WO1997047647A1 - Proteinas vegetales - Google Patents

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WO1997047647A1
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Crisanto Gutierrez-Armenta
Qi Xie
Andrés PELAYO SANZ-BURGOS
Paula Suarez Lopez
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Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
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Definitions

  • the present invention relates to proteins that have biological activity in plant and animal systems, to polynucleotides that code for the expression of said proteins, to oligonucleotides for use in the identification and synthesis of these proteins and polynucleotides, to vectors and cells containing the Recombinant polynucleotides and plants and animals comprising these elements, and the use of proteins, polynucleotides and fragments thereof in the control of plant growth and the vulnerability of plants to viruses.
  • Rb retinoblastoma susceptibility gene
  • DNA tumor viruses that infect animal cells express oncoproteins that interact with the Rb protein through an LXCXE motif, breaking down Rb-E2F complexes and promoting the cells to enter the S phase (Weinberg ibid; Ludlow, J..W. PHASEB J. 7, 866 (1993); Moran, E. FASEB J. 7, 880 (1993); Vousden, K. FASEB J. 7, 872 (1993)).
  • the present inventors have shown that the efficient replication of a plant geminivirus requires the integrity of a motif of LXCXE amino acids in the RepA viral protein and that RepA can interact with members of the human Rb family in yeasts (Xie, Q. Suárez-López, P. and Gutiérrez, C. EMBO J. 14, 4073 (1995)).
  • the presence of the LXCXE motif has also been published in type D vegetable cyclines (Soni, R., Carmichael, JP, Shah, ZH and Murray, JAH Plant Cell 7, 85-103 (1995).
  • the present inventors have identified for the first time characteristic sequences of plant Rb proteins and the corresponding coding polynucleotides, they have isolated said proteins and polynucleotides and, in particular, have identified sequences that distinguish them from known animal Rb protein sequences.
  • the inventors have determined that a known DNA sequence from maize encoding a plant Rb protein and hereinafter referred to as ZmRbl.
  • ZmRbl a known DNA sequence from maize encoding a plant Rb protein and hereinafter referred to as ZmRbl.
  • the inventors have shown that ZmRbl interacts in yeasts with RepA, a vegetable geminivirus protein that contains an essential LXCXE motif for its function.
  • the inventors have further determined that the replication of geminivirus DNA in plant cells transfected with plasmids encoding human ZmRbl or pl30, a member of the human Rb family, is reduced.
  • Rb proteins from both humans and plants such as ZmRbl
  • ZmRbl have utility, among others, for therapeutic purposes for plants, diagnosis, growth control or research and many of these plant proteins will have similar utility in animals.
  • the use of retinoblastoma protein is provided in the growth control ' of plant cells and / or plant viruses.
  • the present invention provides control of viral infection and / or the growth of plant cells, where the virus requires the integrity of a motif of LXCXE amino acids in one of its proteins, particularly, for example, in the RepA viral protein. , for normal playback.
  • the particular plant viruses thus controlled are Geminivirus.
  • a preferred method of control using said proteins includes the application of these proteins to the plant cell, either directly or by introduction of DNA or RNA encoding for expression in the plant cell to be treated.
  • retinoblastoma protein By overexpression of the retinoblastoma protein or the expression of an Rb protein or a peptide fragment thereof that interacts with the virus's LXCXE motif, but does not affect the normal functioning of the cell, it is possible to inhibit viral growth. normal and, therefore, also reduce the spread of 'the infection of this cell to its neighbors.
  • antisense DNA or RNA into platelet cells in the form of vectors containing the promoters necessary for transcription of the DNA or RNA, it will be possible to exploit the well-known antisense mechanism to inhibit Rb protein expression, and by this of the S phase.
  • Such plants would be useful, among other aspects, to replicate DNA and RNA to high levels, for example in yeasts.
  • Methods for introducing antisense DNA into cells are well known to those skilled in the art: see for example "Principles of gene manipulation - An introduction to Genetic Engineering (1994) RW O ⁇ d & SB Primrose; Oxford-Blackwell Scientific Publications Fifth Edition p398 .
  • a recombinant nucleic acid is provided, particularly in the form of DNA or cRNA (mRNA), which codes for the expression of the Rb protein that is characteristic of plants.
  • This nucleic acid is characterized by one or several characteristic regions that differ from the nucleic acid of the known animal Rb protein and is exemplified herein by SEQ ID No 1, bases 31-2079.
  • the DNA or RNA may have a sequence containing degenerate substitutions in the nucleotides of the codons in SEQ ID No. 1, and where the RNA the T is U.
  • the most preferred DNA or RNA are capable of hybridizing with the polynucleotide of SEQ ID No. 1 under conditions of low stringency, preferably being able to hybridize under conditions of high stringency.
  • low stringency conditions and “high stringency conditions” are understood by the experts, but are conveniently used in US 5202257, Col-9-Col 10. If modifications were made that donate to the expression of a protein with different amino acids, preferably of the same class to the amino acids corresponding to SEQ ID No. 1; that is, they are conservative substitutions. Such substitutions are known to experts, for example, see US 5380712, and is contemplated only when the protein has activity with retinoblastoma protein.
  • the preferred DNA or cRNA encodes a plant Rb protein that has pocket subdomains A and B that have between 30% and 75% homology to the human Rb protein, particularly compared to pl30, more preferably between 50% and 64% homology.
  • the vegetable protein Rb thus encoded has conserved the amino acid C706 of human Rb.
  • the spacer sequence between the Pockets A and B are not conserved with respect to animal Rb proteins, preferably having a homology of less than 50% with the same region found in said animal proteins. More preferably, the protein thus encoded has a homology of 80% or greater with that of SEQ ID No 2 of the attached sequence list, even more preferably 90% or more and more preferably 95% or more.
  • a recombinant DNA of SEQ ID No. 1, bases 31 to 2079, or the entire SEQ ID No. 1, or the corresponding RNA encoding the corn cDNA clone encoding ZmRbl of SEQ ID No. 2 is provided.
  • the protein expressed by the recombinant DNA or RNA of the second aspect is provided, new proteins derived from said DNA or RNA and a protein derived from the naturally occurring DNA or RNA, by mutagenic means such as the use of mutagenic PCR primers.
  • vectors, cells, plants and animals comprising the recombinant DNA or RNA of correct or antisense sense of the invention are provided.
  • a method is provided to control cell or viral growth comprising the administration of DNA, RNA or proteins of the second or third aspect, to the cell.
  • Said administration may be direct in the case of proteins or may include indirect means, such as electroporation or plant seed cells with DNA or by transformation of cells with expression vectors capable of expressing or over-expressing the proteins of the invention or fragments of they are capable of inhibiting cell or viral growth.
  • the method uses an expression vector capable of producing antisense RNA from the cDNA of the invention.
  • plant protein and nuecleic acids includes an N-terminal domain corresponding in sequence to amino acids 1 to 90 of SEQ ID No. 2 and a nucleotide sequence corresponding to bases 31 to 300 of SEQ ID No. 1. These sequences are characterized by having less than 150 and less than 450 units than animal sequences that have more than 300 amino acids and 900 more base pairs.
  • Fig. 1 Sub-figure A shows the relative lengths of the present ZmRbl protein and human retinoblastoma proteins.
  • Sub-figure B shows the alignment of the amino acid sequences of the Pocket A and Pocket B of the ZmRbl with those of Xenopus, chicken, mouse and three human proteins (Rb, pl07 and pl30).
  • Fig. 2 This figure is a map of the main characteristics of the WDV virus and the pWori vector derived from WDV and the positions of the deletions and mutations used to establish that the LXCXE motif is required for replication in plant cells.
  • EXAMPLE 1 Isolation of DNA and protein expression clones
  • pBluéscript SK- (pBS) phagemids from the positive clones were excised by in vivo cleavage with the ExAssist (Stratagene) phage according to protocols recommended by the manufacturer.
  • DNA sequencing was carried out using a SequenaseTM (USB) device. The 5 'end of mRNAs encoding p75ZmRbl was determined by RACE-PCR. Poly-A + was purified
  • the first chain was synthesized using the oligonucleotide DraI35 (5'-GATTTAAAATCAAGCTCC, nucleotide positions 113-96). After denaturation at 90 ° C for 3 minutes, the RNA was removed by RNase treatment, the cDNA was recovered and a tail was created at the 5 'position with terminal transferase and dATP. Then, a PCR fragment was amplified using the DraI35 primer and the linker-primer (50 bp) from the Stratagene cDNA synthesis kit.
  • One of the positive clones (pBS.Rbl) thus produced contained a ⁇ 4 kb insert which, according to the restriction analysis, extended to the 5 'and 3' ends of the region contained in the Expressed Tag Sequence used.
  • the Nucleotide sequence corresponding to the longest cDNA insert (3747 bp) is shown in SEQ ID No 1.
  • This ZmRbl cDNA contains a single open reading phase capable of encoding a 683 amino acid protein (predetermined Mr 75247, p75ZmRbl) followed for a 3 'untranslated region of 1646 bp. Non-translated regions of similar length have also been found in mammalian Rb cDNA (Lee, W.
  • Plasmid pWori ⁇ was constructed by deleting in pWori the majority of the sequences encoding WDV proteins (Sanz and Gutierrez, unpublished). Plasmid p35S.Rbl was constructed by inserting the CaMV 35S promoter (obtained from pWDV3: 35SGUS) upstream of the ZmRBl cDNA into the pBS vector. Plasmid p35S.130 was constructed by introducing the complete coding sequence of human pl30 instead of ZmRbl sequences within p35S.Rbl. Plasmid p35.A + B was constructed by replacing sequences encoding the ORFs of Rep A and Rep B of WDV instead of ZmRbl in plasmid p35S.Rbl
  • the ZmRbl protein contains segments homologous to subdomains A and B of the "pocket" that is present in all members of the Rb family. These subdomains are separated by an unconserved spacer.
  • the ZmRbl also contains non-conserved N-terminal and C-terminal domains.
  • ZmRbl shares an amino acid identity of -28-30% (similarity of -50%) with members of the Rb family (Hannon, GJ, Demetrick, D. & Beach, D. Genes Dev. 7, 2378 (1993); Cobrinik, D., Whyte, P., Peeper, DS, Jacks, T. & Weinberg, RA ibid., P. 2392 (1993).
  • Amino acids 561-577 encompass a proline-rich domain.
  • ZmRbl contains 16 consensus sites, SP or TP, for phosphorylation by cyclin-dependent kinases (CDKs) with one at the 5 'end of subdomain A and several in the C-terminal zone that are potential phosphorylation sites.
  • CDKs cyclin-dependent kinases
  • Dwarf wheat geminivirus (WDV) replication is dependent on an intact LXCXE motif of the viral RepA protein. This motive may mediate the interaction with a member of the human Rb family, pl30, in yeasts. Therefore, the inventors investigated whether p75ZmRbl could be complexed with WDV RepA using the two yeast hybrid system (Fields, S. and Song, O. Nature 340, 245-264 (1989)). Yeast cells were cotransformed with a plasmid encoding the GAL4BD-RepA fusion protein and with plasmids encoding different GAL4AD fusion proteins.
  • the GAL4AD-p75ZmRbl fusion could also be complexed with GAL4BD-RepA to allow the growth of recipient yeast cells in the absence of histidine. This interaction was slightly stronger than that observed with the human protein pl30.
  • the RepA was also able to join to some extent the truncated form in the N-terminal of p75ZmRbl.
  • the role of the LXCXE motif in the RepA-p75ZmRbl interaction was determined using a point mutation in WDV RepA
  • the E198K mutant of WDV RepA behaves similarly to point-like mutations of animal virus oncoproteins (Moran, E., Zerler, B., Harrison, TM and Mathews, MB Mol. Cell Biol. 6, 3470 (1986); Cherington, V. et al., Ibid, p. 1380 (1988); Lillic, JW, Lowenstein, PM, Green, MR and Green, M. Cell 50, 1091 (1987); DeCaprio, JA et al., Ibid., P.275 (1988)).
  • yeast cotransformants are related to the levels of b-galactosidase activity.
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • the accumulation of newly replicated viral plasmid DNA was impaired in wheat cells transfected with plasmids expressing human p75ZmRbl or pl30, when the expression of the WDV replication protein (s) is directed by the WDV promoter or by the CaMV 35S promoter.
  • p75ZmRbl could also play key regulatory roles at other levels during the life of the plant cell.
  • a key issue that arises from the existence of Rb homologs in plant cells is whether, as in animals, the disruption of the Rb pathway leads to a tumor tendency disorder.
  • the inventors have observed that the VirB4 protein encoded by the Ti plasmids of both AgroJbacterium tumefaciens and
  • VirB4 protein is necessary for tumor induction
  • wheat cells were co-transfected with pWori (0.5 g) and pBS plasmids (control), p35S.Rbl or p35S.130 (10 g in each case ). Replication of the test plasmid (p Wori) was analyzed two days after transfection and was detected as described in part A using ethidium bromide marking; and hybridization of Southern C.
  • the pWoriDD test plasmid (which does not encode replication proteins) of functional WDVs but replicates when they are provided by a different plasmid, i.e., pWori).
  • Wheat cells were co-transfected, as indicated, with pWori ⁇ (0.25 g), pWori (0.25 g) p35S.AB (6 g), p35S.Rbl (10 g) and / or p35S.130 (10 g).
  • Replication of the test plasmid (pWoriDD) was analyzed 36 hours after transfection and was detected as described in part A using ethidium bromide, Southern hybridization. Plasmids pWori (MI) and pWori ⁇ were used
  • ORGANISM Zea mays (ix) CHARACTERISTICS:
  • GAT TTT AAA TCA ATT TTG ATC AAT AAT GAT TAT ATT CCC TAT GAT GAG 150 Asp Phe Lys Ser lie Leu He Asn Asn Asp Tyr lie Pro Tyr Asp Glu 25 30 35 40
  • AGT ATC TAT ATT GGG AGT ACG AAC CGT AAT GGG GTA TTA GTA TCG CGC 1590 Ser He Tyr He Gly Ser Thr Asn Arg Asn Gly Val Leu Val Ser Arg 505 510 515 520
  • GACGCTGACTCATCTC ⁇ ATAATGGCAGATGCTTAACCATCTTTAGGAGCTCATGTCATGA3259

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Abstract

La presente invención se basa en el aislamiento y caracterización de una secuencia de ADN de células de plantas que codifica una proteína retinoblastoma. Dicho hallazgo está basado en las propiedades estructurales y functionales de la proteína retinoblastoma de plantas como posible regulador del ciclo celular, del crecimiento celular y de la diferenciación celular en plantas. Por todo ello, se reivindican, entre otros aspectos, la utilización de la proteína retinoblastoma o de la secuencia de ADN que la codifica en el control del crecimiento de células vegetales, plantas y/o virus vegetales, así como la utilización de vectores, células, plantas o animales o células animales modificados a través de la manipulación de la ruta de control basada en la proteína retinoblastoma de plantas.

Description

PROTEÍNAS VEGETALES DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a proteínas que tienen actividad biológica en sistemas vegetales y animales, a polinucleótidos que codifican para la expresión de dichas proteínas, a oligonucleótidos para usarse en la identificación y síntesis de estas proteínas y polinucleótidos, a vectores y células que contienen los polinucleótidos en forma recombinante y a plantas y animales que comprenden estos elementos, y al uso de las proteínas, polinucleótidos y fragmentos de los mismos en el control del crecimiento de las plantas y de la vulnerabilidad de las plantas a virus .
La progresión del ciclo celular se regula mediante efectores positivos y negativos. Entre los últimos, el producto del gen de susceptibilidad a retinoblastoma (Rb) controla el paso de células de mamíferos a través de la fase Gl . En las células de mamíferos, Rb regula el tránsito Gl/S mediante la inhibición de la función de la familia de factores de transcripción E2F, de la que se sabe que interacciona con secuencias de la región promotora de genes necesarios para la replicación del ADN de la célula (véase, por ejemplo, Weinberg, R.A. Cell 81, 323 (1995) ; Nevins, J.R. Science 258, 424 (1992)) . Los virus tumorales de ADN que infectan células animales expresan oncoproteínas que interaccionan con la proteína Rb mediante un motivo LXCXE, rompiendo complejos Rb-E2F y promoviendo que las células entren en fase S (Weinberg ibid; Ludlow, J..W. FASEB J. 7, 866 (1993) ; Moran, E. FASEB J. 7, 880 (1993) ; Vousden, K. FASEB J. 7, 872 (1993)) .
Los presentes inventores han demostrado que la replicación eficaz de un geminivirus vegetal requiere la integridad de un motivo de aminoácidos LXCXE en la proteína viral RepA y que RepA puede interaccionar con miembros de la familia Rb humana en levaduras (Xie, Q. Suárez-López, P. y Gutiérrez, C. EMBO J. 14, 4073 (1995) ) . También se ha publicado la presencia del motivo LXCXE en ciclinas vegetales de tipo D (Soni, R., Carmichael, J. P., Shah, Z. H. y Murray, J. A. H. Plant Cell 7, 85-103 (1995) .
Actualmente, los presentes inventores han identificado por primera vez secuencias características de proteínas Rb vegetales y los correspondientes polinucleótidos codificantes, han aislado dichas proteínas y polinucleótidos y, en particular, han identificado secuencias que los distinguen de secuencias proteicas Rb animales conocidas. Los inventores han determinado que una secuencia de DNA conocida procedente de maíz que codifica una proteína Rb vegetal y se denomina en lo sucesivo ZmRbl . Los inventores han demostrado que ZmRbl interacciona en levaduras con RepA, una proteína vegetal de geminivirus que contiene un motivo LXCXE esencial para su función. Los inventores han determinado adicionalmente que se reduce la replicación de ADN de geminivirus en células vegetales transfectadas con plásmidos que codifican ZmRbl o pl30 humano, un miembro de la familia Rb humana.
Significativamente, el trabajo de los inventores sugiere que las células animales y vegetales pueden compartir estrategias fundamentalmente similares para el control del crecimiento y, por lo tanto, es de esperar que proteínas Rb tanto de humanos como de plantas, tales como ZmRbl, tengan utilidad, entre otros, en fines terapéuticos para vegetales, diagnosis, control del crecimiento o investigaciones y muchas de dichas proteínas vegetales tendrán una utilidad similar en los animales .
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de la proteína de retinoblastoma en el control del crecimiento 'de células vegetales y/o virus vegetales. Particularmente, la presente invención proporciona el control de la infección viral y/o el crecimiento de -células vegetales, donde el virus requiere la integridad de un motivo de aminoácidos LXCXE en una de sus proteínas, particularmente, por ejemplo, en la proteína viral RepA, para la reproducción normal . Los virus vegetales particulares así controlados son Geminivirus. Un procedimiento preferido de control que usa dichas proteínas incluye la aplicación de éstas a la célula vegetal, bien directamente o mediante introducción de ADN o ARN que codifica para su expresión en la célula vegetal que se desea tratar. Mediante la sobre-expresión de la proteína de retinoblastoma o la expresión de una proteína Rb o un fragmento peptídico de la misma que interacciona con el motivo LXCXE del virus, pero que no afecta al funcionamiento normal de la célula, es posible inhibir el crecimiento viral normal y, por lo tanto, también reducir la propagación de ' la infección de esta célula a sus vecinas .
Alternativamente, por introducción de ADN o ARN antisentido en células de platas en forma de vectores que contengan los promotores necesarios para la transcripción del ADN o ARN, será posible explotar el bien conocido mecanismo de antisentido para inhibir la expresión de la proteína Rb, y por ello de la fase S. Tales plantas serían de utilidad, entre otros aspectos, para replicar ADN y ARN hasta elevados niveles, por ejemplo en levaduras. Los métodos para introducir ADN antisentido en células, son bien conocidos para los expertos en el tema: véase por ejemplo "Principies of gene manipulation - An introduction to Genetic Engineering (1994) R.W. Oíd & S.B. Primrose; Oxford-Blackwell Scientific Publications Fifth Edition p398. En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico recombinante, particularmente en forma de ADN o ARNc (ARNm) , que codifica para la expresión de la proteína Rb que es característica de plantas. Este ácido nucleico se caracteriza por una o varias regiones características que difieren del ácido nucleico de la proteína Rb animal conocida y se ejemplifica aquí por la SEC ID No 1, bases 31-2079. El ADN o ARN puede tener una secuencia que contenga sustituciones degeneradas en los nucleótidos de los codones en SEQ ID No. 1, y donde el ARN la T es U. Los ADN o ARN más preferidos son capaces de hibridar con el polinucleótido de la SEQ ID No. 1 en condiciones de baja estringencia, preferiblemente siendo capaz de esa hibridación en condiciones de alta estringencia.
Las expresiones "condiciones de baja estringencia" y "condiciones de alta estringencia" son entendidas por los expertos, pero se emplifican convenientemente en US 5202257, Col-9-Col 10. Si se hicieran modificaciones que donduzcan a la expresión de una proteína con diferentes aminoácidos, preferiblemente de la misma clase a los aminoácidos correspondientes a la SEQ ID No. 1; es decir son sustituciones conservativas. Tales sustituciones son conocidas por los expertos, por ejemplo, ver US 5380712, y se contempla solo cuando la proteína tenga actividad con proteína retinoblastoma.
El ADN o ARNc preferido codifica para una proteína Rb vegetal que tiene subdominios de bolsillo A y B que tienen entre un 30% y un 75% de homología con la proteína Rb humana, particularmente en comparación con pl30, más preferiblemente entre un 50% y un 64% de homología. Particularmente, la proteína Rb vegetal así codificada ha conservado el aminoácido C706 de la Rb humana. Preferiblemente, la secuencia espadadora entre los bolsillos A y B no se conserva con respecto a las proteínas Rb animales, preferiblemente, teniendo una homología inferior al 50% con la misma región que se encuentra en dichas proteínas animales. Más preferiblemente, la proteína así codificada tiene una homología del 80% o mayor con la de la SEC ID No 2 de la lista de secuencias adjunta, aún más preferiblemente de un 90% o mayor y más preferiblemente de un 95% o mayor. Particularmente, se proporciona un ADN recombinante de SEC ID No 1, bases 31 a 2079, o la SEC ID No 1 entera, o los correspondientes ARN que codifican para el clon de ADNc de maíz que codifica ZmRbl de la SEC ID No. 2.
En un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona la proteína expresada por el ADN o ARN recombinante del segundo aspecto, nuevas proteínas derivadas de dicho ADN o ARN y una proteína derivada del ADN o ARN que se produce de forma natural, mediante medios mutagénicos tales como el uso de cebadores de PCR mutagénicos. En un cuarto aspecto, se proporcionan vectores, células, vegetales y animales que comprenden el ADN o ARN recombinante de sentido correcto o antisentido, de la invención.
En un uso particularmente preferido del primer aspecto, se proporciona un procedimiento para controlar el crecimiento celular o viral que comprende la administración de ADN, ARN o proteínas del segundo o tercer aspecto, a la célula. Dicha administración puede ser directa en el caso de proteínas o puede incluir medios indirectos, tales como electroporación o células de semillas vegetales con ADN o por transformación de células con vectores de expresión capaces de expresar o sobre-expresar las proteínas de la invención o fragmentos de las mismas que son capaces de inhibir el crecimiento celular o viral. Alternativamente, el método utiliza un vector de expresión capaz de producir ARN antisentido del cDNA de la invención.
Otra de las características particulares de la proteína de las plantas y de los ácidos nuecleicos incluye un dominio N-terminal correspondiente en secuencia a los aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID No. 2 y una secuencia de nucleótidos correspondiente a las bases 31 a 300 de la SEQ ID No. 1. Estas secuencias se caracterizan por poseer menos de 150 y menos de 450 unidades que las secuencias animales que poseen más de 300 aminoácidos y 900 pares de bases más.
La presente invención se ilustrará adicionalmente mediante referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes. A los especialistas se les ocurrirán otras realizaciones que caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas a la luz de éstos.
Figuras . Fig.l La sub-figura A muestra las longitudes relativas de la presente proteína ZmRbl y las proteínas de retinoblastoma humanas. La sub-figura B muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de los Pocket A y Pocket B de la ZmRbl con las de Xenopus, pollo, ratón y tres proteínas humanas (Rb, pl07 y pl30) .
Fig.2 Esta figura es una mapa de las principales características del virus WDV y el vector pWori derivado de WDV y las posiciones de las deleciones y mutaciones utilizadas para establecer que el motivo LXCXE se requiere para su replicación en células de plantas. EJEMPLO 1 Aislamiento de ADN v clones de expresión de proteínas
Se aisló ARN total a partir de raíz de maíz y de hojas maduras triturando el material previamente congelado en nitrógeno líquido esencialmente como se describe en Soni et al (1995) . Se identificaron los ARNm de p75ZmRbl mayoritarios y minoritarios mediante hibridación a un fragmento interno PstI marcado con 32P cebado aleatoriamente (1,4 kb) . Se seleccionó una parte de la biblioteca de ADNc de maíz (106 pfu) en IZAPII (Stratagene) mediante la hibridación posterior con oligonucleótidos marcados en el extremo 5' diseñados para ser complementarios a una secuencia EST conocida de maíz homologa de pl30. Estos oligonucleótidos fueron 5' -AATAGACACATCGATCAA/G (M. 5m, posiciones de nucleótidos 1411-1438) y 5'- GTAATGATACCAACATGG (M. 3c, posiciones de nucleótidos 1606-1590) (Isogen Biosciences) .
Después del segundo ciclo de selección, se aislaron fagémidos pBluéscript SK- (pBS) procedentes de los clones positivos por escisión in vivo con el fago auxiliar ExAssist (Stratagene) de acuerdo con protocolos recomendados por el fabricante . Se llevó a cabo la secuenciación de ADN usando un equipo Sequenase TM (USB) . Se determinó el extremo 5' de los ARNm que codificaban p75ZmRbl por RACE-PCR. Se purificó Poli-A +
ARNm por cromatografía sobre oligo-dT-celulosa
(Amersham) . La primera cadena se sintetizó usando el oligonucleótidoDraI35 (5' -GATTTAAAATCAAGCTCC, posiciones de nucleótidos 113-96) . Después de la desnaturalización a 90°C durante 3 minutos, se eliminó el ARN por tratamiento con RNasa, se recuperó el ADNc y se creó una cola en la posición 5' con transferasa terminal y dATP. Después, se amplificó un fragmento de PCR usando el cebador DraI35 y el engarce-cebador (50 pb) del equipo de síntesis de ADNc de Stratagene.
Uno de los clones positivos (pBS.Rbl) así producidos contenía un inserto de ~ 4 kb que, según el análisis de restricción, se prolongaba a los extremos 5' y 3' de la región contenida en la Secuencia Tag Expresada usada. La secuencia de nucleótidos correspondiente al inserto de ADNc más largo (3747 pb) se muestra en la SEC ID No 1. Este ADNc de ZmRbl contiene una sola fase de lectura abierta capaz de codificar una proteína de 683 aminoácidos (predeterminada Mr 75247, p75ZmRbl) seguida por una región 3' no traducida de 1646 pb. También se han encontrado regiones no traducidas de longitud similar en ADNc de Rb de mamíferos (Lee, W. L, et al., Science 235, 1394 (1987) ; Bernards, R. et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86, 6474 (1989) . El análisis de Northern indica que las células de maíz derivadas tanto de meristemos de raíz como de hojas maduras contiene un mensajero principal de -2,7 ± 0,2 kb de longitud. Además, también aparece un mensajero minoritario de -3,7 + 0,2 kb. Se han detectado transcritos heterogéneos en otras especies (Destrée, O. H. J. et al., Dev. Biol . 153, 141 (1992) .
Se construyó el plásmido pWoriΔΔ mediante la deleción en pWori de la mayoría de las secuencias que codifican proteínas de WDV (Sanz y Gutiérrez, no publicado) . El plásmido p35S.Rbl se construyó mediante la inserción del promotor CaMV 35S (obtenido a partir de pWDV3 :35SGUS) cadena arriba del ADNc de ZmRBl en el vector pBS. El plásmido p35S.130 se construyó introduciendo la secuencia codificante completa de pl30 humano en lugar de secuencias ZmRbl en el interior de p35S.Rbl. El plásmido p35.A+B se construyó mediante la sustitución de secuencias que codifican los ORF de Rep A y Rep B de WDV en lugar de ZmRbl en el plásmido p35S.Rbl
( Sec Soni, R. y Murray, J.A. H. Anal. Biochem, 218, 474- 476 (1994) ) .
La secuencia alrededor del codón de metionina en la posición de nucleótido 31 contiene un comienzo de la traducción consenso (Kozak, M. J. Mol. Biol. 196, 947
(1987) . Para determinar si el ADNc contenía la región codificante de ZmRbl completa, el extremo 5' del ARNm se amplificó por RACE-PCR usando un oligonucleótido derivado de una región cercana al supuesto iniciador AUG, que produce un fragmento de -150 pb. Los resultados son consistentes con el clon de ADNc de ZmRbl que contiene la región codificante completa.
La proteína ZmRbl contiene segmentos homólogos a los subdominios A y B del "bolsillo" que está presente en todos los miembros de la familia Rb. Estos subdominios están separados por un espaciador no conservado. El ZmRbl también contiene dominios N-terminales y C-terminales no conservados. En general, el ZmRbl comparte una identidad de aminoácidos del -28-30% (similaridad del -50%) con los miembros de la familia Rb (Hannon, G. J., Demetrick, D. & Beach, D. Genes Dev. 7, 2378 (1993) ; Cobrinik, D., Whyte, P., Peeper, D.S., Jacks, T. & Weinberg, R.A. ibid., p. 2392 (1993) . Ewen, M.E. , Xing, Y., Lawrence, J.B. y Livingston, D. M. Cell 66, 1155 (1991)) (Lee W. L et al, Science 235, 1394 (1987) ; Bernards et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 6974 (1989)) , presentando los subdominios A y B la mayor homología (-50-64%) . Sorprendentemente, el aminoácido C706 de la Rb humana, crítico para su función (Kaye, F.J., Kratzke, R.A. , Gerster, J.L. y Horowitz, J. M. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 6922 (1990)) , también se conserva en p75ZmRbl de maíz.
Nota: Los aminoácidos 561-577 abarcan un dominio rico en prolina.
ZmRbl contiene 16 sitios consenso, SP o TP, para fosforilación por kinasas dependientes de ciclina (CDKs) con uno en el extremo 5' del subdominio A y varios en la zona C-terminal que son sitios potenciales de fosforilación. Un grupo preferido de ácidos nucleicos que codifican proteínas en las que uno omás de estos sitios están alterados o delecionados, convirtiendo a la proteína más resistente a la fosforilación y así, a su funcionalidad, por ejemplo, unión a E2F o similares. Esto se puede realizar fácilmente mediante mutagénesis dirigida mediante PCR.
EJEMPLO 2
Actividad in vivo
La replicación de geminivirus de trigo enano (WDV) es dependiente de un motivo LXCXE intacto de la proteína RepA viral. Este motivo puede mediar la interacción con un miembro de la familia Rb humana, pl30, en levaduras. Por lo tanto, los inventores investigaron si p75ZmRbl podría complejarse con RepA de WDV usando el sistema de dos híbridos de levadura (Fields, S. y Song, O. Nature 340, 245-264 (1989)) . Se cotransformaron células de levadura con un plásmido que codificaba la proteína de fusión GAL4BD-RepA y con plásmidos que codificaban diferentes proteínas de fusión GAL4AD. La fusión GAL4AD- p75ZmRbl también podía complejarse con GAL4BD-RepA para permitir el crecimiento de las células de levadura receptoras en ausencia de histidina. Esta interacción fue ligeramente más fuerte que la observada con la proteína humana pl30. La RepA también pudo unirse en alguna medida a la forma truncada en el N-terminal de p75ZmRbl . El papel del motivo LXCXE en la interacción RepA-p75ZmRbl se determinó usando una mutación puntual en RepA de WDV
(E198K) , de la que se ha demostrado anteriormente que destruye la interacción con pl30 humana. La cotransformación de ZmRbl con un plásmido que codificaba la fusión GAL4BD-RepA (E198K) indicó que la interacción entre RepA y p75ZmRbl se producía a través del motivo LXCXE.
A este respecto, el mutante E198K de RepA de WDV se comporta de forma similar a mutaciones puntuales análogas de oncoproteínas de virus animales (Moran, E., Zerler, B., Harrison, T.M. y Mathews, M. B. Mol. Cell Biol. 6, 3470 (1986) ; Cherington, V. et al., ibid, p. 1380 (1988) ; Lillic, J. W. , Lowenstein, P. M., Green, M. R. y Green, M. Cell 50, 1091 (1987) ; DeCaprio, J. A. et al., ibid., p.275 (1988) ) . La interacción específica entre p75ZmRbl de maíz y RepA de WDV en el sistema de dos híbridos de levadura (Fields et al) se basaba en la capacidad de reconstituir una actividad GAL4 funcional a partir de dos proteínas de fusión GAL4 separadas que contienen el dominio de unión de ADN (GAL4BD) y el dominio de activación (GAL4AD) . Se cotransformaron células HF7c de levadura con un plásmido que expresaba las fusiones GAL4BD-RepA o GAL4BD-
RepA(E198K) y los plásmidos que expresaban GAL4AD solo
(Vec) o unido a pl30 humano, p75 (p75ZmRbl) de maíz o una deleción N-terminal de 69 aminoácidos de p75 (p75ZmRbl- DN) . Las células se alinearon en placas con o sin histidina de acuerdo con la distribución mostrada en la esquina izquierda superior. La capacidad de crecer en ausencia de histidina depende de la reconstitución funcional de una actividad GAL4 tras la interacción de las proteínas de fusión, ya que esto activa la expresión del gen HIS3 , que está bajo el control del elemento de respuesta GAL4. Las características del crecimiento de estos cotransformantes de levadura están relacionadas con los niveles de la actividad b-galactosidasa.
En Xie et al (1995) se describen procedimientos para el análisis de dos híbridos. Las fusiones GAL4AD-ZmRbl se construyeron en el vector pGAD424.
EJEMPLO 3
Actividad in vivo
La replicación del ADN de geminivirus requiere la maquinaria celular de replicación de ADN así como otros factores específicos de la fase S (Davies, J. W. y Stanley, J. Trends Genet . 5, 77 (1989) ; Lazarowitz, S. Crit. Rev. Plant Sci. 11, 327 (1992)) . Consistente con este requisito, la infección por geminivirus parece promover que células no proliferantes entre en la fase S, como se indica por la acumulación del antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) , una proteína que normalmente no está presente en los núcleos de células diferenciadas (Nagar, S., Pedersen, T. J. , Carrick, K. M. , Hanley-Bowdoin, L. y Robertson, D. Plant Cell 7, 705 (1995) ) . Los hallazgos de los inventores de que la replicación eficaz de ADN de WDV requiere un motivo LXCXE intacto en RepA junto con el descubrimiento de un homólogo vegetal de Rb, apoya al modelo de que, como en células animales, la formación de complejos de Rb vegetal con proteínas RepA virales, promueve la entrada inapropiada de células infectadas en la fase S. Por lo tanto, una forma de investigar la función de p75ZmRbl fue medir la replicación del ADN de geminivirus en células transíectadas con un plásmido que llevaba las secuencias ZmRbl bajo un promotor funcional en células vegetales, un método análogo al usado previamente en células humanas (Uzvolgi, E. et al., Cell Growth Diff. 2, 297 (1991)) . La acumulación de ADN plasmídico viral nuevamente replicado se vio perjudicada en células de trigo transíectadas con plásmidos que expresaban p75ZmRbl o pl30 humano, cuando la expresión de la(s) proteína (s) de replicación de WDV está dirigida por el promotor de WDV o por el promotor CaMV 35S.
Como la replicación de ADN de WDV requiere un medio celular en fase S, la interferencia con la replicación de ADN viral por p75ZmRbl y pl30 humano demuestra fuertemente un papel para la proteína de retinoblastoma en el control de la transición Gl/S en las plantas. La existencia de un homólogo de Rb vegetal implica que, a pesar de su antigua divergencia, las células vegetales y animales usan, al menos en parte, proteínas reguladoras y rutas similares para el control del ciclo celular.
Dos líneas de evidencia refuerzan este modelo. En primer lugar, en células de alfalfa se ha identificado un gen que codifica una proteína que complementa específicamente a la transición a Gl/S pero no a la transición G2/M del mutante cdc28 de levadura en fase de germinación (Hirt, H., Páy, A., Bógre, L., Meskiene, I. y Heberle-Bors, E. Plant J. 4, 61 (1993)) . En segundo lugar, se han aislado homólogos vegetales de ciclinas de tipo D a partir de Arabidopsis y éstos, como sus parientes procedentes de mamíferos, contienen motivos LXCXE. En relación con las versiones vegetales de CDK4 y CDK6 , las ciclinas vegetales de tipo D pueden regular el paso a través de la fase Gl mediante el control del estado de fosforilación de proteínas semejantes a Rb.
En células animales, la familia Rb se ha implicado en la supresión de tumores y en el control de la diferenciación y el desarrollo. Así pues, p75ZmRbl también podría jugar papeles reguladores clave a otros niveles durante la vida de la célula vegetal. Una cuestión clave que surge por la existencia de homólogos de Rb en células vegetales, es si, como en animales, la interrupción de la ruta de Rb conduce a un trastorno de tendencia a tumores. A este respecto, los inventores han observado que la proteína VirB4 codificada por los plásmidos Ti tanto de AgroJbacterium tumefaciens como de
A . rhyzogeneε, contiene un motivo LXCXE. Aunque la
Proteína VirB4 es necesaria para la inducción tumoral
(Hooykas, P. J.J. y Beijersbergen, A. G. M. Annu. Rev. Phytopathol . 32, 57 (1994) , queda por examinar la función de su motivo LXCXE en este contexto. La infección por geminivirus no está acompañada por el desarrollo de tumores en la planta infectada pero, en algunos casos, se ha observado un crecimiento anormal de ejemplares enanos (G. Dafalla y B. Gronenborn, comunicación personal) . Se llevó a cabo la inhibición de la replicación de ADN de geminivirus de trigo enano (WDV) por ZmRbl o pl30 humano en células de trigo cultivadas, como se indica a continuación. A. Se transfectaron células de trigo, como se ha indicado, con pWori (Xie et al. 1995) solo (0,5 g) , un plásmido de replicación basado en WDV que codifica las proteínas de WDV necesarias para la replicación del ADN viral y con el plásmido de control pBS (10 g) o p35S.Rbl (10 g) , que codifica secuencias ZmRbl bajo el control del promotor CaMV 35S. Se purificó el ADN total uno y dos días después de la transfección, se fraccionó en cantidades iguales en geles de agarosa y mareaje con bromuro de etidio) y se identificó el ADN viral de pWori por hibridación de Southern. El ADN plasmídico representa exclusivamente el ADN del plásmido nuevamente replicado, ya que es totalmente resistente a la digestión con Dpnl y sensible a Mbol . Debe indicarse que las muestras digeridas con Mbol se representan por aproximadamente la mitad de la longitud que las muestras no digeridas. B. Para ensayar el efecto de pl30 humano sobre la replicación de ADN de WDV, se cotransfectaron células de trigo con pWori (0,5 g) y plásmidos pBS (control) , p35S.Rbl o p35S.130 (10 g en cada caso) . La replicación del plásmido de ensayo (p Wori) se analizó dos días después de la transfección y se detectó como se describe en la parte A usando mareaje con bromuro de etidio; y hibridación de Southern C. Para ensayar el efecto de ZmRbl o pl30 humano sobre la replicación de ADN de WDV cuando la expresión de proteínas virales estaba dirigida por el promotor CaMV 35S, se usó el plásmido de ensayo pWoriDD (que no codifica proteínas de replicación de WDV funcionales pero se replica cuando éstas se proporcionan por un plásmido diferente, es decir, pWori) . Se cotransfectaron células de trigo, como se ha indicado, con pWoriΔΔ (0,25 g) , pWori (0,25 g) p35S.A B (6 g) , p35S.Rbl (10 g) y/o p35S.130 (10 g) . La replicación del plásmido de ensayo (pWoriDD) se analizó 36 horas después de la transfección y se detectó como se describe en la parte A usando mareaje con bromuro de etidio, hibridación de Southern. Se usaron plásmidos pWori (MI) y pWoriΔΔ
(M2, Sanz y Gutiérrez, no publicado) , 100 pg en cada caso, como marcadores. Se llevaron a cabo cultivos en suspensión de células de trigo, transfección por bombardeo de partículas y análisis de la replicación de ADN viral como se describe en (Xie et al 1995) , con la excepción de que la extracción de ADN se modificó como en
(Soni y Murray. Arnal. Biochem. 218,474-476 (1995) .
LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE:
(A) NOMBRE CRISANTO GUTIÉRREZ ARMENTA
(A) NOMBRE QI XIE
(A) NOMBRE ANDRÉS PELAYO SANZ-BURGOS
(A) NOMBRE PAULA SUAREZ-LÓPEZ (B) CALLE: CSIC-UAM, UNIVERSIDAD AUTÓNOMA, CANTOBLANCO (C) CIUDAD: MADRID
(E) PAÍS: ESPAÑA
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 28049
(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS VEGETALES (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
(A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible
(B) ORDENADOR: IBM PC compatible
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Licencia de Patente N° 1,0,Versión N° 1,30 (EPO)
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 3747 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico
(C) CADENA: doble
(D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO
(vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Zea mays (ix) CARACTERÍSTICAS :
(A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 31..2079 <xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID NO : 1 :
GAATTCGGCA CGAGCAAAGG TCTGATTGAT ATG GAA TGT TTC CAG TCA AAT TTG 54
Met Glu Cys Phe Gln Ser Asn Leu
1 , 5
GAA AAA ATG GAG AAA CTA TGT AAT TCT AAT AGC TGT AAA GGG GAG CTT 102 Glu Lys Met Glu Lys Leu Cys Asn Ser Asn Ser Cys Lys Gly Glu Leu 10 15 20
GAT TTT AAA TCA ATT TTG ATC AAT AAT GAT TAT ATT CCC TAT GAT GAG 150 Asp Phe Lys Ser lie Leu He Asn Asn Asp Tyr lie Pro Tyr Asp Glu 25 30 35 40
AAC TCG ACG GGG GAT TCC ACC AAT TTA GGA CAT TCA AAG TGT GCC TTT 198 Asn Ser Thr Gly Asp Ser Thr Asn Leu Gly His Ser Lys Cys Ala Phe 45 50 55
GAA ACÁ TTG GCA TCT CCC ACÁ AAG ACÁ ATA AAG AAC ATG CTG ACT GTT 246 Glu Thr Leu Ala Ser Pro Thr Lys Thr He Lys Asn Met Leu Thr Val 60 65 70
CCT AGT TCT CCT TTG TCA CCA GCC ACC GGT GGT TCA GTC AAG ATT GTG 294 Pro Ser Ser Pro Leu Ser Pro Ala Thr Gly Gly Ser Val Lys De Val 75 80 85
CAÁ ATG ACÁ CCA GTA ACT TCT GCC ATG ACG ACÁ GCT AAG TGG CTT CGT 342 Gln Met Thr Pro Val Thr Ser Ala Met Thr Thr Ala Lys Trp Leu Arg 90 95 100
GAG GTG ATA TCT TCA TTG CCA GAT AAG CCT TCA TCT AAG CTT CAG CAG 390 Glu Val He Ser Ser Leu Pro Asp Lys Pro Ser Ser Lys Leu G!n Gln 105 110 115 120
TTT CTG TCA TCA TGC GAT AGG GAT TTG ACÁ AAT G CT GTC ACÁ GAA AGG 438 Phe Leu Ser Ser Cys Asp Arg Asp Leu Thr Asn Ala Val Thr Glu Arg 125 130 135 GTC AGC ATA GTT TTG GAA GCA ATT TTT CCA ACC AAA TCT TCT GCC AAT 486 Val Ser He Val Leu Glu Ala He Phe Pro Thr Lys Ser Ser Ala Asn 140 145 150
CGG GGT GTA TCG TTA GGT CTC AAT TGT GCA AAT GCC TTT GAC ATT CCG 534 Arg Gly Val Ser Leu Gly Leu Asn Cys Ala Asn Ala Phe Asp lie Pro 155 160 165
TGG GCA GAA GCC AGA AAA GTG GAG GCT TCC AAG TTG TAC TAT AGG GTA 582
Trp Ala Glu Ala Arg Lys Val Glu Ala Ser Lys Leu Tyr Tyr Arg Val 170 175 180
TTA GAG GCA ATC TGC AGA GCG GAG TTA CAÁ AAC AGC AAT GTA AAT AAT 630 Leu Glu Ala lie Cys Arg Ala Glu Leu Gln Asπ Ser Asπ Val Asn Asn 185 190 195 200
CTA ACT CCA TTG CTG TCA AAT GAG CGT TTC CAC CGA TGT TTG ATT GCA 678 Leu Thr Pro Leu Leu Ser Asn Glu Arg Phe His Arg Cys Leu Ilc Ala 205 210 215
TGT TCA GCG GAC TTA GTA TTG GCG ACÁ CAT AAG ACÁ GTC ATC ATG ATG 726 Cys Ser Ala Asp Leu Val Leu Ala Thr His Lys Thr Val He Met Met 220 225 230
TTT CCT GCT GTT CTT GAG AGT ACC GGT CTA ACT G CA TTT GAT TTG AGC 774 Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Thr Gly Leu Thr Ala Phe Asp Leu Ser 235 240 245
AAA ATA ATT GAG AAC TTT GTG AGA CAT GAA GAG ACC CTC CCA AGA GAA 822 Lys He He Glu Asn Phe Val Arg His Glu Glu Thr Leu Pro Arg Glu 250 255 260
TTG AAA AGG CAC CTA AAT TCC TTA GAA GAA CAG CTT TTG GAA AGC ATG 870 Leu Lys Arg His Leu Asn Ser Leu Glu Glu Gln Leu Leu Glu Ser Met 265 270 275 280 GCA TGG GAG AAA GGT TCA TCA TTG TAT AAC TCΛ CTG ATT GTT GCC AGG 918 Ala Trp Glu Lys Gly Ser Ser Leu Tyr Asn Ser Leu lie Val Ala Arg 285 290 295
CCA TCT GTT GCT. TCA GAA ATA AAC CGC CTT GGT CTT TTG GCT GAA CCA 966 Pro Ser Val Ala Ser Glu He Asn Arg Leu Gly Leu Leu Ala Glu Pro 300 305 310
ATG CCA TCT CTT GAT GAC TTA GTG TCA AGG CAG AAT GTT CGT ATC GAG 1014 Met Pro Ser Leu Asp Asp Leu Val Ser Arg Gln Asn Val Arg He Glu 315 320 325
GGC TTG CCT GCT ACÁ CCA TCT AAA AAA CGT GCT GCT GGT CCA GAT GAC 1062 Gly Leu Pro Ala Thr Pro Ser Lys Lys Arg Ala Ala Gly Pro Asp Asp 330 335 340
AAC GCT GAT CCT CGA TCA CCA AAG AGA TCG TGC AAT GAA TCT AGG AAC 1 110 Asn Ala Asp Pro Arg Ser Pro Lys Arg Ser Cys Asn Glu Ser Arg Asn 345 350 355 360
ACÁ GTA GTA GAG CGC AAT TTG CAG ACÁ CCT CCA CCC AAG CAÁ AG C CAC 1 158 Thr Val Val Glu Arg Asn Leu Gln Thr Pro Pro Pro Lys Gln Ser His 365 370 375
ATG GTG TCA ACT AGT TTG AAA GCA AAA TGC CAT CCA CTC CAG TCC ACÁ 1206 Met Val Ser Thr Ser Leu Lys Ala Lys Cys His Pro Leu Gln Ser Thr 380 385 390
TTT GCA AGT CCA ACT GTC TGT AAT CCT GTT GGT GGG AAT GAA AAA TGT 1254 Phe Ala Ser Pro Thr Val Cys Asn Pro Val Gly Gly Asn Glu Lys Cys 395 400 405
GCT GAC GTG ACÁ ATT CAT ATA TTC TTT TCC AAG ATT CTG AAG TTG GCT 1302 Ala Asp Val Thr He His He Phe Phe Ser Lys He Leu Lys Leu Ala 410 415 420 GCT ATT AGA ATA AGA AAC TTG TGC GAA AGG GTT CAÁ TGT GTG GAA CAG 1350 Ala lie Arg lie Arg Asn Leu Cys Glu Arg Val Gln Cys Val Glu Gln 425 430 435 440
ACÁ GAG CGT GTC TAT AAT GTC TTC AAG CAG ATT CTT GAG CAÁ CAG ACÁ 1398 Thr Glu Arg Val Tyr Asn Val Phe Lys Gln He Leu Glu Gln Gln Thr 445 450' 455
ACÁ TTA TTT TTT AAT AGA CAC ATC GAT CAÁ CTT ATC CTT TGC TGT CTT 1446 Thr Leu Phe Phe Asn Arg His He Asp Gln Leu He Leu Cys Cys Leu 460 465 470
TAT GGT GTT GCA AAG GTT TGT CAÁ TTA GAA CTC ACÁ TTC AGG GAG ATA 1494 Tyr Gly Val Ala Lys Val Cys Gln Leu Glu Leu Thr Phe Arg Glu He 475 480 485
CTC AAC AAT TAC AAA AGA GAA GCA CAÁ TGC AAG CCA GAA GTT TTT TCA 1542 Leu Asn Asn Tyr Lys Arg Glu Ala Gln Cys Lys Pro Glu Val Phe Ser 490 495 500
AGT ATC TAT ATT GGG AGT ACG AAC CGT AAT GGG GTA TTA GTA TCG CGC 1590 Ser He Tyr He Gly Ser Thr Asn Arg Asn Gly Val Leu Val Ser Arg 505 510 515 520
CAT GTT GGT ATC ATT ACT TTT TAC AAT GAG GTA TTT GTT CCA GCA GCG 1638 His Val Gly He lie Thr Phe Tyr Asn Glu Val Phe Val Pro Ala Ala
525 530 535
AAG CCT TTC CTG GTG TCA CTA ATA TCA TCT GGT ACT CAT CCA GAA GAC 1686 Lys Pro Phe Leu Val Ser Leu He Ser Ser Gly Thr His Pro Glu Asp 540 545 550
AAG AAG AAT GCT AGT GGC CAÁ ATT CCT GGA TCA CCC ΛAG CCA TCT CCT 1734 Lys Lys Asn Ala Ser Gly Gin He Pro Gly Ser Pro Lys Pro Ser Pro 555 560 565 TTC CCA AAT TTA CCA GAT ATG TCC CCG AAG AAA GTT TCA GCA TCT CAT 1782 Phe Pro Asn Leu Pro Asp Met Ser Pro Lys Lys Val Ser Ala Ser His 570 575 580
AAT GTA TAT GTG TCT CCT TTG CGG CAÁ ACC AAp TTG GAT CTA CTG CTG 1830 Asn Val Tyr Val Ser Pro Leu Arg Glπ Thr Lys Leu Asp Leu Leu Leu 585 ' 590 > 595 600
TCA CCA AGT TCC AGG AGT TTT TAT GCA TGC ATT GGT GAA GGC ACC CAT 1878 Ser Pro Ser Ser Arg Ser Phe Tyr Ala Cys lie Gly Glu Gly Thr His 605 610 615
GCT TAT CAG AGC CCA TCT AAG GAT TTG GCT GCT ATA AAT AGC CGC CTA 1926 Ala Tyr Gln Ser Pro Ser Lys Asp Leu Ala Ala He Asn Ser Arg Leu 620 625 630
AAT TAT AAT GGC AGG AAA GTA AAC AGT CGA TTA AAT TTC GAC ΛTG GTG 1974 Asn Tyr Asn Gly Arg Lys Val Asn Ser Arg Leu Asn Phe Asp Met Val 635 640 645
AGT GAC TCA GTG GTA GCC GGC AGT CTG GGC CAG ATA AAT GGT GGT TCT 2022 Ser Asp Ser Val Val Ala Gly Ser Leu Gly Gln lie Asn Gly Gly Ser 650 655 660
ACC TCG GAT CCT GCA GCT GCA TTT AGC CCC CTT TCA AAG AAG AGA GAG 2070 Thr Ser Asp Pro Ala Ala Ala Phe Ser Pro Leu Ser Lys Lys Arg Glu 665 670 675 680
ACÁ GAT ACT TGATCAATTA TAAATGGTGG CCTCTCTCGT ATATAGCTCA 2119
Thr Asp Thr
CAGATCCGTG CTCCGTAGCA GTCTATTCTTCTGA ATAAGTGGATTAACTG G AGCGATTTA 2179
ACTGTACATG TATGTGTTAGTGAGAAGCAGCAGTTTTTAG GCAGCAAACTGTTTCAAGTT2239
AGCTTTTGAG CTATCACCΛTTTCTCTGCTG ATTGAACATA TCCGCTGTGT AGAGTGCTAA 2299 TGAATCTTTA GTπTCATTG GGCTGACATA ACAAΛTCTTT ATCCTAGTTG GCTGGTTGTT 2359
GGGAGGCATTCATCAGGGTTATATTTGGTTGTCAAAAAGTACTGTACTTAATTCACATCT24I9
TTCACATTTTTCACTAGCAA TAGCAGCCCC AAATTGCTTT CCTG ACTAGG AACATATTCT 2479
TTACAGGTAT AAGCATGCCA ACTCTAAACT ATATGAATCC TTTTTATATTCTCATTTTTA 2539
AGTACTTCTC TGTTTCTGCT ACTTTTOTAC TGTATATTTC C AGCTTCTCC ATC AGACTG A 2599
TGATCCCATATTCAGTGTGCTGCAAGTGATTTGACCATATGTGGCTTATCCTTCAGGTAT 2659
GTCTCATGTT GTGACTTCAT TGCTGATTGC TTTTGTA ATG GTACTGTTG A GTTCATTTCT 2719
GGTTACAATCAGCCTTrACTGCTTTATATrGTTCTACTAATTTTGGCTTG CACAGCCAGG 2779
ACGATTGGTT TTCTGCATCA ATCAATCTTTTTTAGG ACAA GATATTTTTG TATGCTACAC 2839
TTCCCAAATTGC\ATTAATCCAGAAGTCTACCTTGTTTTATTCTATTAGTTCTCAGCAAC 2899
AGTGAATGAATATGAATCAGTCATGCTGATAGATGrrCATCTGGTTATTCCAAACAATCT2959
GACATCGCATCTCTTTCTGCAAGTGAGATGAAGAAAACCTGAAATGCTATCACCATTTAA3019
AACATTGGCTTCTGGAAGTTCAGGTGATTAGCAGGAGACGTTCTGACArrGCCATTGACA3079
TGTACGGTAG TGATGGCAGG AGACGTTCTT AAACAGCAGC TGCTCCTTCA GCTTGTAATG 3139
TCTGATTGTATTGACCAAGAGCATCCACCTTGCCTTATGGTACTAACTGA ATGAGCTGGT 3199
GACGCTGACTCATCTC<:ATAATGGCAGATGCTTAACCATCTTTAGGAGCTCATGTCATGA3259
TTCCAGCTGC ACCGTGTCAA ATGTGAAGGC CCTGCAAGGC TTTCCAGGCC GCACCAATCC 3319
TGCTTGCTTC TTGAAGATAC ATATGGTGCC ACCTAAATAA AAGCTGTTTC TGGTTATGTC 3379
TGTCCTTGAC ATGTCAACAG ATTAGTGTTG GGTTGCAGTC ATGTGGTGTTTAAGTCTTGG 3439 AGAAGGCGAGAAGTCATTGCΓGCCAGCATTGTGATCGTCAGGCACAGAAGTACTCAAAAG3499
TGAGAGCTAC TTGTTGCGAG CAAACGGAGG GCGATATAGG TTGATAGCCA ATTTCAGTTC3559
TCTATATACAAGCAGCGGATTTTGTTrAGAGTTAGCITrTGAGATGCATCATTτCTrTCΛ 3619
CATCTGATTCTGTGTGTTGTAACTCGGAGTCGCGTAGAAGTTAGAATGCTAACTGACCTT 3679
AATTTTCACCGAATAATTTG CTAGCGTTTTTCAGTATGAA ΛTCCTTGTCTTAAAAAAAAA 3739
AAAAAAAA 3747
( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 2 :
( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD : 683 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal
( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID NO : 2 :
Met Glu Cys Phe Gln Ser Asn Leu Glu Lys Met Glu Lys Leu Cys Asn 1 5 10 15
Ser Asn Ser Cys Lys Gly Glu Leu Asp Phe Lys Ser lie Leu He Asn 20 25 30
Asn Asp Tyr He Pro Tyr Asp Glu Asn Ser Thr Gly Asp Ser Thr Asn 35 40 45
Leu Gly His Ser Lys Cys Ala Phe Glu Thr Leu Ala Ser Pro Thr Lys 50 55 60
Thr lie Lys Asn Met Leu Thr Val Pro Ser Ser Pro Leu Ser Pro Ala 65 70 75 80 Thr Gly Gly Ser Val Lys He Val Gln Met Thr Pro Val Thr Ser Ala 85 90 95
Met Thr Thr Ala Lys Trp Leu Arg Glu Val He Ser Ser Leu Pro Asp •100 105 1 10
Lys Pro Ser Ser Lys Leu Gln Gln Phe Leu Ser Ser Cys: Asp Arg Asp 1 15 120 125
Leu Thr Asn Ala Val Thr Glu Arg Val Ser He Val Leu Glu Ala He 130 135 140
Phe Pro Thr Lys Ser Ser Ala Asn Arg Gly Val Ser Leu Gly Leu Asn 145 150 155 160
Cys Ala Asn Ala Phe Asp He Pro Trp Ala Glu Ala Arg Lys Val Glu 165 170 175
Ala Ser Lys Leu Tyr Tyr Arg Val Leu Glu Ala He Cys Arg Ala Glu 180 185 190
Leu Gln Asn Ser Asn Val Asn Asn Leu Thr Pro Leu Leu Ser Asn Glu 195 200 205
Arg Phe His Arg Cys Leu He Ala Cys Ser Ala Asp Leu Val Leu Ala 210 215 220
Thr His Lys Thr Val He Met Met Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Thr 225 230 235 240
Gly Leu Thr Ala Phe Asp Leu Ser Lys He He Glu Asn Phe Val Arg
245 250 255
His Glu Glu Thr Leu Pro Arg Glu Leu Lys Arg His Leu Asn Ser Leu 260 265 270 Glu Glu Gln Leu Leu Glu Ser Met Ala Trp Glu Lys Gly Ser Ser Leu 275 280 285
Tyr Asn Ser Leu He Val Ala Arg Pro Ser Val Ala Ser Glu He Asn 290 295 300
Arg Leu Gly Leu Leu Ala Glu Pro Met Pro Ser Leu Asp Asp Leu Val
305 310 315 320
Ser Arg Gln Asn Val Arg He Glu Gly Leu Pro Ala Thr Pro Ser Lys
325 330 335
Lys Arg Ala Ala Gly Pro Asp Asp Asn Ala Asp Pro Arg Ser Pro Lys 340 345 350
Arg Ser Cys Asn Glu Ser Arg Asn Thr Val Val Glu Arg Asn Leu Gln 355 360 365
Thr Pro Pro Pro Lys Gln Ser His Met Val Ser Thr Ser Leu Lys Ala 370 375 380
Lys Cys His Pro Leu Gln Ser Thr Phe Ala Ser Pro Thr Val Cys Asn 385 390 395 400
Pro Val Gly Gly Asn Glu Lys Cys Ala Asp Val Thr lie His He Phe 405 410 415
Phe Ser Lys He Leu Lys Leu Ala Ala He Arg He Arg Asn Leu Cys 420 425 430
Glu Arg Val Gln Cys Val Glu Gln Thr Glu Arg Val Tyr Asn Val Phe 435 440 445
Lys Gln He Leu Glu Gln Gln Thr Thr Leu Phe Phe Asn Arg His He 450 455 460 Asp Gln Leu He Leu Cys Cys Leu Tyr Gly Val Ala Lys Val Cys Gln 465 470 475 480
Leu Glu Leu Thr Phe Arg Glu He Leu Asn Asn Tyr Lys Arg Glu Ala 485 490 495
Gln Cys Lys Pro Glu Val Phe Ser Ser He Tyr He Gly Ser Thr Asn 500 505 510
Arg Asn Gly Val Leu Val Ser Arg His Val Gly He He Thr Phe Tyr
515 520 525
Asn Glu Val Phe Val Pro Ala Ala Lys Pro Phe Leu Val Ser Leu He
530 535 540
Ser Ser Gly Thr His Pro Glu Asp Lys Lys Asn Ala Ser Gly Gln He 545 550 555 560
Pro Gly Ser Pro Lys Pro Ser Pro Phe Pro Asn Leu Pro Asp Met Ser 565 570 575
Pro Lys Lys Val Ser Ala Ser His Asn Val Tyr Val Ser Pro Leu Arg 580 585 590
Gln Thr Lys Leu Asp Leu Leu Leu Ser Pro Ser Ser Arg Ser Phe Tyr 595 600 605
Ala Cys He Gly Glu Gly Thr His Ala Tyr Glπ Ser Pro Ser Lys Asp 610 615 620
Leu Ala Ala He Asn Ser Arg Leu Asn Tyr Asn Gly Arg Lys Val Asn 625 630 635 640
Ser Arg Leu Asn Phe Asp Met Val Ser Asp Ser Val Val Ala Gly Ser 645 650 655
Leu Gly Gln He Asn Gly Gly Ser Thr Ser Asp Pro Ala Ala Ala Phe 660 665 670
Ser Pro Leu Ser Lys Lys Arg Glu Thr Asp Thr 675 ' 680
27a
INDICACIÓN RELATIVA AL DEPOSITO DE UN MICRO-ORGANISMO
El micro-organismo a que se hace referencia en la página 7 de la descripción ha sido depositado en la institución siguiente :
COLECCIÓN ESPAÑOLA DE CULTIVOS TIPO (CECT) Departamento de Microbiología Facultad de Ciencias Biológicas 46100 BURJASOT (Valencia) España
Identificación del depósito: pBS.Rbl
Fecha de depósito: 12 Junio 1996
No. de orden: 4699
Estas indicaciones aparecen reflejadas en el formulario PCE/RO/134 adjunto al petitorio.

Claims

- 28 - REIVINDICACIONES
1. Uso de una proteína de retinoblastoma (Rb) para el control del crecimiento de células vegetales y/o virus vegetales.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus requiere la integridad de un motivo de aminoácidos LXCXE en una de sus proteínas para la reproducción normal.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el virus es un Geminivirus.
4. Un procedimiento para controlar el crecimiento de una célula vegetal o de un virus vegetal dentro de esa célula, que comprende el aumento o disminución del nivel y/o actividad de una proteína de retinoblastoma en esa célula vegetal .
5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 , caracterizado porque el nivel de proteína se aumenta por aplicación directa.
6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el nivel de proteína se aumenta mediante la introducción de ADN o ARN que codifica para su expresión, en la célula vegetal que se desea tratar.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, 5 ó 6, en el que la proteína se sobre-expresa.
8. Un procedimiento para controlar el crecimiento de una célula vegetal o de un virus vegetal, que comprende expresar una proteína Rb o un fragmento peptídico de la - 29 - misma que interacciona con el motivo LXCXE del virus, pero no afecta al funcionamiento normal de la célula, de forma que se inhibe el crecimiento vegetal o el crecimiento viral normal .
9. Ácido nucleico recombinante que codifica para la expresión de una proteína Rb que tiene una o varias características de la proteína Rb vegetal no compartidas por la proteína Rb animal .
10. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende una o varias regiones características que difieren del ácido nucleico de la proteína Rb animal conocido.
11. Ácido nucleico recombinante en forma de ADN o ARNc que codifica para una proteína Rb vegetal que tiene subdominíos de bolsillo A y B que tienen una secuencia con una homología del 30% al 75% con la proteína Rb humana.
12. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, que tiene una secuencia con una homología del 30% al 75% con la proteína de retinoblastoma Rb pl30.
13. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque tiene una homología del 50% al 64% con la proteína de retinoblastoma Rb animal o pl30.
14. Ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 que codifica para el aminoácido C706 de la Rb humana.
15. Ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en la que la secuencia - 30 - espaciadora entre los bolsillos A y B no se conserva con respecto a proteínas animales .
16. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la secuencia espaciadora tiene una homología menor del 50% con respecto a la misma región encontrada en proteínas de retinoblastoma animal.
17. Ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 que tiene una homología del 80% o mayor con el de la ΞEC NO 2.
18. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la homología es del 90% o mayor.
19. ADN recombinante que comprende una secuencia que corresponde a la SEC ID No 1, bases 31 a 2079.
20. ADN recombinante que comprende una secuencia que corresponde a la SEC ID No 1 o que corresponde a ARN que codifica para el clon de ADNc de maíz que codifica ZmRbl de SEC ID No 2.
21. Proteína codificada por el ADN o el ARN recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20 o nuevas proteínas derivadas de dicho ADN o ARN, y proteína derivada de ADN o ARN que se produce de forma natural alterado por medios mutagénicos .
22. Proteína de acuerdo con la reivindicación 21, en la que el medio mutagénico comprende mutagénesis usando cebadores de PCR mutagénicos.
23. ADN o ARN antisentido de un gen que codifica una proteina retinoblastoma de planta, un gen que posee la - 31 - secuencia de ácido nucleico como la que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20.
24. Vectores, células, plantas o animales que comprenden el ADN o el ARN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21.
25. Un método de controlar el crecimiento y/o la proliferación de una célula vegetal o de un virus de plantas que comprende la disminución de los niveles de proteina retinoblastoma de plantas en la célula por incorporación a la célula de ADN o ARN antisentido a la proteina retinoblastoma.
26. ADNc que codifica una proteina como se reivindica en la reivindicación 21.
27. Un ácido nucleico que codifica una proteina en la que uno o más de estos sitios están alterados o delecionados, haciendo a la proteína más resistente a la fosforilación y así, a su funcionalidad, por ejemplo, unión a E2F o similares .
28. Una proteína codificada por el ácido nucelico que se describe en la reivindicación 27.
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