ES2652603T3 - Composiciones bioactivas de plantas de Theacea y procedimientos para su producción y uso - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para aislar una fracción bioactiva que proviene de jugo celular de una planta Theacea, comprendiendo dicho procedimiento: proporcionar biomasa fresca de una planta Theacea, en el que dicha biomasa fresca comprende biomasa de planta Theacea fresca que no ha sufrido ningún procesamiento de té convencional; separar la biomasa fresca de la planta Theacea en jugo celular y un componente de paredes celulares, en el que dicha separación comprende moler, macerar y prensar la biomasa fresca para separar la biomasa fresca en el jugo celular y el componente de paredes celulares; tratar el jugo celular en condiciones eficaces para producir una fracción bioactiva, comprendiendo dichas condiciones someter el jugo celular a tratamiento con microondas para inducir la coagulación, proporcionando de este modo una fracción de membrana coagulada y una porción no coagulada del jugo celular, aislar la fracción bioactiva de la fracción de membrana coagulada, en el que la fracción bioactiva es la fracción de membrana o un extracto de la fracción de membrana, en el que la fracción de membrana se aísla separando la fracción de membrana coagulada del jugo celular no coagulado usando centrifugación y, en el que el extracto de la fracción de membrana se aísla sometiendo la fracción de membrana a extracción con disolvente con dimetilsulfóxido y a continuación centrifugación para proporcionar un sobrenadante que comprende el extracto de la fracción de membrana.

Description

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coagulación 40 es suficiente para permitir la separación posterior de la fracción de membrana coagulada de otros componentes no coagulados del jugo celular 30. Como se muestra en la figura 1, un modo de realización de dicha separación se logra por enfriamiento y centrifugación 42 para proporcionar la fracción de membrana (precipitado) 50 y el sobrenadante 60, que está libre de componentes de la membrana de cloroplastos específicos tales como clorofila y fosfolípidos.
Para producir el extracto de la fracción de paredes celulares (es decir, la composición A 110), las paredes celulares 32 se someten a secado 34 (por ejemplo, varios tratamientos con microondas posteriores) y a continuación a mezclado del material seco con agua 36 en condiciones usadas comúnmente para preparar tés convencionales (por ejemplo, mezclado en agua a 85 ºC).
Para producir el extracto de la fracción de membrana (es decir, la composición B 120), la fracción de membrana 50 se somete a mezclado con disolvente 52 y a continuación centrifugación 54 para proporcionar el sobrenadante 56 y la composición B 120.
Para producir el suero de jugo celular (es decir, la composición D 140), el sobrenadante 60 se somete a coagulación 62 (por ejemplo, precipitación isoeléctrica) y a centrifugación 64 para proporcionar el suero de jugo celular (sobrenadante) 66 y a continuación la composición D 140.
El procesamiento de té convencional 22 de biomasa fresca 10 se usa para producir, por ejemplo, el control positivo 150 (de varios tés, incluyendo, por ejemplo, los tés blanco, verde, oolong y negro).
La composición A 110, composición B 120, composición D 140, y el control positivo 150 se pueden usar a continuación para la filtración y las pruebas 80.
Ejemplos
Ejemplo 1-Preparación de composiciones bioactivas derivadas de plantas Camellia sinensis
En la figura 1 se muestra un esquema de un modo de realización del procedimiento de preparación de las composiciones bioactivas de la presente invención. A continuación se muestra una descripción de aspectos relevantes de un modo de realización del procedimiento de la presente invención.
Preparación de biomasa. Se cultivaron cantidades suficientes de biomasa de planta Camellia (Camellia sinensis) fresca (solo tejido superior de planta joven tierna con brotes) para proporcionar aproximadamente 100 kg de materia seca. Se calculó que el nivel de materia seca en la biomasa fresca era de un 21,70 %, requiriendo el cultivo de aproximadamente 461 kg de biomasa de planta fresca para proporcionar 100 kg de materia seca. Se tuvo cuidado de preservar el contenido en humedad inherente de la biomasa de planta y de evitar el marchitamiento debido a la pérdida de humedad. Se llevó a cabo el cultivo de manera tal que se evitara o se minimizara el picado, la maceración y la molienda de la biomasa recogida para evitar la alteración de la estructura celular de la hoja, lo que desencadena las reacciones enzimáticas endógenas catalizadas por fenoloxidasa y peroxidasa. Debido a que estas reacciones se intensifican con el tiempo de oxidación, se completaron todas las etapas en el periodo de tiempo más corto posible. Por ejemplo, se administró biomasa cultivada para el procesamiento no más de 10 minutos después del corte. Esto se realizó para minimizar la exposición de la biomasa de planta al sol, temperatura alta y otros factores ambientales negativos. Se realizó una etapa de lavado para retirar las partículas de suelo y otros restos de las plantas antes del procesamiento adicional. Este lavado se llevó a cabo lavando las plantas cultivadas durante ≤ 5 minutos en ≤ 1 kg/cm2 de presión de agua. El lavado con agua residual no contenía ningún pigmento verde ni marrón, lo que indica una presión de agua y una duración del lavado apropiadas. Se retiró el agua en exceso de la biomasa de planta lavada.
Molienda, maceración y prensado de la biomasa de planta. Después del cultivo, recogida y lavado de la biomasa de planta, las plantas sufren a continuación molienda, maceración y prensado pressing para extraer el contenido intracelular (es decir, el jugo celular de planta) y para separarlo de la fracción de las paredes celulares enriquecida de fibra (fracción de paredes celulares). Se usó un molino de martillos (modelo VS 35, Vincent Corporation, FL) que tiene un motor de 10 HP y conjunto de pantallas, para moler la biomasa para proporcionar partículas de tejido de planta de un tamaño adecuadamente pequeño en la menor cantidad de tiempo y sin un incremento significativo de la temperatura de la biomasa. Se ajustó el molino de martillos para producir el tamaño máximo de partículas de planta macerada de ≤ 0,5 centímetros durante ≤ 10 segundos de tratamiento. La temperatura de la biomasa se incrementó solo ≤ 5 ºC. Se usó de inmediato una prensa de husillo continua horizontal (Compact Press "CP-6", Vincent Corporation, FL) para extraer el jugo celular de planta de la planta. Se mantuvo la presión en el cono de la prensa de husillo en un nivel de 24 kg/cm2, con una velocidad de husillo de 12 rpm y un incremento de temperatura de solo ≤ 5 ºC. Este tratamiento proporcionó los 185 kg de fracción de paredes celulares que tiene un nivel de materia seca de un 41,39 % y 276 kg de jugo celular de planta que tiene un nivel de materia seca de un 8,49 %.
Preparación del extracto de la fracción de paredes celulares (composición A). Se secó la alícuota de la fracción de paredes celulares que tiene un nivel de materia seca inicial de un 41,39 % en una combinación de campana de microondas (modelo GH9115XE, Whirlpool) durante 30 s y a continuación se enfrió durante 30 s. Se repitió este tratamiento varias veces hasta que el nivel de materia seca en la fracción de paredes celulares alcanzó un 96,52 %.
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Se usó el siguiente procedimiento para producir té negro. Se mantuvo la biomasa fresca que contenía un 21,70 % de materia seca a 25 ºC con aireación periódica (1 hora "encendida" y 1 hora "apagada”) hasta que el nivel de materia seca alcanzó un 35 %. A continuación, se molieron (machacaron) a las partículas que tienen un tamaño de 2-3 mm. Este procedimiento da lugar a un incremento en la temperatura de la biomasa hasta aproximadamente 30 ºC. Se dispuso la biomasa molida en forma de capa (2" (5,08 cm) de alto) en una cinta transportadora de plástico para su fermentación (oxidación) durante 90 min a 25 ºC. Se secó la biomasa fermentada, que adquirió el color marrón, a 130 ºC durante 30 min hasta alcanzar un nivel de materia seca de un 97,5 %. A continuación, se añadieron 66,01 de agua desionizada con una temperatura de 85 ºC a 4,0 kg de hojas secas y se mantuvo con alta agitación durante 5 min. Estas condiciones están de acuerdo con el procedimiento de preparación de té, que se describe en D’Amelio, F.S., Botanicals. A Phytocosmetic Desk Reference, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.: CRC Press, p. 361 (1999), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad (véanse los análisis en www.leaftea.com; www.divinitea.com; www.equatorcoffee.com, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad). Se filtró la mezcla a través de 4 capas de una tela de nailon y se filtró a través del filtro que tiene poros de 0,8 μm. El pH del extracto de la fracción de paredes celulares obtenido era igual a 4,96 y el nivel de materia seca era igual a un 1,38 %. Este extracto se usó además para las pruebas de sus actividades.
Ejemplo 2-Distribución de materia seca con respecto a la preparación de composiciones bioactivas a partir de Camellia sinensis, Camellia japonica, Camellia reticulate, Camellia sasanqua y Eurya sandwicensis
Se analizaron y se compararon varias fracciones recogidas durante la producción de composiciones bioactivas para determinar su distribución de materia seca. La tabla 1 muestra la distribución de 100 kg de materia seca entre los productos de fraccionamiento de plantas de té. Se determinó que el procedimiento de la presente invención permite una conversión del rendimiento extraído en jugos celulares de planta en el intervalo de desde aproximadamente un 20 a un 30 % de materia seca de biomasa inicial. El rendimiento de materia seca de las fracciones de membrana estaba en el intervalo de un 5 % a un 10 % de materia seca de biomasa inicial y de un 25 % a un 35 % de materia seca de jugo celular. La tabla 1 muestra que los rendimientos de la materia seca de las fracciones de citoplasma no excedieron de un 1,0 % de la materia seca de biomasas inicial y posteriormente de un 2,5 % de la materia seca del sobrenadante de jugo celular. La mayoría de la materia seca del sobrenadante de jugo celular se concentró en suero de jugo celular. Se usaron la fracción de paredes celulares, la fracción de membrana y la fracción de citoplasma como fuentes para la preparación de sus extractos, que se categorizan como composiciones bioactivas. El suero de jugo celular se usó directamente "como es" como composición bioactiva posterior que no tiene disolventes exógenos.
Tabla 1 -Distribución de 100 kg de materia seca entre los productos del fraccionamiento de la biomasa fresca
Producto
Fuente de planta
Camellia sinensis
Biomasa inicial
100,0
Fracción de paredes celulares
76,6
Jugo celular
23,4
Fracción de membrana
6,5
Fracción de citoplasma
0,6
Suero de jugo celular
16,3
Cabe destacar que los tres materiales seleccionados son la representación más diversificada de todas las estructuras funcionales, que existen en el tejido de la planta fresca. Solo el suero de jugo celular soluble tiene propiedades fisicoquímicas, lo que permite la administración directa a los sistemas de prueba in vitro usados comúnmente. Se usaron la fracción de paredes celulares, la fracción de membrana y la fracción de citoplasma como materias primas para la extracción con disolventes. Debido a que la fracción de paredes celulares es estructuralmente similar a los productos de planta de té convencionales, se extrajo esta fracción con agua para proporcionar la mejor comparación con tés convencionales. Se extrajo la fracción de membrana con dimetilsulfóxido, que facilita la solubilización eficaz de los componentes tanto hidrófobos como hidrófilos integrados en las estructuras de cloroplastos y mitocondrias. Se extrajo la fracción de citoplasma con agua. Se usó el suero de jugo celular "como es".
La tabla 2 muestra el rendimiento de las cuatro composiciones bioactivas probadas: extracto de la fracción de paredes celulares (composición A), extracto de la fracción de membranas (composición B), extracto de la fracción de citoplasma (composición C), suero de jugo celular (composición D) y controles -extracto de té blanco o extracto de té negro de 100 kg de la biomasa materia seca inicial.
Tabla 2 -Rendimiento de las composiciones bioactivas de 100 kg de biomasa inicial
Producto
Fuente de planta
Camellia sinensis
Biomasa inicial
100,0
Composición A (extracto de la fracción de paredes celulares)
14,35
Composición B (extracto de la fracción de membrana)
2,37
Composición C (extracto de la fracción de citoplasma)
0,2
Composición D (suero de jugo celular)
16,3
Control (extracto de té blanco o té negro)
15,14...19,36
La tabla 2 muestra que el rendimiento total de las composiciones bioactivas A, B, C y D de 100 kg de materia seca de Camellia sinensis iguala un 33,3 %, lo que excede significativamente el rendimiento del procedimiento de té convencional -15,14...19,36 %.
5 Ejemplo 3-Comparación de la composición A (extracto de la fracción de paredes celulares) y extractos de tés convencionales
Se midieron varios parámetros de la composición bioactiva A y extractos de té blanco y té negro obtenidos a partir del mismo lote de Camellia sinensis fresca y los resultados posteriores de estos se presentan en la tabla 3 (Los procedimientos experimentales usados se describen en los ejemplos 9 y 20, y en la publicación de solicitud de
10 patente de los EE. UU. N.º 2003/0175235).
Tabla 3 -Varios parámetros de la composición bioactiva A y extractos de tés blanco y negro.
Parámetro
Extracto de la fracción de paredes celulares (composición A) Controles
Extracto de té blanco
Extracto de té negro
Materia seca, %
0,84 1,10 1,38
pH
5,24 5,52 4,96
Conductividad, mS/cm
1,57 2,23 5,32
Sólidos disueltos totales, g/l
0,78 1,23 2,71
Potencial redox, mV
123 159 188
Área bajo la curva de los espectros (ASC) 200 -450 nm, Abs • nm
5,727 6,604 4,616
ASC : Materia seca
6,818 6,004 3,345
Actividad eliminadora de superóxido (RCI50), μg DM/ml
26,3 114,5 227,1
Color (escala 1...10)
9,6 4,7 7,5
Sabor (escala 1...10)
9,3 6,1 6,6
Sensación bucal (escala 1...10)
9,4 6,5 5,3
La tabla 3 muestra que el extracto de la fracción de paredes celulares tienen menores niveles de materia seca, electrolitos y sólidos disueltos en comparación con los extractos de té blanco y té negro convencionales. Los datos espectrales UV/VIS muestran que el extracto de la fracción de paredes celulares tiene el valor específico más alto 15 del área bajo la curva de los espectros, es decir este producto particular de Camellia (composición A) tiene el mayor nivel de constituyentes ópticamente activos por unidad de materia seca. Adicionalmente, el extracto de la fracción de paredes celulares tiene la menor cantidad de potencial redox, lo que indica que esta composición se oxida menos que los extractos de té blanco y té negro convencionales. El extracto de la fracción de paredes celulares demostró la actividad eliminadora de superóxido, dando como resultado una inhibición del 50 % de la reducción de 20 la c de citocromos (RCI50) a una concentración mucho menor que los extractos de té blanco y té negro. Se seleccionó un procedimiento de prueba de análisis de descripción cualitativo ("QDA") para caracterizar y cuantificar sistemáticamente tés basándose en el color, sabor y sensación bucal, que rigen la aceptabilidad de las bebidas de té. El procedimiento de QDA emplea un equipo entrenado de catadores expertos para cuantificar los atributos anteriores de las bebidas de té con relación a los estándares de referencia definidos. La evaluación comparativa del
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semi-permeable. La selección de un valor límite de membrana particular se determina por el tipo de composición bioactiva, pero en general es preferente un límite mayor que permita la liberación en la fase acuosa circundante de un mayor porcentaje de materia seca de la composición que disminuya la cantidad del potencial redox.
Ejemplo 5 -Preparación de ingrediente tópico SF derivado de suero de jugo celular
El suero de jugo celular (composición D) no se puede usar como ingrediente activo de productos tópicos debido a su falta de estabilidad y deterioro de color y olor. El procedimiento descrito permite el refinamiento de la fracción de suero de jugo celular para proporcionar un ingrediente tópico SF estable y activo (este procedimiento es similar al describe previamente en la publicación de solicitud de patente de los EE. UU. N.º 2003/0175235, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). El refinamiento del suero de jugo celular implicó las siguientes etapas: tratamiento térmico, enfriamiento, filtración y estabilización. El refinamiento se realizó de inmediato después de la separación del suero de jugo celular de la fracción de citoplasma como se describe en el ejemplo 1. Se expuso el suero de jugo celular a un tratamiento de microondas usando un control de sonda de temperatura. Este tratamiento continuó hasta que la temperatura del suero de jugo celular alcanzó 99 ºC (se requería 90 ºC como se describió previamente en la publicación de solicitud de patente de los EE. UU. N.º 2003/0175235, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). Una vez que se indujo la coagulación, el suero de jugo celular tratado se enfrió de inmediato hasta 10 ºC. El suero de jugo celular coagulado se filtró a vacío a través de un filtro con poros de 0,8 μm (se usaron capas dobles de filtros Whatman N.º 2 en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.º 2003/0175235). Se desechó el precipitado y se usó el suero de jugo celular resultante para procesamiento adicional (es decir, estabilización). Se logró la estabilización del filtrado de suero de jugo celular añadiendo conservantes (no se necesitó antioxidante exógeno como se describió previamente en la publicación de solicitud de patente de los EE. UU. N.º 2003/0175235.) y se logró incubar la mezcla hasta su completa solubilizante. Los conservantes usados incluyeron lo siguiente: sorbato de potasio al 0,1 %, benzoato de sodio al 0,1 %, metilparabeno de sodio al 0,1 % y ácido cítrico al 0,1 %. Esta preparación dio como resultado la producción de 16,3 kg de rendimiento de materia seca (o aproximadamente 286 litros) de los ingredientes tópicos SF, que se usaron para la caracterización de sus cualidades bioactivas y fisicoquímicas. Las condiciones de almacenamiento recomendadas para el ingrediente tópico SF incluyen el almacenamiento en un recipiente cerrado protegido de la luz a una temperatura de entre 15 ºC y 25 ºC.
Ejemplo 6 -Especificaciones de producto del ingrediente tópico SF derivado de la fracción de suero de jugo celular
Se preparó el ingrediente tópico SF de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 5. Se realizaron análisis del ingrediente tópico SF para determinar sus diversas características fisicoquímicas, microbianas, de citotoxicidad y bioactividad, como se describe a continuación. El ingrediente tópico SF es un líquido transparente, que tiene un color marrón amarillento claro y un olor característico suave. No se añadió disolvente (es decir glicol, aceite o agua) al medio de vehículo. La tabla 5 resume los datos físicos y químicos del ingrediente tópico SF.
Tabla 5 -Parámetros físicos y químicos del ingrediente tópico SF
Parámetro
Procedimiento Resultados
Contenido en sólidos, %
Véase el ejemplo 10, "Procedimiento 1" 5,04
Gravedad específica, g/cm3
USP <841> 1,015
Color
Escala Gardner 5 -6
Índice de refracción
USP <831> 1.312
PH
USP <79I> 4,0
Potencial redox, mV
Véase referencia [1] 75
conductividad, S/m
Véase referencia [2] 1,02
Referencias: [1] Handbook of chemistry and Physics, 80ª edición, CRC Press, 1999-2000, 5-90; [2] Handbook of Chemistry and Physics, 80ª edición, CRC Press, 1999-2000, 8-21, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
La tabla 6 describe los datos de espectros UV con relación al ingrediente tópico SF. 5
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Tabla 6 -Espectros UV del ingrediente tópico SF (dilución 1:500)
Pico
Parámetro Procedimiento Resultados
Inicio, mn
USP <197> 450
N.º 1
Cima, nm -" 266,5
Final, nm
-" 247
Altura, Abs
-" 0,231
Área, Abs x nm
-" 13,676
Inicio, nm
USP <197> 247
Cima, nm
-" 204
N.º 2
Final, nm -" 200
Altura, Abs
-" 1,396
Área, Abs x mn
-" 32,413
El análisis microbiano realizado de acuerdo con el siguiente procedimiento (USP <61>) demostró que el ingrediente tópico SF contiene menos de 100 unidades formadoras de colonias por gramo de muestra y no tiene patógenos (E. coli, Candida albicans, Pseudomonas sp. y Staphylococcus aureus). Estos datos demuestran que el ingrediente tópico SF satisface los requisitos industriales para los ingredientes de productos tópicos.
Se determinó que el ingrediente tópico SF era estable (es decir, mantenía la integridad física y química) durante al menos 12-18 meses mientras se almacene a una temperatura de entre 15 y 25 ºC en un recipiente cerrado protegido de la luz. El ingrediente tópico SF es un producto biodegradable. En una evaluación clínica controlada, el ingrediente tópico demostró las actividades biológicas, que se resumen en la tabla 7.
Tabla 7 -Actividades biológicas del ingrediente tópico SF
Actividad
Procedimiento μg DM/ml
Actividad eliminadora de superóxido (RCI50)
Véase el ejemplo 20, "Procedimiento 7" 69,5
Inhibidor de elastasa (CI50)
Véase el ejemplo 20, "Procedimiento 5" 32,3
Inhibidor de MPM-9 (CI50)
Véase el ejemplo 20, "Procedimiento 6" 14,6
Inhibidor de tripsina (CI50)
Véase referencia [1] 7,8
Referencia: [1] Cannel et al., Planta Medica 54:10-14 (1988), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
La tabla 7 mostró que el ingrediente tópico SF demostró capacidad eliminadora de superóxido. En una evaluación clínica controlada, el ingrediente tópico SF demostró una inhibición del 50 % de reducción de citocromo c (RCI50) a una concentración de 69,5 μg de materia seca por ml. La RCI50 de positivo control (ácido rosmarínico) = 26,5 μg/ml. Además de las propiedades antioxidantes, el ingrediente tópico SF demostró actividades antiproteolíticas frente a péptido hidrolasas, por ejemplo elastasa, gelatinasa B o la denominada matriz metaloproteinasa 9 (MPM-9), y tripsina. Entre estas enzimas, la posición única pertenece a elastasa y MPM-9, que actúan de forma sinérgica y desempeñan un papel importante en la inflamación cutánea. Cabe destacar, que ambas MPM-9 y elastasa se secretan por los leucocitos (neutrófilos) y estas enzimas son las enzimas clave en la ruta final que da lugar a la inflamación. En general, se acuerda que si la preparación puede inhibir ambas enzimas (elastasa y MPM-9), se considera que dicha preparación es muy eficaz para tratar procedimientos inflamatorios.
Cabe destacar que los procedimientos de envejecimiento cutáneo, quemaduras solares, formación de heridas y cicatrices tienen el mismo mecanismo de inflamación, lo que implica tanto MPM-9 como elastasa. Por tanto, el ingrediente tópico SF que puede inhibir las dos enzimas anteriores tiene un espectro muy amplio de aplicaciones "entre las que está la lesión inflamatoria debido a los siguientes motivos:
a.
Estas dos enzimas pueden sinergizar para degradar todos los componentes de la matriz extracelular de tejido humano;
b.
La elastasa puede inactivar la propia defensa inhibidora del cuerpo frente a MPM-9; y
c.
La MPM-9 puede inactivar la propia defensa inhibidora del cuerpo frente a la elastasa.
La combinación de las propiedades antiinflamatorias y antioxidantes del ingrediente tópico SF sugiere que esta preparación hidrófila basada en la composición bioactiva D puede actuar sistémicamente en problemas de
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trastornos cutáneos muy fundamentales.
Ejemplo 7 -Preparación del ingrediente tópico MF derivado de la fracción de membrana
La fracción de membrana recién obtenida es una pasta que tiene color intenso y olor específico. Esta fracción se representa predominantemente por cloroplastos y su composición incluye predominantemente fosfolípidos, proteínas de membrana, clorofila y carotenoides. El secado de la fracción de membrana da como resultado pérdidas irreversibles de muchas propiedades valiosas requeridas para la exploración de la fracción de membrana como ingrediente tópico. Sin secar, la fracción de membrana inestable se transforma rápidamente en conglomerados insolubles y no dispersables de color oscuro que tienen un olor fuerte y no característico. Como resultado, dicho material no se puede usar como ingrediente tópico. El procedimiento descrito a continuación permite la transformación de fracciones de membrana recién obtenidas en ingredientes tópicos estables y activos (este procedimiento es similar al descrito previamente en la publicación de solicitud de patente de los EE. UU. N.º 2003/0175235).
Inmediatamente después de la separación de la fracción de membrana del jugo celular de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 1, la fracción de membrana se estabilizó y se incorporó en una matriz polimérica. Para preparar aproximadamente 100 gramos de ingrediente tópico MF, la fracción de membrana celular se estabilizó mezclándola con emulsionante no iónico polisorbato 80 (Tween 80) y antioxidantes (Tenox 4). Específicamente, se mezclaron enérgicamente 20 gramos de fracción de membrana fresca con 3,5 gramos de Tween 80 y 0,1 gramos de Tenox 4 (solución de hidroxianisol butilado e hidroxitolueno butilado en aceite) hasta homogeneidad, mientras se evita la aireación durante el mezclado.
Una vez estabilizada, la fracción de membrana se incorporó en una matriz polimérica (es decir, una dispersión de emulsionante polimérico, polímero reticulado de acrilatos/C10-C30 acrilato). La matriz polimérica se preparó dispersando 0,9 gramos de Pemulen TR-2 en 69,2 gramos de agua desionizada caliente y mezclando hasta uniformidad usando agitación moderada, mientras se evita la aireación. En paralelo, se combinaron 5 gramos de glicerina y 1,0 gramo de Phenonip (mezcla de fenoxietanol (y) metilparabeno (y) butilparabeno (y) etilparabeno (y) propilparabeno) en un recipiente separado y se mezcló hasta uniformidad. Con agitación moderada, las fases que contienen Pemulen y glicerina se combinaron y se mezclaron hasta uniformidad. Para incorporar la fracción de membrana en la matriz polimérica, la fase que contiene la fracción de membrana, Tween 80 y Tenox 4, se añadió a la fase que contiene el Pemulen, glicerina y Phenonip, y a continuación se mezcló con agitación enérgica mientras se evita la aireación. La estabilización de la mezcla de fracción de membrana se logró neutralizándola con solución acuosa al 18 % de hidróxido de sodio (NaOH) y se mezcló enérgicamente para producir un sistema uniforme que tiene un pH de 5,0 ± 0,4. Esta preparación, que se inició a partir de 100 kg de biomasa de Camellia fresca (aproximadamente 461 kg de hojas frescas que tienen un 21,7 % de materia seca), dio como resultado la producción de 11,85 kg de rendimiento de materia seca (o aproximadamente 172 litros) de ingrediente tópico MF, que se usó para la caracterización de sus cualidades fisicoquímicas y bioactivas. Las condiciones de almacenamiento recomendadas para el ingrediente tópico MF incluyen el almacenamiento en un recipiente cerrado protegido de la luz a una temperatura de entre 2 y 8 ºC.
Ejemplo 8 -Especificaciones de producto del ingrediente tópico MF derivado de la fracción de membrana
Se preparó el ingrediente tópico MF de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 7. Se realizaron análisis del ingrediente tópico MF para determinar sus diversas características fisicoquímicas, microbianas, de citotoxicidad y bioactividad, como se describe a continuación. El ingrediente tópico MF es un gel opaco, que tiene un color marrón verdoso y un olor característico suave. El ingrediente tópico MF se formuló utilizando los constituyentes del jugo celular natural gelificados con un polímero para garantizar el mayor nivel de pureza uniformidad, compatibilidad, estabilidad, seguridad y eficacia.
La tabla 8 describe los datos físicos y químicos del ingrediente tópico MF.
Tabla 8 -Parámetros físicos y químicos del ingrediente tópico MF
Parámetro
Procedimiento Resultados
Residuo no volátil (RNV), %
Véase el ejemplo 10, "Procedimiento 2" 6,9
Gravedad específica, g/cm3
USP <841> 1,035
Viscosidad, cps
USP <911> 18,700
pH
USP <791> 4,6
Carotenoides totales, % RNV
Véase el ejemplo 10, "Procedimiento 4" 0,36
Luteína, % RNV
Véase el ejemplo 10 20, "Procedimiento 4" 0,34
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La tabla 9 resume los datos de los valores L*a*b* con relación al ingrediente tópico MF.
Tabla 9. -Valores L*a*b* del ingrediente tópico MF
Parámetro
Procedimiento Resultados
L*
Véase el ejemplo 10, "Procedimiento 3" 30,27
a*
-" 27,36
b*
-" 42,56
Los análisis microbianos demostraron que el ingrediente tópico MF satisface los requisitos de la industria para los ingredientes tópicos con respecto a las CFU y ausencia de patógenos (USP <61>).
Se determinó que el ingrediente tópico MF era estable (es decir, mantenía la integridad física y química) durante al menos 12-18 meses mientras se almacene a una temperatura de entre 2 y 8 ºC en un recipiente cerrado protegido de la luz. El ingrediente tópico MF es un producto biodegradable. En una evaluación clínica controlada, el ingrediente tópico MF demuestra actividad inhibidora de elastasa y actividad inhibidora de tripsina. La tabla 10 resume determinados resultados de bioactividad para el ingrediente tópico MF.

Tabla 10. -Resultados de bioactividad del ingrediente tópico MF
Actividad
Procedimiento CI50 (μg/ml)
Inhibidor de elastasa (CI50)
Véase el ejemplo 10, "Procedimiento 5" 12,3
Inhibidor de MPM-9 (CI50)
Véase el ejemplo 10, "Procedimiento 6" 5,6
Inhibidor de tripsina (CI50)
Véase referencia [1] 3,8
Referencia: [1] Cannel et al, Planta Medica 54:10-14 (1988), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
La tabla 10 muestra que el ingrediente tópico MF demostró propiedades similares a las del ingrediente tópico SF (véase el ejemplo 6). Aunque el ingrediente tópico MF no tiene actividad eliminadora de superóxido, demuestra mayores actividades de inhibición enzimática específica que el ingrediente tópico SF. Por tanto, el ingrediente tópico MF, que se basa en la composición bioactiva B, se debe considerar como un potente ingrediente antiinflamatorio multfase que tiene aplicaciones amplias para el tratamiento de trastornos cutáneos.
Ejemplo 9 -Análisis espectrales de las composiciones bioactivas derivadas de plantas de Camellia sinensis
Introducción a los análisis espectrales. La radiación ultravioleta (UV) tiene efectos dañinos sobre la piel humana. Los efectos a corto plazo incluyen bronceado y quemaduras solares, mientras que los efectos a largo plazo de una exposición UV acumulativa incluyen el fotoenvejecimiento de la piel y un incremento en el riesgo de cáncer de piel. La lesión cutánea por exposición ultravioleta está mediada por un daño oxidativo, y varios extractos vegetales con actividad antioxidante son prometedores como agentes protectores: extracto de semilla de uva (Carini et al., "Protective Effect of Procyanidines from Vitis vinifera Seeds on UV-Induced Photodamage: In vitro and In vivo Studies," Proceedings of the 19th IFSCC Congress 3:55-63 (1996), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad), licopeno (Di Mascio et al., "Lycopene as the Most Efficient Biological Carotenoid Singlet Oxygen Quencher," Archives of Biochemistry and Biophysics 274:532-8 (1989); y Ribaya-Mercado et al., "Skin Lycopene is Destroyed Preferentially Over β-Carotene During Ultraviolet Irradiation in Humans," Journal of Nutrition 125:1854-9 (1995), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad), silimarina (Morazzoni et al., "Silybum marianum (Carduus marianus)," Fitoterapia 66:3-42 (1995); Katiyar et al., "Protective Effects of Silymarin Against Photocarcinogenesis in a Mouse Skin Model," Journal of the National Cancer Institute 89:556-66 (1997), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad), y en especial extracto de té verde que tiene mayor eficacia en comparación con extractos producidos a partir de otras fuentes vegetales (Katiyar et al., "Protection Against Ultraviolet-B Radiation-Induced Local and Systemic Suppression of Contact Hypersensitivity and Edema Responses in C3H/HeN Mice by Green Tea Polyphenols," Photochemistry and Photobiology 62:855-61 (1995); Ruch et al., "Prevention of Cytotoxicity and Inhibition of Intercellular Communication by Antioxidant Catechins Isolated from Chinese Green Tea," Carcinogenesis 10:1003-8 (1989); Wang et al., "Protection Against Ultraviolet B Radiation-Induced Photocarcinogenesis in Hairless Mice by Green Tea Polyphenols," Carcinogenesis 12:1527-30 (1991), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad).
Se descubrió que las hojas de la planta de té (Camellia sinensis) tienen un alto contenido en polifenoles con actividad antioxidante que incluye (-)-epicatequina, (-)-epicatequina-3-galato, (-)-epigalocatequina, y (-) epigalocatequina-3-galato. El extracto de té verde ha demostrado actividad antioxidante frente al peróxido de hidrógeno y los radicales de superóxido y prevención de la citotoxicidad oxidativa. El extracto también puede
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prevenir la inhibición de la comunicación intercelular, un posible mecanismo de promoción tumoral. Existe una estrecha asociación entre la supresión inmunitaria inducida por UV y el desarrollo de cáncer de piel, y se ha descubierto que el extracto de té verde protege frente a la inflamación y la supresión inmunitaria provocada por la radiación UV-B. El extracto de té verde tomado por vía oral en agua potable o aplicado por vía tópica protege frente a la carcinogénesis cutánea inducida por UV-B en modelos animales. Estos resultados indican que el extracto de té verde tomado por vía oral puede ayudar a evitar el cáncer de piel.
Aunque se han establecido las propiedades de protección UV de los productos de Camellia, el mayor potencial de la planta de té como fuente para una protección eficaz de la piel frente al daño solar no se ha explorado completamente debido a las limitaciones de la tecnología convencional, que está orientada a centrarse en una banda de limitada a relativamente estrecha de ingredientes activos: de forma predominante catequinas.
Los estudios sobre las propiedades de protección UV comparativos descritos en el presente documento entre productos de Camellia "novedosos" y "convencionales" han demostrado ahora que la tecnología de "fraccionamiento de Camellia fresca" puede proporcionar productos más potentes. La comparación se realizó utilizando los procedimientos usados comúnmente para determinar las propiedades espectrales de las soluciones y el factor de protección solar (SPF) in-vitro.
Metodología A: Espectros UV/VIS. Se obtuvieron espectros UV/VIS de productos de Camellia en la región de 200 450 nm usando el espectrofotómetro que cumple con la farmacopea Ultrospec 4300 Pro (Amersham Biosciences Ltd., Buckinghamshire, Inglaterra). Los parámetros espectrales de productos de Camellia diluidos en agua destilada se determinaron de acuerdo con el procedimiento descrito en USP <197>.
Metodología B: Espectros de absorbancia. Se obtuvieron espectros de absorbancia de los productos de Camellia en la región de 250 -450 nm usando el analizador de transmitancia UV-1000S (Labsphere, Inc., North Sutton, NH) y sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT), que imita las propiedades de superficie de piel humana. Contiene componentes tanto proteicos como lipídicos optimizados y está diseñado para tener topografía, pH, tensión de superficie crítica y fuerza iónica similar a la piel humana.
Las muestras de Camellia se pulverizaron uniformemente sobre una superficie de sustrato prehidratado (dosis de aplicación = 2,0 μl / cm2). Después de 15 min después de la aplicación, se tomaron los espectros de absorbancia inicial por medio de (5) repeticiones. A continuación, se irradiaron los sustratos con productos aplicados por un simulador de luz solar de amplio espectro (Modelo 16S-300 Single Port, Solar Light Company, Inc., Filadelfia, PA) equipado con una lámpara de xenón de 300 vatios. El sistema de control de dosis PMA 2100-DCS permitió un control de precisión de la dosis administrada a una muestra.
De inmediato después de la irradiación (dosis de irradiación = 60 Julios / cm2), se tomaron los espectros de absorbancia del mismo punto en (5) cinco repeticiones. Se usaron los espectros de absorbancia de las muestras antes y después de la irradiación para el análisis estadístico.
Muestras. Se evaluaron las siguientes composiciones bioactivas, que se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 1: composición A (extracto de la fracción de paredes celulares que tienen un 0,84 % de materia seca), composición B (extracto de la fracción de membrana que tiene un 6,83 % de materia seca), composición D (suero de jugo celular que tiene un 5,69 % de materia seca). Como controles, se usaron extracto de té blanco convencional que tiene un 1,10 % de materia seca y extracto de té negro convencional que tiene un 1,38 % de materia seca. Se obtuvieron todas las muestras del mismo lote de Camellia fresca, que se recogió en Charleston Tea Plantation, SC. Estas muestras no contenían ningún aditivo.
Análisis. Se descubrió que todas las muestras de Camellia tienen valores de absorbancia UV altos y por tanto se diluyeron con agua destilada. Los espectros UV-VIS de los productos de Camellia diluidos se presentan en las figuras 2 y 3.
Los espectros de todas las muestras líquidas tienen ciertas similitudes. Por ejemplo, las posiciones de los picos varían en intervalos relativamente estrechos de λmáx1 = 269 -274 nm y λmáx2 = 205 -208 nm, lo que indica la presencia de anillos aromáticos y sistemas conjugados de enlaces σ -π en todas las muestras sometidas a prueba. Sin embargo, el valor de cima de los picos, el área bajo cada pico y el área total bajo las curvas espectrales integrales son diferentes (tabla 11), lo que sugiere que las muestras sometidas a prueba tienen diferentes composiciones de constituyentes ópticamente activos.
imagen9
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La comparación de las áreas bajo las curvas espectrales integrales obtenidas de 200 nm a 450 nm demuestra claramente que el extracto de la fracción de membrana (composición B) y el suero de jugo celular (composición D) tuvieron los mayores valores de absorción (tabla 11). La proporción de "área bajo los espectros : materia seca" indica que el valor de absorción específico de las muestras es creciente en las siguiente secuencia: extracto de té negro > extracto de té blanco > extracto de fracción de paredes celulares > suero de jugo celular > extracto de fracción de membrana (tabla 12).

Tabla 12 -Características espectrales seleccionadas de los productos de Camellia
Materia seca %
Área bajo los espectros, Abs • nm Proporción: Área bajo los espectros (200-450 nm) Materia seca Área bajo los espectros (290-400nm) Abs • nm Proporción: Área bajo los espectros(290-400 nm) Materia seca
Extracto de té blanco
1,10 6,604 6,004 0,812 0,738
Extracto de té negro
1,38 4,616 3,345 0,854 0,619
Extracto de fracción de paredes celulares
0,84 5,727 6,818 0,776 0,924
Extracto de fracción de membrana
6,83 80,133 11,733 4,304 0,630
Suero de jugo celular
5,69 39,599 6,959 4,320 0,759
En base a la comparación de los valores de absorción, parece que las composiciones bioactivas novedosas son protectores de la piel más eficaces frente al daño solar que los extractos de té blanco y té negro convencionales. Cabe señalar que las propiedades de protección UV de los productos de Camellia se pueden estimar mejor usando datos de absorción relacionados con el área de 290 nm a 400 nm debido a que esta parte particular de los espectros es responsable del daño inducido por UV de la piel (Sayre et al., "A Method for the Determination of UVA Protection for Normal Skin," Journal of American Academy of Dermatology 23: 429-40 (1990), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). Aunque la absorción de las muestras líquidas sometidas a prueba en el área de 290-400 nm solo contribuye al ~10 % de absorción de UV/VIS total, las composiciones de Camellia novedosas tienen además mayor absorción en el área espectral.
Por tanto, los datos relacionados con las soluciones diluidas de muestras de Camellia proporcionaron una estimación inicial de potencia de protección UV de los productos sometidos a prueba, que se evaluó adicionalmente usando el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT). Los resultados se presentan en las figuras 4-13. Se descubrió que las composiciones de Camellia novedosas y los extractos de té blanco y té negro convencionales tienen características espectrales diferentes incluso después de que se aplicaran sobre el sustrato en concentraciones, que se igualaron con respecto al nivel de materia seca (Figuras 4 y 5).
Los espectros de muestras de Camellia, que se aplicaron en el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) incluyeron de cuatro a dos picos característicos, que tienen valores de cima diferentes (tabla 13).

Tabla 13 -Parámetros de espectros de absorbancia de productos de Camellia aplicados en el sustrato deprueba Vitro-Skin®
Pico n.º 1
Pico n.º 2 Pico n.º 3 Pico n.º 4
λmáx4
Altura, Abs λmáx3 Altura, Abs λmáx2 Altura, Abs λmáx1 Altura, Abs
Extracto de té blanco
260 0,389 286 0,461 330 0,163 392 0,076
Extracto de té negro
260 0,399 286 0,373 330 0,175 390 0,105
Extracto de fracción de pared celular
260 0,555 286 0,569 330 0,203 389 0,118
Extracto de fracción de membrana
260 0,394 286 0,549 - - 394 0,059
Suero de jugo celular
260 0,431 286 0,517 - - - -
Cabe señalar que los parámetros de los picos característicos de los productos de Camellia en las soluciones (tabla 11) fueron muy diferentes en comparación con los característicos de los productos de Camellia, que se aplicaron en el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) (tabla 13). Como muestran los experimentos de control, el menor nivel de pH (~ 5,5) sobre la superficie Vitro-Sin® no puede ser responsable de las diferencias anteriores, que probablemente son el resultado de interacciones químicas entre los productos de Camellia y los
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ingredientes usados para la preparación del sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT). Por tanto, el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) contiene componentes tanto proteicos como lipídicos que podrían interaccionar químicamente con los constituyentes fenólicos de Camellia. Cabe destacar que se observaron desplazamientos en las propiedades espectrales de los productos sometidos a prueba para todas las composiciones bioactivas así como para los extractos de tés convencionales.
También se compararon los espectros de composiciones de Camellia novedosas y extractos de productos de Camellia convencionales "como son", teniendo en cuenta los diferentes contenidos en materia seca de las muestras sometidas a prueba. Los espectros de absorbancia de los productos de Camellia aplicados en el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) en volúmenes iguales se presentan en la figura 6.
Aunque existen algunas similitudes entre los espectros del extracto de la fracción de paredes celulares y del extracto de té blanco, el primer producto tienen mayor absorbancia en el área de 250 -280 nm y en el área de UV cercano. Cabe destacar que una mayor absorbancia no se corresponde con el nivel de materia seca, que es mayor en el extracto de té blanco (1,10 %) en comparación con el extracto de la fracción de paredes celulares (0,84 %). Esto sugiere que las composiciones de estas dos muestras no son idénticas y que el extracto de la fracción de paredes celulares también tienen menor conductividad que consiste en mayores ingredientes ópticamente activos no disociados responsables de la alta absorbancia (véanse los datos presentados en la tabla 3).
Adicionalmente, se descubrió que los espectros del extracto de la fracción de membrana (composición B) y del suero de jugo celular (composición D) son diferentes de los espectros del extracto de la fracción de paredes celulares (composición A) y del extracto de té blanco. Por tanto, los espectros del extracto de la fracción de membrana y del suero de jugo celular de nuevo indican que estos productos tiene una composición diferente del extracto de té blanco y del extracto de la fracción de paredes celulares. Al mismo tiempo, los datos espectrales sugieren que las composiciones del extracto de la fracción de membrana y del suero de jugo celular no son idénticas. Por ejemplo, el extracto de la fracción de membrana tiene tres picos característicos a 260 nm, 286 nm y 394 nm. Los espectros del suero de jugo celular contienen dos picos a 260 nm y 286 nm. La comparación de estos dos espectros indica que el extracto de la fracción de membrana tiene aproximadamente dos veces mayor extinción que el suero de jugo celular, aunque la diferencia en los niveles de materia seca solo es del ~ 1 %. Por tanto, los cuatro productos de Camellia sometidos a prueba tienen composiciones de constituyentes significativamente diferentes, que son ópticamente activos en la región de 250 -450 nm. Los datos relacionados con la comparación cuantitativa de los productos de Camellia se presentan en la tabla 14.

Tabla 14 -Características seleccionadas de productos de Camellia aplicados al sustrato de prueba Vitro-Skin®
Área bajo los espectros (250-450 nm) Abs • nm
Área bajo los espectros (290-400 nm) Abs • nm Área bajo los espectros(290-400 nm) Área bajo los espectros(250-450 nm) %
Extracto de té blanco
15,577 9,312 59,78
Extracto de fracción de paredes celulares
18,571 10,422 56,12
Extracto de fracción de membrana
89,148 53,803 60,35
Suero de jugo celular
60,861 35,161 57,77
La tabla 14 muestra que la absorción de las muestras en el área de 250 -450 nm y en el área de 290 -400 nm es creciente en el siguiente orden: extracto de té blanco > extracto de fracción de paredes celulares > suero de jugo celular > extracto de fracción de membrana. Esta secuencia está completamente de acuerdo con la secuencia de los valores de absorción específicos de los productos de Camellia sometidos a prueba en las soluciones diluidas (tabla 12). La contribución de la absorbancia en la región de 250 -400 nm a la absorbancia de los espectros tomados de 250 nm a 450 nm alcanzó un ~ 55-60 % cuando se aplicaron las muestras sometidas a prueba en el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT).
Cabe destacar que los espectros de las composiciones de Camellia novedosas en soluciones diluidas y después de su aplicación en el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) son sorprendentemente diferentes. Estas diferencias son tanto cuantitativas como cualitativas para el extracto de la fracción de membrana y el suero de jugo celular. Por lo tanto, en el intervalo de 250 nm a 450 nm el extracto de la fracción de membrana en solución alcanza su nivel máximo a 274 nm. El mismo extracto de la fracción de membrana cuando se aplica en el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT), no mostró ningún pico característico en la longitud de onda anterior, pero en cambio tuvo dos picos característicos a 260 nm y 286 nm (figura 7A).
Se observó el patrón similar en las propiedades espectrales para el suero de jugo celular, aunque se identificó la absorción adicional a ~ 360 nm en la muestra aplicada en el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT), pero dicho fenómeno no se registró en los espectros UV/VIS de la misma composición en la solución (figura 7B).
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Cabe señalar que las diferencias anteriores entre los espectros pueden ser el resultado de la interacción química entre las composiciones de Camellia novedosas y la superficie del sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) que tiene componentes proteicos y lipídicos, que imitan la piel humana. Estas interacciones dan lugar al incremento drástico de la absorbancia en la región espectral responsable del efecto dañino de la irradiación UV, es decir, las composiciones de Camellia novedosas tienen potencias de protección UV significativas. Los experimentos de control con sueros de jugo celular de cebada (Hordeum vulgare) (figura 8A) y salvia (Salvia officinalis) (figura 8B) mostraron que las diferencias en los espectros de las mismas muestras en solución y después de su aplicación en el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) no se observaron para fuentes vegetales distintas de Camellia. Por tanto, el desplazamiento espectral en los productos de Camellia después de su aplicación en el sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) indica las interacciones específicas que tienen lugar solo entre los productos de Camellia novedosos y el sustrato que imita la piel humana.
Los experimentos de control con sustrato prehidratado demostraron que después de la irradiación la absorbancia del sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) disminuyó significativamente, en especial en el intervalo de 260 -330 nm (figura 9). Este efecto refleja una fotoestabilidad relativamente baja del sustrato no protegido, que se irradió por dosis alta de luz solar de amplio espectro.
La irradiación del sustrato con el extracto de té blanco aplicado inició cambios en los espectros de absorbancia (figura 10) lo que es análogo a los cambios espectrales del sustrato de prueba Vitro-Skin® no protegido (IMS Testing Group, Milford, CT). Cuando se eliminó la contribución del sustrato, los espectros de muestra no irradiada e irradiada indicaron alguna similitud pero no demostró un comportamiento totalmente idéntico. Por ejemplo, la absorbancia en el intervalo de 290 -310 nm disminuyó y se empezó a formar un pico ancho a 360 nm.
La irradiación del extracto de la fracción de paredes celulares (figura 11) dio lugar a cambios similares en los espectros de absorbancia, en especial con respecto a la curva obtenida después de la eliminación (sustracción) de la contribución del sustrato.
Aunque las composiciones del extracto de té blanco y del extracto de la fracción de paredes celulares no son idénticas, el patrón de las modificaciones inducidas por irradiación en sus espectros es bastante similar. Cabe destacar que tanto el extracto de té blanco como el extracto de la fracción de paredes celulares no pueden proteger completamente el sustrato frente a la acción destructiva de la irradiación y como resultado, la absorbancia del sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) disminuye casi tanto como en la condición en la que este sustrato no está en absoluto protegido (figura 9). Esto es especialmente obvio en el intervalo de 250 nm 330 nm aunque a mayores longitudes de onda se observa cierto incremento en la absorbancia.
La irradiación del extracto de la fracción de membrana produjo un efecto muy diferente sobre sus espectros de absorbancia (figura 12). Por ejemplo, la irradiación no inició ningún cambio en el intervalo espectral de 250 -285 nm. Como se analiza, este intervalo particular de espectros se vio afectado muy significativamente por la destrucción del sustrato de prueba Vitro-Skin® irradiado (IMS Testing Group, Milford, CT) y por lo tanto la comparación de los espectros sugiere que la destrucción del sustrato se evitó completamente por presencia del extracto de la fracción de membrana sobre su superficie.
Sin embargo, se registraron ciertos cambios en los espectros del extracto de la fracción de membrana. Por ejemplo, la absorbancia disminuyó ligeramente en el intervalo de 290 -320 nm y se acompañó de un pequeño incremento de la absorbancia a mayores longitudes de onda. Cabe señalar en especial que se probó que el extracto de la fracción de membrana era muy eficaz en el intervalo de espectros en el que los ácidos nucleicos y los aminoácidos aromáticos tienen picos característicos a 260 nm y 280 nm posteriormente. Por tanto, el efecto del extracto de la fracción de membrana permite el uso de este producto como posible ingrediente protector de UV para aplicaciones tópicas.
Después de la irradiación, la fracción de suero demostró ciertos cambios en sus espectros de absorbancia (figura 13).
En general, estos cambios se pueden describir como una ligera disminución en la absorción en el intervalo de 250 340 nm y un ligero incremento en la absorción en el intervalo de 340 -450 nm. Cabe destacar que la eliminación de la posible contribución proporcionada por la fotodestrucción del sustrato de prueba Vitro-Skin® (IMS Testing Group, Milford, CT) (véase la curva roja en los espectros por encima de los espectros iniciales de la fracción de suero no irradiada) indicó claramente que el sustrato se preservó eficazmente por la aplicación de la fracción de suero sobre su superficie.
Observaciones y conclusiones. Los resultados anteriores muestran claramente que el mejor de los productos de Camellia convencionales (extracto de té blanco) proporciona una protección relativamente débil frente a acción destructora de la irradiación UV. El extracto de la fracción de paredes celulares demostró propiedades similares al extracto de té blanco, pero el extracto de la fracción de membrana y el suero de jugo celular tienen propiedades protectoras de UV mucho más potentes.
Se descubrió que las propiedades de protección UV de los productos de Camellia eran crecientes en la siguiente
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secuencia: extracto de té blanco = extracto de la fracción de paredes celulares > suero de jugo celular > extracto de fracción de membrana.
Cabe destacar que las propiedades espectrales de los productos de Camellia y el patrón de los cambios de estas propiedades después de la irradiación UV proporcionan pruebas sólidas de que los constituyentes en el extracto de té blanco (control), extracto de la fracción de paredes celulares, extracto de la fracción de membrana y suero de jugo celular difieren todos y presentan actividades únicas. Es de particular interés en el caso de composiciones de Camellia novedosas en las que la actividad UV descrita anteriormente no se puede atribuir a polifenoles como con los extractos de té blanco.
Ejemplo 10 – Evaluación comparativa de productos de Camellia: una perspectiva general
Los Ejemplos 10 a 19 describen procedimientos, resultados y análisis relacionados con experimentos llevados a cabo para evaluar el intervalo de actividades biológicas relacionadas con la modulación de funciones celulares por las composiciones bioactivas de Camellia sinensis de la presente invención. El objetivo principal fue evaluar el intervalo de actividades biológicas de productos obtenidos a partir de los procedimientos de la presente invención y compararlos con actividades del mejor producto obtenido mediante tecnología convencional (tradicional) del té – extracto de té blanco que se exploró como un control positivo y se comparó con las siguientes composiciones bioactivas de la presente invención: (1) extracto de fracción de paredes celulares de hojas frescas (composición A, tal como se denomina en el presente documento); (2) extracto de fracción de membrana (composición B, tal como se denomina en el presente documento); y (3) suero de jugo celular (composición D, tal como se denomina en el presente documento).
Los ensayos se llevaron a cabo para evaluar el efecto de estas composiciones bioactivas de Camellia en los patrones de crecimiento de tres líneas celulares humanas: una línea mieloide con características de células de leucemia monocítica (Mono Mac 6) y dos líneas de cáncer de mama con características de etapas tempranas de la neoplasia in vivo (MCF-7) y una línea más altamente invasiva, metastásica e insensible a estrógenos con características de cáncer avanzado (MDA-MB-435S).
Se descubrió que el extracto de té blanco convencional demostró un determinado efecto inhibidor de la actividad metabólica de algunas células tumorales. Sin embargo, el grado de tal inhibición no fue significativo para todos los tipos de células ensayadas e incluso cuando se detectó la inhibición, por lo general no era completa, sino mínima o modesta. El extracto de fracción de pared celular demostró propiedades similares a las propiedades del extracto de té blanco.
Es notable que ambos derivados del jugo celular: el extracto de fracción de membrana y el suero del jugo celular, fueron los inhibidores mucho más potentes de funciones metabólicas de todas las líneas celulares ensayadas que se cultivaron en presencia y ausencia de diferentes estímulos. Por ejemplo, el extracto de fracción de membrana demostró claramente una mayor potencia de inhibición y su efecto se podría medir con fiabilidad a una dosis del 0,001 %. El suero de jugo celular demostró una respuesta compleja: estimulación a una dosis más baja e inhibición a una dosis alta.
Cabe señalar que, en lugar de inducir citólisis necrótica, el extracto de fracción de membrana y el suero de jugo celular parecen iniciar una vía de muerte celular programada o apoptótica en las células tumorales. Los datos experimentales indican que esta vía se atribuye a la pérdida de función mitocondrial y puede requerir de 24 a 48 horas de exposición para que sea detectada.
Como consecuencia de la exposición a composiciones bioactivas, la función metabólica de todas las líneas de células tumorales ensayadas: MCF-7, un modelo de cáncer de mama humano en etapas tempranas, MDA-MB435S, un modelo de cáncer de mama avanzado, y Mono Mac 6, un modelo de leucemia monocítica, se inhibieron de la forma más eficaz mediante el extracto de fracción de membrana y de una manera menos potente y más selectiva, mediante el suero de jugo celular. Notablemente, el extracto de té blanco y el extracto de fracción de pared celular demostraron ser inactivos o mucho menos potentes que las composiciones B y D anteriores. Esta tendencia se demostró claramente para las células ensayadas en diferentes condiciones: células MCF-7 en ausencia y en presencia de factor de crecimiento transformante, células MDA-MB-435S y células monocíticas Mono Mac 6 tanto estimuladas como no estimuladas.
Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de la capacidad del procedimiento de la presente invención para aumentar de manera drástica la potencia de las plantas Camellia y producir nuevos productos muy impresionantes que demuestran actividades, que no se identificaron ni siquiera para el mejor producto de la tecnología convencional del té.
Los efectos de las fracciones de Camellia de la presente invención en las actividades proteolíticas mediadas por células tienen implicaciones para la lesión inflamatoria del tejido así como para la invasión tumoral y la metástasis. Por lo tanto, las células de cáncer de mama y las células de leucemia claramente se pueden sugerir como posibles dianas para las composiciones bioactivas de la presente invención, sobre todo, el extracto de fracción de membrana. Cabe indicar que se demostró previamente que la línea celular COLO 205 que proviene del carcinoma de colon libera niveles significativos de MMP-2, que se activa después mediante una enzima de tipo tripsina
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Ejemplo 12 – Evaluación comparativa de los productos de Camellia: razón fundamental para la selección delíneas celulares
Como un sistema de ensayo para la modulación de funciones celulares, se usaron dos líneas que proviene de carcinoma de mama como modelos de células de neoplasia (MCF-7 y MDA-MB-435S), y se usó una línea monocitoide humana (Mono Mac 6) como un modelo de células inflamatorias. Las líneas celulares anteriores se describen en el Ejemplo 21.
MCF-7 se considera un modelo de cáncer de mama temprano o poco desdiferenciado. La línea aún conserva la sensibilidad a estrógeno y tiene un fenotipo invasivo relativamente bajo: su capacidad para metastatizar en modelos animales inmunodeficientes es bastante modesta. En estudios previos, se ha demostrado que la línea celular MCF7 presenta una respuesta característica al factor de crecimiento transformante β (TGF-β): tras el cultivo durante 24 horas en presencia de TGF-β, las células secretan niveles aumentados de enzimas proteolíticas de la familia de la metaloproteinasa de matriz (MMP) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) pro-angiogénico, dos marcadores diferentes de una invasividad potenciada y de potencial metastásico. Esta respuesta al TGF-β es un marcador de tumores y algunas líneas de células tumorales, al contrario de la detención del crecimiento, que se induce en células normales mediante el factor de crecimiento. Para evaluar las composiciones bioactivas de la presente invención, se usaron como dianas las células MCF-7 cultivadas en ausencia y presencia de TGF-β.
La línea MDA-MB-435S es más altamente invasiva, metastásica e insensible a estrógenos. Esta línea celular que proviene de carcinoma humano también presenta alguna sensibilidad a TGF-βm pero incluso en ausencia del factor de crecimiento, libera de manera espontánea mayores niveles de MMP y VEGF que MCF-7, consistente con su uso como un modelo de cáncer más avanzado. En la presente evaluación, se examinaron los efectos de composiciones bioactivas en células MDA-MB-435S cultivadas solo en ausencia de TGF-β.
La línea monocitoide humana, Mono Mac 6, expresa una serie de biomarcadores que consisten en los de los monocitos o macrófagos en reposo, y responde como los monocitos y macrófagos humanos a estímulos activadores proinflamatorios tales como miristato acetato de forbol (PMA). Se examinaron los efectos de las composiciones bioactivas en las células Mono Mac 6 cultivadas en ausencia y presencia de PMA, para servir como modelos de mnocitos/macrófagos en reposo y activados.
Por lo tanto, la combinación seleccionada de las líneas celulares descritas anteriormente proporciona una base fiable para evaluaciones de los poderes antitumorales y antiinflamatorios de las composiciones bioactivas de Camellia. El ensayo paralelo de las líneas celulares seleccionadas con una serie de sondas funcionales proporciona la oportunidad de extraer conclusiones más valiosas relativas a las actividades de los productos y su mecanismo de acción que la investigación de las respuestas de una única diana o dianas de ensayo que tienen sensibilidades similares o respuestas similares para determinados estímulos.
Ejemplo 13 – Evaluación comparativa de composiciones bioactivas de Camellia: razón fundamental para la selección de ensayos
Las evaluaciones iniciales se basaron en dos ensayos de variabilidad y una sonda de funciones celulares (véase el Ejemplo 20, “Método 8”).
El primer ensayo mide los niveles de la enzima del citosol, deshidrogenasa láctica, que se libera en el medio de cultivo extracelular solo cuando la célula lisa. Tal pérdida de la integridad de la membrana celular se considera tradicionalmente que es una señal de muerte celular necrótica y refleja el patrón de citotoxicidad.
El segundo ensayo mide la actividad deshidrogenasa mitocondrial tal como se refleja mediante la reducción de una sal de tetrazolio a su formazano de color. Cuando el reactivo MTS (una sal de tetrazolio) se aplica a células vivas, se convierte en un compuesto de color intenso (formazano). La pérdida de la actividad deshidrogenasa mitocondrial también se puede asociar con la muerte celular, pero es típicamente un marcador para las etapas tempranas en una vía de muerte celular programada o apoptótica en la que la integridad de membrana celular generalmente se conserva bien después de que el núcleo se ha condensado y las mitocondrias han cesado su función.
La ausencia de deshidrogenasa láctica indica la pérdida completa de viabilidad asociada con la citólisis, mientras que una disminución en la reducción de las sales de tetrazolio indica la pérdida de actividad mitocondrial, pero no necesariamente la pérdida irrevocable de la integridad o viabilidad de la membrana celular.
Como una sonda adicional de funciones celulares, se examinaron los efectos de las composiciones bioactivas de Camellia en niveles de proteinasas secretados por la línea Mono Mac 6 (véase el Ejemplo 20, “Procedimiento 9”). En estudios previos con esta línea celular, se observó que, tras la incubación con PMA, las células Mono Mac 6 secretaron dos metaloproteinasas de matriz gelatinolíticas, MMP-2 (gelatinasa A) y MMP-9 (gelatinasa B). Estas MMP también se secretan por una serie de tumores y por su estroma circundante, y están implicadas en lesiones inflamatorias del tejido, así como en la invasión del tumor y metástasis. También se ha demostrado anteriormente que algunos agentes en desarrollo como fármacos antiinflamatorios y antitumorales (los agentes que se han investigado se conocen por disminuir la destrucción de tejido inflamatorio así como la invasión y metástasis de líneas de células tumorales) parecen reducir los niveles de las MMP producidas por células además de cualquier
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Secreción de MMP. Se han usado dos ensayos diferentes para medir los niveles de dos gelatinasas, MMP-2 (gelatinasa A) y MMP-9 (gelatinasa B), liberadas por células Mono Mac 6. Estas MMP están implicadas en el daño a tejidos imflamatorios así como la invasión y metástasis tumoral. Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) que se han empleado para MMP-2 y MMP-9 se usaron en primer lugar para estimar los niveles totales de las dos enzimas en el medio de cultivo de células Mono Mac 6 cultivadas durante 48 horas en presencia de PMA 10 nM a diferentes dosis de estas tres composiciones bioactivas de Camellia y el control positivo.
Esta línea celular secreta solo MMP-2 cuando no se estimula, pero secreta tanto MMP-2 como MMP-9 cuando se activa. (Los niveles de MMP liberados tras 24 horas normalmente son demasiado bajos para detectarlos de manera fiable).
Los resultados de las mediciones de ELISA se muestran en las figuras 34 a la 37. Tal como se observó para los efectos del extracto de la fracción de paredes celulares y el extracto de té blanco en la reducción de MTS por las células Mono Mac 6, no hubo cambios significativos en los niveles de MMP-2 y MMP-9 secretados a ninguna dosis de estos extractos. A la dosis más alta (0,01 % p/v) del extracto de la fracción de membrana y suero de jugo celular, se observó que disminuían los niveles de MMP-2, con el extracto de fracción de membrana presentando la mejor potencia a esta dosis. Cabe destacar que se observó una aparente ligera estimulación de libración de MMP-2 en las siguientes dosis más altas de la composición B (0,001 %) y la composición D (0,002 %). Esta estimulación es reminiscente de la estimulación de la actividad reductasa de MTS en células MCF-7 tratadas con TGF-β a dosis similares de estas composiciones.
La disminución dependiente de la dosis de los niveles de MMP-2 detectados mediante ELISA no fue paralela a los efectos del extracto de la fracción de membrana y del suero del jugo celular en los niveles de MMP-9. Estos niveles aumentaron (aparentemente de manera notable por el suero del jugo celular) en las dosis más altas, pero no se cambiaron en las dosis menores ensayadas. La detección de los niveles no cambiados o aumentados de MMP-9 secretada por células Mono Mac 6 expuestas durante 48 horas a dosis de preparaciones de Camellia que produjeron la inhibición significativa de la actividad reductasa de MTS solo tras 24 horas, es una evidencia adicional de que la pérdida de función mitocondrial en células Mono Mac 6 expuestas al extracto de fracción de membrana o al suero de jugo celular de Camellia no refleja la citólisis necrótica, en cuyo caso la secreción de MMP habría cesado de manera abrupta.
Como evidencia adicional de los efectos de las composiciones de Camellia en la secreción de MMP mediante células Mono Mac 6, se usó la técnica de zimografía en gelatiba para examinar el medio de cultivo recogido tal como se describe anteriormente para las mediciones de ELISA. En este procedimiento, el medio de cultivo se somete en primer lugar a electroforesis en geles de poliacrilamida impregnados con gelatina en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) para separar las proteínas basándose en el peso molecular. El SDS se elimina por lavado de los geles para permitir que al menos una porción de cualquier a de las enzimas presentes se renaturalice y los genes se incuben en un medio, que maximiza la actividad de las MMP. Las MMP disuelven la gelatina donde quiera que esté presente. Tras la visualización de la gelatina no digerida en la mayor parte de los geles con una tinción de proteínas, los geles se escanean, con las MMP apareciendo como zonas claras frente a la tinción de fondo. Las imágenes negativas se han presentado en el presente documento, de manera que las MMP aparecen como zonas oscuras frente a la claridad del fondo.
Cabe destacar que las MMP se secretan por la mayoría de las células como precursores inactivos, que se activan después de manera extracelular. Sin embargo, dado que la secuencia de desnaturalización y renaturalización empleada en la zimografía, incluso las denominadas proformas de las MMP adquieren actividad genolítica y producen zonas claras. Las figuras 34 a la 37 ilustran las imágenes negativas de los zimogramas de gelatina de medios de cultivo recogidos tras 48 horas de exposición de células Mono Mac 6 a las diferentes composiciones bioactivas de Camellia, junto con el medio de cultivo recogido de células cultivadas en ausencia (U) o presencia (S) de PMA 10 nM pero en ausencia de composiciones de Camellia.
Los efectos de la composición A y el control positivo se evaluaron solo para las dosis más bajas (0,0001 %, “lo”) y las dosis más altas (0,01 %, “hi”) de las preparaciones, mientras que los efectos de las composiciones B y D también se evaluaron a una dosis intermedia del 0,001 % (“med”). Es evidente a partir de los cuatro paneles que las células Mono Mac 6 solo liberan MMP-2 (aproximadamente 67 kD) en ausencia de PMA, y esta enzima se encuentra de manera predominante en la proforma. El tratamiento con PMA 10 nM da como resultado la inducción de la secreción de MMP-9 (aproximadamente 92 kD) así como las actividades proteolíticas adicionales que convierten los niveles significativos de las preformas de las dos MMP a sus formas activas de peso molecular ligeramente más bajo.
En consistencia con los resultados de ELISA, la exposición de células Mono Mac 6 estimuladas con PMA al extracto de la fracción de paredes celulares y al extracto de té blanco no tuvo un efecto detectable en los niveles de las proformas o de las formas activas de las dos MMP visualizadas mediante zimografía de gelatina. Al contrario, la exposición a las dosis más altas de las composiciones B y D dieron como resultado una notable disminución de los niveles de MMP-2 visualizada mediante zimografía de gelatina, pero no un cambio evidente en los niveles de MMP
9.
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(continuación)
Línea celular y modelo
Estímulo Tiempo de cultivo Extracto de té blanco (control positivo) Extracto de fracción de paredes celulares (composición A) Extracto de fracción de membrana (composición B) Suero de jugo celular (composición D)
Células MCF-7 de cáncer humano
24 horas Inhibición significativa pero incompleta Inhibición significativa pero incompleta Inhibición completa Inhibición completa
24 horas
Modesta inhibición Sin efecto Inhibición significativa pero incompleta Inhibición completa
Cáncer de mama temprano
TGF-β 48 horas Modesta inhibición Sin efecto Estimulación a una dosis baja e inhibición completa a dosis alta Estimulación a una dosis baja pero inhibición incompleta a una dosis alta
Células Mono
24 horas Modesta Modesta Inhibición Inhibición
Mac 6 de
inhibición inhibición completa pronunciada
leucemia
humana
48 horas
Sin efecto Sin efecto Inhibición significativa pero incompleta Inhibición pronunciada
Inflamación
PMA 24 horas Sin efecto Modesta inhibición Inhibición significativa pero incompleta Inhibición significativa pero incompleta
48 horas
Modesta inhibición Sin efecto Inhibición significativa pero incompleta Inhibición significativa pero incompleta
La Tabla 15 muestra que las capacidades de la preparación de Camellia para modular funciones celulares de una forma dependiente de la dosis aumenta en el siguiente orden: extracto de té blanco = extracto de fracción de
5 paredes celulares > suero de jugo celular > extracto de fracción de membrana. Los datos experimentales sugieren que las nuevas composiciones bioactivas de Camellia preparadas por procesamiento de tejido vegetal fresco en extracto de fracción de membrana derivado de jugo celular (composición B) y suero de jugo celular (composición D) no provocan ninguna toxicidad necrótica total hacia las células.
Por lo tanto, la tecnología de la presente invención presenta la capacidad de aumentar de manera drástica la
10 potencia de las composiciones bioactivas de Camellia y de producir nuevos productos muy impresionantes que demuestran las actividades de células humanas que no se demostraron en los mejores productos (por ejemplo, extracto de té blanco) producido mediante tecnología convencional de Camellia.
Ejemplo 19 – Evaluación comparativa de composiciones bioactivas de Camellia: implicaciones para futuros estudios
15 Los efectos de las composiciones bioactivas de Camellia de la presente invención en actividades proteolíticas mediadas por células tienen implicaciones para las lesiones inflamatorias del tejido así como la invasión y metástasis tumoral. Por lo tanto, las células del cáncer de mama y las células de leucemia monocítica se pueden sugerir como posibles dianas para las composiciones bioactivas de Camellia de la presente invención, más notablemente, la composición B (extracto de fracción de membrana). Se demostró previamente que la línea celular
20 COLO 205 que proviene de carcinoma de colon libera niveles significativos de MMP-2, que después se activa mediante una enzima de tipo tripsina también secretada por las células. Este tipo de célula tumoral es uno de una serie de posibles dianas para las composiciones bioactivas de Camellia de la presente invención, basándose en los resultados con células Mono Mac 6.
A partir de estos estudios, se puede confiar en que las composiciones bioactivas aisladas a partir de Camellia
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en comparar áreas de cada catequina enumerada con su estándar puro. Los resultados se muestran en la figura 38 y en la tabla 16 (dada a continuación).

Tabla 16 -Contenido en catequina de las composiciones bioactivas de Camellia
Muestra
Producto químico analizado Promedio mg/g basado en 100 % de materia seca Promedio mg/g basado en producto como tal
Extracto de té blanco
(-)-epigalocatequina 0,3 0,0033
(+)-catequina
1,33 0,0146
(-)-epicatequina
0,15 0,0017
galato de (-)-epigalocatequina
0,65 0,0071
galato de (-)-galocatequina
0,003 0,0000
galato de (-)-epicatequina
0,212 0,0023
extracto de la fracción de paredes celulares
(-)-epigalocatequina 0,00 0,0000
(+)-catequina
2,39 0,0201
(-)-epicatequina
0,01 0,0001
galato de (-)-epigalocatequina
0,01 0,0001
galato de (-)-galocatequina
0,00 0,0000
galato de (-)-epicatequina
0,006 0,0001
extracto de la fracción de membrana
(-)-epigalocatequina 2,27 0,1552
(+)-catequina
8,96 0,6121
(-)-epicatequina
0,60 0,0409
galato de (-)-epigalocatequina
9,28 0,6340
galato de (-)-galocatequina
0,01 0,0006
galato de (-)-epicatequina
2,33 0,1589
suero de jugo celular
(-)-epigalocatequina 3,01 0,1714
(+)-catequina
6,09 0,3465
(-)-epicatequina
0,95 0,0539
galato de (-)-epigalocatequina
1,97 0,1120
galato de (-)-galocatequina
0,04 0,0024
galato de (-)-epicatequina
0,57 0,0325
Las realizaciones de la invención incluyen:
5 1. Una composición bioactiva que comprende:
una composición bioactiva derivada de una planta Theacea, en la que dicha fracción bioactiva se selecciona del grupo que consiste en una fracción de paredes celulares, un extracto de fracción de paredes celulares, una fracción de membrana, un extracto de fracción de membrana, una fracción de citoplasma, un extracto de fracción de citoplasma, un suero de jugo celular y combinaciones de los mismos.
10 2. La composición bioactiva de acuerdo con la realización 1, en la que dicha fracción bioactiva es una fracción de paredes celulares.
3. La composición bioactiva de acuerdo con la realización 1, en la que dicha fracción bioactiva es un extracto de
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