ES2527297T3

ES2527297T3 - Anticuerpos humanos para CD20 humano y método para utilizar los mismos

Info

Publication number: ES2527297T3
Application number: ES08796917.6T
Authority: ES
Inventors: Joel H. Martin; Li-Hsien Wang; Sean Stevens; Erin M. Allison
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2015-01-22
Anticipated expiration: 2028-07-31
Also published as: NI201000016A; US20120100145A1; US7879984B2; CA2695199A1; SV2010003468A; CN101809037A; JP2010535033A; AU2008282152A1; BRPI0813985B1; TN2010000056A1; MX2010000970A; CO6260105A2; JP5588865B2; WO2009018411A1; US20090035322A1; AU2008282152B2; RU2486205C2; EP2178916A1; BRPI0813985A2; PL2178916T3

Abstract

Un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al CD20 humano y que es capaz de inducir una citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en una estirpe celular de célula B de linfoma de no Hodgkin con una concentración de anticuerpo de 1 nM o menor, exhibe un EC50 de 0,2 nM o menos según se mide en células Daudi o un EC50 de 0,4 nM o menos según se mide en células RL y aumentar el tiempo de supervivencia libre de síntomas 9 veces o más cuando se administra por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a ratones injertados con estirpe celular Raji de linfoma de célula B de no Hodgkin, con relación a ratones SCID injertados con estirpe celular Raji de linfoma de célula B de no Hodgkin que recibe 10 mg/kg de un control Fc humano, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende: - una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) y una CDR1 de cadena ligera (LCDR1), en donde la HCDR1 y LCDR1 son de la SEQ ID NO:341 y 349; - una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) y una CDR2 de cadena ligera (LCDR2), en donde la HCDR2 y LCDR2 son de la SEQ ID NO: 343 y 351; y - una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3), donde la HCDR3 y LCDR3 son de la SEQ ID NO:345 y 353;

Description

Anticuerpos humanos para CD20 humano y método para utilizar los mismos

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con anticuerpos humanos y con fragmentos de anticuerpos específicos para CD20 humano, con composiciones farmacéuticas y con métodos terapéuticos de los mismos.

Declaración de la técnica relacionada

El CD20 (también conocido como antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B humanos o Bp35; antígeno B1 de superficie de linfocitos B, Leu-16, BM5, y LF5) es una proteína de transmembrana hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente ~35 kD expresado sobre linfocitos pre-B y B maduros (Valentine et al. (1989), J. Biol. Chem., 264:11282; Einfield et al. (1988), EMBO J., 7:711-717). La secuencia de aminoácidos del CD20 humano aparece en la SEQ ID NO:1 (Aceso GenBank No. NP-690605). Se describen anticuerpos anti-CD20, por ejemplo, en los documentos US 5,736,137, WO 2004/056312, y US 2004/0167319.

Los métodos para producir anticuerpos útiles como productos terapéuticos humanos incluyen la generación de anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados (véase, por ejemplo, el documento US 6,949,245). Véase también, por ejemplo, los documentos WO 94/02602 y US 6,596,541, que describen métodos para generar ratones genéticamente modificados capaces de producir anticuerpos útiles para fabricar productos terapéuticos humanos.

Breve resumen de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que une específicamente CD20 humano y es capaz de inducir citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en una estirpe celular de linfoma de célula B de no Hodgkin humana con una concentración de anticuerpo de 1 nM o menos, exhibe un EC50 de 0,2 nM o menos como se mide en células Daudi, o un EC50 de 0,4 nM o menos según se mide por células RL, y aumenta el tiempo de supervivencia libre de síntomas 9 veces o más cuando se administra por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a ratones injertados con la estirpe celular de linfoma de célula B de no Hodgkin humana Raji, relación con ratones SCID injertado con la línea de célula de linfoma de célula B de no Hodgkin humana Raji que reciben 10 mg/kg de un control Fc humano, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende:

-: una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) y una CDR1 de cadena ligera (LCDR1), en donde el HCDR1 y LCDR1 son SEQ ID NO:341 y 349;

-: una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) y una CDR2 de cadena ligera (LCDR2), en donde la HCDR2 y LCDR2 son SEQ ID NO:343 y 351; y

-: una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3), en donde la HCDR3 y LCDR3 son SEQ ID NO:345 y 353.

Los anticuerpos proporcionados son anticuerpos humanos, preferiblemente anticuerpos humanos recombinantes que se unen específicamente al CD20 humano. Estos anticuerpos se caracterizan por unirse específicamente al CD20 humano y por mediar en la muerte de células de linfoma de células B que expresan el CD20. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender solo una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab’)2 o scFv), y se pueden modificar para efectuar funcionalidad, por ejemplo, para eliminar o potenciar funciones efectoras residuales (Reddy et al. (2000), J. Immunol., 164:1925-1933).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente al CD20 humano y es capaz de inducir una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en células que expresan CD20 en presencia del complemento, en donde el anticuerpo a una concentración de aproximadamente 1 nM o menos induce 50% de lisis de células Daudi y RL en la presencia de suero humano normal al 5% con complemento. El anticuerpo o fragmento del mismo exhibe un EC50 de 0,2 nM o menos, cuando se mide en células Daudi, o un EC50 de 0,4 nM o menos cuando se mide en células RL. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de aumentar el tiempo de supervivencia libre de síntomas entre 9 veces o más, con relación a animales tratados con control en un modelo de ratón de linfoma humano.

El anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente al CD20 humano y es capaz de inducir una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de células que expresan CD20 en la presencia de células

mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde el anticuerpo exhibe un EC50 de aproximadamente 0,2 nM o menos, según se mide en células Daudi. En realizaciones preferidas, el anticuerpo exhibe un EC50 de aproximadamente 50 pM o menos; aproximadamente 20 pM o menos; de aproximadamente 10 pM o menos. En una realización preferida, los anticuerpos exhiben una actividad ADCC mejorada pueden comprender niveles reducidos de fucosilación, por ejemplo fucosa aproximadamente al 5%.

En una realización, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del anticuerpo de la invención comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) de la SEQ ID NO: 339, o una secuencia sustancialmente similar de la misma. En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento comprende la secuencia HCVR de la SEQ ID NO:339.

En una realización más específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende adicionalmente una secuencia de la región variable de cadena ligera (LCVR) de la SEQ ID NO: 347 o una secuencia sustancialmente similar de esta. En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento comprende la LCVR de la SEQ ID NO: 347.

En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende el par de secuencias HCVR/LCVR de la SEQ ID NO: 339/347.

En un segundo aspecto, la invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo. En realizaciones específicas, la molécula de ácido nucleico codifica una HCVR, en donde la secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 338, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma. En un aspecto relacionado, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una LCVR, en donde la secuencia es la SEQ ID NO: 346, o una secuencia sustancialmente idéntica a estas. En una realización preferida, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende una HCVR codificada por una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:338, una LCVR codificada por una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:346, respectivamente.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 345; y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 353. El anticuerpo o fragmento del mismo comprende como un par de secuencias de HCDR3 y LCDR3 de la SEQ ID NO: 345/353.

El anticuerpo o fragmento del mismo comprende adicionalmente una secuencia de dominico de CDR1 de cadena pesada (HCDR1) de la SEQ ID NO: 341; una secuencia de dominio de CDR2 de cadena pesada (HCDR2) de la SEQ ID NO: 343; una secuencia de dominio de la CDR1 de cadena ligera (LCDR1) de la SEQ ID NO: 349; y una secuencia de dominio de la CDR2 de cadena ligera (LCDR2) de la SEQ ID NO: 351. El anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de CDR de cadena pesada y ligera de las SEQ ID NO: 341, 343, 345, 349, 351 y 353.

En un cuarto aspecto, la invención consta moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno de la invención, en donde las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un dominio HCDR3 y un dominio LCDR3 son 344 y 352; respectivamente.

En un sexto aspecto, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que llevan las moléculas de ácidos nucleicos de la invención, y células anfitrionas en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos para fabricar los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención obtenida al cultivar las células anfitrionas de la invención. Por lo tanto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención. La invención proporciona adicionalmente un método para producir un anticuerpo CD20 anti-humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende las etapas de introducir el vector de expresión de la invención en una célula anfitriona aislada, hace crecer la célula bajo condiciones que permiten la producción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y recuperar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido de esta manera. La célula anfitriona puede ser una célula procariota o eucariota, preferiblemente la célula anfitriona es una célula de E. coli o una célula de mamífero, tal como una célula CHO. En una realización preferida, se puede producir un anticuerpo con cantidades variables de fucosilación. Por ejemplo, se puede seleccionar una estirpe celular CHO para producir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con un rango de fucosilación desde un mínimo de aproximadamente 5% a un máximo de aproximadamente 95%.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención. Por lo tanto, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende anticuerpo anti-CD20 humano o fragmento del mismo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

En un octavo aspecto, la invención presenta un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo completamente humano capaz de unirse al CD20 humano con un EC50 de 0,2 nM o menos según se mide en células Daudi o un EC50 de 0,4 nM o menos según se mide por células RL, según se mide mediante experimentos de unión celular (descritos adelante). En una realización preferida, el anticuerpo de la invención exhibe un EC50 de aproximadamente 10-9 a aproximadamente 10-12 M o mayor, por ejemplo por lo menos 10-9 M, por lo menos 10-10 M, por lo menos M, por lo menos 10-11 M, o por lo menos 10-12 M, cuando se mide mediante la unión al antígeno presentado sobre la superficie celular.

La invención abarca anticuerpos anti-CD20 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil una modificación para eliminar los sitios de glicosilación no deseados, o un anticuerpo que carezca del grupo funcional fucosa, presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo para incrementar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase Shield et al. (2002), JBC, 277:26733). En otras aplicaciones, se puede efectuar la modificación de una galactosilación con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En un noveno aspecto, la invención presenta un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo como se describió anteriormente, para uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por CD20 en un humano en donde la enfermedad o afección tratada es linfoma de no Hodgkin, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, leucemia linfocítica crónica, y enfermedades inflamatorias. En una realización relacionada, la invención abarca el uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para uso para atenuar o inhibir una enfermedad o condición mediada por CD20 en un humano, en donde la enfermedad de selecciona del grupo que consiste de linfoma de no Hodgkin, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, leucemia linfocítica crónica, y enfermedades inflamatorias

Otros objetos y ventajas resultarán evidentes a partir de la revisión de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Curva de supervivencia libre de síntomas. Los resultados se muestran para un control Fc humano, anticuerpos de control I y II, y anticuerpos: 8G6-5, 9D4-7, 10F2-13, y 7E1-13.

Descripción detallada

Antes de describir los presentes métodos, se debe entender que esta invención no se limita a métodos y condiciones experimentales particulares descritas, ya que pueden variar dichos métodos y condiciones. También se debe entender que la terminología utilizada aquí tiene el propósito de describir solo realizaciones particulares y no está destinada a limitar, dado que el alcance de la presente invención se limitará solo por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el significado como se entiende habitualmente por uno medianamente versado en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar cualesquier métodos y materiales, similares o equivalentes a aquellos descritos aquí en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.

Definiciones

El término “CD20” incluye las variantes e isoformas del CD20 humano, que se expresan en la naturaleza por las células. La unión de un anticuerpo de la invención al antígeno CD20 media en la muerte de células que expresan CD20 (por ejemplo, una célula tumoral). La muerte de las células que expresan CD20 puede ocurrir en una serie de formas, que incluyen la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de células que expresan CD20, la apoptosis de células que expresan CD20, la fagocitosis de células efectoras de células que expresan CD20, o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de células efectoras (ADCC) de células que expresan CD20.

El término “anticuerpo”, como se utiliza aquí, está destinado a referirse a moléculas de inmunoglobulinas que comprenden cuatro cadenas se polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada esta compuesta por una región variable de cadena pesada

(que se abrevia aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (CL1). Se pueden subdividir adicionalmente las regiones VH y VL en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercalada con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de marco (FR). Cada VH y VL se compone por tres CDR y cuatro

FR, dispuestas desde el terminal amino hasta el terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

El término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo” o “fragmento de anticuerpo”), como se utiliza aquí, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hCD20). Se ha demostrado que fragmentos de un anticuerpo de longitud completa pueden realizar la función de unión a antígeno de un anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL1 y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2 un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos F(ab)’ enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominio VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se les puede unir, utilizando métodos recombinantes, por medio de un ligador sintético que les permite ser producidos como una cadena sencilla contigua en la que el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science, 242:423-426; y Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85:5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla también están destinados a ser abarcados dentro de el término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo. También se abarcan otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, como diacuerpos (véase, por ejemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90:6444-6448).

Una “CDR” o región determinante de complementariedad es una región de hipervariabilidad intercalada dentro regiones que son más conservadas, denominadas “regiones marco” (FR). En diversas realizaciones del anticuerpo anti-hCD20 o fragmento de la invención, las FR pueden ser idénticas a la secuencias de línea germinal humana o se pueden modificar natural o artificialmente.

El término “resonancia de plasmón de superficie”, como se utiliza aquí, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real, por medio de detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensora, que utiliza, por ejemplo, el sistema BIACORETM( Pharmacia Biosensor AB).

El término “epítopo” se refiere a un determinante antigénico que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo denominada parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por aminoácidos espacialmente yuxtapuestos procedentes de diferentes segmentos de una (o más) cadena

o cadenas de polipéptidos lineales. Un epítopo lineal es un epítopo producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena de polipéptidos. En ciertas circunstancias, un epítopo puede incluir otras unidades estructurales, tales como sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo sobre el antígeno.

El término “identidad sustancial” o “sustancialmente idénticos”, cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que cuando se alinea óptimamente, con las inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en por lo menos aproximadamente 95%, y más preferiblemente en por lo menos aproximadamente 96%, 97% 98% o 99% de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, como FASTA, BLAST o GAP, como se discute adelante.

Cuando se aplica a polipéptidos, el término “similitud sustancial” o “sustancialmente similar” significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan pesos de huecos por defecto, comparten por lo menos 95% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente por lo menos 98% o 99% de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren mediante sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una “sustitución conservadora de aminoácidos” es una en la que un residuo de aminoácidos se sustituye por otro residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará de forma sustancial las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en donde dos o más secuencias de aminoácidos difieran entre sí por sustituciones conservadoras, se puede ajustar el porcentaje o grado de similitud de forma ascendente para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por aquellos expertos en la Técnica. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol., 24: 307-331. Ejemplos de grupos de aminoácidos que poseen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifático-hidroxilo: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptofano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina, glutamatoaspartato, y asparagina-glutamina. Alternativamente, un reemplazo conservador es cualquier modificación que tiene

un valor positivo en la matriz de probabilidad log PAM250 que se describe en Gonnet et al. (1992) Science, 256: 1443-45. Un reemplazo “moderadamente conservador” es cualquier cambio con un valor no negativo en la matriz de probabilidad log PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos se mide normalmente, utilizando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas compara secuencias similares utilizando mediciones de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, que incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT, que se pueden utilizar con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos, o entre una proteína de tipo silvestre y la luteína de los mismos. Véase, por ejemplo, GCG versión 6.1. Las secuencias de polipéptidos también se pueden comparar utilizando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG versión 6.1, FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y el porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor superposición entre las secuencias pregunta y de investigación (Pearson (2000), supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un numero elevado de secuencias de diferentes organismos, es el programa de ordenador BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, que utilizan parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389 402.

El término “cantidad efectiva” es una concentración o una cantidad de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que resulta en alcanzar un propósito establecido particular. Se puede determinar de forma empírica la “cantidad efectiva” de un anticuerpo anti-CD20 o un fragmento de unión a antígeno de este anticuerpo. Adicionalmente, una “cantidad terapéuticamente efectiva” es una concentración o una cantidad de un anticuerpo anti-CD20 o fragmento de unión a antígeno del mismo que es efectiva para lograr un efecto terapéutico mencionado. Esta cantidad también se puede determinar de forma empírica.

Preparación de anticuerpos humanos

Los métodos para generar anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo, la tecnología Veloclmmune™ (Regeneron Pharmaceuticals), XenoMouseTM (Green et al. (1994) Nature Genetics, 7:13-21; Abgenix), el método “minilocus”, y la presentación de fagos (y véase, por ejemplo, los documentos US 5,545,807, US 6,787,637). La tecnología Veloclmmune™ (documento US 6,596,541) abarca un método para generar un anticuerpo completamente humano de alta especificidad para un antígeno seleccionado. Esta tecnología implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de las cadenas pesada y ligera humanas, unidas de forma operativa con loci de regiones constantes del ratón endógenos, de tal manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se liga de forma operativa con el ADN que codifica las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera humanas. El ADN luego se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano. En una realización específica, la célula es una célula CHO.

Los anticuerpos pueden ser terapéuticamente Útiles para bloquear una interacción de ligando-receptor o para inhibir la interacción del componente receptor, más que para matar células a través de la fijación del complemento (CDC) y la participación en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y mediar en la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo se puede seleccionar con base en si es deseable que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

Las inmunoglobulinas humanas pueden existir en dos formas que se asocian con la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción estable de cuatro cadenas de aproximadamente 150-160 kDa, en la que los dímeros se mantienen unidos por un enlace de disulfuro de cadena pesada intercatenario. En una segunda forma, los dímeros no se enlazan a través de enlaces disulfuro intercatenarios, y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y una cadena pesada acopladas de forma covalente (semianticuerpo). Estas formas han resultado extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad. La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos intactos de IgG se debe, pero no se limita a diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región de bisagra del anticuerpo. Una única sustitución de aminoácido en la región de bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir de forma significativa la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology, 30:105) hasta niveles normalmente observados que utilizan una bisagra de IgG1 humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región de bisagra, CH2 o CH3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Los anticuerpos de la invención se preparan preferiblemente con el uso de la tecnología VeloclmmuneTM. Un ratón transgénico, en el que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina endógena se reemplazan por las correspondientes regiones variables humanas, se expone al antígeno de interés, y se recuperan

células linfáticas (como células B) de los ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una estirpe celular de mieloma para preparar estirpes celulares de hibridoma inmortales, y se detectan y seleccionan dichas estirpes celulares de hibridoma para identificar las estirpes celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. Se puede aislar el ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera y unir con regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y de la cadena ligera. Dicha proteína de anticuerpo se puede producir en una célula, como una célula CHO. Alternativamente, se puede aislar el ADN que codifica anticuerpos quiméricos específicos de antígenos o los dominios variables de las cadenas ligera y pesada directamente a partir de linfocitos específicos a antígenos.

En general, los anticuerpos de la presente invención poseen afinidades muy altas, normalmente poseen un KD, de aproximadamente 10-8 a aproximadamente 10-12 M o mayor, por ejemplo por lo menos 10-8 M, por lo menos 10-9 M,

10-10 10-11 10-12

por lo menos M, por lo menos M, o por lo menos M o EC50 de aproximadamente 10-9 a aproximadamente 10-12 M o mayor, por ejemplo por lo menos 10-9 M, por lo menos 10-10 M, por lo menos 10-11 M, o por lo menos 10-12 M, cuando se mide mediante la unión a antígeno presente sobre la superficie celular.

En primer lugar, se aíslan los anticuerpos quiméricos que tienen alta afinidad con una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describe adelante, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para características deseables, que incluyen afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan por una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada (por ejemplo, SEQ ID NO:416, 417, 418). Mientras que la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, alta afinidad de unión a antígeno y características de especificidad objetivo residentes en la región variable.

Mapeo de Epítopos y tecnologías relacionadas

Para detectar anticuerpos que se unen a un epítopo concreto, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado convencional, tal como aquel descrito en “Antibodies: A Laboratory Manual”, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow y Lane, eds. Otros métodos incluyen barrido de mutantes de alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol. Biol., 2481443-463), o análisis de división de péptidos, como se describe en los ejemplos adelante. Adicionalmente, se pueden emplear métodos tales como escisión de epítopo, la extracción de epítopo, y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science, 9:487-496).

Para determinar las características de unión de los anticuerpos se construyen proteínas CD20 mutantes que contienen sustituciones de aminoácidos seleccionados. Las proteínas CD20 mutantes contienen sustituciones de determinados aminoácidos que aparecen en la proteína humana con correspondientes aminoácidos que aparecen en la proteína de ratón. Este método ayuda a asegurar que las proteínas CD20 mutantes mantienen su estructura terciaria y, supuestamente, cualesquier epítopos conformacionales. La unión de los anticuerpos de prueba a estas proteínas CD20 mutantes se compara con la unión a anticuerpos CD20 de control (conocidos), según se mide mediante FACS. Ninguno de los anticuerpos de la invención muestra un perfil de unión que sea idéntico (con respecto a cada uno de los mutante) a cualquiera de los anticuerpos control.

Inmunoconjugados

La invención abarca un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humano conjugado con una unidad estructural terapéutica (“inmunoconjugado”), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes de citotoxinas incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos de agentes de citotoxinas y de agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081.

Biespecíficos

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido objetivo o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido objetivo. Véase, por ejemplo, Tutt et al. (1991) J. Immunol., 147:60-69. Los anticuerpos anti-CD20 humanos se pueden unir o coexpresar con otra molécula funcional, por ejemplo otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede estar funcionalmente unido (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra forma) a una o más de otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Un anticuerpo multiespecífico de la invención se puede unir específicamente a una célula que exprese CD20 y a una célula efectora humana que exprese un polipéptido, tal como un receptor Fc humano, y/o componentes del complejo del receptor de células T. En una realización, el anticuerpo multiespecífico de la invención comprende una porción de unión a CD20 y una citoquina.

Usos Terapéuticos

Los anticuerpos humanos, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas de la invención son útiles en métodos terapéuticos para tratar enfermedades humanas que se inhiben

o mejoran al inhibir el crecimiento de células que expresan CD20 y/o hacer morir células que expresan CD20. El mecanismo de acción mediante el cual se logran los métodos terapéuticos de la invención incluyen muerte de la célula que expresa CD20 en presencia de células efectoras, por ejemplo, mediante CDC, apoptosis, ADCC, fagocitosis, o mediante una combinación de dos o más de estos mecanismos. El mecanismo para lograr el efecto terapéutico de las moléculas de la invención puede resultar en la muerte o inhibición directa de células que expresan CD20 o, indirectamente, al inhibir células que no expresan CD20 para, por ejemplo, expresar un antígeno de superficie celular estructuralmente relacionado (es decir, sin reactividad cruzada con antígenos de la superficie celular relacionados pero funcionalmente distintos). Las células que expresan CD20 que se pueden inhibir o matar utilizando los anticuerpos humanos de la invención incluyen, por ejemplo, células B tumorigénicas.

Ejemplos de enfermedades y afecciones que involucran células que expresan CD20 incluyen, pero no se limitan a enfermedades tumorigénicas, tales como linfoma de células B (NHL, linfoma/leucemia linfoblástica de precursores de células B, neoplasmas de células B maduras, linfoma linfocítico pequeño/leucemia linfocítica crónica de células B, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma del centro del folículo cutáneo, linfoma de células B de la zona marginal, leucemia de células vellosas, linfoma de células B grande difuso, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo luego e trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, y linfoma de células grandes anaplásico); enfermedades inmunológicas, como enfermedades autoinmunológicas (psoriasis, artritis psoriásica, dermatitis, escleroderma sistémico y esclerosis, enfermedad del intestino inflamatoria, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de insuficiencia respiratoria, meningitis, encefalitis, uveítis, glomerulonefritis, eccema, asma, aterosclerosis, deficiencia en la adhesión de leucocitos, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, diabetes de aparición durante juventud, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis del complejo inmunológico, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM); trombocitopenias de mediación inmunológica, púrpura trombocitopénico idiopático agudo y púrpura trombocitopénico idiopatico crónico, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis del lupus, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, dermatitis atópica, pénfigo, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiencia renal crónica, mononucleosis de infecciosa aguda, VIH, y enfermedades asociadas a herpesvirus; síndrome de insuficiencia respiratoria aguda grave y coreorretinitis; enfermedades y afecciones provocadas por la infección de células B por virus, tal como el virus de Epstein-Barr. La enfermedad o afección atenuada o inhibida por la invención es una seleccionada de linfoma de no Hodgkin, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, leucemia linfocítica crónica y enfermedad inflamatoria.

En una realización específica, el sujeto al cual se le administra el anticuerpo también se trata adicionalmente con un agente quimioterapéutico, radiación, o un agente que module (potencia o inhibe) la expresión o la actividad de un receptor Fc, tal como una citoquina. Normalmente, las citoquinas para administración durante el tratamiento incluyen el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrofagos (GM-CSF), el gamma-interferón, (IFN-γ), y el, factor de necrosis tumoral (TNF). Los agentes terapéuticos típicos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina, cisplatino, bleomicina, carmustina, clorambucilo, y ciclofosfamida.

Administración y formulaciones terapéuticas

La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-CD20 humanos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se administrarán con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una transferencia, administración, tolerancia mejorada y similares. En general, los portadores, excipientes u otros agentes pueden incluir, por ejemplo, aceites (por ejemplo, de colza, semilla de algodón, cacahuete, cártamo, sésamo, soya), ácidos grasos y sales y esteres de los mismos (por ejemplo, ácido oleico, ácido esteárico, ácido palmítico), alcoholes (por ejemplo, etanol, alcohol bencílico), polialcoholes (por ejemplo, glicerol, propilenglicoles y polietilenglicoles, por ejemplo, PEG 3350), polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80), gelatina, albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humana), sales (por ejemplo, cloruro de sodio), ácido succínico y sales de los mismos (por ejemplo, succinato de sodio), aminoácidos y sales de los mismos (por ejemplo, alanina, histidina, glicina, arginina, lisina), ácido acético o sal o éster del mismo (por ejemplo, acetato de sodio, acetato de amonio), ácido cítrico y sales de los mismos (por ejemplo, citrato de sodio), ácido benzoico y sales de los mismos, ácido fosfórico y sales de los mismos (por ejemplo, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico), ácido láctico y sales de los mismos, ácido poliláctico, ácido glutámico y sales de los mismos (por ejemplo, glutamato de sodio), calcio y sales de los mismos (por ejemplo, cloruro de calcio, acetato de calcio), fenol, azúcares (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa), eritritol, arabitol, isomalta, lactitol, maltitol, manitol, sorbitol, xilitol, tensoactivos no iónicos (por ejemplo, TWEEN® 20, TWEEN® 80), tensoactivos iónicos (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio), clorobutanol, DMSO, hidróxido de sodio, glicerina, m-cresol, imidazol, protamina, cinc y sales de los mismos (por ejemplo, sulfato de cinc), timerosal, metilparabeno, propilparabeno,

carboximetilcelulosa, clorobutanol, y heparina. Otros agentes no terapéuticos se describen en el documento US 7,001,392, en particular en la tabla A. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, Pa). Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (como LIPOFECTINTM), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidra, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, carboceras en emulsión (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carboceras. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, con la condición de que el ingrediente activo en la formulación no sea inactivado por la formulación, y que la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la ruta de administración. Véase, también, Powell et al., PDA (1998)

J. Pharm. Sci. Technol., 52:238-311, y las citas del presente documento para información adicional relacionada con excipientes y portadores bien conocidos por los químicos farmacéuticos.

La dosis de las composiciones terapéuticas puede variar dependiendo de la edad y el tamaño del sujeto que recibe la administración, enfermedad objetivo, condiciones, ruta de administración y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se emplea para tratar diversas afecciones y enfermedades asociadas con la actividad CD20, que incluyen el linfoma de no Hodgkin, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, leucemia linfocítica crónica, enfermedades inflamatorias y similares, en un paciente adulto, es ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención, normalmente con una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección o enfermedad se puede ajustar la frecuencia y la duración del tratamiento. En otra administración parenteral y oral, se puede administrar el anticuerpo en una dosis que corresponde a la dosis mencionada anteriormente.

Se conocen diversos sistemas de suministro y se pueden utilizar para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar virus mutantes, endocitosis mediada por receptores (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem., 262;4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a la ruta intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición se puede administrar mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección de bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.), y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser preferiblemente sistémica o local.

La composición farmacéutica también se puede suministrar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249:1527-1533). En determinadas situaciones, la composición farmacéutica se puede suministrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede utilizar una bomba (véase Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201). En otra realización, se pueden utilizar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984). En aún otra realización, un sistema de liberación controlada se puede colocar cerca del objetivo de la composición, requiriendo de esta manera solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984).

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutaneas e intramusculares, infusiones de goteo, etc. Estas preparaciones inyectables se pueden preparar mediante métodos de conocimiento público. Por ejemplo, las preparaciones inyectables se pueden preparar, por ejemplo, al disolver, suspender o emulsionar el anticuerpo o su sal, descritos anteriormente, en un medio acuoso estéril o un medio oleoso que se emplea habitualmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, la solución salina fisiológica, una solución isotónica que contenga glucosa y otros agentes auxiliares, que se pueden utilizar en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensoactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso se emplea, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soya, etc., que se pueden utilizar en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de esta manera se carga preferiblemente en una ampolla apropiada.

De forma ventajosa, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los ingredientes activos. Dichas formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad contenida del anticuerpo mencionado anteriormente es generalmente de aproximadamente 5 a 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en la forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a 100 mg, y en aproximadamente 10 a 250 mg para las otras formas de dosificación.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se ofrecen con el fin de proporcionar a aquellos expertos en la técnica una descripción completa y descripción de cómo fabricar y utilizar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tomar en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados centígrados, y la presión es a o cerca a la presión atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos para CD20 humano

La inmunización de los roedores se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow & Lane, eds. (1988) Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York; Malik y Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, 1994, San Diego). En una realización, las células que expresan CD20 se administran directamente a ratones que tienen loci de ADN que codifican las regiones variables de la cadena pesada y las regiones variables de la cadena ligera kappa de Ig humanas (VeloclmmuneTM, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; documento US 6,596,541), con un adyuvante para estimular la respuesta inmunológica. Este adyuvante puede incluir adyuvante de Freund completo e incompleto, sistema adyuvante MPL+TDM (Sigma), o RIBI (dipéptidos de muramilo) (véase O’Hagan, Vaccine Adjuvant, fr Human Press, 2000, Totawa, NJ). Para lograr altos niveles de expresión de CD20 humano sobre la superficie celular se transfectan estirpes celulares de murino MG87 y/o NS/0 con un plásmido que codifica el CD20 humano, y las células que expresan altos niveles de CD20 se enriquecen utilizando tecnología FACS. En una realización, el CD20 se administra de modo indirecto como un plásmido de ADN que contiene un gen CD20, y el CD20 se expresa utilizando el sistema de expresión de proteínas del anfitrión para producir la proteína antigénica in vivo. En ambos métodos, para lograr una respuesta inmunológica de anticuerpos óptima los ratones reciben inyecciones de refuerzo cada 3 a 4 semanas. La respuesta inmunológica se monitorea mediante un inmunoensayo con base en células, como se describe adelante en que se inmunoensayan muestras de suero en diluciones en serie en 1 a 3 veces. La valoración del suero se define como la dilución de la muestra de suero que produce una señal del ensayo dos veces mayor que la antecedente. Cuando los animales alcanzan su máxima respuesta inmunológica se recolectan las células B que expresan anticuerpo y se fusionan con células de mieloma de ratón para formar hibridomas.

Ejemplo 2. Detección del hibridoma específico a antígeno

En la detección primaria, se transfieren células NS/0 (ATCC) con el gen CD20 humano y se reúnen células con alta expresión (células NS/0-hCD20) y se mantienen en cultivo para su uso en la detección en un medio condicionado para hibridoma, generalmente de aproximadamente 11 a 14 días después de la fusión. Las células NS/0-hCD20 en RPMl 1640 con suero de ternera fetal al 10% se cultivan en placa a una densidad de 50.000 células por pozo en placas de poli-D-lisina de 96 pozos. El medio condicionado para hibridoma se diluye 5 veces y se deja que se una a las células durante 30 minutos. Las células luego se fijan sobre placas con la adición de un volumen igual de formaldehído al 8% durante 20 min, seguido de cuatro lavados sucesivos con PBST. Las placas se incuban con BSA al 5% durante 2 h a temperatura ambiente (RT). Después de lavado, los anticuerpos unidos a placa se incuban con anticuerpos policlonales específicos de Fcγ anti-IgG de ratón de cabra conjugado con HRP durante 30 min, y las placas se revelan utilizando un sustrato de 3.3’, 5.5’-tetrametilbenzidina (TMB) (BD Pharmigen) luego de los lavados finales. La reacción de HRP se detiene con un volumen igual de ácido fosfórico 1 M. Las señales de unión del anticuerpo se miden mediante densidad óptica a 450 nm. Las células NS/0 parentales, que no tienen expresión detectable de CD20, se utilizan como control de fondo para excluir a los sobrenadantes del hibridoma con unión a la superficie celular no específica. Se excluyen los pozos positivos para células parentales NS/0 y células que expresan CD20.

Ejemplo 3. Secuenciación de anticuerpos humanos contra CD20

Antes de la secuenciación, las células de hibridoma específicas de antígeno se subclonan como células individuales utilizando un citómetro de flujo MOFLOTM. La secuenciación de las regiones variables de cadena ligera y pesada se realiza mediante métodos estándar (véase, por ejemplo, el documento US 2004/0167319A1). Se prepara el ARN total a partir de cada estirpe celular de hibridoma con un equipo RNEASYTM (Qiagen). Se prepara el cADN utilizando el equipo de amplificación de cADN SMART RACETM (Clonetech). Se secuencian las secuencias de ADN de las HCVR y LCVR, y las secuencias de aminoácidos predichas para las HCVR y LCVR proporcionadas para anticuerpos seleccionados (HCVR/LCVR SEQ ID NO): 3B9-10N (3/11); 3B9-10GSP (19/21); 3B9-10FGL (23/25); 9C11-14N (27/35); 9C11-14GSP (43/45); 9C11-14FGL (47/49); 2B7-7N (51/59); 2B7-7GSP (67/69); 2B7-7FGL (71/73); 2C114N (75/83); 2C11-4GSP (91/93); 2C11-4FGL (95/97); 3H7-6N (99/107); 3H7-6GSP (115/117); 3H7-6FGL (119/121); 5H2-17N

(123/131); 5H2-17GSP (139/141); 5H2-17FGL (143/145); 6B9-4N (147/155); 6B9-4GSP (163/165); 6B9-4FGL (167/169); 6F6-1N (171/179); 6F6-1GSP (187/189); 6F6-1FGL (191/193); 8G6-5N (“8G6-5”) (195/203); 8G6-5GSP

(211/213); 8G6-5FGL (215/217); 9C3-8N (219/227); 9C3-8GSP (235/237); 9C3-8FGL (239/241); 9D4-7N (“9D4-7”) (243/251); 9D4-7GSP (259/261); 9D4-7FGL (263/265); 9E4-20N (267/275); 9E4-20GSP (283/285); 9E4-20FGL (287/289); 9H4-12N (291/299); 9H4-12GSP (307/309); 9H4-12FGL (311/313); 10E3-17N (315/323); 10E3-17GSP (331/333); 10E3-17FGL (335/337); 10F2-13N (“10F2-13”) (339/347); 10F2-13GSP (355/357); 10F2-13FGL

5 (359/361); 7E1-13N (363/371); 7E1-13GSP (379/381); 7E1-13FGL (383/385).

Ejemplo 4. Especificidad de unión a antígeno de los anticuerpos anti-CD20

Después de que se han convertido los anticuerpos quiméricos en IgG totalmente humano, se determinan las propiedades de unión a antígeno específicas con un protocolo ELlSA similar al protocolo descrito anteriormente, excepto que se utiliza un anticuerpo policlonal específico de Fcγ anti-hIgG de cabra conjugado con HRP como

10 anticuerpo de detección, y se utiliza una estirpe celular Daudi (que expresa CD20 endógeno) como una fuente del antígeno. Todos los anticuerpos probados se unen específicamente a las células Daudi con unos valores EC50 que varían de aproximadamente 0,4 nM a aproximadamente 20 nM.

La especificidad de unión a antígeno de los anticuerpos anti-CD20 completamente humanos se verifica utilizando una citometría de flujo, como se describe adelante, con células MG87 transfectadas con CD20 humano. 15 Brevemente, las células MG87 parentales y las células MG87 transfectadas con CD20 humano se incuban durante 30 min a 4° C con cada uno de 15 anticuerpos humanos y los dos anticuerpos control, seguido de incubación con anticuerpo anti-IgG humano conjugado con PE. La unión se evalúa mediante citometría de flujo. Las intensidades de fluorescencia se comparan con la unión a la estirpe celular parental y la muestra que coincide con el isotipo de control. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Todos los anticuerpos se unen a las células MG87 transfectadas

20 con CD20 humano, mientras que no se observa unión a las células MG87 parenterales, indicando que los anticuerpos son específicos de CD20. Control 1: mAb anti-CD20 quimérico (murinolhumano), rituximab, (RITUXAN@, IDEC Pharmaceuticals Corp.); control II: mAb anti-CD20 humano, 2F2, descrito en el documento WO 2005/103081).

Tabla 1

Anticuerpo: Intensidad de fluorescencia media Total

No transfectado: Transfectado con CD20 Humano

No teñido: 5,78 5,86

Control I: 6,15 2955.71

Control II: 6,08 3315.94

7E1-13: 6,11 3076,88

2B7-7: 6,08 3483,32

10F2-13: 6,13 3396,69

9H4-12: 6,06 2043,95

10E3-17: 6,03 3071,01

9D4-7: 6,66 3156,91

9C3-8: 6,03 2913,87

3B9-10: 6,07 2986,32

9E4-20: 6,03 2908,67

3H7-6: 6,1 3302,01

6B9-4: 6,09 2933,36

6F6-1: 6,05 3385,59

8G6-5: 6,04 3407,87

2C11-4: 6,02 2009,86

9C11-14: 6,05 2751,56

Ejemplo 5. Unión del anticuerpo anti-CD20 humano con CD20 humano mutante

Se generan CD20 humanos mutantes al sustituir secuencias de aminoácidos del CD20 humanos por los correspondientes aminoácidos de ratón utilizando un equipo de mutagénesis de Strategene (Tabla 2). Luego se transfecta un vector de plásmido que comprende un CD20 humano mutante, un promotor de CMV, y un gen resistente a higromicina-IRES-marcador GFP en las células MG87. Para cada CD20 humano mutante se recoge un grupo de células resistentes a higromicina que exhiben alta expresión de GFP y se crea una estirpe estable para el ensayo de unión de anticuerpos.

Tabla 2

Mutante: Mutaciones

#1: Y77F

#2: N163D

#3: A170S P172S

#4: N166D

#5: P172S

#6: Y77F N166D

#7: Y77F N163D

#8: Y77F N163D N166D

#9: N163D N166D

#10: A157V

10 Brevemente, aproximadamente 1 x 106 células de cada estirpe celular transfectada establemente que expresa un CD20 humano mutante se recogen e incuban con cada anticuerpo anti-humano, a 10 µg/ml, en hielo durante 1 h, seguido mediante incubación con IgG anti-humano de cabra conjugado con APC (Jackson Immunolabs), a 10 µg/ml, en hielo durante 45 min. Para cada anticuerpo se evalúa la unión a cada CD20 humano mutante mediante citometría de flujo. Se evalúan los niveles de intensidad fluorescencia promedia mientras se establece un límite con

15 una pequeña población de células (aproximadamente 20%) que exhiben un nivel medio de expresión de GFP, para minimizar los efectos debidos a los niveles de expresión del CD20 mutante variables dentro de cada estirpe celular. Para cada CD20 mutante, el anticuerpo que exhibe la mayor intensidad de fluorescencia media se clasifica como 100% de unión. La tabla 3 muestra el porcentaje de unión de cada anticuerpo anti-CD20 para cada CD20 humano mutante.

20 Tabla 3

Anticuerpo: Porcentaje de unión a CD20 humano mutante (%)

#1: #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10

Control II: 60 30 70 51 84 1 1 0 4 79

3B9-10: 56 6 67 40 72 1 1 0 4 79

9C11-14: 89 83 0 87 29 87 96 100 100 83

7E1-13: 94 49 95 84 85 1 1 0 4 92

Anticuerpo: Porcentaje de unión a CD20 humano mutante (%)

#1: #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10

6F6-1: 100 74 100 85 100 16 2 0 4 98

8G6-5: 86 45 65 70 76 5 1 0 4 96

10F2-13: 79 54 55 60 69 1 2 0 4 87

2B7-7: 100 40 87 100 88 12 2 0 4 83

10E3-17: 61 1 6 1 49 1 1 0 4 87

2C11-4: 35 0 11 31 30 1 1 0 3 68

9D4-7: 67 2 70 5 66 0 2 0 4 75

6B9-4: 74 3 64 3 67 1 2 0 3 75

3H7-6: 28 1 43 4 45 0 1 0 3 80

9C3-8: 36 0 84 22 76 0 1 0 3 77

9H4-12: 19 0 0 0 2 1 2 0 4 52

9E4-20: 14 0 57 8 57 1 1 0 3 76

Control I: 96 100 0 96 2 100 100 93 97 100

Ejemplo 6. Potencia en citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

Los anticuerpos humanos anti-CD20 humano se prueban para su capacidad de promover la citotoxicidad

dependiente del complemento (CDC) utilizando las estirpes celulares de linfoma humano Daudi y RL como estirpes

5 celulares objetivo. Los anticuerpos se diluyen en serie (rango de concentración final de 50 nM a 0,85 pM más control

con regulador) en el medio y se agregan a células objetivo sembradas en un formato de placa de 96 pozos. Se

agrega suero humano con componentes del complemento (Quidel) a cada pozo para producir una concentración

final del suero del 5%. Las células se incuban a 37° C durante 2 h con los anticuerpos de prueba y el suero humano

con los componentes del complemento, y después se ensayan para la supervivencia celular, que se detecta 10 mediante ALAMARBLUETM. La fluorescencia se mide utilizando una longitud de onda de excitación de 560 nm y una

longitud de onda de emisión de 590 nm (tabla 4).

Tabla 4

Anticuerpo: Daudi EC50 (nM) n RL EC50 (nM) N

10F2-13: 0,17 ± 0,08 3 0,36 ± 0,10 4

8G6-5: 0,21 ± 0,08 3 1,06 ± 0,43 4

9D4-7: 0,22 ±0,21 4 0,83 ± 0,60 5

2B7-7: 0,24 ± 0,09 4 1,03 ± 0,40 5

Control II: 0,28 ± 0,11 5 0,77 ± 0,41 6

6B9-4: 0,34 ± 0,25 3 0,97 ± 0,32 4

Anticuerpo: Daudi EC50 (nM) n RL EC50 (nM) N

3H7-6: 0,44 ± 0,27 2 3,66 ± 3,85 2

6F6-1: 0,56 ± 0,35 3 1,20 ± 0,43 4

10E3-17: 0,59 ± 0,24 2 7,80 ± 8,64 3

Control I: 0,84 ± 0,60 6 >50 4

9E4-20: 1,53 ± 0,87 3 1,70 ± 1,80 4

7E1-13: 1,59 ± 0,71 3 5,81 ± 3,77 4

3B9-10: 1,866 0,96 3 8,84 ± 6,94 4

9C3-8: 2,22 ± 1,62 2 11,13 ± 9,29 2

9C11-14: 7,14 ± 6,63 3 12,01 ± 6,61 4

9H4-12: 51,10 ± 38,4 2 29,60 ± 23,76 2

2C11-4: >50 2 5,19 ± 3,10 3

Ejemplo 7. Constante de disociación funcional de los anticuerpos anti-CD20 humanos

Se analizan las constantes de disociación de los mAb anti-CD20 en un ensayo CDC. Los experimentos se realizan en 3 grupos separados. Dentro de cada grupo se determina el porcentaje de lisis celular para 5 anticuerpos en un 5 momento relacionado a los controles I y II a 0, 1 y 6 h. El anticuerpo se une a las células al incubar 2 µg de cada anticuerpo con 106 células Daudi durante 45 min (RT). Para el punto de tiempo cero, las células se lavan e inmediatamente se resuspenden en 100 µl de medio que contiene complemento del suero humano normal al 20%, y después se incuban durante 45 min a 37° C, CO2 al 5%. Para los puntos de tiempo de 1 y 6 h, se lavan 106 células luego de la unión del anticuerpo, se resuspenden en 12 ml de medio fresco en un tubo Falcon de 15 ml, y se incuban 10 en un inversor mecánico durante 1 y 6 h, respectivamente. Las células se lavan a la terminación de los puntos de tiempo seleccionados y se incuban en medio que contiene complemento del suero humano normal al 20%, y se incuban durante 45 min. Luego de incubación en suero se agrega 7-aminoactinomicina D (7AAD) a cada muestra y se incuba durante 15 min a RT para evaluar la viabilidad de las células. Se determina el porcentaje de citotoxicidad en cada punto de tiempo al establecer regiones como una dispersión directa frente a una gráfica de dispersión

15 bidimensional 7AAD que representa células positivas y negativas 7AAD, con residuos excluidos de ambas regiones. El porcentaje de citotoxicidad se grafica para cada punto de tiempo como 100 menos porcentaje de células negativas 7AAD (Tabla 5 a 7).

Tabla 5

Anticuerpo: % de Citotoxicidad

0 hora: 1 hora 6 hora

Control I: 98,5 86,9 16

Control II: 99,6 99,1 98,5

10F2-13: 99,6 99,2 98,5

8G6-5: 99,6 99,2 97,7

9D4-7: 99,4 99,0 96,0

Anticuerpo: % de Citotoxicidad

0 hora: 1 hora 6 hora

2B7-7: 99,4 99,4 98,3

9C11-14: 55,8 22,3 12,9

Tabla 6

Anticuerpo: % de Citotoxicidad

0 hora: 1 hora 6 hora

Control I: 91,9 65,3 52,1

Control II: 98,3 98,6 97,7

6B9-4: 98,1 98,5 97,5

3H7-6: 97,5 94,0 67,6

6F6-1: 97,1 97,1 76,4

10E3-17: 97 96,2 79,2

9E4-20: 67,4 31,2 49,9

Tabla 7

Anticuerpo: % de Citotoxicidad

0 hora: 1 hora 6 hora

Control I: 98,3 81,1 20,5

Control II: 99,1 99,2 98,7

7E1-13: 98,1 98,5 89,3

3B9-10: 98,4 97,9 82,2

9C3-8: 98,7 98,5 76,9

9H4-12: 43,2 17,4 23,1

2C11-4: 29,1 14 22,4

Ejemplo 8. Constante de disociación bioquímica de los anticuerpos anti-CD20 humanos

Se determinan las constantes de disociación bioquímicas para anticuerpos anti-CD20 de ensayo seleccionados y se comparan con los anticuerpos de control I y II. Dos anticuerpos humanos seleccionados, control I o II (cada uno 2

µg/ml) se incuban con células Raji que expresan CD20, a 106/ml, durante 2 h a RT. Las células luego se lavan, se elimina el exceso de anticuerpo, se resuspende en medio que contiene suero al 1% y se incuban a 37° C. En el tiempo 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 y 180 min, se retira una alícuota de 1 ml de células, se lava, se tiñe con anticuerpo anti-hFc marcado con PE y se realiza un análisis FACS. Se utiliza intensidad de fluorescencia media (MFI) como indicador de la cantidad de anticuerpo unido a la superficie celular. Se calculan las constantes de disociación bioquímicas al establecer el porcentaje de unión en tiempo cero como 100%. El experimento se repite 5 veces más y se determina la constante de disociación bioquímica para 12 de los anticuerpos de prueba y se compara con el control I y II (Tablas 8 a 13).

Tabla 8

Tiempo (min): % de Unión

Control I: Control II 9C11-14 10F2-13

0: 100,00 100,00 100,00 100,00

15: 58,36 69,04 50,86 74,85

30: 47,04 72,03 42,22 73,99

45: 33,77 74,00 28,77 70,77

60: 22,96 61,38 17,49 54,30

90: 11,82 54,43 9,66 51,12

120: 6,89 51,33 5,11 47,40

180: 2,73 52,73 2,06 51,65

Tabla 9

Tiempo (min): % de Unión

Control I: Control II 8G6-5 9D4-7

0: 100,00 100,00 100,00 100,00

15: 67,11 80,54 86,48 81,00

30: 51,18 81,20 73,09 82,76

45: 41,97 85,86 86,95 80,73

60: 31,17 85,44 83,93 74,50

90: 15,53 81,30 73,26 62,59

120: 13,08 73,68 67,93 45,99

180: 2,42 51,57 47,96 22,34

Tabla 10

Tiempo (min): % de Unión

Control I: Control II 3H7-6 6F6-1

0: 100,00 100,00 100,00 100,00

15: 68,02 90,93 69,38 87,04

30: 55,97 84,05 56,58 80,86

45: 29,49 64,85 33,12 56,45

60: 33,24 86,17 36,98 68,75

90: 15,42 80,84 19,45 60,57

120: 9,40 82,08 12,25 54,56

180: 3,40 69,25 3,97 34,60

Tabla 11

Tiempo (min): % de Unión

Control I: Control II 2B7-7 6B9-4

0: 100,00 100,00 100,00 100,00

15: 59,47 82,97 88,14 91,05

30: 58,96 69,72 90,53 95,32

45: 49,57 78,71 90,30 96,45

60: 30,98 64,19 76,95 79,77

90: 18,41 67,06 69,17 64,66

120: 8,46 58,03 66,95 60,04

180: 2,70 51,73 64,01 49,03

Tabla 12

Tiempo (min): % de Unión

Control I: Control II 7E1-13 10E3-17

0: 100,00 100,00 100,00 100,00

15: 73,07 81,04 89,23 88,88

Tiempo (min): % de Unión

Control I: Control II 7E1-13 10E3-17

30: 51,70 86,27 83,34 78,82

45: 34,75 87,98 79,89 69,99

60: 22,53 76,71 73,89, 66,64

90: 14,01 87,36 96,29 65,20

120: 8,54 93,79 94,46 50,86

180: 3,44 84,95 89,58 29,76

Tabla 13

Tiempo (min): % de Unión

Control I: Control II 3B9-10 9E4-20

0: 100,00 100,00 100,00 100,00

15: 73,84 88,42 77,88 40,59

30: 58,06 83,57 76,63 15,90

45: 39,64 85,97 70,32 6,76

60: 26,86 75,25 62,64 3,31

90: 12,89 67,46 55,16 1,60

120: 6,83 61,69 47,74 0,97

180: 3,27 68,62 48,25 0,81

Ejemplo 9. Ensayo de citotoxidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC)

5 Se evalúa la ADCC inducida por anticuerpos anti-CD20 humanos seleccionados utilizando células Daudi (células de una estirpe celular de linfoma humano que expresa CD20 de forma endógena). Brevemente, primero se mezclan células Daudi (10.000 células/pozo en 50 µl) con un volumen igual de anticuerpo anti-CD20 humano diluido en serie, dando como resultado una concentración final de anticuerpo que varía de 0,169 pM a 10 nM, y se incuba durante 10 min a RT en una placa de 96 pozos (control = pozos sin Ab). Por separado, se preparan células mononucleares de

10 sangre periférica humana (PBMC, células efectoras) siguiendo un procedimiento convencional de enriquecimiento por centrifugación con gradiente de Ficoll-Hypaque. Las PBMC enriquecidas se recogen, lavan y cultivan en placa en RPMI 1640 que contiene FBS inactivado con calor al 10%, glutamina 2 mM y beta-mercaptoetanol 50 nM. Las células entonces se estimulan con 5 ng/ml de IL-2 humano durante 3 días, se lavan una vez en medio y luego se utilizan directamente en el ensayo de ADCC. A cada mezcla de anticuerpo y células objetivo se agregan

15 aproximadamente 300.000 PBMC para obtener una relación final de células efectoras a células objetivo de aproximadamente 30:1. Luego las placas de 96 pozos se incuban durante 4 h y se centrifugan a 250 x g. Los sobrenadantes se recolectan y ensayan para actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) utilizando el sistema de Ensayo de Citotoxicidad no Radiactivo CYTOTOX 96® (Promega) (tabla 14). Tabla 14

Tabla 14

Anticuerpo: EC50 (pM) N

9C11-14: 10.22 4

9E4-20: 2.37 3

3B9-10: 6.77 2

8G6-5: 14.83 5

10F2-13: 6.68 7

6F6-1: 5.15 4

7E1-13: 2.14 3

9D4-7: 1.53 3

2C11-4: 1.45 1

10E3-17: 1.20 3

2B7-7: 1.99 3

6B9-4: 4.27 3

9C3-8: 11.02 3

3H7-6: 11.11 3

9H4-12: 33.82 1

Ejemplo 10. Actividades terapéuticas de los anticuerpos anti-CD20 con un modelo de ratón de xenoinjerto de linfoma humano

5 Se realizan estudios de la eficacia in vivo para anticuerpos anti-CD20 seleccionados utilizando un modelo de ratón de xenoinjerto de linfoma de células B de no Hodgkin humanas. Se compran ratones hembra con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) de 6 semanas de edad. Después de una semana de aclimatación se inyectan 2.5 millones de células Raji recién recolectadas (células de una estirpe celular de linfoma de células B de no Hodgkin humano) por vía intravenosa a cada ratón. Cada ratón injertado con células Raji luego se trata con FC humano (hFC), control

10 I, control II, 8G6-5, 9D4-7, 10F2-13, o 7E1-13, cada uno a 10 mg/kg, mediante inyección intravenosa en la cola lateral a los 3, 6 y 9 días después del injerto. Los ratones se monitorean durante un periodo de hasta 180 días. Los ratones que exhiben signos de enfermedad, incluyen parálisis de las patas traseras, caquexia y masas tumorales locales grandes ocasionales se someten a eutanasia mediante asfixia con CO2. Se construyen las curvas de supervivencia libre de síntomas utilizando el método de Kaplan-Meier (Figura 1). Los resultados se expresan como

15 porcentaje de supervivencia como una función del tiempo de supervivencia libre de síntomas. Estos resultados muestran que el Ab 10F2-13 aumenta los tiempos de supervivencia significativamente en el modelo animal, de aproximadamente 20 días (animales tratados con control de hFc) a aproximadamente 180 días (más de un aumento de 9 veces del índice de supervivencia) (50% de animales tratado sobreviven aproximadamente 20 días (control de hFc), aproximadamente 40 días (control I), aproximadamente 85 días (control II), y más de 180 días (10F2-13)).

20 Estos mayores tiempos de supervivencia son por lo menos 2 veces mayores (con relación al control II), aproximadamente 4,5 veces mayores (con relación al control I), o por lo menos aproximadamente 9 veces mayores

o más con relación a los animales tratados con hFc.

Lista de secuencias

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> Anticuerpos Humanos para CD20 humano y Métodos para Utilizar los Mismos

<130> 6022A

<140> Para ser asignado

<141> 2008-07-31 5 <150> 60/962,811 <151> 2007-07-31

<150> 61/067,994 <151> 2008-03-03

<160> 418

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1 10 <211> 297

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 2

10 <210> 3

<211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 3

<210> 4

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 4 ggattcacct ttaatgatta tgcc 24

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 6 attagttgga atagtgatag cata 24

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 7

<210> 8

<211> 60

5: <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 8

10: gcaaaagata atcactatgg ttcggggagt tattactact accaatacgg tatggacgtc 60

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15: <220>

<223> Sintético

<400> 9

<210> 10 20 <211> 322

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético 25 <400> 10

23

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 11

10: <210> 12

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

15: <223> Sintético

<400> 12

cagagtgtta gcagcaac: 18

<210> 13

<211> 6

20: <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 13

5 <210> 14

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Sintético

<400> 14 ggtacatcc 9

<210> 15

<211> 3 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 15

<210> 16

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 25 <220>

<223> Sintético

<400> 16 caacaatata ataactggcc gctcact 27

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 5 <223> Sintético

<400> 17

<210> 18

<211> 382 10 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 18

<210> 19

<211> 127

<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 19

<210> 20

<211> 322

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 20

10 <210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 21

<210> 22

<211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 22

10 <210> 23

<211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 23

<210> 24

<211> 322

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 24

10 <210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 25

<210> 26

<211> 367

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 26

10 <210> 27

<211> 122

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 27

<210> 28

<211> 24

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 28

ggattcacct tcagtgactc ctac 24 10 <210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 29

<210> 30

<211> 24 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 30 attagtagta gtggaagtac cata 24

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 31

<210> 32

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 32 gcgagagaag aaccaggaaa ctacgtctat tacggtatgg acgtc 45

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

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<210> 34

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<220>

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<210> 35

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<220>

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<400> 35

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<213> Secuencia Artificial

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cagactacta ccagctac 18

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<220>

<223> Sintético

<400> 37

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<220>

<223> Sintético

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cagctgcgta ccaactggat cacc: 24

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<220>

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<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

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ggattcacct ttcgagatta tacc: 24

10: <210> 53

<211> 8

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<220>

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<400> 53

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<220>

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<212> PRT

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> ADN

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cagagtgtta gcaactac 18

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<211> 107

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<400> 108

cagagtgtta gcagcaac 18

<210> 109

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<212> PRT

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<220>

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10 <210> 121

<211> 107

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<213> Secuencia Artificial

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<400> 121

<210> 122

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<220>

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10 <210> 123

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<220>

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ggttacacct ttaatagtta tgga: 24

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

15: <223> Sintético

<400> 125

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 126 atcagaactt acaatggtaa caca 24

<210> 127

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<210> 128

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<220>

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<400> 128

<210> 129

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 129

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<211> 322

<212> ADN

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<220>

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<220>

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 136

cagcagtata ataactggcc gatcacc: 27

<210> 137

<211> 9

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 137

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<211> 322

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<220>

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10 <210> 143

<211> 128

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<400> 144

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<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<400> 145

<210> 146

<211> 379

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<220>

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10 <210> 147

<211> 126

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<213> Secuencia Artificial

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<210> 148

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<220>

<223> Sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 373

<210> 374

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 374 ggtgcatcc 9

<210> 375

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 375

<210> 376

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético <400> 376 cagcagtata ataactggcc gatcacc 27

<210> 377

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 377

<210> 378

<211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 15 <220>

<223> Sintético

<400> 378

<210> 379 20 <211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético 25 <400> 379

<210> 380

<211> 322

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 380

10 <210> 381

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 381

<210> 382

<211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 382

10 <210> 383

<211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 383

<210> 384

<211> 322

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 384

10 <210> 385

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 385

<210> 386

<211> 355

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 386

10 <210> 387

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 387 <210> 390

<210> 388

<211> 24

<212> ADN

5: <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 388

ggttacacct ttaccatcta tagt: 24

10: <210> 389

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

15: <223> Sintético

<400> 389

<211> 24 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 390 atcggcgctt acaatggtga caca 24

<210> 391

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 391

<210> 392

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 392 gcgagaagta caactacaac cccctttgac tac 33

<210> 393

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 393

<210> 394

<211> 355 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 394

<210> 395

<211> 118

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 395

15 <210> 396

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Sintético

<400> 396

ggttacacct ttaccatcta tagt 24

<210> 397

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 397

<210> 398

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 15 <220>

<223> Sintético

<400> 398 atcggcgctt acaatggtga caca 24

<210> 399 20 <211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético 25 <400> 399

<210> 400

<211> 33

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 400

5: gcgagaagta caactacaac cccctttgac tat 33

<210> 401

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10: <220>

<223> Sintético

<400> 401

<210> 402 15 <211> 355

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético 20 <400> 402

<210> 403

<211> 118

<212> PRT 25 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 403

<210> 404 5 <211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

10 <400> 404 ggttacacct ttaccatcta tagt 24

<210> 405

<211> 8

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 405

20 <210> 406

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 406 aacagcgctt acaatgggaa caca 24

<210> 407

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 407

<210> 408

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 408 gcgagaagta caactgtaac cccctttgac tac 33

<210> 409

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 409

<210> 410

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(8)

<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

<400> 410

<210> 411

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(8)

<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

<400> 411

<210> 412

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(19)

<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

<400> 412

<210> 413

<211> 6 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> 15 <221> VARIANT

<222> (1) ... (6)

<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

<400> 413

20 <210> 414

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 25 <223> Sintético

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)...(3)

<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

<400> 414

<210> 415

<211> 9 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> 10 <221> VARIANT

<222> (1)...(9)

<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

<400> 415

15 <210> 416

<211> 330

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Sintético

<400> 416

<210> 417

<211> 327

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 417

<210> 418

<211> 327

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 418

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al CD20 humano y que es capaz de inducir una citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en una estirpe celular de célula B de linfoma de no Hodgkin con una concentración de anticuerpo de 1 nM o menor, exhibe un EC50 de 0,2 nM

o menos según se mide en células Daudi o un EC50 de 0,4 nM o menos según se mide en células RL y aumentar el tiempo de supervivencia libre de síntomas 9 veces o más cuando se administra por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg a ratones injertados con estirpe celular Raji de linfoma de célula B de no Hodgkin, con relación a ratones SCID injertados con estirpe celular Raji de linfoma de célula B de no Hodgkin que recibe 10 mg/kg de un control Fc humano, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende:

-

una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) y una CDR1 de cadena ligera (LCDR1), en donde la HCDR1 y LCDR1 son de la SEQ ID NO:341 y 349;

-

una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) y una CDR2 de cadena ligera (LCDR2), en donde la HCDR2 y LCDR2 son de la SEQ ID NO: 343 y 351; y

-

una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3), donde la HCDR3 y LCDR3 son de la SEQ ID NO:345 y 353;
2.

Un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al CD20 humano y que es capaz de inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) con una concentración de anticuerpo de aproximadamente 5 nM o menor, en una estirpe celular de linfoma de célula B de no Hodgkin, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) y una secuencia de región variable de cadena ligera (LCVR), en donde que las secuencias de HCVR y LCVR son de la SEQ ID NO: 339 y 347.
3.

El anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, en donde la concentración de anticuerpo requerida para inducir CDC es 1 nM o menor.
4.

El anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 3, se caracteriza adicionalmente por exhibir un EC50 de 0,2 nM o menor, según se mide en células Daudi, o un EC50 de 0,4 nM o menor, que se mide mediante células RL.
5.

Un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza por exhibir un KD o EC50 de por lo menos 10-11 M, cuando se mide mediante unión al antígeno presentado sobre la superficie celular.
6.

Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5.
7.

Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.
8.

Un método para producir un anticuerpo anti-CD20 humano o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende las etapas de introducir el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 en una célula anfitriona aislada, cultivar la célula bajo condiciones que permiten la producción del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo, y recuperar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido de esta manera.
9.

El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la célula anfitriona es una célula E. coli, una célula CHO,

o una célula COS.
10.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
11.

Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por CD20 en un humano, en donde la enfermedad o afección se selecciona de linfoma no Hodgkin, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, leucemia linfocítica crónica, y enfermedades inflamatorias.
12.

Uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la fabricación de un medicamento para uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por CD20 en un humano, en donde la enfermedad o afección se selecciona del grupo que

consiste de linfoma no Hodgkin, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, leucemia linfocítica crónica, y enfermedades inflamatorias.