JP6246593B2 - 生物活性植物性化粧用組成物およびそれらの製造方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2008年5月7日に出願された米国特許出願第12/116,924号の一部継続出願であり、米国特許出願第12/116,924号は、2002年1月25日に出願された米国仮特許出願第60/351,886号に基づく優先権利益を主張する、2003年1月24日に出願された米国特許出願第10/351,910号(現在は米国特許第7,442,391号、2008年10月28日発行)の分割であり、これらの開示は、それらの全体が本明細書での参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明の膜由来化粧用組成物は、(1)新鮮な植物バイオマスから抽出された細胞ジュースに由来する膜画分および(2)安定化剤を含む。膜画分は、抗タンパク質分解活性、細胞増殖阻害活性、および/または抗タンパク質分解活性と細胞増殖阻害活性の両方を有する。抗タンパク質分解活性は、少なくとも1種のプロテイナーゼの阻害により、細胞増殖阻害活性は、少なくとも1つの型の細胞の増殖の阻害による。本発明における使用に適した安定化剤の例には、乳化剤、保存剤、抗酸化剤、ポリマー、およびそれらの混合物が含まれる。
本発明のセラム由来化粧用組成物は、(1)新鮮な植物バイオマスから抽出された細胞ジュースに由来し、抗酸化活性、細胞増殖刺激活性、および/または抗酸化活性と細胞増殖刺激活性の両方を有する細胞セラム画分、ならびに(2)安定化剤を含む。細胞増殖刺激活性は、少なくとも1つの型の細胞の増殖の刺激による。本発明で使用に適した安定化剤の例には、保存剤および抗酸化剤が含まれる。本発明で使用される適切な保存剤には、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウムおよびクエン酸が含まれる。本発明で使用される適切な抗酸化剤の例は、メタ重亜硫酸ナトリウムである。
一例として、本発明の生物活性植物性化粧用組成物を調製するための全プロセスを、図1を参照して以下に説明する。図1で描かれるように、新鮮な植物が収穫され、収集され、洗浄されて2、新鮮な植物バイオマスをもたらす。この新鮮な植物バイオマスを粉砕、離解および圧搾にかけて4、植物細胞ジュース6およびプレスケーキ8をもたらす。次いで、植物細胞ジュース6は、ナイロンメッシュ10を通してろ過されて、ろ過された植物細胞ジュース12をもたらす。ろ過された植物細胞ジュース12はマイクロ波処理14に曝され、植物細胞ジュース12を凝固させる。凝固した植物細胞ジュースは、冷却され16、次いで遠心分離18にかけられ、膜画分20および植物細胞ジュース上清30をもたらす。以下に記載のとおりに、膜画分20を用いて、膜由来生物活性植物性化粧用組成物28(すなわち、膜由来化粧用組成物)を調製する。以下に記載のとおりに、植物細胞ジュース上清30を用いて、細胞セラム由来生物活性植物性化粧用組成物52(すなわち、セラム由来化粧用組成物)を調製する。
一実施形態において、膜由来化粧品組成物を調製する方法は、以下のとおりである。この方法は、新鮮な植物バイオマスから抽出された植物細胞ジュースを準備する工程を含む。次いで、植物細胞ジュースは、それを膜画分と細胞ジュース上清とに分離するのに有効な条件下で処理される。得られた膜画分は、抗タンパク質分解活性、細胞増殖阻害活性、または抗タンパク質分解活性と細胞増殖阻害活性の両方を有する。次いで、膜画分は、抗タンパク質分解活性、細胞増殖阻害活性、または抗タンパク質分解活性と細胞増殖阻害活性の両方を示す安定な生物活性植物性化粧用組成物をもたらすのに有効な条件下で変換され、ここで、抗タンパク質分解活性は、少なくとも1種のプロテイナーゼの阻害により、細胞増殖阻害活性は、少なくとも1つの型の細胞の細胞増殖の阻害による。
(a)膜画分の安定化は、これを非イオン性乳化剤ポリソルベート80(Tween80)および抗酸化剤(Tenox4)との混合することを含む。一例として、20グラムの新鮮な膜画分は、混合中の空気混入を避けながら、3.5グラムのTween80および0.1gのTenox4(ブチル化ヒドロキシアニソールおよびブチル化ヒドロキシトルエンの油中溶液)と均一になるまで激しく混合する。
(b)ポリマー性乳化剤(アクリレート/C10〜C30アクリレートクロスポリマー)の分散液の調製:一例として、0.9グラムのPemulen TR−2を69.2グラムの温かい脱イオン水中に分散させ、空気混入を避けて、穏やかな撹拌を用いて均一になるまで混合した。並行して、5グラムのグリセリンおよび1グラムのPhenonip(フェノキシエタノール(および)メチルパラベン(および)ブチルパラベン(および)エチルパラベン(および)プロピルパラベンの混合物)を別個の容器中で合わせ、均一になるまで混合する。穏やかに撹拌しながら、Pemulenを含有する相とPhenonipと一緒のグリセリンを含有する相とを合わせ、均一になるまで混合する。
(c)膜画分のポリマーマトリックス中への取り込み:一例として、膜画分、Tween80およびTenox4を含有する相を、Pemulen、グリセリンおよびPhenonipを含有する相に添加し、空気混入を避けながら激しく撹拌して混合する。
(d)生成物の中和:一例として、膜画分および他の成分を含有するバッチを、水酸化ナトリウム(NaOH)の18%水溶液で中和し、激しく混合して、pH=5.0±0.4を有する均一な系を生成させる。
本発明はまた、抗酸化活性、細胞増殖刺激活性、または抗酸化活性と細胞増殖刺激活性の両方を示すセラム由来化粧用組成物を調製する方法に関する。この方法は、膜由来化粧用組成物に関して既に上記したとおりに、新鮮な植物バイオマスから抽出された植物細胞ジュースを準備する工程を含む。次いで、植物細胞ジュースは、植物細胞ジュースを膜画分と細胞ジュース上清とに分離するのに有効な条件下で処理される。この工程も、膜由来化粧用組成物に関して上記したものと同じである。細胞ジュース上清は、細胞ジュース上清を細胞質画分と細胞セラム画分とに分離するのに有効な条件下で加工される。細胞セラム画分は、抗酸化活性、細胞増殖刺激活性、または抗酸化活性と細胞増殖刺激活性の両方を有する細胞セラム画分ろ液をもたらすのに有効な条件下で精製される。細胞セラム画分ろ液は、抗酸化活性、細胞増殖刺激活性、または抗酸化活性と細胞増殖刺激活性の両方を示す安定な生物活性植物性化粧用組成物をもたらすのに有効な条件下で安定化される。
(a)一例として、pH調整は、5.0N塩酸(HCl)によりpH=3.0にすることを用いる滴定方法によって誘発される、セージおよびマリゴールドの花から得られた細胞セラムについて行われる。このような調整は、アルファルファ、オオムギおよびラベンダーから得られる細胞セラムについては必要でない。
(b)熱処理は、利用可能な植物供給源のすべてから得られた細胞セラムについて行われる。一例として、細胞セラムは、温度プローブ制御下でマイクロ波処理に曝される。この処理は、温度が90℃に達するまで継続される。温度プローブは、不必要な成分の完全な凝固を誘発するのに必要な点を示す。いったん凝固が誘発されると、処理された細胞ジュースは10℃に直ちに冷却される。
(c)凝固した細胞セラムは、ろ過または遠心分離によって清澄化され得る。一例として、凝固した細胞セラムは、ワットマンNo.2ろ紙の二重層を通して真空ろ過されてもよい。沈殿物は廃棄され、ろ液はさらなる加工に用いられる。
(d)ろ液の安定化は、特定の保存剤および抗酸化剤の添加、ならびにそれらの完全な可溶化が達成されるまで(通常は、30分間以上の強い混合が必要とされる)の混合物のインキュベーションを含んだ。
バイオマス準備:十分な量の新鮮なアルファルファ(Medicago sativa)植物バイオマス(すなわち茎および葉の組織)を収穫して、約100kgの乾燥物質を得た。新鮮なアルファルファ植物バイオマス中の乾燥物質のレベルは、15.75パーセントであると計算され、100kgの乾燥物質を得るために約635kgの新鮮なアルファルファ植物バイオマスの収穫を必要とした。植物バイオマスの生来の含水量を維持し、水分損失による萎れを避けるために注意を払った。植物を地上少なくとも5センチメートルで切断して、収集される植物バイオマス中の土壌および他の瓦礫の量を制限した。切断は、植物の叩き切り、すりつぶし、押しつぶしを避けるか、または最小化するような方法で行った。収穫した植物を、切断して遅くとも60分後に加工に供給した。これは、植物バイオマスの日光、高温、および他の負の環境因子への曝露を最小化するために行った。洗浄工程を行って、さらなる加工前に植物から土壌粒子および他の瓦礫を除去した。この洗浄は、収穫した植物を1kg/cm2以下の水圧で5分間以下の間洗浄することによって行った。残存水洗浄液は、緑色の色素を含有せず、水圧および洗浄期間が適切であることを示した。過剰な水を洗浄した植物バイオマスから除去した。
化粧用植物性成分101を、実施例1で上記した方法によって調製した。化粧用植物性成分101の分析を行って、以下に記載されるとおりの、その様々な物理化学的、微生物的、細胞毒性のおよび生物活性の特性を決定した。化粧用植物性成分101は、透明な液体であり、これは、淡黄色および薄い特徴的な臭いを有する。溶媒(すなわち、グリコール、油または水)は、担体媒体にまったく加えなかった。
化粧用植物性成分201を調製する方法は、以下に記す変更点を伴うが、化粧用植物性成分101に関して実施例1で記載した方法と同じであった。オオムギ(Hordeum vulgare)の新鮮な茎および葉の組織を、植物バイオマス出発材料として用いた。新鮮なオオムギ植物バイオマス中の乾燥物質のレベルは、13.67パーセントであると計算され、100kgの乾燥物質を得るために約732kgの新鮮なオオムギ植物バイオマスの収穫を必要とした。この調製は、15.1kgの乾燥物質収量(または約433リットル)の化粧用植物性成分201の生成をもたらした。
化粧用植物性成分201を、実施例3において上記した方法によって調製した。化粧用植物性成分201の分析を行って、以下に記載するような、その様々な物理化学的、微生物的、細胞毒性のおよび生物活性の特性を決定した。化粧用植物性成分201は、透明な液体であるが、これは、淡黄色および薄い特徴的な臭いを有する。溶媒(すなわち、グリコール、油または水)は、担体媒体にまったく加えなかった。
化粧用植物性成分301を調製する方法は、以下に記す変更点を伴うが、化粧用植物性成分101に関して実施例1で記載した方法と同じであった。ラベンダー(Lavandula angustifolia)の新鮮な茎および葉の組織を、植物バイオマス出発材料として用いた。新鮮なラベンダー植物バイオマス中の乾燥物質のレベルは、13.24パーセントであると計算され、100kgの乾燥物質を得るために約755kgの新鮮なラベンダー植物バイオマスの収穫を必要とした。また、保存剤と抗酸化剤との混合物は、以下、すなわち、0.1%ソルビン酸カリウム、0.1%安息香酸ナトリウム、0.1%メチルパラベンナトリウム、0.1%クエン酸、および0.2%メタ重亜硫酸ナトリウムを含有した。この調製は、18.5kgの乾燥物質収量(または約444リットル)の化粧用植物性成分301の生成をもたらした。
化粧用植物性成分301を、実施例5で上記した方法によって調製した。化粧用植物性成分301の分析を行って、以下に記載されるとおりの、その様々な物理化学的、微生物的、細胞毒性のおよび生物活性の特性を決定した。化粧用植物性成分301は、透明な液体であり、これは、黄褐色および特徴的な臭いを有する。溶媒(すなわち、グリコール、油または水)は、担体媒体にまったく加えなかった。
化粧用植物性成分401を調製する方法は、以下に示す変更点を伴うが、化粧用植物性成分101に関して実施例1で記載した方法と同一であった。マリゴールド(Calendula officinalis)の新鮮な花組織を、植物バイオマス出発材料として用いた。新鮮なマリゴールド花植物バイオマス中の乾燥物質のレベルは、7.80パーセントであると計算され、100kgの乾燥物質をもたらすために約1,282kgの新鮮なマリゴールド花植物バイオマスの収穫を必要とした。植物を切断後および洗浄前に、花を植物全体から分離した。花の加工(すなわち、洗浄工程で始まって、かつ粉砕の前)は、植物の切断後遅くとも3から4時間後に開始した。また、細胞セラム画分のマイクロ波処理前に、細胞セラムのpHを0.5N塩酸(HCl)を用いる滴定法使用して、最初にpH3.0に調整した。この調製は、27.1kgの乾燥物質収量(または約704リットル)の化粧用植物性成分401の生成をもたらした。
化粧用植物性成分401は、実施例7で上記した方法によって調製した。化粧用植物性成分401の分析を行って、以下に記載されるとおりの、その様々な物理化学的、微生物的、細胞毒性および生物活性の特性を決定した。化粧用植物性成分401は、透明な液体であり、これは、淡黄色および薄い特徴的な臭いを有する。溶媒(すなわち、グリコール、油または水)は、担体媒体にまったく加えなかった。
化粧用植物性成分501を調製する方法は、以下に記す変更点を伴うが、化粧用植物性成分101に関して実施例1で記載した方法と同一であった。セージ(Salvia officinalis)の新鮮な茎および葉の組織を、植物バイオマス出発材料として用いた。新鮮なセージ植物バイオマス中の乾燥物質のレベルは、10.64パーセントであると計算され、100kgの乾燥物質をもたらすために約940kgの新鮮なセージ植物バイオマスの収穫を必要とした。細胞セラム画分のマイクロ波処理前に、細胞セラムのpHを、0.5N塩酸(HCl)による滴定法を用いて、最初にpH3.0に調整した。また、保存剤と抗酸化剤の混合物は、以下、すなわち、0.1%ソルビン酸カリウム、0.1%安息香酸ナトリウム、0.1%メチルパラベンナトリウム、0.1%クエン酸、および0.2%メタ重亜硫酸ナトリウムを含んだ。この調製は、14.9kgの乾燥物質収量(または約370リットル)の化粧用植物性成分501生成をもたらした。
化粧用植物性成分501は、実施例9で上記した方法によって調製した。化粧用植物性成分501の分析を行って、以下に記載されるとおりの、その様々な物理化学的、微生物的、細胞毒性および生物活性の特性を決定した。化粧用植物性成分501は、透明な液体であり、これは、黄褐色および特徴的な臭いを有する。溶媒(すなわち、グリコール、油または水)は、担体媒体にまったく加えなかった。
化粧用植物性成分402を調製する方法は、以下に記す変更点を伴うが、化粧用植物性成分401に関して実施例7で記載した方法と同一であった。いったん膜画分(沈殿物)が、ろ過された細胞ジュースから分離されると、実施例7で記載した方法に、もはや従わなかった。代わりに、以下に記載するとおりに、膜画分を処理して、化粧用植物性成分402を得た。
化粧用植物性成分402は、実施例11で上記した方法によって調製した。化粧用植物性成分402の分析を行って、以下に記載するとおりの、その様々な物理化学的、微生物的、細胞毒性の、および生物活性の特性を決定した。化粧用植物性成分402は、不透明なゲルであり、これは、橙色および薄い特徴的な臭いを有する。化粧用植物性成分402を、最高レベルの純度均一性、相溶性、安定性、安全性および有効性を保証するために、ポリマーでゲル化させた天然の細胞ジュース成分を用いて調合した。
化粧用植物性成分502を調製する方法は、以下に記す変更点を伴うが、化粧用植物性成分402に関して実施例11で記載した方法と同一であった。セージ(Salvia officinalis)の新鮮な茎および葉の組織を植物バイオマス出発材料として用いた。新鮮なセージ植物バイオマス中乾燥物質のレベルは、10.64パーセントであると計算され、100kgの乾燥物質をもたらすために約940kgの新鮮なセージ植物バイオマスの収穫を必要とした。この調製は、6.7kgの乾燥物質収量(または約124リットル)の化粧用植物性成分502の生成をもたらした。
化粧用植物性成分502は、実施例13で上記した方法によって調製した。化粧用植物性成分502の分析を行って、以下に記載するとおりの、その様々な物理化学的、微生物的、細胞毒性および生物活性の特性を決定した。化粧用植物性成分502は、不透明なゲルであり、これは、緑色および特徴的な臭いを有する。化粧用植物性成分502を、最高レベルの純度均一性、適合性、安定性、安全性および有効性を保証するために、ポリマーでゲル化させた天然の細胞ジュース成分を用いて調合した。
化粧用植物性成分101、201、301、401、402、501および502の生成の間に収集した様々な画分を、乾燥物質分布について分析および比較した。
化粧用植物性成分に関連した物理化学的、スペクトル、微生物的、毒物学的、性能および有効性のデータを、表24および表25に示す。
化粧用植物性成分101、102、201、301、302、401、402、501および502ならびにその他のものを、それらの抗炎症および抗酸化の性質について分析した。これらの分析の結果を、以下のこの実施例19にまとめる。手順および結果は、以下の実施例20〜実施例24で説明する。
炎症過程の間に、エラスターゼ活性は、複数の酵素の作用に直接関係するが、好中球エラスターゼは、最高濃度で提示され、エラスチンを含む多種多様な結合組織成分に対する最も活性なプロテイナーゼである。評価アッセイにおいて、この酵素の阻害は、好中球エラスターゼに特異的である合成可溶性ペプチド基質(メトキシスクシニル−Ala−Ala−Pro−Val−p−ニトロアニリド)を用いた。好中球エラスターゼの供給源は、嚢胞性線維症の患者の気道分泌に由来する精製酵素調製物であった。阻害の濃度依存性の分析は、阻害活性の効力の定量をもたらした。この活性は、50%阻害(IC50)を達成するのに必要なそれぞれの化粧用植物性成分内の乾燥物質の濃度として表される。さらに、阻害定数Kiの値を決定した。阻害データのグラフ分析も、阻害の様式(可逆的または不可逆的)に関連した情報をもたらす。好中球エラスターゼは、制御されたレベルで存在する場合に、正の生理学的役割を有するので、不可逆的阻害剤の無差別の使用は、これらの酵素の正常な機能を損ない得る。
好中球は、マトリックスメタロプロテイナーゼのクラスからの主たる2種の酵素を含有し、これらは、集合的に広範な結合組織破壊に関与する:好中球コラゲナーゼ(MMP−8)およびゼラチナーゼB(MMP−9)。エラスターゼは、生来のコラーゲンに対して活性不足であり、かつ好中球コラゲナーゼ単独では、それ自体で結合組織タンパク質を可溶化することができないので、ゼラチナーゼBが、細胞外マトリックスに対する炎症性損傷の主たる一因と考えられる。炎症細胞由来のマトリックスメタロプロテイナーゼによって仲介された細胞外マトリックスの分解を阻害する化粧用植物性成分の潜在性を評価するため、この酵素に対する特異的アッセイを用いた。ゼラチナーゼB活性は、低分子量合成基質(APMA)の加水分解により検出した。ゼラチナーゼBの阻害剤は、用量依存性様式で酵素反応生成物の形成の加速率を減少させる。このような酵素阻害は、試験した化粧用成分を反応混合物に加えた場合に見られた。
活性化炎症細胞により発生した反応性酸素種(内在性または外来性)は、スーパーオキシド捕捉活性の測定を与えるために用いられる特有のオキシダントを生成する。スーパーオキシド捕捉活性の評価に用いたアッセイは、酸化に伴う損傷を中和する際に有益である、抗酸化活性の一形態と関係する。高収率でかつ制御された方式でスーパーオキシドアニオンを発生させるために、酵素系(キサンチンオキシダーゼ)を用いた。この酵素によるキサンチンのヒポキサンチンへの転換は、かなりの量のスーパーオキシドアニオンを発生させ、これは、供給される基質の量と化学両論的である。用いたアッセイは、スーパーオキシドレベルの高感度の尺度として、シトクロムcのその第二鉄から第一鉄形態への還元に基づいた。キサンチンに対するキサンチンオキシダーゼの作用によって発生したスーパーオキシドアニオンを検出するためにシトクロムc還元を用いる利点は、「呼吸バースト」を受ける活性化炎症細胞によるスーパーオキシドアニオンの放出を検出するために、同じ尺度を用いることができることである。呼吸バーストの大きさを低減させるが、酵素的に発生したスーパーオキシドアニオンを捕捉しない化粧用植物性成分は、細胞により発生した反応性酸素種の捕捉剤として作用しているというよりはむしろ細胞機能の一部の態様を恐らくは阻害している。
前の実施例23に記載した種々の化粧用植物性成分のスーパーオキシド捕捉能は、インビトロで酵素的に発生させたスーパーオキシドアニオンの供給源、および活性化炎症細胞(すなわち、好中球)により発生したインビボ反応性酸素種を用いて測定した。好中球は、それらが、局所炎症の部位に最大数で関与するので、およびそれらがスーパーオキシドアニオンおよび過酸化水素などの種の一部を次亜塩素酸などの抗酸化剤に変換するので、反応性酸素種の特に重要な供給源である。好中球によって細胞外環境に放出されるスーパーオキシドの検出は、「呼吸バースト」と総称的に称される複数の反応性酸素種を発生させるこれらの細胞の活性の全体レベルの高感度の尺度である。酵素的に形成されたスーパーオキシド、すなわち、フェリシトクロムcを検出するために用いたように、好中球に由来する細胞外スーパーオキシドを検出するために同じ反応剤を用いた。この分子は、タンパク質であり、好中球に入ることができないので、それは、細胞内反応性酸素種を検出しない。
以下は、化粧用植物性成分101、201、301、401、402、501および502の特定の特性を決定するために用いた様々な方法である。これらの方法は、上記実施例を通して参照される。「試験生成物」または「試験試料」への以下の言及は、化粧用植物性成分101、201、301、401、402、501および502を指す。
C*=(a*2+b*2)1/2
DE*=[(DL)2+(Da*)2+(Db*)2]1/2
DH=[(DE*)2−(DL*)2−(DC*)2]1/2
以下は、限定することなく化粧品用植物性601および701を含めて、本発明の様々な化粧用植物性成分の特定の特徴を決定するために用いた様々な方法である。これらの方法は、実施例を通して参照される。特定の場合、「試験生成物」または「試験試料」への以下の言及は、化粧用植物性成分601および/または701を指す。
重量オスモル濃度は、溶液1kg当たりの溶質のオスモル数として定義される、溶質濃度の尺度である。重量オスモル濃度は、溶液の単位質量当たりの溶質粒子のオスモル数を測定する。重量オスモル濃度は、それが溶質のモルというよりはむしろ溶質粒子のモルを測定するので、容積モル濃度(molarity)と区別される。一部の化合物は溶液中で解離できるが、一方で他のものはできないので、この区別が生じる。塩などのイオン性化合物は、それらの構成イオンに溶液中で解離でき、したがって、溶液の容積モル濃度と重量オスモル濃度との間に一対一の関係はない。例えば、塩化ナトリウム(NaCl)は、Na+とCl−イオンとに解離する。したがって、溶液中1モルのNaClごとに、2オスモルの溶質粒子が存在する(すなわち、1M NaCl溶液は、2オスモルのNaCl溶液である)。ナトリウムイオンと塩素イオンの両方が、溶液の浸透圧に影響する。非イオン性化合物は、解離せず、溶質1モル当たり溶質1オスモルだけを形成する。例えば、グルコースの1M溶液は、1オスモルである(Widmaier, Eric P.;Hershel Raff, Kevin T. Strang (2008年)、Vander's Human Physiology、第11版、McGraw-Hill、108〜112頁)。浸透圧計モデル3250(Advanced Instruments,Inc)を用いて、成分の重量オスモル濃度を決定した。この装置は、測定原理として凝固点降下を用いる。凝固点は、溶解した粒子の存在およびそれらの数(しかし、それらの同一性ではない)に依存する束一的性質である。凝固点降下は、溶質が、種々の塩などの電解質、および炭水化物などの非電解質である場合の両方の場合に起こる。
乾燥物質は、成分中の不揮発性成分の濃度を反映する。乾燥物質レベルは、液体試料の重量と、液体成分が蒸発した後の残留乾燥物質の重量と比較することによって決定した。使い捨てアルミニウム計量皿(VWR25433−016)、Ohaus Explorer E00640バランス(Ohaus Corporation)および105℃に設定したShel Labモデル1400Eオーブン(VWR)を用いた。乾燥物質パーセントは、(「風袋+乾燥物質」−「風袋」)/(「風袋+湿った物質」−「風袋」)*100として計算する。
ASTM D1544で規定されたとおりのガードナー色スケールは、淡黄色から茶褐色の範囲の色特性を用いて光伝達試料を等級分けするための単数の色スケールである。スケールは、最も明るいものについて1から最も暗いものについて18まで番号付けしたガラス標準品の色度によって定義される。試料のガードナー色は、Lovibond Gardner Comparator3000(The Tintometer Limted of Salisbury、英国)(着色ガラス標準品と直接比較することによって試料のガードナー色を視覚的に決定するための3視野装置)で決定した。
屈折率は、Cole−Parmer(Vernon Hills、イリノイ州)のPolystatモデル12108−10温度調節器で与えられる温度調節を有するReichert Analytical Instruments(Depew、ニューヨーク州)製のArias500屈折計で測定することによって決定した。手順は、Arias500屈折計用の取り扱い説明書の6.0、4.1および4.4〜4.5の項に基づく。
pHは、溶液中の水素イオン活性の常用対数の負数として定義し、溶液の酸性または塩基性の尺度であるpHを決定するために用いた。
極大吸収波長はnm、水加熱セルホルダー(Amersham部品番号80−2106−08)を有する、Amersham Biosciencesとして以前に知られた、以前にGE Healthcareの下の、Biochrom Ltd(Cambridge、英国)製のUltrospec4300pro UV/可視分光光度計で決定した。手順は、SWIFT IIアプリケーションソフトウェアUV/可視分光光度計と表題されたAmershamマニュアル番号80−2108−25のセクション2および4、およびUltrospec4300pro UV/可視分光光度計ユーザーマニュアルと表題されたAmershamマニュアル番号80−2111−79の7および15頁に基づく。装置制御は、SWIFT IIソフトウェア一式(Biochrom Ltd)によって、および温度制御は、Torrey Pines Scientific(Carlsbad、カナダ国)製CB20Miniサーキュレータによって提供した。
ケルダール法を用いて、タンパク質窒素含有量を測定した。
微生物含有量および限度:総平板菌数、CFU/g;かびおよび酵母、CFU/g;大腸菌(E. coli);サルモネラ属の種(Salmonella sp.);黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus);シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)を、米国薬局方(US Pharmacopoeia)XXX、NF25、<61>、微生物学的限度試験に従って決定した。
トリプシンは、インビボ表皮増殖および炎症に関与するタンパク質分解酵素である。トリプシン阻害活性は、96ウェルマイクロタイタープレート(マイクロプレート)およびコンピュータ制御マイクロプレートリーダーによる使用のために設計された動的比色アッセイによって決定した。基質の切断における酵素活性は、405nm波長における吸光度の増加として測定した黄色の発色によって示した。負の対照ウェルについての吸光度増加の最高率の平均を、酵素活性の100%とみなし、IC50は、酵素活性を50%に減少させるのに必要なウェル中の試料の濃度として計算した。IC50値が低ければ低いほど、より高いトリプシン阻害活性を示す。L−BAPA(Nα−ベンゾイル−L−アルギニン4−ニトロアニリド塩酸塩)基質、トリプシン、および溶媒の試薬は、Sigma−Aldrichから入手した。pH8.2Tris−CaCl2緩衝剤を、トリプシンおよびL−BAPA基質の作業溶液を調製するために用いた。緩衝剤試薬用の溶媒として(負の対照として)、および試料の系列希釈液を調製するために希釈剤として脱イオン水を用いた。各ウェルにおける反応体積は200μlであり、トリプシンの濃度は60nMに等しく、基質は、0.5mMに等しかった。
チロシナーゼは、対応するカテコールへのモノフェノールのo−ヒドロキシル化(モノフェノラーゼまたはクレゾラーゼ活性)、および対応するo−キノンへのモノフェノールの酸化(ジフェノラーゼまたはカテコラーゼ活性)を触媒する銅含有モノオキシゲナーゼである。これらのチロシナーゼの機能は、メラニン形成の間のメラニン色素の形成に重要な役割を果たす。メラニン産生は、皮膚の色の主として原因であり、日光誘発皮膚損傷の予防に重要な役割を果たす。しかしながら、皮膚におけるメラニン産物の異常な蓄積は、肝斑(melasma)、肝斑(chloasma)、そばかす、および老人性色素斑を含む過剰色素沈着の原因であり、これは、望ましくない美的外観をもたらし得る(Jeonら、(2005年)Bull Korean Chem. Soc、第26巻:1135〜1137頁)。
LDH(乳酸脱水素酵素)放出細胞毒性決定法は、ある種の細胞成分基質は、典型的には細胞内に隔離され、細胞外媒体中に不足しているという事実に基づく。細胞生存率の損失は、細胞膜完全性の損失およびこのような基質の放出をもたらす。細胞外LDH濃度は、LDHによって着色形態に変換される色素を用いて比色分析的に測定することができる。したがって、被験物質の細胞毒性は、被験物質を細胞培養液の増殖培地に加え、適当なインキュベーション時間後に培地中のLDH濃度を測定し、その結果を正常な未処理細胞の負の対照の細胞培養液の増殖培地から得たもの、および公知の細胞毒性剤で処理された正の対照の細胞培養液からのものと比較することによって決定され得る。
MatTek Melanodermアッセイは、メラニン関連皮膚色素沈着に対する被験物質の効果を決定する(美白/明色化適用など)。このアッセイは、肉眼的および顕微鏡的観察、ならびに正常ヒト角化細胞と、ヒト表皮およびその着色をモデルとするメラニン形成細胞との共培養液中の終点メラニン含有量決定に基づく。Melanoderm細胞培養液は、試験の継続時間の間維持および観察され、未処理の負の対照を、増殖培地に加えた被験物質を有する培養液のみならず、増殖培地に加えた公知のメラニン形成性影響物質を有する正の対照と比較する。試験の最後に、細胞培養液を回収し、加工して、比色アッセイを用いてメラニン含有量を測定する。
抗酸化剤は、酸化により引き起こされる損傷を低減する薬剤である。抗酸化活性は、BioTek Instruments Inc(Winooski、バーモント州)製のSynergy2マイクロプレートリーダーとともに用いられる、(www.biotek.com/resources/docs/ORAC_Assay_Application_Note.pdf)で入手できるBioTekからのApplication Note「Perfoming Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) Assays with Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader」に記載された方法の修正を用いてORAC試験によって決定した。このアッセイでは、AAPH(2,2’−アゾビス2−アミノ−プロパン)が、蛍光プローブ(ナトリウムフルオレセイン)を損傷させる反応性酸素種を発生する。(R)−Troloxメチルエーテルなどの抗酸化剤は、この損傷を予防または遅延化し、それらの効果は、蛍光測定によって定量化され得る。蛍光読み取りは、485nmに設定した励起波長および528nmに設定した発光波長によって行い、反応体積は200μl、AAPH濃度は55mM、ナトリウムフルオレセイン濃度は1.33μM、および(R)−Troloxメチルエーテル濃度範囲は80μMから2μMであった。ナトリウムフロオレセイン(Fluka46960)、AAPH(Sigma440914)および(R)−Troloxメチルエーテル(Fluka93509)は、Sigma−Aldrich(St.Louis、ミズーリ州)から入手した。AUC(曲線下面積)値は、比率(ウェルについて最初の蛍光読み取り値によって除した、ウェルについての現下の蛍光読み取り値)の合計として計算した。脱イオン水を有するウェルのAUC値の平均を、(R)−Troloxメチルエーテルを有するウェルおよび被験物質を有するウェルのAUCから減じて、抗酸化剤による蛍光の保存に対応するAUCを得た。検量線は、(R)−Troloxメチルエーテル重量−相当するORAC活性を示すウェルの抗酸化関連AUCの関数として生成した。次いで、被験物質についてのORAC活性を、1単位重量の(R)−Troloxメチルエーテルによって生じたものと等しい抗酸化活性を達成するのに必要な被験物質の単位重量として計算し、数字が低ければ低いほど、高いORAC活性を示す。
フリーラジカル捕捉剤は、生物系においてフリーラジカルと反応し、フリーラジカルによって誘発される損傷を低減し、フリーラジカルの作用から保護する成分である。フリーラジカル捕捉活性、すなわち、DPPH(2,2−ジフェニル−1−ピクリルヒドラジル)フリーラジカル捕捉活性は、SUN−SRi(Rockwood、テネシー州)製ガラス被覆ポリプロピレン製96−ウェルマイクロタイタープレート(カタログ番号400062)およびBioTek Instruments Inc(Winooski、バーモント州)製Synergy2マイクロプレートリーダーを伴う使用に適合させた動的比色アッセイによって決定した。吸光度は、515nmの波長で測定した。各マイクロプレートウェル中の反応体積は200μlであり、DPPHの初期濃度は114μMに等しかった。L−アルコルビン酸を正の対照として用いた。DPPH(Sigma D9132)およびUSP L−アルコルビン酸(Sigma A−2218)は、Sigma−Aldrich(St.Louis、ミズーリ州)から入手した。反応の化学量論を計算して、1単位重量のDPPHをクエンチするのに必要な被験物質の単位重量として表し、これはより低い数値がより高い活性を示す。この方法は、(LWT- Food Sicenc and Technology、第28巻、Issue 1、1995年、25〜30頁に公表されたW.Brand-Williamsらによる「Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity」)に記載された手順から改変した。
スーパーオキシド捕捉アッセイプロトコルは、Journal of Neuroscience Methods 97(2000年)139〜144頁中「Rapid Microplate Assay for Superoxide Scavenging Efficiency」から改変した。
化粧用植物性成分601を調製する方法は、化粧用植物性成分101に関して実施例1で記載した方法と同一であり、その変化は以下に記す。ムラサキツメクサ(Trifolium pratense)の新鮮な茎、花および葉の組織を、植物バイオマス出発材料として用いた。新鮮なムラサキツメクサ植物バイオマス中の乾燥物質のレベルは、15.16パーセントであると計算され、100kgの乾燥物質をもたらすために約560kgの新鮮なムラサキツメクサ植物バイオマスの収穫を必要とした。この調製は、15.36kgの乾燥物質収量(または約300リットル)の化粧用植物性成分601の生成をもたらした。
化粧用植物性成分601は、実施例27で上記した方法によって調製した。
マッシュルームチロシナーゼ阻害効力試験によれば、ムラサキツメクサセラム画分は、チロシナーゼを阻害し、約0.02%w/vのIC50値を達成し得る。
化粧用植物性成分701を調製する方法は、以下の変更点を伴うが、化粧用植物性成分101に関して実施例1で記載した方法と同一であった。ハス(Nelumbo nucifera)の新鮮な茎、花および葉の組織を、植物バイオマス出発材料として用いた。新鮮なハス(Nelumbo nucifera)植物バイオマス中の乾燥物質のレベルは、20.7パーセントであると計算され、100kgの乾燥物質をもたらすために約483kgのハス(Nelumbo nucifera)植物バイオマスの収穫を必要とした。この調製は、約13kgの乾燥物質収量(または約262リットル)の化粧用植物性成分701の生成をもたらした。
化粧用植物性成分701は、実施例30で上記した方法によって調製した。
MB Researchにより完成されたLDH放出細胞毒性法(MB Researchプロトコル701-01)試験によれば、ハスセラム画分は、細胞培養培地中容積で最大10%までの濃度範囲の被験物質で細胞毒性をやはり示さない。
換などが、本発明の精神から逸脱することなしになされ得ることは当業者に明らかであり
、したがって、これらは、以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内にあるとみ
なされる。
上記の開示によって提供される本願発明の具体例として、以下の発明が挙げられる。
[1] 新鮮な植物バイオマスから抽出された細胞ジュースに由来し、抗酸化活性、細胞増殖刺激活性および/または抗酸化活性と細胞増殖刺激活性との両方を有する細胞セラム画分ろ液であって、前記新鮮な植物バイオマスがハス(Nelumbo nucifera)およびムラサキツメクサ(Trifolium pratense)からなる群から選択される植物供給源由来である細胞セラム画分ろ液;ならびに
安定化剤
を含む生物活性植物性化粧用組成物であって、
ここで、前記細胞増殖刺激活性が少なくとも1つの型の細胞の増殖刺激によるものであり、
前記細胞セラム画分ろ液が、以下の工程:
新鮮な植物バイオマスから抽出された植物細胞ジュースを準備する工程;
前記植物細胞ジュースを、膜画分と細胞ジュース上清とに分離するのに有効な条件下でを処理する工程;
前記細胞ジュース上清を、細胞質画分と細胞セラム画分とに分離するのに有効な条件下で加工する工程;ならびに
前記細胞セラム画分ろ液をもたらすのに有効な条件下で前記細胞セラム画分を精製する工程であって、前記精製工程が、前記細胞セラム画分を温度処理工程にかけて凝固した細胞セラム画分をもたらす工程、および前記凝固した細胞セラム画分を清澄化して細胞セラム画分ろ液をもたらす工程、を含む工程
によって細胞ジュースから誘導される、生物活性植物性化粧用組成物。
[2] 前記安定化剤が、保存剤および抗酸化剤からなる群から選択される、[1]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[3] 前記保存剤が、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウムおよびクエン酸からなる群から選択される、[2]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[4] 前記抗酸化剤が、メタ重亜硫酸ナトリウムである、[2]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[5] 前記抗酸化活性が、スーパーオキシド捕捉活性および好中球呼吸バースト阻害活性からなる群から選択される、[2]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[6] 前記細胞セラム画分ろ液が、前記生物活性植物性化粧用組成物の約1〜約10重量パーセントを構成する、[1]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[7] 約50〜約190μg乾燥物質/mlのICR 50 値のスーパーオキシド捕捉効力範囲を有し、前記ICR 50 値が、シトクロムc還元の50パーセントを阻害するのに必要な、細胞セラム画分ろ液中に含有される乾燥物質の濃度を表す、[6]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[8] 前記細胞セラム画分ろ液が約1.0〜125μg乾燥物質/mlの範囲の細胞増殖刺激効力を有する、[1]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[9] 前記細胞セラム画分ろ液が約110〜190パーセントのNRU値を有し、前記NRU値が細胞生存率を表す、[8]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[10] 酢酸ミリスチン酸ホルボール刺激好中球から呼吸バーストの二相性調節を引き起こす能力を有し、前記呼吸バーストを約1.0〜5.0μg乾燥物質/mlで阻害し、前記呼吸バーストを約20〜180μg乾燥物質/mlで刺激する、[1]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[11] 表38または表39に示されるものと実質的に同じ特性を備える、[1]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[12] 哺乳動物への局所適用に適し、化粧品として許容される担体および化粧品として有効な量の[1]に記載の生物活性植物性化粧用組成物を含む、生物活性植物性化粧用調合物。
[13] 前記化粧品として許容される担体が、親水性クリーム基剤、親水性ローション基剤、親水性界面活性剤基剤、疎水性クリーム基剤、疎水性ローション基剤および疎水性界面活性剤基剤からなる群から選択される、[12]に記載の化粧用調合物。
[14] 前記生物活性植物性化粧用組成物が、化粧用調合物の総重量の約0.001パーセント〜約95パーセントの範囲の量で存在する、[12]に記載の化粧用調合物。
[15] 前記植物供給源がハス(Nelumbo nucifera)である、[1]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[16] 前記植物供給源がムラサキツメクサ(Trifolium pratense)である、[1]に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
[17] 前記植物供給源がハス(Nelumbo nucifera)である、[12]に記載の化粧用調合物。
[18] 前記植物供給源がムラサキツメクサ(Trifolium pratense)である、[12]に記載の化粧用調合物。
[19] 新鮮な植物バイオマスから抽出された植物細胞ジュースを準備する工程であって、前記新鮮な植物バイオマスがハス(Nelumbo nucifera)およびムラサキツメクサ(Trifolium pratense)からなる群から選択される植物供給源由来である工程;
前記植物細胞ジュースを、膜画分と細胞ジュース上清とに分離するのに有効な条件下で処理する工程;
前記細胞ジュース上清を、細胞質画分と細胞セラム画分とに分離するのに有効な条件下で加工する工程;
抗酸化活性、細胞増殖刺激活性、および/または抗酸化活性と細胞増殖刺激活性との両方を有する細胞セラム画分ろ液をもたらすのに有効な条件下で、前記細胞セラム画分を精製する工程であって、前記精製工程が、前記細胞セラム画分を温度処理工程にかけて、凝固した細胞セラム画分をもたらす工程、および前記凝固した細胞セラム画分を清澄化して細胞セラム画分ろ液をもたらす工程、を含む工程;ならびに
前記抗酸化活性、細胞増殖刺激活性、または抗酸化活性と細胞増殖刺激活性との両方を示す安定な生物活性植物性化粧用組成物をもたらすのに有効な条件下で、前記細胞セラム画分ろ液を安定化させる工程
を含む、生物活性植物性化粧用組成物を調製する方法。
[20] 前記処理する工程が、
前記植物ジュースを凝固させて、凝固した細胞ジュース混合物をもたらす工程、および
前記凝固した細胞ジュースを膜画分と細胞ジュース上清とに分離する工程
を含む、[19]に記載の方法。
[21] 前記凝固させる工程が、植物細胞ジュースを不安定化させて、凝固した細胞ジュース混合物をもたらす工程であって、前記不安定化が、熱処理、電気−膜処理、化学処理、および/またはそれらの組合せによって達成される、[20]に記載の方法。
[22] 前記熱処理が、
植物細胞ジュースを加熱して、膜画分の凝固を誘発するのに必要な加熱温度に加熱する工程、および
加熱された前記細胞ジュースを、前記細胞ジュース上清から前記膜画分の定量的分離を可能にするのに有効な温度に冷却する工程
を含む、[21に記載の方法。
[23] 前記加熱する工程が45〜70℃で行われる、[22]に記載の方法。
[24] 前記冷却する工程が30〜45℃で行われる、[22]に記載の方法。
[25] 前記分離する工程がろ過または遠心分離により行われる、[20]に記載の方法。
[26] 前記加工する工程が、
前記細胞ジュース上清を細胞質画分沈殿工程にかけて、細胞質画分および細胞セラム画分を含む細胞質/細胞セラム混合物をもたらす工程、ならびに
前記細胞セラム画分から細胞質画分を分離する工程
を含む、[19]に記載の方法。
[27] 前記細胞質画分沈殿工程が、等電滴定、電気透析、および/またはそれらの組合せによって行われる、[26]に記載の方法。
[28] 前記等電滴定が、前記細胞ジュース上清のpHを約2.5〜6.5に調整する工程を含む、[27]に記載の方法。
[29] 前記分離する工程がろ過または遠心分離によって行われる、[26]に記載の方法。
[30] 前記温度処理工程が、
前記細胞セラム画分を、前記細胞セラム画分内で凝固を誘発するのに必要な加熱温度に加熱する工程、および
細胞セラム画分を、前記細胞セラム画ろ液のさらなる定量的分離を可能にするのに有効な温度に冷却する工程
を含む、[19]に記載の方法。
[31] 前記加熱温度が80〜95℃である、[30]に記載の方法。
[32] 前記冷却する工程が少なくとも約15℃低い温度までである、[30]に記載の方法。
[33] 前記清澄化する工程がろ過または遠心分離によって行われる、[19]に記載の方法。
[34] 前記ろ過が、前記凝固した細胞セラム画分を真空ろ過して、前記細胞セラム画分ろ液をもたらす工程を含む、[33]に記載の方法。
[35] 前記細胞セラム画分のpHを、前記精製する工程の直前に約3.0〜4.0に調整する工程をさらに含む、[19]に記載の方法。
[36] 前記安定化させる工程が、前記細胞セラム画分ろ液を、少なくとも1種の保存剤と少なくとも1種の抗酸化剤との混合物中でインキュベートして、前記安定な生物活性植物性化粧用組成物をもたらす工程を含む、[19]に記載の方法。
[37] 前記保存剤が、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウム、およびクエン酸からなる群から選択される、[36]に記載の方法。
[38] 前記抗酸化剤が、重亜硫酸ナトリウムである、[36]に記載の方法。
[39] 前記植物供給源がハス(Nelumbo nucifera)である、[19]に記載の方法。
[40] 前記植物供給源がムラサキツメクサ(Trifolium pratense)である、[19]に記載の方法。
[41] [19]に記載の方法によって製造された安定な生物活性植物性化粧用組成物。
Claims (8)
- 新鮮な植物バイオマスから抽出された細胞ジュースに由来し、皮膚において抗酸化活性、およびメラニン生合成阻害または明色化/美白効果を有する細胞セラム画分ろ液であって、前記新鮮な植物バイオマスがムラサキツメクサ(Trifolium pratense)から選択される植物供給源由来である細胞セラム画分ろ液;ならびに
安定化剤
を含む、皮膚におけるメラニン生合成阻害または明色化/美白効果のための生物活性植物性化粧用組成物。 - 前記安定化剤が保存剤および抗酸化剤からなる群から選択される、請求項1に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
- 前記保存剤が、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウムおよびクエン酸からなる群から選択される、請求項2に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
- 前記抗酸化剤がメタ重亜硫酸ナトリウムである、請求項2に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
- 前記細胞セラム画分ろ液が、前記生物活性植物性化粧用組成物の1〜10重量パーセントを構成する、請求項1に記載の生物活性植物性化粧用組成物。
- 哺乳動物への局所適用に適し、化粧品として許容される担体および化粧品として有効な量の請求項1〜5のいずれか1項に記載の生物活性植物性化粧用組成物を含む、皮膚におけるメラニン生合成阻害または明色化/美白効果のための生物活性植物性化粧用調合物。
- 前記化粧品として許容される担体が、親水性クリーム基剤、親水性ローション基剤、親水性界面活性剤基剤、疎水性クリーム基剤、疎水性ローション基剤および疎水性界面活性剤基剤からなる群から選択される、請求項6に記載の化粧用調合物。
- 前記生物活性植物性化粧用組成物が、化粧用調合物の総重量の0.001パーセント〜95パーセントの範囲の量で存在する、請求項6に記載の化粧用調合物。
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