CN102203131A - ***干细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了***干细胞和***癌干细胞以及它们在治疗***癌和再生***组织中的应用。

Description

***干细胞及其用途

相关申请

本申请根据35 USC 119(e)要求2008年10月22日提交的美国临时申请No.61/196,930的优先权权益，其公开的全文通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及***干细胞和***癌干细胞以及它们在治疗***癌和使***组织再生中的用途。

背景

已经基于这样的观察提出了***干细胞(PSCs)的存在，所述观察即在啮齿动物中，正常的***再生可以在雄激素剥夺和替代的重复循环后发生¹。***依赖于雄激素进行正确的生长和组织稳态⁷。在雄激素剥夺后，由于需要雄激素进行生存的细胞的凋亡，***经历了退化。明显地，雄激素的替代诱导***再生回到其起初的大小和功能状态。在啮齿动物***中退化/再生过程可以重复超过30个循环的事实¹证实成年人***包含长寿命的，不依赖雄激素的干细胞群体。已经在小鼠和人***中鉴定了富含干细胞的群体^2-6，8-10。

已经报道了一些细胞表面标记用于鉴定候选的PSCs，所述标记包括干细胞抗原-1(Sca-1)，CD133(prominin-1)，和CD44^2-6。然而，在小鼠***中的非-PSCs也表达这些标记并且因此鉴定定义的PSC群体仍旧是难以捉摸的。

CD117(c-Kit，干细胞因子受体)是受体酪氨酸激酶亚类III家族的成员并且与关于血小板衍生生长因子、巨噬细胞集落刺激因子，和FMS-样受体酪氨酸激酶(FLT3)配体的受体相关。Heinrich，M.C.等，J.Clin.Oncol.20(6)：1692-1703(2002).c-Kit及其配体干细胞因子(SCF)对于血生成、黑素原生成和生育力是必要的。SCF在造血体系(hierarchy)的多种水平上作用以促进细胞存活、增殖、分化、粘附和功能激活。Ashman，L.K.，等，Intl.J.of Biochem.Cell Biol(生物化学细胞生物学国际杂志).31：1037-1051(1999).已经在人恶性肿瘤中观察到CD117表达，并且CD117的激酶活性涉及许多这些肿瘤的病理生理学，所述肿瘤包括肥大细胞增生/肥大细胞白血病(mastocytosis/mast cell leukemia)、生殖细胞肿瘤(germ cell tumors)、小细胞肺癌(small-cell lung carcinoma)(SCLC)，胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors)(GIST)、急性髓细胞性白血病(AML)(acute myelogenous leukemia)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、黑素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian carcinoma)和乳腺癌(breast carcinoma)。J.Clin.Oncol.20(6)：1692-1703(2002)(上文)。

癌干细胞(CSCs)是在肿瘤中具有自我更新能力并且产生构成肿瘤的癌细胞的异质谱系的细胞。Clark，M.F.等，Cancer Res(癌症研究).66(19)：9339-9344(2006)。认为这些细胞负责转移、治疗抗性和复发。然而，CSCs仅组成癌肿瘤块的小部分，并且难以进行鉴定和/或分离。认为癌干细胞来自经历突变的正常干细胞。这些突变的干细胞经历了致瘤性转化以形成包含癌干细胞的肿瘤，所述癌干细胞可以通过存在于正常干细胞上的相同标记进行鉴定。Zhu，L.等，Nature(自然)457，603-607(2009)。

发明概述

本发明的一个方面提供表达CD117的分离的***干细胞。在一个实施方案中，所述干细胞还表达CD133和CD44。在一个实施方案中，所述干细胞还表达CD133和CD44和Sca-1。在一些实施方案中，所述***干细胞能够在体外产生包含腺腔的***集落(lumen-containing prostate colonies)。在另一些实施方案中，所述***干细胞能够在体内产生功能性***。

本发明的另一个方面提供表达CD117的分离的***癌干细胞。在一个实施方案中，所述***癌干细胞还表达CD133和CD44。在另一个实施方案中，所述***癌干细胞还表达CD133和CD44和Sca-1。在一些实施方案中，所述***癌干细胞能够在体内模型中产生***癌。

本发明的另一个方面提供分离***干细胞的方法，所述方法包括获得谱系消减的(lineage depleted)(Lin-)***细胞群和分选Lin-细胞群以获得表达CD117，CD133，和CD44的细胞群。在一个实施方案中，所述方法还包括分选Lin-***细胞群以获得表达Sca-1的细胞群。例如，使用荧光激活细胞分选术(FACS)来分选这些细胞。

本发明的另一个方面提供抑制表达CD117，CD133，和CD44的***干细胞或***癌干细胞增殖的方法，所述方法包括使***干细胞或***癌干细胞与治疗有效量的CD117拮抗剂接触。

本发明的另一个方面提供预防患者中***癌复发的方法，所述方法包括确定患者的***癌是否包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞，并且如果患者的***癌包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞，向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂。在一个实施方案中，还将有效量的CD133拮抗剂或CD44拮抗剂施用于所述患者。

本发明的另一个方面提供选择用CD117拮抗剂治疗的***癌患者的方法，所述方法包括确定患者是否具有包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞的***癌，并且如果患者具有包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞的***癌，选择所述患者用CD117拮抗剂进行治疗。在一些实施方案中，所述患者已经具有***癌的复发。

本发明的另一个方面提供治疗患者中***癌的方法，所述方法包括确定所述患者是否具有包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞的***癌，并且如果患者具有包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞的***癌，向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂。在一个实施方案中，还向所述患者施用有效量的CD133拮抗剂或CD44拮抗剂。在一些实施方案中，所述患者已经具有***癌的复发。

本发明的另一个方面提供选择***癌患者用于用CD117拮抗剂进行辅助治疗的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞，并且如果所述患者的***癌包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞，选择患者用于用CD117拮抗剂进行辅助治疗。

本发明的另一个方面提供向治疗***癌的患者提供辅助疗法的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞，并且如果所述患者的***癌包含表达CD117，CD133，和CD44的***细胞，向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂。在一个实施方案中，还向所述患者施用有效量的CD133拮抗剂或CD44拮抗剂。

在上述方面的一些实施方案中，所述CD117拮抗剂是抗-CD117抗体，或小分子，如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)或马来酸舒尼替尼(sunitinib malate)。

本发明的另一个方面提供促进***组织生长或修复的方法，所述方法包括在需要***组织生长或修复的患者中植入表达CD117，CD133，和CD44的***干细胞。在一个实施方案中，所述患者具有不完全的***，并且干细胞被植入所述不完全的***。

本发明的又一个方面提供促进***生长的方法，所述方法包括在产生功能性***的条件下，在哺乳动物宿主中植入表达CD117，CD133，和CD44的***干细胞。在一个实施方案中，在宿主的肾被膜下(under renal capsule)植入所述干细胞。在一个实施方案中，宿主是人，在另一个实施方案中，宿主是猪。

本发明的另一个方面提供向需要其的患者提供功能性***的方法，所述方法包括在产生功能性***的条件下，在哺乳动物宿主中植入表达CD117，CD133，和CD44的人***干细胞，和收集所述***。在一个实施方案中，将收集的***移植到需要功能性***的人患者中。

本发明的另一个方面提供筛选抑制***癌干细胞增殖的化合物的方法，所述方法包括使表达CD117，CD133，和CD44的***癌干细胞与测试化合物接触，并且检测所述测试化合物是否抑制细胞的增殖。

附图简述

图1显示来自成年C57BL/6小鼠的完整***。显示四对叶(D-背叶，L-侧叶，V-腹叶，A-前叶)。底版显示相对于尿道关于每个***叶的远侧、中间和近侧区域。

图2是这样的图表，其显示在成熟C57BL/6***的不同区域中基因表达的Q-RT-PCR，针对远端区域标准化。与远端的统计学比较：^*P＜0.05；^**P＜0.01；^***P＜0.001。

图3a是显示在成熟C57BL/6***的不同叶中基因表达的Q-RT-PCR的图表，针对背叶标准化。图3b是在背叶(D)、侧叶(L)、腹叶(V)，和前叶(A)中基因表达的统计学分析。^*P＜0.05；^**P＜0.01；^***P＜0.001；^****P＜0.0001。

图4是在成熟C57BL/6***中基因表达的Q-RT-PCR分析(正常，***后3天，***后14天，和***后14天加3天的激素替代(hormone replacement))。将数据表示为相对于GADPH的倍数变化。与激素替代的统计学比较：^*P＜0.05；^**P＜0.01；^***P＜0.0001.所有的棒表示平均值+s.e.m。

图5是显示使用磁珠分选富集CD117+细胞的图表。

图6是用于证实CD117+***干细胞具有自我更新能力的系列分离和移植程序的示意图。

图7a是显示关于用抗-CD117抗体治疗的***和关于未治疗的***，***区域中随时间的净生长的量化的图表。^*P＜0.05；^**P＜0.01。图7b是关于如在抗-CD117治疗的第8天确定的***和关于未治疗的***的每mm²的分支点的量化的图表。^*P＜0.001。

图8a是在CD117+/-分选的群体中，关于SLUG表达的Q-RT-PCR分析。^*P＜0.03。图8b是在成熟C57BL/6***中，关于SLUG表达的微阵列分析(正常，***后3天，***后14天，和***后14天加3天的激素替代)。将数据表示为相对于正常的倍数变化。与激素替代的统计学比较：^*P＜0.02.图8c是在用抗-CD117抗体治疗的先体外后体内(ex vivo)的***中的SLUG表达的Q-RT-PCR分析。将数据表示为相对于第1天对照的倍数变化。^*P＜0.003。

图9是这样的图表，其显示在表达单一和多种***干细胞标记的成熟C57BL/6***中活细胞的百分比。

图10是用于获得表达表面标记Sca-1，CD133，CD44，和CD117的组合的细胞群的荧光激活的细胞分选术程序的流程图。

图11是显示在肾被膜植入后三个月移植物重量的量化的图表。数据来自两个独立的实验。^*(Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺对比Lin^-Sca-1^-CD133^-CD44^-CD117^-∶P＝0.002；Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺对比Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117^-∶P＝0.03；Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺对比仅UGM∶P＝0.004)。

图12是显示在肾被膜植入后三个月仅UGM、Lin-Sca-1-CD133-CD44-CD117-，Lin-Sca-1+CD133+CD44+CD117+，和Lin-Sca-1+CD133+CD44+CD117-植入物的***产生能力的图表。

图13是单细胞移植程序的示意图。

图14a显示在对分离自单细胞植入物的细胞进行激光捕获显微切割(LCM)后基于PCR的基因分型。图14b显示确定***干细胞在Lin-Sca-1+CD133+CD44+CD117+细胞群中的频率的有限稀释分析。

图15a是显示在表达单一和多种***干细胞标记的人临床良性非-BPH***样本中的活细胞百分比的图表。图15b是显示在表达单一和多种***干细胞标记的人临床BPH***样本中的活细胞百分比的图表。

优选实施方案的详细描述

定义

术语“CD117”指来自任何脊椎动物来源的任何CD117，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人和猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指出。术语涵盖“全长，”未加工的CD117以及由在所述细胞中加工所产生的任何形式的CD117。术语还涵盖天然存在的CD117的变体，例如剪接变体、等位基因变体和其它同种型。术语还涵盖维持CD117至少一种生物学活性(例如激酶活性)的天然CD117的片段或变体。在科学文献中，还将CD117称为c-kit和干细胞因子受体。

术语“CD44”指来自来自任何脊椎动物来源的任何CD44，所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类动物(例如人和猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指出。术语涵盖“全长，”未加工的CD44以及由在所述细胞中加工所产生的任何形式的CD44。术语还涵盖天然存在的CD44的变体，例如剪接变体、等位基因变体和其它同种型。术语还涵盖维持CD44至少一种生物学活性的天然CD44的片段或变体。

术语“CD133”指来自任何脊椎动物来源的任何CD133，所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类动物(例如人和猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指出。术语涵盖“全长，”未加工的CD133以及由在所述细胞中加工所产生的任何形式的CD133。术语还涵盖天然存在的CD133的变体，例如剪接变体、等位基因变体和其它同种型。术语还涵盖维持CD133至少一种生物学活性的天然CD44的片段或变体。在科学文献中，还将CD133称为prominin-1。

术语“Sca-1”指来自来自任何脊椎动物来源的任何Sca-1，所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类动物(例如人和猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指出。术语涵盖“全长，”未加工的Sca-1以及由在所述细胞中加工所产生的任何形式的Sca-1。术语还涵盖天然存在的Sca-1的变体，例如剪接变体、等位基因变体和其它同种型。术语还涵盖维持Sca-1至少一种生物学活性的天然Sca-1的片段或变体。

术语“一种***干细胞(prostate stem cell)”(PSC)或“多种***干细胞(prostate stem cells)”(PSCs)用于本文时指可以自我更新并且能够产生在***中发现的所有上皮细胞类型的一种***细胞或多种***细胞。***干细胞可以通过它们在体外产生包含腺腔的***集落的能力进行检测。***干细胞最终能够在体内产生功能性***。

术语“一种***癌干细胞(prostate cancer stem cell)”(PCSC)或多种“***癌干细胞(prostate cancer stem cells)”(PCSCs)用于本文时指能够产生与***癌相关的发生肿瘤的细胞的一种细胞或多种细胞。***癌干细胞是负责由突变的正常***中形成***癌，和/或在最初的癌症治疗后重新形成***癌的细胞。***癌干细胞可以使用体外细胞增殖测定法进行检测。它们还可以使用体内移植测定法进行检测。例如，将提议的***癌干细胞注射或移植到体内宿主模型中，并检查所述模型以确定是否所述细胞的注射/移植形成发展***癌的模型。在模型中产生***癌的那些细胞是***癌干细胞。

术语“多核苷酸”或“核酸”可以在本文互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶结合到聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它们的类似物。

术语“检测”包括任何检测方式，包括直接和间接检测。

术语“诊断”在本文中用于意指鉴定分子的或病理学的状态、疾病或病症，诸如确定癌症(例如***癌)或癌症的特定类型(例如以特定变异为特征的***癌)。术语″预测″用于本文时指预测可归因于癌症的死亡或进展(包括例如瘤形成疾病如癌症的复发、转移扩散和药物抵抗)的可能性。术语″预测″用于本文时，也指患者对药物或一组药物响应良好或不良的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在一个实施方案中，预测涉及患者在治疗后是否存活一定时间而不伴随癌症的复发和/或这样存活的可能性，该治疗例如用特定治疗剂治疗和/或手术去除原发性肿瘤，和/或化疗。在另一个实施方案中，预测涉及患者是否经历癌症的复发和/或患者经历癌症复发的可能性。本发明的预测方法可以在临床上通过选择对于任何特定患者的最适合的治疗方式来做出治疗决定。本发明的预测方法在预测患者是否可能对治疗方案(如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合，外科手术干预，化疗等)响应良好，或预测治疗方案后患者是否可能长期存活中是有价值的工具。基于本发明的预测方法可选择接受特定治疗的患者。

术语“细胞增殖病症”和“增殖病症”指与可测量程度的异常细胞增殖相关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖病症是癌症。

“肿瘤”在用于本文时指所有瘤形成性细胞生长和增殖，无论是恶性的或者是良性的，及所有癌前的和癌性的细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖病症”、“增殖病症”和“肿瘤”在本文中不相互排他的引用。

术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征典型地为细胞生长和增殖不受调节的生理病况。癌症的实例包括但不限于癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)(例如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s and non-Hodgkin’s lymphoma))、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、和白血病(leukemia)。癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、小细胞肺癌(small-cell lung cancer)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌(cancer of the peritoneum)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、胃肠癌(gastrointestinal cancer)、胃癌(gastric cancer)、食管癌(esophageal cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、神经胶质瘤(glioma)、***(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、肝癌(liver cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(breast cancer)、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectal cancer)、肺癌(lung cancer)、子宫内膜癌或子宫癌(endometrial or uterine carcinoma)、唾液腺癌(salivary gland carcinoma)、肾癌(kidney cancer)、肝癌(liver cancer)、***癌(prostate cancer)、外阴癌(vulval cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、肝癌(hepatic carcinoma)、黑素瘤(melanoma)、白血病(leukemia)和其它淋巴增殖性病症(lymphoproliferative disorder)、和各种类型的头和颈癌(head and neck cancer)。

术语“***肿瘤”或“***癌”是指***的任何肿瘤或癌症。

术语“***肿瘤细胞”或“***癌细胞”是指体内或体外的***肿瘤细胞或***癌细胞，并包括来源于此类细胞的细胞系。

术语“赘生物”或“赘生性细胞”是指比相应正常组织或细胞增殖更快的异常组织或细胞，并且在去除启动生长的刺激后继续生长。

“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指体内或体外的肿瘤细胞或癌细胞，并包括来源于此类细胞的细胞系。

用于本文时，“治疗”(“treatment”)(以及变化诸如“治疗”(“treat”)或“治疗”(“treating”))或“疗法”(“therapy”)指临床介入，其试图改变被治疗的个体或细胞的自然过程，并且可以为了预防或者在临床病理的过程中进行。希望的治疗效果包括预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果，防止转移，减低疾病发展速率，减轻或缓和疾病状态，和缓和/或者改善的预后。

术语“辅助疗法”是指在初次癌症治疗之后给予的另外的癌症治疗以降低癌症复发的风险。

“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，家畜(如猪和牛)、竞技动物、宠物(如猫、狗和马)、灵长类动物(包括人和非人灵长类动物)、和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。

“有效量”指在需要的剂量和时间阶段，有效获得需要的治疗或预防效果的量。

本发明的物质/分子的“治疗有效量”可以根据因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述物质/分子激发个体中需要的反应的能力而改变。治疗有效量涵盖这样的量，其中治疗有益作用超出所述物质/分子的任何毒性或有害作用。

术语“长期”存活在用于本文时是指治疗性处理后存活至少1年，5年，8年或10年。

在根据本发明使用时，术语对特定治疗剂或治疗选项“抵抗性升高”意味着对标准剂量的药物或对标准治疗方案的响应降低。

在根据本发明使用时，术语对特定治疗剂或治行选项“敏感性降低”意味着对标准剂量的药剂或对标准治疗方案的响应降低，其中降低的响应可通过增加药剂剂量或治疗密度来弥补(至少部分弥补)。

“患者响应”可利用表明对患者有益处的任何终点来评估，包括但不限于：(1)在某种程度上抑制肿瘤生长，包括减缓和完全的生长阻滞；(2)减少肿瘤细胞数目；(3)减小肿瘤尺寸；(4)抑制(即降低、减缓或完全阻止)肿瘤细胞渗入临近的周围器官和/或组织；(5)抑制(即降低、减缓或完全阻止)转移；(6)增强抗肿瘤的免疫压答，其可以但不必造成肿瘤消退或排斥；(7)在某种程度上减轻一种或多种与肿瘤有关的症状；(8)延长治疗后存活的长度；和/或(9)降低治疗后给定时间点的死亡率。

“响应”治疗剂的肿瘤或癌症是显示任何肿瘤进展减退的肿瘤或癌症，所述减退包括但不限于：(1)在某种程度上抑制肿瘤生长，包括减缓和完全的生长阻滞；(2)减少肿瘤细胞数目；(3)减小肿瘤尺寸；(4)抑制(即降低、减缓或完全阻止)肿瘤细胞渗入临近的周围器官和/或组织；和/或(5)抑制(即降低、减缓或完全阻止)转移。

术语“拮抗剂”以最广意义使用，包括部分或完全抑制或中和多肽(例如CD117)的生物学功能(例如激酶活性)的任何分子，或部分或完全抑制编码该多肽的核酸的转录或翻译的任何分子。适当的拮抗剂分子包括但不限于拮抗性抗体、多肽片段、寡肽、有机分子(包括小分子)和反义核酸。

术语“激动剂”以最广意义使用，包括部分或完全模拟多肽的生物学活性的任何分子，或增加编码该多肽的核酸的转录或翻译的任何分子。适当的激动剂分子包括但不限于激动性抗体、多肽片段、寡肽、有机分子(包括小分子)、多核苷酸、多肽和多肽-Fc融合体。

本文所用的术语“细胞毒性试剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素)，化疗剂(例如，甲氨喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂(intercalating agents)、酶及其片段，诸如核酸降解酶(nucleolytic enzymes)、抗生素和毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体，以及下文公开的多种抗肿瘤药或抗癌药。下文记述了其它的细胞毒性试剂。“杀肿瘤细胞”剂引起肿瘤细胞的破坏。

“毒素”是能够对细胞的生长或增殖具有破坏效应的任何物质。

“化疗剂”是有效用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷基化试剂，如塞替哌(thiotepa)和CYTOXAN

环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；聚乙酸类(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；Δ-9-四氢***酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol)、MARINOL

)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN

)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)CAMPTOSAR

)、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、scopolectin和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosoureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)、特别是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)，包括烯二炔蒽环类抗生素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、ADRIAMYCIN

多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿剂如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；aldophosphamide glycoside；5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

多糖复合物(JHS Natural Products(JHS天然产品)，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺(2，2’，2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine0)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE

FILDESIN

)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类化合物(taxoids)，例如，TAXOL

紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，新泽西)无克列莫佛(Cremophor-free)的ABRAXANE^TM、紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，伊利诺伊州)；和TAXOTERE

多西他赛(docetaxel)(

-Poulenc Rorer、Antony、法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR

)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；铂类似物如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN

)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)；奥沙利铂(oxaliplatin)；leucovovin；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE)；诺安托(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO)；维甲类(retinoids)如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)(XELODA

)；任何上述物质的药用盐、酸或衍生物；以及上述物质中两种或多种的组合，如CHOP，即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙组合治疗法的缩写，和FOLFOX，使用奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATIN^TM)与5-FU和leucovovin联合的治疗方案的缩写。

下列物质也包含在本定义中，它们是：起调控、减少、阻断或抑制可以促进癌症生长的激素的作用的抗激素药剂，所述抗激素药剂通常处在***治疗或全身治疗形式中。它们可以是激素本身。实例包括抗***药和选择性***受体调节物(SERMs)，包括例如，他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、EVISTA

雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)，曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON

托瑞米芬(toremifene)；抗***药(anti-progesterones)；***受体下调剂(ERDs)；起作用抑制或关闭卵巢的药剂，例如，促黄体生成激素释放素(leutinizing hormone-releasing hormone)(LHRH)激动剂如LUPRON

和ELIGARD

醋酸亮丙立德(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和tripterelin；其它抗雄激素药诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；和芳香酶抑制剂(aromatase inhibitors)，其抑制芳香酶，该酶调节肾上腺中的***生成，诸如，例如，4(5)-咪唑类(4(5)-imidazoles)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、赴美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR

伏氯唑(vorozole)、FEMARA

来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX

阿那曲唑(anastrozole)。另外，所述化疗剂的定义包括二膦酸盐(bisphosphonates)如氯膦酸盐(clodronate)(例如，BONEFOS

或OSTAC)、DIDROCAL

依替膦酸盐(etidronate)、NE-58095、ZOMETA

唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)、FOSAMAX阿仑膦酸盐(alendronate)、AREDIA

帕米膦酸盐(pamidronate)、SKELID替鲁膦酸盐(tiludronate)、或ACTONEL

利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、特别是抑制异常细胞增生所涉及的信号传导途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，诸如例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗诸如THERATOPE疫苗和基因治疗疫苗、例如，ALLOVECTIN

疫苗、LEUVECTIN

疫苗和VAXID

疫苗；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIX

rmRH；托西拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也已知为GW572016)；和上述任意物质的药用盐、酸或衍生物。

″抗体″(Abs)和″免疫球蛋白″(Igs)指具有类似结构特征的糖蛋白。当抗体显示针对特异性抗原的结合特异性时，免疫球蛋白包括抗体和通常缺乏抗原特异性的其它抗体样分子。后者的多肽例如由淋巴***在低水平产生，和由骨髓瘤以增加的水平产生。

术语″抗体″和“免疫球蛋白”，广义地在本文交互使用，并包括单克隆抗体(例如全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)并且还可以包括某些抗体片段(如本文更详细描述)。抗体可以是嵌合的抗体、人抗体、人源化抗体和/或亲和力成熟抗体。

术语“抗-CD117抗体”或“与CD117结合的抗体”指这样的抗体，其能够以足够的亲和性结合CD117，从而使所述抗体可以用作靶向CD117的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，结合CD117的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗-CD117抗体结合在不同物种的CD117中都保守的CD117的表位。

术语“抗-CD44抗体”指这样的抗体，其能够以足够的亲和性结合CD44，从而使所述抗体可以用作靶向CD44的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，结合CD44的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗-CD44抗体结合在不同物种的CD44中都保守的CD44的表位。

术语“抗-CD133抗体”指这样的抗体，其能够以足够的亲和性结合CD133，从而使所述抗体可以用作靶向CD133的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，结合CD133的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗-CD133抗体结合在不同物种的CD133中都保守的CD133的表位。

术语“抗-Sca-1抗体”指这样的抗体，其能够以足够的亲和性结合Sca-1，从而使所述抗体可以用作靶向Sca-1的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，结合Sca-1的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗-Sca-1抗体结合在不同物种的Sca-1中都保守的Sca-1的表位。

术语“全长抗体，”“完整的抗体”和“完整抗体”在本文交替地用于指以其基本完整形式存在的抗体，而非下文定义的抗体片段。术语特别指具有包含Fc区的重链的抗体。

″抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留至少一种，和多到大部分或全部当其在完整抗体中存在时在正常情况下与该部分相关的功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，并且由此保持其结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如，包含Fc区的抗体片段保持至少一种当其存在于完整抗体中时，正常情况下与Fc区相关的生物学功能，如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有基本与完整抗体类似的体内半衰期的单价抗体。例如，所述抗体片段可以包含与能够赋予所述片段体内稳定性的Fc序列相连的抗原结合臂。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，所述“Fab”片段每个具有单抗原结合位点，以及残余的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)₂片段，所述片段具有两个抗原组合位点，并且仍旧能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，每个可变结构域的三个CDRs相互作用从而限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之，六个CDRs将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个CDRs的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，然而亲和性低于完整结合位点。

Fab片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域并且还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端加入几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文关于Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab’)₂抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶联。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单多肽链存在。一般地，所述scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，所述接头使scFv形成对于抗原结合需要的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun于The Pharmacology of Monoclonal  Antibodies(单克隆抗体药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag，New York，1994)，269-315页中。

术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在相同的多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短所以不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 93/1161；Hudson等.(2003)，Nat.Med.9：129-134；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。三链抗体(triabodies)和四链抗体(tetrabodies)还在Hudson等.(2003)Nat.Med.9：129-134中进行描述。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能突变(例如天然存在突变)外。因此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同抗体混合物的特征。在某些实施方案中，所述单克隆抗体典型地包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶标结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择方法可以是从众多克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合)中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶标结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶标的亲和性、将靶标结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优点在于它们典型地未受到其它免疫球蛋白的污染。

修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler等.，自然(Nature)256：495(1975)；Harlow等，抗体：实验室手册(Antibodies： A Laboratory Manual)，(冷泉港实验室出版社，第2版.1988)；Hammerling等，于：单克隆抗体和T-细胞杂交瘤 (Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)，563-681(Elsevier，N.Y.，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等，自然(Nature)352：624-628(1991)；Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1992)；Sidhu等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)338(2)：299-310(2004)；Lee等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；WO91/10741；Jakobovits等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)90：2551(1993)；Jakobovits等，自然(Nature)362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等，生物.技术(Bio.Technology)10：779-783(1992)；Lonberg等，自然(Nature)368：856-859(1994)；Morrison，自然(Nature)368：812-813(1994)；Fishwild等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)14：845-851(1996)；Neuberger，自然生物技术(Nature Biotechnol.)14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利号.4,816,567；和Morrison等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)USA 81：6851-6855(1984))。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基用具有期望特异性、亲和性和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节例如参见Jones等，自然(Nature)321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见下述综述文章和其中引用的文献：Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。

“人抗体”是这样的抗体，其包含与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。所述技术包括筛选人源的组合文库，如噬菌体展示文库(见，例如，Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol).，222：581-597(1991)和Hoogenboom等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，19：4133-4137(1991))；使用人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系来生产人单克隆抗体(见，例如，Kozbor免疫学杂志(J.Immunol).，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体生产技术和应用(Monoclonal antibody Production Techniques and Applications)，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)；和Boerner等，免疫学杂(J.Immunol.)，147：86(1991))；和在转基因动物(例如小鼠)中产生单克隆抗体，所述转基因动物能够在缺乏内源免疫球蛋白生产的情况下产生人抗体的全部所有组成成分(见，例如，Jakobovits等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，90：2551(1993)；Jakobovits等，自然(Nature)，362：255(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol.，7：33(1993))。人抗体的这种定义具体地排除了包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。

“亲和力成熟的”抗体是在抗体的一个或多个CDRs中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和性与没有那些改变的母体抗体相比有所提高的抗体。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和性。亲和力成熟的抗体可使用一些本领域已知方法来生成。Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或构架残基的随机诱变：Barbas等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)91：3809-3813(1994)；Schier等，基因(Gene)169：147-155(1995)；Yelton等，免疫学杂志(J.Immunol.)155：1994-2004(1995)；Jackson等，免疫学杂志(J.Immunol.)154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)226：889-896(1992)。

“封闭”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或减少其结合的抗原的生物学活性的抗体。某些封闭抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物学活性。

将“小分子”或“小有机分子”在本文定义为具有低于约500道尔顿的分子量的有机分子。

“CD117-结合的寡肽”或“结合CD117的寡肽”是能够以足够的亲和性结合CD117从而使得所述寡肽可以用作靶向CD117的诊断剂和/或治疗剂的寡肽。在某些实施方案中，CD117-结合寡肽与不相关的非-CD117蛋白结合的程度少于CD117-结合寡肽与CD117结合的约10％，如通过例如表面等离子共振测定法(surface plasmon resonance assay)所测量的。在某些实施方案中，CD117-结合寡肽具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，或≤0.1nM的解离常数(Kd)。

“CD117-结合有机分子”或“结合CD117的有机分子”是除了如本文定义能够以足够的亲和性结合CD117从而使得所述有机分子可以用作靶向CD117的诊断剂和/或治疗剂的寡肽或抗体的有机分子。在某些实施方案中，CD117-结合有机分子与不相关的非CD117蛋白的结合的程度少于CD117-结合有机分子与CD117结合的约10％，如通过例如表面等离子共振测定法所测量的。在某些实施方案中，CD117-结合有机分子具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，或≤0.1nM的解离常数(Kd)。

结合靶多肽的任何分子的解离常数(Kd)可以使用表面等离子共振测定法方便地进行测量。所述测定法可以使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃用固定的靶多肽CM5芯片以～10反应单位(RU)进行。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore，Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)根据生产商的说明书进行活化。在以5μl/分钟的流速注射之前，将靶多肽用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释到5μg/ml(～0.2μM)从而获得约10反应单位(RU)的偶联蛋白。在注射靶多肽后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。关于动力学测量，将结合分子的两倍系列稀释物(0.78nM到500nM)在具有0.05％Tween 20(PBST)的PBS中，在25℃，以约25μl/min的流速进行注射。使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件版本3.2)，通过同时拟合缔合和解离传感图来计算缔合速率(k_on)和解离速率(k_off)。将平衡解离常数(Kd)计算为k_off/k_on的比率。见，例如，Chen，Y.，等，(1999)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)293：865-881。如果抗体的缔合速率通过上述的表面等离子共振测定法确定超过10⁶M^-1s^-1，那么缔合速率可以通过使用荧光猝灭技术来确定，所述荧光猝灭技术在25℃，在存在增加浓度的抗原时，测量20nM在PBS，pH 7.2中的抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如使用分光光度计，如滞流装备的分光光度计(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv仪器)，或具有搅拌的比色杯的8000-系列的SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)进行测量的。

“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的用于将药剂，例如药物递送给哺乳动物的小囊泡。所述脂质体的成分一般以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。

术语″标记″当用于本文时，指可检测的化合物或组合物。所述标记本身是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶促标记的情形中，可以催化形成可检测产物的基底化合物或组合物的化学改变。可以作为可检测标记的放射性核素包括，例如I-131，I-123，I-125，Y-90，Re-188，Re-186，At-211，Cu-67，Bi-212，和Pd-109。

“分离”的生物分子，如核酸、多肽或抗体是已经从其天然环境的至少一种成分进行鉴定和分离和/或回收的生物分子。

″分离的细胞″是这样的细胞，所述细胞已经从其天然环境的至少一种成分鉴定和分离和/或回收。

本发明的组合物和方法

如本文所提供，CD117是具有多能、自我更新能力的***干细胞(PSCs)的稀有标记。CD117表达主要位于尿道近侧的小鼠***的区域，并且在***诱导的***退化后被上调，与PSC标记一致的两个特征。当体内移植时，CD117⁺ PSCs可以产生功能性的，产生分泌的***。而且，CD117⁺ PSCs显示长期的自我更新能力，如通过体内系列分离和移植所证实的。PSCs的另外的纯化在一些实施方案中是需要的，并且通过基于另外的标记CD133，和/或CD44，和/或Sca-1分选或分离细胞而实现。如在实施例中所述，由Lin-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺表型限定的成年小鼠***分离的单细胞可以在体内移植后产生***。

因此，在本发明的一个方面中提供分离PSCs的方法。在一个实施方案中，***细胞群获自供体的***。在一些实施方案中，所述供体是哺乳动物供体。在一些实施方案中，所述供体是人。在其它实施方案中，所述供体是小鼠、大鼠、猪或其它适合的哺乳动物供体。在一些实施方案中，对所述***细胞群进行处理以去除所有的导致谱系消减的(Lin-)细胞群的谱系细胞。获得Lin-细胞群的方法是本领域公知的，并且在实施例中进行描述。对所述***细胞群进行分选从而获得这样的细胞群，所述细胞群表达细胞表面标记CD117，CD133，CD44，和Sca-1的至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种。在具体的实施方案中，对Lin-细胞群进行分选从而获得表达CD117，CD133，和CD44(表型Lin-/CD117+/CD133+/CD44+)或CD117，CD133，CD44，Sca-1(表型Lin-/CD117+/CD133+/CD44+/Sca-1+)的细胞群。另外的实施方案包括，例如分选细胞群从而获得具有下列表型：Lin-/CD117+，Lin-/CD117+/CD133+，Lin-/CD117+/CD44+，Lin-/CD117+/Sca-1+，Lin-/CD117+/CD133+/Sca-1+，Lin-/CD117+/CD44+/Sca-1+的细胞的方法。

基于细胞表面标记分选细胞的方法是本领域公知的，并且包括，例如标准的流式细胞术，磁法细胞分选，和荧光激活的细胞分选术(FACS)。

本发明的另一个方面提供获自所述细胞分选方法的细胞群和/或单细胞。所述细胞群是基本纯的并且不包含不表达用于分选所述细胞的标记的显著细胞群。在一些实施方案中，所述细胞群是至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或99.5％纯的。

使用所述分选方法获得的PSCs可以用在许多方法中，包括***组织再生的方法和筛选化合物的方法。

在男性中失去功能性***通常会导致许多不合需要的生理和情感状况，包括失去性功能、尿失禁、肠功能障碍和抑郁症。Kirby，R.S.等，Prost Can Prost Disease 1：179-184(1998)，Weber，B.等，Am J Men′s Health，2(2)：165-171(2008)。因此，本发明的一个方面提供在患者中再生功能性***的方法。在一个实施方案中，将本发明的PSC植入患者中从而使所述PSC再生功能性的***。在一个实施方案中，患者没有***并且所述PSC被植入患者的尿道附近导致产生***。在另一个实施方案中，患者具有不完全的***，并且所述PSC被植入在不完全的***中或不完全的***附近，导致***组织和功能性***的再生。在一个实施方案中，所述患者是人患者。在另一个实施方案中，所述患者时人男性患者。

在又一个实施方案中，将宿主生物用于产生移植到患者中的***。在一个实施方案中，所述患者是人患者。在另一个实施方案中，所述患者是人男性患者。在一个实施方案中，将来自患者、或来自与患者相同物种的成员的PSC植入宿主生物体中，导致产生***。将所述PSC以提供足够的血管化作用从而产生***的方式植入宿主生物体中。在一个实施方案中，将所述PSC植入在所述宿主的肾被膜下。将所述***从所述宿主中移去并且移植到需要功能性***的患者中。在一个实施方案中，所述宿主和患者是相同的或来自相同的物种。在一个实施方案中，所述宿主和患者是人。在另一个实施方案中，所述宿主和患者不是相同的物种。在一个实施方案中，所述宿主是猪或其它适合的非人哺乳动物。在另一个实施方案中，所述患者是人。

在又一个实施方案中，***在先体外后体内(ex vivo)***中产生。先体外后体内产生组织和器官的***是已知的并且描述在例如美国专利号6,121,042，6,210,957，6,171,812，7,410,792，6,432,713，6,599,734，6,607,917，和6,921,662中。

用于分离正常PSCs的标记在分离***癌干细胞(PCSCs)中也是有用的。本发明的PCSCs表达用于分离正常的PSCs的相同标记。正常的PSCs和PCSCs可以使用确定所述细胞是否分化为***(正常PSCs)或增殖并产生***癌(PCSCs)的测定法从一种或其它种进行分化。所述测定法是本领域已知的并且在本文描述。

将PSCs和PCSCs用于筛选这样的化合物的方法，所述化合物可以用于增加组织产生或减少细胞增殖并且用于治疗***癌。因此，本发明的一个方面提供鉴定用于治疗***癌的化合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使PSC或PCSC(或基本纯的PSCs或PCSCs的群体)与测试化合物接触，并且筛选测试化合物对于PSC或PCSC的增殖或存活性的作用。在一个具体的实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117和CD44。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117和CD133。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117，CD44，和CD133。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117，CD44，CD133，和Sca-1。在一个实施方案中，所述方法确定所述测试化合物是否抑制所述PSC或PCSC的增殖。对增殖的抑制可以使用任何本领域已知的方法进行确定，所述方法包括体外细胞增殖测定法。在一些实施方案中，所述方法包括确定在缺乏测试化合物的情况下PSC或PCSC的增殖以提供关于测试化合物的作用的比较。在另一个实施方案中，所述方法确定所述测试化合物是否杀死PSC或PCSC。

用于抑制细胞生长或增殖的测定法是本领域中公知的。用于细胞增殖的某些测定法，由本文所述的“细胞杀伤”测定法例示，测量细胞存活力。一种所述测定法是CellTiter-Glo^TM发光细胞存活测定法，这是可以从Promega(Madison，WI)商购的。该测定法基于存在的ATP的量化(其指示代谢活性细胞)确定在培养物中的活细胞的数量。见Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88，美国专利号6602677。该测定法可以以96孔或384孔形式进行，使其易于进行自动的高通量筛选(HTS)。见Cree等(1995)AntiCancer Drugs(抗癌药物)6：398-404。该测定法包括直接将单试剂(CellTiter-Glo

 Reagent)加入培养的细胞中。这导致细胞裂解并且产生由萤光素酶反应得到的发光信号。发光信号与存在的ATP的量成比例，所述ATP的量与在培养物中存在的活细胞的数目直接成比例。数据可以由发光计或CCD照相成像装置记录。将发光输出量表示为相对光单位(RLU)。

用于细胞增殖的另外的测定法是“MTT”测定法，一种测量通过线粒体还原酶将3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯基四氮唑溴化物氧化为甲

的比色测定法。象CellTiter-Glo^TM测定法一样，该测定法显示在细胞培养物中存在的代谢活性细胞的数量。见，例如Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)65：55-63，和Zhang等(2005)Cancer Res.(癌症研究)65：3877-3882。

用于诱导细胞死亡的测定法是本领域公知的。在一些实施方案中，这样的测定法测量，例如膜完整性的损失，如通过碘化丙锭(PI)、锥虫蓝(见Moore等(1995)Cytotechnology(细胞技术)，17：1-11)，或7AAD的吸收所显示的。在示例性PI吸收测定法中，将细胞在补充了10％热灭活的FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco′s改进的Eagle培养基(D-MEM)∶Ham′s F-12(50∶50)中进行培养。由此，将测定法在缺乏补体和免疫效应细胞的情况下进行。将细胞以3x 10⁶/碟的密度接种在100x20mm的碟中，并使其附着过夜。移去培养基，并将其用单独的新鲜培养基或包含各种浓度的抗体或免疫缀合物的培养基替换。将细胞温育3天时间阶段。在处理后，将单层用PBS洗涤，并通过胰蛋白酶消化脱离。接着，将细胞在4℃以1200rpm离心5分钟，将沉淀物重新悬浮在3ml冷Ca²⁺结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl₂)中，并等分到35mm滤器-加帽的12x75mm管(1ml/管，每处理组3管)中以去除细胞块。管接着接受PI(10μg/ml)。使用FACSCAN^TM流式细胞仪和FACSCONVERT^TM CellQuest软件(Becton Dickinson)来分析样品。由此鉴定诱导如通过PI吸收确定的统计学显著水平的细胞死亡的化合物。

关于诱导凋亡的化合物的示例性测定法是用于检测基因组DNA的核小体间降解的膜联蛋白结合测定法和组蛋白DNA ELISA比色测定法。这样的测定法可以使用例如细胞死亡检测ELISA试剂盒(Roche，Palo Alto，CA)进行。

本发明的另一个方面提供鉴定用于促进组织再生的化合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使PSC(或基本纯的PSCs的群体)与测试化合物接触，并评估所述测试化合物对于PSCs生长和分化为***组织、***集落或功能性***的作用。在具体的实施方案中，PSC表达CD117。在另一个实施方案中，所述PSC表达CD117和CD44。在另一个实施方案中，所述PSC表达CD117和CD133。在另一个实施方案中，所述PSC表达CD117，CD44，和CD133。在另一个实施方案中，所述PSC表达CD117，CD44，CD133，和Sca-1。在一些实施方案中，所述方法包括在缺乏测试化合物的情况下确定测试化合物对于PSCs的生长和分化的作用从而提供关于测试化合物的作用的比较。用于确定化合物的生长促进作用的测定法见于实施例中。

在另一个方面中，提供抑制PSC或PCSC的增殖的方法，所述方法包括将PSC或PCSC暴露于CD117的拮抗剂或与CD117的拮抗剂接触。在具体的实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117和CD44。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117和CD133。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117，CD44，和CD133。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117，CD44，CD133，和Sca-1。

本发明的另一个方面提供基于PSCs或PCSCs在患者的***癌中存在与否治疗***癌的方法。预期其***癌包含PSCs或PCSCs的患者对用抑制PSCs或PCSCs的增殖的化合物进行的治疗有响应。因此，PSCs或PCSCs的存在与否可以用于确定抑制PSCs或PSCSs的增殖的化合物是否应该包括在患者的治疗方案中。治疗方案可以是初级治疗方案(primary treatment regime)。PSCs或PSCSs的存在在预测***癌是否有可能在患者中复发中是特别有用的，所述患者已经具有明显成功的初级治疗方案。如果在***癌中检测到PSCs或PSCSs的存在，那么预测所述患者可能经历***癌的复发并且是用于辅助疗法的候选物，所述辅助疗法用抑制PSCSs的增殖，或预防PCSCs产生***癌的化合物进行。

一种具体的实施方案提供治疗患者中***癌的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果患者的***癌包含PSC或PCSC，对所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂。另一个实施方案提供用于治疗患者中***癌的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果所述患者的***癌包含PSC或PCSC，则向所述患者施用治疗有效量的CD133拮抗剂。另一个实施方案提供用于治疗患者中的***癌的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果所述患者的***癌包含PSC或PCSC，则向所述患者施用治疗有效量的CD44拮抗剂。另一个实施方案提供用于治疗患者中的***癌的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果所述患者的***癌包含PSC或PCSC，则向所述患者施用治疗有效量的Sca-1拮抗剂。另一实施方案提供治疗患者中***癌的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果所述患者的***癌包含PSC或PCSC，向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂和至少一种的CD133拮抗剂、CD44拮抗剂和/或Sca-1拮抗剂的组合。

本发明的另一个方面涉及预测***癌患者在结束用于治疗***癌的初级疗法后，是否可能经历***癌的复发。一个实施方案提供预测***癌患者是否可能经历***癌的复发的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC并且如果患者的***癌包含PSC或PCSC，则预测所述患者可能经历复发。这种预测可以用于指导患者的进一步治疗并可以导致辅助疗法的应用。在一个实施方案中，在预测患者可能经历***癌的复发的之后进行包括向患者施用CD117拮抗剂的辅助疗法。在另一个实施方案中，在预测所述患者可能经历***癌的复发之后进行包括向患者施用CD133拮抗剂的辅助疗法。在另一个实施方案中，在预测所述患者可能经历***癌的复发后，进行包括向患者施用CD44拮抗剂的辅助疗法。在另一个实施方案中，在预测所述患者可能经历***癌的复发之后，进行包括向患者施用Sca-1拮抗剂的辅助疗法。在另一个实施方案中，预测患者可能经历***癌的复发后，进行辅助疗法，所述辅助疗法包括向患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂和至少一种的CD133拮抗剂、CD44拮抗剂、和/或Sca-1拮抗剂的组合。

另一个实施方案提供用于预防患者中***癌的复发的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果患者的***癌包含PSC或PCSC则向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂。另一个实施方案提供向治疗***癌的患者提供辅助疗法的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果患者的***癌包含PSC或PCSC，则向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂。另一个实施方案提供向治疗***癌的患者提供辅助疗法的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果所述患者***癌包含PSC或PCSC，则向所述患者施用治疗有效量的CD133拮抗剂。另一个实施方案提供向治疗***癌的患者提供辅助疗法的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果所述患者***癌包含PSC或PCSC，则向所述患者施用治疗有效量的CD44拮抗剂。另一个实施方案提供向治疗***癌的患者提供辅助疗法的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且如果所述患者***癌包含PSC或PCSC，则向所述患者施用治疗有效量的Sca-1拮抗剂。另一个实施方案提供向治疗***癌的患者提供辅助疗法的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC，并且向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂和至少一种的CD133拮抗剂、CD44拮抗剂、和/或Sca-1拮抗剂的组合。

另一种实施方案提供选择***癌患者用CD117拮抗剂进行治疗的方法，所述方法包括确定所述患者是否具有包含PSC或PCSC的***癌，并且如果所述患者具有包含PSC或PCSC的***癌，选择所述患者用CD117拮抗剂进行治疗。

又一个实施方案提供选择***癌患者用CD117拮抗剂进行辅助治疗的方法，所述方法包括确定所述患者的***癌是否包含PSC或PCSC并且如果所述患者的***癌包含PSC或PCSC，选择所述患者用CD117拮抗剂进行辅助治疗。

在上述方面的具体实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117和CD44。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117和CD133。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117，CD44，和CD133。在另一个实施方案中，所述PSC或PCSC表达CD117，CD133，CD44，和Sca-1。

检测标记CD117，CD133，CD44，和Sca-1的表达可以通过本领域已知的任何方法进行。在一个实施方案中，通过确定标记基因mRNA转录水平检测标记的过量表达。mRNA转录的水平可以通过本领域技术人员已知的各种方法，定量地或定性地进行确定。mRNA转录的水平也可以通过检测从mRNA产生的cDNA水平来直接或间接地确定。用于确定mRNA转录水平的示例性方法包括，但不限于：PCR，实时定量RT-PCR和基于杂交的测定法，包括基于微阵列的测定法和基于滤器的测定法(filter-based assay)如RNA印迹。

在其它实施方案中，标记的表达通过确定标记多肽表达的水平来检测。标记多肽的水平可以通过本领域技术人员已知的某些方法定量地或定量地确定，所述方法包括基于抗体的检测方法。在一个实施方案中，在测试样品中检测标记基因的表达包括使测试样品与对标记多肽特异的抗体接触，并且通过检测抗体与标记多肽的结合确定测试样品中的标记多肽表达的水平(定量地或定性地)。在某些实施方案中，抗体与标记多肽的结合可以通过本领域技术人员已知的各种方法检测，所述方法包括但不限于免疫组化、荧光激活细胞分选术、蛋白质印迹、放射性免疫测定法、ELISA等。

癌细胞的样品，或测试样品优选地包含直接从***癌肿瘤中取出的细胞，但是所述测试样品还可以包含转移性癌细胞、循环肿瘤细胞，或任何适合的鉴定标记基因或多肽在癌症中的扩增或表达状态的细胞样品。

在一些实施方案中，可以通过确定用于确定标记表达的相同测试样品中，或在来自将测试标记表达的相同癌症的样品中持家基因(如肌动蛋白家族成员)的表达，来产生对照。持家基因作用为比较对照，关于所述比较对照确定标记基因的表达。

在上述方面的具体实施方案中，CD117的拮抗剂是小分子拮抗剂。在另一个实施方案中，所述CD117的拮抗剂是拮抗剂抗体。在另一个实施方案中，CD117的拮抗剂是可溶的CD117受体或其变体。

多种CD117激酶拮抗剂是本领域已知的。所述激酶拮抗剂包括，但不限于拮抗剂抗体和小分子拮抗剂例如，3-[2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基(methylidene)]-吲哚满-2-酮(“SU5416”)；5-[1，2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-基亚基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-丙酸(“SU6668”)；甲磺酸伊马替尼(“STI571”，Gleevec

Novartis)，马来酸舒尼替尼(Sutent

Pfizer)，3-苯基-1H-苯并呋喃并[3，2-c]吡唑(“GTP-14564”)，5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-3H-吲哚-3-基亚基)甲基]N-[2-(二乙基氨基)乙基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酰胺(carboxamide)(“SU11652”)，6，7-二甲氧基-3-苯基喹噁啉(“AG 1296”)，1，2-二甲基-6-(2-噻吩基)-咪唑并[5，4-g]喹喔啉(“AGL 2043”).和吲哚满酮如3-[3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-2-亚甲基(methylidenyl)]-2-吲哚满酮(“SU5402”)(见，例如，Bernard-Pierrot(2004)癌基因(Oncogene)23：9201-9211)。

在上述方面的具体实施方案中，CD133、CD44或Sca-1的拮抗剂是小分子拮抗剂。在另一个实施方案中，CD133，CD44，或Sca-1的拮抗剂是拮抗剂抗体。在另一个实施方案中，CD133，CD44，或Sca-1的拮抗剂分别是CD133，CD44，或Sca-1的变体。

药物组合物

包含所述拮抗剂的治疗制剂包括在内，并且通过混合具有需要纯度的活性成分和任选的生理可接受的载体、赋形剂或稳定剂使用本领域已知的标准方法进行制备(雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(20.sup.th edition)，A.Gennaro编辑，2000，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，Pa.).。可接受的载体包括盐水或缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的平衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEEN^TM，PLURONICS^TM，或PEG。

任选地，所述制剂包含药用盐、优选地氯化钠并且优选地在约生理浓度包含药用盐。任选地，本发明的制剂可以包含药用防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂的浓度范围是0.1到2.0％，典型地以v/v计。适合的防腐剂包括在药物领域中已知的那些。苄醇、苯酚、间甲苯酚、羟苯甲酯和羟苯丙酯是优选的防腐剂。任选地，本发明的制剂可以包含浓度为0.005到0.02％的药用表面活性剂。

本文制剂也可以包含超过一种活性化合物，如被治疗的特定适应症所需要，优选地是对彼此没有不良影响具有补充活性的那些。所述分子适当地以对于意欲目的有效的量组合存在。

活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊剂中，例如分别在胶状药物递送***(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳，纳米颗粒和纳米胶囊)或在微乳中的羟甲基纤维素或明胶-微囊剂和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊剂。所述技术在雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)中公开，见上文。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的适合的实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质以成形的制品的形式存在，例如薄膜或微囊剂。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,9l9)，L-谷氨酸和.γ.乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)，和聚-D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够释放分子超过100天，而某些水凝胶则在更短的时间阶段释放蛋白。当包封的抗体仍旧在体内较长时间时，它们可能由于在37℃暴露于水分而变性或聚集，导致生物学活性的损失和免疫原性的可能变化。根据涉及的机制，可以设计合理的策略来进行稳定。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫化物交换的分子间S-S键形成，那么稳定可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冷冻干燥、控制水分含量、使用适合的添加剂并且开发特定的聚合物基质组合物来实现。

根据已知方法，将如本文所述的拮抗剂，如CD117拮抗剂施用于人受试者，所述方法如作为推注(bolus)的静脉内施用或在一定时间阶段内通过持续输注施用，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑液内、鞘内、口服、局部或吸入途径进行施用。如果大量副作用或毒性与具体的拮抗作用相关，则局部施用可能是特别需要的。还可以将先体外后体内(ex vivo)策略用于治疗应用。先体外后体内策略包括用编码抗体或抗体片段的多核苷酸转染或转导获自受试者的细胞。接着，使转染或转导的细胞返回到受试者中。所述细胞可以是下述宽范围类型细胞的任一种，包括，但不限于：造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌肉细胞。

在一个实例中，当所述疾病或肿瘤定位允许，将治疗化合物局部施用，例如通过直接注射施用，并且可以将注射周期性重复。还可以在外科手术切除肿瘤后，将拮抗剂全身性递送给受试者或直接递送到肿瘤细胞，例如递送到肿瘤或肿瘤床中，从而预防或减少局部复发或转移。

为了预防或治疗疾病，本发明的拮抗剂的适合剂量(当单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂组合)将取决于待治疗的疾病类型，抗体的类型，疾病的严重性和进程，而不管抗体是用于预防还是治疗目的、以前的疗法、患者的临床病史和对抗体的响应，以及主治医师的判断。将抗体以一次或以一系列治疗适当地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg到20mg/kg(例如0.1mg/kg-15mg/kg)的抗体可以是施用于患者的起始候选剂量，而不管例如是通过一次或多次单独施用还是通过持续输注进行施用。一种典型的每日剂量范围可以在约1μg/kg到100mg/kg或更多，这取决于上述因素。对于在数日或更长时间内的重复施用，取决于病况，治疗通常将持续直到对疾病症状需要的抑制发生。抗体的一个示例性剂量是在约0.05mg/kg到约20mg/kg的范围内。因此，可以将约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg，10mg/kg，15mg/kg，或20mg/kg的一个或多个剂量(或其任何组合)施用于患者。可以将所述剂量间歇性地施用，例如每周、每两周、或每三周(例如，从而使所述患者接受约2到约20，或例如约6个剂量的抗体)施用。可以开始施用更高的负载剂量，随后施用一剂或多剂更低的剂量。示例性的给药方案包括施用约4mg/kg的起始负载剂量，随后每周一次施用约2mg/kg抗体的维持剂量。然而，其它剂量方案可以是有用的。该疗法的进程容易通过常规技术和测定法进行监测。

组合疗法

本发明的拮抗剂可以与具有抗癌性质的第二化合物组合在药物组合制剂中，或作为组合疗法组合在给药方案中。药物组合制剂或给药方案的第二化合物可以对组合中的抗体具有补充活性从而使它们不会对彼此存在不利的影响。

所述第二化合物可以是抗体、化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、和/或保心药。所述分子以对于意欲的目的是有效的量适当地组合存在。包含本发明化合物的药物组合物也可以含有治疗有效量的化疗剂如微管蛋白-形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂或DNA结合物。

其它的治疗方案可以与根据本发明鉴定的拮抗剂的施用组合。所述组合疗法可以作为同时或顺序方案进行施用。当顺序施用时，组合可以以两次或更多次施用进行施用。所述组合的施用包括使用单独的制剂或单一药物制剂的共同施用，和以任意顺序的连续施用，其中存在两种(或全部)活性剂同时发挥它们的生物学活性时的时期。

如上讨论，本发明的某些实施方案提供CD117拮抗剂和CD133拮抗剂、CD44拮抗剂或Sca-1拮抗剂的组合。另外的实施方案提供CD117拮抗剂和超过一种CD133拮抗剂、CD44拮抗剂和/或Sca-1拮抗剂的组合。

组合疗法的另外实例包括与化疗剂的组合，所述化疗剂如厄洛替尼(erlotinib)(TARCEVA

Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(bortezomib)(VELCADE

Millenium Pharm.)、氟维斯群(fulvestrant)(FASLODEX

AstraZeneca)、sutent(SU11248，Pfizer)、来曲唑(letrozole)(FEMARA

Novartis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、奥沙利铂(oxaliplatin)(Eloxatin

Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil))、亚叶酸(leucovorin)、雷帕霉素(Rapamycin)(西罗莫司(Sirolimus)、RAPAMUNE

Wyeth)、拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB

GSK572016，GlaxoSmithKline)、氯那法尼(lonafarnib)(SCH 66336)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006，Bayer Labs.)和吉非替尼(gefitinib)(IRESSAAstraZeneca)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)，烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替哌(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙烯硫代磷酸胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；聚乙酸类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorarmbucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素类，加利车霉素(calicheamicin)，加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)，包括烯二炔蒽环类抗生素A(dynemicin A)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN

多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉代多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；aldophosphamide glycoside；5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

多糖复合物(JHS天然产物，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺(2，2’，2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；紫杉烷类化合物(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOLBristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、无克列莫佛(Cremophor)的ABRAXANE^TM、紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)、和TAXOTERE

多西他塞(doxetaxel)(-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR

吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE

长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromehtylornithine)(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；和上述任一种的药用盐，酸或衍生物。

所述组合疗法还包括：(i)抗激素剂，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用如抗-***和选择性***受体调节剂(SERMs)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX

他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON·托瑞米芬(toremifene)；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的***产生，如例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN

益西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR

伏氯唑(vorozole)、FEMARA

来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX

阿那曲唑(anastrozole)；(iii)抗-雄激素如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)芳香酶抑制剂；(v)蛋白激酶抑制剂；(vi)脂质激酶抑制剂；(vii)反义寡核苷酸，特别是抑制在涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些，如例如PKC-α，Ralf和H-Ras；(viii)核酶如VEGF表达抑制剂(例如，ANGIOZYME

核酶)和HER2表达抑制剂；(ix)疫苗如基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN

疫苗，LEUVECTIN

疫苗，和VAXID

疫苗；PROLEUKIN

 rIL-2；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIX

 rmRH；(x)抗生血管药剂如贝伐珠单抗(AVASTIN

Genentech)；和(xi)上述任一种的药用盐、酸或衍生物。

关于所述化疗剂的制备和给药时间表可以根据生产商的说明书使用或由技术人员根据经验确定。关于所述化疗法的制备和给药时间表也在Chemotherapy Service，(1992)Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，Md中进行描述。

组合疗法可以提供“协同性”并证实“协同作用”，即一起使用活性成分时获得的作用大于由单独使用化合物获得的作用的总和。当活性成分(1)共同配制和施用或在组合的单位剂量制剂中同时递送；(2)交替地或平行地作为单独的制剂递送；或(3)通过一些其他方案时，获得协同作用。当在交替疗法中递送时，当顺序施用或递送所述化合物(例如通过在单独的注射器中不同的注射)时，获得协同作用。一般地，在交替疗法过程中，每种活性成分的有效剂量顺序地，即连续地进行施用，而在组合疗法中，将两种以上的活性成分的有效剂量一起施用。

制品和试剂盒

本发明的另一个实施方案是包含用于治疗癌症的物质的制品。所述制品包含容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶子、玻璃小瓶、注射器等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有对于所述病症的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的取用口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉溶液袋或玻璃小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的多特异性抗体或抗体片段抗体。标签或包装说明书标明该组合物用于治疗特定的病症。标签或包装说明书还包括向患者施用该组合物的说明书。也考虑了包含本文描述的联合疗法的制品和试剂盒。

包装说明书是指常规地在治疗产品的商业化包装中包含的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。在一个实施方案中，包装说明书标明该组合物用于治疗***癌。在另一个实施方案中，包装说明书标明该组合物用于治疗如本文所述包含PSC或PCSC的***癌。

另外，制品还可以包括第二容器，其中装有药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立场出发的其它需要的材料，包括其它的缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器。

标签或包装说明书可以提供所述组合物的描述以及关于意欲的体外或诊断应用的说明书。

认为前文的书面描述足以使本领域技术人员实施本发明。提供下述实施例仅为了说明用途，且无意以任何方式限制本发明的范围。事实上，根据前文描述，对本文显示和描述的那些以外的对本发明的多种修改对本领域技术人员来说是明显的并落入所附权利要求的范围。

除非另有说明，实施例中提及的商业上可获得的试剂根据生产商的说明书使用。在以下实施例中及在整个说明书中以ATCC登记号鉴定的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type CuIture Collection，Manassas，VA)。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准程序，如上文描述的和下述教科书中的那些：Sambrook等人，见上文；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)(Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，1989)；Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR实验方案：方法和 应用指南)(Academic Press(学术出版社)，Inc.：N.Y.，1990)；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)：冷泉港，1988)；Gait，Oligonucleotide Synthesis(寡核 苷酸合成)(IRL Press：Oxford，1984)；Freshney，Animal Cell Culture(动物细 胞培养)，1987；Coligan等人，Current Protocols in Immunology(现代免疫学 学实验方案)，1991。

实施例

实施例1-方法

动物

怀孕的SD大鼠和C57BL/6雄性小鼠(出生后4天和8-10周龄)购自Charles River实验室，无胸腺nu/nu雄性小鼠(6-8周龄)购自Harlan Sprague Dawley，并且WBB6F1/J雄性小鼠(野生型或W/W^v；4-8周龄)购自The Jackson实验室。W等位基因编码CD117基因，其中跨膜结构域和激酶结构域的氨基端缺失，而W^v等位基因编码具有单点突变的CD117基因。

抗体

抗体购自下列来源-BD Biosciences：APC-缀合的CD117(抗-小鼠：克隆2B8；抗-人：克隆YB5.B8)，PE-Cy7-缀合的Sca-1(克隆D7)，Ki67(克隆B56)，E-钙黏着蛋白(克隆36)，活性胱天蛋白酶3(多克隆557035)；eBioscience：PE-缀合的CD133(抗-小鼠：克隆13A4)，APC-Alexa Fluor

750-缀合的CD44(抗-小鼠/人：克隆IM7)，功能封闭的CD117(克隆ACK2)；Miltenyi Biotec：PE-缀合的CD133(抗-人：克隆AC133)；Abcam：CK18(克隆C-04)，H-2k^b(克隆ER-HR52)，CD117(多克隆ab956)；Chemicon：小鼠特异性β1整联蛋白(克隆MB1.2)，突触小泡蛋白(克隆SY38)；R&D***：CD117(克隆180627)；Covance：CK14(多克隆AF64)；AbD Serotec：CD31(克隆2H8)；Sigma：α-SMA(克隆1A4)；Santa Cruz Biotechnology：probasin(多克隆M-18)，p63(克隆4A4)；Invitrogen：突触小泡蛋白(多克隆Z66)，缀合于Alexa Fluor 488或594的二级抗体.Nkx3.1多克隆抗体由C.Abate-Shen(UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School，New Jersey)惠赠。

UGM基质细胞制备.

已经在前面描述了尿殖窦间充质(UGM)分离方法¹⁸。简言之，将来自怀孕SD大鼠的E18胚胎处死，并且收集尿殖窦。在从尿殖窦上皮分离UGM后，用在补充了10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100U ml^-1青霉素和100mg ml^-1链霉素的DMEM中的1mg ml^-1胶原酶/分散酶(Roche)在37℃将UGM消化60分钟，在***培养基(补充了10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，10μg mL^-1胰岛素，5.5μg mL^-1转铁蛋白，6.7ng mL^-1硒，1nM睾酮(Innovative Research of America(美国创新研究))，100U ml^-1青霉素，和100mg ml^-1链霉素的DMEM)中洗涤2次，并在相同的培养基中，在包被了10μg ml^-1的I型胶原蛋白的24孔板中培养。将UGM细胞通过胰蛋白酶消化在汇合状态下传代，并在体外培养多达1周。

***细胞制备.

将新鲜切下的人***样本(良性***过度增生(BPH)和良性非-BPH样本，通过病理学家的肉眼区分；湿重在1-3g之间)获自Bio-options Inc.和The University of California，San Francisco，根据联邦和州政府指导来自知情的患者。将人和小鼠的***切碎，置于补充了10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100U ml^-1青霉素和100mg ml^-1链霉素的DMEM中，用1mg ml^-1胶原酶/分散酶在37℃消化90分钟，伴随搅拌，并通过70μm滤器。

体内系列分离/移植.

对于CD117⁺细胞的次级移植，将原代移植物进行磁力分选(每个原代移植物获得～49,000个离解的细胞，其中CD117⁺细胞构成19％的磁力分选的细胞)，并将分选的细胞(每个移植物10,000个细胞)与UGM基质细胞(每个移植物250,000个细胞)混合。对于CD117⁺细胞的三级移植，将次级移植物进行磁力分选(每个次级移植物获得～40,000个离解的细胞，其中CD117⁺细胞构成11％磁力分选的细胞)，并将分选的细胞(2,200个细胞/移植物)与UGM基质细胞(250,000个细胞/移植物)混合。关于Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺细胞的次级移植，通过FACS分选原代移植物(每个次级移植物获得～31,000个离解的细胞，其中Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺细胞构成0.02％的有活力的FACS-分选的细胞)。将分选的细胞(15个细胞/移植物)与UGM基质细胞(250,000细胞/移植物)混合。所有的系列移植移植物在植入后12周收集。在具有Coolpix

 4300数码照相机(Nikon)的SMZ 800解剖显微镜(Nikon)上获得肉眼(gross)移植物图像。

RNA分离和Q-RT-PCR.

收集来自8-10周龄C57BL/6小鼠的***并拨开以延伸细管。为了比较***区，将每个***叶分为远侧/中间/近侧区域。为了比较***叶，将每个***分为背叶/侧叶/腹叶/前叶。使用RNeasy

 Mini试剂盒(Qiagen)分离总的RNA并用Power SYBR

 Green(Applied Biosystems(应用生物***))使用下列引物组进行Q-RT-PCR：

Sca-1，5′-ATGGACACTTCTCACACTACAAAG-3′(SEQ ID NO：1)和5′-TCAGAGCAAGGTCTGCAGGAGGACTG-3′(SEQ ID NO：2)；CD44，5′-AATTCCGAGGATTCATCCCA-3′(SEQ ID NO：3)and 5′-CGCTGCTGACATCGTCATC-3(SEQ ID NO：4)；CD49b，5′-CCGGCATACGAAAGAATTGG-3′(SEQ ID NO：5)and 5′-GAAGAGCTGAGGGTTATGT-3′(SEQ ID NO：6)；CD49f，5′-GTGGCCCAAGGAGATTAGC-3′(SEQ ID NO：7)and 5′-GTTGACGCTGCAGTTGAGA-3′(SEQ ID NO：8)；CD 133，5′-ACCAACACCAAGAACAAGGC-3′(SEQ ID NO：9)and 5′-GGAGCTGACTTGAATTGAGG-3(SEQ ID NO：10)；Bcl2，5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3′(SEQ ID NO：11)and 5′-AGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3′(SEQ ID NO：12)；TERT，5′-ATGGCGTTCCTGAGTATG-3′(SEQ ID NO：13)and 5′-TTCAACCGCAAGACCGACAG-3′(SEQ ID NO：14)；p63，5′-TTGTACCTGGAAAACAATG-3′(SEQ ID NO：15)and 5′-TCGAAGCTGTGTGGGCCCGGG-3(SEQ ID NO：16)；CK14，5′-GACTTCCGGACCAAGTTTGA-3′(SEQ ID NO：17)and 5′-CTTGAGGCTCTCAATCTGC-3′(SEQ ID NO：18)；CK18，5′-ACTCCGCAAGGTGGTAGATG-3′(SEQ ID NO：19)and 5′-GCCTCGATTTCTGTCTCCAG-3′(SEQ ID NO：20)；CD24，5′-TAAAGGACGCGTGAAAGGTTTGA-3′(SEQ ID NO：21)and 5′-GACAAAATGGGTCTCCATTCCGCAC-3′(SEQ ID NO：22)；CD34，5′-ATGCAGGTCCACAGGGACACG-3′(SEQ ID NO：23)and 5′-CTGTCCTGATAGATCAAGTAG-3′(SEQ ID NO：24)；CD117，5′-GACGCAACTTCCTTATGATC-3′(SEQ ID NO：25)and 5′-TGGTTTGAGCATCTTCACGG-3′(SEQ ID NO：26)；Slug，5′-TTTCTCCAGACCCTGGCTGCT-3′(SEQ ID NO：27)and 5′-TTTTCCCCAGTGTGAGTTCTA-3′(SEQ ID NO：28)；GAPDH，5′-ACTGGCATGGCCTTCCG-3′(SEQ ID NO：29)and 5′-CAGGCGGCACGTCAGATC-3′(SEQ ID NO：30)。使用ΔCt方法将基因表达标准化为GAPDH。

流式细胞术

将***细胞(非谱系消减的)用0.1％Triton

 X-100进行透化处理，用一级抗体(CK14，CK18，APC-缀合的CD117)和二级抗体(Alexa Fluor

 488或594)染色，并在LSR-II流式细胞仪(Becton Dickinson)上分析。

体外集落形成

将来自8-10周龄的C57BL/6小鼠的***细胞磁力分选为CD117^+/-级分，以8,000细胞/100μl 3mg ml^-1的I型胶原蛋白重新悬浮在DMEM中，将其在37℃置于平底96孔板中1小时，并覆盖补充了15ng ml^-1的表皮生长因子(Roche)的***培养基。将培养基每48小时更换，并在7天后评估集落形成。

先体外后体内的***培养物

收集新生后4天的C57BL/6小鼠***，并将其置于8μm孔径的细胞培养***物(insert)(BD Falcon)上，并将***物置于包含300μl补充了0.5％葡萄糖，2mM谷氨酰胺，10μg mL^-1胰岛素，5.5μg mL^-1转铁蛋白，6.7ng mL^-1硒，100U ml^-1青霉素，100mg ml^-1链霉素，和25ng ml^-1两性霉素B(fungizone)的DMEM/F-12的24孔板中。还使用补充了功能-封闭的抗-CD117抗体(25μg ml^-1)的培养基。更换培养基，并每48小时获得图像，在10天后收集***。在具有Retiga Exi数字照相机(QImaging)的MZ16FA解剖显微镜(Leica)上获得图像。使用MetaMorph

软件(Molecular Devices(分子装置))对***区域的净生长进行量化。对8天***的肉眼图像进行分支点量化。

***和雄激素替代

关于微阵列和Q-RT-PCR分析：使用8-10周龄的C57BL/6小鼠。在第0天，对小鼠进行***。在***后3和14天，收集来自子集(subset)或小鼠的***。在***后第14天，植入睾酮丸剂(15mg/丸剂/小鼠)。在第17天(激素替代后3天)，收集***。使用RNeasy

 Mini试剂盒分离总的RNA，并将MOE430v2 Affymetrix

芯片用于微阵列分析。为了在体内***再生过程中评估CD117功能：使用8周龄的C57BL/6小鼠。在第0天，***小鼠。在***后第12天，将抗-豚草对照抗体(在PBS中的10mg kg^-1)或功能封闭的抗-CD117抗体(10mg kg^-1在PBS中)通过i.p.注射施用。在***后第14天，植入睾酮丸剂(15mg/丸剂/小鼠)。在第15天(激素替代后1天)，施用抗体治疗。在第19天(激素替代后5天)，收集***，对其进行称重，处理用于组织学分析。将***重量表示为在******后14天与对照相比的净增加。

免疫组化.

将OCT冷冻的组织切成8μm的切片，固定在4％低聚甲醛(关于CK14，CK18，CD117，突触小泡蛋白，probasin，β1整联蛋白，H-2k^b，CD31，SMA)或甲醇∶丙酮(1∶1 vol/vol；关于E-钙黏着蛋白，激活的胱天蛋白酶3，Ki67，Nkx3.1)中，并用一级抗体温育45分钟，用次级抗体温育30分钟。将人***样本固定在***中，切成6μm的切片，并用BD RetrievagenA(BD Biosciences)进行抗原回收。关于特异性对照，使用物种-匹配的一级抗体。在具有ORCA-ER数字照相机(Hamamatsu)的Axioplan^TM 2成像显微镜(Zeiss)上获得图像。关于先体外后体内的***，通过分别评估至少600，400，和1,200个细胞来量化关于CK14/CK18，Ki67，和E-钙黏着蛋白是阳性的细胞的百分比。关于在体内再生的***，通过分别评估至少800和2,500个细胞来量化关于CK14/CK18和Ki67是阳性的细胞的百分比。

激光捕获显微切割和基于PCR的基因分型

将单细胞来源的移植物切成8μm的切片，置于金属构架膜(metal frame membrane)载玻片(Molecular Machines & Industries)上，并用小鼠-特异性β1整联蛋白和CD31染色。在移植物中，用Nikon E2000 CellCut激光捕获显微解剖刀(laser capture microdissector)(Molecular Machines & Industries)分离β1整联蛋白⁺/CD31^-细胞。关于Foxn1^+/+细胞对照，分离在移植物内的大鼠基质细胞(β1整联蛋白^-/CD31^-)。关于Foxn1^+/-细胞对照，分离邻近移植物的无胸腺nu/nu肾细胞(β1整联蛋白⁺)。将捕获的细胞用PicoPure^TM DNA提取试剂盒(Molecular Devices)裂解，并进行基于PCR的基因分型(http://jaxmice.jax.org/pub-cgi/protocols/protocols.sh)。用关于Foxn1的引物(5′-GGCCCAGCAGGCAGCCCAAG-3′(SEQ ID NO：31)和5′-AGGGATCTCCTCAAAGGCTTC-3′(SEQ ID NO：32)通过PCR扩增基因组DNA，并将其用BsaJI消化，在4％琼脂糖凝胶上运行。未消化的PCR产物是168bp；消化的Foxn1^+/+PCR产物提供了90bp，58bp，和20bp片段；消化的Foxn1^+/-PCR产物提供了110bp，90bp，58bp，和20bp片段。缺失110bp产物指示基因组DNA来自Foxn1^+/+(野生型)细胞。PCR对照反应包括水(阴性对照)和野生型小鼠基因组DNA(阳性对照)。

共焦和单细胞显微镜检查

扫描共焦图像并且用LSM 510 META共焦显微镜(Zeiss)获得所述共焦图像。在具有Cascade Photometrics数字照相机(Roper Scientific)的Eclipse TE300倒置显微镜(Nikon)上获得单细胞图像。

有限稀释分析

使用在′statmod′软件包中的′limdil′功能进行有限稀释分析(http://bioinf.wehi.edu.au/software/limdil/index.html)。使用95％的置信区间。

统计学分析

通过双尾斯氏t检验评估组之间的差异。将少于0.05的P值认为是显著的。

体内***产生

在以前描述了***产生测定法^17，18。关于CD117⁺细胞的原代移植，将来自8-10周龄的C57BL/6小鼠的***离解，并且用抗-小鼠CD117微珠(Miltenyi Biotec)磁力分选为CD117^+/-级分(每个***获得～500,000个离解的细胞，其中CD117⁺细胞构成7％的磁力分选的细胞，其中17.5±2.4％(n＝10)是有活力的，如通过流式细胞术所确定的)。将分选的细胞(100,000细胞/移植物)与在3mg ml^-1 I型胶原蛋白(20μl/移植物)UGM基质细胞(250,000细胞/移植物)混合，在3℃温育1小时从而使胶原蛋白胶凝，并用***培养基覆盖。在3℃过夜温育后，将胶原蛋白凝胶以及皮下90天的缓慢释放睾酮的丸剂(12.5mg/丸剂/小鼠；Innovative Research of America(美国创新研究))移植在6-8周龄的无胸腺nu/nu小鼠的肾被膜下。在植入后8周收集移植物。对于Lin-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺细胞的原代移植，通过FACS分选***，并将分选的细胞(1,300细胞/移植物)与UGM基质细胞(250,000细胞/移植物)混合。将移植物在植入后12周收集。

单细胞FACS和体内***产生

将方法的详情描述在实施例8中。将来自8-10周龄的C57BL/6小鼠的***进行解离，并使用小鼠谱系细胞消减试剂盒(Mouse Lineage Cell Depletion Kit)(Miltenyi Biotec)以及生物素缀合的抗小鼠CD-31单克隆抗体(BD Biosciences；克隆390)进行谱系消减。用FACSAria流式细胞仪(Becton Dickinson)进行FACS。用单色阳性对照进行补偿调节。将单细胞分选到包含20ml的3mg ml21的I型胶原蛋白的Microtest U底96孔板(BD Falcon)中。检查来自单细胞FACS的共127个单独的细胞，其中证实106个孔包含来自6个独立实验的有活力的单细胞。

实施例2-鉴定***干细胞标记

小鼠的***是由四对叶(背叶/侧叶/腹叶/前叶)组成的分支导管网络(branched ductal network)，其中每个叶相对于尿道被分为三个区(远侧/中间/近侧；图1)¹¹。将野生型***解剖为远侧/中间/近侧区域并且进行定量逆转录酶聚合酶链式反应(Q-RT-PCR)以鉴定干细胞标记^12-14。四种细胞表面标记(Sca-1，CD44，CD49b，和CD133)，所有已知的PSCs标记^2-6，8，以及三种细胞内干细胞标记(Bcl2，端粒末端转移酶逆转录酶(TERT)，和p63)在近侧区域显示优先的表达(图2和图3a/3b)，由此证实该测定***的有效性。CD44，CD49b，CD133，Bcl2，TERT，和p63都是***基底标记(basal marker)的事实^{3-5，8，15，16}提示基底标记，相对于腺腔标记(luminal markers)可以以更高的水平在近侧区域中表达。与此相一致，基底标记细胞角蛋白14(CK14)在近侧区域中显示优先表达，而关于腺腔标记CK18则观察到相反的模式。这些数据支持PSCs可以组成基底细胞的亚群，如以前所提议的^8，9。

评估了在以前没有报道用于鉴定正常PSCs的干细胞表面标记(CD24，CD34，和CD117)的表达水平。CD34和CD117，而不是CD24主要在近侧区域中表达。因为与CD34比较，CD117显示了在近侧和远侧区域之间更大的差异表达，CD117作为潜在的PSC标记而受到关注。免疫染色证实具有主要的近侧表达模式的基底CD117⁺CK14⁺群。然而，还在近侧区域中观察到CD117⁺CK14^-群，随后进行分析鉴定腺腔CD117⁺CK18⁺群。用关于CK14，CK18，和CD117的三重标记进行流式细胞术。尽管CD117⁺细胞在基底区室中富集，这些发现表明CD117⁺细胞并不是专门定位于基底或腺腔区室的。而且，CD117表达没有局限于特定的***叶。相反，CD117以及CD44，CD49b和CD133在所有的4对叶中进行表达，在***背叶中检测到主要的表达(图3a和3b)。因此，CD117显示类似于已知PSC标记的表达图谱。

尽管正常的PSCs是不依赖雄激素的，并且在***过程后存活，它们仍旧保持雄激素-响应性并且在激素替代后实现***的再生¹。如果正常的PSCs表达CD117，预期CD117表达在***后增加(由于干细胞富集)并且在激素替代后减少(由于分化细胞扩增)。事实上，CD117，CK14和CD44，而不是CD24显示这种模式(图4)。这些发现还表明CD117显示与正常PSC标记相容的表达图谱。

实施例3-关于PSCs富集CD117⁺群

为了提供关于PSCs富集CD117⁺群的功能性证据，通过磁珠分选制备来自解离的成熟C57BL/6***的CD117^+/-级分，并且通过Q-RT-PCR证实富集(图5)。在体外进行标准的***集落形成测定法¹³。CD117⁺细胞，而不是CD117^-细胞产生许多包含腺腔的集落。尽管这种体外测定法提示CD117⁺群包含PSCs，CD117⁺细胞在体内产生***的能力是必要的干细胞表型评估。使用体内***产生***^17，18，将来自C57BL/6小鼠供体的CD117^+/-级分与大鼠胚胎尿殖窦间充质(UGM)基质细胞组合并且植入在无胸腺nu/nu小鼠宿主的肾被膜下。尽管CD117^-细胞在肾被膜下仍旧是有活力的，CD117^-移植物是小的，不透明的，并且它们仅在不能产生***上与UGM细胞的移植物类似(***产生频率，n＝1/10)。与此相反，CD117⁺移植物是大的、血管化的，并且是半透明的(***产生频率，n＝10/12)。CD117⁺移植物的组织学检查揭示关于由基底(CK14)和腺腔(CK18)细胞谱系组成的上皮小管的分支形态学。在相同的植入物内和穿过多种植入物的一些***导管和腺泡中观察到在野生型小鼠***的基底区室中¹⁹被鉴定为孤立突触小泡蛋白⁺细胞的稀有神经内分泌细胞。CD117⁺移植物也表达***-特异性蛋白probasin²⁰和Nkx3.1²¹，指示功能性***产生。使用小鼠β1整联蛋白-特异性抗体，证实CD117⁺移植物是小鼠起源的，并且不是由于污染来自UGM基质细胞制备物的大鼠上皮细胞造成的。而且，使用特异性识别供体(C57BL/6)而不是宿主(无胸腺nu/nu)小鼠细胞的I类MHC单倍型H-2k^b抗体，证实产生的***来自移植的CD117⁺供体细胞。这些发现证实，关于具有功能性***产生能力的正常的PSCs富集CD117⁺群。

实施例4-CD117⁺ PSCs具有自我更新的能力

干细胞的定义的特征是自我更新的能力²²。为了评估CD117⁺细胞的自我更新能力并且确定减少数量的CD117⁺细胞是否仍旧保持***产生能力，用连续减少数量的CD117⁺细胞进行系列移植(图6)。CD117⁺细胞，而不是CD117^-细胞的二级和三级移植产生的功能性***包含来自供体C57BL/6小鼠细胞的多种细胞类型。这些发现提供CD117⁺群包含具有自我更新能力的正常PSCs的直接证据。

实施例5-CD117⁺信号传导对于正常的***发育和对于***再生是重要的

确定功能性CD117信号传导对于正常***发育的重要性。小鼠的***(prostrate)发育以在怀孕的17.5天从尿殖窦芽殖的上皮细胞开始，伴随延伸的导管向外生长以及在出生后发育的前三周中出现的分支¹¹。关于显性-白斑基因座纯合(W/W)的小鼠缺乏CD117信号传导并且是围产期致死的²³，由此排除了对正常***发育的评估。分析了显示部分受损的CD117信号传导并因此具有活力的杂合W/W^v小鼠²³。尽管在4周龄具有相同的体积大小，突变的***显示在成体具有类似减少的减少的大小。检查了突变体***细胞的增殖、分化和存活状态，这是因为CD117信号传导调节在不同的干细胞类型中的这些过程²⁴。突变体***显示被抑制的增殖，尽管与野生型比较，基底/腺腔分化、细胞存活和血管/平滑肌细胞募集没有改变。类似地，在出生后第4天收集的和在存在功能性封闭抗-CD117抗体(ACK2)时先体外后体内培养的野生型C57BL/6***显示被抑制的生长和减少的分支(图7a和7b)。通过评估转录因子Slug(图8a-c)，一种CD117途径的下游靶标的表达²⁵证实了CD117信号传导的ACK2抑制。明显地，被处理的***显示减弱的增殖和增加的基底与腺腔细胞比率，而对细胞存活没有影响。

为了进一步评估CD117在体内PSC功能中的可能作用，在体内抑制剂量²⁶将ACK2施用于被***的成年C57BL/6小鼠并且在激素替代后评估***再生。与先体外后体内处理的***类似，减弱的体内CD117功能抑制***再生，这与被抑制的增殖和增加的基底-腺腔细胞比率一致，而对细胞存活或血管/平滑肌细胞募集没有作用。这些发现表明用拮抗剂封闭剂对CD117信号传导的损害，与在W/W^v小鼠中观察到的CD117信号传导的部分受损相反，可以抑制***腺腔细胞分化，并且加强CD117信号传导在正常***发育中的可能作用。考虑到CD117信号传导对于骨髓-衍生细胞的功能(包括造血干细胞和内皮先祖细胞的运动性²⁷)是重要的，以及血管***及其支持基质可能在建立PSC小生境中具有重要作用¹⁴，可能消除的CD117功能可以对非上皮细胞在***中的募集/维持具有不利影响，这又可能损害***的发育。

实施例6-干细胞标记频率

为了比较CD117⁺细胞在***中的百分比与在其它PSC群体中的百分比，获得谱系消减(Lin^-)群体，并进行流式细胞术。尽管CD117⁺细胞在有活力的细胞群中显示最低的频率(约1％)，Sca-1⁺和CD133⁺细胞在有活力的细胞群中以高得多的频率进行检测(图9)。这与其它研究是一致的，其报道了Sca-1和CD133在干细胞和非干细胞类型(包括基质和分化的上皮细胞)中的表达^6，28。这些更高的频率显示Sca-1和CD133可能标记高度异质的***细胞亚群。考虑到单染细胞群的异质性，预期每种单独使用的标记不会产生完全由干细胞组成的亚群。因此，将组合的多种标记用于进一步精选PSC表型。确定Lin-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺细胞占在小鼠***中有活力细胞群的0.12％(图9)

实施例7-具有表型Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺的PSCs能够生产产生分泌物的***

进行荧光激活细胞分选术(FACS)来获得表达多种表面标记组合的细胞群(图10)，随后进行肾被膜植入。在该实验中，通过磁珠分选解离的***细胞以获得Lin-细胞，其随后通过FACS进行分选。Lin-碘化丙锭-(Lin-，有活力的)群体关于Sca-1表达门控以获得Lin-Sca-1+和Lin-Sca-1-群体。Lin-Sca-1-群体关于CD133-，CD44-，和CD117-级分的连续门控产生Lin-Sca-1-CD133-CD44-CD117-细胞。Lin-Sca-1+群体关于CD133+和CD44+级分的连续门控产生Lin-Sca-1+CD133+CD44+群体，其又关于CD117表达门控，以获得Lin-Sca-1+CD133+CD44+CD117+细胞和Lin-Sca-1+CD133+CD44+CD117-细胞。

在移植后三个月的移植物重量量化表明仅Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺群体能够产生***(图11和12)。关于各种分选的细胞群的***产生频率如下：Lin^-Sca-1^-CD133^-CD44^-CD117^-，n＝0/8；Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺，n＝6/9；Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117^-，n＝0/6。

进行了组织学检查(如在上述实施例3中所述)，表明再生的***由基底(CK14)和腺腔(CK18)细胞谱系组成，并且所述***表达***特异性蛋白probasin²⁰和Nkx3.1²¹，表明功能性***产生。使用小鼠β1整联蛋白-特异性抗体证实所述***是小鼠起源的，并不是由于污染了来自UGM基质细胞制备物的大鼠上皮细胞造成的，并且使用特异性识别供体(C57BL/6)而不是宿主(无胸腺nu/nu)小鼠细胞的I类MHC单倍型H-2k^b抗体证实产生的***来自移植的CD117⁺供体细胞。

系列移植产生类似的结果，其中关于各种分选的细胞群的***产生频率如下：Lin^-Sca-1^-CD133^-CD44^-CD117^-，n＝0/3；Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺，n＝1/3；Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117^-，n＝0/3，证实Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺群体包含具有自我更新能力的正常PSCs。

实施例8-从单Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺细胞产生***

为了确实证实***产生可以从单Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺细胞实现，通过FACS将有活力的单细胞分选到各个孔中。对每个孔成像以证实单细胞的存在，并将单供体C57BL/6小鼠细胞与大鼠UGM基质细胞组合移植到宿主无胸腺nu/nu小鼠的肾被膜下(图13)。更具体地，收集成熟的C57BL/6***，将其解离为单细胞，通过磁珠分选进行谱系消减以获得Lin-群体，并且用碘化丙锭和针对细胞表面标记Sca-1，CD133，CD44，和CD117的抗体染色。通过FACS，将有活力(碘化丙锭-)的单Lin-Sca-1+CD133+CD44+CD117+细胞分选到包含4℃的胶原蛋白溶液的96孔板的各个孔中。接着，将板在37℃温度调节的室中进行显微镜检查从而证实每个孔的单细胞的存在，并且捕获在每个孔中的每个单细胞的数字图像。在胶原蛋白胶凝作用后，将大鼠UGM基质细胞加入每个孔(250,000细胞/孔)并将板在37℃温育过夜，导致胶原蛋白凝胶收缩。接着，将凝胶伴随皮下缓慢释放睾酮丸剂移植在宿主无胸腺nu/nu小鼠的肾被膜下。移植后三个月，收集单细胞植入物并进行组织学检查。

明显地，14个***产生自97个单细胞移植物。组织学分析证实尽管单独的UGM细胞的移植物不能产生***，14个成功的单细胞移植的移植物显示明显的***发育。上皮小管的存在包含多种细胞谱系并证实了probasin和Nkx3.1的表达。重要的是，单细胞来源的***表达小鼠-特异性的β1整联蛋白和C57BL/6-供体特异性的H-2k^b。还通过激光捕获显微切割的细胞的基于PCR的基因分型证实产生的***来自单移植的供体细胞(图14a)。单细胞来源的***显示由基质细胞和***的厚层围绕的相互连接的分支腺功能形态学。通过有限稀释分析，将PSCs在Lin^-Sca-1⁺CD133⁺CD44⁺CD117⁺群体中的频率确定为1/10(图14b)。

实施例9-人PSC

为了确定CD117是否也标记人***中的潜在的PSC群，进行人良性***过度增生(BPH；n＝5)和良性非-BPH(n＝4)***样本的流式细胞计数分析。在良性非-BPH和BPH样本中在有活力的细胞群中观察到低频的CD117⁺细胞(分别地约0.2％和0.4％；图15a和15b)。Sca-1人的直向同源物已经被确定性地鉴定，但是通过组合CD117和标记CD133和CD44，将在良性非-BPH和BPH样本中CD133⁺CD44⁺CD117⁺细胞的有活力细胞的频率分别确定为0.004％和0.01％(图15a和15b)。通过在共表达基底细胞标记p63的***上皮细胞中进行免疫染色，在良性非-BPH和BPH样本中检测CD117⁺细胞。用于组织学分析的良性非-BPH和BPH样本是取自相同患者的配对样本。这些发现表明，除了在小鼠***中标记PSC群体之外，预期CD117表达标记在人***中的潜在PSC群体。

将在本说明书中引用或提及的所有的专利、专利申请、专利申请公开物，和其它公开物通过参考结合在本文，结合的程度如同将每个独立专利、专利申请、专利申请公开物或公开物特别地和单独地指定通过参考结合在本文中的程度一样。

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Claims (33)

1.表达CD117的分离的***干细胞。

2.权利要求1的干细胞，其中所述干细胞还表达CD133和CD44。

3.权利要求1或2的干细胞，其中所述干细胞还表达Sca-1。

4.权利要求1-3中任一项的干细胞，其中所述干细胞能够在体外产生包含腺腔的***集落。

5.权利要求1-3中任一项的干细胞，其中所述干细胞能够在体内产生功能性***。

6.表达CD117的分离的***癌干细胞。

7.权利要求6的干细胞，其中所述干细胞还表达CD133和CD44。

8.权利要求6或7的干细胞，其中所述干细胞还表达Sca-1。

9.权利要求6-8中任一项的干细胞，其中所述干细胞能够在体内模型中产生***癌。

10.分离***干细胞的方法，所述方法包括下述步骤：

a.获得谱系消减的(Lin-)***细胞群。

b.分选所述Lin-细胞群以获得表达CD117，CD133和CD44的细胞群。

11.权利要求10的方法，所述方法还包括分选所述Lin-***细胞群从而获得表达Sca-1的细胞群的步骤。

12.权利要求10或11的方法，其中使用荧光激活细胞分选术(FACS)来分选所述细胞。

13.抑制表达CD117，CD133和CD44的***干细胞或***癌干细胞增殖的方法，所述方法包括使所述***干细胞或***癌干细胞与治疗有效量的CD117拮抗剂接触。

14.预防患者中***癌复发的方法，所述方法包括：

a.确定所述患者的***癌是否包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞，和

b.如果所述患者的***癌包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞，则向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂。

15.权利要求14的方法，所述方法还包括向所述患者施用有效量的CD133拮抗剂或CD44拮抗剂。

16.选择用CD117拮抗剂进行治疗的***癌患者的方法，所述方法包括：

a.确定所述患者是否具有包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞的***癌，和

b.如果所述患者具有包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞的***癌，则选择所述患者用CD117拮抗剂进行治疗。

17.治疗患者中的***癌的方法，所述方法包括

a.确定所述患者是否具有包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞的***癌，和

b.如果所述患者具有包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞的***癌，则向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂。

18.权利要求17的方法，所述方法还包括向所述患者施用有效量的CD133拮抗剂或CD44拮抗剂。

19.权利要求16，17或18的方法，其中所述患者已经具有所述***癌的复发。

20.选择***癌患者用CD117拮抗剂进行辅助治疗的方法，所述方法包括：

a.确定所述患者的***癌是否包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞，和

b.如果所述患者的***癌包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞，选择所述患者用CD117拮抗剂进行辅助治疗。

21.向治疗***癌的患者提供辅助疗法的方法，所述方法包括：

a.确定所述患者的***癌是否包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞，和

b.如果所述患者的***癌包含表达CD117，CD133和CD44的***细胞，则向所述患者施用治疗有效量的CD117拮抗剂。

22.权利要求21的方法，所述方法还包括向所述患者施用有效量的CD133拮抗剂或CD44拮抗剂。

23.权利要求13-22中任一项的方法，其中所述CD117拮抗剂是抗-CD117抗体。

24.权利要求13-22中任一项的方法，其中所述CD117拮抗剂是小分子。

25.权利要求24的方法，其中所述CD117拮抗剂是甲磺酸伊马替尼或马来酸舒尼替尼。

26.促进***组织生长或修复的方法，所述方法包括在需要***组织生长或修复的患者中植入表达CD117，CD133和CD44的***干细胞。

27.权利要求26的方法，其中所述患者具有不完全的***，并且将所述干细胞植入所述不完全的***。

28.促进***生长的方法，所述方法包括在产生功能性***的条件下，在哺乳动物宿主中植入表达CD117，CD133和CD44的***干细胞。

29.权利要求28的方法，其中将所述干细胞植入所述宿主的肾被膜下。

30.权利要求28或29的方法，其中所述宿主是猪。

31.向需要其的患者提供功能性***的方法，所述方法包括：

a.在产生功能性***的条件下，在哺乳动物宿主中植入表达CD117，CD133和CD44的人***干细胞；和

b.收集所述***。

32.权利要求31的方法，其中将所述收集的***移植到需要功能性***的人患者中。

33.筛选抑制***癌干细胞的增殖的化合物的方法，所述方法包括：

a.使表达CD117，CD133和CD44的***癌干细胞与测试化合物接触，和

b.检测所述测试化合物是否抑制所述细胞的增殖。

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