IT202100021194A1 - Proteina del glutine detossificata per la formulazione di alimenti a fini medici speciali - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

?PROTEINA DEL GLUTINE DETOSSIFICATA PER LA FORMULAZIONE DI ALIMENTI A FINI MEDICI SPECIALI"

DESCRIZIONE

Campo di applicazione

La presente invenzione riguarda una ?-gliadina modificata (polipeptide) priva di tossicit? o che presenta una tossicit? inferiore rispetto alla forma prevalente "wild type" (WT), ideale per la preparazione di alimenti destinati agli individui che soffrono di celiachia od agli individui inclini a sviluppare la malattia. L'invenzione riguarda anche le sequenze di DNA codificanti le ?gliadine modificate, gli organismi in grado di produrre tali ?-gliadine modificate ed i prodotti comprendenti tali ?-gliadine modificate.

Tecnica nota

La celiachia ? una malattia immuno-mediata che colpisce in Europa circa l'1% della popolazione. La patologia ? caratterizzata da uno stato di infiammazione cronica dell'intestino tenue innescato dall'ingestione delle proteine del glutine (gliadine e glutenine) presenti nella cariosside o chicco, cio? il frutto secco, di alcuni cereali, tra cui anche il frumento, in soggetti geneticamente predisposti, perch? portatori di specifiche combinazioni alleliche del sistema dell'antigene leucocitario umano (Human Leukocyte Antigen, HLA) (DQ2.5, DQ8, DQ2.2 o DQ7.5).

L?autoantigene verso cui, a livello intestinale, si attiva la risposta autoanticorpale ? la transglutaminasi tissutale, un enzima di membrana calciodipendente. Gli auto-anticorpi provocando l?inattivazione di tale enzima, determinano l?inibizione del differenziamento degli enterociti e l?appiattimento dell?epitelio dei villi intestinali provocando il malassorbimento dei nutrienti.

La diagnosi della patologia prevede indagini sierologiche, biopsia intestinale e screening genetico. I saggi sul siero prevedono il dosaggio degli anticorpi di classe A (IgA) anti-transglutaminasi tissutale (anti-tTG), antiendomisio (EMA) e anti-gliadina (AGA). Gli AGA di classe G (IgG) sono un marcatore meno specifico. Nella prima infanzia gli AGA hanno una sensibilit? maggiore degli anti-tTG, ma il test AGA perde in sensibilit? con il progredire dell?et?.

Esistono varie tipologie di celiachia: tipica o sintomatica, atipica, silente e potenziale. Se non trattata, la malattia contribuisce ad aumentare la probabilit? di contrarre altre patologie, e la completa e permanente eliminazione del glutine dalla dieta ? l?unico trattamento attualmente disponibile per ottenere la remissione dei sintomi e la prevenzione delle complicanze. L?eliminazione del glutine deve essere molto rigorosa e deve essere effettuata scrupolosamente per tutta la vita, poich? anche minime quantit? di glutine sono sufficienti a far regredire le condizioni di salute del paziente migliorate con la dieta o ad impedirne la guarigione. Oltre al grano e al farro, anche specie di cereali a loro affini, quali orzo, segale, triticale e grano Khorasan, contengono le proteine del glutine. Altri cereali invece come il mais, il miglio, il sorgo, il teff, il riso e la zizania, sono considerati sicuri, cos? come gli pseudocereali amaranto, quinoa e grano saraceno.

La funzione fisiologica delle gliadine e delle glutenine (una miscela di pi? di 100 diverse proteine), ? quella di riserva energetica e di sostegno della germinazione e delle fasi iniziali dello sviluppo della pianta. Quando, per produrre gli impasti, l'acqua viene aggiunta alla farina ottenuta macinando i chicchi, la matrice che tali proteine formano intorno ai granuli di amido si trasforma in una rete elastica e viscosa detta glutine. Nella pasta, durante la cottura, il reticolo glutinico rallenta l?assorbimento di acqua da parte dell?amido conferendo al prodotto tenacia ed elasticit?, mentre nel pane trattiene le bolle di gas prodotte dal lievito; questa propriet?, abbinata a quelle di coesione, omogeneit?, visco-elasticit? e tenacia, permette di ottenere un prodotto soffice ed elastico, gradevole al palato.

La qualit? della vita dei pazienti celiaci ? inferiore rispetto a quella dei soggetti sani perch? seguire una dieta priva di glutine ben bilanciata e rigorosa ? molto difficile. I cereali non permessi ai celiaci si ritrovano infatti in numerosi prodotti ed il rischio di contaminazione accidentale lungo la filiera alimentare ? molto elevato. Inoltre il glutine ? spesso aggiunto nella produzione industriale di molti cibi per migliorarne le caratteristiche in termini di consistenza o densit?. I prodotti attualmente presenti sul mercato possono essere suddivisi in tre categorie principali: i) alimenti permessi perch? naturalmente privi di glutine (contenuto di glutine inferiore a 20 parti per milione, p.p.m.; limite massimo riconosciuto come quantit? di glutine tollerabile per un celiaco); ii) alimenti a rischio perch? con contenuto di glutine compreso tra 20 p.p.m. e 100 p.p.m. o a rischio di contaminazione e per i quali ? necessario conoscere e controllare gli ingredienti ed i processi di lavorazione; iii) alimenti vietati perch? contenenti glutine.

Le proteine del glutine, numerose e molto diversificate, sono codificate da pi? geni raggruppati in loci distribuiti su cromosomi diversi. Tale complessit? genetica rende impossibile generare con le tecniche di genetica classica, ad esempio l?incrocio e la selezione, grano o altri cereali contenenti glutine che ne siano privi.

Sebbene siano stati fatti notevoli progressi per migliorare l'appetibilit? degli alimenti senza glutine, spesso i prodotti industriali disponibili sul mercato sono altamente calorici, hanno un valore nutritivo inferiore e sono particolarmente costosi. Prodotti senza glutine con buone propriet? nutrizionali possono essere ottenuti usando i semi del lupino, della canapa, della soia, del mais, dei piselli, ma gli impasti ottenuti con le farine preparate a partire da questi semi o chicchi non hanno le caratteristiche richieste dall'industria della panificazione e della pasta. La sostituzione della maglia glutinica ? attualmente una delle maggiori sfide nell?ambito delle tecnologie alimentari. Per eliminare la tossicit? del glutine ? necessario principalmente eliminare la tossicit? da ?gliadine.

La domanda di brevetto WO 2011/157806 descrive un procedimento per la realizzazione di ?-gliadine modificate in cui una o pi? sostituzioni, o delezioni riguardano almeno uno degli epitopi DQ2 (DQ2-Glia-?l, DQ2-Glia?2 e/o DQ2-Glia-?3) nella regione immunodominante della proteina (peptide 33, posizioni amminoacidiche 56-88) e/o l?epitopo DQ8 Glia-?l (posizioni amminoacidiche 229-237). Le sostituzioni, o delezioni, riguardano l'aminoacido in posizione 3 e/o 8 dell'epitopo DQ2-Glia-?1: Pro-{Phe/Tyr}-Pro-Gln-Pro-{Gln/Glu}-Leu-Pro-Tyr, l'amminoacido in posizione 3 e/o 8 dell'epitopo DQ2-Glia-?2: {Pro/Phe}-Pro-Gln-Pro-{Gln/Glu}-Leu-Pro-Tyr-Pro-Gln, l'amminoacido in posizione 3 e/o 8 dell'epitopo DQ2-Glia-? 3 Phe-Arg-Pro-Gln-Gln-Pro-Tyr-Pro-Gln e l?amminoacido in posizione 3 e/o 5 dell?epitopo DQ8 Glia-?l: Gln-Gly-Ser-Phe-Gln-Pro-Ser-Gln-Gln. Nel caso dei tre epitopi DQ2 preferibilmente l'amminoacido in posizione 3 e/o 8 ? sostituito con una serina mentre nel caso dell?epitopo DQ8 l?amminoacido in posizione 3 ? sostituito preferibilmente con fenilalanina e quello in posizione 5 con arginina. L?eliminazione dell?immunogenicit? che si otterrebbe mediante queste modifiche non ? stata verificata utilizzando la proteina modificata ricombinante bens? mediante saggi in vitro utilizzando peptidi sintetici.

La domanda di brevetto WO 2021/001784 descrive un procedimento per la realizzazione di forme modificate di ?-gliadina che si legano alle cellule T derivate da un paziente celiaco con minore affinit? rispetto alla corrispondente ?-gliadina non mutata. Anche in questo caso le mutazioni riguardano posizioni amminoacidiche localizzate tra l'amminoacido Leu e l'amminoacido Phe del peptide 33 dell'?-gliadina ove sono state individuate unit? antigeniche di 7 residui (Gln-Leu-Pro-Tyr-Pro-Gln-Pro; Gln-Leu-Pro-Tyr-Ser-Gln-Pro; Pro-Leu-Pro-Tyr-Pro-Gln-Pro). In particolare le sostituzioni interessano due o tre amminoacidi nelle posizioni 1, 4 e 5 delle unit? antigeniche. La sostituzione in posizione 1 comprende una sostituzione con un amminoacido carico positivamente, per es. l'istidina o la lisina. La sostituzione in posizione 4 dell'unit? antigenica comprende una sostituzione con una prolina, un amminoacido alifatico, un amminoacido polare o glicina e la sostituzione in posizione 5 dell'unit? antigenica comprende una sostituzione con un piccolo amminoacido, un amminoacido polare o un amminoacido aromatico. In alcune forme realizzative anche la posizione 3 dell'unit? antigenica dell'?-gliadina modificata ? sostituita con un amminoacido aromatico o polare. La ridotta capacit? delle forme modificate della gliadina di legare l?HLA ? stata determinata in conformit? a un modello computazionale predittivo e non su campioni reali di proteina. La mancata attivazione delle cellule T in campioni bioptici di pazienti celiaci ? stata determinata rilevando in un saggio ELISA i livelli di IFN-? prodotti in risposta a stimolazione con peptidi sintetici e non con la proteina completa modificata.

Quindi, sebbene sia stato dimostrato che mirate sostituzioni amminoacidiche in peptidi sintetici con sequenza corrispondente a quella degli epitopi compresi nel P33 inibiscano la stimolazione in vitro di linfociti T di soggetti celiaci, lo stesso non ? mai stato verificato con un??-gliadina completa contenente tali sostituzioni, o altri residui modificati al di fuori della regione immunodominante.

Pertanto, nonostante i progressi fatti negli ultimi anni grazie anche alla tecnologia del DNA ricombinante, poter disporre di forme di ??gliadina prive o con ridotta tossicit? per formulare alimenti per pazienti celiaci che permettano di avere una dieta pi? varia e di qualit? rimane ancora una sfida aperta.

Sommario dell'invenzione

La presente invenzione risponde alle precedenti e ad altre esigenze della tecnica anteriore fornendo una forma della proteina ?-gliadina di Triticum aestivum appartenente al locus Gli-A2 (UniProtKB - P02863- GliaWT) modificata nella sequenza (GliaMUT) e caratterizzata da ridotta immunogenicit? e da una buona capacit? di espressione, in particolare in batteri.

La forma modificata della proteina ?-gliadina (GliaMUT, SEQ ID No: 1) differisce dalla sequenza della forma prevalente di ?-gliadina (GliaWT, SEQ ID No: 2) per 36 dei 266 aminoacidi.

L'invenzione riguarda anche la sequenza polinucleotidica che codifica l'?-gliadina modificata (gliamut, SEQ ID No: 3) secondo l'invenzione e il suo utilizzo per produrre la proteina modificata ricombinante e/o per esprimere la proteina modificata in piante.

Inoltre, l?invenzione riguarda anche l?uso della sequenza polinucleotidica che codifica l'?-gliadina modificata (gliamut, SEQ ID No: 3) per la produzione di proteine di glutine ricombinanti, non tossiche, o che sono meno dannose per i pazienti celiaci e/o per trasformare piante per produrre glutine non tossico, o meno dannoso per soggetti celiaci.

Secondo un ulteriore aspetto l'invenzione riguarda anche i prodotti alimentari che comprendono l'?-gliadina modificata dell'invenzione.

Breve descrizione delle figure

Figura 1: Allineamento della sequenza amminoacidica della GliaWT (riga superiore) con quella della GliaMUT (riga inferiore).

Figura 2: Sequenza nucleotidica (riga superiore) codificante la proteina GliaMUT (riga inferiore, sequenza amminoacidica in codice a singola lettera) secondo l'invenzione. La sequenza evidenziata in giallo indica il peptide segnale, la sequenza evidenziata in grigio indica il sito di taglio del Fattore Xa, la sequenza evidenziata in magenta indica la sequenza FLAG tag, la sequenza evidenziata in turchese indica la sequenza 6XHis tag.

Figura 3: Sequenza nucleotidica (riga superiore) codificante la proteina GliaWT (riga inferiore, sequenza amminoacidica in codice a singola lettera) secondo l'invenzione. La sequenza evidenziata in giallo indica il peptide segnale, la sequenza evidenziata in grigio indica il sito di taglio del Fattore Xa, la sequenza evidenziata in magenta indica la sequenza FLAG tag, la sequenza evidenziata in turchese indica la sequenza 6XHis tag.

Figura 4: Confronto dell?espressione delle proteine GliaWT e GliaMUT nei diversi ceppi di Escherichia coli indotti per tempi diversi ed a diverse temperature.

Figura 5: Confronto della resa del procedimento di estrazione delle proteine GliaWT e GliaMUT dai pellet di colture batteriche indotte e non indotte (N.I., utilizzate come controllo).

Figura 6: Purificazione delle proteine dagli estratti alcolici mediante cromatografia di affinit? con ioni metallici immobilizzati (IMAC) in condizioni denaturanti. Analisi Western blot delle frazioni di GliaWT (6A) e GliaMUT (6B) eluite da colonna. Frazioni purificate di GliaMUT rivelate mediante colorazione con blu di Coomassie (6C).

Figura 7: Analisi mediante saggio immunoenzimatico ELISA del riconoscimento delle proteine GliaMUT e GliaWT in estratti batterici (7A) o dopo purificazione (7B) da parte dell?anticorpo monoclonale R5 specifico per il peptide P33.

Figura 8: Analisi mediante saggio immunoenzimatico ELISA del riconoscimento delle proteine GliaMUT e GliaWT da parte di un anticorpo policlonale di coniglio anti-gliadina (8A) e di anticorpi presenti nel siero certificato di un soggetto celiaco a diverse diluizioni (8B).

Figura 9: Analisi mediante Western blot dell'espressione di GliaWT (9A) e GliaMUT (9B) in Nicotiana benthamiana e delle frazioni (E3, E4, E5, E6) di GliaMUT purificate mediante IMAC (9C).

Descrizione dettagliata dell'invenzione

Scopo della presente invenzione ? fornire una forma modificata (GliaMUT) della sequenza della proteina ?-gliadina di Triticum aestivum (UniProtKB - P02863 - GliaWT) caratterizzata da mancanza di tossicit?, o ridotta tossicit?, per il paziente celiaco.

La forma modificata della proteina ?-gliadina (GliaMUT) secondo l'invenzione presenta identit? di sequenza compresa tra 80% e 90% con la sequenza della forma prevalente di ?-gliadina (GliaWT), preferibilmente le due sequenze condividono un grado di omologia compreso tra 84-87%, ancora pi? preferibilmente un grado di omologia pari all'86,5% (230/266). La forma modificata della proteina ?-gliadina (GliaMUT) secondo l'invenzione differisce dalla sequenza della forma prevalente di ?-gliadina (GliaWT) per 36 dei 266 aminoacidi ed ha sequenza SEQ ID No: 1.

I termini "polipeptide", "peptide" e "proteina" sono qui usati in modo intercambiabile per riferirsi a un polimero di amminoacidi. I termini si applicano ai polimeri di amminoacidi in cui uno o pi? residui di amminoacidi ? un mimetico chimico artificiale di un corrispondente amminoacido naturale, nonch? ai polimeri di amminoacidi naturali e ai polimeri di amminoacidi non presenti in natura. Il termine "amminoacido" si riferisce agli amminoacidi naturali e sintetici, nonch? agli analoghi degli amminoacidi e ai mimetici degli amminoacidi che funzionano in modo simile agli amminoacidi naturali. Gli amminoacidi naturali sono quelli codificati dal codice genetico, cos? come gli amminoacidi che vengono successivamente modificati. Gli analoghi degli amminoacidi si riferiscono a composti che hanno la stessa struttura chimica di base di un amminoacido naturale, cio? un carbonio legato a un idrogeno, un gruppo carbossilico, un gruppo amminico e un gruppo R, ad esempio omoserina, norieucina, metionina solfossido, metionina metil solfonio. Tali analoghi hanno gruppi R modificati (ad esempio norieucina) o ossature peptidiche modificate, ma conservano la stessa struttura chimica di base di un amminoacido naturale. I mimetici degli amminoacidi si riferiscono a composti chimici che hanno una struttura diversa dalla struttura chimica generale di un amminoacido, ma che funziona in modo simile a un amminoacido naturale. Nella presente descrizione gli amminoacidi sono indicati con i loro simboli di tre lettere comunemente noti agli esperti del settore o con i simboli di una lettera raccomandati dalla Commissione per la nomenclatura biochimica IUPAC-IUB. L?espressione "varianti modificate in modo conservativo" come qui utilizzato si applica sia alle sequenze di amminoacidi che di acidi nucleici.

Per quanto riguarda le sequenze di amminoacidi, l?esperto del settore riconoscer? che singole sostituzioni, delezioni o aggiunte a una sequenza di acido nucleico, peptide, polipeptide o proteina che altera, aggiunge o elimina un singolo amminoacido o una piccola percentuale di amminoacidi nella sequenza codificata, ? una "variante conservativamente modificata" se l'alterazione provoca la sostituzione di un amminoacido con un amminoacido chimicamente simile. Le tabelle di sostituzione conservativa che forniscono amminoacidi funzionalmente simili sono ben note nell'arte. Le varianti modificate in modo conservativo non escludono varianti polimorfe, omologhi interspecie e alleli dell'invenzione. I seguenti otto gruppi contengono ciascuno amminoacidi che sono sostituzioni conservative l'uno dell'altro: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Acido aspartico (D), Acido glutammico (E); 3) Asparagina (N), Glutammina (Q); 4) Arginina I, Lisina (K); 5) isoieucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteina (C), Metionina (M) (si veda, ad esempio, Creighton, Proteins (1984)).

Sorprendentemente, ? stato trovato che le sostituzioni di 36 residui amminoacidi, che determinano la mancanza di tossicit?, o la ridotta tossicit?, per il paziente celiaco secondo la presente invenzione, non sono localizzate esclusivamente nella regione immunodominante della proteina (P33), ma sono distribuite nell'intera sequenza amminoacidica della proteina.

In una forma realizzativa preferita dell'invenzione le sostituzioni riguardano gli amminoacidi alle posizioni 13, 18, 23, 25, 30, 36, 37, 42, 49, 54, 55, 64, 67, 75, 79, 81, 89, 93, 115, 123, 130, 139, 144, 151, 164, 181, 191, 197, 200, 205, 211, 218, 224, 230, 232, 240 della sequenza della forma prevalente matura (senza peptide segnale) di ?-gliadina (GliaWT). Dal 50 al 70% delle sostituzioni riguardano sostituzioni amminoacidiche conservative rispetto alla sequenza della forma prevalente di ?-gliadina (GliaWT), cio? un aminoacido sostituito con un altro avente un gruppo laterale R con propriet? biochimiche simili; preferibilmente il 64% (23/36) delle sostituzioni amminoacidiche sono sostituzioni conservative, come mostrato nell'allineamento in Figura 1 (trattino verticale: identit?; due punti o punto: sostituzione conservativa; nessun simbolo: divergenza).

Rientrano nell'ambito dell'invenzione anche le sequenze amminoacidiche che condividono almeno 80% di omologia con la sequenza GliaMUT e, in particolare, le sequenze amminoacidiche in cui fino al 20% degli aminoacidi sostituiti rispetto alla sequenza della proteina GliaMUT matura (senza peptide segnale) riguardano gli amminoacidi alle posizioni 13, 18, 23, 25, 30, 36, 37, 42, 49, 54, 55, 64, 67, 75, 79, 81, 89, 93, 115, 123, 130, 139, 144, 151, 164, 181, 191, 197, 200, 205, 211, 218, 224, 230, 232, 240 o forme modificate della proteina ?-gliadina comprendenti sostituzioni degli amminoacidi ad almeno l?80% delle posizioni 13, 18, 23, 25, 30, 36, 37, 42, 49, 54, 55, 64, 67, 75, 79, 81, 89, 93, 115, 123, 130, 139, 144, 151, 164, 181, 191, 197, 200, 205, 211, 218, 224, 230, 232, 240 della sequenza SEQ ID N.1.

Le sostituzioni amminoacidiche della proteina GliaMUT hanno un effetto sulla capacit? di interazione con un anticorpo policlonale commerciale di coniglio anti-gliadina (G9144Anti-Gliadin (Wheat) antibody - Sigma), e con gli anticorpi AGA presenti nel siero di un soggetto con diagnosi di celiachia ma non ancora sottoposto a dieta priva di glutine, come descritto in seguito nella sezione sperimentale. I risultati dimostrano infatti che la proteina ?gliadina mutata secondo l'invenzione (GliaMUT), diversamente dalla forma prevalente WT (GliaWT), non viene riconosciuta dall?anticorpo policlonale di coniglio n? dagli anticorpi presenti nel siero di pazienti. (Figura 8). E? stato dimostrato che gli epitopi riconosciuti dagli AGA sono sovrapposti o strettamente associati a quelli riconosciuti dai linfociti T (Bateman et al, Gut 53:1274?1278, 2004; Fleur du Pr? et al, Best Practice and Research Clinical Gastroenterology 29:413-423, 2015). Pertanto, il fatto che la GliaMUT non sia pi? riconosciuta dagli AGA pu? considerarsi un?indicazione che le sostituzioni amminoacidiche mirate effettuate sono effettivamente in grado di ridurne l?immunogenicit?.

Con il termine ?immunogenico? si intende la capacit? di un agente di dare origine a una risposta immunitaria in un ospite, sia umorale che cellulomediata. Gli agenti immunogenici sono tipicamente "estranei" all'ospite, ad esempio appartenenti ad una specie diversa, o ad un batterio, virus o fungo. Un agente non estraneo pu? essere immunogenico, ad esempio nel caso di una risposta autoimmune. Si definisce ?antigene?, una molecola o una porzione di molecola, polipeptide, glicoproteina, lipoproteina, lipide, carboidrato o altro agente che ? riconosciuto come "estraneo" e legato da un anticorpo e/o recettore delle cellule T. Il termine "derivato da" indica l'antigene essenzialmente cos? com'? nel suo contesto antigenico naturale, o quello che ? stato modificato per essere espresso in determinate condizioni, per includere solo la porzione pi? immunogenica o per rimuovere altri componenti associati potenzialmente dannosi.

L'epitopo (o determinante antigenico) ? quella piccola parte di antigene che lega l'anticorpo specifico o il recettore per l?antigene dei linfociti T. Una singola molecola di antigene pu? contenere diversi epitopi riconosciuti da anticorpi o recettori per l?antigene dei linfociti T differenti.

Un oggetto dell'invenzione riguarda la sequenza polinucleotidica di DNA, acido desossiribonucleico, avente sequenza SEQ ID No: 3 (gliamut) che codifica l'?-gliadina modificata (GliaMUT) secondo l'invenzione.

L?invenzione comprende anche le sequenze polinucleotidiche codificanti una forma modificata di ?-gliadina di Triticum aestivum correlate per effetto della degenerazione del codice genetico o comprendenti codoni ottimizzati per l?espressione in sistemi cellulari o cellule ospite per la produzione industriale.

La sequenza polinucleotidica ? stata disegnata per produrre in forma ricombinante la proteina GliaMUT.

Il termine "ricombinante" o "chimerico" come usato qui con riferimento, ad esempio, a un acido nucleico, proteina o vettore, indica che l'acido nucleico, proteina o vettore, ? stato modificato dall'introduzione di un acido nucleico o proteina eterologhi, o per l'alterazione di un acido nucleico o di una proteina nativi. Cos?, per esempio, i vettori chimerici e ricombinanti comprendono sequenze di acidi nucleici che non si trovano all'interno della forma nativa (non chimerica o non ricombinante) del vettore.

I termini "acido nucleico" e "polinucleotide" sono qui usati in modo intercambiabile per riferirsi a polimeri di desossiribonucleotidi o ribonucleotidi in forma a filamento singolo o doppio. I termini comprendono geni, cDNA, RNA e oligonucleotidi. Sono compresi anche gli acidi nucleici contenenti analoghi nucleotidici noti o residui o legami strutturali modificati, che sono sintetici, presenti in natura e non presenti in natura, che hanno propriet? di legame simili a quelle dell'acido nucleico di riferimento e che sono metabolizzati in modo simile ai nucleotidi di riferimento. Se non diversamente indicato, una particolare sequenza di acido nucleico comprende anche sue varianti modificate in modo conservativo (ad esempio, sostituzioni di codoni degenerati) e sequenze complementari, oltre alla sequenza esplicitamente indicata. In particolare, le sostituzioni di codoni degeneri possono essere ottenute generando sequenze in cui la terza posizione di uno o pi? codoni selezionati (o tutti) ? sostituita pur codificando lo stesso aminoacido. Come ? noto all?esperto del settore, a causa della degenerazione del codice genetico, un gran numero di acidi nucleici funzionalmente identici codifica per una determinata proteina e sono da considerarsi comprese nell?ambito di protezione rivendicato (Batzer et al, Nucleic Acid Res. 1991, 19:5081; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 1985, 260:2605-2608; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 1994, 8:91-98).

La sequenza polinucleotidica ? stata disegnata utilizzando i codoni preferenzialmente utilizzati da cellule batteriche, in particolare Escherichia coli per codificare gli amminoacidi.

All?estremit? 3? della sequenza polinucleotidica, ovvero quella codificante l?estremit? C-terminale della proteina GliaMUT ? presente la sequenza codificante i marcatori (tag) molecolari FLAG e 6XHis, che consentono di rilevare le proteine ricombinanti mediante l?uso di anticorpi e di purificarle mediante cromatografia per affinit?.

Inoltre, nella sequenza polinucleotidica SEQ ID No: 3, tra la sequenza codificante la proteina di interesse e quelle codificanti i tag ? inserita la sequenza codificante la sequenza amminoacidica riconosciuta dall?enzima proteolitico Fattore Xa, utile per rimuovere i tag dalle proteine ricombinanti. In Figura 2 ? mostrato l'allineamento della sequenza nucleotidica (riga superiore) codificante la sequenza amminoacidica (riga inferiore, con codice a singola lettera) della proteina GliaMUT secondo l'invenzione e in Figura 3 l'allineamento della sequenza nucleotidica (riga superiore) codificante la sequenza amminoacidica (riga inferiore, con codice a singola lettera) della proteina GliaWT. Nelle figure 2 e 3 la sequenza evidenziata in giallo indica la sequenza segnale di secrezione, la sequenza evidenziata in grigio indica il sito di taglio del Fattore Xa, la sequenza evidenziata in magenta indica la sequenza FLAG tag, la sequenza evidenziata in turchese indica la sequenza 6XHis tag.

La sequenza polinucleotidica SEQ ID No: 3 che codifica l'?-gliadina modificata (GliaMUT) secondo l'invenzione reca alle estremit? 5? e 3? sequenze di consenso riconosciute da enzimi di restrizione utili per l?inserimento nei vettori plasmidici di espressione, quali ad esempio pET21b (NOVAGEN) per l?espressione in E. coli, e pBI-? per l?espressione transiente in pianta mediata da Agrobacterium tumefaciens, secondo quanto descitto in Marusic C. et al. (BMC biotechnology 2007, 7: 12).

Secondo lo stesso disegno ? stata prodotta anche un'analoga sequenza polinucleotidica codificante la proteina ?-gliadina di Triticum aestivum (UniProtKB - P02863) (GliaWT).

La sequenza polinucleotidica secondo l'invenzione pu? essere prodotta per sintesi od utilizzando le tecniche di biologia molecolare standard note all'esperto del settore. La sequenza polinucleotidica secondo l'invenzione pu? essere inserita nel vettore di espressione, utilizzando le tecniche di biologia molecolare standard ed ottenere un vettore ricombinante utilizzato per trasformare cellule competenti batteriche, ad esempio i ceppi commerciali Shuffle (NEB) e Rosetta (NOVAGEN) e di A. tumefaciens, ad esempio A. tumefaciens ceppo LBA4404, e produrre la proteina.

Con il termine ?vettore di espressione? si intende un costrutto di acido nucleico, generato in modo ?ricombinante? o sinteticamente, con una serie di elementi di acido nucleico specificati che consentono la trascrizione di un particolare acido nucleico in una cellula ospite. Il vettore di espressione pu? essere parte di un plasmide, virus o frammento di acido nucleico. Tipicamente, nel vettore di espressione viene inserito o clonato un acido nucleico legato ad un promotore da trascrivere operativamente.

Oggetto dell'invenzione ? anche il vettore che comprende la sequenza polinucleotidica secondo l'invenzione di sequenza SEQ ID No: 3, che ? un vettore idoneo per l'espressione della sequenza in microrganismi procariotici (es. E. coli e Bacillus subtilis), in sistemi di espressione eucariotici, ad esempio, lieviti come Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, in sistemi di espressione eucariotici, animali e vegetali. All'esperto del settore sar? chiaro che la proteina ricombinante secondo l'invenzione pu? essere espressa sia in microrganismi sia in organismi eucarioti, ad esempio in organismi vegetali.

La sperimentazione condotta ha dimostrato che il vettore ricombinante comprendente la sequenza polinucleotidica secondo l'invenzione avente sequenza SEQ ID No: 3 permette di produrre la proteina GliaMUT secondo l'invenzione avente sequenza SEQ ID No: 1 in diversi ceppi di E. coli dopo induzione con 0,5 mM di isopropiltiogalattoside (IPTG). Il dato sperimentale ha mostrato che la forma mutata della gliadina ? espressa in maggior quantit? nel ceppo di E. coli Rosetta alla temperatura di incubazione di 37 ?C (Figura 4).

Inoltre, la proteina ricombinante GliaMUT secondo l'invenzione, del peso molecolare atteso di 35 kDa, pu? essere facilmente estratta e purificata dai batteri utilizzati per la produzione mediante un metodo di precipitazione basato sull'impiego di una soluzione alcolica secondo il protocollo messo a punto da Molberg O et al. (Gastroenterology 125: 337-344, 2003), come illustrato nella sezione sperimentale di questa descrizione. I risultati sono mostrati in Figura 5.

Un vettore ricombinante per l?espressione in cellule vegetali comprendente la sequenza polinucleotidica secondo l'invenzione avente sequenza SEQ ID No: 3 ha dimostrato di consentire di produrre la proteina anche in un sistema per l'espressione eterologa vegetale, infatti pu? essere utilizzato anche per l'espressione transiente della proteina in Nicotiana benthamiana, una specie affine al tabacco, estremamente efficiente in termini di resa e tempi per la produzione in un procedimento su scala preparativa. L'espressione transiente in Nicotiana benthamiana ? un procedimento affidabile e scalabile in modo lineare semplicemente aumentando il numero di piante utilizzate. L'analisi ha dimostrato che la proteina GliaMUT si accumula sia nella frazione solubile che nella frazione insolubile dell'estratto delle foglie di Nicotiana benthamiana con un picco in entrambi i casi intorno a 6 giorni dopo infiltrazione (d.p.i.) (Figura 9).

Secondo un ulteriore aspetto l'invenzione riguarda anche una cellula o una pianta comprendente nel suo genoma la sequenza codificante l'?-gliadina modificata secondo l'invenzione. In una forma realizzativa la cellula ? una cellula di un cereale che endogenamente non contiene glutine, in particolare una cellula di riso (Oryza sativa), avena (Avena sativa), mais (Zea mays), sorgo (Sorghum vulgare), grano saraceno (Fagopyrum esculentum), Quinoa (Chenopodium quinoa) o anche una cellula di una specie di grano geneticamente modificato in cui sono stati eliminati i geni delle ?-gliadine. Preferibilmente la cellula che comprende la sequenza codificante l' ? -gliadina secondo l'invenzione ? una cellula di riso.

L?invenzione riguarda l?uso della proteina ?-gliadina modificata estratta e/o purificata da batteri, cellule eucariotiche e cellule vegetali da sola od in aggiunta a farine ottenute da specie vegetali che endogenamente non contengono glutine, in particolare riso (Oryza sativa), avena (Avena sativa), mais (Zea mays), sorgo (Sorghum vulgare), grano saraceno (Fagopyrum esculentum), Quinoa (Chenopodium quinoa) o anche da specie di grano geneticamente modificato in cui sono stati eliminati i geni delle ?-gliadine, per ottenere alimenti o prodotti alimentari lavorati detossificati o a ridotta tossicit? per soggetti celiaci.

L?alimento o il prodotto alimentare lavorato comprendente l?a-gliadina modificata secondo l?invenzione ? un prodotto ottenuto tramite panificazione, un prodotto da forno, ancora pi? preferibilmente il prodotto lavorato ? pane e/o pasta.

Il prodotto lavorato del cereale, come ad esempio la farina, ? prodotta dalla macinazione delle cariossidi della pianta di cereale, che comprende nel suo genoma la sequenza polinucleotidica che codifica l' ? -gliadina modificata secondo l'invenzione.

Il prodotto lavorato, come ad esempio farina, ? ottenuta dai semi di una pianta transgenica che esprime la sequenza polinucleotidica che codifica l' ?gliadina modificata, ad esempio Oryza sativa.

Preferibilmente il prodotto lavorato ? un prodotto ottenuto tramite panificazione, un prodotto da forno, ancora pi? preferibilmente il prodotto lavorato ? pane e/o pasta.

L'invenzione sar? ora ulteriormente descritta attraverso esempi che permetteranno all'esperto del settore di comprendere i vantaggi derivanti dall'utilizzo dell'invenzione.

ESEMPI

Esempio 1 - Saggio di espressione in E. coli

Le sequenze polinucleotidiche codificanti le proteine GliaMUT Seq ID No: 2 e GliaWT Seq ID No: 3, ottenute per sintesi (Eurofins Genomics, Germany) sono state clonate nel vettore plasmidico di espressione commerciale per l?espressione in E. coli pET21b (NOVAGEN).

L'espressione ? stata indotta aggiungendo 0.5 mM IPTG al mezzo di coltura a 30 ?C (ceppi Shuffle e Rosetta) e a 37 ?C (ceppo Rosetta), verificando l?accumulo delle proteine ricombinanti 1, 2, 3 e 4 ore dopo induzione.

Gli estratti proteici (5?l) delle gliadine ricombinanti espresse nei ceppi di E.coli Shuffle e Rosetta a diverse temperature sono state separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS-PAGE 12 % p/v. Le proteine sono state elettrotrasferite dal gel su membrana PVDF. La membrana ? stata saturata utilizzando una soluzione al 4% (p/v) di latte scremato in tampone fosfato (PBS). La presenza delle proteine ricombinanti ? stata rilevata incubando la membrana prima con un anticorpo murino anti?His tag alla concentrazione di 10 ?g/ml in una soluzione al 2% (p/v) di latte scremato in PBS e poi con un anticorpo di capra anti-topo-HRP alla diluizione di 1:5000 sempre in una soluzione al 2% (p/v) di latte scremato in PBS. La rivelazione ? stata effettuata mediante chemiluminescenza con la soluzione ECL. Come controllo positivo (C+) ? stato utilizzato un estratto precedentemente quantificato di GliaWT (200 ng).

L'analisi mediante Western Blot (WB) ha dimostrato che le proteine sono espresse in entrambi i ceppi e che la proteina mutante si esprime meglio nel ceppo Rosetta (Figura 4).

Esempio 2 - Estrazione alcolica delle proteine ricombinanti espresse in batteri E. coli.

I pellet ottenuti dopo 4 ore di induzione delle colture (250ml) dei batteri veicolanti le sequenze codificanti GliaWT e GliaMUT, sono stati utilizzati per estrarre le proteine seguendo il protocollo di Molberg et al. Il pellet ? stato risospeso in 10 ml di tampone di estrazione (70% EtOH, 1% DTT) lasciato in incubazione per 2 ore a 60?C. Dopo bollitura per 5 min e centrifugazione (30 min a 14500 x g, 12?C), al surnatante sono stati aggiunti due volumi di tampone di precipitazione (1,5M NaCl). Dopo incubazione o.n. a 4?C, il campione ? stato centrifugato (30 min. a 14500 x g, 12?C) e il pellet risospeso in 2 ml di 6 M Urea, 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Aliquote da 10 ml dei campioni di proteine cos? ottenuti sono state separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS-PAGE 12% p/v. Come controllo negativo lo stesso procedimento di estrazione ? stato applicato ai pellet di colture batteriche non indotte. Le proteine sono state elettrotrasferite dal gel su membrana PVDF. La membrana ? stata saturata utilizzando una soluzione al 4% (w/v) di latte scremato in tampone fosfato (PBS). La presenza delle proteine ricombinanti ? stata rilevata incubando la membrana prima con un anticorpo murino anti? Histag alla concentrazione di 10mg/ml in una soluzione al 2% (p/v) di latte scremato in PBS e poi con un anticorpo di capra anti-topo-HRP alla diluizione di 1:5000 sempre in una soluzione al 2% (p/v) di latte scremato in PBS. La rivelazione ? stata effettuata mediante chemiluminescenza con la soluzione ECL (Figura 5).

Esempio 3 - Purificazione delle proteine ricombinanti estratte Gli estratti ottenuti da pellet batterici (500 ml di coltura indotta) sono stati utilizzati per effettuare prove di purificazione di GliaWT e GliaMUT mediante cromatografia di affinit? con ioni metallici immobilizzati (IMAC) in condizioni denaturanti, ovvero utilizzando tamponi contenenti urea. La colonna cromatografica (BIORAD Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges da 1mL di volume) ? stata equilibrata a temperatura ambiente in tampone di lavaggio denaturante 1 (6 M Urea, 300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 5 mM imidazolo) ad un flusso di 1 ml/min. Il campione contenente le proteine, diluito 1:10 in tampone di lavaggio denaturante 1 (5 ml finali), ? stato caricato sulla colonna ad un flusso di 1 ml/min. E?stato quindi effettuato un primo lavaggio (10 ml) utilizzando il tampone di lavaggio denaturante 1 ed un secondo lavaggio con pari volume di tampone di lavaggio denaturante 2 (6 M Urea, 300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 10 mM imidazolo). L?eluizione ? stata effettuata con 5 ml di tampone di eluizione (6 M Urea, 300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 250 mM imidazolo) raccogliendo frazioni di 0,5 ml di volume. Le dieci frazioni raccolte sono state quindi analizzate mediante WB per verificare la presenza della proteina ricombinante (GliaWT in Figura 6A e GliaMUT6B, rispettivamente). L?analisi delle frazioni purificate di GliaMUT dopo elettroforesi su gel di poliacrilammide colorato mediante Coomassie ha evidenziato la presenza di una banda del peso molecolare atteso di circa 35 kDa (Figura 6C).

Esempio 4 - Determinazione dell'interazione tra la proteina mutata GliaMUT e anticorpi specifici per la gliadina, anche nel siero certificato di un paziente celiaco.

a) L'effetto delle sostituzioni aminoacidiche sul riconoscimento da parte di un anticorpo monoclonale specifico diretto alla regione dell'epitopo che attiva la risposta immunitaria nel soggetto celiaco ? stato verificato utilizzando un saggio immunoenzimatico (ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) commerciale correntemente impiegato per l'analisi quantitativa di gliadina (frumento), secalina (segale) e ordeina (orzo) negli alimenti dichiarati privi di glutine riconosciuto come AOAC-OMA (2012.01) e AACCI 38.50.0, certificato da AOAC-RI (120601) e metodo ufficiale (tipo 1) del Codex Alimentarius. Tale saggio si basa sull?impiego dell?anticorpo monoclonale R5 anti-?-gliadina.

Le proteine GliaWT e GliaMUT ottenute mediante estrazione alcolica dai pellet di colture (250 ml) di cellule Shuffle dopo 4 ore di induzione sono state analizzate con il kit RIDASCREEN?GliadinRbiopharm, seguendo le indicazioni fornite dalla societ? produttrice, prima (A) e dopo (B) purificazione mediante IMAC. Gli estratti (EXT) e di purificati (PUR) sono stati saggiati a diverse diluizioni (da 1:12,5 a 1:1600) e di campioni GliaWT sono stati quantificati facendo riferimento allo standard interno di ?-gliadina purificata a concentrazione nota fornito dal kit. Il segnale di assorbanza ? stato rilevato mediante lettore ELISA alla lunghezza d?onda di 450 nm.

I risultati ottenuti sugli estratti alcolici ottenuti secondo la procedura dell'esempio 2 e sulle proteine purificate ottenute all'esempio 3, hanno dimostrato che la proteina GliaMUT a differenza della proteina GliaWT, non viene riconosciuta dall?anticorpo monoclonale anti-?-gliadina R5 che si lega alla porzione immunoattiva della gliadina DQ2.

Utilizzando una gliadina standard a concentrazione nota, ? stato possibile determinare che nelle condizioni utilizzate, le cellule del ceppo SHuffle veicolanti il plasmide pET-GliaWT indotte a 30?C per 4 ore con 0,5 mM IPTG producono 208 ?g di proteina/litro di coltura. La resa di proteina con alto grado di purezza (>90%) dopo purificazione su colonna cromatografica ma in condizioni non ottimizzate si riduce a 50 ?g /litro.

L?analisi densitometrica di un WB in cui sono stati caricati la GliaWT quantificata prodotta in cellule SHuffle, la GliaWT prodotta in Rosetta e la GliaMUT prodotta sia in SHuffle che in Rosetta ha permesso di concludere che mediante estrazione alcolica ? possibile ottenere:

GliaWT SHuffle (30?C) 208 ?g/litro coltura GliaWT Rosetta (37?C) 160 ?g/litro coltura GliaMUT SHuffle (30?C) 80 ?g/litro coltura GliaMUT Rosetta (37?C) 280 ?g/litro coltura

I dati dell'analisi quantitativa sono mostrati in Figura 7.

b) L'effetto delle sostituzioni amminoacidiche sul riconoscimento da parte di un anticorpo di coniglio policlonale anti-gliadina o di anticorpi IgA presenti nei sieri di soggetti celiaci ? stato verificato mediante saggio immunoenzimatico.

Gli estratti proteici ottenuti da batteri indotti con IPTG che non esprimevano nessuna proteina eterologa o che esprimevano la proteina GliaWT o la proteina GliaMUT sono stati analizzati mediante saggi ELISA utilizzando un anticorpo policlonale commerciale di coniglio anti-gliadina (G9144 Anti-Gliadin (Wheat) antibody produced in rabbit, SIGMA) o il siero di soggetti con diagnosi di celiachia ma non ancora sottoposti a dieta priva di glutine.

Gli estratti proteici di E. coli contenenti 500 ng di Glia WT o 500 ng di Glia MUT, o con un estratto proteico di E. coli di controllo che non contiene alcuna proteina eterologa, sono stati posti in incubazione con:

? anticorpo di coniglio anti-gliadina, il cui legame a proteine presenti nel pozzetto ? stato rivelato mediante un anticorpo secondario di capra specifico per immunoglobuline di coniglio e marcato con perossidasi di rafano (31460 Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody HRP, Termofischer)

? il siero di un soggetto sano (siero C-) o quello di un soggetto con diagnosi di celiachia a diverse diluizioni di (Dil 1, Dil 2 e Dil 3) utilizzato come controllo positivo calibrato da un test commerciale immunoenzimatico in colorimetria per la determinazione degli anticorpi IgA specifici anti ?-gliadina nel siero umano (?-gliatest SIgA Chromo Eurospital).

I risultati ottenuti hanno dimostrato che la proteina GliaMUT, a differenza della proteina GliaWT viene riconosciuta con un?efficienza significativamente pi? bassa dall?anticorpo policlonale anti-gliadina di coniglio (Figura 8A) e non viene riconosciuta dalle IgA presenti nel siero del soggetto celiaco (Figura 8B)

Esempio 5 - Saggi di espressione in piante di Nicotiana benthamiana Sospensioni di cellule di A. tumefaciens LBA4404 trasformate con i plasmidi veicolanti le sequenze codificanti le proteine GliaWT e GliaMUT, sono stati utilizzate per infiltrare piante di N. benthamiana (agroinfiltrazione) in combinazione con sospensioni di A. tumefaciens trasformate con un plasmide veicolante la sequenza codificante la proteina p19 (p19: soppressore del silencing post-trascrizionale derivato dall?Artichoke Mottled Crinckle virus).

Estratti proteici grezzi ottenuti da foglie agro-infiltrate con i costrutti di interesse o con il solo pBI-?/p19 (20 ?g di proteine solubili totali, TSP) sono stati analizzati per un periodo di 6 giorni post-infiltrazione (d.p.i.) per valutare l'andamento dell?accumulo delle proteine ricombinanti. Sia la frazione solubile, sia quella insolubile dell?estratto di foglia sono state analizzate mediante analisi Western Blot. In breve, campioni di biomassa fogliare sono stati macinati finemente in N2 liquido con mortaio e pestello, risospesi ed omogeneizzati in tampone di estrazione (200 mg biomassa; 1:3 peso/volume; Glycerol Buffer: Tris-HCl 100 mM pH 8,1; 10% di glicerolo; 400 mM saccarosio; 5 mM MgCl2; KCl 10 mM; 10 mM 2-?-mercaptoetanolo) contenente un cocktail di inibitori di proteasi (Complete?; Roche, Mannheim, Germania). I campioni sono stati incubati in ghiaccio per 30 min in leggera oscillazione e gli estratti sono stati chiarificati per centrifugazione a 16.000 x g per 20 min. I supernatanti sono stati trasferiti in una nuova provetta e tenuti in ghiaccio fino al momento dell'uso. Il contenuto in proteine solubili totali (TSP) nei supernatanti ? stato stimato mediante Bradford assay (Bio-Rad Inc.). I pellet (frazione insolubile) sono stati risospesi in ugual volume di SDS-PAGE sample buffer 1x (10% glicerolo, Tris-HCl 60 mM pH 6,8, 0,025% blu di bromofenolo, 2% SDS, 3% 2-mercaptoetanolo). I campioni contenenti 20 ?g di TSP e la corrispondente frazione insolubile sono stati denaturati a 9?C per 5 minuti e successivamente sottoposti a elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE 12%), Le proteine sono state elettro-trasferite dal gel su membrana PVDF. La membrana ? stata saturata utilizzando una soluzione al 4 % (p/v) di latte scremato in tampone fosfato (PBS). Le proteine ricombinanti sono state rilevate incubando la membrana prima con un anticorpo anti?FLAG tag-HRP diluito 1:1000 in 2% (p/v) latte scremato in PBS. La rivelazione ? stata effettuata mediante chemiluminescenza con la soluzione ECL. Come controllo negativo sono state utilizzate piante infiltrate solo con A. tumefaciens veicolante il plasmide codificante la proteina soppressore del silencing (p19(-)) (evidenziata la banda attesa pM ~ 35 kDa) (Figura 9A e 9B). La frazione solubile degli estratti GliaMUT ? stata utilizzata per effettuare purificazione mediante IMAC e le frazioni eluite dalla colonna cromatografica analizzate, come precedentemente descritto, mediante SDS-PAGE e WB con anticorpo anti-FLAG tag (Figura 9C). Nel complesso queste analisi hanno mostrato che entrambe le proteine sono prodotte in forma solubile nelle cellule vegetali e che GliaMUT, nonostante sia espressa a livelli pi? bassi rispetto a GliaWT, pu? essere purificata.

Claims (13)

RIVENDICAZIONI

1. Una forma modificata della proteina ?-gliadina comprendente sostituzioni degli amminoacidi in almeno l?80% delle posizioni 13, 18, 23, 25, 30, 36, 37, 42, 49, 54, 55, 64, 67, 75, 79, 81, 89, 93, 115, 123, 130, 139, 144, 151, 164, 181, 191, 197, 200, 205, 211, 218, 224, 230, 232, 240 della sequenza della forma prevalente matura, senza peptide segnale, di ?-gliadina di Triticum aestivum (UniProtK ? P02863) ed avente sequenza SEQ ID No.1.

2. La forma modificata della proteina ?-gliadina secondo la rivendicazione 1 comprendente le sostituzioni degli amminoacidi alle posizioni 13, 18, 23, 25, 30, 36, 37, 42, 49, 54, 55, 64, 67, 75, 79, 81, 89, 93, 115, 123, 130, 139, 144, 151, 164, 181, 191, 197, 200, 205, 211, 218, 224, 230, 232, 240 della sequenza della forma prevalente matura, senza peptide segnale, di ?gliadina di Triticum aestivum ed avente sequenza SEQ ID No.1.

3. La forma modificata della proteina ?-gliadina secondo le rivendicazioni 1 e 2 in cui dal 50 al 70% delle sostituzioni sono sostituzioni amminoacidiche conservative rispetto alla sequenza della forma prevalente di ?-gliadina di Triticum aestivum.

4. La forma modificata della proteina ?-gliadina secondo la rivendicazione 3 in cui il 64% delle sostituzioni sono sostituzioni amminoacidiche conservative rispetto alla sequenza della forma prevalente di ?-gliadina di Triticum aestivum.

5. Una sequenza polinucleotidica di DNA, acido desossiribonucleico, codificante una forma modificata di ?-gliadina di Triticum aestivum secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 avente sequenza SEQ ID No: 3 o una sua sequenza polinucleotidica correlata per effetto della degenerazione del codice genetico o comprendente codoni ottimizzati per l?espressione in sistemi cellulari o cellule ospite per la produzione industriale.

6. Un vettore d?espressione comprendente la sequenza polinucleotidica di DNA secondo la rivendicazione 5.

7. Il vettore d?espressione secondo la rivendicazione 6 che ? idoneo per l?espressione in un microorganismo procariotico, in un organismo eucariotico, in un organismo animale o vegetale.

8. Una cellula comprendente la sequenza polinucleotidica codificante la proteina ?-gliadina modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 o la sequenza polinucleotidica secondo la rivendicazione 5.

9. La cellula secondo la rivendicazione 8 in cui la cellula ? la cellula di un procariote, o la cellula di un eucariote, in particolare la cellula di un cereale che endogenamente non contiene glutine, una cellula di riso (Oryza sativa), avena (Avena sativa), mais (Zea mays), sorgo (Sorghum vulgare), grano saraceno (Fagopyrum esculentum), Quinoa (Chenopodium quinoa) o anche una cellula di una specie di grano geneticamente modificato in cui sono stati eliminati i geni delle ?-gliadine.

10. Una pianta che comprende nel suo genoma la sequenza polinucleotidica codificante la proteina ?-gliadina modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 o la sequenza polinucleotidica secondo la rivendicazione 5.

11. Uso della proteina ?-gliadina modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 estratta e/o purificata da batteri, cellule eucariotiche e cellule vegetali da sola o in aggiunta a farine ottenute da specie vegetali che endogenamente non contengono glutine, da riso (Oryza sativa), avena (Avena sativa), mais (Zea mays), sorgo (Sorghum vulgare), grano saraceno (Fagopyrum esculentum), Quinoa (Chenopodium quinoa) o anche da specie di grano geneticamente modificato in cui sono stati eliminati i geni delle ?-gliadine, per produrre alimenti o prodotti alimentari lavorati detossificati o a ridotta tossicit? per soggetti celiaci.

12. Un alimento od un prodotto alimentare lavorato comprendente l??-gliadina modificata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 detossificato o a ridotta tossicit? per i soggetti celiaci.

13. L?alimento o prodotto alimentare secondo la rivendicazione 12 ottenuto tramite panificazione.