ES2648792T3 - Epítopos relacionados con la enfermedad celiaca - Google Patents
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Abstract
Un agente seleccionado de: (a) un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y (b) un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud.
Description
Epítopos relacionados con la enfermedad celiaca
5 La invención se refiere a epítopos útiles en el diagnóstico y la terapia de la enfermedad celiaca, incluyendo diagnosis, terapéutica, kits y métodos de uso de lo anterior.
La enfermedad celiaca está causada por una hipersensibilidad mediada por el sistema inmunitario a gluten dietético. Las proteínas del gluten en trigo, centono, cebada y en algunos casos avena son tóxicas en la enfermedad celiaca. El gluten está compuesto de gliadinas alfa/beta, gamma y omega, y gluteninas de bajo y alto peso molecular (BPM y APM) en trigo, hordeínas en cebada, secalinas en centeno y aveninas en avena. Las hordeínas y secalinas son homólogas a gliadinas gamma y omega y gluteninas de bajo y alto peso molecular en trigo. Las aveninas son filogenéticamente más distantes que las hordeínas y secalinas del gluten de trigo.
15 El objetivo de la investigación en la enfermedad celiaca ha sido definir los componentes tóxicos del gluten definiendo los péptidos que estimulan los linfocitos T específicos a gluten. La definición precisa de epítopos de gluten permite el desarrollo de nuevas diagnosis, terapéutica, ensayos para la contaminación por gluten en comida y granos no tóxicos que retienen las cualidades del cocinado/horneado del gluten tradicional. Muchas de estas aplicaciones requieren un completo entendimiento de todos en vez de los péptidos tóxicos más comunes en gluten.
Los genes codificadores de HLA-DQ2 y/o HLA-DQ8 están presentes en más del 99 % de los individuos con enfermedad celiaca en comparación con aproximadamente el 35 % de la población Caucásica general. Los péptidos derivados de gluten (epítopos) unidos a HLADQ2 o HLA-DQ8 estimulan los linfocitos T específicos. Los epítopos restringidos a HLA-DQ2 y DQ8 incluyen una secuencia de 9 aminoácidos “núcleo” que interactúa directamente con
25 la ranura de unión peptídica de HLA-DQ2 o DQ8 y con receptores de linfocito T afines. En general, bibliotecas de péptidos de solapamiento (normalmente 15 a 20meros) que contienen todos los péptidos 10 o 20mero únicos en un antígeno se han usado para mapear epítopos de linfocitos T restringidos a HLA de clase II.
Se sabe que una serie de péptidos de gluten activan los linfocitos T específicos a gluten en enfermedad celiaca. Estudios previos han identificado péptidos de gluten de proteínas de gluten seleccionadas o productos de digestión del gluten. Los clones y las líneas de linfocito T aislados de biopsias intestinales se han usado para investigar estos componentes de gluten.
La modificación del gluten por la enzima, transglutaminasa de tejido (tTG) presente en el tejido intestinal, incrementa
35 sustancialmente la capacidad estimuladora del gluten sobre los linfocitos T específicos a gluten. La mayoría de los epítopos conocidos para los linfocitos T específicos a gluten corresponden a péptidos de gluten desamidados por tTG. La transglutaminasa media la desamidación de residuos de glutamina específicos (a glutamato) en gluten. Secuencias que contienen glutamina susceptibles a desamidación por tTG se ajustan generalmente a un motivo: QXPX o QXX (FYMILVW) (véase Vader W. y col. 2002 J. Exp. Med. 195:643-649, PCT WO 03/066079, y Fleckenstein B. 2002. J. Biol. Chem. 277:34109-16). El motivo para péptidos que se unen a HLA-DQ2 y que son susceptibles a desamidación por tTG se ha usado para predecir ciertos epítopos de gluten (Vader y col. J. Exp. Med. 2002 J. Exp. Med. 195:643-649, PCT WO 03/066079).
Sin embargo, otros grupos han identificado epítopos para clones de linfocito T intestinal específico a gluten y líneas
45 que usan paneles de once gliadinas alfa/beta recombinantes (11) y cinco gamma (Arentz-Hansen H. 2000. J. Exp. Med. 191:603-612, Arentz-Hansen H. 2002. Gastroenterology 123:803-809, PCT WO 02/083722), y lisados de proteínas de gluten purificadas (Sjostrom H. y col. 1998. Scand. J. Immunol. 48,111-115; van de Wal, Y. y col. 1998.
J. Immunol. 161(4):1.585-1.588; van de Wal, Y. y col. 1999. Eur. J. Immunol. 29:3.133-3.139; Vader W. y col. 2002. Gastroenterology 122:1.729-1.737.).
Nuestro trabajo ha aprovechado la observación de que la exposición a gluten in vivo induce linfocitos T específicos a gluten CD4+ restringidos a HLA-DQ2 en sangre periférica expresando una integrina localizada en el intestino (alfa4beta7). Esta técnica permitió el mapeado del epítopo dominante en A-gliadina (57-73 QE65) (Anderson, RP y col. 2000. Nat. Med. 6:337-342., documento WO 01/25793). A-gliadina 57-73 QE65 corresponde a dos epítopos de
55 solapamiento identificados usando clones de linfocito T intestinal (Arentz-Hansen H. y col. 2000. J. Exp. Med. 191:603-612, Arentz-Hansen H. y col. 2002. Gastroenterology 123:803-809). La ventaja de la exposición a gluten in vivo para inducir linfocitos T específicos a gluten es que se puede consumir cualquier comida y los linfocitos T resultantes inducidos en sangre (cuantificados en sangre periférica usando un ensayo simple ELISPOT de interferón gamma durante la noche) se habrán estimulado in vivo por epítopos presentados endógenamente, en vez de preparados in vitro por un antígeno sintético o purificado. Los ensayos durante la noche de linfocitos T de sangre periférica policlonales frescos también evitan el potencial para artefactos asociados con la purificación prolongada de clones de linfocito T.
Interesantemente, los clones y las líneas de linfocito T específicos para varios epítopos de gliadina gamma (Arentz
65 Hansen H. 2002. Gastroenterology 123:803-809, PCT WO 02/083722) reaccionan de manera cruzada con el epítopo de A-gliadina originalmente definido 57-73 QE65.
Aunque hay considerable homología dentro de las gliadinas alfa/beta, el trabajo anterior (véase el documento WO 03/104273) ha mostrado que el epítopo dominante reconocido en la enfermedad celiaca asociada a HLA-DQ2, “Agliadina 57-73 QE65", es codificado por una minoría de las gliadinas alfa/beta presentes en Genbank.
5 Compendio de la invención
El estudio actual se presentó para desarrollar un método que permitirá el mapeado de todos los epítopos de linfocito T en gluten. El consumo de pan de trigo (200 g diario durante 3 días) o avena (100 g diariamente durante 3 días) se usó para inducir linfocitos T específicos a gluten o avenina en sangre periférica (recogida 6 días después de comenzar la exposición). Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se evaluaron en ensayos ELISPOT de interferón gamma durante la noche usando una biblioteca de péptidos de gluten y avenina que incluyen todas las secuencias de 12mero único incluidas en cada entrada de Genbank para gluten de trigo y/o aveninas de avena. Este objetivo se alcanzó estableciendo un algoritmo para diseñar péptidos que abarcan todos los epítopos potenciales en proteínas de gluten en Genbank (2922 20meros incluían todos los 14 epítopos de linfocito T
15 potenciales de 964 9meros únicos), adaptando el ensayo ELISPOT de interferón gamma a un ensayo de alto rendimiento capaz de investigar más de 1.000 péptidos con sangre de un único individuo y desarrollar herramientas bioinformáticas para analizar e interpretar los datos generados.
Se identificó una serie de 41 “superfamilias” de péptidos de gluten de trigo como epítopos de linfocito T putativos. Las superfamilias compartían motivos en los que se permitió un nivel limitado de redundancia. Muchas de las familias más potentes incluyen epítopos de linfocito T conocidos que incluyen el epítopo dominante previamente descrito, A-gliadina 57-73.
A través de mapeado completo de epítopos de gluten usando CMSP después de exposición a gluten, los inventores
25 han encontrado una serie de novedosos epítopos de gliadina, glutenina BPM y APM, y avenina para la enfermedad celiaca asociada a HLADQ2 y HLA-DQ8. Se identificaron novedosos epítopos para la enfermedad celiaca asociada a HLADQ2 y HLA-DQ8. La enfermedad celiaca asociada a HLADQ2 y HLA-DQ8 son genéticamente y funcionalmente distintas en términos del intervalo de epítopos de linfocito T que se reconocen. Además, tres péptidos presentes en proteínas de avenina de avena también activaron las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) después de la exposición a avena en sujetos celiacos HLA-DQ2+, la primera vez que se han identificado epítopos de avena. La identificación de péptidos de avenina reconocidos por linfocitos T después de la exposición a avena in vivo proporciona una base molecular para la recaída ocasional observada de celiacos después de la exposición a avena (Lundin KEA y col. 2003 Gut 52:1.649-52) y puede proporcionar una base para un diagnóstico predictivo o destoxificación genética de avena.
35 Los datos presentados en el presente documento proporcionarán una base completa para la definición de epítopos de linfocito T tanto “dominantes” comunes como “débiles” ocasionales en enfermedad celiaca. Esta información es la plataforma para aplicaciones funcionales tales como diagnosis, ensayos de alimentos, inmunoterapia y profilaxis, y para el diseño de proteínas de gluten no tóxicas útiles en granos modificados.
En particular, a través del mapeado completo de epítopos de linfocito T de gluten, los inventores han encontrado epítopos bioactivos en la enfermedad celiaca en pacientes HLA-DQ2+ en gliadinas y gluteninas de trigo, que tienen secuencias núcleo similares (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-199) y secuencias ampliadas similares (por ejemplo, SEQ ID NO: 200-1554, 1555-1655, 1656-1671 y 1830-1903). Los inventores también han encontrado epítopos bioactivos 45 en la enfermedad celiaca en pacientes HLA-DQ2+ en: aveninas de avena que tienen secuencias núcleo similares (por ejemplo, SEQ ID NO: 1684-1695) y secuencias ampliadas similares (por ejemplo, SEQ ID NO: 1672-1683, 1696-1698 y 1764-1768); secalinas de centeno (SEQ ID NO: 1769-1786); y hordeínas de cebada (SEQ ID NO: 1787-1829). Además, se han identificado epítopos bioactivos en la enfermedad celiaca en pacientes HLA-DQ8+ en gliadinas de trigo que tienen secuencias núcleo similares (por ejemplo, SEQ ID NO: 1699-1721) y secuencias ampliadas similares (por ejemplo, SEQ ID NO: 1722-1763 y 1908-1927). Este mapeado completo proporciona así epítopos dominantes reconocidos por linfocitos T en pacientes celiacos. Por tanto, los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar usando cualquiera de estos epítopos identificados, y análogos y equivalentes de los mismos. Además, se ha demostrado que combinaciones de epítopos, es decir, “combitopos” o péptidos sencillos que comprenden dos o más epítopos, inducen respuestas equivalentes a los epítopos
55 individuales, indicando que varios epítopos se pueden utilizar para usos terapéuticos, diagnósticos y otros de la invención. Tales combitopos pueden estar en forma de, por ejemplo, SEQ ID NO: 1906.
Agentes descritos en el presente documento incluyen uno o más de los epítopos que tienen las secuencias enumeradas en SEQ ID NO: 1578-1579, 1582-1583, 1587-1593, 1600-1620, 1623-1655, 1656-1671, 1672-1698, 1699-1763, 1764-1768, 1769-1786, 1787-1829, 1895-1903, 1906 y 1908-1927 y análogos y equivalentes de los mismos como se define en el presente documento.
Específicamente, la presente invención proporciona:
65 [1]. Un agente seleccionado de:
- (a)
- un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y
- (b)
- un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud;
[2]. Una composición farmacéutica que comprende un agente según [1] y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable;
[3]. Una composición para su uso en un método de prevención o tratamiento de la enfermedad celiaca que comprende al menos un agente seleccionado de:
- (a)
- un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y
- (b)
- un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud;
[4]. Un agente seleccionado de:
- (a)
- un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200;
- (b)
- un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud; y
- (c)
- un análogo de (a) que es un péptido aislado que se une a anticuerpo, dicho anticuerpo se une a un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200;
para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca en un individuo mediante inducción de inmunotolerancia del individuo para prevenir la producción de tal anticuerpo;
[5]. Un método de diagnóstico de la enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra del hospedador, in vitro, con al menos un agente seleccionado de:
- (i)
- un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y
- (ii)
- un análogo de (i) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce (i) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud; y
- (b)
- determinar in vitro si los linfocitos T en la muestra reconocen el agente; indicando el reconocimiento por los linfocitos T que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca;
[6]. Una composición, para su uso en un método de diagnóstico de la enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo que comprende un agente seleccionado de
- (a)
- un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y
- (b)
- un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud,
comprendiendo dicho método la determinación de si los linfocitos T del individuo reconocen el agente, indicando el reconocimiento por los linfocitos T que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca;
[7]. Un método para identificar un análogo de un péptido que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200 comprendiendo dicho método determinar, in vitro, si un péptido candidato es reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200, indicando el reconocimiento del péptido candidato que el péptido candidato es un análogo, siendo dicho análogo de no más de 50 aminoácidos de longitud;
[8]. Un método de diagnóstico de la enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo que comprende determinar, in vitro, la presencia de un anticuerpo que se une a un epítopo de una secuencia peptídica seleccionada de:
- (i)
- un péptido que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y
- (ii)
- un análogo peptídico de (i) que es capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce (i) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud,
en una muestra del individuo, indicando la presencia del anticuerpo que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca;
[9]. Un método in vitro de determinación de si una composición es capaz de causar enfermedad celiaca que comprende determinar si una secuencia proteica capaz de ser modificada por una transglutaminasa a un péptido
que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200 está presente en la composición, indicando la presencia de la secuencia de oligopéptido que la composición es capaz de causar enfermedad celiaca;
5 [10]. Un kit para llevar a cabo un método según [5] que comprende un agente seleccionado de
- (a)
- un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y
- (b)
- un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud,
10 y un medio para detectar el reconocimiento del péptido por el linfocito T; y
[11]. Un anticuerpo o fragmento del mismo, específico para SEQ ID NO: 200.
15 El término “proteína de gluten” abarca gliadinas alfa/beta, gamma y omega, y gluteninas de alto y bajo peso molecular (BPM y APM) en trigo, hordeínas en cebada, secalinas en centeno, y aveninas en avenas. La invención se trata particularmente de gliadinas y aveninas.
El agente se puede usar para la preparación de un medio diagnóstico para su uso en un método de diagnosis de
20 enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo, comprendiendo dicho método determinar si los linfocitos T del individuo reconocen el agente, indicando el reconocimiento por los linfocitos T que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca.
El descubrimiento de epítopos que se modifican por transglutaminasa también permite el diagnóstico de la
25 enfermedad celiaca basándose en la determinación de si están presentes otros tipos de respuesta inmunitaria a estos epítopos.
Breve descripción de los dibujos
30 La Figura 1 muestra un método para generar todos los posibles epítopos peptídicos de un grupo de proteínas.
La Figura 2 muestra los números de acceso de Genbank para productos génicos de gluten presentes en la base de datos Genbank el 16 de junio de 2003.
35 La Figura 3A muestra un algoritmo de expectación-maximización (EM) para analizar los datos de ELISPOT. La Figura 3B muestra un ensayo sobre un conjunto de datos de pacientes con enfermedad celiaca.
La Figura 4 muestra un procedimiento iterativo para encontrar el conjunto mínimo de epítopos que responden.
40 La Figura 5 muestra secuencias de gliadina y glutenina (SEQ ID NO: 1-1554). En la columna “consenso”, las letras minúsculas usan el código estándar de aminoácidos de una letra, pero las letras mayúsculas tienen un significado diferente: E=[“e” o “q”], F=[“f” o “y” o “w”], I=[“i” o “1” o “v”], S=[“s” o “t”], R=[“r” o “k” o “h”]. La columna “secuencia” usa el código estándar de aminoácidos de una letra.
45 La Figura 6 muestra péptidos de gluten que estimulan el interferón gamma en CMSP recogida 6 días después de exposición a gluten en voluntarios con enfermedad celiaca HLA-DQ2+ (SEQ ID NO: 1555-1655). Los 9meros indicados son comunes a 200 grupos de péptidos 20mer bioactivos “estructuralmente” relacionados. Las secuencias de gluten se clasifican según la proporción X de bioactividad de sujetos que responden.
50 La Figura 7 muestra los resultados de un experimento de exposición a trigo (SEQ ID NO: 1656-1671). Estos péptidos dan respuestas de alta calidad (indicadas “Y”) en diez sujetos (A-J) después de exposición a trigo.
La Figura 8 muestra péptidos de Avenina (+/-desamidación por tTG) que estimulan interferón-γ en CMSP recogida 6 días después de exposición a gluten en voluntarios con enfermedad celiaca HLA-DQ2+ (SEQ ID NO:
55 1672-1698). Aquellos marcados con un * son 20meros únicos óptimos que inducen IFN-γ después de la exposición a avena.
La Figura 9 muestra los 40 20meros más potentes (SEQ ID NO: 1699-1763) en dos sujetos HLA-DQ8 (no HLA-DQ2) agrupados según las secuencias núcleo compartidas. La secuencia núcleo del grupo 6 (QGSFQPSQQ)
60 corresponde al epítopo de gliadina alfa descrito por van de Wal y col. (J. Immunol. 1998, 161(4):1.585-1.588). La respuesta máxima en el Sujeto A era de 271 SFC (solo medio, no respuesta de péptido: 4 SFC), y en B era de 26 SFC (solo medio, no respuesta de péptido: 1 SFC).
La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de A-gliadina (SEQ ID NO: 1928) basándose en la 65 secuenciación de aminoácidos.
Descripción detallada de la invención
El término “enfermedad celiaca” abarca un espectro de afecciones causadas por grados variantes de sensibilidad al gluten, incluyendo una forma grave caracterizada por una mucosa de intestino delgado lisa (atrofia vellosa 5 hiperplásica) y otras formas caracterizadas por síntomas más suaves.
El individuo anteriormente mencionado (en el contexto de diagnóstico o terapia) es humano. Pueden tener enfermedad celiaca (sintomática o asintomática) o se supone que la tienen. Pueden estar en una dieta libre de gluten. Pueden estar en una respuesta de fase aguda (por ejemplo, pueden tener enfermedad celiaca, pero
10 solamente han ingerido gluten en las últimas 24 horas antes de lo cual habían estado en una dieta libre de gluten durante 14 a 28 días).
El individuo puede ser susceptible a enfermedad celiaca, tal como una susceptibilidad genética (determinada, por ejemplo, por el individuo que tiene parientes con enfermedad celiaca o que poseen genes que causan predisposición 15 a enfermedad celiaca).
El agente
El agente es un péptido, por ejemplo, de 7 a 50 aminoácidos de longitud, tal como 10 a 40, 12 a 35 o 15 a 30 20 aminoácidos de longitud.
El agente puede ser el péptido representado por SEQ ID NO: 200 o un epítopo que comprende la secuencia que comprende SEQ ID NO: 200 que es un oligopéptido aislado derivado de una proteína de gluten; o un equivalente de estas secuencias de una proteína de gluten de origen natural.
25 Por tanto, el epítopo puede ser un derivado de una proteína de origen natural, particularmente de un gluten de trigo. Tal derivado generalmente es un fragmento de la proteína de gluten, o un derivado mutado de la proteína completa
o fragmento. Por lo tanto, el epítopo de la invención no incluye la proteína de gluten completa de origen natural, y no incluye otras proteínas de gluten de origen natural completas.
30 Generalmente tales fragmentos serán al menos 7 aminoácidos de longitud (por ejemplo, al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos de longitud).
Generalmente tales fragmentos serán reconocidos por linfocitos T a al menos en la misma medida en que los 35 agentes de los cuales se derivan son reconocidos en cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento usando muestras de pacientes con enfermedad celiaca.
El agente puede ser el péptido representado por SEQ ID NO: 200 o una proteína que comprende una secuencia que corresponde a SEQ ID NO: 200 (tal como fragmentos de una proteína de gluten que comprende SEQ ID NO: 200,
40 por ejemplo, después de que la proteína de gluten se haya tratado con transglutaminasa). Los fragmentos bioactivos de tales secuencias son también agentes de la invención. Generalmente tales fragmentos serán al menos de 7 aminoácidos de longitud (por ejemplo, al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos de longitud). Análogos de estas secuencias, como se definen en el presente documento, también son agentes de la invención.
45 En el caso en el que el epítopo comprende una secuencia equivalente a los epítopos anteriores (incluyendo fragmentos) de otra proteína de gluten (por ejemplo, cualquiera de las proteínas de gluten anteriormente mencionadas en el presente documento o cualquier proteína de gluten que causa enfermedad celiaca), tales secuencias equivalentes corresponderán a un fragmento de una proteína de gluten generalmente tratada (parcialmente o completamente) con transglutaminasa. Tales péptidos equivalentes se pueden determinar alineando
50 las secuencias de otras proteínas de gluten con la proteína de gluten de la cual deriva el epítopo original (por ejemplo, usando cualquiera de los programas mencionados en el presente documento). La transglutaminasa está comercialmente disponible (por ejemplo, Sigma T-5398).
El agente que es un análogo es capaz de ser reconocido por un RLT que reconoce (i). Por lo tanto, generalmente
55 cuando se añade el análogo a los linfocitos T en presencia de (i), generalmente también en presencia de una célula presentadora de antígeno (CPA) (tal como cualquiera de las CPA mencionadas en el presente documento), el análogo inhibe el reconocimiento de (i), es decir, el análogo es capaz de competir con (i) en tal sistema.
El análogo puede ser uno que es capaz de unirse al RLT que reconoce (i). Tal unión se puede ensayar mediante
60 técnicas estándar. Tales RLT se pueden aislar de los linfocitos T que se ha demostrado que reconocen (i) (por ejemplo, usando el método de la invención). La demostración de la unión del análogo a los RLT, a continuación, se puede demostrar determinando si los RLT inhiben la unión del análogo a una sustancia que une el análogo, por ejemplo, un anticuerpo al análogo. Generalmente el análogo se une a una molécula MHC de clase II (por ejemplo, HLA-DQ2) en tal inhibición del ensayo de unión.
Generalmente el análogo inhibe la unión de (i) a un RLT. En este caso se disminuye la cantidad de (i) que se une al RLT en presencia del análogo. Esto es porque el análogo es capaz de unirse al RLT y, por lo tanto, compite con (i) para unirse al RLT.
5 Los linfocitos T para su uso en los anteriores experimentos de unión se pueden aislar de pacientes con enfermedad celiaca, por ejemplo, con la ayuda del método de la invención. Otras características de unión del análogo también pueden ser las mismas que (i), y, por tanto, generalmente el análogo se une a la misma molécula MHC de clase II a la cual se une el péptido (HLA-DQ2 o -DQ8). Generalmente el análogo se une a los anticuerpos específicos para (i) y, por tanto, inhibe la unión de (i) a tales anticuerpos.
10 El análogo es un péptido. Puede tener homología con (i), generalmente al menos 70 % de homología, preferiblemente al menos 80, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de homología con (i), por ejemplo, sobre una región de al menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más (tal como la longitud entera del análogo y/o (i), o a través de la región que contacta con el RLT o se une a la molécula MHC) aminoácidos contiguos. En la técnica se conocen métodos de
15 medición de homología de proteína y se entenderá por los expertos en la técnica que en el presente contexto, la homología se calcula sobre la base de la identidad del aminoácido (a veces referido como “homología dura”).
Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que se puede usar para calcular homología (por ejemplo, usado con sus ajustes por defecto) (Devereux y col. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Los
20 algoritmos PILEUP y BLAST se pueden usar para calcular homología o alinear secuencias (generalmente con sus ajustes por defecto), por ejemplo, como se describe en Altschul S. F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, S., F. y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.
El programa para la realización de los análisis BLAST está públicamente disponible a través del “National Center for
25 Biotechnology Information” en Internet en, por ejemplo, “www.ncbi.nlm.nih.gov/”. Este algoritmo implica identificar primero el par de secuencia de alta puntuación (HPS) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia cuestionada que o bien empareja o satisface alguna puntuación umbral valorada T como positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de palabra de alrededor (Altschul y col., supra). Estas correspondencias de palabra de alrededor iniciales actúan como
30 semillas para la iniciación de búsquedas para encontrar HSP que las contienen. Las correspondencias de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como la puntuación de alineamiento acumulativo se pueda incrementar. Las extensiones para las correspondencias de palabra en cada dirección se paran cuando: la puntuación de alineamiento acumulativo disminuye en la cantidad X de su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa va a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuo
35 de puntuación negativa; o se alcanza el final de cada secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la rapidez del alineamiento. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra
(W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 89:10.915-10.919) alineamientos (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas cadenas.
40 El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:5.873-5.787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), lo cual proporciona un indicio de la probabilidad por la cual un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurrirían por casualidad. Por ejemplo, una
45 secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menos de aproximadamente 1, preferiblemente menos de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 0,001.
50 Los análogos peptídicos homólogos generalmente difieren de (i) por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más mutaciones (las cuales pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones). Estas mutaciones se pueden medir a través de cualquiera de las regiones anteriormente mencionadas en relación con el cálculo de homología. Las sustituciones preferiblemente son “conservadoras”. Estas se definen según la siguiente Tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna se pueden sustituir uno
55 por otro:
- ALIFÁTICO
- No polar GAP
- ILV
- Polar-no cargado
- CSTM
- NQ
- DE
- Polar – cargado
- KR
- AROMÁTICO
- HFWY
Generalmente, los aminoácidos en el análogo en las posiciones equivalentes a aminoácidos en (i) que contribuyen a la unión de la molécula MHC o que son responsables del reconocimiento por el RLT, son los mismos o conservados.
Generalmente el péptido análogo comprende una o más modificaciones, las cuales pueden ser modificaciones post
5 traducción naturales o modificaciones artificiales. La modificación puede proporcionar un resto químico (generalmente por sustitución de un hidrógeno, por ejemplo, un enlace C-H), tal como un grupo amino, acetilo, hidroxi o halógeno (por ejemplo, flúor) o grupo carbohidrato. Generalmente la modificación está presente en el terminal N o C.
10 El análogo puede comprender uno o más aminoácidos no naturales, por ejemplo, aminoácidos con una cadena lateral diferente de los aminoácidos naturales. En general, el aminoácido no natural tendrá un terminal N y/o terminal
C. El aminoácido no natural puede ser un L-o un D-aminoácido.
Generalmente el análogo tiene una forma, tamaño, flexibilidad o configuración electrónica que es básicamente 15 similar a (i), Generalmente es un derivado de (i).
En una realización el agente se une a una molécula MHC de clase II (o un fragmento de la misma capaz de unirse al agente). 2, 3, 4 o más de tales complejos pueden estar asociados o unidos uno a otro, por ejemplo, usando un sistema basado en biotina/estreptavidina, en el cual generalmente 2, 3 o 4 moléculas MHC marcadas con biotina se
20 unen a un resto de estreptavidina. Este agente unido generalmente inhibe la unión del complejo (i)/MHC de clase II a un RLT o anticuerpo que es específico para el complejo.
El análogo generalmente se diseña por medios computacionales y, a continuación, se sintetiza usando métodos conocidos en la técnica. Alternativamente el análogo se puede seleccionar de una biblioteca de compuestos. La
25 biblioteca puede ser una biblioteca combinatoria o una biblioteca de expresión, tal como una biblioteca de expresión en fagos. La biblioteca de compuestos puede estar expresada en la biblioteca de expresión en la forma de estar unida a una molécula MHC de clase II, tal como HLA-DQ2 o -DQ8. Los análogos generalmente se seleccionan de la biblioteca basándose en su capacidad de imitar las características de unión (i). Por tanto, se pueden seleccionar basándose en la capacidad de unión a un RLT o anticuerpo que reconoce (i).
30 Generalmente los análogos serán reconocidos por linfocitos T a al menos en la misma medida que cualquiera de los agentes (i), por ejemplo, al menos en la misma medida que el epítopo equivalente es reconocido en cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento, generalmente usando linfocitos T de pacientes con enfermedad celiaca. Los análogos se pueden reconocer a esta medida in vivo y, por tanto, pueden ser capaces de inducir
35 síntomas de enfermedad celiaca a al menos en la misma medida que cualquiera de los agentes mencionados en el presente documento (por ejemplo, en un paciente humano o modelo animal).
Los análogos se pueden identificar en un método que comprende determinar si una sustancia candidata es reconocida por un receptor de linfocito T que reconoce un epítopo de la invención, indicando el reconocimiento de la
40 sustancia que la sustancia es un análogo. Tales RLT pueden ser cualquiera de los RLT mencionados en el presente documento, y pueden estar presentes sobre los linfocitos T. Cualquier ensayo adecuado mencionado en el presente documento se puede usar para identificar el análogo. En una realización este método se lleva a cabo in vivo. Como se ha mencionado anteriormente los análogos preferidos se reconocen a al menos en la misma medida que el epítopo equivalente, y así el método se puede usar para identificar análogos que se reconocen en esta medida.
45 En una realización el método comprende determinar si una sustancia candidata es capaz de inhibir el reconocimiento de un epítopo de la invención, indicando la inhibición del reconocimiento que la sustancia es un análogo.
50 El agente puede ser un producto que comprende al menos 2, 5, 10 o 20 agentes definidos por (i) o (ii). Generalmente la composición comprende epítopos de la invención (o análogos equivalentes) de diferentes proteínas de gluten, tales como cualquiera de las especies o variedades de o tipos de proteína de gluten mencionadas en el presente documento. Composiciones preferidas comprenden al menos un epítopo de la invención, o análogo equivalente, de todos los glútenes presentes en cualquiera de las especies o variedades mencionadas en el
55 presente documento, o de 2, 3, 4 o más de las especies mencionadas en el presente documento (tales como del panel de especies que consisten en trigo, centeno, cebada, avena y triticale). Por tanto, el agente puede ser monovalente o multivalente.
Según ciertas realizaciones de la invención, el agente no tiene o no está basado en una secuencia descrita en los
60 documentos WO 02/083722 y/o WO 01/25793 y/o W003/104273 y/o enumerada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1555-1577, 1580-1581, 1584-1586, 1594-1599, 1621-1622 y/o no es un agente derivado de A-gliadina, cuya secuencia es dada en la Figura 10.
Diagnóstico
Como se mencionó anteriormente el método de diagnóstico de la invención se puede basar en la detección de los linfocitos T que se unen al agente o en la detección de anticuerpos que reconocen el agente.
Los linfocitos T que reconocen el agente en el método (que incluyen el uso anteriormente mencionado) generalmente son linfocitos T que se han sensibilizado previamente in vivo a una o más proteínas de gluten. Como se mencionó anteriormente se ha encontrado que tales linfocitos T experimentados con antígeno están presentes en la sangre periférica.
10 En el método los linfocitos T se pueden poner en contacto con el agente in vitro o in vivo, y determinar si el reconocimiento de los linfocitos T del agente se puede realizar in vitro o in vivo. Por tanto, la invención proporciona el agente para su uso en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano. Se proporcionan diferentes agentes para uso simultáneo, separado o secuencial en tal método.
15 El método in vitro generalmente se lleva a cabo en solución acuosa en la que se añade el agente. La solución también comprenderá los linfocitos T (y en ciertas realizaciones las CPA discutidas más adelante). El término “poner en contacto” usado en el presente documento incluye añadir la sustancia particular a la solución.
20 La determinación de si los linfocitos T reconocen el agente generalmente se consigue detectando un cambio en el estado de los linfocitos T en presencia del agente o determinando si los linfocitos T se unen al agente. El cambio en el estado generalmente está causado por actividad funcional específica a antígeno del linfocito T después de que RLT se una al agente. El cambio de estado se puede medir dentro (por ejemplo, cambio en la expresión intracelular de proteínas) o fuera (por ejemplo, detección de sustancias secretadas) de los linfocitos T.
25 El cambio en el estado del linfocito T puede ser el comienzo de o el incremento en la secreción de una sustancia del linfocito T tal como citoquina, especialmente IFN-γ, IL-2 o TNF-α. La determinación de la secreción de IFN-γ es particularmente preferida. La sustancia generalmente se puede detectar dejando que se una a un agente de unión específico y, a continuación, midiendo la presencia del complejo agente de unión específico/sustancia. El agente de
30 unión específico generalmente es un anticuerpo, tal como anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos a citoquinas están comercialmente disponibles, o se pueden producir usando técnicas estándares.
Generalmente el agente de unión específico se inmoviliza sobre un soporte sólido. Después de que se permita que la sustancia se una al soporte sólido opcionalmente se puede lavar para separar el material que no se une
35 específicamente al agente. El complejo agente/sustancia se puede detectar usando un segundo agente de unión que se unirá al complejo. Generalmente el segundo agente se une a la sustancia en un sitio que es diferente del sitio al que se une el primer agente. El segundo agente preferiblemente es un anticuerpo y está marcado directa o indirectamente por un marcador detectable.
40 Por tanto, el segundo agente puede ser detectado por un tercer agente que generalmente está marcado directa o indirectamente por un marcador detectable. Por ejemplo, el segundo agente puede comprender un resto de biotina, permitiendo la detección por un tercer agente que comprende un resto de estreptavidina y generalmente fosfatasa alcalina como marcador detectable.
45 En una realización el sistema de detección que se usa es el ensayo ELISPOT ex vivo descrito en el documento WO 98/23960. En ese ensayo IFN-γ secretado del linfocito T está unido por un primer anticuerpo específico a IFN-γ que está inmovilizado sobre un soporte sólido. A continuación, se detecta el IFN-γ unido usando un segundo anticuerpo específico a IFN-γ que está marcado con un marcador detectable. Tal anticuerpo marcado se puede obtener de MABTECH (Estocolmo, Suecia). Otros marcadores detectables que se pueden usar se describen más adelante.
50 El cambio en el estado del linfocito T que se puede medir puede ser el incremento en la absorción de sustancias por el linfocito T, tal como la absorción de timidina. El cambio en el estado puede ser un incremento en el tamaño de los linfocitos T, o la proliferación de los linfocitos T, o un cambio en los marcadores de superficie celular sobre el linfocito
T.
55 En una realización el cambio de estado se detecta midiendo el cambio en la expresión intracelular de las proteínas, por ejemplo, el incremento en la expresión intracelular de cualquiera de las citoquinas anteriormente mencionadas. Tales cambios intracelulares se pueden detectar poniendo en contacto el interior del linfocito T con un resto que se une a las proteínas expresadas de una manera específica y que permite la clasificación de los linfocitos T por
60 citometría de flujo.
En una realización cuando se une al RLT el agente se une a una molécula MHC de clase II (generalmente HLA-DQ2 o -DQ8), que generalmente está presente sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno (CPA). Sin embargo, como se menciona en el presente documento, otros agentes pueden unirse a un RLT sin la necesidad de
65 unirse también a una molécula MHC.
Generalmente los linfocitos T que se ponen en contacto en el método se cogen del individuo en una muestra de sangre, aunque se pueden usar otros tipos de muestras que contienen linfocitos T. La muestra se puede añadir directamente al ensayo o se puede primero procesar. Generalmente el procesamiento puede comprender dilución de la muestra, por ejemplo, con agua o tampón. Generalmente la muestra se diluye de 1,5 a 100 veces, por ejemplo, 2
5 a 50 o 5 a 10 veces.
El procesamiento puede comprender separación de componentes de la muestra. Generalmente se separan células mononucleares (CM) de las muestras. Las CM comprenderán los linfocitos T y CPA. Por tanto, en el método las CPA presentes en las CM separadas pueden presentar el péptido a los linfocitos T. En otra realización solamente los linfocitos T, tales como solamente los linfocitos T CD4, se pueden purificar de la muestra. CMSP, CM y linfocitos T se pueden separar de la muestra usando técnicas conocidas en la técnica, tales como las descritas en Lalvani y col (1997) J. Exp. Med. 186, p859-865.
En una realización, los linfocitos T usados en el ensayo están en forma de muestras no procesadas o diluidas, o son
15 linfocitos T recién aislados (tal como en forma de CM o CMSP recién aisladas) que se usan directamente ex vivo, es decir, no se cultivan antes de ser usados en el método. Por tanto, los linfocitos T no se han vuelto a estimular de una manera específica a antígeno in vitro. Sin embargo, los linfocitos T se pueden cultivar antes de su uso, por ejemplo, en presencia de uno o más de los agentes, y generalmente también citoquinas que promueven el crecimiento exógeno. Durante el cultivo el(los) agente(s) generalmente está(n) presente(s) sobre la superficie de CPA, tales como la CPA usada en el método. El precultivo de los linfocitos T puede conducir a un incremento en la sensibilidad del método. Por tanto, los linfocitos T se pueden convertir en línea celulares, tales como líneas celulares de corto plazo (por ejemplo, como se describe en Ota y col (1990) Nature 346, p183-187).
La CPA que generalmente está presente en el método puede ser del mismo individuo que el linfocito T o de un
25 hospedador diferente. La CPA puede ser una CPA de origen natural o una CPA artificial. La CPA es una célula que es capaz de presentar el péptido a un linfocito T. Generalmente es un linfocito B, célula dendrítica o macrófago. Generalmente se separa de la misma muestra que el linfocito T y generalmente está purificada juntamente con el linfocito T. Por tanto, la CPA puede estar presente en CM o CMSP. La CPA generalmente es una célula ex vivo recién aislada o una célula cultivada. Puede estar en forma de una línea celular, tal como una línea celular a corto plazo o inmortalizada. La CPA puede expresar moléculas MHC de clase II vacías sobre su superficie.
En el método se pueden usar uno o más agentes (diferentes). Generalmente los linfocitos T derivados de la muestra se pueden colocar en un ensayo con todos los agentes que se pretende ensayar o los linfocitos T se pueden dividir y colocar en ensayos separados cuada uno de los cuales contiene uno o más de los agentes.
35 La invención también proporciona los agentes tales como dos o más de cualquiera de los agentes mencionados en el presente documento (por ejemplo, las combinaciones de agentes que están presentes en el agente de composición discutido anteriormente) para separar simultáneamente o usar secuencialmente (por ejemplo, para su uso in vivo).
En una realización el agente por sí mismo se añade directamente a un ensayo que comprende linfocitos T y CPA. Como se discutió anteriormente los linfocitos T y CPA en tal ensayo podría estar en forma de CM. Cuando se usan agentes que pueden ser reconocidos por el linfocito T sin la necesidad de presentación por CPA, a continuación, no se requiere CPA. Los análogos que imitan el (i) original unido a una molécula MHC son un ejemplo de tal agente.
45 En una realización se suministra el agente a la CPA en ausencia del linfocito T. A continuación, se suministra la CPA al linfocito T, generalmente después de dejar que presente el agente sobre su superficie. El péptido se puede haber absorbido dentro de la CPA y presentado, o simplemente absorbido sobre la superficie sin entrar dentro de la CPA.
La duración durante la cual el agente está en contacto con los linfocitos T variará dependiendo del método usado para determinar el reconocimiento del péptido. Generalmente 105 a 107, preferiblemente 5x105 a 106 CMSP se añaden a cada ensayo. En el caso en el que el agente se añade directamente al ensayo su concentración es de 10-1 a 103 µg/ml, preferiblemente 0,5 a 50 µg/ml o 1 a 10 µg/ml.
55 Generalmente la duración del tiempo durante el que se incuban los linfocitos T con el agente es de 4 a 24 horas, preferiblemente 6 a 16 horas. Cuando se usan CMSP ex vivo se ha encontrado que se pueden incubar 0,3x106 CMSP en 10 µg/ml de péptido durante 12 horas a 37 ºC.
La determinación del reconocimiento del agente por los linfocitos T se pueden hacer midiendo la unión del agente a los linfocitos T (esto se puede llevar a cabo usando cualquier formato de ensayo de unión adecuado discutido en el presente documento). Generalmente los linfocitos T que se unen al agente se pueden clasificar basándose en esta unión, por ejemplo, usando una máquina de FACS. La presencia de linfocitos T que reconocen el agente se considerará que se da si la frecuencia de células clasificadas usando el agente está por encima de un valor “control”. La frecuencia de los linfocitos T experimentados con antígeno generalmente es de 1 de 106 a 1 de 103, y por lo tanto
65 se puede determinar si las células clasificadas son o no linfocitos T experimentados con antígeno.
La determinación del reconocimiento del agente por los linfocitos T se pueden medir in vivo. Generalmente el agente se administra al hospedador y, a continuación, se puede medir una respuesta que indica el reconocimiento del agente. El agente generalmente se administra intradérmicamente o epidérmicamente. El agente generalmente se administra poniéndolo en contacto con el exterior de la piel, y se puede retener en el sitio con la ayuda de un apósito
5 o vendaje. Alternativamente, el agente se puede administrar con una aguja, tal como por inyección, pero también se puede administrar por otros métodos tales como balística (por ejemplo, las técnicas balísticas que se pueden usar para administrar ácidos nucleicos). El documento EP-A-0693119 describe técnicas que generalmente se pueden usar para administrar el agente. Generalmente, se administra de 0,001 a 1.000 µg, por ejemplo, de 0,01 a 100 µg o 0,1 a 10 µg de agente.
En una realización se puede administrar un producto que es capaz de proporcionar el agente in vivo. Por tanto, se puede administrar un polinucleótido capaz de expresar el agente, generalmente en cualquiera de los modos anteriormente descritos para la administración del agente. El polinucleótido generalmente tiene cualquiera de las características del polinucleótido proporcionado por la invención que se discute más adelante. El agente se expresa
15 a partir del polinucleótido in vivo. Generalmente se administra de 0,001 a 1.000 µg, por ejemplo, de 0,01 a 100 µg o 0,1 a 10 µg de polinucleótido.
El reconocimiento del agente administrado a la piel generalmente está indicado por la ocurrencia de la inflamación (por ejemplo, induración, eritema o edema) en el sitio de administración. Esto generalmente se mide por examen visual del sitio.
El método de diagnóstico basado en la detección de un anticuerpo que une al agente generalmente se lleva a cabo poniendo en contacto una muestra del individuo (tal como cualquiera de las muestras mencionadas en el presente documento, opcionalmente procesadas de cualquier manera anteriormente mencionada) con el agente y
25 determinando si un anticuerpo en la muestra une al agente, indicando tal unión que el individuo tiene, o es susceptible a enfermedad celiaca. Se puede usar cualquier formato adecuado de ensayo de unión, tal como cualquiera de tales formatos mencionados en el presente documento.
Terapia
La identificación del epítopo inmunodominante y otros epítopos descritos en el presente documento permite que se produzcan productos terapéuticos que guían los linfocitos T que reconocen este epítopo (siendo tales linfocitos T unos que participan en la respuesta inmunitaria frente a proteínas de gluten). Estos descubrimientos también permiten la prevención o el tratamiento de enfermedad celiaca por supresión (por inducción de
35 inmunotolerancia(tolerization)) de un anticuerpo o respuesta de linfocito T a el(los) epítopo(s).
Ciertos agentes de la invención unen al RLT que reconoce el epítopo de la invención (medido usando cualquiera de los ensayos de unión anteriormente discutidos) y causan inducción de inmunotolerancia del linfocito T que lleva el RLT. Tales agentes, opcionalmente en asociación con un vehículo, por lo tanto, se pueden usar para prevenir o tratar enfermedad celiaca.
Generalmente la inducción de inmunotolerancia puede ser causada por los mismos péptidos que pueden (después de ser reconocidos por el RLT) causar actividad funcional específica a antígeno del linfocito T (tal como tal actividad mencionada en el presente documento, por ejemplo, secreción de citoquinas). Tales agentes causan inducción de
45 inmunotolerancia cuando se presentan al sistema inmunitario en un contexto de “inducción de inmunotolerancia”.
La inducción de inmunotolerancia conduce a una disminución en el reconocimiento de un linfocito T o epitopo de anticuerpo por el sistema inmunitario. En el caso de un epítopo de linfocito T esto puede ser causado por la deleción
o anergización de los linfocitos T que reconocen el epitopo. Por tanto, se disminuye la actividad del linfocito T (por ejemplo, medida en ensayos adecuados mencionados en el presente documento) en respuesta al epítopo. La inducción de inmunotolerancia de una respuesta de anticuerpo significa que se produce una cantidad disminuida del anticuerpo específico al epitopo cuando se administra el epítopo.
Se conocen métodos de presentación de antígenos al sistema inmunitario en dicho contexto y se describen por
55 ejemplo en Yoshida y col. Clin. Immunol. Immunopathol. 82, 207-215 (1997), Thurau y col. Clin. Exp. Immunol. 109, 370-6 (1997), y Weiner y col. Res. Immunol. 148, 528-33 (1997). En particular ciertas vías de administración pueden causar inducción de inmunotolerancia, tales como oral, nasal o intraperitoneal. La inducción de inmunotolerancia también se puede conseguir por células dendríticas y péptidos que presentan tetrámeros. Se pueden administrar (por ejemplo, en una composición que también comprende el agente) productos particulares que causan inducción de inmunotolerancia al individuo. Tales productos incluyen citoquinas, tales como citoquinas que favorecen una respuesta Th2 (por ejemplo, IL-4, TGF-β; o IL-10). Se pueden administrar productos o agente a una dosis que causa inducción de inmunotolerancia.
En una realización, los agentes de inducción de inmunotolerancia (inmunotolerancia de linfocito T y anticuerpo)
65 están presentes en una composición que comprende al menos 2, 4, 6 o más agentes que inducen inmunotolerancia a diferentes epítopos de la invención, por ejemplo, a las combinaciones de epítopos anteriormente discutidas en
relación con los agentes que son un producto que comprende más de una sustancia.
Prueba de si una composición es capaz de causar enfermedad celiaca
5 Como se mencionó anteriormente la invención proporciona un método de determinación de si una composición es capaz de causar enfermedad celiaca que comprende detectar la presencia de una secuencia de proteína que es capaz de ser modificada por una transglutaminasa como la secuencia que comprende el agente o epitopo de la invención (tal actividad de la transglutaminasa puede ser una actividad de transglutaminasa intestinal humana).
10 Generalmente esto se realiza usando un ensayo de unión en el que un resto que se une a la secuencia de una manera específica se pone en contacto con la composición y se detecta la formación de complejo secuencia/resto y se usa para establecer la presencia del agente. Tal resto puede ser cualquier sustancia adecuada (o tipo de sustancia) mencionada en el presente documento, y generalmente es un anticuerpo específico. Se puede usar cualquier formato adecuado del ensayo de unión (tal como los mencionados en el presente documento).
15 En una realización, la composición se pone en contacto con al menos 2, 5, 10 o más anticuerpos que son específicos para epítopos de la invención de diferentes proteínas de gluten, por ejemplo, un panel de anticuerpos capaces de reconocer las combinaciones de epítopos anteriormente discutidos en relación con los agentes de la invención que son un producto que comprende más de una sustancia.
20 La composición generalmente comprende material de una planta que expresa una proteína de gluten que es capaz de causar enfermedad celiaca (por ejemplo, cualquiera de las proteínas de gluten o plantas mencionadas en el presente documento). Tal material puede ser una parte de la planta, tal como un producto recolectado (por ejemplo, semilla). El material puede ser productos procesados del material vegetal (por ejemplo, tal producto mencionado en
25 el presente documento), tal como una harina o alimento que comprende la proteína de gluten. El procesamiento de material alimenticio y el ensayo en los ensayos de unión adecuados es rutinario, por ejemplo, como se menciona en Kricka L.J., J. Biolumin. Chemilumin. 13, 189-93 (1998).
Ensayos de unión
30 La determinación de la unión entre cualquiera de las dos sustancias mencionadas en el presente documento se puede hacer midiendo una característica de una o ambas sustancias que cambia tras la unión, tal como un cambio espectroscópico.
35 El formato del ensayo de unión puede ser un sistema “de desplazamiento de banda”. Esto implica determinar si la presencia de una sustancia (tal como una sustancia candidata) avanza o retarda el progreso de la otra sustancia durante la electroforesis en gel.
El formato puede ser un método de unión competitivo que determina si la sustancia es capaz de inhibir la unión de la 40 otra sustancia a un agente que se sabe que se une a la otra sustancia, tal como un anticuerpo específico.
Kits
La invención también proporciona un kit para llevar a cabo el método que comprende uno o más agentes y un medio
45 para detectar el reconocimiento del agente por el linfocito T. Generalmente, se proporcionan los diferentes agentes para su uso simultáneo, separado o secuencial. Generalmente, los medios para detectar el reconocimiento permiten
o ayudan a la detección basándose en las técnicas anteriormente discutidas.
Por tanto, los medios pueden permitir la detección de una sustancia secretada por los linfocitos T después del
50 reconocimiento. Por tanto, el kit puede incluir adicionalmente un resto de unión específico para la sustancia, tal como un anticuerpo. El resto generalmente específico para IFN-γ. El resto generalmente está inmovilizado sobre un soporte sólido. Esto significa que después de la unión al resto la sustancia seguirá en la proximidad del linfocito T que lo secretó. Por tanto, se forman “manchas” del complejo sustancia/resto sobre el soporte, representando cada mancha un linfocito T que está secretando la sustancia. La cuantificación de las manchas, y generalmente la
55 comparación frente a un control, permite la determinación del reconocimiento del agente.
El kit también puede comprender un medio para detectar el complejo sustancia/resto. Un cambio detectable se puede dar en el propio resto después de unirse a la sustancia, tal como un cambio de color. Alternativamente, se puede permitir que un segundo resto directa o indirectamente marcado para la detección se una al complejo
60 sustancia/resto para permitir la determinación de las manchas. Como se discutió anteriormente el segundo resto puede ser específico para la sustancia, pero se une a un sitio diferente sobre la sustancia que el primer resto.
El soporte inmovilizado puede ser una placa con pocillos, tal como una placa de microtitración. Por lo tanto, cada ensayo se puede llevar a cabo en un pocillo separado en la placa.
Además, el kit puede comprender medio para los linfocitos T, restos de detección o tampones de lavado para usarse en las etapas de detección. El kit además puede comprender reactivos adecuados para la separación de la muestra, tal como la separación de CMSP o linfocitos T de la muestra. El kit puede estar diseñado para permitir la detección de los linfocitos T directamente en la muestra sin requerir ninguna separación de los componentes de la muestra.
El kit puede comprender un instrumento que permite la administración del agente, tal como la administración intradérmica o epidérmica. Generalmente tal instrumento comprende apósito, vendaje o una o más agujas. El instrumento puede permitir administración balística del agente. El agente en el kit puede estar en forma de una composición farmacéutica.
El kit también puede comprender controles, tales como controles positivos o negativos. El control positivo puede permitir que se ensaye el sistema de detección. Por tanto, el control positivo generalmente imita el reconocimiento del agente en cualquiera de los métodos anteriores. Generalmente en los kits diseñados para determinar el reconocimiento in vitro el control positivo es una citoquina. En el kit diseñado para detectar el reconocimiento in vivo
15 del agente el control positivo puede ser antígeno al cual la mayoría de los individuos debería responder.
El kit también puede comprender un medio para tomar una muestra que contiene linfocitos T del hospedador, tal como una muestra de sangre. El kit puede comprender un medio para separar células mononucleares o linfocitos T de una muestra del hospedador.
Anticuerpos
La invención también proporciona anticuerpos monoclonales o policlonales que específicamente reconocen los agentes (tales como el epítopo de la invención) de la invención, y métodos de producción de tales anticuerpos. Los
25 anticuerpos de la invención se unen específicamente a estas sustancias de la invención.
Con los propósitos de esta invención, el término “anticuerpo” incluye fragmentos de anticuerpo tal como Fv, F(ab) F(ab’)2 así como anticuerpos de cadena sencilla.
Un método para producir un anticuerpo policlonal comprende inmunizar un animal hospedador adecuado, por ejemplo, un animal experimental, con el inmunógeno y aislar inmunoglobulinas del suero. Por lo tanto, el animal puede ser inoculado con el inmunógeno, posteriormente sacar sangre del animal y purificar la fracción de IgG. Un método para producir un anticuerpo monoclonal comprende inmortalizar células que producen el anticuerpo deseado. Se pueden producir células de hibridoma fusionando células de bazo de un animal experimental inoculado
35 con células tumorales (Kohler y Milstein (1975) Nature 256, 495-497).
Se puede seleccionar una célula inmortalizada que produce el anticuerpo deseado por un procedimiento convencional. Los hibridomas se pueden dejar crecer en cultivo o inyectar intraperitonealmente para la formación de fluido de ascitis o dentro de la corriente sanguínea de un hospedador alogénico o hospedador inmunocomprometido. Se puede preparar anticuerpo humano por inmunización in vitro de linfocitos humanos, seguido de transformación de los linfocitos con virus Epstein-Barr.
Para la producción de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales, el animal experimental es adecuadamente una cabra, conejo, rata o ratón. Si se desea, el inmunógeno se puede administrar como un conjugado en el que se
45 acopla el inmunógeno, por ejemplo por una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos, a un vehículo adecuado. La molécula vehículo generalmente es un vehículo fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido se puede aislar y, si se desea, purificar.
El agente o anticuerpo de la invención, puede llevar un marcador detectable. Se prefieren marcadores detectables que permiten la detección de la sustancia secretada por inspección visual, opcionalmente con la ayuda de un medio de ampliación óptica. Tal sistema se basa generalmente en un marcador enzimático que causa cambio de color en un sustrato, por ejemplo, fosfatasa alcalina que causa un cambio de calor en un sustrato. Tales sustratos están comercialmente disponibles, por ejemplo, en BioRad. Otros marcadores adecuados incluyen otras enzimas tales como peroxidasa, o marcadores de proteína, tal como biotina; o radioisótopos, tales como 32P o 35S. Los anteriores
55 marcadores se pueden detectar usando técnicas conocidas.
Los agentes o anticuerpos de la invención pueden estar en forma básicamente purificada. Pueden estar en forma básicamente aislada, en cuyo caso generalmente comprenderán al menos 80 %, por ejemplo, al menos 90, 95, 97 o 99 % del péptido, anticuerpo o masa seca en la preparación. El agente o anticuerpo generalmente está básicamente libre de otros componentes celulares. El agente o anticuerpo se puede usar en tal forma básicamente aislada, purificada o libre en el método o estar presente en tales formas en el kit.
La invención proporciona agentes terapéuticos (incluyendo profilácticos) o sustancias diagnósticas (los agentes de la invención). Estas sustancias están formuladas para la administración clínica mezclándolas con un vehículo o 65 diluyente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, se pueden formular para la administración tópica, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, intradérmica, epidérmica o transdérmica. Las sustancias se
pueden mezclar con cualquier vehículo que sea farmacéuticamente aceptable y apropiado para la vía de administración deseada. El vehículo o diluyente farmacéuticamente para la inyección puede ser, por ejemplo, una solución estéril o isotónica tal como Agua para Inyección o solución salina fisiológica, o una partícula vehículo para administración balística.
La dosis de las sustancias se puede ajustar según diversos parámetros, especialmente según el agente usado; la edad, peso y afección del paciente a tratar; el modo de administración usado; la gravedad de la afección a tratar; y el régimen clínico requerido. Como guía, la cantidad de sustancia administrada por la inyección es adecuadamente de 0,01 mg/kg a 30 mg/kg, preferiblemente de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg.
10 Las vías de administración y dosis descritas están previstas solamente como guía puesto que un experto será capaz de determinar fácilmente la vía óptima de administración y la dosis para cualquier paciente particular y afección.
Por tanto, las sustancias de la invención se pueden usar en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal,
15 o en un método diagnóstico practicado sobre el cuerpo humano. En particular, se pueden usar en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca. La invención también proporciona los agentes para su uso en un método de fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad celiaca. Por tanto, la invención proporciona un método de prevención o tratamiento de la enfermedad celiaca que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo una sustancia de la invención (generalmente una cantidad eficaz no tóxica de la
20 misma).
El agente de la invención se puede producir usando técnicas químicas sintéticas estándar, tales como por el uso de un sintetizador automatizado. El agente se puede producir de un polipéptido más largo, por ejemplo, una proteína de fusión, cuyo polipéptido generalmente comprende la secuencia del péptido. El péptido se puede derivar del
25 polipéptido, por ejemplo, hidrolizando el polipéptido, tal como usando una proteasa; o rompiendo físicamente el polipéptido. El polinucleótido de la invención se puede producir usando técnicas estándar, tal como usando un sintetizador.
Desamidación
30 Cuando una sustancia descrita en el presente documento incluye un residuo Gln, la invención también proporciona esa secuencia en la que el residuo Gln se ha desamidado a un residuo Glu. Uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) residuo(s) Gln por secuencia se pueden desamidar, pero cuando hay más de un residuo Gln, no todos ellos se deben desamidar. Preferiblemente, los residuos Gln que se desamidan son aquellos susceptibles a desamidación
35 por transglutaminasa.
En el listado de secuencia se dan ejemplos en los que Gln se pueden desamidar. Por ejemplo, el residuo 4 de la SEQ ID NO: 1 puede ser un residuo Gln o un residuo Glu, el residuo 6 de la SEQ ID NO: 2 puede ser un residuo Gln o un residuo Glu, los residuos 4 y 7 de la SEQ ID NO: 6 pueden ser cada uno independientemente residuos Gln o
40 Glu, etc. Los residuos Gln que son susceptibles a desamidación, y sus homólogos Glu desamidados, se refieren como residuos “Glx”.
Cuando el agente incluye más de un residuo Glx, estos se pueden disponer en cualquier configuración. Por ejemplo, los residuos Glx pueden ser residuos consecutivos, y/o pueden estar separados por otro u otros más (por ejemplo, 1,
45 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, etc.) residuos. Como se mencionó anteriormente, para los epítopos HLA-DQ8, el agente preferiblemente comprende un residuo Glx que está separado por siete residuos de otro residuo Glx. Los agentes preferidos de la invención son agentes desamidados, es decir, el agente comprende el uno o más residuos Glx en la forma de Glu. Esto se puede conseguir de diversos modos, por ejemplo, incluyendo residuos Glu durante la producción, o convirtiendo residuos Gln en Glu por desamidación. La conversación de Gln a Glu se puede conseguir
50 tratando un agente que contiene residuos Gln que son susceptibles a desamidación con un agente de desamidación. El uno o más residuos Gln preferiblemente se desamidan a Glu por transglutaminasa, por ejemplo, como se describe en los ejemplos.
El experto en la técnica será capaz de determinar que los residuos Gln particulares en el agente son susceptibles a
55 la desamidación y, por tanto, que los residuos deberían ser residuos Glu que surgen de la desamidación de un residuo Gln. Por ejemplo, secuencias que contienen Gln susceptibles de desamidación por transglutaminasa generalmente conforme a un motivo: por ejemplo, QXPX, QXPF(Y), QXX(FYMILVW), QXPF, QXX(FY), PQ(QL)P(FY)P. Por ejemplo, la secuencia PQ(QL)P(FY) P facilita la desamidación de la Q subrayada en la posición 2 por transglutaminasa.
60 En particular, se prefieren agentes que comprendan la versión desamidada de la SEQ ID NO: 200 (en donde tales secuencias no están ya desamidadas). Lo más preferiblemente, los agentes de la invención comprenden la versión desamidada con transglutaminasa de la SEQ ID NO: 200 (de nuevo, donde no está ya desamidada). Los análogos de estos agentes, como se define en el presente documento, también están incluidos dentro del alcance de la
65 invención.
Ejemplos (Ejemplos de referencia excepto en tanto que están relacionados con el agente de la presente invención)
– La invención se ilustra por los siguientes Ejemplos no limitantes:
Biblioteca de cribado de epítopo de gliadina inicial
En los experimentos iniciales que implican 29 individuos HLA-DQ2+ con enfermedad celiaca en dieta libre de gluten a largo plazo, se usaron ensayos ELISPOT de interferón gamma para investigar un Pepset previo (descrito en el documento WO 03/104273) inicialmente como conjuntos de péptidos y a continuación en 15 sujetos como péptidos individuales con y sin desamidación por tTG. Esta biblioteca de Pepset consistía en 652 péptidos de gliadina 20mero que abarcaban todos los 12meros únicos contenidos dentro de todas las entradas de Genbank descritas como gliadinas de trigo encontradas en septiembre de 2001. Esta biblioteca de Pepset se diseñó “manualmente” a partir de secuencias de proteína derivadas de gen alineadas usando el programa informático ClustaIW (MegAlign) ordenado en grupos filogenéticos.
15 Aproximadamente se proporcionaron 0,6 micromoles de cada uno de los 652 de los 20meros. Dos péptidos 20meros marcadores se incluyeron en cada conjunto de 96 (VLQQHNIAHGSSQVLQESTY -péptido 161, y IKDFHVYFRESRDALWKGPG) y se caracterizaron por HPLC de fase inversa y análisis de secuencia de aminoácidos. Las purezas promedio de estos péptidos marcadores eran de 19 % y 50 %, respectivamente. Los péptidos se disolvieron inicialmente en acetonitrilo (10 %) y Hepes 100 mM a 10 mg/ml. La concentración final de los péptidos individuales incubados con CMSP para los ensayos ELISpot de IFN-γ eran de 20 µ/ml. Estos péptidos se desamidaron por incubación con tTG tisular de conejillo de indias (Sigma T5398) en la relación de 100:32 µg/ml durante dos horas a 37 ºC. Las soluciones peptídicas se almacenaron a -20 ºC y eran recién descongeladas antes de usar. Estos estudios se llevaron a cabo en Oxford, UK. Los ensayos ELISpot se realizaron como se describe para los llevados a cabo en Melbourne, Australia (todos los otros estudios descritos en el presente documento). Los datos
25 de “Oxford” en relación con las respuestas del sujeto a péptidos individuales se agruparon con los datos de “Melbourne” para posterior análisis de epítopo “mínimo” en el “algoritmo EM” (véase más adelante).
Biblioteca de cribado de epítopo de gliadina de la segunda ronda
Se diseñó una biblioteca de epítopo de gliadina de segunda ronda según las secuencias bioactivas identificadas a partir de la biblioteca de cribado de epítopo de gliadina inicial de 652 20meros. Se definieron los 20meros de gliadina con bioactividad media equivalente a >5 % del 20mero de gliadina más potente (91: PQPFPPQLPYPQPQLPYPQP) en 15 sujetos HLA-DQ2+ evaluados con todos los 652 20meros desamidados. Puesto que los estudios anteriores (véase el documento WO 03/104273) indicaron que conjuntos desamidados de este Pepset eran más potentes que
35 sin desamidación, se identificaron los residuos de glutamina dentro de los 20meros bioactivos potencialmente desamidados por tTG según el motivo QXPX, QXZ (FYWILVM) en el que X es cualquier aminoácido excepto prolina, y P es prolina, Z es cualquier aminoácido, y FYWILVM representa aminoácidos hidrófobos (coherentes con los motivos para desamidación mediada por tTG publicados por Vader W. y col. J. Exp. Med. 2002 J. Exp. Med. 195:643-649, PCT WO 03/066079, y Fleckenstein B. 2002. J. Biol. Chem. 277:34109-16).
A continuación, se identificaron péptidos 12mero en los cuales cada sitio de desamidación potencial podría estar en la posición 4, 6 o 7 en el 9mero localizado dentro de la ranura de unión de HLA-DQ2 (anclajes de HLA-DQ2 en estas posiciones muestran una preferencia para glutamato). A continuación, se flaquean las secuencias de epitopo núcleo 12mero candidatas con glicina seguido del residuo N terminal presente en el polipéptido de gliadina madre y en el C
45 terminal por el residuo C terminal presente en el polipéptido de gliadina madre seguido por glicina (es decir, GXXXXXXXQXXXXXXG).
Se sintetizaron péptidos con glutamina o glutamato en la posición 9. A continuación, se evaluaron los péptidos (100 µg/ml) (+/-desamidación por tTG) en ensayos ELISPOT de interferón gamma usando CMSP de 15 voluntarios celiacos HLA-DQ2+ después de exposición a gluten. Se analizaron resultados de estos ensayos según el algoritmo EM (véase más adelante). Además, se sintetizaron los distintos péptidos más potentes y se purificaron a >80 % (Mimotopos) y se evaluaron en ensayos ELISPOT de interferón gamma usando CMSP de 15 voluntarios celiacos HLA-DQ2+ después de exposición a gluten de trigo.
Para hacer práctico el diseño de una biblioteca de péptido sustancialmente mayor que abarque todas las proteínas similares a gliadina y glutenina de trigo, gluten de centeno, cebada y avena (prolaminas), y para confirmar los datos de la biblioteca de péptidos de gliadina previa, se desarrolló un algoritmo iterativo para automatizar el diseño de un conjunto mínimo de 20meros que incluían todos los 12meros únicos (excluyendo las secuencias peptídicas señal) en proteínas de gluten. El algoritmo ScanSet se muestra en la Figura 1.
El método ensaya si todos los epítopos peptídicos posibles de un grupo de proteínas son antígenos potenciales en un intervalo de pacientes. Los epítopos de linfocito T oscilan en tamaño entre 9 y 15 AA. Ensayar todos los posibles 65 12meros en un conjunto de proteínas, llega a ser rápidamente inviable debido a los altos números.
En el presente documento usamos el hecho de que, por ejemplo, un péptido 20mero puede cubrir hasta 9 12meros diferentes. Por lo tanto, desarrollamos un planteamiento combinatorio para cubrir todos los 12meros posibles representados en una familia de proteínas.
5 Se generan péptidos largos de 20 aminoácidos (20mero) que se ensayan como antígenos, y que cubren todas las secuencias de péptido 12mero que existen en el grupo de proteínas. Definimos la longitud de péptidos para generar como L (por ejemplo, 20) y la longitud de los epítopos que queremos cubrir como S. Desarrollamos un programa informático que genera todos los Lmeros que se dan excepcionalmente de un conjunto de proteínas. Además, generamos todos los Smeros que se dan excepcionalmente a partir de este conjunto de proteínas. A continuación, seleccionamos un conjunto de N Lmeros que contiene todas las secuencias de Lmeros. La Figura 1 perfila cómo funciona este algoritmo.
El 16 de junio de 2003, los números de acceso contenidos en Genbank para 53 gliadinas alfa/beta, 53 gama y 2 omega, y 77 gluteninas BPM y 55 APM de T. aestivum, 59 hordeínas, 14 secalinas y 20 aveninas (véase la Figura
15 2). En total, ScanSet identificó 18117 12meros únicos contenidos en los 225 productos génicos de gluten.
Todos los 12meros de gluten únicos se podrían subsumir en 2922 20meros. Estos 20meros se sintetizaron en una biblioteca de péptidos Pepset (Mimotopes Inc., Melbourne, Australia). Se sintetizaron péptidos de Pepset en lotes de 96 (Mimotopes Inc., Melbourne Australia). Se proporcionó aproximadamente 0,7 a 1,3 micromoles de cada uno de los 2922 20meros. Se incluyeron dos péptidos 20mero marcadores en cada conjunto de 96 (un péptido representativo de los otros 94 péptidos sobre cada placa particular, y IKDFHVYFRESRDALWKGPG) y se caracterizaron por HPLC de fase inversa y espectroscopía de masas. Purezas promedio de estos péptidos marcadores eran de 36 % (intervalo: 5 a 68 %) y 64 % (intervalo: 55 a 71 %), respectivamente.
25 Los péptidos se disolvieron inicialmente en acetonitrilo acuoso (50 %). Los péptidos en acetonitrilo acuoso se transfirieron a placas de 96 pocillos estériles y se diluyeron en PBS estéril con calcio 1 mM (250 µg/ml) y, a continuación, se incubaron con tTG (25 µg/ml) (Sigma T5398) durante 6 horas 37 ºC y, a continuación, se almacenaron congelados (-20 ºC) hasta su uso.
Todos los sujetos tenían enfermedad celiaca comprobada por biopsia y habían seguido una dieta libre de gluten estricta durante al menos 6 meses. Todos los sujetos poseían HLA-DQB01*02 (HLA-DQ2) solo (n=100) o HLADQA1*03 y HLA-DQB1*0302 (HLA-DQ8) solo (n=5). En todos los casos, se evaluó tTG-IgA antes de la exposición a gluten y estaba en el intervalo normal (se encontró que el 30 % de los voluntarios iniciales tenían tTG-IgA elevada y se excluyeron puesto que la exposición a gluten crónica está asociada a fracaso en inducir linfocitos T específicos a
35 gluten en sangre periférica por exposición a gluten limitada). Los voluntarios consumieron “white bread block loaf” de Baker’s Delight (200 g diarios durante tres días) o avena de Uncle Tobys (100 g diarios durante tres días). Todos menos tres sujetos completaron la exposición de tres días (un retirado después del primer bocado de pan, y los otros dos vomitaron después de dos rebanadas de pan. Los datos de los dos últimos se incluyeron en el análisis posterior). Se sacó sangre (300 ml) seis días después de comenzar la exposición a gluten. En nuestros estudios previos no se han encontrado respuestas de ELISpot de IFN-γ específicas a péptido de gluten, y por tanto no se evaluó la sangre “pre-exposición” en este conjunto de experimentos (Anderson, R.P. y col. 2000. Nat. Med. 6:337342., los documentos WO 01/25793, WO 03/104273).
Se realizaron ensayos ELISpot de IFN-γ (Mabtech, Suecia) en placas de 96 pocillos (MAIP S-45, Millipore) en las
45 que cada pocillo contenía 20 µl de solución peptídica y 100 µl de CMSP (2-8x105/pocillo) en RPMI que contenía 10 % de suero AB humano inactivado por calor. Después del desarrollo y el secado, se evaluaron las placas de ELISpot de IFN-γ usando el contador de placa de ELISpot automatizado MAIP. A continuación, se analizaron los datos según un algoritmo novedoso (Expectación-Maximización: EM) para definir y cuantificar respuestas del interferón gamma a secuencias de 9mero contenidas dentro de la biblioteca de péptidos (véase la Figura 3 y más adelante). A continuación, se racionalizaron péptidos 9mero según un algoritmo que asume la redundancia en el reconocimiento de linfocito T, el algoritmo “IterativeCluster” (véase la Figura 4 y más adelante), dejando grupos de aminoácidos con propiedades químicas similares en una posición cualquiera en el 9mero, o para glutamato para reemplazar glutamina en cualquier posición (asumiendo que puede haber ocurrido desamidación).
55 Puesto que había conjuntos de datos de solamente dos individuos HLA-DQ8+ que no eran también HLA-DQ2+, y estos estaban utilizando solamente los 721 20meros de gliadina de trigo de la “biblioteca de cribado de epítopo de gluten completa”, se identificaron péptidos bioactivos tomando el rango promedio de respuestas de ELISPOT de IFN-γ específica a péptido en los dos sujetos. Para la predicción de probables epítopos de gliadina restringidos a HLA-DQ8, se asumió que un residuo de glutamina susceptible a desamidación mediada por tTG ocupaba o bien la posición 1 o 9 en las regiones núcleo de 9mero potenciales de epítopos, coherentes con el motivo de unión a HLA-DQ8 y los descubrimientos de van de Wal y col. (van de Wal, Y. y col 1998. J. Immunol. 161 (4):1.585-1.588).
El algoritmo expectación-maximización (EM) para analizar los datos de ELISpot:
65 La Figura 3 muestra un algoritmo para analizar datos que vienen de un ensayo que usa el ELISpot. Las respuestas de linfocito T a diferentes péptidos se miden en placas de 96 pocillos usando ensayos de linfocito T. Los ensayos se
realizaron sobre muchos pacientes usando muchos antígenos peptídicos diferentes. El resultado de los ensayos de linfocito T se pueden resumir en una tabla en la que las filas representan péptidos y las columnas pacientes y las mediciones individuales (recuentos) están en la tabla (por ejemplo, véase la Figura 3B). El propósito del algoritmo EM es diferenciar entre respuesta y no respuesta de un paciente a un péptido y estimar un índice medio de
5 respuesta y una proporción de personas que responden a cada péptido.
Las respuestas se midieron para un número de diferentes pacientes (i se usará para indicar el paciente) y para muchos péptidos diferentes (j se usará para indicar el péptido). Cada medición (yij) representa un recuento de linfocitos T del paciente i que responde al péptido j. Para estimar, si una medición para un cierto péptido en un paciente se puede llamar una respuesta o si es más probable que venga de una distribución de fondo, proponemos un modelo para un problema de datos incompletos, siendo yij el recuento observado de manchas y zij un indicador no observado, si la persona i responde al péptido j.
El número observado de recuentos yij se modeliza para venir de distribuciones de Poisson independientes: poisson
15 (αi,λj), si el paciente i está respondiendo al péptido j, es decir, zij=1, y poisson (αi,λ0), si el paciente i no está respondiendo al péptido j, es decir, zij=0.
- •
- Datos completos yij (recuentos observados), zij (indicador de respuesta, no observado).
- •
- Parámetros: θ=(αi,λj,λ0,pj)
- •
- αi: capacidad de respuesta total del paciente.
- •
- λj: tasa de respuesta inducida por péptido.
- •
- λ0: tasa de respuesta de fondo.
- •
- pj: proporción de personas que responden al péptido j.
Algoritmo EM:
- •
- Variables de conjunto inicialmente a valores aleatorios
- •
- Etapa E: calcular probabilidad
- •
- Etapa M: maximizar función de probabilidad
- •
- Iterar Etapa E y M
Procedimiento iterativo para encontrar el conjunto mínimo de epítopos que responden
35 Se desarrolló un programa para calcular un conjunto mínimo de péptidos para su uso en una vacuna basada en las respuestas de linfocito T estimadas en el algoritmo EM. Medimos las respuestas del linfocito T a Lmeros de un grupo de proteínas. Los péptidos se generaron para cubrir todos los posibles Smeros. Estimamos los siguientes parámetros para la respuesta por un algoritmo EM: tasa de respuesta, número de personas que responden, proporción de personas que responden. La proporción de personas que responden multiplicadas por la tasa estimada de respuesta se usa como criterio para definir los epítopos que son buenos antígenos. Muchos de los Lmeros medidos contienen los mismos epítopos Smero. Para encontrar los epítopos (Smeros) que pueden explicar todas las respuestas en Lmeros seleccionamos el Smero que está contenido en Lmeros que en la media tienen las respuestas más altas. A continuación, separamos todos los Lmeros que contienen este Smero de nuestras mediciones. Luego, seleccionamos el Smero con las respuestas más altas en los Lmeros restantes. Iteramos este
45 procedimiento hasta que no existan Smeros con respuestas mayores de un límite especificado. Usamos varias iteraciones con diferentes límites. Este proceso se esboza en la Figura 4. Dicha lista definida de Lmeros agrupados se puede usar como base para definir los epítopos óptimos y seleccionar péptidos que funcionan como antígenos buenos.
Epítopos de HLA-DQ2 en gluten de trigo
Se identificaron epítopos de HLA-DQ2 en gliadinas de trigo y gluteninas usando CMSP recogida el día 6 después de comenzar la exposición a gluten en un total de 76 individuos HLA-DQ2+ en ensayos ELISPOT de interferón gamma (biblioteca de epítopo de gliadina inicial: n=15, biblioteca de cribado de epítopo de gliadina de la segunda ronda:
55 n=15, biblioteca de cribado de epítopo de gluten completa: n=46). Todos los datos relacionados con respuestas peptídicas individuales en sujetos celiacos se agruparon y analizaron por el algoritmo EM.
Se identificaron una serie de secuencias de 9mero y se ordenaron según la intensidad de las respuestas de gamma interferón y la proporción de individuos que responden (véase la Figura 5). Muchas de las secuencias identificadas se podrían agrupar en “superfamilias” que permiten que varios aminoácidos diferentes con propiedades químicas similares se presenten en una posición cualquiera en el epítopo putativo (véase la Figura 6). Por ejemplo, en la “Secuencia 1” de la Figura 6 (SEQ ID NO: 1555) P(QR)P(QE)LP(FY)PQ, glutamina (Q) o arginina (R) ambas son aceptadas en la posición 2 excepto que Q genera un epítopo sustancialmente más bioactivo.
Revisando las 110 secuencias de 9mero más “activas” identificadas por el algoritmo EM, la “lista” de motivos 9mero se podría abreviar en 41 9meros, muchos de los cuales solapados (por ejemplo, “Secuencia 1” y “2” (SEQ ID NO: 1555 y 1558 respectivamente) se solapan por 7 residuos y ambas están presentes en la A-gliadina 57-73 QE65). En casos seleccionados, se sintetizaron péptidos de alta calidad y se confirmó la bioactividad de los péptidos
5 identificados por el algoritmo EM (véase la Figura 7).
Epítopos de HLA-DQ2 en aveninas de avena
Se evaluaron péptidos de avenina después de la exposición a avena (n=30 sujetos) o después de pan de trigo (n=8) en sujetos celiacos HLA-DQ2+. Se encontraron respuestas de ELISPOT para los péptidos encontrados en la Figura
8. Uno de los péptidos de avenina reactivos era homólogo a una secuencia en gluten de trigo (SEQ ID NO: 1590).
Estudios de péptido de alta calidad de avena (avenina)
15 Se evaluaron péptidos de avenina de alta calidad 3 días después de completar la exposición a avena con avena libre de trigo pura, 100 g/d durante 3 días (respuestas de ELISPOT de interferón gamma de CMSP “día 6”). Estos péptidos se diseñaron sobre péptidos previamente definidos usando la biblioteca de péptidos de avenina de grado de cribado (“primera ronda”) y sobre sitios de desamidación potenciales. Había 25 péptidos (como 16meros) con pureza verificada por HPLC como >80 %, y las secuencias confirmadas por espectroscopía de masas.
Las respuestas de ELISPOT de interferón gamma a los péptidos de avenina de alta calidad seguido de desamidación por tTG se compararon en 18 sujetos con enfermedad celiaca DQ2+.
Los péptidos dominantes (>70 % de respuesta máxima) después de exposición a avena incluían:
25 EQQFGQNIFSGFSVQL (SEQ ID NO: 1764) (11/18 sujetos), QLRCPAIHSVVQAIIL (SEQ ID NO: 1765) (4/18 sujetos), y QYQPYPEQEQPILQQQ (SEQ ID NO: 1766) (3/18 sujetos). 2/18 sujetos no tenían respuestas específicas a avenina (definido por SFU (unidades formadoras de mancha) >3xblanco) y SFU máximo medio de 6/18 sujetos era menos de 10. Dos péptidos adicionales provocaron respuestas positivas: QIPEQLRCPAIHSVVQ (SEQ ID NO: 1767) (3/18 sujetos) y EQYQPEQQPFMQPL (SEQ ID NO: 1768) (>40 % de respuesta peptídica máxima en 5/18 sujetos). El panel de 25 péptidos incluía varios péptidos similares al péptido 1490 (SEQYQPYPEQQEPFVQ) publicado en Arentz-Hansen, PLoS Medicine (oct. 2004, vol. 1, artículo 1 (84-92), sin embargo, ese péptido indujo una fuerte respuesta positiva en solamente un sujeto, y respuesta más débil en 5 sujetos.
Las respuestas de ELISPOT de interferón gamma a péptidos de avenina de alta calidad estaban ausentes antes de
35 la exposición a gluten y se bloquearon por pretratamiento de CMSP con anticuerpo anti-HLA DQ pero no anti-HLA DR.
Bibliotecas de péptidos de cribado de centeno y cebada
Se evaluaron bibliotecas de péptidos de la primera ronda 20 mero de hordeína y secalina 3 días después de completar la exposición a centeno (pan, 100 g/d durante 3 días) o cebada (hervida, 100 g/d durante 3 días) (respuestas de ELISPOT de interferón gamma de CMSP “6 días”). Aunque el análisis iterativo que usa las bibliotecas de péptidos de la 2º y 3ª ronda para definir epítopos no se ha realizado aún, los 20meros pretratados con tTG encontrados para inducir respuestas “potentes” compartían considerable similitud estructural con los péptidos
45 bioactivos identificados después de la exposición a trigo. Sin embargo, las secuencias peptídicas dominantes después de exposición a centeno o cebada no incluían péptidos con la secuencia PQPQLPY que se encontró que es dominante después de la exposición a trigo. El 20mero dominante (>70 % de respuesta máxima) después de la exposición a centeno era normalmente PQQLFPLPQQPFPQPQQPFP (SEQ ID NO: 1769) (8/14 sujetos), u ocasionalmente QPFPQPQQPTPIQPQQPFPQ (SEQ ID NO: 1770) (4/14), QQPQQLFPQTQQSSPQQPQQ (SEQ ID NO: 1771) (1/14), PQTQQPQQPFPQPQQPQQLF (SEQ ID NO: 1772) (1/14) y/o QEQREGVQILLPQSHQQLVG (SEQ ID NO: 1773) (1/14). Péptidos adicionales indicados para más del 40 % de respuesta máxima en al menos 1 sujeto incluyen:
FPQQPQQPFPQPQQQLPLQP (SEQ ID NO: 1774) (3/14, 2 > 70 %)
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
65 SPQQPQLPFPQPQQPFVVVV (SEQ ID NO: 1785) (4/14, 1 > 70 %) QQPSIQLSLQQQLNPCKNVL (SEQ ID NO: 1786) (1/14, 1 > 70 %)
Generalmente, los péptidos dominantes después de la exposición a cebada incluían uno de seis motivos peptídicos,
o eran uno de otros ocho 20meros individuales “dominantes” en solamente uno de los 17 sujetos después de la exposición a cebada. Los seis motivos identificados:
5 QQPIPQQPQPY (SEQ ID NO: 1787)
PFPQPQQPFPW (SEQ ID NO: 1788)
LQPQQPFPQ (SEQ ID NO: 1789)
PQPQQASPL (SEQ ID NO: 1790)
IIPQQPQQPF (SEQ ID NO: 1791)
YPEQPQQPF (SEQ ID NO: 1792)
Los péptidos de hordeína de cebada que muestran al menos 40 % de respuesta peptídica máxima en al menos un sujeto incluyen los siguientes, en los que un asterisco indica los ochos péptidos individuales que muestran la respuesta máxima en un único individuo:
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
35 FPQYQIPTPLQPQQPFPQQP (SEQ ID NO: 1812) (2/17, 1 > 70 %) FPLQPQQPFPQQPQQPFPQQ (SEQ ID NO: 1813) (1/17, 0 > 70 %) QQPFPLQPQQPFPQPQPFPQ (SEQ ID NO: 1814) (1/17, 0 > 70 %) SPLQPQQPFPQGSEQIIPQQ (SEQ ID NO: 1815) (1/17, 0 > 70 %) PQQASPLQPQPQQASPLQPQ (SEQ ID NO: 1816) (1/17, 1 > 70 %) PQQPPFWPQQPFPQQPPFGL (SEQ ID NO: 1817) (1/17, 1 > 70 %)* PVLSQQQPCTQDQTPLLQEQ (SEQ ID NO: 1818) (1/17, 1 > 70 %) RQLPKYIIPQQPQQPFLLQP (SEQ IDNO: 1819) (1/17, 1 > 70 %) QGSEQIIPQQPQQPFPLQPH (SEQ ID NO: 1820) (7/17, 3 > 70 %)* PQGSEQIIPQQPFPLQPQPF (SEQ ID NO: 1821) (2/17, 1 > 70 %)
45 QPFPTPQQFFPYLPQQTFPP (SEQ ID NO: 1822) (4/17, 1 > 70 %) PFPQPPQQKYPEQPQQPFPW (SEQ ID NO: 1823) (1/17, 1 > 70 %) QKYPEQPQQPFPWQQPTIQL (SEQ ID NO: 1824) (1/17, 1 > 70 %) FQQPQQSYPVQPQQPFPQPQ (SEQ ID NO: 1825) (3/17, 1 > 70 %) QIPYVHPSILQQLNPCKVFL (SEQ ID NO: 1826) (1/17, 1 > 70 %) LAAQLPAMCRLEGGGGLLAS (SEQ ID NO: 1827) (1/17, 1 > 70 %) PYLPEELSPQYQIPTPLQPQ (SEQ ID NO: 1828) (1/17, 1 > 70 %)* VSPHPGQQTTVSPHQGQQTT (SEQ ID NO: 1829) (1/17, 1 > 70 %)*
Bibliotecas de péptidos de glutenina y gliadina de trigo de la segunda y tercera ronda
55 La biblioteca de gliadina y glutenina de trigo de la segunda ronda se diseñó sobre las secuencias de péptidos de gliadina y glutenina de trigo 20mero que inducían al menos 5 % de la respuesta (ELISPOT de interferón gamma) estimulada por el péptido 20mero pretratado (enzimáticamente desamidado) por transglutaminasa (tTG) más activo en cualquier sujeto. Se evaluaron todos los péptidos 16mero de la 2º ronda en al menos 18 sujetos. La biblioteca de la 2º ronda generada a partir de la biblioteca de 20mero de gliadina de “Oxford” se había evaluado en diez sujetos – estos datos se mezclaron con los datos generados a partir de los 18 sujetos usados para evaluar la nueva biblioteca de gliadina/glutenina de la 2º ronda (ampliada). Por lo tanto, se evaluaron péptidos 16mero individuales pretratados con transglutaminasa en o bien 18 (novedosas secuencias de gliadina/glutenina basadas en la biblioteca de 20mero de “Melbourne”) o 28 sujetos (secuencias de gliadina basadas en la biblioteca de 20mero de “Oxford”). Todos los
65 16meros identificados para la biblioteca de Oxford de la segunda ronda también cumplieron los criterios de selección para la biblioteca de la segunda ronda de Melbourne.
Los datos de la biblioteca de péptidos de la segunda ronda se analizaron según la “dominancia” de respuestas peptídicas en el ELISPOT de interferón gamma en sujetos individuales, es decir, el porcentaje de respuesta de una CMSP del individuo a un péptido específico normalizado frente a esa respuesta inducida por péptido máxima del individuo. Las secuencias de los péptidos que estimularon al menos el 40 % de la respuesta específica a péptido
5 máxima en al menos un sujeto se muestran en la Tabla 1 de a continuación. El conjunto de datos apoya la consistencia y la “dominancia” de los péptidos que se ajustan a las secuencias identificas usando la primera biblioteca de péptido 20mero de la primera ronda usando el algoritmo Expectación-Maximización (EM) anteriormente descrito.
10 Tabla 1: Péptidos confirmados en la biblioteca de la segunda ronda como al menos el 40 % tan activos como el péptido con la actividad máxima en un sujeto cualquiera: clasificados según la potencia de la familia de péptido
- Péptido
- SEQ ID NO: >70 % 40-70 % 10-40 % <10 %
- G-QLPYPQPQLPYPQP-G
- 1830 18/28 4/28 3/28 3/28
- G-LQPFPQPQLPYPQP-G
- 1831 14/28 8/28 Nada 6/28
- G-LQPFPQPQLPFPQP-G
- 1832 4/28 8/28 5/28 10/28
- G-LQPFPQPQLPYLQP-G
- 1833 1/28 1/28 12/28 14/28
- G-LQPFPQPQLPYSQP-G
- 1834 2/28 3/28 12/28 11/28
- G-LQPFPQPQLSYSQP-G
- 1835 Nada 1/28 2/28 25/28
- G-QQPFPQPQQPFPWQ-G
- 1837 9/28 8/28 5/28 6/28
- G-QQPFPQPQQPIPVQ-G
- 1838 8/28 5/28 7/28 8/28
- G-QQPFPQPQQPFSQQ-G
- 1839 4/28 7/28 8/28 9/28
- G-QQPFPQPQQPFCQQ-G
- 1840 2/28 2/28 13/28 11/28
- G-GLERPWQQQPLPPQ-G
- 1841 2/18 1/18 Nada 15/18
- G-QTFPHQPQQAFPQP-G
- 1842 1/28 2/28 Nada 25/28
- LQQQCSPVAMPQRLAR
- 1843 1/28 1/28 11/28 15/28
- QGQQGYYPISPQQSGQ
- 1844 1/18 1/18 1/18 15/18
- PGQGQSGYYPTSPQQS
- 1845 1/18 1/18 Nada 16/18
- QGQPGYYPTSPQQIGQ
- 1846 1/18 1/18 1/18 15/18
- GQGQSGYYPTSPQQSG
- 1847 1/18 Nada 2/18 15/18
- QQGYYPTSPQQSGQGQ
- 1848 Nada 1/18 Nada 17/
- QGQQGYYPTSPQQPPQ
- 1849 Nada 1/18 Nada Nada
- QQGYYPISPQQLGQGQ
- 1850 Nada 1/18 Nada Nada
- YVPPDCSTINVPYANI
- 1851 1/18 1/18 1/18 15/18
- IIMQQEQQEQRQGVQI
- 1852 1/28 Nada 8/28 19/28
- VAHAIIMHQQQQQQQE
- 1853 Nada 1/28 2/28 25/28
- G-QPIPQQPQQPFPLQ-G
- 1854 1/28 Nada 5/28
- G-FPQLQQPQQPFPQQ-G
- 1855 1/28 Nada 1/28 26/28
- G-FPQTQQPQQPFPQQ-G
- 1856 Nada 1/28 2/28 25/28
- G-QPLSQQPQQTFPQQ-G
- 1857 Nada 1/28 Nada 27/28
- G-QQPQQQPQQPFPQQ-G
- 1858 Nada 1/28 5/28 22/28
- G-FPQPQQPQQPFPQQ-G
- 1859 Nada 1/28 3/28 25/28
- G-FPQPQQPQQSFPQQ-G
- 1860 Nada 1/28 1/28 26/28
- G-QPQQTFPQQPQLPF-G
- 1861 1/18 Nada 2/18 15/18
- G-MQVDPSGQVQWPQQ-G
- 1862 1/18 Nada Nada 17/18
- G-IQVDPSGQVQWPQQ-G
- 1863 1/18 Nada Nada 17/18
- G-MQADPSGQVQWPQQ-G
- 1864 1/18 Nada Nada 17/18
- G-MQVDPSSQVQWPQQ-G
- 1865 1/18 Nada Nada 17/18
- G-QQEQQILQQILQQQ-G
- 1866 1/18 Nada Nada 17/18
- VPLYRTTTSVPFGVGT
- 1867 1/18 Nada Nada 17/18
- LQTLPSMCNVYIPPYC
- 1868 1/18 Nada Nada 17/18
- LALQTLPAMCNVYIPP
- 1869 1/18 Nada Nada 17/18
- DAIRAIIYSIVLQEQQ
- 1870 1/18 Nada Nada 17/18
- G-QQQFSQPQQQFPQP-G
- 1871 Nada 5/28 7/28 16/28
- G-FFPQPQQQFPQPQQ-G
- 1872 Nada 1/28 10/28 17/28
- G-FPQQPQQQFPQPQQ-G
- 1873 Nada 1/28 Nada 27/28
- G-QQPFPQPQQQFPQP-G
- 1874 Nada 1/28 12/28 15/28
- G-QPQPFLPQLPYPQP-G
- 1875 Nada 4/28 9/28 15/28
- G-QQPFPQPQQQLPQP-G
- 1876 Nada 3/28 6/28 19/28
- G-LPFPQQPQQPLPQP-G
- 1877 Nada 2/18 4/18 12/18
- G-QQAFPQPQQTFPHQ-G
- 1878 Nada 3/28 8/28 17/28
- G-QQPFTQPQQPTPIQ-G
- 1879 Nada 1/28 4/28 23/28
- G-QQIFPQPQQTFPHQ-G
- 1880 Nada 1/28 10/28 17/28
- G-QQQFIQPQQPFPQQ-G
- 1881 Nada 2/28 11/28 15/28
(Continuación)
- Péptido
- SEQ ID NO: >70 % 40-70 % 10-40 % <10 %
- G-QPFPLQPQQPFPQQ-G
- 1882 Nada 2/28 7/28 19/28
- G-QPFPWQPQQPFPQQ-G
- 1883 Nada 2/28 8/28 18/28
- G-QPTPIQPQQPFPQQ-G
- 1884 Nada 2/28 5/28 21/28
- G-QVSFQQPQQQYPSP-G
- 1885 Nada 2/28 4/28 22/28
- G-FFQQPQQQYPSSQQ-G
- 1886 Nada 1/28 1/28 26/28
- G-GKSQVLQQSTYQLL-G
- 1887 Nada 2/18 1/18 15/18
- GQVVNNHGQTVFNDIG
- 1888 Nada 1/18 4/18
- G-QPQLPFPQQPQQQF-G
- 1889 Nada 1/28 2/28 25/28
- G-QPFPQPQQAQLPFP-G
- 1890 Nada 1/28 2/28 25/28
- G-HQQPGQRQQGYYPT-G
- 1891 Nada 1/18 1/18 16/18
- G-HQQFPQQQIPWQP-G
- 1892 Nada 1/18 1/18 16/18
- LEAVTSIALRTLPTMC
- 1893 Nada 1/18 1/18
- G-QQPQFSQQQQIPVI-G
- 1894 Nada 1/18 Nada 17/18
La biblioteca de péptidos de la tercera ronda consistía en 74 péptidos basados en secuencias estructuralmente
5 distintas en la biblioteca de la segunda ronda encontrada que induce al menos 10 % de la respuesta máxima a cualquier péptido en cualquier sujeto. Estos péptidos corresponden a secuencias de tipo natural (no desamidadas) virtualmente idénticas a las usadas en la biblioteca de la segunda ronda. La distinta característica de esta biblioteca era que consistía en péptidos con pureza verificada por HPLC como >80 %, y con secuencias confirmadas por espectroscopía de masas.
10 Se compararon las respuestas de ELISPOT de interferón gamma a los péptidos de la biblioteca de la 3ª ronda después de desamidación por tTG en 14 sujetos. Una vez más, las secuencias que incluían el motivo PQPQLPY eran “dominantes” en 9/14 sujetos. Sin embargo, PFPQPQQPFPW (SEQ ID NO: 1895) estimuló >70 % de respuesta máxima en 1/14 sujetos, , PFPQQPQQPFPQ (SEQ ID NO: 1896) en 1/14, PQPFLPQLPYPQP (SEQ ID NO: 1897)
15 en 1/14, QPFPQPQQPQQP (SEQ ID NO: 1898) en 4/14 (incluyendo 3 sujetos en los que los péptidos PQPQLPY no son epítopos potentes) SGQGVSQSQQQSQQQ (SEQ ID NO: 1899) en 2/14 (incluyendo uno en el que los péptidos PQPQLPY no son potentes), QYEVIRSLVLRTLPNM (SEQ ID NO: 1900) y GLARSQMLQQSICHVG (SEQ ID NO: 1901) cada uno en un sujeto (el mismo) en el que los péptidos PQPQLPY no son epítopos potentes, RTTTSVPFGVGTGVGA (SEQ ID NO: 1902) en 1/14 sujetos y AIHTVIHSIIMQQEQQ (SEQ ID NO: 1903) en 1/14
20 sujetos.
Muchas de las secuencias ensayadas en la tercera ronda estaban estructuralmente relacionadas y las respuestas del sujeto individual estaban presentes o ausentes según el “parentesco” de ciertas secuencias, sugiriendo redundancia de péptidos reconocidos por linfocitos T específicos a gluten inducidos por exposición a gluten in vivo.
25 Las respuestas de ELISPOT de interferón gamma a los péptidos de la 3ª ronda estaban ausentes antes de la exposición a gluten, y se bloquearon por pretratamiento de CMSP con anticuerpo anti-HLA DQ pero no HLA DR.
Combitopos
30 El asunto de la redundancia de epitopo y la utilidad potencial en diagnosis y terapéutica de péptidos diseñados para combatir epítopos dominantes “únicos” se abordó comparando respuestas de ELISPOT de interferón gamma después de exposición a trigo (n=16 sujetos con enfermedad celiaca HLA DQ2), centeno (n=17) o cebada (n=13) a las secuencias: QLQPFPQPELPYPQPQL (SEQ ID NO: 1904) ("P04724E"), QPEQPFPQPEQPFPWQP (SEQ ID NO:
35 1905) ("626fEE"), y QLQPFPQPELPYPQPFPQQPEQPFPQPEQPFPWQP (SEQ ID NO: 1906) ("Combitopo"). Después de la exposición a centeno y cebada la suma de las respuestas medias de ELISPOT (unidades formadoras de mancha) a P04724E y 626fEE eran casi idénticas (99 %, y 102 %, respectivamente) a la respuesta a una concentración similar (óptima) del Combitopo. Sin embargo, después de la exposición a trigo (n=16 sujetos), la respuesta de P04724E media era 89 % de esa a Combitopo, y las respuestas de 626fEE medias eran 70 % de la
40 respuesta a Combitopo. Estos descubrimientos serían coherentes con la considerable redundancia de estas secuencias de epítopo relacionadas, P04724E y 626fEE, después de la exposición a trigo pero no después de centeno o cebada, y que combinar las secuencias de epítopo dominantes dentro de péptidos más largos no reduce su disponibilidad biológica. Por lo tanto, los combitopos derivados de epítopos potentes seleccionados pueden ser dispositivos de administración eficientes para terapéutica y diagnosis basados en epítopo de linfocito T en
45 enfermedad celiaca.
Epítopos en gluten de trigo asociado con la enfermedad celiaca HLA-DQ8+
Se identificaron epítopos en gliadinas de trigo usando CMSP después de exposición a gluten en dos individuos, un
50 homocigoto HLA-DQ8, y un heterocigoto HLA-DQ8. Las respuestas de linfocito T inducidas en otros individuos celiacos HLA-DQ8 (no DQ2) respondieron débilmente a la exposición a gluten y sus datos no permitieron análisis
detallado.
20meros desamidados que incluían la secuencia núcleo: QGSFQPSQQ (SEQ ID NO: 1907), correspondientes al epitopo conocido de gliadina alfa restringido a HLA-DQ8 (en el que Q1 y Q9 están desamidados por tTG para
5 actividad óptima), indujeron respuestas peptídicas moderadamente fuertes. Sin embargo, una serie de péptidos “núcleo” se asociaron con respuestas más potentes en 20meros derivados de gliadinas gamma y omega (véase la Figura 9). Los péptidos más potentes poseían glutamina en una secuencia que sugeriría susceptibilidad a desamidación separada por siete residuos de una segunda glutamina también susceptible a desamidación (como se encontró en QGSFQPSQQ (SEQ ID NO: 1907)) sugiriendo que estas secuencias desamidadas llegarían a ser ligantes de alta afinidad para HLA-DQ8 después de desamidación por tTG. (El motivo de unión para HLA-DQ8 favorece el glutamato en posiciones 1 y 9) Un grupo adicional de 20meros poseían residuos de glutamina susceptibles a desamidación pero no separados por siete residuos de una segunda glutamina susceptible a desamidación mediada por tTG.
Cinco sujetos con enfermedad celiaca que poseían alelos de HLA DQ2 y HLA DQ8 se sometieron a exposición a gluten de trigo. Se usaron CMSP de dos sujetos inicialmente expuestos para investigar la biblioteca de 20mero de gliadina de trigo de “Melbourne” de la primera ronda. Las secuencias de 20mero identificadas usando CMSP de estos dos sujetos HLA DQ8 CD se analizaron más por cribado, en cinco sujetos HLA DQ8+ DQ2-CD que incluían los dos sujetos originales, una biblioteca de segunda ronda basada en 20meros reactivos en la biblioteca de la 1º ronda. La biblioteca de la 2ª ronda consistía en 16meros de solapamiento de grado de cribado, y 13meros previstos para corresponder a productos de desamidación mediada por tTG de epítopos con el potencial para desamidación de glutamina en la posición 1 y/o posición 9 (coherente con el motivo de unión del péptido de HLA DQ8). Además,
25 los 1400 20meros pretratados con tTG de glutenina (APM y BPM) en la biblioteca de gluten de trigo de “Melbourne” también se investigaron en estos cinco sujetos.
Los 16meros de gliadina más potentes y consecuentemente dominantes eran las secuencias relacionadas
VYIPPYCTIAPFGIFG (SEQ ID NO: 1908) (3/5 sujetos con >70 % de respuesta máxima a 16mero de gliadina) y AMCNVYIPPYCAMAPF (SEQ ID NO: 1908) también dominante en 3/5 sujetos (4/5 sujetos producían respuestas dominantes a uno o ambos de estos péptidos). Además, se identificó una serie de péptidos derivados de 20meros bioactivos previamente identificados cuyas respuestas en el ELISPOT se aumentaban o eran permisivas a los residuos de glutamina específicos que están desamidados: (QE) QPTPIQP (QE) (SEQ ID NO: 1909), (QE) QPFPLQP (QE) (SEQ ID NO: 1910), (QE)QPIPVQP(QE) (SEQ ID NO: 1911), (QE) QPQQPFP (QE) (SEQ ID NO:
35 1912), (QE) QP (QE) LPFP (QE) (SEQ ID NO: 1913), (QE) GSFQPSQ (QE) (SEQ ID NO: 1914) (epítopo de HLA DQ8 previamente publicado, van der Wal 1998), (QE) LPFP (QE) QP (QE) (SEQ ID NO: 1915), y (QE) QPFP (QE) QP (QE) (SEQ ID NO: 1916).
El cribado de la biblioteca de 20mero de glutenina identificó una serie adicional de secuencias que eran dominantes en al menos uno de los cinco sujetos. Los péptidos 20mero dominantes compartían los motivos o tenían las secuencias: PQQQQQQLVQQQ (SEQ ID NO: 1917), QGIFLQPH (LQ) I (AS) QLEV (SEQ ID NO: 1918), QPGQGQQG(HY) Y (SEQ ID NO: 1919), QSRYEAIRAII(FY) S (SEQ ID NO: 1920), RTTTSVPFD (SEQ ID NO: 1921), QPPFWRQQP (SEQ ID NO: 1922), Q (PS) (PS) (FI) (PS) QQQQ (SEQ ID NO: 1923), (QPLR) GYYPTSPQ (SEQ ID NO: 1924) (epítopo de HLA DQ8 previamente identificado, van der Wal 2001), QGSYYPGQASPQ (SEQ ID
45 NO: 1925), GYYPTSSLQPEQGQQGYYPT (SEQ ID NO: 1926), y QGQQLAQGQQGQQPAQVQQG (SEQ ID NO: 1927). Los péptidos de glutenina se evaluaron después de pretratamiento con transglutaminasa. Por lo tanto, no se conoce el requerimiento para la desamidación para estos epítopos.
Se ha evaluado una biblioteca completa de péptidos de grado de cribado “no caracterizados” que incluyen todas las secuencias 12mero únicas codificadas por genes presentes en Genbank definidos como gluten de trigo (Triticum aestivum) (para hacer pan), centeno, cebada o avena, gliadina, glutenina, secalina, hordeína o avenina usando linfocitos T de voluntarios con enfermedad celiaca HLA DQ2+ (y en algunos casos HLA DQ8+) seis días después de comenzar la exposición a gluten in vivo. Se ha identificado un patrón relativamente coherente de jerarquía de epítopo en enfermedad celiaca HLA DQ2 que es similar a, pero no idéntico, después del consumo de otros granos 55 tóxicos en enfermedad celiaca. Los péptidos con la secuencia PQPQLPY son dominantes después de la exposición a trigo en al menos dos tercios de la enfermedad celiaca HLA DQ2+, pero otros epítopos son ocasionalmente dominantes mientras los péptidos PQPQLPY son básicamente inactivos en menos de uno de seis sujetos HLA DQ2+ con enfermedad celiaca. La contribución de los epítopos dominantes raros será mejor evaluada después del cribado de grandes números (por ejemplo, >30) de sujetos (en progreso). La jerarquía de epitopo después del consumo de centeno y cebada es similar a la de después de trigo con la excepción de que los péptidos desamidados similares a las secuencias de gliadina/hordeína/secalina PQPQQPFP o PFPQQPQQP son normalmente dominantes en vez de PQPQLPY (una secuencia única a gliadinas alfa de trigo). Los combitopos que comprenden epítopos de gluten que se solapan serial y parcialmente son tan activos o más activos que los epítopos sencillos solos y ofrecen un medio de administración eficaz de epítopos de gluten múltiples durante el
65 reconocimiento del linfocito T. Por lo tanto, tales combitopos son útiles en el diseño y administración de terapias peptídicas en enfermedad celiaca que guía epítopos de linfocito T único múltiples.
Referencias
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- Arentz-Hansen H., Korner R., Molberg O., Quarsten H., Van der Wal Y., Kooy YMC, Lundin KEA, Koning F.,
15 Roepstorff P., Sollid LM, McAdam SN. “The intestinal T cell response to alpha-gliadin in adult celiac disease is focused on a single deamidated glutamine targeted by tissue transglutaminase”. J. Exp. Med. 2000; 191:603-12.
12. Vader LW, de Ru A., van der Wal, Kooy YMC, Benckhuijsen W., Mearin ML, Drijfhout JW, van Veelen P., Koningm F. “Specificity of tissue transglutaminase explains cereal toxicity in celiac disease”. J. Exp. Med. 2002; 195:643-649.
20 13. van der Wal Y., Kooy Y., van Veelan P., Pena S., Mearin L., Papadopoulos G., Koning F. “Selective deamidation by tissue transglutaminase strongly enhances gliadin-specific T cell reactivity”. J. Immunol. 1998; 161:1585-8.
14. van der Wal Y., Kooy Y., van Veelan P., Pena S., Mearin L., Molberg O., Lundin KEA, Sollid L., Mutis T., Benckhuijsen WE, Drijfhout JW, Koning F. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1998; 95:10.050-10.054.
25 15. Vader W., Kooy Y., Van Veelen P. y col. “The gluten response in children with celiac disease is directed toward multiple gliadin and glutenin peptides”. Gastroenterology 2002, 122:1729-37
16. Arantz-Hansen H., McAdam SN, Molberg O., y col. “Celiac lesion T cells recognize epitopes that cluster in regions of gliadin rich in proline residues”. Gastroenterology 2002, 123:803-809.
Claims (29)
- REIVINDICACIONES1. Un agente seleccionado de:5 (a) un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y(b) un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud.
-
- 2.
- Un agente según la reivindicación 1 que está restringido a HLA-DQ2.
-
- 3.
- Un agente según la reivindicación 1 que está restringido a HLA-DQ8.
-
- 4.
- Un agente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es un péptido aislado de hasta 50 aminoácidos.
15 5. Un agente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 unido a (i) una molécula HLA, o (ii) un fragmento de una molécula HLA capaz de unirse a (a) o (b). -
- 6.
- Una composición farmacéutica que comprende un agente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
-
- 7.
- Una composición farmacéutica según la reivindicación 6 que comprende un péptido que está restringido a HLA-DQ2 y un segundo péptido que está restringido a HLA-DQ8.
- 8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6 en la que el péptido comprende un epítopo de trigo. 25
-
- 9.
- Una composición farmacéutica según la reivindicación 6 en la que el péptido comprende un epítopo de avena.
-
- 10.
- Una composición farmacéutica según la reivindicación 6 que comprende un péptido que comprende un epítopo de trigo y un péptido que comprende un epítopo de avena.
-
- 11.
- Una composición para su uso en un método de prevención o tratamiento de la enfermedad celiaca que comprende al menos un agente seleccionado de:
(a) un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y35 (b) un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud. -
- 12.
- Una composición para su uso según la reivindicación 11, comprendiendo dicho método la inducción de inmunotolerancia de un individuo a una proteína de gluten para suprimir la producción de una respuesta de linfocito T o de anticuerpo a un agente como se define en la reivindicación 11.
-
- 13.
- Un agente seleccionado de:
(a) un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y45 (b) un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud; y(c) un análogo de (a) que es un péptido aislado que se une a un anticuerpo, dicho anticuerpo se une a un epítopo que comprende la SEQ ID NO: 200.para su uso en un método de tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca en un individuo por inducción de inmunotolerancia del individuo para prevenir la producción de tal anticuerpo. - 14. Un método de diagnóstico de la enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo quecomprende: 55
- (a)
- poner en contacto una muestra del hospedador, in vitro, con al menos un agente seleccionado de:
- (i)
- un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y
- (ii)
- un análogo de (i) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce (i) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud; y
- (b)
- determinar in vitro si los linfocitos T en la muestra reconocen el agente; indicando el reconocimiento por los linfocitos T que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca.
65 15. Una composición, para su uso en un método de diagnóstico de la enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo que comprende un agente seleccionado de- (a)
- un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y
- (b)
- un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud,
5 comprendiendo dicho método la determinación de si los linfocitos T del individuo reconocen el agente, indicando el reconocimiento por los linfocitos T que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca; -
- 16.
- Un método según la reivindicación 14 en el que el agente comprende (i) o (ii) unido a (a) una molécula HLA, o (b) un fragmento de una molécula HLA capaz de unirse a (i) o (ii).
-
- 17.
- Un método según la reivindicación 16 en el que la molécula HLA o fragmento es un complejo que comprende cuatro moléculas de HLA o fragmentos de moléculas de HLA.
-
- 18.
- Una composición para su uso según la reivindicación 15 en la que el método comprende administrar el agente a
15 la piel de un individuo y detectar la presencia de inflamación en el sitio de administración, indicando la detección de la inflamación que los linfocitos T del individuo reconocen el agente. -
- 19.
- Un método según la reivindicación 14 en el que la muestra es muestra de sangre.
-
- 20.
- Un método según la reivindicación 19 en el que los linfocitos T no se vuelven a estimular de una manera específica a antígeno in vitro antes de dicha determinación.
-
- 21.
- Un método según la reivindicación 20 en el que el reconocimiento del agente por los linfocitos T se determina
detectando la secreción de una citoquina de los linfocitos T. 25 -
- 22.
- Un método según la reivindicación 21 en el que la citoquina es IPN-γ.
-
- 23.
- Un método según la reivindicación 21 o reivindicación 22 en el que la citoquina se detecta permitiendo que la citoquina se una a un anticuerpo inmovilizado específico a la citoquina y, a continuación, detectando la presencia del complejo anticuerpo/citoquina.
-
- 24.
- Un método según la reivindicación 14 en el que dicha determinación se realiza midiendo si el agente se une al receptor del linfocito T.
35 25. Un método para identificar un análogo de un péptido que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200 comprendiendo dicho método determinar, in vitro, si un péptido candidato es reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce un epítopo que comprende la SEQ ID NO: 200, indicando el reconocimiento del péptido candidato que el péptido candidato es un análogo siendo dicho análogo de no más de 50 aminoácidos de longitud. - 26. Un método de diagnóstico de la enfermedad celiaca, o susceptibilidad a enfermedad celiaca, en un individuo que comprende determinar, in vitro, la presencia de un anticuerpo que se une a un epítopo de una secuencia peptídica seleccionada de:(i) un péptido que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y45 (ii) un análogo peptídico de (i) que es capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce (i) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud;en una muestra del individuo, indicando la presencia del anticuerpo que el individuo tiene, o es susceptible a, enfermedad celiaca.
- 27. Un método in vitro de determinación de si una composición es capaz de causar enfermedad celiaca que comprende determinar si una secuencia de proteína capaz de ser modificada por una transglutaminasa a un péptido que comprende al menos un epítopo que comprende la SEQ ID NO: 200 está presente en la composición, indicando la presencia de la secuencia de proteína que la composición es capaz de causar enfermedad celiaca.
-
- 28.
- Un método según la reivindicación 27 en el que dicha determinación se hace poniendo en contacto la composición con un anticuerpo específico para la secuencia de proteína que es capaz de así ser modificada, indicando la unión del anticuerpo a una secuencia de proteína en la composición que la composición es capaz de causar enfermedad celiaca.
-
- 29.
- Un kit para llevar a cabo un método según las reivindicaciones 14, 16, 17 o 19 a 24 que comprende un agente seleccionado de
(a) un péptido aislado que comprende al menos un epítopo que comprende SEQ ID NO: 200; y65 (b) un análogo de (a) que es un péptido aislado capaz de ser reconocido por un receptor de linfocito T que reconoce el péptido de (a) y que no es más de 50 aminoácidos de longitud,y un medio para detectar el reconocimiento del péptido por el linfocito T. - 30. Un kit según la reivindicación 29 en el que los medios para detectar el reconocimiento comprenden un anticuerpoa IFN-γ. 5
- 31. Un kit según la reivindicación 30 en el que el anticuerpo se inmoviliza sobre un soporte sólido y opcionalmente el kit también comprende un medio para detectar el complejo anticuerpo/IFN-γ.
- 32. Un anticuerpo o fragmento del mismo, específico para SEQ ID NO: 200. 10
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