ES2256042T3 - Epitope diagnostico y terapeutico y plata transgenica. - Google Patents
Epitope diagnostico y terapeutico y plata transgenica.Info
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Abstract
Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos PQPELPY (SEC ID Nº 1).
Description
Epítope diagnóstico y terapéutico y planta
transgénica.
La presente invención se refiere al diagnóstico y
la terapia de la enfermedad celiaca, y a una proteína gliadina que
no causa la enfermedad celiaca.
Una reacción inmune a la gliadina (un componente
del gluten) en la dieta causa la enfermedad celiaca. Se sabe que
las respuestas inmunes en el tejido intestinal responden
preferentemente a la gliadina que ha sido modificada por una
transglutaminasa intestinal. La enfermedad celiaca se diagnostica
por medio de la detección de anticuerpos antiendomisiales, pero
ello requiere una confirmación mediante el hallazgo de una
inflamación linfocítica en biopsias intestinales. Sin embargo, la
realización de dicha biopsia es inconveniente para el paciente.
Los investigadores han supuesto anteriormente que
sólo las respuestas a células T intestinales proporcionan una
indicación precisa de la respuesta inmune frente a las gliadinas.
Por lo tanto, se han concentrado en la investigación de las
respuestas a las células T en el tejido intestinal^{1}. Por
ejemplo, el documento EP 0905518 describe epítopes de células T a
partir de glutenina y gliadina. Estos son reconocidos
específicamente por las células T específicas del gluten, o
aquellas que son sensibles, derivadas del medio intestinal. Los
péptidos tienen secuencias SGQGSFQPSQQ (gliadina
206-216; ID SEC Nº 4) y GQQGYYPTSPQQSGQ (glutenina;
ID SEC Nº 5). Se conocen los epítopes de gliadina que requieren
modificación de transglutamisa ^{2}(antes de ser
reconocidos por el sistema inmune).
Los inventores han descubierto el epítope de
células T inmunodominante reconocido por el sistema inmune en la
enfermedad celiaca, y han demostrado que es reconocido por las
células T en la sangre periférica de los individuos con enfermedad
celiaca. Se descubrió que dichas células T estaban presentes en
frecuencias lo bastante altas para ser detectables sin
reestimulación (es decir, podía usarse un sistema de detección "de
respuesta fresca"). El epítope se identificó por medio de un
procedimiento basado en la clonación de células no T que
proporcionaba un reflejo más preciso de los epítopes que se estaban
reconociendo. El epítope inmunodominante requiere modificación de
transglutaminasa (causando la sustitución de una glutamina concreta
por glutamato) antes de ser reconocido por el sistema inmune.
Basándose en este trabajo los inventores han
desarrollado una prueba que puede usarse para diagnosticar la
enfermedad celiaca en una fase temprana. La prueba puede llevarse a
cabo en una muestra de sangre períferica y, por lo tanto, no se
requiere una biopsia intestinal. La prueba es más sensible que las
pruebas de anticuerpos que se están usando actualmente.
La invención proporciona de ese modo un
procedimiento para diagnosticar la enfermedad celiaca, o la
susceptibilidad a la enfermedad celiaca, en un individuo, que
comprende:
(a) poner en contacto una muestra del hospedador
con un agente seleccionado entre (i) el epítope que comprende la
secuencia siguiente: ID SEC Nº 1 ó 2 o una secuencia equivalente de
un homólogo producido de forma natural de la gliadina representado
por la ID SEC Nº 3 (ii) un epítope que comprende la secuencia
siguiente: ID SEC Nº 1, o una secuencia equivalente de homólogo
producido de forma natural de la gliadina representado por la ID
SEC Nº 3, epítope que es un oligopéptido aislado derivado de una
proteína gliadina, (iii) un análogo de (i) o (ii) que puede ser
reconocido por un receptor de célula T que reconoce (i) o (ii), que
en el caso de un análogo péptido no tiene más de 50 aminoácidos de
longitud, o (iv) un producto que comprende dos o más agentes, tal
como se define en (i), (ii) o (iii), y (b) determinar in
vitro si las células T presentes en la muestra reconocen al
agente, indicando el reconociento por parte de las células T que el
individuo tiene o es susceptible de padecer la enfermedad
celiaca.
La invención proporciona también el uso del
agente para la preparación de un medio de diagnóstico para
utilizarse en un procedimiento de diagnóstico de la enfermedad
celiaca o susceptibilidad a la enfermedad celiaca en un individuo,
comprendiendo dicho procedimiento la determinación de si las células
T del individuo reconocen al agente, indicando el reconocimiento
por parte de las células T que el individuo tiene o es susceptible
de padecer la enfermedad celiaca.
El hallazgo de un epítope inmunodominante que es
modificado por la transglutaminasa permite también el diagnóstico
de la enfermedad celiaca basándose en determinar si se producen
otros tipos de respuesta inmune a este epítope. De ese modo, la
invención proporciona también un procedimiento de diagnóstico de la
enfermedad celiaca, o susceptibilidad a la enfermedad celiaca en un
individuo que comprende determinar la presencia de un anticuerpo
que se une al epítope en una muestra del individuo, indicando la
presencia del anticuerpo que el individuo tiene o es susceptible de
padecer la enfermedad celiaca.
La invención proporciona además el agente,
opcionalmente en asociación con un vehículo, para usarse en un
procedimiento de tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca
por células T tolerantes que reconocen al agente. Se proporciona
también un antagonista de una célula T que tiene un receptor de
célula T que reconoce (i) o (ii) opcionalmente en asociación con un
vehículo para usarse en un procedimiento de tratamiento o prevención
de la enfermedad celiaca antagonizando dichas células T. Se
proporciona además el agente o un análogo que une un anticuerpo
(que une el agente) para usarse en un procedimiento de tratamiento o
prevención de la enfermedad celiaca en un individuo haciendo
tolerante al individuo para evitar la producción de dicho
anticuerpo.
La invención proporciona un procedimiento para
determinar si una composición es capaz de causar la enfermedad
celiaca que comprende determinar si una proteína capaz de ser
modificada por una transglutaminasa en una secuencia de
oligopéptidos, tal como se ha definido anteriormente, se halla
presente en la composición, indicando la presencia de la proteína
que la composición es capaz de causar la enfermedad celiaca.
La invención proporciona también una proteína
gliadina mutante cuya secuencia natural puede modificarse por una
transglutaminasa en una secuencia que comprende un epítope que
comprende la secuencia definida anteriormente, pero una proteína
gliadina mutante que ha sido modificada de tal modo que no contiene
una secuencia que pueda ser modificada por una transglutaminasa a
una secuencia que contiene dicho epítope que comprende la secuencia;
o un fragmento de dicha proteína gliadina mutante que tiene al
menos 15 aminoácidos de longitud y que comprende la secuencia que
ha sido modificada de ese modo.
La invención proporciona también una proteína que
comprende una secuencia que es capaz de unirse a un receptor de
células T, receptor de células T que reconoce al agente y una
secuencia que es capaz de causar antagonismo de una célula T que
porta dicho receptor de células T.
Además la invención proporciona un alimento que
comprende las proteínas definidas anteriormente.
La invención se ilustra por medio de los dibujos
adjuntos en los que:
La figura 1 muestra respuestas PBMC (célula
mononuclear de sangre periférica) IFN\gammaELISPOT (el eje
vertical muestra células que forman manchas por 10^{6} PBMC) a la
transglutaminasa tratada con (tTG) y grupo de péptidos sin tratar 3
(cada péptido 10 \mug/ml) incluyendo 15 mers solapados que abarcan
51-85 A-gliadina (véase tabla 1) y
gliadina digerida por a-quimotripsina (40 \mug/ml)
en el sujeto 1 de la enfermedad celiaca, inicialmente en remisión
tras una dieta sin gluten estimulada posteriormente con 200 g de pan
al día durante tres días desde el día 1 (a). Las respuestas PBMC
IFN\gammaELISPOT obtenidas del sujeto 2 a los grupos de péptidos
de A-gliadina tratados con tTG 1-10
que abarcaban la proteína de de A-gliadina completa
durante un tratamiento de estimulación con pan de diez días (b). El
eje horizontal muestra los días trascurridos después del inicio de
la ingesta de pan.
La figura 2 muestra las respuestas de PBMC
IFN\gammaELISPOT al grupo de péptidos tratados con tTG 3 (que
abarcaba A-gliadina 51-85) en siete
sujetos que padecían la enfermedad celiaca (el eje vertical muestra
las células que forman manchas por 10^{6} PBMC), inicialmente en
remisión con una dieta sin gluten, estimulada con pan durante tres
días (días 1-3). El eje horizontal muestra los días
trascurridos desde el inicio de la ingesta de pan (a). Respuestas
de PBMC IFN\gammaELISPOT a péptidos 15 mer solapados tratados tTG
incluidos en el grupo 3; las barras representan la respuesta media
(\pm SEM) a péptidos individuales (10 \mug/ml) en seis sujetos
que padecían la enfermedad celiaca el día 6 ó 7 (b)(en cada uno de
los sujetos las respuestas ELISPOT a péptidos se calcularon como un
% de la respuesta suscitada por el péptido 12, tal como se muestra
por medio de los ejes verticales).
La figura 3 muestra las respuestas de PBMC
IFN\gammaELISPOT a truncamientos tratados con tTG de
A-gliadina 56-75 (0,1 \muM). Las
barras representan la media (\pm SEM) en 5 sujetos que padecían la
enfermedad celiaca. (En los sujetos individuales las respuestas se
calcularon como el % de la respuesta máxima suscitada por cualquiera
de los péptidos sometidos a ensayo).
La figura 4 muestra cómo se trazó la estructura
mínima del epítope de A-gliadina dominante por medio
de péptidos de A-gliadina 7-17 mer
tratados con tTG (0,1 \muM) que incluyen la secuencia PQPQLPY
(A-gliadina 62-60) (a), y los
mismos péptidos sin tratamiento tTG pero con la sustitución
Q\rightarrowE65 (b). Cada línea representa las respuestas de PBMC
IFN\gammaELISPOT en cada uno de los tres sujetos que padecían la
enfermedad celiaca en el día 6 ó 7 después de haber ingerido el pan
los días 1-3. (En los sujetos individuales las
respuestas ELISPOT se calcularon como un % de la respuesta
suscitada por la A-gliadina 17 mer,
57-73).
La figura 5 muestra los aminoácidos que fueron
desamidados por tTG. Se incubó A-gliadina
56-75 (LQLQPFPQP
QLPYPQPQSFP) (0,1\muM) con tTG (50 \mug/ml) a 37ºC durante 2 horas. Se identificó y purificó un solo producto por medio de HPLC de fase inversa. El análisis de aminoácidos permitió un % de desamidación (Q-E) de cada residuo Gln en A-gliadina 56-75 atribuible al tTG que ha de calcularse (eje vertical).
QLPYPQPQSFP) (0,1\muM) con tTG (50 \mug/ml) a 37ºC durante 2 horas. Se identificó y purificó un solo producto por medio de HPLC de fase inversa. El análisis de aminoácidos permitió un % de desamidación (Q-E) de cada residuo Gln en A-gliadina 56-75 atribuible al tTG que ha de calcularse (eje vertical).
La figura 6 muestra el efecto de sustituir
Q-E en A-gliadina
57-73 en otras posiciones además de Q65 por medio
de los 17 mers: QLQPFPQPELPYPQPES (E57, 65), QLQPFPQPELPYPQPES (E65,
72), ELQPFPQPELPYPQPES (E57, 65, 72), y QLQPFPQPELPYPQPQS (E65) en
tres sujetos que padecían la enfermedad celiaca los días 6 y 7
después de ingerir el pan los días 1-3. El eje
vertical muestra el % de la respuesta de E65.
La figura 7 muestra que la
A-gliadina 56-75 tratada con tTG
(0,1 \muM) suscitó respuestas de IFN\gammaELISPOT en (a) PBMC
bajo en nódulo magnético CD4 y CD8. (Las barras representan las
respuestas de PBMC bajo en CD4 como un % de las respuestas de PBMC
bajo en CD8; las células formadoras de manchas por millón de PBMC
bajo en CD8 eran: sujeto 4: 29, y sujeto 6: 535).(b) Las respuestas
PBMC IFN\gammaELISPOT (células formadoras de manchas/millón de
PBMC) tras incubación con anticuerpos monoclonales a
HLA-DR (L243), -DQ(L2) y -DP(B7.21)
(10 \mug/ml) una hora antes de 56-75 tratado con
tTG (0,1 \muM) en dos sujetos que padecían la enfermedad celiaca
homocigóticos para HLA-DQ al*0501,b1*0201.
La figura 8 muestra el efecto de sustituir Glu en
la posición 65 por otros aminoácidos en el epítope inmunodominante.
El eje vertical muestra el % de respuesta en los tres sujetos en
relación con el epítope inmunodominante.
La figura 9 muestra la inmunorreactividad de los
péptidos de gliadina que se producen de forma natural (midiendo las
respuestas de tres sujetos) que contienen la secuencia PQLPY con
(sombreado) y sin (claro) tratamiento de transglutaminasa.
La figura 10 muestra la depleción inmunomagnética
de nódulos específica de CD8, CD4, \beta_{7} y \alpha^{B}
de las células mononucleares de sangre periférica de dos sujetos
celiacos seis días después de comenzar la estimulación del gluten
seguido de interferón gamma ELISPOT. Se usó como antígeno
A-gliadina 57-73 QE65 (25 mcg/ml),
gliadina digerida por quimotripsina tratada con tTG (100 mcg/ml) o
PPD (10 mcg/ml).
La figura 11 muestra la longitud óptima del
epítope de célula T.
La figura 12 muestra una comparación de
A-gliadina 57-73 QE65 con otros
péptidos en un estudio de respuesta de dosis.
La Figura 13 muestra una comparación de las
respuestas específicas de gliadina y A-gliadina
57-73 QE65.
La Figura 14 muestra la bioactividad de los
polimorfismos de gliadina en los sujetos celiacos.
Las figuras 15 y 16 muestran la definición de las
secuencias de epítope central.
Las figuras 17 a 27 muestran la actividad
agonista de las variantes de A-gliadina
57-73 QE65.
La figura 28 muestra respuestas en diferentes
grupos de pacientes.
El término "enfermedad celiaca" abarca un
espectro de estados causados por diversos grados de sensibilidad al
gluten, incluida una forma grave que se caracteriza por una mucosa
intestinal pequeña y plana (atrofia vellosa hiperplástica) y otras
formas caracterizadas por síntomas más suaves.
El individuo mencionado anteriormente (en el
contexto del diagnóstico o la terapia) es humano. Pueden tener
enfermedad celiaca (sintomática o asintomática) o sospecharse que la
tiene. Puede que esté sometido a una dieta sin gluten. Puede
encontrarse en una fase de respuesta aguda (por ejemplo, puede tener
enfermedad celiaca, pero sólo haber ingerido gluten en las últimas
24 horas, antes de lo cual había estado sometido a dieta sin gluten
durante 14 a 28 días).
El individuo puede ser susceptible de padecer
enfermedad celiaca, como es el caso de una susceptibilidad genética
(determinada por ejemplo por el hecho de que tenga parientes con
enfermedad celiaca o posea genes que causen predisposición a la
enfermedad celiaca).
El agente es normalmente un péptido, con una
longitud por ejemplo de entre 7 y 50 aminoácidos, como por ejemplo
entre 10 y 40, o 15 a 30 aminoácidos de longitud.
ID SEC Nº 1 es PQPELPY. ID SEC Nº 2 es
QLQPFPQPELPYPQPQS. ID SEC Nº 3 se muestra en la Tabla 1 y es la
secuencia de una A-gliadina entera. El glutamato en
posición 4 de ID SEC Nº 1 (equivalente a posición 9 de ID SEC Nº 2)
se genera por el tratamiento de transglutaminasa de la
A-gliadina.
El agente puede ser el péptido representado por
ID SEC Nº 1 ó 2 o un epítope que comprenda ID SEC Nº 1, que es un
oligopéptido aislado derivado de una proteína gliadina; o un
equivalente de estas secuencias procedente de una proteína que se
produce de forma natural que es un homólogo de ID SEC Nº 3. De ese
modo, el epítope puede ser un derivado de la proteína representada
por ID SEC Nº 3. Dicho derivado es normalmente un fragmento de la
gliadina, o un derivado mutado de la proteína entera o fragmento de
proteína. Por lo tanto, el epítope de la invención no incluye esta
proteína gliadina entera que se da de modo natural, ni incluye
tampoco otras gliadinas enteras que se dan de modo natural.
El epítope puede por lo tanto ser un fragmento de
A-gliadina (p.ej. ID SEC Nº 3), que comprende la
secuencia de ID SEC Nº 1, obtenible por medio de tratamiento
(completa o parcialmente) con transglutaminasa, es decir, con 1, 2,
3 o más glutaminas sustituidas por glutamatos (incluida la
sustitución dentro de ID SEC Nº 1).
Tales fragmentos pueden ser o pueden incluir las
secuencias representadas por las posiciones 55 a 70, 58 a 73, 61 a
77 de ID SEC Nº 3 mostradas en la Tabla 1. Normalmente tales
fragmentos serán reconocidos por las células T en al menos el mismo
grado en que los péptidos representados por ID SEC Nº 1 ó 2 son
reconocidos en cualquiera de los ensayos descritos en este
documento por medio de muestras de los pacientes de enfermedad
celiaca.
En el caso en el que el epítope comprende una
secuencia equivalente a los epítopes anteriores (incluidos
fragmentos) de otra proteína gliadina (p.ej. cualquiera de las
proteínas gliadina mencionadas en este documento o cualquier
gliadina que cause la enfermedad celiaca), dichas secuencias
equivalentes corresponderán a un fragmento de una proteína gliadina
tratada normalmente (parcial o completamente) con transglutaminasa.
Tales péptidos equivalentes pueden determinarse alineando las
secuencias de otras proteínas gliadina con ID SEC Nº 3 (por ejemplo
usando cualquiera de los programas mencionados en este documento).
La transglutaminasa se encuentra disponible en el mercado (p.ej.
Sigma T-5398). La Tabla 4 proporciona ejemplos de
secuencias equivalentes apropiadas.
El agente que es un análogo es capaz de ser
reconocido por un TCR que reconoce (i) o (ii). Así pues, por lo
general, cuando el análogo se añade a las células T en presencia de
i) o (ii), normalmente también en presencia de una célula que
presenta antígeno (APC) (como puede ser cualquiera de las APC
mencionadas en este documento), el análogo inhibe el reconocimiento
de (i) o (ii), es decir, el análogo es capaz de competir con (i) o
(ii) en tal sistema.
El análogo puede ser uno que sea capaz de unirse
a la TCR que reconozca (i) o (ii). Tal unión puede probarse por
medio de técnicas estándar. Tales TCR pueden aislarse de células T
que han demostrado reconocer (i) o (ii) (p.ej. usando el
procedimiento de la invención). La demostración de la unión del
análogo a las TCR puede mostrarse a continuación determinando si
las TCR inhiben la unión del análogo a una sustancia que se une al
análogo, p.ej. un anticuerpo del análogo. Normalmente el análogo se
une a una molécula MHC de clase II (p.ej. HLA-DQ2)
en tal ensayo de inhibición de unión.
Normalmente, el análogo inhibe la unión de (i) o
(ii) a una TCR. En este caso se reduce la cantidad de i) o (ii) que
puede unirse a la TCR en presencia del análogo. Ello es debido a que
el análogo es capaz de unirse a la TCR y por lo tanto compite con
(i) o (ii) para unirse a la TCR.
Las células T para usarse en los experimentos de
unión anteriores pueden aislarse de pacientes con enfermedad
celiaca, por ejemplo con ayuda del procedimiento de la
invención.
Otras características de unión del análogo pueden
ser también las mismas que i) o (ii), y por lo tanto normalmente el
análogo se une a la misma molécula MHC de clase II a la que se unen
los péptidos (HLA-DQ2). El análogo normalmente se
une a anticuerpos específicos de (i) o (ii), y por lo tanto inhibe
la unión de (i) o (ii) a dichos anticuerpos.
El análogo es normalmente un péptido. Puede tener
homología con (i) o (ii), normalmente al menos 70% de homología,
preferentemente al menos 80%, 90%, 95%, 97% o 99% de homología con
(i) o (ii), por ejemplo sobre una zona de al menos 15 aminoácidos
contiguos más (como puede ser toda la longitud del análogo y/o (i) o
(ii), o a lo largo de la zona que pone en contacto la TCR o se une
a la molécula MHC). Los procedimientos de medición de la homología
de proteínas son bien conocidos en la técnica y los expertos en la
materia entenderán que en el presente contexto, la homología se
calcula sobre la base de la identidad de aminoácidos (referida a
veces como "homología dura").
Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el
programa BESTFIT, que puede usarse para calcular la homología (por
ejemplo usada en sus valores por defecto) (Devereux y col.
(1984), Nucleic Acids Research 12, págs. 387-395).
Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la
homología o las secuencias de alineamiento (normalmente en sus
valores por defecto), por ejemplo de la manera descrita en Altschul
S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F
y col (1990) J Mol Biol 215: 403-10.
El software para realizar los análisis BLAST se
encuentra a disposición pública a través del National Center for
Biotechnology Information (http: www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este
algoritmo implica identificar en primer lugar el par de secuencia
de puntuación alta (HSP) identificando palabras cortas de longitud W
en la secuencia de pregunta que o bien se corresponden o satisfacen
alguna puntuación umbral T valorada positivamente cuando se alinea
con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de
datos. Se denomina T al umbral de puntuación de la palabra vecina
(Atlschul y col, supra). Estos resultados iniciales de
palabras vecinas actúan como iniciadores de búsquedas para
encontrar HSP que las contengan. Los resultados de palabras se
extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la
medida en que pueda aumentar la puntuación de alineamiento
acumulativo. Las extensiones de los resultados de palabras en cada
dirección se detienen cuando: la puntuación de alineamiento
acumulativo cae en la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la
puntuación acumulativa llega a cero o cae por debajo, debido a la
acumulación de uno o más alineamientos de residuos que puntúan
negativamente; o se alcanza el extremo de cada secuencia.
Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST
determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa
BLAST usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de
11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff
(1992) Proc. Natl.Acad. Sci. EE UU 89:
10915-10919), alineamientos (B) de 50, expectativa
(E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas líneas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase p.ej. Karlin
y Altschul (1993) Proc. Natl.Acad. Sci. EE UU 90:
5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por
el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña
(P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de
que se produzca por casualidad una coincidencia entre dos secuencias
de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia se
considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más
pequeña al comparar la primera secuencia con la segunda es inferior
a aproximadamente 1, preferentemente menos de aproximadamente 0,1,
más preferentemente menos de aproximadamente 0,01, y lo más
preferentemente menos de 0,001.
Los análogos péptidos homólogos difieren
normalmente de (i) o (ii) en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más mutaciones
(que pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones). Estas
mutaciones pueden medirse a lo largo de cualquiera de las zonas
mencionadas anteriormente en relación con el cálculo de la
homología. Las sustituciones son preferentemente
"conservadoras". Se definen de acuerdo con la siguiente Tabla.
Los aminoácidos situados en el mismo bloque en la segunda columna y
preferentemente en la misma línea en la tercera columna pueden
sustituirse entre sí.
ALIFÁTICO | No polar | GAP |
ILV | ||
Polar - sin cargar | CSTM | |
NQ | ||
Polar - cargado | DE | |
KR | ||
AROMÁTICO | HFWY |
Normalmente los aminoácidos en las posiciones
análoga y equivalente a los aminoácidos en (i) o (ii) que
contribuyen a unirse a la molécula MHC o son responsables de
reconocer la TCR, son los mismos o están conservados.
Normalmente, el péptido análogo comprende una o
más modificaciones, que pueden ser modificaciones naturales
post-traducción o modificaciones artificiales. La
modificación puede proporcionar una fracción química (normalmente
por sustitución de un hidrógeno, p.ej. de un enlace
C-H), como puede ser un grupo amino, acetilo,
hidroxi o grupo halógeno (p.ej. fluorina) o grupo carbohidrato.
Normalmente, la modificación está presente en el terminus N o
C.
El análogo puede comprender uno o más aminoácidos
no naturales, por ejemplo aminoácidos con una cadena lateral
diferente a los aminoácidos naturales. Generalmente, el aminoácido
no natural tendrá un terminus N y/o un terminus C. El aminoácido no
natural puede ser un aminoácido L- o D-.
El análogo normalmente tiene una forma, tamaño,
flexibilidad o configuración electrónica que es básicamente similar
a (i) o (ii). Es normalmente un derivado de (i) o (ii). En una forma
de realización el análogo es una proteína de fusión que comprende
la secuencia ID SEC Nº 1 ó 2, o cualquier otro péptido mencionado en
este documento; y secuencia de no gliadina.
En una realización, el análogo es o imita (i) o
(ii) unido a una molécula MHC de clase II. 2, 3, 4 o más complejos
de este tipo pueden estar asociados o unidos entre sí, por ejemplo
por medio de un sistema basado en biotina/estreptavidina, en el que
normalmente 2, 3 ó 4 moléculas MHC etiquetadas con biotina se unen
con una fracción de estreptavidina. Este análogo normalmente inhibe
la unión del complejo (i) o (ii)/MHC Clase II a una TCR o anticuerpo
que es específico para el complejo.
El análogo es normalmente un anticuerpo o un
fragmento de un anticuerpo, como por ejemplo un fragmento Fab o
(Fab)_{2}. El análogo puede inmovilizarse en un soporte
sólido, específicamente en un análogo que imite a un péptido unido
a una molécula MHC.
El análogo se diseña normalmente por medios
informáticos y luego se sintetiza por medio de procedimientos
conocidos en la técnica. Otra opción es que puede seleccionarse de
entre una biblioteca de compuestos. La biblioteca puede ser un
banco combinatorio o un banco expositor, como puede ser una
biblioteca de muestra de bacteriófagos. La biblioteca de compuestos
puede expresarse en la biblioteca de muestra de manera unida a una
molécula MHC de clase II, como por ejemplo HLA-DQ2.
Los análogos se seleccionan generalmente de la biblioteca en
función de su capacidad de imitar las características de unión (i) o
(ii). Por lo tanto, pueden seleccionarse en función de su capacidad
de unirse a una TCR o anticuerpo que reconozca (i) o (ii).
Normalmente los análogos se reconocerán por parte
de las células T en al menos el mismo grado que cualquiera de los
agentes (i) o (ii), por ejemplo en al menos el mismo grado que el
epítope equivalente y preferentemente en el mismo grado en que el
péptido representado por ID SEC Nº 2 es reconocido en cualquiera de
las pruebas descritas en este documento, normalmente por medio de
células T de pacientes con enfermedad celiaca. Los análogos pueden
reconocerse en estos grados in vivo y por lo tanto pueden
inducir los síntomas de la enfermedad celiaca en al menos el mismo
grado que cualquiera de los agentes mencionados en este documento
(p.ej. en un paciente humano o en un modelo animal).
Los análogos pueden identificarse en un
procedimiento que comprende determinar si una sustancia candidato
es reconocida por un receptor de células T que reconoce un epítope
de la invención, indicando el reconocimiento de la sustancia que la
sustancia es un análogo. Tales TCR pueden ser cualquiera de las TCR
mencionadas en este documento, y pueden estar presentes en las
células T. Cualquier ensayo apropiado mencionado en este documento
puede usarse para identificar el análogo. En una forma de
realización este procedimiento se efectúa in vivo. Como se
ha mencionado anteriormente, los análogos preferentes se reconocen
en al menos el mismo grado que el péptido ID SEC Nº 2, y por lo
tanto el procedimiento puede usarse para identificar análogos que se
reconocen en esta medida.
En una forma de realización el procedimiento
comprende determinar si una sustancia candidato es capaz de inhibir
el reconocimiento de un epítope de la invención, indicando la
inhibición de reconocimiento que la sustancia es un análogo.
El agente puede ser un producto que comprende al
menos 2, 5, 10 o 20 agentes tal como define (i), (ii) o (iii).
Normalmente la composición comprende epítopes de la invención (o
análogos equivalentes) de diferentes gliadinas, como por ejemplo
cualquiera de las especies, o variedad o tipos de gliadina
mencionados en esta patente. Las composiciones preferentes
comprenden al menos un epítope de la invención, o análogo
equivalente, de todas las gliadinas presentes en cualquiera de las
especies o variedades mencionadas en esta patente o de 2, 3, 4 o
más de las especies mencionadas en este documento (como, por
ejemplo, el panel de especies consistente en trigo, centeno,
cebada, avena y triticale).
Tal como se ha mencionado antes, el procedimiento
de diagnóstico de la invención puede basarse en la detección de
células T que se unen al agente o en la detección de anticuerpos que
reconocen el agente.
Las células T que reconocen el agente en el
procedimiento (que incluye el uso mencionado anteriormente) son
generalmente células T que han sido sensibilizadas previamente in
vivo a la gliadina. Tal como se ha mencionado antes, se ha
descubierto que dichas células T sometidas a antígeno están
presentes en la sangre periférica.
En el procedimiento las células T pueden ponerse
en contacto con el agente in vitro o in vivo, y la
determinación de si las células T reconocen al agente puede
efectuarse in vitro o in vivo. Por lo tanto la
invención proporciona el agente que ha de usarse en un
procedimiento de diagnóstico practicado en el cuerpo humano. Se
proporcionan diferentes agentes para su uso simultáneo, separado o
secuencial en dicho procedimiento.
El procedimiento in vitro se lleva a cabo
normalmente en una solución acuosa a la que se añade el agente. La
solución comprenderá también las células T (y en determinadas
realizaciones las APC expuestas más adelante). El término "poner
en contacto" tal como se usa en este documento incluye añadir la
sustancia concreta a la solución.
Por lo general, se determina si las células T
reconocen el agente detectando un cambio en el estado de dichas
células T en presencia del agente o determinando si las células T se
unen al agente. El cambio de estado es causado generalmente por una
actividad funcional específica de antígeno de la célula T después
de que la TCR ligue al agente. El cambio de estado puede medirse
dentro (por ejemplo, el cambio en la expresión intracelular de las
proteínas) o fuera (por ejemplo, detección de sustancias secretadas)
de las células T.
El cambio de estado de la célula T puede ser el
inicio o incremento en la secreción de una sustancia de la célula
T, como puede ser una citocina, especialmente
IFN-\gamma, IL-2 o
TNF-\alpha. Se prefiere en particular la
determinación de la secreción de IFN-\gamma. La
sustancia puede detectarse normalmente permitiendo que se ligue a
un agente ligante específico y luego midiendo la presencia del
agente ligante específico o complejo de sustancias. El agente
ligante específico es normalmente un anticuerpo, como por ejemplo,
anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos de las
citocinas están disponibles en el mercado, o pueden fabricarse con
técnicas estándar.
Normalmente el agente ligante específico se
inmoviliza sobre un soporte sólido. Después de dejar que la
sustancia se ligue, el soporte sólido, opcionalmente, puede lavarse
para eliminar el material que no está unido específicamente al
agente. El agente o complejo de sustancias puede detectarse por
medio de un segundo agente ligante que unirá el complejo.
Normalmente el segundo agente une la sustancia en un sitio que es
diferente del sitio que se une al primer agente. El segundo agente
es preferentemente un anticuerpo y es etiquetado directa o
indirectamente por medio de una etiqueta detectable.
Por lo tanto el segundo agente puede detectarse
por medio de un tercer agente que normalmente se etiqueta directa o
indirectamente con una etiqueta detectable. Por ejemplo, el segundo
agente puede comprender una fracción de biotina, permitiendo la
detección por parte de un tercer agente que comprende una fracción
de estreptavidina y normalmente fosfatasa alcalina como etiqueta
detectable.
En una forma de realización el sistema de
detección que se usa es el ensayo ELISPOT
ex-vivo descrito en el documento WO
98/23960. En este ensayo IFN-\gamma secretado
desde la célula T es unido por medio de un primer anticuerpo
especifico de IFN-\gamma que se inmoviliza sobre
un soporte sólido. A continuación el IFN-\gamma
unido es detectado por medio de un segundo anticuerpo específico de
IFN-\gamma que es etiquetado por medio de una
etiqueta detectable. Dicha etiqueta detectable la proporciona
MABTECH (Estocolmo, Suecia). Más adelante se exponen otras
etiquetas detectables que pueden usarse.
El cambio de estado de la célula T que puede
medirse puede ser el incremento de absorción de sustancias por la
célula T, como por ejemplo la absorción de timidina. El cambio de
estado puede ser un aumento del tamaño de las células T, o
proliferación de las células T, o un cambio en los marcadores de
superficie celular en la célula T.
En una forma de realización el cambio de estado
se detecta midiendo el cambio en la expresión intracelular de las
proteínas, por ejemplo el aumento de expresión intracelular de
cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente. Tales
cambios intracelulares pueden detectarse poniendo en contacto el
interior de la célula T con una fracción que se une a las proteínas
expresadas de una manera específica y que permite la clasificación
de las células T por medio de citometría de flujo.
En una forma de realización cuando se une a la
TCR el agente se une a una molécula MHC de clase II (normalmente
HLA-DQ2), que está presente normalmente en la
superficie de una célula presentadora de antígeno (APC). No
obstante, tal como se ha mencionado en esta patente, otros agentes
pueden unirse a una TCR sin la necesidad de unirse también a una
molécula MHC.
Generalmente, las células T con las que se entra
en contacto en el procedimiento se toman del individuo en una
muestra de sangre, si bien puede usarse otros tipos de muestras que
contienen células T. La muestra puede añadirse directamente al
ensayo o procesarse primero. Normalmente el proceso puede comprender
la dilución de la muestra, por ejemplo con agua o tamponador.
Normalmente la muestra se diluye entre 1,5 y 100 veces, por ejemplo
de 2 a 50 ó 5 a 10 veces.
El proceso puede comprender la separación de los
componentes de la muestra. Normalmente se separa de las muestras
las células mononucleares (MC). Las MC comprenderán las células T y
las APC. Por lo tanto en el procedimiento las APC presentes en las
MC separadas pueden presentar el péptido a las células T. En otra
realización sólo las células T, como por ejemplo sólo las células T
CD4, pueden purificarse a partir de la muestra. Las PBMC, las MC y
las células T pueden separarse de la muestra por medio de técnicas
conocidas, como pueden ser las descritas en Lalvani y col
(1997) J.Exp. Med. 186, pp 859-865.
En una forma de realización las células T usadas
en el ensayo están en forma de muestras sin procesar o diluidas, o
son células T recién aisladas (como por ejemplo en la forma de MC o
PBMC recién aisladas) que se usan directamente ex vivo, es
decir no se cultivan antes de usarse en este procedimiento. Por lo
tanto, las células T no se han reestimulado de una manera
específica de antígeno in vitro. No obstante, las células T
pueden cultivarse antes de su uso, por ejemplo en presencia de uno
o más de los agentes, y generalmente también citocinas promotoras
de crecimiento exógeno. Durante el cultivo el agente o agentes están
presentes normalmente en la superficie de las APC, como pueden ser
las APC usadas en el procedimiento. El cultivo previo de las células
T puede conducir a un aumento en la sensibilidad del procedimiento.
De este modo, las células T pueden convertirse en líneas celulares,
como puede ser líneas celulares a corto plazo (por ejemplo tal como
se describe en Ota y col (1990) Nature 346, pp
183-187).
La APC que típicamente está presente en el
procedimiento puede ser del mismo individuo que la célula T o de un
hospedador diferente. La APC puede ser una APC que aparece de forma
natural o una APC artificial. La APC es una célula que es capaz de
presentar el péptido a una célula T. Típicamente, es una célula B,
célula dendrítica o macrófago. Típicamente, se separa a partir de
la misma muestra que la célula T y típicamente se purifica
conjuntamente con la célula T. De este modo, la APC puede estar
presente en las MC o en las PBMC. La APC típicamente es una célula
recién aislada ex vivo o una célula cultivada. Puede estar en
forma de línea celular, tal como una línea celular a corto plazo o
inmortalizada. La APC puede expresar moléculas de MHC de clase II
vacías en su superficie.
En el procedimiento pueden usarse uno o más
agentes (diferentes). Típicamente, las células T derivadas de la
muestra puede colocarse en un ensayo con todos los agentes que se
pretenden ensayar o las células T pueden dividirse y colocarse en
ensayos independientes, que contienen cada uno de los cuales uno o
más agentes.
La invención también proporciona los agentes,
tales como dos o más de cualquiera de los agentes mencionados en
este documento (por ejemplo, las combinaciones de agentes que están
presentes en la composición de agente descrita anteriormente) para
su uso simultáneo independiente o secuencial (por ejemplo, para su
uso in vivo).
En una realización, el agente per se se
añade directamente a un ensayo que comprende células T y APC. Como
se discute anteriormente, las células T y las APC de este ensayo
podrían estar en forma de MC. Cuando se usan agentes que pueden ser
reconocidos por la célula T sin necesidad de ser presentados por las
APC, entonces no se necesitan APC. Los agentes análogos que
mimetizan la unión (i) o (ii) original a una molécula MHC son un
ejemplo de estos agentes.
En una realización, se proporciona el agente a
las APC en ausencia de la célula T. A continuación, se proporciona
la APC a la célula T, típicamente tras haber permitido que presente
el agente en su superficie. El péptido puede haber sido captado
dentro de las APC y presentarse, o simplemente captarse en la
superficie sin que entre dentro de la APC.
La duración durante la cual el agente se pone en
contacto con las células T variará dependiendo del procedimiento
usado para determinar el reconocimiento del péptido. Típicamente, se
añaden de 10^{5} a 10^{7}, preferiblemente de 5 x 10^{5} a
10^{6} PBMC a cada ensayo. En el caso en que el agente se añade
directamente al ensayo, su concentración es de 10^{-1} a
10^{3} \mug/ml, preferiblemente de 0,5 a 50 \mug/ml o de 1 a
10 \mug/ml.
Típicamente, la longitud de tiempo durante el
cual las células T se incuban con el agente es de 4 a 24 horas,
preferiblemente de 6 a 16 horas. Cuando se usan PBMC ex vivo,
se ha encontrado que pueden incubarse 0,3 x 10^{6} PBMC en 10
\mug/ml de péptido durante 12 horas a 37ºC.
La determinación del reconocimiento del agente
por las células T puede hacerse midiendo la unión del agente a las
células T (esto puede realizarse usando cualquier formato de ensayo
de unión adecuado descrito en este documento). Típicamente, las
células T que se unen al agente puede clasificarse en base a esta
unión, por ejemplo usando un aparato FACS. Se considerará que se da
la presencia de células T que reconocen el agente, si la frecuencia
de células clasificadas usando el agente está por encima de un valor
"control". La frecuencia de células T que han tenido contacto
con el antígeno generalmente es de 1 entre 10^{6} a 1 entre
10^{3} y, por tanto, puede determinarse si las células
clasificadas son o no células T que han tenido contacto con el
antígeno.
La determinación del reconocimiento del agente
por las células T puede medirse in vivo. Típicamente, el
agente se administra al hospedador y después puede medirse una
respuesta que indique el reconocimiento del agente. Típicamente, el
agente se administra por vía intradérmica o epidérmica. El agente
típicamente se administra mediante el contacto con la parte externa
de la piel y puede mantenerse en el sito con la ayuda de un
adhesivo o vendaje. De forma alternativa, el agente puede
administrarse mediante una aguja, tal como por inyección, pero
también puede administrarse mediante otros procedimientos tales como
balística (por ejemplo, las técnicas de balística que se han usado
para suministrar ácidos nucleicos). El documento
EP-A-0693119 describe técnicas que
típicamente pueden usarse para administrar el agente. Típicamente,
se administran de 0,001 a 1000 \mug, por ejemplo, de 0,01 a 100
\mug o de 0,1 a 10 \mug del agente.
En una realización, puede administrarse un
producto que es capaz de proporcionar el agente in vivo. De
este modo, puede administrarse un polinucleótido capaz de expresar
el agente, típicamente por cualquiera de los medios descritos
anteriormente para la administración del agente. Típicamente, el
polinucleótido tiene cualquiera de las características del
polinucleótido proporcionado por la invención que se describe a
continuación. El agente se expresa in vivo a partir del
polinucleótido. Típicamente, se administran de 0,001 a 1000 \mug,
por ejemplo, de 0,01 a 100 \mug o de 0,1 a 10 \mug del
polinucleótido.
Típicamente, el reconocimiento del agente
administrado en la piel se indica mediante la aparición de
inflamación (por ejemplo, induración, eritema o edema) en el lugar
de la administración. Generalmente, esta se mide mediante el
examen visual del sitio.
Típicamente, el procedimiento de diagnóstico
basado en la detección de un anticuerpo que se une al agente se
realizar poniendo en contacto una muestra del individuo (tal como
cualquiera de las muestras mencionadas aquí, opcionalmente
procesado de cualquiera de las formas mencionadas en este documento)
con el agente y determinando si un anticuerpo de la muestra se une
al agente, indicando dicha unión que el individuo tiene, o es
susceptible de padecer enfermedad celiaca. Puede usarse cualquier
formato adecuado de ensayo de unión, tal como cualquier formado
mencionado en este documento.
La identificación del epítope inmunodominante
permite que se hagan los productos terapéuticos que se dirigen a
las células T que reconocen este epítope (siendo estas células T las
que participan en la respuesta inmune frente a gliadina). Este
hallazgo también permite la prevención o el tratamiento de la
enfermedad celiaca suprimiendo (mediante tolerización) una
respuesta de anticuerpo o células T al epítope.
Ciertos agentes de la invención se unen al TCR
que reconoce el epítope de la invención (según se mide usando
cualquiera de los ensayos de unión descritos anteriormente) y causan
la tolerización de la célula T que expresa el TCR. Estos agentes,
opcionalmente en asociación con un vehículo, pueden usarse, por
tanto, para prevenir o tratar la enfermedad celiaca.
Generalmente, puede causarse tolerización
mediante los mismos péptidos que pueden causar (tras ser reconocidos
por el TCR) la actividad funcional específica de antígeno de la
célula T (tal como cualquier actividad mencionada en este
documento, por ejemplo, la secreción de citocinas). Estos agentes
causan la tolerización cuando son presentados al sistema inmune en
un contexto "tolerizante".
La tolerización lleva a un descenso en el
reconocimiento de un epítope de célula T o anticuerpo por el
sistema inmune. En el caso de un epítope de célula T, esto puede
originarse mediante la deleción o por anergia de las células T que
reconocen el epítope. De este modo, desciende la actividad de la
célula T (por ejemplo como se mide en ensayos adecuados mencionados
en este documento) en respuesta al epítope. La tolerización de una
respuesta anticorpal significa que se produce una cantidad
disminuida de anticuerpo específico del epítope cuando se
administra el epítope.
Se conocen procedimientos de presentación de
antígenos al sistema inmune en este contexto y se describen, por
ejemplo, en Yoshida y col. Clin. Immunol. Immunopathol.
82,207-215 (1997), Thurau y col. Clin. Exp.
Immunol. 109,370-6(1997) y Weiner y
col. Res. Immunol. 148,528-33 (1997). En
particular, ciertas vías de administración pueden causar
tolerización, tales como oral, nasal o intraperitoneal. Pueden
administrarse al individuo productos particulares que causan
tolerización (por ejemplo, en una composición que también comprende
el agente). Estos productos incluyen citocinas, tales como
citocinas que favorecen una respuesta Th2 (por ejemplo,
IL-4, TGF-\beta o
IL-10). Los productos o agentes pueden administrarse
a una dosis que causa tolerización.
La invención proporciona una proteína que
comprende una secuencia capaz de actuar como un antagonista de la
célula T (la célula T que reconoce el agente). Estas proteínas y
estos antagonistas también pueden usarse para prevenir o tratar la
enfermedad celiaca. El antagonista causará un descenso en la
respuesta de células T. En una realización, el antagonista se une
al TCR de la célula T (generalmente en forma de complejo con
HLA-DQ2) pero, en lugar de causar la activación
funcional normal, causa una señal anómala que pasará a través de la
cascada de señalización intracelular de TCR causando un descenso de
la actividad funcional de la célula T (por ejemplo, en respuesta al
reconocimiento de un epítope, típicamente según se mide mediante
cualquier ensayo adecuado mencionado en este documento).
En una realización, el antagonista compite con el
epítope para unirse con un componente de la ruta de procesamiento y
presentación del MCH, tal como una molécula de MHC (típicamente
HLA-DQ2). De este modo, el antagonista puede unirse
a HLA-DQ2 (y, de este modo, ser un péptido
presentado por esta molécula de MHC), tal como el péptido TP (Tabla
10) o un homólogo del mismo.
Los procedimientos para causar antagonismo son
bien conocidos en la técnica. En una realización, el antagonista es
un homólogo de los epítopes mencionados anteriormente y puede tener
cualquiera de la secuencia, unión u otras propiedades del agente
(particularmente análogos). Típicamente, los antagonistas difieren
de cualquiera de los epítopes anteriores (que son capaces de dar
lugar a una función específica de antígeno en la célula T) en 1, 2,
3, 4 o más mutaciones (cada una de las cuales puede ser una
sustitución, inserción o deleción). Estos antagonistas se denominan
en la técnica "ligandos peptídicos alterados" o "LPA".
Típicamente, las mutaciones están en las posiciones de aminoácidos
que entran en contacto con el TCR.
El antagonista puede diferir del epítope por una
sustitución en la secuencia que es equivalente a la secuencia
representado por los aminoácidos 65 a 67 de la
A-gliadina (estos antagonistas se muestran en la
Tabla 9). De este modo, preferiblemente el antagonista tiene una
sustitución en el equivalente de las posiciones 64, 65 ó 67.
Preferiblemente, las sustituciones son 64W, 67W, 67M o 65T.
Puesto que la respuesta inmune de células T
frente al epítope de la invención en un individuo es policlonal,
puede que sea necesario administrar más de un antagonista para
causar antagonismo de células T de la respuesta que tiene
diferentes TCR. Por tanto, los antagonistas pueden administrarse en
una composición que comprende al menos 2, 4, 6 o más antagonistas
diferentes, que antagonizan cada una células T diferentes.
La invención también proporciona un procedimiento
para identificar un antagonista de una célula T (que reconoce al
agente) que comprende poner en contacto una sustancia candidata con
la célula T y detectar si la sustancia causa un descenso en la
capacidad de la célula T para experimentar una respuesta específica
de antígeno (por ejemplo, usando cualquier ensayo adecuado
mencionado en este documento), indicando la detección de cualquiera
de estos descensos en dicha capacidad que la sustancia es un
antagonista.
En una realización, los antagonistas (incluyendo
combinaciones de antagonistas de un epítope en particular) o los
agentes tolerizantes (célula T y anticuerpo tolerizante) están
presentes en una composición que comprende al menos 2, 4, 6 o más
antagonistas o agentes que antagonizan o tolerizan a diferentes
epítopes de la invención, por ejemplo, a las combinaciones de
epítopes descritos anteriormente en relación con los agentes que son
un producto que comprende más de una sustancia.
Como se menciona anteriormente, la invención
proporciona un procedimiento para determinar si una composición es
capaz de causar la enfermedad celiaca que comprende detectar la
presencia de una secuencia proteica que es capaz de ser modificada
por una transglutaminasa en una secuencia que comprende el agente o
epítope de la invención (esta actividad transglutaminasa puede ser
una actividad transglutaminasa intestinal humana). Típicamente esto
se realiza usando un ensayo de unión en el que se pone en contacto
con la composición un resto que se une a la secuencia de una forma
específica, se detecta la formación del complejo secuencia/resto y
se usa para determinar la presencia del agente. Este resto puede ser
cualquier sustancia adecuada (o tipo de sustancia) mencionada en
este documento, y típicamente es un anticuerpo específico. Puede
usarse cualquier formato adecuado de ensayo de unión (tal como los
mencionados en este documento).
En una realización, la composición se pone en
contacto con al menos 2, 5, 10 o más anticuerpos de diferentes
gliadinas que son específicos de los epítopes de la invención, por
ejemplo, un grupo de anticuerpos capaces de reconocer las
combinaciones de epítopes descritas anteriormente en relación con
agentes de la invención que son productos que comprende más de una
sustancia.
Típicamente, la composición comprende material de
una planta que expresa una gliadina que es capaz de causar la
enfermedad celiaca (por ejemplo, cualquiera de las gliadinas o
plantas mencionadas en este documento). Este material puede ser una
parte de la planta, tal como un producto recolectado (por ejemplo,
semillas). El material puede ser productos procesados del material
vegetal (por ejemplo, cualquiera de estos productos mencionados en
este documento), tales como una harina o alimento que contenga la
gliadina. El procesamiento del material alimenticio y las pruebas y
ensayos de unión adecuados son rutinarios, por ejemplo, como se
menciona en Kricka LJ, J. Biolumin. Chemilumin.
13,189-93(1998).
La determinación de la unión entre dos sustancias
cualesquiera mencionadas en este documento puede hacerse midiendo
una característica de una o de ambas sustancias que cambia tras la
unión, tal como un cambio espectroscópico.
El formato del ensayo de unión puede ser un
sistema de "desplazamiento de banda". Esto implica determinar
si la presencia de una sustancia (tal como una sustancia candidata)
favorece o retrasa el progreso de las otras sustancias durante la
electroforesis en gel.
El formato puede ser un procedimiento de unión
competitivo que determina si una sustancia es capaz de inhibir la
unión de la otra sustancia a un agente del que se sabe que se une a
la otra sustancia, tal como un anticuerpo específico.
La invención proporciona una proteína gliadina en
la que se ha mutado una secuencia de un epítope de la invención, o
una secuencia que puede modificarse mediante una transglutaminasa
para proporcionar esta secuencia, de modo que ya no causa, o es
reconocida por, una respuesta de la célula T que reconoce el
epítope. En este contexto, el término reconocimiento se refiera al
TCR que se une al epítope de tal manera que tiene lugar una
actividad funcional específica de antígeno normal (no antagonista)
de la célula T.
Los procedimientos para identificar epítopes
equivalentes en otras gliadinas se discuten anteriormente. El tipo
silvestre de la gliadina mutada en uno de los que causa la
enfermedad celiaca. Esta gliadina podrá tener homología con la SEC
ID Nº 3, por ejemplo, en el grado mencionado anteriormente (en
relación con el análogo) a lo largo de toda la SEC ID Nº 3 o a lo
largo de 15, 30, 60, 100 ó 200 aminoácidos contiguos de la SEC ID
Nº 3.
La gliadina mutada no causará la enfermedad
celiaca o causará síntomas reducidos de la enfermedad celiaca.
Típicamente, la mutación disminuye la capacidad del epítope para
inducir una respuesta de células T. El epítope mutado puede tener
una unión reducida a HLA-DQ2, una capacidad reducida
para ser presentado por una APC o una capacidad reducida para
unirse o para ser reconocido (es decir, causar actividad funcional
específica de antígeno) por las células T que reconocen el agente.
Por tanto, la gliadina o el epítope mutado mostrarán un
reconocimiento reducido o ningún reconocimiento en cualquiera de los
ensayos mencionados en este documento en relación con los aspectos
diagnósticos de la invención.
La mutación puede ser una o más deleciones,
adiciones o sustituciones en el epítope de una longitud de 1 a 3, 4
a 6, 6 a 10, 11 a 15 o más, por ejemplo, a lo largo de la secuencia
SEC ID Nº 2 o su equivalente. Preferiblemente, la gliadina mutada
tiene al menos una mutación en la SED ID Nº 1. Una mutación
preferida está en la posición 65 de la A-gliadina
(o en una posición equivalente de otras gliadinas). Típicamente, la
glutamina que aparece de forma natural en esta posición se sustituye
por cualquiera de los aminoácidos mostrados en la Tabla 3,
preferiblemente por histidina, tirosina, triptófano, lisina, prolina
o arginina.
De este modo, la invención también proporciona el
uso de una mutación (cualquiera de las mutaciones en cualquiera de
las secuencias descritas en este documento) en un epítope de una
proteína gliadina, cuyo epítope es un epítope de la invención, para
reducir la capacidad de la proteína gliadina para causar la
enfermedad celiaca.
En una realización, la secuencia mutada es capaz
de actuar como un antagonista. De este modo, la invención también
proporciona una proteína que comprende una secuencia que es capaz de
unirse a un receptor de la célula T, cuyo receptor de célula T
reconoce un agente de la invención y cuya secuencia es capaz de
causar antagonismo de una célula T que expresa este receptor de
célula T.
La invención también proporciona proteínas que
son fragmentos de las anteriores proteínas gliadinas mutantes, que
al menos tienen 15 aminoácidos de longitud (por ejemplo, al menos
30, 60, 100, 150, 200 ó 250 aminoácidos de longitud) y que
contienen las mutaciones descritas anteriormente que reducen la
capacidad de la gliadina para ser reconocida. Cualquiera de las
proteínas mutadas (incluyendo fragmentos) mencionadas en este
documento, también se presenta en forma de proteínas de fusión, por
ejemplo, con otras gliadinas o con proteínas no gliadina.
Típicamente, la proteína de tipo silvestre
equivalente a la proteína gliadina mutada es de una gramínea
monocotiledónea, tal como una planta del género Triticum, por
ejemplo, trigo, centeno, avena o triticale. Típicamente, la
proteína es una gliadina \alpha, \alpha\beta, \gamma o
\omega. La gliadina puede ser una A-gliadina.
La invención también proporciona un kit para
realizar el procedimiento que comprende uno o más agentes y, de
forma opcional, un medio para detectar el reconocimiento del agente
por la célula T. Típicamente, se proporcionan los diferentes
agentes para su uso de forma simultánea, independiente o secuencial.
Típicamente, los medios para detectar el reconocimiento permiten o
ayudan a la detección en función de las técnicas descritas
anteriormente.
De este modo, los medios pueden permitir la
detección de una sustancia secretada por las células T tras el
reconocimiento. Así, el kit puede incluir de forma adicional un
resto de unión específica al sustrato, tal como un anticuerpo.
Típicamente, el resto es específico de IFN-\gamma.
Típicamente, el resto está inmovilizado en un soporte sólido. Esto
significa que tras la unión al resto, la sustancia se mantendrá en
las proximidades de la célula T que la secreta. De este modo, se
formarán ``manchas de complejo sustancia/resto en el soporte,
representando cada mancha a una célula T que secreta la sustancia.
La cuantificación de las manchas y, típicamente, la comparación con
el control, permite la determinación del reconocimiento del
agente.
El kit también puede comprende un medio para
detectar el complejo sustancia/resto. Puede darse un cambio
detectable en el propio resto después de la unión de la sustancia,
tal como un cambio de color. De forma alternativa, puede permitirse
que un segundo resto se una directa o indirectamente al complejo
sustancia/resto para permitir la determinación de las manchas. Como
se describe anteriormente, el segundo resto puede ser específico de
la sustancia, pero unirse a un sitio diferente de la sustancia al
del primer resto.
El soporte inmovilizado puede ser una placa con
pocillos, tal como una placa de microvaloración. Por tanto, cada
ensayo puede realizarse en un pocillo distinto de la placa.
Adicionalmente, el kit puede contener medio para
las células T, restos de detección o tampones de lavado usados en
las etapas de detección. Adicionalmente, el kit puede comprender
reactivos adecuados para la separación de la muestra, tal como la
separación de PBMC o de células T a partir de la muestra. El kit
puede estar diseñado para que permita la detección de las células T
directamente en la muestra sin que se requiera ninguna separación
de los componentes de la muestra.
El kit puede comprender un instrumento que
permita la administración del agente, tal como la administración
intradérmica o epidérmica. Típicamente, tal instrumento comprende
adhesivo, vendaje o una o más agujas. El instrumento puede permitir
el suministro del agente. El agente en el kit puede estar en forma
de una composición farmacéu-
tica.
tica.
El kit también puede comprender controles, tales
como controles positivo y negativo. El control positivo puede
permitir probar el sistema de detección. De esta manera, típicamente
el control positivo mimetiza el reconocimiento del agente en
cualquiera de los procedimientos anteriores. Típicamente, en los
kits diseñados para determinar el reconocimiento in vitro,
el control positivo es una citocina. En el kit diseñado para
detectar el reconocimiento del agente in vivo, el control
positivo puede ser un antígeno frente al que deberían responder la
mayoría de los individuos.
El kit también puede comprender un medio para
tomar una muestra que contiene células T a partir del hospedador,
tal como una muestra de sangre. El kit puede comprender un medio
para separar células mononucleares o células T a partir de una
muestra del hospedador.
La invención también proporciona un
polinucleótido que es capaz de una expresión que proporciona el
agente o proteínas gliadina mutantes. Típicamente, el
polinucleótido es AND o ARN y es de cadena sencilla o doble.
Preferiblemente, el polinucleótido comprenderá al menos 50 bases o
pares de bases, por ejemplo, de 50 a 100, de 100 a 500, de 500
a 1000 o de 1000 a 2000, o más bases o pares de bases. Por tanto,
el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia
de SEC ID Nº 1 ó 2, o cualquiera de los agentes mencionados en este
documento. En los extremos 5' y 3' de esta secuencia codificadora,
el polinucleótido de la invención tiene una secuencia o codones que
son diferentes de la secuencia o codones 5' y 3' de estas secuencias
en el correspondiente gen de gliadina.
Los extremos 5' y/o 3' de la secuencia del
polinucleótido que codifica el péptido, tienen una secuencia
codificadora o no codificadora. La secuencia 5' y/o 3' de la
secuencia codificadora puede comprender secuencias que ayudan a la
expresión, tales como transcripción y/o traducción, de la secuencia
que codifica el agente. El polinucleótido puede ser capaz de
expresar el agente de la célula procariótica o eucariótica. En una
realización, el polinucleótido es capaz de expresar el agente en
una célula de mamífero, tal como una célula de humano, primate o
roedor (por ejemplo, ratón o rata).
Un polinucleótido de la invención puede hibridar
selectivamente con un polinucleótido que codifica la SED ID Nº 3 a
un nivel significativamente por encima del fondo. Típicamente, la
hibridación selectiva se logra usando condiciones altamente
rigurosas del medio (por ejemplo, cloruro sódico 0,03 M y citrato
sódico 0,03 M desde aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC).
Sin embargo, esta hibridación puede realizarse en cualquier
condición adecuada conocida en la técnica (véase Sambrook y
col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Por
ejemplo, si se requiere alta rigurosidad, la condiciones adecuadas
incluyen SSC x 0,2 a 60ºC. Si se requiere menor rigurosidad, las
condiciones adecuadas incluyen SSC x 2 a 60ºC.
Los agentes o proteínas de la invención pueden
estar codificados por los polinucleótidos descritos en este
documento.
El polinucleótido puede formar parte o estar
incorporado en un vector capaz de replicarse. Este vector es capaz
de replicarse en una célula adecuada. El vector puede ser un vector
de expresión. En tal vector, el polinucleótido de la invención está
unido de forma operativa a una secuencia control que es capaz de
proporcionar la expresión del polinucleótido. El vector puede
contener un marcador seleccionable, tal como el gen de resistencia
a ampicilina.
El polinucleótido o el vector pueden estar
presentes en una célula. Esta célula puede haber sido transformada
con el polinucleótido o el vector. La célula puede expresar el
agente. Se elegirá la célula compatible con dicho vector y, por
ejemplo, puede ser una célula procariótica (bacteria), levadura,
insecto o de mamífero. El polinucleótido o el vector pueden
introducirse en células hospedadoras usando técnicas convencionales
incluyendo la precipitación con fosfato de calcio, la transfección
con DEAE-dextrano o la electroporación.
La invención proporciona procedimientos para la
producción de las proteínas de la invención por medios
recombinantes. Esto puede comprender (a) cultivar una célula
transformada como se define anteriormente en condiciones que
permitan la expresión de la proteína y, preferiblemente (b)
recuperar el polipéptido expresado. De forma opcional, el
polipéptido puede aislarse y/o purificarse por técnicas conocidas en
la materia.
La invención también proporciona TCR que
reconocen (o se unen) al agente, o fragmentos del mismo, que son
capaces de este reconocimiento (o unión). Estos puede estar
presentes en cualquier forma mencionada en este documento (por
ejemplo, pureza) descrita en este documento en relación con la
proteína de la invención. La invención también proporciona célula T
que expresan estos TCR que puede estar presentes en cualquier forma
(por ejemplo, pureza) descrito en este documento para las células de
la invención.
La invención también proporciona anticuerpos
monoclonales o policlonales que reconocen de forma específica a los
agentes (tales como cualquiera de los epítopes de la invención) y
que reconocen a las proteínas gliadina mutantes (y típicamente que
no reconocen a las gliadinas de tipo silvestre equivalentes) de la
invención y procedimientos para hacer estos anticuerpos. Los
anticuerpos de la invención se unen de forma específica a estas
sustancias de la invención.
Para los fines de esta invención, el término
"anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo tales como
fragmentos Fv, F(ab) y F(ab)_{2}, así como
anticuerpos de cadena única.
Un procedimiento para producir un anticuerpo
policlonal comprende inmunizar un animal hospedador adecuado, por
ejemplo un animal de experimentación, con el inmunógeno y aislar las
inmunoglobulinas a partir del suero. El animal puede, por tanto,
inocularse con el inmunógeno, posteriormente se recoge la sangre del
animal y se purifica la fracción IgG. Un procedimiento para
producir un anticuerpo monoclonal comprende inmortalizar las
células que producen el anticuerpo deseado. Las células del
hibridoma puede producirse fusionando células del bazo de un animal
experimental inoculado con células tumorales (Kohler y Milstein
(1975) Nature 256, 495-497).
Puede seleccionarse una célula inmoralizada que
produzca el anticuerpo deseado por un procedimiento convencional.
Los hibridomas pueden crecerse en cultivos o inyectarse por vía
intraperitoneal para la formación de líquido ascítico o en el
torrente sanguíneo de un hospedador alogénico u hospedador
inmunocomprometido. Pueden prepararse anticuerpos humanos por
inmunización in vitro de linfocitos humanos, seguido de la
transformación de los linfocitos con el virus de
Esptein-Barr.
Para la producción tanto de anticuerpos
monoclonales como policlonales, adecuadamente el animal de
experimentación es una cabra, conejo, rata o ratón. Si se desea,
puede administrarse el inmunógeno como un conjugado en el que el
inmunógeno se une, por ejemplo, mediante una cadena lateral de uno
de los restos de aminoácidos, a un vehículo adecuado. La molécula
transvehículoa típicamente es un vehículo fisiológicamente
aceptable. El anticuerpo obtenido puede aislarse y, si se desea,
purificarse.
El polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo
de la invención, puede llevarse a un nivel detectable. Se prefieren
niveles detectables que permitan la detección de la sustancia
secretada por inspección visual, de forma opcional con la ayuda de
un medio de amplificación óptica. Típicamente, este sistema está
basado en un marcador enzimático que causa cambio de color en un
sustrato, por ejemplo, fosfatasa alcalina que causa un cambio de
color en un sustrato. Estos sustratos están disponibles en el
mercado, por ejemplo, de BioRad. Otros marcadores adecuados
incluyen otras enzimas tales como peroxidasa o marcadores proteicos,
tales como biotina, o radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S.
Los marcadores anteriores puede detectarse usando técnicas
conocidas.
Los polinucleótidos, agentes, proteínas,
antibióticos o células de la invención pueden estar en forma
sustancialmente purificada. Pueden estar en forma sustancialmente
aislada, en cuyo caso generalmente comprenderán al menos el 80%,
por ejemplo, al menos el 90, 95, 97 ó 99% del polinucleótido,
péptido, anticuerpo, células o masa seca de la preparación.
Típicamente, el polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo está
sustancialmente libre de otros componentes celulares. El
polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo puede usarse en el
procedimiento en esta forma sustancialmente aislada, purificada o
libre o estar presente en el kit en estas formas.
La invención también proporciona un mamífero
transgénico que expresa un TCR de la invención. Este puede ser
cualquiera de los mamíferos descritos en este documento (por
ejemplo, en relación con la producción del anticuerpo).
Preferiblemente, el mamífero tiene, o es susceptible de padecer, la
enfermedad celiaca. El mamífero también puede expresar
HLA-DQ2 y/o puede dársele una dieta que comprende
una gliadina que cause la enfermedad celiaca (por ejemplo,
cualquiera de las proteínas gliadina mencionadas en este documento).
De este modo, el mamífero puede actuar como un modelo animal de
enfermedad celiaca.
La invención también proporciona un procedimiento
para identificar un producto que es terapéutico para la enfermedad
celiaca, que comprende administrar una sustancia candidata de la
invención a un mamífero que tiene, o que es susceptible de padecer,
la enfermedad celiaca y determinar si la sustancia previene o trata
la enfermedad celiaca en el mamífero, indicando la prevención o
tratamiento de la enfermedad celiaca que la sustancia es un
producto terapéutico. Este producto puede usarse para tratar o
prevenir la enfermedad celiaca.
La invención proporciona agentes terapéuticos
(incluyendo profilácticos) o sustancias diagnósticas (los agentes,
proteínas y polinucleótidos de la invención). Estas sustancias se
formulan para su administración clínica mezclándolas con un
vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo,
pueden formularse para la administración tópica, parenteral,
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, intradérmica,
epidérmica o transdérmica. Las sustancias pueden mezclarse con
cualquier vehículo que sea farmacéuticamente aceptable y apropiado
para la ruta de administración deseada. El vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable para inyección puede ser, por ejemplo,
una solución estéril o isotónica tal como agua para inyección o
solución salina fisiológica o una partícula transvehículoa para
suministro balístico.
La dosis de la sustancias puede ajustarse según
diversos parámetros, especialmente según el agente usado; la edad,
peso y estado del paciente que va a ser tratado; el modo de
administración usado; la gravedad de la afección que se va a tratar
y el régimen clínico requerido. Como orientación, la cantidad de
sustancia administrada mediante inyección es adecuadamente de 0,01
mg/kg a 30 mg/kg, preferiblemente de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg.
Las vías de administración y las dosificaciones
descritas sólo pretenden ser una orientación ya que un experto será
capaz de determinar fácilmente la vía óptima de administración y la
dosificación para cualquier paciente y afección en particular.
Las sustancias de la invención pueden, de este
modo, usarse en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o
animal, o en un procedimiento diagnóstico ejercido en el cuerpo
humano. En particular, pueden usarse en un procedimiento para
tratar o prevenir la enfermedad celiaca. La invención también
proporciona los agentes para su uso en un procedimiento de
fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad
celiaca.
El agente de la invención puede hacerse usando
técnicas químicas sintéticas convencionales, tales como mediante en
uso de un sintetizador automático. El agente puede hacerse a partir
de un polipéptido más largo, por ejemplo, una proteína de fusión,
cuyo polipéptido típicamente comprende la secuencia del péptido. El
péptido puede derivar del polipéptido mediante, por ejemplo,
hidrólisis del polipéptido, tal como usando una proteasa o mediante
rotura fisiológica del polipéptido. El polinucleótido de la
invención puede hacerse usando técnicas convencionales, tales como
usando un sintetizador.
La célula de la invención puede ser una célula
vegetal, tal como una célula de una especie de gramínea
monocotiledónea. La especie puede ser una cuya forma silvestre
exprese gliadinas, tales como cualquiera de las proteínas gliadina
mencionadas en este documento (incluyendo gliadinas con cualquier
grado de homología con la SEC ID Nº 3 mencionada en este
documento). Esta gliadina puede causar la enfermedad celiaca en
humanos. La célula puede ser de trigo, maíz, avena, centeno, arroz,
cebada, triticale, sorgo o caña de azúcar. Típicamente, la célula
es del género Triticum, tales como aestivum, spelta,
polonicum o monococcum.
Típicamente, la célula vegetal de la invención es
una que no expresa una gliadina de tipo silvestre (tales como
cualquiera de las gliadinas mencionadas en este documento que pueden
causar la enfermedad celiaca) o una que no expresa una gliadina que
comprende una secuencia que puede ser reconocida por una célula T
que reconoce al agente. De este modo, si la célula vegetal de tipo
silvestre expresaba esta gliadina, después puede ser manipulada
genéticamente para prevenir o reducir la expresión de esta gliadina
o cambiar la secuencia de aminoácidos de la gliadina de modo que ya
no cause la enfermedad celiaca (típicamente por no expresar ya el
epítope de la inven-
ción).
ción).
Esto puede hacerse, por ejemplo, introduciendo
mutaciones en 1, 2, 3 o más o en todos los genes de esta gliadina
en la célula, por ejemplo, codificadores o no codificadores (por
ejemplo, regiones promotoras). Estas mutaciones pueden ser de
cualquiera de los tipos o longitudes de mutaciones descritas en este
documento (por ejemplo, en relación con proteínas homólogas). Las
mutaciones pueden introducirse de forma dirigida (por ejemplo,
usando mutagénesis dirigida a sitio o técnicas de recombinación
homóloga) o de forma aleatoria (por ejemplo, usando un mutágeno y,
típicamente a continuación, seleccionando células mutagenizadas que
ya no expresan la gliadina (o una secuencia de gliadina que causa
la enfermedad celiaca).
En el caso de plantas o células vegetales que
expresan una proteína que comprende una secuencia capaz de actuar
como antagonista, esta planta o célula vegetal puede expresar una
proteína gliadina de tipo silvestre (por ejemplo, una que cause la
enfermedad celiaca). Preferiblemente, auque la presencia de la
secuencia antagonista causará la reducción de los síntomas de la
enfermedad celiaca (tal como sin síntomas) en un individuo que
ingiere un alimento que contiene la proteína de una planta o célula
vegetal.
El polinucleótido que está presente en la célula
vegetal (o que ha sido transformado en ésta), generalmente
comprenderá un promotor capaz de expresar la proteína gliadina
mutante en la célula vegetal. Dependiendo del patrón de expresión
deseada, el promotor puede ser constitutivo, específico de tejido o
fase y/o inducible. Por ejemplo, puede obtenerse una potente
expresión constitutiva en plantas con los promotores CAMV 35S,
Rubisco ssu o de histona. También, pueden usarse promotores
específicos de tejido o específicos de etapa para dirigir la
expresión de la proteína de la invención a un tejido en particular
de una planta transgénica o en una fase en particular de su
desarrollo. De este modo, por ejemplo pueden usarse promotores
específicos de semillas, específicas de raíces, específicas de
hojas, específicas de flores, etc. Los promotores específicos de
semillas incluyen aquellos descritos por Dalta y col.
(Biotechnology Ann. Rev. (1997), 3, pág. 269-296).
Ejemplos en particular de promotores específicos de semillas son
los promotores napin (documento
EP-A-0 255.378), promotores de
faseolina, promotores de glutenina, promotores de heliantenina
(documentos WO92/17580), promotores de albúmina (documento
WO98/45460), promotores de oleosina (documento WO98/45461) y
promotores de ATS1 y ATS3 (documento PCT/US98/06798).
La célula puede estar en cualquier forma. Por
ejemplo, puede ser una célula aislada, por ejemplo, un protoplasto,
o puede ser parte de un tejido vegetal, por ejemplo, un callo o un
tejido escindido de una planta o puede ser parte de una planta
completa. La célula puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, de
cualquier parte de la planta). Por ejemplo, una célula
indiferenciada, tal como una célula de un callo, o una célula
diferenciada, tal como una célula de un tipo encontrado en
embriones, polen, raíces, brotes u hojas. Las partes de la planta
incluyen raíces, brotes, hojas y las partes implicadas en la
reproducción, tales como polen, óvulo, anteras, pétalos, sépalos y
otras partes de la flor.
La invención proporciona un procedimiento para
obtener una célula vegetal transgénica que comprende la
transformación de una célula vegetal con un polinucleótido o vector
de la invención para obtener una célula vegetal transgénica. Puede
usarse cualquier procedimiento de transformación adecuado (en el
caso del trigo, pueden usarse las técnicas descritas en Vasil y
col., Biotechnology 10,667-674 (1992). Las
técnicas de transformación preferidas incluyen electroporación de
los protoplastos de la planta y bombardeo de partículas. De este
modo, la transformación pude dar lugar a un tejido o planta
quimérica en la que algunas células son transgénicas y otras
no.
La célula de la invención o la célula obtenida de
este modo puede regenerarse en una planta transgénica por técnicas
conocidas en la materia. Estas pueden implicar el uso de sustancias
para el crecimiento de plantas tales como auxinas, giberelinas y/o
citocinas para estimular el crecimiento y/o división de la célula
transgénica. De forma similar, puede usarse técnicas tales como
embriogénesis somática y cultivo de meristemos. Son bien conocidas
en la materia las técnicas de regeneración y puede encontrarse
ejemplos en, por ejemplo, los documentos US 4.459.355, US
4.536.475, US 5.464.763, US 5.177.010, US 5.187.073, EP 267.159, EP
604.662, EP 672.752, US 4.945.050, US 5.036.006, US 5.100.792, US
5.371.014, US 5.478.744, US 5.179.022, US 5.565.346, US 5.484.956,
US 5.508.468, US 5.538.877, US 5.554.798, US 5.489.520, US
5.510.318, US 5.204.253, US 5.405.765, EP 442.174, EP
486-233, EP 486-234, EP
539-563, EP 674-725, W0 91/02071 y
WO 95/06128.
En muchas de estas técnicas, una etapa es la
formación de un callo, es decir, un tejido vegetal que comprende
células en expansión y/o en división. Estos callos son un aspecto
adicional de la invención, como lo son otros tipos de cultivos de
células vegetales y de partes de plantas. De este modo, por ejemplo,
la invención proporciona tejidos y partes de plantas transgénicas,
incluyendo embriones, meristemos, semillas, brotes, raíces, tallos
y partes de la flor. Éstas pueden ser quiméricas en el sentido de
que algunas de sus células son células de la invención y algunas no
lo son. Las partes y tejidos de plantas transgénicas, plantas y
semillas de la invención pueden ser de cualquiera de las especies
vegetales mencionadas en este documento.
Típicamente, los procedimientos de regeneración
implicarán la selección de células transformadas por medio de genes
marcadores.
La etapa de regeneración origina una primera
generación de plantas transgénicas. La invención también
proporciona procedimientos para obtener plantas transgénicas de
generaciones sucesivas a partir de esta primera generación de
plantas. Éstas se conocen como progenie de plantas transgénicas.
Pueden obtenerse progenies de plantas de segunda, tercera, cuarta,
quinta, sexta y posteriores generaciones a partir de la primera
generación de plantas transgénicas mediante cualquier medio
conocido en la técnica.
De este modo, la invención proporciona un
procedimiento para obtener una progenie de planta transgénica que
comprende obtener una segunda generación de progenie de plantas
transgénicas, a partir de una primera generación de plantas
transgénicas de la invención y, opcionalmente, obtener plantas
transgénicas de una o más generaciones posteriores a partir de la
progenie de la planta de segunda generación obtenido de este
modo.
La progenie de plantas puede producirse a partir
de sus predecesores de generaciones anteriores mediante cualquier
técnica conocida. En particular, la progenie de plantas puede
producirse mediante:
la obtención de una semilla transgénica a partir
de una planta transgénica de la invención que pertenece a una
generación previa, la obtención, a continuación, de una progenie de
plantas transgénicas de la invención que pertenece a una nueva
generación, mediante el crecimiento de la semilla transgénica;
y/o
la propagación clonal de una planta transgénica
de la invención que pertenece a una generación previa para dar una
progenie de plantas transgénicas de la invención que pertenece a una
nueva generación; y/o
el cruzamiento de una primera generación de
plantas transgénicas de la invención que pertenece a una generación
previa con otra planta compatible para obtener una progenie de
plantas transgénicas de la invención que pertenece a una nueva
generación; y, opcionalmente,
la obtención de progenies de plantas transgénicas
de una o más generaciones posteriores a partir de la progenie de
plantas obtenidas de esta manera.
Estas técnicas pueden usarse en cualquier
combinación. Por ejemplo, la propagación clonal y la propagación
sexual puede usarse en diferentes puntos de un procedimiento que da
lugar a una planta transgénica adecuada para el cultivo. En
particular, puede emprenderse el retrocruzamiento repetitivo con un
taxón vegetal con características agronómicamente convenientes.
También pueden realizarse etapas adicionales de extracción de
células de una planta y de regeneración de nuevas plantas a partir
de éstas.
También puede introducirse características
adicionales convenientes mediante la transformación de las células,
tejidos vegetales, plantas o semillas, en cualquier etapa adecuada
en el procedimiento anterior, para introducir secuencias
codificadoras deseables distintas de los polinucleótidos de la
invención. Esto puede realizarse mediante las técnicas descritas en
este documento para la introducir de polinucleótidos de la
invención.
Por ejemplo, pueden seleccionarse transgenes
adicionales a partir de los que codifican otras características de
resistencia a herbicidas, por ejemplo, tolerancia a: Glifosato (por
ejemplo, usando un gen de sintetasa EPSP (por ejemplo, el documento
EP-A-0 293.358) o un gen de una
glifosato oxidorreductasa (documento WO 92/000377); o tolerancia a
fosametina; un dihalobenzonitrilo; glufosinato, por ejemplo, usando
un gen de una fosfinotricina acetil transferasa (PAT) o de
glutamina sintetasa (cf. documento
EP-A-0 242.236); asulam, por
ejemplo, usando un gen de una dihidropteroato sintetasa (documento
EP-A-0 369.367); o una sulfonilurea,
por ejemplo, usando un gen ALS; difenil ésteres tales como
acifluorfen u oxifluorfeno, por ejemplo usando un gen de una
protoporfireno oxidasa; un oxodiazol tal como oxodiazón, una imida
cíclica tal como cloroftalima; un fenil pirazol tal como TNP, o un
análogo de fenopilato o carbamato de los mismos.
De forma similar, se pueden introducir genes de
propiedades beneficiosas diferentes a la tolerancia a herbicida.
Por ejemplo, se pueden introducir genes de resistencia a insectos,
en particular genes que codifican toxinas de Bacillus
thuringiensis (Bt). Asimismo, se pueden introducir genes
de resistencia a enfermedades, por ejemplo, como en el documento
W091/02701 o W095/06128.
Típicamente, una proteína de la invención se
expresa en una planta de la invención. Dependiendo del promotor
usado, esta expresión puede ser constitutiva o inducible. De forma
similar, puede ser específica de tejido o de etapa, es decir,
dirigida hacia un tejido vegetal particular (como cualquiera de los
tejidos mencionados en este documento) o una etapa del desarrollo
de la planta.
La invención también proporciona procedimientos
de obtención de productos vegetales mediante recolección, y
opcionalmente, por procesamiento adicional, de plantas transgénicas
de la invención. Por producto vegetal se entiende cualquier
producto útil que se puede obtener de una planta en cultivo.
La invención proporciona un producto que
comprende las proteínas gliadinas mutantes o una proteína que
comprende una secuencia capaz de actuar como un antagonista.
Típicamente Este deriva de, o comprende, partes de la planta de
plantas mencionadas en este documento que expresan estas proteínas.
Este producto puede obtenerse directamente mediante recolección o
indirectamente, mediante recolección y procesamiento adicional de la
planta de la invención. Los productos que se pueden obtener
directamente incluyen granos. De forma alternativa, este producto
puede obtenerse indirectamente, mediante recolección y procesamiento
adicional. Ejemplos de productos que se pueden obtener mediante
procesamiento adicional son harina o bebidas alcohólicas destiladas;
productos alimenticios hechos a partir del material obtenido
directamente o procesado adicionalmente, por ejemplo, productos
horneados (por ejemplo, pan) hechos a partir de la harina.
Típicamente, estos productos alimenticios, pueden ser ingeridos y
digeridos (es decir, no tóxicos y de valor nutritivo) por individuos
humanos.
En el caso de los productos alimenticios que
comprenden la proteína que comprende una secuencia antagonista, el
producto alimenticio también puede comprender una gliadina de tipo
silvestre, pero preferiblemente el antagonista es capaz de causar
una reducción (por ejemplo, completamente) en los síntomas de la
enfermedad celiaca después de ingerir este alimento.
La invención se ilustra mediante los siguientes
ejemplos:
Ejemplo
1
Hemos realizado el mapeo de epítopes de la
enfermedad celiaca mediante el uso de un conjunto de 51 péptidos
sintéticos 15-mer que abarcan la secuencia completa
de una a-gliadina completamente caracterizada,
"A-gliadina" (véase la Tabla 1). Los péptidos
de A-gliadina se trataron también individualmente
con tTG para generar productos que podrían mimetizar esos productos
in vivo^{3}. También buscamos estudiar pacientes con
enfermedad celiaca en el momento del inicio de la recaída de la
enfermedad para evitar la posibilidad de que pueda producirse la
"extensión" o el "agotamiento" del epítope, como se
describe en enfermedades infecciosas y autoinmunes
experimentales.
En un estudio piloto, dos sujetos con enfermedad
celiaca en remisión, definida por la ausencia de anticuerpos
anti-endomisio en suero (EMA), o una dieta sin
gluten, se alimentaron diariamente con cuatro rebanadas de pan
blanco que contenía gluten convencional además de su dieta normal
sin gluten. El Sujeto 1 dejó el pan después de tres días debido a
dolor abdominal, úlceras en la boca y diarrea leve, pero el Sujeto 2
continuó durante 10 días con sólo nausea leve en una semana. Los
EMA se hicieron positivos en el Sujeto 2 una semana después de la
estimulación con pan, lo que indica que el pan usado había causado
una recaída de la enfermedad celiaca. Pero en el Sujeto 1, los EMA
se mantuvieron negativos hasta dos meses después de la estimulación
con pan. En ambos sujetos, los síntomas que aparecieron con la
estimulación con pan se resolvieron después de dos días de volver a
la dieta sin gluten.
No se encontraron respuestas de PBMC en ensayos
de ELISPOT para IFN\gamma frente a péptidos de
A-gliadina antes o durante la estimulación con pan.
Pero desde el día después de la retirada del pan (Día 4) en el
Sujeto 1 una única mezcla de 5 péptidos solapantes que abarcaban
A-gliadina 51-85 (Mezcla 3) tratado
con tTG mostró una potente respuesta de IFN\gamma (véase la
Figura 1a). En el Sujeto 1, la respuesta de IFN\gamma de PBMC
frente al péptido de A-gliadina se mantenía dirigida
sólo a la Mezcla 3 y era máximo el Día 8. Las dinámicas y la
magnitud de la respuesta frente a la Mezcla 3 eran similares a la
desencadenada por gliadina digerida con
\alpha-quimiotripsina. Las respuestas de
IFN\gamma de PBMC frente a la Mezcla 3 tratada con tTG eran
sistemáticamente de 5 a 12 veces mayores que frente a la Mezcla 3
sin trata con tTG, y las respuestas frente a una gliadina digerida
con \alpha-quimiotripsina era de 3 a 10 veces
mayor si se trataba con tTG. En el Sujeto 2, la Mezcla 3 tratada
con tTG fue también el único grupo inmunogénico de péptidos de
A-gliadina el Día 8, pero esta respuesta era más
débil que la del Sujeto 1, no se veía el Día 4 y el Día 11 la
respuesta frente a la Mezcla 3 había disminuido y otras mezclas
tratadas con tTG de péptidos A-gliadina
desencadenaba respuestas de IFN\alpha más fuertes (véase la
Figura 1b).
El estudio piloto indicaba que la respuesta de
células T inicial en estos sujetos con enfermedad celiaca se
producía frente a una única mezcla de cinco péptidos de
A-gliadina tratadas con tTG y se medía fácilmente
en sangre periférica. Pero si la exposición al antígeno se
continuaba durante diez días en lugar de tres, aparecen respuestas
de células T frente a otros péptidos de A-gliadina,
de acuerdo con la extensión del epítope.
En cinco de seis sujetos más con enfermedad
celiaca con dieta sin gluten (véase la Tabla 1), la estimulación
con pan durante tres días permitía identificar péptidos tratados con
tTG en la Mezcla 3, y en especial, los péptidos que correspondían
con 56-70 (12) y 60-75 (13) como los
únicos componentes de A-gliadina que desencadenaban
el IFN\gamma a partir de PBMC (véase la Figura 2). Los ensayos de
ELISPOT para IL-10 realizados en paralelo con el
ELISPOT para IFN\gamma no mostraron respuesta de
IL-10 frente a los péptidos 12 o 13 tratados con
tTG. En un sujeto, no había respuestas de IFN\gamma frente a
ningún péptido de A-gliadina o a la gliadina
digerida con \alpha-quimiotripsina antes, durante
o hasta cuatro días después de la estimulación con pan. En ninguno
de estos sujetos con enfermedad celiaca cambió el estado de los EMA
con respecto al valor basal cuando se midió durante dos meses
después de la estimulación con pan.
Los PBMC de cuatro sujetos sanos negativos para
EMA con los alelos HLA-DQ \alpha1*0501,
\beta1*0201 (2 mujeres de 28 y 52 años) que habían sido
estimulados durante tres días con pan después de seguir una dieta
sin gluten durante un mes, no mostraron respuestas de IFN\gamma
por encima del control negativo frente a ninguno de los péptidos
A-gliadina con o sin tratamiento con tTG. De este
modo, la inducción de IFN\gamma en PBMC frente a la Mezcla 3
tratada con tTG y a los péptidos de A-gliadina
56-70 (12) y 60-75 (13) era
específica de la enfermedad celiaca (7/8 vs 0/4, p<0,01 mediante
análisis de Chi-cuadrado).
Los péptidos tratados con tTG que representan
truncamientos de A-gliadina 56-75
revelaron que la misma secuencia peptídica central ( QPQLP) era
esencial para la antigenicidad en los cinco sujetos con enfermedad
celiaca valorados (véase la Figura 3). Las respuestas de IFN\gamma
de PBMC frente a péptidos tratados con tTG que abarcan esta
secuencia central que comienza con el 7-mer PQPQLPY
y que aumenta en longitud, indicaba que el 17-mer
tratado con tTG, QLQPFPQPQLPYPQPQS (A-gliadina
57-73) poseía actividad óptima en el ELISPOT para
IFN\gamma (véase la Figura 4).
El análisis por HPLC demostró que el tratamiento
de la A-gliadina 56-75 con tTG
generaba un único producto que eluía ligeramente más tarde que el
péptido parental. La secuenciación de aminoácidos indicaba que de
entre los seis restos de glutamina (Q) que contenían la
A-gliadina 56-75, la Q65 se
desanidada preferentemente con tTG (véase la Figura 5). La
bioactividad de los péptidos que corresponden a expansiones seriadas
de la secuencia central de A-gliadina
62-68 en la que el glutamato (E) se sustituía por
Q65, era equivalente a los mismos péptidos con Q65 después del
tratamiento con tGT (véase la Figura 4a). La sustitución conjunta o
única de Q57 y Q72 por E, junto con E65 no potenciaba la
antigenicidad del 17-mer en los tres sujetos con
enfermedad celiaca estudiados (véase la Figura 6). Se investigaron
Q57 y Q72 porque los restos de glutamina seguidos de prolina en los
péptidos de gliadina no se desaminan con tTG in vitro (W.
Vader y col, Actas del 8º Simposio Internacional de
Enfermedad Celiaca). Por tanto, el epítope inmunodominante de
células T se definió como QLQPFPQPELPYPQPQS.
En dos sujetos con enfermedad celiaca homocigotos
para HLA-DQ \alpha1*0501, \beta1*0201, el
anticuerpo monoclonal anti-DQ bloqueaba la
respuesta de INF\gamma en ELISPOT frente a
A-gliadina 56-75 tratado con tTG,
pero no los anticuerpos anti-DP y
anti-DR (véase la Figura 7). La depleción de PBMC
con perlas magnéticas anti-CD4 y
anti-CD8 de dos sujetos con enfermedad celiaca
indicaba que la respuesta de IFN\gamma a
A-gliadina 56-75 tratado con tTG
está mediada por células T CD4.
En este estudio describimos una estimulación con
un antígeno alimenticio muy simple usando pan blanco convencional
para desencadenar una población transitoria de células T CD4 en la
sangre periférica de sujetos con enfermedad celiaca sensibles a un
A-gliadina 17-mer tratado con tTG
con la secuencia: QLQPFPQPELPYPQPQS (restos 57-73).
La respuesta inmune a A-gliadina
56-75 (Q-E65) está restringida al
alelo de HLA asociado con la enfermedad celiaca, DQ \alpha1*0501,
\beta1*0201. La actividad transglutaminasa tisular in vitro
desamida selectivamente Q65. Las respuestas de IFN\gamma en
sangre periférica desencadenadas frente a los péptidos sintéticos
de A-gliadina con la sustitución
Q-E65, son equivalentes a la de los péptidos Q65 de
A-gliadina tratados con tTG; ambos estimulan hasta
10 veces más las células T en el ELISPOT para IFN\gamma que los
péptidos QE65 de A-gliadina.
Hemos definido deliberadamente este epítope de
células T específico de la enfermedad celiaca usando la
estimulación antigénica in vivo y ensayos inmunes ex
vivo a corto plazo para evitar la posibilidad de artefactos
metodológicos que se puedan producir con el uso de clones de células
T en el mapeo del epítope. Nuestros hallazgos indican que las
respuestas de células T de sangre periférica frente a la ingestión
de gluten son rápidas pero de vida corta y pueden utilizarse para
el mapeo del epítope. La estimulación antigénica in vivo ha
demostrado también que hay una jerarquía temporal de respuestas
inmunes frente a péptidos de A-gliadina;
A-gliadina 57-73 modificada por tTG
no sólo desencadena la respuesta de IFN\gamma más fuerte en PBMC,
sino que también es la primera respuesta de IFN\gamma en
aparecer.
Puesto que hemos ensayado solo péptidos que
abarcan a la A-gliadina, puede haber otros epítopes
en otras gliadinas de igual o mayor importancia en la patogénesis
de la enfermedad celiaca. De hecho, la secuencia peptídica en el
núcleo del epítope en la A-gliadina que hemos
identificado (PQPQLPY) es compartida por otras gliadinas diversas
(números de acceso de SwissProt y Trembl: P02863, Q41528, Q41531,
Q41533, Q9ZP09, P04722, P04724, PI8573). Sin embargo, los péptidos
de A-gliadina que previamente han demostrado poseer
bioactividad en estimulación de biopsia y en estudios in
vivo (por ejemplo: 31-43, 44-55
y 206-217)^{4,5} no desencadenaban
respuestas de IFN\gamma en PBMC después de los tres días de
estimulación con pan en sujetos con enfermedad celiaca. Estos
péptidos pueden ser epítopes "secundarios" de células T que
aparecen con la extensión de la respuesta inmune.
Ejemplo
2
El efecto de sustituir el glutamato de la
posición 65 en el epítope de A-gliadina
57-73 se determinó midiendo las respuestas en
sangre periférica frente a los epítopes sustituidos en un ensayo de
ELISPOT para IFN\gamma usando péptidos sintéticos (a 50 pg/ml).
Las respuestas se midieron en 3 sujetos con enfermedad celiaca 6
días después de comenzar la estimulación con gluten (4 rebanadas de
pan diarias durante 3 días). Los resultados se muestran en la Tabla
3 y en la Figura 8. Como puede verse, la sustitución del glutamato
por histidina, tirosina, triptófano, lisina, prolina o arginina
estimulaba una respuesta cuya magnitud era de menos del 10% de la
magnitud de la respuesta al epítope inmunodominante. De este modo,
podría usarse la mutación de A-gliadina en esta
posición para producir una gliadina mutante con inmunoreactividad
reducida o ausente.
Ejemplo
3
La inmunoreactividad de otros péptidos
equivalentes de otras gliadinas de trigo que aparecen de forma
natural se valoró usando péptidos sintéticos que corresponden a las
secuencias naturales que, a continuación, se trataban con
transglutaminasa. Estos péptidos se ensayaron en un ELISPOT de la
misma manera y con PBMC de los mismos sujetos, como se describe en
el Ejemplo 2. Al menos cinco de los péptidos mostraron
inmunoreactividad comparable al péptido de
A-gliadina 57-73 E65 (tras el
tratamiento con transglutaminasa) lo que indicaba que otras
proteínas gliadinas en el trigo es probable también que induzcan
esta respuesta inmune específica de la enfermedad celiaca (Tabla 4
y Figura 9).
Sujetos: Los pacientes usados en el
estudio acudían a la Clínica Celiaca en Oxford, Reino Unido. La
enfermedad celiaca se diagnosticó en función de la histología
típica del intestino delgado y a la normalización de síntomas e
histología del intestino delgado con dieta sin gluten.
Tipaje tisular: El tipaje tisular se
realizó usando ADN extraído de sangre periférica con EDTA como
anticoagulante. El genotipaje de HLA-DQA y DQB se
realizó mediante PCR usando mezclas de cebadores específicos de
secuencia^{6-8}.
Ensayo de anticuerpos antiendomisio: Los
EMA se detectaron mediante inmunofluorescencia indirecta usando
suero de pacientes diluido 1: 5 con esófago de mono, seguido de IgA
de cabra anti-humano conjugado con FITC. Se
cuantificó la IgA antes que los EMA, y ninguno de los sujetos era
deficiente en IgA.
Estimulación antigénica: Los sujetos con
enfermedad celiaca que siguieron una dieta sin gluten, consumieron
4 rebanadas de pan que contenía gluten (50 g/rebanada, "pan blanco
de sándwich convencional" de Sainsbury) diariamente durante 3 ó
10 días. Los EMA se valoraron la semana antes y hasta dos meses
después de comenzar la estimulación con pan. Los sujetos sanos que
habían seguido una dieta sin gluten durante cuatro semanas,
consumieron su dieta habitual que incluía cuatro rebanadas de pan
con gluten durante tres días, y luego volvieron a la dieta sin
gluten durante seis días más.
ELISPOT para IFN\gamma e
IL-10: Se prepararon PBMC a partir de
50-100 ml de sangre venosa mediante centrifugación
en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. Después
de tres lavados, las PBMC se resuspendieron en RPMI completo que
contenía un 10% de suero AB humano inactivado mediante
calentamiento. Los ensayos de ELISPOT para la secreción de
IFN\gamma e IL-10 de una única célula se
realizaron usando kits comerciales (Mabtech, Estocolmo, Suecia) con
placas de 96 pocillos (MAIP-S-45;
Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante (como
se describe previamente^{9}) con 2-5 x 10^{5}
(IFN\gamma) o 0,4-1 x 10^{5}
(IL-10) PBMC en cada pocillo. Los péptidos se
valoraron en pocillos por duplicado y se incluyó en todos los
ensayos un derivado de una proteína purificada de Mycobacterium
tuberculosis (PPD RT49) (Serum Institute; Copenhague, Dinamarca) (20
pg/ml) como control positivo.
Péptidos: Los péptidos sintéticos se
adquirieron en el Research Genetics (Huntsville, Alabama),
verificándose la autenticidad de los péptidos por espectroscopia de
masa y HPLC y con >70% de pureza. La digestión de gliadina
(Sigma; G-3375) (100 mg/ml) con
\alpha-quimiotripsina (Sigma;
C-3142) 200: 1 (p/p) se realizó a temperatura
ambiente en NH_{4}HCO_{3} 0,1 M con urea 2 M y se paró después
de 24 h por calentamiento a 98ºC durante 10 minutos. Tras la
centrifugación (13.000g, 10 minutos), el sobrenadante de la
digestión de la gliadina se esterilizó por filtración (0,2 \mum).
La digestión de la gliadina se verificó por SDS-PAGE
y se valoró la concentración de proteína. La gliadina digerida con
\alpha-quimiotripsina (640 \mug/ml) y los
péptidos de gliadina sintéticos (15-mer: 160
\mug/ml, otros péptidos: 0,1 mM) se trataron individualmente con
tTG (Sigma; T-5398) (50 \mug/ml) en PBS+CaCl_{2}
1 mM durante 2 h a 37ºC. Los péptidos y las mezclas de péptidos se
alicuotaron en placas de 96 pocillos estériles y se almacenaron
congelados a -20ºC hasta su uso.
Secuenciación de aminoácidos de los
péptidos: Se usó HPLC en fase inversa para purificar el péptido
resultante del tratamiento de la A-gliadina
56-75 con tTG. Se identificó un único producto y se
sometió a secuenciación de aminoácidos (secuenciador automático
Modelo 494A, Applied Biosystems, Foster City, California). Se
confirmó que la secuencia de G56-75 sin modificar
era: LQLQPFPQPQLPYPQPQSFP, y G56-75 tratado con tTG
se identificó como: LQLQPFPQPELPYPQPQSFP. La desamidación de restos
glutamilo se identificó como la cantidad (pmoles) de glutamato
recuperado, expresado como porcentaje de la cantidad combinada de
glutamina y glutamato recuperado en los ciclos 2, 4, 8, 10, 15 y 17
de la secuenciación de aminoácidos. La desamidación atribuible a tTG
se definió como (% de desamidación de glutamina en el péptido
tratado con tTG - % de desamidación en el péptido sin tratar)/(100
- % de desamidación en el péptido sin tratar).
CD4/CD8 y restricción a HLA de clase II:
Después de la incubación con PBMC en RPMI completo con suero humano
al 10%, inactivado mediante calentamiento (5 x 10^{6} células/ml)
durante 30 minutos en hielo, las perlas magnéticas recubiertas con
anti-CD4 o anti-CD8 (Dynal, Oslo,
Noruega) se lavaron cuatro veces con RPMI. Las perlas se retiraron
usando un imán y se contaron las células restantes. La restricción a
HLA de clase II in vivo de la respuesta inmune frente a
A-gliadina 56-75 tratada con tTG se
estableció incubando PBMC (5 x 10^{6} células/ml) con anticuerpos
monoclonales anti-HLA-DR (L243),
anti-DQ (L2) y anti–DP (B7.21) (10 \mug/ml) a
temperatura ambiente durante una hora antes de la adición del
péptido.
Ejemplo
4
Las interacciones entre adresinas de endotelio y
de linfocitos facilitan el alojamiento de linfocitos específicos de
órgano. Se conocen muchas adresinas. El heterodímero
\alpha_{4}\beta_{7} es específico de la lámina propia del
intestino y de otros linfocitos de mucosa y el
\alpha^{E}\beta_{7} es específico de linfocitos
intraepiteliales en intestino y piel. Aproximadamente el 30% de las
células T CD4 de sangre periférica expresan
\alpha_{4}\beta_{7} y se supone que están en tránsito a un
sitio de la mucosa, mientras que el 5% de las células T de sangre
periférica expresan \alpha^{E}\beta_{7}. Las perlas
inmunomagnéticas recubiertas con anticuerpo específico para
\alpha^{E} o \beta_{7}, depleciona las PBMC de células que
expresan \alpha^{E}\beta_{7} o \alpha^{E}\beta_{7} y
\alpha_{4}\beta_{7}, respectivamente. En combinación con el
ensayo de ELISPOT, la depleción con perlas inmunomagnéticas permite
la determinación de la expresión de adresinas en células T
específicas de gliadina, que pueden identificar a estas células
como alojadas en una superficie mucosa. De manera interesante, la
estimulación con gluten in vivo se asocia con un rápido
influjo de células T CD4 a la lámina propia del intestino delgado
(no a sitios intraepiteliales), donde aproximadamente el 90% de los
linfocitos expresan \alpha_{4}\beta_{7}.
Se prepararon las perlas inmunomagnéticas y se
usaron para deplecionar los PBMC de sujetos celiacos el día 6 ó 7
después de comenzar los 3 días de estimulación con gluten. El
análisis por FACS demostró que las perlas \alpha^{E}
deplecionaban aproximadamente el 50% de las células T CD4 positivas,
mientras que las perlas \beta_{7} deplecionaban todas las
células T CD4 \beta_{7} positivas. La depleción de PBMC usando
perlas CD4 o \beta_{7}, pero no perlas CD8 o \alpha^{E},
suprimía las respuestas en el ELISPOT para interferón gamma. Las
respuestas frente a gliadina tTG y a PPD se suprimían mediante la
depleción de CD4, pero estaba afectada sistemáticamente por la
depleción con perlas específicas de integrinas.
De este modo, las células T específicas de
A-gliadina 57-73 QE65 inducidas tras
la estimulación con gluten en la enfermedad celiaca expresan la
integrina \alpha_{4}\beta_{7}, presente en las células T CD4
de la lámina propia en el intestino delgado.
Ejemplo
5
Datos anteriores que analizan péptidos de 7 a 17
aminoácidos de longitud que abarcan el núcleo del epítope de
células T dominante en la A-gliadina, indican que el
17-mer, A-gliadina
57-73 QE65 inducía las respuestas máximas en el
ELISPOT para interferón gamma usando células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) de voluntarios celiacos a los 6 días después de
comenzar una estimulación de 3 días con gluten.
Los péptidos que representan formas de expansión
de la secuencia central del epítope de células T dominante en la
A-gliadina se valoraron en ELISPOT para IFN gamma
usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de
voluntarios celiacos a los 6 días después de comenzar una
estimulación de 3 días con gluten (n=4). Péptido 13:
A-gliadina 59-71
QE65(13-mer), péptido 15:
58-72 QE65(15-mer),...,
péptido 27: 52-78 QE65 (27-mer).
Como se muestra en la Figura 11, la expansión de
la secuencia del A-gliadina 57-73
QE65 no potencia sustancialmente la respuesta en el ELISPOT para
IFN gamma. Los posteriores ejemplos caracterizan la actividad
agonista y antagonista del A-gliadina
57-73 QE65 usando péptidos
17-mer.
Ejemplo
6
Se realizaron estudios de
dosis-respuesta usando péptidos que correspondían a
los péptidos sin modificar y tratados con transglutaminasa que
corresponden a los epítopes de células T de clones de células T
específicos de gluten y líneas de biopsias intestinales de sujetos
celiacos. Las respuestas a los péptidos se expresaron como
porcentaje de respuesta a A-gliadina
57-73 QE65. Todos los sujetos eran
HLA-DQ2+ (ninguno era DQ8+).
Los estudios indican que
A-gliadina 57-73 QE65 es el péptido
de gliadina más potente en la inducción de interferón gamma en el
ensayo de ELISPOT usando PBMC de celiaco después de la estimulación
con gluten (véanse las Figuras 12a-h y las Tablas 5
y 6). Los epítopes segundo y tercero son fragmentos subóptimos de
péptidos más largos, es decir, A-gliadina
57-73 QE65 y GDA4_TRIGO
P04724-84-100 QE92. El epítope es
sólo modestamente bioactivo (aproximadamente 1/20 de la actividad
de A-gliadina 57-73 QE65 después de
sustraer el blanco).
A-gliadina 57-73
QE65 es más potente que otros epítopes de células T conocidos en la
enfermedad celiaca. Hay 16 polimorfismos de
A-gliadina 57-73 (incluyendo la
secuencia PQLPY) entre los genes de gliadina secuenciados, su
bioactividad se valora a continuación.
Ejemplo
7
La contribución relativa del epítope dominante,
A-gliadina 57-73 QE65, a la
respuesta de células T total frente a gliadina en la enfermedad
celiaca es una cuestión crítica. La gliadina digerida con
pepsina-tripsina y con quimiotripsina se ha usado
tradicionalmente como antígeno para el desarrollo de líneas y clones
de células T en la enfermedad celiaca. Sin embargo, es posible que
estas proteasas puedan escindir a través de ciertos epítopes del
péptido. De hecho, la digestión de la
\alpha9-gliadina recombinante con quimiotripsina
genera el péptido QLQPFPQPELPY, que es un truncamiento de la
secuencia óptima del epítope QLQPFPQPELPYPQPQS (véase
anteriormente). El tratamiento con transglutaminasa aumenta
sustancialmente la potencia de la gliadina digerida con
quimiotripsina en ensayos de proliferación de clones y líneas de
células T específicos de gliadina. Por lo tanto, la gliadina
digerida con quimiotripsina y tratada con transglutaminasa (gliadina
tTG) puede no ser un antígeno ideal, pero las respuestas contra
esta mezcla pueden aproximarse al número "total" de linfocitos
de sangre periférica específicos de gliadina. La comparación de las
respuestas frente a A-gliadina 57-73
QE65 y a gliadina tTG en el ensayo de ELISPOT da una indicación de
la contribución de este epítope dominante a la respuesta inmune
total a gliadina en la enfermedad celiaca y también es una medida de
la expansión del epítope.
Se valoraron las PBMC recogidas los días 6 ó 7
después de comenzar la estimulación con gluten en 4 sujetos
celiacos en estudios de dosis-respuesta usando
gliadina digerida con quimiotripsina +/- tratamiento con tTG y
comparado con las respuestas en ELISPOT a una concentración
subóptima de A-gliadina 57-73 QE65
(25 \mug/ml). El tratamiento con tTG de gliadina potenciaba las
respuestas de PBMC en el ELISPOT aproximadamente 10 veces (tTG era
comparable al blanco cuando se valoraba por separado) (véanse las
Figuras 13a-c). En los cuatro sujetos con
enfermedad celiaca estudiados, el A-gliadina
57-73 QE65 (25 \mug/ml) desencadenaba respuestas
entre el 14 y el 115% de las de la gliadina tTG (500 \mug/ml) y
cuanto mayor era la respuesta a A-gliadina
57-73 QE65, mayor era la proporción que
representaba de la respuesta a gliadina tTG.
Datos relativamente limitados sugieren que en
algunos sujetos, las respuestas a A-gliadina
57-73 QE65 son comparables a las de gliadina tTG .
La extensión del epítope asociada con respuesta de células T
anti-gliadina más desarrollada puede ser
responsable de la contribución más pequeña de
A-gliadina 57-73 QE65 a la respuesta
"total" a gliadina en la sangre periférica de algunos
individuos. La extensión del epítope se puede mantener en
individuos con dietas sin gluten menos estrictas.
Ejemplo
8
Se valoraron los péptidos 15-mer
solapantes que abarcan la secuencia completa de la
A-gliadina para identificar la secuencia
inmunodominante en la enfermedad celiaca. La
A-gliadina fue la primera proteína y gen de alfa
gliadinas que se secuenció por completo, pero es una de las
aproximadamente 30-50 proteínas relacionadas con
alfa gliadina en el trigo. Se han identificado 25 genes de
alfa-gliadina distintos buscando en las bases de
datos de proteínas, describiéndose en Swiss-Prot y
TREMBL 8 alfa-gliadinas más. Dentro de estas 25
alfa-gliadinas, hay 16 polimorfismos distintos de
la secuencia correspondiente a A-gliadina
57-73 (véase la Tabla 7).
Se valoraron los péptidos sintéticos que
correspondían con estos 16 polimorfismos, en forma no modificada,
después del tratamiento con transglutaminasa in vitro, así
como con una sustitución de glutamato en la posición 10
(equivalente a QE65 en A-gliadina
57-73) usando PBMC de sujetos celiacos, normalmente
después de una dieta sin gluten, los días 6 ó 7 después de la
estimulación con gluten en ensayos de ELISPOT para interferón gamma.
Los péptidos sustituidos con glutamato se compararon a tres
concentraciones (2,5, 25 y 250 \mug/ml), los péptidos sin
modificar y los péptidos tratados con transglutaminasa se valoraron
únicamente a 25 \mug/ml. La bioactividad se expresó como % de
respuesta asociada con 25 \mug/ml de A-gliadina
57-73 QE65 en sujetos independientes (n=4) (véase
la Figura 14).
La bioactividad de los péptidos de "tipo
silvestre" aumentaba sustancialmente (>5 veces) por el
tratamiento con transglutaminasa. El tratamiento con
transglutaminasa de péptidos de tipo silvestre tenía como resultado
una bioactividad similar a la de los mismos péptidos sustituidos con
glutamato en la posición 10. La bioactividad de cinco péptidos
sustituidos con glutamato (B, C, K, L, M), era >70% la de
A-gliadina 57-73 QE65 (A), pero
ninguno era significativamente más bioactivo que
A-gliadina 57-73 QE65. Las
respuestas de PBMC a péptidos sustituidos con glutamato a
concentraciones de 2, 5 y 250 \mug/ml eran comparables a las de 25
\mug/ml. Seis péptidos de gliadina sustituidos con glutamato (H,
I, J, N, O, P) tenían <15% de la actividad de la
A-gliadina 57-73 QE65. Otros
péptidos tenían una bioactividad intermedia.
Al menos seis péptidos derivados de gliadina
tienen una potencia equivalente a A-gliadina
57-73 QE65 después de la modificación por
transglutaminasa. También existen polimorfismos de
A-gliadina 57-73 relativamente no
bioactivos. Estos datos indican que la modificación por
transglutaminasa de los péptidos de varias gliadinas de Tricetum
aestivum, T. uartu y T spelta puede ser capaz de generar
el epítope de células T inmunodominante en la enfermedad
celiaca.
La modificación genética del trigo para generar
trigo no tóxico para celiacos es probable que requiera la
eliminación o modificación de múltiples genes de gliadina. La
generación de trigo que contiene gliadinas u otras proteínas o
péptidos que incorporan secuencias que definen antagonistas de
ligandos peptídicos alteradas de A-gliadina
57-73 es una estrategia alternativa para generar
trigo modificado genéticamente que es terapéutico en vez de "no
tóxico" en la enfermedad celiaca.
Ejemplo
9
La comparación de los péptidos correspondientes
con los truncamientos de A-gliadina
56-75 a partir de los extremos N y C terminales,
indicaban que la secuencia central del epítope de células T es PELPY
(A-gliadina 64-68). Los intentos
para definir no agonistas y antagonistas se centrarán en variantes
de A-gliadina que eran sustituidas en restos que
contribuyen sustancialmente a su bioactividad.
Los péptidos que corresponden a
A-gliadina 57-73 QE65 con alanina
(Figura 15) o con lisina (Figura 16) sustituidos en los restos 57 a
73 se compararon en el ELISPOT para IFN gamma usando células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios celiacos 6
días después de comenzar la estimulación de 3 días con gluten
(n=8). [BL es blanco, E es A-gliadina
57-73 QE65: QLQPFPQPELPYPQPQS].
Se ha encontrado que los restos que corresponden
a A-gliadina 60-70 QE65
(PFPQPELPYPQ) contribuyen sustancialmente a la bioactividad de
A-gliadina 57-73 QE65. Se valoraron
las variantes de A-gliadina 57-73
QE65 sustituido en las posiciones 60-70 en un
procedimiento en dos etapas. Inicialmente, se valoró
A-gliadina 57-73 QE65 sustituida en
las posiciones 60-70 usando 10 diferentes
aminoácidos con propiedades opuestas. Un segundo grupo de variantes
de A-gliadina 57-73 QE65
(sustituidas con todos los demás aminoácidos naturales, excepto
cisteína, en las posiciones que mostraron ser sensibles a
modificación) se valoraron en una segunda vuelta.
Ejemplo
10
A-gliadina 60-70
QE65 es la secuencia central del epítope de células T dominante en
la A-gliadina. Las variantes de péptidos
antagonistas y no agonistas de este epítope se generan más
probablemente por modificación de esta secuencia central.
Inicialmente, A-gliadina 57-73 QE65
sustituido en las posiciones 60-70 usando 10
aminoácidos diferentes con propiedades opuestas será valorado en el
ELISPOT para IFN gamma usando PBMC de sujetos celiacos 6 días
después de comenzar la estimulación de 3 días con gluten. También se
valoró un segundo grupo de variantes de A-gliadina
57-73 QE65 (sustituidas con todos los demás
aminoácidos naturales, excepto cisteína) en las posiciones
61-70 Ambos grupos de péptidos (todos a 50
\mug/ml, por duplicado) se valoraron usando PBMC de 8 sujetos y
se compararon con el péptido sin modificar (20 replicados por
ensayo). Estudios anteriores indican que la concentración óptima
para A-gliadina 57-73 QE65 en este
ensayo está entre 10 y 100 \mug/ml.
Los resultados se expresan como la respuesta
media en las células formadoras de manchas (95% de intervalo de
confianza) como el % de la respuesta media de A-G
57-73 QE65 en cada individuo. Se usó la prueba t no
apareada para comparar las respuestas en ELISPOT de los péptidos
modificados con la de A-G 57-73
QE65. Se definieron los superagonistas como los que tenían una
respuesta mayor que la de A-G 57-73
QE65 a un nivel de significancia de p<0,01; agonistas parciales
como los que tenían una respuesta inferior a la de
A-G 57-73 QE65 a un nivel de
significancia de p<0,01 y no agonistas como los que no eran
significativamente diferentes (p>0,01) del blanco (tampón sin
péptido). Los péptidos con una actividad agonista del 30% o menos
que la de A-gliadina 57-73 QE65 se
consideraron parcialmente "adecuados" o no agonistas para
valorar su actividad antagonista (véase la Tabla 8 y las Figuras
17-27).
La respuesta en ELISPOT para IFN gamma de PBMC
frente a A-gliadina 57-73 QE65 es
muy específica a un nivel molecular. La prolina en la posición 64
(P64), glutamato en posición 65 (E65) y leucina en posición 66
(L66), y en un menor grado, Q63, P67, Y68 y P69 son especialmente
sensibles a modificación. Las sustituciones de Y61 e Y70 generan
ambas superagonistas con el 30% más de bioactividad que el péptido
parental, probablemente por que potencia la unión a
HLA-DQ2, ya que el motivo para esta molécula de HLA
indica una preferencia por restos hidrófobos voluminosos en las
posiciones 1 y 9. Se identificaron 18 péptidos no agonistas. Las
bioactividades de las variantes (50 \mug/ml): P65, K64, K65 e Y65
(bioactividad 7-8%) eran comparables al blanco (7%).
En total, 57 variantes mutadas de A-gliadina
57-73 QE65 era el 30% o menos bioactivas que
A-gliadina 57-73 QE65.
La especificidad molecular de la respuesta de
células T de linfocitos de sangre periférica (PBL) frente al
epítope dominante, A-gliadina 57-73
QE65, es sistemáticamente reproducible entre los sujetos celiacos
HLA-DQ2+, y es muy específica para un número
restringido de aminoácidos en los 7 aminoácidos centrales. Ciertas
variantes de un único aminoácido de A-gliadina
57-73 QE65 son sistemáticamente no agonistas en
todos los sujetos celiacos HLA-DQ2+.
Ejemplo
11
La homogeneicidad de la respuesta de células T de
PBL a A-gliadina 57-73 QE65 en la
enfermedad celiaca HLA-DQ2+ sugiere que pueden
existir ligandos peptídicos alterados (LPA) con capacidad
antagonista en PBMC ex vivo, incluso aunque la respuesta de
células T de PBL es probable que sea poli u oligoclonal.
Generalmente, Los antagonistas LPA son agonistas débiles. Se han
identificado 57 variantes sustituidas en un único aminoácido de
A-gliadina 57-73 QE65 con actividad
agonista del 30% o menos y son candidatos adecuados como
antagonistas LPA. Además, se han identificado ciertos polimorfismos
naturales de A-gliadina 57-73 QE65
desde el punto de vista de la bioactividad más débiles (véase más
abajo) que pueden ser antagonistas LPA "naturales". También se
ha sugerido que la competición por unirse a MHC puede antagonizar
también con las células T inmunes específicas de antígeno. Por lo
tanto, los péptidos no gliadina que no inducen respuesta de IFN
gamma en PBMC de celiacos tras la estimulación con gluten, pero que
se sabe que unen HLA-DQ2, pueden ser capaces de
reducir respuestas de células T desencadenadas por
A-gliadina 57-73 QE65. Dos péptidos
que se unen ávidamente a HLA-DQ2 son HLA de clase 1
\alpha 46-60 (HLA 1a) (PRAPWIEQEGPEYW) y
peroxidasa tiroidea (tp) 632-645Y
(IDVWLGGLLAENFLPY).
Se añadió simultáneamente péptido (50 \mug/ml)
o tampón, y A-gliadina 57-73 QE65
(10 \mug/ml) en ELISPOT para IFN gamma usando PBMC de voluntarios
celiacos 6 días después de comenzar la estimulación de 3 días con
gluten (n=5). Los resultados se expresaron como la respuesta con
péptido más A-G 57-73 QE65 (media
de duplicados) como el % de la respuesta con tampón más
A-G 57-73 QE65 (media de 20
replicados) (véase la Tabla 9).
Cuatro variantes de A-gliadina
57-73 QE65 sustituidas en un único aminoácido
reducen la respuesta en ELISPOT para interferón gamma de PBMC
frente a A-gliadina 57-73 QE65
(p<0,01) entre el 25% y el 28%, otras 13 variantes de péptidos
reducen la respuesta en ELISPOT entre el 18% y el 24% (p<0, 06).
La peroxidasa tiroidea (tp) 632-645Y, que se une a
HLA-DQ2, reduce las respuestas de interferón gamma
de PBMC frente a A-gliadina 57-73
QE65 el 31% (p<0,0001), pero el otro ligante de
HLA-DQ2, HLA de clase 1 \alpha
46-60, no altera la respuesta (véase la Tabla 9).
El péptido correspondiente al polimorfismo modificado por
transglutaminasa de A-gliadina
57-73, número de acceso de SwissProt: P04725
82-98 QE90 (PQPQPFPPELPYPQPQS) reduce las respuestas
a A-gliadina 57-73 QE65 el 19%
(p<0,009) (véase la Tabla 11).
Las respuestas de interferón gamma de PBMC frente
a A-gliadina 57-73 QE65 en ensayos
de ELISPOT se reducen mediante la administración conjunta de
ciertas variantes de un único aminoácido de
A-gliadina 57-73 QE65, y un péptido
no relacionado que se sabe que se une a HLA-DQ2 en
un exceso de 5 veces. Estos hallazgos sugieren que existen
antagonistas de ligandos peptídicos alterados de
A-gliadina 57-73 QE65. No sólo
probables antagonistas LPA, sino también ciertos péptidos que se
unen eficazmente a HLA-DQ2, reducen las respuestas
de células T de PBL frente a A-gliadina
57-73 QE65.
Estos hallazgos apoyan dos estrategias para
interrumpir la respuesta de células T frente al epítope
A-gliadina dominante en la enfermedad celiaca
HLA-DQ2+.
1. Optimización de antagonistas PLA sustituyendo
aminoácidos en más de una posición (64-67) para su
uso como productos farmacéuticos peptídicos "tradicionales" o
para modificaciones genéticas específicas de genes de gliadina en
trigo.
2. El uso de péptidos de alta afinidad que se
unen a HLA-DQ2 para inhibir competitivamente la
presentación de A-gliadina 57-73
QE65 en asociación con HLA-DQ2.
Estas dos aproximaciones pueden ser mutuamente
compatibles. Se generaron superantígenos sustituyendo F61 y Q70 por
restos de tirosina. Es probable que estos superantígenos fueran el
resultado de la unión mejorada a HLA-DQ2 antes que
de la potenciación del contacto con el receptor de células T.
Combinando estas modificaciones con otras sustituciones que generan
antagonistas LPA moderadamente eficaces podría potenciarse
sustancialmente el efecto inhibidor de variantes de
A-gliadina 57-73 QE65
sustituidas.
Ejemplo
12
La inducción de sensibilidad al epítope de
células T de A-gliadina dominante en PBMC medido en
ELISPOT para interferón gamma sigue a la estimulación con gluten en
casi todos los sujetos celiacos DQ2+ que siguieron una dieta sin
gluten (DSG) estricta de larga duración, pero no en sujetos sanos
DQ2+ después de 4 semanas de seguir una DSG estricta. Las
respuestas a A-gliadina 57-73 QE65
no se pueden medir en las PBMC de sujetos celiacos antes de la
estimulación con gluten y los datos piloto han sugerido que estas
respuestas no podrían medirse en PBMC de celiacos sin tratar. Estos
datos sugieren que en la enfermedad celiaca la inmunosensibilidad a
A-gliadina 57-73 QE65 se restablece
después de la exclusión antigénica (DSG). Si se tiene que
desarrollar una prueba diagnóstica usando el ensayo de ELISPOT y
PBMC, es deseable definir la duración de la DSG necesaria antes de
que la estimulación con gluten sea capaz de inducir respuestas
frente a A-gliadina 57-73 QE65 y a
otros péptidos de gliadina inmunoreactivos en sangre.
Se seleccionaron sujetos celiacos DQ2+
recientemente diagnosticados de las consultas externas de
gastroenterología. Se prepararon las PBMC y se ensayaron en ELISPOT
para interferón gamma antes de que los sujetos comenzaran la DSG, y
una o dos semanas después de comenzar la DSG. Además, la
estimulación con gluten (3 días consumiendo 4 rebanadas de pan
blanco convencional, 200 g/día) se realizó una y dos semanas después
de iniciar la DSG. Se prepararon los PBMC y se ensayaron el día
seis después de comenzar la estimulación con gluten. Se valoraron
A-gliadina 57-73 QE65 (A), P04724
84-100 QE92 (B) (por separado y combinados) y
A-gliadina 57-73 QP65 (P65)
(variante no bioactiva, véase anteriormente) (todos a 2,5
\mug/ml).
Todos menos un paciente celiaco recién
diagnosticado eran DQ2+ (uno era DQ8+) (n=11). Los PBMC de los
celiacos recién diagnosticados que no habían sido tratados, o
después de 1 ó 2 semanas siguiendo una DSG, no mostraban respuestas
a A-gliadina 57-73 QE65 ni a P04724
84-100 QE93 (por separado o combinados) que fueran
significativamente diferentes del blanco o de
A-gliadina 57-73 QP65 (n=9) (véase
la Figura 28). La estimulación con gluten en celiacos que habían
seguido una DSG durante sólo una semana no potenciaba
sustancialmente las respuestas a A-gliadina
57-73 QE65 o a P04724 84-100 QE92
(por separado o combinados). Pero 2 semanas de estimulación con
gluten después de comenzar la DSG inducían respuestas a
A-gliadina 57-73 QE65 y a P04724
84-100 QE92 (por separado o combinados) que eran
significativamente mayores que la variante no bioactiva de
A-gliadina 57-73 QP65 y que el
blanco. Aunque estas respuestas tras la estimulación con gluten a
las 2 semanas eran sustanciales, parecían ser menores que en
sujetos >2 meses después de comenzar la DSG. Las respuestas a
A-gliadina 57-73 QE65 por separado
eran equivalentes o mayores que las respuestas a
P0472484-100 QE92 por separado o cuando se mezclaba
con A-gliadina 57-73 QE65. Ninguno
de los sujetos experimentó síntomas problemáticos con la
estimulación con gluten.
La sensibilidad inmune (como se mide en PBMC
después de la estimulación con gluten) a A-gliadina
se restablece parcialmente 2 semanas después de comenzar la DSG, lo
que implica que la "insensibilidad inmune" a este epítope de
células T dominante prevalece en la enfermedad celiaca sin tratar y
durante al menos una semana después de iniciar la DSG. El momento
óptimo de una prueba diagnóstica para la enfermedad celiaca, usando
la estimulación con gluten y la medida de la respuesta a
A-gliadina 57-73 QE65 en el ensayo
de ELISPOT, es al menos 2 semanas después de comenzar una DSG.
Las células T secretoras de interferón gamma
específicas de A-gliadina 57-73 QE65
no se puede medir en sangre periférica de celiacos sin tratar, y
pueden inducirse sólo por la estimulación con gluten después de al
menos 2 semanas de DSG (exclusión antigénica). Por tanto, el momento
de una prueba diagnóstica usando esta metodología es crucial y son
necesarios estudios adicionales para su optimización. Estos
hallazgos están de acuerdo con la anergia funcional de células T
específica del epítope dominante, A-gliadina
57-73 QE65, invertida por la exclusión antigénica
(DSG). Este fenómeno no se ha demostrado previamente en ninguna
enfermedad humana y apoya la posibilidad de que en la enfermedad
celiaca pueda inducirse anergia de células T con terapia
peptídica.
1. Molberg O, y col. Nature Med.
4,713-717 (1998).
2. Quarsten H, y col. Eur. J.
Immunol. 29,2506-2514 (1999).
3. Greenberg CS y col. FASEB
5,3071-3077 (1991).
4. Mantzaris G, Jewell D, Scand.
J. Gastroenterol. 26,392-398 (1991).
5. Mauri L, y col. Scand. J.
Gastroenterol. 31,247-253 (1996).
6. Bunce M, y col. Tissue Antigens
46,355-367 (1995).
7. Olerup O, y col. Tissue antigens
41,119-134 (1993).
8. Mullighan CG, y col.
Tissue-Antigens. 50,688-92
(1997).
9. Plebanski M y col.
Eur.J.Immunol. 28,4345-4355
(1998).
\vskip1.000000\baselineskip
Sexo | Dieta sin | HLA-DQ2 | Estimulación | Síntomas | |
Edad | gluten | con pan | con pan | ||
1 | 64 m | 14 años | Homocigoto | 3 días | Dolor abdominal, letargo, úlceras en la boca, diarrea |
2 | 57 h | 1 año | Heterocigoto | 10 días | Letargo, nauseas |
3 | 35 m | 7 años | Heterocigoto | 3 días | Nauseas |
4 | 36 h | 6 sem | Homocigoto | 3 días | Dolor abdominal, úlceras en la boca, diarrea |
5 | 26 h | 19 años | Heterocigoto | 3 días | Ninguno |
6 | 58 h | 35 años | Heterocigoto | 3 días | Ninguno |
7 | 55 h | 1 año | Heterocigoto | 3 días | Diarrea |
8 | 48 m | 15 años | Homocigoto | 3 días | Dolor abdominal, diarrea |
\vskip1.000000\baselineskip
Aminoácido en la posición 65 | Intervalo | Media |
Glutamato | (100) | 100% |
Asparragina | (50-84) | 70% |
Aspartato | (50-94) | 65% |
Alanina | (44-76) | 64% |
Cisteína | (45-83) | 62% |
Serina | (45-75) | 62% |
Valina | (24-79) | 56% |
Treonina | (46-66) | 55% |
Glicina | (34-47) | 40% |
Leucina | (8-46) | 33% |
Glutamina | (16-21) | 19% |
Isoleucina | (3-25) | 14% |
Metionina | (3-32) | 14% |
Fenilalanina | (0-33) | 12% |
Histidina | (0-13) | 8% |
Tirosina | (0-17) | 8% |
Triptófano | (0-17) | 8% |
Lisina | (0-11) | 4% |
Prolina | (0-4) | 2% |
Arginina | (0-2) | 1% |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\begin{minipage}[t]{150mm} NE: no especificado en la publicación original, iTCC clon de células T intestinales; iTCL línea de célula T policlonal intestinal, bTCC clon de célula T de sangre periférica.\end{minipage} |
\begin{minipage}[t]{150mm} * Todos los péptidos son los producidos de los péptidos de gluten de tipo silvestre modificados con transglutaminasa excepto los péptidos cuatro y sexto.\end{minipage} |
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ * \begin{minipage}[t]{150mm} Secuencia se refiere a la del péptido modificado transglutaminasa (tTG) y la del epítope de la célula T. El tipo silvestre es el péptido de gliadina sin modificar. Los datos son de 4 sujetos. El blanco era 5(1)%.\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.6cmA. Secuencias derivadas de la cepa Mjolner de trigo de otoño Nórdico
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.6cmB. Búsqueda en SWISSPROT y TREMBL (10.12.99) de gliadinas que contienen las secuencias: {}\hskip1.5cm XXXXXXXPQLPYXXXXX
Péptido | % de inhibición | P | |
TP | 31 | <0,0001 | |
HLA1a | 0 | 0,95 |
\vskip1.000000\baselineskip
A-gliadina 57-73QE65 | Polimorfismo | % Inhibición | P | |
P04725 82-98 QE90 | PQPQPFPPELPYPQPQS | 19 | 0,009 | |
Q41509 77-93 QE85 | QLQPFLQPELPYSQPQP | 11 | 0,15 | |
Gli\alpha 1,6 58-74 QE66 | QPQPFPPPELPYPQTQP | 11 | 0,11 | |
P04723 77-93 QE85 | PQPQPFPPELPYPQTQP | 10 | 0,14 | |
Gli\alpha 3-5 57-73 QE65 | QLQPFPQPELSYSQPQP | 7 | 0,34 | |
P02863 77-93 QE85 | QLQPFPQPELPYSQPQP | 6 | 0,35 | |
Q41509 77-93 QE85 | QLQPFLQPELPYSQPQP | 6 | 0,41 | |
P04727 79-95 QE65 | PQPQPFLPELPYPQPQS | 6 | 0,39 | |
P04726 82-98 QE90 | PQPQPFPPELPYPQPPP | 5 | 0,43 |
<110> ISIS INNOVATION LIMITED
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Epítope diagnóstico y terapéutico y
planta transgénica
\vskip0.400000\baselineskip
<130> N.77933A
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 266
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Leu Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu
Pro Tyr Pro Gln Pro}
\sac{Gln Ser Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu
Pro Tyr Pro Gln Pro}
\sac{ Gln Ser Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Glu}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Glu}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Glu}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Ser
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Arg Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Leu Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Leu Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
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Tyr Pro Gln Thr Gln}
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
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\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Leu}
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Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
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Tyr Pro Gln Pro Gln}
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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Tyr Pro Gln Pro Pro}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Leu Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Leu Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
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\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Ley Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Leu Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Ser Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Leu Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Pro}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Leu Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Ser Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Leu Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Leu Pro Gln Pro Glu Gln Pro Gln Gln
Ser Phe Pro Glu Gln}
\sac{Glu Ser Pro Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu
Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln
Pro Tyr Pro Gln Pro}
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Tyr Pro Ser Gly Glu Gly Ser Phe Gln
Pro Ser Gln Glu Asn}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln
Gln Ser Gly Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro
Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro
Glu Tyr Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Val Trp Leu Gly Gly Leu Leu Ala Glu
Asn Phe Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Leu Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Ser
Tyr Ser Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Ley Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Leu Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Ser
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Leu Gln Pro Glu Leu Pro
Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Leu Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro
Tyr Pro Gln Pro Pro}
\sac{Pro}
Claims (55)
1. Un péptido que comprende la secuencia de
aminoácidos PQPELPY (SEC ID Nº 1).
2. Una proteína de fusión que comprende (a) la
secuencia de aminoácidos PQPELPY (SEC ID Nº 1) y (b) otra
secuencia de gliadina o no gliadina.
3. Un péptido según la reivindicación 1, o una
proteína de fusión según la reivindicación 2, que tiene una
longitud de 7 a no más de 50 aminoácidos.
4. Un péptido según la reivindicación 3, que
tiene una longitud de 10 a 40 aminoácidos.
5. Un péptido o proteína de fusión según
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la
secuencia de aminoácidos QLQPFPQPELPYPQPQS (SEC ID Nº 2).
6. Una proteína de fusión según la reivindicación
2, en la que la secuencia de gliadina es de trigo, centeno, cebada,
avena o triticale.
7. Una proteína de fusión según la reivindicación
2, en la que (b) no es una secuencia de gliadina.
8. Una composición que comprende dos o más de los
péptidos o proteínas de fusión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
9. Una composición farmacéutica que comprende un
péptido o proteína de fusión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
10. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 9 que comprende (a) al menos un péptido según la
reivindicación 1 y (b) un epítope de gliadina de al menos uno de
trigo, centeno, cebada, avena y triticale.
11. Un péptido o proteína de fusión como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una
composición farmacéutica como se define en la reivindicación 9 ó 10
para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de la
enfermedad celiaca.
12. Un péptido, proteína de fusión o composición
farmacéutica como se define en la reivindicación 11, en el que
dicho tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca es mediante
tolerización.
13. Un procedimiento de diagnóstico de enfermedad
celiaca, o de susceptibilidad a padecer enfermedad celiaca, en un
individuo que comprende:
(a) poner en contacto una muestra del hospedador
con un péptido o proteína de fusión de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, y
(b) determinar in vitro si las células T
de la muestra reconocen al péptido o proteína de fusión; el
reconocimiento por las células T indica que el individuo tiene, o
es susceptible a, la enfermedad celiaca.
14. Uso de un péptido o proteína de fusión de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de
un medio de diagnóstico para su uso en un procedimiento de
diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a padecer
enfermedad celiaca, en un individuo, comprendiendo dicho
procedimiento determinar si las células T del individuo reconocen
el péptido, indicando el reconocimiento por las células T que el
individuo tiene, o es susceptible a, la enfermedad celiaca.
15. Uso según la reivindicación 14 en el que el
procedimiento comprende administrar el péptido o proteína de fusión
en la piel de un individuo y detectar la presencia de inflamación en
el lugar de administración, la detección de inflamación indicando
que las células T del individuo reconocen el péptido o proteína de
fusión.
16. Un procedimiento según la reivindicación 13 o
un uso según la reivindicación 14, en el que la muestra es una
muestra de sangre.
17. Un procedimiento según la reivindicación 13 ó
16, o su uso según la reivindicación 14 en los que las células T no
se reestimulan de forma específica de antígeno in vitro antes
de dicha determinación.
18. Un procedimiento o uso según cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 17 en el que el reconocimiento del
péptido o proteína de fusión por las células T se determina
detectando la secreción de una citocina por las células T.
19. Un procedimiento o uso según la
reivindicación 18 en el que la citocina es
IFN-\gamma.
\newpage
20. Un procedimiento o uso según la
reivindicación 18 ó 19 en el que la citocina se detecta permitiendo
a la citocina que se una a un anticuerpo inmovilizado específico
para la citocina y detectando, a continuación, la presencia de
complejos anticuerpo/citocina.
21. Un procedimiento o uso según una cualquiera
de las reivindicaciones 13 a 17 en el que dicha determinación se
hace midiendo si el péptido o la proteína de fusión se unen al
receptor de célula T.
22. Un procedimiento de diagnóstico de enfermedad
celiaca, o susceptibilidad a padecer enfermedad celiaca, en un
individuo que comprende determinar la presencia de un anticuerpo que
se une a la secuencia de aminoácidos
PQPELPY (SEC ID Nº 1) en una muestra del individuo, indicando la presencia del anticuerpo que el individuo tiene, o es susceptible a, la enfermedad celiaca.
PQPELPY (SEC ID Nº 1) en una muestra del individuo, indicando la presencia del anticuerpo que el individuo tiene, o es susceptible a, la enfermedad celiaca.
23. Un procedimiento para determinar si una
composición es capaz de causar la enfermedad celiaca, que comprende
determinar si en la composición está presente una secuencia capaz de
ser modificada en un péptido por una transglutaminasa como se
define en la reivindicación 1, indicando la presencia de la
secuencia que la composición es capaz de causar la enfermedad
celiaca.
24. Un procedimiento según la reivindicación 23
en el que dicha determinación se hace poniendo en contacto la
composición con un anticuerpo específico de la secuencia que es
capaz de ser codificada en la secuencia peptídica, indicando la
unión del anticuerpo a una proteína de la composición que la
composición es capaz de causar la enfermedad celiaca.
25. Un kit para realizar un procedimiento o uso
según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21 que comprende
un péptido o proteína de fusión de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 y un medio para detectar el reconocimiento
del péptido o proteína de fusión por la célula T.
26. Un kit según la reivindicación 25 en el que
el medio para detectar el reconocimiento comprende un anticuerpo
frente a IFN-\gamma.
27. Un kit según la reivindicación 26 en el que
el anticuerpo se inmoviliza en un soporte sólido y, de forma
opcional, el kit también comprende un medio para detectar el
complejo anticuerpo/INF-\gamma.
28. Uso de un péptido o proteína de fusión como
se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para producir
un anticuerpo específico del péptido.
29. Un polinucleótido que comprende una secuencia
codificadora que codifica un péptido o proteína de fusión como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
30. Un polinucleótido según la reivindicación 29,
en el que las secuencias 5' y/o 3' de la secuencia codificadora
comprende secuencias que ayudan a la expresión de la secuencia que
codifica el péptido o la proteína de fusión.
31. Un polinucleótido según la reivindicación 30,
en el que el polinucleótido es capaz de expresar el péptido o
proteína de fusión en una célula procariótica o eucariótica.
32. Un polinucleótido según la reivindicación 31,
en el que la célula eucariótica es una célula de mamífero.
33. Un vector de expresión que comprende un
polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a
32, en el que el polinucleótido está unido de forma operativa a una
secuencia control que es capaz de proporcionar la expresión del
polinucleótido.
34. Una célula que comprende un polinucleótido o
vector de expresión como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 33 o que se ha transformada con este
polinucleótido o vector de expresión.
35. Una célula según la reivindicación 34, que es
una célula procariótica o una célula de mamífero.
36. Una proteína que comprende: (a) una proteína
gliadina mutante con al menos una mutación en el epítope
^{62}PQPQLPY^{68}, en la que la mutación reduce la capacidad del
epítope para inducir una respuesta de células T; o (b) un fragmento
de la proteína mutante de (a), cuyo fragmento tiene una longitud de
al menos 15 aminoácidos y comprende la secuencia PQPQLPY
mutada.
37. Una proteína según la reivindicación 36, en
la que la mutación está en la posición 65 de la
A-gliadina, o en una posición equivalente de otras
gliadinas.
38. Una proteína según la reivindicación 37, en
la que el resto de glutamina de la posición 65 se sustituye por un
resto de histidina, tirosina, triptófano, lisina, prolina o
arginina.
39. Un polinucleótido que comprende una secuencia
codificadora que codifica una proteína como se define en cualquiera
de las reivindicaciones 36 a 38.
40. Un polinucleótido según la reivindicación 39
que comprende adicionalmente una o más secuencias reguladoras
unidas de forma operativa con la secuencia codificadora, cuyas
secuencias reguladores son capaces de asegurar la expresión de la
secuencia codificadora en una célula.
41. Un polinucleótido según las reivindicaciones
39 ó 40, que es un vector o que está en forma de un vector.
42. Una célula que comprende un polinucleótido
como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41 o
que se ha transformado con este polinucleótido.
43. Una célula según la reivindicación 42 que es
una célula de una especie de gramínea monocotiledónea.
44. Una célula según la reivindicación 43 que es
una célula de trigo, maíz, avena, centeno, arroz, cebada,
triticale, sorgo o azúcar de caña.
45. Un procedimiento para la producción de una
proteína codificada por una secuencia codificadora como se define
en la reivindicación 39, cuyo procedimiento comprende:
(a) cultivar una célula según una cualquiera de
las reivindicaciones 42 a 44 en condiciones que permitan la
expresión de la proteína; y de manera opcional
(b) recuperar la proteína expresada.
46. Un procedimiento para obtener una célula
vegetal transgénica que comprende: (a) transformar una célula
vegetal con un vector según la reivindicación 41 para obtener una
célula vegetal transgénica.
47. Una célula vegetal transgénica que puede
obtenerse por un procedimiento según la reivindicación 46.
48. Una planta transgénica o semilla vegetal que
comprende células vegetales según una cualquiera de las
reivindicaciones 42 a 44.
49. Un callo de células vegetales transgénicas
que comprende células vegetales según la reivindicación 43 ó 44,
que puede obtenerse a partir de una célula vegetal transgénica como
se define en la reivindicación 43, 44 ó 47.
50. Una planta o callo según la reivindicación 48
ó 49 que es de una especie como se define en la reivindicación 43 ó
44.
51. Un procedimiento para obtener un producto
vegetal que comprende recolectar un producto vegetal a partir de
una planta según la reivindicación 48 ó 50 y, de manera opcional,
procesar además el producto recolectado.
52. Un procedimiento según la reivindicación 51
en el que la planta es una planta de trigo y el producto vegetal
recolectado es el grano; procesado además de manera opcional en
harina u otro producto del grano.
53. Un producto vegetal que puede obtenerse
mediante un procedimiento según la reivindicación 51 ó 52.
54. Un alimento que comprende una proteína como
se define en cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38.
55. Un alimento según la reivindicación 54, en la
que se usa una proteína como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 36 a 38 en lugar de la gliadina de tipo
silvestre.
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