CN104278029B - 一种检测小鼠内耳干细胞的标记分子及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测小鼠内耳干细胞的标记分子及应用，所述的标记分子为Opcml、Phex和Gdf10；本发明筛选出小鼠内耳干细胞特异性的细胞标记分子可以区分小鼠内耳干细胞与其他组织来源的细胞，也可为其他物种内耳干细胞特异性标记分子研究提供参考。

Description

一种检测小鼠内耳干细胞的标记分子及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种小鼠内耳干细胞鉴定，特别涉及一种组合式细胞标记分子鉴定小鼠内耳干细胞的新型方法，这种方法能特异性地鉴定分离和培养的小鼠内耳干细胞。

(二)背景技术

2003年首次从成年小鼠椭圆囊感觉上皮中发现了一类细胞：这些细胞在体外与肌源性细胞联合培养可沿着中胚层方向分化；体内实验证明可在鸡胚原肠胚形成过程中向3个胚层方向分化。这类细胞命名为内耳干细胞。体外诱导证明内耳干细胞可以分化为毛细胞样细胞，提示内耳中存在干细胞或者毛细胞祖细胞。内耳干细胞具有自我更新和多分化潜能，这种多潜能干细胞一个重要的特性就是在悬浮培养条件下可以形成球体。此后，研究人员逐渐从耳蜗Corti器、大上皮脊、小上皮脊、***囊和椭圆囊感觉上皮、三个半规管的壶腹脊等不同组织中分离得到内耳干细胞。

近年来的研究发现内耳干细胞具有多分化潜能，在特定的分化条件下可以发育成内耳毛细胞。将内耳干细胞接种在多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，贴壁无血清培养。14天之后，基因检测表明分化之后的细胞表达毛细胞特异性蛋白，说明有部分细胞分化为内耳毛细胞。对这些分化后的毛细胞进行电生理检测，产生电压依赖性电流。内耳干细胞在体外除了可以分化为毛细胞之外，还可以分化为内耳支持细胞、神经元和星形胶质细胞等，说明内耳干细胞具有多分化潜能，在将来遗传性耳聋听力功能重塑再生医学方面具有重要的应用价值。

但是到目前为止，对内耳干细胞的研究不多。这主要是由于内耳干细胞的分离、培养以及纯化存在一定的困难。虽然目前有研究发现了一些不同物种内耳干细胞表达的基因，但这些基因尚缺乏较强的组织特异性，例如成鼠分离的内耳干细胞表达的Nestin，Pax-2，BMP-4以及BMP-7，在其他的组织中也有不同程度的表达。因此，到目前为止尚缺乏针对内耳干细胞特异性的细胞标记分子，这对内耳干细胞的分离和纯化以及鉴定造成了一定的困难，也是内耳干细胞应用研究方面存在的一个技术瓶颈。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种鉴定小鼠内耳干细胞的标记分子，并采用这种标记分子特异性地鉴定小鼠内耳干细胞的方法；本发明是通过对分离的小鼠内耳干细胞进行细胞球培养方法获得克隆的小鼠内耳干细胞，并提取小鼠内耳干细胞核糖核酸(RNA)进行小鼠基因表达谱芯片检测小鼠内耳干细胞基因表达谱，然后筛选特异性候选基因。最后从新生小鼠中提取出如大脑、肝脏、皮肤等10个不同组织的RNA，对候选的目的基因进行特异性检测，确定小鼠内耳干细胞的特异性组合式细胞标记分子。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种检测小鼠内耳干细胞的标记分子，所述的标记分子为Opcml(核苷酸序列为序列7所示)、Phex(核苷酸序列为序列8所示)和Gdf10(核苷酸序列为序列9所示)。

本发明还提供一种所述的标记分子在检测小鼠内耳干细胞中的应用，所述的应用为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别以Opcml正向引物和Opcml反向引物，Phex正向引物和Phex反向引物，Gdf10正向引物和Gdf10反向引物作为三对引物进行PCR扩增，若Opcml正向引物和Opcml反向引物扩增产物920bp，Phex正向引物和Phex反向引物扩增产物258bp，且Gdf10正向引物和Gdf10反向引物扩增产物381bp，则单细胞为小鼠内耳干细胞；

Opcml正向引物：5’-ATGTACCATCCCGCCTACTG-3’；

Opcml反向引物：5’-CCAGGCCCATACAGGGTGAT-3’；

Gdf10正向引物：5’-CAGTTTGACTGGCTGGGCTA-3’；

Gdf10反向引物：5’-GGTCCCCTGGATTACCCTTG-3’；

Phex正向引物：5’-AGGTGTCAAAACCCCTGCAA-3’；

Phex反向引物：5’-GGACAATCTTGGGCATGGGG-3’。

本发明所述检测小鼠内耳干细胞的标记分子按如下步骤筛选：

(1)内耳干细胞分离和成球培养

解剖小鼠获得小鼠耳蜗基底膜后，将基底膜胰酶消化，用移液枪吹打散后，获得单细胞，然后将单细胞悬浮在内耳干细胞培养基中，在37℃、5％CO₂孵育箱中悬浮培养5-6天，形成内耳干细胞球。本发明分离培养的小鼠内耳干细胞阳性表达Nestin、Abcg2、Pax-2、BMP-4及BMP-7等基因。

(2)基因表达谱芯片检测基因表达谱与特异性候选基因筛选

将分离的内耳干细胞总RNA进行Phalanx小鼠基因表达谱检测(检测单位：上海仪方生物科技有限公司)。经对比内耳毛细胞以及内耳祖细胞后，对内耳干细胞差异表达性基因进行进一步分析，从内耳干细胞中筛选出30个特异表达的基因。

(3)特异性组合式细胞标记分子验证

根据内耳干细胞筛选的30种特异表达的基因，结合比较内耳祖细胞及毛细胞中特异表达的基因，候选Opcml、Phex和Gdf10共3种基因，对小鼠大脑、肝脏、皮肤、肺、肠、胃、肾脏、肌肉、心脏及眼睛10个不同的组织及器官进行RNA提取后，聚合酶链反应(PCR)检测这3种基因在不同组织细胞内的表达水平，验证出Opcml、Phex和Gdf10三种分子组合为小鼠内耳干细胞最佳组合式细胞标记分子。通过小鼠不同组织3种候选基因的分子检测，只有在小鼠内耳干细胞中Opcml、Phex和Gdf10这三种基因都是阳性表达的。因此这三种基因的组合阳性表达可作为小鼠内耳干细胞的分子标记。

本发明提供的标记分子在小鼠内耳干细胞中是特异性表达的，通过Phalanx小鼠基因表达谱的检测，表明Opcml、Phex和Gdf10三种基因具有显著的高水平表达，可应用于小鼠内耳干细胞的鉴定，用于小鼠内耳干细胞的分选和纯化依据，亦可应用于小鼠分离或体外培养扩增的内耳干细胞分选以及纯化研究。

本发明的有益效果是：

(1)本发明筛选出小鼠内耳干细胞特异性的细胞标记分子Opcml、Phex和Gdf10。

(2)以本发明提供的细胞标记分子可以区分小鼠内耳干细胞与其他组织来源的细胞。

(3)使用本发明提供的细胞标记分子的阳性表达可鉴定小鼠内耳干细胞，为发展新的分离纯化技术提供依据。

(4)本发明提供的细胞标记分子也可为其他物种内耳干细胞特异性标记分子研究提供参考。

(四)附图说明

图1小鼠内耳干细胞球显微图，A行为100×放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、5天的形态，B行为250×放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、5天的形态；C行为用DAPI对培养1、3、5天的内耳干细胞球染色后，250×放大倍数下显微图。

图2小鼠内耳干细胞基因表达电泳图，泳道1为Marker，泳道2为GAPDH，泳道3为Nestin，泳道4为Abcg2，泳道5为Pax-2，泳道6为BMP-4，泳道7为BMP-7。

图3小鼠内耳干细胞球5-Brdu染色激光共聚焦显微图，a为使用DAPI观察内耳干细胞球中的细胞核，b为Brdu抗体标志显微图，c为a与b合并图。

图4小鼠内耳干细胞Nestin表达激光共聚焦显微图，a为使用DAPI观察内耳干细胞球中的细胞核，b是Nestin抗体标志显微图，c为DAPI与Nestin共同标志显微图。

图5候选基因在不同组织中的表达电泳图，泳道1为大脑，泳道2为肝脏，泳道3为皮肤，泳道4为肺，泳道5为肠，泳道6为胃，泳道7为肾脏，泳道8为肌肉，泳道9为心脏，泳道10为眼睛，泳道11为内耳干细胞。

图6标志分子Opcml+Phex+Gdf10在不同类型细胞中的表达电泳图，泳道1为内耳单细胞检测Opcml，泳道2为内耳单细胞Phex，泳道3为内耳单细胞检测Gdf10；泳道4为肺组织细胞检测Opcml，泳道5为肺组织细胞检测Phex，泳道6为肺组织细胞检测Gdf10；泳道7为肠组织细胞检测Opcml，泳道8为肠组织细胞检测Phex，泳道9为肺组织细胞检测表达Gdf10。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所用PBS的pH值均为7.4。

实施例1 小鼠内耳干细胞的分离及培养

1)将ICR小鼠(浙江省医学科学院)在-20℃冰箱中麻醉5分钟，浸入75％酒精中杀菌。用手术剪将小鼠直接断头，去除皮毛。然后在无菌状态下中分头颅，去除大脑及脑干，充分暴露位于颅底的颞骨。仔细的用剪刀和镊子分离出颞骨，将其转移到装有4℃预冷PBS(pH值为7.4)的3.5cm培养皿中。显微镜下用镊子在耳蜗底部钻一个小孔，从下至上剖开螺壳，暴露完整的蜗轴和蜗管。用镊子夹住耳蜗管的最底部，将耳蜗管与蜗轴分离。由此得到的耳蜗管包括螺旋韧带、前庭膜、以及基底膜(包含Corti器)。将分离得到的耳蜗管转移到新鲜4℃预冷的PBS中，进一步将包含Corti器的基底膜与前庭膜及螺旋韧带分离开。将基底膜转移到100μL 0.05％(w/v)的胰酶(购自Gbico)中，37℃消化7分钟，加入100μl 1mg/ml的大豆胰酶抑制剂(PBS缓冲液配制，购自Gbico，pH＝7.4)终止胰酶反应。

2)用量程为200μL的移液枪吹打步骤1)反应物30-40次，使单细胞从基底膜中脱落。细胞脱落后经70μm的细胞筛过滤，去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细胞聚集的单细胞悬液。然后用内耳干细胞培养基稀释，细胞密度为10⁵/ml，获得稀释后的单细胞悬液。内耳干细胞培养基组成为：1％(v/v)B27(血清替代物B27)、2％(v/v)N2(血清替代物N2)、20ng/mL EGF(表皮生长因子)、50ng/mL bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、10ng/mLIGF-1(类胰岛素生长因子1)、50μg/ml青霉素，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham's F-12，pH值为7.4。

3)稀释后的单细胞悬液经20μm的细胞筛过滤，获得单细胞悬液。

4)取步骤3)获得的200μL单细胞悬液，用2mL内耳干细胞培养基稀释后在37℃、5％CO₂孵育箱中悬浮培养1-5天，其中内耳干细胞会形成内耳干细胞球，其它非干细胞的细胞由于生长条件的限制而逐渐凋亡。分别取50μL培养1、3和5天的内耳干细胞培养基滴于玻片上，在显微镜下分别放大100倍(图1中的A行)和250倍(图1中的B行)观察内耳干细胞球。同时，分别取50μL培养1、3和5天的内耳干细胞培养基，让其中的内耳干细胞球在玻片上贴壁后，用200μL DAPI试剂(Roche公司)孵育细胞球1-3分钟，进行DAPI染色，并放大250倍观察内耳干细胞球，如图1中C行所示，每一个细胞球里有几十至数百个细胞。

实施例2 内耳干细胞基因表达检测

1)内耳干细胞总RNA提取：将实施例1中培养5天的含内耳干细胞球的培养基收集在15ml离心管中，1000rpm离心5分钟弃上清；加入1mL TRIzol(TakaRa公司)，置漩涡振荡器上震荡至内耳干细胞完全溶解后，转移至1.5ml EP管(Axgen公司)中；加入200μL氯仿(国药集团化学试剂有限公司)，剧烈振荡混匀，室温放置5min；4℃下12,000rpm离心15min，吸取上层水相约300μL入新的1.5ml EP管中；加入等体积的异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)，颠倒混匀，室温静置10min；4℃下12,000rpm离心10min，弃上清；用体积浓度75％的乙醇水溶液洗涤沉淀，4℃下12,000rpm离心5min，弃上清；室温干燥2-5min后，加入适量DEPC水(Sigma公司)溶解，即为内耳干细胞总RNA样品，用于下一步实验或保存于-80℃冰箱。

2)cDNA第一链合成：内耳干细胞总RNA样品用DNA酶(Sigma公司)消化处理清除残余的基因组DNA污染，用紫外分光光度计测定(波长为260nm)RNA浓度。cDNA第一链合成采用反转录试剂盒(Fermentas公司)，取2μg总RNA(0.5-1μL)用于第一链合成，平行3次。具体步骤如下：2μg总RNA(0.5-1μL)、1μL oligo(dT)18引物和1μL随机引物，ddH₂O补至总体积12μL，置65℃反应5min；加入5×buffer 4μL、dNTP2μL、ribolockTM RNase inhibitor 1μL和RevertAidTM M-MulV反转录酶1μL，反应总体积为20μL，PCR反应程序为25℃ 5min→42℃60min→70℃ 5min，RNA反转录产物即为cDNA第一链，用于下一步PCR反应。

3)PCR反应：将步骤2)制备的cDNA第一链作为模板进行RT-PCR扩增，所用引物序列见表1。PCR反应采用PCR Mix试剂盒(上海翊圣生物技术有限公司)，PCR反应体系为：cDNA 2μL、2mM dNTP 1μL、10μM的上下游引物各1μL、10×buffer(含1.5mM Mg²⁺)5μL和TaqDNA聚合酶1μL，加H₂O补至总体积50μL。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃～62℃退火30s，72℃延伸30s，35循环，72℃延伸7min，退火温度和循环数根据引物的具体情况进行选择。反应完成后取5μL扩增产物加1μL溴酚兰指示剂(Sigma公司)，用1.2％的琼脂糖(Biowest公司)进行凝胶电泳。采用RT-PCR检测细胞球中干细胞标志基因Nestin、Abcg2以及内耳发育标志基因Pax-2、BMP-4及BMP-7的表达情况，GAPDH作为参照基因。电泳完毕后，用凝胶成像分析***观测，结果如图2，表明实施例1中培养得到的细胞球中含有内耳干细胞。

表1用于RT-PCR的引物序列

实施例3 内耳干细球5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测

1)将实施例1中培养5天形成的内耳干细胞球用量程为200μL的移液枪吹打成单细胞，并1000rpm离心后收集细胞，然后细胞用2mL含5μmol/L Brdu(Sigma公司)的内耳干细胞培养液重悬后，37℃下培养5天形成子代内耳干细胞球。用200μL 0.1mg/ml的多聚赖氨酸(Sigma公司)孵育盖玻片5分钟，然后完全吸除多聚赖氨酸。用PBS漂洗盖玻片3次，每次5分钟。将盖玻片放入37℃孵育箱中干燥过夜。将子代内耳干细胞球接种于上述用多聚赖氨酸预处理的盖玻片上，然后用10％(v/v)胎牛血清(PBS；GIBCO公司)的DMEM/F12培养基在37℃下诱导贴壁培养4小时，并完全吸除培养基，备作如下Brdu免疫细胞化学检测。

2)细胞免疫化学：在100ml PBS(Gbico，pH＝7.4)中加入4g多聚甲醛，配制成4％(w/v)多聚甲醛固定液。然后将200μL 4％(w/v)多聚甲醛固定液加到步骤1)玻片贴壁培养4小时的内耳干细胞球上固定细胞15分钟，再用4℃预冷PBS(pH值为7.4)清洗细胞两遍；加入含0.25％(v/v)Triton-X 100(GIBCO公司)的PBS，于室温(25℃)下孵育10分钟，对细胞进行破膜处理。PBS清洗3遍，每遍5分钟。然后用含1％(w/v)BSA的0.1％(v/v)PBST(100ml PBS缓冲液(Gbico，pH＝7.4)中加入100μL Tween-20(Sigma公司))淹没细胞，室温(25℃)下封闭30分钟；用200μL含1％BSA的0.1％(v/v)PBST稀释的Brdu一抗(兔源多抗，Sigma公司；Brdu一抗与含1％BSA的0.1％(v/v)PBST的稀释体积比为1：200)完全覆盖细胞，4℃下孵育过夜。吸出含有一抗的PBST溶液，PBS清洗3遍，每遍5分钟；于室温(25℃)下用含1％BSA的PBS稀释的Alexa Fluor 488绑定驴抗兔二抗(Jackson；Alexa Fluor 488绑定驴抗兔二抗与含1％BSA的PBS稀释比为1:400)孵育细胞1小时；吸出含有二抗的PBS，PBS清洗细胞3次后加入200μL DAPI(Roche公司)复染1分钟，激光共聚焦显微镜下观察如图3。图3为内耳干细胞球形成之前加入Brdu试剂，内耳干细胞球形成之后检测Brdu抗体表达的情况。a为使用DAPI观察内耳干细胞球中的细胞核，b是Brdu抗体标记显微图，c是a与b合并图。内耳干细胞球中绝大部分细胞表达Brdu，说明这些细胞由增殖产生。

实施例4 内耳干细胞蛋白Nestin表达检测

将玻片放入24孔中，如实施例3预先用多聚赖氨酸处理5分钟，PBS洗3遍，每遍5分钟。处理好的玻片放入孵育箱中过夜干燥。将实施例1方法培养5天形成的内耳干细胞球接种在处理好的玻片上，用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养基在37℃诱导贴壁培养4小时，做Nestin免疫细胞化学检测。一抗为Nestin(兔源多抗，Abcam；Nestin与含1％BSA的0.1％(v/v)PBST的稀释体积比为1:200)，其它操作同实施例3。检测结果如图4，为实施例1方法培养5天形成的内耳干细胞球中干细胞标志蛋白nestin的检测结果。a为使用DAPI观察内耳干细胞球中的细胞核，b是Nestin抗体标记显微图，c是a与b合并图。说明细胞球中绝大部分细胞表达Nestin，为内耳干细胞。

实施例5 基因表达谱的检测

将3批内耳干细胞RNA送上海仪方生物科技有限公司进行Phalanx小鼠基因表达谱的检测。

RNA样品的定量与纯度以NanoDrop ND-1000(上海仪方生物科技有限公司)测定。纯度的吸光度质检标准为A260/A280≥1.8且A260/A230≥1.5。蛋白的吸收峰处于280nm，若比值过低表示样品中存在蛋白或酚类物质的影响；230nm吸收峰则是芳香基团、硫氰酸盐，或其他有机物质，A260/A230低于1.5则表示样本中可能存在一些污染。RIN值以安捷伦RNA6000nano assay检测(上海仪方生物科技有限公司)，检测RNA样本中18s与28s(真核生物)是否完整以判定RNA的完整性。RIN值在0-10之间，以10分为满分。RIN＞6表示样本的完整性良好可用于芯片实验。用于基因表达谱芯片检测的RNA质量检测如表2所示。

表2样品RNA质量检测

相对比较内耳毛细胞以及内耳祖细胞，对内耳干细胞差异表达性基因进行进一步分析，从内耳干细胞中筛选出30个特异表达的基因如表3。表3说明了内耳干细胞特异性表达基因在内耳干细胞中表达强度很高，在祖细胞和毛细胞中表达很低或是基本不表达，所以可以认为是特异性表达。

表3在内耳干细胞中特异性表达基因的基本信息

注：参考序列号来自于NCBI，详情参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

实施例6 特异性标志基因的验证

依据表3，筛选出在内耳干细胞中表达的Opcml、Phex和Gdf10共3种基因作为候选基因。从小鼠分离大脑、肝脏、皮肤、肺、肠、胃、肾脏、肌肉、心脏及眼睛共10种不同的组织及器官，用液氮将组织研磨成粉状，加入1ml Trizol溶解，提取总RNA后进行这8种基因的PCR检测。RNA的提取、cDNA第一链合成以及PCR反应同实施例2。候选基因引物设计见表4。

表4候选特异性基因的引物设计

PCR结束之后进行琼脂糖凝胶电泳的检测，候选基因在不同组织中的表达情况如图5。根据候选基因验证结果，除了内耳干细胞外，其他组织的细胞皆不能同时表达Opcml、Phex和Gdf10三种基因，由此确定Opcml、Phex和Gdf10三种基因的阳性表达为小鼠内耳干细胞的组合式细胞标记。

实施例7内耳干细胞的鉴定

1)将待测ICR小鼠(浙江省医学科学院)在-20℃冰箱中麻醉5分钟，浸入75％酒精中杀菌。用手术剪将小鼠直接断头，去除皮毛。然后在无菌状态下中分头颅，去除大脑及脑干，充分暴露位于颅底的颞骨。仔细的用剪刀和镊子分离出颞骨，将其转移到装有4℃预冷PBS(pH值为7.4)的3.5cm培养皿中。显微镜下用镊子在耳蜗底部钻一个小孔，从下至上剖开螺壳，暴露完整的蜗轴和蜗管。用镊子夹住耳蜗管的最底部，将耳蜗管与蜗轴分离。由此得到的耳蜗管包括螺旋韧带、前庭膜、以及基底膜(包含Corti器)。将分离得到的耳蜗管转移到新鲜预冷的PBS中，进一步将包含Corti器的基底膜与前庭膜及螺旋韧带分离开。将基底膜转移到100μL 0.05％(w/v)的胰酶(购自Gbico)中，37℃消化7分钟，加入100μl1mg/ml的大豆胰酶抑制剂(PBS缓冲液配制，购自Gbico，pH＝7.4)终止胰酶反应。

2)用量程为200μL的移液枪吹打步骤1)反应物30-40次，使单细胞从基底膜中脱落。细胞脱落后经70μm的细胞筛过滤，去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细胞聚集的内耳单细胞悬液。然后用内耳干细胞培养基稀释，细胞密度为10⁵/ml，获得稀释后的单细胞悬液。内耳干细胞培养基组成为：1％(v/v)B27、2％(v/v)N2、20ng/mL EGF、50ng/mLbFGF、10ng/mL IGF-1、50μg/ml青霉素，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham's F-12，pH值为7.4。

3)稀释后的单细胞悬液经20μm的细胞筛过滤，获得单细胞悬液，离心，获得单细胞。

4)提取步骤3)获得的内耳单细胞的RNA，进行Opcml、Phex和Gdf10三种基因表达的PCR检测。RNA的提取、cDNA第一链合成以及PCR反应同实施例2。同时提取小鼠肺组织细胞和肠组织细胞RNA并进行PCR检测作为对照。凝胶电泳见图6所示，泳道1、2和3为内耳单细胞，泳道4、5和6为肺组织细胞，泳道7、8和9为肠组织细胞，依次对应Opcml、Phex和Gdf10三种基因的检测。Opcml扩增产物长度为920bp，Phex扩增产物长度为258bp，Gdf10扩增产物长度为381bp。从图6可以看出，泳道4、5和6只表达Phex和Gdf10，但不表达Opcml；泳道7、8和9仅表达Gdf10，但是不表达Opcml和Phex。泳道1、2和3同时表达表达Opcml、Phex和Gdf10这三种基因，表明检测的内耳单细胞为内耳干细胞。

Claims (2)

1.一种检测小鼠内耳干细胞的标记分子，其特征在于所述的标记分子为Opcml、Phex和Gdf10。

2.一种权利要求1所述的标记分子在检测小鼠内耳干细胞中的应用，其特征在于所述的应用为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别以Opcml正向引物和Opcml反向引物，Phex正向引物和Phex反向引物，Gdf10正向引物和Gdf10反向引物作为三对引物进行PCR扩增，若Opcml正向引物和Opcml反向引物扩增产物920bp，Phex正向引物和Phex反向引物扩增产物258bp，且Gdf10正向引物和Gdf10反向引物扩增产物381bp，则单细胞为小鼠内耳干细胞；

Opcml正向引物：5’-ATGTACCATCCCGCCTACTG-3’；

Opcml反向引物：5’-CCAGGCCCATACAGGGTGAT-3’；

Gdf10正向引物：5’-CAGTTTGACTGGCTGGGCTA-3’；

Gdf10反向引物：5’-GGTCCCCTGGATTACCCTTG-3’；

Phex正向引物：5’-AGGTGTCAAAACCCCTGCAA-3’；

Phex反向引物：5’-GGACAATCTTGGGCATGGGG-3’。