibroblastos, promoción de metástasis e inhibición de la actividad de linfocitos NK. Por ejemplo, los anticuerpos IgG modificados son útiles para tratar la glomeruloesclerosis segmentaria focal (FSGS), fibrosis hepática (HF), infarto de miocardio agudo (AMI), fibrosis pulmonar idiopática (IPF), esclerodermia (SSc) y síndrome de Marfan.
Los anticuerpos IgG modificados son útiles para tratar enfermedades y afecciones que incluyen, aunque sin limitación, enfermedades fibróticas (tales como glomerulonefritis, cicatrización neural, cicatrización dérmica, fibrosis pulmonar, fibrosis de los pulmones, fibrosis inducida por radiación, fibrosis hepática, mielofibrosis), quemaduras, enfermedades mediadas por el sistema inmunitario, enfermedades inflamatorias (incluyendo artritis reumatoide), rechazo de trasplantes, cáncer, contractura de Dupuytren y úlceras gástricas. Los anticuerpos IgG modificados también son útiles para tratar, prevenir y reducir el riesgo de aparición de insuficiencias renales incluyendo, aunque sin limitación: nefropatía diabética (de tipo I y tipo II), nefropatía inducida por radiación, nefropatía obstructiva, esclerosis generalizada difusa, fibrosis pulmonar, rechazo de aloinjertos, nefropatía hereditaria (por ejemplo, poliquistosis renal, espongiosis medular renal, riñón en herradura), glomerulonefritis, nefroesclerosis, nefrocalcinosis, lupus eritematoso diseminado, síndrome de Sjogren, enfermedad de Berger, hipertensión sistémica o glomerular, nefropatía tubulointersticial, acidosis tubular renal, tuberculosis renal e infarto renal. En particular, los anticuerpos IgG modificados son útiles cuando se combinan con antagonistas del sistema de renina-angiotensina-aldosterona incluyendo, aunque sin limitación: inhibidores de renina, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (ACE), antagonistas del receptor Ang II (también conocidos como "bloqueantes del receptor Ang II") y antagonistas de aldosterona. A modo de ejemplo, se exponen métodos para usar anticuerpos IgG modificados en combinación con dichos antagonistas en el documento WO 2004/098637.
Los anticuerpos IgG modificados también son útiles para tratar enfermedades y afecciones asociadas con el depósito de ECM, incluyendo, esclerosis generalizada, adhesiones posoperatorias, cicatrización queloide e hipertrófica, vitreorretinopatía proliferativa, cirugía para drenaje de glaucoma, lesión de la córnea, cataratas, enfermedad de La Peyronie, síndrome de dificultad respiratoria en el adulto, cirrosis hepática, cicatrización posterior a infarto de miocardio, reestenosis tras angioplastia, cicatrización después de hemorragia subaracnoidea, esclerosis múltiple, fibrosis después de laminectomía, fibrosis después de reparación de tendón y otras reparaciones, cicatrización debido a eliminación de tatuaje, cirrosis biliar (incluyendo colangitis esclerosante), pericarditis, pleuritis, traqueostomía, lesión penetrante del sistema nervioso central, síndrome miálgico eosinofílico, reestenosis vascular, enfermedad venooclusiva, pancreatitis y artropatía psoriásica.
Los anticuerpos IgG modificados son útiles además para promover la reepitelialización en enfermedades y afecciones tales como úlceras venosas, úlceras isquémicas (úlceras por presión), úlceras diabéticas, sitios de injerto, sitios donadores de injerto, abrasiones y quemaduras, enfermedades del epitelio bronquial, tales como asma, ARDS, enfermedades del epitelio intestinal, tales como mucositis asociada con tratamiento citotóxico, úlceras esofágicas (enfermedad de reflujo), úlceras de estómago, lesiones del intestino delgado y el intestino grueso (enfermedad inflamatoria del intestino).
Los anticuerpos IgG modificados también pueden usarse para promover la proliferación de células endoteliales, por ejemplo, en la estabilización de placas ateroescleróticas, promoción de curación de anastomosis vascular, o para inhibir la proliferación de células del músculo liso, tal como en arteriopatía, reestenosis y asma.
Los anticuerpos IgG modificados son útiles para potenciar la respuesta inmunitaria a infecciones mediadas por macrófagos. También son útiles para reducir la inmunosupresión provocada, por ejemplo, por tumores, SIDA o enfermedades granulomatosas. Los anticuerpos IgG modificados son útiles para tratar enfermedades hiperproliferativas, tales como cánceres, incluyendo, aunque sin limitación, cáncer de mama, próstata, ovario, estómago, renal, pancreático, colorrectal, de piel, pulmonar, cervicouterino y de vejiga, glioma, mesotelioma, así como diversas leucemias y sarcomas, tales como sarcoma de Kaposi, y son útiles para tratar o prevenir recidivas o metástasis de dichos tumores. Los anticuerpos IgG modificados también son útiles para inhibir las metástasis mediadas por ciclosporina.
En el contexto del tratamiento contra el cáncer, "tratamiento" incluye cualquier intervención médica que provoque ralentización del crecimiento del tumor o reducción en las metástasis del tumor, así como remisión parcial del cáncer para prolongar la esperanza de vida de un paciente.
Los métodos de tratamiento comprenden administrar un anticuerpo IgG modificada o composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo IgG modificado. Los anticuerpos IgG modificados pueden usarse en la fabricación de un medicamento para administración. Por ejemplo, un método de preparación de un medicamento o composición farmacéutica comprende formular un anticuerpo IgG modificado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición puede administrarse en solitario o en combinación con otros tratamientos, simultánea o secuencialmente dependiendo de la afección a tratar.
La administración es preferiblemente en una "cantidad terapéuticamente eficaz" suficiente para mostrar beneficio a un paciente. Dicho beneficio puede ser al menos mejora de al menos un síntoma de una enfermedad o afección particular. La cantidad real administrada, y la tasa y evolución temporal de administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de la enfermedad o afección que se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre dosificación, etc., puede determinarse basándose en estudios preclínicos y clínicos, cuyo diseño pertenece al nivel de habilidades en la técnica.
La dosis precisa dependerá de varios factores, incluyendo si el anticuerpo IgG modificado es para diagnóstico o para tratamiento, el tamaño y ubicación de la zona a tratar, y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molécula fijada al anticuerpo IgG modificado. Una dosis típica de un anticuerpo IgG modificado, por ejemplo, puede ser en el intervalo de 100 qg a 1 gramo para aplicaciones sistémicas, y 1 qg a 1 mg para aplicaciones tópicas. La dosis para un solo tratamiento de un paciente adulto puede ajustarse proporcionalmente para niños y lactantes. Los tratamientos pueden repetirse diariamente, dos veces a la semana, semanalmente, mensualmente o a otros intervalos, a criterio del médico. El tratamiento puede ser periódico, y el periodo entre administraciones es aproximadamente dos semanas o más, preferiblemente aproximadamente tres semanas o más, más preferiblemente aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente una vez al mes.
Pueden ser útiles y seguros en seres humanos niveles de dosis de aproximadamente 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 15 mg o 20 mg de los anticuerpos divulgados por kg de peso corporal del paciente. Por ejemplo, 0,5-5 mg/kg en rata y ratón ha sido una dosis eficaz en un entorno agudo. Por lo tanto, para dosificación a largo plazo, puede administrarse 0,3-10 mg/kg a seres humanos, basándose en una semivida esperada de 21 días. Las dosis pueden ser suficientes para la eficacia, mientras sean suficientemente bajas para facilitar la administración óptima. Por ejemplo, una dosis de menos de 50 mg facilita la administración subcutánea. Puede usarse administración intravenosa como vía de administración para enfermedades graves, donde pueden requerirse dosis altas y los intervalos de dosificación largos. La inyección subcutánea puede aumentar la posible respuesta inmunitaria a un producto. La administración local para enfermedad localizada puede reducir la cantidad de producto administrado y aumentar la concentración en el sitio de acción, lo que puede mejorar la seguridad.
Los anticuerpos IgG modificados pueden administrarse por inyección, por ejemplo, por vía subcutánea, intravenosa, intracavidad (por ejemplo, después de resección tumoral), intralesión, intraperitoneal o intramuscular. Los anticuerpos IgG modificados también pueden administrarse por inhalación o por vía tópica (por ejemplo, intraocular, intranasal, rectal, en heridas, sobre la piel), o por vía oral.
Un anticuerpo IgG modificado habitualmente se administrará en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del anticuerpo IgG modificado. Por tanto, las composiciones farmacéuticas pueden comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable, vehículo, tampón, estabilizante u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales deben ser atóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. Dichos materiales podrían incluir, por ejemplo, todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción. Algunos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, glúcidos, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o sustancias auxiliares, tales como agentes emulsionantes, conservantes o tampones, que aumentan la vida útil o eficacia.
La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración. Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio afectado, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que se apirógena y tiene pK, isotonicidad y estabilidad adecuadas. Los expertos en la materia serán capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer e inyección de Ringer con lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.
Un anticuerpo IgG modificado puede formularse en formas líquidas, semisólidas o sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración, la aplicación terapéutica, las propiedades fisicoquímicas de la molécula y la vía de administración. Las formulaciones pueden incluir excipientes, o una combinación de excipientes, por ejemplo: glúcidos, aminoácidos y tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden incluir una amplia gama de concentraciones y pH de los anticuerpos IgG modificados. Pueden producirse formulaciones sólidas por liofilización, secado por pulverización o secado por tecnología de fluidos supercríticos, por ejemplo.
Las composiciones terapéuticas pueden formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración de fármaco elevada. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el anticuerpo IgG modificado en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula de una dispersión, o usando tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
El compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá el anticuerpo IgG modificado contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la materia.
Un método de uso de un anticuerpo IgG modificado puede comprender provocar o permitir la unión a TGFp. Dicha unión puede tener lugar in vivo, por ejemplo, después de la administración de un anticuerpo IgG modificado a un paciente, o puede tener lugar in vitro, por ejemplo, en ELISA, inmunoelectrotransferencia, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad o ensayos celulares, o en métodos terapéuticos basados ex vivo, por ejemplo, métodos en que células o líquidos corporales se ponen en contacto ex vivo con un anticuerpo IgG modificado y después se administran a un paciente.
Se proporciona un kit que comprende un anticuerpo IgG modificado. El anticuerpo IgG modificado puede marcarse para permitir su reactividad en una muestra a determinar. Pueden emplearse kits en análisis diagnóstico, por ejemplo. Un kit puede contener instrucciones para el uso de los componentes. Pueden incluirse dentro del kit materiales complementarios para ayudar en o para posibilitar la realización de dicho método.
La reactividad de un anticuerpo IgG modificado en una muestra puede determinarse mediante cualquier medio apropiado, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA). Puede mezclarse antígeno marcado radiactivamente con antígeno sin marcar (la muestra de ensayo) y dejarse unir al anticuerpo IgG modificado. El antígeno unido se separa físicamente del antígeno no unido y se determina la cantidad de antígeno radiactivo unido al anticuerpo IgG modificado. También puede usarse un ensayo de unión competitiva con antígeno no radiactivo, usando un antígeno o un análogo ligado a una molécula indicadora. La molécula indicadora puede ser un fluorocromo, fosforescente o tinte. Los fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y Texas Red. Los tintes cromogénicos adecuados incluyen diaminobenzidina.
Otros indicadores incluyen partículas coloidales macromoleculares o material en partículas, tal como microesferas de látex que están coloreadas, son magnéticas o paramagnéticas, y agentes biológica o químicamente activos que pueden provocar directa o indirectamente señales detectables a observar visualmente, detectar electrónicamente o registrar de otro modo. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones que se desarrollan o cambian los colores o provocan cambios en las propiedades eléctricas, por ejemplo. Pueden ser molecularmente excitables, de modo que las transiciones electrónicas entre estados de energía provoquen absorciones o emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas usadas junto con biosensores. Pueden emplearse sistemas de detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina. Las señales generadas por conjugados de anticuerpo-indicador pueden usarse para obtener datos cuantificables absolutos o relativos de la unión del anticuerpo relevante en las muestras.
También se divulga el uso de un anticuerpo IgG modificado para medir los niveles de antígeno en un ensayo de competición. El anticuerpo IgG modificado puede ligarse a una molécula indicadora, de modo que se produce un cambio físico u óptico en la unión, por ejemplo. La molécula indicadora puede generar directa o indirectamente señales detectables, y preferiblemente medibles. Las moléculas indicadoras pueden ligarse directa o indirectamente, covalentemente, por ejemplo, mediante un enlace peptídico o no covalentemente. El anticuerpo IgG modificado y un indicador proteínico pueden ligarse mediante un enlace peptídico y expresarse de forma recombinante como una proteína de fusión.
Aspectos adicionales de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación, incluyendo la siguiente ejemplificación experimental.
Ejemplos
Ejemplo 1: Anticuerpo IgG4 modificado con aminoácidos adicionales en la región de codo de la cadena ligera
CAT192 es un anticuerpo específico de TGFp1, pero la mayor parte de su afinidad de unión se perdió cuando se convirtió de un scFv en una IgG4 de longitud completa (figura 1). El subtipo de anticuerpo y los formatos Fc en solitario no explican este fenómeno, porque el Fab tanto de IgG 1 como de IgG4 presentaban afinidad muy baja por TGFp1. La estrecha unión de scFv a TGFp1 puede deberse a la alta flexibilidad resultante del conector largo (GGGGS)3 que conecta los dominios Fv de la cadena pesada y ligera. Esta alta flexibilidad puede haberse perdido durante la conversión del scFv en las versiones de Fab o IgG. La baja afinidad de CAT192 se caracterizó mediante una tasa de asociación muy lenta, pero una tasa de disociación también muy lenta. La tasa de asociación y la tasa de disociación lentas sugirieron que la unión entre CAT 192 y TGFp1 puede requerir un posible cambio conformacional que se limitaba por aminoácidos desfavorables en CAT192 (IgG4). Aquí se describen experimentos diseñados para aumentar la flexibilidad/afinidad de las versiones de Fab o IgG del scFv añadiendo aminoácidos adicionales en la región de codón de la cadena ligera, que liga el dominio Fv del anticuerpo al dominio CH1. Más específicamente, se diseñaron mutantes para añadir secuencias de una glicina (G), dos glicinas (GG), dos glicinas y una serina (GGS), tres glicinas y una serina (GGGS), y cuatro glicinas y una serina (GGGGS) en la región de codo de la cadena ligera de tipo silvestre como se muestra a continuación en la tabla 2, con los aminoácidos añadidos subrayados.
Tabla 2: Mutantes de inserción de la región de codo de la cadena ligera de IgG4 modificada
Figure imgf000013_0001
El aminoácido n.° 25 de la cadena ligera es una Ala en scFv, pero se cambió a Ser cuando se convertía en IgG4. Por lo tanto, se incluyó un mutante A25S adicional como control para ensayar si cambiar la Ala a Ser afecta a la afinidad del scFv por TG Fpi. El CAT192 de tipo silvestre y las secuencias de ADN y de aminoácidos mutantes se enumeran a continuación.
SEQ ID NO: 38: Secuencia de aminoácidos de LC de tipo silvestre de IgG1 CAT192 con la región de codo subrayada:
EIVLTQSPSSLSASYGDRYTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTL O SGVP SRF SGSGSGTDFTLTIN SLOPEDF AT YY CLOD SNYPLTF GGGTRLEDCR TVAAPSYFIFPPSDEOLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALOSGNSO E S VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SP VTK SFNRGE C SEQ ID NO: 27: Secuencia codificante de la cadena ligera de CAT192 (IgG1) atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggccacagccaccggcgtgcacagcGAGATCGT GCTGAC A CAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCAC CTGT AGAGCC AGCC AGGGC ATCGGCGACGACCTGGGATGGT AT C AGC AGA AGCCTGGCAAGGCCCCCATCCTGCTGATCTACGGCACCAGCACACTGCAG AGCGGCGTGCCCTCCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACC CTGACCATCAACAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCTG CAAGACAGCAACTACCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCCGGCTGGAAAT CAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGA GCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCG GCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTAC TCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAA GGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGACCA AGTCCTTC AACCGGGGCGAGT GCTGA CAT192LC+G (LEIKGRTVA)
Directo 5'-ggctggaaatcaagggccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No. 28)
Complementario 5'-gcggccaccgtacggcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No. 29)
CAT192LC+GG. (LEIKGGRTVA)
Directo 5'-ggctggaaatcaagggcggccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No. 30)
Complementario 5'-gcggccaccgtacggccgcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No. 31)
CAT192LC+GGS. (LEIKGGSRTVA)
Directo 5'-ggctggaaatcaagggcggcagccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No. 32)
Complementario 5'-gcggccaccgtacggctgccgcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No. 33)
CAT192LC+GGGS. (LEIKGGGSRTVA)
Directo 5'-ggctggaaatcaagggcggcggcagccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No. 34)
Complementario 5'-gcggccaccgtacggctgccgccgcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No. 35)
CAT192LC+GGGGS. (LEIKGGGGSRTVA)
Directo 5'-ggctggaaatcaagggcggcggcggcagccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No. 36)
Complementario 5'-gcggccaccgtacggctgccgccgccgcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No. 37)
Los cinco mutantes de LC CAT 192, junto con el mutante A25S y el LC WT se coexpresaron con Fab de HC de CAT 192 marcado con His usando el sistema de transfección Expi293F (Life Technologies) en un formato de placa de 24 pocillos (4 x 1 ml). Se recogió el medio acondicionado (CM) 4 días después de la transfección y se usó el instrumento Octet QK384 para calcular el nivel de expresión y la unión a TGFp1 en un ensayo único. Se usó Fab CAT192-His purificado como curva patrón (diluido 2 veces de 100 a 3,125 pg/ml). El CM de Fab CAT192 se diluyó 1:10 en diluyente y se incluyó CM de Fab GC1008 como control positivo. Se midió la unión de biosensores anti-Fab-CH1 durante 2 min a 1000 rpm y 30 °C de temperatura de placa para la cuantificación y captura. Los sensores entonces se movieron a pocillos que contenían 200 nM de TGFp1 para la evaluación de la unión.
El resultado de unión a TGFp1 mostró que cada inserción de aminoácido adicional aumentaba la afinidad de unión del Fab CAT 192 en comparación con el equivalente WT. La adición de al menos dos glicinas aumentó la afinidad de unión a un nivel comparable al del anticuerpo Fab GC1008. El mutante A25S mostró afinidad de unión débil por TGFp1, similar a la afinidad del Fab WT y el Fab CAT192 recombinante purificado. Este resultado fue cualitativo porque la cantidad de Fab capturado en los sensores no se normalizó para la concentración o tampón sustraído.
Las variantes de Fab de LC de CAT192 entonces se purificaron usando puntas PureSpeed IMAC de Rainin para evaluar de forma precisa la afinidad por TGFp1 y confirmar la especificidad de isoforma usando resonancia de plasmones superficiales. El medio acondicionado para cada muestra se dividió en cuatro pocillos (~800 pl cada uno) y se añadieron ~200 pl de tampón de equilibrado a cada uno para usar dos puntas de purificación de 1 ml (20 pl de resina) para cada muestra. Se intercambió el tampón de las muestras usando filtros Amicon Ultra en PBS Gibco pH 7,2 después de la etapa de elución para retirar el imidazol. Las concentraciones se midieron por A280 y se cargaron 3,5 pg en un gel de SDS-PAGE con tris-glicina al 4-20 % no reductor y se tiñó con Coomassie para comprobar la pureza. El rendimiento global varió de un 12-42 % del material de partida en CM.
Se usó el instrumento Biacore T200 para evaluar la afinidad de unión por TGFp de Fab WT y de LC mutantes de CAT 192 purificados. Se inmovilizaron TGFp1, TGFp2 y TGFp3 (124, 125 y 112 UR) en un chip CM5 serie S usando química de amina. Se usó un amplio intervalo de concentración para representar los productos de unión de baja y alta afinidad. Los Fab se diluyeron 3 veces de 270 a 0,37 nM en tampón HBS-EP+. Cada muestra se inyectó por duplicado. La Kd se determinó usando el intervalo de concentración típico con 30 nM como concentración máxima. Los resultados de unión de Biacore fueron de acuerdo con los resultados de Octet descritos anteriormente, concretamente, la adición de aminoácidos en la región de codo de LC de CAT192 mejoró la afinidad de unión por TGFp1. Se demostró una mejora por etapas con la inserción de cada residuo adicional (figura 6). Ninguno de los mutantes de LC de Fab CAT 192 se unió a TGFp2 o TGFp3 en las mismas condiciones, lo que demuestra que los mutantes conservaban la selectividad de isoforma, mientras se aumentaba significativamente la unión a TGFp1. Por lo tanto, los mutantes manipulados en el codo eran un conjunto de variantes novedosas con selectividad de isoforma y unión de alta afinidad a TGFp1.
Tabla 3: Kd de Fab modificados
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0002
Ejemplo 2: Anticuerpo IgG4 modificado con aminoácidos adicionales en la región de codo de la cadena pesada
Como un seguimiento de los mutantes de la cadena ligera en la región de codo que han mostrado alta afinidad y unión selectiva a TGFp1, también se diseñaron mutantes para aumentar la flexibilidad/afinidad insertando aminoácidos adicionales en la región de codo de la cadena pesada, que ligaban el dominio Fv del anticuerpo con el dominio CH1. Más específicamente, se diseñaron mutantes para añadir secuencias de una glicina (G), dos glicinas (GG) y cuatro glicinas y una serina (GGGGS) en la región de codo de la cadena pesada de tipo silvestre como se muestra a continuación en la tabla 4, con los aminoácidos añadidos subrayados.
Tabla 4: Mutantes de inserción del codo de la cadena pesada de IgG4 modificada
Figure imgf000015_0001
HC+GG-ST fue un subproducto inesperado del proceso de mutagénesis por PCR, que añadió las dos glicinas en el codo como se diseñó, pero también había eliminado dos aminoácidos en el extremo de la región de codo, como se confirma por la secuenciación de ADN. Este mutante tenía el mismo número de aminoácidos en la región de codo de la cadena pesada, pero diferente composición de aminoácidos en el conector del codo. Se incluyó como control para comparaciones de caracterización y afinidad.
Cebadores de CAT192 HC+G
Directo 5'-ccaccgtgacagtgtctggcagcgccagc-3' (SEQ ID NO: 50)
Complementario 5'-gctggcgctgccagacactgtcacggtgg-3' (SEQ ID NO: 51)
Cebadores de CAT192 HC+GG-ST
Directo 5'-ccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagc-3' (SEQ ID NO: 52)
Complementario 5'-gctggcgctgccgccagacactgtcacggtgg-3' (SEQ ID NO: 53)
Cebadores de CAT192 HC+GGGGS
Directo 5'-caccaccgtgacagtgtctggcggcggcggcagcagcgccagca-3' (SEQ ID NO: 54)
Complementario 5'-tgctggcgctgctgccgccgccgccagacactgtcacggtggtg-3' (SEQ ID NO: 55)
Cebadores de CAT192 HC+GG
Directo 5'-caccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagca-3' (SEQ ID NO: 529)
Complementario 5'-tgctggcgctgccgccagacactgtcacggtggtg-3' (60)
Estos mutantes de HC de CAT192 se coexpresaron con Fab de LC de CAT192 usando el sistema de transfección Expi293F (Life Technologies) en un formato de placa de 24 pocillos (4 x 1 ml). Los medios acondicionados se recogieron 4 días después de la transfección y después se purificaron usando puntas PureSpeed IMAC de Rainin para evaluar de forma precisa la afinidad por TGFp1.
Se usó el instrumento Biacore T200 para evaluar la afinidad de unión por TGFp de Fab mutantes de CAT192 purificados como se describe en el ejemplo 1. Los resultados mostrados en la figura 6 sugirieron que, como los mutantes en la región de codo de la cadena ligera, la adición de aminoácidos en la región de codo de la cadena pesada de CAT192 también mejoraba la afinidad de unión por TGFp1. Por ejemplo, el mutante CAT192 HC+GGGGS mostró unión de afinidad muy alta a TGFp1.
Ejemplo 3: Mutantes de combinación de la cadena pesada y ligera
Se crearon mutantes de CAT192 de combinación por cotransfección de ADN que portan mutantes en las regiones de codo tanto de la cadena pesada como de la ligera usando el sistema de transfección Expi293F (Life Technologies) en un formato de placa de 24 pocillos (4 x 1 ml). Las diferentes combinaciones se enumeran en la tabla 5.
Tabla 5: Diversos mutantes de combinación de la cadena pesada y ligera
Figure imgf000016_0001
Los medios acondicionados se recogieron 4 días después de la transfección y después se purificaron usando puntas PureSpeed IMAC de Rainin para evaluar de forma precisa la afinidad por TGFp1.
Se usó el instrumento Biacore T200 para evaluar la afinidad de unión por TGFp de Fab mutantes de CAT192 purificados como se describe en el ejemplo 1. Los resultados mostrados en la figura 3 sugirieron que los mutantes de combinación restablecían la unión de alta afinidad a TGFp1 de CAT192. La afinidad de unión (KD) mediante estos Fab mutantes se enumera en la tabla 6.
Tabla 6: Afinidad de unión por TGFp1 (KD) de los mutantes de combinación de la cadena pesada y ligera determinada por Biacore
Figure imgf000016_0002
n/d = ninguno detectado
Se requirieron menos inserciones de aminoácidos cuando se manipulaba la región de codo tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera. Por ejemplo, el mutante de combinación de "HC+G" y "LC+G" mostró unión de afinidad muy alta a TGFp1.
Ejemplo 4: Caracterización de afinidad y potencia de variantes de IgG4 de longitud completa
Se generaron mutantes en formato de IgG4 para determinar si la afinidad reobtenida por Biacore puede confirmarse en el ensayo de potencia basado en células A549. El Fab de HC de CAT192 se clonó en la cadena principal de IgG4 de cadena pesada S228P para minimizar la formación de semianticuerpos, y entonces se cotransfectaron células Expi293F con IgG4 CAT192 HC S228P y el mutante de inserción de LC.
Se realizó una transfección de 30 ml en la HC de CAT192 de longitud completa y mutantes de inserción de LC para obtener suficiente material para el bioensayo. Se transfectaron células Expi293F con 30 gg de ADN (15 gg de LC 15 gg de HC). El medio acondicionado se recogió 4 días después de la transfección y se analizó por Octet usando biosensores de proteína A para obtener aproximadamente 200 gg/ml de expresión. El CM entonces se purificó usando columnas Hi-Trap proteína A HP con una bomba peristáltica. El CM se cargó en cada columna a 0,5 ml/min, se lavó con 25 volúmenes de columna (CV) de NaPi 50 mM, NaCl 25 mM pH 7,1 (2 ml/min), se lavó con 25 CV de succinato de sodio 10 mM pH 6,0 (2 ml/min) y se eluyó en 3 fracciones x 2 ml con succinato de sodio 10 mM pH 3,75 a 1 ml/min (marcadas n.° 1, n.° 2, n.° 3). Los eluidos de proteína A se neutralizaron con NaOH 0,2 M, y se añadió NaCl 0,2 M para una concentración final de NaCl 40 mM. Las muestras entonces se concentraron y se intercambió el tampón a NaPi 50 mM, NaCl 25 mM pH 7,1. Estos eluidos de proteína A del mutante de inserción de HC y LC de IgG4 de CAT192 S228P entonces se procesaron en un gel de Tris glicina al 4-20 % (figura 3) y se compararon por Biacore para la unión a TGFp1/TGFp2/TGFp3 (figura 4). Los resultados de Biacore mostraron que los mutantes de IgG4 de CAT192 purificados de hecho volvían a lograr unión a TGFp1. Ninguno de los mutantes se unió a TGFp2 o TGFp3 (figura 4).
Tabla 7 Afinidad de unión por TGFp1 (KD) de las variantes de IgG4 de longitud completa determinada por Biacore
Figure imgf000017_0001
n/d = ninguno detectado
Los mutantes de inserción de LC de IgG de CAT192 S228P entonces se caracterizaron en un ensayo de potencia celular de A549 (Rapoza etal., 2006, J Immunol Methods, Vol. 316, pág. 18). Los resultados (figura 5) mostraron que los mutantes de inserción de CAT192 neutralizaron la actividad de TGFp1, como se demuestra por los efectos inhibidores por los mutantes sobre la producción de IL-11 estimulada por TGFp1. Parecía que dos glicinas añadidas al codo de la cadena ligera eran suficientes para que CAT 192 volviera a lograr eficacia, como se observa en el ensayo de unión Biacore.
Ejemplo 5: Estudio de termoestabilidad
Se realizó fluorimetría diferencial de barrido (DSF) en los mutantes de inserción del codo para determinar la manera en que los aminoácidos adicionales en la región de bisagra de la cadena pesada y cadena ligera afectaban a la termoestabilidad de los mutantes de inserción de Fab de CAT192. El principio básico de DSF es que según aumenta la temperatura, un tinte fluorescente se une a las regiones hidrófobas de la proteína según se despliega, proporcionando un aumento en la señal. Este método puede realizarse con muestra limitada y puede usarse para obtener estabilidad relativa de las muestras de un modo de alto rendimiento. Se usó naranja Sypro como tinte fluorescente. Las condiciones usadas fueron 0,1 mg/ml de proteína, una relación de tinte de 1:4000 y un volumen total de 10 gl. Los resultados mostraron que la estabilidad relativa de los mutantes de inserción de Fab de CAT 192 disminuía ligeramente con la adición de glicinas en el codo, teniendo los mutantes menos estables la adición más larga (figura 7). Los valores de Tm se resumen en la figura 7. Los valores de Tm de algunos de los mutantes de cadena más larga no se calcularon debido a su patrón de desplegamiento. La ligera disminución también se observó cuando algunos de los mutantes de la cadena ligera se convirtieron de formato Fab en IgG4 (figura 8).
Ejemplo 6: Determinación de la estructura cristalina de variantes de Fab de CAT192
Se resolvieron las estructuras proteínicas de Fab CAT 192 WT y 3 variantes para proporcionar la explicación estructural en cuanto a la manera en que se restablecía la alta afinidad con la flexibilidad aumentada de los dominios variables.
Se realizó una transfección de 150 ml en los mutantes de inserción de Fab de HC y LC de CAT192 para obtener suficiente material para los estudios de estructura. Se transfectaron células Expi293F con 150 pg de ADN (75 pg de LC 75 pg de HC). El medio acondicionado se recogió 5 días después de la transfección. El CM entonces se purificó usando columnas His-Trap Excel equilibradas con NaPi 20 mM pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 5 mM. La proteína Fab se eluyó con NaPi 20 mM pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM y se intercambió inmediatamente el tampón a HEPES 20 mM pH 7,0, NaCl 50 mM usando una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200 10/300). Los Fab entonces se concentraron hasta 20 mg/ml y se establecieron tamices de matriz dispersa tanto a temperatura ambiente como a 4 °C. Todos los cristales usados para la determinación de la estructura se obtuvieron a 4 °C en una relación 1:1 de proteína a condición de cristalización. La proteína de tipo silvestre y los mutantes de menor afinidad de unión cristalizaron en un grupo espacial P21 en condiciones de PEG similares (WT: 12 % de PEG 8K/0,1 M de cacodilato de sodio pH 6/0,2 M de MgCl2 , CAT192 WT HC/LC+G: 12 % de PEG 20K/0,1 M de MES pH 6,5, CAT192 HC+GGGGS/WT LC: 12 % de PEG 20K, 0,1 M de MES pH 5,75). El mutante de alta afinidad de unión (HC+GG/LC+GG) cristalizó en sulfato de amonio 2 M, acetato de sodio 0,1 M pH 4,6 (grupo espacial: C2).
Las variantes de afinidad de unión baja/moderada y las estructuras de Fab de tipo silvestre (HC+WT/LC+G y HC+GGGGS/LC+WT) fueron casi idénticas (figura 9,o parte A). HC WT/LC+G y HC+GGGGS/LC WT se superpusieron con CAT192 WT con un R.M.S.D de 0,516 Á y 0,538 Á respectivamente. En cada una de estas estructuras, la densidad de electrones para la región CDRH3 se perdió para todas las moléculas en la unidad asimétrica. Esto implicaba que esta CDR era muy flexible para los mutantes de afinidad de unión baja/moderada. En contraste, el mutante de alta afinidad de unión (HC+g G/LC+GG) presentó grandes cambios conformacionales en los dominios variables en comparación con las otras estructuras de Fab de CAT192 (figura 9, parte A). Aunque los dominios constantes entre los cuatro Fab se superpusieron bien, los dominios variables en CAT192 HC+GG/LC+GG se desplazaron significativamente en comparación con las otras estructuras (figura 9, parte B). Además, la región CDR3 de h C estaba completamente estructurada en la estructura de alta afinidad de unión y se estabilizaba por interacción con la CDR3 de LC (<3 Á). Estas cuatro estructuras, de acuerdo con los resultados de Biacore, sugirieron que se requería un gran reordenamiento conformacional para restablecer la alta afinidad de unión de CAT192.
Lista de secuencias
SEQ ID NO: 1: Dominio VH de IgG1 humana clon SL15 (SQN4 US6492497)
EVQLVESGGGWQPGRSLRLSC A ASGFTF S S Y GMHWVRQ APGKELEWV AVI SYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYS GYDTDPQ Y S W GQGTTVT V S S
SEQ ID NO: 2: Dominio VH de IgG1 humana clon JT182 (SQN10 US6492497)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQ APGKELEWV AVI
5 YDGSIK YY AD S VKGRFTISRDN SKNTL YLQMN SLRAEDT AVYY CARI GE Y S
GYDTP ASPD WGQGTT V I V S S
SEQ ID NO: 3: Dominio Vk de IgG1 humana clon SL15A: (SQN6 US6492497)
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTTNSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIK
SEQ ID NO: 4: Dominio Vk de IgG1 humana clon SL15S: (SQN8 US6492497)
EÍVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSIL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTMSLQPEDFATYYOLQDSNYPLTFGGGTRLEIK
SEQ ID NO: 5: Región de bisagra de IgG1 humana PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SEQ ID NO: 6: Región Fc de IgG1 humana
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP P VLD SDGSFFL Y SKLTVDKSRWQQGNVF SC S VMHEALHNHYTQK SL SLSPGK
SEQ ID NO: 7
SYGMH
SEQ ID NO: 8
VISYDGSIKYYADSVKG SEQ ID NO: 9
TGEYSGYDTSGVEL SEQ ID NO: 10
TGEYSGYDTDPQYS SEQ ID NO: 11
TGFYSGYDTPASPD SEQ ID NO: 12
RASQGIGDDLG SEQ ID NO: 13
GTSTLQS SEQ ID NO: 14
LQDSNYPLT SEQ ID NO: 15
TGX1YSGYDTX2X3X4X5X6
SEQ ID NO: 16: Cadena ligera de CAT192 (IgG4) EWLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTL Q SGVP SRF SGSGSGTDFTLTIN SLQPEDF AT YY CLQD SNYPLTF GGGTRLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ E S VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK Y Y ACE VTHQGL S SP YTK SFNRGE C SEQ ID NO: 17: Cadena pesada de CAT192 (IgG4) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S S YGMHWVRQAPGKELEWYAVI SYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYS GYDTDPQ Y S W GQGTT YT Y S S ASTKGP S YFPL APC SRSTSE ST AALGCL VKD YF PEP VT V S W N S GALT S GVHTFP A VLQ S SGL Y SL S S V VT VP S S SLGTKT YT CNVD HKP SNTKVDKRVESKY GPPCP S CP APEFLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT C VVVD V SQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV S VLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQV SLT CL VKGF YP SDIA VEWE SN GQPENNYKTTPP VLD SD GSFFL Y SRLT VDK SR WQEGNVF S C S VMHE ALHNH YT QK SL SL SLGK SEQ ID NO: 18: Cadena pesada de CAT192 (IgG4) S228P
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S S YGMHWVRQ APGKELEWYAVI SYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYS GYDTDPQ Y S W GQGTT YT Y S S ASTKGP S YFPL APC SRSTSE ST AALGCL VKD YF PEP VT V S W N S GALT S GVHTFP A VLQ S SGL Y SL S S V VT VP S S SLGTKT YT CNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT C VVVD V SQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV S VLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQV SLT CL VKGF YP SDIA VEWE SN GQPENNYKTTPP VLD SD GSFFL Y SRLT VDK SR WQEGNVF S C S VMHE ALHNH YT QK SL SL SLGK SEQ ID NO: 19: CAT191 (scFv) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVI S YDGSIK YY AD S VKGRFTISRDN SKNTL YLQMN SLRAEDT AVYY C ART GE Y S GYDTDPQYSWGQGTTVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVGD RVTITCRSSQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDF TLTIN SLQPEDF AT YY CLQD SNYPLTF GGGTRLEIK SEQ ID NO: 20: TGF|31 humano
ALDTNY CFS STEKNCC VRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANF CLGPCP YIW SLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNM IVRSCKCS SEQ ID NO: 21: Región de codo de LC de tipo silvestre de IgG4 CAT192 LEIKRTVA SEQ ID NO: 22: Región de codo de LC mutante con 1 aminoácido adicional insertado LEIKGRTVA SEQ ID NO: 23: Región de codo de LC mutante con 2 aminoácidos adicionales insertados LEIKGGRTVA SEQ ID NO: 24: Región de codo de LC mutante con 3 aminoácidos adicionales insertados LEIKGGSRTVA SEQ ID NO: 25: Región de codo de LC mutante con 4 aminoácidos adicionales insertados LEIKGGGSRTVA SEQ ID NO: 26: Región de codo de LC mutante con 5 aminoácidos adicionales insertados LEIKGGGGSRTVA SEQ ID NO: 27: Secuencia codificante de la cadena ligera de CAT192 (IgG1) atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggccacagccaccggcgtgcacagcGAGATCGT GCTGAC A CAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCAC CTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCGGCGACGACCTGGGATGGTATCAGCAGA AGCCTGGCAAGGCCCCCATCCTGCTGATCTACGGCACCAGCACACTGCAG AGCGGCGTGCCCTCCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACC CTGACCATCAACAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCTG CAAGACAGCAACTACCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCCGGCTGGAAAT CAAGCGTACGGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCCTCCGACGA GCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTA CCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCG GCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTAC TCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAA GGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGACCA AGTCCTTC AACCGGGGCGAGT GCTGA SEQ ID NO: 28: CAT192LC+G (LEIKGRTVA). directo
5'-ggctggaaatcaagggccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID NO: 29: CAT192LC+G (LEIKGRTVA), complementario
5'-gcggccaccgtacggcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID NO: 30: CAT192LC+GG (LEIKGGRTVA). directo
5'-ggctggaaatcaagggcggccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID NO: 31: CAT192LC+GG (LEIKGGRTVA).
complementario 5'-gcggccaccgtacggccgcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID NO: 32: CAT192LC+GGS (LEIKGGSRTVA). directo
5'-ggctggaaatcaagggcggcagccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID NO: 33: CAT192LC+GGS (LEIKGGSRTVA). complementario
5'-gcggccaccgtacggctgccgcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID NO: 34: CAT192LC+GGGS (LEIKGGGSRTVA). directo
5'-ggctggaaatcaagggcggcggcagccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID NO: 35: CAT192LC+GGGS (LEIKGGGSRTVA). complementario
5'-gcggccaccgtacggctgccgccgcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID NO: 36: CAT192LC+GGGGS (LEIKGGGGSRTVA). directo
5'-ggctggaaatcaagggcggcggcggcagccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID NO: 37: CAT 192LC+GGGGS (LEIKGGGGSRTVA). complementario
5'-gcggccaccgtacggctgccgccgccgcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID NO: 38: LC de tipo silvestre de IgG1 CAT192 EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTL Q SGVP SRF SGSGSGTDFTLTIN SLQPEDF AT YY CLQD SNYPLTF GGGTRLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ E S VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SP VTK SFNRGE C
SEQ ID NO: 39: Cadena ligera mutante con 1 aminoácido adicional insertado EIVLTQSPSSLSASYGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTL Q S GVP SRF S GS GSGTDF TLTIN SLQPEDF AT Y Y CLQD SNYPLTF GGGTRLEIKG RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QE S YTEQD SKD ST Y SL S S TLTL SK AD YEKHK Y Y ACE YTHQGL S SP YTK SFNRG EC SEQ ID NO: 40: Cadena ligera mutante con 2 aminoácidos adicionales insertados EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTL Q S GVP SRF S GS GSGTDF TLTIN SLQPEDF AT Y Y CLQD SNYPLTF GGGTRLEIKG GRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN S QES VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SP VTK SFNR GEC SEQ ID NO: 41: Cadena ligera mutante con 3 aminoácidos adicionales insertados EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTL Q S GVP SRF S GS GS GTDFTLTIN SLQPEDF AT Y Y CLQD SNYPLTF GGGTRLEIKG GSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG N S QES VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQ GL S SP VTK SFN RGEC SEQ ID NO: 42: Cadena ligera mutante con 4 aminoácidos adicionales insertados EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTL Q S GVP SRF S GS GSGTDF TLTIN SLQPEDF AT Y Y CLQD SNYPLTF GGGTRLEIKG GGSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GN S QE S VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SP VTK SF NRGEC SEQ ID NO: 43: Cadena ligera mutante con 5 aminoácidos adicionales insertados EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTL Q S GVP SRF S GS GSGTDF TLTIN SLQPEDF AT Y Y CLQD SNYPLTF GGGTRLEIKG GGGSRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALO S GN S QES VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK V Y ACE YTHQGL S SP VTK S FNRGEC SEQ ID NO: 44: Región de codo de HC de tipo silvestre de IgG4 CAT192
TVTVSSAS SEQ ID NO: 45: Región de codo de HC mutante con 1 aminoácido adicional insertado
TVTVSGSAS SEQ ID NO: 46: Región de codo de HC mutante con 2 aminoácidos adicionales insertados
TVTVSGGSAS SEQ ID NO: 47: Región de codo de HC mutante con 2 aminoácidos adicionales insertados y un aminoácido eliminado TVTVSGGSA SEQ ID NO: 48: Región de codo de HC mutante con 5 aminoácidos adicionales insertados TVTVSGGGGSSAS SEQ ID NO: 49: Secuencia codificante de HC de tipo silvestre de IgG4 CAT192
■:TGGTCCTGCATCATCCT ■ ÍTG ............ :............ ■ " GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGG CAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCT ACGGAATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGAACTGGAATGGGT GGCCGTGATCAGCTACGACGGCAGCATCAAGTACTACGCCGACAGCGTGA AGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTG CAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTAG AACCGGCGAGTACAGCGGCTACGACACCGACCCTCAGTACTCTTGGGGCC AGGGCACCACCGTGACAGTGTCTAGCGCCAGCACCAAGGGCCCAAGCGTG TTCCCTCTGGCCCCTTGCAGCAGAAGCACCAGCGAATCTACAGCCGCCCT GGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGA ACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCATACCTTTCCAGCCGTGCTGCAG AGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACTGTGCCCAGCAGCTC TCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAGAGTGCATCACCACCACCATCAC SEQ ID NO: 50: CAT192HC+G (TVTVSGSAS). directo
5'-ccaccgtgacagtgtctggcagcgccagc-3'
SEQ ID NO: 51: CAT192HC+G (TVTVSGSAS), complementario
5'-gctggcgctgccagacactgtcacggtgg-3'
SEQ ID NO: 52: CAT192HC+GG-ST (TVTVSGGSA), directo
5'-ccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagc-3'
SEQ ID NO: 53: CAT 192HC+GG-ST (TVTVSGGSA), complementario
5'-gctggcgctgccgccagacactgtcacggtgg-3'
SEQ ID NO: 54: CAT 192HC+GGGGS (TVTVSGGGGSSAS). directo
5'-caccaccgtgacagtgtctggcggcggcggcagcagcgccagca-3'
SEQ ID NO: 55: CAT 192HC+GGGGS (TVTVSGGGGSSAS). complementario
5'-tgctggcgctgctgccgccgccgccagacactgtcacggtggtg-3'
SEQ ID NO: 56: Cadena pesada mutante con 1 aminoácido adicional insertado EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S SYGMHWVRQAPGKELEWVAVI SYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYYYCARTGEYS GYDTDPQYSWGQGTTVTVSGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEP VT VS WNSGALT SGVHTFP AVLQ S SGLYSLSSVVTVP S S SLGTQT YICNV NHKP SNTK VDKK VEPK S CDKTHT CPPCP APELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISR TPE VTC VVVD V SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S VL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KN Q V SLTCL VKGF YP SDIA VEWE SN GQPENN YKTTPP VLD SDGSFFL Y SKLT V DKSRWQQGNVF SC S VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 57: Cadena pesada mutante con 2 aminoácidos adicionales insertados y 2 aminoácidos eliminados EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S SYGMHWVRQAPGKELEWVAVI SYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYS GYDTDPQYSWGQGTTVTVSGGSAKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEP VT V S WN S GALT S GVHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTQT YICNVN HKP SNTK VDKK VEPK S CDKTHT CPPCP APELLGGP S VFLFPPKPKDTLMI SRTP

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión aislada que se une a TGFpl, en la que la proteína de unión aislada es una IgG, que comprende una primera cadena polipeptídica, una segunda cadena polipeptídica, una tercera cadena polipeptídica y una cuarta cadena polipeptídica, caracterizado por que
(a) se añade un conector a dicha primera y segunda cadena polipeptídica, teniendo cada una de ellas la fórmula de, del extremo N al extremo C: (dominio VL)-(conector1)-(dominio CL), o
(b) se añade un conector a dicha tercera y cuarta cadena polipeptídicas, teniendo cada una de ellas la fórmula de, del extremo N al extremo C: (dominio VH)-(conector2)-(dominio CH1)-(bisagra)-(región Fc), o
(c) tanto (a) como (b);
en la que:
(i) el dominio VL de cada una de la primera y segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y
(ii) el dominio VH de cada una de la tercera y cuarta cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y
en la que el conector1, cuando está presente, y el conector2, cuando está presente, comprenden el residuo aminoacídico o secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista que consiste en G, GG, GGS, GGGS y GGGGS.
2. La proteína de unión aislada de la reivindicación 1, en la que la IgG es una IgG4 humana.
3. La proteína de unión aislada de la reivindicación 2, en la que la IgG4 comprende una mutación S228P (numeración EU).
4. La proteína de unión aislada de la reivindicación 1, en la que la IgG es un isotipo de IgG1 humana.
5. La proteína de unión aislada de la reivindicación 1, en la que cada una de la primera y segunda cadena polipeptídica independientemente comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 38, 39, 40, 41,42 o 43.
6. La proteína de unión aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5, en la que cada una de la tercera y cuarta cadena polipeptídica independientemente comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 18, 56, 57, 58 o 61.
7. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. La proteína de unión aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección resultante directa o indirectamente de la actividad de TGFp1, en la que la enfermedad es
(i) una enfermedad fibrótica, cáncer o una enfermedad mediada por el sistema inmunitario;
(ii) enfermedad del remodelado óseo;
(iii) nefropatía; o
(iv) esclerosis generalizada cutánea difusa.
9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de unión aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6.
10. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 9.
11. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 10.
12. Un método de preparación de la proteína de unión aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 11 en condiciones adecuadas para producir dicha proteína de unión.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI726870B (zh) 2015-03-04 2021-05-11 美商健臻公司 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β１的ｓｃＦｖ-Ｆｃ二聚體
TWI733661B (zh) 2015-03-04 2021-07-21 美商健臻公司 以高親合性、結合性及特異性結合轉化生長因子－β１的經修飾ＩｇＧ抗體
CN109071646A (zh) 2016-03-11 2018-12-21 供石公司 TGFβ1-结合免疫球蛋白及其用途
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
TWI787230B (zh) 2017-01-20 2022-12-21 法商賽諾菲公司 抗ＴＧＦ-β抗體及其用途
US20210221849A1 (en) * 2018-05-10 2021-07-22 Mirabiologics Inc. Artificial Protein Containing Antigen-Binding Region of Antibody and Being Fused With Physiologically Active Peptide
US20220119513A1 (en) * 2020-06-08 2022-04-21 Zoetis Services Llc Anti-tgfb antibodies and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020099179A1 (en) 1989-12-21 2002-07-25 Linda K. Jolliffe Cdr-grafted antibodies
US5616561A (en) 1995-03-31 1997-04-01 Regents Of The University Of California TGF-β antagonists as mitigators of radiation-induced tissue damage
US6492497B1 (en) * 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
EP1486560A3 (en) 1999-04-30 2005-02-09 Cambridge Antibody Technology LTD Specific antibodies and antibody fragments for TGFBETA1
US20060286105A1 (en) 2003-04-30 2006-12-21 Steven Ledbetter Tgf-beta antagonists combined with renin-angiotensin-aldosteron-system antagonists for treating renal insufficiency
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
JP2008513542A (ja) * 2004-09-22 2008-05-01 ジェンザイム・コーポレイション 免疫抑制剤の腎毒性を制限するためのＴＧＦ−βアンタゴニストの使用
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
EP1874818B1 (en) 2005-04-22 2011-04-13 Eli Lilly And Company Tgf beta 1 specific antibodies
AU2006330542B2 (en) 2005-12-23 2012-05-24 Eli Lilly And Company TGF-beta binding compositions
WO2007109254A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
KR20090013763A (ko) 2006-03-23 2009-02-05 기린 파마 가부시끼가이샤 인간 트롬보포이에틴 수용체에 대한 아고니스트 항체
EP3254696A1 (en) * 2006-10-03 2017-12-13 Genzyme Corporation Use of tgf beta antagonists to treat infants at risk of developing bronchopulmonary dysplasia
CN102264390A (zh) 2008-07-02 2011-11-30 新兴产品开发西雅图有限公司 Il6免疫治疗
US9409950B2 (en) 2010-12-23 2016-08-09 Biogen Ma Inc. Linker peptides and polypeptides comprising same
TWI743461B (zh) * 2011-03-28 2021-10-21 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
KR102051014B1 (ko) * 2011-06-03 2019-12-04 조마 테크놀로지 리미티드 Tgf-베타에 특이적인 항체
US20140072581A1 (en) 2012-07-23 2014-03-13 Zymeworks Inc. Immunoglobulin Constructs Comprising Selective Pairing of the Light and Heavy Chains
TWI664979B (zh) 2013-03-11 2019-07-11 健臻公司 經生物工程之抗-ＴＧＦ-β抗體及抗原結合片段
TWI726870B (zh) 2015-03-04 2021-05-11 美商健臻公司 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β１的ｓｃＦｖ-Ｆｃ二聚體
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