CN116472287A - 犬白介素-31受体α的犬源化抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了犬IL‑31受体α的犬源化大鼠抗体，其对犬IL‑31受体α具有高结合亲和力，并且能够阻断犬IL‑31与犬IL‑31受体α的结合。本发明还提供了所述抗体用于治疗犬的特应性皮炎的用途。

Description

犬白介素-31受体α的犬源化抗体

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年10月15日提交的美国临时专利申请序列号63/092,294，2020年10月15日提交的美国序列号63/092,296，2020年12月18日提交的美国序列号63/127,184，2021年8月20日提交的美国序列号63/235,258，2021年8月20日提交的美国序列号63/235,257，上述所有申请的全部内容通过全文引用并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式以电子方式提交，并通过引用将其全部并入本文。所述ASCII副本创建于2021年10月1目，名为25071-WO-PCT_SL.txt，大小为103,453字节。

技术领域

本发明涉及犬IL-31受体α的抗体，其对犬IL-31受体α具有高亲和力，并且能够阻断犬IL-31与犬IL-31受体α的结合。本发明还涉及本发明的抗体在治疗犬的特应性皮炎中的用途。

背景技术

免疫***包括由常驻和再循环的特化细胞组成的网络，这些细胞协同地作用以保护宿主免受传染性疾病和癌症的侵害。免疫***执行此功能的能力在很大程度上取决于白细胞分泌的统称为白介素的一组蛋白质的生物活性。在经过充分研究的白介素中，有四种重要的分子被鉴定为白介素-31(IL-31)、白介素-4(IL-4)、白介素-13(IL-13)，和白介素-22(IL-22)。尽管IL-4、IL-13、IL-22和IL-31是产生免疫反应的关键细胞因子，而免疫反应是抵御细胞外病原体(例如，组织或腔内寄生的寄生虫)所需的，但这些细胞因子也与人类和动物过敏性疾病(包括特应性皮炎)的发病机制有关。

特应性皮炎(AD)是一种复发性瘙痒和慢性炎性皮肤病，其特征是人体的免疫***失调和表皮屏障异常。特应性皮炎的病理和免疫学属性已成为广泛研究的主题[Rahman等，Inflammation&Allergy-drug target 10:486-496(2011)和Harskamp等，Seminar inCutaneous Medicine and Surgery 32:132-139(2013)中综述]。特应性皮炎也是伴侣动物(尤其是狗)的常见疾病，据估计其患病率约为犬科动物种群的10-15％。狗和猫中特应性皮炎的发病机制[Nuttall等，Veterinary Records 172(8):201-207(2013)中综述]与人类中特应性皮炎的发病机制显著相似，包括多种免疫细胞的皮肤浸润和包括IL-4、IL-13和IL-31的优势的CD4⁺Th2极化的细胞因子环境。此外，IL-22与导致表皮增生的过度上皮增殖有关，表皮增生是特应性皮炎的特征。

例如，针对犬IL-31的抗体已被证明对与犬的特应性皮炎相关的瘙痒具有显著效果[US 8,790,651 B2；US 10,093,731B2]。此外，针对人类IL-31受体α(IL-31RA)的抗体已经过测试，并发现对人类中的特应性皮炎相关的瘙痒具有效果[Ruzicka等，New EnglandJournal of Medicine,376(9),826–835(2017)]。

IL-4和IL-13是密切相关的蛋白质，可由许多细胞类型分泌，包括CD4⁺Th2细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、巨噬细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。IL-4和IL-13显示出很多重叠的功能，并且对T细胞依赖性体液免疫应答的发展至关重要。已知IL-4与两种受体即I型和II型IL-4受体以高亲和力结合。已经开发出针对人IL-4受体α(IL-4Rα)的单克隆抗体，并且已经广泛测试了其中这些抗体中的一些对治疗人类特应性皮炎的治疗效果[参见，例如，US2015/0017176A1]。最近，还公开了阻断犬IL-4与犬IL-4Rα结合的针对犬IL-4Rα的犬源化抗体[US2018/0346580A1，通过引用将其全部并入本文]。由于II型IL-4受体由IL-4受体α链和IL-13受体α1链组成，因此已经获得了针对犬IL-4Rα的抗体，该抗体可以阻断犬IL-4和犬IL-13与II型犬IL-4受体结合，从而用于帮助阻断与特应性皮炎相关的炎症[US2018/0346580A1]。

白介素-22(IL-22)，也称为IL-10相关T细胞衍生的诱导因子(IL-TIF)，属于IL-10细胞因子家族。IL-22是在人体中抗CD3刺激后由正常T细胞产生的。注射脂多糖后，各种器官中也会诱导小鼠IL-22表达，这表明IL-22可能参与炎性反应。IL-22特异性结合IL-10R2(也称为IL-10Rβ)和白介素22受体(IL-22R)的异二聚体复合物组成的受体复合物，并通过该受体复合物发出信号[参见，Lee等，Pharmacology Research&Perspectives，1-13页(2018:e00434)]。白介素22受体也称为白介素-22R，α1；IL-22RA1；IL-22R1；zcytor11；和CRF2-9[Xu等，Proc.Nat.Acad.Sci.98(17)9511-9516(2001)；Gelebart和Lai,Atlas ofGenetics and Cytogenetics 14(12):1106-1110(2010)]。IL-22在伤口愈合过程中诱导上皮细胞增殖，且其缺乏可导致不受控的增殖和增强肿瘤发展[Huber等，Nature 491:259-263(2012)]。IL-22在几种肝癌细胞系中已显示激活STAT-1和STAT-3并上调急性期蛋白的产生。白介素-22和IL-22R的抗体通过阻断IL-22与IL-22R的相互作用且因此阻断导致上皮增殖的相关信号传导途径来起到抗增殖剂的作用。

已被证明有助于治疗特应性皮炎和/或已显示有希望这样做的药物包括：Janus激酶(JAK)抑制剂[参见例如，U.S.8,133,899；U.S.8,987,283；WO 2018/108969]、脾脏酪氨酸激酶(SYK)抑制剂[参见例如，U.S.8,759,366]以及在TH2细胞上表达的趋化因子受体同源分子的拮抗剂[参见例如，U.S.7,696,222、U.S.8,546,422、U.S.8,637,541和U.S.8,546,422]。

然而，尽管最近在治疗特应性皮炎方面取得了一些成功，但仍有必要设计替代和/或更好的疗法，以解决犬特应性皮肤炎的一种或多种症状。

本文对任何参考文献的引用不应解释为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。

发明内容

本发明提供了针对犬IL-31受体α(IL-31RA)的新的哺乳动物抗体，包括犬源化抗体。在某些实施方式中，针对犬IL-31受体α(cIL-31RA)的哺乳动物抗体是分离的抗体。在优选实施方式中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段结合犬IL-31RA。在一些特定实施方式中，哺乳动物抗体或抗原结合片段还阻断犬IL-31RA与犬白介素-31的结合。在特定实施方式中，抗体是针对犬IL-31RA的大鼠抗体。在一些特定实施方式中，哺乳动物抗体是针对犬IL-31RA的犬源化大鼠抗体。

因此，本发明提供了结合犬IL-31RA的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其包含重链，其包含一组三个重链互补决定区(CDR)，重链CDR 1(HCDR1)、重链CDR 2(HCDR2)和重链CDR 3(HCDR3)，以及一组三个轻链CDR：轻链CDR 1(LCDR1)、轻链CDR 2(LCDR2)、和轻链CDR3(LCDR3)。

在某些实施方式中，哺乳动物抗体或抗原结合片段包含包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3；以及还包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR3。在特定实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体与由选自以下的氨基酸组成的表位结合：SEQ ID NO:102、或SEQ IDNO:103、或者SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103两者。在相关实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体结合SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103或者SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103两者的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基和/或更优选3至8个或更多个氨基酸残基。

在其他实施方式中，哺乳动物抗体或抗原结合片段包含包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR3；以及还包含包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR3。

在另外其他实施方式中，哺乳动物抗体或抗原结合片段包含包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HCDR3；以及还包含包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的LCDR2和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的LCDR3。在特定实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体与由SEQ ID NO:101的氨基酸序列组成的表位结合。在相关实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体结合SEQ ID NO:101的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基和/或更优选3至8个或更多个氨基酸残基。

在特定实施方式中，犬IL-31RA的哺乳动物抗体是大鼠抗体。在特定实施方式中，犬IL-31RA的哺乳动物抗体是犬源化大鼠抗体。在某些实施方式中，犬源化抗体包含重链，所述重链包含IgG-D cFc，但是天然存在的IgG-D铰链区被包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的铰链区替代。在其他实施方式中，犬源化抗体包含重链，所述重链包含IgG-D cFc，但是天然存在的IgG-D铰链区被包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的铰链区替代。在另外其他实施方式中，犬源化抗体包含重链，所述重链包含IgG-D cFc，但是天然存在的IgG-D铰链区被包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的铰链区替代。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含重链，所述重链包含IgG-D cFc，但是天然存在的IgG-D铰链区被包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的铰链区替代。

在某些实施方式中，犬源化抗体包含重链，所述重链包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的修饰的犬IgG-B(IgG-Bm))。在替代实施方式中，犬源化抗体包含重链，所述重链包含未修饰的犬IgG-B，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。

在组合物的某些实施方式中，针对犬IL-31RA(cIL-31RA)的犬源化抗体包含重链，其包含SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89的氨基酸序列，和轻链，其包含SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93的氨基酸序列。在特定实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体与由SEQ ID NO:101的氨基酸序列组成的表位结合。在相关实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体结合SEQ ID NO:101的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基和/或更优选3至8个或更多个氨基酸残基。本发明还提供了这些犬源化抗体的抗原结合片段。

在特定实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链。在其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ IDNO:91的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链。在另外其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链。在其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链。在另外其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链。在特定实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体结合SEQ ID NO:101的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基和/或更优选3至8个或更多个氨基酸残基。

在组合物的某些实施方式中，针对cIL-31RA的犬源化抗体包含重链，其包含SEQID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:100的氨基酸序列，和轻链，其包含SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99的氨基酸序列。在特定实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体与由以下氨基酸组成的表位结合：SEQ ID NO:102、或SEQ ID NO:103、或者SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103两者。在相关实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体结合SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103、或者SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103两者的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基和/或更优选3至8个或更多个氨基酸残基。

本发明还提供了这些犬源化抗体的抗原结合片段。

在其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ IDNO:97的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链。在另外其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链。在特定实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体与由以下氨基酸组成的表位结合：SEQ ID NO:102、或SEQ ID NO:103、或者SEQ IDNO:102和SEQ ID NO:103两者。在相关实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体结合SEQ IDNO:102或SEQ ID NO:103、或者SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103两者的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基和/或更优选3至8个或更多个氨基酸残基。

在另外其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQID NO:98的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链。在另外其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链。在特定实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体与由以下氨基酸组成的表位结合：SEQ ID NO:102、或SEQ ID NO:103、或者SEQID NO:102和SEQID NO:103两者。在相关实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体结合SEQID NO:102或SEQ ID NO:103、或者SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103两者的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基和/或更优选3至8个或更多个氨基酸残基。

在另外其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的重链。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQID NO:99的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链。在另外其他实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链。在又一个实施方式中，犬源化抗体包含包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链。在特定实施方式中，当与犬IL-31RA结合时，抗体结合SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103、或者SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103两者的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基和/或更优选3至8个或更多个氨基酸残基。

本发明还提供了所有这些犬源化抗体的抗原结合片段。

本发明还提供了分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段(包括犬源化抗体、犬抗体或其抗原结合片段)，其与犬白介素-31受体α(犬IL-31RA)结合，并且当与犬IL-31RA结合时，抗体与由选自以下的氨基酸序列组成的表位结合：SEQ ID NO:101、或SEQ ID NO:102、或SEQ ID NO:103、或SEQ ID NO:104、或SEQ ID NO:105或者其任何组合，其中抗体与犬IL-31RA结合并阻断犬IL-31RA与犬IL-31的结合。

在某些实施方式中，分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段(包括犬源化抗体、犬抗体或其抗原结合片段)特异性结合犬IL-31RA，并且当与犬IL-31RA结合时，抗体结合SEQID NO:101、或SEQ ID NO:102、或SEQ ID NO:103、或SEQ ID NO:104、或SEQ ID NO:105或者其任何组合的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基和/或更优选3至8个或更多个氨基酸残基。在特定实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合犬IL-31RA并阻断犬IL-31RA与犬IL-31RA的结合。

本发明还提供了核酸，包括分离的核酸，其编码CDR，犬源化抗体或其抗原结合片段的重链和/或犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链。

因此，本发明还提供了编码本发明的哺乳动物抗体或其抗原结合片段的一组三个重链互补决定区(CDR)，重链CDR 1(HCDR1)、重链CDR 2(HCDR2)和重链CDR 3(HCDR3)的核酸。在优选实施方式中，核酸编码本发明的犬源化抗体或其抗原结合片段的一组三个重链互补决定区(CDR)，重链CDR 1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR 3(HCDR3)。

在该类型的某些实施方式中，核酸编码包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR3。在该类型的另一个实施方式中，核酸编码包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQID NO:20的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的HCDR3。在该类型的又一个实施方式中，核酸编码包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HCDR2，和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HCDR3。

本发明还提供了编码本发明的哺乳动物抗体或其抗原结合片段的一组三个轻链互补决定区(CDR)，轻链CDR 1(HCDR1)、轻链CDR 2(HCDR2)和轻链CDR 3(HCDR3)的核酸。在该类型一个更特定的实施方式中，核酸编码包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR3。在该类型的另一个实施方式中，核酸编码包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR3。在该类型的又一个实施方式中，核酸编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的LCDR3。

本发明还提供了编码本发明的哺乳动物抗体或其抗原结合片段的重链的核酸。本发明还提供了编码本发明的哺乳动物抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸。此外，本发明提供了包含一个或多个本发明的核酸的表达载体，以及包含此类表达载体的宿主细胞。

本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的犬源化抗体及其抗原结合片段以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。本发明还提供了治疗特应性皮炎的方法，其包括向患有特应性皮炎的犬施用前述组合物之一。在特定实施方式中，本发明提供了帮助阻断与特应性皮炎相关的瘙痒的方法，其包括向由此需要的犬施用治疗有效量的本发明的药物组合物。

本发明的这些和其他方面将通过参考以下的附图说明和具体实施方式得到更好的理解。

附图说明

图1。测试犬IL-31RA的细胞外结构域(ECD)与犬IL-31结合的能力。结果表明，犬IL-31RA ECD以剂量依赖的方式与生物素化的犬IL-31结合。

图2A-2E。针对其对犬IL-31RA的反应性，测试所选择的大鼠mAb与犬IL-31RA的结合。结果表明，所选择的大鼠mAb以剂量依赖性方式与犬IL-31RA结合。所测试的全部14个大鼠单克隆抗体与犬IL-31RA均具有较强结合反应性。图2A：4G7(·)、20B822B4(▲)、27A10/>和大鼠IgG2a/κ(◆)对照。图2B：38B6(·)、48B1/>49D3(▲)和大鼠IgG2a/κ(◆)对照。图2C：10A12/>44E2/>和大鼠IgG2a/κ(◆)对照。图2D：47F3(·)、51G4/>和大鼠IgG2a/κ/>对照。图2E：7D7(·)、28F12/>53B3(▲)以及大鼠IgG2a/κ/>和大鼠IgG2b/κ(◆)对照。

图3。通过ELISA测试所选择的大鼠mAb阻断犬IL-31与犬IL-31RA结合的能力。结果表明一些选择的mAb能够以剂量依赖性方式阻断犬IL-31与犬IL-31RA的结合，而另一些则不能：图3显示了抗体：4G7(·)、28F12(▲)、44E248B1/>以及大鼠IgG2a/∈(Δ)和大鼠IgG2b/∈/>对照。

图4。对表达IL-31受体复合物的Ba/f3-OI细胞进行IL-31诱导的STAT-3磷酸化测试。结果表明，IL-31在Ba/f3-OI细胞中以剂量依赖性方式诱导STAT-3磷酸化，这意味着：(i)犬IL-31受体复合物在细胞表面成功表达；(ii)犬IL-31与IL-31受体的结合可以刺激内源性STAT3磷酸化；和(iii)然后启动其下游信号通路。将Ba/f3细胞(·)作为对照。

图5。在Ba/f3-OI细胞中抑制IL-31介导的STAT-3磷酸化。结果表明，抗体4G7(·)和44E2(▲)抑制IL-31介导的STAT-3磷酸化。将含有或不含cIL-31(+)的培养基作为对照。

图6A-6C显示了通过ELISA评价的含有λ(L)或∈(K)轻链的犬源化抗犬IL-31RA抗体的结合。

图6A描述了通过ELISA评价的含有λ(L)轻链的犬源化抗犬IL-31RA抗体(cAl2)的结合。嵌合的大鼠/犬源化：嵌合10A12[·]、犬源化10A12VH1VL5犬源化10A12VH1VL6犬源化10A12VH2VL5[▲]和犬源化10A12VH2VL6/>

图6B描述了通过ELISA评价的含有∈(K)轻链的犬源化抗犬IL-31RA抗体(28F12)的结合。嵌合的大鼠/犬源化：嵌合28F12[·]、犬源化28F12VH1VK3犬源化28F12VH1VK4[▲]、犬源化28F12VH2VK2/>犬源化28F12VH2VK3/>和犬源化28F12VH2VK4[Δ]。

图6C描述了通过ELISA评价的含有κ(K)轻链的犬源化抗犬IL-31RA抗体(44E2)的结合。嵌合的大鼠/犬源化：嵌合44E2[·]、犬源化44E2VH2VK1犬源化44E2VH2VK2[▲]、犬源化44E2VH5VK1/>犬源化44E2VH5VK2/>和犬源化44E2VH4VK1[Δ]。结果显示了犬源化抗犬IL-31RA抗体与犬IL-31RA结合。

图7A-7C是显示cIL-31RA抗体抑制cIL-31-介导的STAT-3磷酸化的图。针对抑制STAT-3磷酸化的能力对命名为犬源化10A12、犬源化c28F12和犬源化44E2的三种不同犬源化单克隆抗犬IL-31RA抗体进行评价。

图7A描述了cIL-31RA抗体(c10A12)抑制cIL-31介导的STAT-3磷酸化。嵌合的大鼠/犬源化：嵌合10A12[·]和犬源化10A12VH2VL6

图7B描述了cIL-31RA抗体(c28F12)抑制cIL-31介导的STAT-3磷酸化。嵌合的大鼠/犬源化：嵌合28F12[·]、犬源化28F12VH2K2和犬源化28F12VH2VK3[▲]。

图7C描述了cIL-31RA抗体(c44E2)抑制cIL-31介导的STAT-3磷酸化。嵌合的大鼠/犬源化：嵌合c44E2[·]、犬源化44E2VH2VK 1犬源化44E2VH2VK2[▲]和犬源化44E2VH5VK2/>数据显示，在IL-31存在的情况下，全部三种抗体都导致STAT-3磷酸化的剂量依赖性抑制。

图8A-8C显示了在犬IL-31RA上分别针对抗体10A12、28F12和44E2的表位。图8A分别描述了SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105的氨基酸序列。图8B描述了SEQ ID NO:101的氨基酸序列。图8C分别描述了SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103的氨基酸序列。

具体实施方式

作为对特应性皮炎更好疗法需要的回应，本发明提供可实现对与特应性皮炎相关的皮肤炎症的显著作用的制剂和方法。

缩略语

在整个本发明的具体实施方式和实施例中，将使用以下缩写：

ADCC抗体依赖性细胞毒性

CDC补体依赖性细胞毒性

CDR免疫球蛋白可变区中的互补决定区，使用Kabat编号***定义

EC50导致50％效力或结合的浓度

ELISA酶联免疫吸附测定

FR抗体框架区：不包括CDR区的免疫球蛋白可变区

IC50导致50％抑制的浓度

IgG免疫球蛋白G

Kabat由Elvin A.Kabat开创的免疫球蛋白比对和编号***[Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]

mAb单克隆抗体(也称为Mab或Mab)

V区不同抗体之间序列可变的IgG链的区段。

VH免疫球蛋白重链可变区

VL免疫球蛋白轻链可变区

VK免疫球蛋白κ轻链可变区

定义

为了更容易理解本发明，某些技术和科学术语具体定义如下。除非在本文其他地方特殊定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文所用，包括所附权利要求，诸如“一”、“一个”和“该”的词的单数形式包括它们对应的复数引用，除非上下文另有明确规定。

“施用”和“处理”，当它应用于动物(例如，犬科动物受试者、细胞、组织、器官或生物流体)时，是指外源性药物、治疗、诊断试剂或组合物与动物(例如，犬科动物受试者、细胞、组织、器官或生物流体)接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。

“施用”和“处理”还意指例如通过试剂、诊断、结合化合物或通过另一种细胞进行的体外和离体处理。术语“受试者”包括任何有机体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，犬科动物、猫科动物或人)并且最优选犬科动物。

“治疗”或“处理”是指将治疗剂(如含有本发明的任何抗体的组合物)内部或外部施用于例如具有一种或多种症状或被怀疑患有该药剂具有治疗活性的病症的犬科动物受试者或患者。通常，药剂以有效减轻和/或改善治疗的受试者或群体中的一种或多种疾病/病症症状的量施用，无论是通过任何临床可测量度诱导此类症状的消退或抑制此类症状的进展。有效缓解任何特定疾病/病症症状的治疗剂的量(也称为“治疗有效量”)可以根据诸如患者(例如，犬科动物)的疾病/病症状态、年龄和体重，以及药物组合物在受试者中引起期望反应的能力的因素而变化。可以通过兽医或其他熟练的医疗保健提供者通常使用的任何临床评估来评估疾病/病症症状是否已经减轻或改善，以评估该症状的严重性或进展状态。尽管本发明的实施方式(例如，治疗方法或制品)可能不能有效地减轻每个受试者的目标疾病/病症症状，但它应该减轻具有统计学显著数量的受试者的目标疾病/病症症状，如由本领域已知的任何统计检验确定的，如Student’s t检验、卡方检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验。

“治疗”在应用于人类、兽医(例如，犬科动物)或研究对象时，是指治疗性处理以及研究和诊断应用。“治疗”在应用于人类、兽医(例如，犬科动物)或研究对象，或细胞、组织或器官时，包括本发明的抗体与例如，犬科动物或其他动物受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。

如本文所用，除非另有说明，术语“犬科动物”包括所有家狗、牧羊犬(Canis lupusfamiliaris)或家犬(Canis familiaris)。

如本文所用，术语“猫科动物”是指猫科的任何成员。该科的成员包括野生、动物园和家养成员，包括家猫、纯种和/或杂种伴侣猫、展示猫、实验猫、克隆猫和野猫(wild cats)或流浪猫(feral cats)。

如本文所用，术语“犬框架”是指犬抗体的重链和轻链的除了本文定义为CDR残基的高变区残基以外的氨基酸序列。关于犬源化抗体，在大多数实施方式中，天然犬CDR的氨基酸序列被两条链中相应的外源CDR(例如，来自小鼠或大鼠抗体的那些)替换。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可以包含一些外源非CDR残基，例如，以保持犬抗体内外源CDR的构象，和/或改变Fc功能，如以下示例和/或在US10,106,607B2中公开，特此通过引用将其全部并入本文。

缩写为“Fc”的“片段可结晶区”对应于与称为Fc受体的细胞表面受体相互作用的抗体的CH3-CH2部分。Tang等首先描述了四种犬IgG中每一种的犬片段可结晶区(cFc)[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)；另见，Bergeron等，Vet.Immunol.Immunopathol.157:31-41(2014)和U.S.10,106,607B2]。

如本文所用，犬Fc(cFc)“IgG-Bm”是在IgG-B的SEQ ID NO：78的氨基酸序列中包含两(2)个氨基酸残基置换D31A和N63A(见下文)且没有c-末端赖氨酸(“K”)的犬IgG-B Fc。SEQ ID NO：77的位置31处的天冬氨酸残基(D)和SEQ ID NO：77的位置63的天冬酰胺残基(N)在IgG-Bm中被丙氨酸残基(A)置换。这两个氨基酸残基置换用于显著降低天然存在的犬IgG-B的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)[参见US 10,106,607B2，其内容通过引用整体并入本文]。还设想了对IgG-Bm的进一步氨基酸置换，这与可在IgG-B中进行的那些相似，并且可以包括有利于在双特异性抗体中形成异二聚体的氨基酸置换。

IgG-B的氨基酸序列，SEQ ID NO:77是：

下面提供了IgG-B的氨基酸序列SEQ ID NO:78。

如本文所用，例如在抗体的氨基酸序列中用另一个氨基酸残基“置换氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“替代氨基酸残基”并且表示氨基酸序列中特定位置的特定氨基酸残基已被不同的氨基酸残基替代(或置换)。可以特别设计此类置换，即通过例如重组DNA技术在氨基酸序列的特定位置处有目的地用丝氨酸替代丙氨酸。或者，抗体的特定氨基酸残基或氨基酸残基串可以通过更天然的选择过程用一个或多个氨基酸残基替代，例如基于细胞产生的抗体结合该抗原上给定区域(例如，含有表位或其部分的区域)的能力，和/或使抗体包含保留与它所取代的CDR相同的规范结构的特定CDR。此类置换/替代可导致“变体”CDR和/或变体抗体。

如本文所用，术语“抗体”是指表现出所需生物活性的任何形式的抗体。抗体可以是单体、二聚体或更大的多聚体。因此，它以最广泛的意义使用，且特别地涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、犬源化抗体、完全犬抗体、嵌合抗体和骆驼源化的单域抗体。“亲本抗体”是通过将免疫***暴露于抗原而获得的抗体，然后修饰抗体用于预期用途，例如将抗体犬源化以用作犬治疗性抗体。

如本文所用，如在标准结合测定(例如，ELISA或流式细胞术)中所确定的，“阻断”或“阻止”或“封闭”例如犬受体与其结合伴体(配体)的结合的本发明的抗体是(部分或完全)阻断犬受体与其犬配体的结合的抗体，反之亦然。

通常，当犬抗原结合活性以摩尔为基础表示时，本发明的抗体或抗原结合片段保留其活性的至少10％(当与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的犬抗原结合亲和力。还意在本发明的抗体或抗原结合片段可以包括不显著改变其生物学活性的保守或非保守氨基酸置换(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。

“分离的抗体”是指纯化状态，且在这种情况下是指分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或例如细胞碎片和生长培养基的其他物质。一般而言，术语“分离的”并非意指完全不存在此类物质或不存在水、缓冲剂或盐，除非它们以实质上干扰本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。

如本文所用，如果抗体与包含犬IL-31RA的氨基酸序列的一部分的多肽结合，但不与缺乏犬IL-31RA序列的该部分的其他犬蛋白结合，则抗体被称为特异性结合包含给定抗原序列的多肽(在这种情况下为犬IL-31RA的一部分氨基酸序列)。例如，特异性结合包含犬IL-31RA的多肽的抗体可以结合标记的犬IL-31RA形式，但不会结合其他/>标签的犬蛋白。当抗体或衍生自抗体的抗原结合位点的结合化合物对犬抗原或其变体或突变蛋白比其对任何其他测试的犬抗原的亲和力大至少10倍、更优选大至少20倍和甚至更优选大至少100倍时，该抗体或结合化合物“特异性”地结合其犬抗原或变体或突变体。

如本文所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一和第二抗体来自不同的物种。[US4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)]。通常，可变结构域从来自实验动物(如啮齿动物)的抗体(亲本抗体)获得，而恒定结构域序列从动物受试者抗体(例如，人或犬)获得，因此产生的嵌合抗体与亲本(例如，啮齿动物)抗体相比，分别在人类或犬科动物受试者中引起不良免疫反应的可能性较小。

如本文所用，术语“犬源化抗体”是指包含来自犬和非犬(例如，大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，犬源化抗体将包含基本上所有的至少一个或多个，通常两个可变结构域(其中所有或基本上所有高变环对应于非犬免疫球蛋白的那些(例如，包含如下例示的6个CDR))，并且所有或基本上所有框架(FR)区(并且通常所有或基本上所有剩余框架)是犬免疫球蛋白序列的那些。如本文所例示的，犬源化抗体包含来自鼠抗犬抗原抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR以及犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含一个或多个如本文所例示的氨基酸变化，其进一步优化犬源化抗体的有效性，例如增加其与其犬抗原的结合和/或其阻断该犬抗原与犬抗原的天然结合伴体结合的能力。

每个轻/重链对的可变区配对形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，这两个结合位点通常是相同的。通常，重链和轻链的可变结构域包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，其位于相对保守的框架区(FR)内。CDR通常通过框架区对齐，从而能够与特定表位结合。通常，从N端到C端，轻链和重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常，氨基酸对于每个结构域的分配是根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等；NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978)；Kabat等，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Chothia,等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)或Chothia等，Nature 342:878-883(1989)]的定义。

如本文所用，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变域中的LCDR1、LCDR2和LCDR3以及重链可变域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3)[参见Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)，按序列定义抗体的CDR区域；另见Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，通过结构定义抗体的CDR区域]。如本文所用，术语“框架”或“FR”残基是指除了本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

狗IgG有四种已知的IgG重链亚型，且称为IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。两种已知的轻链亚型称为λ和κ。在本发明的具体实施方式中，除了结合犬IL-31RA以外，本发明的针对其抗原的犬或犬源化抗体最佳地具有两种属性：

1.缺乏如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的效应物功能，和

2.使用工业标准技术如基于蛋白质A色谱的技术易于大规模纯化。

天然存在的犬IgG同种型都不满足这两个标准。例如，IgG-B可以使用蛋白A纯化，但具有高水平的ADCC活性。另一方面，IgG-A与蛋白A弱结合，但也显示出ADCC活性。此外，IgG-C和IgG-D都不能在蛋白A柱上纯化，尽管IgG-D没有显示ADCC活性。(IgG-C存在相当大的ADCC活性)。本发明解决这些问题的一种方式是通过提供对本发明抗原特异性的修饰的本发明的犬IgG-B抗体，其缺乏诸如ADCC的效应物功能并且可以使用工业标准蛋白A色谱法容易地纯化。

如本文所用，“止痒剂”是一种倾向于抑制、缓解和/或预防瘙痒的化合物、大分子和/或制剂。通常将止痒剂称为止痒药。

如本文所用，“止痒抗体”是可以在动物(包括哺乳动物，如人、犬和/或猫)中起止痒剂作用的抗体，特别是针对特应性皮炎方面。在特定实施方式中，止痒抗体与IL-31信号转导通路中的特定蛋白如IL-31或其受体IL-31RA结合。止痒抗体与其相应抗原(例如，IL-31或IL-31RA)的结合抑制例如IL-31与IL-31RA的结合，并干扰和/或阻止该途径的成功信号转导，从而抑制、缓解和/或防止由IL-31信号转导途径引起的瘙痒。

如本文所用，“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间在它们最佳比对时的序列相似性。当两个比较序列两者中的一个位置都被相同的碱基或氨基酸残基占据时，例如，如果两个DNA分子中每一个的一个位置被腺嘌呤占据，那么该分子在该位置是同源的。同源性百分比是两个序列共享的同源位置数除以比较的位置总数×100。例如，如果两个序列的10个位置中有6个在序列最佳比对时匹配或同源，则这两个序列是60％同源的。通常，当两个序列比对以获得最大百分比同源性时进行比较。序列同一性是指当两条序列最佳比对时，两条多肽的氨基酸在等同位置处相同的程度。如本文所用，当两个序列的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列100％“相同”。

因此，当两个氨基酸序列的50％的氨基酸残基相同时，氨基酸序列与第二氨基酸序列50％“相同”。序列比较是在给定蛋白(例如，被比较的蛋白或多肽的一部分)所包含的连续氨基酸残基段上进行的。在特定实施方式中，考虑到否则可能改变两个氨基酸序列之间的对应性的选定缺失或***。序列相似性包括相同的残基和不相同的、生化相关的氨基酸。生化相关氨基酸具有相似性质且可以是可互换使用的。

“保守修饰的变体”或“保守置换”是指用具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸取代蛋白质中的氨基酸，使得在不改变蛋白质的生物活性的情况下通常可以进行该改变。一般而言，本领域技术人员认识到，多肽非必需区中的单个氨基酸置换不会显著改变生物活性[参见，例如，Watson等，MolecularBiology of the Gene，The Benj amin/Cummings Pub.Co.，p.224(第4版；1987)]。此外，结构或功能相似的氨基酸的置换不太可能破坏生物活性。示例性的保守置换列于紧接下方的表A中。

表A

示例性的保守氨基酸置换

原始残基	保守置换
		Ala(A)	Gly；Ser
Arg(R)	Lys；His
		Asn(N)	Gln；His
Asp(D)	Glu；Asn
		Cys(C)	Ser；Ala
Gln(Q)	Asn
		Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
		His(H)	Asn；Gln
Ile(I)	Leu；Val
		Leu(L)	Ile；Val
Lys(K)	Arg；His
		Met(M)	Leu；Ile；Tyr
Phe(F)	Tyr；Met；Leu
		Pro(P)	Ala；Gly
Ser(S)	Thr
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	ryr；Phe
		Tyr(Y)	Trp；Phe
Val(V)	Ile；Leu

本发明还涵盖本发明抗体的功能保守变体。如本文所用，“功能保守变体”是指其中一个或多个氨基酸残基已被改变而不改变所需特性(如抗原亲和力和/或特异性)的抗体或片段。此类变体包括但不限于用具有相似特性的氨基酸替换氨基酸，如上表A的保守氨基酸置换。

“分离的核酸分子”是指基因组的DNA或RNA、mRNA、cDNA或合成来源，或其某些组合，其与自然界中发现分离的多核苷酸的全部或部分多核苷酸不相关，或与天然不与其连接的多核苷酸连接。出于本公开的目的，应当理解“包含(特定核苷酸序列)的核酸分子”不包括完整的染色体。“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子除了指定序列外，还可以包括多达十个或甚至多达二十个或更多个其他蛋白或其部分或片段的编码序列，或者可以包括可操作地连接的调控序列，其控制所述核酸序列的编码区的表达，和/或可以包括载体序列。

本发明提供本发明的分离的犬源化抗体，该抗体用于治疗病症，例如治疗犬的特应性皮炎的使用方法。在犬科动物中，有四个IgG重链，称为A、B、C和D。这些重链代表了犬IgG的四个不同亚类，称为IgG-A(或IgGA)、IgG-B(或IgGB)、IgG-C(或IgGC)和IgG-D(或IgGD)。两条重链中的每一条都由一个可变结构域(VH)和三个称为CH-1、CH-2和CH-3的恒定结构域组成。CH-1结构域通过称为“铰链”或可选地“铰链区”的氨基酸序列连接到CH-2结构域。

这4条重链的核酸和氨基酸序列首先由Tang等人鉴定[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)]。这些重链的氨基酸和核酸序列也可从GenBank数据库中获得。例如，IgGA重链的氨基酸序列的登录号为AAL35301.1，IgGB的登录号为AAL35302.1，IgGC的登录号为AAL35303.1，和IgGD的登录号为(AAL35304.1)。犬抗体还包含两种类型的轻链，κ和λ。这些轻链的DNA和氨基酸序列可以从GenBank数据库中获得。例如，κ轻链氨基酸序列的登录号为ABY 57289.1，和λ轻链的登录号为ABY 55569.1。

在本发明中，四种犬IgG Fc片段中每一种的氨基酸序列是基于由Tang等，同上确定的CH1和CH2结构域的确定边界。结合犬IL-31RA的犬源化大鼠抗犬抗体包括但不限于：本发明的抗体，其包含犬IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D重链和/或犬κ或λ轻链以及大鼠抗犬IL-31RA CDR。因此，本发明提供了本发明的犬源化大鼠抗犬抗体，包括分离的犬源化大鼠抗犬抗体，其与犬IL-31RA结合，并且优选地还阻断犬IL-31RA与犬IL-31的结合。

因此，本发明进一步提供了犬源化大鼠抗体和使用本发明的抗体治疗病况的方法，例如，治疗犬的特应性皮炎。

本发明进一步提供了全长犬重链，其可以与相应的轻链匹配以制备犬源化抗体。因此，本发明进一步提供本发明的犬源化大鼠抗犬抗原抗体(包括分离的犬源化大鼠抗犬抗体)，以及本发明的抗体在治疗病症中的使用方法，例如治疗犬的特应性皮炎。

本发明还提供本发明的抗体，其包含犬片段可结晶区域(cFc区)，其中cFc被遗传修饰以增强、减少或消除一种或多种效应子功能。在本发明的一个方面，遗传修饰的cFc降低或消除了一种或多种效应物功能。在本发明的另一个方面，遗传修饰的cFc增强了一种或多种效应子功能。在某些实施方式中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGB Fc区。在另一个这样的实施方式中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGC Fc区。在一个具体实施方式中，效应子功能是增强、降低或消除的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在另一个实施方式中，效应子功能是增强、降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在又一个实施方式中，cFc区被遗传修饰以增加、减少或消除ADCC和CDC两者。

为了产生缺乏效应物功能的犬IgG的变体，产生了许多突变的犬IgGB重链。这些变体可以在重链氨基酸序列的Fc部分中包括以下单个或组合的置换中的一个或多个：P4A、D31A、N63A、G64P、T65A、A93G和P95A。将变体重链(即，包含此类氨基酸置换)克隆到表达质粒中，并与包含编码轻链的基因的质粒一起转染到HEK293细胞中。评估从HEK 293细胞表达和纯化的完整抗体与Fc_γRI和C1q的结合，以评估它们介导免疫效应物功能的潜力。[参见US10,106,607 B2，其内容通过引用整体并入本文。]

本发明还提供修饰的犬IgG-D，其代替其天然IgG-D铰链区，它们包含来自以下的铰链区：

IgG-A:FNECRCTDTPPCPVPEP SEQ ID NO:79

IgG-B:PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEM SEQ ID NO:80；或

IgG-C:AKECECKCNCNNCPCPGCGL SEQ ID NO:81。

或者，IgG-D铰链区可以通过用脯氨酸残基替换丝氨酸残基来遗传修饰，即PKESTCKCIPPCPVPES，SEQ ID NO:82(替代天然存在的丝氨酸残基的脯氨酸残基(P)加下划线并为粗体)。此类修饰可导致缺乏fab臂交换的犬IgG-D。可以使用重组DNA技术的标准方法构建修饰的犬IgG-D[例如，Maniatis等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1982)]。为了构建这些变体，可以修饰编码犬IgG-D的氨基酸序列的核酸，以便其编码修饰的IgG-D。然后将修饰的核酸序列克隆到表达质粒中用于蛋白质表达。

如本文所述的犬源化大鼠抗犬抗体的六个互补决定区(CDR)可包含犬抗体κ(k)或λ(l)轻链和犬抗体重链IgG，所述犬抗体κ或λ轻链包含大鼠轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述犬抗体重链IgG包含大鼠重链HCDR1、HCDR2和HCDR3。

核酸

本发明还包括编码本发明的抗体的核酸(参见例如以下实施例)。

本发明还包括编码免疫球蛋白多肽的核酸，当通过BLAST算法进行比较时，所述免疫球蛋白多肽包含与本文提供的犬源化抗体的氨基酸序列至少约70％相同、优选至少约80％相同、更优选至少约90％相同和最优选至少约95％相同(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，除了未变化的CDR，其中选择算法的参数以给出相应序列在相应参考序列的整个长度上的最大匹配。本发明进一步提供了编码免疫球蛋白多肽的核酸，当使用BLAST算法进行比较时，所述免疫球蛋白多肽包含与任何参考氨基酸序列至少约70％相似、优选至少约80％相似、更优选至少约90％相似和最优选至少约95％相似(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，其中选择算法的参数以给出相应序列在相应参考序列的整个长度上的最大匹配，也包括在本发明中。

如本文所用，核苷酸和氨基酸序列同一性百分比可使用C,MacVector(MacVector,Inc.Cary,NC 27519)、Vector NTI(Informax,Inc.MD)、Oxford Molecular Group PLC(1996)和具有比对默认参数和用于同一性的默认参数的Clustal W算法确定。这些商业上可用的程序也可用于使用相同或类似的默认参数来确定序列相似性。或者，可以使用默认过滤条件下的高级Blast搜索，例如，使用默认参数的GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)堆积程序(pileup program)。

以下参考文献与常用于序列分析的BLAST算法有关：BLAST ALGORITHMS：Altschul,S.F.等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish,W.等，Nature Genet.3:266-272(1993)；Madden,T.L.等，Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul,S.F.等，NucleicAcids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang,J.等，Genome Res.7:649-656(1997)；Wootton,J.C.等，Comput.Chem.17:149-163(1993)；Hancock,J.M.等，Comput.Appl.Biosci.10:67-70(1994)；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS：Dayhoff,M.O.等，"A model of evolutionarychange in proteins."Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(编著)，pp.345-352,(1978)；Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等，"Matrices for detecting distant relationships."Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,suppl.3."(1978),M.O.Dayhoff(编著)，pp.353-358(1978),Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,J.Mol.Biol.219:555-565(1991)；States,D.J.等，Methods 3:66-70(1991)；Henikoff,S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992)；Altschul,S.F.等，J.Mol.Evol.36:290-300(1993)；ALIGNMENT STATISTICS：Karlin,S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)；Karlin,S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(1993)；Dembo,A.等，Ann.Prob.22:2022-2039(1994)；和Altschul,S.F."Evaluating the statisticalsignificance of multiple distinct local alignments."Theoretical andComputational Methods in Genome Research(S.Suhai编著，),pp.1-14,Plenum,NewYork(1997)。

抗体蚕自工程化

作为实例而非限制，犬重链恒定区可以来自IgG-B或修饰的cFc，如本文使用的IgG-Bm[参见，U.S.10,106,607B2，其全部内容通过引用并入本文]和犬轻链恒定区可以来自κ或λ。

可以将抗体工程化为包含对亲本(即，大鼠)单克隆抗体可变结构域内的犬骨架和/或犬骨架残留物的修饰，例如，以改善抗体的性质。

犬源化抗犬IL-31受体α单克隆抗体的构建可以通过确定编码犬IgG重链和轻链的DNA序列来进行。犬重链和轻链的DNA和蛋白序列是本领域公知的，并且可以通过检索NCBI基因和蛋白数据库来获得。如上所述，对于犬抗体，有四种已知的IgG亚型：IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D，以及两种类型的轻链，即κ和λ。犬源化大鼠抗犬IL-31抗体可以通过本领域公知的方法重组产生。可用作表达本文公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的很多永生化细胞系。尤其，这些细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优先的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或其片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够长的时间以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，允许抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中来产生抗体。

可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。此外，可以使用许多已知技术增强从生产细胞系表达本发明的抗体(或其中的其他部分)。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达***(GS***)是在某些条件下增强表达的常用方法。结合欧洲专利号0216846、0256055和0323997以及欧洲专利申请号89303964.4对GS***进行了整体或部分讨论。

在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如，犬恒定区，如IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D犬重链恒定区或其变体。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如，犬轻链恒定区域，如λ或κ犬轻链区或其变体。作为实例而非限制，犬重链恒定区可以来自IgG-B和犬轻链恒定区可以来自κ。

表位作图

抗体与其同源蛋白抗原的相互作用是通过抗体的特异性氨基酸(副表位)与靶抗原的特定氨基酸(表位)的结合介导的。表位是一种抗原决定簇，通过免疫球蛋白引起特异性反应。表位由抗原表面的一组氨基酸组成。目标蛋白可以包含被不同抗体识别的若干表位。抗体识别的表位分为线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中氨基酸的连续序列的延伸形成，而构象表位由初级氨基酸序列中不连续(例如，相距很远)的氨基酸组成，但在三维蛋白质折叠时结合在一起。

表位作图是指识别抗体在其靶抗原上识别的氨基酸序列(即，表位)的过程。由单克隆抗体(mAb)识别的靶抗原上的表位鉴定具有重要的应用。例如，其可以帮助开发新的治疗方法、诊断方法和疫苗。表位作图也有助于选择优化的治疗性mAb，并有助于阐明其作用机制。IL-31受体α的表位信息也可以阐明独特的表位，并确定疫苗的保护或致病作用。表位鉴定也可以导致基于所鉴定的肽表位与载体蛋白或其他免疫刺激剂的化学或遗传偶联的亚单位疫苗的开发。

表位作图可以使用多克隆或单克隆抗体进行，并且根据表位的可疑性质(即，线性与构象)采用几种方法进行表位鉴定。对线性表位作图更简单，相对来说更容易执行。为此，用于线性表位作图的商业服务通常使用肽扫描。在这种情况下，靶蛋白的一组重叠的短肽序列被化学合成，并测试其结合目标抗体的能力。该策略快速、高通量，并且执行起来相对便宜。另一方面，对不连续表位作图在技术上更具挑战性，并且需要更专业的技术，如单克隆抗体及其靶蛋白的x射线共晶体学、氘氢(H/D)交换、与酶促消化相结合的质谱以及本领域技术人员公知的几种其他方法。

表位结合和交叉阻断抗体

本发明的抗犬类IL-31RA抗体或其抗原结合片段包括与犬IL-31RA中与本文公开的抗体之一结合的表位相同的抗体或其抗体结合片段，例如，与结合包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的表位的28F12抗体结合，包括犬源化抗体，以及交叉阻断(部分或全部)或被本文讨论的用于犬IL-31RA结合的抗体或片段交叉阻断(局部或全部)的任何抗体或抗原结合片段；以及其任何变体。

交叉阻断抗体和抗原结合片段可以基于其在标准结合测定中与例如28F12抗体交叉竞争的能力来鉴定(例如，ELISA，如下所示，或流式细胞术)。例如，可以使用标准ELISA测定，其中将重组犬IL-31RA蛋白固化在培养板上，对其中一种抗体进行荧光标记，并评价未标记抗体竞争标记抗体结合的能力。另外或替代地，/>分析可用于评估抗体交叉竞争的能力。测试抗体抑制28F12抗体与犬IL-31RA结合的能力表明，测试抗体可以与28F12抗体竞争与犬IL-31-RA的结合，因此，在一些情况下，可以与28F10抗体结合到犬IL-31RA上相同的表位。与本发明的任何抗犬IL-31RA抗体或片段结合的表位相同的抗体及其片段也形成本发明的一部分。

药物组合物和施用

为了制备包含本发明的抗体的药物或无菌组合物，可以将这些抗体与药学上可接受的载体或赋形剂混合[参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences andU.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)]。

治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉末、浆液、水溶液或混悬液的形式混合来制备[参见，例如，Hardman等，(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等(编著)，(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(编著)，(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(编著)，(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY]。在一个实施方式中，将本发明的抗体在pH 5-6的乙酸钠溶液中稀释至适当浓度，并添加NaCl或蔗糖以获得张力。可以添加额外的试剂，如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，以增强稳定性。

单独或与另一种药剂联合施用，抗体组合物的毒性和治疗有效性可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序确定，例如，用于确定LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数(LD₅₀/ED₅₀)。在特定方面，表现出高治疗指数的抗体是需要的。从这些细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制定用于犬科动物的剂量范围。此类化合物的剂量优选地位于包括几乎没有毒性或没有毒性的ED₅₀在内的循环浓度的范围内。剂量可以在这个范围内变化，取决于所使用的剂型和施用途径。

施用方式可以变化。合适的施用途径包括口服、直肠、经粘膜、肠、肠胃外；肌肉内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。在具体的实施方式中，本发明的抗体可以通过侵入性途径例如通过注射施用。在本发明的进一步实施方式中，本发明的抗体或其药物组合物静脉内、皮下、肌内、动脉内或通过吸入、气溶胶递送施用。通过非侵入性途径(例如，口服；例如，在丸剂、胶囊或片剂中)施用也在本发明的范围内。

组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，本发明的药物组合物可以通过用皮下注射针(包括例如预填充注射器或自动注射器)注射来施用。本文公开的药物组合物也可以用无针皮下注射装置施用；例如美国专利号：6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。

本文公开的药物组合物也可以通过输注施用。众所周知的施用药物组合物的植入物和模块的示例包括：美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控的速度分配药物的可植入的微型输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的输液速度递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的可变流量植入式输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送***。许多其他这样的植入物、递送***和模块对于本领域技术人员来说是众所周知的。

或者，可以局部而非全身方式施用本发明的抗体，通常以储库或持续释放制剂的形式。

施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体的血清或组织周转率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性以及靶细胞在生物基质中的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体以改善目标疾病/病症状态，同时最小化不良副作用。因此，递送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体以及所治疗病症的严重性。提供选择治疗性抗体适当剂量的指导[参见，例如，Wawrzynczak Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996)；Kresina(编著)，Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,NY(1991)；Bach(编著)，Monoclonal Antibodiesand Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY(1993)；Baert编著，New Engl.J.Med.348:601-608(2003)；Milgrom等，New Engl.J.Med.341:1966-1973(1999)；Slamon等，New Engl.J.Med.344:783-792(2001)；Beniaminovitz等，NewEngl.J.Med.342:613-619(2000)；Ghosh等，New Engl.J.Med.348:24-32(2003)；Lipsky等，New Engl.J.Med.343:1594-1602(2000)]。

确定合适的剂量由兽医进行，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，剂量从比最佳剂量稍低的量开始，然后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用实现所需或最佳效果。重要的诊断指标包括那些症状的指标。

本文提供的抗体可以通过连续输注或通过，例如，每天、每周1-7次、每周、每两周、每月、双月、每季度、每半年、每年等施用的剂量来提供。可以通过例如，静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、直肠、肌肉内、脑内、脊柱内或通过吸入提供剂量。总每周剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多[参见，例如，Yang等，NewEngl.J.Med.349:427-434(2003)；Herold等，New Engl.J.Med.346:1692-1698(2002)；Liu等，J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456(1999)；Portielji等，CancerImmunol.Immunother.52:133-144(2003)]。还可以提供剂量以在犬的血清中实现本发明的抗体的预定目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更多。在其他实施方式中，本发明的抗体以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者每周、每两周、“每4周”、每月、每两个月或每季度皮下或静脉内施用。

如本文所用，“抑制”或“治疗”或“处理”包括延迟与病症相关的症状的发生和/或降低此类病症的症状的严重性。该术语还包括改善现有的不受控制的或不需要的症状、预防额外的症状以及改善或预防这些症状的基础原因。这些术语还包括改善现有的不受控制的或不需要的症状、预防额外的症状以及改善或预防这些症状的基础原因。因此，这些术语表示对患有疾病、病状和/或症状或具有发生此类疾病、疾病或症状的可能的脊椎动物受试者(例如，犬科动物)产生了有益的结果。

如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指当单独或与另外的治疗剂组合施用细胞、组织或受试者(例如犬科动物)时有效地引起疾病或病症的一种或多种症状或此类疾病或病症的进展的可测量的改善的本发明的抗体的量。治疗有效剂量进一步指足以导致至少部分症状改善，例如治疗、治愈、预防或改善相关医疗状况，或增加此类病症的治疗、治愈、预防或改善率的抗体的量。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是联合、连续还是同时施用。有效量的治疗剂将产生诊断量度或参数的改善至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。在使用主观指标来评估病情严重程度的情况下，有效量也可以产生主观指标的改善。

实施例

实施例1

IL-31受体α

核苷酸序列

SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码与HIS标签融合的犬IL-31受体α(cIL-31RA)的胞外域。犬IL-31RA ECD HIS-标记蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。通过化学合成制备核苷酸序列，然后将其克隆到适合于在真核细胞(HEK-293或CHO细胞)中生产相应蛋白的表达质粒中。

犬IL-31RA ECD-10His：[SEQ ID NO:1]

实施例2

IL-31受体αECD的表达和纯化

根据生产厂商的建议，通过MaxCyte仪器使用电穿孔将包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的质粒转染到HEK-293或CHO细胞中。转染后几天，收获转染细胞和未转染对照的上清液，并向离心以去除细胞碎片。根据生产厂商的建议，通过将来自转染细胞的澄清的收获液通过镍柱，从细胞培养液中纯化具有HIS标签的IL-31RA。通过测量纯化的蛋白在280nm的紫外光下的吸光度来定量纯化的蛋白。

犬IL-31RA ECD-10His：[SEQ ID NO:2]

实施例3

犬IL-3lRA与生物素化犬IL-31的结合

方案

1.在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中稀释至1μg/mL的IL-31RA蛋白包被免疫板。添加100μL/孔。在2-7°下将板孵育过夜。

2.使用275μL/孔的含吐温20的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBST)洗板3次。

3.在36±2℃下使用200μL/孔的封闭缓冲液[含1％脱脂奶粉(NFDM)的PBST]封闭板30-45分钟，轻柔振荡(120±20RPM)。

4.使用275μL/孔的PBST洗板3次。

5.在稀释板上，在含1％NFDM的PBST中3倍稀释生物素化的IL-31(10μg/mL)，并以100μL/孔转移至免疫板上。在36±2℃下孵育30-45分钟，轻柔振荡(120±20RPM)。

6.使用275μL/孔的PBST洗板3次。

7.在含1％NFDM的PBST中将辣根过氧化物酶-链霉亲和素(HRP-链霉亲和素)稀释至1：1000的最终稀释液。

8.向免疫板中添加100μL/孔的HRP-链酶亲和素，并在36±2℃下孵育30-45分钟，轻柔振荡(120±20RPM)。

9.使用275μL/孔的PBST洗板3次。

10.在使用前立即混合等体积预热的TMP 2-组分底物。

11.向免疫板重添加100μL/孔的已制备的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMP)底物，并在36±2℃下避光孵育10至15分钟，轻柔振荡(120±20RPM)。

12.通过添加100μL/孔的1M H₃PO₄终止反应。

13.使用微量酶标仪在波长为450nm、参考波长为540nm的条件下读板。

实施例4

针对犬IL-31受体α的单克隆抗休

在3至4周的时间内，通过用犬IL-31RA ECD多次免疫接种两只Lewis大鼠(每次使用10μg或25μg抗原/只大鼠)，产生抗犬IL-31RA的单克隆抗体(mAb)。免疫接种后，从每只大鼠收集血清，并通过ELISA检测犬IL-31RA。将具有最高IL-31RA ECD反应性的大鼠的***细胞与骨髓瘤SP2/0细胞系融合以产生杂交瘤。融合后约10天，使用下述方案，通过ELISA在IL-31RA ECD蛋白包被板上筛选来自生长中的杂交瘤的上清液。在该ELISA中，选择了大约260个显示出与IL-31RA潜在结合的克隆，如下图2A-2E所示，将大鼠IgG2a/κ用作阴性对照。大部分克隆的OD450>1。

ELISA的程序：

1.用IL-31RA(在PBS缓冲液中1μg/mL)包被96孔板的一半面积，25μL/孔。

2.在4℃下将板孵育过夜。

3.用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗板3次。

4.用封闭缓冲液(含5％胎牛血清(FBS)的PBS)封闭板，25ul/孔在室温下30分钟。

5.将25ul/孔的杂交瘤上清液转移至96孔板，在室温下孵育60分钟。

6.用PBST洗板3次。

7.以25ul/孔向板中加入抗大鼠-HRP(在封闭缓冲液中1:4000稀释)，并在室温下孵育60分钟。

8.用PBST洗板5次。

9.向板中添加基于TMB的试剂，进行2-3分钟显色反应。

10.使用0.16M硫酸终止反应。

11.使用酶标仪读板。

选择了14个针对犬IL-31RA产生的结合IL-31的大鼠抗体。大鼠抗体的重链和轻链可变区如下所示。在下面的实施例5中进一步测试了这些抗体阻断犬IL-31RA与犬IL-31结合的能力。

49D3VH[SEQ ID NO:49]

49D3VL[SEQ ID NO:50]

/>

10A12VH[SEQ ID NO:51]

10A12VL[SEQ ID NO:52]

47F3VH[SEQ ID NO:53]

47F3VL[SEQ ID NO:54]

51G4VH[SEQ ID NO:55]

51G4VL[SEQ ID NO:56]

53B3VH[SEQ ID NO:57]

53B3VL[SEQ ID NO:58]

27A10VH[SEQ ID NO:59]

27A10VL[SEQ ID NO:60]

44E2VH[SEQ ID NO:61]

44E2VK[SEQ ID NO:62]

4G7VH[SEQ ID NO:63]

4G7VK[SEQ ID NO:64]

28F12VH[SEQ ID NO:65]

/>

28F12VK[SEQ ID NO:66]

38A6VH[SEQ ID NO:67]

38A6VK[SEQ ID NO:68]

20B8VH[SEQ ID NO:69]

20B8VK[SEQ ID NO:70]

7D7VH[SEQ ID NO:71]

7D7VK[SEQ ID NO:72]

22B4VH[SEQ ID NO:73]

22B4VK[SEQ ID NO:74]

48B1VH[SEQ ID NO:75]

48B1VK[SEQ ID NO:76]

实施例5

抗IL-31受体α抗体的阻断活性

在下述阻断ELISA中评价抗犬IL-31RA杂交瘤上清液阻断IL-31与IL-31RA结合的能力。

方案

1.用IL-31RA(在PBS缓冲液中1μg/mL)包被96孔板的一半面积，25μL/孔。

2.在4℃下将板孵育过夜。

3.用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗板3次。

4.用封闭缓冲液(含5％FBS的PBS)封闭板，25ul/孔在室温下30分钟。

5.将25ul/孔的杂交瘤上清液转移至96孔板，在室温下孵育60分钟。

6.用PBST洗板3次。

7.以25ul/孔转移生物素化IL31(在封闭缓冲液中0.5μg/mL)，在室温下孵育60分钟。

8.用PBST洗板3次。

9.以25ul/孔向板中加入链霉亲和素-HRP(在封闭缓冲液中1:5000稀释)，并在室温下孵育60分钟。

10.用PBST洗板5次。

11.向板中添加基于TMB的试剂，进行2-3分钟显色反应。

12.使用0.16M硫酸终止反应。

13.使用酶标仪读板。

结果：

在显示与IL-31RA结合的大约260个克隆中，只有20至25个克隆也显示出犬IL-31与犬IL-31RA的结合的潜在阻断。其中，鉴定了一组特定的三种大鼠抗犬IL-31RA抗体(44E2、4G7和28F12)，其既结合IL-31RA又阻断IL-31与IL-31RA的结合。参见，图3，其中将大鼠IgG2a和IgG2b作为阴性对照。这三种抗体似乎在其各自CDR的氨基酸序列中显示出一些适度的同源性。在下表3中也提供了这些氨基酸序列。

第二组六种大鼠抗犬IL-31RA抗体被鉴定为包含具有显著氨基酸序列相似性的CDR组，所述抗体既结合犬IL-31RA又阻断犬IL-31与犬IL-31RA的结合。在下表3中也提供了这些氨基酸序列。

实施例6

犬源化抗体

产生犬源化重链和轻链的整个过程可以以不同的组合混合，以产生犬源化抗犬IL-31受体αmAb，包括以下方案：

i)鉴定包含所需抗IL-31受体αmAb的CDR的VH和VL结构域的DNA序列。

ii)鉴定所需抗IL-31RA mAb的H和L链CDR。

iii)鉴定犬IgG的H和L链的适宜序列。

iv)鉴定编码上述序列的内源性犬IgG H和L链的CDR的DNA序列。

v)使用编码所需抗IL-31RA CDR的DNA序列替代编码内源性犬H和L链CDR的DNA序列。此外，使用从所需抗IL-31受体αmAb框架区选定的残基任选地替代一些犬框架残基。

vi)从步骤(v)合成DNA，将其克隆到合适的表达质粒中，并将含有所需犬源化H和L链的质粒转染到HEK 293细胞中。

vii)从HEK 293上清液重纯化表达的犬源化抗体。

viii)测试纯化的犬源化抗体与犬IL-31受体α链的结合。

上述步骤的应用可以产生下面提供的一组犬源化的H和L链序列。相应SEQ ID NO列于下表5中。

图6A-6C显示了通过ELISA评价的包含λ(L)或κ(K)轻链的犬源化抗犬IL-31RA抗体的结合。结果表明，犬源化抗犬IL-31RA抗体与犬IL-31RA结合。

图7A-7C是显示使用以下实施例6中所述的测定法通过cIL-31RA抗体抑制cIL-31介导的STAT-3磷酸化的图。评估了三种不同的犬源化单克隆抗犬IL-31RA抗体c10A12、c28F12和c44E2抑制STAT-3磷酸化的能力。数据显示，在IL-31存在的情况下，所有三种抗体都导致STAT-3磷酸化的剂量依赖性抑制。

犬IL-31受体α的犬源化抗体(cIL-31RA)

C10A12VL5-CCL[SEQ ID NO:83]

C10A12VH1-CIgGBm[SEQ ID NO:84]

c10A12VH2-cIgGBm[SEQ ID NO:85]

c10A12VL4-cCL[SEQ ID NO:86]

c10A12VL6-cCL[SEQ ID NO:87]

c28F12VH1-cIgGBm[SEQ ID NO:88]

c28F12VH2-cIgGBm[SEQ ID NO:89]

c28F12VK1-cCK[SEQ ID NO:90]

c28F12VK2-cCK[SEQ ID NO:91]

c28F12VK3-cCK[SEQ ID NO:92]

c28F12VK4-cCK[SEQ ID NO:93]

c44E2VH1-cIgGBm[SEQ ID NO:94]

c44E2VH4-cIgGBm[SEQ ID NO:95]

c44E2VH5-cIgGBm[SEQ ID NO:96]

c44E2VK1-cCK[SEQ ID NO:97]

c44E2VK2-cCK[SEQ ID NO:98]

c44E2VK4-cCK[SEQ ID NO:99]

c44E2VH2-cIgGBm[SEQ ID NO:100]

实施例7

STAT-3测定

已知Stat-3在包含IL-31异二聚体受体的细胞中被IL-31激活。为了开发一种评估犬IL-31对STAT-3的激活的方法，通过化学合成分别制备编码IL-31RA和OSMR的核苷酸序列，然后将其克隆到表达载体pcDNA3.1中。将分别含有IL-31RA和OSMR核苷酸序列的载体共转染到Ba/f3细胞中，并将转染的细胞(表示为“Ba/f3-OI”)在抗生素选择下作为混合物生长。如下测试犬IL-31诱导STAT-3活化的能力。

材料：

细胞系：Ba/f3-OI稳定混合细胞

含有小鼠IL-3或含有犬IL-31(cIL-31)的生长培养基

RPMI 1640 435ml(ThermoFisher,12633-020)

FBS 50mL(SAFC目录号12003c-500mL)

2-巯基乙醇(50mM)0.5mL(Gibco 31350-010)

100X Pen Strep 5mL(Gibco 15140-122批号1734040)

200mM L-Glu 10ml(Gibco 25030-081批号1677185)

500ng/mL Geneticin G418(来自Gibco或Sigma)

5ng/mL mIL-3或100ng/mL cIL-31

饥饿培养基：不含mIL-3和cIL-31的生长培养基

p-STAT3(Tyr705)测定试剂盒：PerkinElmer，ALSU-PST3-A-HV

程序

细胞培养

1.解冻一小瓶Ba/f3-OI细胞，并且使细胞在37℃CO₂下，在125rpm的摇床上，在含有mIL-3的培养基中生长。

2.在设置基于细胞的测定之前，将细胞传代2-3次，使细胞具有≥90％的活力。

3.为建立测定，收集细胞并将其重悬于饥饿培养基中至1x10⁷个活细胞/mL。

4.将细胞分配到96孔板，50μL/孔(约5x10⁵个细胞/孔)。

5.在细胞板中的饥饿培养基中三倍稀释cIL-31，然后将50μL连续稀释的cIL-31等分试样转移到细胞培养板中。

6.在37℃CO₂摇床中孵育细胞培养板15-30min，125rpm，持续1-2hr。

根据生产厂商的说明书进行AlphaLISA测定：

7.将细胞离心，吸出上清液，加入1x裂解缓冲液，50-100μL/孔。在RT下孵育10min，1000rpm振荡。

8.将30μL的细胞裂解物转移到1/2面积的培养板中，或冷冻并储存在-80℃用于将来的测试。

9.SureFire测试：向细胞裂解物中加入15μL/孔的受体混合物。密封并在1000rpm下搅拌板2min，然后在RT下孵育1-2小时。

10.向细胞裂解物中添加15μL/孔供体混合物。密封并在1000rpm下搅拌板2min，然后在RT下孵育1-2小时(板可以在4℃下储存过夜。在次日读板前在室温下孵育1hr)。

11.在520–620nm下在Alpha酶标仪上读板。

结果：

如图4中所示，在Ba/f3-OI细胞中，犬IL-31以剂量依赖性方式刺激STAT-3激活。

实施例8

抗犬IL-3lRA抗体的生物活性

按照如下所示评估抗犬IL-31RA mAb在Ba/f3-OI细胞中抑制STAT-3激活的能力：

1.解冻一小瓶Ba/f3-OI细胞，并且使细胞在37℃CO₂下，在125rpm的摇床上，在含有mIL-3的培养基中生长。

2.在设置基于细胞的测定之前，将细胞传代2-3次，使细胞具有≥90％的活力。

3.为建立测定，收集细胞并将其重悬于饥饿培养基中至1x10⁷个活细胞/mL。

4.将细胞分配到96孔板，50μL/孔(约5x10⁵个细胞/孔)。

5.将抗体在96孔板上成行的饥饿培养基重三倍稀释，初始浓度为200μg/mL。然后在每孔中添加5-10μL cIL-31，以达到100ng/mL的终浓度。

6.将50μL稀释抗体和cIL-31的混合物转移至细胞培养板的各孔中，轻柔混合。

7.在37℃CO₂振荡器中孵育细胞培养板，125rpm，持续1-2hr。

根据生产厂商的说明书进行AlphaLISA测定：(参见实施例7)

结果：

如图5所示，在Ba/f3 OI细胞中，抗体4G7和44E2都抑制犬IL-31刺激STAT-3激活的能力。

实施例9

犬IL-31受体α表位的作图

使用质谱

采用基于化学交联和质谱检测的方法鉴定由抗犬IL-31受体αmAb识别的表位[CovalX Instrument Incorporated，位于999Broadway,Suite 305,Saugus,MA 01906-4510]。将该技术应用于犬IL-31受体α链的表位作图，鉴定了由表6中所列mAb识别的表位。用本文公开的三种抗体对犬IL-31受体α进行表位作图的结果表明，mAb识别存在于犬IL-31受体α的胞外域内的特异性肽表位(见下表6)。

值得注意的是，所测试的三种单克隆抗体(mAb)中每一种鉴定的表位都有显著差异。如下面的表6所示，数据表明28F12抗体与包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的单个表位结合，其中抗体与氨基酸序列SEQ ID NO:2的位置215和225的精氨酸(R)残基和位置233的赖氨酸(K)残基结合。数据还表明44E2抗体与两个不同表位结合：第一表位包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列，其中抗体与氨基酸序列SEQ ID NO:2的位置408处的苏氨酸(T)残基结合，和第二表位包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，其具有两个单独的部分，其中一部分抗体与氨基酸序列SEQ ID NO:2的位置464和472的丝氨酸(S)残基和位置471的酪氨酸(Y)残基结合，另一部分抗体与氨基酸序列SEQ ID NO:2的位置487的苏氨酸(T)残基结合。数据还表明10A12抗体与两个不同表位结合：第一表位包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列，其中抗体与氨基酸序列SEQ ID NO:2的位置31、34和42处的酪氨酸(Y)残基和位置39处的苏氨酸(T)残基结合，和第二表位包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列，其中述抗体与氨基酸序列SEQID NO:2的位置89处的赖氨酸(K)残基、位置90处的丝氨酸(S)残基，位置93处的苏氨酸(T)残基和位置94处的酪氨酸(Y)残基结合。

序列表

表1

犬IL-31RA胞外域-HIS标签

表2

非阻断抗体的CDR

表3

阻断抗体的CDR

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表4大鼠抗犬IL-31RA可变区

表5

犬IL-31RA的犬源化抗体的氨基酸序列

SEQ ID NO：	IL-31受体α	重链	轻链
				83	C10A12VL5-CCL		√
84	C10A12VH1-CIgGBm	√
				85	c10A12VH2-cIgGBm	√
86	c10A12VL4-cCL		√
				87	c10A12VL6-cCL		√
88	c28F12VH1-cIgGBm	√
				89	c28F12VH2-cIgGBm	√
90	c28F12VK1-cCK		√
				91	c28F12VK2-cCK		√
92	c28F12VK3-cCK		√
				93	c28F12VK4-cCK		√
94	c44E2VH1-cIgGBm	√
				95	c44E2VH4-cIgGBm	√
96	c44E2VH5-cIgGBm	√
				97	c44E2VK1-cCK		√
98	c44E2VK2-cCK		√
				99	c44E2VK4-CcK		√
100	c44E2VH2-cIgGBm	√

表6

表位序列

/>

Claims (22)

1.一种分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其结合犬白介素-31受体α(犬IL-31RA)，其中所述抗体包含一组六个互补决定区(CDR)，其中三个是重链CDR：重链CDR 1(HCDR1)、重链CDR 2(HCDR2)和重链CDR 3(HCDR3)，和其中三个是轻链CDR：轻链CDR 1(LCDR1)、轻链CDR 2(LCDR2)、和轻链CDR 3(LCDR3)；和

其中所述一组六个CDR选自由(i)、(ii)、和(iii)组成的组；其中对于组(i)：

HCDR1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

HCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；

HCDR3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；

LCDR1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；

LCDR2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和

LCDR3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；

其中对于组(ii)：

HCDR1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；

HCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；

HCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；

LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；

LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和

LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和

其中对于组(iii)：

HCDR1包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；

HCDR2包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；

HCDR3包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；

LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；

LCDR2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；和

LCDR3包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，

其中HCDR1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

其中HCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；

其中HCDR3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；

其中LCDR1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；

其中LCDR2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；和

其中LCDR3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中当与犬IL-31RA结合时，所述抗体与由选自以下的氨基酸序列组成的表位结合：SEQ ID NO:102、SEQ IDNO:103、以及SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103两者。

4.根据权利要求1所述的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，

其中HCDR1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；

其中HCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；

其中HCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；

其中LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；

其中LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和

其中LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，

其中HCDR1包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；

其中HCDR2包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；

其中HCDR3包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；

其中LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；

其中LCDR2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；和

其中LCDR3包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中当与犬IL-31RA结合时，所述抗体与由SEQ ID NO:101的氨基酸序列组成的表位结合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体及其抗原结合片段结合犬IL-31RA并阻断犬IL-31RA与犬白介素-31的结合。

8.根据权利要求7所述的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其是犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段。

9.根据权利要求8所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含铰链区，所述铰链区包含选自SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、和SEQ ID NO:82的氨基酸序列。

10.根据权利要求8所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链包含含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的修饰的犬IgG-B(IgG-Bm)。

11.根据权利要求8所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬源化IL-31RA抗体包含轻链和重链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、和SEQID NO:93的氨基酸序列；所述重链包含选自SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89的氨基酸序列。

12.根据权利要求11所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬源化IL-31RA抗体包含：

包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的重链。

13.根据权利要求8所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬源化IL-31RA抗体包含轻链和重链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、和SEQID NO:100的氨基酸序列；所述重链包含选自SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96的氨基酸序列。

14.根据权利要求13所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中所述犬源化IL-31RA抗体包含：

包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链；或

包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的重链。

15.一种犬或犬源化抗体或其抗原结合片段，其与犬白介素-31受体α(犬IL-31RA)结合，并且当与犬IL-31RA结合时，所述抗体与由选自以下的氨基酸序列组成的表位结合：SEQID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、或其任何组合；其中所述抗体与犬IL-31RA结合并且阻断犬IL-31RA与犬IL-31的结合。

16.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-15所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的重链。

17.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-15中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链。

18.一种表达载体，其包含根据权利要求17所述的分离的核酸。

19.一种表达载体，其包含根据权利要求16所述的分离的核酸。

20.一种宿主细胞，其包含根据权利要求18或权利要求19或者权利要求18或权利要求19两者所述的表达载体。

21.一种药物组合物，其包含根据权利要求8-15中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体或稀释剂。

22.一种帮助阻断与特应性皮炎相关的瘙痒的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求21所述的药物组合物。