ES2624502T3 - Anticuerpos anti-il-12, composiciones, métodos y usos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-IL-12 o porcion que se une al antigeno del mismo, que tiene una region de union al antigeno que comprende tres CDR de cadena pesada (CDR1, CDR2, y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y tres CDR de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 4, 5 y 6.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Anticuerpos anti-il-12, composiciones, metodos y usos Descripcion

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a anticuerpos espedficos para la protema interleuquina-12 (IL-12), as^ como a acidos nucleicos que codifican tales anticuerpos anti-IL-12, celulas huesped, y formulaciones terapeuticas y usos de los mismos.

TECNICA RELACIONADA

Interleuquina-12 (IL-12) es una citoquina heterodimerica que consiste en cadenas polipeptfdicas glicosiladas de 35 y 40 kD que estan unidas por puentes disulfuro. La citoquina es sintetizada y secretada por las celulas presentadoras de antfgeno incluyendo celulas dendnticas, monocitos, macrofagos, celulas B, celulas de Langerhans y queratinocitos asf como celulas citoltticas naturales (NK). IL-12 media una variedad de procesos biologicos y se ha denominado como factor estimulador de celulas NK (NKSF), factor estimulador de celulas T, factor de maduracion de linfocitos T citotoxicos y factor de lmea de celulas B transformadas por EBV (Curfs, J.H.A.J et al., Clinical Microbiology Reviews, 10:742-780 (1997)).

Interleuquina-12 se puede unir al receptor de IL-12 expresado en la membrana plasmatica de celulas (por ejemplo, celulas T, celula NK), alterando de esta manera (por ejemplo, iniciando, previniendo) procesos biologicos. Por ejemplo, la union de IL-12 al receptor de IL-12 puede estimular la proliferacion de celulas T y celulas NK preactivadas, aumentar la actividad citolftica de celulas T citotoxicas (cTl), celulas NK y celulas LAK (celulas citoltticas activadas por linfoquina), inducir produccion de interferon gamma (IFN GAMMA) por celulas T y celulas NK e inducir diferenciacion de celulas Th0 indiferenciadas a celulas Th1 que producen IFN GAMMA e IL-2 (Trinchieri, G., Annual Review of Immunology, 13:251-276 (1995)). En particular, IL-12 es esencial para la generacion de celulas citoltticas (por ejemplo, NK, CTL) y para montar una respuesta inmune celular (por ejemplo, una respuesta inmune mediada por celulas Th1). De esta manera, IL-12 es cnticamente importante en la generacion y regulacion tanto de inmunidad protectora (por ejemplo, erradicacion de infecciones) como respuestas inmunes patologicas (por ejemplo, autoinmunidad) (Hendrzak, J.A. y Brunda, M.J., Laboratory Investigation, 72:619-637 (1995)). Segun esto, una respuesta inmune (por ejemplo, protectora o patogenica) se puede aumentar, suprimir o prevenir mediante manipulacion de la actividad biologica de IL-12 in vivo, por ejemplo, por medio de un anticuerpo.

El Documento WO00/56772 describe anticuerpos humanos que se unen a IL-12 humanos y metodos para producir tales anticuerpoes.

Los anticuerpos de mairnferos no humanos, quimericos, policlonales (por ejemplo, anti-sueros) y/o monoclonales (Mab) y fragmentos (por ejemplo, productos de digestion proteolttica o protemas de fusion de los mismos) son agentes terapeuticos potenciales que se estan investigando en algunos casos para intentar tratar ciertas enfermedades. Sin embargo, tales anticuerpos o fragmentos pueden provocar una respuesta inmune cuando se administran a seres humanos. Tal respuesta inmune puede producir una depuracion mediada por complejos inmunes de los anticuerpos o fragmentos de la circulacion y hace la administracion repetida no adecuada para terapia, reduciendo por lo tanto el beneficio terapeutico para el paciente y limitando la readministracion del anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, la administracion repetida de anticuerpos o fragmentos que comprenden partes no humanas puede producir enfermedad del suero y/o anafilaxia. Para evitar estos y otros problemas, se han tomado un numero de propuestas para reducir la inmunogenicidad de tales anticuerpos y partes de los mismos, incluyendo la quimerizacion y humanizacion, como es bien sabido en la tecnica. Estos y otros enfoques, sin embargo, aun pueden producir anticuerpos o fragmentos que tiene alguna inmunogenicidad, baja afinidad, baja avidez, o con problemas en cultivo celular, aumento a escala, produccion y/o rendimientos bajos. De esta manera, tales anticuerpos o fragmentos pueden ser menos que idealmente adecuados para la fabricacion o uso como protemas terapeuticas.

Segun esto, existe una necesidad para proporcionar anticuerpos anti-IL-12 o fragmentos que superen uno o mas de estos problemas, asf como mejoras sobre anticuerpos conocidos o fragmentos de los mismos.

COMPENDIO DE LA INVENCION

La invencion proporciona un anticuerpo anti-IL-12 humanos o porcion que se une al antfgeno del mismo, que tiene una region de union al antfgeno que comprende tres CDR de cadenas pesadas (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, 2, y 3, y tres CDR de cadena ligera (CDR!, CDR2, y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, 5, y 6.

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende el anticuerpo anti-I L-12 de acuerdo con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

la invencion, y al menos un vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptable.

La invencion tambien proporciona un acido nucleico que comprende, o hibrida selectivamente con, un polinucleotido que codifica el anticuerpo anti-IL-12 de la invencion.

La invencion tambien proporciona una celula huesped procariota o eucariota que comprende el acido nucleico de acuerdo con la invencion.

La invencion tambien proporciona un metodo para producir un anticuerpo anti-IL-12, que comprende traducir el acido nucleico de acuerdo con la invencion bajo condiciones in vitro, in vivo o in situ, de tal manera que el anticuerpo IL-12 se expresa en cantidades detectables o recuperables.

La invencion tambien proporciona un anticuerpo anti-IL-12 de la invencion para su uso en diagnostico o

terapia.

COMPENDIO DE LA DIVULGACION

La presente divulgacion proporciona anticuerpos anti-IL-12 aislados humanos, de primates, roedores, mairnferos, quimericos, humanizados y/o injertados con CDR, inmunoglobulinas, productos de la escision y otras porciones espedficas y variantes de los mismos, asf como composiciones de anticuerpos anti-IL-12, acidos nucleicos que los codifican o complementarios, vectores, celulas huesped, composiciones, formulaciones, dispositivos, animales transgenicos, plantas transgenicas, y metodos para la fabricacion y el uso de los mismos, como se describe y permite aqrn, en combinacion con lo que es conocido en la tecnica.

La presente divulgacion tambien proporciona al menos un anticuerpo anti-IL-12 aislado como se describe en la presente. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invencion incluye cualquier protema o peptido que contiene la molecula que comprenda al menos una porcion de una molecula de inmunoglobulina, como pero no limitado a al menos una Region Determinante Complementaria (CDR) de una cadena pesada o ligera o ligando de union a la porcion de la misma, una region variable de cadena pesad o cadena ligera, una region constante de cadena pesada o ligera, una region marco, o una porcion de las mismas, que puede incorporarse en un anticuerpo de la presente invencion. Un anticuerpo de la divulgacion puede incluir o derivarse de cualquier mamffero, como pero no limitado a un humano, un raton un conejo, una rata, un roedor, un primate, o cualquier combinacion de los mismos, y similares.

La presente divulgacion proporciona moleculas aisladas de acido nucleico que comprenden, complementario a, o que hibrida con, un polinucleotido que codifica al menos un anticuerpo anti-idiotipo contra IL-12, que comprende al menos una secuencia, dominio, parte o variante especificada del mismo. La presente especificacion ademas divulga vectores recombinantes que comprenden dichas moleculas de acido nucleico que codifican el anticuerpo anti-idiotipo contra IL-12, celulas huesped que comprenden tales acidos nucleicos y/o vectores recombinantes, asf como metodos para hacer y/o usar tales acidos nucleicos de anticuerpos anti-idiotipo, vectores y/o celulas huesped.

La presente divulgacion tambien proporciona al menos un metodo para expresar al menos un anticuerpo anti-IL-12, o un anticuerpo anti-idiotipo de IL-12, en una celula huesped, que comprende cultivar la celula huesped como se describe aqrn en condiciones en donde al menos se expresa un anticuerpo anti-IL-12 en cantidades detectables y/o recuperables.

La presente divulgacion tambien proporciona al menos una composicion que comprende (a) un anticuerpo aislado como se describe aqrn; y (b) un soporte o diluyente adecuado. El soporte o diluyente puede ser opcionalmente farmaceuticamente aceptable, segun soportes o diluyentes conocidos. La composicion puede opcionalmente comprender ademas al menos un compuesto, protema o composicion adicional.

La presente especificacion ademas divulga al menos un metodo o composicion de un anticuerpo anti-IL-12, para administrar una cantidad terapeuticamente eficaz para modular o tratar al menos una afeccion relacionada con IL-12 en una celula, tejido, organo, animal o paciente, y/o antes de, posterior a, o durante una afeccion relacionada, como se describe aqrn.

La presente divulgacion tambien proporciona al menos una composicion, dispositivo y/o metodo de distribucion de una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-IL-12, segun la presente divulgacion.

La presente divulgacion proporciona ademas al menos un metodo o composicion de un anticuerpo anti-IL- 12, para el diagnostico de al menos una afeccion relacionada con IL-12 en una celula, tejido, organo, animal o paciente, y/o antes de, posterior a, o durante una afeccion relacionada, como se describe aqrn.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La presente divulgacion tambien proporciona al menos una composicion, dispositivo y/o metodo de

distribucion para el diagnostico de al menos un anticuerpo anti-IL-12, segun la presente divulgacion.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Las figuras 1A y 1B son graficos que muestran la union dependiente de la concentracion de mAb humano anti-IL-12 a IL-12 humana inmovilizada. Se hicieron diluciones en serie de los anticuerpos anti-IL-12 en BSA al 1%/PBS y se incubaron en placas recubiertas de IL-12 hr durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron dos veces con Tween 20 al 0,02% (monolaurato sorbitano de polioxietileno (20)), solucion salina 0,15 M y despues se ensayaron con anticuerpo espedfico anti-IgG kappa humano de cabra marcado con peroxidasa de rabano (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo, se desarrollaron con sustrato o-fenilendiamina (OPD) y se midio la densidad optica (DO) de cada pocillo a 490 nm.

Figura 2: Los carriles de izquierda a derecha en las figuras A y B contienen IL-12 humana, p40 de IL-12 humana, IL-12 murina, y marcadores de peso molecular pretenidos. La figura 2A muestra bandas tenidas a partir de protema total. Las bandas principales en cada carril son IL-12 humana (75 kd), IL-12 humana p40 (40 kd), e IL-12 murina (75 kd). La figura 2B muestra una inmunotransferencia preparada de un gel identico al mostrado en la figura 2A. La membrana se hizo reaccionar con C340 seguido por IgG anti-humana de cabra marcada con HRP y se detecto espedficamente IL-12 humana (monomero y multimeros) e IL-12 p40 humana solo. Una membrana control (no mostrado) que se hizo reaccionar IgG anti-humana de cabra marcada con HRP no mostro ninguna banda.

Figura 3: Analisis por transcripcion inversa-PCR de la expresion del gen de IFNy en PBL humanos tratados con IL-2, IL-12, IL-2+IL-12 con y sin anticuerpo anti-IL-12 C340, 8.6.2, anticuerpo isotipo control. Se hizo una transcripcion inversa del ARN total, se amplifico mediante PCR usando cebadores espedficos del gen. Tambien se determino el nivel del ARNm de p-actina en cada muestra que sirvio como control para la integridad y contenido de ARNm.

La figura 4 es un histograma que muestra que el mAb humano anti-IL-12 (C340) inhibe la produccion de interferon-Y (IFNy) por celulas monodticas de sangre perifericas (PBMC) CD3+ con monocitos eliminados estimuladas con IL-2 mas IL-12. Las PBMC se cultivaron durante cinco horas en medio control (sin citoquinas anadidas, medio suplementado con IL-12 (0,1 ng/ml) mas IL-2 (50 UI/ml) (IL-12/IL-2), medio control que contema mAb C340 (10 pg/ml) y medio IL-12/IL-2 que contema mAb C340 (10 pg/ml). El IFNY intracelular se midio mediante inmunotincion de dos colores con CD3-PE e IFNy-FITC. Se muestran los datos para un donante.

La figura 5 es un grafico que muestra la inhibicion dependiente de la dosis de la secrecion de IFNY por linfocitos de sangre periferica estimulados con IL-2 mas IL-12 con dos lotes diferentes de un mAb humano anti-IL-12 (C340). Se cultivaron los PBL humanos (8 x 106/ml) durante 24 horas con IL-2 10 U/ml, IL-2 mas IL-12 400 pg/ml, o IL-2 mas IL-12 y mAb C340 como se indica. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y se ensayaron para IFNy mediante EIA.

La figura 6 es un histograma que muestra la inhibicion dependiente de dosis de la citotoxicidad de celulas LAK inducidas con IL-12 mas IL-2 por un mAb humano anti-IL-12 (C340). Las celulas efectoras LAK (PBL humanas, 8 x 106/ml) se cultivaron durante 24 horas con IL-12 (400 ng/ml) mas IL-2 (10 U/ml) y mAb C340 (5000ng/ml o 50 ng/ml, como se indica). Las celulas efectoras LAK se lavaron y se cultivaron con celulas diana Raji marcadas con 51Cr durante cuatro horas a una relacion de efector a diana (E:T) de 80:1, y se midio la cantidad de 51Cr liberado en el medio tras la lisis de las celulas Raji. Los resultados se expresan como la media de tres donantes normales y error estandar. El control positivo de IL-12 (IL-12) son celulas efectoras incubadas con IL-12 y sin anticuerpo. El fondo (FONDO) es celulas efectoras incubadas sin IL-12 ni anticuerpo.

Las figuras 7A y 7B son histogramas que muestran que la expresion de CD95 inducida por IL-12 mas IL-2 en celulas mononucleares CD3+ de sangre periferica se inhibe por mAb humano anti-IL-12 (C340). Se cultivaron las PBMC durante 72 horas en medio que contema 0,1 ng/ml de IL-12 y una dosis suboptima de IL-2 (50 UI/ml) en presencia o ausencia del mAb C340 (10 pg/ml). La expresion de CD95 se midio mediante citometna de flujo de las celulas tenidas con anti-CD95-FITC. La seleccion de poblaciones se realizo usando analisis de dos colores (CD3 o CD56-PE frente a CD95-FITC) y dispersion de la luz frontal frente a ortogonal.

La figura 8 es un grafico que muestra que los anticuerpos humanos recombinantes anti-IL-12 humana (rC340) se unen a IL-12 inmovilizada en una manera que es indistinguible del mAb C340 purificado. Se determino la concentracion de rC340 en los sobrenadantes de tres lmeas celulares productoras de rC340, y los sobrenadantes se evaluaron para la union a IL-12 en un ELISA. Las placas se cubrieron con IL-12 humana 2 pg/ml y se incubaron con mAb C340 purificado del hibridoma original (estandar) o los sobrenadantes de las imeas celulares recombinantes. Se detecto el anticuerpo unido a IL-12 usando IgG (cadena pesada + cadena ligera) anti-humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina.

Las figuras 9A-9C son graficos que muestran la cinetica de crecimiento y la cantidad de anticuerpo secretado por tres subclones de celulas recombinantes productoras de rC340 derivados independientemente (Figura 9A, subclon C379B; figura 9B, subclon C381A; Figura 9C, subclon C389A). Las celulas recombinantes se sembraron en botellas T75 a una densidad inicial de 2 x 105 celulas/ml en medio estandar. A varios tiempos, las celulas se resuspendieron y se determino el numero de celulas vivas y la cantidad (pg/ml) de rC340 en el medio.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona anticuerpos humanos anti-IL-12 aislados, recombinantes y/o sinteticos, as^ como composiciones y moleculas de acido nucleico codificantes que comprenden al menos un polinucleotido que codifica al menos un anticuerpo anti-IL-12 de la invencion. La presente invencion incluye ademas, pero no esta limitada a, usos de tales anticuerpos, por ejemplo en composiciones diagnosticas y terapeuticas, metodos y dispositivos.

Como se usa aqrn, un “anticuerpo anti-interleuquina-12”, “anticuerpo anti-IL-12”, “parte de anticuerpo anti- IL-12” o “fragmento de anticuerpo anti-IL-12” y/o “variante de anticuerpo anti-IL-12” y similares incluye cualquier molecula que contiene protema o peptido que contiene al menos una parte de una molecula de inmunoglobulina, tal como pero no limitada a al menos una region determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una parte de union al ligando de la misma, una region variable de una cadena pesada o una cadena ligera, una region constante de una cadena pesada o una cadena ligera, una region marco, o cualquier parte de la misma, o al menos una parte de un receptor o protema de union a IL-12, que se puede incorporar en un anticuerpo de la presente invencion. Tal anticuerpo opcionalmente ademas afecta a un ligando espedfico, tal como pero no limitado a donde tal anticuerpo modula, disminuye, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloquea, inhibe, abroga y/o interfiere con al menos una actividad o union de IL-12, o con la actividad o union de receptor de IL-12, in vitro, in situ y/o in vivo. Como ejemplo no limitante, un anticuerpo anti-IL-12 adecuado, porcion o variante especificada de la presente invencion se puede unir al menos a una IL-12, o partes especificadas, variantes o dominios de las mismas. Un anticuerpo anti-IL-12 adecuado, parte especificada, o variante tambien puede opcionalmente afectar al menos a una actividad o funcion de IL-12, tal como pero no limitada a smtesis de ARN, ADN o protema, liberacion de IL-12, senalizacion del receptor de IL-12, corte de IL-12 de membrana, actividad de IL-12, produccion y/o smtesis de IL-12. El termino “anticuerpo” se pretende ademas que abarque anticuerpos, fragmentos de digestion, partes especificadas y variantes de los mismos, incluyendo mimeticos de anticuerpos, o que comprenden partes de anticuerpos que mimetizan la estructura y/o funcion de un anticuerpo o fragmento especificado o parte del mismo, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de union a antfgeno que se unen a IL-12 de mairnfero. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a IL-12 o partes de la misma, incluyendo, pero no limitados a fragmentos Fab (por ejemplo, mediante digestion con papama), Fab' (por ejemplo, mediante digestion con pepsina y reduccion parcial) y F(ab')2 (por ejemplo, mediante digestion con pepsina), fabc (por ejemplo, mediante digestion con plasmina), pFc' (por ejemplo, mediante digestion con pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, mediante digestion con pepsina, reduccion parcial y reagregacion), Fv o scFv (por ejemplo, mediantes tecnicas de biologfa molecular), estan abarcados por la invencion (ver, por ejemplo, Colligan, Immunology, supra).

Tales fragmentos se pueden producir mediante corte enzimatico, tecnicas sinteticas o recombinantes, como se sabe en la tecnica y/o como se describe aqrn. Los anticuerpos tambien se pueden producir en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpos en los que se han introducido uno o mas codones de terminacion 5' del sitio natural de terminacion. Por ejemplo, se puede disenar un gen combinacion que codifique una parte de cadena pesada F(ab')2 para incluir secuencias de ADN que codifiquen el dominio CH1 y/o la region bisagra de la cadena pesada. Las diferentes partes de los anticuerpos se pueden unir qmmicamente mediante tecnicas convencionales, o se pueden preparar como una protema contigua usando tecnicas de ingeniena genetica.

Como se usa aqrn, el termino “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo en el que sustancialmente cada parte de la protema (por ejemplo, CDR, marco, dominios Cl, Ch (por ejemplo, Ch1, Ch2, Ch3), bisagra, (Vl, Vh)) es sustancialmente no inmunogenica en seres humanos, con solo cambios o variaciones minoritarios de secuencia. De forma similar, los anticuerpos designados de primate (mono, babuino, chimpance, etc.), de roedor (raton, rata, conejo, cobaya, hamster, y similares) y de otros mamfferos designan tales anticuerpos espedficos de especie, subgenero, genero, subfamilia, familia. Ademas, los anticuerpos quimericos incluyen cualquier combinacion de los anteriores. Tales cambios o variaciones opcionalmente y preferiblemente retienen o reducen la inmunogenicidad en seres humanos u otras especies relativos a los anticuerpos no modificados. De esta manera, un anticuerpo humano es distinto de un anticuerpo quimerico o humanizado. Se senala que un anticuerpo humano se puede producir por un animal no humano o celula procariota o eucariota que es capaz de expresar genes de inmunoglobulina humana (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena ligera) funcionalmente reorganizados. Ademas, cuando un anticuerpo humano es un anticuerpo de cadena sencilla, puede comprender un peptido enlazador que no se encuentra en los anticuerpos nativos humanos. Por ejemplo, un Fv puede comprender un peptido enlazador, tal como de dos hasta alrededor de ocho glicinas u otros residuos de aminoacidos, que une la region variable de la cadena pesada y la region variable de la cadena ligera. Tales peptidos enlazadores se considera que son de origen humano.

Tambien se pueden usar anticuerpos biespedficos, heteroespedficos, heteroconjugados o similares que son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de union para al menos dos antfgenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de union es para al menos una protema IL-12, la otra es para cualquier otro antfgeno. Los metodos para hacer anticuerpos biespedficos son conocidos en la tecnica. Tradicionalmente, la produccion recombinante de anticuerpos biespedficos se basa en la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

co-expresion de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)). Debido a la variedad al azar de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas diferentes de anticuerpos, de las cuales solo una tiene la estructura biespedfica correcta. La purificacion de la molecula correcta, que normalmente se hace mediante pasos de cromatograffa de afinidad, es bastante incomoda, y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se divulgan, por ejemplo en WO 93/08829, Patentes de EE.UU. Nos. 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

Los anticuerpos anti-IL-12 (tambien denominados anticuerpos IL-12) de la presente invencion se pueden caracterizar opcionalmente mediante union de alta afinidad a IL-12 y opcionalmente y preferiblemente como que tienen baja toxicidad. En particular, un anticuerpo de la invencion, donde los componentes individuales, tal como la region variable, la region constante y marco, individualmente y/o colectivamente, opcionalmente y preferiblemente poseen inmunogenicidad baja, es util en la presente invencion. Los anticuerpos que se pueden usar en la invencion se caracterizan opcionalmente por su capacidad para tratar pacientes durante periodos extensos con mejora medible de smtomas y toxicidad baja y/o aceptable. Inmunogenicidad baja o aceptable y/o afinidad alta, asf como otras propiedades adecuadas, pueden contribuir a los resultados terapeuticos alcanzados. “Inmunogenicidad baja” se define aqrn como que aumenta las respuestas HAHA, HACA o HAMA significativas en menos de alrededor del 75%, o preferiblemente menos de alrededor del 50% de los pacientes tratados y/o que aumenta tftulos bajos en el paciente tratado (menos de alrededor de 300, preferiblemente menos de alrededor de 100 medido con un inmunoensayo enzimatico de doble antfgeno) (ver, por ejemplo, Elliott et al., Lancet 344/1125-1127 (1994)).

Utilidad

Los acidos nucleicos aislados de la presente invencion se pueden usar para la produccion de al menos un anticuerpo anti-IL-12 o variantes especificadas del mismo, que se pueden usar para medir o efectuar en una celula, tejido, organo o animal (incluyendo mairnferos y seres humanos), para diagnosticar, seguir, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los smtomas de, al menos una afeccion de IL-12, seleccionada de, pero no limitada a, al menos un trastorno o enfermedad inmune, un trastorno o enfermedad cardiovascular, un trastorno o enfermedad infecciosa, maligna y/o neurologica, u otras afecciones conocidas o especificadas relacionadas con IL- 12.

Tal metodo puede comprender administrar una cantidad eficaz de una composicion o una composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-12 a una celula, tejido, organo, animal o paciente en necesidad de tal modulacion, tratamiento, alivio, prevencion o reduccion en los smtomas, efectos o mecanismos. La cantidad eficaz puede comprender una cantidad de alrededor de 0,001 a 500 mg/kg por administracion individual (por ejemplo, bolus), multiple o continua, o para alcanzar una concentracion en suero de 0,01-5000 pg/ml de concentracion en suero por administracion individual, multiple o continua, o cualquier intervalo eficaz o valor en el mismo, como se hace y determina usando metodos conocidos, como se describe aqrn o se conoce en las tecnicas relevantes.

Citas

Todas las publicaciones o patentes citadas aqrn muestran el estado de la tecnica en el momento de la presente invencion y/o proporcionan descripcion y ejecutabilidad de la presente invencion. Las publicaciones se refieren a cualquier publicacion cientffica o de patente, o cualquier otra informacion disponible en cualquier formato incluyendo todos los formatos registrados, electronicos o impresos. Se mencionan espedficamente las siguientes referencias: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (19872001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edicion, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Anticuerpos de la presente invencion

Al menos un anticuerpo anti-IL-12 de la presente invencion se puede opcionalmente producir por una lmea celular, una lmea celular mezclada, una celula inmortalizada o una poblacion clonica de celulas inmortalizadas, como se sabe bien en la tecnica. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edicion, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se pueden preparar anticuerpos humanos que son espedficos para protemas IL-12 humanas o fragmentos de los mismos contra un antfgeno inmunogenico apropiado, tal como protema IL-12 aislada y/o protema IL-12 o una parte de la misma (incluyendo moleculas sinteticas, tal como peptidos sinteticos). Se pueden hacer de forma similar otros anticuerpos de mairnferos espedficos o generales. La preparacion de antigenos inmunogenicos, y la produccion de anticuerpos monoclonales se pueden realizar usando cualquier tecnica adecuada.

En un planteamiento, se produce un hibridoma fusionando una lmea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una lmea celular de mieloma tal como, pero no limitada a, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, o similares, o heteromielomas, productos de fusion de los mismos, o cualquier celula o celula fusionada derivada de las mismas, o cualquier otra lmea celular adecuada conocida en la tecnica. Ver, por ejemplo, www.atcc.org,
www.lifetech.com, y similares, con celulas productoras de anticuerpos, tal como, pero no limitado a celulas que contienen celulas inmunes o B aisladas o clonadas de bazo, sangre periferica, linfa, amfgdala u otras celulas, o cualquier otra celula que expresa secuencias constantes o variables o marco o CDR de cadena pesada o ligera, como acido nucleico endogeno o heterologo, como ADN recombinante o endogeno, vmco, bacteriano, de alga, procariota, de anfibio, insecto, reptil, pez, mam^era, roedor, equino, ovino, de cabra, oveja, primate, eucariota, genomico, ADNc, ADNr, ADN o ARN mitocondrial, ADN o ARN de cloroplasto, ARNhn, ARNm, ARNt, monocatenario, bicatenario, tricatenario, hibridado, y similares o cualquier combinacion de los mismos. Ver, por ejemplo, Ausubel, supra, y Colligan, Immunology, supra, capttulo 2.

Tambien se pueden obtener celulas productoras de anticuerpo de sangre periferica o, preferiblemente de bazo o ganglios linfaticos, de seres humanos u otros animales adecuados que se han inmunizado con el antfgeno de interes. Tambien se puede usar cualquier otra celula huesped adecuada para expresar acidos nucleicos endogenos o heterologos que codifican un anticuerpo, fragmento especificado o variante del mismo, de la presente invencion. Las celulas fusionadas (hibridomas) o celulas recombinantes se pueden aislar usando condiciones selectivas de cultivo u otros metodos adecuados conocidos, y clonar mediante dilucion limitante o separacion de celulas, u otros metodos conocidos. Se pueden seleccionar las celulas que producen anticuerpos con la especificidad deseada mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA).

Se pueden usar otros metodos adecuados de producir o aislar anticuerpos de la especificidad precisa, incluyendo, pero no limitado a, metodos que seleccionan anticuerpos recombinantes de una librena de peptidos o protemas, por ejemplo, pero no limitado a, bacteriofago, ribosoma, oligonucleotido, ARN, ADNc, o similar, librena de presentacion; por ejemplo, disponible de Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, dE; Biovation, Aberdeen, Escocia, UK: BioInvent, Lund, Suecia; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. Ver, por ejemplo, EP 368684, PCT/GB91/01134; PCT/gB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260 (5/12/94); PCT/GB94/01422;

PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); W090/14443; W090/14424; W090/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); W095/16027 (BioInvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); US 4704692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); W089/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); o peptidos o protemas generados estocasticamente - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, ahora Applied Molecular Evolution (AME) o que se basan en la inmunizacion de animales transgenicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93:154161 (1998), asf como patentes y solicitudes relacionadas) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se conoce en la tecnica y/o como se describe aqur Tales tecnicas, incluyen, pero no estan limitadas a, presentacion en ribosomas (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (Mayo 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)); tecnologfas de produccion de anticuerpo por celula individual (por ejemplo, metodo de anticuerpo de linfocito seleccionado (“SLAM”) (patente de EE.UU. No. 5627052, Wen et al., J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)); microgota de gel y citometna de flujo (Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)); seleccion de celulas B (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Pafses Bajos (1988)).

Tambien se pueden usar metodos para manipular o humanizar anticuerpos no humanos o humanos y son bien conocidos en la tecnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado o manipulado tiene uno o mas residuos de aminoacidos de una fuente que es no humana, por ejemplo, pero no limitado a raton, rata, conejo, primate no humano u otro mai^ero. Estos residuos de aminoacidos humanos con frecuencia se denominan residuos “importados”, que tfpicamente se toman de un dominio variable constante u otro “importado” de una secuencia humana conocida. Las secuencias de IgG humanas conocidas se divulgan, por ejemplo, en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/;
www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html;
www.mgen.uni- heidelberg.de/SD/IT/IT.html;
www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html;
www.antibodyresource.com/;

mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.
www.immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/~hcl/;www.pebio.com/pa/340913/340913.html;
www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.rn.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html;www.biodesign.com/table.asp;
www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html;www.isacnet.org/sites_geo.html;aximt1.imt.uni- marburg.de/~rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html;
www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/int-doc/public/INTRO.html;
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:81041/; www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide0l.html;
www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;
www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html;
www.jerini.de/fr_products.htm;
www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud de EE.UU. (1983). Tales secuencias importadas se pueden usar para reducir la inmunogenicidad o reducir, aumentar o modificar la union, afinidad, asociacion, disociacion, avidez, especificidad, vida media, o cualquier otra caractenstica adecuada, como se sabe en la tecnica. Generalmente parte o todas las secuencias CDR no humanas o humanas se mantienen mientras que las secuencias no humanas de las regiones variables y constantes se cambian con aminoacidos humanos u otros. Los anticuerpos tambien se pueden opcionalmente humanizar con retencion de la alta afinidad por el antfgeno y otras propiedades biologicas favorables. Para alcanzar este fin, los anticuerpos humanizados se pueden preparar opcionalmente mediante un proceso de analisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de las inmunoglobulinas estan normalmente disponibles y son familiares para los expertos en la materia. Hay disponibles programas de ordenador que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias candidatas de inmunoglobulinas seleccionadas. La inspeccion de estas presentaciones permite el analisis de los posibles papeles de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de la inmunoglobulina, es decir, el analisis de residuos que tienen influencia en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antfgeno. De esta manera, se pueden seleccionar y combinar residuos FR a partir de las secuencias consenso e importadas de modo que se alcance la caractenstica deseada del anticuerpo, tal como afinidad aumentada para el/los antfgeno(s) diana. En general, los residuos CDR estan directamente y mas sustancialmente implicados en influenciar la union al antfgeno. Se puede realizar la humanizacion o manipulacion de anticuerpos de la presente invencion usando cualquier metodo conocido, tal como pero no limitado a los descritos en, Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), patentes de EE.UU. Nos: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; W090/14443, W090/14424, W090/14430, EP 229246.

El anticuerpo anti-IL-12 tambien se puede generar opcionalmente mediante inmunizacion de un animal transgenico (por ejemplo, raton, rata, hamster, primate no humano, y similares) capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se describe aqrn y/o como se conoce en la tecnica. Las celulas que producen un anticuerpo humano anti-IL-12 se pueden aislar de tales animales e inmortalizar usando metodos adecuados, tal como los metodos descritos aquL

Se pueden producir ratones transgenicos que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos que se unen a antfgenos humanos mediante metodos conocidos (por ejemplo, pero no limitados a las patentes de EE.UU. Nos. 5770428, 5569825, 5545806, 5625126, 5625825, 5633425, 5661016 y 5789650 concedida a Lonberg et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al., patente de EE.UU. No. 5545807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al., Int. Inmunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90(8):3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1 ):65-93 (1995) y Fishwald et al., Nat Biotechnol 14(7): 845-851 (1996). Generalmente, estos ratones comprenden al menos un transgen que comprende ADN de al menos un locus de inmunoglobulina humana que esta funcionalmente reorganizado, o que puede sufrir reorganizacion funcional. Los loci endogenos de inmunoglobulina en tales ratones se pueden desorganizar o delecionar para eliminar la capacidad del animal de producir anticuerpos codificados por genes endogenos.

Se puede realizar de forma conveniente el cribado de anticuerpos para union espedfica a protemas o fragmentos similares usando librenas de presentacion de peptidos. Este metodo implica el cribado de grandes colecciones de peptidos para miembros individuales que tienen la funcion o estructura deseada. El cribado de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

anticuerpos de libreiias de presentacion de peptidos es bien conocido en la tecnica. Las secuencias de peptidos presentadas pueden tener desde 3 a 5000 o mas aminoacidos de longitud, frecuentemente de 5-100 aminoacidos de longitud, y con frecuencia desde alrededor de 8 a 25 aminoacidos de longitud. Ademas de metodos qmmicos de smtesis para generar librenas de peptidos, se han descrito varios metodos de ADN recombinante. Un tipo implica la presentacion de una secuencia peptfdica en la superficie de un bacteriofago o celula. Cada bacteriofago o celula contiene la secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia peptfdica particular presentada. Tales metodos se describen en las publicaciones de patentes PCT Nos. 91/17271, 91/18980, 91/19818, y 93/08278. Otros sistemas para generar librenas de peptidos tienen aspectos tanto de smtesis qmmica in vitro como de metodos recombinantes. Ver, las publicaciones de patente de PCT Nos. 92/05258, 92/14843 y 96/19256. Ver tambien, las patentes de EE.UU. Nos. 5658754; y 5643768. Las librenas de presentacion de peptidos, vectores y kits de cribado estan comercialmente disponibles de tales suministradores como Invitrogen (Carlsbad, CA), y Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, cedidas a Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, cedidas a Dyax, 5427908, 5580717, cedidas a Affymax; 5885793, cedida a Cambridge antibody Technologies; 5750373, cedida Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, cedidas a Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; o Sambrook, supra.

Tambien se pueden preparar los anticuerpos de la presente invencion usando al menos un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-12 para proporcionar animales o mairnferos transgenicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas, y similares, que produzcan tales anticuerpos en su leche. Tales animales se pueden proporcionar usando metodos conocidos. Ver, por ejemplo, pero no limitado a, las patentes de EE.uU. nos. 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616; 5565362; 5304489, y similares.

Los anticuerpos de la presente invencion se pueden preparar ademas usando al menos un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-12 para proporcionar plantas transgenicas y celulas vegetales cultivadas (por ejemplo, pero no limitado a tabaco y mafz) que producen tales anticuerpos, partes especificadas o variantes en las partes de la planta o en celulas cultivadas de ellas. Como ejemplo no limitante, se han usado con exito hojas de tabaco transgenico que expresan protemas recombinantes para proporcionar grandes cantidades de protemas recombinantes, por ejemplo usando un promotor inducible. Ver, por ejemplo, Cramer et al, Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) y las referencias citadas allL Ademas, se ha usado mafz transgenico para expresar protemas de mai^ero a niveles de produccion comercial, con actividades biologicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas de fuentes naturales. Ver, por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) y las referencias citadas allL Tambien se han producido anticuerpos en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgenicas incluyendo fragmentos de anticuerpos, tal como anticuerpos de cadena sencilla (scFv), incluyendo semillas de tabaco y tuberculo de patata. Ver, por ejemplo, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) y las referencias citadas allL De esta manera, los anticuerpos de la presente invencion tambien se pueden producir usando plantas transgenicas, segun metodos conocidos. Ver tambien, por ejemplo, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994); y las referencias citadas allb

Los anticuerpos de la invencion se pueden unir a IL-12 con un amplio rango de afinidades (Kd). En una forma de realizacion preferida, al menos un mAb humano de la presente invencion se puede unir opcionalmente a IL- 12 humana con gran afinidad. Por ejemplo, un mAb humano se puede unir a IL-12 con una Kd igual a o menor de alrededor de 10'7 M, tal como pero no limitada a 0,1-9,9 (o cualquier rango o valor dentro) X 10'7, 10'8, 10'9, 10'10, 10' ii, 10-12, 10‘13 o cualquier rango o valor dentro del mismo.

La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antfgeno se puede determinar experimentalmente usando cualquier metodo adecuado. (Ver, por ejemplo, Berzofsky, et al., “Antibody-Antigen Interactions,” En Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992); y los metodos descritos allf). La afinidad de una interaccion anticuerpo-antfgeno particular medida puede variar si se mide en condiciones diferentes (por ejemplo, concentracion de sal, pH). De esta manera, las medidas de afinidad y otros parametros de union a antfgeno (por ejemplo, Kd, Ka, Kd) se hacen preferiblemente con soluciones normalizadas de anticuerpo y antfgeno, y un tampon normalizado, tal como el tampon descrito aqub

Moleculas de acido nucleico

Usando la informacion proporcionada aqrn, se puede obtener una molecula de acido nucleico de la presente invencion que codifica al menos un anticuerpo anti-IL-12 usando metodos descritos aqrn o conocidos en la tecnica.

Las moleculas de acido nucleico de la presente invencion pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, ARNhn, ARNt o cualquier otra forma, o en forma de ADN, incluyendo, pero no limitado a, ADNc y ADN genomico obtenidos mediante clonacion o producido sinteticamente, o cualquier combinacion de los mismos. El ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario, o cualquier combinacion de los mismos. Cualquier parte de al menos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

una hebra del ADN o ARN puede ser la hebra codificante, tambien conocida como la hebra sentido, o puede ser la hebra no codificante, tambien denominada hebra anti-sentido.

Las moleculas de acido nucleico aisladas divulgadas aqrn incluyen moleculas de acido nucleico que comprenden un marco abierto de lectura (ORF), opcionalmente con uno o mas intrones, por ejemplo, pero no limitado a, al menos una parte especificada de al menos una CDR, como CDR1, CDR2 y/o CDR3 de al menos una cadena pesada (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1-3) o cadena ligera (por ejemplo, SEQ iD NOS: 4-6); moleculas de acido nucleico que comprenden la region codificante de un anticuerpo anti-IL-12 o region variable (por ejemplo, SEQ ID NOS: 7, 8); y moleculas de acido nucleico que comprenden una secuencia de nucleotidos sustancialmente diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneracion del codigo genetico, todavfa codifican al menos un anticuerpo anti-IL-12 como se describe aqrn y/o como se conoce en la tecnica. Por supuesto, el codigo genetico es bien conocido en la tecnica. De esta manera, sena rutinario para el experto en la materia generar tales variantes degeneradas de acido nucleico que codifican anticuerpos anti-IL-12 espedficos de la presente invencion. Ver, por ejemplo, Ausubel et al., supra. Ejemplos no limitantes de moleculas aisladas de acido nucleico incluyen SEQ ID NO: 8, correspondiente a ejemplos no limitantes de un acido nucleico que codifica, respectivamente, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, region variable de HC y region variable de LC.

Como se indica aqrn, las moleculas de acido nucleico de la presente invencion que comprenden un acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-12 pueden incluir, pero no estan limitadas a, aquellas que codifican la secuencia de aminoacidos de un fragmento de anticuerpo, por sf mismo; la secuencia codificante del anticuerpo entero o una parte del mismo; la secuencia codificante de un anticuerpo, fragmento o parte, asf como secuencias adicionales, tal como la secuencia codificante de al menos un peptido senal lfder o de fusion, con o sin las secuencias codificantes anteriormente mencionadas, tal como al menos un intron, junto con secuencias adicionales no codificantes, incluyendo, pero no limitadas a, secuencias no codificantes 5' y 3', tal como las secuencias transcritas no traducidas que desempenan un papel en la transcripcion, procesamiento de ARNm, incluyendo senales de ayuste y poliadenilacion (por ejemplo - union a ribosomas y estabilidad de ARNm); una secuencia codificante adicional que codifica aminoacidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. De esta manera, la secuencia que codifica un anticuerpo se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un peptido que facilita la purificacion del anticuerpo fusionado que comprende un fragmento o parte de anticuerpo.

Polinucleotidos que hibridan selectivamente con un polinucleotido descrito aqrn

La presente especificacion divulga acidos nucleicos aislados que hibridan en condiciones selectivas de hibridacion con los polinucleotidos divulgados aqrn. De esta manera, se pueden usar los polinucleotidos para aislar, detectar y/o cuantificar acidos nucleicos que comprenden tales polinucleotidos. Por ejemplo, se pueden usar los polinucleotidos para identificar, aislar, o amplificar clones parciales o completos en una genoteca depositada. En algunos casos, los polinucleotidos son secuencias de ADN genomico o ADNc aisladas, o de otra manera complementarias a, un ADNc de una genoteca de acido nucleico humano o de mairnfero.

Preferiblemente, la genoteca de ADNc comprende al menos el 80% de secuencias completas, preferiblemente al menos el 85% o el 90% de secuencias completas, y mas preferiblemente al menos el 95% de secuencias completas. Las genotecas de ADNc se pueden normalizar para aumentar la representacion de especies infrecuentes. Tfpicamente, pero no exclusivamente, se emplean condiciones de hibridacion poco rigurosas o moderadas con secuencias que tienen una identidad de secuencia reducida respecto a las secuencias complementarias. Opcionalmente se pueden emplear condiciones moderadas y muy rigurosas para secuencias de mayor identidad. Las condiciones poco rigurosas permiten la hibridacion selectiva de secuencias que tienen alrededor del 70% de identidad de secuencia y se pueden emplear para identificar secuencias ortologas o paralogas.

Opcionalmente, los polinucleotidos codificaran al menos una parte de un anticuerpo codificado por los polinucleotidos descritos aqrn. Los polinucleotidos abarcan secuencias de acidos nucleicos que se pueden emplear para la hibridacion selectiva a un polinucleotido que codifica un anticuerpo de la presente invencion. Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra.

Construccion de acidos nucleicos

Los acidos nucleicos aislados de la presente invencion se pueden hacer usando (a) metodos recombinantes, (b) tecnicas sinteticas, (c) tecnicas de purificacion, o combinaciones de las mismas, como es bien sabido en la tecnica.

Los acidos nucleicos pueden comprender de forma conveniente secuencias ademas de un polinucleotido de la presente invencion. Por ejemplo, se puede insertar un sitio de multi-clonacion que comprende uno o mas sitios de endonucleasas de restriccion en el acido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleotido. Ademas, se pueden insertar secuencias traducibles para ayudar en el aislamiento del polinucleotido traducido de la presente invencion. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

las protemas de la presente invencion. El acido nucleico de la presente invencion - excluyendo las secuencias codificantes - es opcionalmente un vector, adaptador o enlazador para la clonacion y/o expresion de un polinucleotido de la presente invencion.

Se pueden anadir secuencias adicionales a tales secuencias de clonacion y/o expresion para optimizar su funcion en la clonacion y/o expresion, para ayudar en el aislamiento del polinucleotido, o para mejorar la introduccion del polinucleotido en una celula. El uso de vectores de clonacion, vectores de expresion, adaptadores y enlazadores es bien conocido en la tecnica. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra).

Metodos recombinantes para construir acidos nucleicos

Las composiciones aisladas de acido nucleico de esta invencion, tales como ARN, ADNc, ADN genomico, o cualquier combinacion de los mismos, se pueden obtener de fuentes biologicas usando cualquiera de las metodologfas de clonacion conocidas por los expertos en la materia. En algunas formas de realizacion, se usan sondas de oligonucleotidos que hibridan de forma selectiva, en condiciones rigurosas, con los polinucleotidos de la presente invencion para identificar la secuencia deseada en una genoteca de ADNc o ADN genomico. El aislamiento de ARN y la construccion de genotecas de ADNc o genomico, es bien conocido para el experto en la materia. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra).

Metodos de cribado y aislamiento de acidos nucleicos

Se puede cribar una genoteca de ADNc o genomico usando una sonda basada en la secuencia de un polinucleotido de la presente invencion, tales como los divulgados aquL Se pueden usar las sondas para hibridar con secuencias de ADN genomico o ADNc para aislar genes homologos en el mismo o en diferentes organismos. Los expertos en la materia apreciaran que se pueden emplear varios grados de rigor de hibridacion en el ensayo; y bien el medio de hibridacion o el de lavado puede ser riguroso. Cuando las condiciones de hibridacion se hacen mas rigurosas, debe haber un mayor grado de complementariedad entre la sonda y la diana para se produzca la formacion de un duplex. Se puede controlar el grado de rigor mediante uno o mas de temperatura, fuerza ionica, pH y la presencia de un solvente parcialmente desnaturalizante tal como formamida. Por ejemplo, el rigor de la hibridacion se vana convenientemente cambiando la polaridad de la reaccion reactiva mediante, por ejemplo, la manipulacion de la concentracion de formamida dentro del intervalo del 0% al 50%. El grado de complementariedad (identidad de secuencia) requerido para la union detectable variara segun el rigor del medio de hibridacion y/o del medio de lavado. El grado de complementariedad sera optimamente del 100%, o del 70-100%, o cualquier intervalo o valor dentro del mismo. Sin embargo, se debe entender que se pueden compensar las variaciones minoritarias de secuencia en las sondas y cebadores reduciendo el rigor del medio de hibridacion y/o de lavado.

Los metodos de amplificacion de ARN o ADN se conocen bien en la tecnica y se pueden usar segun la presente invencion sin experimentacion excesiva, basado en las ensenanzas y directrices presentadas aquL

Los metodos conocidos de amplificacion de ADN o ARN incluyen, pero no estan limitados a, reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y procesos de amplificacion relacionados (ver por ejemplo las patentes de EE.UU. Nos. 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, a Mullis, et al.; 4795699 y 4921794 a Tabor, et al; 5142033 a Innis; 5122464 a Wilson, et al.; 5091310 a Innis; 5066584 a Gyllensten, et al; 4889818 a Gelfand, et al; 4994370 a Silver, et al; 4766067 a Biswas; 4656134 a Ringold) y amplificacion mediada por ARN que usa ARN antisentido a la secuencia diana como molde para la smtesis de ADN bicatenario (Patente de EE.uU. No. 5130238 a Malek et al., con el nombre comercial de nAsBA). (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra).

Por ejemplo, se puede usar la tecnologfa de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de polinucleotidos de la presente invencion y genes relacionados directamente de genotecas de ADN genomico o ADNc. La PCR y otros metodos de amplificacion in vitro tambien pueden ser utiles, por ejemplo, para clonar secuencias de acido nucleico que codifican protemas a ser expresadas, para hacer acidos nucleicos para usar como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para la secuenciacion de acidos nucleicos, o para otros fines. Los ejemplos de tecnicas suficientes para dirigir a los expertos a traves de metodos de amplificacion in vitro se encuentran en Berger, supra, Sambrook, supra, y Ausubel, supra, asf como en Mullis, et al., patente de EE.UU. No. 4683202 (1987); e Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). En la tecnica se conocen kits comercialmente disponibles para la amplificacion genomica por PCR. Ver, por ejemplo, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Ademas, por ejemplo, se puede usar la protema 32 del gen de T4 (Boehringer Mannheim) para mejorar el rendimiento de productos de PCR largos.

Metodos sinteticos para construir acidos nucleicos

Los acidos nucleicos aislados de la presente invencion tambien se pueden preparar mediante smtesis qmmica directa por metodos conocidos (ver, por ejemplo, Ausubel, et al., supra). La smtesis qmmica generalmente produce un oligonucleotido monocatenario, que se puede convertir a ADN bicatenario mediante hibridacion con una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

secuencia complementaria, o mediante polimerizacion con una ADN polimerasa usando la cadena sencilla como molde. El experto en la materia reconocera que mientras la smtesis qmmica de ADN puede estar limitada a secuencias de alrededor de 100 o mas bases, se pueden obtener secuencias mas largas mediante la ligacion de secuencias mas cortas.

Casetes de expresion recombinantes

La presente invencion proporciona ademas casetes de expresion recombinantes que comprenden un acido nucleico de la presente invencion. Se puede usar una secuencia de acido nucleico de la presente invencion, por ejemplo un ADNc o una secuencia genomica que codifica un anticuerpo de la presente invencion, para construir un casete de expresion recombinante que se puede introducir en al menos una celula huesped deseada. Un casete de expresion recombinante tfpicamente comprendera un polinucleotido de la presente invencion operativamente unido a secuencias reguladoras del inicio de la transcripcion que dirigiran la transcripcion del polinucleotido en la celula huesped deseada. Se pueden emplear promotores tanto heterologos como no heterologos (es decir, endogenos) para dirigir la expresion de los acidos nucleicos de la presente invencion.

En algunas formas de realizacion, se pueden introducir acidos nucleicos aislados que sirven como promotor, potenciador, u otros elementos en la posicion adecuada (5', 3', o en un intron) de una forma no heterologa de un polinucleotido de la presente invencion de modo que aumente o disminuya la expresion de un polinucleotido de la presente invencion. Por ejemplo, se pueden cambiar los promotores endogenos in vivo o in vitro mediante mutacion, delecion y/o sustitucion.

Vectores y celulas huesped

La presente invencion tambien se refiere a vectores que incluyen moleculas aisladas de acido nucleico de la presente invencion, celulas huesped que estan geneticamente manipuladas con los vectores recombinantes, y la produccion de al menos un anticuerpo anti-IL-12 mediante tecnicas recombinantes, como se sabe bien en la tecnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel, et al., supra.

Los polinucleotidos se pueden unir opcionalmente a un vector que contiene un marcador de seleccion para su propagacion en un huesped. Generalmente, se introduce un vector plasirndico en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un ftpido cargado. Si el vector es un virus, se puede empaquetar in vitro usando una lrnea celular empaquetadora apropiada y despues transducir en las celulas huesped.

El inserto de ADN debe estar operativamente unido a un promotor apropiado. Las construcciones de expresion contendran ademas sitios para el inicio de la transcripcion, la terminacion y, en la region transcrita, un sitio de union a ribosomas para la traduccion. La parte codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones preferiblemente incluira un inicio de traduccion al principio y un codon de terminacion (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente al final del ARNm a ser traducido, con UAA y UAG preferidos para expresion en celulas de mamferos o eucariotas.

Los vectores de expresion incluiran preferiblemente, pero opcionalmente, al menos un marcador de seleccion. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, pero no estan limitados a, resistencia a metotrexato (MTX), dihidrofolato reductasa (DHFR, patentes de EE.UU. Nos. 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), ampicilina, neomicina (G418), acido micofenolico, o glutamina sintetasa (GS, patentes de EE.UU. Nos. 5122464; 5770359; 5827739) para cultivo de celulas eucariotas, y genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias o procariotas. Los medios y condiciones de cultivo apropiados para las celulas huesped descritas anteriormente son conocidos en la tecnica. Los vectores seran facilmente aparentes al experto en la materia. La introduccion de una construccion de vector en una celula huesped se puede realizar mediante transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion medida por DEAE-dextrano, transfeccion mediada por ftpidos cationicos, electroporacion, transduccion, infeccion u otros metodos conocidos. Tales metodos estan descritos en la tecnica, tal como Sambrook, supra, capftulos 1-4 y 16-18; Ausubel, supra, capftulos 1, 9, 13, 15, 16.

Se puede expresar al menos un anticuerpo de la presente invencion en una forma modificada, tal como una protema de fusion, y puede incluir no solo senales de secrecion, sino tambien regiones funcionales heterologas adicionales. Por ejemplo, se puede anadir una region de aminoacidos adicionales, particularmente aminoacidos cargados, al extremo N de un anticuerpo para mejorar la estabilidad y la persistencia en la celula huesped, durante la purificacion, o durante el manejo y almacenamiento posteriores. Ademas, se pueden anadir grupos peptfdicos a un anticuerpo de la presente invencion para facilitar la purificacion. Tales regiones se pueden eliminar antes de la preparacion final de un anticuerpo o al menos un fragmento del mismo. Tales metodos se describen en muchos manuales estandar de laboratorio, tal como Sambrook, supra, capftulos 17.29-17.42 y 18.1-18.74; Ausubel, supra, capftulos 16, 17 y 18.

El experto en la materia esta informado de los numerosos sistemas de expresion disponibles para la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

expresion de un acido nucleico que codifica una protema de la presente invencion.

De forma alternativa, los acidos nucleicos de la presente invencion se pueden expresar en una celula huesped mediante encendido (mediante manipulacion) en una celula huesped que contiene ADN endogeno que codifica un anticuerpo de la presente invencion. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. Nos. 5580734, 5641670, 5733746, y 5733761.

Ilustrativo de cultivos celulares utiles para la produccion de anticuerpos, partes especificadas o variantes de los mismos, son celulas de mairnfero. Los sistemas de celulas de mairnfero con frecuencia estaran en forma de monocapas de celulas aunque tambien se pueden usar suspensiones o biorreactores de celulas de mairnfero. Se han desarrollado en la tecnica un numero de lmeas de celulas huespedes adecuadas capaces de expresar protemas glicosiladas intactas, e incluyen, las lmeas celulares COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10), CHO (por ejemplo, ATCC CRL 1610), y BSC-1 (por ejemplo, ATCC CRL-26), celulas Cos-7, celulas CHO, celulas hep G2, P3x63Ag8.653, SP2/0-Ag14, celulas 293, celulas HeLa y similares, que estan facilmente disponibles de, por ejemplo, la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Va (
www.atcc.org). Las celulas huesped preferidas incluyen celulas de origen linfoide tal como celulas de mieloma y linfoma. Celulas huesped particularmente preferidas son celulas P3X63Ag8.653 (numero de acceso de ATCC cRl-1580) y celulas SP2/0-Ag14 (numero de acceso de ATCC CRL-1851). En una forma de realizacion particularmente preferida, la celula recombinante es una celula P3X63Ag8.653 o una celula SP2/0-Ag14.

Los vectores de expresion para estas celulas pueden incluir uno o mas de las siguientes secuencias de control de la expresion, tal como, pero no limitadas a un origen de replicacion; un promotor (por ejemplo, los promotores tardfo o temprano de SV40, el promotor de CMV (patentes de EE.UU. Nos. 5168062, 5385839) un promotor tk de HSV, un promotor pgk (fosfoglicerato quinasa), un promotor EF-1 alfa (patente de EE.UU. No. 5266491), al menos un promotor de inmunoglobulina humana; un potenciador, y/o sitios de informacion de procesamiento, tal como sitios de union a ribosomas, sitios de ayuste de ARN, sitios de poliadenilacion (por ejemplo, un sitio de adicion de poli A del Ag T grande de SV40), y secuencias de terminacion de la transcripcion. Ver, por ejemplo, Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra. Otras celulas utiles para la produccion de acidos nucleicos o protemas de la presente invencion son conocidas y/o estan disponibles, por ejemplo, del catalogo de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo de Lmeas Celulares e Hibridomas (
www.atcc.org) o de otras fuentes comerciales conocidas.

Cuando se emplean celulas huesped eucariotas, ffpicamente se incorporan en el vector secuencias de poliadenilacion o de terminacion de la transcripcion. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilacion del gen de la hormona de crecimiento bovina. Tambien se pueden incluir secuencias para un ayuste exacto del transcrito. Un ejemplo de una secuencia de ayuste es el intron VP1 de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Ademas, se pueden incorporar en el vector secuencias genicas para el control de la replicacion en la celula huesped, como se sabe en la tecnica.

Purificacion de un anticuerpo

Se puede recuperar y purificar un anticuerpo anti-IL-12 de cultivos de celulas recombinantes mediante metodos bien conocidos incluyendo, pero no limitados a, purificacion con protema A, precipitacion con sulfato de amonio o etanol, extraccion acida, cromatograffa de intercambio anionico o cationico, cromatograffa en fosfocelulosa, cromatograffa de interaccion hidrofobica, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de hidroxilapatita y cromatograffa de lectina. Tambien se puede emplear cromatograffa ffquida de alta resolucion (“HPLC”) para la purificacion. Ver, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), por ejemplo, los capffulos 1, 4, 6, 8, 9, 10.

Los anticuerpos de la presente invencion incluyen productos purificados naturalmente purificados, productos de procedimientos de smtesis qmmica, y productos producidos mediante tecnicas recombinantes a partir de un huesped eucariota, incluyendo, por ejemplo, celulas de levadura, vegetales superiores, insecto y mairnfero. Dependiendo del huesped empleado en un procedimiento de produccion recombinante, el anticuerpo de la presente invencion puede estar glicosilado o puede estar no glicosilado, con glicosilado preferido. Tales metodos se describen en muchos manuales estandar de laboratorio, tal como Sambrook, supra, secciones 17.37-17.42, Ausubel, supra, capffulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science, supra, capftulo, 12-14.

Anticuerpos anti-IL-12

Los anticuerpos aislados de la presente invencion comprenden un anticuerpo codificado por cualquiera de los polinucleotidos de la presente invencion como se discute mas completamente aqrn, o cualquier anticuerpo aislado o preparado. Preferiblemente, el anticuerpo humano se une a IL-12 humana y, de esta manera neutraliza parcial o sustancialmente al menos una actividad biologica de la protema. Un anticuerpo que neutraliza parcialmente o preferiblemente sustancialmente al menos una actividad biologica de al menos una protema IL-12 o fragmento se puede unir a la protema o fragmento y de esta manera inhibe la actividad mediada a traves de la union de IL-12 al

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

receptor de IL-12 o traves de otros mecanismos dependientes o mediados por IL-12. Como se usa aqrn, el termino “anticuerpo neutralizante” se refiere a un anticuerpo que puede inhibir una actividad dependiente de IL-12 en aproximadamente el 20-120%, preferiblemente en al menos aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 98, el 99, el 100% o mas dependiendo del ensayo. La capacidad de un anticuerpo anti-IL-12 para inhibir una actividad dependiente de IL- 12 se evalua preferiblemente mediante al menos un ensayo adecuado de protema o receptor de IL-12, como se describe aqrn y/o como se conoce en la tecnica. Un anticuerpo humano de la invencion puede ser de cualquier clase (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) o isotipo y puede comprender una cadena ligera kappa o lambda. En una forma de realizacion, el anticuerpo humano comprende una cadena pesada IgG o fragmento definido, por ejemplo, al menos uno de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Los anticuerpos de este tipo se pueden preparar empleando un raton transgenico u otro mamfero transgenico no humano que comprende al menos un transgen de cadena ligera humana (por ejemplo, IgG, IgA e IgM (por ejemplo, y1, y2, y3, y4) como se describe aqu y/o como se sabe en la tecnica. En otra forma de realizacion, el anticuerpo humano anti-IL-12 humana comprende una cadena pesada IgG1 y una cadena ligera IgG1.

Al menos un anticuerpo de la invencion se une a al menos un epftopo especificado espedfico para al menos una protema IL-12, subunidad, fragmento, parte o cualquier combinacion de las mismas. El al menos un epftopo puede comprender al menos una region de union a anticuerpo que comprende al menos una parte de dicha protema, epftopo que preferiblemente comprende al menos una parte extracelular, soluble, hidrofflica, externa o citoplasmica de dicha protema. El al menos un epftopo especificado puede comprender cualquier combinacion de al menos una secuencia de aminoacidos de al menos 1-3 aminoacidos a la parte especificada entera de aminoacidos contiguos de la SEQ ID NO: 9.

El anticuerpo humano o fragmento de union al antfgeno del mismo de la presente invencion comprende una region de union al antfgeno que comprende tres CDR de cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2, y/o CDR3) que tienen la secuencia de aminoacidos de las CDR 1, 2 y/o 3 correspondientes (por ejemplo SEQ ID NO: 1, 2 y/o 3) y tres CDR de cadena ligera (es decir CDR1, CDR2, y/o CDR3) que tienen la secuencia de aminoacidos de las CDR 1, 2 y/o 3 correspondientes (por ejemplo, SEQ ID NO: 4,5 y/o 6). Las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera del anticuerpo o fragmento que se une al antfgeno tienen la secuencia de aminoacidos de la CDR correspondiente de al menos uno de mAB 12B75, C340, o cualquier otro descrito en la presente. Tales anticuerpos pueden prepararse uniendo qmmicamente entre sf las varias porciones (por ejemplo, CDR, marco) del anticuerpo usando tecnicas convencionales, preparando y expresando una (es decir, una o mas) molecula de acido nucleico que codifica el anticuerpo usando tecnicas convencionales de tecnologfa de ADN recombinante o usando cualquier otro metodo adecuado.

El anticuerpo anti-IL-12 comprende una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7 y una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 8. Se pueden preparar anticuerpos que se unen a IL-12 humana y que comprenden un region variable de cadena pesada o ligera definida usando metodos adecuados, tal como presentacion en fagos (Katsube, Y., et al., Int J Mol Med, 1(5):863-868 (1993)) o metodos que emplean animales transgenicos, conocidos en la tecnica y/o descritos aqrn. Por ejemplo, se puede inmunizar un raton transgenico, que comprende un transgen de cadena pesada de inmunoglobulina humana funcionalmente reorganizado y un transgen que comprende ADN de un locus de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana que puede sufrir reorganizacion funcional, con IL-12 humana o un fragmento de la misma para provocar la produccion de anticuerpos. Si se desea, se pueden aislar las celulas productoras de anticuerpos y se pueden preparar hibridomas u otras celulas inmortalizadas productoras de anticuerpo como se describe aqrn y/o como se sabe en la tecnica. De forma alternativa, el anticuerpo, la parte especificada o variante se puede expresar usando el acido nucleico codificante o la parte del mismo en una celula huesped adecuada.

Una sustitucion conservadora de aminoacido se refiere al cambio de un primer aminoacido por un segundo aminoacido que tiene propiedades qmmicas y/o ffsicas (por ejemplo, carga, estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofilicidad) que son similares a las del primer aminoacido. Las sustituciones conservadoras incluyen el cambio de un aminoacido por otro dentro de los siguientes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E); asparragina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y). K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), metionina (M), cistema (C) y glicina (G); F, W e Y; C, S y T.

Codigos de aminoacidos

Los aminoacidos que hacen los anticuerpos anti-IL-12 de la presente invencion con frecuencia se abrevian. Las designaciones de aminoacidos se pueden indicar designando el aminoacido mediante su codigo de una letra, su codigo de tres letras, nombre, o codon(es) de tres nucleotidos como esta bien entendido en la tecnica (ver Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Tercera Ed., Garland Publishing, Inc., Nueva York, 1994):

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CODIGO DE UNA LETRA

CODIGO DE TRES LETRAS NOMBRE CODON(ES) DE TRES NUCLEOTIDOS

A

Ala Alanina GCA, GCC, GCG, GCU

C

Cys Cistema UGC, UGU

D

Asp Acido aspartico GAC, GAU

E

Glu Acido glutamico GAA, GAG

F

Phe Fenilalanina UUC, UUU

G

Gly Glicina GGA, GGC, GGG, GGU

H

His Histidina CAC, CAU

Ile Isoleucina AUA, AUC, AUU

K

Lys Lisina AAA, AAG

L

Leu Leucina UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU

M

Met Metionina AUG

N

Asn Asparragina AAC, AAU

P

Pro Prolina CCA, CCC, CCG, CCU

Q

Gln Glutamina CAA, CAG

R

Arg Arginina AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU

S

Ser Serina AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU

T

Thr Treonina ACA, ACC, ACG, ACU

V

Val Valina GUA, GUC, GUG, GUU

W

Trp Triptofano UGG

Y

Tyr Tirosina UAC, UAU

Un anticuerpo anti-IL-12 de la presente invencion puede incluir una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos, bien de mutaciones naturales o por manipulacion humana, como se especifica aqrn.

Por supuesto, el numero de sustituciones que hana el experto en la materia depende de muchos factores, incluyendo los descritos anteriormente. En terminos generales, el numero de sustituciones, inserciones o deleciones de aminoacidos para cualquier protema, fragmento o variante anti-IL-12 derivada de Ig no sera mas de 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, tal como de 1-30 o cualquier intervalo o valor dentro del mismo, como se especifica aqrn.

Los aminoacidos en un anticuerpo anti-IL-12 de la presente invencion que son esenciales para la funcion se pueden identificar mediante metodos conocidos en la tecnica, tal como mutagenesis dirigida o mutagenesis de barrido con alanina (por ejemplo, Ausubel, supra, capftulos 8, 15; Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). El ultimo procedimiento introduce mutaciones individuales de alanina en cada residuo de la molecula. Las moleculas mutantes resultantes se ensayan despues para su actividad biologica, tal como, pero no limitada a al menos una actividad neutralizante de IL-12. Los sitios que son cnticos para la union al anticuerpo tambien se pueden identificar mediante analisis estructural tales como cristalizacion, resonancia magnetica nuclear o marcaje de fotoafinidad (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).

Como apreciara el experto en la materia, la presente invencion incluye al menos un anticuerpo biologicamente activo de la presente invencion. Los anticuerpos biologicamente activos tienen una actividad especifica de al menos el 20%, el 30%, o el 40%, y preferiblemente de al menos el 50%, el 60%, o el 70%, y lo mas preferiblemente de al menos el 80%, el 90%, o el 95%-100% de la del anticuerpo nativo (no sintetico), endogeno o affn y conocido. Los metodos de ensayar y cuantificar medidas de actividad enzimatica y especificidad de sustrato, son bien conocidos para el experto en la materia.

En otro aspecto, la invencion se refiere a anticuerpos humanos, como se describe aqrn, que estan modificados mediante la union covalente de un grupo organico. Tales modificaciones pueden producir un anticuerpo con propiedades farmacocineticas mejoradas (por ejemplo, vida media en suero in vivo aumentada). El grupo organico puede ser un grupo polimerico hidrofflico lineal o ramificado, un grupo acido graso, o un grupo ester de acido graso. En formas de realizacion particulares, el grupo polimerico hidrofflico puede tener un peso molecular desde alrededor de 800 hasta alrededor de 120.000 Dalton y puede ser un polialcano glicol (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG)), poffmero de hidrato de carbono, poffmero de aminoacido o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

polivinilpirrolidona, y el grupo acido graso o ester de acido graso puede comprender desde alrededor de ocho hasta alrededor de cuarenta atomos de carbono.

Los anticuerpos modificados de la invencion pueden comprender uno o mas grupos organicos que estan unidos de forma covalente, directa o indirectamente, al anticuerpo. Cada grupo organico que esta unido a un anticuerpo de la invencion puede ser independientemente un grupo polimerico hidrofflico, un grupo acido graso, o un grupo ester de acido graso. Como se usa aqrn, el termino “acido graso” abarca acidos monocarboxfficos y acidos dicarboxfficos. Un “grupo polimerico hidrofflico”, como se usa aqrn el termino, se refiere a un poffmero organico que es mas soluble en agua que en octano. Por ejemplo, polilisina es mas soluble en agua que en octano. De esta manera, un anticuerpo modificado mediante la union covalente de polilisina esta abarcado por la invencion. Los poffmeros hidrofflicos adecuados para modificar los anticuerpos de la invencion pueden ser lineales o ramificados e incluyen, por ejemplo, polialcano glicoles (por ejemplo, PEG, monometoxi-polietilenglicol (mPEG), PPG y similares), hidratos de carbono (por ejemplo, dextrano, celulosa, oligosacaridos, polisacaridos y similares), poffmeros de aminoacidos hidrofflicos (por ejemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato y similares), oxidos de polialcanos (por ejemplo, oxido de polietileno, oxido de polipropileno y similares) y polivinilpirrolidona. Preferiblemente, el poffmero hidrofflico que modifica el anticuerpo de la invencion tiene un peso molecular desde alrededor de 800 hasta alrededor de 150.000 Dalton como entidad molecular separada. Por ejemplo, se pueden usar PEG5000 y PEG20.000, en donde el subrndice es el peso molecular medio del poffmero en Dalton. El grupo polimerico hidrofflico puede estar sustituido con uno hasta alrededor de seis grupos alquilo, acido graso o ester de acido graso. Los poffmeros hidrofflicos que estan sustituidos con un grupo acido graso o ester de acido graso se pueden preparar empleando metodos adecuados. Por ejemplo, se puede acoplar un poffmero que comprende un grupo amina a un carboxilato del acido graso o el ester de acido graso, y se puede acoplar un carboxilato activado (por ejemplo, activado con N,N- carbonildiimidazol) en un acido graso o ester de acido graso a un grupo hidroxilo en un poffmero.

Los acidos grasos y esteres de acidos grasos adecuados para modificar los anticuerpos de la invencion pueden ser saturados o pueden contener una o mas unidades de insaturacion. Los acidos grasos que son adecuados para modificar los anticuerpos de la invencion incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n- tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (C18, estearato), n-eicosanoato (C20, araquidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C30), n-tatracontonoato (C40), cis-A9-octadecanoato (C18, oleato), todo cis- A5,8,11,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), acido octanedioico, acido tetradecanedioico, acido octadecanodioico, acido docosanodioico, y similares. Los esteres de acidos grasos adecuados incluyen monoesteres de acidos dicarboxfficos que comprenden un grupo alquilo inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior puede comprender desde uno hasta alrededor de doce, preferiblemente desde uno hasta alrededor de seis, atomos de carbono.

Los anticuerpos humanos modificados se pueden preparar usando metodos adecuados, tal como mediante reaccion con uno o mas agentes modificadores. Un “agente modificador” como se usa el termino aqrn, se refiere a un grupo organico adecuado (por ejemplo, poffmero hidrofflico, un acido grado, un ester de acido graso) que comprende un grupo activador. Un “grupo activador” es un grupo qmmico o grupo funcional que puede, en las condiciones adecuadas, reaccionar con un segundo grupo qmmico formando de esta manera un enlace covalente entre el agente modificador y el segundo grupo qmmico. Por ejemplo, los grupos activadores que reaccionan con amina incluyen grupos electrofflicos tal como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, fluor, yodo), esteres de N- hidroxisuccinimidilo (NHS) y similares. Los grupos activadores que pueden reaccionar con tioles incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacetilo, acrilolilo, disulfuros de piridilo, tiol del acido 5-tiol-2-nitrobenzoico (TNB-tiol), y similares. Un grupo funcional aldetffdo se puede acoplar a moleculas que contienen amina o hidracida, y un grupo azida puede reaccionar con grupos de fosforo trivalente para formar enlaces fosforamidato o fosforimida. Los metodos adecuados para introducir grupos activadores en moleculas son conocidos en la tecnica (ver por ejemplo, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Un grupo activador se puede unir directamente al grupo organico (por ejemplo, poffmero hidrofflico, acido graso, ester de acido graso), o mediante un grupo enlazador, por ejemplo un grupo divalente de C1-C12 en donde se pueden cambiar uno o mas atomos de carbono por un heteroatomo tal como oxfgeno, nitrogeno o azufre. Los grupos enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- y -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Los agentes modificadores que comprenden un grupo enlazador se pueden producir, por ejemplo, haciendo reaccionar mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminohexano) con un acido graso en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) para formar un enlace amida entre la amina libre y el carboxilato del acido graso. El grupo protector Boc se puede eliminar del producto mediante tratamiento con acido trifluoroacetico (TFA) para exponer una amina primaria que se puede acoplar a otro carboxilato como se describe, o se puede hacer reaccionar con antffdrido maleico y ciclar el producto resultante para producir un derivado maleimido activado del acido graso. (Ver, por ejemplo, Thompson et al., WO 92/16221).

Los anticuerpos modificados de la invencion se pueden producir haciendo reaccionar un anticuerpo humano con un agente modificador. Por ejemplo, los grupos organicos se pueden unir al anticuerpo en una forma no espedfica de sitio empleando un agente modificador que reacciona con amina, por ejemplo, un ester NHS de PEG. Los anticuerpos humanos modificados tambien se pueden preparar reduciendo los puentes disulfuro (por ejemplo, puente disulfuro intra-cadena) de un anticuerpo. El anticuerpo reducido se puede hacer reaccionar despues con un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

agente modificador que reacciona con tiol para producir el anticuerpo modificado de la invencion. Los anticuerpos humanos modificados que comprenden un grupo organico que esta unido a sitios espedficos de un anticuerpo de la presente invencion se pueden preparar usando metodos adecuados, tal como proteolisis inversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), y los metodos descritos en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).

ANTICUERPOS ANTI-IDIOTIPO CONTRA COMPOSICIONES PROTEICAS DERIVADAS DE IG ANTI-IL-12

Ademas de los anticuerpos anti-IL-12 monoclonales o quimericos, la presente especificacion tambien divulga un anticuerpo anti-idiotipico (anti-Id) espedfico para tales anticuerpos de la invencion. Un anticuerpo anti-Id es un anticuerpo que reconoce determinantes unicos generalmente asociados con la region de union al antfgeno de otro anticuerpo. Se puede preparar el anti-Id inmunizando un animal de la misma especie y tipo genetico (por ejemplo, cepa de raton) que la fuente del anticuerpo Id con el anticuerpo o una region que contiene la CDR del mismo. El animal inmunizado reconocera y respondera a los determinantes idiotfpicos del anticuerpo inmunizante y producira un anticuerpo anti-Id. El anticuerpo anti-Id tambien se puede usar como un “inmunogeno” para inducir una respuesta inmune en aun otro animal, produciendo un denominado anticuerpo anti-anti-Id.

COMPOSICIONES DE PROTEfNAS DERIVADAS DE IG ANTI-IL-12

La presente invencion tambien proporciona al menos una composicion de anticuerpo anti-IL-12 que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos, cuatro, al menos cinco, al menos seis o mas anticuerpos anti-IL-12 de los mismos, como se describe aqrn y/o como se sabe en la tecnica que se proporcionan en una composicion, mezcla o forma no natural.

Las composiciones de anticuerpos anti-IL-12 de la presente invencion pueden ademas comprender al menos uno de cualquier cantidad adecuada y eficaz de al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero no limitado a un anticuerpo contra TNF o fragmento, un receptor soluble de TNF o fragmento, protemas de fusion de los mismos, o antagonistas de TNF de molecula pequena), un antirreumatico (por ejemplo, metotrexato, auranofm, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de sodio y oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalcina), un relajante muscular, un narcotico, un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucosido, un antifungico, un antiparasftico, un antivmco, un carbapenemo, cefalosporina, una fluroquinolona, un macrolido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antisoriatico, un corticosteriode, un esteroide anabolico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutriente, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusfgeno, un antiemetico, un antiulcera, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un farmaco de remplazo hormonal, un modulador de receptor de estrogeno, midriatico, un cicloplegico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitotico, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antimaniaco, un antipsicotico, un ansiolftico, un hipnotico, un simpatomimetico, un estimulante, donepezil, tacrina, una medicacion contra el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, un cromolm, una epinefrina o analogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citoquina o un antagonista de citoquina. Ejemplos no limitantes de tales citoquinas incluyen, pero no estan limitados a, cualquiera de IL-1 a IL-23. Las dosis adecuadas son bien conocidas en la tecnica. Ver, por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a Edicion, Appleton y Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Edicion Deluxe, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Tales anticancerosos o antiinfecciosos tambien pueden incluir moleculas de toxinas que se asocian, unen, coformulan o coadministran con al menos un anticuerpo de la presente invencion. La toxina puede opcionalmente actuar para aniquilar selectivamente la celula o tejido patologico. La celula patologica puede ser una celula cancerosa u otra. Tales toxinas pueden ser, pero no estan limitadas a, toxina purificada o recombinante o fragmento de toxina que comprende al menos un dominio citotoxico funcional de la toxina, por ejemplo, seleccionado de al menos uno de ricina, toxina de la difteria, una toxina de veneno, o una toxina bacteriana. El termino toxina tambien incluye tanto endotoxinas como exotoxinas producidas por cualquier bacteria o virus natural, mutante o recombinante que pueden producir cualquier afeccion patologica en seres humanos y otros mairnferos, incluyendo choque toxico, que puede producir la muerte. Tales toxinas pueden incluir, pero no estan limitadas a, enterotoxina labil al calor de E. coli enterotoxigenica (LT), enterotoxina estable al calor (ST), citotoxina de Shigella, enterotoxinas de Aeromonas, toxina-1 del smdrome de choque toxico (TSST-1), enterotoxina A (SEA), B (SEB), o C (SEC) de Staphylococcus, enterotoxinas de Streptococcus y similares. Tales bacterias incluyen pero no estan limitadas a, cepas de una especie E. coli enterotoxigenica (ETEC), E. coli enterohemorragica (por ejemplo, cepas de serotipo 0157:H7), especies de Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, y Shigella sonnei), especies de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), especies de Clostridium (por ejemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), especies de Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), especies de Heliobacter, (por ejemplo, Heliobacter pylori), especies de Aeromonas (por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, especies de Vibrios (por ejemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), especies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, y Streptococci. Ver, por ejemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3a ed., pp. 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2a. Ed.; pp. 239-254, Plenum Medical Book Co., Nueva York (1991); Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3a. Ed., Churchill Livingstone, Nueva York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16a edicion, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990).

Los compuestos, composiciones o combinaciones de anticuerpo anti-IL-12 de la presente invencion pueden comprender ademas al menos uno de cualquier auxiliar adecuado, tal como, pero no limitado, diluyente, aglutinante, estabilizador, tampones, sales, solventes lipofflicos, conservantes, adyuvantes o similares. Los auxiliares farmaceuticamente aceptables son preferidos. Los ejemplos no limitantes de, y metodos de preparacion de tales soluciones esteriles son bien conocidos en la tecnica, tal como, pero no limitados a Gennaro. Ed., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Los soportes farmaceuticamente aceptables se pueden seleccionar rutinariamente que sean adecuados para el modo de administracion, solubilidad y/o estabilidad de la composicion del anticuerpo anti-IL-12 como es bien sabido en la tecnica o como se describe aquL

Los excipientes y aditivos farmaceuticos utiles en la presente composicion incluyen pero no estan limitados a, protemas, peptidos, aminoacidos, lfpidos, e hidratos de carbono (por ejemplo, azucares, incluyendo monosacaridos, di-, tri-, tetra- y oligosacaridos; azucares derivados tales como alditoles, acidos aldonicos, azucares esterificados y similares; y polisacaridos o polfmeros de azucares), que pueden estar presentes de forma individual o en combinacion, comprendiendo solo o en combinacion del 1-99,99% en peso o volumen. Los excipientes proteicos de ejemplo incluyen seroalbumina tal como seroalbumina humana (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, casema, y similares. Aminoacidos/componentes de anticuerpo representativos, que tambien pueden funcionar en capacidad amortiguadora, incluyen alanina, glicina, arginina, betama, histidina, acido glutamico, acido aspartico, cistema, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo, y similares. Un aminoacido preferido es glicina.

Los excipientes de hidratos de carbono adecuados para su uso en la invencion incluyen, por ejemplo, monosacaridos tal como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacaridos, tal como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacaridos, tal como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucidol), mioinositol y similares. Los excipientes de hidratos de carbono preferidos para su uso en la presente invencion son manitol, trehalosa, y rafinosa.

Las composiciones de anticuerpo anti-IL-12 tambien pueden incluir un tampon o un agente para ajustar el pH; tfpicamente, el tampon es una sal preparada de un acido organico o una base. Los tampones representativos incluyen sales de acidos organicos tal como sales de acido dtrico, acidos ascorbico, acido gluconico, acido carbonico, acido tartarico, acido succmico, acido acetico o acido ftalico; tampones Tris, clorhidrato de trometamina o fosfato. Los tampones preferidos para su uso en la presente invencion son sales de acidos organicos tales como citrato.

Ademas, las composiciones de anticuerpo anti-IL-12 de la invencion pueden incluir excipientes/aditivos polimericos tales como polivinilpirrolidonas, ficoles (un azucar polimerico), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, tal como 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina), polietilenglicoles, agentes saborizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestaticos, agentes tensoactivos (por ejemplo, polisorbatos, tal como “TWEEN 20” y “TWEEN 80”), lfpidos (por ejemplo, fosfolfpidos, acidos grasos), esteroides (por ejemplo, colesterol), y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA).

Estos y excipientes y/o aditivos farmaceuticos adicionales conocidos adecuados para su uso en las composiciones de anticuerpo anti-IL-12 segun la invencion son conocidos en la tecnica, por ejemplo, como se enumeran en “Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 19a ed., Williams & Williams, (1995), y en “Physician's Desk Reference”, 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Los materiales de soporte o excipiente preferidos son hidratos de carbono (por ejemplo, sacaridos y alditoles) y tampones (por ejemplo, citrato) o agentes polimericos.

Formulaciones

Como se ha observado anteriormente, la invencion proporciona formulaciones estables, que es preferiblemente un tampon fosfato con solucion salina o una sal elegida, asf como soluciones conservadas y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

formulaciones que contienen un conservante asf como formulaciones multiuso conservadas adecuadas para uso farmaceutico o veterinario, que comprenden al menos un anticuerpo anti-IL-12 en una formulacion farmaceuticamente aceptable. Las formulaciones conservadas contienen al menos un conservante conocido u opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en al menos un fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bendlico, nitrito fenilmercurico, fenoxietanol, formaldeddo, clorobutanol, cloruro de magnesio (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metil, etil, propil, butil y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. Se puede usar cualquier concentracion o mezcla adecuada como se sabe en la tecnica, tal como 0,001-5% o cualquier intervalo o valor dentro del mismo, tal como, pero no limitado a 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, o cualquier intervalo o valor en el mismo. Ejemplos no limitantes incluyen, sin conservante, m-cresol al 0,1-2% (por ejemplo, al 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), alcohol bendlico al 0,1-3% (por ejemplo, al 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%) timerosal al 0,001-0,5% (por ejemplo, al 0,005, 0,01), fenol al 0,001-2,0% (por ejemplo, al 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), alquilparabeno(s) al 0,0005-1,0% (por ejemplo, al 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%), y similares.

Como se ha indicado anteriormente, la invencion proporciona un artfculo de fabricacion, que comprende material de empaquetamiento y al menos un vial que comprende una solucion de al menos un anticuerpo anti-IL-12 con las tampones y/o conservantes prescritos, opcionalmente en un diluyente acuoso, en donde dicho material de empaquetamiento comprende una etiqueta que indica que tal solucion se puede mantener durante un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o mas. La invencion comprende ademas un artfculo de fabricacion, que comprende material de empaquetamiento, un primer vial que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-12 liofilizado, y un segundo vial que comprende un diluyente acuoso de tampon o conservante prescrito, en donde dicho material de empaquetamiento comprende una etiqueta que instruye a un paciente a reconstituir el al menos un anticuerpo anti-IL-12 en el diluyente acuoso para formar una solucion que se puede mantener durante un periodo de veinticuatro horas o mas.

El al menos un anticuerpo anti-IL-12 usado segun la presente invencion se puede producir por medios recombinantes, incluyendo a partir de celulas de marnfferos o preparaciones transgenicas, o se puede purificar de otras fuentes biologicas, como se describe aqrn o como se sabe en la tecnica.

El intervalo del al menos un anticuerpo anti-IL-12 en el producto de la presente invencion incluye cantidades que producen tras la reconstitucion, si es en un sistema humedo/seco, concentraciones desde alrededor de 1,0 pg/ml hasta alrededor de 1000 mg/ml, aunque concentraciones menores y mayores son operativas y dependen del vedculo de administracion deseado, por ejemplo, las formulaciones en solucion seran diferentes de los parches transdermicos, metodos pulmonares, transmucosa, o bombas osmoticas o microbombas.

Preferiblemente, el diluyente acuoso opcionalmente comprende ademas un conservante farmaceuticamente aceptable. Los conservantes preferidos incluyen aquello seleccionados del grupo que consiste en fenol, m-cresol, p- cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bendlico, alquilparabeno (metil, etil, propil, butil y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos. La concentracion de conservante usado en la formulacion es una concentracion suficiente para producir un efecto anti- microbiano. Tales concentraciones dependen del conservante seleccionado y se determinan facilmente por el experto en la materia.

Se pueden anadir opcionalmente y preferiblemente al diluyente otros excipientes, por ejemplo, agentes de isotonicidad, tampones, antioxidantes, potenciadores de conservantes. Un agente de isotonicidad, tal como glicerina, se usa normalmente a concentraciones conocidas. Preferiblemente se anade un tampon fisiologicamente tolerado para proporcionar un control del pH mejorado. Las formulaciones pueden cubrir un amplio rango de pH, tal como desde alrededor de pH 4 hasta alrededor de pH 10, y rangos preferidos desde alrededor de pH 5 hasta alrededor de pH 9, y un rango mas preferido de alrededor de 6,0 hasta alrededor de 8,0. Preferiblemente las formulaciones de la presente invencion tienen un pH entre alrededor de 6,8 y alrededor de 7,8. Los tampones preferidos incluyen tampones fosfato, lo mas preferiblemente fosfato de sodio, particularmente solucion salina tamponada con fosfato (PBS).

Opcionalmente se pueden anadir a las formulaciones o composiciones otros aditivos, tal como un solubilizante farmaceuticamente aceptable como Tween 20 (monolaurato sorbitano de polioxietileno (20)), Tween 40 (monopalmitato sorbitano de polioxietileno (20)), Tween 80 (monooleato sorbitano de polioxietileno (20)), Pluronic F68 (copolfmeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno), y PEG (polietilenglicol) o agentes tensoactivos no ionicos tales como polisorbato 20 o 80 o poloxamero 184 o 188, polioles Pluronic®, otros copolfmeros en bloque, y agentes quelantes tales como EDTA y eGtA para reducir la agregacion. Estos aditivos son particularmente utiles si se usa una bomba o envase de plastico para administrar la formulacion. La presencia de agentes tensoactivos farmaceuticamente aceptables mitiga la propension de las protemas de agregar.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las formulaciones de la presente invencion se pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo anti-IL-12 y un conservante seleccionado del grupo que consiste en fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencflico, alquilparabeno (metil, etil, propil, butil y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. La mezcla del al menos un anticuerpo anti-IL-12 y conservante en un diluyente acuoso se lleva a cabo usando procedimiento convencionales de disolucion y mezcla. Para preparar una formulacion adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo anti-IL-12 en solucion tamponada con el conservante deseado en una solucion tamponada en cantidades suficientes para proporcionar la protema y el conservante en las concentraciones deseadas. El experto en la materia reconocena variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en que se anaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulacion, son todos factores que se pueden optimizar para la concentracion y medios de administracion usados.

Las formulaciones reivindicadas se pueden suministrar a pacientes como soluciones transparentes o como viales duales que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-IL-12 liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que comprende agua, un conservante y/o excipientes, preferiblemente un tampon fosfato y/o solucion salina y una sal elegida, en un diluyente acuoso. Bien un vial de una solucion individual o un vial dual que requiere reconstitucion se pueden reutilizar multiples veces y puede ser suficiente para un ciclo unico o ciclos multiples de tratamiento del paciente y de esta manera puede proporcionar una pauta de tratamiento mas conveniente que las actualmente disponible.

Los presentes artfculos de fabricacion reivindicados son utiles para la administracion durante un periodo de inmediatamente a veinticuatro horas o mas. Segun esto, los artmulos de fabricacion ahora reivindicados ofrecen ventajas significativas al paciente. Las formulaciones de la invencion opcionalmente se pueden almacenar de forma segura a temperaturas desde alrededor de 2 hasta alrededor de 40°C y mantienen la actividad biologica de la protema durante periodos de tiempo extensos, de esta manera, permiten una etiqueta de empaquetamiento que indica que la solucion se puede mantener y/o usar durante un periodo de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, o 96 horas o mas. Si se usa diluyente conservado, tal etiqueta puede incluir el uso hasta 1-12 meses, medio ano, uno y medio y/o dos.

Las soluciones de al menos un anticuerpo anti-IL-12 en la invencion se pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo en un diluyente acuoso. La mezcla se lleva a cabo usando procedimientos convencionales de disolucion y mezcla. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo en agua o tampon en cantidades suficientes para proporcionar la protema y opcionalmente un conservante o tampon a las concentraciones deseadas. El experto en la materia reconocena variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en que se anaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulacion, son todos factores que se pueden optimizar para la concentracion y medios de administracion usados.

Los productos reivindicados se pueden suministrar a pacientes como soluciones transparentes o como viales duales que comprenden un vial del al menos un anticuerpo anti-IL-12 liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que comprende el diluyente acuoso. Bien un vial de una solucion individual o un vial dual que requiere reconstitucion se pueden reutilizar multiples veces y puede ser suficiente para un ciclo unico o ciclos multiples de tratamiento de paciente y de esta manera puede proporcionar una pauta de tratamiento mas conveniente que las actualmente disponible.

Los productos reivindicados se pueden suministrar indirectamente a pacientes proporcionando a farmacias, clmicas, u otras instituciones e instalaciones, soluciones transparentes o viales duales que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-IL-12 liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente acuoso. La solucion transparente en este caso puede ser de hasta un litro o incluso mayor en tamano, proporcionando una gran reserva de la que se pueden retirar partes mas pequenas de la solucion del al menos un anticuerpo una o multiples veces para su transferencia a viales mas pequenos y ser suministrada por la farmacia o clmica a sus clientes y/o pacientes.

Los dispositivos reconocidos que comprenden estos sistemas de viales individuales incluyen aquellos dispositivos de inyectores de pluma para la administracion de una solucion tal como BD Pens, BD Autojector®, Humaject® NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, y OptiPen®, GenotropinPen®; Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, RecoPen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por ejemplo fabricados o desarrollados por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ,
www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suiza,
www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (
www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK,
www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN,
www.mediject.com). Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema de viales dual incluyen aquellos sistemas de inyectores de pluma para reconstitucion de un farmaco liofilizado en un cartucho para administracion de la solucion reconstituida tal como HumatroPen®.

Los productos ahora reivindicados incluyen material de empaquetamiento. El material de empaquetamiento

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

proporciona, ademas de la informacion requerida por las agencias reguladoras, las condiciones en que el producto se puede usar. El material de empaquetamiento de la presente invencion proporciona instrucciones al paciente para reconstituir el al menos un anticuerpo anti-IL-12 en el diluyente acuoso para formar una solucion y para usar la solucion durante un periodo de 2-24 horas o mayor para el producto en dos viales, humedo/seco. Para el vial individual, el producto en solucion, la etiqueta indica que tal solucion se puede usar durante un periodo de 2-24 horas o mayor. Los productos ahora reivindicados son utiles para uso de producto farmaceutico en seres humanos.

Las formulaciones de la presente invencion se pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar al menos un anticuerpo anti-IL-12 y un tampon seleccionado, preferiblemente un tampon fosfato que contiene solucion salina o una sal elegida. La mezcla del al menos un anticuerpo anti-IL-12 y tampon en un diluyente acuoso se lleva a cabo usando procedimiento convencionales de disolucion y mezcla. Para preparar una formulacion adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos un anticuerpo anti-IL-12 en agua o tampon con el agente tamponante en agua en cantidades suficientes para proporcionar la protema y el tampon en las concentraciones deseadas. El experto en la materia reconoceria variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en que se anaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la formulacion, son todos factores que se pueden optimizar para la concentracion y medios de administracion usados.

Las formulaciones estables o conservadas reivindicadas se pueden suministrar a pacientes como soluciones transparentes o como viales duales que comprenden un vial de al menos un anticuerpo anti-IL-12 liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que comprende un conservante o tampon y excipientes en un diluyente acuoso. Bien un vial de una solucion individual o un vial dual que requiere reconstitucion se pueden reutilizar multiples veces y puede ser suficiente para un ciclo unico o ciclos multiples de tratamiento de paciente y de esta manera puede proporcionar una pauta de tratamiento mas conveniente que las actualmente disponibles.

Se puede administrar a un paciente al menos un anticuerpo anti-IL-12 en las formulaciones o soluciones estables o conservadas descritas aqrn segun la presente invencion a traves de una variedad de metodos de distribucion incluyendo inyeccion SC o IM; transdermica, pulmonar, transmucosa, implante, bomba osmotica, cartucho, microbomba, u otros medios que aprecia el experto en la materia, como es bien sabido en la tecnica.

Aplicaciones terapeuticas

El anticuerpo o porcion que se une al antigeno del mismo de la invencion puede ser para modular o tratar al menos una enfermedad inmune, en una celula, tejido, organo, animal o paciente, incluyendo, pero no limitada a, al menos uno de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide sistemica de inicio juvenil, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, ulcera gastrica, artropatias seronegativas, artrosis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistemico, smdrome antifosfotipido, iridociclitis/uveftis/neuritis optica, fibrosis pulmonar idiopatica, vasculitis sistemica/ granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, orquitis/procedimientos reversos de vasectoirna, enfermedades alergicas/atopicas, asma, rinitis alergica, eczema, dermatitis de contacto alergica, conjuntivitis alergica, neumonitis hipersensible, trasplantes, rechazo al trasplante de organos, enfermedad de injerto contra el huesped, smdrome de respuesta inflamatoria sistemica, smdrome septico, septicemia por gram positivos, septicemia por gram negativos, septicemia de cultivo negativo, septicemia fungica, fiebre neutropenica, urosepticemia, meningococcemia, traumatismo/hemorragia, quemaduras, exposicion a radiacion ionizante, pancreatitis aguda, smdrome de dificultad respiratoria aguda, artritis reumatoide, hepatitis inducida por alcohol, patologfas inflamatorias cronicas, sarcoidosis, patologfa de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefrosis, enfermedades atopicas, reacciones hipersensibles, rinitis alergica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafilaxia sistemica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolttica, trombocitopenia, rechazo de injerto de cualquier organo o tejido, rechazo a trasplante de rinon, rechazo al trasplante de corazon, rechazo al trasplante de Itigado, rechazo al trasplante de pancreas, rechazo al trasplante de pulmon, rechazo al trasplante de medula osea (BMT), rechazo a aloinjerto de piel, rechazo al trasplante de cartilago, rechazo al injerto de hueso, rechazo al trasplante de intestino delgado, rechazo al implante de timo fetal, rechazo al trasplante de paratiroides, rechazo a xenoinjerto de cualquier organo o tejido, rechazo de aloinjerto, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynoud, diabetes resistente a insulina de tipo B, asma, miastenia grave, citotoxicidad mediada por anticuerpo, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, lupus eritematoso sistemico, smdrome POEMS (polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gammopatia monoclonal y smdrome de cambios en la piel), polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gammopatia monoclonal, smdrome de cambios en la piel, smdrome antifosfotipido, penfigo, escleroderma, enfermedad mezclada de tejido conjuntivo, enfermedad idiopatica de Addison, diabetes melitus, hepatitis cronica activa, cirrosis biliar primaria, vitiligo, vasculitis, smdrome de cardiotomfa post-IM, hipersensibilidad de tipo IV, dermatitis de contacto, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de aloinjerto, granulomas debido a organismos intracelulares, sensibilidad a farmacos, metabolico/idiopatico, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia en alfa-1-antitripsina, retinopatia diabetica, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluacion del eje hipotalamico-pitutaria-adrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis qrnstica, enfermedad del pulmon neonatal cronica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), linfohistiocitosis hematofagocftica familiar, afecciones dermatologicas, soriasis, alopecia, smdrome nefrotico, nefritis, nefritis glomerular, insuficiencia renal aguda, hemodialisis, uremia, toxicidad, preeclampsia, terapia okt3, terapia anti-cd3, terapia de citoquina, quimioterapia, terapia de radiacion (por

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ejemplo, incluyendo, pero no limitada a astenia, anemia, caquexia, y similares), intoxicacion de salicilato cronica, y similares. Ver, por ejemplo, The Merck Manual, 12a-17a ediciones, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Segunda edicion, Appleton y Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).

El anticuerpo o porcion que se une al antfgeno del mismo de la invencion puede ser para modular o tratar al menos una enfermedad cardiovascular en una celula, tejido, organo, animal o paciente, incluyendo pero no limitado a, al menos uno de smdrome de aturdimiento cardiaco, infarto de miocardio, insuficiencia cardfaca congestiva, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular isquemico, hemorragia, arteriosclerosis, aterosclerosis, reestenosis, enfermedad aterosclerotica diabetica, hipertension, hipertension arterial, hipertension renovascular, smcope, shock, sffilis del sistema cardiovascular, insuficiencia cardfaca Pulmonar, hipertension pulmonar primaria, arritmias cardiacas, latidos auriculares ectopicos, flutter auricular, fibrilacion auricular (sostenida o paroxfstica), smdrome post-perfusion, respuesta de inflamacion de bypass cardiopulmonar, taquicardia auricular caotica o multifocal, taquicardia QRS estrecha regular, arritmias espedficas, fibrilacion ventricular, arritmias de conjunto His, bloqueo auriculoventricular , Bloqueo de la rama del haz, trastornos isquemicos del miocardio, enfermedad coronaria, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiomiopatfa, cardiomiopatfa congestiva dilatada, cardiomiopatfa restrictiva, enfermedades coronarias valvulares, endocarditis, enfermedad pericardica, tumores cardfacos, aneuriomas aorticos y perifericos, diseccion aortica, inflamacion de la aorta, oclusion de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos vasculares perifericos, trastornos arteriales ocultos, enfermedad ateroesclerotica periferica, tromboangitis obliterantes, trastornos arteriales perifericos funcionales, fenomeno y enfermedad de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fistula arteriovenosa, linfedema, lipedema, angina inestable, lesion por reperfusion, smdrome post-bomba, lesion por isquemia-reperfusion, y simialres. Dicho metodo puede opcionalmente comprender administrar una cantidad efectiva de una composicion o composicion farmaceutica que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-12 a una celula, tejido, organo, animal o paciente con necesidad de dicha modulacion, tratamiento o terapia.

La presente divulgacion tambien proporciona un metodo para modular o tratar al menos una enfermedad infecciosa en una celula, tejido, organo, animal o paciente.

El anticuerpo o o porcion que se une al antfgeno del mismo de la invencion se puede administrar antes, al mismo tiempo, y/o despues de al menos uno seleccionado de al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero no limitado a un anticuerpo contra TNF o fragmento, un receptor soluble de TNF o fragmento, protemas de fusion de los mismos, o un antagonista de TNF de molecula pequena), un antirreumatico (por ejemplo, metotrexato, auranofm, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de sodio y oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalcina), un relajante muscular, un narcotico, un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucosido, un antifungico, un antiparasftico, un antivmco, un carbapenemo, cefalosporina, una fluroquinolona, un macrolido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antisoriatico, un corticosteriode, un esteroide anabolico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutriente, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusfgeno, un antiemetico, un antiulcera, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un farmaco de remplazo hormonal, un modulador de receptor de estrogeno, midriatico, un cicloplegico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitotico, un radiofarmaco, un antidepresivo, un agente antimaniaco, un antipsicotico, un ansiolftico, un hipnotico, un simpatomimetico, un estimulante, donepezil, tacrina, una medicacion contra el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, un cromolm, una epinefrina o analogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citoquina o un antagonista de citoquina. Las dosis adecuadas son bien conocidas en la tecnica. Ver por ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a Edicion, Appleton y Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Edicion Deluxe, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Los antagonistas de TNF adecuados para la presente invencion incluyen, pero no estan limitados a, anticuerpos anti-TNF, fragmentos de union a antfgeno de los mismos, y moleculas de receptor que se unen espedficamente a TNF; compuestos que previenen y/o inhiben la smtesis de TNF, la liberacion de TNF o su accion en celulas diana, tal como talidomida, tenidap, inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, pentoxifilina y rolipram), agonistas del receptor de adenosina A2b y potenciadores del receptor de adenosina A2b; compuestos que previenen y/o inhiben la senalizacion del receptor de TNF, tal como los inhibidores de la protema quinasa activada por mitogenos (MAP); compuestos que bloquean y/o inhiben el corte de TNF de membrana, tal como los inhibidores de metaloproteinasa; compuestos que bloquean y/o inhiben la actividad de TNF, tal como inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) (por ejemplo, captopril); y compuestos que bloquean y/o inhiben la produccion y/o smtesis de TNF, tal como inhibidores la MAP quinasa.

Como se usa aqrn, un “anticuerpo contra el factor de necrosis tumoral”, “anticuerpo contra TNF”, “anticuerpo de TNF”, o fragmento y similares disminuye, bloquea, inhibe, abroga o interfiere con la actividad de TNF

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

in vitro, in situ y/o preferiblemente in vivo. Por ejemplo, un anticuerpo humano contra TNF adecuado de la presente invencion se puede unir a TNFa e incluye anticuerpos anti-TNF, fragmentos de union al antfgeno de los mismos, y mutantes o dominios especificados de los mismos que se unen espedficamente a TNFa. Un anticuerpo o fragmento contra TNF adecuado tambien puede disminuir, bloquear, abrogar, interferir, prevenir y/o inhibir la smtesis de ARN, ADN o protema TNF, la liberacion de TNF, la senalizacion del receptor de TNF, el corte de TNF de membrana, la actividad de TNF, la produccion y/o smtesis de TNF.

El anticuerpo quimerico cA2 consiste en la region variable de union al antfgeno del anticuerpo de raton neutralizante de alta afinidad IgG1 anti-TNFa humano, designado A2, y las regiones constantes de una inmunoglobulina kappa IgG1 humana. La region Fc de IgG1 humana mejora la funcion efectora del anticuerpo alogenico, aumenta la vida media circulante en suero y disminuye la inmunogenicidad del anticuerpo. La avidez y especificidad del anticuerpo quimerico cA2 deriva de la region variable del anticuerpo murino A2. En una forma de realizacion particular, una fuente preferida de acidos nucleicos que codifican la region variable del anticuerpo murino A2 es la lmea celular de hibridoma A2.

A2 quimerico (cA2) neutraliza el efecto citotoxico tanto del TNFa humano natural como recombinante en una manera dependiente de la dosis. De los ensayos de union del anticuerpo quimerico cA2 y TNFa humano recombinante, se calculo que la constante de afinidad del anticuerpo quimerico era de 1,04x1010 M-1. Los metodos preferidos para determinar la especificidad y afinidad del anticuerpo monoclonal mediante inhibicion competitiva se pueden encontrar en Harlow, et al., antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988; Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, Nueva York, (1992-2000); Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72-79 (1983); Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York (1987-2000); y Muller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983).

En una forma de realizacion particular, el anticuerpo monoclonal murino A2 es producido por una lmea celular designada c134A. El anticuerpo quimerico cA2 es producido por una lmea celular designada c168A.

Ejemplos adicionales de anticuerpos monoclonales anti-TNF que se pueden usar en la presente invencion se describen en la tecnica (ver por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5231024; Moller, A. et al., Cytokine 2(3):l62- 169 (1990); Solicitud de EE.UU. No. 07/943852 (presentada el 11 de septiembre 1992); Rathjen et al., Publicacion International No. WO 91/02078 (publicada el 21 de febrero de 1991); Rubin et al., publicacion de patente EPO No. 0 218 868 (publicada el 22 de abril de 1987), Yone et al., Publicacion de Patente EPO No. 0 288 088 (26 de octubre de 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); y Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987).

Moleculas de receptor de TNF

Las moleculas de receptor de TNF preferidas utiles en la presente invencion son aquellas que se unen a TNF con gran afinidad (ver, por ejemplo, Feldmann et al., publicacion International No. WO 92/07076 (publicada el 30 abril de 1992); Schall et al., Cell 61:361-370 (1990); y Loetscher et al., Cell 61:351-359 (1990) y opcionalmente poseen baja inmunogenicidad. En particular, los receptores de TNF de la superficie celular de 55 kDa (p55 TNF-R) y de 75 kDa (p75 TNF-R) son utiles en la presente invencion. Las formas truncadas de estos receptores, que comprenden los dominios extracelular (ECD) de los receptores o partes funcionales de los mismos (ver, por ejemplo, Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223:831-840 (1994)), tambien son utiles en la presente invencion. Las formas truncadas de los receptores de TNF, que comprenden el ECD, se han detectado en orina y suero como protemas inhibidoras de union a TNF de 30 y 40 kDa (Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem. 265:1531-1536 (1990)). Las moleculas multimericas de receptor de TNF y las moleculas inmunorreceptoras de fusion de TNF, y derivados y fragmentos o partes de las mismas, son ejemplos adicionales de moleculas de receptor de TNF que son utiles en los metodos y composiciones de la presente invencion. Las moleculas de receptor de TNF que se pueden usar en la invencion se caracterizan por su capacidad para tratar pacientes durante periodos extensos con mejora de smtomas de buena a excelente y baja toxicidad. La baja inmunogenicidad y/o alta afinidad, asf como otras propiedades no definidas, pueden contribuir a los resultados terapeuticos alcanzados.

Las moleculas multimericas de receptor de TNF utiles en la presente invencion comprenden todo o una parte funcional del ECD de dos o mas receptores de TNF unidos a traves de uno o mas enlazadores polipeptfdicos u otros enlazadores no peptfdicos, tal como polietilenglicol (PEG). Las moleculas multimericas pueden comprender ademas un peptido senal de una protema secretada para dirigir la expresion de la molecula multimerica. Estas moleculas multimericas y los metodos para su produccion se han descrito en La solicitud de EE.UU. No. 08/437533 (presentada el 9 de mayo de 1995).

Las moleculas inmunorreceptoras de fusion de TNF utiles en la presente invencion comprenden al menos una parte de una o mas moleculas de inmunoglobulina y todo o una parte funcional de uno o mas receptores de TNF. Estas moleculas inmunorreceptoras de fusion se pueden ensamblar como monomeros, o hetero- u homo-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

multfmeros. Las moleculas inmunorreceptoras de fusion tambien pueden ser monovalentes o multivalentes. Un ejemplo de tales moleculas inmunorreceptoras de fusion es la protema de fusion receptor de TNF/IgG. Las moleculas inmunorreceptoras de fusion de TNF y los metodos para su produccion se han descrito en la tecnica (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1053510539 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219 (1994); Butler et al., Cytokine 6(6):616-623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler et al., patente de EE.UU. No. 5447851; y solicitud de EE.UU. No. 08/442133 (presentada el 16 de mayo de 1995). Tambien se pueden encontrar metodos para producir moleculas inmunorreceptoras de fusion en Capon et al., patente de EE.UU. No. 5116964; Capon et al., patente de EE.UU. No. 5225538; y Capon et al., Nature 337:525-531(1989).

Un equivalente funcional, derivado, fragmento o region de la molecula del receptor de TNF se refiere a la parte de la molecula del receptor de TNF, o la parte de la secuencia de la molecula del receptor de TNF que codifica una molecula de receptor de TNF, que es de tamano y secuencias suficientes para parecerse funcionalmente a moleculas del receptor de TNF que se pueden usar en la presente invencion (por ejemplo, se une a TNF con gran afinidad y posee baja inmunogenicidad). Un equivalente funcional de la molecula del receptor de TNF tambien incluye moleculas modificadas del receptor de TNF que se parecen funcionalmente a las moleculas del receptor de TNF que se pueden usar en la presente invencion (por ejemplo, se une a TNF con gran afinidad y posee baja inmunogenicidad). Por ejemplo, un equivalente funcional de una molecula de receptor de TNF puede contener un codon “SILENCIOSO” o una o mas sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos (por ejemplo, sustitucion de un aminoacido acido por otro aminoacido acido; o sustitucion de un codon que codifica un aminoacido hidrofobico igual o diferente por otro codon que codifica un aminoacido hidrofobico). Ver, Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, Nueva York (1987-2000).

Las citoquinas incluyen cualquier citoquina conocida. Ver, por ejemplo,
www.CopewithCytokines.com. Los antagonistas de citoquinas incluyen, pero no estan limitados a, cualquier anticuerpo, fragmento o mimetico, cualquier receptor soluble, fragmento o mimetico, cualquier antagonista de molecula pequena, o cualquier combinacion de los mismos.

Tratamientos terapeuticos. El anticuerpo o composicion de la invencion se puede usar en un metodo para tratar un trastorno mediado por IL-12, que comprende administrar una cantidad eficaz del anticuerpo o composicion a una celula, tejido, organo, animal o paciente en necesidad. Tal metodo puede opcionalmente comprender ademas la coadministracion o terapia de combinacion para tratar tales enfermedades inmunes, en donde la administracion de dicho anticuerpo o composicion comprende ademas administrar, antes, al mismo tiempo, y/o despues, al menos uno seleccionado de al menos uno de al menos uno seleccionado de al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero no limitado a un anticuerpo contra TNF o fragmento, un receptor soluble de TNF o fragmento, protemas de fusion de los mismos, o un antagonista de TNF de molecula pequena), un antirreumatico (por ejemplo, metotrexato, auranofm, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato de sodio y oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalcina), un relajante muscular, un narcotico, un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucosido, un antifungico, un antiparasftico, un antivmco, un carbapenemo, cefalosporina, una fluroquinolona, un macrolido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antisoriatico, un corticosteriode, un esteroide anabolico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un nutritivo, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusfgeno, un antiemetico, un antiulcera, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un farmaco de remplazo hormonal, un modulador de receptor de estrogeno, midriatico, un cicloplegico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitotico, un radiofarmaco, un antidepresivo, un agente antimaniaco, un antipsicotico, un ansiolftico, un hipnotico, un simpatomimetico, un estimulante, donepezil, tacrina, una medicacion contra el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, un cromolm, una epinefrina o analogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citoquina o un antagonista de citoquina.

Tfpicamente, el tratamiento de afecciones patologicas se efectua administrando una cantidad o dosis eficaz de al menos una composicion de anticuerpo anti-IL-12 que totaliza, de media, un intervalo de al menos alrededor de 0,01 hasta 500 miligramos de al menos un anticuerpo anti-IL-12 por kilo de paciente por dosis, y preferiblemente desde al menos alrededor de 0,1 a 100 miligramos de anticuerpo/kilo de paciente por administracion individual o multiple, dependiendo de la actividad espedfica contenida en la composicion. De forma alternativa, la concentracion eficaz en suero puede comprender 0,1-5000 pg/ml de concentracion en suero por administracion individual o multiple. Las dosis adecuadas son conocidas para los medicos y, por supuesto, dependeran del estado particular de la enfermedad, la actividad espedfica de la composicion que se administra, y el paciente particular que se somete a tratamiento. En algunos casos, para alcanzar la cantidad terapeutica deseada, puede ser necesario proporcionar administracion repetida, es decir, administraciones individuales repetidas de una dosis controlada o medida particular, donde las administraciones individuales se repiten hasta alcanzar la dosis diaria o efecto deseado.

Las dosis preferidas pueden incluir opcionalmente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y/o 100500 mg/kg/administracion, o cualquier intervalo, valor o fraccion de las mismas, o para alcanzar una concentracion en suero de 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0,

7.5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0,

5.5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, y/o 5000 pg/ml de concentracion en suero por administracion individual o multiple, o cualquier intervalo, valor o fraccion de las mismas.

De forma alternativa, la dosis administrada puede variar dependiendo de factores conocidos, tal como las caractensticas farmacodinamicas del agente particular, y su modo y via de administracion; edad, salud y peso del receptor; naturaleza y extension de los smtomas, tipo de tratamiento concurrente, frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. Normalmente una dosis de principio activo puede ser alrededor de 0,1 a 10 mg por kilogramo de peso corporal. Normalmente de 0,1 a 50, y preferiblemente de 0,1 a 10 mg por kilo por administracion o en forma de liberacion sostenida es eficaz para obtener los resultados deseados.

Como ejemplo no limitante, se puede proporcionar el tratamiento de seres humanos o animales como una dosis de una vez o periodica de al menos un anticuerpo de la presente invencion de 0,1 a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,

40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por dfa, en al menos un dfa del dfa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40, o de forma

alternativa o adicional, al menos una de la semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,

o 52, o de forma alternativa o adicional, al menos uno de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 anos, o cualquier combinacion de los mismos, usando dosis individuales, infusion o repetidas.

Las formas farmaceuticas (composicion) adecuadas para la administracion interna generalmente contienen desde alrededor de 0,1 miligramo hasta alrededor de 500 miligramos de principio activo por unidad o envase. En estas composiciones farmaceuticas el principio activo normalmente estara presente en una cantidad desde el 0,599,999% en peso basado en el peso total de la composicion.

Para la administracion parenteral, el anticuerpo se puede formular como una solucion, suspension, emulsion, o polvo liofilizado en asociacion, o suministrados de forma separada, con un vehfculo parenteral farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de tales vehfculos son agua, solucion salina, solucion de Ringer, solucion de dextrosa, y seroalbumina humana al 1-10%. Tambien se pueden usar liposomas y vehfculos no acuosos tal como aceites no volatiles. El vehfculo o polvo liofilizado pueden contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y estabilidad qmmica (por ejemplo, tampones y conservantes). La solucion se esteriliza mediante tecnicas conocidas o adecuadas.

Los soportes farmaceuticos adecuados se describen en las ediciones mas recientes de Remington's Pharmaceutical Science, A. Osol, un texto estandar de referencia en este campo.

Administracion alternativa

Se pueden usar muchos modos conocidos y desarrollados segun la presente invencion para administrar cantidades farmaceuticamente eficaces de al menos un anticuerpo anti-IL-12 segun la presente invencion. Mientras que se usa la administracion pulmonar en la siguiente descripcion, se pueden usar otros modos de administracion segun la presente invencion con resultados adecuados.

Los anticuerpos de IL-12 de la presente invencion se pueden distribuir en un soporte, como una solucion, emulsion, coloide o suspension, o como un polvo seco, usando cualquiera de una variedad de dispositivos y metodos adecuados para la administracion mediante inhalacion u otros modos descritos aqrn o conocidos en la tecnica.

Formulaciones y administracion parenteral

Las formulaciones para la administracion parenteral pueden contener como excipientes comunes agua o solucion salina esteril, polialquilenglicoles tal como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las soluciones acuosas u oleaginosas para inyeccion se pueden preparar usando un emulsionante o humectante apropiado y un agente suspensor, segun metodos conocidos. Los agentes para la inyeccion pueden ser un agente diluyente no toxico no oralmente administrable tal como una solucion acuosa o una solucion o suspension inyectable esteril en un solvente. Como vehfculo o solvente utilizable, se permiten agua,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

solucion de Ringer, solucion salina isotonica, etc.; como solvente normal, o solvente de suspension, se puede usar un aceite no volatil esteril. Para estos fines, se puede usar cualquier tipo de aceite y acido graso no volatil, incluyendo aceites grasos o acidos grasos naturales o sinteticos o semisinteticos; mono- o di- o tri-gliceridos naturales o sinteticos o semisinteticos. La administracion parenteral se conoce en la tecnica e incluye, pero no esta limitada, medios de inyeccion convencionales, un dispositivo de inyeccion sin aguja con gas presurizado como se describe en la patente de EE.UU. No. 5851198, y un dispositivo perforador por laser como se describe en la patente de EE.UU. No. 5839446.

Distribucion alternativa

La invencion se refiere ademas a la administracion de al menos un anticuerpo anti-IL-12 por medio parenteral, subcutaneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intraceliaco, intracelebelar, intracerebroventricular, intracolico, intracervical, intragastrico, intrahepatico, intramiocardiaco, intraosteal, intrapelvico, intrapericardiaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatico, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratoracico, intrauterino, intravesical, bolus, vaginal, rectal, bucal, intranasal, o transdermico. Se puede preparar al menos una composicion de anticuerpo anti-IL-12 para su uso para administracion parenteral (subcutanea, intramuscular o intravenosa) o cualquier otra administracion particularmente en forma de soluciones o suspensiones lfquidas; para su uso en administracion vaginal o rectal particularmente en formas semisolidas tal como, pero no limitadas a, cremas y supositorios; para administracion oral o yugal tal como, pero no limitadas a, en forma de comprimidos o capsulas; o por via intranasal tal como, pero no limitado a, la forma de polvo, gotas nasales o aerosoles o ciertos agentes; o por via transdermica tal como pero no limitado a un gel, pomada, locion, suspension o sistema de distribucion de parche con potenciadores qmmicos tal como dimetilsulfoxido para modificar la estructura de la piel o para aumentar la concentracion de farmaco en el parche transdermico (Junginger, et al. En “Drug Permeation Enhancement”; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. Nueva York 1994), o con agentes oxidantes que permiten la aplicacion de formulaciones que contienen protemas y peptidos sobre la piel (WO 98/53847), o la aplicacion de campos electricos para crear vfas transitorias de transpose tal como electroporacion, o para aumentar la motilidad de farmacos cargados a traves de la piel tal como iontoforesis, o la aplicacion de ultrasonido tal como sonoforesis (patentes de EE.UU. Nos. 4309989 y 4767402).

Administracion pulmonar/nasal

Para la administracion pulmonar, preferiblemente se distribuye al menos una composicion de anticuerpo anti-IL-12 en un tamano de partfcula eficaz para alcanzar las vfas respiratorias bajas del pulmon o senos. Segun la invencion, se puede distribuir al menos un anticuerpo anti-IL-12 mediante cualquiera de una variedad de dispositivos de inhalacion o nasales conocidos en la tecnica para la administracion de un agente terapeutico mediante inhalacion. Estos dispositivos capaces de depositar formulaciones en aerosol en la cavidad sinusal o alveolos de un paciente incluyen inhaladores de dosis medidas, nebulizadores, generadores de polvo seco, aerosoles y similares. Otros dispositivos adecuados para dirigir la administracion pulmonar o nasal de anticuerpos tambien son conocidos en la tecnica. Todos esos dispositivos pueden hacer uso de formulaciones adecuadas para la administracion para dispensar anticuerpos en un aerosol. Tales aerosoles pueden estar comprendidos en soluciones (tanto acuosas como no acuosas) o partfculas solidas. Los inhalador de dosis medidas, como el inhalador de dosis medida Ventolin®, tfpicamente usan un gas propelente y requieren actuacion durante la inspiracion (ver, por ejemplo, WO 94/16970, Wo 98/35888). Los inhaladores de polvo seco como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inhalador Spiros™ (Dora), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, y el inhalador en polvo Spinhaler® (Fisons), usan respiracion-actuacion de un polvo mezclado (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons). Los nebulizadores como AERx™ Aradigm, el nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt), y el nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), las referencias anteriores enteramente incorporadas aqrn mediante referencia, producen aerosoles de soluciones, mientras que los inhaladores de dosis medidas, inhaladores de polco seco, etc., generan aerosoles de partfcula pequena. Estos ejemplos espedficos de dispositivos de inhalacion comercialmente disponibles se pretende que sean una representacion de dispositivos espedficos adecuados para la practica de esta invencion, y no se pretenden como limitantes del ambito de la invencion. Preferiblemente, se distribuye una composicion que comprende al menos un anticuerpo anti-IL-12 mediante un inhalador de polvo seco o un pulverizador. Hay varias caractensticas deseables de un dispositivo de inhalacion para administrar al menos un anticuerpo de la presente invencion. Por ejemplo, la distribucion por el dispositivo de inhalacion es de forma ventajosa fiable, reproducible y exacta. El dispositivo de inhalacion puede distribuir opcionalmente partfculas secas pequenas, por ejemplo, de menos de alrededor de 10 pm, preferiblemente de alrededor de 1-5 pm, para una buena respirabilidad.

Administracion de composiciones de anticuerpo anti-IL-12 como un aerosol

Se puede producir un aerosol que incluya una composicion proteica de anticuerpo IL-12 forzando una suspension o solucion de al menos un anticuerpo anti-IL-12 a traves de una boquilla a presion. El tamano y la configuracion de la boquilla, la presion aplicada, y la velocidad de alimentacion del lfquido se pueden elegir para

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

alcanzar la emision y tamano de partmula deseados. Se puede producir un electrospray, por ejemplo, mediante un campo electrico en union con un capilar o boquilla de alimentacion. De forma ventajosa, las partmulas de la protema de composicion de al menos un anticuerpo anti-IL-12 distribuidas mediante un pulverizador tienen un tamano de partmula de menos de alrededor de 10 pm, preferiblemente en el intervalo de alrededor de 1 pm hasta alrededor de 5 pm, y lo mas preferiblemente alrededor de 2 pm hasta alrededor de 3 pm.

Las formulaciones de composicion proteica de al menos un anticuerpo anti-IL-12 adecuadas para su uso con un pulverizador tfpicamente incluyen composicion proteica de anticuerpo en un solucion acuosa a una concentracion de alrededor de 0,1 mg hasta alrededor de 100 mg de una composicion proteica de al menos un anticuerpo anti-IL-12 por ml de solucion o mg/gm, o cualquier rango o valor dentro de la misma, por ejemplo, pero no limitado a, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml o mg/gm. La formulacion puede incluir agentes tal como un excipiente, un tampon, un agente de isotonicidad, un conservante, un agente tensoactivo, y, preferiblemente, zinc. La formulacion tambien puede incluir un excipiente o agente para la estabilizacion de la protema de la composicion de anticuerpo, tal como un tampon, un agente reductor, una protema de masa, o un hidrato de carbono. Las protema de masa utiles en la formulacion de las protemas de composicion de anticuerpo incluyen albumina, protamina, o similares. Los hidratos de carbono tfpicos utiles en formular las protemas de composicion de anticuerpo incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o similares. La formulacion de la protema de la composicion de anticuerpo tambien puede incluir un agente tensoactivo, que puede reducir o prevenir agregacion inducida por la superficie de la protema de la composicion de anticuerpo producida por la atomizacion de la solucion al formar un aerosol. Se pueden emplear varios agentes tensoactivos convencionales, tales como esteres de acidos grasos y polioxietileno y alcoholes, y esteres sorbitoles de acidos grasos y polioxietileno. Las cantidades generalmente variaran entre el 0,001 y el 14% en peso de la formulacion. Agentes tensoactivos especialmente preferidos para los fines de esta invencion son monooleato sorbitano de polioxietileno, polisorbato 80, polisorbato 20, o similares. Tambien se pueden incluir agentes adicionales conocidos en la tecnica para la formulacion de una protema tal como anticuerpos anti-IL-12, o partes especificadas o variantes en la formulacion.

Administracion de composiciones de anticuerpo anti-IL-12 mediante un nebulizador

Se puede administrar la composicion proteica de anticuerpo mediante un nebulizador, tal como un nebulizador de chorro o un nebulizador ultrasonico. Tfpicamente, en un nebulizador de chorro se usa una fuente de aire comprimido para crear un chorro de aire de gran velocidad a traves de un orificio. Cuando el gas se expande mas alla de la boquilla, se crea una region de baja presion, que arrastra la solucion de protema de la composicion de anticuerpo a traves de un tubo capilar unido a deposito de lfquido. La corriente de lfquido desde el tubo capilar se rompe en filamentos y gotas inestables segun sale del tubo, creando el aerosol. Se pueden emplear un rango de configuraciones, velocidades de flujo, y tipos de separadores para alcanzar las caractensticas de realizacion deseadas de un nebulizador a chorro determinado. En un nebulizador ultrasonico, se usa energfa electrica de alta frecuencia para crear energfa vibratoria, mecanica, tfpicamente empleando un transductor piezoelectrico. Esta energfa se transmite a la formulacion de la protema de la composicion de anticuerpo directamente o traves de un lfquido de acoplamiento, creando un aerosol que incluye la protema de la composicion de anticuerpo. De forma ventajosa, las partmulas de la protema de la composicion de anticuerpo distribuidas por un nebulizador tienen un tamano de partmula de menos de alrededor de 10 pm, preferiblemente en el intervalo de alrededor de 1 pm hasta alrededor de 5 pm, y lo mas preferiblemente alrededor de 2 pm hasta alrededor de 3 pm.

Las formulaciones de al menos un anticuerpo anti-IL-12 adecuadas para su uso con un nebulizador, de chorro o ultrasonico, tfpicamente incluyen una concentracion de alrededor de 0,1 mg hasta alrededor de 100 mg de la protema de al menos un anticuerpo anti-IL-12 por ml de solucion. La formulacion puede incluir agentes tal como un excipiente, un tampon, un agente de isotonicidad, un conservante, un agente tensoactivo, y, preferiblemente, zinc. La formulacion tambien puede incluir un excipiente o agente para la estabilizacion de la protema de la composicion de al menos un anticuerpo anti-IL-12, tal como un tampon, un agente reductor, una protema de masa, o un hidrato de carbono. Las protemas de masa utiles en la formulacion de las protemas de composicion de anticuerpo incluyen albumina, protamina, o similares. Los hidratos de carbono tfpicos utiles en formular al menos un anticuerpo anti-IL-12 incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o similares. La formulacion de al menos un anticuerpo anti-IL-12 tambien puede incluir un agente tensoactivo, que puede reducir o prevenir agregacion inducida por la superficie de al menos un anticuerpo anti-IL-12 producida por la atomizacion de la solucion al formar un aerosol. Se pueden emplear varios agentes tensoactivos convencionales, tal como esteres de acidos grasos y polioxietileno y alcoholes, y esteres sorbitoles de acidos grasos y polioxietileno. Las cantidades generalmente variaran entre el 0,001 y el 4% en peso de la formulacion. Agentes tensoactivos especialmente preferidos para los fines de esta invencion son monooleato sorbitano de polioxietileno, polisorbato 80, polisorbato 20, o similares. Tambien se pueden incluir agentes adicionales conocidos en la tecnica para la formulacion de una protema tal como una protema de anticuerpo en la formulacion.

Administracion de composiciones de anticuerpo anti-IL-12 mediante un inhalador de dosis medidas

En un inhalador de dosis medidas (MDI), un propulsor, al menos un anticuerpo anti-IL-12, y cualquier

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

excipiente u otros aditivos, estan contenidos en un bote como una mezcla incluyendo un gas comprimido licuado. La actuacion de la valvula de medida libera la mezcla como un aerosol, preferiblemente conteniendo partfculas en el intervalo de tamano de menos de alrededor de 10 pm, preferiblemente de alrededor de 1 pm hasta alrededor de 5 pm, y lo mas preferiblemente alrededor de 2 pm hasta alrededor de 3 pm. El tamano de partfcula de aerosol deseado se puede obtener empleando una formulacion de composicion proteica de anticuerpo producida por varios metodos conocidos para los expertos en la materia, incluyendo micronizacion, secado por rociado, condensacion a punto cntico, o similares. Los inhaladores de dosis medidas preferidos incluyen los fabricados por 3M o Glaxo y que emplean propulsor de hidrofluorocarbono.

Las formulaciones de al menos un anticuerpo anti-IL-12 para su uso con un dispositivo inhalador de dosis medidas generalmente incluiran un polvo finamente dividido que contendra al menos un anticuerpo anti-IL-12 como una suspension en un medio no acuoso, por ejemplo suspendido en un propulsor con ayuda de un agente tensoactivo. El propulsor puede ser de cualquier material convencional empleado para este proposito, tal como clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrodrofluoroalcano-134a), HFA-227 (hidrodrofluoroalcano-227), o similares. Preferiblemente, el propulsor es un hidrofluorocarbono. Se puede elegir el agente tensoactivo para estabilizar el al menos un anticuerpo anti-IL-12 como una suspension en el propulsor, para proteger el principio activo contra la degradacion qmmica, y similares. Los agentes tensoactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitano, lecitina de soja, acido oleico, o similares. En algunos casos se prefieren aerosoles que usan solventes tal como etanol. Tambien se pueden incluir agentes adicionales conocidos en la tecnica para la formulacion de una protema tal como una protema en la formulacion.

El experto en la materia reconocera que los metodos de la presente invencion se pueden alcanzar mediante administracion pulmonar de composiciones de al menos un anticuerpo anti-IL-12 a traves de dispositivos no descritos aquL

Formulaciones y administracion oral

Las formulaciones orales se basan en la coadministracion de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y agentes tensoactivos no ionicos tal como polioxietileno oleil eter y n-hexadecilpolietileno eter) para aumentar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, asf como la coadministracion de inhibidores enzimaticos (por ejemplo, inhibidores de la tripsina pancreatica, diisopropilfluorofosfato (DFF) y trasilol) para inhibir la degradacion enzimatica. El compuesto constituyente activo de la forma farmaceutica de tipo solido para la administracion oral se puede mezclar con al menos un aditivo, incluyendo sacarosa, lactosa, celulosa, manitol, trehalosa, rafinosa, maltitol, dextrano, almidones, agar, arginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma tragacanto, goma arabiga, gelatina, colageno, casema, albumina, polfmeros sinteticos o semisinteticos, y gliceridos. Estas formas farmaceuticas tambien pueden contener otro(s) tipo(s) de aditivos, por ejemplo, agente diluyente inactivo, lubricante tal como estearato de magnesio, parabeno, agente conservante tal como acido sorbico, acido ascorbico, alfa-tocoferol, antioxidante tal como cistema, desintegrador, aglutinante, espesante, agente amortiguador, agente edulcorante, agente saborizante, agente perfumante, etc.

Los comprimidos y pfldoras se pueden procesar adicionalmente en preparaciones entericas recubiertas. Las preparaciones lfquidas para la administracion oral incluyen preparaciones en emulsion, jarabe, elixir, suspension y solucion permisible para uso medico. Estas preparaciones pueden contener agentes diluyentes inactivos normalmente usados en dicho campo, por ejemplo, agua. Tambien se han descrito liposomas como sistemas de distribucion de farmacos para insulina y heparina (patente de EE.UU. No. 4239754). Mas recientemente, se han usado microesferas de polfmeros artificiales de aminoacidos mezclados (proteinoides) para distribuir productos farmaceuticos (patente de EE.UU. No. 4925673). Ademas, se usan compuestos soporte descritos en la patente de EE.UU. No. 5879681 y la patente de EE.UU. No. 55871753 para distribuir agentes biologicamente activos por via oral son conocidos en la tecnica.

Formulaciones y administracion por mucosa

Para la absorcion a traves de las superficies de la mucosa, las composiciones y metodos de administrar al menos un anticuerpo anti-IL-12 incluyen una emulsion que comprende una pluralidad de partmulas submicronicas, una macromolecula mucoadhesiva, un peptido bioactivo, y una fase acuosa continua, que fomentan la absorcion a traves de las superficies de mucosas alcanzado la mucoadhesion de las partmulas en emulsion (patente de EE.UU. No. 5514670). Las superficies mucosas adecuadas para la aplicacion de las emulsiones de la presente invencion pueden incluir vfas de administracion corneal, conjuntiva, yugal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal y rectal. Las formulaciones para administracion vaginal o rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener como excipientes, por ejemplo, polialquilenglicoles, vaselina, manteca de cacao, y similares. Las formulaciones para administracion intranasal pueden ser solidas y contener como excipientes, por ejemplo, lactosa o pueden ser soluciones acuosas u oleaginosas de gotas nasales. Para la administracion yugal los excipientes incluyen azucares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidon pregelatinizado, y similares (patente de EE.UU. No. 5849695).

Formulaciones y administracion transdermica

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Para la administracion transdermica, el al menos un anticuerpo anti-IL-12 se encapsula en un dispositivo de distribucion tal como un liposoma o nanopartmulas polimericas, micropartmulas, microcapsula o microesferas (denominadas colectivamente como micropartmulas a menos que se especifique de otra manera). Se conocen un numero de dispositivos adecuados, incluyendo micropartmulas hechas de polfmeros sinteticos tal como acidos polihidroxi tal como acido polilactico, acido poliglicolico y copoUmeros de los mismos, poliortoesteres, polianh^dridos, y polifosfacenos, y polfmeros naturales tal como colageno, poliaminoacidos, albumina y otras protemas, alginato y otros polisacaridos, y combinaciones de los mismos (patente de EE.UU. No. 5814599).

Administracion y formulaciones prolongadas

Algunas veces puede ser deseable distribuir los compuestos de la presente invencion al sujeto a lo largo de periodos prolongados de tiempo, por ejemplo, durante periodos de una semana a un ano a partir de una administracion unica. Se pueden utilizar varias formas farmaceuticas de liberacion lenta, deposito o implante. Por ejemplo, una forma farmaceutica puede contener una sal no toxica farmaceuticamente aceptable de los compuestos que tiene un grado bajo de solubilidad en lfquidos corporales, por ejemplo, (a) una sal de adicion acida con un acido polibasico tal como acido fosforico, acido sulfurico, acido crtrico, acido tartarico, acido tanico, acido pamoico, acido algmico, acido poliglutamico, acidos naftaleno mono- o di-sulfonico, acido poligalacturonico, y similares; (b) una sal con un cation metalico polivalente tal como zinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, mquel, cadmio y similares o con un cation organico formado de por ejemplo, N,N'-dibencil-etilendiamina o etilendiamina; o (c)combinaciones de (a) y (b), por ejemplo, una sal de tanato de zinc. Ademas, los compuestos de la presente invencion o, preferiblemente, una sal relativamente insoluble tal como las que se acaban de describir, se pueden formular en un gel, por ejemplo, un gel de monoestearato de aluminio con, por ejemplo, aceite de sesamo, adecuado para inyeccion. Sales particularmente preferidas son sales de zinc, sales de tanato de zinc, sales de pamoato, y similares. Otro tipo de formulacion en deposito de liberacion lenta para inyeccion contendna el compuesto o sal dispersado para encapsular en un polfmero no antigenico, no toxico, de degradacion lenta tal como un polfmero de acido polilactico/acido poliglicolico por ejemplo como se describe en la patente de EE.UU. No. 3773919. Los compuestos, o preferiblemente, sales relativamente insolubles tales como las descritas anteriormente tambien se pueden formular en pellas silasticas de matriz de colesterol, particularmente para uso en animales. En la bibliograffa se conocen formulaciones adicionales de liberacion lenta, deposito o implante, por ejemplo liposomas de gas o lfquidos (patentes de EE.UU. No. 5770222 y “Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

Habiendo descrito la invencion en general, la misma se entendera mas facilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustracion y no se pretende que sean limitantes.

Se usa el vector pC4 para la expresion del anticuerpo de IL-12. El plasmido pC4 es un derivado del plasmido pSV2-dhfr (No. de acceso de la ATCC 37146). El plasmido contiene el gen DHFR de raton bajo el control del promotor temprano de SV40. Se pueden seleccionar celulas de ovario de hamster chino u otras que carecen de actividad dihidrofolato que se transfectan con estos plasmidos haciendolas crecer en un medio selectivo (por ejemplo MEM alfa menos, Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con el agente quimioterapeutico metotrexato. La amplificacion de los genes DHFR en celulas resistentes a metotrexato (MTX) esta bien documentada (ver, por ejemplo, F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J.L. Hamlin y C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); y M.J. Page y M.A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Las celulas crecidas en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al farmaco sobreproduciendo la enzima diana, DHFR, como resultado de la amplificacion del gen DHFR. Si un segundo gen esta unido al gen DHFR, normalmente se coamplifica y se sobreexpresa. Se sabe en la tecnica que este planteamiento se puede usar para desarrollar lmeas celulares que llevan mas de 1000 copias del gen(es) amplificado(s). Posteriormente, cuando se retira el metotrexato, se obtienen lmeas celulares que contienen el gen amplificado integrado en uno o mas cromosoma(s) de la celula huesped.

El plasmido pC4 contiene para expresar el gen de interes el promotor fuerte de la repeticion terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) mas un fragmento aislado del potenciador del gen inmediato temprano del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)). En 3' del promotor hay sitios de corte de enzimas de restriccion BamHI, Xbal y Asp718 que permiten la integracion de los genes. Tras estos sitios de clonacion el plasmido contiene el intron 3' y el sitio de poliadenilacion del gen de la preproinsulina de rata. Tambien se pueden usar para la expresion otros promotores de alta eficacia, por ejemplo, el promotor de la b-actina humana, los promotores temprano o tardfo de SV40 o las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo, VIH y HTLVI. Se pueden usar los sistemas de expresion genica de Clontech Tet-Off y Tet-On y sistemas similares para expresar IL-12 de una manera regulada en celulas de mairnferos (M. Gossen, y H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). Para la poliadenilacion del ARNm se pueden usar tambien otras senales, por ejemplo, de los genes de la hormona de crecimiento o la globina humanas. Tambien se pueden seleccionar lmeas celulares estables que llevan un gen de interes integrado en los cromosomas tras cotransfeccion con un marcador de seleccion tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso usar mas de un marcador de seleccion al principio, por ejemplo G418 mas metotrexato.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El plasmido pC4 se digiere con enzimas de restriccion y despues se desfosforila usando fosfatasa de intestino de ternera mediante procedimientos conocidos en la tecnica. El vector se afsla despues de un gel de agarosa al 1%.

Se usa la secuencia de ADN que codifica el anticuerpo contra IL-12 completo, por ejemplo, como se presenta en SEQ ID NOS: 7 y 8, correspondientes a las regiones variables de HC y LC de un anticuerpo contra IL-12 de la presente invencion, segun pasos de metodos conocidos. Tambien se usa el acido nucleico asilado que codifica una region constante humana adecuada (es decir regiones HC y LC) en esta construccion (por ejemplo, proporcionado en el vector p1351).

El ADN que codifica la region variable y constante aislada y el vector desfosforilado se ligan despues con ADN ligasa de T4. Se transforman celulas de E. coli HB 101 o XL-1 Blue y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plasmido pC4 usando, por ejemplo, analisis con enzimas de restriccion.

Se usan celulas de ovario de hamster chino (CHO) que carecen de un gen DHFR activo para la transfeccion. Se contransfectan 5 g de plasmido de expresion pC4 con 0,5 g del plasmido pSV2-neo, usando lipofectina. El plasmido pSV2neo contiene un marcador de seleccion dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibioticos incluyendo G418. Las celulas se siembran en MEM alfa menos suplementado con G418 1 g/ml. Despues de 2 dfas, las celulas se tripsinizan y se siembran en placas de clonacion de hibridoma (Greiner, Alemania) en MEM alfa menos suplementado con 10, 25 o 50 ng/ml de metotrexato mas G418 1 g/ml. Despues de alrededor de 10-14 dfas se tripsinizan colonias individuales y despues se siembran en placas petri de 6 pocillos o botellas de 10 ml usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen a las concentraciones mas altas de metotrexato se transfieren despues a placas nuevas de 6 pocillos que contienen concentraciones de metotrexato incluso mas altas (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Se repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que crecen a una concentracion de 100-200 mM. Se analiza la expresion del producto del gen deseado, por ejemplo, mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia o mediante analisis de HPLC de fase reversa.

Ejemplo 2: Generacion de anticuerpos monoclonales IgG humanos de alta afinidad que reaccionan con IL-12 humana usando ratones transgenicos

Resumen

Se han usado ratones transgenicos que contienen genes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana para generar anticuerpos monoclonales de alta afinidad, completamente humanos, que se pueden usar de forma terapeutica para inhibir la accion de IL-12 para el tratamiento de una o mas enfermedades mediadas por IL-12. Se inmunizan ratones hforidos (CBA/J x C57/BL6/J)F2 que contienen transgenes humanos de la region variable y constante de anticuerpo tanto para la cadena pesada como ligera con IL-12 humana recombinante (Taylor et al., Intl. Immunol. 6:579-591 (1993); Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14:826 (1996); Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)). Varias fusiones produjeron uno o mas paneles de anticuerpos monoclonales IgG completamente humanos que reaccionan con IL-12. Los anticuerpos anti-IL-12 completamente humanos se caracterizan adicionalmente. Todos son IgG1. Se determina que tales anticuerpos tienen constantes de afinidad de alrededor de entre 1x109 y 9x1012 Las afinidades inesperadamente altas de estos anticuerpos monoclonales totalmente humanos los hacen candidatos adecuados para aplicaciones terapeuticas en enfermedades, patologfas o trastornos relacionados con IL-12.

Abreviaturas

BSA - seroalbumina bovina

CO2 - dioxido de carbono

DMSO - dimetilsulfoxido

EIA- inmunoensayo enzimatico

SBF - suero bovino fetal

H2O2 - peroxido de hidrogeno

HRP - peroxidasa de rabano

ID - intradermico

Ig - inmunoglobulina

IL-12 - interleuquina-12

IP - intraperitoneal

IV - intravenoso

Mab - anticuerpo monoclonal

DO - densidad optica

OPD - Diclorhidrato de o-fenilenediamina

PEG - polietilenglicol

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

PSA - penicilina, estreptomicina, anfotericina

RT - temperatura ambiente

SC - subcutaneo

v/v - volumen por volumen

p/v- peso por volumen

Materiales y Metodos

Animales

Los ratones transgenicos que pueden expresar anticuerpos humanos son conocidos en la tecnica (y estan comercialmente disponibles (por ejemplo, de GenPharm International, San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA, y otros) que expresan inmunoglobulinas humanas pero no IgM o Ig de raton. Por ejemplo, tales ratones transgenicos contienen transgenes de secuencias humanas que padecen union V(D)J, cambio de clase de cadena pesada, y mutacion somatica para generar un repertorio de inmunoglobulinas de secuencia humana (Lonberg, et al., Nature 368:856-859 (1994)). El transgen de la cadena ligera puede derivar, por ejemplo, en parte de un clon de cromosoma artificial de levadura que incluye casi la mitad de la region V de la lmea germinal humana. Ademas, el transgen de la cadena pesada puede codificar tanto la region constante humana p como humana 1 (Fishwild, et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)) y/o 3. Se pueden usar ratones derivados de linajes genotfpicos apropiados en los procesos de inmunizacion y fusion para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos contra IL-12.

Inmunizacion

Se pueden usar uno o mas programas de inmunizacion para generar los hibridomas humanos anti-IL-12. Se pueden realizar las primeras fusiones diversas segun el siguiente protocolo de inmunizacion ejemplar, pero se pueden usar otros protocolos similares conocidos. Varios ratones transgenicos hembras y/o machos quirurgicamente castrados de 14-20 semanas de edad se inmunizan IP y/o ID con 1-1000 pg de iL-12 recombinante humana emulsionada con un volumen igual de TITERMAX o adyuvante completo de Freund en un volumen final de 100-400 pL (por ejemplo, 200). Cada raton puede recibir tambien opcionalmente de 1-10 pg en 100 pL de solucion salina fisiologica en cada uno de 2 sitios SC. Los ratones se pueden inmunizar despues 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 y/o 21-34 dfas despues IP (1-400 pg) y SC (1-400 pg x 2) con IL-12 emulsionada con un volumen igual de TITERMAX o adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se pueden sangrar 12-25 y 25-40 dfas despues mediante puncion retro-orbital sin anticoagulante. La sangre se deja coagular a temperatura ambiente durante una hora y se recoge y titula el suero usando un ensayo EIA de IL-12 segun metodos conocidos. Se realizan las fusiones cuando las inyecciones repetidas no producen que los tttulos aumenten. A este tiempo, se les puede dar a los ratones una inyeccion de recuerdo IV final de 1-400 pg de IL-12 diluida en 100 pL de solucion salina fisiologica. Tres dfas despues, los ratones se pueden sacrificar mediante dislocacion cervical y recoger los bazos de forma aseptica y sumergirlos en 10 mL de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) fna que contiene penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 pg/mL, y anfotericina B 0,25 pg/mL (PSA). Se recogen los esplenocitos mediante perfusion esteril del bazo con PSA-PBs. Las celulas se lavan una vez en PSA-PBS fno, se cuentan usando exclusion del colorante azul de tripano y se resuspenden en medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM.

Fusion celular

La fusion se puede llevar a cabo a una proporcion de 1:1 hasta 1:10 de celulas de mieloma murino a celulas viables del bazo segun metodos conocidos, por ejemplo, como se sabe en la tecnica. Como ejemplo no limitante, se pueden precipitar juntas las celulas del bazo y las celulas de mieloma. El precipitado se puede despues resuspender lentamente, a lo largo de 30 segundos, en 1 mL de solucion PEG al 50%/PBS (p/v) (peso molecular de PEG 1.450, Sigma) a 37 C. La fusion se puede detener anadiendo lentamente 10,5 mL de medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM (37 C) a lo largo de 1 minuto. Las celulas fusionadas se centrifugan durante 5 minutos a 500-1500 rpm. Las celulas se resuspenden despues en medio HAT (medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM, suero fetal de clon I (Hyclon) al 10%, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, gentamicina 10 pg/mL, suplemento de cultivo origen (Fisher) al 2,5%, medio condicionado RPMI 1640/Hepes-653 al 10%, 2-mercaptoetanol 50 pM, hipoxantina 100 pM, aminopterina 0,4 pM, y timidina 16 pM) y se siembran a 200 pL/pocillo en quince placas de cultivo de 96 pocillos de fondo plano. Las placas se colocan en un incubador humidificado a 37 C que contiene CO2 al 5% y aire al 95% durante 7-10 dfas.

Deteccion de anticuerpos humanos IgG anti-IL-12 en suero de raton

Se puede usar EIA de fase solida para cribar sueros de raton para anticuerpos humanos IgG espedficos para IL-12 humana. Brevemente, las placas se pueden recubrir con IL-12 a 2 pg/mL en PBS durante la noche. Despues de lavar en solucion salina 0,15 M que contiene Tween 20 al 0,02% (v/v), los pocillos se pueden bloquear con BSA al 1% (p/v) en PBS, 200 pL/pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se usan inmediatamente o se congelan a -20 C para su uso futuro. Se incuban las diluciones del suero de raton en las placas recubiertas de IL-12 a 50 pL/pocillo a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavan y despues se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ensayan con 50 pL/pocillo de IgG anti-humano de cabra marcado con HRP, espedfico de Fc diluido 1:30.000 en BSA al 1%-PBS durante 1 hora a temperature ambiente. Las placas se pueden lavar de nuevo y se anaden 100 pL/pocillo de la solucion de sustrato citrato-fosfato (acido dtrico 0,1 M y fosfato de sodio 0,2 M, H2O2 al 0,01% y OPD 1 mg/mL) durante 15 minutos a temperature ambiente. Se anade despues solucion de parada (acido sulfurico 4 N) a 25 pL/pocillo y se leen las DO a 490 nm por medio de un espectrofotometro de placas automatizado.

Deteccion de inmunoglobulinas completamente humanas en sobrenadantes de hibridoma

Se pueden detectar hibridomas de crecimiento positivo que secretan inmunoglobulinas completamente humanas usando un EIA adecuado. Brevemente, se pueden recubrir placas de 96 pocillos extrafbles (VWR, 610744) con 10 pg/mL de IgG de cabra anti-humana Fc en tampon carbonato de sodio durante la noche a 4 C. Las placas se lavan y se bloquean con BSA al 1% en PBS durante 1 hora a 37°C y se usan inmediatamente o se congelan a -20 C. Se incuban los sobrenadantes de hibridoma sin diluir en placas durante una hora a 37°C. Las placas se lavan y se ensayan con kappa anti-humana de cabra marcada con HRP diluida 1:10.000 en BSA al 1% en PBS durante una hora a 37°C. Las placas se incuban despues con solucion de sustrato como se ha descrito anteriormente.

Determinacion de la reactividad de anti-IL-12 completamente humano

Los hibridomas, como anteriormente, se pueden ensayar simultaneamente para la reactividad a IL-12 usando un RIA adecuado u otro ensayo. Por ejemplo, se incuban los sobrenadantes en placas con IgG de cabra anti-humana Fc como anteriormente, se lavan y despues se ensayan con IL-12 radiomarcada con cuentas por pocillo adecuadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan dos veces con PBS y se cuantifica la IL-12 radiomarcada unida usando un contador adecuado.

Los hibridomas que secretan IgG1 humana anti-IL-12 se pueden expandir en cultivo celular y subclonar serialmente mediante dilucion limitante. Las poblaciones clonicas resultantes se pueden expandir y crioconservar en medio de congelacion (SBF al 95%, DMSO al 5%) y almacenar en nitrogeno lfquido.

Isotipado

Se puede realizar la determinacion del isotipo de los anticuerpos usando un EIA en un formato similar al usado para cribar los sueros inmunes de raton para tftulos espedficos. Se pueden recubrir placas de 96 pocillos con IL-12 como se ha descrito anteriormente y se puede incubar el anticuerpo purificado a 2 pg/mL en la placa durante una hora a temperatura ambiente. La placa se lava y se ensaya con IgG1 anti-humana de cabra marcada con HRP o IgG3 anti-humana de cabra marcada con HRP diluida 1:4000 en BSA al 1% en PBS durante una hora a temperatura ambiente. La placa se lava de nuevo y se incuba con solucion de sustrato como se ha descrito anteriormente.

Cinetica de union de anticuerpos humanos anti-IL-12 humana con IL-12 humana

Las caractensticas de union para anticuerpos se pueden evaluar adecuadamente usando un EIA de captura de IL-12 y tecnologfa BIAcore, por ejemplo. Se pueden evaluar concentraciones graduadas de anticuerpos humanos de IL-12 purificados para la union a placas de EIA cubiertas con 2 pg/mL de IL-12 en ensayos como se describe anteriormente. Se pueden presentar las DO como graficas semi-logantmicas que muestren las eficacias de union relativa.

Se pueden obtener las constantes de union cuantitativas, por ejemplo, como sigue, o mediante cualquier otro metodo adecuado conocido. Se coloca un chip CM-5 (carboximetil) de BIAcore en una unidad BIAcore 2000. Se hace fluir tampon HBS (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, agente tensoactivo P20 al 0,005% v/v, pH 7,4) sobre una celula de flujo del chip a 5 pL/minuto hasta que se obtiene una lmea base estable. Se anade una solucion (100 pL) de 15 mg de EDC (clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida) en 200 pL de agua a 100 pL de una solucion de 2,3 mg de NHS (N-hidroxisuccinimida) en 200 pL de agua. Se inyectan cuarenta (40) pL de la solucion resultante en el chip. Se inyectan seis pL de una solucion de IL-12 humana (15 pg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4,8) en el chip, produciendo un aumento de ca. 500 UR. Se cambia el tampon a tampon de carrera TBS/Ca/Mg/BSA (Tris 20 mM, cloruro de sodio 0,15 M, cloruro de calcio 2 mM, acetato de magnesio 2 mM, Triton X- 100 al 0,5%, BSA 25 pg/mL, pH 7,4) y se deja fluir sobre el chip durante la noche para equilibrarlo y para hidrolizar o bloquear cualquier ester se succinimida sin reaccionar.

Los anticuerpos se disuelven en el tampon de carrera a 33,33, 16,67, 8,33 y 4,17 nM. La velocidad de flujo se ajusta a 30 pL/min y la temperatura del instrumento a 25 C. Se usan dos celulas de flujo para las carreras de cinetica, una en la que se ha inmovilizado IL-12 (muestra) y una segunda, celula de flujo sin derivar (blanco). Se inyectan 120 pL de cada concentracion de anticuerpo en las celulas de flujo a 30 pL/min (fase de asociacion) seguido por 360 segundos ininterrumpidos de flujo de tampon (fase de disociacion). La superficie del chip se regenera (complejo interlequina-12/anticuerpo disociado) mediante dos inyecciones secuenciales de 30 pL cada una de tiocianato de guanidina 2 M.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El analisis de los datos se hace usando evaluacion BIA 3.0 o CLAMP 2.0, como se sabe en la tecnica. Para cada concentracion de anticuerpo se resta el sensograma del blanco del sensograma de la muestra. Se hace un ajuste global tanto para la disociacion (kd, seg_1) como para la asociacion (ka, moMseg-1) y la constante de disociacion (Kd, mol) se calcula (kd/ka). Donde la afinidad del anticuerpo es lo suficientemente alta que las RU del anticuerpo capturado sean >100, se corren diluciones adicionales del anticuerpo.

Resultados y Discusion

Generacion de anticuerpos monoclonales anti-IL-12 humana

Se realizan varias fusiones y cada fusion se siembra en 15 placas (1440 pocillos/fusion) que producen varias docenas de anticuerpos espedficos para IL-12 humana. De estos, se determina que algunos consisten en una combinacion de cadenas de Ig humanas y de raton. Los hibridomas restantes secretan anticuerpos anti-IL-12 que consisten solamente en cadenas pesadas y ligeras humanas. De los hibridomas humanos se espera que todos sean IgG1.

Cinetica de union de anticuerpos humanos anti-IL-12 humana

El analisis por ELISA confirma que el anticuerpo purificado de la mayona o todos estos hibridomas se une a IL-12 de una manera dependiente de la concentracion. Las figuras 1-2 muestran los resultados de la eficacia relativa de union de estos anticuerpos. En este caso, se mide la avidez del anticuerpo por su antfgeno afm (epttopo). Se debe advertir que la union de IL-12 directamente a la placa de EIA puede producir desnaturalizacion de la protema y las afinidades aparentes de union no pueden reflejar la union a la protema desnaturalizada. Se encontro un cincuenta por ciento de union en un intervalo de concentraciones.

Se obtienen constantes cuantitativas de union usando el analisis por BIAcore de los anticuerpos humanos y revela que varios de los anticuerpos monoclonales humanos tienen gran afinidad con Kd en el intervalo de 1x10'9 a 7x10'12

Conclusiones

Se realizan varias fusiones usando esplenocitos de ratones hfbridos que contienen transgenes de regiones variables y constantes de anticuerpos humanos que se inmunizan con IL-12 humana. Se generan una serie de anticuerpos monoclonales IgG completamente humanos que reaccionan con IL-12. Los anticuerpos anti-IL-12 completamente humanos se caracterizan adicionalmente. Varios de los anticuerpos generados tienen constantes de afinidad entre 1x109 y 9x1012. Las afinidades inesperadamente altas de estos anticuerpos monoclonales completamente humanos los hacen adecuados para aplicaciones terapeuticas en enfermedades, patologfas o afecciones relacionadas dependientes de IL-12.

Ejemplo 3: C340 es un anticuerpo monoclonal humano neutralizante

Se mostro que la bioactividad de IL-12 se neutralizaba por C340 en una variedad de ensayos de actividad dependientes de IL-12. Puesto que IL-12 aumenta la produccion de IFN GAMMA por celulas NK y linfocitos T, se examino el efecto del anticuerpo C340 sobre el aumento del ARNm de IFN GAMMA y el efecto de C340 sobre la produccion de protema IFN GAMMA (Trinchieri, G., Current Opinion in Immunology, 9:17-23 (1997), Morris, S.C., et al., Journal of Immunology, 152:1047-1056 (1994)). Tambien se investigo en estos estudios la capacidad de C340 de neutralizar de la actividad celular de aniquilacion activada por linfoquina (LAK) dirigida por IL-12 (Kutza, J. y Murasko, D.M., Mechanisms of Ageing and Development, 90:209-222 (1996), Stern, A.S., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 87:6808-6812 (1990)). Por ultimo, se ensayo el efecto de C340 sobre la regulacion por ascenso de la expresion de CD95 en la superficie celular de celulas T y NK mediada por IL-12 (Medvedev, A.E., et al., Cytokine, 9:394-404 (1997)).

Inhibicion de la transcripcion del ARNm de IFN gamma

Para determinar si C340 inhibe la transcripcion del gen de IFN GAMMA inducida por IL-12, IL-2 en PBL humanos, se realizo un ensayo de transcripcion inversa-PCR. Se usaron cebadores espedficos para P-actina (un control para la integridad y contenido de ARNm) e IFN GAMMA para amplificar el ADNc obtenido de PBL humanos estimulados. La figura 3 muestra que C340 disminuye el ARNm de IFN GAMMA en PBMC activadas con IL-12/IL-2 (2 horas).

Inhibicion de IFN GAMMA intracelular medida mediante citometna de flujo

En respuesta a varias senales y como una medida de activacion, se puede inducir que las celulas T y las celulas NK secreten citoquinas. Mas espedficamente, PBL tratados con IL-2 e IL-12 inician smtesis sustancial de IFN gamma en 4-8 horas tras la estimulacion. Esta produccion se puede detectar en el citoplasma de PBL tratados

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

con brefeldina-A mediante citometna de flujo. La figura 4 demuestra una reduccion del 60% en la produccion de IFN GAMMA en tales cultivos cuando C340 IL-12 se anadio junto con IL-12 durante cinco horas.

Inhibicion de la secrecion de IFN GAMMA inducida por IL-12

La figura 5 claramente muestra que dos lotes diferentes de C340 inhibieron la secrecion de IFN GAMMA por linfocitos de sangre periferica en una manera dependiente de la dosis. Se premezclaron cuatrocientos picogramos de IL-12 con cantidades variables de C340 y despues se anadieron a cultivos de PBL estimulados con IL-2. Cuando se midio el IFN GAMMA mediante EIA despues de una incubacion de 18-24 horas, se detectaron cantidades marcadamente disminuidas de IFN GAMMA con tan poco como 1 ?g/mL de anticuerpo C340.

Inhibicion de la citotoxicidad celular LAK inducida por IL-12

Las celulas Raji, una lmea celular derivada de linfoma de Burkitt sensible a IL-12, es una lmea celular resistente a celulas NK, sensible a celulas LAK. Se cultivaron celulas Raji, en triplicado, durante cuatro horas con celulas LAK que se habfan activado con IL-12 400 pg/mL e IL-2 10 U/mL en presencia o ausencia del anticuerpo monoclonal humano C340 (5000 ng/mL o 50 ng/mL). La figura 6 muestra los resultados de tres donantes normales, sanos. La activacion por IL-12 + IL-2 de las celulas efectoras produjo un aumento en la actividad citotoxica sobre la de las celulas activadas con IL-2 sola. El anticuerpo C3410 inhibio este efecto dependiente de IL-12. La magnitud de la inhibicion estaba relacionada con la concentracion del anticuerpo, reduciendo la maxima concentracion ensayada la citotoxidad a niveles de fondo.

Inhibicion del aumento de CD95

Se ha descrito en informes el aumento de CD95 inducido por IL-12 en la superficie de PBL CD56+ muy purificados. Como se puede ver en la figura 7A y 7B, el analisis distribucional de citometna de flujo revelo que la expresion de CD95 estaba significativamente aumentada en celulas T CD3+ y celulas NK CD56+ despues del tratamiento con IL-12 mas IL-2 durante 72 horas. El tratamiento anti-IL-12 concomitante inhibio la expresion de CD95 tanto en poblaciones CD3+ como CD56+. Las celulas CD3+ se inhibieron en ~50% (Figura 7A), mientras que las celulas CD56+ se inhibieron en ~85% (Figura 7B), como se evidencia por un mdice MFI disminuido (porcentaje mayor que el control sin estimular).

Ejemplo 4: Clonacion y caracterizacion del gen

Se clonaron y purificaron fragmentos de ADN genomico que conteman el gen de la cadena pesada de C340 o el de la cadena ligera de C340. El ADN genomico purificado de las celulas de hibridoma de C340 se digirio parcialmente con la enzima de restriccion Sau3A y se selecciono por tamano mediante fraccionamiento por centrifugacion mediante un gradiente de sacarosa del 10-40%. Los fragmentos de ADN en el intervalo de tamano de 15-23 kb se clonaron en el vector bacteriofago, EMBL3, [disponible comercialmente?] y se empaquetaron en partfculas de fago. Varias reacciones de empaquetamiento produjeron una genoteca de 1 millon de clones de bacteriofagos. Aproximadamente se cribaron 600.000 clones de la genoteca mediante hibridacion en placa usando como sonda fragmentos de ADN genomico marcados con 32P que conteman secuencias de la region constante de la cadena pesada de IgG1 humana o secuencias de la region constante de la cadena ligera kappa humana. Se detectaron trece clones de cadena pesada y nueve de cadena ligera. De estos, se purificaron tres clones de cadena pesada y cuatro clones de cadena ligera mediante dos rondas mas de cribado. Se mostro que uno de los clones de cadena pesada y dos de los clones de cadena ligera conteman los extremos 5' y 3' de las secuencias codificantes mediante analisis por PCR del ADN del bacteriofago. El inserto de ADN en el clon de cadena pesada (HC) H4 tema 16 kb de tamano e incluye 3,6 kb de secuencia flanqueante 5' y al menos 2 kb de secuencia flanqueante 3'. El inserto de ADN en el clon de cadena ligera (LC) LC1 tema 15 kb de tamano e inclrna 4,4 kb de secuencia flanqueante 5' y 6,0 kb de secuencia flanqueante 3'. Se sacaron los insertos completos del vector bacteriofago como fragmentos SalI y se clonaron entre los sitios XhoI y SalI del vector plasmfdico de expresion p1351, provisto de un gen de marcador de seleccion gpt. Debido a que hay un sitio SalI interno en la secuencia codificante de la region variable de la cadena pesada, se tuvieron que transferir dos fragmentos SalI del bacteriofago H4 al vector de expresion p1351. Los plasmidos de expresion de la cadena pesada y ligera resultantes se denominaron p1560 y p1558, respectivamente. Se determinaron las orientaciones de los genes de la cadena pesada y ligera en estos dos plasmidos respecto a las secuencias del vector p1351 usando analisis con enzimas de restriccion y PCR, respectivamente. En ambos casos, las orientaciones eran tales que el extremo 5' del fragmento del gen del Ab estaba proximo al extremo 3' del gen gpt. Se secuenciaron ambas hebras de las regiones codificantes de los genes clonados. Las secuencias de los plasmidos p1560 y p1558 se presentan en las figuras 11A-11K y las figuras 13A- 13J, respectivamente.

Ejemplo 5: Preparacion de Imeas celulares recombinantes

El plasmido de la cadena pesada p1560 se linealizo mediante digestion con la enzima de restriccion PvuI y el plasmido de cadena ligera p1558 se linealizo usando la enzima de restriccion SalI. se transfectaron celulas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

p3X63Ag8.653 (653) y SP2/0-Ag14 (SP2/0) separadamente con los plasmidos linealizados premezclados mediante electroporacion y las celulas se cultivaron y se seleccionaron los transfectantes usando acido micofenolico como esta descrito (Knight, et al., Molecular Immunology 30:1443 (1993)). Se ensayaron los sobrenadantes celulares de las colonias resistentes a acido micofenolico aproximadamente dos semanas despues para IgG humana (es decir, C340 recombinante (rC340)). Para ello, los sobrenadantes celulares se incubaron en placas de 96 pocillos de ELISA que estaban recubiertos con anticuerpos de cabra espedficos para la parte Fc de IgG humana. Se detecto la IgG humana que se unio a la placa recubierta usando anticuerpo de cabra anti-IgG humana (cadena pesada + cadena ligera) conjugada con fosfatasa alcalina y sustratos de fosfatasa alcalina como se ha descrito (Knight, et al., Molecular Immunology 30:1443 (1993)). Se transfirieron celulas de los clones de mayor produccion a placas de cultivo de 24 pocillos en medio estandar y se expandieron (IMDM, SBF al 5%, glutamina 2 mM, mezcla de seleccion de acido micofenolico). La cantidad de anticuerpo producido (es decir, secretado en el medio de cultivos agotados) se cuantifico cuidadosamente mediante ELISA usando mAb C340 purificado como estandar. Los clones seleccionados se expandieron despues en botellas T75 y la produccion de IgG humana por estos clones se cuantifico mediante ELISA. Basado en estos valores, se subclonaron seis transfectantes independientes 653 y tres transfectantes independientes SP2/0 (sembrando una media de una celula por pocillo en placas de 96 pocillos), se determino la cantidad de anticuerpo producido por los subclones ensayando (ELISA) los sobrenadantes de las colonias de los subclones individuales. Se seleccionaron tres subclones, el transfectante de 653 19-20 (C379B) y los transfectantes de SP2/0 84-81 (C381A) y 22-56 (C389A) para analisis adicionales.

Ensayo de union a antfgeno de rC340

Antes de subclonar las lmeas celulares seleccionadas como se ha descrito anteriormente, se usaron los sobrenadantes celulares de las tres lmeas parentales (transfectantes de 653 clon 2 y clon 18 y transfectante de SP2/0 clon 1) para ensayar las caractensticas de union a antfgeno de rC340. Primero se determinaron las concentraciones de rC340 en las muestras de los tres sobrenadantes celulares mediante ELISA. Despues se incubaron cantidades de titulacion de las muestras de sobrenadante, o control positivo de C340 purificado, en placas de 96 pocillos recubiertos con 2 pg/ml de IL-12 humana. Se detecto el mAb unido con anticuerpo de cabra anti-IgG humana (cadena pesada + cadena ligera) conjugada con fosfatasa alcalina y sustratos adecuados de fosfatasa alcalina. Como se muestra en la figura 8, rC340 se unio espedficamente a IL-12 humana en una manera indistinguible del mAb C340 original.

Caracterizacion de las lmeas celulares seleccionadas

Se realizaron analisis de curvas de crecimiento en C379B, C381A y C389A sembrando botellas T75 con una densidad celular inicial de 2 x 105 celulas/ml en medio estandar o medio SFM-5 sin suero y despues controlando el numero de celulas y la concentracion de rC340 a diario hasta que los cultivos se agotaron. Los resultados de los cultivos en medio estandar se muestran en las figuras 9A-9C. Los niveles maximos de produccion de mAb C340 para C379B, C381A y C389A fueron de 135 pg/ml, 150 pg/ml y 110 pg/ml, respectivamente. Los intentos de adaptar las celulas C379B al medio SMF-5 no tuvieron exito. Las celulas C381A produjeron la misma cantidad de rC340 en medio SFM-5 que en medio estandar, mientras que las celulas C389A produjeron solo la mitad de rC340 en medio SFM-5 que en medio estandar.

Se evaluo la estabilidad de la produccion de mAb C340 a lo largo del tiempo para los tres subclones cultivando las celulas en placas de 24 pocillos con medio estandar o medio estandar sin seleccion de acido micofenolico durante periodos variables de tiempo. Se observo que las lmeas C379B y C381A produjeron de forma estable rC340 en presencia o ausencia de seleccion durante un periodo de 30 dfas (el tiempo maximo ensayado) y 75 dfas, respectivamente. La lmea C389A era inestable y despues de 43 dfas de cultivo produjo solo el 20% de anticuerpo que al principio del estudio.

Estara claro que la invencion se puede practicar de otra forma a como se ha descrito particularmente en la descripcion y ejemplos anteriores.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> JANSSEN BIOTECH, Inc.

<120> ANTICUERPOS ANTI-IL-12, COMPOSICIONES, METODOS Y USOS

<130> P052751EP

<140> EP 09006396.7

<141 > 2001-08-07

<150> US 09/920,262

<151 > 2001-08-01

<150> US 60/223,358

<151 > 2000-08-07

<150> US 60/236,827

<151 > 2000-09-29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<160> 15

<170> PatentIn Ver 3.1 <210> 1 <211> 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 1

Thr Tyr Trp Leu Gly

1 5

<210>2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

He Met Ser Pro Val Asp Ser Asp lie Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15

Gly

<210>3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Arg Arg Pro Gly Gin Gly Tyr Phe Asp Phe 15 10

<210>4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 15 10

<210>5 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5

<210>6 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Gin Gin Tyr Asn lie Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<210>7 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<400>7

Glu 1

val Gin Leu val 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 val Lys Lys Pro Gly 15 Glu

Ser

Leu Lys lie 20 Ser Cys Lys Gly Ser 25 Gly Tyr Ser Phe Thr 30 Thr Tyr

Trp

Leu Gly 35 Trp Val Arg Gin Met 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Asp Trp lie

Gly

lie 50 Met Ser Pro Val Asp 55 Ser Asp lie Arg Tyr 60 Ser Pro Ser Phe

Gin 65

Gly Gin val Thr Met 70 Ser val Asp Lys Ser 75 lie Thr Thr Ala Tyr 80

Leu

Gin Trp Asn Ser 85 Leu Lys Ala Ser Asp 90 Thr Al a Met Tyr Tyr 95 Cys

Ala

Arg Arg Arg 100 Pro Gly Gin Gly Tyr 105 Phe Asp Phe Trp Gly 110 Gin Gly

Thr

Leu val 115 Thr val Ser Ser

<210>8 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Asp

lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly

1

5 10 15

Asp

Arg val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp

20 25 30

Leu

Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie

35 40 45

Tyr

Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly val pro Ser Arg Phe ser Gly

50

55 60

Ser

Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro

65

70 75 80

Glu

Asp Phe Al a Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn lie Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr

Phe Gly Gl n Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg

100 105

<210>9 <211> 503 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Claims (20)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   Reivindicaciones

   1. Un anticuerpo anti-IL-12 o porcion que se une al antigeno del mismo, que tiene una region de union al antfgeno que comprende tres CDR de cadena pesada (CDR1, CDR2, y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y tres CDR de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 4, 5 y 6.
2. 2. El anticuerpo anti-IL-12 de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo es una inmunoglobulina.
3. 3. El anticuerpo anti-IL-12 de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que dicho anticuerpo se une a IL-12 con una afinidad representada por un Kd de al menos 10'9M, al menos 10'10M, al menos 10'11 M, o al menos 10-12 M.
4. 4. Una composicion que comprende el anticuerpo anti-IL-12 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y al menos un vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
5. 5. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 4, que comprende ademas al menos una composicion que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto o protema seleccionado de al menos uno de un antagonista del TNF, un antirreumatico, un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoratico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, una eritropoyetina, una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un farmaco de sustitucion hormonal, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antipsicotico, un estimulante, un medicamento contra el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o analogo, una citoquina y un antagonista de citoquina.
6. 6. Un acido nucleico que comprende un polinucleotido que codifica el anticuerpo anti-IL-12 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. 7. Una celula huesped procariota o eucariota que comprende el acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 6.
8. 8. Un metodo para producir un anticuerpo anti-IL-12, que comprende traducir un acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 7 bajo condiciones in vitro, in vio o in situ, de tal manera que el anticuerpo IL-12 se expresa en cantidades detectables y recuperables.
9. 9. El anticuerpo anti-IL-12 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en diagnostico o terapia.
10. 10. El anticuerpo anti-IL-12 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso de acuerdo con la reivindicacion

    9, en donde el diagnostico o terapia comprende poner en contacto o administrar una composicion que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-IL-12 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con o a, una celula, tejido, organo o animal.
11. 11. El anticuerpo anti-IL-12 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso de acuerdo con la reivindicacion

    10, en donde dicha cantidad efectiva es 0,001-50 mg/kilogramo de dichas celulas, tejido, organo o animal.
12. 12. El anticuerpo anti-IL-12 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicho contacto o dicha administracion es por al menos un modo seleccionado de parenteral, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelular, intracelebelar, intracerebroventricular, intracervica, intracervical, intragastrica, intrahepatica, intramiocardica, intraosteal, intrapelvica, intrapericardica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatica, intrarrectal, intrarrenal, intrarestinal, intraspinal, intrasinovial, intratoracico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdermico.
13. 13. El anticuerpo anti-IL-12 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende ademas administrar antes, concurrentemente o despues de dichos (a) contacto o administracion, al menos una composicion que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto o protema seleccionadoa de al menos una etiqueta o informador detectable, un antagonista del TNF, un antirreumatico, un relajante muscular, un narcotico, un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (NSAID), un analgesico, un anestesico, un sedante, un anestesico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsorasico, un corticosteroide, un esteroide anabolico, una eritropoyetina, una inmunizacion, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un farmaco de sustitucion hormonal, un radiofarmaco, un antidepresivo, un antipsicotico, un estimulante, un medicamento contra el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o analogo, una citoquina y un antagonista de citoquina.

    00 490nm DO 490nm

    imagen1

    C341

    C340

    C333

    C332

    C331

    C330

    C329

    FIGURA1A

    imagen2

    C354

    C355

    C356

    C366

    FIGURA1B

    FIGURA2A FIGURA2B

    imagen3

    58-li

    IL-12 Humana

    Diniero p40 de IL-12 humana

    IL-12 Murina

    Mareadures de peso moleeular

    imagen4

    imagen5

    imagen6

    1. Control
14. 2. IL-2
15. 3. 1L-12
16. 4. IL-2+IL-12
17. 5. IL-2+IL-12+C340
18. 6. IL-2+IL-12+C338 (isotipo control para C340)
19. 7. IL-2+IL-12+8.6.2
20. 8. IL-2+IL-12+8.A.1

    (isotipo control para 8.6.2)

    FIGURA3

    FIGURA4

    Porcentaje positivas > control no estimuladas

    K5 CO -tv. cn a 09 CD

    o

    O o o o o o O

    o

    J_____

    _I_____ —I_____ _J_____ . i . _i_____ I 1 -L_

    imagen7

    100J

    Produccion de IFN-gamma (pg/ml)

    imagen8

    340 Lote 1 340 Lote 2

    IL-2

    IL-12 + IL-2

    Concentracion de anticuerpo (pg/ml)

    FIGURA 5

    imagen9

    3]

    O

    5

    >

    Indice de Intensidad de Fluorescencia Media: (Porcentaje > Control si estimular)

    imagen10

    MI+2MICZD

    CD

    cz

    zo

    >

    ~^l

    CD

    Indice de Intensidad de Fluorescencia Media: (Porcentaje > Control no estimulado)

    o

    o

    3

    Q.

    o'

    o'

    3

    $

    ls>

    cn

    O-

    §

    cn

    o

    o

    _1_

    N>

    C*

    _L_

    Oi

    O

    j_

    imagen11

    Ol

    imagen12

    002

    cn

    o

    imagen13

    -*-C340 purificado estd +— 653 cion 2 o- 653 cion 18

    SP2/0 cion 1

    imagen14

    FIGURA8

    celulas/ml celulas/ml celulas/ml

    imagen15

    dias

    celulas/ml

    ug/ml

    FIGURA 9A

    imagen16

    celulas/ml

    ug/ml

    FIGURA 9B

    imagen17

    dias

    imagen18

    FIGURA 9C

    celulas/ml

    ug/ml