DE102009045268A1

DE102009045268A1 - Neue Marker für die Diagnose von Zöliakie

Info

Publication number: DE102009045268A1
Application number: DE102009045268A
Authority: DE
Inventors: Karl Dr. Skriner
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2009-10-01
Filing date: 2009-10-01
Publication date: 2011-04-07
Also published as: US20120225442A1; US20170342111A1; EP2483291B1; US9221881B2; WO2011039350A1; ES2563731T3; EP2483291A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf neue Peptide sowie auf deren Verwendung in der Diagnose von Zöliakie.

Description

Die Zöliakie (nach ICD-10, Version WHO 2006: K90.0), auch glutensensitive oder gluteninduzierte Enteropathie, intestinaler Infantilismus; bei Erwachsenen auch nichttropische oder einheimische Sprue, Glutenunverträglichkeit oder Heubner-Herter-Krankheit genannt, ist eine chronische Erkrankung der Dünndarmschleimhaut auf Grund einer Überempfindlichkeit gegen Gluten, ein Protein das in vielen Getreidesorten vorkommt. Die Unverträglichkeit bleibt lebenslang bestehen, sie ist zum Teil genetisch determiniert und kann derzeit nicht ursächlich behandelt werden.
Durch glutenhaltige Nahrungsmittel entsteht eine Entzündung der Dünndarmschleimhaut mit oft ausgedehnter Zerstörung der Darmepithelzellen. Dadurch können Nährstoffe nur schlecht aufgenommen werden und verbleiben unverdaut im Darm. Symptome sind dementsprechend Gewichtsverlust, Durchfall, Erbrechen, Appetitlosigkeit, Müdigkeit, Misslaunigkeit und im Kindesalter nicht zuletzt eine Gedeihstörung. Die Schwere des Krankheitsbildes kann sehr unterschiedlich sein, was eine frühzeitige Diagnose erschwert. Eine nicht therapierte Zöliakie erhöht die Gefahr des Auftreten eines Non-Hodgkin-Lymphoms sowie auch für Karzinome des Verdauungstrakts, wie Darmkrebs. Die Behandlung der Zöliakie besteht derzeit ausschließlich in einer glutenfreien Diät.
Inzwischen sind eine Reihe von schädigenden Peptidfragmenten des Glutens identifiziert worden. Sie gehören alle der alkohollöslichen Fraktion an (sogenannte Prolamine) und werden Gliadin genannt. Bei entsprechend veranlagten Menschen führen diese Peptidfragmente zu einer komplexen Reaktion der Darmschleimhaut und des Immunsystems. Schleimhautzellen des Dünndarmes produzieren vermehrt verschiedene HLA-Klassen (HLA I, DR und DQ). Bestimmte Gliadinpeptide binden an die vermehrt gebildeten HLA-DQ2. Diese Bindung wird dadurch verstärkt, dass aus der zahlreich im Peptid vorhandenen Aminosäure Glutamin Glutaminsäure gebildet wird. Diese Glutaminsäurebildung wird durch das Enzym Gewebstransglutaminase, insbesondere durch Gewebstransglutaminase 2 (tTG2) vermittelt. Mit dieser Veränderung passt der entsprechende Abschnitt des Gliadin besser in die „Taschen” der HLA-Proteine. Der Komplex aus Gliadinpeptid und HLA-DQ2 bindet wiederum an CD4+-T-Helferzellen und ruft in diesen eine vermehrte Produktion von verschiedenen entzündungsauslösenden Botenstoffen hervor, beispielsweise Interferon-γ, TNF-α, Interleukin-6 und Interleukin-2. Im weiteren Prozess der Entzündung werden verschiedene Antikörper gebildet. Neben Antikörpern gegen Gliadinpeptide selbst (Gliadin-Antikörper, AGA) treten auch sogenannte Autoantikörper gegen körpereigene Antigene auf. Die Gewebstransglutaminase, insbesondere tTG2, wurde als hauptsächlich verantwortliches Autoantigen identifiziert. Aufgrund dieser Befunde wird die Zöliakie aus pathophysiologischer Sicht als eine Mischform aus Allergie und Autoimmunerkrankung verstanden. Dabei stellt die allergische Komponente in Form der Überempfindlichkeit gegen das körperfremde Protein Gliadin den auslösenden Faktor dar, während für die Ausprägung der Symptome die autoimmunologische Reaktion gegen körpereigene Strukturen verantwortlich ist. Letztlich endet der Entzündungsvorgang in einer Apoptose der Enterozyten, die schließlich zu einem mehr oder weniger ausgeprägten Verlust von Dünndarmzotten führt. Die so geschädigte Dünndarmschleimhaut ist nun nicht mehr in der Lage, die zugeführte Nahrung in ausreichendem Umfang in die Blutbahn zu überführen, weil die Resorptionsfläche verkleinert ist.
In der serologischen Diagnostik der Zöliakie wird üblicherweise auf das Vorhandensein von Antikörpern des IgA- und/oder des IgG-Typs gegen Gliadin oder tTG2 getestet. Ein Problem der bekannten diagnostischen Marker ist, dass die Sensitivität der Tests noch nicht optimal ist. Insbesondere die Tests auf Vorhandensein von Gliadin-Antikörper weisen geringe Sensitivitäten von weniger als 80% auf. Bekannte Tests auf tTG2-Antikörper sind zwar insgesamt sensitiver, allerdings handelt es sich bei den informativen Epitopen der tTG2 um sogenannte Konformitätsepitope, d. h. Epitope, die von Antikörpern nur erkannt werden können, wenn tTG2 im nicht-denaturierten Zustand präsentiert wird. Damit sind Tests auf tTG2-Antikörper auf solche Testmethoden limitiert, bei denen das tTG2-Antigen im nicht-denaturierten Zustand angeboten wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einen oder mehrere Nachteile des Standes der Technik zu vermindern oder zu vermeiden. Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue Marker für die Diagnose von Zöliakie bereitzustellen.
Die Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung eines Peptids enthaltend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz mit der SEQ ID No. 1. Wobei das erfindungsgemäße Peptid bevorzugt eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID No. 2, der SEQ ID No. 3 oder der SEQ ID No. 4 enthalten oder daraus bestehen kann.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass das erfindungsgemäße Peptid spezifisch von Antikörpern erkannt wird, die von Zöliakie-Patienten gebildet werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass mittels des erfindungsgemäßen Peptids auch solche Zöliakie-Patienten identifiziert werden können, die mit einem oder mehreren der herkömmlichen serologischen Zöliakie-Diagnose-Tests nicht erkannt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass das erfindungsgemäße Peptid kein sogenanntes Konformationsepitop darstellt, sondern auch in denaturierter Form von Antikörpern aus Patientenseren erkannt werden kann. Damit eignet sich das Peptid auch für Testformen und -varianten, die mit auf beispielsweise tTG2 basierenden Tests bislang nicht zugänglich sind und bei denen das Epitop zum Antikörpernachweis im denaturierten Zustand eingesetzt wird, wie z. B. sogenannte „Western-Blotting”-Verfahren. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass ein erfindungsgemäßes Peptid umfassend eine Sequenz mit der SEQ ID No. 1, 2, 3 und/oder 4 und die Sequenz der humanen tTG2 verwendet werden kann, um einen Zöliakie-Diagnose-Test bereitzustellen, der eine Sensitivität aufweist, die höher ist als die Sensitivität jedes bekannten Zöliakie-Diagnose-Tests.
Unter dem Begriff „Peptid” wird für die Zecke der vorliegenden Erfindung jedes Molekül verstanden, dass eine Peptidbindung zwischen mindestens zwei Aminosäuren aufweist. Eine Peptidbindung (-NH-CO-) ist eine amidartige Bindung zwischen der Carboxylgruppe einer ersten Aminosäure und der Aminogruppe einer zweiten Aminosäure. Grundsätzlich umfasst der Begriff „Peptid” somit Dipeptide, Oligopeptide, Polypeptide und Proteine, wobei die Peptide Modifikationen aufweisen können.
Das erfindungsgemäße Peptid weist mindestens eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID No. 1 auf und damit mindestens eine Aminosäuresequenz von 24 Aminosäuren. Das erfindungsgemäße Peptid kann darüber hinaus noch mehr Aminosäuren bzw. Aminosäuresequenzen umfassen.
Aminosäuren sind eine Klasse organischer Verbindungen mit mindestens einer Carboxylgruppe (-COOH) und einer Aminogruppe (-NH₂). Bei den im erfindungsgemäßen Peptid vorkommenden Aminosäuren handelt es sich bevorzugt um α-, β- oder γ-Aminosäuren, besonders bevorzugt um α-Aminosäuren. Dabei können in dem Peptid Aminosäuren der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren enthalten sein, aber auch nicht-natürlich vorkommende α-, β- oder γ-Aminosäuren.
Eine oder mehrere Aminosäuren des erfindungsgemäßen Peptids können modifiziert sein. Unter einer modifizierten Aminosäure wird eine Aminosäure verstanden, die an ihrer Seitenkette eine funktionale Gruppe trägt. Eine funktionale Gruppe zeichnet sich dadurch aus, dass die Gruppe dem Peptid eine Funktion oder Eigenschaft hinzufügt, die das erfindungsgemäße Peptid ohne die funktionale Gruppe nicht oder nicht in ausreichendem Maße besitzt, wobei die funktionale Gruppe nicht direkt an der spezifischen Bindung des erfindungsgemäßen Peptids an Antikörper aus Zöliakie-Patienten-Seren beteiligt ist. Beispiele für eine funktionale Gruppe sind Markergruppen, die beispielsweise einen Nachweis, eine Anreicherung und/oder eine Reinigung des erfindungsgemäßen Peptids erlauben wie z. B. GFP, His-Tag, AVI-Tag, Biotin-Tag, etc.. Andere funktionale Gruppen sind Kopplungsgruppen, die z. B. die reversible oder irreversible Kopplung oder Immobilisierung des erfindungsgemäßen Peptids an andere Moleküle und/oder Träger erlauben. Mittels dieser Kopplungsgruppen lässt sich das erfindungsgemäße Peptid beispielsweise an ein Molekül wie beispielsweise BSA oder einen Mikropartikel binden oder auf einem ggf. entsprechend vorbereiteten Träger immobilisieren. Ein biotinyliertes Peptid kann beispielsweise sehr effektiv auf einer mit Streptavidin (Neutravidin) vorbehandelten Oberfläche immobilisiert werden. Beispiele für solche Kopplungsgruppen sind Biotin, Streptavidin, etc. Es können aber auch chemisch reaktive Gruppen, wie Carboxyl-, Amino- oder Amid-Gruppen verwendet werden. Dem Fachmann sind geeignete Marker- und/oder Kopplungsgruppen bekannt.
Neben der Möglichkeit, dass Seitenketten einzelner Aminosäuren des erfindungsgemäßen Peptids Modifikationen tragen können, umfasst die vorliegende Erfindung auch Peptide, die an ihrem N- und/oder C-Terminus Modifikationen tragen. Neben den bereits oben genannten funktionalen Gruppen kann das Peptid am N- und/oder C-Terminus auch funktionale Gruppen aufweisen, die beispielsweise die Stabilität des Peptids erhöhen oder die Zugänglichkeit des im erfindungsgemäßen Peptid enthaltenen Epitops erleichtern. So kann beispielsweise die Kopplung des Peptids an Antikörper das Peptid stabiler machen.
Das erfindungsgemäße Peptid kann neben den Aminosäuresequenzen mit der SEQ ID No. 1, 2, 3 und/oder 4 noch weitere Aminosäuresequenzen aufweisen. Das Peptid kann beispielsweise auch mehrere Kopien einer Sequenz mit der SEQ ID No. 1, 2, 3 und/oder 4 umfassen.
Das erfindungsgemäße Peptid kann eine oder mehrere Aminosäuresequenzen aufweisen, die als Linker und/oder funktionale Gruppe fungieren. So können z. B. zwei Aminosäuresequenzbereiche eines Peptids durch einen Linker miteinander verbunden vorliegen. Als Linker kann dabei beispielsweise eine Aminosäuresequenz bezeichnet werden, die zwei zu verbindende Teile des erfindungsgemäßen Peptids mittels Peptidbindungen zu einer ununterbrochenen Aminosäurekette verbindet. Solche Linker können auch als Peptidlinker bezeichnet werden. Ein Teil des erfindungsgemäßen Peptids kann auch als funktionale Gruppe ausgebildet sein. Bei dieser funktionalen Gruppe kann es sich beispielsweise um oben bereits beschriebene funktionale Gruppen handeln, die an einer Seitenkette einer oder mehrerer Aminosäuren des erfindungsgemäßen Peptids angebracht sind oder am N- und/oder C-Terminus des Peptids befinden. Sie können aber auch als Aminosäuresequenz ausgebildet sein und integraler Bestandteil der ununterbrochenen Aminosäurekette des erfindungsgemäßen Peptids sein. Solche peptidischen funktionalen Gruppen können Aminosäureketten von 1 oder mehr Aminosäuren umfassen oder ganze Proteine oder funktionale Untereinheiten von Proteinen beinhalten. Beispiele für solche funktionale Gruppen sind Marker zum Nachweis oder zur Reinigung wie z. B. His-Tag, GFP etc oder ausgewählte Epitope, wie beispielsweise Teile oder die gesamte Sequenz der humanen tTG2 (humane Gewebstransglutaminase 2) mit der SEQ ID No. 5.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße Peptid zusätzlich eine Sequenz von mindestens 25 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, bevorzugt von 100 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, aus der Sequenz des humanen tTG2 mit der SEQ ID No. 5 umfassen. Dabei können die Teilbereiche, die Bestandteil des erfindungsgemäßen Peptid sind, grundsätzlich aus jedem Teil der tTG2-Sequenz mit der SEQ ID No. 5 ausgewählt sein. Bevorzugt ist der Teilbereich derart ausgewählt, dass der Teilbereich mindestens ein Epitop umfasst, welches von Antikörpern aus Zöliakie-Patienten-Seren erkannt werden kann. Besonders bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Peptid neben einer oder mehrerer Aminosäuresequenzen mit der SEQ ID No. 1, 2, 3 und/oder 4 zusätzlich eine oder mehrere Teilsequenzen der tTG2 oder eine oder mehrere Kopien der gesamten Sequenz der tTG2 mit der SEQ ID No. 5. Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Peptid noch weitere Aminosäuresequenzen und/oder funktionale Gruppen umfassen, wie beispielsweise ein His-Tag, insbesondere ein 6 × His-Tag. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Peptid eine Sequenz mit der SEQ ID No. 6 [SEQ ID Nos 5 + 2] oder mit der SEQ ID No. 7 [SEQ ID Nos 5 + 2 + 2] aufweisen oder daraus bestehen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein erfindungsgemäßes Peptid zur Verwendung als Medikament, beispielsweise zur Verwendung in der Diagnose, insbesondere in der Diagnose von Zöliakie.
Das erfindungsgemäße Peptid kann entweder synthetisch hergestellt werden, durch kontrollierte Verkettung ausgewählter Aminosäuren. Alternativ kann das erfindungsgemäße Peptid auch gentechnisch hergestellt werden, indem eine für das entsprechende Peptid kodierende Nukleinsäure bereitgestellt und in einen Kontext gebracht wird, der die Expression und ggf. nachfolgende Reinigung des kodierten Peptids erlaubt. Die Expression kann beispielsweise in vitro erfolgen oder in transient oder stabil transfizierten Zellen oder in transformierten Mikroorganismen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und beschrieben z. B. in Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N. Y. (1989) und folgende.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein erfindungsgemäßes Peptid. Der Fachmann ist sich darüber im klaren, dass der genetische Code degeneriert ist und ist ohne unzumutbaren Aufwand in der Lage, ausgehend von einer bestimmten Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Peptids, die möglichen Nukleinsäuresequenzen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zu bestimmen. Unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes ist der Fachmann, ausgehend von einer gegebenen Nukleinsäuresequenz, ohne unzumutbaren Aufwand ebenfalls in der Lage eindeutig und unzweifelhaft zu bestimmen, ob die gegebene Nukleinsäure für ein erfindungsgemäßes Peptid kodiert oder nicht. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst DNA, RNA, Mischungen und/oder funktionale Derivate davon, insbesondere cDNA, genomische DNA, lineare oder zirkuläre DNA, z. B. Vektoren, mRNA, lineare oder zirkuläre RNA und kann teilweise oder ganz synthetisch oder gentechnisch hergestellt sein. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann einzelsträngig oder teilweise oder ganz als Doppelstrang vorliegen.
Bevorzugt handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Nukleinsäure um eine isolierte Nukleinsäure. „Isoliert” bedeutet für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, dass der isolierte Bestandteil aus seinem natürlichen Kontext herausgelöst vorliegt. Im folgenden ist am Beispiel einer isolierten Nukleinsäure beispielhaft verdeutlicht, was von dem Begriff „isoliert” mindestens umfasst ist. Eine Nukleinsäure ist beispielsweise dann isoliert, wenn sie durch den Menschen gezielt verändert worden ist und/oder wenn die Nukleinsäure in eine andere als die natürliche Umgebung oder an einen anderen als den natürlichen Locus verbracht worden ist. Eine Nukleinsäure ist auch dann isoliert im Sinne der Erfindung, wenn sie gereinigt oder getrennt von ihrer natürlichen Umgebung vorliegt, bevorzugt in im Wesentlichen reiner und/oder homogener Form oder im Wesentlichen frei von Nukleinsäuren, die nicht erfindungsgemäße Nukleinsäuren sind. Eine klonierte Nukleinsäure ist grundsätzlich eine isolierte Nukleinsäure.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch transformierte Mikroorganismen oder transformierte Zellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfassen. Dabei werden Mikroorgansimen und Zellen umfasst, die entweder transient oder stabil mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure transformiert bzw. transfiziert worden sind und diese in sich tragen, wobei die erfindungsgemäße Nukleinsäure im Mikroorganismus oder der Zelle beispielsweise frei oder ins Genom eingebaut vorliegen kann. Bei dem erfindungsgemäßen Mikroorgansimus handelt es sich um einzellige Organismen, bevorzugt um Bakterien oder einzellige Pilze wie z. B. Hefen. Bei den erfindungsgemäßen Zellen handelt es sich um Zellen mehrzelliger Organismen, bevorzugt um isolierte Zellen, beispielsweise um solche Zellen, die in vitro in Zellkultur kultiviert werden können. Es kann sich dabei z-B. um primäre Zellen handeln oder auch um immortalisierte Zellen. Insbesondere sind solche Mikroorganismen oder Zellen bevorzugt, die zur Produktion von Peptiden und/oder Proteinen herangezogen werden können oder bereits dazu genutzt worden sind.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf isolierte Antikörper, die an ein erfindungsgemäßes Peptid binden. Unter einem Antikörper wird dabei ein Protein verstanden welches eine oder mehrere spezifische Antigenbindungsstellen (CDR, complementarity determining region) aufweist. Antikörper im Sinne der Erfindung umfassen sowohl polyklonale oder monoklonale Antikörper mit klassischer Antikörperstruktur als auch davon abgeleitete Derivate oder Fragmente wie Fab, Fab2, single chains, usw.. Der Fachmann ist ohne unzumutbaren Aufwand in der Lage, ausgehend von einem bestimmten erfindungsgemäßen Peptid, einen isolierten Antikörper zu generieren, der spezifisch an dieses Peptid bindet. Entsprechende Techniken und Herangehensweisen sind dem Fachmann bekannt und Routine in der täglichen Laborpraxis. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen isolierten Antikörper auch dadurch generiert werden, dass die im Serum von Zöliakie-Patienten vorhandenen Antikörper mittels eines erfindungsgemäßen Peptids isoliert, gereinigt und damit zugänglich gemacht werden. Dazu kann z. B. das erfindungsgemäße Peptid an einen Träger gekoppelt vorliegen, der mit Peptid beladene Träger wird dann mit Zöliakie-Patienten-Serum in Kontakt gebracht. Unspezifisch gebundene Bestandteile des Serums werden entfernt und die spezifisch an das erfindungsgemäße Peptid gebundenen Antikörper werden anschließend eluiert.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können beispielsweise zum Nachweis von Pathogenen, beispielsweise von peptidischen Pathogenen, die mit der Erkrankung Zöliakie assoziiert sind verwendet werden, bevorzugt zum in vitro Nachweis solcher Pathogene. Bevorzugt können solche Pathogene in Nahrungsmitteln nachgewiesen werden, um beispielsweise bestimmte Nahrungsmittel für Zöliakie-Patienten freizugeben oder von der Liste verträglicher Nahrungsmittel zu streichen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Bestimmung der Unbedenklichkeit von Nahrungsmitteln für den Genuss durch Zöliakie-Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass mittels der isolierten Antikörper der Erfindung das Vorhandensein von Zöliakie-assoziierten Pathogenen in den betreffenden Nahrungsmitteln bestimmt wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum in vitro Nachweis von Antikörpern gegen ein erfindungsgemäßes Peptid in einer Probe. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass:

i) ein erfindungsgemäßes Peptid mit einer Probe in vitro in Kontakt gebracht wird; und
ii) an das Peptid gebundener Antikörper nachgewiesen wird.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „in vitro” jede Umgebung verstanden, die nicht innerhalb eines ganzen Organismus, beispielsweise eines menschlichen oder tierischen Körpers liegt.
Unter einem Antikörper wird dabei ein Protein verstanden, welches eine oder mehrere spezifische Antigenbindungsstellen (CDR, complementarity determining region) aufweist. Antikörper im Sinne der Erfindung umfassen sowohl polyklonale oder monoklonale Antikörper mit klassischer Antikörperstruktur als auch davon abgeleitete Derivate oder Fragmente wie Fab, Fab2, single chains, usw..
Unter einer Probe wird eine zu untersuchende Zusammensetzung verstanden. Bevorzugt handelt es sich bei der Probe um biologisches oder medizinisches Material, also Material, dass von einem Organismus, von Bestandteilen eines Organismus oder von Zellen gewonnen wird. Das Material kann, bevor es als Probe im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, weiteren Behandlungsschritten unterzogen werden, z. B. um das Material in einen Zustand zu versetzten, in dem es sich als Probe für das Verfahren besonders eignet. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Probe um Material, das aus einer Körperflüssigkeit gewonnen wurde oder aus einer Körperflüssigkeit besteht. Bevorzugte Körperflüssigkeiten sind Blut, Plasma, Serum, Synovialflüssigkeit, Urin, Stuhl, Interstitalflüssigkeit, Lymphe, Speichel, Schweiß, Spinalflüssigkeit und/oder Tränenflüssigkeit. Besonders bevorzugt sind solche Körperflüssigkeiten in denen Antikörper in hoher Konzentration zu finden sind. Ganz besonders bevorzugt ist die Körperflüssigkeit humanen Ursprungs.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein erfindungsgemäßes Peptid mit einer zu untersuchenden Probe in vitro in Kontakt gebracht. Der Schritt des Inkontaktbringens dient dazu, dass ggf. in der Probe enthaltene Antikörper die Möglichkeit haben an ein Epitop des erfindungsgemäßen Peptids zu binden. Dazu wird dieser Schritt unter Bedingungen und in einer Umgebung durchgeführt, die eine spezifische Antigen-Antikörper-Bindung erlauben. Dem Fachmann sind geeignete Bedingungen bekannt. Bevorzugt umfassen diese Bedingungen eine flüssige Umgebung und/oder das Inkontaktbringen bei einer Temperatur von > 0°C bis < 60°C. Das Inkontaktbringen wird bevorzugt über einen Zeitraum durchgeführt, der eine Ausbildung einer spezifischen Antigen-Antikörper-Bindung zwischen dem erfindungsgemäßen Peptid und ggf. in der Probe enthaltenem für das Peptid spezifischen Antikörper erlaubt. Der Schritt des Inkontaktbringens wird bevorzugt für einen Zeitraum von mehr als 30 Sekunden, besonders bevorzugt von mehr als 2 Minuten, ganz besonders bevorzugt für einen Zeitraum von 2 Minuten bis zu 48 Stunden durchgeführt.
In einem nachfolgenden Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Antikörper nachgewiesen, der an das erfindungsgemäße Peptid spezifisch gebunden ist. Der Nachweis spezifisch an das Peptid gebundenen Antikörpers kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass nach dem Inkontaktbringen nicht an das erfindungsgemäße Peptid gebundene Bestandteile der Probe entfernt werden, z. B. durch einen oder mehrere Wasch-, Reinigungs- oder Isolierungsschritte, und anschließend Mittel eingesetzt werden, die den spezifischen Nachweis von Antikörpern erlauben. Dabei kann der Nachweis in einem oder in mehreren Schritten erfolgen. Bei diesen Mitteln zum spezifischen Nachweis von Antikörpern kann es sich beispielsweise selbst um Antikörper handeln. Der Nachweis kann dann z. B. durch eine Farbreaktion erfolgen, die direkt oder indirekt durch die Mittel zum Nachweis von Antikörpern vermittelt oder ausgelöst wird. Beispielsweise können Antikörper zum Nachweis von spezifischen Antikörpern an funktionale Gruppen oder Moleküle gebunden sein (z. B. Enzyme), die in der Lage sind unter bestimmten Bedingungen eine Farbreaktion auszulösen oder zu vermitteln.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann das erfindungsgemäße Peptid während einem, mehrerer oder aller Schritte des Verfahrens an einen Träger immobilisiert vorliegen. Unter Immobilisierung wird hierbei jede Kopplung, Bindung oder anderweitige Assoziierung zwischen erfindungsgemäßem Peptid und Träger verstanden, die dazu führt, dass Peptid und Träger nicht getrennt voneinander bewegt werden können. Als Träger können beispielsweise Moleküle und/oder Oberflächen eingesetzt werden, die derart ausgestaltet sind, dass sie mit dem erfindungsgemäßen Peptid reversibel oder irreversibel verbindbar sind. Dazu können Träger und/oder erfindungsgemäßes Peptid funktionale Gruppen aufweisen, die eine Verbindung zwischen Peptid und Träger unterstützen und/oder ermöglichen. Beispielhaft seien als Träger Moleküle erwähnt, wie BSA, tTG oder Oberflächen, wie sie von Mikropartikeln, Nanopartikeln oder magnetischen Beads angeboten werden oder Oberflächen von ausgewählten Membranen, Polymeren (z. B. Polystyren) oder solche Oberflächen umfassende Mikrotiterplatten oder Teststreifen. Dem Fachmann sind geeignete Träger und Möglichkeiten zur Verbindung von Peptid und Träger bekannt.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße Verfahren als Immunassay-Verfahren durchgeführt werden, geeignete Immunassay-Verfahren sind beschrieben in David Wild (Ed.): The Immunoassay Handbook. 3. Auflage. Elsevier Science Publishing Company, Amsterdam, Boston, Oxford 2005.
Bevorzugt kann das erfindungsgemäße Verfahren als ELISA-Verfahren (ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay,) durchgeführt werden, geeignete ELISA-Techniken sind beispielsweise beschrieben in Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A. & Kuby, J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. In: Immunology, 5th ed., pp. 148–150. W. H. Freeman, New York, 2003. Dazu kann eine Probe mit einem an einen Träger immobilisierten erfindungsgemäßen Peptid in Kontakt gebracht werden, ggf. werden ungebundene Bestandteile teilweise oder im Wesentlichen entfernt, anschließend wird zum Nachweis von an das Peptid gebundenem Probenantikörper ein an eine funktionale Gruppe gekoppelter oder koppelbarer Antikörper verwendet. Der Nachweis erfolgt in der Regel über eine optisch nachweisbare Reaktion. Der Antikörper zum Nachweis kann beispielsweise spezifisch sein für Antikörper eines bestimmten Organismus oder eines bestimmten Ursprungs und/oder für eine bestimmte Form des Antikörpers, bevorzugt für einen bestimmten Isotyps z. B. Antikörper vom Typ IgA, IgM und/oder IgG, ganz besonders bevorzugt für humane IgA, IgM und/oder humane IgG.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann aber auch in anderen Verfahrensformaten durchgeführt werden, so z. B. bevorzugt als RIA (radio-immunologic assay) oder als Immunassay im Teststreifenformat.
Das vorliegende Verfahren eignet sich zum Nachweis von Antikörpern gegen ein erfindungsgemäßes Peptid, insbesondere zum Nachweis von Antikörpern vom Typ IgA, IgM und/oder IgG, bevorzugt zum Nachweis von Antikörpern humanen Ursprungs. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Diagnose, insbesondere zur serologischen Diagnose, bevorzugt zur Diagnose von Zöliakie verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dazu kann der Kit ein erfindungsgemäßes Peptid immobilisiert an einen Träger enthalten. Zusätzlich kann der Kit eine Anweisung zur Verwendung des Kits und/oder zur Durchführung des mit dem Kit durchführbaren erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten. Bevorzugt ist der Kit als ELISA oder insbesondere als Streifentest ausgeführt. Das heißt, der erfindungsgemäße Kit umfasst das erfindungsgemäße Peptid und ggf. weitere Bestandteile zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Form, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens im ELISA- und/oder Streifentestformat eignet. Insbesondere kann der Kit das erfindungsgemäße Peptid an einen Teststreifen gekoppelt umfassen. Der erfindungsgemäße Kit kann ggf. weitere Bestandteile zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthalten. Solche Bestandteile können beispielsweise Reaktionsgefäße, Filter, Lösungen und/oder andere Mittel umfassen. Insbesondere kann der erfindungsgemäße Kit Mittel zum Nachweis von Antikörpern enthalten, bevorzugt von Antikörpern des IgA-, IgM- und/oder des IgG-Typs, besonders bevorzugt zum Nachweis von Antikörpern humanen Ursprungs.
Der erfindungsgemäße Kit kann zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden. Insbesondere eignet sich der erfindungsgemäße Kit zur Verwendung in der Diagnose, bevorzugt in der serologischen Diagnose, ganz besonders bevorzugt in der Diagnose von Zöliakie.
Der erfindungsgemäße Kit kann dadurch gekennzeichnet sein, dass der Kit zusätzlich Mittel zum Nachweis von Antikörpern des IgA-, IgM und/oder des IgG-Typs enthält, bevorzugt zum Nachweis von humanen Antikörpern des IgA-, IgM und/oder des IgG-Typs.
Der erfindungsgemäße Kit kann insbesondere zur Diagnose von Zöliakie verwendet werden.
Figuren:
1 zeigt Sensitivitäten von kommerziell erhältlichen anti-Gliadin IgA bzw. IgG-ELISA sowie anti-tTG IgA bzw. IgG-ELISA im Vergleich zu CD3-ELISA, dabei ist die %-Häufigkeit an korrekt klassifizierten Zöliakie-Patientenseren als Maß für die Sensitivität jedes Tests angegeben.
2 zeigt Sensitivitäten von kommerziell erhältlichen anti-Gliadin IgA bzw. IgG-ELISA sowie anti-tTG IgA bzw. IgG-ELISA im Vergleich zu CDPtTG-ELISA und tTG-ELISA unter Protokoll des CDPtTG-ELISA, dabei ist die %-Häufigkeit an korrekt klassifizierten Zöliakie-Patientenseren als Maß für die Sensitivität jedes Tests angegeben.
3 zeigt Sensitivitätsüberschneidungen zwischen den einzelnen verwendeten ELISA-Formen, wobei dargestellt ist, wie viel % der von den angegebenen Tests nicht erkannten Zöliakie-Seren mit dem jeweiligen Assay positiv getestet wurden.
4 zeigt, dass CD3 spezifische Antikörper isoliert aus Patientenseren in der Lage sind spezifisch CDPtTG im Westernblot zu erkennen.
Beispiele:
1. Herstellung und Aufreinigung von CD3, tTG und CDtTG
CD3 mit der SEQ ID No. 4 wurde synthetisch hergestellt und am C-terminalen Lysinrest biotinyliert.
Humanes tTG2 mit der SEQ ID No. 5, im Folgenden als tTG bezeichnet, wurde für die rekombinante Expression in einen Vektor mit spaltbarem 6 × His-tag kloniert und nach Standardprotokoll exprimiert, mittels NiNTA-Säulenaufreinigung isoliert und der 6 × His-tag wurde wieder entfernt.
CDPtTG mit der SEQ ID No. 6, im Folgenden auch als CDtTG bezeichnet, wurde für die rekombinante Expression ebenfalls in einen Vektor mit C-terminalem 6 × His-tag kloniert und nach Standardprotokoll exprimiert, mittels NiNTA-Säulenaufreinigung isoliert und der His-tag wurde wieder abgespalten.
2. ELISA für CD3, tTG (hausgemacht) und CDtTG
Für den Nachweis CD3 spezifischer Antikörper wurde ein CD3 Peptid-ELISA entwickelt, bei dem biotinyliertes CD3 mit der SEQ ID No. 4 zunächst an eine mit neutrAvidin beschichtete Mikrotiterplatter gekoppelt wurde und dann folgendes Protokoll verwendet wurde:
NeutrAvidin-CD3 Peptid ELISA
Zunächst wurden die Wells der Mikrotiterplatte mit PBS/5% MP Puffer über Nacht geblockt. Anschließend folgte der Auftrag der biotinylierten Peptide mit je 500 pmol/well in PBS Puffer. Nach einer Inkubation von 2 h wurden die CD3/neutrAvidinbeschichteten Platten 4 × mit PBS/0,1% Tween gewaschen und mit dem Patientenserum, mit einer Verdünnung von 1:800 in PBS/2% MP, 1 h lang inkubiert. Es wurde danach wiederum 4 × gewaschen, gefolgt vom Auftrag des Peroxidasekonjugierten 2.AK mit einer 1:5000 Verdünnung. Die Inkubation dauerte ebenfalls 1 h. Abschließend erfolgte wiederum 4 × waschen gefolgt vom Auftrag des Substrats. Die Reaktion mit Entwicklung der Blaufärbung wurde nach 5 min mit 0,5 M Schwefelsäure abgestoppt. Die resultierende Gelbfärbung wurde mittels des ELISA Readers photometrisch bei einer Messwellenlänge von 450 nm gegen die Referenzwellenlänge von 620 nm gemessen und mit Hilfe der Software Magellan dargestellt. Von allen Lösungen wurden pro Well 100 μl aufgetragen. Das Blocken und die einzelnen Waschschritte erfolgten mit je 300 μl pro Well. Die Inkubationen der Mikrotiterplatten mit Peptid, Patientenserum sowie des 2.AK erfolgten unter schütteln bei RT.
CDtTG-, tTG-ELISA-Protokoll:
Für den Nachweis tTG2- bzw. CDPtTG2-spezifischer Antikörper wurde ein spezifischer ELISA entwickelt, bei dem rekombinantes tTG mit der SEQ ID No. 5 und CDtTG mit der SEQ ID No. 6 zunächst an eine MaxiSorb Mikrotiterplatte (Nunc) gekoppelt wurde und dann wurde folgendes Protokoll verwendet:

A) Kopplungspuffer: 100 mM Tris, 10 mM NaCl pH 7,8
B) Waschpuffer: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% Tween 20 pH 7,4
C) Absättigungspuffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% BSA, 3% Saccharose pH 7,4
D) Serumverdünnungspuffer: 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Tween 20 pH 7,4

Durchführung:
Beschichtung auf MaxiSorp-Platten von Nunc: Beschichtungsmenge: CDPtTG sowie tTG wurden jeweils in einer Konzentration von 0,5 μg/well eingesetzt.
Beschichtungsvolumen: 100 μl/well. Alle tTG's werden in Kopplungspuffer A entsprechend verdünnt. Für die Beschichtung werden Platten ü. N. bei 40C inkubiert.
Bei der ELISA-Durchführung werden Blank und 2.AK-Kontrollen mitgeführt. Die OD-Werte der Blank- und 2.AK-Kontrollen werden bei der Auswertung des ELISAs abgezogen.
Die Platten werden nach der Beschichtung mit 3 × 300 μl/well Waschpuffer B gewaschen. Ein Waschschritt entspricht je 3 min 600 rpm auf dem ELISA-Schüttler. Anschließend blockt man die Platten mit 300 μl/well Absättungspuffer C für 2 h bei RT. Die Seren werden 1:800 in Serumverdünnungspuffer D verdünnt und mit 100 μl/well nach dem Blocken direkt auf Platten gegeben. Inkubation für 1 h bei RT unter Schütteln 5 × mit 300 μl/well mit Waschpuffer B waschen.
2.AK:

– <hlgA HRP von Dako wird 1:1500 in Waschpuffer B verdünnt und 100 μl/well eingesetzt;
– <hlgG>HRP von Dako wird in einer Verdünnung von 1:5000 ebenfalls in Waschpuffer B und 100 μl/well verwendet.

Inkubation für 1 h bei RT unter Schütteln. 4 × mit 300 μl/well mit Waschpuffer B waschen. Mit 100 μl/well TMB-Substrat (SeramunBlue fast) 5 min. reagieren lassen. Anschließend mit 100 μl/well Stopplsg (0,5 M H2SO4) stoppen und im ELISA-Reader bei 450 nm auswerten.
3. Kohorte der Zöliakie-Patienten-Seren
Im Zuge dieser Arbeit wurden humane Patientenseren von 91 Patienten mit positivem Zöliakie Befund, verschiedenen Alters, Geschlecht und pathologischer Charakteristik eingesetzt. Alle verwendeten Seren stammten aus der Poliklinik für klinische Rheumatologie der Charité. Des Weiteren wurden für diese Arbeit 80 Seren von Normalspendern als Kontrollgruppe bearbeitet und mit der Gruppe der Autoimmunerkrankungen verglichen.
4. Vergleich der erzielten Sensitivitäten für CD3-ELISA, tTG-ELISA, CDtTG-ELISA und kommerziell erhältliche Gliadin- und tTG-ELISA
Die unter Punkt 3 genannten Seren wurden nun in den unter Punkt 2 genannten ELISA-Tests eingesetzt. Parallel wurden dieselben Seren auch mit kommerziell erhältlichen Zöliakie-ELISA-Tests untersucht, die entweder auf Gliadin spezifische Antikörper reagieren oder auf tTG2 spezifische Antikörper. Dazu wurden kommerzielle anti-hutTG IgA bzw. IgG ELISA der Firma Generic Assays GmbH (Deutschland) und kommerzielle anti-Gliadin IgA bzw. IgG ELISA der Firma Generic Assays GmbH (Deutschland) eingesetzt.
Wie in 1 gezeigt, erwies sich der CD3-spezifische ELISA als sensitiver in der korrekten Klassifizierung von Zöliakie-Patientenseren im Vergleich zu den kommerziell erhältlichen anti-tTG bzw. anti-Gliadin ELISA.
Wie in 2 gezeigt waren die ELISA, die auf rekombinantem tTG2 basieren, ebenfalls den kommerziell erhältlichen anti-tTG und anti-Gliadin ELISA überlegen in bezug auf die Sensitivität. Der mit Abstand sensitivste ELISA für die korrekte Klassifizierung von Zöliakie-Patientenseren war der auf CDPtTG basierende ELISA. Das Vorhandensein der erfindungsgemäßen Peptid-Sequenz mit der SEQ ID No. 1 führt also insgesamt zu einem Zöliakie-ELISA mit verbesserter Sensitivität gegenüber kommerziellen ELISA und einem anti-tTG ELISA, der unter den selben Bedingungen wie der CDPtTG ELISA durchgeführt wurde.
Damit konnte nicht nur gezeigt werden, dass Peptide, die die erfindungsgemäße Peptidsequenz mit der SEQ ID No. 1 umfassen informativ sind und zur Diagnose von Zöliakie herangezogen werden können. Es konnte auch gezeigt werden, dass ein ELISA, der auf einem Peptid basiert, welches das erfindungsgemäße Peptid mit der SEQ ID No. 1 umfasst, eine verbesserte Sensitivität aufweist.
In 3 sind Überschneidungen in den Sensitivitäten des CD3-ELISA mit den kommerziell erhältlichen anti-Gliadin und anti-tTG ELISA dargestellt. Dabei zeigt sich, dass der CD3-ELISA Seren von Zöliakie-Patienten erkennt, die von einem, mehreren oder sogar allen verwendeten kommerziell erhältlichen ELISA-Tests nicht erkannt wurden. Die Verwendung eines Zölikie-Tests auf Basis eines Peptids umfassend die Peptidsequenz mit der SEQ ID No. 1 liefert so einen wertvollen Beitrag zur vollständigeren serologischen Erfassung und Diagnose von Zöliakie-Patienten.
5. CD3 spezifische Antikörper aus Patientenseren
Affinitätsreinigung von CD3 Antikörpern
Zur Isolierung und Reinigung der affinitätsspezifischer Antikörper gegen das CD3 Peptid aus den Patientenseren wurden die biotinylierte Variante des CD3 Peptids auf avidin oder Neutravidin Mikrotiterplatten gekoppelt und anschließend ein Pool aus 24 stark positiven Zöliakieseren mit wenig unspezifischer Hintergrundbindung für die Immunkomplexbildung eingesetzt. Zu Beginn wurde die Mikrotiterplatte (MTP) mit PEST/5% MP für 1 h bei RT geblockt. Anschließend wurde 3mal mit PBS Waschpuffer gewaschen und die Kavitäten der 96 Well Platte mit 5000 pmol/well CD3 Peptid beschichtet, dies entspricht der 10fachen Kapazität pro Well. Nach einer 1 stündiger Inkubation bei RT wurde die Platte 3mal mit Waschpuffer gewaschen. Nun folgte der Auftrag der Seren auf die Streptavidinplatte oder Neutravidinplatte, wobei zunächst jedes Patientenserum 1:100 in PEST/2% MP verdünnt wurde. Anschließend wurden die Seren gepoolt und mit einem Volumen von 100 μl/Well in die Kavitäten gegeben. Es folgte eine 1 stündige Inkubation bei RT. Danach wurde der Inhalt aller Wells abgenommen und wieder vereinigt und für einen weiteren Reinigungsdurchlauf bzw. als Kontrolle für die affinitätsspezifische Aufreinigungswirkung für einen Reinigungsdurchlauf mit dem negativen Kontrollpeptid, hier Bor 21, verwendet. Nachdem die Seren entfernt wurden, wurde die Platte 4mal mit Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurden die Kavitäten mit 150 μl/well Glycin-Elutionspuffer versetzt und für 10 min auf dem Schüttler inkubiert.
Schließlich wurde der Elutionspuffer mehrmalige resuspendiert und aus den Wells abgenommen und sofort mit 1:10 1 M TrisHCL pH 8,0 Puffer vereinigt. Direkt danach erfolgte das Umpuffern mittels Ultrazentrifugation in Amicon Falcons mit einem Membran CutOff von 55 kDA wobei 5malig ein 5faches Volumen an PBS Puffer als Gegenpuffer eingesetzt wurde. Als Erfolgskontrolle wurde die Charge im CD3 ELISA mit positiven und negativen Kontrollseren getestet. Die so gewonnen Mengen an Antikörpern wurden bei 4°C in PBS gelagert und für weitere immunologische Tests verwendet.
Alle Waschschritte wurden mit einem Volumen von 300 μl/Well durchgeführt. Weiterhin erfolgten alle Inkubationsschritte bei RT auf dem ELISA-Platten-Schüttler mit einer Umdrehungszahl von 600 rpm.
Wie in 4 gezeigt, reagiert der so isolierte CD3-Peptid-Antikörper spezifisch mit CDPtTG in einem Westernblot-Experiment. Daraus folgt, dass das Antigen im CD3-Peptid kein Konformationsantigen ist, sondern auch in denaturiertem Zustand von CD3-Peptid-Antikörpern isoliert aus Patientenseren detektiert werden kann. Damit eignen sich Peptide, die das erfindungsgemäße Peptid mit der SEQ ID No. 1 umfassen nicht nur für die Verwendung in Diagnose-Tests, die auf Antigene in nativem Zustand abstellen, sondern auch für Test-Formate, bei denen das Antigen in denaturiertem zustand eingesetzt wird, wie z. B. Westernblot-Tests, Protein array, Luminex Beat array und/oder Protein chip assays. SEQUENCE LISTING
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N. Y. (1989) [0017]
David Wild (Ed.): The Immunoassay Handbook. 3. Auflage. Elsevier Science Publishing Company, Amsterdam, Boston, Oxford 2005 [0031]
Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A. & Kuby, J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. In: Immunology, 5th ed., pp. 148–150. W. H. Freeman, New York, 2003 [0032]

Claims

Peptid enthaltend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz mit der SEQ ID No. 1.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID No. 2, 3 und/oder 4 enthält oder daraus besteht.
Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid zusätzliche Aminosäuren, einen oder mehrere Linker und/oder eine oder mehrere funktionale Gruppen aufweist.
Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid zusätzlich eine Sequenz von mindestens 25 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aus der Sequenz des humanen tTG2 mit der SEQ ID No. 5 umfasst.
Peptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid eine Sequenz mit der SEQ ID No. 6 oder 7 aufweist oder daraus besteht.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Medikament.
Peptid nach Anspruch 6 zur Verwendung in der Diagnose, insbesondere in der Diagnose von Zöliakie.
Verfahren zum in vitro Nachweis von Antikörpern gegen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass: i) ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einer Probe in vitro in Kontakt gebracht wird; und ii) an das Peptid gebundener Antikörper nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus einer Körperflüssigkeit gewonnen wurde oder es sich um eine Körperflüssigkeit handelt, bevorzugt um Blut, Plasma, Serum, Synovialflüssigkeit, Urin, Stuhl, Interstitalflüssigkeit, Lymphe, Speichel, Schweiß, Spinalflüssigkeit und/oder Tränenflüssigkeit, besonders bevorzugt ist die Körperflüssigkeit humanen Ursprungs.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid an einem Träger immobilisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem ELISA-Format durchgeführt wird.
Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 11, enthaltend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 an einen Träger immobilisiert.
Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit als ELISA oder als Streifentest ausgeführt ist.
Kit nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit zusätzlich Mittel zum Nachweis von Antikörpern des IgA- und/oder des IgG-Typs enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Diagnose, insbesondere zur Diagnose von Zöliakie.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 8 bis 11 zur Diagnose von Zöliakie.
Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Transformierter Mikroorganismus oder transfizierte Zelle umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 17.
Isolierter Antikörper, der an ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bindet.
Verwendung von isolierten Antikörpern nach Anspruch 19 zum Nachweis von Pathogenen, die mit Zöliakie assoziiert sind, bevorzugt in Nahrungsmitteln.