ES2667058T3 - Célula madre hepática inducida y procedimiento para su producción, y aplicaciones de la célula - Google Patents
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Abstract
Una célula madre hepática inducida obtenida mediante un procedimiento que comprende una etapa de inducir una célula de mamífero a una célula madre hepática inducida, en donde la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste en una célula derivada de un adulto, una célula derivada de neonato, una célula derivada de la piel y una célula de un individuo canceroso, en donde dicha etapa de inducción comprende introducir un gen POU5F1, un gen KLF4 y un gen SOX2 en la célula de mamífero con la ayuda de vectores de expresión para llevar la célula de mamífero a un estado tal que los productos génicos del gen POU5F1, el gen KLF4, y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida estarán presentes para asegurar que la abundancia relativa intracelular del producto del gen POU5F1 sea mayor que la del producto génico del gen SOX2, en donde la razón de uso entre el gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida es 4:2:1 en ese orden, y en donde la célula madre hepática inducida está caracterizada porque satisface al menos los siguientes requisitos (1) - (3): (1) expresa al menos 15 genes seleccionados del grupo de los genes enumerados en la siguiente Tabla 1 que son genes marcadores para una célula madre embrionaria;**Tabla** (2) tiene propiedades de un hepatocito en donde al menos genes seleccionados del grupo de genes de la Tabla 2 siguiente se expresan como genes asociados a las propiedades de un hepatocito;**Tabla** (3) puede ser sometido a un cultivo de expansión o cultivo de pases durante al menos 3 días.
Description
DESCRIPCIÓN
5 Campo técnico
La presente invención está definida por las reivindicaciones. Más detalladamente, la presente invención se refiere a una célula madre hepática inducida como se define por las reivindicaciones, una prueba que usa esta célula madre hepática inducida como se define en las reivindicaciones, y esta célula madre hepática inducida para su uso en un 10 método terapéutico de tratamiento de un mamífero como se define en las reivindicaciones. En general, en la presente memoria se describen células madre hepáticas inducidas útiles en pruebas de seguridad, pruebas de toxicidad, pruebas de metabolismo, pruebas de interacción farmacológica, pruebas de actividad antiviral, pruebas de detección para productos farmacéuticos tales como terapias hiperlipidémicas, medicamentos hipertensivos, medicamentos de compuestos de bajo peso molecular y medicamentos de anticuerpos, escrutinio de dianas en el 15 descubrimiento de fármacos, preparación de modelos animales, producción de proteínas producidas por hepatocitos y en medicina regenerativa; en particular, se describen células madre hepáticas inducidas que tienen propiedades de hepatocitos, que expresan un grupo de genes marcadores para células madre embrionarias en cantidades comparables a las células madre embrionarias, y que pueden ser sometidas a cultivo de expansión y cultivo de pases a lo largo de un período prolongado; también se describen en la presente memoria procedimientos para
20 producir tales células madre hepáticas inducidas y aplicaciones de tales células.
La investigación y el desarrollo de nuevos fármacos por parte de las compañías farmacéuticas no solo se ven
25 afectados por la prolongación del período de I + D, sino también por los crecientes costes de I + D. Además, a pesar de la cantidad de candidatos que se espera sean nuevos en el futuro, surgirán problemas en términos de eficacia y seguridad a medida que prosigan las actividades de I + D y se abandone el desarrollo de la mayoría de los candidatos.
30 El desarrollo de nuevos fármacos generalmente requiere de un largo plazo que oscila de 9 a 17 años y enormes cantidades de costes de I + D del orden de mil millones a diez mil millones, por lo que una herramienta de descubrimiento de fármacos capaz de reducir los compuestos candidatos en una etapa temprana como una etapa preclínico conduciría a un menor costo de desarrollo.
35 Sin embargo, en las pruebas no clínicas actuales, es necesario realizar pruebas en animales para evaluar la seguridad, la toxicidad y otras características del fármaco bajo prueba, y este es uno de los factores que conduce a un coste de desarrollo vertiginoso. Lo que es más, la cinética in vivo del fármaco puede diferir debido a las diferencias de especie entre seres humanos y otros animales, lo que dificulta la evaluación suficiente de la seguridad, por lo que solo en la etapa de prueba clínica se encuentra que el compuesto candidato tiene toxicidad, y
40 esto nuevamente hace que se abandone el esfuerzo de desarrollo.
Si bien existe una gran necesidad de establecer un sistema por el cual la cinética in vivo y similares de un compuesto candidato en seres humanos puedan predecirse y evaluarse en una etapa temprana de los procedimientos de investigación y desarrollo; ahora se están realizando esfuerzos para construir un sistema de
45 evaluación que utilice hepatocitos humanos para reemplazar los experimentos con animales que están limitados por la "barrera de las diferencias de especies". Al utilizar este sistema de evaluación, los compuestos candidatos para los fármacos en desarrollo pueden limitarse con precisión a fármacos candidatos altamente seguros en una etapa temprana del desarrollo, por lo que las compañías farmacéuticas tienen una demanda particularmente grande para el sistema.
50 En pruebas no clínicas convencionales que utilizan células cultivadas en seres humanos, se han empleado hepatocitos cultivados primarios o líneas celulares existentes de personas no japonesas. Sin embargo, los hepatocitos cultivados primarios tienen los problemas de una abrumadora escasez de donantes y diferencias de lotes excesivamente grandes. En particular, los hepatocitos de cultivo primario de los japoneses, que implican
55 cuestiones éticas y están regulados por la ley, son extremadamente difíciles de obtener y su suministro constante es imposible.
Además, las enzimas metabolizadoras de fármacos que se expresan en el tejido hepático desempeñan un papel importante en la catálisis del metabolismo de muchos productos farmacéuticos. Sin embargo, debido a que están
60 presentes los polimorfismos que las acompañan, y a que la cantidad de su expresión y su actividad se ven afectadas por importantes diferencias individuales, estos factores hacen que el problema mencionado anteriormente con las pruebas no clínicas sea aún más grave.
Para hacer frente a las diferencias presentes entre un gran número de individuos, es deseable que los hepatocitos cultivados primarios derivados de una pluralidad de donantes que cubren tales diferencias puedan utilizarse repetidamente como células representativas en varios tipos de pruebas. Sin embargo, los hepatocitos de cultivo primario difícilmente pueden expandirse en una placa de cultivo y esto presenta un problema debido a que es prácticamente difícil realizar un cultivo de pase del mismo hepatocito y utilizarlo repetidamente en diversas pruebas.
5 En contraste, muchas de las líneas celulares establecidas existentes son aquellas células que han experimentado anomalías cariotípicas y no hay suficientes líneas celulares para cubrir las diferencias entre una gran cantidad de individuos. Además, las líneas celulares establecidas existentes sometidas a un cultivo de pases prolongado mediante métodos convencionales no muestran la misma actividad enzimática metabolizadora del fármaco o la
10 capacidad inductora del transportador que los hepatocitos de cultivo primario, por lo que dado este resultado, es imposible predecir la seguridad, el metabolismo y otras características en seres humanos en aplicaciones clínicas.
En estas circunstancias, se desean células que tengan propiedades de hepatocitos y que puedan someterse a cultivo de pases durante un período prolongado. Sin embargo, nunca ha habido ningún informe que demuestre que
15 tales células se descubrieron a partir de una pluralidad de donantes que cubren las diferencias entre un gran número de personas.
Con respecto a las células madre para el hígado, se supone la existencia de células madre hepáticas que tienen la capacidad de diferenciarse a hepatocitos. Nuevamente, sin embargo, nunca ha habido ningún informe que
20 demuestre que se hayan descubierto células madre hepáticas que tengan una naturaleza tal que expresen genes autoreplicantes como células madre embrionarias y células madre pluripotentes inducidas y puedan ser sometidas a cultivo de pases ex vivo durante un período prolongado.
Por lo tanto, se están realizando investigaciones para determinar si las células madre embrionarias (células ES) que
25 retienen la pluripotencia para diferenciarse a células somáticas de todos los tejidos y células germinales y que aún son capaces de autorreplicarse casi ilimitadamente en un estado indiferenciado podrían ser aplicables no solo en medicina regenerativa sino también en el campo del descubrimiento de fármacos. Las células madre embrionarias se refieren a una línea de células madre preparada a partir de masas de células internas que pertenecen a una parte del embrión en una etapa de blastocisto que es una etapa de desarrollo temprano de un animal y a veces reciben el
30 nombre de células ES.
Para establecer las células madre embrionarias, se requiere un óvulo fertilizado o un embrión temprano en cualquiera de las fases hasta un blastocisto que esté más desarrollado que el óvulo fertilizado. En el caso de los seres humanos, se utiliza un óvulo fertilizado como material de partida y se reconoce que la pérdida resultante del 35 potencial emergente de la vida humana plantea un problema ético. Por esta razón, algunos países prohíben realizar ningún estudio, incluida la preparación, de células madre embrionarias humanas; incluso en países que permiten la investigación en células madre embrionarias humanas con el reconocimiento de su potencial para tratar enfermedades neurodegenerativas (p. ej., enfermedad de Parkinson) y lesión de la médula espinal, es decir, las enfermedades cuya terapia radical aún no se ha establecido, se imponen limitaciones estrictas en el manejo de las
40 células madre embrionarias humanas. Por lo tanto, los problemas éticos constituyen grandes barreras para la investigación fundamental y aplicada sobre las células madre embrionarias.
Además, las células madre embrionarias necesitan diferenciarse a ciertas células específicas antes de que puedan ponerse en aplicación práctica, y se desarrollan cada vez más métodos para diferenciarlas a hepatocitos, células 45 nerviosas, cardiomiocitos, células beta pancreáticas y similares. Sin embargo, la diferenciación a estas células específicas es difícil de realizar y la diferenciación inducida a hepatocitos es particularmente difícil. Hasta el presente, no se ha establecido ningún método que permita la inducción altamente eficiente de la diferenciación a células madre hepáticas maduras que tenga una calidad suficientemente alta para ser utilizada en la investigación de descubrimiento de fármacos. Todos los métodos que hasta el momento se ha informado que son capaces de
50 inducir la diferenciación requieren hasta tres semanas para inducir la diferenciación. Sin embargo, las células de tipo hepatocito en las que se ha inducido altamente diferenciación alcanzando un coste considerable, mucho trabajo y un tiempo prolongado difícilmente pueden aumentar en número.
Recientemente se ha informado de que al introducir el gen OCT3/4 (OCT3/4 es el nombre de un gen y algunas
55 veces se designa OCT3 u OCT4 pero en lo sucesivo se denomina gen POUF1), el gen SOX2, el gen KLF4 y el gen c-MYC (Documento de Patente 1) o al introducir el gen POU5F1, el gen SOX2 y el gen KLF4 en presencia de un factor de crecimiento de fibroblastos básico (Documento No Relacionado con Patentes 1), se indujeron células madre pluripotentes que son células indiferenciadas, ya que las células madre embrionarias pueden prepararse a partir de células somáticas en seres humanos y similares (Documento de Patente 2). Se sabe que las células madre
60 pluripotentes inducidas por el ser humano (células iPS) tienen dos características: (1) pluripotencia para la diferenciación en tres capas germinales (es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo) que pueden convertirse en todas las células que forman un cuerpo (2) capacidad de autorreplicación mediante la cual las células pueden someterse a un cultivo de pases ilimitadamente en una placa de cultivo en condiciones especificadas mientras permanecen en estado indiferenciado. También se ha informado de que tales células madre pluripotentes inducidas por seres humanos son muy similares a las células madre embrionarias humanas en términos de morfología, expresión génica, antígeno de superficie celular, capacidad autoreplicante a largo plazo y capacidad de formación de teratoma (tumor benigno) (Documentos No Relacionados con Patentes 2 y 3), así como también que los genotipos de las HLA son idénticos a los de las células somáticas que son células derivadas (Documento No Relacionado con
5 Patentes 3).
En la preparación de tales células madre pluripotentes inducidas, se sostiene que una célula somática diferenciada puede "restablecerse o reprogramarse" a una célula madre pluripotente indiferenciada simplemente introduciendo cuatro genes (es decir, el gen POUF1, el gen SOX2, el gen KLF4 y gen c-MYC) o tres genes (es decir, el gen
10 POU5F1, el gen SOX2 y el gen KLF4) en la célula. Sin embargo, en células humanas, las células madre pluripotentes inducidas se preparan a partir de células somáticas con una eficacia del 0,1%-0,01% en el caso de la transfección de cuatro genes, y con una eficacia del 0,01%-0,001% en la transfección de tres genes. Esto significa que de 99,9% a 99,999% de las células no se reprogramarán a una célula madre pluripotente inducida mediante transferencia génica.
15 Además, el gen NANOG, el gen POU5F1, el gen SOX2, el gen ZFP42, el gen SALL4, el gen LIN28 y el gen TERT, y similares que se expresan de forma característica en células madre embrionarias se consideran factores importantes para que las células madre pluripotentes permanezcan indiferenciadas, lo que sirve para suprimir la diferenciación celular. Por lo tanto, en una célula diferenciada, la expresión del gen NANOG, el gen POUF1, el gen SOX2, el gen
20 ZFP42, el gen SALL4, el gen LIN28 y el gen TERT que se consideran factores importantes en el mantenimiento de un estado indiferenciado desaparecerán a medida que los genes de diferenciación (propiedades de la célula diferenciada) se expresen.
En otras palabras, se ha considerado imposible preparar una célula en la que no solo el gen NANOG, el gen
25 POUF1, el gen SOX2, el gen ZFP42, el gen SALL4, el gen LIN28 y el gen TERT se consideren factores importantes en el mantenimiento de un estado indiferenciado, sino también se expresen muchas propiedades de una célula diferenciada (muchos genes de diferenciación).
30
Documento de patente 1: JP 2008-283972 A Documento de patente 2: JP 2008-307007
Documento no relacionado con patentes 1: Nakagawa M et al., Nat Biotechnol., 2008, 26.101-6 Documento no relacionado con patentes 2: Takahashi K, Yamanaka S et al., Cell, 2007, 131, 861-872
40 Documento no relacionado con patentes 3: Masaki H, Ishikawa T et al., Stem Cell Res., 2008, 1, 105-115.
En estas circunstancias, los autores de la presente invención llevaron a cabo un estudio exhaustivo para saber si era posible preparar células que tuvieran los genes importantes para el mantenimiento de un estado indiferenciado y muchas propiedades de los hepatocitos; como resultado, descubrieron que era posible preparar células madre 45 hepáticas inducidas que expresaban genes característicos de las células madre embrionarias y que aún expresaban genes característicos de los hepatocitos; Además, encontraron que estas células madre hepáticas inducidas fueron útiles en pruebas de seguridad, pruebas de toxicidad, pruebas de metabolismo, pruebas de interacción con fármacos, pruebas de actividad antiviral, pruebas de detección para productos farmacéuticos tales como terapias hiperlipidémicas, terapias hipertensivas, medicamentos de compuestos de bajo peso molecular, y medicamentos de
50 anticuerpos, detección de dianas en el descubrimiento de fármacos, preparación de modelos animales, producción de proteínas producidas por hepatocitos y en medicina regenerativa; por consiguiente se ha completado la presente invención.
Compendio de la invención
55
Por lo tanto, un primer objeto de la presente invención es proporcionar una célula madre hepática inducida que expresa genes característicos de una célula madre embrionaria y que aún expresa genes característicos de un
60 hepatocito.
Un segundo objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para preparar una célula madre hepática inducida que exprese genes característicos de una célula madre embrionaria y que aún exprese genes característicos de un hepatocito.
Un tercer objeto de la presente invención es proporcionar métodos que utilizan la célula madre hepática inducida de la presente invención, incluyendo métodos de prueba de seguridad, métodos de prueba de toxicidad, métodos de prueba de metabolismo, métodos de prueba de interacción con fármacos, métodos de prueba de actividad antiviral, métodos de prueba de detección para productos farmacéuticos tales como agentes terapéuticos hiperlipidémicos,
5 productos terapéuticos para la hipertensión, medicamentos de compuestos de bajo peso molecular y medicamentos de anticuerpos, métodos para seleccionar dianas en el descubrimiento de fármacos, métodos para la preparación de modelos animales, métodos para la producción de proteínas producidas por hepatocitos y métodos de medicina regenerativa.
10 Solución alos problemas
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una célula madre hepática inducida obtenida mediante un procedimiento que comprende una etapa de inducir una célula de mamífero a una célula madre hepática inducida, en donde la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste en una célula derivada de 15 adulto, una célula derivada de neonato, célula derivada de piel y una célula de un individuo canceroso, en donde dicha etapa de inducción comprende introducir el gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 en la célula de mamífero con la ayuda de vectores de expresión para llevar el célula de mamífero a tal estado que los productos génicos del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida estarán presentes para asegurar que la abundancia relativa intracelular del producto génico del gen POU5F1 es
20 mayor que la del producto génico del gen SOX2, donde la razón de uso entre el gen POUF1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida es 4:2:1 en ese orden, y en donde la célula madre hepática inducida se caracteriza por satisfacer al menos los siguientes requisitos (1)-(3):
- (1)
- expresa al menos 15 genes seleccionados del grupo de los genes enumerados en la siguiente Tabla 1 que son genes marcadores para una célula madre embrionaria;
- (2)
- tiene propiedades de un hepatocito en donde al menos 15 genes seleccionados del grupo de genes en la Tabla 2 siguiente se expresan como genes asociados con las propiedades de un hepatocito del apartado (2) anterior.
[Tabla 2]
- (3)
- puede ser sometido a un cultivo de expansión o cultivo de pases durante al menos 3 días.
25 [Tabla 1]
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank
- ACVR2B
- NM_001106
- CD24
- L33930
- CDH1
- NM_004360
- CYP26A1
- NM_057157
- DNMT3B
- NM_175850
- DPPA4
- NM_018189
- EDNRB
- NM_003991
- FLT1
- NM_002019
- GABRB3
- NM_000814
- GATA6
- NM_005257
- GDF3
- MM_020634
- GRB7
- NM_005310
- UN28
- NM_024674
- NANOG
- NM_024865
- NODAL
- NM_018055
- PODXL
- NM_005397
- POU5F1
- NM_002701
- SALL4
- NM_020436
- SOX2
- NM_003106
- TDGF1
- NM_003212
- TERT
- NM_198253
- ZFP42
- NM_174900
- ZIC3
- NM_003413
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- AFP
- NM_001134 FGA NM_021871 PDK4 NM_002612
- AGT
- NM_000029 FGA NM_000508 PDZK1 NM_002614
- AHSG
- NM_001622 FGB NM_005141 PLA2G12B NM_032562
- AK027294
- AK027294
- FGG NM_000509 PLG NM_000301
- AK074614
- AK074614
- FLRT3 NM_198391 PRG4 NM_005807
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- AK124281
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- AK126405
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- ALB
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imagen12
- C11orf9
- NM_013279 HPX NM_000613 SLCO2B1 MM_007256
- C13orf15
- NM_014059 HSD17B2 NM_002153 SLP1 NM_003064
- C15orf27
-
NM_152335
HTRA3
NM_053044
SPARCL1
imagen13
- C3
- NM_000064 IGF2 NM_001007139 SPON1 NM_006108
- C5
- NM_001735 IL32 NM_001012631 ST8SIA1 NM_003034
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- CA414006
- CA414006
- INHBB NM_002193 STARD10 NM_006645
- CD163
- NM_004244 ISX NM_001008494 STMN2 S82024
- CD1D
- NM_001766 KCNJ16 NM_170741 TD02 NM_005651
- CDX2
- NM_001265 KYNU NM_003937 TF NM_001063
- CILP
- NM_003613 LAMC2 NM_005562 TMC6 NM_007267
- CMKLR1
- NM_004072 LGALS2 NM_006498 TMEM16D NM_178826
- COL4A6
- NM_033841 LHX2 NM_004789 TSPAN15 NM_012339
- COLEC11
- NM_199235 LOC132205 AK091178 TTR NM_000371
- CXCL14
- NM_004887 LOC285733 AK091900 UBD NM_006398
- CXCR4
- NM_001008540 M27126 M27126 UGT2B11 NM_001073
- CXCR7
- NM_020311 MAF AF055376 UGT2B7 NM_001074
- DACH1
- NM_080759 MFAP4 NM_002404 UNC93A NM_018974
- DENND2A
- NM_015689 MMP10 NM_002425 VCAM1 NM_001078
- DIO3
- NM_001362 MTTP NM_000253 VIL1 NM_007127
- DLK1
-
NM_003836
NGEF
NM_019850
VTN
imagen16
- DUSP6
-
NM_001946
NGFR
NM_002507
WFDC1
imagen17
- imagen18
-
imagen19 imagen20 imagen21 imagen22 imagen23
- imagen24
-
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- imagen30
-
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- imagen36
-
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- imagen42
-
imagen43 imagen44 imagen45 imagen46 imagen47
Preferiblemente, los genes marcadores para una célula madre embrionaria del apartado (1) anterior se expresan en
5 la célula madre hepática inducida en cantidades que varían de 1/8-8 veces las cantidades de los genes que se expresan en la célula madre embrionaria (reivindicación 2). Más preferiblemente, los genes marcadores para una célula madre embrionaria del apartado (1) anterior se expresan en la célula madre hepática inducida en cantidades que varían de 1/4 a 4 veces las cantidades de los genes que se expresan en la célula madre embrionaria (reivindicación 3).
10 [Tabla 2]
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A2M
- NM_000014 ERP27 NM_152321 NRCAM NM_005010
- ACE2
- NM_021804 EVA1 NM_144765 NTF3 NM_002527
- ACVRL1
- NM_000020 F10 NM_000504 OLFML2A NM_182487
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- ADAMTS9
- NM_182920 F2 MM_000506 PAG1 NM_018440
- AFAP1L2
- NM_001001936 FABP1 NM_001443 PCSK6 NM_002570
- AFP
- NM_001134 FGA NM_021871 PDK4 NM_002612
- AGT
- NM_000029 FGA NM_000508 PDZK1 NM_002614
- AHSG
- NM_001622 FGB NM_005141 PLA2G12B NM_032562
- AK027294
- AK027294
- FGG NM_000509 PLG NM_000301
- AK074614
- AK074614
- FLRT3 NM_198391 PRG4 NM_005807
- AK124281
- AK124281
- FMOD NM_002023 PSMAL NM_153696
- AK126405
- AK126405
- FOXA1 NM_004496 PTGDS NM_000954
- ALB
- NM_000477 FTCD NM_206965 PTHR1 NM_000316
- ALDH1A1
- NM_000689 GATA4 NM_002052 RASD1 NM_016084
- ANXA8
- NM_001630 GATM NM_001482 RBP4 NM_006744
- APCDD1
- NM_153000 GDF10 NM_004962 RNF43 NM_017763
- APOA1
- NM_000039 GJB1 NM_000186 RRAD NM_004165
- APOA2
- NM_001643 GLT1D1 NM_144669 S100A14 NM_020672
- APOA4
- NM_000482 GPRC5C NM_022036 SEPP1 NM_005410
- APOB
- NM_000384 GSTA3 NM_000847 SERINC2 NM_178865
- AREG
- NM_001657 GUCY1A3 NM_000856 SERPINA1 NM_001002236
- ART4
- NM_021071 H19 NR_002196 SERPINA3 NM_001085
- ASGR2
- NM_080912 HHEX NM_002729 SERPINA5 NM_000624
- ATAD4
- NM_024320 HKDC1 NM_025130 SH3TC1 NM_018986
- BC018589
- BC018589
- HMGCS2 NM_005518 SLC13A5 NM_177550
- BMP2
- NM_001200 HP NM_005143 SLC40A1 NM_014585
- SX097190
- BX097190 HPR NM_020995 SLC5A9 NM_001011547
- C11orf9
- NM_013279 HPX NM_000813 SLCO2B1 NM_007256
- C13orf15
- NM_014059 HSD17B2 NM_002153 SLPI NM_003064
- C15orf27
- NM_152335 HTRA3 NM_053044 SPARCL1 NM_004684
- C3
- NM_000064 IGF2 NM_001007139 SPON1 NM_006108
- C5
- NM_001735 IL32 NM_001012631 ST8SIA1 NM_003034
- CA414006
- CA414006
- INHBB NM_002193 STARD10 NM_006645
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- CD163
- NM_004244 ISX NM_001008494 STMN2 S82024
- CD1D
- NM_001766 KCNJ16 NM_170741 TD02 NM_005651
- CDX2
- NM_001265 KYNU NM_003937 TF NM_001063
- CILP
- NM_003613 LAMC2 NM_005562 TMC6 NM_007267
- CMKLR1
- NM_004072 LGALS2 NM_006498 TMEM16D NM_178826
- COL4A6
- NM_033641 LHX2 NM_004789 TSPAN15 NM_012339
- COLEC11
- NM_199235 LOC132205 AK091178 TTR NM_000371
- CXCL14
- NM_004887 LOC285733 AK091900 UBD NM_006398
- CXCR4
- NM_001008540 M27126 M27126 UGT2B11 NM_001073
- CXCR7
- NM_020311 MAF AF055376 UGT2B7 NM_001074
- DACH1
- NM_080759 MFAP4 NM_002404 UNC93A NM_018974
- DENND2A
- NM_015689 MMP10 NM_002425 VCAM1 NM_001078
- DIO3
- NM_001362 MTTP NM_000253 VIL1 NM_007127
- DLK1
- NM_003836 NGEF NM_019850 VTN NM_000638
- DUSP6
- NM_001946 NGFR NM_002507 WFDC1 NM_021197
El gen NANOG, el gen POUF1, el gen SOX2, el gen ZFP42 y el gen SALL4 se expresan preferiblemente como los genes marcadores para una célula madre embrionaria del apartado (1) anterior (reivindicación 4). El gen AFP, el gen TTR, el gen TF, el gen APOA2, el gen APOA4, el gen AHSG, el gen FGA, el gen AGT, el gen FABP1, el gen
5 SERPINA1 y el gen RBP4 se expresan preferiblemente como genes asociados con las propiedades de un hepatocito del apartado (2) anterior (reivindicación 5). En otra realización, el gen APOA1, el gen APOA2, el gen APOA4, el gen APOB, el gen FABP1, el gen AGT se expresan preferiblemente como genes asociados con las propiedades de un hepatocito del apartado (2) anterior (reivindicación 6).
10 Preferiblemente, la célula madre hepática inducida de la presente invención expresa adicionalmente al menos un gen seleccionado entre el gen SOX17, el gen FOXA2, el gen GSC, el gen EOMES y el gen TCF2 que son característicos de células madre mesodérmicas y/o células madre endodérmicas (reivindicación 7). También se describe en la presente memoria que al menos un gen seleccionado del grupo de genes en la Tabla 3 siguiente tiene su expresión suprimida o inducida, o tiene la actividad de un producto génico de dicho gen promovida o inhibida, por
15 una sustancia de prueba.
[Tabla 3]
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- ABCB1
- NM_000927 GSTA1 NM_145740 SLC22A6 NM_153277
- ABCB11
- NM_003742 GSTA2 NM_000846 SLC22A7 NM_153320
- ABCB4
- NM_018850 GSTA3 NM_000847 SLC22A8 NM_004254
- ABCC1
- NM_019862 GSTA4 NM_001512 SLC22A9 NM_080866
- ABCC2
- NM_000392 GSTA5 NM_153699 SLCO1A2 NM_005075
- ABCC3
- NM_003786 GSTM1 NM_146421 SLCO1A2 NM_134431
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- ACTB
- NM_001101 GSTM2 NM_000848 SLCO1B1 NM_008446
- AHR
- NM_001621 GSTM3 NM_000849 SLCO1B3 NM_019844
- ARNT
- NM_001688 GSTM4 NM_147148 SLCO1C1 NM_017435
- BAAT
- NM_001701 GSTM5 NM_000851 SLCO2A1 NM_005630
- COMT
- NM_000754 GSTP1 NM_000852 SLCO2B1 NM_007256
- CYP1A1
- NM_000499 GSTT1 NM_000853 SLCO3A1 XM_001132480
- CYP1A2
- NM_000761 GSTT2 NM_000854 SLCO3A1 NM_013272
- CYP1B1
- NM_000104 GSTZ1 NM_145870 SLCO4A1 NM_016354
- CYP2A13
- NM_000766 NAT1 NM_000662 SLCO4C1 NM_180991
- CYP2A6
- NM_000762 NAT2 NM_000015 SULT1A1 NM_177529
- CYP2A7
- NM_000764 NR1H4 NM_005123 SULT1A2 NM_177528
- CYP2B6
- NM_000767 NR1I2 NM_003889 SULT1A3 AK094769
- CYP2C18
- NM_000772 NR1I3 NM_005122 SULT1A4 NM_001017389
- CYP2C19
- NM_000769 PPARA NM_005036 SULT1B1 D89479
- CYP2C8
- NM_000770 PPARA L02932 SULT1B1 NM_014465
- CYP2C9
- NM_000171 PPARD NM_006238 SULT1C2 NM_176825
- CYP2D6
- NM_000106 PPARG NM_138711 SULT1C4 NM_006588
- CYP2E1
- NM_000773 RPL13 NM_033251 SULT1E1 NM_005420
- CYP2F1
- NM_000774 RPS18 NM_022551 SULT2A1 NM_003167
- CYP2J2
- NM_000775 RXRA NM_002957 SULT2B1 NM_004605
- CYP3A4
- NM_017460 RXRB NM_021976 SULT4A1 NM_014351
- CYP3A5
- NM_000777 RXRG NM_008917 TPMT NM_000367
- CYP3A5
- AF355801 SLC10A1 NM_003049 UGT1A6 NM_001072
- CYP3A7
- NM_000765 SLC10A2 NM_000452 UGT1A8 NM_019076
- CYP4A11
- NM_000778 SLC16A1 NM_003051 UGT2A1 NM_006798
- CYP4B1
- NM_000779 SLC17A1 NM_005074 UGT2B10 NM_001075
- CYP4F11
- NM_021187 SLC22A1 NM_153187 UGT2B11 NM_001073
- CYP4F12
- NM_023944 SLC22A10 NM_001039752 AGT2815 NM_001076
- CYP4F2
- NM_001082 SLC22A11 AK075127 UGT2B17 NM_001077
- CYP4F3
- AB002454 SLC22A11 NM_018484 UGT2B28 NM_053039
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- CYP4F8
- NM_007253 SLC22A2 NM_003058 UGT2B4 NM_021139
- EEF1A1
- NM_001402 SLC22A3 NM_021977 UGT2B7 NM_001074
- ENDOG
-
NM_004435
SLC22A4
NM_003059
imagen56 imagen57
- GAPDH
-
NM_002046
SLC22A5
NM_003060
imagen58 imagen59
También se describe en la presente memoria que la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria puede someterse a cultivo de expansión o cultivo de pases durante al menos un mes.
5 También se describe en la presente memoria un procedimiento para producir una célula madre hepática inducida que comprende una etapa de inducir una célula de mamífero a una célula madre hepática inducida, llevando la etapa a la célula de mamífero a tal estado que los productos genéticos del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida estarán presentes para asegurar que la abundancia relativa intracelular del producto génico del gen POU5F1 sea mayor que la del producto génico del gen
10 SOX2. La etapa puede ser tal que utiliza el gen POUF1, el gen KLF4 y el gen SOX2, que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida o los productos génicos de estos genes, y que la proporción en uso del gen POUF1 o el producto génico de este gen con respecto al gen SOX2 o al producto génico de este gen es mayor que uno.
15 De acuerdo con la presente invención, la razón de uso entre el gen POUF1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida satisface la razón de gen POU5F1 > gen KLF4 > gen SOX2, más concretamente con la razón de 4:2:1 en ese orden (reivindicación 1).
Las células de mamífero anteriores para su uso en la presente invención son una célula derivada de adulto, una
20 célula derivada de neonato, una célula derivada de la piel o una célula de un individuo canceroso (reivindicación 1), siendo el mamífero preferiblemente un ser humano (reivindicación 8).
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método de prueba que utiliza la célula madre hepática inducida de la presente invención y el método de prueba es un método de prueba de seguridad, un método de 25 prueba de toxicidad, un método de prueba de metabolismo, un método de prueba de interacción con fármacos, un método de prueba de actividad antiviral, o un método de prueba de selección para productos farmacéuticos tales como agentes terapéuticos hiperlipidémicos, productos terapéuticos para la hipertensión, medicamentos de compuestos de bajo peso molecular y medicamentos de anticuerpos (reivindicación 9). También se describen en la presente memoria un método para seleccionar dianas en el descubrimiento de fármacos, un método para la
30 preparación de un modelo animal y un método para la producción de una proteína producida en hepatocitos. Un séptimo aspecto se refiere a un uso terapéutico dirigido a un mamífero (reivindicación 10).
Efecto ventajoso de la invención
35 De acuerdo con la presente invención, las células madre hepáticas inducidas humanas se pueden preparar a partir de donantes de diferentes razas, sexos, edades o antecedentes genéticos, por lo que la presente invención es eficaz en pruebas no clínicas con nuevos fármacos, tal como una prueba de seguridad, una prueba de toxicidad, una prueba de metabolismo y una prueba de interacción con fármacos, que se realizan antes de las pruebas clínicas. Además, las pruebas no clínicas que utilizan células madre hepáticas inducidas humanas proporcionan herramientas
40 de descubrimiento de fármacos que contribuyen a un desarrollo más eficaz de nuevos fármacos.
Descripción
En las páginas que siguen, se describen en detalle la célula madre hepática inducida descrita en la presente 45 memoria, el procedimiento para su producción y las aplicaciones de esa célula.
La célula madre hepática inducida que se describe en la presente memoria se caracteriza por satisfacer al menos los siguientes tres requisitos (1) a (3):
(1) expresa al menos 15 genes seleccionados del grupo de genes enumerados en la Tabla 1 anterior, que son 50 genes marcadores para una célula madre embrionaria;
- (2)
- tiene propiedades de un hepatocito;
- (3)
- puede ser sometido a un cultivo de expansión o cultivo de pases durante al menos 3 días.
A continuación, en la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, la expresión de los genes marcadores para una célula madre embrionaria del apartado (1) anterior que se conocen como genes marcadores para una célula madre embrionaria sirve para especificar que la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria es una célula que tiene una naturaleza tal que teóricamente se autorreplica de forma ilimitada y que puede someterse a un cultivo de pases prolongado mientras permanece sustancialmente como una célula
5 madre hepática inducida. Es necesario que al menos 15 genes seleccionados del grupo de genes enumerados en la Tabla 1 precedente se expresen necesariamente en la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria.
La célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria no está particularmente limitada siempre que los
10 genes marcadores para una célula madre embrionaria del apartado (1) anterior se expresen en ella, pero los genes marcadores para una célula madre embrionaria del apartado (1) anterior pueden expresarse en la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria en cantidades que varían de 1/16 a 16 veces las cantidades de los genes que se expresan en la célula madre embrionaria, prefiriéndose el intervalo de 1/8-8 veces. Con el fin de mantener el estado de la célula madre hepática inducida o desde el punto de vista del cultivo de pases prolongado,
15 los genes marcadores para una célula madre embrionaria del apartado (1) anterior pueden expresarse en la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria en cantidades casi comparables, a saber, cantidades que varían de 1/4 a 4 veces las cantidades de los genes que se expresan en la célula madre embrionaria, siendo preferido el intervalo de 1/2-2.
20 La célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria es tal que, desde el punto de vista del mantenimiento de un estado indiferenciado, al menos 15 genes seleccionados del grupo de los genes enumerados en la Tabla 1 anterior como genes marcadores de una célula madre embrionaria en el apartado (1) anterior se expresan en la célula madre hepática inducida en cantidades dentro del intervalo de 1/2-2 las cantidades de los genes que se expresan en la célula madre embrionaria, y puesto que el número de genes marcadores para una
25 célula madre embrionaria en el apartado (1) anterior que se expresan dentro de este intervalo aumenta a 20, 25 o incluso más, el resultado se vuelve mejor.
La célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria es tal que, de los genes enumerados en la Tabla 1 anterior como genes marcadores para una célula madre embrionaria del apartado (1) anterior, son expresados
30 preferiblemente cinco y más, o diez y más, o incluso veinte y más en la célula madre hepática inducida en cantidades dentro del intervalo de 1/2-2, de 1/4-4 veces, y de 1/8-8 veces, respectivamente, las cantidades de los genes que se expresan en la célula madre embrionaria.
La célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria es tal que, entre los genes enumerados en la
35 Tabla 1 anterior como genes marcadores de una célula madre embrionaria del apartado (1) anterior, cinco genes que incluyen el gen NANOG, el gen POUF1 y SOX2 pueden expresarse en la célula madre hepática inducida en cantidades dentro del intervalo de 1/4-4 veces las cantidades de los genes que se expresan en la célula madre embrionaria; preferiblemente, cinco genes (es decir, el gen NANOG, el gen POU5F1, el gen SOX2, el gen ZFP42 y el gen SALL4) se expresan en cantidades dentro del intervalo de 1/4-4 veces las cantidades de los genes que se
40 expresan en la célula madre embrionaria; más preferiblemente, diez genes (es decir, el gen NANOG, el gen POU5F1, el gen SOX2, el gen TDGF1, el gen DNMT3B, el gen ZFP42, el gen TERT, el gen GDF3, el gen SALL4 y el gen GABRB3) se expresan en cantidades dentro del intervalo de 1/4-4 veces las cantidades de los genes que se expresan en la célula madre embrionaria.
45 La célula madre embrionaria antes mencionada que se utilizará como referencia para la comparación es cualquiera de hES_H9 (GSM194390), hES_BG03 (GSM194391) y hES_ES01 (GSM194392). Se puede acceder a los datos relevantes para la expresión génica desde la base de datos Gene Expression Omnibus [GEO] ("Gene Expression Omnibus [GEO], [en línea], [búsqueda el 28 de enero de 2010], Internet <http://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/>).
50 Se requiere que la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria tenga las propiedades de un hepatocito del apartado (2) anterior. Las propiedades de un hepatocito en la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria no están particularmente limitadas siempre que sean propiedades características del hepatocito, pero un ejemplo típico es la producción de proteínas (productos génicos) que son características de los hepatocitos. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, la producción de proteínas séricas (p.ej., AFP,
55 TTR, TF, APOA2, APOA4, AHSG, FGA, AGT, FABP1, SERPINA1 y RBP4), la producción de enzimas asociadas al metabolismo de los sacáridos, metabolismo de aminoácidos, metabolismo lipídico y metabolismo del hierro, así como la producción de enzimas y transportadores metabolizadores de fármacos.
La célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria puede expresar genes del apartado (2) anterior
60 asociados con las propiedades de un hepatocito. Estos genes pueden ser los que se expresan de forma característica en los hepatocitos y que están asociados a las propiedades del hepatocito; pueden ilustrarse mediante genes que están asociados a, por ejemplo, la producción de proteínas características de los hepatocitos. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, genes asociados a la producción de proteínas séricas, la producción de enzimas asociadas al metabolismo de sacáridos, metabolismo de aminoácidos, metabolismo de lípidos y metabolismo del hierro, así como la producción de enzimas y transportadores metabolizadores de fármacos, etc. En particular, los genes asociados a la producción de enzimas y transportadores que metabolizan fármacos incluyen, por ejemplo, el grupo de genes enumerados en la Tabla 3 anterior. Dichos genes asociados a la producción de enzimas y transportadores que metabolizan fármacos exhiben expresión génica, inducción, supresión
5 y similares en respuesta a sustancias de ensayo tales como compuestos candidatos para productos farmacéuticos que han sido absorbidos por la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria.
En un ejemplo de la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, al menos 15 genes que son genes asociados al hígado seleccionados del grupo de genes en la Tabla 2 anterior pueden expresarse como genes
10 del apartado (2) anterior asociados a las propiedades de un hepatocito. Estos genes son los que son característicos de los hepatocitos y que se expresan en un cultivo primario humano de hepatocitos.
Los números de acceso de GenBank correspondientes a los respectivos símbolos genéticos se detallan en la Tabla 2 anterior. Se puede acceder a la información genética relevante desde el sitio web de NCBI
15 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/).
Con respecto a los genes del apartado (2) anterior asociados a las propiedades de un hepatocito, 50 o más de los genes enumerados en la Tabla 2 anterior pueden expresarse desde el punto de vista de la posibilidad de proporcionar células que exhiban propiedades características de los hepatocitos, y se prefiere que se expresen 80 o
20 más de tales genes. En la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, el gen AFP se puede expresar entre los genes enumerados en la Tabla 2 anterior, y se prefiere que se expresen el gen AFP, el gen TTR, el gen TF, el gen APOA2, el gen APOA4, el gen AHSG, el gen FGA, el AGT gen, el gen FABP1, el gen de SERPINA1 y el gen RBP4.
25 Los genes mencionados anteriormente generalmente se expresan abundantemente en hepatocitos; por otro lado, se sabe que muchos de estos genes no se expresan sustancialmente en células que no son hepatocitos, incluidas las células madre embrionarias.
En otro ejemplo de la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, los siguientes genes se 30 pueden expresar como genes del apartado (2) anterior asociados a las propiedades de un hepatocito.
En la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, se pueden expresar el gen GSTM3, el gen SLC22A1, el gen GSTA5, el gen ALDH1A1, el gen CYP27A1, el gen CYP1B1, el gen ALDH2, el gen GSTA2, el gen GSTA3, el gen GSTA5, el gen CYP4A2 y el gen UGT2B11. La célula madre hepática inducida que expresa estos
35 genes muestra una propiedad de un hepatocito que produce proteínas asociadas a la cinética del fármaco, por lo que es particularmente útil en un método de prueba de toxicidad.
En la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, se pueden expresar el gen GSTM3, el gen SLC22A1, el gen GSTA5, el gen ALDH1A1, el gen CYP27A1, el gen CYP1B1, el gen ALDH2, el gen GSTA2, el gen
40 GSTA3, el gen GSTA5, el gen CYP4A2 y el gen UGT2B11. La célula madre hepática inducida que expresa estos genes muestra una propiedad de un hepatocito que produce proteínas asociadas a enzimas asociadas al metabolismo de fármacos, por lo que es particularmente útil en un método de prueba de metabolismo.
En la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, pueden expresarse el gen CD81, el gen
45 SCARB1, el gen OCLN, el gen CLDN1 y similares. La célula madre hepática inducida que expresa estos genes muestra una propiedad de un hepatocito que produce proteínas asociadas a la replicación del VHC, por lo que es particularmente útil en un método de prueba de actividad antiviral.
En la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, pueden expresarse el gen APOA1, el gen
50 APOA2, el gen APOA4, el gen APOB, el gen FABP1, el gen AGT y similares. La célula madre hepática inducida que expresa estos genes muestra una propiedad de un hepatocito que produce proteínas asociadas al metabolismo lipídico y la presión sanguínea, por lo que es particularmente útil en una prueba de selección para productos farmacéuticos tales como agentes terapéuticos hiperlipidémicos y agentes terapéuticos para la hipertensión.
55 En la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, pueden expresarse el gen CCL2, el gen CDKN1A, el gen ICAM1, el gen JUNB, el gen RGS2, el gen CCND1 y similares. La célula madre hepática inducida que expresa estos genes muestra una propiedad de un hepatocito que produce transportadores y proteínas asociadas al receptor metabólico, por lo que es particularmente útil en una prueba de selección para productos farmacéuticos tales como compuestos de bajo peso molecular y anticuerpos.
60 En la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, se pueden expresar el gen ALB, el gen TTR, el gen TF, el gen RBP4, el gen FGA, el gen FGB, el gen FGG, el gen AHSG, el gen AFP, el gen FN1, el gen SERPINA1, el gen PLG y similares. La célula madre hepática inducida que expresa estos genes muestra una propiedad de un hepatocito que produce proteínas séricas, por lo que es particularmente útil en un método para la preparación de modelos animales.
En la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, se pueden expresar el gen ALB, el gen TTR, el gen TF, el gen RBP4, el gen FGA, el gen FGB, el gen FGG, el gen AHSG, el gen AFP, el gen FN1, el gen
5 SERPINA1, el gen PLG y similares. La célula madre hepática inducida que expresa estos genes muestra una propiedad de un hepatocito que produce proteínas séricas, por lo que es particularmente útil en un método terapéutico dirigido a animales no humanos.
La célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria puede tener propiedades características de
10 células madre mesendodérmicas y/o células madre endodérmicas, y también pueden haber expresado en ella al menos uno de los siguientes genes que se expresan en células madre mesendodérmicas y/o células madre endodérmicas. a saber, el gen SOX17, el gen FOXA2, el gen GSC, el gen EOMES y el gen TCF2. Un ejemplo concreto es uno que expresa todo el gen SOX17, el gen FOXA2, el gen GSC, el gen EOMES y el gen TCF2.
15 Además, la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria puede ser tal que al menos un gen seleccionado de los genes enumerados en la Tabla 3 anterior que están asociados a la producción de enzimas y transportadores que metabolizan fármacos tiene su expresión suprimida o inducida, o tiene el actividad de un producto génico de dicho gen promovido o inhibido por una sustancia de prueba. La sustancia de prueba tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a sustancias candidatas para productos farmacéuticos y cuando la célula
20 madre hepática inducida descrita en la presente memoria incorpora tal sustancia de prueba, los genes asociados a la producción de enzimas y transportadores metabolizadores de fármacos se suprimen o se inducen para su expresión en la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria y la actividad de los productos génicos de estos genes se promueve o inhibe. Tales células son útiles en aplicaciones de descubrimiento de fármacos tales como una prueba de metabolismo de fármacos. Se sabe que la expresión de los genes del
25 metabolismo de los fármacos, incluidos los genes transportadores y los genes del receptor nuclear, tiene diferencias individuales. Dado que la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria puede ser inducida a partir de varias células, es posible obtener un número suficientemente grande de células madre inducidas para cubrir estas diferencias individuales. Por lo tanto, si, en la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, se suprimía o se inducía la expresión de los genes enumerados en la Tabla 3 anterior, y se inducía o inhibía la
30 actividad de los productos génicos de dichos genes, mediante una sustancia de prueba, esto resultaba útil como una herramienta para el descubrimiento de fármacos. Por consiguiente, la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria es útil en una prueba de cinética de fármacos, una prueba de seguridad, una prueba de toxicidad, una prueba de metabolismo, una prueba de interacción de fármacos y similares.
35 Puesto que la célula madre hepática inducida descrita en la presente muestra diversas propiedades de los hepatocitos, es muy útil para analizar el metabolismo y el mecanismo de acción de diversos compuestos farmacéuticos y para buscar y analizar moléculas que controlan la formación y las funciones del hígado. Por lo tanto, se puede utilizar en pruebas de seguridad, pruebas de toxicidad, pruebas de metabolismo, pruebas de interacción farmacológica, pruebas de actividad antiviral (especialmente en hepatitis de tipo B o C), pruebas de detección para
40 productos farmacéuticos como terapias hiperlipidémicas, compuestos terapéuticos para la hipertensión, medicamentos de compuestos de bajo peso molecular, y medicamentos de anticuerpos, detección de dianas en el descubrimiento de fármacos (p.ej., fibrosis hepática, cirrosis, hígado graso, hepatitis, síndrome metabólico y hematopoyesis), producción de proteínas producidas por hepatocitos, preparación de modelos animales, medicina regenerativa, y similares.
45 La célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria puede someterse a cultivo de expansión o cultivo de pases durante al menos 3 días. Más específicamente, una célula madre hepática inducida puede proliferar durante al menos un mes, medio año o incluso un año o más; esto significa que es teóricamente capaz de autoreplicarse ilimitadamente.
50 Los medios de cultivo para cultivo de expansión o cultivo de pases de la célula madre hepática inducida descritos en la presente memoria no están particularmente limitados siempre que permitan el cultivo de expansión o cultivo de pases de células madre embrionarias, células madre pluripotentes, y similares; se utilizan preferiblemente medios adecuados para el cultivo de células madre embrionarias, células madre pluripotentes y similares. Ejemplos de tales
55 medios incluyen, pero no se limitan a, un medio ES [40% de medio de Eagle modificado por Dulbecco (EMEM), 40% de medio F12 (Sigma), L-glutamina o GlutaMAX (Sigma) 2 mM, 1% de aminoácidos no esenciales (Sigma), βmercaptoetanol 0,1 mM (Sigma), 15-20% de knockout Serum Replacement (Invitrogen), 10 μg/ml de gentamicina (Invitrogen) y 4-10 ng/ml de factor FGF2]; un medio acondicionado que es el sobrenadante de un cultivo de 24 horas de fibroblastos embrionarios de ratón (en lo sucesivo denominado MEF) en un medio ES que carece de β
60 mercaptoetanol 0,1 mM y que se complementa con β-mercaptoetanol 0,1 mM y 10 ng/ml de FGF2 (este medio se denomina en lo sucesivo medio ES con acondicionamiento MEF), un medio óptimo para células iPS (iPSellon), un medio óptimo para células alimentadoras (iPSellon), StemPro (marca registrada) hESC SFM (Invitrogen), mTeSR1 (STEMCELL Technologies/VERITAS), un medio libre de proteína animal libre de suero para el mantenimiento de células ES/iPS humanas, llamado TeSR2 [ST-05860] (STEMCELL Technologies /VERITAS), un medio para células ES/iPS de primates (ReproCELL), ReproStem (ReproCELL) y ReproFF (ReproCELL). Para células humanas, pueden utilizarse medios adecuados para cultivar células madre embrionarias humanas.
Las técnicas para efectuar cultivo de expansión o cultivo de pases de la célula madre hepática inducida descrita en
5 la presente memoria no están particularmente limitadas si son métodos comúnmente utilizados por el experto en la técnica para cultivar células madre embrionarias, células madre pluripotentes y similares. Por ejemplo, después de eliminar el medio de cultivo de las células cultivadas y eliminar las células con PBS(-), se añade una solución de disociación y, después de reposar durante un período determinado, se retira la solución de disociación y después de agregar un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al
10 10%, se realiza la centrifugación y se elimina el sobrenadante; después de eso, se añaden 1X antibiótico/antimicótico, mTeSR e Y-27632 y la suspensión celular se siembra en una placa recubierta con gelatina o colágeno sembrada con MEF para efectuar el cultivo de pases.
Con el fin de asegurar que la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria no se diferenciará
15 aunque se cultive durante más de un mes después de la transferencia génica, se pueden agregar al medio diversos inhibidores o anticuerpos que inhibirán o neutralizarán la actividad de TGF-beta y similares, HGF, factores de crecimiento de fibroblastos tales como FGF1 -FGF21, activina y similares; Los factores de crecimiento de fibroblastos que se utilizan preferiblemente incluyen el factor de crecimiento de fibroblastos ácido FGF1 (también denominado FGF y denominado en lo sucesivo FGF1), así como el factor de crecimiento de fibroblastos básico
20 FGF2 (también denominado bFGF y denominado en lo sucesivo FGF2), FGF4 y FGF7. Los anticuerpos ilustrativos son anticuerpos neutralizadores policlonales o monoclonales contra estos factores de crecimiento. Si se desea, pueden utilizarse microARN, ARNip y ARN antisentido para suprimir la expresión de genes tales como TGF-beta. También es posible utilizar inhibidores como compuestos de bajo peso molecular que actúan contra TGF-beta y similares. Los inhibidores de señalización de TGF-beta ilustrativos incluyen un inhibidor de ALK (p.ej., A-83-01), un
25 inhibidor de TGF-beta RI y un inhibidor de TGF-beta RI quinasa. Debe observarse que los factores de crecimiento de fibroblastos mencionados anteriormente se seleccionan dependiendo del tipo de célula somática que se vaya a inducir y se pueden utilizar factores de crecimiento de fibroblastos derivados de seres humanos, ratones, vacas, caballos, cerdos, peces cebra, etc.
30 Además, también se pueden añadir al medio inhibidores de quinasa asociada a Rho (bobina en espiral asociada a Rho que contiene proteína quinasa), tales como Y-27632 (Calbiochem, soluble en agua) y Fasudil (HA1077: Calbiochem).
Otros inhibidores que se pueden agregar al medio incluyen: tres inhibidores de bajo peso molecular de la tirosina
35 quinasa receptora de FGF, MEK (proteína quinasa activada por mitógeno)/ERK (quinasas reguladas por señal extracelular 1 y 2) y GSK (Glicógeno Quinasa Sintasa) 3 [SU5402, PD184352 y CHIR99021], dos inhibidores de bajo peso molecular de la vía MEK/ERK y GSK3 [PD0325901 y CHIR99021], un compuesto de bajo peso molecular como inhibidor de la enzima metilante de histonas G9a [BIX-01294 (BIX)], azacitidina, tricostatina A (TSA), 7hidroxiflavona, etilamida del ácido lisérgico, kenpaulona, un inhibidor de la quinasa del receptor I de TGF-β/quinasa
40 tipo activina 5 (ALK5) [EMD 616452], inhibidores del receptor de TGF-β 1 (TGFBR1) quinasa [E-616452 y E616451], un inhibidor de la quinasa de la familia Src [EI-275], tiazovivina, PD0325901, CHIR99021, SU5402, PD184352, SB431542, anticuerpo neutralizador anti-TGF-β, A-83-01, Nr5a2, un compuesto inhibidor de p53, ARNip contra p53, un inhibidor de la ruta de p53, etc.
45 Además, la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria puede congelarse o descongelarse mediante métodos conocidos. Un método ilustrativo de congelación que puede utilizarse es el siguiente: después de eliminar el medio de cultivo de las células cultivadas y lavar las células con PBS(-), se añade una solución de disociación y después de reposar durante un período determinado, se retira la solución de disociación y después de añadir un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al 10%,
50 se realiza la centrifugación y se retira el sobrenadante; a continuación, se añade un fluido de crioconservación y la mezcla se distribuye en viales criogénicos, se congela durante la noche a -80°C y después se almacena en nitrógeno líquido. Un método ilustrativo de descongelación es el siguiente: la muestra congelada se descongela en un baño de agua a 37°C y luego se suspende en un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al 10% antes de su uso.
55 Un segundo aspecto descrito en la presente memoria se refiere a un procedimiento para producir una célula madre hepática inducida que comprende una etapa de inducir una célula de mamífero a una célula madre hepática inducida, y el mamífero que se debe tratar no está particularmente limitado siempre que sea un mamífero y pueda ser ilustrado mediante rata, ratón, cobaya, conejo, perro, gato, cerdos tales como minicerdos, vaca, caballo, primates
60 tales como monos incluyendo un cinomolgo, y ser humano, prefiriéndose rata, ratón, cobaya, perro, gato, minicerdos, caballo, cinomolgo y ser humano, y el ser humano se utiliza con particular preferencia.
Cualquiera de las células de los mamíferos mencionados anteriormente puede utilizarse siempre que sean células de mamífero. Los ejemplos que se pueden utilizar incluyen, entre otros, células de órganos como el cerebro, hígado, esófago, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, colon, páncreas, riñón y pulmón, así como células del fluido de la médula ósea, músculo, tejido adiposo, sangre periférica, piel y músculo esquelético. Entre estas, se prefieren células derivadas de hígado endodérmico, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, colon, páncreas, pulmón, etc., utilizándose con preferencia particular células derivadas del estómago y el colon. Estas
5 células también son preferidas porque están fácilmente disponibles como desechos médicos durante la operación en terapia contra el cáncer.
También es posible utilizar células derivadas de tejidos y fluidos corporales que acompañan al parto, tales como las células derivadas de los tejidos del cordón umbilical (cordón umbilical y sangre umbilical), amnios, placenta y líquido
10 amniótico; en particular, pueden utilizarse células derivadas de tejidos inmediatamente después del nacimiento, tales como diversos tejidos de neonatos (p.ej., piel neonatal). También es posible utilizar células de animales fetales.
Las células de los mamíferos mencionados anteriormente que se pueden utilizar incluyen células derivadas de adultos, células derivadas de neonatos, células derivadas de la piel neonatales, células individuales cancerosas,
15 células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas y células diferenciadas de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas.
Los tipos de cánceres en individuos cancerosos no están particularmente limitados y se puede utilizar cualquiera de los cánceres tales como tumor maligno, cáncer sólido, carcinoma, sarcoma, tumor cerebral, cáncer de órgano 20 hematopoyético, leucemia, linfoma y mieloma múltiple. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cáncer oral, cáncer de garganta, cáncer de vías aéreas superiores, cáncer de pulmón, cáncer de células pulmonares, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer duodenal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vías biliares, cáncer de intestino, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de testículo, cáncer de riñón, cáncer de
25 vejiga, cáncer de próstata, cáncer de piel, melanoma maligno, tumor cerebral, sarcoma óseo y cáncer de sangre. Entre otras, se utilizan preferiblemente células derivadas de tejidos no cancerosos o cancerosos en individuos con cánceres endodérmicos del estómago, mama, colon e intestino.
En el procedimiento de producción descrito en la presente memoria, las células recogidas de mamíferos también se
30 pueden utilizar como las células de mamífero mencionadas anteriormente. Las células cosechadas a partir de mamíferos pueden utilizarse inmediatamente o pueden utilizarse después de almacenarse y cultivarse por métodos conocidos. En el caso del cultivo, el número de pases no está particularmente limitado, pero se prefieren las células de un cultivo primario a un cultivo de cuarto pase, siendo particularmente preferido el uso de células de un cultivo primario a un cultivo de segundo pase. El cultivo primario según se utiliza en la presente memoria significa un cultivo
35 que sigue inmediatamente a una cosecha de células de mamíferos y un cultivo de un pase del cultivo primario da como resultado un cultivo de segundo pase y un cultivo de más pases da como resultado un cultivo de tercer pase.
La etapa de inducción de una célula de mamífero a una célula madre hepática inducida en el procedimiento de producción descrito en la presente memoria debe ser un paso en el que la célula de mamífero llegue a tal estado
40 que los productos genéticos del gen POU5F1, gen KLF4 y gen SOX2 sean necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida estará presente para asegurar que la abundancia relativa intracelular del producto génico del gen POU5F1 sea mayor que la del producto génico del gen SOX2. El término "llevar la célula de mamífero a tal estado" es un concepto amplio que incluye no solo el caso de ajustar la célula para tener dicho estado sino también el caso de seleccionar una célula que ha llegado a tal estado y acondicionar la misma.
45 El procedimiento de producción descrito en la presente memoria también requiere que los productos génicos de esos genes estén presentes en proporciones especificadas dentro de la célula de mamífero cuando se induce para que dé lugar a la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria. Si se aplica esta condición, los genes marcadores para la célula madre embrionaria del apartado (1) anterior que son endógenos a la célula de
50 mamífero se expresan, dando lugar finalmente a la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria.
En el procedimiento de producción descrito en la presente memoria, las abundancias relativas intracelulares de los productos genéticos del gen POU5F1, gen KLF4 y gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida anterior pueden satisfacer la relación del gen POU5F1 > gen KLF4 > gen SOX2 y, desde el punto
55 de vista de la inducción altamente eficaz a la célula madre hepática inducida, las abundancias relativas intracelulares del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 se pueden ajustar a la razón 4:2:1 en ese orden.
En el procedimiento de producción descrito en la presente memoria, la célula de mamífero anterior es suficiente para causar un estado tal que los productos genéticos del gen POU5F1, gen KLF4 y gen SOX2 que son necesarios para
60 la inducción a la célula madre hepática inducida estarán presentes para asegurar que la abundancia relativa intracelular del producto génico del gen POU5F1 es mayor que la del producto génico del gen SOX2; los métodos para hacer esto se ilustran pero no se limitan a los que se conocen como técnicas de inducción para dar lugar a células madre pluripotentes inducidas.
Los métodos ilustrativos que pueden emplearse incluyen un método en el que los genes capaces de elevar la intensidad de expresión del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción de la célula madre hepática inducida anterior se introducen en la célula de mamífero anterior, con lo que estos genes se expresan fuertemente para que los productos genéticos previstos se produzcan en la célula, así como un método en 5 el que las proteínas, el ARNm o similares que son productos génicos de los genes capaces de elevar la intensidad de expresión de los genes identificados anteriormente se introducen en la célula de mamífero anterior. Cuando sea necesario, las cantidades de vectores o genes que se introducirán en la célula de mamífero anterior, las cantidades de productos génicos que se deben añadir a los medios y otros factores se pueden ajustar para asegurar que la abundancia relativa intracelular del producto génico del gen POU5F1 sea mayor que la del producto génico del gen
En el procedimiento de producción descrito en la presente memoria, los genes que se pueden utilizar para elevar la intensidad de expresión del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción de la célula madre hepática inducida anterior son el gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 per se. Si el gen POUF1, el 15 gen KLF4 o el gen SOX2 mencionados anteriormente se expresan solo en cantidad insuficiente en la célula de mamífero anterior, el gen o producto génico insuficientes se pueden introducir en la misma célula, y si el gen POU5F1, el gen KLF4 o el gen SOX2 mencionado anteriormente se expresan en la célula anterior, se puede introducir otro gen o un producto del mismo en lugar del gen POU5F1, el gen KLF4 o el gen SOX2 mencionado anteriormente. Los genes que pueden utilizarse como tales otros genes son aquellos que se sabe que inducen las 20 células madre pluripotentes inducidas y pueden ser ilustrados por el gen NANOG, el gen LIN28, el gen TBX3, el gen PRDM14, el gen L-MYC, el gen c-MYC, el gen N-MYC, el gen SALL1, el gen SALL4, el gen UTF1, el gen ESRRB, el gen NR5A2, el gen REM2 GTPasa, el gen TCL-1A, el gen de la proteína asociada a Yes (YAP), el gen de Ecadherina, el gen mutante negativo dominante p53, el gen p53shRNA etc. Los genes capaces de elevar la intensidad de expresión del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción de la
25 célula madre hepática inducida anteriormente pueden utilizarse independientemente o combinando dos o más tipos.
El gen POUF1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida anterior pueden utilizarse combinados con genes que son sustitutos de estos genes.
30 Por ejemplo, en el caso en que una célula que expresa fuertemente el gen POU5F1, el gen KLF4, el gen c-MYC o el gen SOX2, la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria puede inducirse sin utilizar el gen POU5F1, el gen KLF4, el gen c-MYC, o el gen SOX2 pero utilizando el gen mutante negativo dominante p53, el gen p53shRNA, etc. combinados.
35 Los métodos mediante los cuales las proteínas, los ARNm o similares que son productos genéticos del gen POU5F1, gen KLF4 y gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida anterior o genes que son sustitutos de estos genes pueden introducirse en la célula de mamífero anterior incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se conocen como técnicas de inducción para dar lugar a células madre pluripotentes inducidas. Por ejemplo, se pueden añadir a los medios las proteínas, los ARNm o similares que son productos
40 génicos de estos genes.
En el procedimiento de producción descrito en la presente memoria, para aumentar la eficacia de la inducción a la célula madre hepática inducida, los compuestos que se sabe que inducen células madre pluripotentes inducidas pueden añadirse adicionalmente a los medios utilizados para inducir la célula madre hepática inducida descrita en la 45 presente memoria, y estos compuestos están ilustrados por inhibidores que incluyen: tres inhibidores de bajo peso molecular de tirosina quinasa de tipo receptor de FGF, MEK (proteína quinasa activada por mitógeno)/ERK (quinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2), y GSK (Glicógeno Sintasa Quinasa) 3 [SU5402, PD184352 y CHIR99021], dos inhibidores de bajo peso molecular de la vía MEK/ERK y GSK3 [PD0325901 y CHIR99021], un compuesto de bajo peso molecular como inhibidor de la enzima de metilación de histonas G9a [BIX-01294 (BIX)],
50 azacitidina, tricostatina A (TSA), 7-hidroxiflavona, etilamida del ácido lisérgico, kenpaulona, un inhibidor de quinasa del receptor I de TGF-β/quinasa tipo activina 5 (ALK5) [EMD 616452], inhibidores de quinasa del receptor 1 de TGFβ (TGFBR1) [E-616452 y E-616451], un inhibidor de la quinasa de la familia Src [EI-275], tiazovivina, PD0325901, CHIR99021, SU5402, PD184352, SB431542, anticuerpo neutralizante anti-TGF-β, A-83-01, Nr5a2, un compuesto inhibidor de p53, ARNip contra p53 y un inhibidor de la ruta de p53, etc.
55 También es posible utilizar un microARN para aumentar la eficiencia de la inducción a la célula madre hepática inducida. Específicamente, se pueden llevar a cabo métodos comunes para el experto en la técnica, por ejemplo introduciendo un microARN en la célula de mamífero anterior con un vector o añadiendo un microARN al medio.
60 Los ejemplos del microARN que se pueden utilizar para aumentar la eficacia de la inducción a la célula madre hepática inducida incluyen miR-154, miR-200, miR-368, miR-371, miR-291-3p, miR-294, miR-295, miR-302, etc. Si se utiliza una célula humana como célula de mamífero, se puede utilizar un microARN humano. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a, hsa-miR-372 [MI0000780], hsa-miR-373 [MI0000781], hsa-miR-302b [MI0000772], hsa-miR-302c [MI0000773], hsa-miR-302a [MI0000738], hsa-miR-302d [MI0000774], hsa-miR-367 [MI0000775] y hsa-miR-520 [MI0003158]. Estos microARN se pueden utilizar de forma independiente o combinando dos o más tipos.
Se puede acceder a la información sobre estos microRNAs desde el sitio web de miRBase (http://www.mirbase.org/). 5 En cada designación, un número de acceso miRBase está entre paréntesis y el símbolo hsa-representa humano.
La etapa de inducir la célula de mamífero anterior a una célula madre hepática inducida puede implicar el uso de diversos inhibidores o anticuerpos que inhibirán o neutralizarán la actividad de TGF-beta y similares, factores de crecimiento de fibroblastos tales como FGF1-FGF21 y similares, que se van a agregar al medio para cultivar la
10 célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria. Los factores de crecimiento de fibroblastos que se pueden utilizar son FGF1, FGF2, FGF4 y FGF7. Los ejemplos de inhibidores de TGF-beta incluyen inhibidores de señalización de TGF-beta tales como un inhibidor de ALK (p.ej., A-83-01), un inhibidor de TGF-beta RI y un inhibidor de TGF-beta RI quinasa.
15 Estos componentes se añaden preferiblemente al medio para utilizar en la etapa de inducir la célula de mamífero anterior a una célula madre hepática inducida.
La etapa mencionada anteriormente para la inducción a una célula madre hepática inducida puede ser tal que ésta utilice el gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática 20 inducida o productos génicos de estos genes, y que la razón de uso del gen POUF1 o un producto génico de este gen con respecto al gen SOX2 o un producto génico de este gen es mayor que uno. La razón de uso entre el gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida o entre productos génicos de estos genes puede satisfacer la razón de gen POU5F1 > gen KLF4 > gen SOX2, y desde el punto de vista de inducción altamente eficaz para la célula madre hepática inducida, la razón de uso entre
25 el gen POUF1, el gen KLF4 y el gen SOX2 o entre los productos génicos de estos genes puede ser 4:2:1 en ese orden. Los símbolos génicos para el gen POU5F1 (OCT3/4), el gen KLF4 y el gen SOX2, así como los números de acceso de Genbank correspondientes se proporcionan en la Tabla 4.
[Tabla 4]
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank
- KLF4
- NM_004235
- POU5F1
- NM_002701
- SOX2
- NM_003106
30 Si se utilizan el gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida anteriormente en el procedimiento de producción descrito en la presente memoria, se pueden utilizar métodos comunes para el experto en la técnica, por ejemplo introduciendo estos genes en la célula de mamífero anterior con la ayuda de vectores de expresión. Si se utilizan productos génicos tales como proteínas o ARNm del gen POU5F1, gen KLF4 y gen SOX2 anteriores que son necesarios para la inducción a la célula madre
35 hepática inducida, se pueden utilizar métodos comunes para el experto en la técnica, por ejemplo mediante la adición de los productos génicos al medio utilizado para la inducción.
Como se describió anteriormente, además del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida anterior, así como sus productos génicos, los siguientes que se han 40 indicado anteriormente pueden utilizarse típicamente para mejorar la eficacia de la inducción a la célula madre hepática inducida anterior: genes tales como el gen NANOG, el gen LIN28, el gen TBX3, el gen PRDM14, el gen L-MYC, el gen c-MYC, el gen N-MYC, el gen SALL1, el gen SALL4, el gen UTF1, el gen ESRRB, el gen NR5A2, el gen REM2 GTPasa, el gen TCL-1A, el gen de la proteína asociada a Yes (YAP), el gen de E-cadherina, el gen mutante negativo dominante p53, el gen p53shRNA, así como productos génicos y compuestos de los mismos; factores de
45 crecimiento de fibroblastos tales como FGF1 a FGF12; así como el inhibidor de ALK (p.ej., A-83-01), el inhibidor de TGF-beta RI y el inhibidor de quinasa TGF-beta RI.
Para producir células madre hepáticas inducidas a partir de la célula de mamífero anterior, los genes pueden introducirse en la célula de mamífero anterior por cualquier método conocido sin ninguna limitación concreta, y los
50 vectores que pueden utilizarse incluyen vectores virales, plásmidos, cromosomas artificiales (HAC), vectores episomales (EBV), vectores minicirculares, vectores de expresión policistrónicos, vectores como una aplicación del sistema Cre/loxP, vectores que utilizan una integrasa de fago y un transposón tal como un piggyback.
Los vectores virales que pueden utilizarse para introducir genes en la célula de mamífero anterior pueden ser de
55 cualquier tipo conocido. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vectores lentivirales, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores del virus de la inmunodeficiencia de simios (DNAVC Corporation), vectores virales adenoasociados (DNAVC Corporation), vectores del virus Sendai que no tienen genes exógenos residuales en el genoma (DNAVC Corporation, y MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.), minivectores Sendai (DNAVC Corporation) y HVJ. Los vectores retrovirales incluyen vectores retrovirales derivados de la leucemia murina de Moloney.
5 Los plásmidos vectoriales virales que se pueden utilizar pueden ser de cualquier tipo conocido de plásmidos virales de vectores. Por ejemplo, como plásmidos vectores retrovirales, se prefieren pMXs, pMXs-IB, pMXs-puro y pMXsneo (siendo pMXs-IB el mismo vector que pMXs-puro excepto que porta un gen de resistencia a blasticidina en lugar del gen de resistencia a puromicina) [Toshio Kitamura et. al., "Retrovirus-mediated gene transfer and expression
10 cloning: Powerful tools in functional genomics", Experimental Hematology, 2003, 31(11):1007-14], y otros ejemplos incluyen MFG [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733-6737 (1995)], pBabePuro [Nucleic Acids Research, 18, 35873596 (1990)], LL-CG, CL-CG, CS-CG, CLG [Journal of Virology, 72, 8150-8157 (1998)], etc. Adenoviral vector plasmids incluyen pAdex1 [Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821 (1995)], etc.
15 Los medios que pueden utilizarse en la etapa de inducción de la célula de mamífero anterior a células madre hepáticas inducidas no se limitan a ningún tipo concreto, siempre que permitan el cultivo de células madre embrionarias, células madre pluripotentes, y similares, pero el cultivo se puede realizar utilizando medios adecuados para cultivar células madre embrionarias, células madre pluripotentes, y similares. Los ejemplos de tales medios incluyen, pero no están limitados a, un medio ES, un medio ES acondicionado con MEF, un medio óptimo para
20 células iPS, un medio óptimo para células alimentadoras, StemPro (marca registrada) hESC SFM, mTeSR1, un medio libre de suero libre de proteína animal para el mantenimiento de células ES/iPS humanas, denominado TeSR2 [ST-05860], un medio para células ES/iPS de primates, ReproStem y ReproFF. Para células humanas, se utilizan preferiblemente medios adecuados para cultivar células madre embrionarias humanas.
25 Si la célula derivada no es un fibroblasto, por ejemplo, en caso de utilizar una célula epitelial tal como una derivada de un paciente con cáncer de estómago o colon, preferiblemente se co-cultiva con una célula alimentadora después de la transferencia génica.
Un tercer aspecto descrito en la presente memoria se refiere a un método de prueba caracterizado por el uso de la
30 célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria. El método de prueba descrito en la presente memoria puede utilizarse ventajosamente como un método de prueba de seguridad, un método de prueba de toxicidad, un método de prueba de metabolismo, un método de prueba de interacción con fármacos, un método de prueba de actividad antiviral o un método de prueba de detección para productos farmacéuticos tales como agentes terapéuticos hiperlipidémicos, agentes terapéuticos para la hipertensión, medicamentos de compuestos de bajo peso
35 molecular y medicamentos de anticuerpos.
En un método de prueba de interacción de fármacos ilustrativo que utiliza la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria, las células madre hepáticas inducidas humanas se preparan a partir de donantes de diferentes razas, sexos, edades, antecedentes genéticos (p.ej., polimorfismos), etc., se cultivan con un compuesto 40 candidato farmacéutico, y se examina la expresión de genes para diversas enzimas en las subfamilias del citocromo P450 (CYP) en estas células utilizando micromatrices de ADN (KURABO INDUSTRIES LTD.) o un GenomeLabTM GeXP (Beckman Coulter, Inc.) expresador de genes multifuncional para revelar así la interacción entre cada una de las enzimas de la subfamilia del citocromo P450 (CYP) y el compuesto candidato farmacéutico probado. La interacción entre una enzima de la subfamilia del citocromo P450 (CYP) y un compuesto candidato farmacéutico
45 también puede examinarse mediante un método para utilizar un sustrato que produce un producto fluorescente después de que se metaboliza por una enzima del citocromo P450.
Las enzimas del citocromo P450 son catalizadores importantes que metabolizan oxidativamente una amplia gama de sustancias químicas hidrófobas y dado que el metabolismo de estas enzimas está involucrado en el aclaramiento,
50 la toxicidad y la activación del fármaco, se sabe que tienen una influencia potencial sobre las interacciones dañinas entre fármacos. Por lo tanto, el desarrollo de productos terapéuticos de bajo peso molecular y similares requiere un estudio detallado de la interacción enzima-fármaco.
En un método de prueba de actividad antiviral ilustrativo que utiliza la célula madre hepática inducida descrita en la
55 presente memoria, un medio de cultivo en el que la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria está siendo cultivada se infecta con virus de hepatitis A, B o C añadidos y a continuación se añade un compuesto farmacéutico candidato para un medicamento antiviral para evaluar su eficacia.
En un método de prueba de escrutinio terapéutico hiperlipidémico ilustrativo que utiliza la célula madre hepática
60 inducida descrita en la presente memoria, se añade un compuesto candidato terapéutico hiperlipidémico a una placa en la que se cultiva la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria y después de cultivo continuo, las lipoproteínas y lípidos secretados al sobrenadante del cultivo se analizan para evaluar la eficacia del compuesto candidato terapéutico hiperlipidémico añadido.
En un método de prueba ilustrativo para analizar las lipoproteínas y lípidos secretados en el sobrenadante del cultivo, proteínas como CM (quilomicrones), VLDL (lipoproteína de muy baja densidad), LDL (lipoproteína de baja densidad) y HDL (lipoproteína de alta densidad), así como lípidos tales como FC (colesterol libre), PL (fosfolípidos) y TC (colesterol total) se analizan mediante HPLC por penetración en gel (LipoSEARCH; Skylight Biotech, Inc.)
5 Las mediciones también son posibles por los métodos descritos en Usui S, Hara Y, Hosaki S, Okazaki M, "A new online dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC",
J. Lipid Res., 2002;43:805-14, y Mitsuyo Okazaki, Shinichi Usui, Masato Ishigami, Naohiko Sakai, Tadashi Nakamura, Yuji Matsuzawa, Shizuya Yamashita, "Identification of Unique Lipoprotein Subclasses for Visceral Obesity
10 by Component Analysis of Cholesterol Profile in High-Performance Liquid Chromatography", Arterioscler Thromb Vasc Biol. March 2005.
Un cuarto aspecto descrito en la presente memoria se refiere a un método de escrutinio de dianas en el descubrimiento de fármacos que se caracteriza por el uso de la célula madre hepática inducida descrita en la
15 presente memoria.
Un quinto aspecto descrito en la presente memoria se refiere a un método para la preparación de modelos animales que se caracteriza por utilizar la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria.
20 Un sexto aspecto descrito en la presente memoria se refiere a un método para la producción de proteínas producidas por hepatocitos que se caracteriza por el uso de la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria.
La célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria tiene propiedades de un hepatocito, por lo que
25 puede producir proteínas características de diversos hepatocitos. Por lo tanto, un método ilustrativo de acuerdo con el sexto aspecto descrito en la presente memoria comprende cultivar una célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria que produce una proteína específica para un hepatocito particular y que produce una proteína característica de ese hepatocito.
30 Un séptimo aspecto descrito en la presente memoria se refiere a un método terapéutico dirigido a mamíferos que se caracteriza por el uso de la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria.
En el método terapéutico descrito en la presente memoria, la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria como inducida a partir de una célula de mamífero puede trasplantarse en el hígado del mamífero. Por
35 ejemplo, la célula madre hepática inducida descrita en la presente memoria como inducida a partir de una célula canina puede trasplantarse en el hígado del perro.
La presente invención se ilustra más específicamente por medio de los siguientes ejemplos, pero debe entenderse que el alcance de la presente invención no está de ningún modo limitado por esos ejemplos.
45 Se introdujeron tres plásmidos vectores retrovirales para tres genes, POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs y SOX2-pMXs, en células de empaquetamiento para preparar un vector retroviral pantrópico, células Plat-GP, utilizando Fugene HD (Roche; Cat. No. 4709691) para de este modo preparar una solución de vector retroviral. Los plásmidos vectores POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, y SOX2-pMXs se utilizaron a una razón de 4:2:1 en ese orden. La razón de 4:2:1 se puede lograr cuando los genes se introducen en células de empaquetamiento o se puede lograr preparando
50 soluciones de vectores retrovirales separadas para POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, y SOX2-pMXs, y mezclando estas soluciones a una razón de 4:2:1 en ese orden. Los detalles del procedimiento son los que se describen a continuación.
Los vectores POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs y SOX2-pMXs fueron suministrados por Addgene (Tabla 5 siguiente).
Las cantidades de los respectivos vectores fueron las siguientes: 2 μg de POU5F1-pMXs (Addgene), 1 μg de KLF4
60 pMXs (Addgene), 0,5 μg de SOX2-pMXs (Addgene), 0,5 μg de Venus-pCS2 (Nagai T et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol 2002; 20: 87-90), 2 μg de VSV-G-pCMV (Cell Biolab) y 18 μL de FuGENE HD (Roche).
Los vectores POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, y SOX2-pMXs fueron los vectores construidos (Tabla 5).
5 Las cantidades de los vectores respectivos fueron las siguientes: 5 μg de POU5F1-pMX, 2,5 μg de KLF4-pMX, 1,25 μg de SOX2-pMX, 1,25 μg de Venus-pCS2, 5 μg de VSV-G-pCMV, 1,25 μg de GFP-pMXs (Cell Biolab) y 45 μL de FuGENE HD.
10 <Preparación de una solución de vector retroviral para introducir genes en células derivadas de tejidos no cancerosos de paciente con cáncer de estómago>
Los vectores POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, y SOX2-pMXs fueron los vectores construidos (Tabla 5).
15 Las cantidades de los vectores respectivos fueron las siguientes: 5 μg de POU5F1-pMX, 2,5 μg de KLF4-pMX, 1,25 μg de SOX2-pMX, 1,25 μg de Venus-pCS2, 5 μg de VSV-G-pCMV, 1,25 μg de GFP-pMXs, y 45 μL de FuGENE HD.
20 Los vectores POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, y SOX2-pMXs fueron los vectores construidos (Tabla 5).
Las cantidades de los vectores respectivos fueron las siguientes: 5 μg de POU5F1-pMX, 2,5 μg de KLF4-pMX, 1,25 μg de SOX2-pMX, 1,25 μg de Venus-pCS2, 5 μg de VSV-G-pCMV, 1,25 μg de GFP-pMXs, y 45 μL de FuGENE HD. 25
Los vectores POU5F1-pMXs, KLF4-pMXs, y SOX2-pMXs fueron los vectores construidos (Tabla 5).
30 Las cantidades de los vectores respectivos fueron las siguientes: 5 μg de POU5F1-pMX, 2,5 μg de KLF4-pMX, 1,25 μg de SOX2-pMX, 1,25 μg de Venus-pCS2, 5 μg de VSV-G-pCMV, 1,25 μg de GFP-pMXs, y 45 μL de FuGENE HD.
Las células Plat-GP en las que se habían introducido los plásmidos del vector retroviral se cultivaron durante al
35 menos 48 horas; después de eso, el sobrenadante se recolectó tres veces cada 24 horas, y la filtración se realizó utilizando la unidad Steriflip-HV Filter (filtro de tamaño de poro 0,45 μm, Millipore, Núm. Cat SE1M003M00). El procedimiento mencionado anteriormente produjo una solución de vector retroviral pantrópico que contenía los tres genes (POU5F1, KLF4 y SOX2 a una razón de 4:2:1 en ese orden). El vector retroviral pantrópico, que permite la transfección génica a varias células, también introdujo eficazmente los genes en las células humanas.
40 [Tabla 5]
- Detalles de plásmidos vectoriales retrovirales construidos y los distribuidos por Addgene
- Gen
- NCBI No. Vector 5' enzima de restricción 3' enzima de restricción Identificación del clon Proveedor
- POU5F1 humano
- BC117435 pMXs EcoRI EcoRI 40125986 Abra Biosystems
- KLF4 humano
- BC029923 pMXs EcoRI EcoRI 5111134 Abra Biosystems
- SOX2 humano
- BC013923 pMXs EcoRI XhoI 2823424 Abra Biosystems
- POU5F1 humano
- RT-PCR y clonación pMXs EcoR1 EcoR1 17217 Addgene
- KLF4 humano
- RT-PCR y clonación pMXs attB1 attB2 17219 Addgene
- SOX2 humano
- RT-PCR y clonación pMXs attB1 attB2 17218 Addgene
Ejemplo 2 2. Preparación de células madre hepáticas humanas inducidas a partir de células derivadas de tejidoscutáneos neonatales
Las células madre hepáticas humanas inducidas se prepararon a partir de células derivadas de tejidos cutáneos 5 humanos neonatales que son tejidos posparto (nombre comercial: fibroblastos de piel humana neonatal normal, cultivo primario, Núm. de lote 7F3956).
Un vial de células crioconservadas derivadas de tejidos cutáneos humana neonatal (cultivo primario; Lonza; CC2511; Núm. de Lote 7F3956) se descongeló en un baño de agua a 37°C y se suspendió en un medio D-MEM (alto 10 contenido de glucosa) (Invitrogen; Núm. Cat. 11965-092) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-062) y FBS al 10% para obtener de este modo 10 mL de una suspensión celular.
A continuación, la suspensión celular obtenida se centrifugó a 1000 rpm a 4°C durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante y, a continuación, las células restantes se resuspendieron en 12 mL de Fibroblast Growth Medium Kit
15 2 (2% FBS) (en lo sucesivo denominado FGM-2 BulletKit™) (Lonza; Núm. Cat. CC-3132) para obtener de este modo una suspensión celular. La suspensión celular obtenida se añadió a un volumen de 2 mL por pocillo en una placa de plástico de 6 pocillos (Nunc; Núm. Cat. 140675) cuyos fondos de los pocillos se habían recubierto con matrigel (Becton, Dickinson; Núm. Cat. 356230) en una concentración de 20 μg/cm2 durante al menos 30 minutos, durante los cuales se sembraron las células.
20 Después de 3 días, se retiró el medio y se añadió una solución de vector retroviral que contenía los tres genes (POU5F1, KLF4 y SOX2 a una proporción de 4:2:1 en ese orden) en un volumen de 2 mL por pocillo para permitir que prosiguiera la infección a 37°C durante 24 horas. Después de la eliminación del sobrenadante viral, se añadió FGM-2 BulletKit en un volumen de 2 mL por pocillo y las células se cultivaron a 37°C durante un día. A continuación,
25 un medio ES acondicionado con MEF se reemplazó repetidamente cada dos días, y un medio ES se reemplazó los días 12, 14 y 17 después de la introducción de los tres genes. Las formulaciones del medio ES acondicionado con MEF y del medio ES utilizados fueron las siguientes.
30
MEF
Fibroblastos embrionarios de ratón primarios tratados con Mitomicina C [DS Pharma Biomedical] Núm. Cat. R-PMEF-CF 35
Knockout D-MEM (Invitrogen; Núm. Cat. 10829-018), 500 mL Knockout Serum Replacement al 20% (Invitrogen; Núm. Cat. 10828-028)
40 50 μg/ml de gentamicina (Invitrogen; Núm. Cat. 15750-060) 1 X Solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen; Núm. Cat. 11140-050) 10 ng/mL de bFGF (PeproTech; Núm. Cat. 100-18B) 2-Mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma-Aldrich; Núm. de Cat. M7154) GlutaMAX 2 mM o L-glutamina 2 mM
45
Knockout D-MEM (Invitrogen; Núm. Cat. 10829-018), 500 mL Knockout Serum Replacement al 20% (Invitrogen; Núm. Cat. 10828-028)
50 50 μg/ml de gentamicina (Invitrogen; Núm. Cat. 15750-060) 1X Solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen; Núm. Cat. 11140-050) 10 ng/mL de bFGF (PeproTech; Núm. Cat. 100-18B) 103 U/mL de LIF humano recombinante (Wako Pure Chemical; Núm. Cat. 129-05601) 2-Mercaptoetanol 0.1 mM (Sigma-Aldrich; Núm. de Cat. M7154)
55 Inhibidor de ALK5 0.5 μM (A-83-01) (Sigma-Aldrich; Núm. Cat. A5480) PD0325901 0,5 μM (Axon Medchem; Núm. Cat. 1408) CHIR99021 3 μM (Axon Medchem; Núm. Cat. 1386)
Desde 18 días después de la transfección génica, se reemplazó un medio de mantenimiento sin células
60 alimentadoras para células ES/iPS humanas, mTeSR1 (STEMCELL Technologies; Núm. Cat. 05850) cada día. Treinta días después de la transfección génica, se recogió un clon de una colonia celular (NFB1-3) con fórceps y se transfirió a células alimentadoras. Debe observarse que las células alimentadoras, que eran fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical, Núm. Cat. R-PMEF-CF), se habían sembrado en una placa de 24 pocillos recubierta con gelatina (Iwaki; Núm. Cat. 11-020-012) a 5,0×104 células/cm2 el
día antes de la recogida de las células madre hepáticas inducidas.
A continuación se enumeran los números de pases (p) de células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos cutáneos neonatales, y los días en que se sometieron a cultivo de pases y se lisaron en un tampón para un 5 kit de recogida de ARN.
<Células madre hepáticas humanasinducidas derivadasde tejidos cutáneos neonatales>
10 Día 52: 24 pocillos (p1) → 6 pocillos (p2) Día 55: 6 pocillos (p2) → 10 cm (p3) Día 61: Pase (p4) Día 62: Tratamiento con un tampón RLT (solución para lisar células antes de la purificación del ARN) (p5)
15
Ejemplo 3
20 Las células se aislaron de tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de estómago (progresivo). A las células obtenidas, se les añadió una solución de vector retroviral que contenía los tres genes (POU5F1, KLF4 y SOX2 a una razón de 4:2:1 en ese orden) para la transfección génica para preparar de este modo células madre hepáticas humanas inducidas. Los detalles del procedimiento son los que se describen a continuación.
25 Parte de los tejidos frescos de cáncer de estómago obtenidos durante la operación (de un paciente japonés de 67 años de edad con cáncer desarrollado) se lavó con solución salina equilibrada de Hank (sin Rojo Fenol) (Invitrogen; Núm. Cat. 14175-095) y se desmenuzó con tijeras en piezas de aproximadamente 1 mm2. Las piezas se lavaron adicionalmente con solución salina equilibrada de Hank (libre de fenol rojo) hasta que se obtuvo un sobrenadante
30 transparente. Después de la eliminación del sobrenadante, se añadieron al precipitado de tejido 5 mL de una mezcla de colagenasa al 0,01% (Wako Pure Chemical; Núm. de Cat. 034-10533) y 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-062). la agitación se realizó a 37°C durante 60 minutos con un agitador.
Después de que se confirmó que el precipitado de tejido se había digerido por completo, se añadieron 35 mL de un
35 medio D-MEM (alto contenido de glucosa) (Invitrogen; Núm. Cat. 11965-092) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al 10%, que a continuación se centrifugó a 1000 rpm a 4°C durante 5 minutos. A continuación, después de la eliminación del sobrenadante, se añadieron 40 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) (Invitrogen; Núm. Cat. 11965-092) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al 10%, que luego se centrifugó nuevamente a 1000 rpm a 4°C durante 5 minutos. A continuación, después de la eliminación del
40 sobrenadante, se añadieron 10 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al 10%, que luego se sembró en una placa recubierta de colágeno (60 mm) (Iwaki; Núm. Cat. 11-018-004).
Después de 24 horas, se retiró el medio, se añadieron 5 mL de una solución de vector retroviral que contenía los
45 tres genes, y se infectaron a 37°C durante un día. Se retiró el sobrenadante viral y se suspendieron los fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical; Núm. Cat. R-PMEF-CF) a una densidad de 5,0 x 104 células/cm2 en 5 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-062) y FBS al 10%; a continuación, se sembró una placa recubierta de colágeno (60 mm) (Iwaki; Núm. Cat. 11-018-004) en la que se habían cultivado las células
50 transfectadas derivadas de los tejidos cancerosos del paciente con cáncer de estómago, y se llevó a cabo el cocultivo.
Posteriormente, el medio ES acondicionado MEF se reemplazó repetidamente cada tres días, y desde 15 días después de la transfección génica, se reemplazó diariamente un medio de mantenimiento sin células alimentadoras 55 para células ES/iPS humanas, mTeSR1 (STEMCELL Technologies; Núm. Cat. 05850).
Veinticinco días después de la introducción de los tres genes, se recogió un clon de una colonia de células madre hepáticas inducida (GC1-2) y se sometió a cultivo de pases en fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina en una placa de 24 pocillos recubierta de gelatina. Debe observarse que las células alimentadoras, que
60 eran fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical, Núm. Cat. R-PMEF-CF), se habían sembrado en una placa de 24 pocillos recubierta con gelatina (Iwaki; Núm. Cat. 11-020-012) a 5,0 × 104 células/cm2 el día antes de la recolección de células madre hepáticas inducidas.
A continuación se enumeran los números de pases (p) de células madre hepáticas humanas derivadas de tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de estómago, y los días en que se sometieron a cultivo de pases y se lisaron en un tampón para un kit de recolección de ARN.
<Células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de5 estómago>
GC1-2
Día 37: 24 pocillos (p1) → 6 pocillos (p2)
10 Día 43: 6 pocillos (p2) → 10 cm (p3) Día 56: Pase (p4) Día 57: Pase y reserva (p5) Día 60: Tratamiento con un tampón RLT (solución para lisar células antes de la purificación del ARN)
15 Ejemplo 4
20 A las células derivadas de tejidos no cancerosos de un paciente con cáncer de estómago, se les añadieron una solución de vector retroviral que contenía los tres genes (POU5F1, KLF4 y SOX2 a una razón de 4:2:1 en ese orden) para la transfección génica para preparar células madre hepáticas humanas inducidas. Los detalles del procedimiento son los que se describen a continuación.
25 Parte de los tejidos frescos no cancerígenos obtenidos de un paciente con cáncer de estómago durante la operación (un paciente japonés de 67 años con cáncer progresivo) se lavó con solución salina equilibrada de Hank (sin Rojo Fenol) (Invitrogen; Núm. Cat. 14175-095) y se desmenuzó con tijeras en piezas de aproximadamente 1 mm2. Las piezas se lavaron con solución salina equilibrada de Hank (libre de Rojo Fenol) hasta que se obtuvo un sobrenadante transparente. Después de eso, se retiró el sobrenadante, se añadieron 5 mL de una mezcla de
30 colagenasa al 0,1% (Wako Pure Chemical; Núm. Cat. 034-10533) y 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-062) al precipitado de tejido, y la agitación se realizó a 37°C durante 60 minutos con un agitador.
Después de que se confirmó que el precipitado de tejido se había digerido por completo, se añadieron 35 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) (Invitrogen; Núm. Cat. 11965-092) con un suplemento de 1X 35 antibiótico/antimicótico y FBS al 10%, que a continuación se centrifugó a 1000 rpm a 4°C durante 5 horas. A continuación, después de la eliminación del sobrenadante, se añadieron 40 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al 10%, que luego se centrifugó nuevamente a 1000 rpm a 4°C durante 5 horas. Además, después de la eliminación del sobrenadante, se añadieron 10 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) (Invitrogen; Núm. Cat. 11965-092) con un suplemento de 1X
40 antibiótico/antimicótico y FBS al 10%, que a continuación se sembró en una placa recubierta con colágeno (60 mm) (Iwaki; Núm. Cat. 11-018-004).
Después de 24 horas, se retiró el medio, se añadieron 5 mL de una solución de vector retroviral que contenía los tres genes (POU5F1, KLF4 y SOX2 a una razón de 4:2:1 en ese orden), y se infectó a 37°C durante 45 aproximadamente 24 horas. Se eliminó el sobrenadante viral y se suspendieron los fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical; Núm. Cat. R-PMEF-CF) a una densidad de 5,0 x 104 células/cm2 en 5 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-062) y FBS al 10%, que luego se sembró en una placa recubierta con colágeno (60 mm) sobre la que se habían cultivado las células transfectadas derivadas de los tejidos
50 no cancerosos del paciente con cáncer de estómago, y se realizó el co-cultivo.
A partir de ese momento, se reemplazó repetidamente un medio de ES acondicionado con MEF cada tres días, y 31 días después de la introducción de los tres genes, se reemplazó mTeSR1 todos los días. Cuarenta y seis días después de la transfección génica, se recogió un clon de una colonia celular (NGC1-2) y se sometió a cultivo de
55 pases en fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina en una placa de 24 pocillos recubierta de gelatina. Debe observarse que las células alimentadoras, que eran fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical, Núm. Cat. R-PMEF-CF), se habían sembrado en una placa de 24 pocillos recubierta con gelatina (Iwaki; Núm. Cat. 11-020-012) a 5,0 × 104 células/cm2 el día antes de la recolección de células madre hepáticas inducidas.
60 A continuación se enumeran los números de pases (p) de células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos no cancerosos de un paciente con cáncer de estómago, y los días en que se sometieron a cultivo de pases y se lisaron en un tampón para un kit de recolección de ARN.
<Células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos no cancerosos de un paciente concáncer de estómago>
5 Día 52: 24 pocillos (p1) → 6 pocillos (p2) Día 58: 6 pocillos (p2) → 10 cm (p3) Día 65: Pase, reserva y tratamiento con un tampón RLT (solución para lisar células antes de la purificación del ARN) (p4)
10
Ejemplo 5
15 A células derivadas de tejidos de cáncer de nueva aportación de un paciente con cáncer de colon sigmoide, se les añadió una solución de vector retroviral que contenía los tres genes (POU5F1, KLF4 y SOX2 a una razón de 4:2:1 en ese orden) para la transfección génica para preparar células madre hepáticas humanas inducidas. Los detalles del procedimiento son los que se describen a continuación.
20 Parte de los tejidos de cáncer de colon obtenidos durante la operación (de un paciente japonés masculino de 55 años de edad con cáncer de colon sigmoide) se lavó con solución salina equilibrada de Hank (sin Rojo Fenol) (Invitrogen; Núm. Cat. 14175-095) y se trituró con tijeras en piezas de aproximadamente 1 mm2. Las piezas se lavaron con solución salina equilibrada de Hank (libre de Rojo Fenol) hasta que se obtuvo un sobrenadante
25 transparente. Después de eso, se separó el sobrenadante, se añadieron al precipitado de tejido 5 mL de una mezcla de colagenasa al 0,01% (Wako Pure Chemical; Núm. Cat. 034-10533) y 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-062) y la agitación se realizó a 37°C durante 60 minutos con un agitador.
Después de que se confirmó que el precipitado de tejido se había digerido por completo, se añadieron 35 mL de un
30 medio D-MEM (alto contenido de glucosa) (Invitrogen; Núm. Cat. 11965-092) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al 10%, que a continuación se centrifugó a 1000 rpm a 4°C durante 5 minutos. A continuación, después de la eliminación del sobrenadante, se añadieron 40 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al 10%, que luego se centrifugó nuevamente a 1000 rpm a 4°C durante 5 minutos. Después de la eliminación del sobrenadante, se añadieron 10 mL de un medio
35 D-MEM (alto contenido de glucosa) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico y FBS al 10%, que luego se sembró en una placa recubierta con colágeno (100 mm) (Iwaki;. 11-018-006).
Después de 24 horas, se eliminó el medio y se añadieron 10 mL de una solución de vector retroviral que contenía los tres genes. Cinco horas después, se añadieron 5 mL de una solución de vector retroviral Luc-IRES-GFP, y se 40 infectó a 37°C durante aproximadamente 24 horas. Se eliminó el sobrenadante viral y se suspendieron los MEF tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical; Núm. Cat. R-PMEF-CF) a una densidad de 5,0 x 104 células/cm2 en 10 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-092) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-062) y FBS al 10%, que se sembró en una placa recubierta con colágeno (60 mm) sobre la que se cultivaron las células transfectadas derivadas de los tejidos cancerosos del
45 paciente con cáncer de colon, y se realizó el co-cultivo.
Después de eso, el medio ES acondicionado MEF se reemplazó repetidamente cada tres días, y desde 22 días después de la transfección génica, se reemplazó mTeSR1 todos los días. Treinta y un días después de la transfección génica, se recogió un clon de una colonia celular (CC1-4) y se sometió a cultivo de pases en
50 fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical; Núm. Cat. R-PMEF-CF) en una placa de 24 pocillos recubierta de gelatina. Debe observarse que las células alimentadoras, que eran fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical, Núm. Cat. R-PMEF-CF), se habían sembrado en una placa de 24 pocillos recubierta con gelatina (Iwaki; Núm. Cat. 11-020-012) a 5,0 × 104 células/cm2 el día antes de la recolección de células madre hepáticas inducidas.
55 A continuación se enumeran los números de pases (p) de células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de colon, y los días en que se sometieron a cultivo de pases y se lisaron en un tampón para un kit de recogida de ARN.
60 <Células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de colon>
CC1-4
5 Día 59: Pases y reserva (p5) Día 63: Tratamiento con un tampón RLT (solución para lisar células antes de la purificación del ARN) (p5)
Ejemplo 6
Las células madre hepáticas humanas inducidas se prepararon a partir de células derivadas de tejidos cutáneos adultos (nombre del producto: fibroblastos de piel humana adultos normales, cultivo primario, Lonza, Núm. de Lote 15 76582).
Un vial de fibroblastos crioconservados de piel humana adulta normal (cultivo primario; Lonza; Núm. de Lote 76582) se descongeló en un baño de agua a 37°C y se suspendió en un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) (Invitrogen; Núm. Cat. 11965-092) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 1524020 062) y FBS al 10% para obtener de este modo 10 mL de una suspensión celular. A continuación, la suspensión celular obtenida se centrifugó a 1000 rpm a 4°C durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante, y después de eso las células restantes se resuspendieron en 20 mL de FGM-2 BulletKit. La suspensión celular se añadió a un volumen de 10 mL por pocillo en una placa de 100 mm (Nunc; Núm. Cat. 172958) cuyos fondos de pocillos se habían recubierto con matrigel (Becton, Dickinson) a una concentración de 20 μg/cm2 durante al menos 30 minutos, con lo
25 que se sembraron las células.
Después de aproximadamente 24 horas, se eliminó el medio, y se añadieron 10 mL de una solución de vector retroviral que contenía los tres genes, y se infectaron a 37°C durante 24 horas. Se eliminó el sobrenadante viral y se añadieron 10 mL de un medio ES acondicionado con MEF. Posteriormente, el medio ES acondicionado con MEF se 30 reemplazó repetidamente cada tres días, y a partir de los 18 días posteriores a la transfección génica, se reemplazó mTeSR1 (Tecnologías STEMCELL) todos los días. Durante 6 días a partir de los 28 días posteriores a la transfección génica, se reemplazó diariamente el medio ES acondicionado de MEF. A partir de los 34 días posteriores a la transfección génica, mTeSR1 se reemplazó adicionalmente cada día. Treinta y nueve días después de la transfección del gen, se recogió un clon de una colonia celular (AFB1-1) y se sometió a cultivo de pases en
35 fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical; Núm. Cat. R-PMEF-CF) en una placa de 24 pocillos recubierta de gelatina. Debe observarse que las células alimentadoras, que eran fibroblastos embrionarios de ratón tratados con mitomicina (DS Pharma Biomedical, Núm. Cat. R-PMEF-CF), se habían sembrado en una placa de 24 pocillos recubierta con gelatina (Iwaki; Núm. Cat. 11-020-012) a 5,0 × 104 células/cm2 el día antes de la recolección de células madre hepáticas inducidas.
40 A continuación se enumeran los números de pases (p) de células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos cutáneos adultos, y los días en que se sometieron a cultivo de pases y se lisaron en un tampón para un kit de recogida de ARN.
45 <Células madre hepáticas humanasinducidas derivadasde tejidos cutáneos adultos>
Día 50: 24 pocillos (p1) a 6 pocillos (p2)
50 Día 54: 6 pocillos (p2) a 10 cm (p3) Día 59: Pase (p4) Día 63: Pase (p5) Día 67: Pase, reserva y tratamiento con un tampón RLT (solución para lisar células antes de la purificación del ARN) (p5)
55 El cultivo de pases realizado en los Ejemplos 2-6 descritos anteriormente fue como se describe a continuación.
Después de eliminar el medio de las células cultivadas y lavar las células con PBS (-), se añadió una solución de disociación. Después de dejar reposar a 37°C durante 5 minutos, se retiró la solución de disociación, se añadieron 60 20 mL de un medio D-MEM (alto contenido de glucosa) (Invitrogen; Núm. Cat. 11965-092) con un suplemento de 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-062) y FBS al 10% (Invitrogen; Núm. Cat. 26140-079), que luego se centrifugó a 1000 rpm a 4°C durante 5 minutos. A continuación, después de la eliminación del sobrenadante, se añadieron 1X antibiótico/antimicótico (Invitrogen; Núm. Cat. 15240-062), mTeSR, y Y-27632 10 μM, y la suspensión celular se sembró en una placa de 100 mm recubierta de gelatina donde se había sembrado
MEF a 1,.0 × 106 células/placa.
Los siguientes dos tipos de soluciones de disociación se utilizaron para el cultivo de pases:
5 (1) solución de tripsina al 0,25%/ EDTA 1 mM (Invitrogen, Núm. Cat. 25200-056); y
(2) una mezcla que contenía:
10 mL de Colagenasa de 10 mg/mL (Invitrogen; Núm. Cat. 17104-019), 1 mL de una solución de cloruro cálcico de 100 mM,
10 59 mL de PBS, 10 mL de una solución de tripsina al 2,5% (Invitrogen; Núm. Cat. 15090-046), y 20 mL de Knockout Serum Replacement (Invitrogen; Núm. Cat. 10828-028).
Ejemplo 7
15
Las células madre hepáticas humanas inducidas (AFB1-1, NGC1-2) se sometieron a cultivo de pases durante seis
20 meses o más. El medio ilustrativo utilizado incluye mTeSR1 (STEMCELL Technologies/VERITAS), un medio con un suplemento de bFGF para células ES/iPS de primates (ReproCELL), o ReproStem con un suplemento de bFGF (ReproCELL). En el caso en el que se utilizó MEF, se usó una placa de cultivo recubierta con colágeno o gelatina, y en caso de no utilizar MEF, se usó una placa de cultivo recubierta con matrigel. Los resultados muestran que la adición de 0,05-0,5 μM de A-83-01 (inhibidor de señalización de TGF-β, ALK5 quinasa del receptor de TGF-β tipo I,
25 inhibidores de ALK4 y ALK7 del receptor de activina/nodal de tipo I) fue útil para la autorreplicación de células madre hepáticas humanas inducidas, y produjo una tasa de proliferación y una morfología muy satisfactorias.
Ejemplo 8
30 8. Análisis cuantitativo basado en micromatrices de genes marcadores de hepatocitos y genes marcadores de células madre embrionarias
Se analizó la expresión génica de todo el genoma (transcriptoma de ARNm) utilizando el genoma humano completo Oligo DNA Microarray (4X44K) fabricado por Agilent Technologies.
35 <Muestras>
En los Ejemplos 2-6, los ARN totales y los ADN genómicos de células madre hepáticas humanas inducidas (NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1 y CC1-4) preparados en los Ejemplos 2-6 se extrajeron de la soluciones que se habían
40 tratado con un tampón RLT (solución para lisar células antes de la purificación del ARN), utilizando el Mini Kit de ADN/ARN AllPrep (50) (Qiagen; Núm. Cat. 80204).
Los ARN totales de células madre hepáticas humanas inducidas (NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1 y CC1-4) se utilizaron como muestras.
50 Se comprobó la calidad del ARN total en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) utilizando el kit RNA LabChip (marca registrada de Agilent Technologies), y se descubrió que todas las muestras de ARN eran de buena calidad. Las concentraciones y purezas de ARN también se evaluaron utilizando el NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies), y como resultado, se verificó que cada muestra contenía el ARN total en una cantidad requerida para la síntesis de ARNc y a un alto nivel de pureza.
55
De acuerdo con el protocolo de Agilent, el ARNc de doble hebra se sintetizó a partir del ARN total (500 ng) de cada muestra utilizando el kit Quick Amp Labeling (Agilent Technologies). A partir del ADNc preparado, el ARNc se
60 sintetizó mediante transcripción in vitro. Durante la síntesis, el ARNc se marcó con fluorescencia incorporando CTP marcada con cianina (3-CTP Cianina).
Con la ayuda del Kit de hibridación de expresión génica (Agilent Technologies), se añadió el ARNc marcado para la hibridación a un tampón de hibridación para realizar la hibridación durante 17 horas en Whole Human Genome Oligo DNA Microarray (4X44K) fabricado por Agilent Technologies. Después del lavado, las imágenes de las micromatrices de ADN se barrieron con un escáner de micromatrices Agilent, y las señales fluorescentes de cada punto se
5 convirtieron a valores numéricos utilizando Feature Extraction Software (v.9.5.3.1).
La presencia o ausencia de expresión se evaluó tomando como 0 el valor de la mediana del perfil de expresión
10 génica total (distribución de los valores de fluorescencia para las sondas respectivas). Una sonda que mostró un valor de expresión de más de 0 se consideró como una sonda que detectó la expresión de genes, se supuso que había dado lugar a la expresión de genes, y se contó en el número de sondas de expresión.
Cabe señalar que el soporte lógico de análisis utilizado fue GeneSpring GX 10.0 (Agilent Technologies, Inc.) y que la
15 normalización se realizó con el método del percentil 50. Los datos de micromatrices para células madre embrionarias humanas (hES_ES01) que se debían utilizar como control se descargaron de GEO.
20 La Tabla 6 siguiente enumera los genes que se expresan de forma característica en los hepatocitos y que se expresan en la célula madre hepática humana inducida de la presente invención. Entre las 156 sondas expresadas (144 genes) en el Whole Human Genome Oligo DNA Microarray (4X44K) fabricado por Agilent Technologies, que se expresaron de manera característica en hepatocitos, se contaron las expresadas en células madre hepáticas humanas inducidas, y sus nombres de Sonda, Símbolo de Gen, y los Núm. de Acceso de GenBank se enumeran en
25 las tablas respectivas.
[Tabla 6]
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Adhesión al Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Adhesión al Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P116898
- A2M NM_000014 A_24_P347431 FOXA1 NM_004496 A_23_P205355 SERPINA5 NM_000624
- A_23_P252981
- ACE2 NM_021804 A_23_P91552 FTCD NM_206965 A_23_P41390 SH3TC1 NM_018986
- A_24_P324783
- ACVRL1 NM_000020 A_23_P384761 GATA4 NM_002052 A_23_P66739 SLC13A5 NM_177550
- A_24_P945113
- ACVRL1 NM_000020 A_23_P129064 GATM NM_001482 A_23_P102391 SLC40A1 NM_014585
- A_32_P196263
- ADAMTS9 NM_182920 A_23_P52227 GDF10 NM_004962 A_24_P242581 SLC5A9 NM_001011547
- A_23_P406341
- AFAPIL2 NM_001001936 A_23_P250444 GJB1 NM_000166 A_23_P150788 SLCO2B1 NM_007256
- A_23_P58205
- AFP NM_001134 A_32_P19294 GLT1D1 NM_144669 A_23_P91230 SLPI NM_003064
- A_23_P115261
- AGT NM_000029 A_32_P109029 GPRC5C NM_022036 A_23_P113351 SPARCL1 MM_004684 NM_0004684
- A 23 P155514
- AHSG NM_001622 A 23_P253495 GSTA3 NM_000847 A_32_P133072 SPON1 NM_006108
- A_23_P155509
- AHSG MM_001622 A_23_P69573 GUCY1A3 NM_000856 A_3_P354705 ST8SIA1 NM_003034
- A_24_P372189
- AK027294 AK027294 A_24_P52697 H19 NR_002196 A_23_P36345 STARD10 MM.006645
- A_32_P56661
- AK074614 AK074614 A_23_P47034 HHEX NM_002729 A_23_P399265 STMN2 S82024
- A_32_P23525
- AK124281 AK124281 A_23_P202427 HKDC1 NM_025130 A_23_P80974 TDO2 NM_005651
- 4_24_P766716
- AK126405 AK126405 A_23_P103588 HMGCS2 NM_005518 A_73_P212500 TF NM_001063
- A_23_P257834
- ALB NM_000477 A_23_P206760 HP NM_005143 A_23_P212508 TF NM_001063
- A_23_P83098
- ALDH1A1 NM_000689 A_23_P421493 HPR NM_020995 A_23_P101013 TMC6 NM_007267
- A_32_P105549
- 4NXA8 NM_001630 A_23_P161998 HPX NM_000813 A_23_P409093 TMEM16D NM_178826
- A_23_P337262
- APCDD1 NM_153000 A_23_P118065 HSD17B2 NM_002153 A_32_P7015 TSPAN15 NM_012339
- A_23_P203191
- APOA1 NM_000039 A_23_P395438 HTRA3 NM_053044 A_23_P130333 TTR NM_000371
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Adhesión al Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Adhesión al Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P205177
-
F10
NM_000501
A_23_P75283
RBP4
NM_006744
imagen97 imagen98 imagen99
- A_23_P94879
-
F2
NM_000506
A_23_P3934
RNF43
NM_017763
imagen100 imagen101 imagen102
- A_23_P79562
-
FABP1
NM_001443
A_23_P88849
RRAD
NM_004165
imagen103 imagen104 imagen105
- A_23_P375372
-
FGA
NM_021871
A_24_P262127
RRAD
NM_004165
imagen106 imagen107 imagen108
- A_23_P44274
-
FGA
NM_000508
A_23_P124619
S100A14
NM_020672
imagen109 imagen110 imagen111
- A_23_P136125
-
FGB
NM_005141
A_23_P121926
SEPP1
MM.005410
imagen112 imagen113 imagen114
- A_23_P148088
-
FGG
NM_000509
A_24_P145629
SERINC2
NM_178865
imagen115 imagen116 imagen117
- A_23_P166109
-
FLRT3
NM_198391
A_23_P218111
SERPINA1
NM_001002236
imagen118 imagen119 imagen120
- A_23_P114863
-
FMOD
NM_002023
A_23_P2920
SERPINA3
NM_001085
imagen121 imagen122 imagen123
- A_23_P37127
-
FOXA1
NM_004496
A_24_P321766
SERPINA5
NM_000624
imagen124 imagen125 imagen126
La Tabla 7 siguiente enumera los genes expresados en células madre hepáticas humanas inducidas (GC1-2) que se obtuvieron de tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de estómago y que se indujeron en el Ejemplo 3. Células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de estómago: GC1-2 El número de sondas expresadas características de los hepatocitos fue 138.
[Tabla 7]
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P116898
- A2M NM_000014 A_24_P238251 DLK1 NM_003836 A_23_P102364 NGEF NM_019850
- A_23_P252981
- ACE2 NM_021804 A_23_P139704 DUSP6 NM_001946 A_23_P389897 NGFR NM_002507
- A_24_P324783
- ACVRL1 NM_000020 A_23_P139687 ERP27 NM_152321 A_23_P380797 NTF3 NM_002527
- A_24_P945113
- ACVRL1 NM_000020 A_23_P205177 F10 NM 000504 A_24_P220485 OLFML2A NM_182487
- A_32_P196263
- ADAMTS9 NM_182920 A_23_P94879 F2 NM_000506 A_32_P61684 PAG1 NM_018440
- A_23_P408341
- AFAP1L2 NM_001001936 A_23_P79562 FABP1 NM_001443 A_23_P347070 PAG1 NM_018440
- A_23_P58205
- AFP NM_001134 A_23_P375372 FGA NM_021871 A_23_P52121 PDZK1 NM_002914
- A_23_P115261
- AGT NM_000029 A_23_P44274 FGA NM_000508 A_23_P388150 PLA2G12B NM_032562
- A_23_P155514
- AHSG NM_001622 A_23_P138125 FOB NM_005141 A_32_P208123 PLG NM_000301
- A_23_P155509
- AHSG NM_001622 A_23_P148088 FGG NM_000509 A_23_P30693 PLG NM_000301
- A_24_P372189
- AK027294 AK027294 A_23_P166109 FLRT3 NM_198391 A_23_P160286 PRG4 NM_005807
- A_32_P58661
- AK074614 AK074614 A_23_P114883 FMOD NM_002023 A_23_P146554 PTGDS NM_000954
- A_32_P23525
- AK124281 AK124281 A_23_P37127 FOXA1 NM 004496 A_23_P167030 PTHR1 NM_000316
- A_24_P766716
- AK126405 AK126405 A_24_P347431 FOXA1 NM_004496 A_23_P118392 RASD1 NM_016084
- A_23_P257834
- ALB NM_000477 A_23_P384761 GATA4 NM_002052 A_23_P75283 RBP4 NM_006744
- A_23_P83098
- ALDH1A1 NM_000689 A_23_P129064 GATM NM_001482 A_23_P3934 RNF43 NM_017763
- A_32_P105549
- ANXA8 NM_001630 A_23_P250444 GJB1 NM_000166 A_23_P88849 RRAD NM_004165
- A_23_P337262
- APCDD1 NM_153000 A_32_P19294 GLT1D1 NM_144669 A_24_P282127 RRAD MM_004165
- A_23_P203191
- APOA1 NM_000039 A_32_P109029 GPRC5C NM_022036 A_23_P124819 S100A14 NM_020672
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_24_P302249
- APOA2 NM_001643 A_23_P253495 GSTA3 NM_000847 A_23_P121926 SEPP1 NM_005410
- A_23_P87036
- APOA4 NM_000482 A_23_P69573 GUCY1A3 NM_000856 A_24_P145629 SERINC2 NM_178865
- A_23_P79591
- APOB NM_000384 A_24_P52697 H19 NR_002196 A_23_P218111 SERPINA1 NM_001002236
- A_23_P259071
- AREG NM_001657 A_23_P47034 HHEX NM_002729 A_24_P321766 SERPINA5 NM_000624
- A_23_P116902
- ART4 NM_021071 A_23_P103588 HMGCS2 NM_005518 A_23_P205355 SERPINA5 NM_000624
- A_23_P130113
- ASGR2 NM_080912 A_23_P206760 HP NM_005143 A_23_P41390 SH3TC1 NM_018988
- A_24_P753592
- BC018589 BC018589 A_23_P421493 HPR NM_020995 A_23_P102391 SLC40A1 NM_014585
- A_23_P143331
- BMP2 NM_001200 A_23_P161998 HPX NM_000613 A_24_P242581 SLC5A9 NM_001011517
- A_32_P42224
- BX097190 BX097190 A_23_P118065 HSD17B2 NM_002153 A_32_P133072 SPON1 NM_006108
- A_23_P75790
- C11orf9 NM_013279 A 23 P395438 HTRA3 NM_053044 A_23_P354705 ST8SIA1 NM_003034
- A_23_P204937
- C13orf15 NM_014059 A_23_P10542 HTRA3 NM_053044 A_23_P36345 STARD10 NM_006645
- A_24_P10137
- C13orf15 NM_014059 A_23_P150609 IGF2 NM_001007139 A_23_P399265 STMN2 S82024
- A_23_P88678
- C15orf27 NM_152335 A_23_P15146 IL32 NM_0012631 A_23_P212500 TF NM_001063
- A_23_P101407
- C3 NM_000064 A_23_P153964 INHBB NM 002193 A_23_P212508 TF NM_001063
- A_23_P71855
- C5 NM_001735 A_32_P217140 ISX NM_001008494 A_23_P101013 TMC6 NM_007267
- A_32_P213103
- CA414006 CA414006 A_23_P501193 KCNJ16 NM_170741 A_23_P409093 TMEM16D NM_178826
- A_23_P33723
- CD163 NM_004244 A_23_P56898 KYNU NM_003937 4_32_P7015 TSPAN15 NM_012339
- A_23_P151895
- CILP NM_003613 A_23_P201636 LAMC2 NM_005562 A_23_P130333 TTR NM_000371
- A_23_P217379
- COL4A6 NM_033641 A_23_P120902 LGALS2 NM_006498 A_23_P81898 UBD NM_006398
- A_23_P120125
- COLEC11 NM_199235 A_23_P32165 LHX2 NM_004789 A_23_P212968 UGT2B11 NM_001073
- A_24_P388322
- COLEC11 NM_199235 A_24_P178834 LOC132205 AK091178 A_23_P138871 UGT2B7 NM_001074
- A_23_P213745
- CXCL14 NM_004887 A_24_P463929 LOC285733 AK091900 A_23_P214408 UNC93A NM_018974
- A_23_P102000
- CXCR4 NM_001008540 A_24_P845223 M27126 M27126 A_24_P103434 UNC93A NM_018974
- A_23_P131676
- CXCR7 NM_020311 A_24_P256219 MAF AF055376 A_23_P34345 VCAM1 NM_001078
- A_23_P32577
- DACH1 NM_080759 A_23_P164057 MFAP4 NM_002404 A_23_P16866 VIL1 NM_007127
- A_23_P257583
- DENND2A NM_015689 A_23_P13094 MMP10 NM_002425 A_23_P78099 VTN NM_000838
- A_23_P105923
- DIO3 NM_001362 A_23_P213171 MTTP NM_000253 A_23_P108817 MFDC1 NM_021197
La Tabla 8 siguiente enumera los genes expresados en células madre hepáticas humanas inducidas (AFB1-1) que se obtuvieron de tejidos cutáneos adultos y que se indujeron en el Ejemplo 6. Células madre hepáticas humanas derivadas de tejidos cutáneos adultos: AFB1-1. El número de sondas expresadas características de los hepatocitos fue 133.
[Tabla 8]
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P118898
- A2M NM_000014 A_23_P150379 EVA1 MM_144765 A_23_P360797 NTF3 NM_002527
- A_23_P252981
- ACE2 NM_021804 A_13_P205177 F10 NM_000504 A_24_P220485 OLFML2A NM_182487
- A_24_P945113
- ACVRL1 NM_000020 A_23_P94879 F2 NM_000506 A_32_P81684 PAG1 NM_018440
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_32_P198283
- ADAMTS9 NM_182920 A_23_P79562 FABP1 NM_001443 A_23_P347070 PAG1 NM_018440
- A_23_P406341
- AFAP1L2 NM_001001936 A 23_P375372 FGA NM_021871 A_23_P151907 PCSK6 NM_002570
- A_23_P58205
- AFP NM_001134 A_23_P44274 FGA NM_000508 A_24_P243749 PDK4 NM_002612
- A_23_P115261
- AGT NM_000029 A_23_P136125 FGB NM_005141 A_21_P52121 PDZK1 NM_002614
- A_23_P155514
- AHSG NM_001622 A_23_P148088 FGG NM_000509 A_32_P206123 PLG NM_000301
- A_23_P155509
- AHSG NM_001622 A_23_P166109 FLRT3 NM_198391 A_23_P30693 PLG NM_000301
- A_24_P372189
- AK027294 AK027294 A_23_PH4893 FMOD NM_002023 A_23_P160286 PRG4 NM_005807
- A_32_P58661
- AK074614 AK074614 A_24_P347431 FOXA1 NM_004496 A_23_N148554 PTGDS NM_000954
- 4_32_P23525
- AK124281 AK124281 A_23_P91552 FTCD NM_206965 A_23_P187030 PHR1 NM_000316
- A_24_P786716
- AK128405 AK126405 A_23_P384761 GATA4 NM_002052 A_23_P119392 RASD1 NM_016064
- A_23_P257834
- ALB NM_000477 A_23_P129064 3ATM NM_001482 A_23_P75283 RBP4 NM_008744
- A_23_P83098
- ALDH1A1 NM_000689 A_23_P52227 GDF10 NM_004982 A_23_P3934 RNF43 NM_017763
- A_32_P105549
- ANXA8 NM_001630 A_23_P250444 GJB1 NM_000188 A_23_P88849 RRAD NM_004165
- A_23_P337262
- APCDD1 NM_153000 A_32_P19294 GLT1D1 NM_144669 A_24_P262127 RRAD NM_004165
- A_23_P203191
- APOA1 NM_000039 A_32_P109029 GPRC5C NM_022036 A_23_P124619 S100A14 NM_020672
- A_24_P302249
- APOA2 MM_001643 A_23_P253495 GSTA3 NM_000847 A_23_P121926 SEPP1 NM_005410
- A_23_P87038
- APOA4 NM_000482 A_23_P69573 GUCY1A3 NM_000856 A_24_P145629 SERINC2 NM_178865
- A_23_P79591
- APOB NM_000384 A_24_P52697 H19 NR_002196 A_23_P218111 SERPINA1 NM_001002236
- A_23_P259071
- AREG NM_001657 A_23_P47034 HHEX NM_002729 A_23_P205355 SERPINA5 NM_000624
- A_23_P130113
- ASGR2 NM_080912 A_23_P202427 HKDC1 NM_025130 A_23_P41390 SH3TC1 NM_018988
- A_24_P753592
- BC018589 BC018589 A_23_P103588 HMGCS2 NM_005518 A_23_P66739 SLC13A5 NM_177550
- A_23_P143331
- BMP2 NM_001200 A_23_P206760 HP NM_005143 A_23_P102391 SLC40A1 NM_014585
- A_32_P42224
- BX097190 BX097190 A_23_P161998 HPX NM_000613 A_23_P150768 SLCO2B1 NM_007256
- A_23_P75790
- C11 NM_013279 A_23_P118065 HSD17B2 NM_002153 A_23_P91230 SLPI NM_003064
- A_23_P204937
- C13orf15 NM_014059 A_23_P395438 HTRA3 NM_053044 A_23_P113351 SPARCL1 NM_004684
- A_24_P10137
- C13orf15 NM_014059 A_23_P10542 HTRA3 NM_053044 A_32_P133072 SPON1 NM_006108
- A_23_P88678
- C15orf27 NM_152335 A_23_P150609 IGF2 NM_001007139 A_23_P38345 STARD10 NM_006645
- A_23_P101407
- C3 NM_000064 A_23_P15146 IL32 NM_001012631 A_23_P399265 STMN2 S82024
- A_23_P71855
- C5 NM_001735 A_23_P153964 INHBB NM_002193 A_23_P212500 TF NM_001063
- A_32_P213103
- CA414006 CA414006 A_23_P501193 KCNJ16 NM_170741 A_23_P212508 TF NM_001063
- A_23_P151895
- CILP NM_003613 A_23_P58898 KYNU NM_003937 A_23_P101013 TMC6 NM_007267
- A_23_P217379
- COL4A6 NM_033641 A_23_P201636 LAMC2 NM_005562 A_32_P7015 TSPAN15 NM_012339
- A_23_P120125
- COLEC11 NM_199235 A_23_P120902 LGALS2 NM_006498 A_23_P130333 TTR NM_000371
- A_24_P388322
- COLEC11 NM_199235 A_23_P32165 LHX2 NM_004789 A_23_P81898 UBD NM_006398
- A_23_P213745
- CXCL14 NM_004887 A_24_P178834 LOC132205 AK091178 A_23_P212968 UGT2B11 NM_001073
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P102000
- CXCR4 NM_001008540 A_24_P463929 LOC285733 AK091900 A_23_P136671 UGT2B7 NM_001074
- A_23_P131676
- CXCR7 NM_020311 A_24_P845223 M27126 M27126 A_23_P34345 VCAM1 NM_001078
- A_23_P257583
- DENND2A NM_015689 A_23_P164057 MFAP4 NM_002404 A_22_P16866 VIL1 NM_007127
- A_23_P105923
- DIO3 NM_001362 A_23_P213171 MTTP NM_000253 A_23_P78099 VTN NM_000638
- A_24_P236251
- DLK1 NM_003836 A_23_P102364 NGEF NM_019850 A_23_P106617 WFDC1 NM_021197
- A_23_P139704
-
DUSP6
NM_001946
A_23_P389897
NGFR
NM_002507
imagen133 imagen134 imagen135
- A_23_P139687
-
ERP27
NM_152321
A_24_P252364
NRCAM
NM_005010
imagen136 imagen137 imagen138
La Tabla 9 siguiente enumera los genes expresados en células madre hepáticas humanas inducidas (NGC1-2) que se obtuvieron de tejidos no cancerosos de un paciente con cáncer de estómago y que se indujeron en el Ejemplo 4. Células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos no cancerosos de un paciente con cáncer de estómago: NGC1-2 El número de sondas expresadas características de los hepatocitos fue 131.
[Tabla 9]
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P116902
- ART4 NM_021071 A_23_P69573 GUCY1A3 NM_000856 A_23_P205355 SERPINA5 NM_000624
- A_23_P130113
- ASGR2 NM_080912 A_24_P52697 H19 NR_002196 A_23_P66739 SLC13A5 NM_177550
- A_23_P118894
- ATAD4 NM_024320 A_23_P47034 HHEX NM_002729 A_23_P102391 SLC40A1 NM_014585
- A_24_P753592
- BC018589 BC018589 A_23_P103588 HMGCS2 NM_005518 A_23_P91230 SLPI NM_003064
- A_23_P143331
- BMP2 NM_001200 A_23_P209760 HP NM_005143 A_32_P133072 SPON1 NM_006108
- A_32_P42224
- BX097190 BX097190 A_23_P161998 HPX NM_00613 A_23_P36345 STARD10 NM_006645
- A_23_P75790
- C11orf9 NM_013279 A_23_P118065 HSD17B2 NM_002153 A_23_P399265 STMN2 S82024
- A_23_P204937
- C13orf15 NM_014059 A_23_P395438 HTRA3 NM_053044 A_23_P80974 TDO2 NM_005651
- A_24_P10137
- C13orf15 NM_014059 A_23_P10542 HTRA3 NM_053044 A_23_P212500 TF NM_001063
- A_23_P88678
- C15orf27 NM_152335 A_23_P150609 IGF2 NM_001007139 A_23_P212508 TF NM_001063
- A_23_P101407
- C3 NM_000064 A_23_P15146 IL32 NM_001012631 A_23_P101013 TMC6 NM_007267
- A_23_P71855
- C5 NM_001735 A_23_P153964 INHBB NM_002193 A_23_P409093 TMEM16D NM_178826
- A_32_P213103
- CA414006 C414006 A_32_P217140 ISX NM_001008494 A_32_P7015 TSPAN15 NM_012339
- A_23_P151895
- CILP NM_003613 A_23_P501193 KCNJ16 NM_170741 A_23_P130333 TTR NM_000371
- A_23_P217379
- COL4A6 NM_033641 A_23_P56898 KYNU NM_003937 A_23_P81898 UBD NM_006398
- A_23_P120125
- COLEC11 NM_199235 A_23_P201636 LAMC2 NM_005562 A_23_P212968 UGT2B11 NM_001073
- A_24_P388322
- COLEC11 NM_199235 A_23_P120902 LGALS2 NM_008498 A_23_P136671 UGT2B7 NM_001074
- A_23_P213745
- CXCL14 NM_006887 A_23_P32165 LHX2 NM_004789 A_23_P214408 UNC93A NM_018974
- A_23_P102000
- CXCR4 NM_001008540 A_24_P178834 LOC132205 AK091178 A_23_P16866 VIL1 NM_007127
- A_23_P131676
- CXCR7 NM_020311 A_24_P463929 LOC285733 AK091900 A_23_P78099 VTN NM_000638
- A_23_P32577
- DACH1 NM_080759 A_24_PB845223 M27126 M27126 A_23_P108817 WFDC1 NM_021197
- A_23_P257583
-
DENND2A
NM_015689
A_2 _P184057
MFAP4
NM_002404
imagen141 imagen142 imagen143
La Tabla 10 siguiente enumera los genes expresados en células madre hepáticas humanas inducidas (NFB1-3) que se obtuvieron de tejidos cutáneos neonatales y que se indujeron en el Ejemplo 2. Células madre hepáticas humanas derivadas de tejidos cutáneos neonatales: NFB1-3 El número de sondas expresadas características de los hepatocitos fue 96.
[Tabla 10]
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P116898
- A2M NM_000014 A_23_P69573 GUCY1A3 NM_000856
- A_23_P252981
- ACE2 NM_021804 A_24_P52697 H19 NR_002196
- A_24_P945113
- ACVRL1 NM_000020 A_23_P206760 HP NM_005143
- A_32_P196263
- ADAMTS9 NM_182920 A_23_P395438 HTRA3 NM_053044
- A_23_P406341
- AFAP1L2 NM_001001936 A_23_P150609 IGF2 NM_001007139
- A_23_P58205
- AFP NM_001134 A_23_P15146 IL32 NM_001012631
- A_23_P155509
- AHSG NM_001622 A_23_P501193 KCNJ16 NM_170741
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P83098
- ALDH1A1 NM_000689 A_23_P56898 KYNU NM_003937
- A_32_P105549
- ANXA8 NM_001630 A_23_P201636 LAMC2 NM_005562
- A_23_P337262
- APCDD1 NM_153000 A_23_P120902 LGALS2 NM_006498
- A_23_P203191
- APOA1 NM_000039 A_23_P32165 LHX2 NM_004789
- A_24_P302249
- APOA2 NM_001643 A_24_P178834 LOC132205 AK091178
- A_23_P87036
- APOA4 NM 000482 A_23_P164057 MFAP4 NM_002404
- A_23_P116902
- ART4 NM_021071 A_23_P13094 MMP10 NM_002425
- A_23_P130113
- ASGR2 NM_080912 A_23_P213171 MTTP NM_000253
- A_24_P753592
- BC018589 BC018589 A_23_P102364 NGEF NM_019850
- A_23_P143331
- BMP2 NM_001200 A_23_P389897 NGFR NM_002507
- A_32_P42224
- BX097190 BX097190 A_24_P252364 NRCAM NM_005010
- A_23_P75790
- C11orf9 NM_013279 A_23_P360797 NTF3 NM_002527
- A_23_P204937
- C13orf15 NM_014059 A_24_P220485 OLFML2A NM_182487
- A_24_P10137
- C13orf15 MM_014059 A_32_P61684 PAG1 NM_018440
- A_32_P213103
- CA414006 CA414006 A_23_P347070 PAG1 NM_018440
- A_23_P76654
- CDX2 NM_001265 A_23_P52121 PDZK1 NM_002614
- A_23_P217379
- COL4A6 NM_033641 A_23_P388150 PLA2G12B NM_032562
- A_23_P120125
- COLEC11 NM_199235 A_23_P146554 PTGDS NM_000954
- A_23_P213745
- CXCL14 NM_004887 A_23_P167030 PTHR1 NM_000316
- A_23_P102000
- CXCR4 NM_001008540 A_23_P118392 RASD1 NM_016084
- A_23_P131676
- CXCR7 NM_020311 A_23_P75283 RBP4 NM_006744
- A_23_P32577
- DACH1 NM_080759 A_23_P3934 RNF43 NM_017763
- A_23_P257583
- DENND2A NM_015689 A_23_P88849 RRAD NM_004165
- A_23_P105923
- DIO3 NM_001362 A_23_P124619 S100A14 NM_020672
- A 24_P236251
- DLK1 NM_003836 A_23_P121926 SEPP1 NM_005410
- A_23_P139704
- DUSP6 NM_001946 A_24_P321766 SERPINA5 NM_000624
- A_23_P205177
- F10 NM_000504 A_23_P205355 SERPINA5 NM_000624
- A_23_P94879
- F2 NM_000506 A_23_P102391 SLC40A1 NM_014585
- A_23_P79562
- FABP1 NM_001443 A_23_P91230 SLPI NM_003064
- A_23_P136125
- FGB NM_005141 A_32_P133072 SPON1 NM_006108
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P148088
- FGG NM_000509 A_23_P354705 ST8SIA1 NM_003034
- A_23_P166109
- FLRT3 NM_198391 A_23_P36345 STARD10 NM_006645
- A_23_P114883
- FMOD NM_002023 A_23_P399265 STMN2 S82024
- A_24_P347431
- FOXA1 NM_004496 A_23_P212500 TF NM_001063
- A_23_P384761
- GATA4 NM_002052 A_23_P101013 TMC6 NM_007267
- A_23_P129064
- GATM NM_001482 A_23_P409093 TMEM16D NM_178826
- A_23_P52227
- GDF10 NM_004962 A_32_P7015 TSPAN15 NM_012339
- A_23_P250444
- GJB1 NM_000166 A_23_P130333 TTR NM_000371
- A_32_P19294
- GLT1D1 NM_144669 A_23_P212968 UGT2B11 NM_001073
- A_32_P109029
- GPRC5C NM_022036 A_23_P16866 VIL1 NM_007127
- A_23_P253495
- GSTA3 NM_000847 A_23_P78099 VTN NM_000638
La Tabla 11 siguiente enumera los genes expresados en células madre hepáticas humanas inducidas (CC1-4) que se obtuvieron de tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de colon y que se indujeron en el Ejemplo 5. Células madre hepáticas humanas inducidas derivadas de tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de colon: CC1-4 El número de sondas expresadas características de los hepatocitos fue 92.
[Tabla 11]
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P116898
- A2M NM_000014 A_24_P52697 H19 NR_002196
- A_23_P252981
- ACE2 NM_021804 A_23_P47034 HHEX NM_002729
- A_24_P945113
- ACVRL1 NM_000020 A_23_P206760 HP NM_005143
- A_32_P196263
- ADAMTS9 NM_182920 A_23_P421493 HPR NM_020995
- A_23_P406341
- AFAP1L2 NM_001001936 A_23_P161998 HPX NM_000613
- A_23_P58205
- AFP NM_001134 A_23_P395438 HTRA3 NM_053044
- A_23_P115261
- AGT NM_000029 A_23_P150609 IGF2 NM_001007139
- A_23_P155514
- AHSG NM_001622 A_23_P15146 IL32 NM_001012631
- A_23_P155509
- AHSG NM_001622 A_23_P153964 INHBB NM_002193
- A_24_P766716
- AK126405 AK126405 A_23_P501193 KCNJ16 NM_170741
- A_23 P257834
- ALB NM_000477 A_23_P56898 KYNU NM_003937
- A_23_P83098
- ALDH1A1 NM_000689 A_23_P201636 LAMC2 NM_005562
- A_32_P105549
- ANXA8 NM_001630 A_23_P120902 LGALS2 NM_006498
- A_23_P337262
- APCDD1 NM_153000 A_24_P178834 LOC132205 AK091178
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_23_P203191
- APOA1 NM_000039 A_24_P845223 M27126 M27126
- A_24_P302249
- APOA2 NM_001643 A_23_P164057 MFAP4 NM_002404
- A_23_P87036
- APOA4 NM_000482 A_23_P213171 MTTP NM_000253
- A_24_P753592
- BC018589 BC018589 A_23_P102364 NGEF NM_019850
- A_23_P143331
- BMP2 NM 001200 A_23_P360797 NTF3 NM_002527
- A_23_P75790
- C11orf9 NM_013279 A_24_P220485 OLFML2A NM_182487
- A_23_P88678
- C15orf27 NM_152335 A_23_P347070 PAG1 NM_018440
- A_23_P101407
- C3 NM_000064 A_23_P52121 PDZK1 NM_002614
- A_23_P71855
- C5 NM_001735 A_23_P146554 PTGDS NM_000954
- A_23_P33723
- CD163 NM_004244 A_23_P167030 PTHR1 NM_000316
- A_23_P217379
- COL4A6 NM_033641 A_23_P118392 RASD1 NM_016084
- A_23_P120125
- COLEC11 NM_199235 A_23_P75283 RBP4 NM_006744
- A_23_P213745
- CXCL14 NM_004887 A_23_P3934 RNF43 NM_017763
- A_23_P102000
- CXCR4 NM_001008540 A_23_P88849 RRAD NM_004165
- A_23_P131676
- CXCR7 NM_020311 A_23_P124619 S100A14 NM_020672
- A_23_P257583
- DENND2A NM_015689 A_23_P121926 SEPP1 NM_005410
- A_23_P105923
- DIO3 NM_001362 A_24_P145629 SERINC2 NM_178865
- A_24_P236251
- DLK1 NM_003836 A_23_P218111 SERPINA1 NM_001002236
- A_23_P139704
- DUSP6 NM_001946 A_23_P205355 SERPINA5 NM_000624
- A_23_P205177
- F10 NM_000504 A_23_P102391 SLC40A1 NM_014585
- A_23_P94879
- F2 NM_000506 A_24_P242581 SLC5A9 NM_001011547
- A_23_P79562
- FABP1 NM_001443 A_32_P133072 SPON1 NM_006108
- A_23_P166109
- FLRT3 NM_198391 A_23_P36345 STARD10 NM_006645
- A_23_P114883
- FMOD NM_002023 A_23_P399265 STMN2 S82024
- A_23_P37127
- FOXA1 NM_004496 A_23_P212500 TF NM_001063
- A_24_P347431
- FOXA1 NM_004496 A_23_P212508 TF NM_001063
- A 23_P91552
- FTCD NM_206965 A_23_P101013 TMC6 NM_007267
- A_23_P384761
- GATA4 NM_002052 A_23_P130333 TTR NM_000371
- A_23_P129064
- GATM NM_001482 A_23_P214408 UNC93A NM 018974
- A_32_P19294
- GLT1D1 NM_144669 A_24_P103434 UNC93A NM_018974
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank Nombre de la Sonda Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_32_P109029
- GPRC5C NM_022036 A_23_P16866 VIL1 NM_007127
- A_23_P69573
- GUCY1A3 NM_000856 A_23_P78099 VTN NM_000638
Las 31 sondas expresadas (23 genes: Tabla 12) del Whole Human Genome Oligo DNA Microarray (4X44K)
5 elaboradas mediante Agilent Technologies, que se expresaron de manera característica en células madre embrionarias humanas, se expresaron en las células madre hepáticas humanas inducidas de Ejemplos 2-6 en cantidades casi comparables (1/4-4 veces) a las expresadas en células madre embrionarias humanas. Los nombres de las sondas, Símbolos del Gen y Números de Acceso de GenBank para los genes de las células madre embrionarias humanas se enumeran a continuación.
10 [Tabla 12] Los resultados anteriores verifican experimentalmente que las células madre hepáticas humanas inducidas no solo dieron lugar a la expresión de genes marcadores de hepatocitos que es una propiedad de los hepatocitos, sino que también expresaron genes característicos de las células madre embrionarias en cantidades comparables a las
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_24_P231132
- ACVR2B NM_001106
- A_23_P109950
- ACVR2B NM_001106
- A_32_P134209
- ACVR2B NM_001106
- A_23_P85250
- CD24 L33930
- A_23_P206359
- CDH1 NM_004360
- A_23_P138655
- CYP26A1 NM_057157
- A_23_P28953
- DNMT3B NM_175850
- A_23_P380526
- DPPA4 NM_018189
- A_23_P2831
- EDNRB NM_003991
- A_24_P42755
- FLT1 NM_002019
- A_23_P14821
- GABRB3 NM_000814
- A_23_P10966
- GABRB3 NM_000814
- A_23_P304450
- GATA6 NM_005257
- A_23_P72817
- GDF3 NM_020634
- A_23_P163992
- GRB7 NM_005310
- A_23_P74895
- UN28 NM_024674
- A_23_P204640
- NANOG NM_024865
- A_23_P127322
- NODAL NM_018055
- A_23_P215060
- PODXL NM_005397
- A_24_P144601
- POU5F1 NM_002701
- A_23_P59138
- POU5F1 NM_002701
- Nombre de la Sonda
- Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A_32_P132563
- POU5F1 NM_002701
- A_24_P214841
- POU5F1 NM_002701
- A_23_P109072
- SALL4 NM_020436
- A_23_P401055
- SOX2 NM_003106
- A_24_P379969
- SOX2 NM_003106
- A_32_P135985
- TDGF1 NM_003212
- A_23_P366376
- TDGF1 NM_003212
- A_23_P110851
- TERT NM_198253
- A_23_P395582
- ZFP42 NM_174900
- A_23_P327910
- ZIC3 NM_003413
5 células madre embrionarias humanas.
Un análisis adicional de los resultados de micromatrices mostró que la célula madre hepática inducida de la presente invención tiene propiedades características de células madre mesodérmicas y células madre endodérmicas. Más específicamente, la célula madre hepática inducida expresó el gen SOX17, el gen FOXA2, el gen GSC, el gen 10 EOMES y el gen TCF2, que son genes expresados de forma característica en células madre mesodérdermicas y células madre endodérmicas. Entre las células madre hepáticas humanas inducidas (NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1 y CC1-4) preparadas en los Ejemplos 2-6, dos células (NFB1-3 y CC1-4) que albergaban y por lo tanto, expresaron cantidades relativamente pequeñas de genes característicos de los hepatocitos expresaron el gen SOX17, el gen FOXA2, el gen GSC, el gen EOMES y el gen TCF2 en mayores cantidades que otras células madre
15 hepáticas humanas inducidas (GC1-2, NGC1-2, y AFB1-1).
Como se describió anteriormente, se confirmó que las células madre hepáticas humanas inducidas (NGC1-2) preparadas a partir de tejidos no cancerígenos derivados del paciente con cáncer de estómago y células madre hepáticas humanas inducidas (AFB1-1) preparadas a partir de tejidos cutáneos adultos no solo expresaban alfa
20 fetoproteína (AFP), transtiretina (TTR), albúmina (ALB) y alfa 1-antitripsina (AAT) que son genes marcadores de hepatocitos, sino también expresaron el gen POU5F1, el gen SOX2, el gen NANOG y el gen ZFP42 que son genes característicos de las células madre embrionarias en cantidades comparables a las células madre embrionarias humanas. Cabe señalar que AAT a veces se designa como SERPINA1, transtiretina como prealbúmina y ZFP42 como REX1.
25
Ejemplo 9
30 Las células madre hepáticas humanas inducidas (NGC1-2) preparadas a partir de tejidos no cancerosos derivados de pacientes con cáncer de estómago inducidos en el Ejemplo 4, y células madre hepáticas humanas inducidas (AFB1-1) preparadas a partir de tejidos cutáneos adultos inducidos en el Ejemplo 6, se sembraron en el Lab-Tek (marca registrada) Chamber Slide (marca registrada) System (Nunc; Núm. Cat. 177429). Al día siguiente, después
35 de retirar el medio de las células cultivadas y lavar las células dos veces con PBS (-), se añadió una solución de formaldehído al 10% y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, después de eliminar la solución de formaldehído al 10% y lavar tres veces con PBS (-), se añadió una solución de Triton-X100 al 0,1% (ICN Biomedical), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, después de eliminar la solución de Triton-X100 al 0,1% y lavar tres veces con PBS (-), se añadió una
40 solución de bloqueo (en TBS, pH 7,2) (Nacalai Tesque; Núm. Cat. 05151-35) y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante una hora. La reacción con un anticuerpo primario diluido 1:50 se realizó a 4°C durante la noche o a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, después de lavar dos veces con PBS (-),se realizó la reacción con un anticuerpo secundario diluido 1:500 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados son los que se describen a continuación.
5 <Anticuerpos primarios>
Anticuerpo de cabra anti-NANOG humano (R&D Systems; Núm. de Lote KKJ03), anticuerpo de ratón anti-SSEA-4 humano (Millipore; Núm. de Lote LV1488380), anticuerpo de ratón anti-CD9 humano (R&D Systems; Núm. de Lote JOK04), anticuerpo de conejo anti-α-1-fetoproteína humana (Dako; Núm. de Lote A0008), anticuerpo de ratón anti
10 albúmina humana (Sigma-Aldrich; Núm. de Lote A6684).
<Anticuerpos secundarios>
Anticuerpo de burro anti-IgG de cabra marcado con Alexa Fluor 594 (Invitrogen; Núm. Cat. A11058), anticuerpo de
15 cabra anti-IgG de ratón marcado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen; Núm. Cat. A11001), anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con Alexa Fluor 594 (Invitrogen; Núm. Cat. A11005), anticuerpo de burro anti-IgG de conejo marcado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen; Núm. Cat. A21206)
Después de la tinción, se realizó la observación bajo un microscopio fluorescente, y como resultado, se encontró que
20 las células madre hepáticas humanas inducidas preparadas a partir de tejidos no cancerosos derivados del paciente con cáncer de estómago y las células madre hepáticas humanas inducidas preparadas a partir de tejidos cutáneos adultos exhibieron una propiedad de los hepatocitos, concretamente la producción de proteínas alfa-fetoproteína (AFP) y albúmina (ALB), y expresaron glicolípidos, NANOG, SSEA-4 y CD9 que son característicos de las células madre embrionarias (no mostradas).
25
Ejemplo 10
30 El gen CD81, el gen SCARB1, el gen OCLN y el gen CLDN1 que son genes importantes para la replicación del virus de la hepatitis C (VHC) se analizaron utilizando Whole Human Genome Oligo DNA Microarray (4X44K) fabricado por Agilent Technologies. El soporte lógico de análisis utilizado fue GeneSpring GX 10.0 (Agilent Technologies, Inc.) y la normalización se realizó utilizando el método del percentil 50. El procedimiento de prueba fue el mismo que en el Ejemplo 8.
35
Los datos de micromatrices para tres células madre embrionarias humanas (es decir, hES_H9 (GSM194390), hES_BG03 (GSM194391) y hES_ES01 (GSM194392)) y células madre pluripotentes inducidas (es decir, células iPS
Se confirmó y se verificó experimentalmente que las células madre hepáticas humanas inducidas co-expresaron el gen CD81, el gen SCARB1, el gen OCLN y el gen CLDN1, que son genes importantes para la replicación del virus de la hepatitis C (VHC). Por consiguiente, se sugirió que se puede llevar a cabo una prueba para evaluar la eficacia
45 de un compuesto candidato a fármaco antiviral infectando la célula madre hepática inducida de la presente invención con virus de hepatitis C y replicando la célula infectada en presencia del compuesto añadido. La misma aplicación también se sugirió para células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes humanas inducidas.
En la inducción de la célula madre hepática inducida de la presente invención, es necesario llevar la célula de
50 mamífero a un estado tal que los productos génicos del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula madre hepática inducida estarán presentes para garantizar que la abundancia relativa intracelular del producto génico del gen POU5F1 sea mayor que la del producto génico del gen SOX2. En la presente invención, las abundancias relativas intracelulares de los productos genéticos del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 satisfacen preferiblemente la relación del gen POU5F1 > gen KLF4 > gen
55 SOX2, y desde el punto de vista de la inducción de alta eficacia para la célula madre hepática inducida, las abundancias relativas intracelulares de los productos génicos del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 adoptan lo más preferiblemente los valores de 4, 2 y 1 en ese orden.
Además, en la presente invención, por ejemplo, el gen NANOG, el gen POU5F1, el gen SOX2, el gen ZFP42, el gen
60 SALL4, el gen LIN28 y el gen TERT que se expresan característicamente en células madre embrionarias sirven como "genes autoreplicantes" que permiten que las células en varios organismos se auto-repliquen ex vivo
En la inducción de la célula madre hepática inducida de la presente invención, las abundancias relativas intracelulares de los productos génicos del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 se consideraron uno de los factores importantes para determinar el curso final de la diferenciación, y en la preparación de la célula madre pluripotente, se encontró que las abundancias relativas intracelulares de los productos genéticos del gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 adoptaron valores de 1, 1 y 1 en ese orden, y que la célula madre pluripotente no se diferenciaba.
5
De acuerdo con la presente invención, es posible preparar células madre hepáticas humanas inducidas a partir de donantes de diferentes razas, sexos, edades o antecedentes genéticos (tales como polimorfismos) y, por lo tanto,
10 evaluar y predecir la eficacia, seguridad, toxicidad e interacción con fármacos de un fármaco candidato en una prueba no clínica antes de evaluar estas características del fármaco candidato administrado a varios pacientes en una prueba clínica. De acuerdo con esto, la célula madre hepática humana inducida de la presente invención es muy útil desde el punto de vista industrial porque sirve como una herramienta para el descubrimiento de fármacos que contribuye a una eficacia mejorada en el desarrollo de fármacos y una carga reducida para los pacientes.
15 La célula madre hepática inducida de la presente invención es muy útil en la búsqueda y análisis de moléculas que controlan la formación y funciones del hígado: por ejemplo, descubrimiento de fármacos para la fibrosis hepática, cirrosis, hígado graso, hepatitis, síndrome metabólico, hematopoyesis y similares; análisis del metabolismo y mecanismo de acción de varios productos farmacéuticos y compuestos; preparación de vacunas y aplicación a
20 biorreactores.
Claims (8)
-
imagen1 REIVINDICACIONES1. Una célula madre hepática inducida obtenida mediante un procedimiento que comprende una etapa de inducir una célula demamífero a una célula madre hepática inducida,5 endondelacélulademamíferoseseleccionadelgrupoqueconsisteenunacéluladerivadadeunadulto,unacélula derivada de neonato, una célula derivada de la piel y una célula de un individuo canceroso, en donde dicha etapa de inducción comprende introducir un gen POU5F1, un gen KLF4 y un gen SOX2 en la célula de mamífero con la ayuda de vectores de expresión para llevar la célula de mamífero a un estado tal que los productos génicos del gen POU5F1, el gen KLF4, y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célula10 madre hepática inducida estarán presentes para asegurar que la abundancia relativa intracelular del producto del gen POU5F1 sea mayor que la del producto génico del gen SOX2, en donde la razón de uso entre el gen POU5F1, el gen KLF4 y el gen SOX2 que son necesarios para la inducción a la célulamadre hepática inducida es 4:2:1 en ese orden, y en donde la célula madre hepática inducida está caracterizada porque satisface al menos los siguientes requisitos15 (1) -(3):(1) expresa al menos 15 genes seleccionados del grupo de los genes enumerados en la siguiente Tabla 1 que son genes marcadores para una célula madre embrionaria;[Tabla 1]imagen2 imagen3 - Símbolo del Gen
- Acceso Genbank
- TERT
- NM_198253
- ZFP42
- NM_174900
- ZIC3
- NM_003413
- (2)
- tiene propiedades de un hepatocito en donde al menos 15 genes seleccionados del grupo de genes de la Tabla 2 siguiente se expresan como genes asociados a las propiedades de un hepatocito;
[Tabla 2]- (3)
- puede ser sometido a un cultivo de expansión o cultivo de pases durante al menos 3 días.
- Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- A2M
- NM_000014 ERP27 NM_152321 NRCAM NM_005010
- ACE2
- NM_021804 EVA1 NM_144765 NTF3 NM_002527
- ACVRL1
- NM_000020 F10 NM_000504 OLFML2A NM_182487
- ADAMTS9
- NM_182920 F2 NM_000506 PAG1 NM_018440
- AFAP1L2
- NM_001001936 FABP1 NM_001443 PCSK6 NM_002570
- AFP
- NM_001134 FGA NM_021871 PDK4 NM_002612
- AGT
- NM_000029 FGA NM_000508 PDZK1 NM_002614
- AHSG
- NM_001622 FGB NM_005141 PLA2G12B NM_032562
- AK027294
- AK027294
- FGG NM_000509 PLG NM_000301
- AK074614
- AK074614
- FLRT3 NM_198391 PRG4 NM_005807
- AK124281
- AK124281
- FMOD NM_002023 PSMAL NM_153696
- AK126405
- AK126405
- FOXA1 NM_004496 PTGDS NM_000954
- ALB
- NM_000477 FTCD NM_206965 PTHR1 NM_000316
- ALDH1A1
- NM_000689 GATE4 NM_002052 RASD1 NM_016084
- ANXA8
- NM_001630 GATM NM_001482 RBP4 NM_006744
- APCDD1
- NM_153000 GDF10 NM_004962 RNF43 NM_017763
- APOA1
- NM_000039 GJB1 NM_000166 RRAD NM_004165
- APOA2
- NM_001643 GLT1D1 NM_144669 S100A14 NM_020672
- APOA4
- NM_000482 GPRC5C NM_022036 SEPP1 NM_005410
- APOB
- NM_000384 GSTA3 NM_000847 SERINC2 NM_178865
- AREG
- NM_001657 GUCY1A3 NM_000856 SERPINA1 NM_001002236
- ART4
- NM_021071 H19 NR_002196 SERPINA3 NM_001085
- ASGR2
- NM_080912 HHEX NM_002729 SERPINA5 NM_000624
imagen4 imagen5 - Símbolo del Gen
- Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank Símbolo del Gen Acceso Genbank
- ATAD4
- NM_024320 HKDC1 NM_025130 SH3TC1 NM_018986
- BC018589
- BC018589
- HMGCS2 NM_005518 SLC13A5 NM_177550
- BMP2
- NM_001200 HP NM_005143 SLC40A1 NM_014585
- BX097190
- BX097190
- HPR NM_020995 SLC5A9 NM_001011547
- C11orf9
- NM_013279 HPX NM_000613 SLCO2B1 NM_007256
- C13orf15
- NM_014059 HSD17B2 NM_002153 SLPI NM_003064
- C15orf27
- NM_152335 HTRA3 NM_053044 SPARCL1 NM_004684
- C3
- NM_000064 IGF2 NM_001007139 SPON1 NM_006108
- C5
- NM_001735 IL32 NM_001012631 ST8SIA1 NM_003034
- CA414006
- CA414006
- INHBB NM_002193 STARD10 NM_006645
- CD163
- NM_004244 ISX NM_001008494 STMN2 S82024
- CD1D
- NM_001766 KCNJ16 NM_170741 TD02 NM_005651
- CDX2
- NM_001265 KYNU NM_003937 TF NM_001063
- CILP
- NM_003613 LAMC2 NM_005562 TMC6 NM_007267
- CMKLR1
- NM_004072 LGALS2 NM_006498 TMEM16D NM_178826
- COL4A6
- NM_033641 LHX2 NM_004789 TSPAN15 NM_012339
- COLEC11
- NM_199235 LOC132205 AK091178 TTR NM_000371
- CXCL14
- NM_004887 LOC285733 AK091900 UBD NM_006398
- CXCR4
- NM_001008540 M27126 M27126 UGT2B11 NM_001073
- CXCR7
- NM_020311 MAF AF055376 UGT2B7 NM_001074
- DACH1
- NM_080759 MFAP4 NM_002404 UNC93A NM_018974
- DENND2A
- NM_015689 MMP10 NM_002425 VCAM1 NM_001078
- DIO3
- NM_001362 MTTP NM_000253 VIL1 NM_007127
- DLK1
- NM_003836 NGEF NM_019850 VTN NM_000638
- DUSP6
- NM_001946 NGFR NM_002507 WFDC1 NM_021197
- 2. La célula madre hepática inducida mencionada en la reivindicación 1, en donde los genes marcadores para una5 célula madre embrionaria del apartado (1) anterior se expresan en la célula madre hepática inducida en cantidades que varían de 1/8-8 veces las cantidades de los genes que son expresado en la célula madre embrionaria.
- 3. La célula madre hepática inducida mencionada en la reivindicación 2, en donde los genes marcadores de unacélula madre embrionaria del apartado (1) anterior se expresan en la célula madre hepática inducida en cantidades 10 quevaríande1/4a4veceslascantidadesdelosgenesquesonexpresadoenlacélulamadreembrionaria.
imagen6 imagen7 - 4. La célula madre hepática inducida mencionada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el gen NANOG, el gen POU5F1, el gen SOX2, el gen ZFP42 y el gen SALL4 son expresados como genes marcadores para una célulamadre embrionaria del apartado (1) anterior.
- 5 5. La célula madre hepática inducida mencionada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el gen AFP, el gen TTR, el gen TF, el gen APOA2, el gen APOA4, el gen AHSG, el gen FGA, el gen AGT, el gen FABP1, el gen SERPINA1 y gen RBP4 son expresados como genes asociados a las propiedades de un hepatocito del apartado (2) anterior.
- 10 6. La célula madre hepática inducida mencionada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el gen APOA1, el gen APOA2, el gen APOA4, el gen APOB, el gen FABP1 y el gen AGT son expresados como genes asociados a las propiedades de un hepatocito del apartado (2) anterior.
- 7. La célula madre hepática inducida mencionada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que expresa15 adicionalmente al menos un gen seleccionado entre el gen SOX17, el gen FOXA2, el gen GSC, el gen EOMES y el gen TCF2 que son característicos de célulasmadremesendodérmicas y/o célulasmadre endodérmicas.
- 8. La célula madre hepática inducida mencionada en la reivindicación 1, en donde la célula de mamífero es unacélula humana. 20
- 9. Un método in vitro que utiliza la célula madre hepática inducida mencionada en la reivindicación 1, que se selecciona entre un método de prueba de seguridad, un método de prueba de toxicidad, un método de prueba de metabolismo, un método de prueba de interacción con fármacos, un método de prueba de actividad antiviral y un método de prueba de detección para productos farmacéuticos.25
- 10. La célula madre hepática inducida mencionada en la reivindicación 1 para su uso en un método terapéutico de tratamiento de unmamífero, en donde la célulamadre hepática inducida debe trasplantarse al hígado del mamífero.
imagen8
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