ES2711117T3 - Indoles mono o disustituidos como inhibidores de la replicación del virus del dengue - Google Patents

Indoles mono o disustituidos como inhibidores de la replicación del virus del dengue Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula (I)**Fórmula** una forma estereoisomérica, una sal, un solvato o un polimorfo farmacéuticamente aceptables de este, que comprende un grupo indol mono o disustituido; dicho compuesto se selecciona de un grupo donde R1 es H, R2 es F y R3 es H, F o CH3; R1 es F o CH3, R2 es OCH3 y R3 es H; R1 es H, R2 es Cl y R3 es H o CH3; R1 es F, R2 es H y R3 es CH3; R1 es H, R2 es OCH3 y R3 es Cl; R1 es F, R2 es F y R3 es H; R1 es H, R2 es OCH3 y R3 es CH3 o R1 es CH3, R2 es H y R3 es F.

Description

DESCRIPCION
Indoles mono o disustituidos como inhibidores de la replicacion del virus del dengue
La presente invencion se refiere a compuestos de indol mono o disustituidos, y al uso de dichos compuestos como medicamento, mas preferiblemente a su uso como un medicamento para tratar o prevenir infecciones por el virus del dengue. La presente invencion se refiere ademas a composiciones farmaceuticas o preparaciones de combinacion de compuestos y a composiciones o preparados para uso como medicamento, mas preferiblemente para la prevencion o tratamiento de infecciones por el virus del dengue. Tambien se divulgan los procesos de preparacion de los compuestos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los flavivirus, que son transmitidos por los mosquitos o las garrapatas, causan infecciones que ponen en riesgo la vida de los seres humanos, como la encefalitis y la fiebre hemorragica. Se conocen cuatro serotipos distintos, aunque estrechamente vinculados, del dengue flavivirus, denominados DENV1, -2, -3 y -4. El dengue es endemico en la mayona de las regiones tropicales y subtropicales de todo el mundo, principalmente en zonas urbanas y semiurbanas. Segun la Organizacion Mundial de la Salud (OMS), 2.500 millones de personas, de las cuales mil millones son ninos, presentan riesgo de infeccion por DENV (OMS, 2002). Se estima que cada ano, se producen en el mundo entre 50 y 100 millones de casos de fiebre del dengue [FD], medio millon de casos de enfermedad del dengue grave (es decir, fiebre hemorragica por dengue [DHF] y smdrome de shock por dengue [DSS]), y mas de 20.000 muertes. La DHF se ha convertido en la principal causa de hospitalizacion y muerte entre los ninos en regiones endemicas. En conjunto el dengue representa la causa mas comun de enfermedad por arbovirus. Debido a los grandes brotes, que han tenido lugar recientemente en pafses situados en Latinoamerica, el Sudeste Asiatico y el Padfico Occidental (incluso Brasil, Puerto Rico, Venezuela, Camboya, Indonesia, Vietnam, Tailandia), la cantidad de casos de dengue ha aumentado drasticamente en los ultimos anos. No solo la cantidad de casos de dengue esta en aumento, a medida que la enfermedad se propaga a nuevas areas, sino que ademas, los brotes tienden a ser mas graves.
Para prevenir y/o controlar la enfermedad asociada con la infeccion del virus del dengue, los unicos metodos disponibles en la actualidad son las estrategias de erradicacion de mosquitos para controlar el vector. Aunque se esta avanzando en el desarrollo de vacunas contra el dengue, han surgido muchas dificultades. Estas dificultades incluyen la existencia de un fenomeno, que se conoce como mejora dependiente de anticuerpos (ADE).
La recuperacion de una infeccion causada por un serotipo proporciona inmunidad de por vida contra ese serotipo, pero solo confiere una proteccion parcial y transitoria contra una infeccion subsiguiente provocada por uno de los otros tres serotipos. Despues de la infeccion con otro serotipo, los anticuerpos heterologos preexistentes forman complejos con el serotipo del virus del dengue de la nueva infeccion, pero no neutralizan el patogeno. Por el contrario, se cree que se facilita el ingreso del virus a las celulas, lo que resulta en la replicacion no controlada del virus y tttulos virales con picos mayores. Tanto en las infecciones primarias como en las secundarias, los tttulos virales mas altos se asocian con la enfermedad del dengue mas grave. Dado que los anticuerpos maternos pueden pasar facilmente a los ninos mediante la lactancia, esta podna ser una de las razones por la que los ninos se ven mas afectados por la enfermedad del dengue grave que los adultos.
En sitios donde dos o mas serotipos que circulan simultaneamente, tambien conocidos como regiones hiperendemicas, el riesgo de la enfermedad del dengue grave es significativamente mayor debido a un mayor riesgo de sufrir una infeccion secundaria, mas grave. Por otra parte, en una situacion de hiperendemicidad, la probabilidad de aparicion de cepas mas virulentas se incrementa, lo que a su vez aumenta la probabilidad de fiebre hemorragica por dengue (DHF) o smdrome de shock por dengue.
Los mosquitos que transmiten el dengue, incluso los mosquitos de los generos Aedes aegypti y Aedes albopictus (mosquito tigre) se estan dirigiendo hacia el Norte. Segun los Centros para el Control y la Prevencion de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos, actualmente, ambos generos de mosquitos se encuentran omnipresentes en el sur de Texas. La propagacion de mosquitos portadores del dengue hacia el Norte no se limita a los Estados Unidos, si no que se ha observado tambien en Europa.
A pesar de los grandes esfuerzos de las ultimas tres decadas, actualmente, no existe una vacuna disponible para proteger a los seres humanos contra la enfermedad del virus del dengue. El problema principal radica en desarrollar una vacuna, que ofrezca proteccion contra los cuatro serotipos en la misma medida (una vacuna tetravalente). Ademas, hoy en dfa, no existen farmacos antivirales espedficos para el tratamiento o la prevencion de la infeccion por el virus de la fiebre del dengue. Claramente, aun existe una gran necesidad medica no satisfecha de contar con agentes terapeuticos para la prevencion o el tratamiento de infecciones virales en animales, mas espedficamente, en seres humanos y, particularmente, para las infecciones virales causadas por Flavivirus, mas espedficamente, el virus del dengue. Los compuestos con buena potencia antiviral, niveles reducidos de efectos secundarios, de existir, un amplio espectro de actividad contra multiples serotipos del virus del dengue, una toxicidad baja y/o buenas propiedades farmacocineticas o dinamicas resultan muy necesarios. El documento WO/2013/045516 divulga compuestos indol como inhibidores de la replicacion viral.
La presente invencion proporciona compuestos, derivados de indol mono o disustituido, que muestran una actividad potente y elevada contra los cuatro (4) serotipos del virus del dengue. Por otra parte, los compuestos de conformidad con la invencion poseen un buen perfil farmacocinetico y, sorprendentemente, estos compuestos espedficos muestran una mejor estabilidad quiral.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion se basa en el hallazgo inesperado, que indica que al menos uno de los problemas mencionados anteriormente se puede resolver mediante los compuestos actuales de la invencion.
La presente invencion proporciona compuestos, que han probado poseer una actividad antiviral potente contra los cuatro (4) serotipos conocidos actualmente. La presente invencion demuestra, ademas, que estos compuestos inhiben de manera eficiente la proliferacion de virus del dengue (DENV). Por lo tanto, estos compuestos constituyen una clase util de compuestos potentes, que se puede utilizar en el tratamiento y/o la prevencion de infecciones virales en animales, mairnferos y seres humanos, mas espedficamente para el tratamiento y/o la prevencion de infecciones por el virus del dengue.
La presente invencion se refiere ademas a dichos compuestos para uso como medicamentos y a su uso para la fabricacion de medicamentos para el tratamiento y/o la prevencion de las infecciones virales, en particular, las infecciones causadas por los virus pertenecientes a la familia de los virus del dengue en animales o mamfferos, mas espedficamente, en seres humanos. Tambien se divulgan en la presente metodos para la preparacion de todos estos compuestos y a composiciones farmaceuticas que los comprenden en una cantidad efectiva.
La presente invencion tambien se refiere a dichos compuestos para uso en un metodo de tratamiento o prevencion de infecciones causadas por el virus del dengue en seres humanos, mediante la administracion de una cantidad efectiva de uno o mas de dichos compuestos, o una sal farmaceuticamente aceptable de estos, opcionalmente en combinacion con uno o mas medicamentos, como otro agente antiviral, a un paciente en necesidad de tratamiento. Un aspecto de la invencion consiste en proporcionar compuestos de formula (I)
Figure imgf000003_0001
una forma estereoisomerica, una sal, un solvato o un polimorfo farmaceuticamente aceptables de estos, que comprende un grupo indol mono o disustituido; dicho compuesto se selecciona de un grupo donde
Ri es H, R2 es F y R3 es H, F o CH3 ;
R1 es F o CH3, R2 es OCH3 y R3 es H;
Ri es H, R2 es Cl y R3 es H o CH3;
Ri es F, R2 es H y R3 es CH3;
Ri es H, R2 es OCH3 y R3 es Cl;
Ri es F, R2 es F y R3 es H;
Ri es H, R2 es OCH3 y R3 es CH3 o
Ri es CH3 , R2 es H y R3 es F.
En particular, los compuestos de la invencion o su forma estereoisomerica, una sal, un solvato o un polimorfo farmaceuticamente aceptables de estos, se seleccionan del grupo:
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Figure imgf000005_0001
Parte de la presente invencion es tambien una composicion farmaceutica, que comprende un compuesto de formula (I) o una forma estereoisomerica, una sal, un solvato o un polimorfo farmaceuticamente aceptables de este, junto con uno o mas excipientes, diluyentes o vehnculos farmaceuticamente aceptables.
Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos de formula (I) incluyen las sales de adicion de acido y las sales basicas de dichos compuestos. Las sales de adicion de acido adecuadas se forman a partir de acidos, que forman sales no toxicas. Las sales basicas adecuadas se forman a partir de bases, que forman sales no toxicas.
Lo compuestos de la invencion tambien pueden existir en formas no solvatadas y solvatadas. El termino "solvato" se usa en la presente para describir un complejo molecular, que comprende el compuesto de la invencion y una o mas moleculas de disolvente farmaceuticamente aceptables, por ejemplo, etanol.
El termino "polimorfo" se refiere a la capacidad del compuesto de la invencion de existir en mas de una forma o estructura cristalina.
Los compuestos de la presente invencion pueden administrarse como productos cristalinos o amorfos. Pueden obtenerse, por ejemplo, como tapones, polvos o pelfculas solidas por metodos como precipitacion, cristalizacion, secado por congelacion, secado por pulverizacion o secado por evaporacion. Se pueden administrar solos o en combinacion con uno o mas otros compuestos adicionales de la invencion o en combinacion con uno o mas farmacos adicionales. Generalmente, se administraran como una formulacion en asociacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. El termino "excipiente" se usa en la presente para describir cualquier ingrediente distinto del o los compuestos de la invencion. La eleccion del excipiente depende en gran medida de factores como el modo particular de administracion, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y estabilidad y la naturaleza de la forma de dosificacion.
Los compuestos de la presente invencion o cualquier subgrupo de estos pueden formularse en diversas formas farmaceuticas para propositos de administracion. Como composiciones apropiadas se pueden citar todas las composiciones empleadas usualmente para administrar farmacos sistemicamente. Para preparar las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, se combina una cantidad efectiva del compuesto particular, opcionalmente en forma de sal de adicion, como el ingrediente activo en mezcla con un vehfculo farmaceuticamente aceptable; el vetnculo puede tomar una amplia variedad de formas en funcion de la forma de preparacion deseada para la administracion. Estas composiciones farmaceuticas se encuentran deseablemente en forma de dosificacion unitaria adecuada, por ejemplo, para administracion oral o rectal. Por ejemplo, para preparar las composiciones en forma de dosificacion oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmaceuticos habituales, como agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares en el caso de preparaciones lfquidas orales, como suspensiones, jarabes, elixires, emulsiones y soluciones o vehfculos solidos, como almidones, azucares, caolm, diluyentes, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares en el caso de polvos, pfldoras, capsulas y tabletas. Debido a su facilidad de administracion, las tabletas y capsulas representan las formas unitarias de dosificacion oral mas ventajosa, en cuyo caso se emplean obviamente vetnculos farmaceuticos solidos. Tambien se incluyen preparaciones en forma solida, que se pueden convertir, poco antes de su uso, en formas lfquidas.
Resulta especialmente ventajoso formular las composiciones farmaceuticas mencionadas anteriormente en forma de dosificacion unitaria para facilitar la administracion y uniformidad de la dosis. Forma de dosificacion unitaria, como se utiliza en la presente, se refiere a unidades ffsicamente diferenciadas, adecuadas como dosificaciones unitarias. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vetnculo farmaceutico requerido. Los ejemplos de dichas formas de dosificacion unitaria incluyen tabletas (incluso tabletas ranuradas o recubiertas), capsulas, pfldoras, paquetes de polvos, obleas, supositorios, soluciones o suspensiones inyectables y similares asf como multiplos segregados de estas.
Los entendidos en el tratamiento de enfermedades infecciosas podran determinar la cantidad efectiva a partir de los resultados de las pruebas, que se presentan a continuacion. En general, se considera que una cantidad diaria efectiva oscilana entre 0,01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, mas preferiblemente entre 0,1 mg/kg y 10 mg/kg de peso corporal. Puede ser apropiado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o mas subdosis a intervalos apropiados a lo largo del dfa. Dichas subdosis se pueden formular como formas de dosificacion unitarias, por ejemplo, pueden incluir una cantidad de ingrediente activo por forma de dosificacion unitaria de 1 a 1000 mg y, en particular, de 5 a 200 mg.
La dosificacion y frecuencia de administracion exactas dependen del compuesto particular de formula (I) utilizado, la afeccion particular que se esta tratando, la gravedad de la afeccion que se esta tratando, la edad, el peso y la condicion ffsica general del paciente particular asf como de otra medicacion que el sujeto pueda estar tomando, como es bien sabido por los entendidos en la tecnica. Ademas, es evidente que la cantidad efectiva puede reducirse o aumentarse en funcion de la respuesta del sujeto tratado y/o de la evaluacion del medico, que prescribe los compuestos de la presente invencion. Por lo tanto, las escalas de cantidad efectiva mencionadas anteriormente son meramente orientativas y no estan destinadas a limitar el alcance o uso de la invencion en ninguna medida.
La presente divulgacion tambien pretende incluir todos los isotopos de atomos, que se encuentran en los compuestos de la invencion. Por ejemplo, los isotopos de hidrogeno incluyen tritio y deuterio y los isotopos de carbono incluyen C-13 y C-14.
Los presentes compuestos utilizados en la presente invencion tambien pueden existir en su forma estereoqmmicamente isomera, donde se definen todos los compuestos posibles constituidos por los mismos atomos unidos por la misma secuencia de enlaces, pero con diferentes estructuras tridimensionales, que no son intercambiables. Salvo que se mencione o indique lo contrario, la designacion qmmica de los compuestos abarca la mezcla de todas las formas estereoqmmicamente isomeras posibles, que pueden poseer dichos compuesto.
Dicha mezcla puede contener todos los diastereomeros y/o enantiomeros de la estructura molecular basica de dicho compuesto. Todas las formas estereoqmmicamente isomeras de los compuestos utilizados la presente invencion, tanto en forma pura o mezcladas unas con otras, estan incluidas dentro del alcance de la presente invencion, incluso cualquier mezcla racemica o racemato.
Las formas estereoisomeras puras de los compuestos e intermedios como se menciona en la presente se definen como isomeros sustancialmente libres de otras formas enantiomericas o diastereomericas de la misma estructura molecular basica de dichos compuestos o intermedios. En particular, el termino 'estereoisomericamente puros' se refiere a compuestos o intermedios, que tienen un exceso estereoisomerico de al menos el 80% (es decir, mmimo el 90% de un isomero y maximo el 10% de los otros isomeros posibles) hasta un exceso estereoisomerico del 100% (es decir, el 100% de un isomero y nada del otro), mas espedficamente, compuestos o intermedios, que tienen un exceso estereoisomerico del 90% hasta el 100%, incluso mas espedficamente, que tienen un exceso estereoisomerico del 94% hasta el 100% y, mas en particular, que tienen un exceso estereoisomerico del 97% hasta el 100%. Los terminos "enantiomericamente puro" y "diastereomericamente puro" deben entenderse de una manera similar, pero teniendo en cuenta el exceso enantiomerico, respectivamente el exceso diastereomerico de la mezcla en cuestion.
Las formas estereoisomeras puras de los compuestos e intermedios utilizados en esta invencion se pueden obtener mediante la aplicacion de procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los enantiomeros pueden separarse entre sf por medio de la cristalizacion selectiva de sus sales diastereomericas con acidos o bases opticamente activas. Los ejemplos incluyen acido tartarico, acido dibenzoiltartarico, acido ditoluoiltartarico y acido canfosulfonico. Alternativamente, los enantiomeros pueden separarse por tecnicas cromatograficas, mediante el uso de fases estacionarias quirales. Dichas formas estereoqmmicamente isomericas puras tambien se pueden derivar de las correspondientes formas estereoqmmicamente isomericas puras de los materiales de partida apropiados, siempre que la reaccion ocurra estereoespedficamente. Preferiblemente, si se desea un estereoisomero espedfico, dicho compuesto se sintetizara por metodos de preparacion estereoespedficos. Estos metodos emplearan ventajosamente materiales de partida enantiomericamente puros.
Enfoques sinteticos generales
La smtesis de compuestos de formula general I puede llevarse a cabo como se describe en el Esquema 1. El acido acetico 2-(4-fluoro-2-metoxifenil) (II) se puede convertir en el correspondiente cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil) acetilo (III) con un reactivo de cloracion, como cloruro de tionilo. La reaccion de Friedel-Crafts del cloruro de acido III con un indol sustituido de formula general IV se puede realizar mediante un reactivo acido de Lewis, como AlCh o Et2AlCl en un disolvente adecuado, como Ch^Ch, y en condiciones de reaccion adecuadas, que implican tfpicamente refrigeracion, para proporcionar el indol 3-acilado de formula general V. La introduccion de una porcion anilina en la posicion alfa con respecto a la porcion carbonilo de los compuestos de formula general V se puede lograr mediante una secuencia de reaccion, que implica, por ejemplo, bromacion de V con un reactivo, como tribromuro de feniltrimetilamonio, en un disolvente adecuado, como THF, para proporcionar los compuestos de formula general VI y la posterior reaccion de los compuestos de formula general VI con 2(3-amino-5-metoxifenoxi) etanol (VII) en un disolvente adecuado, como CH3CN, y tfpicamente mediante una base, como TEA o DIPEA, para proporcionar los compuestos de formula general I como mezclas racemicas. Alternativamente, los compuestos de formula general VI se pueden hacer reaccionar con una anilina O-protegida de formula general VIII (PG = grupo protector) en un disolvente adecuado, como CH3CN, y tfpicamente mediante una base, como TEA o DIPEA, para proporcionar los compuestos de formula general IX. Un grupo protector util es, por ejemplo, tercbutilo (PG = fBu). La eliminacion del grupo protector de los compuestos de formula general IX se puede realizar por metodos, con los que los entendidos en la tecnica estan familiarizados, que incluyen, por ejemplo, un reactivo, como acido clorddrico concentrado (para PG = fBu), para proporcionar los compuestos de formula general I como mezclas racemicas. La separacion quiral de los compuestos de formula general I se puede realizar, por ejemplo, mediante cromatograffa quiral para proporcionar los enantiomeros A y B de la formula general I.
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Esquema 1
Ejemplos
Metodos LC/MS
La medicion por Cromatograffa Lfquida de Alta Resolucion (HPLC) se realizo mediante el uso de una bomba LC, una red de diodos (DAD) o un detector de rayos UV y una columna, como se especifica en los metodos correspondientes. De ser necesario, se incluyen detectores adicionales (vease la tabla de metodos, que se incluye a continuacion).
El flujo de la columna se lleva al espectrometro de masas (MS), que se configura con una fuente de iones de presion atmosferica. Esta dentro del conocimiento del entendido establecer los parametros de ajuste (por ejemplo, rango de barrido, tiempo de permanencia...) con el fin de obtener los iones, que permiten la identificacion del peso molecular (MW) monoisotopico nominal del compuesto. La adquisicion de datos se realizo con el software adecuado.
Los compuestos se describen por sus tiempos de retencion experimentales (Rt) y iones Si no se especifica de forma diferente en la tabla de datos, el ion molecular reportado corresponde a [M+H]+ (molecula protonada) y/o [M-H]" (molecula desprotonada). En caso de que el compuesto no fuera directamente ionizable, se especifica el tipo de aducto (es decir, [M+NH4I+, [M+HCOO]", etc...). Para moleculas con multiples patrones isotopicos (Br, Cl), el valor reportado es el obtenido para la masa de isotopos mas baja. Todos los resultados se obtuvieron con incertidumbres experimentales, que se asocian comunmente con el metodo utilizado.
En adelante, "SQD" significa Detector Cuadruplo Simple; "MSD", Detector Selectivo de Masas; "RT", temperatura ambiente; "BEH", tnbrido enlazado de etilsiloxano/sflice; "DAD", Detector de Rayos de Diodo; "HSS", Sflice de Alta Resistencia.
Codigos del metodo LCMS (flujo expresado en mL/min., temperatura en columna (T) en °C, tiempo de ejecucion en minutos)
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Metodos SFC-MS
La medicion SFC se realizo por medio de un sistema de cromatograffa de fluidos supercnticos (SFC), compuesto por una bomba binaria para la liberacion de dioxido de carbono (CO2) y un modificador, un muestreador automatico, un horno de columna, un detector de red de diodos equipado con una celda de flujo de alta presion de hasta 400 bares. Si se configura con un Espectrometro de Masas (MS), el flujo de la columna se lleva al (MS). Esta dentro del conocimiento del entendido establecer los parametros de ajuste (por ejemplo, rango de barrido, tiempo de permanencia...) con el fin de obtener los iones, que permiten la identificacion del peso molecular (MW) monoisotopico nominal del compuesto. La adquisicion de datos se realizo con el software adecuado.
Metodos analfticos SFC-MS (flujo expresado en mL/min., temperatura de columna (T) en °C, tiempo de ejecucion en minutos, contrapresion en bares).
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Puntos de fusion
Los valores son o bien los valores maximos o los rangos de fusion y se obtienen con las incertidumbres experimentales, que se asocian comunmente con este metodo analftico.
DSC823e (indicado como DSC)
Para una serie de compuestos, los puntos de fusion se determinaron con un DSC823e (Mettler-Toledo). Los puntos de fusion se midieron con un gradiente de temperatura de 10°C/minuto. La temperatura maxima fue de 300°C.
Rotaciones opticas:
Las rotaciones opticas se midieron en un polanmetro Perkin-Elmer 341 con una lampara de sodio y se reportaron como se indica a continuacion: [a]° (A, c g/100ml, disolvente, T°C).
[a]xT = (100a) / (l x c) : donde l es la longitud de ruta en dm y c es la concentracion en g/100 ml para una muestra a una temperatura T (°C) y una longitud de onda A (en nm). Si la longitud de onda de la luz usada es 589 nm (lmea D de sodio), entonces el sfmbolo D podna utilizarse en su lugar. Siempre se debe dar el signo de la rotacion (+ o -). Cuando se utiliza esta ecuacion, la concentracion y el disolvente siempre se proporcionan entre parentesis despues de la rotacion. La rotacion se representa mediante el uso de grados y no se proporcionan unidades de concentracion (se supone que es g/100 ml).
Ejemplo_____1: Smtesis de 1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 1) y separacion quiral en enantiomeros 1A y 1B.
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Sintesis del intermediario 1a:
Se agrego en porciones pequenas acido 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetico [CAS 886498-61-9] (28.9 g, 157 mmol) a cloruro de tionilo (150 mL) y la solucion resultante se agito durante la noche a temperature ambiente. El disolvente se concentro bajo presion reducida y se co-evaporo con tolueno para proporcionar cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (31.8 g) como un residuo aceitoso que se uso sin purificacion adicional en la siguiente etapa.
Sintesis del intermediario 1b:
Una solucion de 6-fluoro-1H-indol [CAS 399-51-9] (14.2 g, 105 mmol) en CH2Cl2 (400 mL) se enfrio a 0°C bajo atmosfera-N2. Una solucion de cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (160 mL, 160 mmol) se agrego durante un periodo de 10 min a la solucion agitada y la mezcla resultante se mantuvo a 0°C durante 40 min. Posteriormente, una solucion de cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (31.8 g, 160 mmol) en CH2Cl2 (300 mL) se agrego por goteo durante un periodo de 2.5 h mientras que la temperatura interna de la mezcla de reaccion se mantuvo por debajo de 5°C. La temperatura de la mezcla de reaccion agitada se mantuvo a 0°C durante 3.5 h. El bano de hielo se elimino y despues de agitarse a temperatura ambiente durante 2.5 h, la mezcla de reaccion se enfrio nuevamente a 0°C y la reaccion se inactivo mediante la adicion lenta de una solucion de tetrahidrato tartrato de potasio y sodio (sal de Rochelle) [CAS 6100-16-9] (59.6 g, 210 mmol) en agua (70 mL) mientras se manterna la temperatura interna de la mezcla por debajo de 10°C. Despues de agitar durante 30 min adicionales a 0°C, el bano de hielo se elimino y la mezcla resultante se diluyo con THF (1 L). Na2SO4 (150 g) se agrego y despues de agitacion durante la noche, la mezcla se filtro sobre dicalite®. La torta de filtrado se lavo dos veces con THF (2x 1 L). Los filtrados combinados se evaporaron bajo presion reducida a un volumen residual de aproximadamente 50 mL. Se filtro un precipitado blanco y se seco al vacfo a 50°C para proporcionar 1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 1b (22.3 g) como un polvo blanco.
Sintesis de compuesto 1 y separacion quiral de enantiomeros 1A y 1B:
Una solucion agitada de 1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 1b (11.0 g, 36.5 mmol) en THF (300 mL) se enfrio a 0°C bajo atmosfera-N2. Una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (13.9 g, 36.9 mmol) en THF (100 mL) se agrego por goteo durante un periodo de 45 min. La suspension resultante se agito a temperatura ambiente durante 5 h y se evaporo bajo presion reducida hasta un residuo blanco. Este residuo, que conterna la 2-bromo-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona en bruto 1c, se disolvio en acetonitrilo (300 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente. Despues de la adicion de 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAs 725237-16-1] (13.4 g, 73 mmol) y diisopropiletilamina (12.6 mL, 73 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante dos dfas - hasta una conversion completa a Compuesto 1. La mezcla de reaccion se vertio en agua (1.5 L) y se extrajo con 2-metil-THF (2x 750 mL). Los extractos combinados se lavaron con HCl 0.5N (800 mL), una solucion saturada acuosa de NaHCO3 (200 mL) y salmuera (200 mL), se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron bajo presion reducida. El residuo aceitoso se purifico mediante HPLC preparativa (fase estacionaria: RP Uptisphere® Prep C18 ODB -10 pm, 30 x 150 mm, fase movil: 0.25% NH4HCO3 solucion en agua, CH3CN). Las fracciones del producto se concentraron, se disolvieron en metanol y se concentraron nuevamente para producir 1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 1, 9.3 g) como una mezcla racemica.
La separacion quiral de los enantiomeros del Compuesto 1 (9.3g) se realizo mediante HPLC quiral de fase normal (fase estacionaria: AS 20 pm (1 kg), fase movil: 100% MeOH). Las fracciones del producto se combinaron y se evaporaron para proporcionar el enantiomero 1A (4.5 g) como el primer producto eluido y el enantiomero 1B (4.6 g) como el segundo producto eluido. Los enantiomeros 1A y 1B se obtuvieron como aceites pegajosos. El enantiomero 1A (4.5 g) se precipito desde una solucion en MeOH (20 mL) mediante la adicion lenta de agua (11 mL). Despues de agitar durante 30 min a temperatura ambiente un solido blanco se filtro, se lavo con cantidades pequenas de una mezcla de MeOH/agua (1/1) y se seco al vado a 50°C para proporcionar el enantiomero 1A (2.4 g) como un polvo amorfo blanco. El enantiomero 1B (4.6 g) se solidifico mediante trituracion del residuo aceitoso con una mezcla de MeOH (10 mL) y agua (15 mL) bajo agitacion vigorosa durante 25 min. Los solidos se filtraron y posteriormente se cristalizaron a partir de una mezcla de MeOH (70 mL) y agua (30 mL) bajo agitacion a temperatura ambiente durante 3 h. Se filtro un precipitado blanco y se seco al vado a 50°C para proporcionar el enantiomero 1B (2.50 g) como un polvo amorfo blanco.
Compuesto 1:
1H RMN (360 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 3.64 (c, J=4.9 Hz, 2 H), 3.61 (s, 3 H), 3.76 - 3.90 (m, 2 H), 3.96 (s, 3 H), 4.80 (t, J=5.3 Hz, 1 H), 5.72 (t, J=2.2 Hz, 1 H), 5.94 (d, J=2.2 Hz, 2 H), 6.14 (d, J=8.0 Hz, 1 H), 6.38 (d, J=8.1 Hz, 1 H), 6.73 (td, J=8.4, 2.6 Hz, 1 H), 6.93 (dd, J=11.5, 2.4 Hz, 1 H), 7.06 (ddd, J=9.7, 8.8, 2.4 Hz, 1 H), 7.27 (dd, J=9.5, 2.2 Hz, 1 H), 7.37 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H), 8.15 (dd, J=8.8, 5.9 Hz, 1 H), 8.43 (s, 1 H), 12.07 (s a, 1 H)
LC/MS (metodo LC-B): Rt 1.86 min, MH+ 483
Enantiomero 1A:
1H RMN (360 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 3.60 (s, 3 H) 3.64 (m, J=6.60 Hz, 2 H) 3.73 - 3.90 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.80 (t, J=4.94 Hz, 1 H) 5.71 (s a., 1 H) 5.93 (s a., 2 H) 6.14 (d, J=7.95 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=7.97 Hz, 1 H) 6.73 (t, J=8.41 Hz, 1 H) 6.93 (d, J=11.24 Hz, 1 H) 7.05 (t, J=9.02 Hz, 1 H) 7.27 (d, J=9.58 Hz, 1 H) 7.37 (t, J=7.70 Hz, 1 H) 8.09 - 8.19 (m, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 12.06 (s, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.03 min, MH+ 483
[a]D20: 96.9° (c 0.389, DMF)
SFC quiral (metodao SFC-F): Rt 1.73 min, MH+ 483, pureza quiral 100%.
Enantiomero 1B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (t, J=5.12 Hz, 2 H) 3.76 - 3.89 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.77 (s a, 1 H) 5.71 (t, J=2.01 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=2.11 Hz, 2 H) 6.14 (d, J=7.97 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=8.00 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.49, 2.44 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=11.36, 2.48 Hz, 1 H) 7.05 (td, J=9.29, 2.38 Hz, 1 H) 7.26 (d, J=9.49 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.58, 6.88 Hz, 1 H) 8.14 (dd, J=8.77, 5.59 Hz, 1 H) 8.42 (s, 1 H) 12.08 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.03 min, MH+ 483
[a]D20: -100.0° (c 0.478, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-F): Rt 2.38 min, MH+ 483, pureza quiral 100%.
Ejemplo 1.1: Estabilidad quiral del enantiomero 1A a pH 7.4
La estabilidad quiral del enantiomero 1A (R = OMe) se evaluo mediante determinacion del exceso enantiomerico (ee%) despues de la incubacion durante 24 h y 48 h en una solucion tamponada a pH 7.4 a 40°C y 60°C. Para evaluar la influencia del sustituyente-metoxi del enantiomero 1A (R = OMe) en la estabilidad contra racemizacion, la estabilidad quiral del enantiomero 1'A (R = H) se evaluo bajo las mismas condiciones.
A esta altura, se prepararon (pH = 7.4) soluciones tamponadas 5 pM de 1A y 1'A mediante la mezcla de 25 pL de una solucion 100 pM de 1A o 1'A en DMSO con tampon 475 pL acuoso pH 7.4. Se tomaron muestras 24 h y 48 h despues de la incubacion a 40°C y 60°C. Las muestras analfticas se analizaron mediante SFC quiral (deteccion MS) y la pureza quiral se expreso como el exceso enantiomerico (ee% = % enantiomero A - % enantiomero B). Ambos enantiomeros 1A y 1'A tuvieron una pureza quiral de 100% antes de
su incubacion.
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Ejemplo 2: Smtesis de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 2) y separacion quiral en enantiomeros 2A y 2B.
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Smtesis del intermediario 2a:
Una solucion agitada de 6-fluoro-7-metil-1H-indol [CAS 57817-10-4] (5.41 g, 36.2 mmol) en CH2CI2 (100 mL) se enfrio en hielo bajo atmosfera-N2. Una solucion de cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (54.4 mL, 54.4 mmol) se agrego por goteo. Despues de 15 min a 0°C, una solucion de cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (11.0 g, 54.4 mmol, para sintesis: vease Ejemplo 1) en CH2O 2 (30 mL) se agrego por goteo mientas la temperatura interna se mantuvo por debajo de 5°C. El bano de hielo se elimino y la suspension resultante se agito a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reaccion se vertio lentamente en una solucion fna (0°C) saturada acuosa de NaHCO3. La mezcla se filtro sobre dicalite® y la torta de filtrado se lavo con THF. Los filtrados combinados se extrajeron con EtOAc, se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron bajo presion reducida. El residuo se trituro con CH2Cl2 y los solidos se filtraron para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2a (7.47 g) como un polvo blanco.
Sintesis del intermediario 2b:
Una solucion agitada de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2a (7.43 g, 23.56 mmol) en THF (100 mL) se enfrio a 0°C bajo atmosfera-N2. Una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207­ 56-1] (8.96 g, 23.8 mmol) en THF (100 mL) se agrego por goteo. Despues de la adicion, la mezcla de reaccion se agito durante 2 h a temperatura ambiente. La suspension se filtro para eliminar los solidos y el filtrado se evaporo bajo presion reducida. El residuo se trituro con CH2Cl2 , los solidos se filtraron y se secaron al vado para proporcionar 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2b (8.95 g).
Sintesis de compuesto 2 y separacion quiral de enantiomeros 2A y 2B:
2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2b (3.30 g, 8.38 mmol), 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (1.54 g, 8.38 mmol) y diisopropiletilamina (1.44 mL, 8.38 mmol) se mezclaron en CH3CN (100 mL) y la mezcla se calento bajo reflujo durante 3 h. Despues de enfriar a temperatura ambiente, el disolvente se evaporo bajo presion reducida y el residuo se purifico mediante cromatograffa en columna sobre sflice (fase estacionaria: HP-Spher 25 pm (340 g), fase movil: gradiente heptano/EtOAc: 100/0 a 0/100). Las fracciones del producto se concentraron y se purificaron posteriormente mediante HPLC preparativa (fase estacionaria: Uptisphere® C18 ODB - 10 pm, 200 g, 5 cm, fase movil: 0.25% NH4HCO3 solucion en agua, CH3CN). Las fracciones del producto se concentraron, se disolvieron en metanol y se concentraron nuevamente para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 2, 1.4 g) como una mezcla racemica.
La separacion quiral de los enantiomeros del compuesto 2 (1.18 g) se realizo mediante SFC preparativa (fase estacionaria: Quiralcel® Diacel® OD 20 x 250 mm, fase movil: CO2, EtOH con 0.2% /PrNH2) y evaporacion de las fracciones del producto bajo presion reducida. El primer enantiomero eluido se aislo como la sal del acido clortndrico mediante precipitacion a partir de una mezcla de MeOH (30 mL), HCl 1N (5 mL) y agua (130 mL). Un precipitado blanco se formo despues de la agitacion durante la noche y se filtro y se seco al vado a temperatura ambiente para proporcionar 328 mg de enantiomero 2A (como la sal del acido clortndrico). El segundo enantiomero eluido se solidifico mediante liofilizacion a partir de una mezcla de CH3CN/agua para proporcionar 385 mg de enantiomero 2B como un polvo amorfo.
Compuesto 2:
1H RMN (360 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2.38 (d, J=1.62 Hz, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.12 Hz, 2 H) 3.76 - 3.89 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.54 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.11 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.13 Hz, 2 H) 6.16 (d, J=7.95 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=7.96 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.49, 2.47 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.37, 2.49 Hz, 1 H) 7.01 (dd, J=10.29, 8.71 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.62, 6.85 Hz, 1 H) 7.96 (dd, J=8.73, 5.18 Hz, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 12.19 (s, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.08 min, MH+ 497
Enantiomero 2A:
1H RMN (360 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 2.38 (d, J=0.22 Hz, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.64 (t, J=5.21 Hz, 2 H) 3.83 (ct, J=10.02, 5.27 Hz, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 5.71 (t, J=1.46 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.11 Hz, 2 H) 6.16 (s a., 1 H) 6.36 (s a, 1 H) 6.72 (td, J=8.55, 2.62 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.33, 2.46 Hz, 1 H) 7.01 (t, J=9.49 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.64, 6.90 Hz, 1 H) 7.96 (dd, J=8.73, 5.39 Hz, 1 H) 8.43 (d, J=3.24 Hz, 1 H) 12.19 (d, J=2.95 Hz, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.08 min, MH+ 497
[a]D20: -82.7° (c 0.5055, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-G): Rt 1.69 min, MH+ 497, pureza quiral 100%.
Analisis CHN: Calc. anal. para C2/H 26F2N2O5.HCl: C, 60.85; H, 5.11; N, 5.26. Encontrados: C, 62.83; H, 5.02; N, 5.36.
Enantiomero 2B:
1H RMN (360 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 2.38 (d, J=1.62 Hz, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.43 Hz, 2 H) 3.75 - 3.89 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.58 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.11 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.20 Hz, 2 H) 6.16 (d, J=7.97 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=8.00 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.56, 2.56 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.37, 2.49 Hz, 1 H) 7.01 (dd, J=10.29, 8.72 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.68, 6.89 Hz, 1 H) 7.96 (dd, J=8.75, 5.21 Hz, 1 H) 8.43 (s, 1 H) 12.19 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.09 min, MH+ 497
[a]D20: 86.7° (c 0.5075, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-G): Rt 2.88 min, MH+ 497, pureza quiral 100%.
Ejemplo 3: Sintesis de 1-(6-cloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 3) y separacion quiral en enantiomeros 3A y 3B.
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Sintesis del intermediario 3a:
Una solucion agitada de 6-cloro-7-metil-1H-indol [CAS 57817-09-1] (3.2 g, 19.3 mmol) en CH2CI2 (150 mL) bajo corriente-N2 , se enfrio en un bano de enfriamiento de hielo-NaCl. Se agrego cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (29 mL, 29 mmol) durante un periodo de 2 min y la solucion fria se agito a -10°C durante 30 min. Una solucion de cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (5.48 g, 27.1 mmol, para sintesis: vease Ejemplo 1) en CH2Cl2 (30 mL) se agrego por goteo durante 30 min mientas la temperatura interna se mantuvo por debajo de -10°C y la mezcla resultante se agito durante 2 h adicionales a -10°C. La reaccion se inactivo mediante la adicion lenta de una solucion de tetrahidrato tartrato de potasio y sodio (sal de Rochelle) [CAS 6100-16-9] (10.9 g, 38.6 mmol) en agua (10 mL) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 15 min. Un precipitado blanco se presento en la mezcla de reaccion. El precipitado se aislo por filtracion, se lavo con agua y se seco al vado para proporcionar 1-(6-cloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 3a (4200 mg) como un solido blancuzco.
Sintesis del intermediario 3b:
Una solucion de 1-(6-cloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 3a (2000 mg, 6.03 mmol) en THF (120 mL) se agito a temperatura ambiente bajo atmosfera-N2. Una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (2.38 g, 6.33 mmol) en THF (35 mL) se agrego por goteo y la mezcla se agito durante 90 min adicionales a temperatura ambiente. El precipitado se filtro y el filtrado se concentro al vado para proporcionar 2-bromo-1-(6-cloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 3b (2200 mg) como un polvo blancuzco.
Sintesis de compuesto 3 y separacion quiral de enantiomeros 3A y 3B:
Se suspendio 2-bromo-1-(6-cloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 3b (1.31 g, 2.23 mmol) en CH3CN (60 mL). Se agregaron 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (0.6 g, 2.46 mmol), y diisopropiletilamina (847 pL, 4.91 mmol) y la mezcla agitada se calento a 65°C durante la noche. La mezcla se concentro al vado y el residuo se repartio entre EtOAc y agua. La capa organica se separo, se seco sobre Na2SO4, se filtro y se evaporo bajo presion reducida. El residuo se purifico mediante HPLC preparativa (fase estacionaria: Uptisphere® C18 ODB - 10 pm, 200 g, 5 cm, fase movil: 0.25% NH4HCO3 solucion en agua, CH3CN) para proporcionar 1-(6-cloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 3, 590 mg) como una mezcla racemica.
La separacion quiral de los enantiomeros del compuesto 3 (560 mg) se realizo utilizando separacion quiral de fase normal (fase estacionaria: AS 5 pm, fase movil: 100% MeOH, elucion isocratica. Ancho de onda de deteccion 308 nm, flujo 1mL/min). Las fracciones del producto se combinaron y se evaporaron para proporcionar el enantiomero 3A como el primer producto eluido y el enantiomero 3B como el segundo producto eluido. Los enantiomeros 3A y 3B se obtuvieron como aceites pegajosos. Los enantiomeros se disolvieron en una mezcla MeOH/CH2Cl2 (1/1) y se evaporo bajo presion reducida para proporcionar el enantiomero 3A (245 mg) y el enantiomero 3B (263 mg) como polvos amorfos.
Compuesto 3:
1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 6 ppm 2.48 (s, 3 H) 3.70 (s, 3 H) 3.88 - 3.92 (m, 2 H) 3.93 - 4.02 (m, 2 H) 4.03 (s, 3 H) 5.55 (s a, 1 H) 5.83 (t, J=2.20 Hz, 1 H) 5.89 (d, J=2.16 Hz, 2 H) 6.12 (s, 1 H) 6.54 - 6.66 (m, 2 H) 7.28 (d, J=7.80 Hz, 1 H) 7.33 (dd, J=8.55, 6.60 Hz, 1 H) 8.12 - 8.17 (m, 2 H) 8.59 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-B): Rt2.08 min, MH+ 513
Enantiomero 3A:
1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 8 ppm 2.50 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.54 Hz, 2 H) 3.77 - 3.90 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.40 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.12 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.13 Hz, 2 H) 6.17 (d, J=7.96 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.96 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.48, 2.49 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.35, 2.50 Hz, 1 H) 7.21 (d, J=8.61 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.60, 6.87 Hz, 1 H) 7.98 (d, J=8.50 Hz, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 12.23 (s, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.12 min, MH+ 513
[a]D20: 95.2° (c 0.605, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-H): Rt 3.21 min, MH+ 513, pureza quiral 100%.
Enantiomero 3B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2.50 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.38 Hz, 2 H) 3.76 - 3.90 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.51 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.12 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.13 Hz, 2 H) 6.16 (d, J=7.96 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.96 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.48, 2.49 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.35, 2.49 Hz, 1 H) 7.21 (d, J=8.51 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.60, 6.87 Hz, 1 H) 7.98 (d, J=8.50 Hz, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 12.23 (s, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.12 min, MH+ 513
[a]D20: -87.2° (c 0.625, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-H): Rt 1.85 min, MH+ 513, pureza quiral 100%.
Ejemplo_____4. Smtesis de 1-(6-cloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 4) y separacion quiral en enantiomeros 4A y 4B.
Figure imgf000016_0001
Smtesis del intermediary 4a:
Una solucion agitada de 6-cloro-1H-indol [CAS 17422-33-2] (2.23 g, 14.7 mmol) en CH2O 2 (125 mL) bajo corriente-N2 , se enfrio a 0°C utilizando un bano de hielo. Una solucion de cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (22.1 mL, 22.1 mmol) se agrego por goteo y la mezcla se agito durante 10 min a 0°C. Posteriormente, una solucion de cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (4.47 g, 22.1 mmol, para smtesis: vease Ejemplo 1) en CH2Cl2 (30 mL) se agrego por goteo durante un periodo de 50 min y la mezcla resultante se mantuvo a 0°C durante 1 h y posteriormente se agito a 10°C durante 1 h. Despues de enfriarse a 0°C nuevamente, la reaccion se inactivo mediante la adicion lenta de una solucion de tetrahidrato tartrato de potasio y sodio (sal de Rochelle) [CAS 6100-16­ 9] (8.31 g, 29.4 mmol) en agua (9 mL) y la mezcla se dejo calentar a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reaccion se diluyo mediante la adicion de 2-metil-THF (150 mL) y se agito durante 30 min a temperatura ambiente. Se agrego Na2SO4 (30 g) y despues de agitar durante 30 min, la mezcla se filtro sobre dicalite®. La torta de filtrado se lavo varias veces con 2-metil-THF y los filtrados combinados se concentraron al vado a un volumen residual de 25 mL. Despues de reposar durante 2 h, un precipitado se filtro y se seco al vacfo para proporcionar 1-(6-cloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 4a (2.85 g).
Sintesis del intermediario 4c:
Una solucion de 1-(6-cloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 4a (1 g, 3.15 mmol) en 2-metil-THF (50 mL) se agito bajo corriente-N2 y se enfrio en un bano de hielo. Una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (1.24 g, 3.31 mmol) en THF (10 mL) y 2-metil-THF (10 mL) se agrego por goteo y la mezcla se agito a 0°C durante 1 h y posteriormente a 10°C durante 90 min. Posteriormente, una solucion de 3-(2-(ferc-butoxi)etoxi)-5-metoxianilina [CAS 1428973-39-0] (0.83 g, 3.46 mmol) y diisopropiletilamina (1.63 mL, 9.44 mmol) en CH3CN (40 mL) se agrego por goteo y la mezcla de reaccion se calento bajo reflujo durante 90 min. Los disolventes se evaporaron bajo presion reducida. El residuo se recogio en CH3CN (30 mL) y calento bajo reflujo durante 5 h. Despues de enfriar a temperatura ambiente, el disolvente se evaporo al vado y el residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida sobre sflice (fase estacionaria: Grace Reveleris® Sflice 80 g, fase movil: gradiente heptano/EtOAce 100/0 a 0/100). Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron, y se co-evaporaron con 1,4-dioxano para proporcionar 2-((3-(2-(ferc-butoxi)etoxi)-5-metoxifenil)amino)-1-(6-cloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 4c (1.5 g, LC de pureza = 71%). El producto en bruto se utilizo como tal en la siguiente etapa.
Sintesis de compuesto 4 y separacion quiral de enantiomeros 4A y 4B:
Se mezclo 2-((3-(2-(ferc-Butoxi)etoxi)-5-metoxifenil)amino)-1-(6-cloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 4c (1.5 g, 1.92 mmol) con acido clortffdrico 4M en dioxano (25 mL, 0.1 mol) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla se desgasifico y se vertio lentamente en una solucion acuosa saturada de NaHCO3. El producto se extrajo dos veces con 2-metil-THF y los extractos combinados se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y se evaporaron. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida sobre sflice (fase estacionaria: Biotage® SnapUltra Sflice 50 g, fase movil: heptano/EtOAc/EtOH gradiente 100/0/0 a 60/30/10). Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron y posteriormente purificaron mediante HPLC preparativa (fase estacionaria: Uptisphere® C18 ODB - 10 pm, 200 g, 5 cm, fase movil: 0.25% NH4HCO3 solucion en agua, CH3CN). Las fracciones del producto se combinaron y se evaporaron. El residuo se coevaporo a partir de una mezcla de MeOH/CH3CN para proporcionar racemico 1-(6-cloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 4, 500 mg) como un aceite.
Separacion quiral de Compuesto 4 (500 mg) se realizo mediante separacion quiral de fase normal (fase estacionaria: AS 20 pm, fase movil: 100% MeOH). Las fracciones del producto se combinaron y se evaporaron. El primer producto eluido se purifico adicionalmente mediante cromatograffa ultrarrapida sobre sflice (fase estacionaria: Biotage® SnapUltra Grace Reveleris® Sflice 12 g, fase movil: gradiente heptano/EtOAce 100/0 a 0/100). Las fracciones del producto se combinaron, se evaporaron bajo presion reducida y posteriormente se co-evaporaron con CH3CN. El residuo se solidifico mediante liofilizacion a partir de CH3CN/agua para proporcionar el enantiomero 4A (135 mg) como un polvo amorfo. El segundo producto eluido se purifico adicionalmente mediante cromatograffa ultrarrapida sobre sflice (fase estacionaria: Biotage® SnapUltra GraceReveleris® Sflice 12 g, fase movil: gradiente heptano/EtOAce 100/0 a 0/100). Las fracciones del producto se combinaron y se evaporaron bajo presion reducida. El residuo se solidifico mediante liofilizacion a partir de CH3CN/agua para proporcionar el enantiomero 4B (160 mg) como un polvo amorfo.
Compuesto 4:
LC/MS (metodo LC-B): Rt 1.99 min, MH+ 499
Enantiomero 4A:
1H RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 3.61 (s, 3 H) 3.62 - 3.66 (m, 2 H) 3.77 - 3.89 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.76 (t, J=5.72 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.12 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.14 Hz, 2 H) 6.14 (d, J=7.97 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=8.00 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.49, 2.51 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=11.36, 2.52 Hz, 1 H) 7.20 (dd, J=8.53, 1.93 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.60, 6.88 Hz, 1 H) 7.52 (d, J=1.92 Hz, 1 H) 8.13 (d, J=8.51 Hz, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 12.09 (s a, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.09 min, MH+ 499
[a]D20: 107.4° (c 0.565, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-I): Rt1.54 min, MH+499, pureza quiral 100%.
Enantiomero 4B:
1H RMN (360 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (t, J=4.93 Hz, 2 H) 3.76 - 3.90 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.80 (s a., 1 H) 5.71 (t, J=2.09 Hz, 1 H) 5.93 (d, J=2.12 Hz, 2 H) 6.14 (d, J=8.03 Hz, 1 H) 6.39 (d, J=8.05 Hz, 1 H) 6.73 (td, J=8.48, 2.46 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.37, 2.48 Hz, 1 H) 7.21 (dd, J=8.52, 1.94 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.59, 6.88 Hz, 1 H) 7.53 (d, J=1.93 Hz, 1 H) 8.14 (d, J=8.53 Hz, 1 H) 8.46 (s, 1 H) 12.12 (s a, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.08 min, MH+ 499
[a]D20: -102.6° (c 0.5295, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-I): Rt 1.90 min, MH+ 499, pureza quiral 100%.
Ejemplo 5: Smtesis de 1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 5) y separacion quiral en enantiomeros 5A y 5B.
Figure imgf000018_0001
Smtesis del intermediary 5a:
Una solucion de 6,7-difluoro-1H-indol [CAS 271780-84-8] (3.0 g, 19.6 mmol) en CH2O 2 (75 mL) se agito bajo N2 y se enfrio en hielo. Una solucion de cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (30 mL, 30 mmol) se agrego por goteo y la mezcla se agito durante 10 min a 0°C. Posteriormente, una solucion de cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (5.0 g, 24.7 mmol, para smtesis: vease Ejemplo 1) en CH2O 2 (15 mL) se agrego por goteo y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reaccion se vertio lentamente en una solucion fna (0°C) acuosa saturada de NaHCO3. La mezcla se filtro sobre dicalite® y la torta de filtrado se lavo con THF. A partir de los filtrados combinados, la capa organica se separo, se seco sobre MgSO4, se filtro y se evaporo bajo presion reducida. El residuo solido se trituro con CH2O 2, los solidos se filtraron y se seco al vacm a 50°C para proporcionar 1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 5a (4.46 g) como un polvo blanco.
Smtesis del intermediary 5b:
Se suspendio 1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 5a (4.45 g, 13.93 mmol) en THF (60 mL) y se enfrio en hielo bajo N2. Una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (5.30 g, 14.1 mmol) en THF (35 mL) se agrego por goteo y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 h. El precipitado se filtro y se lavo con THF. Los filtrados combinados se evaporaron bajo presion reducida. El residuo se trituro con una pequena cantidad de CH2Cl2, se filtro y se seco al vacro a 50°C para proporcionar 2-bromo-1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 5b (4.10 g) como un polvo blanco.
Smtesis de compuesto 5 y separacion quiral en enantiomeros 5A y 5B:
Una mezcla de 2-bromo-1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 5b (4.10 g, 10.31 mmol), 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (1.91 g, 10.43 mmol), y diisopropiletilamina (1.8 mL, 10.44 mmol) se agito en CH3CN y calento bajo reflujo durante la noche. Despues de enfriar a temperatura ambiente, los disolventes se evaporaron bajo presion reducida y el residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida sobre sflice (fase estacionaria: Sflice 340 g HP-Spher 25 pm, fase movil: CH2Ch/EtOAc gradiente 100/0 a 50/50). Las fracciones del producto se combinaron y se evaporaron bajo presion reducida. El residuo se purifico adicionalmente mediante HPLC preparativa (fase estacionaria: Uptisphere® C18 ODB - 10 pm, 200 g, 5 cm. Fase movil: 0.25% NH4HCO3 solucion en agua, MeOH). Las fracciones del producto se concentraron, se disolvieron en metanol y se concentraron nuevamente para producir 1-(6,7-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 5 , 1.62 g) como una mezcla racemica. Una pequena fraccion de esta partida se solidifico mediante liofilizacion a partir de una mezcla de CH3CN/agua para proporcionar Compuesto 5 (65 mg) como un polvo amorfo blanco.
La separacion quiral de Compuesto 5 (1.50 g) se realizo mediante SFC preparativa (fase estacionaria: Quiralcel® Diacel® OD 20 x 250 mm, fase movil: CO2, EtOH con 0.2% /PrNH2). Las fracciones del producto se combinaron y se evaporaron bajo presion reducida. El primer producto eluido se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en columna sobre sflice (fase estacionaria: Silice 25 g HP-Spher 25 pm, fase movil: CH2Cl2/MeOH gradiente 100/0 a 0/100). Las fracciones del producto se concentraron a una cantidad residual de 2 mL. Un precipitado blanco se filtro, se lavo varias veces con CH2O 2 y se seco al vacro a 50°C para proporcionar el enantiomero 5A (414 mg) como un polvo amorfo blanco. El segundo producto eluido se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en columna sobre sflice (fase estacionaria: Silice 25 g HP-Spher 25 pm, fase movil: CH2Cl2/MeOH gradiente 100/0 a 0/100). Las fracciones del producto se concentraron a una cantidad residual de 2 mL. Un precipitado blanco se filtro, se lavo varias veces con CH2Cl2 y se seco al vado a 50°C para proporcionar el enantiomero 5B (437 mg) como un polvo amorfo blanco.
Compuesto 5:
1H RMN (360 MHz, DMSO-da) 8 ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.36 Hz, 2 H) 3.74 - 3.89 (m, 2 H) 3.93 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.66 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.01 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=2.18 Hz, 2 H) 6.16 (d, J=8.06 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=8.06 Hz, 1 H) 6.73 (td, J=8.42, 2.55 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.35, 2.55 Hz, 1 H) 7.18 - 7.27 (m, 1 H) 7.37 (dd, J=8.43, 6.95 Hz, 1 H) 7.92 (dd, J=8.60, 4.92 Hz, 1 H) 8.49 (s, 1 H) 12.76 (s, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.07 min, MH+ 501
Enantiomero 5A:
1H RMN (360 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.63 Hz, 2 H) 3.75 - 3.89 (m, 2 H) 3.94 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.53 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.12 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.22 Hz, 2 H) 6.16 (d, J=8.21 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=8.11 Hz, 1 H) 6.73 (td, J=8.52, 2.53 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.35, 2.62 Hz, 1 H) 7.19 - 7.27 (m, 1 H) 7.37 (dd, J=8.55, 6.88 Hz, 1 H) 7.92 (dd, J=8.94, 4.36 Hz, 1 H) 8.49 (s, 1 H) 12.77 (s, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.07 min, MH+ 501
[a]D20: -88.3° (c 0.506, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-J): Rt2.46 min, MH+ 501, pureza quiral 100%.
Enantiomero 5B:
1H RMN (360 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.05 Hz, 2 H) 3.76 - 3.89 (m, 2 H) 3.94 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.55 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.16 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.07 Hz, 2 H) 6.16 (d, J=8.09 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=8.15 Hz, 1 H) 6.73 (td, J=8.43, 2.69 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.35, 2.67 Hz, 1 H) 7.16 - 7.28 (m, 1 H) 7.37 (dd, J=8.55, 6.87 Hz, 1 H) 7.92 (dd, J=8.92, 4.37 Hz, 1 H) 8.49 (s, 1 H) 12.77 (s a, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.07 min, MH+ 501
[a]D20: 90.3° (c 0.523, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-J): Rt4.27 min, MH+ 501, pureza quiral 100%.
Ejemplo 6: Smtesis de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)-1-(6-metoxi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona (Compuesto 6) y separacion quiral en enantiomeros 6A y 6B.
Figure imgf000019_0001
Smtesis del intermediary 6a:
Se agrego cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (18.6 mL, 18.6 mmol) por goteo a 0°C a una solucion de 6-metoxi-5-metil-1H-indol [CAS 1071973-95-9] (2 g, 12.4 mmol) en CH2Cl2 (60 mL). Despues de 30 min a 0°C, se agrego lentamente cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (3.3 g, 16.3 mmol, para smtesis: vease Ejemplo 1) en CH2CI2 (60 mL) a 0°C. La reaccion se agito a 0°C durante 3 h. Se agrego hielo-agua y el precipitado se filtro, se lavo con agua, y se seco al vado para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 6a (3.15 g).
Sintesis del intermediario 6b:
A 0°C, se agrego una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (3.8 g, 10.1 mmol) en THF (90 mL) por goteo a una mezcla de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 6a (3.15 g, 9.6 mmol) en THF (90 mL). La mezcla se agito a 0°C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 2.5 h. El precipitado se filtro y se lavo con EtOAc. El filtrado se concentro bajo presion reducida. El residuo resultante se recogio con una cantidad minima de CH3CN y diisopropileter. El precipitado se filtro y se seco al vado para proporcionar 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 6b (2.8 g).
Sintesis de compuesto 6 y separacion quiral en enantiomeros 6A y 6B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 6b (1.0 g, 2.46 mmol), 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (676 mg, 3.69 mmol) y diisopropiletilamina (0.64 mL, 3.69 mmol) en CH3CN (10 mL) y THF (10 mL) se calento a 70°C durante 1 h utilizando un microondas Biotage® Initiator EXP 60 con un una salida de energfa que vana entre 0 a 400W (tiempo de retencion fijo). El disolvente se evaporo bajo presion reducida. El residuo se recogio con EtOAc. La capa organica se lavo dos veces con HCl 1N, se lavo con agua, se seco sobre MgSO4, se filtro y el disolvente se concentro bajo presion reducida. La purificacion se llevo a cabo mediante cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice (15-40 pm, 40 g, CH2O 2/CH3OH 99.5/0.5). Las fracciones puras se recogieron y se evaporaron a sequedad para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)-1-(6-metoxi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona (Compuesto 6, 330 mg) como una mezcla racemica. Esta fraccion se combino con otra partida de Compuesto 6 (60 mg) antes de separacion quiral.
La separacion quiral de Compuesto 6 (390 mg) se realizo mediante SFC preparativa quiral (fase estacionaria: Quiralpak® IC 5 pm 250 x 30 mm, fase movil: 70% CO2 , 30% MeOH) para producir 137 mg del primer enantiomero eluido y 146 mg del segundo enantiomero eluido. El primer enantiomero eluido se combino con otra partida (fraccion 1, cantidad total: 246 mg). El segundo enantiomero eluido se combino con otra partida (fraccion 2, cantidad total: 245 mg). La fraccion 1 se purifico nuevamente mediante cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice (15-40 pm, 12 g, CH2Cl2/CH3OH 99.5/0.5). Las fracciones puras se recogieron y se evaporaron a sequedad para proporcionar 207 mg. El compuesto se solidifico a partir de Et2O/heptano y algunas gotas de CH3CN para proporcionar el enantiomero 6A (173 mg) como un polvo amorfo. La fraccion 2 se purifico nuevamente mediante cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice (15-40 pm, 12 g, CH2Ch/CH3OH 99.5/0.5). Las fracciones puras se recogieron y se evaporaron a sequedad para proporcionar 204 mg. El compuesto se solidifico a partir de Et2O/heptano y algunas gotas de CH3CN para proporcionar el enantiomero 6B (158 mg) como un polvo amorfo.
Compuesto 6:
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2.20 (s, 3 H) 3.60 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.4 Hz, 2 H) 3.77- 3.87 (m, 5 H) 3.96 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.70 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.92 (d, J=1.6 Hz, 2 H) 6.10 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.31 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.5, 2.2 Hz, 1 H) 6.89 - 6.95 (m, 2 H) 7.32 - 7.38 (m, 1 H) 7.89 (s, 1 H) 8.22 (s, 1 H) 11.74 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.89 min, MH+ 509
Enantiomero 6A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 2.20 (s, 3 H) 3.55 - 3.68 (m, 5 H) 3.74 - 3.91 (m, 5 H) 3.96 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.70 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.92 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.10 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.29 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.67 -6.76 (m, 1 H) 6.88 - 6.96 (m, 2 H) 7.36 (dd, J=8.5, 6.9 Hz, 1 H) 7.89 (s, 1 H) 8.22 (s, 1 H) 11.73 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.88 min, MH+ 509
[a]D20: 116.9° (c 0.278, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-A): Rt 4.07 min, MH+ 509, pureza quiral 100%.
Enantiomero 6B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2.20 (s, 3 H) 3.55 - 3.67 (m, 5 H) 3.75 - 3.90 (m, 5 H) 3.96 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.70 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.92 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.10 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.29 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.87 - 6.97 (m, 2 H) 7.36 (dd, J=8.5, 6.9 Hz, 1 H) 7.89 (s, 1 H) 8.22 (s, 1 H) 11.73 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.88 min, MH+ 509
[a]D20: -118.6° (c 0.279, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-A): Rt 7.13 min, MH+ 509, pureza quiral 100%.
Ejemplo 7: Smtesis de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 7) y separacion quiral en enantiomeros 7A y 7B.
Figure imgf000021_0001
Smtesis del intermediary 7a:
Se agrego cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (20 mL, 20 mmol) por goteo a 0°C a una solucion de 5-fluoro-6-metoxi-1H-indol [CAS 1211595-72-0] (2.2 g, 13.3 mmol) en CH2Cl2 (60 mL). Despues de 30 min a 0°C, se agrego lentamente cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (3.85 g, 19 mmol, para smtesis: vease Ejemplo 1) en CH2Cl2 (60 mL) a 0°C. La reaccion se agito a 0°C durante 3 h. Se agregaron hielo-agua y una solucion acuosa de NaHCO3. La mezcla de reaccion se extrajo con CH2Cl2/MeOH. La capa organica se lavo con agua, se seco sobre MgSO4 , se filtro, y el disolvente se concentro bajo presion reducida. El residuo se recogio con una cantidad mmima de CH2Cl2. El precipitado se filtro y se seco para proporcionar 2-4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1H-indol-3-il)etanona 7a (3.2 g).
Sintesis del intermediario 7b:
A 0°C, una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (3.22 g, 8.56 mmol) en THF (80 mL) se agrego por goteo a una mezcla de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1H-indol-3-il)etanona 7a (2.7 g, 8.15 mmol) en THF (80 mL). La mezcla se agito a 0°C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 2.5 h. El precipitado se filtro, se lavo con EtOAc y agua y se seco para proporcionar una primera partida de 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1H-indol-3-il)etanona 7b (1.5 g). La capa organica del filtrado se separo, se seco sobre MgSO4 , se filtro y se concentro bajo presion reducida. El residuo resultante se recogio con una cantidad minima de CH3CN y diisopropileter. El precipitado se filtro y se seco al vado para proporcionar una segunda partida de 7b (1.7 g).
Smtesis de compuesto 7 y separacion quiral en enantiomeros 7A y 7B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1H-indol-3-il)etanona 7b (0.8 g, 1.95 mmol), 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (0.39 g, 2.15 mmol) y trietilamina (0.54 mL, 3.9 mmol) en THF (5 mL) y CH3CN (5 mL) se agito a 70°C durante 12 h. El residuo se diluyo con CH2Cl2 y H2O. La capa organica se separo, se seco sobre MgSO4, se filtro, y el disolvente se evaporo bajo presion reducida. El compuesto bruto se purifico mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (15-40 pm, 40 g en CH2Cl2/MeOH/NH4OH (99/1/0.1)). Las fracciones que conteman Compuesto 7 se combinaron y el disolvente se evaporo bajo presion reducida. El residuo se disolvio en CH2O 2 y se lavo con HCl 1N. La capa organica se separo, se seco sobre MgSO4, se filtro y el disolvente se concentro bajo presion reducida. Se realizo una segunda purificacion mediante HPLC de fase inversa (fase estacionaria: X-Bridge®-C185 pm 30 x 150 mm, fase movil: gradiente de 60% NH4HCO30.5% / 40% MeOH a 0% NH4HCO3 0.5% / 100% MeOH) para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 7 , 350 mg) como una mezcla racemica. Los enantiomeros se separaron mediante SFC preparativa quiral (fase estacionaria: Quiralpak® IC 5 pm 250 x 30 mm, fase movil: 60% CO2, 40% MeOH) para proporcionar 70 mg de Compuesto 2 como una mezcla racemica, 104 mg del primer enantiomero eluido y 100 mg del segundo enantiomero eluido. El primer enantiomero eluido se cristalizo a partir de CH3CN/Et2O para proporcionar el enantiomero 7A (76 mg). El segundo enantiomero eluido se cristalizo a partir de CH3CN/Et2O para proporcionar el enantiomero 7B (62 mg).
Compuesto 7:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 3.56 - 3.68 (m, 5 H) 3.76 - 3.88 (m, 5 H) 3.95 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.4 Hz, 1 H) 5.70 (s, 1 H) 5.92 (s, 2 H) 6.11 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=11.0, 1.9 Hz, 1 H) 7.14 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.36 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 7.81 (d, J=12.0 Hz, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 11.93 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.74 min, MH+ 513
Enantiomero 7A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-da) 8 ppm 3.59 - 3.67 (m, 5 H) 3.77 - 3.88 (m, 5 H) 3.95 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=1.6 Hz, 1 H) 5.92 (d, J=1.6 Hz, 2 H) 6.11 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.4, 2.2 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=11.3, 2.2 Hz, 1 H) 7.14 (d, J=7.3 Hz, 1 H) 7.31 - 7.41 (m, 1 H) 7.81 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 11.71 -12.11 (m, 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.74 min, MH+ 513
[a]D20: 85.7° (c 0.28, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-B): Rt 1.87 min, MH+ 513, pureza quiral 100%.
Punto de fusion: 226°C
Enantiomero 7B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 3.58 - 3.66 (m, 5 H) 3.76 - 3.87 (m, 5 H) 3.95 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.70 (t, J=1.6 Hz, 1 H) 5.92 (d, J=1.6 Hz, 2 H) 6.11 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.4, 2.2 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=11.3, 2.2 Hz, 1 H) 7.14 (d, J=7.3 Hz, 1 H) 7.36 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 7.81 (d, J=11.7 Hz, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 11.92 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.74 min, MH+ 513
[a]D20: -87.6° (c 0.283, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-B): Rt 3.24 min, MH+ 513, pureza quiral 100%.
Punto de fusion: 226°C
Ejemplo 8: Smtesis de 1-(7-cloro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 8) y separacion quiral en enantiomeros 8A y 8B.
Figure imgf000022_0001
Smtesis del intermediary 8a:
Se agrego cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (16.5 mL, 16.5 mmol) por goteo a 0°C a una solucion de 7-cloro-6-metoxi-1H-indol [CAS 1227604-21-8] (2 g, 11 mmol) en CH2Cl2 (60 mL). Despues de 30 min a 0°C, cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (3.3 g, 16.3 mmol, para smtesis: vease Ejemplo 1) en CH2Cl2 (60 mL) se agrego lentamente a 0°C. La reaccion se agito a 0°C durante 3 h. Se agrego hielo-agua y el precipitado se filtro, se lavo con agua, y se seco al vacfo para proporcionar 1-(7-cloro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 8a (2.7 g).
Smtesis del intermediary 8b:
A 0°C, una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (3.06 g, 8.15 mmol) en THF (80 mL) se agrego por goteo a una mezcla de 1-(7-cloro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 8a (2.7 g, 7.76 mmol) en THF (80 mL). La mezcla se agito a 0°C durante 1 h y a temperatura ambiente durante 2.5 h. El precipitado se filtro, se lavo con EtOAc. El filtrado se concentro bajo presion reducida, se solubilizo nuevamente en EtOAc y se lavo con agua. La capa organica se separo, se seco sobre MgSO4 , se filtro y se concentro bajo presion reducida. El residuo resultante se recogio con una cantidad minima de CH3CN y diisopropileter. El precipitado se filtro y se seco al vacfo para proporcionar 2-bromo-1-(7-cloro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 8b (3.2 g).
Sintesis de compuesto 8 y separacion quiral en enantiomeros 8A y 8B:
Una mezcla de 2-bromo-1-(7-cloro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 8b (2 g, 4.69 mmol), 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (0.86 g, 4.69 mmol) y trietilamina (1.3 mL, 9.4 mmol) en CH3CN (100 mL) se agito a temperatura ambiente durante 1 h, y posteriormente a 50°C durante 2 h. El producto en bruto se purifico mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (15-40 pm, 80 g) en tolueno/2-propanol/NH4OH (90/10/0.1)) para proporcionar 800 mg de Compuesto en bruto 8. Parte de esta partida se cristalizo a partir de diisopropileter para proporcionar una primera partida de 1-(7-cloro-6-metoxi-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 8, 90 mg). La purificacion del material restante del Compuesto en bruto 8 se realizo mediante cromatograffa en columna (fase estacionaria: sflice irregular en columna 40 g, fase movil: 0.3% NH4OH, 97% CH2Cl2, 3% MeOH) para proporcionar Compuesto 8 (500 mg) como una mezcla racemica.
Los enantiomeros se separaron mediante SFC quiral (fase estacionaria: Quiralpak® IC 5 pm 250 x 30 mm, fase movil: 55% CO2 , 45% MeOH) para proporcionar 184 mg del primer enantiomero eluido y 190 mg del segundo enantiomero eluido. El primer enantiomero eluido se cristalizo a partir de heptano/diisopropileter/CHaCN para proporcionar el enantiomero 8A (135 mg) como un solido amorfo. El segundo enantiomero eluido se cristalizo a partir de heptano/diisopropileter/CHaCN para proporcionar el enantiomero 8B (150 mg) como un solido amorfo.
Compuesto 8:
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 3.59 - 3.67 (m, 5 H) 3.77 - 3.90 (m, 5 H) 3.95 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.4 Hz, 1 H) 5.71 (s, 1 H) 5.94 (d, J=1.6 Hz, 2 H) 6.14 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.5, 2.2 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.3, 2.2 Hz, 1 H) 7.10 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 7.32 -7.40 (m, 1 H) 8.04 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 12.16 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.89 min, MH+ 529
Enantiomero 8A:
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 3.54 - 3.68 (m, 5 H) 3.73 - 3.90 (m, 5 H) 3.95 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.14 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.5, 2.3 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.1, 2.3 Hz, 1 H) 7.10 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 7.36 (dd, J=8.6, 7.1 Hz, 1 H) 8.04 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 12.03 - 12.26 (m, 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.88 min, MH+ 529
[a]D20: 84.3° (c 0.267, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-C): Rt 4.82 min, MH+ 529, pureza quiral 100%.
Enantiomero 8B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 3.58 - 3.68 (m, 5 H) 3.76 - 3.90 (m, 5 H) 3.95 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.71 (s, 1 H) 5.94 (s, 2 H) 6.14 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.5, 2.3 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.1, 2.3 Hz, 1 H) 7.10 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 7.31 - 7.41 (m, 1 H) 8.04 (d, J=8.6 Hz, 1 H) 8.33 (s, 1 H) 12.06 - 12.31 (m, 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.88 min, MH+ 529
[a]D20: -84.7° (c 0.268, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-C): Rt 6.42 min, MH+ 529, pureza quiral 99.36%.
Ejemplo 9: Sintesis de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 9) y separacion quiral en enantiomeros 9A y 9B.
Figure imgf000024_0001
Sintesis del intermediario 9a:
Se agrego cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (22 mL, 22 mmol) por goteo a 0°C a una solucion de 5-fluoro-7-metil-1H-indol [CAS 1082041-52-8] (1.62 g, 10.9 mmol) en CH2Cl2 (45 mL). Despues de 30 min a 0°C, una solucion de cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (3.3 g, 16.3 mmol, para sintesis: vease Ejemplo 1) en CH2Cl2 (30 mL) se agrego lentamente a 0°C. La reaccion se agito a 0°C durante 3 h. Se agrego solucion de sal de Rochelle (1N, 75 mL) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se filtro y se repartio entre en EtOAc y HCl 1N. La fase organica se lavo con HCl 1N y salmuera, se seco sobre MgSO4 , se filtro y se concentro bajo presion reducida. El residuo se recogio con a minimum amount de EtOAc. El precipitado se filtro para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 9a (2.4 g).
Sintesis del intermediario 9b:
Una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (2.2 g, 5.85 mmol) en THF (60 mL) se agrego por goteo a 0°C a una solucion de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 9a (1.66 g, 5.26 mmol) en THF (45 mL). La mezcla se agito a 0°C durante 1 h y a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se filtro y se lavo con EtOAc. El filtrado se concentro bajo presion reducida para proporcionar 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 9b (1.9 g).
Sintesis de compuesto 9 y separacion quiral en enantiomeros 9A y 9B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 9b (0.202 g, 0.512 mmol) y 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (0.468 g, 2.554 mmol) en CH3CN (2 mL) y THF (2 mL) se agito a temperatura ambiente durante 28 h. La mezcla de reaccion se diluyo con EtOAc y se lavo con HCl 1N. La fase organica se lavo con una solucion de NaHCO3 acuoso saturado y salmuera, se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro bajo presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice (10 g) utilizando un gradiente de isopropanol (10% a 40%) en heptano. Las fracciones que conteman el compuesto deseado se combinaron y se concentraron bajo presion reducida. El residuo se trituro con EtOAc y heptano para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(5-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 9, 147 mg) como una mezcla racemica.
La separacion quiral de Compuesto 9 (430 mg) se realizo mediante SFC quiral (fase estacionaria: Quiralcel® OD-H 5 pm 250 x 20 mm, fase movil: 55% CO2 , 45% MeOH) para proporcionar 198 mg del primer enantiomero eluido y 188 mg del segundo enantiomero eluido. El primer enantiomero eluido se cristalizo a partir de CH2Cl2/diisopropileter para proporcionar el enantiomero 9A (138 mg). El segundo enantiomero eluido se cristalizo a partir de C^Ch/diisopropileter para proporcionar el enantiomero 9B (151 mg).
Compuesto 9:
1H RMN (300 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 2.47 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.62 - 3.67 (m, 2 H) 3.77 - 3.89 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.1 Hz, 1 H) 5.71(t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.14 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.69 - 6.73 (m, 1 H) 6.89 - 6.95 (m, 2 H) 7.34 - 7.39 (m, 1 H) 7.63 - 7.67 (m, 1 H) 8.45 (s, 1 H) 12.21 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-D): Rt 3.9 min, MH+ 497
Enantiomero 9A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 2.47 (s, 3 H) 3.52 - 3.67 (m, 5 H) 3.76 - 3.89 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.72 - 4.83 (m, 1 H) 5.71 (s a., 1 H) 5.94 (s, 2 H) 6.15 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.69 - 6.77 (m, 1 H) 6.90 - 6.97 (m, 2 H) 7.36 (t, J=7.9 Hz, 1 H) 7.62 - 7.69 (m, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 12.21 (s a., 1 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.92 min, MH+ 497
[a]D20: -80.0° (c 0.436, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-D): Rt 2.14 min, MH+ 497, pureza quiral 100%.
Punto de fusion: 181°C
Enantiomero 9B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2.47 (s, 3 H) 3.53 - 3.68 (m, 5 H) 3.74 - 3.88 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.78 (t, J=5.4 Hz, 1 H) 5.66 - 5.73 (m, 1 H) 5.94 (s, 2 H) 6.15 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.0, 1.6 Hz, 1 H) 6.85 -6.98 (m, 2 H) 7.36 (t, J=8.0 Hz, 1 H) 7.65 (dd, J=9.5, 1.6 Hz, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 12.04 - 12.43 (m, 1 H) LC/MS (metodo LC-C): Rt 2.93 min, MH+ 497
[a]D20: 81.1° (c 0.388, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-D): Rt 3.45 min, MH+ 497, pureza quiral 100%.
Punto de fusion: 179°C
Ejemplo 10: Smtesis de 1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 10) y separacion quiral en enantiomeros 10A y 10B.
Figure imgf000025_0001
Smtesis del intermediary 10a:
Se agrego cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (9.8 mL, 9.8 mmol) por goteo a 0°C a una solucion de 5,6-difluoro-1H-indol [CAS 169674-01-5] (1.00 g, 6.5 mmol) en CH2Cl2 (12 mL). Despues de 30 min a 0°C, se agrego lentamente una solucion de cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (1.99 g, 9.8 mmol, para smtesis: vease Ejemplo 1) en CH2Cl2 (3 mL) a 0°C. La reaccion se agito a 0°C durante 3 h. Se agrego solucion 1M de sal de Rochelle y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 30 min. Los solidos formados se filtraron y se repartieron entre EtOAc y HCl 1N. Las fases se separaron. La capa organica se lavo con salmuera, se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro bajo presion reducida para proporcionar 1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 10a (1.26 g).
Smtesis del intermediary 10b:
Una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (1.63 g, 4.34 mmol) en THF (5 mL) se agrego por goteo a 0°C a una solucion de 1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 10a (1.26 g, 3.95 mmol) en THF (35 mL). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se filtro y se lavo con EtOAc. El filtrado se concentro bajo presion reducida. El residuo se recogio con una cantidad minima de acetonitrilo. El precipitado se filtro, se lavo con acetonitrilo y se seco al vado para proporcionar 2-bromo-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 10b (0.758 g).
Smtesis de compuesto 10 y separacion quiral en enantiomeros 10A y 10B:
Una mezcla de 2-bromo-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)etanona 10b (0.758 g, 1.90 mmol) y 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (0.746 g, 4.07 mmol) en Th F (10 mL) y CH3CN (10 mL) se agito a temperatura ambiente durante 3 dfas. La mezcla de reaccion se concentro bajo presion reducida. El residuo se repartio entre EtOAc y HCl 1N. Las fases se separaron. La fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases organicas se combinaron, se lavaron con una solucion de NaHCO3 acuoso saturado y salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron bajo presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice utilizando un gradiente de EtOAc (15% a 100%) en heptano. Las fracciones que conteman Compuesto 10 se combinaron y se concentraron bajo presion reducida. Se realizo una segunda purificacion mediante HPLC de fase inversa (fase estacionaria: X-Bridge®-C18 5 pm 19 x 100 mm, fase movil: gradiente de 80% acido formico 0.1% / 20% CH3CN a 10% acido formico 0.1% / 90% CH3CN) para proporcionar 1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 10, 499 mg) como una mezcla racemica.
Los enantiomeros de Compuesto 10 (459 mg) se separaron mediante SFC preparativa quiral (fase estacionaria: Quiralcel® OD-H 5 pm 250 x 30 mm, fase movil: 60% CO2, 40% MeOH) para proporcionar 208 mg del primer enantiomero eluido y 221 mg del segundo enantiomero eluido. El primer enantiomero eluido se solidifico a partir de heptano para proporcionar el enantiomero 10A (168 mg). El segundo enantiomero eluido se solidifico a partir de heptano para proporcionar el enantiomero 10B (174 mg).
Compuesto 10:
1H RMN (300 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 3.55 - 3.70 (m, 5 H) 3.83 (m, 2 H) 3.94 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.72 (s, 1 H) 5.93 (d, J=1.9 Hz, 2 H) 6.13 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=8.3 Hz, 1 H) 6.73 (td, J=8.5, 2.3 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.3, 2.3 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.5, 7.0 Hz, 1 H) 7.54 (dd, J=10.7, 7.0 Hz, 1 H) 8.00 (dd, J=10.9, 8.3 Hz, 1 H) 8.47 (s, 1 H) 12.17 (s, 1 H)
LC/MS (metodo LC-E): Rt 8.3 min, MH+ 501
Enantiomero 10A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 12.17 (s a., 1 H) 8.47 (s, 1 H) 7.99 (dd, J=11.0, 8.2 Hz, 1 H) 7.53 (dd, J=10.6, 7.1 Hz, 1 H) 7.36 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=11.3, 2.2 Hz, 1 H) 6.73 (td, J=8.5, 2.2 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.13 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 5.93 (s, 2 H) 5.71 (s a, 1 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 3.94 (s, 3 H) 3.82 (m, 2 H) 3.57 - 3.67 (m, 5 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.89 min, MH+ 501
[a]D20: -86.4° (c 0.5727, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-E): Rt2.97 min, MH+ 501, pureza quiral 100%.
Enantiomero 10B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 12.17 (s a., 1 H) 8.47 (s, 1 H) 7.99 (dd, J=10.9, 8.4 Hz, 1 H) 7.53 (dd, J=10.6, 7.1 Hz, 1 H) 7.36 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=11.3, 1.6 Hz, 1 H) 6.73 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=8.2 Hz, 1 H) 6.13 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 5.93 (s, 2 H) 5.71 (s a, 1 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 3.94 (s, 3 H) 3.77- 3.88 (m, 2 H) 3.58 - 3.67 (m, 5 H)
LC/MS (metodo LC-C): Rt2.89 min, MH+ 501
[a]D20: 90.7° (c 0.5227, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-E): Rt4.67 min, MH+ 501, pureza quiral 100%.
Ejemplo 11: Smtesis de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)-1-(6-metoxi-7-metil-1H-indol-3-il)etanona (Compuesto 11) y separacion quiral en enantiomeros 11A y 11B.
Figure imgf000027_0001
Sintesis del intermediario 11a:
Se agrego cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (40.8 mL, 40.8 mmol) por goteo a -25°C a una solucion de 6-metoxi-7-metil-1H-indol [CAS 19500-05-1] (4.39 g, 27.2 mmol) en CH2Cl2 (200 mL) bajo atmosfera-N2. Despues de agitar durante 15 min a -25°C, se agrego por goteo una solucion de cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (7.72 g, 38.1 mmol, para sintesis: vease Ejemplo 1) en CH2Cl2 (200 mL) a -25°C. Se continuo agitando a -25°C durante 1 h y la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente mientras se agitaba durante 2 h. La mezcla de reaccion se vertio en una solucion hielo-agua / sal de Rochelle, y despues de agitar durante un tiempo, los solidos se eliminaron por filtracion sobre dicalite® y la torta de filtrado se lavo varias veces con porciones pequenas de THF. Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo con THF. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y se evaporaron bajo presion reducida. El residuo solido se suspendio en CH2Ch (20 mL). Los solidos se filtraron, se lavaron con porciones pequenas de CH2O 2 y se secaron al vado a 50°C para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 11a (7.5 g).
Sintesis del intermediario 11b:
Una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (5.8 g, 15.5 mmol) en THF (200 mL) se agrego por goteo a 0°C a una solucion de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 11a (4.95 g, 14.1 mmol) en THF (200 mL). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 h. El precipitado se filtro y se lavo con THF. El filtrado se concentro bajo presion reducida. El residuo se trituro con una pequena cantidad de CH2Cl2. El precipitado se filtro, se lavo con CH2Cl2 y se seco al vado para proporcionar 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 11b (4.04 g).
Sintesis de compuesto 11 y separacion quiral en enantiomeros 11A y 11B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(6-metoxi-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 11b (1434 mg, 3.78 mmol) y 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (1037 mg, 5.66 mmol) y diisopropiletilamina (976 pL, 5.66 mmol) en CH3CN (100 mL) se agito a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla de reaccion se concentro bajo presion reducida. El residuo se repartio entre CH2O 2 y HCl 0.5N. Las fases se separaron. La capa organica se lavo con agua, se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro bajo presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida sobre gel de silice (fase estacionaria: Biotage® SNAP Ultra 100 g, fase movil: EtOAc:EtOH(3:1)/heptano gradiente 0/100 a 60/40). Las fracciones que conteman Compuesto 11 se combinaron y se concentraron bajo presion reducida para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)-1-(6-metoxi-7-metil-1H-indol-3-il)etanona (Compuesto 11, 995 mg) como una mezcla racemica. La separacion quiral de los enantiomeros del Compuesto 11 (995 mg) se realizo utilizando separacion quiral de fase normal (fase estacionaria: (S,S) Whelk-O 1 (500 g), fase movil: 100% EtOH, elucion isocratica). Las fracciones del producto se combinaron y se evaporaron para proporcionar el enantiomero 11A como el primer producto eluido y el enantiomero 11B como el segundo producto eluido. Enantiomeros 11A se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (fase estacionaria: Biotage® SNAP Ultra 10 g, fase movil CH2Cl2/MeOH gradiente 100/0 a 98/2). Las fracciones del producto se combinaron, el disolvente se evaporo bajo presion reducida y el residuo se seco al vado a 50°C para proporcionar el enantiomero 11A (255 mg) como un polvo amorfo blanco. El enantiomero 11B se purifico adicionalmente mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice (fase estacionaria: SNAP Ultra 10 g, fase movil CH2Ch/MeOH gradiente 100/0 a 98/2). Las fracciones del producto se combinaron, el disolvente se evaporo bajo presion reducida y el residuo se seco al vado a 50°C para proporcionar el enantiomero 11B (270 mg) como un polvo amorfo blanco.
Compuesto 11:
1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 8 ppm 2.29 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.2 Hz, 2 H) 3.79 (s, 3 H) 3.80 - 3.90 (m, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.77 (t, J=5.4 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=2.0 Hz, 2 H) 6.13 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.32 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.5 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=11.3, 2.4 Hz, 1 H) 6.94 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.6, 6.9 Hz, 1 H) 7.93 (d, J=8.9 Hz, 1 H) 8.31 (d, J=2.9 Hz, 1 H) 11.83 (d, J=3.1 Hz, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.10 min, MH+ 509
Enantiomero 11A:
1H RMN (360 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2.29 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.4 Hz, 2 H) 3.79 (s, 3 H) 3.80 - 3.89 (m, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.70 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 6.13 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.34 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.4, 2.6 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.94 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.93 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.32 (s a, 1 H) 11.85 (s a, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.05 min, MH+ 509
[a]D20: 98.8° (c 0.5285, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-F): Rt2.26 min, MH+ 509, pureza quiral 100%.
Enantiomero 11B:
1H RMN (360 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 2.29 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.1 Hz, 2 H) 3.79 (s, 3 H) 3.80 - 3.90 (m, 2 H) 3.97 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.70 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 6.13 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.34 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.4, 2.6 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.94 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.8, 7.0 Hz, 1 H) 7.93 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 8.32 (s a, 1 H) 11.85 (s a, 1 H)
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.05 min, MH+ 509
[a]D20: -94.1° (c 0.461, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-F): Rt2.73 min, MH+ 509, pureza quiral 100%.
Ejemplo 12: Smtesis de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 12) y separacion quiral en enantiomeros 12A y 12B.
Figure imgf000028_0001
Smtesis del intermediary 12a: Se agrego por goteo cloruro de dietilaluminio 1M en hexano (25.6 mL, 25.6 mmol) a 0°C a una solucion de 7-fluoro-5-metil-1H-indol [CAS442910-91-0] (2.54 g, 17.0 mmol) en CH2Cl2 (150 mL) bajo atmosfera-N2. Despues de agitar durante 30 min a 0°C, una solucion de cloruro de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetilo 1a (5.2 g, 25.6 mmol, para smtesis: vease Ejemplo 1) en CH2Cl2 (150 mL) se agrego por goteo a 0°C. se continuo agitando a 0°C durante 1 h y la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente mientras se agitaba durante 3h. La mezcla de reaccion se vertio en una solucion hielo-agua / sal de Rochelle, y despues de agitar durante un tiempo, los solidos se eliminaron por filtracion sobre dicalite® y la torta de filtrado se lavo varias veces con porciones pequenas de THF. Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo con THF. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se evaporaron bajo presion reducida. El residuo solido se suspendio en CH2O 2 (20 mL). Los solidos se filtraron, se lavo con porciones pequenas de CH2Cl2/heptano (1/1) y se seco al vado a 50°C para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 12a (4.13 g).
Smtesis del intermediario 12b:
Una solucion de tribromuro de feniltrimetilamonio [CAS 4207-56-1] (5.39 g, 14.3 mmol) en THF (150 mL) se agrego por goteo a 0°C a una solucion de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 12a (4.11 g, 13.0 mmol) en THF (100 mL). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1 h. El precipitado se filtro y se lavo con THF. El filtrado se concentro bajo presion reducida. El residuo se trituro con una pequena cantidad de CH2Cl2. El precipitado se filtro, se lavo con CH2O 2 y se seco al vado a 50°C para proporcionar 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 12b (4.81 g).
Sintesis de compuesto 12 y separacion quiral en enantiomeros 12A y 12B:
Una mezcla de 2-bromo-2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 12b (1096 mg, 2.78 mmol) y 2-(3-amino-5-metoxifenoxi)etanol [CAS 725237-16-1] (764 mg, 4.17 mmol) y diisopropiletilamina (718 j L, 4.17 mmol) en CH3CN (25 mL) se agito a temperatura ambiente durante 90 h. La mezcla de reaccion se concentro bajo presion reducida. El residuo se repartio entre CH2O 2 y HCl 0.5N. Las fases se separaron. La capa organica se lavo con agua, se seco sobre MgSO4 , se filtro y se concentro bajo presion reducida. El residuo se purifico mediante cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice (fase estacionaria: Biotage® SNAP Ultra 100 g, fase movil: EtOAc: EtOH(3:1)/heptano gradiente 0/100 a 50/50). Las fracciones que conteman Compuesto 12 se combinaron y se concentraron bajo presion reducida para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-(2-hidroxietoxi)-5-metoxifenil)amino)etanona (Compuesto 12, 919 mg) como una mezcla racemica.
La separacion quiral de los enantiomeros del Compuesto 12 (919 mg) se realizo mediante SFC preparativa (fase estacionaria: Quiralcel® Diacel® OD 20 x 250 mm, fase movil: CO2, EtOH con 0.2% /PrNH2). Las fracciones del producto se combinaron, se evaporaron y se secaron al vado a 50°C para proporcionar el enantiomero 12A (307 mg) como el primer producto eluido y el enantiomero 12B (302 mg) como el segundo producto eluido. Los enantiomeros se produjeron como polvo amorfo blanco.
Compuesto 12:
LC/MS (metodo LC-A): Rt 1.08 min, MH+ 497
Enantiomero 12A:
1H RMN (360 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 2.39 (s, 3 H) 3.62 (s, 3 H) 3.65 (c, J=5.4 Hz, 2 H) 3.77 - 3.90 (m, 2 H) 3.95 (s, 3 H) 4.80 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.72 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 5.95 (d, J=2.2 Hz, 2 H) 6.15 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.74 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.92 (dd, J=12.1, 1.1 Hz, 1 H) 6.94 (dd, J=11.3, 2.2 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.8, 7.0 Hz, 1 H) 7.79 (s, 1 H) 8.40 (s, 1 H) 12.48 (s a, 1 H)
LC/MS (metodo LC-B): Rt 1.98 min, MH+ 497
[a]D20: -113.5° (c 0.355, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-K): Rt 2.26 min, MH+ 497, pureza quiral 100%.
Enantiomero 12B:
1H RMN (360 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 2.38 (s, 3 H) 3.61 (s, 3 H) 3.64 (c, J=5.1 Hz, 2 H) 3.77 - 3.89 (m, 2 H) 3.94 (s, 3 H) 4.79 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.71 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 5.94 (d, J=1.8 Hz, 2 H) 6.15 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.34 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.73 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.91 (d a, J=12.1 Hz, 1 H) 6.93 (dd, J=11.3, 2.6 Hz, 1 H) 7.36 (dd, J=8.4, 7.0 Hz, 1 H) 7.78 (s, 1 H) 8.39 (s, 1 H) 12.46 (s a, 1 H)
LC/MS (metodo LC-B): Rt 1.98 min, MH+ 497
[a]D20: 117.0° (c 0.448, DMF)
SFC quiral (metodo SFC-K): Rt 3.67 min, MH+ 497, pureza quiral 100%.
ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCION Ensayo ant/v/ral de DENV-2
La actividad antiviral de todos los compuestos de la invencion se ensayo contra la cepa 16681 de DENV-2 que se marco con la protema verde fluorescente mejorada (eGPF). El medio de cultivo consiste en un medio esencial mmimo suplementado con 2% de suero de ternera fetal inactivado por calor, 0,04% de gentamicina (50 mg/ml) y 2 mM de L-glutamina. Las celulas Vero, obtenidas de ECACC, se suspendieron en un medio de cultivo y se anadieron 25j L a placas de 384 pocillos (2.500 celulas/pocillo), que ya contienen los compuestos antivirales. Tfpicamente, estas placas contienen una dilucion cuadruple en serie de 9 etapas de dilucion del compuesto del ensayo a 200 veces la concentracion final en DMSO al 100% (200nL). Ademas, la concentracion de cada compuesto se prueba por cuadruplicado (rango de concentracion final: 25|jM - 0.00038j M). Por ultimo, cada placa contiene pocillos que estan asignados como controles de virus (que contienen las celulas y los virus en ausencia del compuesto), controles de celulas (que contienen las celulas en ausencia del virus y el compuesto) y controles de medios (que contienen medios en ausencia de celulas, virus y compuestos). A los pocillos asignados como controles de medios se anadieron 25|jL del medio de cultivo en lugar de celulas Vero. Una vez que se anadieron las celulas a las placas, las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las celulas se distribuyan uniformemente dentro de los pocillos. Luego, las placas se incubaron en un incubador completamente humidificado (37°C, 5% CO2) hasta el dfa siguiente. Posteriormente, la cepa 16681 de DENV-2, marcada con eGFP, se anadio a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 0,5. Por lo tanto, se anadieron 15j L de suspension de virus a todos los pocillos que contienen el compuesto de prueba y a los pocillos asignados como control de virus. Paralelamente, se anadieron 15j L de medio de cultivo a los controles de medios y celulas. Seguidamente, las placas se incubaron durante 3 dfas en un incubador completamente humidificado (37°C, 5% CO2). El dfa de la lectura, la fluorescencia eGFP se midio con un microscopio de fluorescencia automatizado a 488 nm (laser azul). Con el uso de un sistema LIMS interno se calcularon las curvas de respuesta a la dosis de inhibicion para cada compuesto y se determino la concentracion efectiva maxima media (EC50). Por lo tanto, el porcentaje de inhibicion (I) para cada concentracion de ensayo se calcula mediante la siguiente formula: I = 100*(St-Scc)/(Svc-Scc); St, Scc y Svc son la cantidad de senal eGFP en los pocillos del compuesto de prueba, control de celulas y control de virus, respectivamente. La EC50 representa la concentracion de un compuesto en la que la replicacion del virus se inhibe al 50%, que se mide por una reduccion del 50% de la intensidad fluorescente eGFP comparada con el control de virus. La EC50 se calcula con la interpolacion lineal (Tabla 1).
Paralelamente se evaluo la toxicidad de los compuestos en las mismas placas. Una vez realizada la lectura de la senal eGFP se agregaron 10j L de resazurina, una tintura de viabilidad celular, a todos los pocillos de las placas de 384 pocillos. El ensayo de resazurina se basa en la reduccion de la resazurina azul por NADH, producida por las celulas, en el producto altamente fluorescente, resorufina. La formacion de resorufina fluorescente de color rosa esta directamente relacionada con la cantidad de celulas viables en el pocillo. Las placas se incubaron durante 5 horas adicionales en un incubador completamente humidificado (37°C, 5% CO2). Luego se midieron las placas en un lector de Infinito (Tecan) mediante el uso de una longitud de onda de excitacion de 530 nm. Tambien se determino la concentracion citotoxica maxima media (CC50), definida como la concentracion requerida para reducir la conversion de resazurina al 50%, en comparacion con la de los pocillos de control de celulas (Tabla l). Por ultimo, se determino el mdice de selectividad (SI) para los compuestos, que se calcula de la siguiente manera: SI = CC50/EC50.
Tabla 1: ECrq. CCrq. y SI para los compuestos de la invencion en el ensayo antiviral de DENV-2
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
N = cantidad de experimentos independientes en los que se ensayaron los compuestos.
Ensayo de tetravalente con transcriptasa inversa cuantitativa-PCR (RT-qPCR): Protocolo A.
La actividad antiviral de los compuestos de la invencion se ensayo contra la cepa TC974#666 (NCPV) de DENV-1, la cepa 16681 de DENV-2, la cepa H87 (NCPV) de DENV-3 y las cepas H241 (NCPV) y EDEN (SG/06K2270DK1/2005; numero de acceso GenBank QG398256) de DENV-4 en un ensayo de RT-qPCR. Por lo tanto, se infectaron celulas Vero, ya sea con DENV-1, -2, -3 o -4 en presencia o ausencia de compuestos de ensayo. Al dfa 3 de infectadas, las celulas se lisaron y los lisadoscelulares se utilizaron para preparar ADNc de objetivo viral (3'UTR de DENV; tabla 2) y un gen de referencia celular (p-actina, tabla 2). Posteriormente, se realizo un PCR en tiempo real duplex en un instrumento Lightcycler480. El valor Cp generado es inversamente proporcional a la cantidad de expresion de ARN de estos objetivos. La inhibicion de la replicacion de DENV produce un cambio de Cp en el compuesto de ensayo para el gen 3'UTR. Por otro lado, si un compuesto de ensayo es toxico para las celulas se observara un efecto similar sobre la expresion de p-actina. El metodo comparativo AACp se utiliza para calcular EC50, que se basa en la expresion genica relativa del gen objetivo (3'UTR) normalizado con el gen de limpieza celular (p-actina). Ademas, los valores CC50 se determinaron en base a los valores de Cp adquiridos para la limpieza de genes p-actina.
Tabla 2: Cebadores y sondas utilizados para RT-PCR cuantitativa, en tiempo real
Figure imgf000031_0002
a Los elementos de tintes reportero (FAM, HEX) y tinte inhibidor de fluorescencia (BHQ1) se indican en negrita y cursiva.
b La secuencia de nucleotidos de los cebadores y sondas se selecciono de la region conservada en la region 3'UTR del genoma del virus del dengue, basada en el alineamiento de 300 secuencias de nucleotidos de los cuatro serotipos del dengue depositados en GenBank (Gong et al., 2.013 , Methods Mol Biol, Capftulo 16).
El medio de cultivo consiste en un medio esencial mmimo suplementado con 2% de suero de ternera fetal inactivado por calor, 0,04% de gentamicina (50 mg/ml) y 2 mM de L-glutamina. Las celulas Vero, obtenidas de ECACC, se suspendieron en un medio de cultivo y se anadieron 75jL/pocillo a placas de 96 pocillos (10.000 celulas/pocillo), que ya contienen los compuestos antivirales. Tfpicamente, estas placas contienen una dilucion cuadruple en serie de 9 etapas de dilucion del compuesto del ensayo a 200 veces la concentracion final en DMSO al 100% (500nL; rango de concentracion final: 25|jM - 0.00038|jM). Asimismo, cada placa contiene pocillos que estan asignados como controles de virus (que contienen las celulas y los virus en ausencia del compuesto) y controles de celulas (que contienen las celulas en ausencia del virus y el compuesto). Una vez que las celulas se agregaron a las placas, las placas se incubaron en un incubador completamente humidificado (37°C, 5% CO2) hasta el dfa siguiente. Luego se agrego la cepa TC974 # 666 de DENV-1, cepa 16681 de DENV-2, cepa H87 de DENV-3 o las cepas H241 o EDEN de DENV-4. Por lo tanto, se anadieron 25|jL de suspension de virus, donde se logro un Cp de ~ 22 en RTqPCR, y se agrego a todos los pocillos que contienen el compuesto de prueba y a los pocillos asignados como control de virus. Paralelamente, se anadieron 25j L de medio de cultivo a los controles de celulas. Seguidamente, las placas se incubaron durante 3 dfas en un incubador completamente humidificado (37°C, 5% CO2). Despues de 3 dfas, se elimino el sobrenadante de los pocillos y las celulas se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo (~ 100 pl). El granulado celular dentro de las placas de 96 pocillos se almaceno a -80°C durante al menos 1 dfa. A continuacion, se extrajo el ARN con el kit para lisis Cells-to-CTTM, de conformidad con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). Los lisados de celulas se pueden almacenar a -80°C o utilizarse inmediatamente en la etapa de transcripcion inversa.
Como preparacion para la etapa de transcripcion inversa se preparo la mezcla A (tabla 3A) y se distribuyeron 7,57|jL/pocillo en una placa de 96 pocillos. Despues de la adicion de 5 jL del lisado celular, se siguio con una etapa de desnaturalizacion durante 5 minutos a 75°C (tabla 3B). Posteriormente, se anadieron 7,43jL de la mezcla B (tabla 3C) y se inicio el paso de transcripcion reversa (tabla 3D) para generar ADNc.
Por ultimo, se preparo una mezcla de RT-qPCR, la mezcla C (tabla 4A), que se distribuyo en placas de 96 pocillos LightCycler qPCR a los que se agregaron 3 jL de ADNc y la qPCR se realizo de conformidad con las condiciones de la tabla 4B en un LightCycler 480.
Mediante el uso del software LightCycler y un sistema LIMS interno, se calcularon las curvas dosis-respuesta para cada compuesto y se determinaron la concentracion media maxima eficaz (EC50) y la concentracion citotoxica media maxima (CC50) (Tablas 6-9).
Tabla 3: Sintesis de ADNc mediante el uso de la Mezcla A, desnaturalizacion, Mezcla B y transcripcion inversa. Mezcla A
Figure imgf000032_0003
B Etapa de desnaturalizacion:
Figure imgf000032_0001
C Mezcla B
Figure imgf000032_0004
J J_______________________
Protocolo de sintesis de ADNc
Figure imgf000032_0002
Tabla 4: Protocolo y mezcla para qPCR
A Mezcla C
Figure imgf000033_0001
B Protocolo qPCR3
Figure imgf000033_0002
Ensayo de tetravalente con transcriptasa inversa cualitativa-PCR (RT-qPCR): Protocolo B.
Se insertaron celulas Vero (4 * 104) en placas de 96 pocillos. Despues de un dfa, se reemplazo el medio de cultivo celular con 100 pL de medio de ensayo que contiene una dilucion doble, triple o quintuple en serie del compuesto (rango de concentracion: 50 mg/ml - 0.00038 g/ml, 50 mg/ml - 0.0076 g/ml, y 50 ug/mL - 0.00013 g/ml, respectivamente) y 100 pL de dilucion de virus del dengue, donde se logro un Ct de ~ 20 en RTqPCR. Tras un penodo de incubacion de 2 horas, la monocapa de celulas se lavo 3 veces con medio de ensayo para eliminar el virus residual, no adsorbido y los cultivos se incubaron adicionalmente durante 4 dfas (DENV-2 NGC-Tongalike) o 7 dfas (cepa D1/H/IMTSSA/98/606 de DENV-1 Djibouti, cepa prototipo H87 de DENV-3, cepa H241' de DENV-4) en presencia del inhibidor. El sobrenadante se recogio y la carga viral de ARN se determino por RT-PCR cuantitativa en tiempo real. La concentracion efectiva 50% (EC50), que se define como la concentracion del compuesto que se requiere para inhibir la replicacion del ARN viral en un 50%, se determino mediante la interpolacion logantmica (Tablas 7 y 8).
Se aislo el ARN de 100 pL de sobrenadante con el kit para virus NucleoSpin 96 (Servicio Filter, Duren, Alemania) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores TaqMan (DENV-For, DENV-Rev; Tabla 5) y sondas TaqMan (DENV-Sonda Tabla 5) se seleccionaron de genes no estructurales 3 (NS3) o NS5, de los respectivos flavivirus mediante el uso del software Cebador Express (version 2.0; Applied Biosystems, Lennik, Belgica). La sonda TaqMan fue marcada con fluorescencia mediante 6-carboxifluorescema (FAM) en el extremo 5' como tinte reportero y con union al surco menor (MGB) en el extremo 3' como tinte inhibidor de la fluorescencia (Tabla 5). De un solo paso, se realizo RT-PCR cuantitativa en un volumen total de 25 pL, que contiene 13,9375 pL de H2O, 6,25 pL de mezcla maestra (Eurogentec, Seraing, Belgica), 0,375 pL de cebador directo, 0,375 pL de cebador inverso, 1 pL de sonda, 0,0625 pL de transcriptasa inversa (Eurogentec) y 3 pL de muestra. Se realizo RT-PCR a traves del sistema rapido de analisis por PCR en tiempo real ABI 7500 PCR (Applied Biosystems, Branchburg, Nueva Jersey, EE.UU.) bajo las siguientes condiciones: 30 min a 48°C y 10 min a 95°C, seguido por 40 ciclos de 15 seg a 95°C y 1 min a 60°C. Los datos fueron analizados con el software ABI PRISM 7500 SDS (version 1.3.1; Applied Biosystems). Para la cuantificacion absoluta, las curvas de calibracion se generaron mediante el uso de diluciones de 10 veces los preparados modelo de concentraciones conocidas.
Tabla 5: Cebadores y sondas utilizados para RT-PCR cuantitativa, en tiempo real
Figure imgf000034_0001
a Los elementos de tintes reportero (FAM) y tinte inhibidor de fluorescencia (MGB/TAMRA) se indican en negrita y cursiva.
b La secuencia de nucleotidos y la posicion de los cebadores y sondas en el genoma se dedujeron de la secuencia de nucleotidos de DENV 2 n Gc (numero de acceso GenBank M29095; Irie et al, 1989), serotipo 1 del virus del dengue Djibouti cepa D1/H/IMTSSA/98/606 (numero de acceso GenBank AF298808), serotipo 3 del dengue prototipo cepa H87 (c93130), serotipo 4 del virus del dengue cepa H241 (no hay secuencias disponibles).
Ensayo citotoxico (Protocolo B)
Se evaluaron posibles efectos citotoxicos de los compuestos en celulas Vero no infectadas. Las celulas se insertaron en 4 x 104 celulas/pocillo en una placa de 96 pocillos en presencia de soluciones dobles, triples o quintuples en serie (que van desde 50 pg/mL - 0.0038 pg/mL, 50 pg/mL - 0.0076 pg/mL y 50 pg/mL - 0.00013 pg/mL, respectivamente) del compuesto y se incubaron durante 4 a 7 dfas. Se descarto el medio de cultivo y se anadieron 100 pg/mL 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio/fenazina metosulfato (MTS/PMS; Promega, Leiden, Pafses Bajos) en PBS en cada pocillo. Tras un penodo de incubacion de 2 horas a 37°C, la densidad optica se determino a 498 nm. La actividad citotoxica se calculo con la siguiente formula: % viabilidad celular =100 x (ODcompuesto/ODcc), donde ODcompuesto y ODcc corresponden a la densidad optica a 498 nm de los cultivos celulares no infectados tratados con el compuesto y la de cultivos de celulas no infectadas, no tratadas, respectivamente. La concentracion citotoxica en 50% (es decir, la concentracion que reduce la cantidad total de celulas en 50%; CC50) se calculo mediante la interpolacion lineal (tablas 7 y 8).
Tabla 6: Ensayos sobre ECsn, CC^n, y SI para los compuestos contra el serotipo 1 en RT-qPCR
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000034_0003
Figure imgf000035_0001
N = cantidad de experimented independientes en los que se ensayaron los compuestos.
Tabla 7: Ensayos sobre EC^n. CCsg y SI para los compuestos contra el serotipo 2 en RT-qPCR
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000035_0003
N = cantidad de experimentos independientes en los que se ensayaron los compuestos. NA= no aprobado.
Tabla 8: Ensayos sobre EC^n. CC^n. y SI para los compuestos contra el serotipo 3 en RT-qPCR
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000036_0002
N = cantidad de experimentos independientes en los que se ensayaron los compuestos. Tabla 9: Ensayos sobre EC^n. CC^n. y SI para los compuestos contra el serotipo 4 en RT-qPCR
Figure imgf000036_0003
Figure imgf000037_0001
N = cantidad de experimentos independientes en los que se ensayaron los compuestos.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de formula (I)
Figure imgf000042_0001
una forma estereoisomerica, una sal, un solvato o un polimorfo farmaceuticamente aceptables de este, que comprende un grupo indol mono o disustituido; dicho compuesto se selecciona de un grupo donde
Ri es H, R2 es F y R3 es H, F o CH3 ;
R1 es F o CH3, R2 es OCH3 y R3 es H;
Ri es H, R2 es Cl y R3 es H o CH3;
Ri es F, R2 es H y R3 es CH3;
Ri es H, R2 es OCH3 y R3 es Cl;
Ri es F, R2 es F y R3 es H;
Ri es H, R2 es OCH3 y R3 es CH3 o
Ri es CH3 , R2 es H y R3 es F.
2. Un compuesto o su forma estereoisomerica, una sal, un solvato o un polimorfo farmaceuticamente aceptables de este de conformidad con la reivindicacion i, donde el compuesto se selecciona entre el grupo:
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
3. Una composicion farmaceutica, que comprende un compuesto de formula (I) o una forma estereoisomerica, una sal, un solvato o un polimorfo farmaceuticamente aceptables de este de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, junto con uno o mas excipientes, diluyentes o vehnculos farmaceuticamente aceptables.
4. Un compuesto de formula (I) o una forma estereoisomerica, una sal, un solvato o un polimorfo farmaceuticamente aceptables de este de conformidad con la reivindicacion 1 o una composicion farmaceutica de conformidad con la reivindicacion 3 para su uso como medicamento.
5. Un compuesto de formula (I) o una forma estereoisomerica, una sal, un solvato o un polimorfo farmaceuticamente aceptables de este de conformidad con la reivindicacion 1 o una composicion farmaceutica de conformidad con la reivindicacion 3 para su uso en el tratamiento del dengue.
6. Un compuesto representado por la siguiente formula estructural (I)
Figure imgf000044_0002
una forma estereoisomerica, una sal, un solvato o un polimorfo farmaceuticamente aceptables de este, que comprende un grupo indol mono o disustituido; dicho compuesto se selecciona de un grupo donde
R1 es H, R2 es F y R3 es H, F o CH3 ;
R1 es F o CH3, R2 es OCH3 y R3 es H;
R1 es H, R2 es Cl y R3 es H o CH3;
R1 es F, R2 es H y R3 es CH3;
R1 es H, R2 es OCH3 y R3 es Cl;
R1 es F, R2 es F y R3 es H;
R1 es H, R2 es OCH3 y R3 es CH3 o
R1 es CH3 , R2 es H y R3 es F
para uso en la inhibicion de la replicacion del virus o los virus del dengue en una muestra biologica o un paciente.
7. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicacion 6 que comprende ademas la coadministracion de un agente terapeutico adicional.
8. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicacion 7 donde dicho agente terapeutico adicional es otro agente antiviral.
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