ES2649991T3 - Anticuerpo biespecífico recombinante que se une a CD20 y CD95 - Google Patents

Abstract

Un formato de anticuerpo biespecífico, que comprende a) un fragmento Fab que comprende un primer sitio de unión para un primer antígeno; b) un fragmento scFv que comprende un segundo sitio de unión para un segundo antígeno; y c) un dominio CH2 monomérico, en el que el fragmento Fab y el fragmento scFv están ligados a través del dominio CH2, en donde - el primer antígeno es CD95 y el segundo antígeno es CD20; o - el primer antígeno es CD20 y el segundo antígeno es CD95.

Description

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Figura 4: Especificidad de unión de Novotarg para CD20 y CD95.

Análisis de citometría de flujo de células CD95/CD20+ Daudi (●) y células CD95/CD20-LN-18 (○) después de la incubación con las concentraciones indicadas de Novotarg purificado (derivado de anticuerpo CD95XCD20 humanizado). Esto se comparó con la unión del anticuerpo en las diluciones indicadas del sobrenadante del clon 25-CHO-S/BV004/K44 (que expresa Novotarg). Anticuerpo de detección: α Fcy-PE humana de cabra, Jackson Immuno Research 109-116-098.

Figura 5: vida mitad in vivo del derivado del anticuerpo CD95XCD20 quimérico.

Se inyectaron ratones C57BL6 (macho, 6 semanas de edad) con 50 µg de NA-C20 y se tomaron muestras de sangre a las 0,5 h, 1,0 h, 2,0 h y 4,0 h. El suero fue incubado con células SKW 6.4, que luego se analizaron en relación con el anticuerpo unido en una citometría de flujo (anticuerpo de detección: PE-Fcγ antihumana de cabra, Jackson Immuno Research).

Figura 6: Capacidad de NA-C20 y Novotarg para activar CD95 en células CD95+ /CD20+.

Ensayo de incorporación de timidina con células CD95+/CD20+ SWK 6.4 después de la incubación con las concentraciones indicadas de NA-C20 (●) o Novotarg (○). Las células no tratadas sirvieron de control negativo (solo células de columna), las células incubadas con un mAb de ratón contra Apo-1 (entrecruzado por un anticuerpo anti ratón de cabra) sirvieron de control positivo (columna GaM + Apo).

Figura 7: Prueba de NA-C20 en un modelo de ratón SCID.

Ocho ratones SCID fueron inyectados con una dosis letal de la línea celular CD20+/CD95+ B-linfoblastoide SKW 6.4 en el día 0. A continuación, los ratones fueron inyectados repetidamente con 20 µg de NA-C20 (○), NA-CMel (▼) o 100 μΙ de PBS (●) en los días 1, 2 y 3 después de la inoculación de células tumorales, o una vez en el día 1 después de la inoculación de células tumorales con 60 µg de anticuerpos quiméricos contra CD20 (■, imagen7) y un anticuerpo dirigido contra EGFR (receptor del factor de crecimiento epitelial, □), respectivamente.

Descripción detallada.

La expresión "formato de anticuerpo" como se usa en el presente texto se referirá a polipéptidos o proteínas que consisten en o comprenden dominios de anticuerpo, que se entienden como dominios constantes y/o variables de las cadenas pesadas y/o ligeras de inmunoglobulinas, con o sin una secuencia enlazadora. El formato de anticuerpo de la invención es de una estructura específica, que comprende específicamente un sitio de unión de un fragmento Fab que consiste en un par de dominios VL/VH y dominios de anticuerpo constantes, tales como dominios CL/CH1, y comprende además un sitio de unión de un scFv, que está ligado al scFv por un dominio CH2.

Un anticuerpo digerido por papaína da tres fragmentos: dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. Se entiende en el presente texto que el término "Fab" incluye Fab, F(ab) o F(ab'), que pueden incluir o no una región bisagra. El fragmento Fab es una estructura de anticuerpo que aún se une a antígenos, pero es monovalente sin porción Fc.

Los dominios de anticuerpos pueden ser de estructura nativa o modificados por mutagénesis o derivatización, p. ej. para modificar las propiedades de unión con el antígeno o cualquier otra propiedad, tal como la estabilidad o las propiedades funcionales, tales como la unión a los receptores Fc, receptores FcRn y/o Fcgamma. Se considera que las secuencias polipeptídicas son dominios de anticuerpos, si comprenden una estructura de barril beta que consiste en al menos dos cadenas beta de una estructura de dominio de anticuerpo conectada por una secuencia de bucle.

La expresión "formato de anticuerpo" se referirá particularmente a polipéptidos o proteínas que muestran las propiedades de unión biespecífica, es decir, a los antígenos diana CD20 y CD95.

Los ejemplos de formatos de anticuerpo tienen una estructura específica como se representa en la Figura 1. Puede estar compuesta por un fragmento Fab, un dominio CH2 y un fragmento Fv de cadena simple (scFv), en particular un scFv en orientación VH/VL. La molécula de anticuerpo puede tener una cadena principal en la que el dominio CH2 está acoplado a través de su término N a los dominios CH1 y VH de la cadena pesada de un fragmento Fab y a través de su extremo C a un fragmento scFv.

También puede comprender una cadena principal en la que el dominio CH2 está ligado a la cadena ligera de un fragmento Fab, es decir, en la que la cadena principal incluye un dominio VL y un dominio CL, una región bisagra, un dominio CH2 y un fragmento Fv de cadena simple.

Otro ejemplo se refiere a un formato de anticuerpo en el que la cadena principal incluye un dominio VL y un dominio CH1, una región bisagra, un dominio CH2 y un fragmento anscFv. Una segunda cadena de menor peso incluye un VH y un dominio CL. En tal formato de anticuerpo, el fragmento Fab no es pues un fragmento Fab "clásico (natural)” en el que el dominio variable de las cadenas ligera y pesada se fusiona con su dominio constante correspondiente (CL o CH1, respectivamente), sino un fragmento Fab "híbrido" en el que el dominio variable está fusionado con el dominio constante de la "cadena opuesta", es decir, el dominio VH se fusiona con el dominio CL y el dominio VL se fusiona con el dominio CH1.

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de un anticuerpo, también denominado en el presente texto "un sitio de unión con CDR", que es una región específica con estructuras variables que confieren función de unión a varios antígenos. Las estructuras variables pueden derivarse de repertorios naturales de anticuerpos, p. ej. repertorios murinos o humanos, o pueden ser producidos por vía recombinante o sintética, p. ej. mediante mutagénesis y específicamente mediante técnicas de aleatorización. Estas incluyen regiones CDR mutagenizadas, regiones de bucle de dominios de anticuerpos variables, en particular bucles CDR de anticuerpos, tales como bucles CDR1, CDR2 y CDR3 de cualquiera de los dominios de anticuerpos VL y/o VH. El formato de anticuerpo como se usa de acuerdo con la invención comprende típicamente uno o más sitios de unión a CDR, cada uno específico para un antígeno.

El término "específico" o "biespecífico" como se usa en el presente texto se referirá a una reacción de unión que es determinante del ligando cognado de interés en una población heterogénea de moléculas. Por lo tanto, bajo condiciones designadas, p. ej. condiciones de inmunoensayo, el formato de anticuerpo que se une específicamente a su diana particular no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en una muestra.

Un sitio de unión específico no tiene típicamente reactividad cruzada con otras dianas. Con todo, el sitio de unión específico puede unirse específicamente a uno o más epítopos, isoformas o variantes de la diana, o puede tener reactividad cruzada con otros antígenos diana relacionados, p. ej. homólogos o análogos.

La unión específica significa que la unión es selectiva en términos de identidad de la diana, afinidad o avidez de unión alta, media o baja, según se seleccione. La unión selectiva se logra normalmente si la constante de unión o la dinámica de unión es al menos 10 veces diferente, preferiblemente si la diferencia es al menos 100 veces, y más preferiblemente es al menos 1000 veces.

El formato de anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende específicamente dos sitios con propiedades de unión específicas, en donde dos antígenos diana diferentes son reconocidos por el formato de anticuerpo. Así pues, un ejemplo de formato de anticuerpo biespecífico puede comprender dos sitios de unión, donde cada uno de los sitios de unión es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente, p. ej. un receptor de muerte y un antígeno de superficie celular de una célula B.

El término "monovalente" como se usa en el presente texto con respecto a un sitio de unión de un anticuerpo o formato de anticuerpo se referirá a una molécula que comprende solamente un sitio de unión dirigido contra un antígeno diana. El término "valencia" se entiende entonces como el número de sitios de unión dirigidos contra el mismo antígeno diana, uniéndose específicamente al mismo epítopo o bien a diferentes epítopos de un antígeno.

Se entiende que el formato de anticuerpo de la presente invención comprende un sitio de unión monovalente que se une específicamente a una diana de receptor de muerte y otro sitio de unión monovalente para unirse específicamente a un antígeno de superficie celular expresado en células B, en particular células B autorreactivas.

El término "antígeno" como se usa en el presente texto indistintamente con los términos "diana" o "antígeno diana" se referirá a una molécula diana completa o a un fragmento de tal molécula reconocido por un sitio de unión de anticuerpo. Específicamente, las subestructuras de un antígeno, p. ej. una estructura de polipéptido o carbohidrato, generalmente denominada "epítopos", p. ej. los epítopos de las células B o el epítopo de células T, que son inmunológicamente relevantes, pueden reconocerse por tal sitio de unión. El término "epítopo" como se usa en el presente texto se referirá en particular a una estructura molecular que puede constituir completamente un compañero de unión específico o ser parte de un compañero de unión específico a un sitio de unión de un formato de anticuerpo de la presente invención. Un epítopo puede estar compuesto por un carbohidrato, una estructura peptídica, un ácido graso, una sustancia orgánica, bioquímica o inorgánica o derivados de los mismos y cualquier combinación de los mismos. Si un epítopo está comprendido en una estructura peptídica, tal como un péptido, un polipéptido o una proteína, incluirá normalmente al menos 3 aminoácidos, preferiblemente de 5 a 40 aminoácidos, y más preferiblemente entre aproximadamente 10 y 20 aminoácidos. Los epítopos pueden ser epítopos lineales o bien conformacionales. Un epítopo lineal está formado por un único segmento de una secuencia primaria de una cadena de polipéptido o carbohidrato. Los epítopos lineales pueden ser contiguos o solapantes. Los epítopos conformacionales están compuestos de aminoácidos o carbohidratos reunidos por plegamiento del polipéptido para formar una estructura terciaria y los aminoácidos no son necesariamente adyacentes entre sí en la secuencia lineal.

La expresión "antígeno de superficie celular" con respecto a una célula B como se usa en el presente texto se referirá a un antígeno expresado en la superficie de una célula B, preferiblemente una célula B madura, activada o autorreactiva, que puede ser dirigida con un antagonista que se une al mismo. El CD20 se considera un ejemplo de marcador de superficie de las células B dirigido por el formato de anticuerpo de la presente invención.

Un sitio de unión que se une específicamente a CD20 puede derivarse de un anticuerpo monoclonal disponible comercialmente dirigido contra el antígeno, p. ej. rituximab u ocrelizumab dirigidos contra CD20. Específicamente, se puede usar un sitio de unión derivado de cualquiera de los formatos de anticuerpo anti-CD20 como se ejemplifica en la Figura 2.

El término "CD20" incluye cualquier variante, isoforma y homólogo de especie del CD20 humano que se expresan naturalmente por células o se expresan en células transfectadas con el gen CD20.

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secuencia de nucleótidos, respectivamente, en que se deriva de una secuencia homóloga de una especie diferente. Estos se conocen como variantes de origen natural.

La invención proporciona específicamente secuencias quiméricas, humanizadas o humanas y variantes funcionalmente activas de un formato de anticuerpo parental que comprende tales secuencias quiméricas, humanizadas o humanas.

El término "quimérico", como se usa con respecto a un formato de anticuerpo de la invención, se refiere a aquellos anticuerpos en los que una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras es homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homólogo a las secuencias correspondientes en otra especie o clase. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada imita las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homólogas a secuencias de anticuerpos derivados de otra. Por ejemplo, la región variable puede derivarse de fuentes conocidas actualmente que usan células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos hospedadores no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas.

El término "humanizado", como se usa con respecto a un formato de anticuerpo de la invención, se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión con el antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, donde el resto de la estructura de inmunoglobulina de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados sobre dominios constantes o solamente las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas en regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión al antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados, p. ej. por una o más sustituciones de aminoácidos, preferiblemente modificados para parecerse más estrechamente a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados preservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo humanizado de ratón que contiene las seis CDRs del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDRs que están alteradas con respecto al anticuerpo original.

Se entiende que el término “humano” como se usa en el presente texto con respecto a un formato de anticuerpo de la presente invención incluye anticuerpos que tienen regiones variable y constante derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los formatos de anticuerpo humano de la presente invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej. mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en los CDRs. Los formatos de anticuerpo humanos de la invención incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas.

La expresión "variante funcionalmente activa" incluye también variantes alélicas de origen natural, así como mutantes o cualquier otra variante de origen no natural. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de un (poli)péptido que se caracteriza por tener una sustitución, deleción o adición de uno o más aminoácidos que esencialmente no altera la función biológica del polipéptido.

Las variantes funcionalmente activas se pueden obtener mediante alteraciones de secuencia en el polipéptido o en la secuencia de nucleótidos, p. ej. mediante una o más mutaciones puntuales, en donde las alteraciones de secuencia conservan una función del polipéptido inalterado o la secuencia de nucleótidos, cuando se usan en combinación con la invención. Tales alteraciones de secuencia pueden incluir, pero no se limitan a ellas, sustituciones (conservadoras), adiciones, deleciones, mutaciones e inserciones.

Una variante de CDR incluye una secuencia de aminoácidos modificada por al menos un aminoácido, en donde dicha modificación puede ser química o una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos, la cual modificación permite que la variante retenga las características biológicas de la secuencia no modificada. Por ejemplo, la variante es una variante funcional que se une a CD19, CD20, CD40 o CD95. Una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de CDR puede ser por deleción o sustitución de uno a varios aminoácidos, p. ej. 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o por adición o inserción de uno a varios aminoácidos, p. ej. 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o mediante una derivatización química de uno a varios aminoácidos, p. ej. 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o una combinación de los mismos. Las sustituciones en restos de aminoácidos pueden ser sustituciones conservadoras, por ejemplo sustituyendo un aminoácido hidrófobo por un aminoácido hidrófobo alternativo.

Las sustituciones conservadoras son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales y en sus propiedades químicas. Ejemplos de tales familias son aminoácidos con cadenas laterales básicas, con cadenas laterales ácidas, con cadenas laterales alifáticas no polares, con cadenas laterales aromáticas no polares, con cadenas laterales polares no cargadas, con cadenas laterales pequeñas, con cadenas laterales grandes, etc.

Una mutación puntual se entiende en particular como la ingeniería de un polinucleótido que da como resultado la expresión de una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos no modificada por

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Las formulaciones a usar para la administración in vivo necesitarán ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles u otros métodos adecuados.

La administración de la composición farmacéutica que comprende los formatos de anticuerpos de la presente invención puede hacerse de diversas formas, que incluyen administración sistémica o parenteral, preferiblemente en forma de solución acuosa estéril, p. ej. por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea, pero también por vía oral, intranasal, intraótica, transdérmica, mucosal, tópica (p. ej. geles, pomadas, lociones, cremas, etc.), intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, parenteral, rectal o intraocular. Así pues, la invención proporciona el formato de anticuerpo en una formulación correspondiente adecuada para tal uso.

La presente invención incluye un preparado farmacéutico, que contiene como sustancia activa los formatos de anticuerpo de la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva. En particular, una formulación aceptable farmacéuticamente del formato de anticuerpo es compatible con el tratamiento de un sujeto que lo necesite.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva", usada en el presente texto indistintamente con cualquiera de las expresiones "cantidad efectiva" o "cantidad suficiente" del formato de anticuerpo de la presente invención, es una cantidad o actividad suficiente para que, cuando se administra al sujeto, tenga por resultado un efecto beneficioso o deseado, incluyendo los resultados clínicos y, como tal, una cantidad efectiva o sinónimo de ella depende del contexto en el que se aplica. En el contexto de la enfermedad, pueden usarse cantidades terapéuticamente efectivas del formato del anticuerpo para tratar, modular, atenuar, revertir o afectar a una enfermedad o afección que se beneficia de una regulación a la baja o una reducción del exceso de células B, p. ej. para la inhibición de reacciones autoinmunitarias, por ejemplo enfermedades inflamatorias agudas o crónicas asociadas con un trastorno de células B autorreactivas. Se pretende que una cantidad efectiva signifique la cantidad de un compuesto que es suficiente para tratar, prevenir o inhibir tales enfermedades o trastornos. La cantidad de formato de anticuerpo que corresponderá a tal cantidad variará dependiendo de varios factores, tales como el fármaco o compuesto dados, la formulación farmacéutica, la vía de administración, el tipo de enfermedad o trastorno, la identidad del sujeto o del hospedador que se está tratando, y similares, pero que puede ser determinado rutinariamente por un experto en la técnica.

Además, un régimen de tratamiento o prevención de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz del formato de anticuerpo de la presente invención puede consistir en una administración única, o comprender alternativamente una serie de aplicaciones. Por ejemplo, el formato de anticuerpo puede ser administrado al menos una vez al año, al menos una vez cada medio año o al menos una vez al mes. Sin embargo, en otra realización, el formato de anticuerpo puede administrarse al sujeto entre aproximadamente una vez por semana y aproximadamente una administración diaria para un tratamiento dado. La duración del período de tratamiento depende de diversos factores, como la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente, la concentración y la actividad del formato de anticuerpo. También se apreciará que la dosificación efectiva utilizada para el tratamiento o la profilaxis puede aumentar o disminuir en el curso de un régimen particular de tratamiento o profilaxis. Pueden resultar cambios en la dosificación y hacerse evidentes mediante ensayos estándar de diagnóstico conocidos en la técnica. En algunos casos, puede requerirse una administración crónica.

Una cantidad terapéuticamente efectiva del formato de anticuerpo tal como se proporciona a un paciente humano en necesidad del mismo puede estar concretamente en el intervalo de 0,5 a 500 mg, preferiblemente de 1 a 400 mg, incluso más preferiblemente hasta 300 mg, hasta 200 mg, hasta 100 mg o hasta 10 mg, aunque pueden ser indicadas dosis más altas, p. ej. para el tratamiento de condiciones de enfermedades agudas.

Los ejemplos de formulaciones como se usan para administración parenteral incluyen las que son adecuadas para inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril.

En una realización, el formato de anticuerpo de acuerdo con la presente invención es el único agente terapéuticamente activo administrado a un paciente, p. ej. como una monoterapia de modificación de una enfermedad.

Alternativamente, el formato de anticuerpo de acuerdo con la presente invención es administrado en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos incluyendo, pero sin limitarse a ellos, tratamientos estándar, p. ej. quimioterapia en casos de enfermedad maligna, o interferón beta o esteroides en caso de MS, o inmunoglobulinas en dosis elevadas en caso de ITP.

Una terapia de combinación está empleando en particular un régimen estándar, p. ej. como el usado para tratar RRMS. Esto puede incluir interferón beta o esteroides.

En una terapia de combinación, el formato de anticuerpo se puede administrar como una mezcla, o de forma conjunta con uno o más regímenes terapéuticos distintos, p. ej. antes, simultáneamente o después de la terapia concomitante.

Las propiedades biológicas del formato de anticuerpo de acuerdo con la invención se pueden caracterizar ex vivo en experimentos con células, tejidos y organismos completos. Como es sabido en la técnica, los fármacos se prueban con frecuencia in vivo en animales, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, ratones, ratas, conejos, perros, gatos,

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cerdos y monos, para medir la eficacia de un fármaco para el tratamiento contra una enfermedad o un modelo de enfermedad, o para medir la farmacocinética, la farmacodinámica, la toxicidad y otras propiedades de un fármaco. Los animales pueden denominarse modelos de enfermedad. Los productos terapéuticos se prueban con frecuencia en ratones, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, ratones lampiños o atímicos, ratones SCID, ratones xenoinjertados y ratones transgénicos (que incluyen ratones knockin y knockout). Tal experimentación puede proporcionar datos significativos para la determinación del potencial del formato de anticuerpo a usar como un agente terapéutico con la vida mitad apropiada, la función efectora, la actividad apoptótica y la actividad inhibidora de IgG. Cualquier organismo, preferiblemente mamíferos, se puede usar para las pruebas. Por ejemplo, a causa de su similitud genética con seres humanos, primates y monos pueden ser modelos terapéuticos adecuados y por tanto pueden usarse para probar la eficacia, toxicidad, farmacocinética, farmacodinámica, vida mitad u otras propiedades del formato de anticuerpo según la invención. Al final, se requieren pruebas de las sustancias en seres humanos para su aprobación como medicamentos, y estos experimentos se contemplan en el presente texto. Así pues, el formato de anticuerpo de la presente invención puede probarse en modelos animales o en seres humanos para determinar su eficacia terapéutica, su toxicidad, su inmunogenicidad, su farmacocinética y/o otras propiedades clínicas.

Los métodos para producir y caracterizar un anticuerpo de acuerdo con la invención son bien conocidos en la técnica. En una realización preferida, se producen y se criban variantes de anticuerpo en relación con propiedades predefinidas usando uno o más ensayos basados en células, que emplean células que expresan el formato de anticuerpo de la invención o ensayos in vivo. Tales ensayos implican a menudo monitorizar la respuesta de las células al anticuerpo, por ejemplo, supervivencia celular, muerte celular, cambio en la morfología celular o activación transcripcional, tal como expresión celular de un gen natural o gen informador.

Estos ensayos típicamente se basan en la función del formato del anticuerpo; es decir, la capacidad del formato de anticuerpo para unirse a los antígenos diana, p. ej. en la misma célula, y mediar algún evento bioquímico, por ejemplo la apoptosis o inhibición de dichas células, p. ej. en un ensayo de unión competitiva, la inhibición de la unión con células B o la reducción de la expresión de IgG en presencia o ausencia del anticuerpo de la invención.

Los métodos para controlar la muerte o la viabilidad celular son conocidos en la técnica e incluyen el uso de colorantes, reactivos inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos. Por ejemplo, los ensayos de tinción con caspasa pueden permitir que se mida la apoptosis, y la absorción o liberación de sustratos radioactivos o tintes fluorescentes tales como azul alamar puede permitir la monitorización del crecimiento o la activación celular.

La activación transcripcional puede servir también como método para analizar la función en ensayos basados en células. En este caso, la respuesta puede monitorizarse ensayando genes naturales o inmunoglobulinas que pueden regularse al alza, por ejemplo puede medirse la liberación de ciertas interleucinas, o alternativamente la lectura puede ser a través de una construcción reportera. Los ensayos basados en células pueden implicar también la medida de los cambios morfológicos de las células como respuesta a la presencia de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

La producción recombinante del formato de anticuerpo de la invención emplea preferiblemente un sistema de expresión, que incluye p. ej. construcciones de expresión o vectores que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el formato de anticuerpo.

El término "sistema de expresión" se refiere a moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia codificadora deseada y secuencias de control en enlace operativo, de modo que los hospedadores transformados o transfectados con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Para efectuar la transformación, el sistema de expresión se puede incluir en un vector; sin embargo, el ADN relevante puede también integrarse en el cromosoma del hospedador. Alternativamente, se puede usar un sistema de expresión para la transcripción/ traducción in vitro.

Las “construcciones de expresión” o “vectores” usados en el presente texto se definen como secuencias de ADN que se requieren para la transcripción de secuencias de nucleótidos recombinantes clonadas, es decir, de genes recombinantes y la traducción de su RNAm en un organismo hospedador adecuado. Los vectores de expresión comprenden la casete de expresión y adicionalmente suelen comprender un origen para la replicación autónoma en las células hospedadoras o un sitio de integración al genoma, uno o más marcadores seleccionables (p. ej. un gen de síntesis de aminoácido o un gen que confiere resistencia a antibióticos tales como zeocina, kanamicina, G418 o higromicina), varios sitios de segmentación de enzimas de restricción, una secuencia de promotor adecuada y un terminador de la transcripción, los cuales componentes están ligados operativamente. Los términos “plásmido” y “vector” como se usan en el presente texto incluyen secuencias de nucleótidos así como secuencias de nucleótidos integrantes del genoma.

Específicamente, el término se refiere a un vehículo por el cual una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo un gen extraño), p. ej. una secuencia de nucleótidos que codifica el formato de anticuerpo de la presente invención, se puede introducir en una célula hospedadora, para transformar el huésped y promover la expresión (p. ej. transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los plásmidos son los vectores preferidos de la invención.

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Los vectores comprenden típicamente el ADN de un agente transmisible, en el que se inserta ADN extraño. Una forma común de insertar un segmento de ADN en otro segmento de ADN implica el uso de enzimas llamadas enzimas de restricción que segmentan el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) llamados sitios de restricción. Un "casete" se refiere a una secuencia de codificación de ADN o segmento de ADN que codifica un producto de expresión que puede insertarse en un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción del casete están diseñados para asegurar la inserción del casete en el marco de lectura apropiado. Generalmente, el ADN extraño se inserta en uno o más sitios de restricción del ADN del vector, y luego es transportado por el vector a una célula huésped junto con el ADN del vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene ADN insertado o añadido, tal como un vector de expresión, también se puede llamar una "construcción de ADN". Un tipo común de vector es un "plásmido", que generalmente es una molécula autocontenida de ADN bicatenario que puede aceptar fácilmente ADN (extraño) adicional y que puede introducirse fácilmente en una célula hospedadora adecuada. Un vector de la invención contiene con frecuencia ADN codificador y secuencias de control de la expresión, p. ej. ADN promotor, y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para insertar ADN extraño. ADN codificador es una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos en particular para un polipéptido o proteína en particular, tal como un formato de anticuerpo de la invención. El ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula o media o controla de alguna otra forma la expresión del ADN codificador. El ADN promotor y el ADN codificador pueden ser del mismo gen o de genes diferentes, y pueden ser del mismo organismo o de organismos distintos. Los vectores de clonación recombinantes de la invención incluirán con frecuencia uno o más sistemas de replicación para clonación o expresión, uno o más marcadores para selección en el hospedador, p. ej. resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión.

Los procedimientos utilizados para ligar secuencias de ADN, p. ej. proporcionar o codificar los factores de la presente invención y/o el POI, un promotor, un terminador y más secuencias, respectivamente, e insertarlas en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la integración o replicación del hospedador, son bien conocidos por las personas expertas en la técnica, p. ej. como se describe en J. Sambrook y otros, "Molecular Cloning 2ª ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

La expresión "línea celular", como se usa en el presente texto, se refiere a un clon establecido de un tipo particular de célula que ha adquirido la capacidad de proliferar a lo largo de un período prolongado de tiempo. La expresión "línea celular hospedadora" se refiere a una línea de células que se usa para expresar un gen endógeno o recombinante para producir polipéptidos, tal como el formato de anticuerpo recombinante de la invención. Se entiende generalmente que una "línea de células hospedadoras de producción" o "línea de células de producción" es una línea celular lista para ser usada para el cultivo en un biorreactor con el fin de obtener el producto de un proceso de producción, el formato de anticuerpo recombinante de la invención.

Se conoce específicamente una célula hospedadora como una célula o línea de células recombinantes transfectada con una construcción de expresión, tal como un vector de acuerdo con la invención.

El término "recombinante" como se usa en el presente texto significará "que está preparado por ingeniería genética"

o "el resultado de ingeniería genética", p. ej. empleando específicamente secuencias heterólogas incorporadas en un vector recombinante o célula hospedadora recombinante.

Un formato de anticuerpo monoclonal biespecífico de la invención puede producirse usando cualquier sistema de expresión conocido y bien establecido, y tecnología de cultivo de células recombinantes, por ejemplo, mediante expresión en hospedadores bacterianos (sistemas procariotas) o sistemas eucariotas tales como levaduras, hongos, células de insectos o células de mamíferos. Una molécula de anticuerpo de la presente invención se puede producir en organismos transgénicos tales como una cabra, una planta o un ratón transgénico XENOMOUSE, una cepa de ratón modificada genéticamente que tiene grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humana y es deficitaria en la producción de anticuerpos de ratón. También puede producirse un anticuerpo por síntesis química.

De acuerdo con una realización específica, la célula hospedadora es una línea celular de producción de células seleccionadas en el grupo formado por CHO, PerC6, CAP, HEK, HeLa, NSO, SP2/0, hibridoma y Jurkat. Más específicamente, la célula hospedadora se obtiene a partir de células CHO-K1, CHO-DG44 o CHO-S.

Las células de ovario de hámster chino (CHO) se han usado con la mayor frecuencia para la producción de anticuerpos. Además de proporcionar patrones de glicosilación adecuados, estas células permiten la generación constante de líneas celulares clonales altamente productivas genéticamente estables. Se pueden cultivar a densidades elevadas en biorreactores simples utilizando medios libres de suero, y permiten el desarrollo de bioprocesos seguros y reproducibles.

La célula hospedadora de la invención se cultiva específicamente o se mantiene en un cultivo libre de suero que comprende p. ej. otros componentes, como proteínas plasmáticas, hormonas y factores de crecimiento, como una alternativa al suero.

Las células hospedadoras son las más preferidas, cuando se establecen, se adaptan y se cultivan completamente bajo condiciones libres de suero, y opcionalmente en medios que están libres de cualquier proteína/péptido de origen animal.

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