ES2256042T3 - Epitope diagnostico y terapeutico y plata transgenica. - Google Patents

Epitope diagnostico y terapeutico y plata transgenica.

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ES2256042T3 ES00964460T ES00964460T ES2256042T3 ES 2256042 T3 ES2256042 T3 ES 2256042T3 ES 00964460 T ES00964460 T ES 00964460T ES 00964460 T ES00964460 T ES 00964460T ES 2256042 T3 ES2256042 T3 ES 2256042T3
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Abstract

Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos PQPELPY (SEC ID Nº 1).

Description

Epítope diagnóstico y terapéutico y planta transgénica.
La presente invención se refiere al diagnóstico y la terapia de la enfermedad celiaca, y a una proteína gliadina que no causa la enfermedad celiaca.
Una reacción inmune a la gliadina (un componente del gluten) en la dieta causa la enfermedad celiaca. Se sabe que las respuestas inmunes en el tejido intestinal responden preferentemente a la gliadina que ha sido modificada por una transglutaminasa intestinal. La enfermedad celiaca se diagnostica por medio de la detección de anticuerpos antiendomisiales, pero ello requiere una confirmación mediante el hallazgo de una inflamación linfocítica en biopsias intestinales. Sin embargo, la realización de dicha biopsia es inconveniente para el paciente.
Los investigadores han supuesto anteriormente que sólo las respuestas a células T intestinales proporcionan una indicación precisa de la respuesta inmune frente a las gliadinas. Por lo tanto, se han concentrado en la investigación de las respuestas a las células T en el tejido intestinal^{1}. Por ejemplo, el documento EP 0905518 describe epítopes de células T a partir de glutenina y gliadina. Estos son reconocidos específicamente por las células T específicas del gluten, o aquellas que son sensibles, derivadas del medio intestinal. Los péptidos tienen secuencias SGQGSFQPSQQ (gliadina 206-216; ID SEC Nº 4) y GQQGYYPTSPQQSGQ (glutenina; ID SEC Nº 5). Se conocen los epítopes de gliadina que requieren modificación de transglutamisa ^{2}(antes de ser reconocidos por el sistema inmune).
Los inventores han descubierto el epítope de células T inmunodominante reconocido por el sistema inmune en la enfermedad celiaca, y han demostrado que es reconocido por las células T en la sangre periférica de los individuos con enfermedad celiaca. Se descubrió que dichas células T estaban presentes en frecuencias lo bastante altas para ser detectables sin reestimulación (es decir, podía usarse un sistema de detección "de respuesta fresca"). El epítope se identificó por medio de un procedimiento basado en la clonación de células no T que proporcionaba un reflejo más preciso de los epítopes que se estaban reconociendo. El epítope inmunodominante requiere modificación de transglutaminasa (causando la sustitución de una glutamina concreta por glutamato) antes de ser reconocido por el sistema inmune.
Basándose en este trabajo los inventores han desarrollado una prueba que puede usarse para diagnosticar la enfermedad celiaca en una fase temprana. La prueba puede llevarse a cabo en una muestra de sangre períferica y, por lo tanto, no se requiere una biopsia intestinal. La prueba es más sensible que las pruebas de anticuerpos que se están usando actualmente.
La invención proporciona de ese modo un procedimiento para diagnosticar la enfermedad celiaca, o la susceptibilidad a la enfermedad celiaca, en un individuo, que comprende:
(a) poner en contacto una muestra del hospedador con un agente seleccionado entre (i) el epítope que comprende la secuencia siguiente: ID SEC Nº 1 ó 2 o una secuencia equivalente de un homólogo producido de forma natural de la gliadina representado por la ID SEC Nº 3 (ii) un epítope que comprende la secuencia siguiente: ID SEC Nº 1, o una secuencia equivalente de homólogo producido de forma natural de la gliadina representado por la ID SEC Nº 3, epítope que es un oligopéptido aislado derivado de una proteína gliadina, (iii) un análogo de (i) o (ii) que puede ser reconocido por un receptor de célula T que reconoce (i) o (ii), que en el caso de un análogo péptido no tiene más de 50 aminoácidos de longitud, o (iv) un producto que comprende dos o más agentes, tal como se define en (i), (ii) o (iii), y (b) determinar in vitro si las células T presentes en la muestra reconocen al agente, indicando el reconociento por parte de las células T que el individuo tiene o es susceptible de padecer la enfermedad celiaca.
La invención proporciona también el uso del agente para la preparación de un medio de diagnóstico para utilizarse en un procedimiento de diagnóstico de la enfermedad celiaca o susceptibilidad a la enfermedad celiaca en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento la determinación de si las células T del individuo reconocen al agente, indicando el reconocimiento por parte de las células T que el individuo tiene o es susceptible de padecer la enfermedad celiaca.
El hallazgo de un epítope inmunodominante que es modificado por la transglutaminasa permite también el diagnóstico de la enfermedad celiaca basándose en determinar si se producen otros tipos de respuesta inmune a este epítope. De ese modo, la invención proporciona también un procedimiento de diagnóstico de la enfermedad celiaca, o susceptibilidad a la enfermedad celiaca en un individuo que comprende determinar la presencia de un anticuerpo que se une al epítope en una muestra del individuo, indicando la presencia del anticuerpo que el individuo tiene o es susceptible de padecer la enfermedad celiaca.
La invención proporciona además el agente, opcionalmente en asociación con un vehículo, para usarse en un procedimiento de tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca por células T tolerantes que reconocen al agente. Se proporciona también un antagonista de una célula T que tiene un receptor de célula T que reconoce (i) o (ii) opcionalmente en asociación con un vehículo para usarse en un procedimiento de tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca antagonizando dichas células T. Se proporciona además el agente o un análogo que une un anticuerpo (que une el agente) para usarse en un procedimiento de tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca en un individuo haciendo tolerante al individuo para evitar la producción de dicho anticuerpo.
La invención proporciona un procedimiento para determinar si una composición es capaz de causar la enfermedad celiaca que comprende determinar si una proteína capaz de ser modificada por una transglutaminasa en una secuencia de oligopéptidos, tal como se ha definido anteriormente, se halla presente en la composición, indicando la presencia de la proteína que la composición es capaz de causar la enfermedad celiaca.
La invención proporciona también una proteína gliadina mutante cuya secuencia natural puede modificarse por una transglutaminasa en una secuencia que comprende un epítope que comprende la secuencia definida anteriormente, pero una proteína gliadina mutante que ha sido modificada de tal modo que no contiene una secuencia que pueda ser modificada por una transglutaminasa a una secuencia que contiene dicho epítope que comprende la secuencia; o un fragmento de dicha proteína gliadina mutante que tiene al menos 15 aminoácidos de longitud y que comprende la secuencia que ha sido modificada de ese modo.
La invención proporciona también una proteína que comprende una secuencia que es capaz de unirse a un receptor de células T, receptor de células T que reconoce al agente y una secuencia que es capaz de causar antagonismo de una célula T que porta dicho receptor de células T.
Además la invención proporciona un alimento que comprende las proteínas definidas anteriormente.
La invención se ilustra por medio de los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 muestra respuestas PBMC (célula mononuclear de sangre periférica) IFN\gammaELISPOT (el eje vertical muestra células que forman manchas por 10^{6} PBMC) a la transglutaminasa tratada con (tTG) y grupo de péptidos sin tratar 3 (cada péptido 10 \mug/ml) incluyendo 15 mers solapados que abarcan 51-85 A-gliadina (véase tabla 1) y gliadina digerida por a-quimotripsina (40 \mug/ml) en el sujeto 1 de la enfermedad celiaca, inicialmente en remisión tras una dieta sin gluten estimulada posteriormente con 200 g de pan al día durante tres días desde el día 1 (a). Las respuestas PBMC IFN\gammaELISPOT obtenidas del sujeto 2 a los grupos de péptidos de A-gliadina tratados con tTG 1-10 que abarcaban la proteína de de A-gliadina completa durante un tratamiento de estimulación con pan de diez días (b). El eje horizontal muestra los días trascurridos después del inicio de la ingesta de pan.
La figura 2 muestra las respuestas de PBMC IFN\gammaELISPOT al grupo de péptidos tratados con tTG 3 (que abarcaba A-gliadina 51-85) en siete sujetos que padecían la enfermedad celiaca (el eje vertical muestra las células que forman manchas por 10^{6} PBMC), inicialmente en remisión con una dieta sin gluten, estimulada con pan durante tres días (días 1-3). El eje horizontal muestra los días trascurridos desde el inicio de la ingesta de pan (a). Respuestas de PBMC IFN\gammaELISPOT a péptidos 15 mer solapados tratados tTG incluidos en el grupo 3; las barras representan la respuesta media (\pm SEM) a péptidos individuales (10 \mug/ml) en seis sujetos que padecían la enfermedad celiaca el día 6 ó 7 (b)(en cada uno de los sujetos las respuestas ELISPOT a péptidos se calcularon como un % de la respuesta suscitada por el péptido 12, tal como se muestra por medio de los ejes verticales).
La figura 3 muestra las respuestas de PBMC IFN\gammaELISPOT a truncamientos tratados con tTG de A-gliadina 56-75 (0,1 \muM). Las barras representan la media (\pm SEM) en 5 sujetos que padecían la enfermedad celiaca. (En los sujetos individuales las respuestas se calcularon como el % de la respuesta máxima suscitada por cualquiera de los péptidos sometidos a ensayo).
La figura 4 muestra cómo se trazó la estructura mínima del epítope de A-gliadina dominante por medio de péptidos de A-gliadina 7-17 mer tratados con tTG (0,1 \muM) que incluyen la secuencia PQPQLPY (A-gliadina 62-60) (a), y los mismos péptidos sin tratamiento tTG pero con la sustitución Q\rightarrowE65 (b). Cada línea representa las respuestas de PBMC IFN\gammaELISPOT en cada uno de los tres sujetos que padecían la enfermedad celiaca en el día 6 ó 7 después de haber ingerido el pan los días 1-3. (En los sujetos individuales las respuestas ELISPOT se calcularon como un % de la respuesta suscitada por la A-gliadina 17 mer, 57-73).
La figura 5 muestra los aminoácidos que fueron desamidados por tTG. Se incubó A-gliadina 56-75 (LQLQPFPQP
QLPYPQPQSFP) (0,1\muM) con tTG (50 \mug/ml) a 37ºC durante 2 horas. Se identificó y purificó un solo producto por medio de HPLC de fase inversa. El análisis de aminoácidos permitió un % de desamidación (Q-E) de cada residuo Gln en A-gliadina 56-75 atribuible al tTG que ha de calcularse (eje vertical).
La figura 6 muestra el efecto de sustituir Q-E en A-gliadina 57-73 en otras posiciones además de Q65 por medio de los 17 mers: QLQPFPQPELPYPQPES (E57, 65), QLQPFPQPELPYPQPES (E65, 72), ELQPFPQPELPYPQPES (E57, 65, 72), y QLQPFPQPELPYPQPQS (E65) en tres sujetos que padecían la enfermedad celiaca los días 6 y 7 después de ingerir el pan los días 1-3. El eje vertical muestra el % de la respuesta de E65.
La figura 7 muestra que la A-gliadina 56-75 tratada con tTG (0,1 \muM) suscitó respuestas de IFN\gammaELISPOT en (a) PBMC bajo en nódulo magnético CD4 y CD8. (Las barras representan las respuestas de PBMC bajo en CD4 como un % de las respuestas de PBMC bajo en CD8; las células formadoras de manchas por millón de PBMC bajo en CD8 eran: sujeto 4: 29, y sujeto 6: 535).(b) Las respuestas PBMC IFN\gammaELISPOT (células formadoras de manchas/millón de PBMC) tras incubación con anticuerpos monoclonales a HLA-DR (L243), -DQ(L2) y -DP(B7.21) (10 \mug/ml) una hora antes de 56-75 tratado con tTG (0,1 \muM) en dos sujetos que padecían la enfermedad celiaca homocigóticos para HLA-DQ al*0501,b1*0201.
La figura 8 muestra el efecto de sustituir Glu en la posición 65 por otros aminoácidos en el epítope inmunodominante. El eje vertical muestra el % de respuesta en los tres sujetos en relación con el epítope inmunodominante.
La figura 9 muestra la inmunorreactividad de los péptidos de gliadina que se producen de forma natural (midiendo las respuestas de tres sujetos) que contienen la secuencia PQLPY con (sombreado) y sin (claro) tratamiento de transglutaminasa.
La figura 10 muestra la depleción inmunomagnética de nódulos específica de CD8, CD4, \beta_{7} y \alpha^{B} de las células mononucleares de sangre periférica de dos sujetos celiacos seis días después de comenzar la estimulación del gluten seguido de interferón gamma ELISPOT. Se usó como antígeno A-gliadina 57-73 QE65 (25 mcg/ml), gliadina digerida por quimotripsina tratada con tTG (100 mcg/ml) o PPD (10 mcg/ml).
La figura 11 muestra la longitud óptima del epítope de célula T.
La figura 12 muestra una comparación de A-gliadina 57-73 QE65 con otros péptidos en un estudio de respuesta de dosis.
La Figura 13 muestra una comparación de las respuestas específicas de gliadina y A-gliadina 57-73 QE65.
La Figura 14 muestra la bioactividad de los polimorfismos de gliadina en los sujetos celiacos.
Las figuras 15 y 16 muestran la definición de las secuencias de epítope central.
Las figuras 17 a 27 muestran la actividad agonista de las variantes de A-gliadina 57-73 QE65.
La figura 28 muestra respuestas en diferentes grupos de pacientes.
Descripción detallada de la invención
El término "enfermedad celiaca" abarca un espectro de estados causados por diversos grados de sensibilidad al gluten, incluida una forma grave que se caracteriza por una mucosa intestinal pequeña y plana (atrofia vellosa hiperplástica) y otras formas caracterizadas por síntomas más suaves.
El individuo mencionado anteriormente (en el contexto del diagnóstico o la terapia) es humano. Pueden tener enfermedad celiaca (sintomática o asintomática) o sospecharse que la tiene. Puede que esté sometido a una dieta sin gluten. Puede encontrarse en una fase de respuesta aguda (por ejemplo, puede tener enfermedad celiaca, pero sólo haber ingerido gluten en las últimas 24 horas, antes de lo cual había estado sometido a dieta sin gluten durante 14 a 28 días).
El individuo puede ser susceptible de padecer enfermedad celiaca, como es el caso de una susceptibilidad genética (determinada por ejemplo por el hecho de que tenga parientes con enfermedad celiaca o posea genes que causen predisposición a la enfermedad celiaca).
El agente
El agente es normalmente un péptido, con una longitud por ejemplo de entre 7 y 50 aminoácidos, como por ejemplo entre 10 y 40, o 15 a 30 aminoácidos de longitud.
ID SEC Nº 1 es PQPELPY. ID SEC Nº 2 es QLQPFPQPELPYPQPQS. ID SEC Nº 3 se muestra en la Tabla 1 y es la secuencia de una A-gliadina entera. El glutamato en posición 4 de ID SEC Nº 1 (equivalente a posición 9 de ID SEC Nº 2) se genera por el tratamiento de transglutaminasa de la A-gliadina.
El agente puede ser el péptido representado por ID SEC Nº 1 ó 2 o un epítope que comprenda ID SEC Nº 1, que es un oligopéptido aislado derivado de una proteína gliadina; o un equivalente de estas secuencias procedente de una proteína que se produce de forma natural que es un homólogo de ID SEC Nº 3. De ese modo, el epítope puede ser un derivado de la proteína representada por ID SEC Nº 3. Dicho derivado es normalmente un fragmento de la gliadina, o un derivado mutado de la proteína entera o fragmento de proteína. Por lo tanto, el epítope de la invención no incluye esta proteína gliadina entera que se da de modo natural, ni incluye tampoco otras gliadinas enteras que se dan de modo natural.
El epítope puede por lo tanto ser un fragmento de A-gliadina (p.ej. ID SEC Nº 3), que comprende la secuencia de ID SEC Nº 1, obtenible por medio de tratamiento (completa o parcialmente) con transglutaminasa, es decir, con 1, 2, 3 o más glutaminas sustituidas por glutamatos (incluida la sustitución dentro de ID SEC Nº 1).
Tales fragmentos pueden ser o pueden incluir las secuencias representadas por las posiciones 55 a 70, 58 a 73, 61 a 77 de ID SEC Nº 3 mostradas en la Tabla 1. Normalmente tales fragmentos serán reconocidos por las células T en al menos el mismo grado en que los péptidos representados por ID SEC Nº 1 ó 2 son reconocidos en cualquiera de los ensayos descritos en este documento por medio de muestras de los pacientes de enfermedad celiaca.
En el caso en el que el epítope comprende una secuencia equivalente a los epítopes anteriores (incluidos fragmentos) de otra proteína gliadina (p.ej. cualquiera de las proteínas gliadina mencionadas en este documento o cualquier gliadina que cause la enfermedad celiaca), dichas secuencias equivalentes corresponderán a un fragmento de una proteína gliadina tratada normalmente (parcial o completamente) con transglutaminasa. Tales péptidos equivalentes pueden determinarse alineando las secuencias de otras proteínas gliadina con ID SEC Nº 3 (por ejemplo usando cualquiera de los programas mencionados en este documento). La transglutaminasa se encuentra disponible en el mercado (p.ej. Sigma T-5398). La Tabla 4 proporciona ejemplos de secuencias equivalentes apropiadas.
El agente que es un análogo es capaz de ser reconocido por un TCR que reconoce (i) o (ii). Así pues, por lo general, cuando el análogo se añade a las células T en presencia de i) o (ii), normalmente también en presencia de una célula que presenta antígeno (APC) (como puede ser cualquiera de las APC mencionadas en este documento), el análogo inhibe el reconocimiento de (i) o (ii), es decir, el análogo es capaz de competir con (i) o (ii) en tal sistema.
El análogo puede ser uno que sea capaz de unirse a la TCR que reconozca (i) o (ii). Tal unión puede probarse por medio de técnicas estándar. Tales TCR pueden aislarse de células T que han demostrado reconocer (i) o (ii) (p.ej. usando el procedimiento de la invención). La demostración de la unión del análogo a las TCR puede mostrarse a continuación determinando si las TCR inhiben la unión del análogo a una sustancia que se une al análogo, p.ej. un anticuerpo del análogo. Normalmente el análogo se une a una molécula MHC de clase II (p.ej. HLA-DQ2) en tal ensayo de inhibición de unión.
Normalmente, el análogo inhibe la unión de (i) o (ii) a una TCR. En este caso se reduce la cantidad de i) o (ii) que puede unirse a la TCR en presencia del análogo. Ello es debido a que el análogo es capaz de unirse a la TCR y por lo tanto compite con (i) o (ii) para unirse a la TCR.
Las células T para usarse en los experimentos de unión anteriores pueden aislarse de pacientes con enfermedad celiaca, por ejemplo con ayuda del procedimiento de la invención.
Otras características de unión del análogo pueden ser también las mismas que i) o (ii), y por lo tanto normalmente el análogo se une a la misma molécula MHC de clase II a la que se unen los péptidos (HLA-DQ2). El análogo normalmente se une a anticuerpos específicos de (i) o (ii), y por lo tanto inhibe la unión de (i) o (ii) a dichos anticuerpos.
El análogo es normalmente un péptido. Puede tener homología con (i) o (ii), normalmente al menos 70% de homología, preferentemente al menos 80%, 90%, 95%, 97% o 99% de homología con (i) o (ii), por ejemplo sobre una zona de al menos 15 aminoácidos contiguos más (como puede ser toda la longitud del análogo y/o (i) o (ii), o a lo largo de la zona que pone en contacto la TCR o se une a la molécula MHC). Los procedimientos de medición de la homología de proteínas son bien conocidos en la técnica y los expertos en la materia entenderán que en el presente contexto, la homología se calcula sobre la base de la identidad de aminoácidos (referida a veces como "homología dura").
Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT, que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo usada en sus valores por defecto) (Devereux y col. (1984), Nucleic Acids Research 12, págs. 387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la homología o las secuencias de alineamiento (normalmente en sus valores por defecto), por ejemplo de la manera descrita en Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F y col (1990) J Mol Biol 215: 403-10.
El software para realizar los análisis BLAST se encuentra a disposición pública a través del National Center for Biotechnology Information (http: www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar el par de secuencia de puntuación alta (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de pregunta que o bien se corresponden o satisfacen alguna puntuación umbral T valorada positivamente cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Se denomina T al umbral de puntuación de la palabra vecina (Atlschul y col, supra). Estos resultados iniciales de palabras vecinas actúan como iniciadores de búsquedas para encontrar HSP que las contengan. Los resultados de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la medida en que pueda aumentar la puntuación de alineamiento acumulativo. Las extensiones de los resultados de palabras en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineamiento acumulativo cae en la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa llega a cero o cae por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos que puntúan negativamente; o se alcanza el extremo de cada secuencia.
Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl.Acad. Sci. EE UU 89: 10915-10919), alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas líneas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase p.ej. Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl.Acad. Sci. EE UU 90: 5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña al comparar la primera secuencia con la segunda es inferior a aproximadamente 1, preferentemente menos de aproximadamente 0,1, más preferentemente menos de aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente menos de 0,001.
Los análogos péptidos homólogos difieren normalmente de (i) o (ii) en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más mutaciones (que pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones). Estas mutaciones pueden medirse a lo largo de cualquiera de las zonas mencionadas anteriormente en relación con el cálculo de la homología. Las sustituciones son preferentemente "conservadoras". Se definen de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos situados en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí.
ALIFÁTICO No polar GAP
ILV
Polar - sin cargar CSTM
NQ
Polar - cargado DE
KR
AROMÁTICO HFWY
Normalmente los aminoácidos en las posiciones análoga y equivalente a los aminoácidos en (i) o (ii) que contribuyen a unirse a la molécula MHC o son responsables de reconocer la TCR, son los mismos o están conservados.
Normalmente, el péptido análogo comprende una o más modificaciones, que pueden ser modificaciones naturales post-traducción o modificaciones artificiales. La modificación puede proporcionar una fracción química (normalmente por sustitución de un hidrógeno, p.ej. de un enlace C-H), como puede ser un grupo amino, acetilo, hidroxi o grupo halógeno (p.ej. fluorina) o grupo carbohidrato. Normalmente, la modificación está presente en el terminus N o C.
El análogo puede comprender uno o más aminoácidos no naturales, por ejemplo aminoácidos con una cadena lateral diferente a los aminoácidos naturales. Generalmente, el aminoácido no natural tendrá un terminus N y/o un terminus C. El aminoácido no natural puede ser un aminoácido L- o D-.
El análogo normalmente tiene una forma, tamaño, flexibilidad o configuración electrónica que es básicamente similar a (i) o (ii). Es normalmente un derivado de (i) o (ii). En una forma de realización el análogo es una proteína de fusión que comprende la secuencia ID SEC Nº 1 ó 2, o cualquier otro péptido mencionado en este documento; y secuencia de no gliadina.
En una realización, el análogo es o imita (i) o (ii) unido a una molécula MHC de clase II. 2, 3, 4 o más complejos de este tipo pueden estar asociados o unidos entre sí, por ejemplo por medio de un sistema basado en biotina/estreptavidina, en el que normalmente 2, 3 ó 4 moléculas MHC etiquetadas con biotina se unen con una fracción de estreptavidina. Este análogo normalmente inhibe la unión del complejo (i) o (ii)/MHC Clase II a una TCR o anticuerpo que es específico para el complejo.
El análogo es normalmente un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, como por ejemplo un fragmento Fab o (Fab)_{2}. El análogo puede inmovilizarse en un soporte sólido, específicamente en un análogo que imite a un péptido unido a una molécula MHC.
El análogo se diseña normalmente por medios informáticos y luego se sintetiza por medio de procedimientos conocidos en la técnica. Otra opción es que puede seleccionarse de entre una biblioteca de compuestos. La biblioteca puede ser un banco combinatorio o un banco expositor, como puede ser una biblioteca de muestra de bacteriófagos. La biblioteca de compuestos puede expresarse en la biblioteca de muestra de manera unida a una molécula MHC de clase II, como por ejemplo HLA-DQ2. Los análogos se seleccionan generalmente de la biblioteca en función de su capacidad de imitar las características de unión (i) o (ii). Por lo tanto, pueden seleccionarse en función de su capacidad de unirse a una TCR o anticuerpo que reconozca (i) o (ii).
Normalmente los análogos se reconocerán por parte de las células T en al menos el mismo grado que cualquiera de los agentes (i) o (ii), por ejemplo en al menos el mismo grado que el epítope equivalente y preferentemente en el mismo grado en que el péptido representado por ID SEC Nº 2 es reconocido en cualquiera de las pruebas descritas en este documento, normalmente por medio de células T de pacientes con enfermedad celiaca. Los análogos pueden reconocerse en estos grados in vivo y por lo tanto pueden inducir los síntomas de la enfermedad celiaca en al menos el mismo grado que cualquiera de los agentes mencionados en este documento (p.ej. en un paciente humano o en un modelo animal).
Los análogos pueden identificarse en un procedimiento que comprende determinar si una sustancia candidato es reconocida por un receptor de células T que reconoce un epítope de la invención, indicando el reconocimiento de la sustancia que la sustancia es un análogo. Tales TCR pueden ser cualquiera de las TCR mencionadas en este documento, y pueden estar presentes en las células T. Cualquier ensayo apropiado mencionado en este documento puede usarse para identificar el análogo. En una forma de realización este procedimiento se efectúa in vivo. Como se ha mencionado anteriormente, los análogos preferentes se reconocen en al menos el mismo grado que el péptido ID SEC Nº 2, y por lo tanto el procedimiento puede usarse para identificar análogos que se reconocen en esta medida.
En una forma de realización el procedimiento comprende determinar si una sustancia candidato es capaz de inhibir el reconocimiento de un epítope de la invención, indicando la inhibición de reconocimiento que la sustancia es un análogo.
El agente puede ser un producto que comprende al menos 2, 5, 10 o 20 agentes tal como define (i), (ii) o (iii). Normalmente la composición comprende epítopes de la invención (o análogos equivalentes) de diferentes gliadinas, como por ejemplo cualquiera de las especies, o variedad o tipos de gliadina mencionados en esta patente. Las composiciones preferentes comprenden al menos un epítope de la invención, o análogo equivalente, de todas las gliadinas presentes en cualquiera de las especies o variedades mencionadas en esta patente o de 2, 3, 4 o más de las especies mencionadas en este documento (como, por ejemplo, el panel de especies consistente en trigo, centeno, cebada, avena y triticale).
Diagnóstico
Tal como se ha mencionado antes, el procedimiento de diagnóstico de la invención puede basarse en la detección de células T que se unen al agente o en la detección de anticuerpos que reconocen el agente.
Las células T que reconocen el agente en el procedimiento (que incluye el uso mencionado anteriormente) son generalmente células T que han sido sensibilizadas previamente in vivo a la gliadina. Tal como se ha mencionado antes, se ha descubierto que dichas células T sometidas a antígeno están presentes en la sangre periférica.
En el procedimiento las células T pueden ponerse en contacto con el agente in vitro o in vivo, y la determinación de si las células T reconocen al agente puede efectuarse in vitro o in vivo. Por lo tanto la invención proporciona el agente que ha de usarse en un procedimiento de diagnóstico practicado en el cuerpo humano. Se proporcionan diferentes agentes para su uso simultáneo, separado o secuencial en dicho procedimiento.
El procedimiento in vitro se lleva a cabo normalmente en una solución acuosa a la que se añade el agente. La solución comprenderá también las células T (y en determinadas realizaciones las APC expuestas más adelante). El término "poner en contacto" tal como se usa en este documento incluye añadir la sustancia concreta a la solución.
Por lo general, se determina si las células T reconocen el agente detectando un cambio en el estado de dichas células T en presencia del agente o determinando si las células T se unen al agente. El cambio de estado es causado generalmente por una actividad funcional específica de antígeno de la célula T después de que la TCR ligue al agente. El cambio de estado puede medirse dentro (por ejemplo, el cambio en la expresión intracelular de las proteínas) o fuera (por ejemplo, detección de sustancias secretadas) de las células T.
El cambio de estado de la célula T puede ser el inicio o incremento en la secreción de una sustancia de la célula T, como puede ser una citocina, especialmente IFN-\gamma, IL-2 o TNF-\alpha. Se prefiere en particular la determinación de la secreción de IFN-\gamma. La sustancia puede detectarse normalmente permitiendo que se ligue a un agente ligante específico y luego midiendo la presencia del agente ligante específico o complejo de sustancias. El agente ligante específico es normalmente un anticuerpo, como por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos de las citocinas están disponibles en el mercado, o pueden fabricarse con técnicas estándar.
Normalmente el agente ligante específico se inmoviliza sobre un soporte sólido. Después de dejar que la sustancia se ligue, el soporte sólido, opcionalmente, puede lavarse para eliminar el material que no está unido específicamente al agente. El agente o complejo de sustancias puede detectarse por medio de un segundo agente ligante que unirá el complejo. Normalmente el segundo agente une la sustancia en un sitio que es diferente del sitio que se une al primer agente. El segundo agente es preferentemente un anticuerpo y es etiquetado directa o indirectamente por medio de una etiqueta detectable.
Por lo tanto el segundo agente puede detectarse por medio de un tercer agente que normalmente se etiqueta directa o indirectamente con una etiqueta detectable. Por ejemplo, el segundo agente puede comprender una fracción de biotina, permitiendo la detección por parte de un tercer agente que comprende una fracción de estreptavidina y normalmente fosfatasa alcalina como etiqueta detectable.
En una forma de realización el sistema de detección que se usa es el ensayo ELISPOT ex-vivo descrito en el documento WO 98/23960. En este ensayo IFN-\gamma secretado desde la célula T es unido por medio de un primer anticuerpo especifico de IFN-\gamma que se inmoviliza sobre un soporte sólido. A continuación el IFN-\gamma unido es detectado por medio de un segundo anticuerpo específico de IFN-\gamma que es etiquetado por medio de una etiqueta detectable. Dicha etiqueta detectable la proporciona MABTECH (Estocolmo, Suecia). Más adelante se exponen otras etiquetas detectables que pueden usarse.
El cambio de estado de la célula T que puede medirse puede ser el incremento de absorción de sustancias por la célula T, como por ejemplo la absorción de timidina. El cambio de estado puede ser un aumento del tamaño de las células T, o proliferación de las células T, o un cambio en los marcadores de superficie celular en la célula T.
En una forma de realización el cambio de estado se detecta midiendo el cambio en la expresión intracelular de las proteínas, por ejemplo el aumento de expresión intracelular de cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente. Tales cambios intracelulares pueden detectarse poniendo en contacto el interior de la célula T con una fracción que se une a las proteínas expresadas de una manera específica y que permite la clasificación de las células T por medio de citometría de flujo.
En una forma de realización cuando se une a la TCR el agente se une a una molécula MHC de clase II (normalmente HLA-DQ2), que está presente normalmente en la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC). No obstante, tal como se ha mencionado en esta patente, otros agentes pueden unirse a una TCR sin la necesidad de unirse también a una molécula MHC.
Generalmente, las células T con las que se entra en contacto en el procedimiento se toman del individuo en una muestra de sangre, si bien puede usarse otros tipos de muestras que contienen células T. La muestra puede añadirse directamente al ensayo o procesarse primero. Normalmente el proceso puede comprender la dilución de la muestra, por ejemplo con agua o tamponador. Normalmente la muestra se diluye entre 1,5 y 100 veces, por ejemplo de 2 a 50 ó 5 a 10 veces.
El proceso puede comprender la separación de los componentes de la muestra. Normalmente se separa de las muestras las células mononucleares (MC). Las MC comprenderán las células T y las APC. Por lo tanto en el procedimiento las APC presentes en las MC separadas pueden presentar el péptido a las células T. En otra realización sólo las células T, como por ejemplo sólo las células T CD4, pueden purificarse a partir de la muestra. Las PBMC, las MC y las células T pueden separarse de la muestra por medio de técnicas conocidas, como pueden ser las descritas en Lalvani y col (1997) J.Exp. Med. 186, pp 859-865.
En una forma de realización las células T usadas en el ensayo están en forma de muestras sin procesar o diluidas, o son células T recién aisladas (como por ejemplo en la forma de MC o PBMC recién aisladas) que se usan directamente ex vivo, es decir no se cultivan antes de usarse en este procedimiento. Por lo tanto, las células T no se han reestimulado de una manera específica de antígeno in vitro. No obstante, las células T pueden cultivarse antes de su uso, por ejemplo en presencia de uno o más de los agentes, y generalmente también citocinas promotoras de crecimiento exógeno. Durante el cultivo el agente o agentes están presentes normalmente en la superficie de las APC, como pueden ser las APC usadas en el procedimiento. El cultivo previo de las células T puede conducir a un aumento en la sensibilidad del procedimiento. De este modo, las células T pueden convertirse en líneas celulares, como puede ser líneas celulares a corto plazo (por ejemplo tal como se describe en Ota y col (1990) Nature 346, pp 183-187).
La APC que típicamente está presente en el procedimiento puede ser del mismo individuo que la célula T o de un hospedador diferente. La APC puede ser una APC que aparece de forma natural o una APC artificial. La APC es una célula que es capaz de presentar el péptido a una célula T. Típicamente, es una célula B, célula dendrítica o macrófago. Típicamente, se separa a partir de la misma muestra que la célula T y típicamente se purifica conjuntamente con la célula T. De este modo, la APC puede estar presente en las MC o en las PBMC. La APC típicamente es una célula recién aislada ex vivo o una célula cultivada. Puede estar en forma de línea celular, tal como una línea celular a corto plazo o inmortalizada. La APC puede expresar moléculas de MHC de clase II vacías en su superficie.
En el procedimiento pueden usarse uno o más agentes (diferentes). Típicamente, las células T derivadas de la muestra puede colocarse en un ensayo con todos los agentes que se pretenden ensayar o las células T pueden dividirse y colocarse en ensayos independientes, que contienen cada uno de los cuales uno o más agentes.
La invención también proporciona los agentes, tales como dos o más de cualquiera de los agentes mencionados en este documento (por ejemplo, las combinaciones de agentes que están presentes en la composición de agente descrita anteriormente) para su uso simultáneo independiente o secuencial (por ejemplo, para su uso in vivo).
En una realización, el agente per se se añade directamente a un ensayo que comprende células T y APC. Como se discute anteriormente, las células T y las APC de este ensayo podrían estar en forma de MC. Cuando se usan agentes que pueden ser reconocidos por la célula T sin necesidad de ser presentados por las APC, entonces no se necesitan APC. Los agentes análogos que mimetizan la unión (i) o (ii) original a una molécula MHC son un ejemplo de estos agentes.
En una realización, se proporciona el agente a las APC en ausencia de la célula T. A continuación, se proporciona la APC a la célula T, típicamente tras haber permitido que presente el agente en su superficie. El péptido puede haber sido captado dentro de las APC y presentarse, o simplemente captarse en la superficie sin que entre dentro de la APC.
La duración durante la cual el agente se pone en contacto con las células T variará dependiendo del procedimiento usado para determinar el reconocimiento del péptido. Típicamente, se añaden de 10^{5} a 10^{7}, preferiblemente de 5 x 10^{5} a 10^{6} PBMC a cada ensayo. En el caso en que el agente se añade directamente al ensayo, su concentración es de 10^{-1} a 10^{3} \mug/ml, preferiblemente de 0,5 a 50 \mug/ml o de 1 a 10 \mug/ml.
Típicamente, la longitud de tiempo durante el cual las células T se incuban con el agente es de 4 a 24 horas, preferiblemente de 6 a 16 horas. Cuando se usan PBMC ex vivo, se ha encontrado que pueden incubarse 0,3 x 10^{6} PBMC en 10 \mug/ml de péptido durante 12 horas a 37ºC.
La determinación del reconocimiento del agente por las células T puede hacerse midiendo la unión del agente a las células T (esto puede realizarse usando cualquier formato de ensayo de unión adecuado descrito en este documento). Típicamente, las células T que se unen al agente puede clasificarse en base a esta unión, por ejemplo usando un aparato FACS. Se considerará que se da la presencia de células T que reconocen el agente, si la frecuencia de células clasificadas usando el agente está por encima de un valor "control". La frecuencia de células T que han tenido contacto con el antígeno generalmente es de 1 entre 10^{6} a 1 entre 10^{3} y, por tanto, puede determinarse si las células clasificadas son o no células T que han tenido contacto con el antígeno.
La determinación del reconocimiento del agente por las células T puede medirse in vivo. Típicamente, el agente se administra al hospedador y después puede medirse una respuesta que indique el reconocimiento del agente. Típicamente, el agente se administra por vía intradérmica o epidérmica. El agente típicamente se administra mediante el contacto con la parte externa de la piel y puede mantenerse en el sito con la ayuda de un adhesivo o vendaje. De forma alternativa, el agente puede administrarse mediante una aguja, tal como por inyección, pero también puede administrarse mediante otros procedimientos tales como balística (por ejemplo, las técnicas de balística que se han usado para suministrar ácidos nucleicos). El documento EP-A-0693119 describe técnicas que típicamente pueden usarse para administrar el agente. Típicamente, se administran de 0,001 a 1000 \mug, por ejemplo, de 0,01 a 100 \mug o de 0,1 a 10 \mug del agente.
En una realización, puede administrarse un producto que es capaz de proporcionar el agente in vivo. De este modo, puede administrarse un polinucleótido capaz de expresar el agente, típicamente por cualquiera de los medios descritos anteriormente para la administración del agente. Típicamente, el polinucleótido tiene cualquiera de las características del polinucleótido proporcionado por la invención que se describe a continuación. El agente se expresa in vivo a partir del polinucleótido. Típicamente, se administran de 0,001 a 1000 \mug, por ejemplo, de 0,01 a 100 \mug o de 0,1 a 10 \mug del polinucleótido.
Típicamente, el reconocimiento del agente administrado en la piel se indica mediante la aparición de inflamación (por ejemplo, induración, eritema o edema) en el lugar de la administración. Generalmente, esta se mide mediante el examen visual del sitio.
Típicamente, el procedimiento de diagnóstico basado en la detección de un anticuerpo que se une al agente se realizar poniendo en contacto una muestra del individuo (tal como cualquiera de las muestras mencionadas aquí, opcionalmente procesado de cualquiera de las formas mencionadas en este documento) con el agente y determinando si un anticuerpo de la muestra se une al agente, indicando dicha unión que el individuo tiene, o es susceptible de padecer enfermedad celiaca. Puede usarse cualquier formato adecuado de ensayo de unión, tal como cualquier formado mencionado en este documento.
Terapia
La identificación del epítope inmunodominante permite que se hagan los productos terapéuticos que se dirigen a las células T que reconocen este epítope (siendo estas células T las que participan en la respuesta inmune frente a gliadina). Este hallazgo también permite la prevención o el tratamiento de la enfermedad celiaca suprimiendo (mediante tolerización) una respuesta de anticuerpo o células T al epítope.
Ciertos agentes de la invención se unen al TCR que reconoce el epítope de la invención (según se mide usando cualquiera de los ensayos de unión descritos anteriormente) y causan la tolerización de la célula T que expresa el TCR. Estos agentes, opcionalmente en asociación con un vehículo, pueden usarse, por tanto, para prevenir o tratar la enfermedad celiaca.
Generalmente, puede causarse tolerización mediante los mismos péptidos que pueden causar (tras ser reconocidos por el TCR) la actividad funcional específica de antígeno de la célula T (tal como cualquier actividad mencionada en este documento, por ejemplo, la secreción de citocinas). Estos agentes causan la tolerización cuando son presentados al sistema inmune en un contexto "tolerizante".
La tolerización lleva a un descenso en el reconocimiento de un epítope de célula T o anticuerpo por el sistema inmune. En el caso de un epítope de célula T, esto puede originarse mediante la deleción o por anergia de las células T que reconocen el epítope. De este modo, desciende la actividad de la célula T (por ejemplo como se mide en ensayos adecuados mencionados en este documento) en respuesta al epítope. La tolerización de una respuesta anticorpal significa que se produce una cantidad disminuida de anticuerpo específico del epítope cuando se administra el epítope.
Se conocen procedimientos de presentación de antígenos al sistema inmune en este contexto y se describen, por ejemplo, en Yoshida y col. Clin. Immunol. Immunopathol. 82,207-215 (1997), Thurau y col. Clin. Exp. Immunol. 109,370-6(1997) y Weiner y col. Res. Immunol. 148,528-33 (1997). En particular, ciertas vías de administración pueden causar tolerización, tales como oral, nasal o intraperitoneal. Pueden administrarse al individuo productos particulares que causan tolerización (por ejemplo, en una composición que también comprende el agente). Estos productos incluyen citocinas, tales como citocinas que favorecen una respuesta Th2 (por ejemplo, IL-4, TGF-\beta o IL-10). Los productos o agentes pueden administrarse a una dosis que causa tolerización.
La invención proporciona una proteína que comprende una secuencia capaz de actuar como un antagonista de la célula T (la célula T que reconoce el agente). Estas proteínas y estos antagonistas también pueden usarse para prevenir o tratar la enfermedad celiaca. El antagonista causará un descenso en la respuesta de células T. En una realización, el antagonista se une al TCR de la célula T (generalmente en forma de complejo con HLA-DQ2) pero, en lugar de causar la activación funcional normal, causa una señal anómala que pasará a través de la cascada de señalización intracelular de TCR causando un descenso de la actividad funcional de la célula T (por ejemplo, en respuesta al reconocimiento de un epítope, típicamente según se mide mediante cualquier ensayo adecuado mencionado en este documento).
En una realización, el antagonista compite con el epítope para unirse con un componente de la ruta de procesamiento y presentación del MCH, tal como una molécula de MHC (típicamente HLA-DQ2). De este modo, el antagonista puede unirse a HLA-DQ2 (y, de este modo, ser un péptido presentado por esta molécula de MHC), tal como el péptido TP (Tabla 10) o un homólogo del mismo.
Los procedimientos para causar antagonismo son bien conocidos en la técnica. En una realización, el antagonista es un homólogo de los epítopes mencionados anteriormente y puede tener cualquiera de la secuencia, unión u otras propiedades del agente (particularmente análogos). Típicamente, los antagonistas difieren de cualquiera de los epítopes anteriores (que son capaces de dar lugar a una función específica de antígeno en la célula T) en 1, 2, 3, 4 o más mutaciones (cada una de las cuales puede ser una sustitución, inserción o deleción). Estos antagonistas se denominan en la técnica "ligandos peptídicos alterados" o "LPA". Típicamente, las mutaciones están en las posiciones de aminoácidos que entran en contacto con el TCR.
El antagonista puede diferir del epítope por una sustitución en la secuencia que es equivalente a la secuencia representado por los aminoácidos 65 a 67 de la A-gliadina (estos antagonistas se muestran en la Tabla 9). De este modo, preferiblemente el antagonista tiene una sustitución en el equivalente de las posiciones 64, 65 ó 67. Preferiblemente, las sustituciones son 64W, 67W, 67M o 65T.
Puesto que la respuesta inmune de células T frente al epítope de la invención en un individuo es policlonal, puede que sea necesario administrar más de un antagonista para causar antagonismo de células T de la respuesta que tiene diferentes TCR. Por tanto, los antagonistas pueden administrarse en una composición que comprende al menos 2, 4, 6 o más antagonistas diferentes, que antagonizan cada una células T diferentes.
La invención también proporciona un procedimiento para identificar un antagonista de una célula T (que reconoce al agente) que comprende poner en contacto una sustancia candidata con la célula T y detectar si la sustancia causa un descenso en la capacidad de la célula T para experimentar una respuesta específica de antígeno (por ejemplo, usando cualquier ensayo adecuado mencionado en este documento), indicando la detección de cualquiera de estos descensos en dicha capacidad que la sustancia es un antagonista.
En una realización, los antagonistas (incluyendo combinaciones de antagonistas de un epítope en particular) o los agentes tolerizantes (célula T y anticuerpo tolerizante) están presentes en una composición que comprende al menos 2, 4, 6 o más antagonistas o agentes que antagonizan o tolerizan a diferentes epítopes de la invención, por ejemplo, a las combinaciones de epítopes descritos anteriormente en relación con los agentes que son un producto que comprende más de una sustancia.
Comprobar si una composición es capaz de causar la enfermedad celiaca
Como se menciona anteriormente, la invención proporciona un procedimiento para determinar si una composición es capaz de causar la enfermedad celiaca que comprende detectar la presencia de una secuencia proteica que es capaz de ser modificada por una transglutaminasa en una secuencia que comprende el agente o epítope de la invención (esta actividad transglutaminasa puede ser una actividad transglutaminasa intestinal humana). Típicamente esto se realiza usando un ensayo de unión en el que se pone en contacto con la composición un resto que se une a la secuencia de una forma específica, se detecta la formación del complejo secuencia/resto y se usa para determinar la presencia del agente. Este resto puede ser cualquier sustancia adecuada (o tipo de sustancia) mencionada en este documento, y típicamente es un anticuerpo específico. Puede usarse cualquier formato adecuado de ensayo de unión (tal como los mencionados en este documento).
En una realización, la composición se pone en contacto con al menos 2, 5, 10 o más anticuerpos de diferentes gliadinas que son específicos de los epítopes de la invención, por ejemplo, un grupo de anticuerpos capaces de reconocer las combinaciones de epítopes descritas anteriormente en relación con agentes de la invención que son productos que comprende más de una sustancia.
Típicamente, la composición comprende material de una planta que expresa una gliadina que es capaz de causar la enfermedad celiaca (por ejemplo, cualquiera de las gliadinas o plantas mencionadas en este documento). Este material puede ser una parte de la planta, tal como un producto recolectado (por ejemplo, semillas). El material puede ser productos procesados del material vegetal (por ejemplo, cualquiera de estos productos mencionados en este documento), tales como una harina o alimento que contenga la gliadina. El procesamiento del material alimenticio y las pruebas y ensayos de unión adecuados son rutinarios, por ejemplo, como se menciona en Kricka LJ, J. Biolumin. Chemilumin. 13,189-93(1998).
Ensayos de unión
La determinación de la unión entre dos sustancias cualesquiera mencionadas en este documento puede hacerse midiendo una característica de una o de ambas sustancias que cambia tras la unión, tal como un cambio espectroscópico.
El formato del ensayo de unión puede ser un sistema de "desplazamiento de banda". Esto implica determinar si la presencia de una sustancia (tal como una sustancia candidata) favorece o retrasa el progreso de las otras sustancias durante la electroforesis en gel.
El formato puede ser un procedimiento de unión competitivo que determina si una sustancia es capaz de inhibir la unión de la otra sustancia a un agente del que se sabe que se une a la otra sustancia, tal como un anticuerpo específico.
Proteínas mutantes de gliadina
La invención proporciona una proteína gliadina en la que se ha mutado una secuencia de un epítope de la invención, o una secuencia que puede modificarse mediante una transglutaminasa para proporcionar esta secuencia, de modo que ya no causa, o es reconocida por, una respuesta de la célula T que reconoce el epítope. En este contexto, el término reconocimiento se refiera al TCR que se une al epítope de tal manera que tiene lugar una actividad funcional específica de antígeno normal (no antagonista) de la célula T.
Los procedimientos para identificar epítopes equivalentes en otras gliadinas se discuten anteriormente. El tipo silvestre de la gliadina mutada en uno de los que causa la enfermedad celiaca. Esta gliadina podrá tener homología con la SEC ID Nº 3, por ejemplo, en el grado mencionado anteriormente (en relación con el análogo) a lo largo de toda la SEC ID Nº 3 o a lo largo de 15, 30, 60, 100 ó 200 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 3.
La gliadina mutada no causará la enfermedad celiaca o causará síntomas reducidos de la enfermedad celiaca. Típicamente, la mutación disminuye la capacidad del epítope para inducir una respuesta de células T. El epítope mutado puede tener una unión reducida a HLA-DQ2, una capacidad reducida para ser presentado por una APC o una capacidad reducida para unirse o para ser reconocido (es decir, causar actividad funcional específica de antígeno) por las células T que reconocen el agente. Por tanto, la gliadina o el epítope mutado mostrarán un reconocimiento reducido o ningún reconocimiento en cualquiera de los ensayos mencionados en este documento en relación con los aspectos diagnósticos de la invención.
La mutación puede ser una o más deleciones, adiciones o sustituciones en el epítope de una longitud de 1 a 3, 4 a 6, 6 a 10, 11 a 15 o más, por ejemplo, a lo largo de la secuencia SEC ID Nº 2 o su equivalente. Preferiblemente, la gliadina mutada tiene al menos una mutación en la SED ID Nº 1. Una mutación preferida está en la posición 65 de la A-gliadina (o en una posición equivalente de otras gliadinas). Típicamente, la glutamina que aparece de forma natural en esta posición se sustituye por cualquiera de los aminoácidos mostrados en la Tabla 3, preferiblemente por histidina, tirosina, triptófano, lisina, prolina o arginina.
De este modo, la invención también proporciona el uso de una mutación (cualquiera de las mutaciones en cualquiera de las secuencias descritas en este documento) en un epítope de una proteína gliadina, cuyo epítope es un epítope de la invención, para reducir la capacidad de la proteína gliadina para causar la enfermedad celiaca.
En una realización, la secuencia mutada es capaz de actuar como un antagonista. De este modo, la invención también proporciona una proteína que comprende una secuencia que es capaz de unirse a un receptor de la célula T, cuyo receptor de célula T reconoce un agente de la invención y cuya secuencia es capaz de causar antagonismo de una célula T que expresa este receptor de célula T.
La invención también proporciona proteínas que son fragmentos de las anteriores proteínas gliadinas mutantes, que al menos tienen 15 aminoácidos de longitud (por ejemplo, al menos 30, 60, 100, 150, 200 ó 250 aminoácidos de longitud) y que contienen las mutaciones descritas anteriormente que reducen la capacidad de la gliadina para ser reconocida. Cualquiera de las proteínas mutadas (incluyendo fragmentos) mencionadas en este documento, también se presenta en forma de proteínas de fusión, por ejemplo, con otras gliadinas o con proteínas no gliadina.
Típicamente, la proteína de tipo silvestre equivalente a la proteína gliadina mutada es de una gramínea monocotiledónea, tal como una planta del género Triticum, por ejemplo, trigo, centeno, avena o triticale. Típicamente, la proteína es una gliadina \alpha, \alpha\beta, \gamma o \omega. La gliadina puede ser una A-gliadina.
Kits
La invención también proporciona un kit para realizar el procedimiento que comprende uno o más agentes y, de forma opcional, un medio para detectar el reconocimiento del agente por la célula T. Típicamente, se proporcionan los diferentes agentes para su uso de forma simultánea, independiente o secuencial. Típicamente, los medios para detectar el reconocimiento permiten o ayudan a la detección en función de las técnicas descritas anteriormente.
De este modo, los medios pueden permitir la detección de una sustancia secretada por las células T tras el reconocimiento. Así, el kit puede incluir de forma adicional un resto de unión específica al sustrato, tal como un anticuerpo. Típicamente, el resto es específico de IFN-\gamma. Típicamente, el resto está inmovilizado en un soporte sólido. Esto significa que tras la unión al resto, la sustancia se mantendrá en las proximidades de la célula T que la secreta. De este modo, se formarán ``manchas de complejo sustancia/resto en el soporte, representando cada mancha a una célula T que secreta la sustancia. La cuantificación de las manchas y, típicamente, la comparación con el control, permite la determinación del reconocimiento del agente.
El kit también puede comprende un medio para detectar el complejo sustancia/resto. Puede darse un cambio detectable en el propio resto después de la unión de la sustancia, tal como un cambio de color. De forma alternativa, puede permitirse que un segundo resto se una directa o indirectamente al complejo sustancia/resto para permitir la determinación de las manchas. Como se describe anteriormente, el segundo resto puede ser específico de la sustancia, pero unirse a un sitio diferente de la sustancia al del primer resto.
El soporte inmovilizado puede ser una placa con pocillos, tal como una placa de microvaloración. Por tanto, cada ensayo puede realizarse en un pocillo distinto de la placa.
Adicionalmente, el kit puede contener medio para las células T, restos de detección o tampones de lavado usados en las etapas de detección. Adicionalmente, el kit puede comprender reactivos adecuados para la separación de la muestra, tal como la separación de PBMC o de células T a partir de la muestra. El kit puede estar diseñado para que permita la detección de las células T directamente en la muestra sin que se requiera ninguna separación de los componentes de la muestra.
El kit puede comprender un instrumento que permita la administración del agente, tal como la administración intradérmica o epidérmica. Típicamente, tal instrumento comprende adhesivo, vendaje o una o más agujas. El instrumento puede permitir el suministro del agente. El agente en el kit puede estar en forma de una composición farmacéu-
tica.
El kit también puede comprender controles, tales como controles positivo y negativo. El control positivo puede permitir probar el sistema de detección. De esta manera, típicamente el control positivo mimetiza el reconocimiento del agente en cualquiera de los procedimientos anteriores. Típicamente, en los kits diseñados para determinar el reconocimiento in vitro, el control positivo es una citocina. En el kit diseñado para detectar el reconocimiento del agente in vivo, el control positivo puede ser un antígeno frente al que deberían responder la mayoría de los individuos.
El kit también puede comprender un medio para tomar una muestra que contiene células T a partir del hospedador, tal como una muestra de sangre. El kit puede comprender un medio para separar células mononucleares o células T a partir de una muestra del hospedador.
Polinucleótidos, células, mamíferos transgénicos y anticuerpos
La invención también proporciona un polinucleótido que es capaz de una expresión que proporciona el agente o proteínas gliadina mutantes. Típicamente, el polinucleótido es AND o ARN y es de cadena sencilla o doble. Preferiblemente, el polinucleótido comprenderá al menos 50 bases o pares de bases, por ejemplo, de 50 a 100, de 100 a 500, de 500 a 1000 o de 1000 a 2000, o más bases o pares de bases. Por tanto, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica la secuencia de SEC ID Nº 1 ó 2, o cualquiera de los agentes mencionados en este documento. En los extremos 5' y 3' de esta secuencia codificadora, el polinucleótido de la invención tiene una secuencia o codones que son diferentes de la secuencia o codones 5' y 3' de estas secuencias en el correspondiente gen de gliadina.
Los extremos 5' y/o 3' de la secuencia del polinucleótido que codifica el péptido, tienen una secuencia codificadora o no codificadora. La secuencia 5' y/o 3' de la secuencia codificadora puede comprender secuencias que ayudan a la expresión, tales como transcripción y/o traducción, de la secuencia que codifica el agente. El polinucleótido puede ser capaz de expresar el agente de la célula procariótica o eucariótica. En una realización, el polinucleótido es capaz de expresar el agente en una célula de mamífero, tal como una célula de humano, primate o roedor (por ejemplo, ratón o rata).
Un polinucleótido de la invención puede hibridar selectivamente con un polinucleótido que codifica la SED ID Nº 3 a un nivel significativamente por encima del fondo. Típicamente, la hibridación selectiva se logra usando condiciones altamente rigurosas del medio (por ejemplo, cloruro sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M desde aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC). Sin embargo, esta hibridación puede realizarse en cualquier condición adecuada conocida en la técnica (véase Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Por ejemplo, si se requiere alta rigurosidad, la condiciones adecuadas incluyen SSC x 0,2 a 60ºC. Si se requiere menor rigurosidad, las condiciones adecuadas incluyen SSC x 2 a 60ºC.
Los agentes o proteínas de la invención pueden estar codificados por los polinucleótidos descritos en este documento.
El polinucleótido puede formar parte o estar incorporado en un vector capaz de replicarse. Este vector es capaz de replicarse en una célula adecuada. El vector puede ser un vector de expresión. En tal vector, el polinucleótido de la invención está unido de forma operativa a una secuencia control que es capaz de proporcionar la expresión del polinucleótido. El vector puede contener un marcador seleccionable, tal como el gen de resistencia a ampicilina.
El polinucleótido o el vector pueden estar presentes en una célula. Esta célula puede haber sido transformada con el polinucleótido o el vector. La célula puede expresar el agente. Se elegirá la célula compatible con dicho vector y, por ejemplo, puede ser una célula procariótica (bacteria), levadura, insecto o de mamífero. El polinucleótido o el vector pueden introducirse en células hospedadoras usando técnicas convencionales incluyendo la precipitación con fosfato de calcio, la transfección con DEAE-dextrano o la electroporación.
La invención proporciona procedimientos para la producción de las proteínas de la invención por medios recombinantes. Esto puede comprender (a) cultivar una célula transformada como se define anteriormente en condiciones que permitan la expresión de la proteína y, preferiblemente (b) recuperar el polipéptido expresado. De forma opcional, el polipéptido puede aislarse y/o purificarse por técnicas conocidas en la materia.
La invención también proporciona TCR que reconocen (o se unen) al agente, o fragmentos del mismo, que son capaces de este reconocimiento (o unión). Estos puede estar presentes en cualquier forma mencionada en este documento (por ejemplo, pureza) descrita en este documento en relación con la proteína de la invención. La invención también proporciona célula T que expresan estos TCR que puede estar presentes en cualquier forma (por ejemplo, pureza) descrito en este documento para las células de la invención.
La invención también proporciona anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen de forma específica a los agentes (tales como cualquiera de los epítopes de la invención) y que reconocen a las proteínas gliadina mutantes (y típicamente que no reconocen a las gliadinas de tipo silvestre equivalentes) de la invención y procedimientos para hacer estos anticuerpos. Los anticuerpos de la invención se unen de forma específica a estas sustancias de la invención.
Para los fines de esta invención, el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fv, F(ab) y F(ab)_{2}, así como anticuerpos de cadena única.
Un procedimiento para producir un anticuerpo policlonal comprende inmunizar un animal hospedador adecuado, por ejemplo un animal de experimentación, con el inmunógeno y aislar las inmunoglobulinas a partir del suero. El animal puede, por tanto, inocularse con el inmunógeno, posteriormente se recoge la sangre del animal y se purifica la fracción IgG. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal comprende inmortalizar las células que producen el anticuerpo deseado. Las células del hibridoma puede producirse fusionando células del bazo de un animal experimental inoculado con células tumorales (Kohler y Milstein (1975) Nature 256, 495-497).
Puede seleccionarse una célula inmoralizada que produzca el anticuerpo deseado por un procedimiento convencional. Los hibridomas pueden crecerse en cultivos o inyectarse por vía intraperitoneal para la formación de líquido ascítico o en el torrente sanguíneo de un hospedador alogénico u hospedador inmunocomprometido. Pueden prepararse anticuerpos humanos por inmunización in vitro de linfocitos humanos, seguido de la transformación de los linfocitos con el virus de Esptein-Barr.
Para la producción tanto de anticuerpos monoclonales como policlonales, adecuadamente el animal de experimentación es una cabra, conejo, rata o ratón. Si se desea, puede administrarse el inmunógeno como un conjugado en el que el inmunógeno se une, por ejemplo, mediante una cadena lateral de uno de los restos de aminoácidos, a un vehículo adecuado. La molécula transvehículoa típicamente es un vehículo fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido puede aislarse y, si se desea, purificarse.
El polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo de la invención, puede llevarse a un nivel detectable. Se prefieren niveles detectables que permitan la detección de la sustancia secretada por inspección visual, de forma opcional con la ayuda de un medio de amplificación óptica. Típicamente, este sistema está basado en un marcador enzimático que causa cambio de color en un sustrato, por ejemplo, fosfatasa alcalina que causa un cambio de color en un sustrato. Estos sustratos están disponibles en el mercado, por ejemplo, de BioRad. Otros marcadores adecuados incluyen otras enzimas tales como peroxidasa o marcadores proteicos, tales como biotina, o radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S. Los marcadores anteriores puede detectarse usando técnicas conocidas.
Los polinucleótidos, agentes, proteínas, antibióticos o células de la invención pueden estar en forma sustancialmente purificada. Pueden estar en forma sustancialmente aislada, en cuyo caso generalmente comprenderán al menos el 80%, por ejemplo, al menos el 90, 95, 97 ó 99% del polinucleótido, péptido, anticuerpo, células o masa seca de la preparación. Típicamente, el polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo está sustancialmente libre de otros componentes celulares. El polinucleótido, agente, proteína o anticuerpo puede usarse en el procedimiento en esta forma sustancialmente aislada, purificada o libre o estar presente en el kit en estas formas.
La invención también proporciona un mamífero transgénico que expresa un TCR de la invención. Este puede ser cualquiera de los mamíferos descritos en este documento (por ejemplo, en relación con la producción del anticuerpo). Preferiblemente, el mamífero tiene, o es susceptible de padecer, la enfermedad celiaca. El mamífero también puede expresar HLA-DQ2 y/o puede dársele una dieta que comprende una gliadina que cause la enfermedad celiaca (por ejemplo, cualquiera de las proteínas gliadina mencionadas en este documento). De este modo, el mamífero puede actuar como un modelo animal de enfermedad celiaca.
La invención también proporciona un procedimiento para identificar un producto que es terapéutico para la enfermedad celiaca, que comprende administrar una sustancia candidata de la invención a un mamífero que tiene, o que es susceptible de padecer, la enfermedad celiaca y determinar si la sustancia previene o trata la enfermedad celiaca en el mamífero, indicando la prevención o tratamiento de la enfermedad celiaca que la sustancia es un producto terapéutico. Este producto puede usarse para tratar o prevenir la enfermedad celiaca.
La invención proporciona agentes terapéuticos (incluyendo profilácticos) o sustancias diagnósticas (los agentes, proteínas y polinucleótidos de la invención). Estas sustancias se formulan para su administración clínica mezclándolas con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, pueden formularse para la administración tópica, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, intradérmica, epidérmica o transdérmica. Las sustancias pueden mezclarse con cualquier vehículo que sea farmacéuticamente aceptable y apropiado para la ruta de administración deseada. El vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para inyección puede ser, por ejemplo, una solución estéril o isotónica tal como agua para inyección o solución salina fisiológica o una partícula transvehículoa para suministro balístico.
La dosis de la sustancias puede ajustarse según diversos parámetros, especialmente según el agente usado; la edad, peso y estado del paciente que va a ser tratado; el modo de administración usado; la gravedad de la afección que se va a tratar y el régimen clínico requerido. Como orientación, la cantidad de sustancia administrada mediante inyección es adecuadamente de 0,01 mg/kg a 30 mg/kg, preferiblemente de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg.
Las vías de administración y las dosificaciones descritas sólo pretenden ser una orientación ya que un experto será capaz de determinar fácilmente la vía óptima de administración y la dosificación para cualquier paciente y afección en particular.
Las sustancias de la invención pueden, de este modo, usarse en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal, o en un procedimiento diagnóstico ejercido en el cuerpo humano. En particular, pueden usarse en un procedimiento para tratar o prevenir la enfermedad celiaca. La invención también proporciona los agentes para su uso en un procedimiento de fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad celiaca.
El agente de la invención puede hacerse usando técnicas químicas sintéticas convencionales, tales como mediante en uso de un sintetizador automático. El agente puede hacerse a partir de un polipéptido más largo, por ejemplo, una proteína de fusión, cuyo polipéptido típicamente comprende la secuencia del péptido. El péptido puede derivar del polipéptido mediante, por ejemplo, hidrólisis del polipéptido, tal como usando una proteasa o mediante rotura fisiológica del polipéptido. El polinucleótido de la invención puede hacerse usando técnicas convencionales, tales como usando un sintetizador.
Células vegetales y plantas que expresan mutantes de proteínas gliadina o expresan proteínas que comprenden secuencias que pueden actuar como antagonistas
La célula de la invención puede ser una célula vegetal, tal como una célula de una especie de gramínea monocotiledónea. La especie puede ser una cuya forma silvestre exprese gliadinas, tales como cualquiera de las proteínas gliadina mencionadas en este documento (incluyendo gliadinas con cualquier grado de homología con la SEC ID Nº 3 mencionada en este documento). Esta gliadina puede causar la enfermedad celiaca en humanos. La célula puede ser de trigo, maíz, avena, centeno, arroz, cebada, triticale, sorgo o caña de azúcar. Típicamente, la célula es del género Triticum, tales como aestivum, spelta, polonicum o monococcum.
Típicamente, la célula vegetal de la invención es una que no expresa una gliadina de tipo silvestre (tales como cualquiera de las gliadinas mencionadas en este documento que pueden causar la enfermedad celiaca) o una que no expresa una gliadina que comprende una secuencia que puede ser reconocida por una célula T que reconoce al agente. De este modo, si la célula vegetal de tipo silvestre expresaba esta gliadina, después puede ser manipulada genéticamente para prevenir o reducir la expresión de esta gliadina o cambiar la secuencia de aminoácidos de la gliadina de modo que ya no cause la enfermedad celiaca (típicamente por no expresar ya el epítope de la inven-
ción).
Esto puede hacerse, por ejemplo, introduciendo mutaciones en 1, 2, 3 o más o en todos los genes de esta gliadina en la célula, por ejemplo, codificadores o no codificadores (por ejemplo, regiones promotoras). Estas mutaciones pueden ser de cualquiera de los tipos o longitudes de mutaciones descritas en este documento (por ejemplo, en relación con proteínas homólogas). Las mutaciones pueden introducirse de forma dirigida (por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitio o técnicas de recombinación homóloga) o de forma aleatoria (por ejemplo, usando un mutágeno y, típicamente a continuación, seleccionando células mutagenizadas que ya no expresan la gliadina (o una secuencia de gliadina que causa la enfermedad celiaca).
En el caso de plantas o células vegetales que expresan una proteína que comprende una secuencia capaz de actuar como antagonista, esta planta o célula vegetal puede expresar una proteína gliadina de tipo silvestre (por ejemplo, una que cause la enfermedad celiaca). Preferiblemente, auque la presencia de la secuencia antagonista causará la reducción de los síntomas de la enfermedad celiaca (tal como sin síntomas) en un individuo que ingiere un alimento que contiene la proteína de una planta o célula vegetal.
El polinucleótido que está presente en la célula vegetal (o que ha sido transformado en ésta), generalmente comprenderá un promotor capaz de expresar la proteína gliadina mutante en la célula vegetal. Dependiendo del patrón de expresión deseada, el promotor puede ser constitutivo, específico de tejido o fase y/o inducible. Por ejemplo, puede obtenerse una potente expresión constitutiva en plantas con los promotores CAMV 35S, Rubisco ssu o de histona. También, pueden usarse promotores específicos de tejido o específicos de etapa para dirigir la expresión de la proteína de la invención a un tejido en particular de una planta transgénica o en una fase en particular de su desarrollo. De este modo, por ejemplo pueden usarse promotores específicos de semillas, específicas de raíces, específicas de hojas, específicas de flores, etc. Los promotores específicos de semillas incluyen aquellos descritos por Dalta y col. (Biotechnology Ann. Rev. (1997), 3, pág. 269-296). Ejemplos en particular de promotores específicos de semillas son los promotores napin (documento EP-A-0 255.378), promotores de faseolina, promotores de glutenina, promotores de heliantenina (documentos WO92/17580), promotores de albúmina (documento WO98/45460), promotores de oleosina (documento WO98/45461) y promotores de ATS1 y ATS3 (documento PCT/US98/06798).
La célula puede estar en cualquier forma. Por ejemplo, puede ser una célula aislada, por ejemplo, un protoplasto, o puede ser parte de un tejido vegetal, por ejemplo, un callo o un tejido escindido de una planta o puede ser parte de una planta completa. La célula puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, de cualquier parte de la planta). Por ejemplo, una célula indiferenciada, tal como una célula de un callo, o una célula diferenciada, tal como una célula de un tipo encontrado en embriones, polen, raíces, brotes u hojas. Las partes de la planta incluyen raíces, brotes, hojas y las partes implicadas en la reproducción, tales como polen, óvulo, anteras, pétalos, sépalos y otras partes de la flor.
La invención proporciona un procedimiento para obtener una célula vegetal transgénica que comprende la transformación de una célula vegetal con un polinucleótido o vector de la invención para obtener una célula vegetal transgénica. Puede usarse cualquier procedimiento de transformación adecuado (en el caso del trigo, pueden usarse las técnicas descritas en Vasil y col., Biotechnology 10,667-674 (1992). Las técnicas de transformación preferidas incluyen electroporación de los protoplastos de la planta y bombardeo de partículas. De este modo, la transformación pude dar lugar a un tejido o planta quimérica en la que algunas células son transgénicas y otras no.
La célula de la invención o la célula obtenida de este modo puede regenerarse en una planta transgénica por técnicas conocidas en la materia. Estas pueden implicar el uso de sustancias para el crecimiento de plantas tales como auxinas, giberelinas y/o citocinas para estimular el crecimiento y/o división de la célula transgénica. De forma similar, puede usarse técnicas tales como embriogénesis somática y cultivo de meristemos. Son bien conocidas en la materia las técnicas de regeneración y puede encontrarse ejemplos en, por ejemplo, los documentos US 4.459.355, US 4.536.475, US 5.464.763, US 5.177.010, US 5.187.073, EP 267.159, EP 604.662, EP 672.752, US 4.945.050, US 5.036.006, US 5.100.792, US 5.371.014, US 5.478.744, US 5.179.022, US 5.565.346, US 5.484.956, US 5.508.468, US 5.538.877, US 5.554.798, US 5.489.520, US 5.510.318, US 5.204.253, US 5.405.765, EP 442.174, EP 486-233, EP 486-234, EP 539-563, EP 674-725, W0 91/02071 y WO 95/06128.
En muchas de estas técnicas, una etapa es la formación de un callo, es decir, un tejido vegetal que comprende células en expansión y/o en división. Estos callos son un aspecto adicional de la invención, como lo son otros tipos de cultivos de células vegetales y de partes de plantas. De este modo, por ejemplo, la invención proporciona tejidos y partes de plantas transgénicas, incluyendo embriones, meristemos, semillas, brotes, raíces, tallos y partes de la flor. Éstas pueden ser quiméricas en el sentido de que algunas de sus células son células de la invención y algunas no lo son. Las partes y tejidos de plantas transgénicas, plantas y semillas de la invención pueden ser de cualquiera de las especies vegetales mencionadas en este documento.
Típicamente, los procedimientos de regeneración implicarán la selección de células transformadas por medio de genes marcadores.
La etapa de regeneración origina una primera generación de plantas transgénicas. La invención también proporciona procedimientos para obtener plantas transgénicas de generaciones sucesivas a partir de esta primera generación de plantas. Éstas se conocen como progenie de plantas transgénicas. Pueden obtenerse progenies de plantas de segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y posteriores generaciones a partir de la primera generación de plantas transgénicas mediante cualquier medio conocido en la técnica.
De este modo, la invención proporciona un procedimiento para obtener una progenie de planta transgénica que comprende obtener una segunda generación de progenie de plantas transgénicas, a partir de una primera generación de plantas transgénicas de la invención y, opcionalmente, obtener plantas transgénicas de una o más generaciones posteriores a partir de la progenie de la planta de segunda generación obtenido de este modo.
La progenie de plantas puede producirse a partir de sus predecesores de generaciones anteriores mediante cualquier técnica conocida. En particular, la progenie de plantas puede producirse mediante:
la obtención de una semilla transgénica a partir de una planta transgénica de la invención que pertenece a una generación previa, la obtención, a continuación, de una progenie de plantas transgénicas de la invención que pertenece a una nueva generación, mediante el crecimiento de la semilla transgénica; y/o
la propagación clonal de una planta transgénica de la invención que pertenece a una generación previa para dar una progenie de plantas transgénicas de la invención que pertenece a una nueva generación; y/o
el cruzamiento de una primera generación de plantas transgénicas de la invención que pertenece a una generación previa con otra planta compatible para obtener una progenie de plantas transgénicas de la invención que pertenece a una nueva generación; y, opcionalmente,
la obtención de progenies de plantas transgénicas de una o más generaciones posteriores a partir de la progenie de plantas obtenidas de esta manera.
Estas técnicas pueden usarse en cualquier combinación. Por ejemplo, la propagación clonal y la propagación sexual puede usarse en diferentes puntos de un procedimiento que da lugar a una planta transgénica adecuada para el cultivo. En particular, puede emprenderse el retrocruzamiento repetitivo con un taxón vegetal con características agronómicamente convenientes. También pueden realizarse etapas adicionales de extracción de células de una planta y de regeneración de nuevas plantas a partir de éstas.
También puede introducirse características adicionales convenientes mediante la transformación de las células, tejidos vegetales, plantas o semillas, en cualquier etapa adecuada en el procedimiento anterior, para introducir secuencias codificadoras deseables distintas de los polinucleótidos de la invención. Esto puede realizarse mediante las técnicas descritas en este documento para la introducir de polinucleótidos de la invención.
Por ejemplo, pueden seleccionarse transgenes adicionales a partir de los que codifican otras características de resistencia a herbicidas, por ejemplo, tolerancia a: Glifosato (por ejemplo, usando un gen de sintetasa EPSP (por ejemplo, el documento EP-A-0 293.358) o un gen de una glifosato oxidorreductasa (documento WO 92/000377); o tolerancia a fosametina; un dihalobenzonitrilo; glufosinato, por ejemplo, usando un gen de una fosfinotricina acetil transferasa (PAT) o de glutamina sintetasa (cf. documento EP-A-0 242.236); asulam, por ejemplo, usando un gen de una dihidropteroato sintetasa (documento EP-A-0 369.367); o una sulfonilurea, por ejemplo, usando un gen ALS; difenil ésteres tales como acifluorfen u oxifluorfeno, por ejemplo usando un gen de una protoporfireno oxidasa; un oxodiazol tal como oxodiazón, una imida cíclica tal como cloroftalima; un fenil pirazol tal como TNP, o un análogo de fenopilato o carbamato de los mismos.
De forma similar, se pueden introducir genes de propiedades beneficiosas diferentes a la tolerancia a herbicida. Por ejemplo, se pueden introducir genes de resistencia a insectos, en particular genes que codifican toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt). Asimismo, se pueden introducir genes de resistencia a enfermedades, por ejemplo, como en el documento W091/02701 o W095/06128.
Típicamente, una proteína de la invención se expresa en una planta de la invención. Dependiendo del promotor usado, esta expresión puede ser constitutiva o inducible. De forma similar, puede ser específica de tejido o de etapa, es decir, dirigida hacia un tejido vegetal particular (como cualquiera de los tejidos mencionados en este documento) o una etapa del desarrollo de la planta.
La invención también proporciona procedimientos de obtención de productos vegetales mediante recolección, y opcionalmente, por procesamiento adicional, de plantas transgénicas de la invención. Por producto vegetal se entiende cualquier producto útil que se puede obtener de una planta en cultivo.
Productos que contienen proteínas gliadinas mutantes o proteínas que comprenden una secuencia capaz de actuar como un antagonista
La invención proporciona un producto que comprende las proteínas gliadinas mutantes o una proteína que comprende una secuencia capaz de actuar como un antagonista. Típicamente Este deriva de, o comprende, partes de la planta de plantas mencionadas en este documento que expresan estas proteínas. Este producto puede obtenerse directamente mediante recolección o indirectamente, mediante recolección y procesamiento adicional de la planta de la invención. Los productos que se pueden obtener directamente incluyen granos. De forma alternativa, este producto puede obtenerse indirectamente, mediante recolección y procesamiento adicional. Ejemplos de productos que se pueden obtener mediante procesamiento adicional son harina o bebidas alcohólicas destiladas; productos alimenticios hechos a partir del material obtenido directamente o procesado adicionalmente, por ejemplo, productos horneados (por ejemplo, pan) hechos a partir de la harina. Típicamente, estos productos alimenticios, pueden ser ingeridos y digeridos (es decir, no tóxicos y de valor nutritivo) por individuos humanos.
En el caso de los productos alimenticios que comprenden la proteína que comprende una secuencia antagonista, el producto alimenticio también puede comprender una gliadina de tipo silvestre, pero preferiblemente el antagonista es capaz de causar una reducción (por ejemplo, completamente) en los síntomas de la enfermedad celiaca después de ingerir este alimento.
La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos:
Ejemplo 1
Hemos realizado el mapeo de epítopes de la enfermedad celiaca mediante el uso de un conjunto de 51 péptidos sintéticos 15-mer que abarcan la secuencia completa de una a-gliadina completamente caracterizada, "A-gliadina" (véase la Tabla 1). Los péptidos de A-gliadina se trataron también individualmente con tTG para generar productos que podrían mimetizar esos productos in vivo^{3}. También buscamos estudiar pacientes con enfermedad celiaca en el momento del inicio de la recaída de la enfermedad para evitar la posibilidad de que pueda producirse la "extensión" o el "agotamiento" del epítope, como se describe en enfermedades infecciosas y autoinmunes experimentales.
Respuestas clínica y de células T específicas de A-gliadina con 3 y 10 días de estimulación con pan
En un estudio piloto, dos sujetos con enfermedad celiaca en remisión, definida por la ausencia de anticuerpos anti-endomisio en suero (EMA), o una dieta sin gluten, se alimentaron diariamente con cuatro rebanadas de pan blanco que contenía gluten convencional además de su dieta normal sin gluten. El Sujeto 1 dejó el pan después de tres días debido a dolor abdominal, úlceras en la boca y diarrea leve, pero el Sujeto 2 continuó durante 10 días con sólo nausea leve en una semana. Los EMA se hicieron positivos en el Sujeto 2 una semana después de la estimulación con pan, lo que indica que el pan usado había causado una recaída de la enfermedad celiaca. Pero en el Sujeto 1, los EMA se mantuvieron negativos hasta dos meses después de la estimulación con pan. En ambos sujetos, los síntomas que aparecieron con la estimulación con pan se resolvieron después de dos días de volver a la dieta sin gluten.
No se encontraron respuestas de PBMC en ensayos de ELISPOT para IFN\gamma frente a péptidos de A-gliadina antes o durante la estimulación con pan. Pero desde el día después de la retirada del pan (Día 4) en el Sujeto 1 una única mezcla de 5 péptidos solapantes que abarcaban A-gliadina 51-85 (Mezcla 3) tratado con tTG mostró una potente respuesta de IFN\gamma (véase la Figura 1a). En el Sujeto 1, la respuesta de IFN\gamma de PBMC frente al péptido de A-gliadina se mantenía dirigida sólo a la Mezcla 3 y era máximo el Día 8. Las dinámicas y la magnitud de la respuesta frente a la Mezcla 3 eran similares a la desencadenada por gliadina digerida con \alpha-quimiotripsina. Las respuestas de IFN\gamma de PBMC frente a la Mezcla 3 tratada con tTG eran sistemáticamente de 5 a 12 veces mayores que frente a la Mezcla 3 sin trata con tTG, y las respuestas frente a una gliadina digerida con \alpha-quimiotripsina era de 3 a 10 veces mayor si se trataba con tTG. En el Sujeto 2, la Mezcla 3 tratada con tTG fue también el único grupo inmunogénico de péptidos de A-gliadina el Día 8, pero esta respuesta era más débil que la del Sujeto 1, no se veía el Día 4 y el Día 11 la respuesta frente a la Mezcla 3 había disminuido y otras mezclas tratadas con tTG de péptidos A-gliadina desencadenaba respuestas de IFN\alpha más fuertes (véase la Figura 1b).
El estudio piloto indicaba que la respuesta de células T inicial en estos sujetos con enfermedad celiaca se producía frente a una única mezcla de cinco péptidos de A-gliadina tratadas con tTG y se medía fácilmente en sangre periférica. Pero si la exposición al antígeno se continuaba durante diez días en lugar de tres, aparecen respuestas de células T frente a otros péptidos de A-gliadina, de acuerdo con la extensión del epítope.
Inducción de IFN-\gamma específico de la enfermedad celiaca mediante péptidos de A-gliadina tratados con tTG
En cinco de seis sujetos más con enfermedad celiaca con dieta sin gluten (véase la Tabla 1), la estimulación con pan durante tres días permitía identificar péptidos tratados con tTG en la Mezcla 3, y en especial, los péptidos que correspondían con 56-70 (12) y 60-75 (13) como los únicos componentes de A-gliadina que desencadenaban el IFN\gamma a partir de PBMC (véase la Figura 2). Los ensayos de ELISPOT para IL-10 realizados en paralelo con el ELISPOT para IFN\gamma no mostraron respuesta de IL-10 frente a los péptidos 12 o 13 tratados con tTG. En un sujeto, no había respuestas de IFN\gamma frente a ningún péptido de A-gliadina o a la gliadina digerida con \alpha-quimiotripsina antes, durante o hasta cuatro días después de la estimulación con pan. En ninguno de estos sujetos con enfermedad celiaca cambió el estado de los EMA con respecto al valor basal cuando se midió durante dos meses después de la estimulación con pan.
Los PBMC de cuatro sujetos sanos negativos para EMA con los alelos HLA-DQ \alpha1*0501, \beta1*0201 (2 mujeres de 28 y 52 años) que habían sido estimulados durante tres días con pan después de seguir una dieta sin gluten durante un mes, no mostraron respuestas de IFN\gamma por encima del control negativo frente a ninguno de los péptidos A-gliadina con o sin tratamiento con tTG. De este modo, la inducción de IFN\gamma en PBMC frente a la Mezcla 3 tratada con tTG y a los péptidos de A-gliadina 56-70 (12) y 60-75 (13) era específica de la enfermedad celiaca (7/8 vs 0/4, p<0,01 mediante análisis de Chi-cuadrado).
Mapeo fino del epítope mínimo de células T de A-gliadina
Los péptidos tratados con tTG que representan truncamientos de A-gliadina 56-75 revelaron que la misma secuencia peptídica central ( QPQLP) era esencial para la antigenicidad en los cinco sujetos con enfermedad celiaca valorados (véase la Figura 3). Las respuestas de IFN\gamma de PBMC frente a péptidos tratados con tTG que abarcan esta secuencia central que comienza con el 7-mer PQPQLPY y que aumenta en longitud, indicaba que el 17-mer tratado con tTG, QLQPFPQPQLPYPQPQS (A-gliadina 57-73) poseía actividad óptima en el ELISPOT para IFN\gamma (véase la Figura 4).
La desamidación de Q65 por tTG genera el epítope de células T inmunodominante en A-gliadina
El análisis por HPLC demostró que el tratamiento de la A-gliadina 56-75 con tTG generaba un único producto que eluía ligeramente más tarde que el péptido parental. La secuenciación de aminoácidos indicaba que de entre los seis restos de glutamina (Q) que contenían la A-gliadina 56-75, la Q65 se desanidada preferentemente con tTG (véase la Figura 5). La bioactividad de los péptidos que corresponden a expansiones seriadas de la secuencia central de A-gliadina 62-68 en la que el glutamato (E) se sustituía por Q65, era equivalente a los mismos péptidos con Q65 después del tratamiento con tGT (véase la Figura 4a). La sustitución conjunta o única de Q57 y Q72 por E, junto con E65 no potenciaba la antigenicidad del 17-mer en los tres sujetos con enfermedad celiaca estudiados (véase la Figura 6). Se investigaron Q57 y Q72 porque los restos de glutamina seguidos de prolina en los péptidos de gliadina no se desaminan con tTG in vitro (W. Vader y col, Actas del 8º Simposio Internacional de Enfermedad Celiaca). Por tanto, el epítope inmunodominante de células T se definió como QLQPFPQPELPYPQPQS.
La respuesta del epítope inmunodominante de células T está restringido a DQ2 y es dependiente de CD4
En dos sujetos con enfermedad celiaca homocigotos para HLA-DQ \alpha1*0501, \beta1*0201, el anticuerpo monoclonal anti-DQ bloqueaba la respuesta de INF\gamma en ELISPOT frente a A-gliadina 56-75 tratado con tTG, pero no los anticuerpos anti-DP y anti-DR (véase la Figura 7). La depleción de PBMC con perlas magnéticas anti-CD4 y anti-CD8 de dos sujetos con enfermedad celiaca indicaba que la respuesta de IFN\gamma a A-gliadina 56-75 tratado con tTG está mediada por células T CD4.
Discusión
En este estudio describimos una estimulación con un antígeno alimenticio muy simple usando pan blanco convencional para desencadenar una población transitoria de células T CD4 en la sangre periférica de sujetos con enfermedad celiaca sensibles a un A-gliadina 17-mer tratado con tTG con la secuencia: QLQPFPQPELPYPQPQS (restos 57-73). La respuesta inmune a A-gliadina 56-75 (Q-E65) está restringida al alelo de HLA asociado con la enfermedad celiaca, DQ \alpha1*0501, \beta1*0201. La actividad transglutaminasa tisular in vitro desamida selectivamente Q65. Las respuestas de IFN\gamma en sangre periférica desencadenadas frente a los péptidos sintéticos de A-gliadina con la sustitución Q-E65, son equivalentes a la de los péptidos Q65 de A-gliadina tratados con tTG; ambos estimulan hasta 10 veces más las células T en el ELISPOT para IFN\gamma que los péptidos QE65 de A-gliadina.
Hemos definido deliberadamente este epítope de células T específico de la enfermedad celiaca usando la estimulación antigénica in vivo y ensayos inmunes ex vivo a corto plazo para evitar la posibilidad de artefactos metodológicos que se puedan producir con el uso de clones de células T en el mapeo del epítope. Nuestros hallazgos indican que las respuestas de células T de sangre periférica frente a la ingestión de gluten son rápidas pero de vida corta y pueden utilizarse para el mapeo del epítope. La estimulación antigénica in vivo ha demostrado también que hay una jerarquía temporal de respuestas inmunes frente a péptidos de A-gliadina; A-gliadina 57-73 modificada por tTG no sólo desencadena la respuesta de IFN\gamma más fuerte en PBMC, sino que también es la primera respuesta de IFN\gamma en aparecer.
Puesto que hemos ensayado solo péptidos que abarcan a la A-gliadina, puede haber otros epítopes en otras gliadinas de igual o mayor importancia en la patogénesis de la enfermedad celiaca. De hecho, la secuencia peptídica en el núcleo del epítope en la A-gliadina que hemos identificado (PQPQLPY) es compartida por otras gliadinas diversas (números de acceso de SwissProt y Trembl: P02863, Q41528, Q41531, Q41533, Q9ZP09, P04722, P04724, PI8573). Sin embargo, los péptidos de A-gliadina que previamente han demostrado poseer bioactividad en estimulación de biopsia y en estudios in vivo (por ejemplo: 31-43, 44-55 y 206-217)^{4,5} no desencadenaban respuestas de IFN\gamma en PBMC después de los tres días de estimulación con pan en sujetos con enfermedad celiaca. Estos péptidos pueden ser epítopes "secundarios" de células T que aparecen con la extensión de la respuesta inmune.
Ejemplo 2
El efecto sobre el reconocimiento de células T de sustituciones en el epítope inmunodominante
El efecto de sustituir el glutamato de la posición 65 en el epítope de A-gliadina 57-73 se determinó midiendo las respuestas en sangre periférica frente a los epítopes sustituidos en un ensayo de ELISPOT para IFN\gamma usando péptidos sintéticos (a 50 pg/ml). Las respuestas se midieron en 3 sujetos con enfermedad celiaca 6 días después de comenzar la estimulación con gluten (4 rebanadas de pan diarias durante 3 días). Los resultados se muestran en la Tabla 3 y en la Figura 8. Como puede verse, la sustitución del glutamato por histidina, tirosina, triptófano, lisina, prolina o arginina estimulaba una respuesta cuya magnitud era de menos del 10% de la magnitud de la respuesta al epítope inmunodominante. De este modo, podría usarse la mutación de A-gliadina en esta posición para producir una gliadina mutante con inmunoreactividad reducida o ausente.
Ejemplo 3
Ensayo de la inmunorreactividad de péptidos equivalentes de otras gliadinas que aparecen de forma natural
La inmunoreactividad de otros péptidos equivalentes de otras gliadinas de trigo que aparecen de forma natural se valoró usando péptidos sintéticos que corresponden a las secuencias naturales que, a continuación, se trataban con transglutaminasa. Estos péptidos se ensayaron en un ELISPOT de la misma manera y con PBMC de los mismos sujetos, como se describe en el Ejemplo 2. Al menos cinco de los péptidos mostraron inmunoreactividad comparable al péptido de A-gliadina 57-73 E65 (tras el tratamiento con transglutaminasa) lo que indicaba que otras proteínas gliadinas en el trigo es probable también que induzcan esta respuesta inmune específica de la enfermedad celiaca (Tabla 4 y Figura 9).
Procedimientos
Sujetos: Los pacientes usados en el estudio acudían a la Clínica Celiaca en Oxford, Reino Unido. La enfermedad celiaca se diagnosticó en función de la histología típica del intestino delgado y a la normalización de síntomas e histología del intestino delgado con dieta sin gluten.
Tipaje tisular: El tipaje tisular se realizó usando ADN extraído de sangre periférica con EDTA como anticoagulante. El genotipaje de HLA-DQA y DQB se realizó mediante PCR usando mezclas de cebadores específicos de secuencia^{6-8}.
Ensayo de anticuerpos antiendomisio: Los EMA se detectaron mediante inmunofluorescencia indirecta usando suero de pacientes diluido 1: 5 con esófago de mono, seguido de IgA de cabra anti-humano conjugado con FITC. Se cuantificó la IgA antes que los EMA, y ninguno de los sujetos era deficiente en IgA.
Estimulación antigénica: Los sujetos con enfermedad celiaca que siguieron una dieta sin gluten, consumieron 4 rebanadas de pan que contenía gluten (50 g/rebanada, "pan blanco de sándwich convencional" de Sainsbury) diariamente durante 3 ó 10 días. Los EMA se valoraron la semana antes y hasta dos meses después de comenzar la estimulación con pan. Los sujetos sanos que habían seguido una dieta sin gluten durante cuatro semanas, consumieron su dieta habitual que incluía cuatro rebanadas de pan con gluten durante tres días, y luego volvieron a la dieta sin gluten durante seis días más.
ELISPOT para IFN\gamma e IL-10: Se prepararon PBMC a partir de 50-100 ml de sangre venosa mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. Después de tres lavados, las PBMC se resuspendieron en RPMI completo que contenía un 10% de suero AB humano inactivado mediante calentamiento. Los ensayos de ELISPOT para la secreción de IFN\gamma e IL-10 de una única célula se realizaron usando kits comerciales (Mabtech, Estocolmo, Suecia) con placas de 96 pocillos (MAIP-S-45; Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante (como se describe previamente^{9}) con 2-5 x 10^{5} (IFN\gamma) o 0,4-1 x 10^{5} (IL-10) PBMC en cada pocillo. Los péptidos se valoraron en pocillos por duplicado y se incluyó en todos los ensayos un derivado de una proteína purificada de Mycobacterium tuberculosis (PPD RT49) (Serum Institute; Copenhague, Dinamarca) (20 pg/ml) como control positivo.
Péptidos: Los péptidos sintéticos se adquirieron en el Research Genetics (Huntsville, Alabama), verificándose la autenticidad de los péptidos por espectroscopia de masa y HPLC y con >70% de pureza. La digestión de gliadina (Sigma; G-3375) (100 mg/ml) con \alpha-quimiotripsina (Sigma; C-3142) 200: 1 (p/p) se realizó a temperatura ambiente en NH_{4}HCO_{3} 0,1 M con urea 2 M y se paró después de 24 h por calentamiento a 98ºC durante 10 minutos. Tras la centrifugación (13.000g, 10 minutos), el sobrenadante de la digestión de la gliadina se esterilizó por filtración (0,2 \mum). La digestión de la gliadina se verificó por SDS-PAGE y se valoró la concentración de proteína. La gliadina digerida con \alpha-quimiotripsina (640 \mug/ml) y los péptidos de gliadina sintéticos (15-mer: 160 \mug/ml, otros péptidos: 0,1 mM) se trataron individualmente con tTG (Sigma; T-5398) (50 \mug/ml) en PBS+CaCl_{2} 1 mM durante 2 h a 37ºC. Los péptidos y las mezclas de péptidos se alicuotaron en placas de 96 pocillos estériles y se almacenaron congelados a -20ºC hasta su uso.
Secuenciación de aminoácidos de los péptidos: Se usó HPLC en fase inversa para purificar el péptido resultante del tratamiento de la A-gliadina 56-75 con tTG. Se identificó un único producto y se sometió a secuenciación de aminoácidos (secuenciador automático Modelo 494A, Applied Biosystems, Foster City, California). Se confirmó que la secuencia de G56-75 sin modificar era: LQLQPFPQPQLPYPQPQSFP, y G56-75 tratado con tTG se identificó como: LQLQPFPQPELPYPQPQSFP. La desamidación de restos glutamilo se identificó como la cantidad (pmoles) de glutamato recuperado, expresado como porcentaje de la cantidad combinada de glutamina y glutamato recuperado en los ciclos 2, 4, 8, 10, 15 y 17 de la secuenciación de aminoácidos. La desamidación atribuible a tTG se definió como (% de desamidación de glutamina en el péptido tratado con tTG - % de desamidación en el péptido sin tratar)/(100 - % de desamidación en el péptido sin tratar).
CD4/CD8 y restricción a HLA de clase II: Después de la incubación con PBMC en RPMI completo con suero humano al 10%, inactivado mediante calentamiento (5 x 10^{6} células/ml) durante 30 minutos en hielo, las perlas magnéticas recubiertas con anti-CD4 o anti-CD8 (Dynal, Oslo, Noruega) se lavaron cuatro veces con RPMI. Las perlas se retiraron usando un imán y se contaron las células restantes. La restricción a HLA de clase II in vivo de la respuesta inmune frente a A-gliadina 56-75 tratada con tTG se estableció incubando PBMC (5 x 10^{6} células/ml) con anticuerpos monoclonales anti-HLA-DR (L243), anti-DQ (L2) y anti–DP (B7.21) (10 \mug/ml) a temperatura ambiente durante una hora antes de la adición del péptido.
Ejemplo 4
Expresión de integrinas de la mucosa por linfocitos de sangre periférica específicos de gliadina
Las interacciones entre adresinas de endotelio y de linfocitos facilitan el alojamiento de linfocitos específicos de órgano. Se conocen muchas adresinas. El heterodímero \alpha_{4}\beta_{7} es específico de la lámina propia del intestino y de otros linfocitos de mucosa y el \alpha^{E}\beta_{7} es específico de linfocitos intraepiteliales en intestino y piel. Aproximadamente el 30% de las células T CD4 de sangre periférica expresan \alpha_{4}\beta_{7} y se supone que están en tránsito a un sitio de la mucosa, mientras que el 5% de las células T de sangre periférica expresan \alpha^{E}\beta_{7}. Las perlas inmunomagnéticas recubiertas con anticuerpo específico para \alpha^{E} o \beta_{7}, depleciona las PBMC de células que expresan \alpha^{E}\beta_{7} o \alpha^{E}\beta_{7} y \alpha_{4}\beta_{7}, respectivamente. En combinación con el ensayo de ELISPOT, la depleción con perlas inmunomagnéticas permite la determinación de la expresión de adresinas en células T específicas de gliadina, que pueden identificar a estas células como alojadas en una superficie mucosa. De manera interesante, la estimulación con gluten in vivo se asocia con un rápido influjo de células T CD4 a la lámina propia del intestino delgado (no a sitios intraepiteliales), donde aproximadamente el 90% de los linfocitos expresan \alpha_{4}\beta_{7}.
Se prepararon las perlas inmunomagnéticas y se usaron para deplecionar los PBMC de sujetos celiacos el día 6 ó 7 después de comenzar los 3 días de estimulación con gluten. El análisis por FACS demostró que las perlas \alpha^{E} deplecionaban aproximadamente el 50% de las células T CD4 positivas, mientras que las perlas \beta_{7} deplecionaban todas las células T CD4 \beta_{7} positivas. La depleción de PBMC usando perlas CD4 o \beta_{7}, pero no perlas CD8 o \alpha^{E}, suprimía las respuestas en el ELISPOT para interferón gamma. Las respuestas frente a gliadina tTG y a PPD se suprimían mediante la depleción de CD4, pero estaba afectada sistemáticamente por la depleción con perlas específicas de integrinas.
De este modo, las células T específicas de A-gliadina 57-73 QE65 inducidas tras la estimulación con gluten en la enfermedad celiaca expresan la integrina \alpha_{4}\beta_{7}, presente en las células T CD4 de la lámina propia en el intestino delgado.
Ejemplo 5
Longitud óptima del epítope de células T
Datos anteriores que analizan péptidos de 7 a 17 aminoácidos de longitud que abarcan el núcleo del epítope de células T dominante en la A-gliadina, indican que el 17-mer, A-gliadina 57-73 QE65 inducía las respuestas máximas en el ELISPOT para interferón gamma usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios celiacos a los 6 días después de comenzar una estimulación de 3 días con gluten.
Los péptidos que representan formas de expansión de la secuencia central del epítope de células T dominante en la A-gliadina se valoraron en ELISPOT para IFN gamma usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios celiacos a los 6 días después de comenzar una estimulación de 3 días con gluten (n=4). Péptido 13: A-gliadina 59-71 QE65(13-mer), péptido 15: 58-72 QE65(15-mer),..., péptido 27: 52-78 QE65 (27-mer).
Como se muestra en la Figura 11, la expansión de la secuencia del A-gliadina 57-73 QE65 no potencia sustancialmente la respuesta en el ELISPOT para IFN gamma. Los posteriores ejemplos caracterizan la actividad agonista y antagonista del A-gliadina 57-73 QE65 usando péptidos 17-mer.
Ejemplo 6
Comparación del A-gliadina 57-73 QE65 con otros epítopes de células T restringidos a DQ2 en la enfermedad celiaca
Se realizaron estudios de dosis-respuesta usando péptidos que correspondían a los péptidos sin modificar y tratados con transglutaminasa que corresponden a los epítopes de células T de clones de células T específicos de gluten y líneas de biopsias intestinales de sujetos celiacos. Las respuestas a los péptidos se expresaron como porcentaje de respuesta a A-gliadina 57-73 QE65. Todos los sujetos eran HLA-DQ2+ (ninguno era DQ8+).
Los estudios indican que A-gliadina 57-73 QE65 es el péptido de gliadina más potente en la inducción de interferón gamma en el ensayo de ELISPOT usando PBMC de celiaco después de la estimulación con gluten (véanse las Figuras 12a-h y las Tablas 5 y 6). Los epítopes segundo y tercero son fragmentos subóptimos de péptidos más largos, es decir, A-gliadina 57-73 QE65 y GDA4_TRIGO P04724-84-100 QE92. El epítope es sólo modestamente bioactivo (aproximadamente 1/20 de la actividad de A-gliadina 57-73 QE65 después de sustraer el blanco).
A-gliadina 57-73 QE65 es más potente que otros epítopes de células T conocidos en la enfermedad celiaca. Hay 16 polimorfismos de A-gliadina 57-73 (incluyendo la secuencia PQLPY) entre los genes de gliadina secuenciados, su bioactividad se valora a continuación.
Ejemplo 7
Comparación de las respuestas específica de gliadina y de A-gliadina 57-73 QE65 en sangre periférica
La contribución relativa del epítope dominante, A-gliadina 57-73 QE65, a la respuesta de células T total frente a gliadina en la enfermedad celiaca es una cuestión crítica. La gliadina digerida con pepsina-tripsina y con quimiotripsina se ha usado tradicionalmente como antígeno para el desarrollo de líneas y clones de células T en la enfermedad celiaca. Sin embargo, es posible que estas proteasas puedan escindir a través de ciertos epítopes del péptido. De hecho, la digestión de la \alpha9-gliadina recombinante con quimiotripsina genera el péptido QLQPFPQPELPY, que es un truncamiento de la secuencia óptima del epítope QLQPFPQPELPYPQPQS (véase anteriormente). El tratamiento con transglutaminasa aumenta sustancialmente la potencia de la gliadina digerida con quimiotripsina en ensayos de proliferación de clones y líneas de células T específicos de gliadina. Por lo tanto, la gliadina digerida con quimiotripsina y tratada con transglutaminasa (gliadina tTG) puede no ser un antígeno ideal, pero las respuestas contra esta mezcla pueden aproximarse al número "total" de linfocitos de sangre periférica específicos de gliadina. La comparación de las respuestas frente a A-gliadina 57-73 QE65 y a gliadina tTG en el ensayo de ELISPOT da una indicación de la contribución de este epítope dominante a la respuesta inmune total a gliadina en la enfermedad celiaca y también es una medida de la expansión del epítope.
Se valoraron las PBMC recogidas los días 6 ó 7 después de comenzar la estimulación con gluten en 4 sujetos celiacos en estudios de dosis-respuesta usando gliadina digerida con quimiotripsina +/- tratamiento con tTG y comparado con las respuestas en ELISPOT a una concentración subóptima de A-gliadina 57-73 QE65 (25 \mug/ml). El tratamiento con tTG de gliadina potenciaba las respuestas de PBMC en el ELISPOT aproximadamente 10 veces (tTG era comparable al blanco cuando se valoraba por separado) (véanse las Figuras 13a-c). En los cuatro sujetos con enfermedad celiaca estudiados, el A-gliadina 57-73 QE65 (25 \mug/ml) desencadenaba respuestas entre el 14 y el 115% de las de la gliadina tTG (500 \mug/ml) y cuanto mayor era la respuesta a A-gliadina 57-73 QE65, mayor era la proporción que representaba de la respuesta a gliadina tTG.
Datos relativamente limitados sugieren que en algunos sujetos, las respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 son comparables a las de gliadina tTG . La extensión del epítope asociada con respuesta de células T anti-gliadina más desarrollada puede ser responsable de la contribución más pequeña de A-gliadina 57-73 QE65 a la respuesta "total" a gliadina en la sangre periférica de algunos individuos. La extensión del epítope se puede mantener en individuos con dietas sin gluten menos estrictas.
Ejemplo 8
Definición de péptidos de gliadina bioactivos en la enfermedad celiaca: Polimorfismos de A-gliadina 57-73
Se valoraron los péptidos 15-mer solapantes que abarcan la secuencia completa de la A-gliadina para identificar la secuencia inmunodominante en la enfermedad celiaca. La A-gliadina fue la primera proteína y gen de alfa gliadinas que se secuenció por completo, pero es una de las aproximadamente 30-50 proteínas relacionadas con alfa gliadina en el trigo. Se han identificado 25 genes de alfa-gliadina distintos buscando en las bases de datos de proteínas, describiéndose en Swiss-Prot y TREMBL 8 alfa-gliadinas más. Dentro de estas 25 alfa-gliadinas, hay 16 polimorfismos distintos de la secuencia correspondiente a A-gliadina 57-73 (véase la Tabla 7).
Se valoraron los péptidos sintéticos que correspondían con estos 16 polimorfismos, en forma no modificada, después del tratamiento con transglutaminasa in vitro, así como con una sustitución de glutamato en la posición 10 (equivalente a QE65 en A-gliadina 57-73) usando PBMC de sujetos celiacos, normalmente después de una dieta sin gluten, los días 6 ó 7 después de la estimulación con gluten en ensayos de ELISPOT para interferón gamma. Los péptidos sustituidos con glutamato se compararon a tres concentraciones (2,5, 25 y 250 \mug/ml), los péptidos sin modificar y los péptidos tratados con transglutaminasa se valoraron únicamente a 25 \mug/ml. La bioactividad se expresó como % de respuesta asociada con 25 \mug/ml de A-gliadina 57-73 QE65 en sujetos independientes (n=4) (véase la Figura 14).
La bioactividad de los péptidos de "tipo silvestre" aumentaba sustancialmente (>5 veces) por el tratamiento con transglutaminasa. El tratamiento con transglutaminasa de péptidos de tipo silvestre tenía como resultado una bioactividad similar a la de los mismos péptidos sustituidos con glutamato en la posición 10. La bioactividad de cinco péptidos sustituidos con glutamato (B, C, K, L, M), era >70% la de A-gliadina 57-73 QE65 (A), pero ninguno era significativamente más bioactivo que A-gliadina 57-73 QE65. Las respuestas de PBMC a péptidos sustituidos con glutamato a concentraciones de 2, 5 y 250 \mug/ml eran comparables a las de 25 \mug/ml. Seis péptidos de gliadina sustituidos con glutamato (H, I, J, N, O, P) tenían <15% de la actividad de la A-gliadina 57-73 QE65. Otros péptidos tenían una bioactividad intermedia.
Al menos seis péptidos derivados de gliadina tienen una potencia equivalente a A-gliadina 57-73 QE65 después de la modificación por transglutaminasa. También existen polimorfismos de A-gliadina 57-73 relativamente no bioactivos. Estos datos indican que la modificación por transglutaminasa de los péptidos de varias gliadinas de Tricetum aestivum, T. uartu y T spelta puede ser capaz de generar el epítope de células T inmunodominante en la enfermedad celiaca.
La modificación genética del trigo para generar trigo no tóxico para celiacos es probable que requiera la eliminación o modificación de múltiples genes de gliadina. La generación de trigo que contiene gliadinas u otras proteínas o péptidos que incorporan secuencias que definen antagonistas de ligandos peptídicos alteradas de A-gliadina 57-73 es una estrategia alternativa para generar trigo modificado genéticamente que es terapéutico en vez de "no tóxico" en la enfermedad celiaca.
Ejemplo 9
Definición de la secuencia central del epítope
La comparación de los péptidos correspondientes con los truncamientos de A-gliadina 56-75 a partir de los extremos N y C terminales, indicaban que la secuencia central del epítope de células T es PELPY (A-gliadina 64-68). Los intentos para definir no agonistas y antagonistas se centrarán en variantes de A-gliadina que eran sustituidas en restos que contribuyen sustancialmente a su bioactividad.
Los péptidos que corresponden a A-gliadina 57-73 QE65 con alanina (Figura 15) o con lisina (Figura 16) sustituidos en los restos 57 a 73 se compararon en el ELISPOT para IFN gamma usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de voluntarios celiacos 6 días después de comenzar la estimulación de 3 días con gluten (n=8). [BL es blanco, E es A-gliadina 57-73 QE65: QLQPFPQPELPYPQPQS].
Se ha encontrado que los restos que corresponden a A-gliadina 60-70 QE65 (PFPQPELPYPQ) contribuyen sustancialmente a la bioactividad de A-gliadina 57-73 QE65. Se valoraron las variantes de A-gliadina 57-73 QE65 sustituido en las posiciones 60-70 en un procedimiento en dos etapas. Inicialmente, se valoró A-gliadina 57-73 QE65 sustituida en las posiciones 60-70 usando 10 diferentes aminoácidos con propiedades opuestas. Un segundo grupo de variantes de A-gliadina 57-73 QE65 (sustituidas con todos los demás aminoácidos naturales, excepto cisteína, en las posiciones que mostraron ser sensibles a modificación) se valoraron en una segunda vuelta.
Ejemplo 10
Actividad agonista de variantes sustituidas de A-gliadina 57-73 QE65
A-gliadina 60-70 QE65 es la secuencia central del epítope de células T dominante en la A-gliadina. Las variantes de péptidos antagonistas y no agonistas de este epítope se generan más probablemente por modificación de esta secuencia central. Inicialmente, A-gliadina 57-73 QE65 sustituido en las posiciones 60-70 usando 10 aminoácidos diferentes con propiedades opuestas será valorado en el ELISPOT para IFN gamma usando PBMC de sujetos celiacos 6 días después de comenzar la estimulación de 3 días con gluten. También se valoró un segundo grupo de variantes de A-gliadina 57-73 QE65 (sustituidas con todos los demás aminoácidos naturales, excepto cisteína) en las posiciones 61-70 Ambos grupos de péptidos (todos a 50 \mug/ml, por duplicado) se valoraron usando PBMC de 8 sujetos y se compararon con el péptido sin modificar (20 replicados por ensayo). Estudios anteriores indican que la concentración óptima para A-gliadina 57-73 QE65 en este ensayo está entre 10 y 100 \mug/ml.
Los resultados se expresan como la respuesta media en las células formadoras de manchas (95% de intervalo de confianza) como el % de la respuesta media de A-G 57-73 QE65 en cada individuo. Se usó la prueba t no apareada para comparar las respuestas en ELISPOT de los péptidos modificados con la de A-G 57-73 QE65. Se definieron los superagonistas como los que tenían una respuesta mayor que la de A-G 57-73 QE65 a un nivel de significancia de p<0,01; agonistas parciales como los que tenían una respuesta inferior a la de A-G 57-73 QE65 a un nivel de significancia de p<0,01 y no agonistas como los que no eran significativamente diferentes (p>0,01) del blanco (tampón sin péptido). Los péptidos con una actividad agonista del 30% o menos que la de A-gliadina 57-73 QE65 se consideraron parcialmente "adecuados" o no agonistas para valorar su actividad antagonista (véase la Tabla 8 y las Figuras 17-27).
La respuesta en ELISPOT para IFN gamma de PBMC frente a A-gliadina 57-73 QE65 es muy específica a un nivel molecular. La prolina en la posición 64 (P64), glutamato en posición 65 (E65) y leucina en posición 66 (L66), y en un menor grado, Q63, P67, Y68 y P69 son especialmente sensibles a modificación. Las sustituciones de Y61 e Y70 generan ambas superagonistas con el 30% más de bioactividad que el péptido parental, probablemente por que potencia la unión a HLA-DQ2, ya que el motivo para esta molécula de HLA indica una preferencia por restos hidrófobos voluminosos en las posiciones 1 y 9. Se identificaron 18 péptidos no agonistas. Las bioactividades de las variantes (50 \mug/ml): P65, K64, K65 e Y65 (bioactividad 7-8%) eran comparables al blanco (7%). En total, 57 variantes mutadas de A-gliadina 57-73 QE65 era el 30% o menos bioactivas que A-gliadina 57-73 QE65.
La especificidad molecular de la respuesta de células T de linfocitos de sangre periférica (PBL) frente al epítope dominante, A-gliadina 57-73 QE65, es sistemáticamente reproducible entre los sujetos celiacos HLA-DQ2+, y es muy específica para un número restringido de aminoácidos en los 7 aminoácidos centrales. Ciertas variantes de un único aminoácido de A-gliadina 57-73 QE65 son sistemáticamente no agonistas en todos los sujetos celiacos HLA-DQ2+.
Ejemplo 11
Actividad antagonista de las variantes sustituidas
La homogeneicidad de la respuesta de células T de PBL a A-gliadina 57-73 QE65 en la enfermedad celiaca HLA-DQ2+ sugiere que pueden existir ligandos peptídicos alterados (LPA) con capacidad antagonista en PBMC ex vivo, incluso aunque la respuesta de células T de PBL es probable que sea poli u oligoclonal. Generalmente, Los antagonistas LPA son agonistas débiles. Se han identificado 57 variantes sustituidas en un único aminoácido de A-gliadina 57-73 QE65 con actividad agonista del 30% o menos y son candidatos adecuados como antagonistas LPA. Además, se han identificado ciertos polimorfismos naturales de A-gliadina 57-73 QE65 desde el punto de vista de la bioactividad más débiles (véase más abajo) que pueden ser antagonistas LPA "naturales". También se ha sugerido que la competición por unirse a MHC puede antagonizar también con las células T inmunes específicas de antígeno. Por lo tanto, los péptidos no gliadina que no inducen respuesta de IFN gamma en PBMC de celiacos tras la estimulación con gluten, pero que se sabe que unen HLA-DQ2, pueden ser capaces de reducir respuestas de células T desencadenadas por A-gliadina 57-73 QE65. Dos péptidos que se unen ávidamente a HLA-DQ2 son HLA de clase 1 \alpha 46-60 (HLA 1a) (PRAPWIEQEGPEYW) y peroxidasa tiroidea (tp) 632-645Y (IDVWLGGLLAENFLPY).
Se añadió simultáneamente péptido (50 \mug/ml) o tampón, y A-gliadina 57-73 QE65 (10 \mug/ml) en ELISPOT para IFN gamma usando PBMC de voluntarios celiacos 6 días después de comenzar la estimulación de 3 días con gluten (n=5). Los resultados se expresaron como la respuesta con péptido más A-G 57-73 QE65 (media de duplicados) como el % de la respuesta con tampón más A-G 57-73 QE65 (media de 20 replicados) (véase la Tabla 9).
Cuatro variantes de A-gliadina 57-73 QE65 sustituidas en un único aminoácido reducen la respuesta en ELISPOT para interferón gamma de PBMC frente a A-gliadina 57-73 QE65 (p<0,01) entre el 25% y el 28%, otras 13 variantes de péptidos reducen la respuesta en ELISPOT entre el 18% y el 24% (p<0, 06). La peroxidasa tiroidea (tp) 632-645Y, que se une a HLA-DQ2, reduce las respuestas de interferón gamma de PBMC frente a A-gliadina 57-73 QE65 el 31% (p<0,0001), pero el otro ligante de HLA-DQ2, HLA de clase 1 \alpha 46-60, no altera la respuesta (véase la Tabla 9). El péptido correspondiente al polimorfismo modificado por transglutaminasa de A-gliadina 57-73, número de acceso de SwissProt: P04725 82-98 QE90 (PQPQPFPPELPYPQPQS) reduce las respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 el 19% (p<0,009) (véase la Tabla 11).
Las respuestas de interferón gamma de PBMC frente a A-gliadina 57-73 QE65 en ensayos de ELISPOT se reducen mediante la administración conjunta de ciertas variantes de un único aminoácido de A-gliadina 57-73 QE65, y un péptido no relacionado que se sabe que se une a HLA-DQ2 en un exceso de 5 veces. Estos hallazgos sugieren que existen antagonistas de ligandos peptídicos alterados de A-gliadina 57-73 QE65. No sólo probables antagonistas LPA, sino también ciertos péptidos que se unen eficazmente a HLA-DQ2, reducen las respuestas de células T de PBL frente a A-gliadina 57-73 QE65.
Estos hallazgos apoyan dos estrategias para interrumpir la respuesta de células T frente al epítope A-gliadina dominante en la enfermedad celiaca HLA-DQ2+.
1. Optimización de antagonistas PLA sustituyendo aminoácidos en más de una posición (64-67) para su uso como productos farmacéuticos peptídicos "tradicionales" o para modificaciones genéticas específicas de genes de gliadina en trigo.
2. El uso de péptidos de alta afinidad que se unen a HLA-DQ2 para inhibir competitivamente la presentación de A-gliadina 57-73 QE65 en asociación con HLA-DQ2.
Estas dos aproximaciones pueden ser mutuamente compatibles. Se generaron superantígenos sustituyendo F61 y Q70 por restos de tirosina. Es probable que estos superantígenos fueran el resultado de la unión mejorada a HLA-DQ2 antes que de la potenciación del contacto con el receptor de células T. Combinando estas modificaciones con otras sustituciones que generan antagonistas LPA moderadamente eficaces podría potenciarse sustancialmente el efecto inhibidor de variantes de A-gliadina 57-73 QE65 sustituidas.
Ejemplo 12
Desarrollo del ELISPOT para interferón gamma usando PBMC, A-gliadina 57-73 QE65 y P04724 84-100 QE92 como diagnóstico para la enfermedad celiaca: Definición de inmunosensibilidad en la enfermedad celiaca recién diagnosticada
La inducción de sensibilidad al epítope de células T de A-gliadina dominante en PBMC medido en ELISPOT para interferón gamma sigue a la estimulación con gluten en casi todos los sujetos celiacos DQ2+ que siguieron una dieta sin gluten (DSG) estricta de larga duración, pero no en sujetos sanos DQ2+ después de 4 semanas de seguir una DSG estricta. Las respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 no se pueden medir en las PBMC de sujetos celiacos antes de la estimulación con gluten y los datos piloto han sugerido que estas respuestas no podrían medirse en PBMC de celiacos sin tratar. Estos datos sugieren que en la enfermedad celiaca la inmunosensibilidad a A-gliadina 57-73 QE65 se restablece después de la exclusión antigénica (DSG). Si se tiene que desarrollar una prueba diagnóstica usando el ensayo de ELISPOT y PBMC, es deseable definir la duración de la DSG necesaria antes de que la estimulación con gluten sea capaz de inducir respuestas frente a A-gliadina 57-73 QE65 y a otros péptidos de gliadina inmunoreactivos en sangre.
Se seleccionaron sujetos celiacos DQ2+ recientemente diagnosticados de las consultas externas de gastroenterología. Se prepararon las PBMC y se ensayaron en ELISPOT para interferón gamma antes de que los sujetos comenzaran la DSG, y una o dos semanas después de comenzar la DSG. Además, la estimulación con gluten (3 días consumiendo 4 rebanadas de pan blanco convencional, 200 g/día) se realizó una y dos semanas después de iniciar la DSG. Se prepararon los PBMC y se ensayaron el día seis después de comenzar la estimulación con gluten. Se valoraron A-gliadina 57-73 QE65 (A), P04724 84-100 QE92 (B) (por separado y combinados) y A-gliadina 57-73 QP65 (P65) (variante no bioactiva, véase anteriormente) (todos a 2,5 \mug/ml).
Todos menos un paciente celiaco recién diagnosticado eran DQ2+ (uno era DQ8+) (n=11). Los PBMC de los celiacos recién diagnosticados que no habían sido tratados, o después de 1 ó 2 semanas siguiendo una DSG, no mostraban respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 ni a P04724 84-100 QE93 (por separado o combinados) que fueran significativamente diferentes del blanco o de A-gliadina 57-73 QP65 (n=9) (véase la Figura 28). La estimulación con gluten en celiacos que habían seguido una DSG durante sólo una semana no potenciaba sustancialmente las respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 o a P04724 84-100 QE92 (por separado o combinados). Pero 2 semanas de estimulación con gluten después de comenzar la DSG inducían respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 y a P04724 84-100 QE92 (por separado o combinados) que eran significativamente mayores que la variante no bioactiva de A-gliadina 57-73 QP65 y que el blanco. Aunque estas respuestas tras la estimulación con gluten a las 2 semanas eran sustanciales, parecían ser menores que en sujetos >2 meses después de comenzar la DSG. Las respuestas a A-gliadina 57-73 QE65 por separado eran equivalentes o mayores que las respuestas a P0472484-100 QE92 por separado o cuando se mezclaba con A-gliadina 57-73 QE65. Ninguno de los sujetos experimentó síntomas problemáticos con la estimulación con gluten.
La sensibilidad inmune (como se mide en PBMC después de la estimulación con gluten) a A-gliadina se restablece parcialmente 2 semanas después de comenzar la DSG, lo que implica que la "insensibilidad inmune" a este epítope de células T dominante prevalece en la enfermedad celiaca sin tratar y durante al menos una semana después de iniciar la DSG. El momento óptimo de una prueba diagnóstica para la enfermedad celiaca, usando la estimulación con gluten y la medida de la respuesta a A-gliadina 57-73 QE65 en el ensayo de ELISPOT, es al menos 2 semanas después de comenzar una DSG.
Las células T secretoras de interferón gamma específicas de A-gliadina 57-73 QE65 no se puede medir en sangre periférica de celiacos sin tratar, y pueden inducirse sólo por la estimulación con gluten después de al menos 2 semanas de DSG (exclusión antigénica). Por tanto, el momento de una prueba diagnóstica usando esta metodología es crucial y son necesarios estudios adicionales para su optimización. Estos hallazgos están de acuerdo con la anergia funcional de células T específica del epítope dominante, A-gliadina 57-73 QE65, invertida por la exclusión antigénica (DSG). Este fenómeno no se ha demostrado previamente en ninguna enfermedad humana y apoya la posibilidad de que en la enfermedad celiaca pueda inducirse anergia de células T con terapia peptídica.
Referencias
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7. Olerup O, y col. Tissue antigens 41,119-134 (1993).
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9. Plebanski M y col. Eur.J.Immunol. 28,4345-4355 (1998).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Secuencia de la proteína A-gliadina (basada en la secuenciación de aminoácidos)
1
TABLA 2 Sujetos con enfermedad celiaca estudiados
Sexo Dieta sin HLA-DQ2 Estimulación Síntomas
Edad gluten con pan con pan
1 64 m 14 años Homocigoto 3 días Dolor abdominal, letargo, úlceras en la boca, diarrea
2 57 h 1 año Heterocigoto 10 días Letargo, nauseas
3 35 m 7 años Heterocigoto 3 días Nauseas
4 36 h 6 sem Homocigoto 3 días Dolor abdominal, úlceras en la boca, diarrea
5 26 h 19 años Heterocigoto 3 días Ninguno
6 58 h 35 años Heterocigoto 3 días Ninguno
7 55 h 1 año Heterocigoto 3 días Diarrea
8 48 m 15 años Homocigoto 3 días Dolor abdominal, diarrea 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
Aminoácido en la posición 65 Intervalo Media
Glutamato (100) 100%
Asparragina (50-84) 70%
Aspartato (50-94) 65%
Alanina (44-76) 64%
Cisteína (45-83) 62%
Serina (45-75) 62%
Valina (24-79) 56%
Treonina (46-66) 55%
Glicina (34-47) 40%
Leucina (8-46) 33%
Glutamina (16-21) 19%
Isoleucina (3-25) 14%
Metionina (3-32) 14%
Fenilalanina (0-33) 12%
Histidina (0-13) 8%
Tirosina (0-17) 8%
Triptófano (0-17) 8%
Lisina (0-11) 4%
Prolina (0-4) 2%
Arginina (0-2) 1% 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4
2
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Epítopes de célula T descritos en la enfermedad celiaca
5
\begin{minipage}[t]{150mm} NE: no especificado en la publicación original, iTCC clon de células T intestinales; iTCL línea de célula T policlonal intestinal, bTCC clon de célula T de sangre periférica.\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{150mm} * Todos los péptidos son los producidos de los péptidos de gluten de tipo silvestre modificados con transglutaminasa excepto los péptidos cuatro y sexto.\end{minipage}
TABLA 6 Bioactividad relativa de epítopes de células T para gliadina en PBMC celiacas tras la estimulación con gluten
6 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *  \begin{minipage}[t]{150mm} Secuencia se refiere a la del
péptido modificado transglutaminasa (tTG) y la del epítope de la
célula T. El tipo silvestre es el péptido de gliadina sin modificar.
Los datos son de 4 sujetos. El blanco era
5(1)%.\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 7 Polimorfismos de A-gliadina 57-73 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.6cm
A. Secuencias derivadas de la cepa Mjolner de trigo de otoño Nórdico
7 
\newpage
TABLA 7 (continuación) 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.6cm
B. Búsqueda en SWISSPROT y TREMBL (10.12.99) de gliadinas que contienen las secuencias: {}\hskip1.5cm XXXXXXXPQLPYXXXXX
8
TABLA 8 Bioactividad de variantes sustituidas de A-gliadina 57-73 QE65 (Sust) en comparación con A-gliadina 57-73 QE65(G) (media 100%, 95% IC 97-104) y blanco (sin péptido,bl)(media 7,1%, 95% IC: 5,7-8,5)
9
10
11
12
TABLA 9 Antagonismo de A-gliadina 57-73 QE65 en ELISPOT gliadina para interferón gamma mediante variantes sustituidas de A-gliadina 57-73 Q65 (Sust) (P es el nivel de significanza en una prueba T no pareada). También se muestra la actividad agonista (% de agonista) de los péptidos en comparación con A-gliadina 57-73 QE65
13
14
TABLA 10 Inhibición de la respuesta de A-gliadina 57-73 QE65 en ELISPOT para interferón gamma por péptidos conocidos porque se unen a HLA-DQ2 (P es el nivel de significanza en una prueba t no pareada)
Péptido % de inhibición P
TP 31 <0,0001
HLA1a 0 0,95 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 11 Antagonismo de la respuesta de A-gliadina 57-73 QE65 en ELISPOT para interferón gamma por polimorfismos que aparecen de forma natural de A-gliadina 57-73 QE65 (P es el nivel de significanza en una prueba t no pareada)
A-gliadina 57-73QE65 Polimorfismo % Inhibición P
P04725 82-98 QE90 PQPQPFPPELPYPQPQS 19 0,009
Q41509 77-93 QE85 QLQPFLQPELPYSQPQP 11 0,15
Gli\alpha 1,6 58-74 QE66 QPQPFPPPELPYPQTQP 11 0,11
P04723 77-93 QE85 PQPQPFPPELPYPQTQP 10 0,14
Gli\alpha 3-5 57-73 QE65 QLQPFPQPELSYSQPQP 7 0,34
P02863 77-93 QE85 QLQPFPQPELPYSQPQP 6 0,35
Q41509 77-93 QE85 QLQPFLQPELPYSQPQP 6 0,41
P04727 79-95 QE65 PQPQPFLPELPYPQPQS 6 0,39
P04726 82-98 QE90 PQPQPFPPELPYPQPPP 5 0,43
<110> ISIS INNOVATION LIMITED
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Epítope diagnóstico y terapéutico y planta transgénica
\vskip0.400000\baselineskip
<130> N.77933A
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
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<400> 1
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\sa{Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr}
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<210> 2
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<400> 2
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\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
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<210> 3
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<211> 266
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<400> 3
15
16 
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<210> 4
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<400> 4
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\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr}
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<210> 5
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<400> 5
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\sa{Gln Pro Gln Leu Pro}
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<210> 6
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<400> 6
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\sa{Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr}
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<210> 7
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<400> 7
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\sa{Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro}
\sac{Gln Ser Phe Pro}
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<210> 8
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<400> 8
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\sa{Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro}
\sac{ Gln Ser Phe Pro}
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<210> 9
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<213> Homo sapiens;
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<400> 19
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\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Leu Gln Pro Gln}
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
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<400> 20
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\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<400> 21
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<400> 22
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
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<400> 26
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<211> 17
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<400> 27
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<213> Homo sapiens;
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<400> 28
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
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<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
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<400> 31
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
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<400> 33
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\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Leu Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Ser Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
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\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
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<213> Homo sapiens;
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\newpage
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<213> Homo sapiens;
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\vskip0.400000\baselineskip
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Homo sapiens;
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\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
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\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Gln Gln Gln Pro Phe Pro Pro Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Pro}
\sac{Gln Pro Phe}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Tyr Pro Ser Gly Glu Gly Ser Phe Gln Pro Ser Gln Glu Asn}
\sac{Pro Gln}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Val Trp Leu Gly Gly Leu Leu Ala Glu Asn Phe Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Leu Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Ley Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
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<400> 70
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\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
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<210> 71
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Leu Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
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<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
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<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Thr Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Ser Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
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\sa{Gln Leu Gln Pro Phe Leu Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Ser Gln Pro Gln}
\sac{Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Leu Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln}
\sac{Ser}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens;
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Pro}
\sac{Pro}

Claims (55)

1. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos PQPELPY (SEC ID Nº 1).
2. Una proteína de fusión que comprende (a) la secuencia de aminoácidos PQPELPY (SEC ID Nº 1) y (b) otra secuencia de gliadina o no gliadina.
3. Un péptido según la reivindicación 1, o una proteína de fusión según la reivindicación 2, que tiene una longitud de 7 a no más de 50 aminoácidos.
4. Un péptido según la reivindicación 3, que tiene una longitud de 10 a 40 aminoácidos.
5. Un péptido o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la secuencia de aminoácidos QLQPFPQPELPYPQPQS (SEC ID Nº 2).
6. Una proteína de fusión según la reivindicación 2, en la que la secuencia de gliadina es de trigo, centeno, cebada, avena o triticale.
7. Una proteína de fusión según la reivindicación 2, en la que (b) no es una secuencia de gliadina.
8. Una composición que comprende dos o más de los péptidos o proteínas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Una composición farmacéutica que comprende un péptido o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
10. Una composición farmacéutica según la reivindicación 9 que comprende (a) al menos un péptido según la reivindicación 1 y (b) un epítope de gliadina de al menos uno de trigo, centeno, cebada, avena y triticale.
11. Un péptido o proteína de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 9 ó 10 para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca.
12. Un péptido, proteína de fusión o composición farmacéutica como se define en la reivindicación 11, en el que dicho tratamiento o prevención de la enfermedad celiaca es mediante tolerización.
13. Un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o de susceptibilidad a padecer enfermedad celiaca, en un individuo que comprende:
(a) poner en contacto una muestra del hospedador con un péptido o proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
(b) determinar in vitro si las células T de la muestra reconocen al péptido o proteína de fusión; el reconocimiento por las células T indica que el individuo tiene, o es susceptible a, la enfermedad celiaca.
14. Uso de un péptido o proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un medio de diagnóstico para su uso en un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a padecer enfermedad celiaca, en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento determinar si las células T del individuo reconocen el péptido, indicando el reconocimiento por las células T que el individuo tiene, o es susceptible a, la enfermedad celiaca.
15. Uso según la reivindicación 14 en el que el procedimiento comprende administrar el péptido o proteína de fusión en la piel de un individuo y detectar la presencia de inflamación en el lugar de administración, la detección de inflamación indicando que las células T del individuo reconocen el péptido o proteína de fusión.
16. Un procedimiento según la reivindicación 13 o un uso según la reivindicación 14, en el que la muestra es una muestra de sangre.
17. Un procedimiento según la reivindicación 13 ó 16, o su uso según la reivindicación 14 en los que las células T no se reestimulan de forma específica de antígeno in vitro antes de dicha determinación.
18. Un procedimiento o uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 en el que el reconocimiento del péptido o proteína de fusión por las células T se determina detectando la secreción de una citocina por las células T.
19. Un procedimiento o uso según la reivindicación 18 en el que la citocina es IFN-\gamma.
\newpage
20. Un procedimiento o uso según la reivindicación 18 ó 19 en el que la citocina se detecta permitiendo a la citocina que se una a un anticuerpo inmovilizado específico para la citocina y detectando, a continuación, la presencia de complejos anticuerpo/citocina.
21. Un procedimiento o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 en el que dicha determinación se hace midiendo si el péptido o la proteína de fusión se unen al receptor de célula T.
22. Un procedimiento de diagnóstico de enfermedad celiaca, o susceptibilidad a padecer enfermedad celiaca, en un individuo que comprende determinar la presencia de un anticuerpo que se une a la secuencia de aminoácidos
PQPELPY (SEC ID Nº 1) en una muestra del individuo, indicando la presencia del anticuerpo que el individuo tiene, o es susceptible a, la enfermedad celiaca.
23. Un procedimiento para determinar si una composición es capaz de causar la enfermedad celiaca, que comprende determinar si en la composición está presente una secuencia capaz de ser modificada en un péptido por una transglutaminasa como se define en la reivindicación 1, indicando la presencia de la secuencia que la composición es capaz de causar la enfermedad celiaca.
24. Un procedimiento según la reivindicación 23 en el que dicha determinación se hace poniendo en contacto la composición con un anticuerpo específico de la secuencia que es capaz de ser codificada en la secuencia peptídica, indicando la unión del anticuerpo a una proteína de la composición que la composición es capaz de causar la enfermedad celiaca.
25. Un kit para realizar un procedimiento o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21 que comprende un péptido o proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un medio para detectar el reconocimiento del péptido o proteína de fusión por la célula T.
26. Un kit según la reivindicación 25 en el que el medio para detectar el reconocimiento comprende un anticuerpo frente a IFN-\gamma.
27. Un kit según la reivindicación 26 en el que el anticuerpo se inmoviliza en un soporte sólido y, de forma opcional, el kit también comprende un medio para detectar el complejo anticuerpo/INF-\gamma.
28. Uso de un péptido o proteína de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para producir un anticuerpo específico del péptido.
29. Un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora que codifica un péptido o proteína de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
30. Un polinucleótido según la reivindicación 29, en el que las secuencias 5' y/o 3' de la secuencia codificadora comprende secuencias que ayudan a la expresión de la secuencia que codifica el péptido o la proteína de fusión.
31. Un polinucleótido según la reivindicación 30, en el que el polinucleótido es capaz de expresar el péptido o proteína de fusión en una célula procariótica o eucariótica.
32. Un polinucleótido según la reivindicación 31, en el que la célula eucariótica es una célula de mamífero.
33. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en el que el polinucleótido está unido de forma operativa a una secuencia control que es capaz de proporcionar la expresión del polinucleótido.
34. Una célula que comprende un polinucleótido o vector de expresión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 o que se ha transformada con este polinucleótido o vector de expresión.
35. Una célula según la reivindicación 34, que es una célula procariótica o una célula de mamífero.
36. Una proteína que comprende: (a) una proteína gliadina mutante con al menos una mutación en el epítope ^{62}PQPQLPY^{68}, en la que la mutación reduce la capacidad del epítope para inducir una respuesta de células T; o (b) un fragmento de la proteína mutante de (a), cuyo fragmento tiene una longitud de al menos 15 aminoácidos y comprende la secuencia PQPQLPY mutada.
37. Una proteína según la reivindicación 36, en la que la mutación está en la posición 65 de la A-gliadina, o en una posición equivalente de otras gliadinas.
38. Una proteína según la reivindicación 37, en la que el resto de glutamina de la posición 65 se sustituye por un resto de histidina, tirosina, triptófano, lisina, prolina o arginina.
39. Un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora que codifica una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38.
40. Un polinucleótido según la reivindicación 39 que comprende adicionalmente una o más secuencias reguladoras unidas de forma operativa con la secuencia codificadora, cuyas secuencias reguladores son capaces de asegurar la expresión de la secuencia codificadora en una célula.
41. Un polinucleótido según las reivindicaciones 39 ó 40, que es un vector o que está en forma de un vector.
42. Una célula que comprende un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41 o que se ha transformado con este polinucleótido.
43. Una célula según la reivindicación 42 que es una célula de una especie de gramínea monocotiledónea.
44. Una célula según la reivindicación 43 que es una célula de trigo, maíz, avena, centeno, arroz, cebada, triticale, sorgo o azúcar de caña.
45. Un procedimiento para la producción de una proteína codificada por una secuencia codificadora como se define en la reivindicación 39, cuyo procedimiento comprende:
(a) cultivar una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44 en condiciones que permitan la expresión de la proteína; y de manera opcional
(b) recuperar la proteína expresada.
46. Un procedimiento para obtener una célula vegetal transgénica que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector según la reivindicación 41 para obtener una célula vegetal transgénica.
47. Una célula vegetal transgénica que puede obtenerse por un procedimiento según la reivindicación 46.
48. Una planta transgénica o semilla vegetal que comprende células vegetales según una cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44.
49. Un callo de células vegetales transgénicas que comprende células vegetales según la reivindicación 43 ó 44, que puede obtenerse a partir de una célula vegetal transgénica como se define en la reivindicación 43, 44 ó 47.
50. Una planta o callo según la reivindicación 48 ó 49 que es de una especie como se define en la reivindicación 43 ó 44.
51. Un procedimiento para obtener un producto vegetal que comprende recolectar un producto vegetal a partir de una planta según la reivindicación 48 ó 50 y, de manera opcional, procesar además el producto recolectado.
52. Un procedimiento según la reivindicación 51 en el que la planta es una planta de trigo y el producto vegetal recolectado es el grano; procesado además de manera opcional en harina u otro producto del grano.
53. Un producto vegetal que puede obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 51 ó 52.
54. Un alimento que comprende una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38.
55. Un alimento según la reivindicación 54, en la que se usa una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38 en lugar de la gliadina de tipo silvestre.
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