BRPI0113109B1

BRPI0113109B1 - anticorpo de anti-il-12 isolado, composição e método para produzir o referido anticorpo

Info

Publication number: BRPI0113109B1
Application number: BRPI0113109A
Authority: BR
Inventors: Scallon Bernard; M Knight David; Peritt David; Shealy David; Giles-Komar Jill
Original assignee: Centocor Inc; Johnson & Johnson
Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2017-02-07
Also published as: AU8113701A; EP2305817A3; CN101550190A; YU9303A; ATE431412T1; PT2305817T; LT2090657T; HU228009B1; NZ535865A; LUC00145I2; BR0113109A; US20200062841A1; LT3178934T; EP1309692A2; DK1309692T3; US10259867B2; ES2323760T3; NL300390I2; US20110082190A1; CY2009007I2

Abstract

"anticorpos anti-il-12, composições, métodos e usos". a presente invenção refere-se a pelo menos um novo anticorpo de anti-il-12, incluindo ácidos nuclêicos isolados que codificam pelo menos um anticorpo de anti- il-12, il-12, vetores, células hospedeiras, animais ou plantas transgênicas, e métodos de produção e uso do mesmo, incluindo composições, métodos e dispositivos terapêuticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO DE ANTI-IL-12 ISOLADO, COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA PRODUZIR O REFERIDO ANTICORPO".

HISTÓRICO DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

Este pedido é baseado em parte em, e reivindica prioridade a, U.S. Provisório 60/223.358 depositado em 7 de agosto de 2000 e 60/223.827 depositado em 29 de setembro de 2000, cada um dos quais é inteiramente incorporado aqui por referência. A presente invenção refere-se a anticorpos, incluindo porções ou variantes especificadas, específicos a pelo menos uma proteína de interleu-cina-12 (IL-12) ou fragmento do mesmo, bem como ácidos nucléicos codificando tais anticorpos anti-IL-12, ácidos nucléicos complementares, vetores, células hospedeiras, e método de produção e uso dos mesmos, incluindo formulações, administração e dispositivos terapêuticos.

TÉCNICA RELACIONADA lnterleucina-12 é uma citocina heterodimérica consistindo em cadeias de polipeptídeo glicosiladas de 35 a 40 kD as quais são ligadas por dissulfeto. A citocina é sintetizada e secretada por células apresentando an-tígeno incluindo células dendríticas, monócitos, macrófagos, células B, células de Langerhans e queratinócitos bem como células assassinas naturais (NK). IL-12 media uma variedade de processos biológicos e foi referido como fator estimulador de célula NK (NKSF), fator estimulador de célula T, fator de maturação de linfócito T e fator de linha de célula B transformada por EBV (Curfs, J.H.A.J., e outros, Clinicai Microbiology Reviews, 10:742-780 (1997)). lnterleucina-12 pode aglutinar a receptor IL-12 expresso na membrana plasmática de células (por exemplo, células T, célula NK), desse modo alterando (por exemplo, iniciando, prevenindo) processos biológicos. Por exemplo, a aglutinação de IL-12 ao receptor IL-12 pode estimular a proliferação de células T e células NK pré-ativadas, acentuar atividade citolítica de células T citotóxicas (CTL), células NK e células LAK (assassinas ativadas por linfocina), induzir produção de gama interferon (IFN GAMA) por cé- lulas T e células NK e induzir diferenciação de células ThO singelas em células Th1 que produzem IFN GAMA e IL-2 (Trinchieri, G., Annual Review of Immunology, 13:251-276 (1995)). Em particular, IL-12 é vital para a geração de células citolíticas (por exemplo, NK, CTL) e para montar uma resposta imunológica celular (por exemplo, uma resposta imunológica mediada por célula Th1). Assim, IL-12 é criticamente importante na geração e regulamento de ambas imunidade protetora (por exemplo, erradicação de infecções) e respostas imunológicas patológicas (por exemplo, auto-imunidade) (Hendrzak, J. A. e Brunda, M.J., Laboratory Investigation, 72:619-637 (1995)). Conformemente, uma resposta imunológica (por exemplo, protetora ou patogênica) pode ser acentuada, suprimida ou prevenida por manipulação da atividade biológica de IL-12 \n vivo, por exemplo, por meio de um anticorpo.

Anticorpos de mamífero não-humano, quiméricos, policlonais (por exemplo, antisoros) e/ou monoclonais (Mabs) e fragmentos (por exemplo, produtos de digestão proteolítica ou produtos de proteína de fusão do mesmo) são agentes terapêuticos potenciais que estão sendo investigados em alguns casos para tentar tratar certas doenças. Entretanto, tais anticorpos ou fragmentos podem extrair uma resposta imunológica quando administrados a seres humanos. Tal resposta imunológica pode resultar em uma liberação mediada por complexo imunológico dos anticorpos ou fragmentos da circulação, e fazer administração repetida inadequada para terapia, desse modo reduzindo o benefício terapêutico ao paciente e limitando a readminis-tração do anticorpo ou fragmento. Por exemplo, administração repetida de anticorpos ou fragmentos compreendendo porções não-humanas pode levar à enfermidade e/ou anafalaxia do soro. A fim de evitar estes e outros problemas, várias aproximações foram tomadas para reduzir a imunogenicidade de tais anticorpos e porções dos mesmos, incluindo quimerização e humani-zação, como bem-conhecido na técnica. Estas e outras aproximações, entretanto, ainda podem resultar em anticorpos ou fragmentos tendo alguma imunogenicidade, baixa afinidade, baixa avidez, ou com problemas em cultura de célula, aumento de escala, produção e/ou baixos rendimentos. Assim, tais anticorpos ou fragmentos podem ser menos do que idealmente adequados para produção ou uso como proteínas terapêuticas.

Conformemente existe uma necessidade para fornecer anticorpos anti-IL-12 ou fragmentos que superam um ou mais destes problemas, bem como melhorias sobre anticorpos conhecidos ou fragmentos dos mesmos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece anticorpos anti-IL-12 humanos, de primata, de roedores, de mamíferos, quiméricos, humanizados e/ou enxerta-dos por CDR isolados, imunoglobulinas, produtos de divisão e outras porções especificadas e variantes disso, bem como composições de anticorpo anti-IL-12, ácidos nucléicos codificadores ou complementares, vetores, células hospedeiras, composições, formulações, dispositivos, animais transgê-nicos, e métodos de produção e uso disso, como descritos e habilitados aqui, em combinação com o que é conhecido na técnica. A presente invenção também fornece pelo menos um anticorpo anti-IL-12 isolado como descrito aqui. Um anticorpo de acordo com a presente invenção inclui qualquer proteína ou peptídeo contendo molécula que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina, tal como mais não-limítado a pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma porção agluti-nante de ligante da mesma, uma região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região de estrutura, ou qualquer porção disso, que pode ser incorporada em um anticorpo da presente invenção. Um anticorpo da invenção pode incluir ou ser derivado de qualquer mamífero, tal como mas não-limitado a um ser humano, um camundongo, um coelho, um rato, um roedor, um primata, ou qualquer combinação disso, e outros mais.

TRECHO FALTANDO NO MOMENTO DA PUBLICAÇÃO DO PED. PCT A presente invenção fornece, em um aspecto, moléculas de ácido nucléico isoladas compreendendo pelo menos uma sequência especificada, domínio, porção ou variante disso. A presente invenção além disso fornece vetores recombinantes compreendendo ditas moléculas de ácido nucléico codificadoras de anticorpo antiidioiipo IL-12, células hospedeiras contendo tais ácidos nucléicos e/ou vetores recombinantes, bem como métodos de produzir e/ou usar tais ácidos nucléicos, vetores e/ou células hospedeiras de anticorpo de antiidiotipo. A presente invenção também fornece pelo menos um método para expressar pelo menos um anticorpo anti-IL-12, ou anticorpo antiidiotipo de anti-IL-12, em uma célula hospedeira, compreendendo cultivando uma célula hospedeiras como descrito aqui sob condições onde pelo menos um anticorpo anti-IL-12 é expresso em quantidades detectáveis e/ou recuperáveis. A presente invenção também fornece pelo menos uma composição compreendendo (a) um ácido nucléico codificando anticorpo anti-IL-12 isolado e/ou anticorpo como descrito aqui; e (b) um veículo ou diluente adequado. O veículo ou diluente pode opcionalmente ser farmaceuticamente aceitável, de acordo com veículos ou diluentes conhecidos. A composição pode opcionalmente além disso compreende pelo menos um composto, proteína ou composição adicional. A presente invenção além disso fornece pelo menos um método ou composição de anticorpo anti-IL-12, para administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz para modular ou tratar pelo menos uma condição relacionada a IL-12 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente e/ou, antes de, subsequente a, ou durante uma condição relacionada, como descrito aqui. A presente invenção também fornece pelo menos uma composição, dispositivo e/ou método de distribuição de uma quantidade terapeuticamente ou profilativamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-IL-12, de acordo com a presente invenção. A presente invenção além disso fornece pelo menos um método ou composição de anticorpo anti-IL-12, para diagnosticar pelo menos uma condição relacionada a IL-12 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente e/ou, antes de, subseqüente a, ou durante uma condição relacionada, como descrito aqui. A presente invenção também fornece pelo menos uma composição, dispositivo e/ou método de distribuição para diagnosticar pelo menos um anticorpo anti-IL-12, de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figuras 1A e 1B são gráficos mostrando aglutinação dependente de concentração de mAbs anti-IL-12 humanos a IL-12 humano. Anticorpos anti-IL-12 foram seriamente diluídos em BSA/PBS 1% e incubados em placas revestidas rhlL-12 por 1 hora a 37°C. Placas foram lavadas duas vezes com Tween 20 0,02% (monolaurato de polioxietileno sorbitano (20)), solução salina 0,15 M e então sondados com anticorpo específico a IgG capa anti-humano de cabra rotulado por peroxidase de rábano silvestre (HRP) por 1 hora à temperatura ambiente. Placas foram novamente lavadas, desenvolvidas com substrato de o-fenilenodiamina (OPD) e a densidade ótica (OD) de cada cavidade como medido em 490 nm.

Figura 2: Caminhos da esquerda para direita em Figuras A e B contém IL-12 humano, IL-12 p40 humano, IL-12 de murino, e marcadores de peso molecular pré-manchado. Figura 2A mostra faixas manchadas de proteína total, As faixas primárias, em cada caminho são IL-12 humano (75 kd), IL-12 humano p40 (40 kd), e IL-12 de murino (75 kd). Figura 2B mostra um Western blot preparada de um gel idêntico aqueles mostrado em Figura 2A. Mancha foi reagida com C340 seguido por IgG anti-humano de cabra rotulado por HRP e especificamente detectado por IL-12 (monômero ou multíme-ros) e IL-12 p40 humano somente. Uma mancha de controle (não-mostrada) reagida com IgG anti-humano de cabra rotulado por HRP não exibiu quaisquer faixas.

Figura 3: Análise de transcrição reversão-PCR de expressão de gene IFNy em PBL humano tratado com IL-2, IL-12, IL-2+IL-12 com e sem anticorpo anti-IL-12, C340, 8.6.2, anticorpo de controle de isótipo. RNA total foi transcrito em reverso, ampnaao por PCR usando iniciadores específicos a gene. O nível de mRNA de β-actina em cada amostra foi também determi-. nado o qual serviu como um controle para integridade e conteúdo de mRNA.

Figura 4 é um histograma mostrando que mAb anti-IL-12 humano (C340) inibe produção de interferon-γ (IFNy) por células mononucleares de sangue periféricas CD3+ esgotada de monócito (PBMC) estimuladas com IL-2 mais IL-12, PBMC foram cultivados por cinco horas em meios de controle (nenhuma cítocina adicionada), meios suplementados com IL-12 (0,1 ng/ml) mais IL-2 (50 lU/ml) (IL-2/IL-2), meios de controle contendo mAb C340 (10 pg/ml) e meios IL-12/IL-2 contendo mAb C340 (10 pg/ml). IFNy intracelular foi medido por imunomanchamento de duas cores com CD3-PE e IFNy-FITC. Dados são mostrados para um doador.

Figura 5 é um gráfico mostrando inibição dependente de dose de secreção IFNy por línfócitos do sangue periféricos estimulados por IL-2 mais IL-12 com dois lotes diferentes de um mAb anti-IL-12 humano (C340). PBL humano (8 x 106/ml) foram cultivados por 24 horas com 10 U/ml IL-2, IL-2 mais 400 pg/ml IL-12, ou IL-2 mais IL-12 e mAb C340 como indicado. Os sobrenadantes da cultura foram removidos e analisados por IFNy por EIA.

Figura 6 é um histograma mostrando inibição dependente da dose de citotoxicidade de célula LAK induzida por IL-2 mais IL-12 por um mAb anti-IL-12 humano (C340). Células efetuadoras LAK (PBL humano, 8 x 106/ml) foram cultivadas por 24 horas com IL-12 (400 pg/ml) mais IL-2 (10 U/ml) e mAb C340 (5000 ng/ml ou 50 ng/ml) como indicado). As células efetuadoras LAK foram lavadas e cultivadas com células alvo Raji rotuladas por 51 Cr por quatro horas em um efetuador para alvejar razão (E:T) de 80:1, e a quantidade de 51 Cr liberada nos meios em quebra de células Raji foi medida. Resultados são expressos como a média de erro padrão dos três doadores normais. Controle positivo de IL-12 (IL-12) é células efetuadoras incubadas com IL-12 e sem anticorpo. Histórico (BKGD) é células efetuadoras incubadas sem IL-12 ou anticorpo.

Figuras 7A e 7B são histogramas mostrando que expressão induzida por IL-2 mais IL-2 de CD95 em células mononucleares sanguíneas periféricas de CD3+ é inibida por mAb anti-IL-12 humano (C340). PBMC foram cultivados por 72 horas em meios contendo 0,1 ng/ml de IL-12 e uma dose subótima de IL-2 (50 lU/ml) na presença ou ausência de mAb C340 (10 pg/ml). Expressão de CD95 foi medida a citometria de fluxo de células manchadas com anti-CD95-FITC. Barreira foi executada usando análise de duas cores (CD3 ou CD 56-PE contra CD95-FITC) e dispersão de luz dianteira contra ortogonal.

Figura 8 é um gráfico mostrando que anticorpos IL-12 anti-humano humano recombinante (rC340) aglutinam a IL-12 imobilizado em um modo que é indistinguível de mAb C340 purificado. A concentração de rC340 nos sobrenadantes de três linhas de células recombinantes produtoras de rC340 foi determinada, e os sobrenadantes foram avaliados por aglutinação de IL-12 em um ELISA. Placas foram revestidas com 2 pg/ml de IL-12 humano e incubado com mAb C340 purificado do hibridoma original (padrão) ou os sobrenadantes de linhas de células recombinantes. Anticorpo ligado a IL-12 foi detectado usando IgG anti-humano de cabra conjugado com fosfa-tase alcalina (cadeia pesada + cadeia leve).

Figuras 9A-9C são gráficos mostrando cinéticas crescentes e a quantidade de anticorpo secretado por três subclones de células recombinantes produtores de r340 independentemente derivados (Figura 9A, subclone C379B; Figura 9B, subclone C318A; Figura 9C, subclone C389A). Células recombinantes foram semeadas em frascos T75 em uma densidade inicial de 2 x 105 células/ml em meios padrão. Em vários momentos, células foram ressuspensas e o número de células do fígado e a quantidade (pg/ml) de rC340 no meio foram determinados, DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece anticorpos anti-IL-12 isolados, recombinantes e/ou sintéticos humanos, de primata, de roedor, de mamífero, quimérico, humanizado ou enxertado por CDR e anticorpos de antíídiotipo IL-12 a isso, bem como composições e moléculas de ácido nucléico codíficado-ras compreendendo pelo menos um poíinucleotídeo codificando pelo menos um anticorpo anti-IL-12 ou anticorpo antíídiotipo. A presente invenção além disso incluí, mas não é limitada a, métodos de produzir e usar tais ácidos nucléícos e anticorpos e anticorpos de antiidiotipos, incluindo composições, métodos e dispositivos diagnósticos e terapêuticos.

Como usado aqui, um "anticorpo de anti-interleücina-12", "anticorpo anti-IL12", "porção de anticorpo anti-IL-12" ou "fragmento de anticorpo anti-IL-12" e/ou "variante de anticorpo anti-IL-12" e outros mais incluem qualquer proteína ou peptídeo contendo molécula que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina, tal como mas não-limitado a pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou uma porção aglutinação de ligante disso, uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região de estrutura, ou qualquer porção disso, ou pelo menos uma porção de uma proteína receptora ou aglutinante de IL-2, a qual pode ser incorporada a um anticorpo da presente invenção. Tal anticorpo opcionalmente além disso afeta um ligante específico, tal como mas não-limitado a onde tal anticorpo modula, diminui, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloqueia, inibe, abroga e/ou interfere com pelo menos uma atividade ou aglutinação de IL-12, ou com atividade receptora ou aglutinação de IL-12, in vitro, in situ e/ou in vivo. Como um exemplo não-limitante, um anticorpo anti-IL-12, porção especificada ou variante da presente invenção pode aglutinar pelo menos IL-12, ou porções especificadas, variantes ou domínios disso. Um anticorpo anti-IL-12 adequado, porção especificada, ou variante pode também opcionalmente afetar pelo menos um de atividade ou função de IL-12, tal como mas não-limitado a, RNA, DNA ou síntese de proteína, liberação de IL-12, sinalização de receptor IL-12, divisão de IL-12 de membrana, atividade de IL-12, produção e/ou síntese de IL-12. O termo "anticorpo" é além disso pretendido a abranger anticorpos, fragmentos de digestão, porções especificadas e variantes disso, incluindo mimétícos de anticorpos ou compreendendo porções de anticorpos que imitam a estrutura e/ou função de um anticorpo ou fragmento especificado ou porção disso, incluindo anticorpos de cadeia simples e fragmentos disso. Fragmentos funcionais incluem fragmentos de aglutinação de antígeno que aglutinam a um IL-12 de mamífero. Por exemplo, fragmentos de anticorpos capazes de aglutinar a IL-12 ou porções disso, incluindo, mas não-limitado a fragmentos de Fab (por exemplo, digestão de papaí- na), Fab’ (por exemplo, por digestão e redução parcial de peptídeo) e F(ab’)2 (por exemplo por digestão de pepsina), facb (por exemplo, por digestão de plasmina), pFc’ (por exemplo, por digestão de pepsina ou plasmina), Fd (por exemplo, por digestão, redução parcial ou reagregação de pepsina), Fv ou scFv (por exemplo, por técnicas de biologia molecular), são abrangidos pela invenção (veja, por exemplo, Colligan, Immunology, supra).

Tais fragmentos podem ser produzidos por técnicas de divisão enzimáticas, sintéticas ou recombinantes, como conhecido na técnica e/ou como descritas aqui, anticorpos podem também ser produzidos em uma variedade de formas truncadas usando genes de anticorpos nos quais um ou mais códons de parada foram introduzidos a jusante do sítio de parada natural. Por exemplo, um gene de combinação codificando uma porção de cadeia pesada F(ab’)2 pode ser designada a incluir sequências de DNA codificando o domínio CHi e/ou região de articulação da cadeia pesada. As várias porções de anticorpos podem ser unidas juntas quimicamente por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua usando técnicas de engenharia genética.

Como usado aqui, o termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo no qual substancialmente cada parte da proteína (por exemplo, CDR, estrutura, Cl, domínios Ch (por exemplo, Ch1, Ch2, Ch3), articulação (Vl, Vh)) é substancialmente não-imunogênicos em seres humanos, com somente mudanças ou variações menores em seqüência. Similarmente, anticorpos designados de primata (macaco, babuíno, chimpanzé, etc), roedores (camundongo, rato, coelho, porquinho-da-lndia, hamster, e outros mais) e outros mamíferos designam tais anticorpos específicos a espécies, subgê-neros, gêneros, subfamília, família. Além disso, anticorpos quiméricos incluem qualquer combinação do acima. Tais mudanças ou variações opcionalmente e preferivelmente retém ou reduzem a imunogenicidade em seres humanos ou outras espécies relativas a anticorpos não-modificados. Assim, um anticorpo humano está distinto de um anticorpo quimérico ou humanizado. É mostrado que um anticorpo humano pode ser produzido por uma célula de animal não-humano ou procariótica ou eucariótica que é capaz de expressar genes de imunoglobulina humana funcionalmente rearranjada (por exemplo, cadeia pesada e/ou cadeia leve). Além disso, quando um anticorpo humano é um anticorpo de cadeia simples, ele pode compreender um peptí-deo ligante que não é encontrado em anticorpos humanos nativos. Por exemplo, um Fv por compreender um peptídeo ligante, tal como dois a cerca de oito glicinas ou outros resíduos de aminoácidos, os quais conectam-se a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve. Tais peptídeos ligantes são considerados a serem de origem humana.

Anticorpos biespecíficos, heteroespecíficos, heteroconjugados ou similares podem também ser usados onde são monoclonais, preferivelmente seres humanos ou humanizados, anticorpos que têm especificidades de aglutinação por pelo menos dois antígenos diferentes. No presente caso, uma das especificidades de aglutinação é por pelo menos uma proteína IL-12, o outro é por qualquer antígeno. Métodos de produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombi-nante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)). Devido ao agrupamento aleatório de cadeia pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 molecuias ae anticorpos diferentes, dos quais somente um tem a estrutura bíespecífica correta. A purificação da molécula correta, a qual é geralmente feita por etapas de cromatografia de afinidade, é preferivelmente incômodo, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos, por exemplo, em WO 93/08829, Patente US NQs, 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker e outros, EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh e outros, Methods in Enzymology 121:210 (1986), cada um inteiramente incorporado aqui por referência).

Anticorpos anti-IL-12 (também denominados anticorpos IL-12) úteis nos métodos e composições da presente invenção podem opcionalmente ser caracterizados por aglutinação de alta afinidade a IL-12 e opcionalmente e preferivelmente tendo baixa toxicidade. Em particular, um anticorpo, fragmento específico ou variante da invenção, onde os componentes > individuais, tais como região variável, região constante e estrutura, individualmente e/ou coletivamente, opcionalmente e preferivelmente possuem baixa imunogenicidade, é útil na presente invenção. Os anticorpos que podem ser usados na invenção são opcionalmente caracterizados por sua capacidade para tratar pacientes por períodos extensos com alívio mensurável de i sintomas e toxicidade baixa e/ou aceitável Imunogenicidade baixa ou aceitável e/ou alta afinidade, bem como outras propriedades, podem contribuir para os resultados terapêuticos alcançados. "Baixa Imunogenicidade baixa" é definida aqui como aumentando respostas de HAHA, HACA ou HAMA si-gnificantes em menos do que aproximadamente 75%, ou preferivelmente menos do que aproximadamente 50% dos pacientes relacionados e/ou aumentando títulos baixos no paciente tratado (menos do que aproximadamente 300, preferivelmente menos do que aproximadamente 100 medido com o imunoensaio de enzima de antígeno duplo) (veja, por exemplo, Elliott e outros, Lancet 344:1125-1127 (1994), inteiramente incorporada aqui por referência).

Utilidade Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser usados para produção de pelo menos um anticorpo anti-IL-12 ou variante especificada disso os quais podem ser usados para medir ou efetuar em uma célula, tecido, órgão ou animal (incluindo mamíferos e seres humanos), para diagnosticar, monitorar, modular, tratar, aliviar, ajudar, prevenir a incidência de, ou reduzir os sintomas de, pelo menos uma condição de IL-12, selecionada de, mas não-limitada a, pelo menos um de um distúrbio ou doença imunológica, um distúrbio ou doença cardiovascular, uma infecção, malignidade, e/ou distúrbio ou doença neurológico, ou outra condição relacionada a IL-12 conhecida ou especificada.

Tal método pode compreender administrando uma quantidade eficaz de uma composição ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti-IL-12 a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento, alívio, prevenção, ou redução em sintomas, efeitos ou mecanismos. A quantidade eficaz pode compreender a quantidade de aproximadamente 0,001 a 500 mg/kg por administração simples (por exemplo, bólus), múltipla ou contínua, ou para alcançar uma concentração de soro de 0,01-5000 pg/ml de concentração de soro por administração simples, múltipla ou contínua, ou qualquer limite ou valor eficaz a isso, como feito e determinado usando métodos conhecidos, como descrito aqui ou conhecido nas técnicas relevantes.

Citações Todas as publicações ou patentes citadas aqui são inteiramente incorporadas aqui por referência como eles mostram o estado da técnica na hora da presente invenção e/ou fornecem descrição e permissão da presente invenção. Publicações referem-se a quaisquer publicações científicas ou patentes, ou qualquer outra informação disponível em qualquer formato de meio, incluindo todos os formatos registrados, eletrônicos ou impressos. As referências seguintes são inteiramente incorporadas aqui por referência: Ausubel, e outros, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow e Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Co-lligan, e outros, eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan e outros, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Anticorpos da Presente Invenção Pelo menos um anticorpo anti-IL-12 da presente invenção pode ser opcionalmente produzido por uma linha de célula, uma linha de célula mista, uma célula imortalizada ou população clonal de células imortalizadas, como bem-conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Ausubel e outros, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow e Lane, antibodies, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan e outros, eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc,. NY (1994-2001); Colligan e outros, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons. NY. NY, (1997-2001), cada uma inteiramente incorporada aqui por referência.

Anticorpos humanos que são específicos para proteínas IL-12 humanas ou fragmentos disso podem ser elevados contra um antígeno imunogênico apropriado, tal como proteína isolada e/ou IL-12 ou uma porção disso (incluindo moléculas sintéticas, tais como peptídeos sintéticos). Outros anticorpos de mamíferos específicos ou gerais podem ser similarmente elevados. Preparação de antígenos imunogênicos, e produção de anticorpo monoclona! podem ser executadas usando qualquer técnica adequada.

Em uma aproximação, um hibridoma é produzindo fundindo uma linha de célula imortal adequada (por exemplo, uma linha de célula de mie-loma tal como, mas não-limitado a, Sp2/0, Sp2/0-AG 14, NSO, NS1, NS2. AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60. MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, ou outros mais, ou hete-romilomas, produtos de fusão disso, ou qualquer células ou células de fusão derivada disso, ou qualquer outra linha de célula adequada como conhecido na técnica. Veja, por exemplo, www.atcc.org,www.lifetech.com, e outros mais, com células produtoras de anticorpo, tais como, mas não-limitado a, células do baço isoladas ou clonadas, periféricas do sangue, linfa, amígdala, ou outra imunológica ou contendo célula B, ou quaisquer outras células expressando seqüências constantes ou variáveis ou de estrutura ou CDR de cadeia pesada ou cadeia leve, quer como ácido nucléico endógeno ou hete-rólogo, como recombinante ou endógeno, viral, bacterial, algal, procariótica, anfíbio, de inseto, de réptil, de peixe, de mamífero, de roedor, equino, ovino, de cabra, ovelha, de primata, eucariótico, de DNA genômico, cDNA, rDNA, DNA ou RNA mitocondiral, DNA ou RNA cloroplasto, hnRNA, mRNA, tRNA, filamentado simples, duplo ou triplo, hibridizado, e outros mais ou qualquer combinação disso. Veja, por exemplo, Ausubel, supra, e Coiligan, Immuno-logy, supra, capítulo 2, inteiramente incorporada aqui por referência. Células produtoras de anticorpo podem também ser obtidas do sangue periférico, preferivelmente os nódulos do baço ou línfa, de seres humanos ou outros animais adequados que foram imunizados com o antígeno de interesse. Qualquer outra célula hospedeira adequada pode também ser usada expressando ácido nucléico heterólogo ou endógeno codificando um anticorpo, dito fragmento ou variante disso, da presente invenção. As céluias fundidas (hibridomas) ou células recombinantes podem ser isoladas usando condições de cultura seletivas ou outros métodos conhecidos adequados, e clonadas limitando diluição ou espécie de célula, ou outros métodos conhecidos. Células as quais produzem anticorpos com a especificidade desejada podem ser selecionadas por um ensaio adequado (por exemplo, ELISA).

Outros métodos adequados de produzir ou isolar anticorpos da especificidade requerida podem ser usados, incluindo, mas não-limitado a, métodos que selecionam anticorpos recombinantes de uma biblioteca de peptídeo ou proteína (por exemplo, mas não-limitado a, um bacteriófago, ribossoma, oligonucleotídeo, RNA, cDNA, ou outros mais, biblioteca de exibição; por exemplo, como disponível de Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire. RU; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aber-deen, Escócia, RE: Biolnvent. Lund, Suécia; Dyax Corp., Enzon, Affymax/ Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys, Veja, por exemplo, EP 368.684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260(5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO90/14443; WO90/14424; W090/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); WO95/16027 (Biolnvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); US 4.704.692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); ou peptídeos ou proteínas gerados histoquimicamente - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, agora Evolução Molecular Aplicada (AME) cada uma inteiramente incorporada aqui por referência) ou que conta com imunização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos SCID, Nguyen e outros, Microbiol. Immunol. 41:901907 (1997); Sandhu e outros, Crit, Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren e outros, Immunol. 93: 154-161 (1998), cada uma inteiramente incorporada aqui por referência bem como patentes e pedidos relacionados) que são capazes de produzir repertório de anticorpos humanos, como conhecidos na técnica e/ou como descritos aqui. Tais técnicas, incluem, mas não são limitadas a, exibição de ribossoma (Hanes e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94;4937-4942 (Maio de 1997); Hanes e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:14130-14135 (Novembro de 1998)); tecnologias de produção de anticorpo de células simples (por exemplo, método de anticorpo de linfócito selecionado ("SLAM") (Patente US N- 5.627.052, Wen e outros, J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:78437848 (1996)); microgota de gel e citometria de fluxo (Powell e outros, Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray e outros, J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny e outros, Bio/Technol. 13:787-790 (1995)); seleção de célula B (Steenbakkers e outros, Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak e outros, Progress Biotech., Vol, 5, In vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck. ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Holanda (1988)). Métodos para projetar ou humanizar anticorpos não-humanos ou humanos podem também ser usados e são bem-conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado ou projetado tem um ou mais resíduos de aminoácidos de uma fonte a qual é não-humana, por exemplo, mas não-limitada a camundongo, rato, coelho, primata não-humano ou outro mamífero. Estes resíduos de aminoácidos humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importação", os quais são tipicamente tomados a partir de uma variável, constante ou outro domínio de "importação" de uma sequência humana conhecida. Sequências Ig humanas conhecidas são reveladas, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; ww.sciquest.com/; www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/ onlinecomp, html: www.public.iastate.edu/~pedro/research-tools.html; www. mgen .uni-heidelberg.de/SD/IT/IT. html ; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.html; www.library.thinkquest.org/12429/lmmune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html;www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmunology.html. www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/~hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html: www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;www.rn.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/ Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html: www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html;www.isaenet.org/sites_geo.htm!; aximtl .imt.uni-marburg.de/~rek/ AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html: www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.htmi; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/rAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www,biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr_products.htm;www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), cada uma ínteíramente incorporada aqui por referência. Tais se-qüências importadas podem ser usadas para reduzir imunogenicidade ou reduzir, acentuar, ou modificar aglutinação, afinidade, na média, fora da média, avidez, especificidade, meia-vida, ou qualquer outra característica ade- quada, como conhecido na técnica. Geralmente parte ou todas as sequências de CDR humanas ou não-humanas são mantidas enquanto as sequências não-humanas das regiões constantes variáveis são substituídas com aminoácidos humanos ou outros. Anticorpos podem também opcionalmente 5 ser humanizados com retenção de afinidade para o antígeno e outras propriedades favoráveis biológicas. Para alcançar este objetivo, anticorpos humanizados podem ser opcionalmente preparados por um processo de análise das sequências parenterais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências parenterais e humanizadas. ) Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares àqueles versados na técnica. Programas de computadores estão disponíveis os quais ilustram e exibem prováveis estruturas conforma-cionais tridimensionais de sequências de imunoglobulina de candidato selecionado. Inspeção destas exibições permite análise do provável papel dos i resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata par aglutinar seu antígeno. Neste modo, resíduos FR podem ser .selecionados e combinados a partir do consenso e seqüêncías de importação de modo que a característica de anticorpo desejado, tal como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo(s), seja alcançada. Em geral, os resíduos de CDR βει tão diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar aglutinação de antígeno. Humanização ou projeto de anticorpos da presente invenção podem ser executadas usar qualquer método conhecido, tal como mas não-limitado àqueles descritos em, Winter (Jones e outros, Nature 321:522 (1986); Riechmann e outros, Nature 332:323 (1988); Verhoeyen e outros, Science 239:1534 (1988)), Sims e outros, J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia e Lesk. J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta e outros, J. Immunol. 151:2623 (1993), Patente US Ne 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5.766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, W090/14430, EP 229246, cada uma inteiramente incorporada aqui por referência, incluídas referências citadas a isso. O anticorpo anti-IL-12 pode também ser opcionalmente gerado por imunização de um animal transgênico (por exemplo, camundongo, rato, hamster, primata não-humano, e outros mais) capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, como descritos aqui e/ou como conhecidos na técnica. Células que produzem um anticorpo anti-IL-12 humano pode ser isolado de tais animais e imortalizadas usando métodos adequados, tais como os métodos descritos aqui.

Camundongos transgênicos que podem produzir um repertório de anticorpos humanos que aglutinam a antígenos humanos podem ser produzidos por métodos conhecidos (por exemplo, mas não-limitado a, Patente US N2s 5.770.428, 5.569.825, 5.545.806, 5.625.126, 5.625.825, 5.633.425, 5.661.016 e 5.789.650 publicado a Lonberg e outros; Jakobovits e outros WO 98/50433, Jakobovits e outros WO 98/24893, Lonberg e outros WO 98/24884, Lonberg e outros WO 97/13852, Lonberg e outros WO 94/25585, Kucherlapate e outros WO 96/34096, Kucherlapate e outros EP 0463 151 B1, Kucherlapate e outros EP 0710719 A1, Surani e outros Patente US Ns 5.545.807, Bruggemann e outros WO 90/04036, Bruggemann e outros EP 0438474 B1, Lonberg e outros EP 0814259 A2, Lonberg e outros GB 2272440 A, Lonberg e outros Nature 368:856-859 (1994), Taylor e outros, Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green e outros, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez e outros, Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor e outros, Nuc/eic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon e outros, Proc Natl Acad Sei USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg e outros, Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) e Fishwald e outros, Nat Biotechnol 14(7):845-851 (1996), os quais são cada um inteiramente incorporados aqui por referência). Geralmente, estes camundongos compreendem pelo menos um transgene compreendendo DNA a partir de pelo menos uma localização de imunoglobulina humana que é funcionalmente disposta, ou os quais podem suportar disposição funcional. As localizações de imunoglobulina endógenas em tais camundongos podem ser rompidas ou anuladas para eliminar a ca- pacidade do animal para produzir anticorpos codificados por genes endóge-nos.

Peneiramento de anticorpos para aglutinação específica para proteínas similares ou fragmentos podem ser convenientemente alcançados usando bibliotecas de exibição de peptídeo. Este método envolve o peneiramento de coleções grandes de peptídeos para membros individuais tendo a função ou estrutura desejada, peneiramento de anticorpo de bibliotecas de exibição de peptídeo é bem-conhecido na técnica. As seqüências de peptídeo exibidas podem ser de 3 a 5000 ou mais aminoácidos em comprimento, freqüentemente de 5-100 aminoácidos em comprimento, e freqüentemente de aproximadamente 8 a 25 aminoácidos em comprimento, Além de métodos sintéticos químicos diretos para projetar bibliotecas de peptídeos, diversos métodos de DNA recombinantes foram descritos. Um tipo envolve a exibição de uma seqüência de peptídeo na superfície de um bacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de peptídeo particular. Tais métodos são descritos em Publicação de Patente US N9 91/17271, 91/18980, 91/19818, e 93/08278. Outros sistemas para gerar bibliotecas de peptídeos têm aspectos de ambos em síntese química in vitro e métodos recombinantes. Veja, Patente N9 PCT 92/05258, 92/14843, e 96/19256. Veja também, Patente U.S. N9 5.658.754; e 5.643.768. Bibliotecas de exibição de peptídeos, vetor, e kits de peneiramento estão comercialmente disponíveis de tais fornecedores como Invitro-gen (Carlsbad, CA), e Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, RU). Veja, por exemplo Patente US N9s 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, designada a Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, designada a Dyax, 5427908, 5580717, designada a Affymax; 5885793, designada a Cambridge antibody Technologies; 5750373, designada a Genentech. 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, designada a Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; ou Sambrook, supra, cada uma das patentes e publicações acima inteiramente incorporadas aqui por referência.

Anticorpos da presente invenção podem também ser preparados usando pelo menos um ácido nucléico codificador de anticorpo anti-IL-12 para fornecer animais ou mamíferos trangênicos, tais como cabras, vacas, cavalos, ovelhas, e outros mais, que produzem tais anticorpos em seu leite. Tais animais podem ser fornecidos usando métodos conhecidos. Veja, por exemplo, mas não-limitado a, Patente US N-s 5.827.690; 5.849.992; 4,873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; 5.304.489, e outros mais, cada uma das quais é inteiramente incorporada aqui por referência.

Anticorpos da presente invenção podem adicionalmente ser preparados usando pelo menos um ácido nucléico codificador de anticorpo anti-IL-12 para fornecer plantas transgênicas e células de planta cultivadas (por exemplo, mas não-limitado a tabaco e milho) que produzem tais anticorpos, porções especificadas ou variantes nas partes da planta ou em células cultivadas disso. Como um exemplo não-limitante, folhas de tabaco transgênicas expressando proteínas recombinantes foram usadas com sucesso para fornecer quantidades grandes de proteínas recombinantes, por exemplo, usando um promotor induzível. Veja, por exemplo, Cramer e outros, Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) e referências citadas a isso. Também, milho transgênico foi usado para expressar proteínas de mamíferos em níveis de produção comerciais, com atividades biológicas equivalentes àquelas produzidas em outros sistemas recombinantes ou purificados a partir de fontes naturais. Veja, por exemplo, Hood e outros, Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) e referências citadas a isso. Anticorpos foram também produzidos em grandes quantidades de sementes de plantas transgênicas incluindo fragmentos de anticorpos, tais como anticorpos de cadeia simples (scFv's), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. Veja, por exemplo, Conrad e outros, Plant Mol. Biol. 38: 101-109 (1998) e referência citada a isso. Assim, anticorpos da presente invenção podem ser produzidos usando plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos. Veja, por exemplo, Fischer e outros, Biotechnol, Appl. Biochem. 30:99-108 (Outubro de 1999), Ma e outros, Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma e outros, Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelam e outros, Biochem. Soc, Trans. 22:940-944 (1994); e referências citadas a isso. Veja, também geralmente para expressão de planta de anticorpos, mas não-limitado a, cada uma das referências acima é inteiramente incorporada aqui por referência.

Os anticorpos da invenção podem aglutinar a IL-12 humano com um amplo limite de afinidades (Kp). Em uma concretização preferida, pelo menos um mAb humano da presente invenção pode opcionalmente aglutinar IL-12 humano com alta afinidade. Por exemplo, um mAb humano pode aglutinar IL-12 humano com um Kp igual a ou menos do que aproximadamente 10'7M, tal como mas não-limitado a, 0,1-9,9 (ou qualquer limite ou valor disso) X10'7,10'3,10'9,10'10,10'11,10‘12,10'13ou qualquer limite ou valor disso. A afinidade ou avidez de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente usando qualquer método adequado. (Veja, por exemplo, Berzofsky, e outros, "Antibody-Antigen Interactions", Em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); e métodos descritos aqui). A afinidade medida de uma interação de antígeno-anticorpo particular pode variar se medido sob condições diferentes (por exemplo, concentração de sal, pH). Assim, medições de afinidade e outros parâmetros aglutinantes de antígeno (por exemplo, KD, Ka, Kd) são preferivelmente feitos com soluções padronizadas de anticorpo e antígeno, e um tampão padronizado, tal como o tampão descrito aqui.

Moléculas de Ácido Nucléico Usando a informação fornecida aqui, tais seqüências de nucleo-tídeos codificando pelo menos 70-100% dos aminoácidos contíguos de pelo menos um de SEQ ID NQs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, fragmentos especificados, variantes ou seqüências de consenso disso, ou um vetor depositado compreendendo pelo menos uma destas seqüências, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção codificando pelo menos um anticorpo antí-IL-12 pode ser obtido usando métodos descritos aqui ou como conhecidos na técnica.

Moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem estar na forma de RNA, tal como mRNA, hnRNA, tRNA ou outra forma, na forma de DNA, incluindo, mas não-limitado a, cDNA e DNA genômico obtido cio- nando ou produzido sinteticamente, ou quaisquer combinações disso, O DNA pode ser de filamento triplo, filamento duplo ou filamento simples, ou qualquer combinação disso. Qualquer proporção de pelo menos um filamento do DNA ou RNA pode ser o filamento de codificação, também conhecido como o filamento de sentido, ele pode ser o filamento de não-codifica-ção, também referido como o filamento de anti-sentido.

Moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucléico compreendendo um quadro de leitura aberto (ORF), opcionalmente com um ou mais íntrons, por exemplo, mas não-limitado a, pelo menos uma porção especificada de pelo menos um CDR, como CDR1, CDR2, e/ou CDR3 de pelo menos uma cadeia pesada (por exemplo SEQ ID Nss:1-3) ou cadeia leve (por exemplo, SEQ ID Nss: 46); moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação para um anticorpo anti-IL-12 ou reqião variável (por exemplo, SEQ ID N%:7,8) e moléculas de ácido nucléico as quais compreendem uma seqüência de nucleotídeo substancialmente diferente daquelas descritas acima mas as quais, devido a degeneração do código genético, ainda codificam pelo menos um anticorpo anti-IL-12 como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica. É claro, o código genético é bem-conhecido na técnica. Assim seria rotina a um versado na técnica gerar tais variantes de ácido nucléico que codificam anticorpos anti-IL-12 específicos da presente invenção. Veja, por exemplo, Ausubel, e outros, supra, e tais variantes de ácido nucléico são incluídos na presente invenção. Exemplos não-limitantes de moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção incluem SEQ ID N5s: 10-15, correspondendo a exemplos não-limitantes de uma codificação de ácido nucléico, respectivamente, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, região variável de HC e região variável de LC.

Em outro aspecto, a invenção fornece moléculas de ácido nucléico isoladas codificando um anticorpo anti-IL-12 tendo uma seqüência de aminoácido como codificada pelo ácido nucléico contido no plasmídeo depositado como nomes de clones designados e N2s de Depósito ATCC, respectivamente, depositado em.

Como indicado aqui, moléculas de ácido nucléico da presente invenção as quais compreendem um ácido nucléico codificando um anticorpo anti-IL-12 podem incluir, mas não são limitadas a, aquelas codificando a seqüência de aminoácido de um fragmento de anticorpo, por si mesmo; a seqüência codificadora para o anticorpo inteiro ou uma porção do mesmo; a seqüência codificadora para um anticorpo, fragmento ou porção, bem como seqüências adicionais, tais como a seqüência codificadora de pelo menos um líder de sinal ou peptídeo de fusão, com ou sem as seqüências codifica-doras adicionais antes mencionadas, tais como pelo menos um íntron, junto com seqüências adicionais, não-codificadoras, incluindo mas não-limitadas a, seqüências 5’ ou 3’ não-codificadoras, tais como as seqüências não traduzidas, transcritas que desempenham um papel em transcrição, processamento de mRNA, incluindo sinais de junção e de poliadenilação (por exemplo- aglutinação de ribossoma e estabilidade de mRNA); uma seqüência codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionais, tais como aqueles que fornecem funcionalidades adicionais. Assim, a seqüência codificando um anticorpo pode ser fundida a uma seqüência marcadora, tal como uma seqüência codificando um peptídeo que facilita purificação do anticorpo fundido compreendendo um fragmento ou porção de anticorpo, Polínucleotídeos os Quais Seletivamente Hibridizam um Polinu-cleotídeo como Descritos Aqui A presente invenção fornece ácidos nucléicos isolados que hibridizam sob condições de hibridização seletivas a um polinucleotideo descrito aqui. Assim, os polínucleotídeos desta concretização podem ser usados para isolar, detectar, e/ou quantificar ácidos nucléicos compreendendo tais polínucleotídeos. Por exemplo, polínucleotídeos da presente invenção podem ser usados para identificar, isolar, ou amplificar clones parciais ou de comprimento completo em uma biblioteca depositada. Em algumas concretizações, os polínucleotídeos são seqüências genômicas ou de cDNA isoladas, ou de outro modo complementares a, um cDNA de uma biblioteca de ácido nucléico humano ou de mamífero.

Preferivelmente, a biblioteca de cDNA compreende pelo menos 80% das sequências de comprimento completo, preferivelmente pelo menos 85% ou 90% das sequências de comprimento completo, e mais preferivelmente pelo menos 95% das seqüéncias de comprimento completo. As bibliotecas de cDNA podem ser normalizadas a aumentar a representação de seqüéncias raras. Condições de hibridização de baixa ou moderada severidade são tipicamente, mas não exclusivamente, empregadas com seqüên-cias tendo uma identidade de seqüência reduzida relativo a seqüéncias complementares. Condições de severidade moderada ou alta podem opcionalmente ser empregadas para sequências de maior identidade. Condições de baixa severidade permitem hibridização seletiva de seqüéncias tendo 70% de identidade de seqüência e podem ser empregadas a identificar se-qüências ortólogas ou parólogas.

Opcionalmente, polinucleotídeos desta invenção codificarão pelo menos uma porção de um anticorpo codificado pelos polinucleotídeos descritos aqui. Os polinucleotídeos desta invenção abrangem seqüéncias de ácido nucléico que podem ser empregadas para hibridização seletiva a um polinucleotídeo codificando um anticorpo da presente invenção. Veja, por exemplo, Ausubel, supra; Coliigan, supra, cada um inteiramente incorporado aqui por referência.

Construção de Ácidos Nucléicos Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser feitos usando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificação, ou combinações do mesmo, como bem-conhecido na técnica.

Os ácidos nucléicos podem convenientemente compreender sequências além de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de multiclonagem compreendendo um ou mais sítios de restrição de endonucleases podem ser inseridos no ácido nucléico para auxiliar em isolamento do polinucleotídeo. Também seqüéncias traduzíveis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo traduzido da presente invenção. Por exemplo, uma seqüência marcadora de hexahistidina fornece um meio conveniente para purificar as proteínas da presente invenção. O ácido nucléico da presente invenção - excluindo a seqüência codificadora - é opcionalmente um vetor, adaptador, ou ligante para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presente invenção.

Sequências adicionais podem ser adicionadas a tais sequências de clonagem e/ou expressão, para otimizar suas funções em clonagem e/ou expressão, para auxiliar em isolamento o polinucleotídeo ou melhorar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. Uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores, e ligantes é bem-conhecído na técnica. (Veja, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra). Métodos Recombinantes para Construir Ácidos Nucléicos As composições de ácido nucléico desta invenção, tais como RNA, cDNA, DNA genômico, ou qualquer combinação disso, podem ser obtidas a partir de fontes biológicas usando qualquer número de metodologias de clonagem conhecidas àqueles versados na técnica. Em algumas concretizações, sondas de oligonucleotídeos que seletivamente hibridizam, sob condições severas, aos polinucleotídeos da presente invenção são usados para identificar a seqüência desejada em biblioteca de cDNA ou DNA genômico. O isolamento de RNA, e construção de bibliotecas de cDNA e genômi-cas, é bem-conhecido àqueles versados na técnica, (veja, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra). Métodos de Peneiramento e Isolamento de Ácidos Nucléicos A biblioteca de cDNA ou genômica pode ser peneirada usando uma sonda baseada na seqüência de um polinucleotídeo da presente invenção, tal como aquelas descritos aqui. Sondas podem ser usadas para hibri-dizar com seqüências de DNA ou cDNA genômicas para isolar genes homólogos nos mesmos organismos ou diferentes. Aqueles versados na técnica apreciarão que vários graus de severidade de hibridização podem ser empregados no ensaio; e ou a hibridização ou o meio de lavagem podem ser severos. Como as condições para hibridização tornam-se mais severas, deve existir um grau maior de complementaridade entre a sonda e o alvo para formação dúplex ocorrer. O grau de severidade pode ser controlado por um ou mais de temperatura, força iônica, pH e a presença de um solvente parcialmente desnaturante tal como formamida. Por exemplo, a severidade de hibridização é convenientemente variada mudando a polaridade da solução reagente através, por exemplo, de manipulação da concentração de formamida dentro do limite de 0% a 50%. O grau de complementaridade (identidade de seqüência) exigido por aglutinação detectável variará de acordo com a severidade do meio de hibridização e/ou meio de lavagem. O grau de complementaridade opcionalmente será 100%, ou 70-100%, ou qualquer limite ou valor a isso, Entretanto, deveria ser compreendido que variações de seqüências menores nas sondas e iniciadores podem ser compensadas reduzindo a severidade da hibridização e/ou meio de lavagem. Métodos de amplificação de RNA ou DNA são bem-conhecidos na técnica e podem ser usados de acordo com a presente invenção sem experimentação indevida, baseado no ensinamento e guia apresentados aqui. Métodos conhecidos de amplificação de DNA ou RNA incluem, mas não são limitados a, reação de cadeia de polimerase (PCR) e processos de amplificação relacionados (veja, por exemplo, Patente U.S. N2s 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, a Mullis. e outros; 4.795.699 e 4.921.794 a Tabor, e outros; 5,142.033 a Innis: 5.122.464 a Wilson, e outros; 5.091.310 a Innis; 5.066.584 a Gyllensten, e outros; 4.889,818 a Gelfand, e outros: 4,994.370 a Silver, e outros; 4.766.067 a Biswas; 4.656.134 a Rin-gold) e amplificação mediada por RNA que usa RNA de anti-sentido à seqüência alvo como um modelo para síntese de DNA de filamento duplo (Patente U.S, Ne 5.130,238 a Malek, e outros, com o nome comercial NASBA), os conteúdos inteiros dos quais referências são incorporadas aqui por referência. (Veja, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra).

Por exemplo, tecnologia da reação de cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar seqüências de polinucleotídeos da presente invenção e genes relacionados diretamente de bibliotecas de DNA ou cDNA, PCR e outros métodos de amplificação ín vitro podem também ser úteis, por exemplo, a seqüências de ácido nucléico de clone que codificam proteínas a serem expressas, para fazer ácidos nucléicos usarem sondas para detectar a presença do mRNA desejado em amostras, para seqüencí- amento de ácido nucléico, ou outros propósitos. Exemplos de técnicas suficientes para direcionar pessoas versadas através de métodos de amplificação in vitro são encontradas em Berger. supra. Sambrook, supra, e Ausubel, supra, bem como Mullis, e outros, Patente U.S. NQ 4.683.202 (1987); e Innis, e outros, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds.. Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Kits comercialmente disponíveis para amplificação PCR genômica são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Adicionalmente, por exemplo, a proteína de gene 32 T4 (Boehrínger Mannheim) pode ser usada para melhorar rendimento de produtos de PCR longos. Métodos Sintéticos para Construir Ácidos Nucléicos Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser preparados por síntese química direta por métodos conhecidos (veja, por exemplo, Ausubel e outros, supra). Síntese química geralmente produz um oligonucleotídeo de filamento simples, os quais podem ser convertidos em DNA de filamento duplo por hibridização com uma seqüência complementar, ou por polimerização com uma DNA polimerase usando o filamento simples como um modelo. Um versado na técnica reconhecerá que enquanto que síntese química de DNA pode ser limitada a seqüências de aproximadamente 100 ou mais bases, sequências maiores podem ser obtidas pela ligação de seqüências mais curtas.

Cassetes de Expressão Recombinantes A presente invenção além disso fornece cassetes de expressão recombinantes compreendendo um ácido nucléico da presente invenção. Uma seqüência de ácido nucléico da presente invenção, por exemplo um cDNA ou uma seqüência genômica codificando um anticorpo da presente invenção, pode ser usada para construir um cassete de expressão recombi-nante que pode ser introduzido em pelo menos uma célula hospedeira desejada. Um cassete de expressão recombinante tipicamente compreenderá um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a seqüências reguladoras de iniciação transcricional que direcionará a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira pretendida. Ambos promotores heterólogos e não-heterólogos (isto é, endógenos) podem ser empregados para direcionar expressão dos ácidos nucléicos da presente invenção.

Em algumas concretizações, ácidos nucléicos isolados que servem como promotores, acentuadores, ou outros elementos podem ser introduzidos na posição apropriada (a jusante, a montante ou em íntron) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeo da presente invenção a fim de regular no máximo ou mínimo expressão de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, promotores endógenos podem ser alterados in vivo ou in vitro por mutação, deleção e/ou substituição.

Vetores e Células Hospedeiras A presente invenção também refere-se a vetores que incluem moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção, células hospedeiras são geneticamente projetadas com os vetores recombinantes, e a produção de pelo menos um anticorpo IL-12 por técnicas recombinantes, como é bem-conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook, e outros, supra; Ausubel, e outros, supra, cada uma inteiramente incorporada aqui por referência.

Os polinucleotídeos podem opcionalmente ser ligados a um vetor contendo um marcador selecionável para propagação em um hospedeiro. Geralmente, um vetor de plasmídeo é introduzido em um precipitado, tal como precipitado de fosfato de cálcio, ou em um complexo com um lipídeo carregado. Sé o vetor é um vírus, ele pode ser empacotado in vitro usando uma linha de célula de empacotamento apropriada e então transformando em células hospedeiras. A inserção de DNA deveria ser operacionalmente ligada a um promotor apropriado. Os constructos de expressão além disso conterão sítios para iniciação de transcrição, término e, na região transcrita, um sítio de aglutinação de ribossoma para tradução. A porção de código dos transcritos maduros expressos pelos constructos preferivelmente incluirão uma tradução iniciando do começo e um códon de término (por exemplo, UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicionado no final do mRnA a ser traduzido, com UAA e UAG preferidos para expressão de célula de mamífero ou euca- riótica.

Vetores de expressão preferivelmente mas opcionalmente incluirão pelo menos um marcador selecionávei. Tais marcadores incluem, por exemplo, mas não-limitados a, metotrexato (MTX), dihidrofolato reductase (DHFR, Patentes US Nes 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5,179.017), ampicilina, neomicina (G418), ácido micofenólico, ou glutamina sintase (GS, Patentes US Nes 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) resistência para cultura de célula eucariótica, e genes de resistência à tetra-ciclina ou ampicilina para cultivo em £ coli e outras bactérias ou procariotas (as patentes acima são inteiramente incorporadas aqui por referência). Meios de cultura e condições apropriadas para as células hospedeiras acima descritas são conhecidos na técnica. Vetores adequados serão prontamente aparentes ao versado na técnica. Introdução de um constructo de vetor em uma célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipí-deo catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos conhecidos. Tais métodos são descritos na técnica, tais como Sambrook, supra, Capítulos 1-4 e 16-18; Ausubel, supra, Capítulos 1,9,13,1516.

Pelo menos um anticorpo da presente invenção pode ser expresso em uma forma modificada tal como proteína de fusão, e pode incluir não somente sinais de secreção, mas também regiões funcionais heterólo-gas adicionais. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, podem ser adicionados ao término N de um anticorpo para melhorar estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante purificação, ou durante manuseio e armazenagem subsequente. Também, porções de peptídeos podem ser adicionadas a um anticorpo da presente invenção para facilitar purificação. Tais regiões podem ser removidas antes da preparação final de um anticorpo ou pelo menos um fragmento disso. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório, tais como Sambrook. supra, Capítulos 17.29-17.42 e 18.1-18.74; Ausubel, supra, Capítulos 16,17 e 18.

Aqueles verados na técnica são cultos nos numerosos sistemas de expressão disponíveis para expressão de um ácido nucléíco codificando uma proteína da presente invenção.

Alternativamente, ácidos nucléicos da presente invenção podem ser expressos em uma célula hospedeira ligando (por manipulação) em uma célula hospedeira que contém DNA endógeno codificando um anticorpo da presente invenção. Tais métodos são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em Patente US N9s. 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746, e 5.733.761, inteiramente incorporados aqui por referência.

Ilustrativo de culturas de célula úteis para a produção de anticorpos, porções especificadas ou variantes disso, são células de mamíferos. Sistemas de células de mamífero frequentemente estarão na forma de mo-nocamadas de células embora suspensões de células de mamíferos ou bir-reatores possam também ser usados. Várias linhas de células hospedeiras adequadas capazes de expressar proteínas glicosiladas intactas foram desenvolvidas na técnica, e incluem as linhas de células COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610) e BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células Cos-7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células 293, células HeLa e outras mais, as quais estão prontamente disponíveis de, por exemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org). Células hospderias preferidas de origem de linfóide tais como células mieloma e linfóides. Células hospedeiras particularmente preferidas são células P3X63Ag8.653 (Número de Acesso ATCC CRL-1580) e células SP2/0-Ag14 (Número de Acesso ATCC CRL-1851). Em uma concretização particularmente preferida, a célula recombinante é uma célula P3X63Ab8.653 ou uma célula SP2/0-Ag14.

Vetores de Expressão para estas células podem incluir uma ou mais das sequências de controle de expressão seguinte, tais como, mas não-límitadas a uma origem de reprodução: um promotor (por exemplo, promotores SV40 tardio ou precoce, o promotor CMV (Patentes US NQs . 5.168.062; 5.385.839), um promotor HSV tk, um promotor pgk (fosfoglicerato quinase), um promotor EF-1 alfa (Patentes US N9 5.266.491), pelo menos um promotor de imunoglobulina humana, um realçador, e/ou sítios de informação de processamento, tais como sítios de aglutinação de ribossomo, sítios de junção de RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, um sítio de adição de TAg poli A grande de SV40), e sequências terminadoras transcri-cíonais. Veja, por exemplo, Ausubel e outros, supra; Sambrook. e outros, supra. Outras células úteis para produção de ácidos nucléicos ou proteínas da presente invenção são conhecidas e/ou disponíveis, por exemplo, proveniente do American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) ou outras fontes comerciais conhecidas.

Quando células hospedeiras eucarióticas são empregadas, poliadenilação ou seqüências terminadoras de transcrição são tipicamente incorporadas no vetor. Um exemplo de uma seqüência terminadora é a se-qüência de poliadenilação do gene de hormônio de crescimento bovino. Seqüências para junção precisa do transcrito podem também ser incluídas. Um exemplo de uma seqüência de junção é o íntron VP1 de SV40 (Sprague, e outros, J. Virol. 45:773-781 (1983)). Adicionalmente, seqüências de genes para controlar reprodução na célula hospedeira podem ser incorporadas no vetor, como conhecido na técnica.

Purificação de um anticorpo Um anticorpo anti-IL-12 pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de céluias recombinantes por métodos bem-conhecidos incluindo, mas não-limitados a, purificação de proteína A, precipitação de sulfato de amônio e etanol, extração de ácido, cromatografia de troca de ânion ou cáti-on, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrófoba, cromatografia por afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Cromatografia Líquida de Alto Desempenho ("HPLC") pode ser empregada para purificação. Veja, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), por exemplo, Capítulos 1, 4, 6, 8,9,10, cada um inteiramente incorporado aqui por referência.

Anticorpos da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos sintéticos químicos, e produtos pro- duzidos por técnicas recombinantes de um hospedeiro eucariótico, por exemplo, células de leveduras, de plantas maiores, de insetos e mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregado, em um procedimento de produção recombinante, o anticorpo da presente invenção pode ser glícosilado ou pode ser não-glicosilado, com o glícosilado preferido. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padrão, tais como Sambrook, supra, Seções 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10,12,13, 16,18 e 20, Col-ligan, Protein Science, supra, Capítulos 12-14, são .inteiramente incorporados aqui por referência.

Anticorpos Anti-IL-12 As concretizações isoladas da presente invenção compreendem um anticorpo codificado por qualquer um dos polinucleotídeos da presente invenção como discutido mais completamente aqui, ou qualquer anticorpo isolado ou preparado. Preferivelmente, o anticorpo humano ou fragmento aglutinante de antígeno aglutina IL-12 humano e, desse modo parcialmente ou substancialmente neutraliza pelo menos uma atividade biológica da proteína. Um anticorpo, ou porção ou variante especificada disso, que parcialmente ou preferivelmente substancialmente neutraliza pelo menos uma atividade biológica de pelo menos uma proteína ou fragmento de IL-12 pode aglutinar a proteína ou fragmento e desse modo inibir atividades mediadas através da aglutinação de IL-12 ao receptor de IL-12 ou através de outros mecanismos dependentes ou mediados por IL-12. Como usado aqui, o termo "neutralizando anticorpo" refere-se a um anticorpo que pode inibir uma atividade dependente de IL-12 por aproximadamente 20-120%, preferivelmente por pelo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 90,91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98, 99,100% ou mais dependendo do ensaio, A capacidade de um anticorpo anti-IL-12 para inibir uma atividade dependente de IL-12 é preferivelmente "taxada por pelo menos um ensaio de proteína IL-12 ou receptor adequado, como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica. Um anticorpo humano da invenção pode ser de qualquer classe (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc,) ou isótipo e pode compreender uma cadeia leve capa ou lambda. Em uma concretização, o anticorpo humano compreende uma cadeia pesada de IgG ou fragmento definido, por exemplo pelo menos um de isótipos, IgG 1, !gG2, lgG3 ou lgG4. Anticorpos deste tipo podem ser preparados empregando um camundongo transgênico ou outro mamífero não-humano transgênico compreendendo pelo menos em transgene de cadeia leve humana (por exemplo, IgG, IgA) e IgM (por exemplo, γ1, 72, γ3, γ4) como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica. Em outra concretização, o anticorpo humano IL-12 anti-humano compreende uma cadeia pesada lgG1 e uma cadeia leve lqG1.

Pelo menos um anticorpo da invenção aglutina a pelo menos um epítopo especificado específico a pelo menos uma proteína IL-12, subunida-de, fragmento, porção ou qualquer combinação disso. A pelo menos um epitopo pode compreender pelo menos uma região de aglutinação de anticorpo que compreende pelo menos uma porção de dita proteína, qual epitopo é preferivelmente compreendido de pelo menos uma porção extracelular, solúvel, hidrófila, externa ou citoplasmática de dita proteína. O pelo menos um epitopo especificado pode compreender qualquer combinação de pelo menos uma seqüência de aminoácido de pelo menos 1-3 aminoácidos à porção especificada inteira de aminoácidos contíguos do SEQID N9: 9.

Geralmente, o anticorpo humano ou fragmento de aglutinação de antígeno da presente invenção compreenderá uma região de aglutinação de antígeno que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3) ou variante de pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região determinante de complementaridade humana (CDR1, CDR2 e CDR3) ou variante de pelo menos uma região variável de cadeia leve. Como um exemplo não-limitante, o anticorpo ou porção ou variante de aglutinação de antígeno pode compreender pelo menos um CDR3 de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácido de RFC ID N9: 3, e/ou CDR3 de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácido de NO. de ID de SEQ: 6. Em uma concretização particular, o anticorpo ou fragmento de aglutinação de antígeno pode ter uma região de aglutinação que compreende pelo menos uma porção de pelo menos um CDR de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e/ou CDR3) tendo a seqüência de aminoácido dos CDRs 1,2 e/ou 3 correspondentes (por exemplo, SEQ ID Nes: 1, 2 e/ou 3). Em outra concretização particular, o anticorpo ou porção ou variante de aglutinação de antígeno pode ter uma região de aglutinação de antígeno que compreenda pelo menos uma porção de pelo menos um CDR de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e/ou CDR3) tendo a sequência de aminoácido dos CDRs 1,2 e/ou 3 correspondentes (por exemplo SEQ ID Nes: 4,5 e/ou 6). Em uma concretização preferida os três CDR de cadeia pesada e os três CDRs de cadeia leve do anticorpo ou fragmento de aglutinação de antígeno têm a seqüência de aminoácido do CDR correspondente de pelo menos um mAb 12B75, C340, ou quaisquer outros como descrito aqui. Tais anticorpos podem ser preparados unindo quimicamente as várias porções (por exemplo, CDR, estrutura) do anticorpo usando técnicas convencionais, preparando e expressando uma (isto é, uma ou mais) molécula de ácido nucléico que codifica o anticorpo usando técnicas convencionais de tecnologia de DNA recombinante ou usando qualquer outro método adequado. O anticorpo anti-IL-12 pode compreender pelo menos um de uma região variável de cadeia pesada ou leve tendo uma seqüência de aminoácido definida. Por exemplo, em uma concretização preferida, o anticorpo anti-IL-12 compreende pelo menos um de pelo menos uma região variável de cadeia pesada, opcionalmente tendo as sequências de aminoácido de SEQ ID N5: 7 e/ou pelo menos uma...região..variável de cadeia leve, opcionalmente tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID Ne: 8, anticorpos que aglutinam a IL12 humano e que compreendem uma região variável de cadeia pesada ou leve definida podem ser preparados usando métodos adequados, tais como exibição de fago (Katsube, Y, e outros, Int J Mol Med, 1(5):863-868 (1998)) ou métodos que empregam animais transgênicos, como conhecidos na técnica e/ou como descritos aqui. Por exemplo, um camundongo transgênico, compreendendo um transgene de cadeia pesada de imunoglobulina humana funcionalmente redisposta e um transgene compreendendo DNA de uma localização de cadeia leve de imunoglobulina humana que pode suportar rearranjo funcional, podem ser imunizados com IL- 12 humano ou um fragmento disso para extrair a produção de anticorpos. Se desejado, as células produtoras de anticorpos podem ser isoladas e hibri-domas ou outras células produtoras de anticorpos imortalizadas podem ser preparadas como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica. Alternativamente, o anticorpo, porção ou variante especificada pode ser expresso usando o ácido nucléico codificador ou porção disso em uma célula hospedeira adequada. A invenção também refere-se a anticorpos, fragmentos de aglutinação de antígeno, cadeias de imunoglobulina e CDRs compreendendo aminoácidos em uma sequência que é substancialmente a mesma como uma sequência de amínoácido descrita aqui. Preferivelmente, tais anticorpos ou fragmentos de aglutinação de antígenos compreendendo tais cadeias ou CDRs podem aglutinar IL-12 humano com alta afinidade (por exemplo, Kd menos do que ou igual a aproximadamente 10'9M). Seqüências de amínoácido que são substancialmente as mesmas como a sequência descrita aqui incluem seqüências compreendendo substituições de aminoácidos conservadoras, bem como deleções e/ou inserções de aminoácidos. Uma substituição de amínoácido conservadora refere-se à reposição de um primeiro ami-noácido por um segundo amínoácido que tem propriedades químicas e/ou físicas (por exemplo, carga, estrutura, polaridade, hidrofobicidade/hidrofili-cidade) que são similares àquelas do primeiro amínoácido. Substituições conservadoras incluem reposição de um amínoácido por outro dentro dos grupos seguintes: lisina (K), arginína (R), e histidina (H); aspartato (D) e glu-tamato (E); asparagina (N), glutamína (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D, e E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), metionina (M), cisteína (C) e glicina (G); F, We Y; C,SeT, Códigos de Aminoácidos Os aminoácidos que compõem anticorpos anti-IL-12 da presente invenção são frequentemente abreviados. As designações de aminoácidos podem ser indicadas designando o aminoácido por seu código de letra simples, seu código de três letras, nome, ou códon(s} de três nucleotídeos como é bem-compreendido na técnica (veja Alberts, B., e outros, Molecular Biology of The Cell, Terceira Ed., Garland Pubiishing, Inc., New York, 1994).

Um anticorpo anti-IL-12 da presente invenção pode incluir uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácidos, ou de mutações naturais ou manipulação humana, como especificado aqui. É claro, várias substituições de aminoácidos que um versado faria dependem de muitos fatores, incluindo aqueles descritos acima. Geralmente falando, várias substituições, inserções ou deleções de aminoácidos para qualquer proteína derivada ed Ig de anti-IL-12 dada, fragmento ou variante não serão mais do que 40,30,20,19,18,17,16,15,14,13,12,11,10, 9,8, 7,6, 5,4,3,2,1, tal como 1-30 ou qualquer limite ou valor a do mesmo, como especificado aqui.

Aminoácidos em um anticorpo anti-IL-12 da presente invenção que são essenciais para função podem ser identificados por métodos conhe- cidos na técnica, tais como mutagênese direcionada a sítio ou mutagênese de exploração de alanina (por exemplo, Ausubel, supra, Capítulos 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). O ultimo procedimento induz mutações de alanina simples em cada resíduo na molécula. As moléculas mutantes resultantes são então testadas para atividade biologia, tal como, mas não-limitado a, pelo menos uma atividade de IL-12. Sítios que são críticos para aglutinação de anticorpo podem também ser identificados por análise estrutural tal como cristalização, ressonância magnética nuclear ou rotulação de fotoafinidade (Smith, e outros, J. Mol. Bíol. 224:899-904 (1992) e de Vos, e outros, Science 255:306-312 (1992)).

Anticorpos anti-IL-12 da presente invenção podem incluir, mas não estão limitados, a, pelo menos uma porção, sequência ou combinação selecionada de 5 a todos os aminoácidos contíguos de pelo menos um de SEQID N9s: 1,2,3,4,5,6.

Anticorpos IL-12 ou porções ou variantes especificadas da presente invenção podem incluir, mas não são limitados a, pelo menos uma porção, sequência ou combinação selecionada de pelo menos 3-5 aminoácidos contíguos de SEQ ID N9: 1; 5-17 aminoácidos contíguos de SEQ ID N9:2; 5-10 aminoácidos contíguos de SEQ ID Ne:3; 5-11 aminoácidos contíguos de SEQ ID N9:4, 5-7 aminoácidos contíguos de SEQ ID N2:5; 5-9 aminoácidos contíguos de SEQ ID N9:6; Leu21, Lys76, Met83, Ser85 de SEQ ID N9:7, Um anticorpo anti-IL-12 pode além disso opcionalmente compreender um polipeptídeo de pelo menos um de 70-100% de 5,17, 10,11, 7, 9, 119, ou 108 aminoácidos contíguos de pelo menos um de SEQ ID N9s:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, Em uma concretização, a seqüência de aminoácido de uma cadeia de imunoglobulina, ou porção disso (por exemplo, região variavel, CDR) têm aproximadamente 70-100% de identidade ípor exemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97,98,99,100 ou qualquer limite ou valor do mesmo) para a seqüência de aminoácido da cadeia correspondente de pelo menos um de SEQ ID Nes: 7, 8. Por exemplo, a sequência de amínoácido de uma região variável de cadeia leve pode ser comparada com a seqüência de SEQ ID N-:8, ou sequência de aminoácido de um CDR3 de cadeia pesada pode ser comparada com SEQ ID N-:3. Preferivelmente, 70-100% de identidade de aminoácido (isto é, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ,96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer limite ou valor do mesmo) é determinada usando um algoritmo de computador adequado, como conhecido na técnica.

Seqüênciaà de regiões variáveis de cadeia pesada ou de cadeia leve exemplares são fornecidas qm SEQ ID NQs; 7 e 8. Os anticorpos da presente invenção, ou variantes especificadas disso, podem compreender qualquer um dos vários resíduos de aminoácidos contíguos de um anticorpo da presente invenção, onde aquele número é selecionado do grupo de números inteiros consistindo em 10-100% dos vários resíduos contíguos em um anticorpo anti-!L-12. Opcionalmente, esta subseqüência de aminoácidos contíguos é pelo menos aproximadamente 10, 20,30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, ou mais aminoácidos em comprimento, ou qualquer limite ou valor disso. Além disso, várias tais subseqüências podem ser qualquer número inteiro selecionado do grupo consistindo em 1 a 20, tal como pelo menos 2, 3, 4 ou 5.

Conforme aqueles versados apreciarão, a presente invenção inclui pelo menos um anticorpo biologicamente ativo da presente invenção. Anticorpos biologicamente ativos têm uma atividade específica em pelo menos 20%, 30%, ou 40%, e preferivelmente pelo menos 50%, 60%, ou 70%, e mais preferivelmente pelo menos 80%, 90% ou 95%-1000% daquele do nativo (não-sintético), endógeno ou relacionado e anticorpo conhecido. Métodos de analisar e quantificar medições de atividade enzimática e especificidade do substrato, são bem-conhecidos daqueles versados na técnica.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a anticorpos humano e fragmentos de aglutinação de antígeno, como descrito aqui, os quais são modificados pela ligação covalente de uma porção orgânica. Tal modificação pode produzir um anticorpo ou fragmento de aglutinação de antígeno com propriedades farmacocinéíicas aperfeiçoadas (por exemplo, meia-vida de soro in vivo aumentada). A porção orgânica pode ser um grupo polimérico hidrófilo linear ou ramificado, grupo de ácido polimérico, ou grupo de éster de ácido graxo. Em concretizações particulares, o grupo polimérico hidrófilo pode ter um peso molecular de aproximadamente 800 a cerca de 120.000 Dáltons e podem ser um polialquileno glicol (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG)), polímero de carboidrato, polímero de aminoácído ou polivinil pirrolidona, e o grupo de ácido graxo ou éster de ácido graxo pode compreender de aproximadamente oito a cerca de quarenta átomos de carbono.

Os anticorpos e fragmentos de aglutinação de antígeno modificados da invenção podem compreender uma ou mais porções orgânicas que estão covalentemente ligadas, diretamente ou indiretamente, ao anticorpo. Cada porção orgânica que está ligada a um anticorpo ou fragmento de aglutinação de antígeno da invenção pode independentemente ser um grupo polimérico hidrófilo, um grupo de ácido graxo ou um grupo de éster de ácido graxo. Como usado aqui, o termo "ácido graxo" abrange ácidos monocarbo-xílicos ou ácidos dicarboxílicos. Um "grupo polimérico hidrófilo", conforme o termo é usado aqui, refere-se a um polímero orgânico que é mais solúvel em água do que em octano. Assim, um anticorpo modificado pela ligação cova-lente de polilisina é abrangido pela invenção. Polímeros hidrófilos adequados para modificar anticorpos da invenção podem ser lineares ou ramificados e incluem, por exemplo, polialcano glicóis (por exemplo, PEG, monometóxi-polietileno glicol (mPEG), PPG e outros mais), carboidratos (por exemplo, dextrano, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos, e outros mais), polímeros de aminoácidos hidrófilos (por exemplo, polilisina, políarginina, polias-partato e outros mais), óxidos de polialcano (por exemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno e outros mais) e polivinil pirrolidona. Preferivelmente, o polímero hidrófilo que modifica o anticorpo da invenção tem um peso molecular de aproximadamente 800 a cerca de 150.000 Dáltons como uma entidade molecular separada. Por exemplo PEGsooo e PEG2o.ooo, onde o subscrito é o peso molecular do polímero em Dáltons, podem ser usados. O grupo poíimérico hidrófilo pode ser substituído com um a cerca de seis grupos alquila, de ácido graxo ou éster de ácido graxo. Polímeros hidrófilos que são substituídos com um grupo de ácido graxo ou de éster de ácido graxo podem ser preparados empregando métodos adequados. Por exemplo, um polímero compreendendo um grupo amina pode ser acoplado a um carboxi-lato do ácido graxo ou éster de ácido graxo, e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com Ν,Ν-carbonil diimidazol) ou um ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado a um grupo hidroxila em um polímero. Ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para modificar anticorpos da invenção podem ser saturados ou podem conter uma ou mais unidades de insaturação. Ácidos graxos que são adequados para modificar anticorpos da invenção incluem, por exemplo, n-dodecanoato {C12, laurato), n-tetradecanoato (Cu, miristato), n-octadecanoato (Cia, estearato), n-eicosanoato (C20, araquidato), n-docosanoato (C23, behenato), n-triacon-tanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), cis-A9-octadecanoato (C18, oleato), todos os cis-A5,8,11,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), ácido octa-nodióico, ácido tetradecanodióico, ácido octadecanodióico, ácido docosano-dióico, e outros mais. Ésteres de ácido graxo adequados incluem monoéste-res de ácidos dicarboxílicos que compreendem um grupo alquila inferior linear ou ramificado. O grupo alquila inferior pode compreender de um a cerca de doze, preferivelmente um a cerca de seis, átomos de carbono.

Os anticorpos humanos modificados e fragmentos de aglutinação de antígeno podem ser preparados usando métodos adequados, tais como por reação com um ou mais agentes modificantes, Um "agente modifi-cante" como 0 termo é usado aqui, refere-se a um grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrófilo, um ácido graxo, um éster de ácido graxo) que compreende um grupo ativador. Um "grupo atívador" é uma porção química ou grupo funcional que pode, sob condições apropriadas, reagir com um segundo grupo químico desse modo formando uma ligação covaiente entre 0 agente modificador e 0 segundo grupo químico. Por exemplo, grupos ativa-dores reativos a amina incluem grupo eletrófilos tais como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, iodo), N-hidroxissuccínimidil ésteres (NHS), e ou- tros. Grupos ativadores que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, maleimida, iodoacetila, acrilolila, piridil dissulfetos, ácido 5-tiol-2-nitro-benzóico tiol (TNB-tiol), e outros mais. Um grupo funcional de aldeído pode ser acoplado a moléculas contendo amina ou hidrazida, e um grupo azida podem reagir com um grupo de fósforo trívalentes para formar ligações de fosforamidato ou fosforimida. Métodos adequados para introduzir grupos ativadores em moléculas são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Hermanson, G. TM Bioconjugate Techniques. Academic Press; San Diego, CA (1996)). Um grupo ativador pode ser ligado diretamente ao grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrófilo, ácido graxo, ésíeres de ácido graxo), ou através de uma porção ligante, por exemplo um grupo CrC12 divalente onde um ou mais átomos de carbono podem ser substituídos por um heteroátomo tal como oxigênio, nitrogênio ou enxofre. Porções ligantes adequadas incluem, por exemplo, tetraetileno glicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- e -CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH-NH-. Agentes modificadores que compreendem uma porção ligante pode ser produzida, por exemplo, reagindo um mono-Boc-alquildiamina (por exemplo, mono-Boc-etilenodiamina, mono-Boc-diaminohexano) com um ácido graxo na presença de 1-etíl-3-(3-dimetilaminopropi!) carbodiimida (EDC) para formar uma ligação de amida entre a amina livre e o carboxilato de ácido graxo. O grupo protetor pode ser removido a partir do produto por tratamento com ácido trifluoroacético (TFA) para expor uma amina primária que pode ser acoplada a outro carboxilato como descrito, ou pode ser reagida com anidrido maléico e o produto resultante ciclizado para produzir um derivado de maleimido ativado do ácido graxo. (Veja, por exemplo, Thompson, e outros, WO 92/16221 os ensinamentos inteiros dos quais são incorporados aqui por referência).

Aos anticorpos modificados da invenção podem ser produzidos reagindo um anticorpo humano ou fragmento de aglutinação de antígeno com um agente modificador. Por exemplo, as porções orgânicas podem ser ligadas ao anticorpo em um modo não-específico a sítio empregando um agente modificador reativo a amina, por exemplo, um éster NHS de PEG. Anticorpos humanos modificados ou fragmentos de aglutinação de antígeno podem também ser preparados reduzindo ligações de dissulfeto (por exemplo, ligações de dissulfeto intracadeia) de um anticorpo ou fragmento de aglutinação de antígeno. O anticorpo reduzido ou fragmento de aglutinação de antígeno pode então ser reagido com um agente modificador reativo a tiol para produzir o anticorpo modificado da invenção. Anticorpos humanos modificados e fragmentos de aglutinação de antígeno compreendendo uma porção orgânica que está ligada a sítios específicos de um anticorpo da presente invenção podem ser preparados usando métodos adequados, tais como proteólise reversa (Fisch e outros, Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen e outros, Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran e outros, Protein Sei. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh e outros, Bioorg. Chem., 24(1):59-68 (1996); Capellas e outros, Biotechnol. Bioeng. 56(4):456-463 (1997)), e os métodos descritos em Hermanson, G. T., Bioconjugate Techni-ques, Academic Press: San Diego, CA (1996). ANTICORPOS ANTIIDIOTIPO PARA OMPOSIÇQES DE PROTEÍNA DERIVADAS DEIG ANTI-IL-12 Além dos anticorpos anti-IL-12 monoclonais ou quiméricos, a presente invenção é também direcionada a um anticorpo antiidiotípico (anti-Id) específico a tais concretizações da invenção. Um anticorpo anti-ld é um anticorpo o qual reconhece determinantes únicos geralmente associados com a região de aglutinação de antígeno de outro anticorpo. O anti-ld pode ser preparado imunizando um animal das mesmas espécies e tipo genético (por exemplo cepa de camundongo) como a fonte do anticorpo Id com o anticorpo ou uma região contendo CDR disso. O animal imunizado reconhecerá e responderá aos determinantes idiotípicos do anticorpo imunizante e produzem um anticorpo anti-ld. O anticorpo anti-ld pode também ser usado como um "imunógeno" para induzir uma resposta imunológica em ainda outro animal, produzindo um suposto anticorpo anti-anti-ld. COMPOSIÇÕES DE PROTEÍNA DERIVADA AIG ANTI-IL-12 A presente invenção também fornece pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-12 compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou mais anticorpos anti-IL-12 disso, como descrito aqui e/ou como conhecido na técnica que são fornecidas em uma composição, mistura ou forma ocorrendo não naturalmente. Tais composições compreendem composições não ocorrendo naturalmente compreendo pelo menos uma ou duas variantes, domínios, fragmentos, ou variantes específicos anuladas C ou N terminalmente de comprimento completo da seqüência de aminoácido de anticorpo anti-IL-12 selecionada do grupo consistindo em 70-100% dos ami-noácidos contíguos de SEQ ID Nes: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, ou fragmentos, domínios, ou variantes específicos dos mesmos. Composições de proteína, fragmento ou variante derivadas de anti-IL-12 preferidas incluem pelo menos um ou dois fragmentos, domínios ou variantes de comprimento completo como pelo menos um CDR contendo porções da seqüência de anticorpo anti-IL-12 de 70-100% de SEQ ID N-s: 1,2, 3, 4, 5, 6, ou fragmentos, domínios, ou variantes específicos disso. Composições preferidas adicionais compreendem 40-99% de pelo menos de 70-100% de SEQ ID N5s: 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou fragmentos, domínios ou variantes específicos disso, Tais porcentagens da composição são em peso, volume, concentração, molaridade, ou molalidade como soluções líquidas ou secas, misturas, suspensão, emulsões ou colóides, como conhecido na técnica ou como descrito aqui.

Composições de anticorpo anti-IL-12 da presente invenção podem além disso compreender pelo menos uma de qualquer quantidade adequada e eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti-IL-12 a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia, opcionalmente além disso compreendendo pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, mas não-limitado a um anticorpo TNF ou fragmento, um receptor TNF solúvel ou fragmento, proteínas de fusão disso, ou um antagonista de TNF de molécula pequena), um anti-reumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatio-prina, etanorcept, tiomalato de sódio de ouro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), um relaxante muscular, um narcótico, uma droga antiinflamatória não-esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobial (por exemplo, aminoglicosídeo, um antifungal, um antiparasítico, um an-tiviral, um carbapenemo, cefalosporina, uma fluorquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro antimicrobial), um antipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, um agente relacionado a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente tíróide, uma vitamina, um hormônio relacionado a cálcio, um antidiarréico, um antitussivo, um antiemético, um antiúicera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropoieti-na (por exemplo epoetina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupo-gen), um sargramostim (GM-CSF, Leucina), uma imunização, uma imuno-globulina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, da-clizumab), um hormônio de crescimento, uma droga de reposição de hormônio, um modulador de receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplé-gico, um agente de alquilação, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressívo, um antímaníaco, um antipsicótíco, um anxiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, uma medicação para asma, um beta agonista, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, alfa dornase (Pulmozima), uma citocina, ou um antagonista de citocina. Exemplos não-limitantes de tais citocinas incluem, mas não são limitados a, qualquer um de IL-1 a IL-23. Dosagens adequadas são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Wells e outros, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a Edição, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Ta-rascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada uma das quais referências são inteiramente incorporadas aqui por referência.

Tais anticâncer ou antiinfectivos podem também incluir moléculas de toxina que são associadas, ligadas, co-formuladas ou co-administradas com pelo menos um anticorpo da presente invenção, A toxina pode opcionalmente atuar para seletivamente matar a célula ou tecido patológico. A célula patológica pode ser uma célula de câncer ou outra. Tais toxinas podem ser, mas não são limitadas a, toxina purificada ou recombinante ou fragmento de toxina compreendendo pelo menos um domínio citotóxico funcional de toxina, por exemplo, selecionado de pelo menos um de ricina, toxina de difteria, uma toxina venenosa, ou uma toxina bacterial. O termo toxina também inclui ambas endotoxinas e exotoxinas produzidas por quaisquer bactérias ou vírus ocorrendo naturalmente, mutantes ou recombinantes os quais podem causar condição patológica em seres humanos e outros mamíferos, incluindo choque de toxina, a qual pode resultar em morte. Tais toxinas podem incluir, mas não estão limitadas a, enterotoxina instável a calor de £ coli enterotoxigênica (LT), enterotoxina instável a calor (ST), citoto-xina de Shigella, enterotoxinas de Aeromonas, síndrome de toxina-1 de choque tóxico (TSST-1), enterotoxina A (SEA), B (SEB), ou C (SEC) de Sta-phylococcal, enterotoxinas de Streptococcal e outras mais. Tais bactérias incluem, mas não são limitadas a, classes de umas espécies de E. coli enterotoxigênica (ETEC), £ coli enterohemorrágica (por exemplo, classes de sorotipo 0157:H7), espécies de Staphylococcus (por exemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), espécies de Shigella (por exemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, e Shigella son-neí), espécies de Salmonella (por exemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), espécies de Clostridium (por exemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), espécies de Camphlobacter (por exemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fe-tus), espécies de Heliobacter, (por exemplo, Heliobacter pylori), espécies de Aeromonas (por exemplo, Aeromonas sóbria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, espécies de Vibrios (por exemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemoíyticus), espécies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, e Streptococci. Veja, por exemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3a ed., pp 1-13, Little, Brown e Co,, Boston, (1990); Evans e outros, eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2a Ed,, pp 239-254, Plenum Medicai Book Co., New York (1991); Mandell e outros, Principies and Practice of Infectious Diseases, 3a Ed,, Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow e outros, eds., The Merck Manual, 16a edição, Merck and Co,, Rahway, N.J., 1992; Wood e ou- tros, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack e outros, Science, 248:705-711 (1990), os conteúdos das quais referências são incorporadas completamente aqui por referência.

Compostos, composições ou combinações de anticorpos anti-IL-12 da presente invenção podem além disso compreender pelo menos um de qualquer auxiliar adequado, tal como mas não-limitado a, diluente, aglutí-nante, estabilizador, tampões, sais, solventes lipófilos, conservante, adju-vante ou outros mais. Auxiliares farmaceuticamente aceitáveis são preferidos. Exemplos não-limitantes de, e métodos de preparar tais soluções estéreis são bem-conhecidos na técnica, tais como, mas não-limitados a, Genna-ro, Ed., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser rotineiramente selecionados que são adequados para o modo de administração, solubilidade e/ou estabilidade do anticorpo anti-IL-12, fragmento ou composição variante bem-conhecida na técnica ou como descrito aqui.

Excipientes farmacêuticos e aditivos úteis na presente composição incluem mas não são limitados a proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídeos, e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra-, e oligossacarídeos, açúcares derivados tais como alditióis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e outros mais; e polissacarídeos ou polímeros de açúcares), os quais podem estar presente unicamente ou em combinação, compreendendo sozinho ou em combinação 1-99,99% por peso ou volume. Excipientes de proteínas exemplares incluem albumina do soro tal como albumina do soro humana (HSA), albumina humana recombi-nante (rHA), gelatina, caseína, e outros mais. Componentes de aminoáci-do/anticorpo representativos, os quais podem também funcionar em uma capacidade tamponadora, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidi-na, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, vali-na, metionina, fenílalanina, aspartame, e outros mais. Um aminoácido preferido é glicina.

Excipientes de carboidrato adequados para uso na invenção incluem, por exemplo, monossacarídeos tais como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose, e outros mais; dissacarídeos, tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose, e outros mais; polissacarídeos, tais como rafi-nose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos, e outros mais; e aldi-tióis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), mioí-nositol e outros mais. Excipientes de carboidrato preferidos para uso na presente invenção são manitol, trealose, e rafínose.

Composições de anticorpo anti-IL-12 podem também incluir um tampão ou um agente ajustador de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado de um ácido ou base orgânica. Tampões representativos incluem sais de ácido orgânico tais como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético, ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de trometamina, ou tampões de fosfato. Tampões preferidos para uso nas composições presentes são sais de ácidos orgânicos tais como citrato.

Adicionalmente, composições de anticorpo anti-IL-12 da invenção podem incluir excipientes/aditivos poliméricos tais como polivinilpirroli-donas, ficóis (um açúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, tais como 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina), polietileno glicóís, agentes aroma-tizantes, agentes antimicrobiais, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestá-ticos, tensoativos (por exemplo, polissorbatos tais como "TWEEN 20” e "TWEEN 80"), lipídeos (por exemplo, fosfolipídeos, ácidos graxos), esterói-des (por exemplo, colesterol), e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).

Este e excipientes farmacêuticos adicionais conhecidos e/ou aditivos adequados para uso nas composições de anticorpo anti-IL-12, porção ou variante de acordo com a invenção são conhecidos na técnica, por exemplo, como relacionados em "Remington; The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed., Williams & Williams, (1995), e na "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medicai Economics, Montvale, NJ (1998), as descobertas das quais são ínteiramente incorporadas por referência. Materiais veículos ou excipientes preferidos são carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos.

Formulações Como percebido acima, a invenção fornece para formulações estáveis, a qual é preferivelmente um tampão de fosfato com solução salina ou um sal escolhido, assim como soluções e formulações preservadas contendo um conservante bem como formulações preservadas de multiuso adequadas para uso farmacêutico ou veterinário, compreendendo pelo menos um anticorpo anti-IL-12 em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Formulações conservadas contém pelo menos um preservativo conhecido ou opcionalmente selecionado do grupo consistindo em pelo menos um fe-nol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, nitrito de fenil-mercúrio, fenoxietanol, formaldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e outros mais), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas disso em um diluente aquoso. Qualquer concentração ou mistura adequada pode ser usada conforme conhecida na técnica, tal como 0,001-5%, ou qualquer limite ou valor aqui, tal como, mas não-limitado a 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8,3,9, 4,0, 4,3, 4,5,4,6, 4,7, 4,8, 4,9, ou qualquer limite ou valor disso. Exemplos não-limitantes incluem, nenhum conservante, m-cresol 0,1-2% (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), álcool benzílico 0,1-3% (por exemplo, 0,5, 0,9,1,1,1,5,1,9, 2,0, 2,5%), timerosal 0,001-0,5% (por exemplo, 0,005, 0,01), fenol 0,001-2,0% (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), alquilparabeno(s) 0,0005-1,0% (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9,1,0%), e outros mais.

Como percebido acima, a invenção fornece um artigo de produção, compreendendo material de empacotamento e pelo menos um frasco compreendendo uma solução de pelo menos um anticorpo anti-IL-12 com os tampões e/ou conservantes prescritos, opcionalmente em um diluente aquoso, onde dito material de empacotamento compreende um rótulo que indica que tal solução pode ser mantida durante um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12,18, 20,24,30, 36, 40,48,54,60, 66, 72 horas ou mais. A invenção além disso compreende um artigo de produção, compreendendo material de empacotamento, um primeiro frasco compreendendo liofilizado pelo menos um anticorpo anti-IL-2, e um segundo frasco compreendendo um diluente aquo-so de tampão ou conservante prescrito, onde dito material de empacotamento compreende pelo menos um rótulo que instrui um paciente a reconstituir o pelo menos um anticorpo anti-IL-12 no diluente aquoso para formar uma solução que pode ser mantida sobre um período de vinte e quatro horas ou mais.

Pelo menos um anticorpo anti-IL-12 usado de acordo com a presente invenção pode ser produzido por meios recombinantes, incluindo de célula de mamífero ou preparações transgênicas, ou pode ser purificado a partir de outras fontes biológicas, como descrito aqui ou como conhecido na técnica. O limite de pelo menos um anticorpo anti-IL-12 no produto da presente invenção inclui quantidades rendendo em reconstituição, se em um sistema úmido/seco, concentrações são operáveis e são dependentes no veículo de distribuição pretendido, por exemplo, formulações de solução diferenciarão-se de emplastro transdérmico, pulmonar, transmucosal, ou métodos de bomba osmóticos ou de microbomba.

Preferivelmente, o diluente aquoso opcionalmente além disso compreende um conservante farmaceuticamente aceitável. Preservativos preferidos incluem aqueles selecionados do grupo consistindo em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquílparabeno (meti-la, etila, propila, butila e outros mais), cloreto de benzalcônio, cloreto de ben-zetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas disso. O concentração de preservativo usada na formulação é uma concentração suficiente para render um efeito antimicrobial. Tais concentrações são dependentes no conservante selecionado e estão prontamente determinados pelo versado na técnica.

Outros excipientes, por exemplo, agentes de isotonicidade, tam- pões, antioxidantes, realçadores preservativos, podem ser opcionalmente e preferivelmente adicionados ao diluente. Um agente de isotonicidade, tal como glicerina, é comumente usado em concentrações conhecidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é preferivelmente adicionado para fornecer controle de pH aperfeiçoado. As formulações podem cobrir um amplo limite de pHs, tais como de aproximadamente 4 a cerca de pH 10, e limites preferidos de aproximadamente pH 5 a cerca de pH 9, e um limite mais preferido de aproximadamente 6,0 a cerca de 8,0. Preferivelmente as formulações da presente invenção têm pH entre aproximadamente 6,8 e aproximadamente 7,8. Tampões preferidos incluem tampões de fosfatos, mais preferivelmente fosfato de sódio, particularmente solução salina tamponada de fosfato (PBS).

Outros aditivos, tais como uns estabilizadores farmaceutica-mente aceitáveis como Tween 20 (monolaurato de polioxietileno (20) sorbi-tano), Tween 40 (monopalmítato de polioxietileno (20) sorbitano), Tween 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitano), Pluronic F68 (copolímeros de bloco de polioxipropileno de polioxietileno), e PEG (polietileno glicol) ou ten-soativos não-iônicos tais como polissorbato 20 ou 80 ou polioxâmero 184 ou 188, Pluronic® polils, outros copolímeros de bloco, e queladores tais como EDTA ou EGTA podem opcionalmente ser adicionados às formulações ou composições para reduzir agregação. Estes aditivos são particularmente úteis se uma bomba ou recipiente plástico é usado para administrar a formulação. A presença de tensoativo farmaceuticamente aceitável mitiga a propensão da proteína a agregar.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo o qual compreende misturando pelo menos um anticorpo anti-IL-12 e um preservativo selecionado do grupo consistindo em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (meti-la, etila, propila, butila e outros mais), cloreto de benzalcônio, cloreto de ben-zetônio, desidroacetato de sódio e timerosal ou misturas disso em um diluente aquoso. Misturando pelo menos um anticorpo anti-IL-12 e preservativo em um diluente aquoso é realizado usando procedimentos de dissolução e mistura convencionais. Para preparar uma formulação adequada, por exem- pio, uma quantidade medida de pelo menos um anticorpo anti-IL-12 em solução tamponada é combinado com o preservativo desejado em uma solução tamponada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e preservativo nas concentrações desejadas, Variações deste processo seriam reconhecidas por um versado na técnica. Por exemplo, a ordem dos componentes são adicionados, se aditivos adicionais são usados, a temperatura e pH nos quais a formulação é preparada, são todos os fatores que podem ser otimizados para a concentração e meios de administração usados.

As formulações usadas podem ser fornecidas a pacientes como soluções transparentes ou como frascos duais compreendendo um frasco de liofilizado pelo menos um anticorpo anti-IL-12 que é reconstituído com um segundo frasco contendo água, um preservativo e/ou excipientes, preferivelmente um tampão de fosfato e/ou solução salina e um sal escolhido, em um diluente aquoso. Quer um frasco de solução simples ou frascos duais exigindo reconstituição pode ser reusado múltiplas vezes e pode ser suficiente para ciclos simples ou múltiplos de tratamento do paciente e assim fornecer um regime de tratamento mais conveniente do que comumente disponíveis.

Os artigos de produção reivindicados presentes são úteis para administração durante um período de imediatamente a vinte e quatro horas ou mais. Conformemente, os artigos de produção presentemente reivindicados oferecem vantagens signifícantes ao paciente. Formulações da invenção podem opcionalmente ser armazenadas em segurança em temperaturas de aproximadamente 2 a cerca de 40°C e reter a atividade biológica da proteína por períodos estendidos de tempo, assim, permitindo um rótulo de empacotamento indicando que a solução pode ser mantida e/ou usada durante um período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, ou 96 horas ou mais. Se diluente preservado é usado, tal rótulo pode incluir uso até 1-12 meses, meio ano, um ano e meio, e/ou dois anos.

As soluções de pelo menos um anticorpo anti-IL-12 na invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturando pelo menos um anticorpo em um diluente aquoso. Mistura é realizada usando procedimentos de mistura e dissolução convencionais. Para preparar um diluente adequado, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um anticorpo em água ou tampão é combinada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e opcionalmente um preservativo ou tampão nas concentrações desejadas. Variações deste processo seriam reconhecidas por um versado na técnica. Por exemplo, a ordem que os componentes são adicionados, se aditivos adicionais são usados, a temperatura e pH no qual a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e meios de administração usados.

Os produtos reivindicados podem ser divididos a pacientes como soluções transparentes ou como frascos duais compreendendo um frasco de liofilizado pelo menos um anticorpo anti-IL-12 que é reconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. Quer um frasco de solução simples ou frasco dual exigindo reconstituição pode ser reusado múltiplas vezes e pode ser suficiente para ciclos simples e múltiplos de tratamento do paciente e assim fornece um regime de tratamento mais convincente do que correntemente disponível.

Os produtos reivindicados podem ser fornecidos indiretamente a pacientes fornecendo a farmácias, clínicas, ou outras tais instituições e facilita, soluções transparentes ou frascos duais compreendendo um frasco de liofilizado em pelo menos um anticorpo anti-IL-12 que é reconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. A solução transparente no caso pode estar até um litro ou ainda maior em tamanho, fornecendo um reservatório grande do qual porções menores da pelo menos uma solução de anticorpo pode ser recuperada uma ou múltiplas vezes para transferência em frascos menores e fornecida pela farmácia ou clínica a seus consumidores e/ou pacientes.

Dispositivos reconhecidos compreendendo estes sistemas de frascos simples incluem aqueles dispositivos de caneta-injetora para distribuição de uma solução tal como Canetas BD, BD Autojectoi®, Humaject®, Novo-Pen®, B-D®Pen, AutoPen®, e OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Ne- edle-Free Injectoi®, Intraject®, Medi-Ject®, por exemplo, como feito ou desenvolvido por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medicai Products , Weston Medicai (Peterborough, UK, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapo-lis, MN, www.mediject.com). Dispositivos reconhecidos compreendendo um sistema de frasco dual incluem aqueles sistemas de caneta-injetora para reconstituir uma droga liofilizada em um cartucho para distribuição da solução reconstituída tal como HumatroPen®.

Os produtos presentemente reivindicados incluem material de empacotamento. 0 material de empacotamento fornece, além da informação exigida pelas agências reguladoras, as condições sob as quais o produto pode ser usado. 0 material empacotado da presente invenção fornece instruções ao paciente para reconstituir o pelo menos um anticorpo anti-IL-12 no diluente aquoso para formar uma solução e para usar a solução sobre um período de 2-24 horas ou mais para os dois frascos, produto úmido/seco. Para o frasco simples, produto de solução, o rótulo indica que tal solução pode ser usada durante um período de 2-24 horas ou mais. Os produtos presentemente reivindicados são úteis para uso de produto farmacêutico humano.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturando pelo menos um anticorpo anti-IL-12 e um tampão selecionado, preferivelmente um tampão de fosfato contendo solução salina ou um sal escolhido. Misturando o pelo menos um anticorpo e tampão em um diluente aquoso é realizado usando procedimentos de dissolução e mistura convencionais. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um anticorpo em água ou tampão é combinado com o agente tampão desejado em água em quantidades suficientes para fornecer a proteína e tampão nas concentrações desejadas. Variações deste processo seriam reconhecidas por um versado na técnica. Por exemplo, a ordem que os componentes são adicionados, se aditivos adicionais são usados, a temperatura e pH na qual a formu- lação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e meios de administração usados.

As formulações reivindicadas estáveis ou preservadas podem ser fornecidas a pacientes como soluções transparentes ou como frascos duais compreendendo um frasco de liofilizado pelo menos um anticorpo anti-IL-12 que é reconstituído com um segundo frasco contendo um preservativo ou tampão e excipientes em um diluente aquoso. Ou um frasco de solução simples ou frasco dual exigindo reconstituição pode ser reusado múltiplas vezes e pode ser suficiente para ciclos simples ou múltiplos de tratamento de paciente e assim fornece um regime de tratamento mais conveniente do que correntemente disponível.

Pelo menos um anticorpo anti-IL-12 em ou as formulações ou soluções estáveis ou preservadas descritas aqui, podem ser administradas a um paciente de acordo com a presente invenção via uma variedade de métodos de distribuição incluindo injeção SC ou IM; transdérmico, pulmonar, transmucosal, implante, bombas osmótica, cartucho, microbomba, ou outros meios apreciados pelo versado na técnica, bem-conhecido na técnica. Aplicações Terapêuticas A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença relacionada imunológica, em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente incluindo, mas não-limitado a, pelo menos um de artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite reumatóide juvenil de início sistêmico, artrite psoriática, espondilite ancilosiante, úlcera gástrica, artropatias soronegativas, osteoartrite, doença inflamatória do intestino, co-lite ulcerativa,' lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de antifosfolipídio, iri-dociclite/uveíte/neurite ótica, fibrose pulmonar idiopática, vasculite sistêmi-ca/granulomatose de wegener, sarcoidose, procedimentos reversos de or-quite/vasectomia, doenças alérgicas/atópicas, asma, rinite alérgica, eczema, dermatite de contato alérgica, conjuntivite alérgica, pneumotite de hipersen-sibilidade, transplantes, rejeição de transplante de órgão, doença de enxerto-contra-hospedeiro, síndrome de resposta inflamatória sistêmica, síndrome de sepsia, sepsia de Gram-positivo, sepsia de Gram-negativo, sepsia de cultura negativa, sepsia fungai, febre neutropênica, urosepsia, meningo-coccemia, trauma/hemorragía, queimaduras, exposição a radiação íonizante, pancreatite aguda, síndrome de dificuldade respiratória aulta, artrite reuma-tóide, hepatite induzida por álcool, patologias inflamatórias crônicas, sarcoi-dose, patologia de Crohn, anemia de célula setoira, diabetes, nefrose, doenças atópicas, reações de hípersensibílidade, rinite alérgica, febre de feno, rinite perenial, conjuntivite, endometriose, asma, urticária, anafalaxia sistêmica, dermatite, anemia perniciosa, doença hemolftica, trombocitopenia, rejeição a enxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição de transplante de rim, rejeição de transplante do coração, rejeição de transplante do fígado, rejeição de transplante do pâncreas, rejeição de transplante de pulmão, rejeição de transplante de medula óssea (BMT), rejeição de aloenxerto de pele, rejeição de transplante de cartilagem, rejeição de enxerto ósseo, rejeição de transplante de intestino delgado, rejeição de implante de timo fetal, rejeição de transplante de paratireóide, rejeição de xenoenxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição de aloenxerto, reações de hípersensibílidade de anti-receptor, doenças de Graves, doença de Raynoud, diabetes resistente a insulina tipo B, asma, miastenia grave, citotoxidade mediada por anticorpo, reações de hípersensibílidade tipo III, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de POEMS (polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia mo-noclonal, e síndrome de mudanças de pele), polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal, síndrome de mudanças de pele, síndrome de antifosfolipídio, pênfigo, escleroderma, doença de tecido conectivo misto, doença de Addison idiopática, diabetes melitus, hepatite ativa crônica, cirrose biliar primária, vitiligo, vasculite, síndrome de cardiotomia pós-MI, hipersensibilidade tipo IV, dermatite de contato, pneumonite de hipersensibi-lidade, rejeição de aloenxerto, granulomas devido a organismos intracelulares, sensibilidade a droga, metabólico/ídíopático, doença de Wilson, hema-cromatose, deficiência de alfa-1 -antitripsina, retinopatia diabética, tiroidite de Hashimoto, osteoporose, avaliação de eixo hipotalâmico-pitutária-adrenal, cirrose biliar primária, tiroidite, encefalomieliíe, caquexia, fibrose cística, doença pulmonar crônica neonatal, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), linfohistiocitose hematofagocítica familiar, condições dermatológicas, psoríase, alopecia, síndrome nefrótica, nefrite, nefrite glomerular, insuficiência renal aguda, hemodiálise, uremia, toxidade, pré-eclâmpsia, terapia okt3, terapia anti-cd3, terapia de citocina, quimioterapia, terapia de radiação (por exemplo, incluindo mas não-limitado a astenia, anemia, caquexia, e outros mais}, intoxicação de salicilato crônica,e outros mais. Veja, por exemplo, o Merck Manual, 12a-17a Edições, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977,1982,1987,1992,1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells e outros, eds, Segunda Edição, Appleton and Lange, Stamford, Conn,, (1998, 2000), cada uma inteiramente incorporada aqui por referência. A presente invenção também fornece um método para formular ou tratar pelo menos uma doença cardiovascular em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente, incluindo, mas não-limitado a, (TRECHO FALTANDO NO MOMENTO DA PUBLICAÇÃO DO PEDIDO PCT CORRESPONDENTE) simultaneamente, e/ou após pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista TNF (por exemplo, mas não-limitado a um anticorpo TNF ou fragmento, um receptor TNF solúvel ou fragmento, proteínas de fusão do mesmo, ou um antagonista TNF de molécula pequena), um anti-reumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatioprina, etanor-cept, tiomalato de sódio de ouro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), um relaxante muscular, um narcótico, uma droga antiinflamató-ria não-esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobial (por exemplo, aminoglicosídeo, um antifungal, um antiparasítico, um antiviral, um carbapenemo, cefalosporina, uma fluorquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro antimicrobial), um antipsoriá-tico, um corticosteróide, um esteróide anabólico, um agente relacionado a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente tiróide, uma vitamina, um hormônio relacionado a cálcio, um antidiarréico, um antitussivo, um antiemé-tico, uma antiúlcera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropoietina (por exemplo epoetina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupogen), um sargramostim (GM-CSF, Leucina), uma imunização, uma imunoglobuiina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximab, oiclosporina, daciizumab), um hormônio de crescimento, uma droga de reposição de hormônio, um mo-dulador de receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente de alquilação, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um antimaníaco, um antipsicótico, um anxiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil tacrina, uma medicação para asma, um beta agonista, um esteróide inalado, um inibidor de ieucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, alfa dornase (Pulmozíma), uma citocina, ou um antagonista de citocina. Do-sagens adequadas são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Wells e outros, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a Edição, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada uma das quais referências são inteiramente incorporadas aqui por referência.

Antagonistas TNF adequados para composições, terapia de combinação, co-administração dispositivos e/ou métodos da presente invenção (além disso compreendendo pelo menos um anticorpo, porção especificada e variante do mesmo, da presente invenção), incluem, mas não são limitados a anticorpos anti-TNF, fragmentos de aglutinação de antígeno do mesmo, e moléculas receptoras as quais aglutinam especificamente a TNF, compostos os quais previnem e/ou inibem síntese de TNF, liberação de TNF ou sua ação em células alvo, tais como talidomida, tenidap, inibidores de fosfodiesterase (por exemplo, pentoxifilina e rolipram), agonistas de receptor de adenosina A2b e realçadores de receptores de adenosina A2b; compostos os quais previnem e/ou inibem sinalização de receptor de TNF, tais como inibidores de proteína ativada por mitógeno (MPA) quinase; compostos os quais bloqueiam e/ou inibem divisão de TNF da membrana, tais como inibidores de metaloproteinase; compostos os quais bloqueiam e/ou inibem atividade de TNF, tais como inibidores de enzima de conversão de angiotensina (ACE) (por exemplo captopril); e compostos os quais bloqueiam e/ou inibem produção e/ou síntese de TNF, tais como inibidores de MAP quinase.

Como usado aqui, um "anticorpo de fator de necrose de tumor", "anticorpo de TNF", "anticorpos de TNF", ou fragmento e outros mais diminui, bloqueia, inibe, abroga, ou interfere com atividade de TNF in vitro, in situ e/ou preferivelmente in vivo. Por exempio, um anticorpo humano de TNF adequado da presente invenção pode aglutinar TNFa e inclui anticorpos an-ti-TNF, fragmentos de aglutinação de antígeno disso, e mutantes especificados ou domínios disso que aglutinam especificamente a TNFa. Um anticorpo de TNF adequado ou fragmento pode também diminuir, bloquear, abrigar, interferir, prevenir e/ou inibir RNA TNF, DNA ou síntese de proteína, liberação de TNF, sinalização de receptor de TNF, divisão de TNF da membrana, atividade de TNF, produção e/ou síntese de TNF.

Anticorpo quimérico cA2 consiste na região variável de aglutinação de antígeno do anticorpo TNFa lgG1 anti-humano de camundongo neu-tralizante de alta afinidade, designado A2, e as regiões constantes de um lgG1 humano, imunoglobulina capa. A região de lgG1 Fc humana melhora função efetuadora de anticorpo alogenêica, aumenta a meia-vida do soro circulante e diminui a imunogenicidade do anticorpo. A avidez e especificidade do epitopo do anticorpo quimérico A2 são derivado da região variável do anticorpo de murino A2. Em uma concretização particular, uma fonte preferida para ácidos nucléicos codificando a região variável do anticorpo de murino A2 é a linha de célula de hibridoma A2.

Quimérico A2 (cA2) neutraliza o efeito cítotóxico de ambos TNFa natural e recombinante humano em uma dose dependente do modo. Proveniente de ensaios de aglutinação de anticorpos quiméricos cA2 e TNFa humano recombinante, a afinidade constante de anticorpo quimérico cA2 foi calculada para ser 1,O4x1O10M'1. Métodos preferidos para determinar especificidade e afinidade de anticorpos monoclonais por inibição competitiva podem ser encontrados em Harlow, e outros, antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan e outros, eds., Current Protocois in Immunology, Greene Publishing Assoe, and Wiley Interscience, New York, (1992-2000); Kozbor e outros, Immunol. Today, 4:72-79 (1983); Ausubel e outros, eds. Current Protocolsin Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2000); e Muller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983), quais referências são completamente incorporadas aqui por referência.

Em uma concretização particular, anticorpo monoclona! de muri-no A2 é produzido por uma linha de célula designada c134A. Anticorpo qui-mérico cA2 é produzido por uma linha de célula designada c168A.

Exemplos adicionais de anticorpos anti-TNF monoclonais que podem ser usados na presente invenção são descritos na técnica (veja, por exemplo, Patente U.S. N2 5.231.024; Mõller, A. e outros, Cytokirte 2(3):162-169 (1990); Pedido de Patente N9 U.S. 07/943.852 (depositado em 11 de Setembro de 1992); Rathjen e outros, Publicação Internacional WO 91/02078 (publicada em 21 de Fevereiro de 1991); Rubin e outros, Publicação de Patente EPO N2 0 218 868 (publicada em 22 de Abril de 1987); Yone e outros, Publicação de Patente N9 EPO 0 288 088 (26 de outubro de 1988); Liang, e outros, Biochem. Biophys.Res. Comm. 137:847-854 (1986); Mea-ger, e outros, Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly e outros, Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, e outros, Hybridoma 6:489-507 (1987); e Hirai, e outros, J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987), quais referências são completamente incorporadas aqui por referência).

Receptor de Moléculas de TNF

Moléculas receptoras de TNF preferidas úteis na presente invenção são aquelas que aglutinam TNF com alta afinidade (veja, por exemplo, Feldmann e outros, Publicação Internacional N9 WO 92/07076 (publicada em 30 de abril de 1992); Schall e outros, Cell 61:361-370 (1990); e Lo-etscher e outros, Cell 61:351-359 (1990), quais referências são inteiramente incorporadas aqui por referência) e opcionalmente possuem baixa imuno-genicidade. Em particular, os receptores de superfície celular de TNF de 55 kDa (p55 TNF-R) e 75 kDa (p75 TNF-R) são úteis na presente invenção. Formas truncadas destes receptores, compreendendo os domínios extrace-lulares (ECD) dos receptores ou porções funcionais disso (veja, por exemplo, Corcoran e outros, Eur. J: Biochem. 223:831-840 (1994)), são também úteis na presente invenção. Formas truncadas dos receptores TNF, compreendendo o ECD, foram detectadas em urina e soro como proteínas de aglutinação inibitórias de TNF de 30 kDa e 40 kDa (Engelmann, H. e outros, J, Biot. Chem. 265:1531-1536 (1990)). Moléculas multiméricas de receptor de TNF e moléculas de fusão de imunorreceptor de TNF, e derivados e fragmentos ou porções disso, são exemplos adicionais de moléculas receptoras de TNF as quais são úteis nos métodos e composições da presente invenção. As moléculas receptoras de TNF as quais podem ser usadas na invenção são caracterizadas por sua capacidade para tratar pacientes por períodos estendidos com bom a excelente alívio de sintomas e baixa toxicidade. Baixa imunogenicidade e/ou alta afinidade, bem como outras propriedades indefinidas, podem contribuir aos resultados terapêuticos alcançados.

Moléculas multiméricas receptoras de TNF úteis na presente invenção compreendem tudo ou uma porção do ECD de dois ou mais receptores de TNF ligados via um ou mais ligantes ou outros ligantes de não-peptídeo, tais como polietileno glicol (PEG). As moléculas multiméricas podem além disso compreender um peptídeo de sina! de uma proteína secre-tada para direcionar expressão da molécula multimérica. Estas moléculas multiméricas e métodos para sua produção foram descritos em Pedido de Patente U.S. NQ 08/437.533 (depositado em 9 de maio de 1995), o conteúdo do qual é inteiramente incorporado aqui por referência.

Moléculas de fusão de imunorreceptor YNF útil nos métodos e composições da presente invenção compreendem pelo menos uma porção de uma ou mais moléculas de imunoglobulina e tudo ou uma porção funcional de um ou mais receptores de TNF. Estas moléculas de fusão de imunorreceptor podem ser reunidas como monômeros, ou hetero ou homomultíme-ros. As moléculas de fusão de imunorreceptor podem ser monovalentes ou multivaientes. Um exemplo de tal molécula de fusão de imunorreceptor TNF é receptor de TNF/proteína de fusão de IgG. Moléculas de fusão de imunorreceptor e métodos para sua produção foram descritos na técnica (Lesslauer e outros, Eur. J. Immunol. 21:2883-2886 (1991); Ashkenazi e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10535-10539 (1991); Peppel e outros, J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991); Kolls e outros, Proc. Nutl. Acad. Sei. USA 91:215-219 (1994); Builer e outros, Cytokine 6(6):616-623 (1994); Baker e outros, Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler e outros, Patente U.S. N9 5.447.851; e Pedido de Patente U.S. N- 08/442.133 (depositado em 16 de Maio de 1995), cada uma das quais referências são completamente incorporadas aqui por referência). Métodos para produzir moléculas de fusão de imunorre-ceptores podem também ser encontradas em Capon e outros, Patente U.S. N- 5.116.964; Capon e outros, Patente U.S. N9 5.225.538; e Capon e outros, Nature 337:525-531 (1989), quais referências são completamente incorporadas aqui por referência.

Um equivalente funcional, derivado, fragmento ou região de molécula receptora de TNF refere-se à porção da molécula receptora de TNF, ou a porção da sequência da molécula receptora de TNF a qual codifica molécula receptora de TNF, isto é de tamanho suficiente e seqüências para funcionalmente reunir moléculas receptoras de TNF que podem ser usadas na presente invenção (por exemplo, aglutina TNF com alta afinidade e possui baixa imunogenicidade). Um equivalente funcional de molécula receptora de TNF também inclui moléculas receptoras de TNF modificadas que funcionalmente reúnem moléculas receptoras de TNF que podem ser usadas na presente invenção (por exemplo, aglutinam TNF com alta afinidade e possuem baixa imunogenicidade). Por exemplo, um equivalente funcional de molécula receptora de TNF pode conter um códon "SILENCIOSO" ou uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácidos (por exemplo, substituição de um aminoácido acídico por outro aminoácido acídico; ou substituição de um códon codificando o mesmo aminoácido hidrófobo ou diferentes por outro códon codificando um aminoácido hidrófobo). Veja Au-subel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, e Wiley-lnterscience, New York (1987-2000).

Citocinas incluem qualquer citocina conhecida. Veja, por exemplo, www.CopewithCytokines.com. Antagonista de citocina incluem, mas não são limitadas a, qualquer anticorpo, fragmento ou mimético solúvel, qualquer antagonista de molécula pequena, ou qualquer combinação do mesmo.

Tratamentos Terapêuticos. Qualquer método da presente invenção pode compreender um método para tratar um distúrbio mediado por IL-12, compreendendo administrando uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma vez anticorpo anti-IL-12 a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia. Tal método pode opcionalmente além disso compreender co-administração ou terapia de combinação para tratar tais doenças imunológicas, onde a administração de dito pelo menos um anticorpo anti-IL-12, porção especificada ou variante disso, além disso compreende administrando, antes de, simultaneamente e/ou após, pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, mas não-limitado a um anticorpo de TNF ou fragmento, um receptor de TNF solúvel ou fragmento, proteínas de fusão do mesmo, ou um antagonista de TNF de molécula pequena), um anti-reumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatioprina, etanorcept, tiomalato de sódio de ouro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), um relaxante muscular, um narcótico, uma droga antiinfiamatória não-esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobíal (por exemplo, aminoglicosí-deo, um antifungal, um antiparasítico, um antiviral, um carbapenemo, cefa-losporina, uma fluorquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfona-mida, uma tetraciclina, outro antimicrobíal), um antipsoriático, um corticoste-róide, um esteróide anabólico, um agente relacionado a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente tiróide, uma vitamina, um hormônio relacionado a cálcio, um antidiarréico, um antitussivo, um antiemético, um anti-úlcera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropoietina (por exemplo epoetina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupogen), um sargramostim (GM-CSF, Leucina), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossu-pressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio de crescimento, uma droga de reposição de hormônio, um modulador de receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente de alquila-ção, um antimetabólito, um inibidor micótico, um radiofarmacêutico, um anti- depressivo, um antimaníaco, um antipsicótico, um anxiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil tacrina, uma medicação para asma, um beta agonista, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrie-no, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, alfa doma-se (Pulmozima), uma citocina, ou um antagonista de citocina.

Tipicamente, tratamento de condições patológicas é efetuado administrando uma quantidade ou dosagem de pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-12 na qual total, em média, um limite de pelo menos aproximadamente 0,01 a 500 miligramas de pelo menos uma vez anticorpo anti-IL-12 por quilograma de paciente por dose e preferivelmente de pelo menos aproximadamente 0,1 a 100 miligramas de anticorpo/quilograma de paciente por administração única ou múltipla, dependendo da atividade específica do contida na composição. Alternativamente, a concentração de soro eficaz pode compreender 0,1-5000 pg/ml de concentração de soro por administração única ou múltipla, Dosagens adequadas são conhecidas a práticos médicos e, é claro, dependerão do estado da doença particular, atividade específica a composição sendo administrada, e o paciente particular sofrendo tratamento. Em alguns exemplos, para alcançar a quantidade terapêutica desejada, pode ser necessária para fornecer administração repetida, isto é, administrações individuais repetidas de uma dose monitorada ou medida particular, onde as administrações individuais são repetidas até a dose diária desejada ou efeito ser alcançado.

Doses preferidas podem opcionalmente incluir 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e/ou 100-500 mg/kg/administração, ou qualquer limite, valor, ou fração disso, ou para alcançar uma concentração de soro de 0,1, 0,5, 0,9, 1,0,1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0,7,5,7,9, 8,0,8,5,8,9, 9,0,9,5,9,9,10,10,5,10,9,11, 11,5, 11,9, 20, 12.5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7.5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9,13,0,13,5,13,9,14,14,5,15,15,5,15,9,16,16,5,16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, e/ou 5000 pg/ml de concentração de soro por administração única ou múltipla, ou qualquer limite, valor ou fração disso.

Alternativamente a dosagem administrada pode variar dependendo dos fatores conhecidos, tais como características farmacodinâmicas do agente particular, e seu modo e rota de administração; idade, saúde, e peso do recipiente; natureza e extensão dos sintomas tipo de tratamento corrente, frequência de tratamento, e o efeito desejado. Geralmente uma dose de ingrediente ativo pode ser aproximadamente 0,1 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal. Ordinariamente 0,1 a 50, e preferivelmente 0,1 a 10 miligramas por quilograma por administração ou em forma de liberação sustentada é eficaz para obter resultados desejados.

Como um exemplo não-limítante, tratamento de seres humanos ou animais pode ser fornecido como uma dosagem única ou periódica de pelo menos um anticorpo da presente invenção 0,1 a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9,1,0,1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13,14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em pelo menos um de dia 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40, ou alternativamente ou adicionalmente, pelo menos uma de semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11,12, 13,14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, ou 52, ou alternativamente ou adicionalmente, pelo menos um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, ou 20 anos, ou qualquer combinação disso, usando doses únicas, de infusão ou repetidas.

Formas de dosagens (composição) adequadas para administra- ção interna geralmente contém de aproximadamente 0,1 miligrama a cerca de 500 miligramas de ingrediente ativo por unidade ou recipiente. Nestas composições farmacêuticas o ingrediente ativo ordinariamente estará presente em uma quantidade de aproximadamente 0,5-99,999% em peso baseado no peso total da composição.

Para administração parenteral, o anticorpo pode ser formulado como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação, ou separadamente fornecido, com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e albumina de soro humano 1-10%. Lipossomas e veículos não-aquosos tais como óleos fixos podem também ser usados. O veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantém isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e preservativos). A formulação é esterilizada por técnicas conhecidas ou adequadas.

Veículos farmacêuticos adequados estão descritos na maioria das edições recentes de Remington’s Pharmaceutical Sciences, A, Osol, um texto de referência padrão neste campo.

Administração Alternativa Muitos modos conhecidos e desenvolvidos podem ser usados de acordo com a presente invenção para administrar quantidades farmaceuticamente eficazes de pelo menos um anticorpo anti-IL-12 de acordo com a presente invenção. Enquanto administração pulmonar é usada na descrição seguinte, outros modos de administração podem ser usados de acordo com a presente invenção com resultados adequados.

Anticorpos IL-12 da presente invenção podem ser distribuídos em um veículo, como uma solução, emulsão, colóide, ou suspensão ou como um pó seco, usando qualquer um de uma variedade de dispositivos e métodos adequados para administração por inalação ou outros modos descritos aqui dentro ou conhecidos na técnica.

Formulações Parenterais e Administração Formulações para administração parenteral podem conter como excipientes comuns água ou solução salina estéril, polialquileno glicóis tais como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e outros mais. Suspensões aquosas ou oleosas para injeção podem ser preparadas usando um emulsificador ou umectante apropriado e um agente de suspensão, de acordo com métodos conhecidos. Agentes para injeção podem ser um agente de diluição não-tóxico, não oralmente administrável tal como solução aquosa ou uma solução ou suspensão injetável estéril em um solvente, Como o veículo ou solvente usável, água, solução de Ringer, solução salina isotônica, etc. são permitidos; como um solvente ordinário, ou solvente de suspensão, óleo não-volátil estéril pode ser usado. Para estes propósitos, qualquer tipo de óleo não-volátil e ácido graxo podem ser usados, incluindo óleos graxos ou ácidos graxos naturais ou sintéticos ou semi-sintéticos; mono- ou di- ou triglicerídios naturais ou sintéticos ou semi-sintéticos. Administração parenteral é conhecida na técnica e inclui, mas não é limitada a, meios convencionais de injeções, um dispositivo de injeção sem agulha pressurizado a gás como descrito em Patente U.S. Ne 5.851.198, e um dispositivo perfurador a laser como descrito em em Patente U.S. N9 5.839.446 inteiramente incorporados aqui por referência.

Distribuição Alternativa A invenção além disso refere-se à administração de pelo menos um anticorpo antí-IL-12 por parenteral, subcutâneo, intramuscular, intraveno-sa, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartila-ginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intra-cólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocardial, intra-osteal, intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retinal, intra-espinhal, intra-sinovíal, intratorácica, intra-uterina, intravesical, bólus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou transdérmica. Pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-12 pode ser preparada para uso para parenteral (subcutâneo, intramuscular ou intravenoso) ou qualquer outra administração particular na forma de soluções ou suspensões líquidas; para uso em administração vaginal ou retal particularmente em formas semi-sólidas tais como, mas não- limitadas a, cremes e supositórios; para administração bucal, ou sublingual tal como, mas não-limitada a, na forma de comprimidos ou cápsulas; ou in-tranasalmente tal como, mas não-limitado a, forma de pós, gotas nasais,ou aerossóis ou certos agentes; ou transdermicamente tais como mas não-limitado a um gel, ungüento, loção, suspensão ou sistema de distribuição de emplastro com realçadores químicos tais como dimetil sulfóxido para ou modificar a estrutura da pele ou para aumentar a concentração de droga no emplastro transdérmico (Junginger, e outros, Em “Drug Permeation Enhan-cement", Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcei Dekker, Inc. New York 1994, inteiramente incorporada aqui por referência), ou com agentes oxidantes que permitem a aplicação de formulações contendo proteínas e peptídeos na pele (WO 98/53847), ou aplicações de campos elétricos para criar caminhos de transporte transitórios tais como eletroporação, ou para aumentar a mobilidade de drogas carregadas através da pele tal como iontoforese, ou aplicação de ultra-som tal como sonoforese (Patentes US NQS 4.309.989 e 4.767.402) (as publicações e patentes acima sendo inteiramente incorporadas aqui por referência).

Administração Puímonar/Nasal Para administração pulmonar, preferivelmente pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-12 é distribuída em um tamanho de partícula eficaz para alcançar as vias aéreas inferiores do pulmão ou sinos. De acordo com a invenção, pelo menos um anticorpo anti-IL-12 pode ser distribuído por qualquer uma das variedades de dispositivos de inalação ou nasais conhecidos na técnica para administração de um agente terapêutico por inalação. Estes dispositivos capazes de depositar formulações aerolisadas na cavidade do sino ou alvéolos de um paciente incluem inaladores de dose medida, nebulizadores, geradores de pó secos, pulverizadores e outros mais. Outros dispositivos adequados para direcionar a administração pulmonar ou nasal de anticorpos são também conhecidos na técnica. Todos tais dispositivos podem usar de formulações adequadas para a administração da dispersão de anticorpo em um aerossol. Tais aerossóis podem ser compreendidos de ou soluções (ambas aquosas e não-aquosas) ou partícula sóli- das. Inaladores de dose medida como o inalador de dose medida Ventolin®, tipicamente usa um gás propulsor e exige atuação durante inspiração (Veja, por exemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Inaladores de pó seco como Turbuhaler® (Astra), Rotahalei® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inalador Spiros® (Dura), dispositivos vendidos por Inhale Therapeutics, e o inalador de pó Spinhaler® (Fisons), atuação por respiração de um pó misto (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra. WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, inteiramente incorporados aqui por referência). Nebulizadores como AERx® Aradigm, o nebulizador Ultraveni® (Mallinckrodt), e o nebulizador Acom II® (Marquest Medicai Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), as referências acima inteiramente incorporadas aqui por referência, produzem aerossóis de soluções, enquanto inaladores de doses medidas, inaladores de pó seco, etc. geram aerossóis de partícula pequena. Estes exemplos específicos de dispositivos de inalação comercialmente disponíveis são pretendidos a serem um representativo de dispositivos específicos adequados para a prática desta invenção, e não são pretendidos como limitando o objetivo da invenção. Preferivelmente, uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo anti-IL-12 é distribuído por um inalador de pó seco ou um pulverizador. Existem vários aspectos desejáveis de um dispositivo de inalação para administrar pelo menos um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, distribuição pelo dispositivo de inalação é vantajosamente seguro, reproduzível e preciso. O dispositivo de inalação pode opcionalmente distribuir partículas secas pequenas, por exemplo, menos do que aproximadamente 10 pm, preferivelmente aproximadamente 1-5 pm, para boa respirabilidade.

Administração de Composições de anticorpo IL-12 como um Pulverizador Uma pulverização incluindo proteínas de composição de anticorpo IL-12 pode ser produzida forçando uma suspensão ou solução de pelo menos um anticorpo anti-IL-12 através de um bocal sob pressão. O tamanho e configuração do bocal, a pressão aplicada, e a taxa de alimentação líquida pode ser escolhida para alcançar a saída desejada em tamanho de partícula. Uma eletropulverização pode ser produzida, por exemplo, por um campo elétrico em conjunção com um capilar ou alimentação do bocal. Vantajosamente, partículas de pelo menos uma proteína de composição de anticorpo anti-lL-12 distribuída por um pulverizador têm um tamanho de partícula menor do que aproximadamente 10 μιτι, preferivelmente no limite de aproximadamente 1 pm a cerca de 5 μιτι, e mais preferivelmente aproximadamente 2 pm a cerca de 3 μιτι.

Formulações de pelo menos uma proteína de composição de anticorpo anti-IL-12 adequada para uso com um pulverizador tipicamente incluem proteína de composição de anticorpo em uma solução aquosa em uma concentração de aproximadamente 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos uma proteína de composição de anticorpo anti-IL-12 por ml de solução ou mg/gm, ou qualquer limite ou valor disso, por exemplo, mas não-limitado a, 0,1, 0,2, 0,3,0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40,45, 50,60,70, 80, 90 ou 100 mg/ml ou mg/gm. A formulação pode incluir agentes tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um preservativo, um tensoativo, e preferivelmente, zinco. A formulação pode também incluir um excipiente ou agente para estabilização da proteína de composição do anticorpo, tal como um tampão, um agente redutor, uma proteína de volume, ou um carboidrato. Proteínas volumosas úteis em formular proteínas de composição de anticorpo incluem albumina, protamina, ou outras mais. Carboidratos típicos úteis em formular proteínas de composição de anticorpo incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose, ou outros mais. A formulação de proteína de composição de anticorpo pode também incluir um tensoativo, o qual pode reduzir ou prevenir agregação induzida por superfície da proteína de composição do anticorpo gerada por atomização da solução em formação de um aerossol. Vários tensoatívos convencionais podem ser empregados, tais como ésteres e álcoois de ácido graxo de polioxietileno, e ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitol. Quantidades geralmente variarão entre 0,001 e 14% em peso da formulação. Tensoatívos especialmente preferidos para propósitos desta invenção são monooleato de polioxietileno sorbitano, polissorbato 80, polissorbato 20, ou outros mais. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína tal como anticorpos IL-12, ou porções ou variantes especificadas, podem também ser incluídos na formulação.

Administração de composições de anticorpos IL-12 por um Nebulizador Proteína de composição de anticorpo pode ser administrada por um nebulizador, tal como nebulizador a jato ou um nebulizador ultra-sônico. Tipicamente, em um nebulizador a jato, uma fonte de ar comprimido é usada para criar um jato de ar de alta velocidade através de um orifício. Conforme o gás expande além do bocal, uma região de baixa pressão é criada, a qual puxa uma solução de proteína de composição de anticorpo através de um tubo capilar conectado a um reservatório líquido. A corrente líquida do tubo capilar é divida em filamento instáveis e gotas conforme ele sai do tubo, criando o aerossol. Um limite de configurações, taxas de fluxo, e tipos de anteparos podem ser empregados para alcançar as características de desempenho desejadas de um dado nebulizador a jato. Em um nebulizador ultra-sônico, energia elétrica de alta freqüência é usada para criar energia vibracio-nal, mecânica, tipicamente empregando um transdutor piezelétrico. Esta energia é transmitida à formulação de proteína de composição de anticorpo ou diretamente ou através de um fluido de acoplagem, criando um aerossol incluindo a proteína de composição de anticorpo, Vantajosamente, partículas de proteína de composição de anticorpo distribuídas por um nebulizador têm um tamanho de partícula menor do que aproximadamente 10 pm, preferivelmente no limite de aproximadamente 1 pm a cerca de 5 pm, e mais preferivelmente aproximadamente 2 pm a cerca de 3 pm.

Formulações de pelo menos um anticorpo anti-IL-12 adequado para uso com um nebulizador, ou a jato ou ultra-sônico, tipicamente incluem uma concentração de aproximadamente 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos uma proteína de anticorpo anti-IL-12 por ml de solução. A formulação pode incluir agentes tais como um excipiente, um tampão, um agente isotô-nico, um preservativo, um tensoativo, e, preferivelmente, zinco. A formulação pode também incluir um excipiente ou agente para estabilização da pelo menos uma proteína de composição do anticorpo anti-IL-12, tal como um tampão, um agente redutor, uma proteína de volume, ou um carboidrato. Proteínas volumosas úteis em formular pelo menos uma proteína de composição do anticorpo anti-IL-12 incluem albumina, protamina, ou outras mais. Carboidratos típicos úteis em formular pelo menos uma proteína de composição do anticorpo anti-IL-12 incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose, ou outros mais. A pelo menos uma formulação de anticorpo anti-IL-12 pode também incluir um tensoativo, o qual pode reduzir ou prevenir agregação induzida por superfície do pelo menos um anticorpo anti-IL-12 gerado por atomização da solução em formação de um aerossol. Vários tensoativos convencionais podem ser empregados, tais como ésteres e álcoois de ácido graxo de polioxietileno, e ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitol. Quantidades geralmente variarão entre 0,001 e 4% em peso da formulação. Tensoativos especialmente preferidos para propósitos desta invenção são monooleato de polioxietileno sorbitano, polissorbato 80, poíissorbato 20, ou outros mais. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína tal como proteína de anticorpo podem também ser incluídos na formulação.

Administração de composições de anticorpo IL-2 oor um Inalador de Dose Medida Em um inalador de dòse medida (MDI), um propulsor, pelo menos um anticorpo anti-IL-12, e quaisquer excipientes ou outros aditivos estão contidos em uma caixa como uma mistura incluindo um gás comprimido liquefeito, Atuação da válvula de metragem libera a mistura como um aerossol, preferivelmente contendo partículas no limite de tamanho de menos do que aproximadamente 10 pm, preferivelmente no limite de aproximadamente 1 pm a cerca de 5 pm, e mais preferivelmente aproximadamente 2 pm a cerca de 3 pm. O tamanho de partícula de aerossol desejada pode ser obtido empregando uma formulação de proteína de composição de anticorpo por vários métodos conhecidos àqueles versados na técnica, incluindo moagem a jato, secagem por atomização, condensação de ponto crítico, ou outros mais. Inaladores de dose medida preferidos incluem àqueles produzidos por 3M ou Glaxo e empregando um propulsor de hidrofluorocarbono.

Formulações de pelo menos um anticorpo anti-IL-12 para uso como um dispositivo de inalador de dose medida geralmente incluirá um pó finamente dividido contendo pelo menos um anticorpo anti-IL-12 como uma suspensão em um meio não-aquoso, por exemplo, suspenso em um propulsor com o auxílio de um tensoativo, O propulsor pode ser qualquer material convencional empregado para este propósito, tal como clorofluorocarbono, um hidroclorofIuorocarbono, um hidrofluorocarbono, ou um hidrocarbono, incluindo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluoroalcano-134a), HFA-227 (hi-drofluoroalcano-277) ou outros mais. Preferivelmente o propulsor é um hidrofluorocarbono. O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar o pelo menos um anticorpo anti-IL-12 como uma suspensão no propulsor, para proteger o agente ativo contra degradação química, e outros mais. Tensoati-vos adequados incluem trioleato de sorbitano, lecitina de soja, ácido oléico, ou outros mais. Em alguns casos aerossóis de solução são preferidos usando solventes tais como etanol. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína tal como proteína podem também estar incluídos na formulação.

Um versado na técnica reconhecerá que os métodos da invenção corrente podem ser alcançados por administração pulmonar de pelo menos uma composição de anticorpo anti-IL-12 via dispositivos não descritos aqui, Formulações e Administração Oral Formulações orais contam com a co-administração de auxiliares (por exemplo, resorcinóis e tensoativos não-iônicos tais como oleil éter de polioxietileno e éter n-hexadecilpoííetileno) para aumentar artificialmente a permeabilidade das paredes intestinais, bem como a co-administração de inibidores enzimáticos (por exemplo, inibidores de tripsina pancreáticos, diiso-propiIfIuorofosfato (DFF) e trasilol) para inibir degradação enzimática. O composto constituinte eficaz da forma de dosagem do tipo sólida para administração oral pode ser misturado com pelo menos um aditivo, incluindo sa-carose, lactose, celulose, manitol, trealose, rafinose, maltitol, dextrano, ami- dos, ágar, arginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma de tragacanto, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sintético ou semi-sintético, e glicerídeo. Estas formas de dosagens podem também conter outro tipo(s) de aditivos, por exemplo, agente de diluição inativo, lubrificante tal como estearato de magnésio, parabeno, agente preservativo, tal como ácido sórbico, ácido ascórbico, alfa-tocoferol, antioxldante tal como cisteína, desintegrador, aglutinante, espessante, agente de tamponamento, agente adoçante, agente aromatizante, agente de perfume, etc.

Comprimidos e pílulas podem ser além disso processados em preparações revestidas entéricas. As preparações líquidas para administração oral incluem emulsão, xarope, elixir, suspensão e preparações de solução permissíveis para uso médico. As preparações podem conter agentes de diluição inativos ordinariamente usados em dito campo, por exemplo, água. Lipossomas foram também descritos como sistemas de distribuição de droga para insulina e heparina (Patente U.S. Ns 4.239.754). Mais recentemente, microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos mistos (protei-nóides) foram usadas para distribuir produtos farmacêuticos (Patente U.S. N2 4.925.673). Além do mais, compostos veículos descritos em Patente U.S. N2 5.879.681 e Patente U.S. NQ 5.5.871.753, são usados para distribuir agentes biologicamente ativos oralmente são conhecidos na técnica. Formulações e Administração Mucosais Para absorção através de superfícies mucosais, composições e métodos de administrar pelo menos um anticorpo anti-IL-12 incluem uma emulsão compreendendo uma pluralidade de partículas de submícron, uma macromolécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo, e uma fase contínua aquosa, a qual promove absorção através de superfícies mucosais alcançando mucoadesão das partículas de emulsão (Patente US N2 5.514.670). Superfícies mucosas adequadas para aplicação das emulsões da presente invenção podem incluir rotas de administração corneal, conjuntival, bucal, subingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomáquica, intestinal e retal. Formulações para administração vaginal ou retal, por exemplo supositórios, podem conter como excipientes, por exemplo, polialquilenoglicóis, vaselina, mantei- ga de cacau, e outros mais. Formulações para administração intranasal podem ser sóiidas e conter como excipientes, por exemplo, lactose ou podem ser soluções aquosas ou oleosas de gotas nasais. Para excipientes de administração bucal incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinado e outros mais (Patente U.S. N2 5.849.695). Formulações e Administração Transdérmicas Para administração transdérmica, o pelo menos um anticorpo anti-IL-12 é encapsulado em um dispositivo de distribuição tal como um li-possoma ou nanopartículas poliméricas, micropartícula, microcápsula, ou microesferas (referidas coletivamente como micropartículas a não ser de outro modo estabelecido). Vários dispositivos adequados são conhecidos, incluindo micropartículas feitas de polímeros sintéticos tais como ácidos po-lihidróxi tais como ácido polilático, ácido poliglicólico e copolímeros disso, poliortoésteres, polianidridos, e polifosfazenos, e polímeros naturais tais como colágeno, poliaminoácidos, albumina e outras proteínas, alginato e outros polissacarídeos, e combinações disso (Patente US Ne 5.814.599). Administração Prolongada e Formulações Pode ser algumas vezes desejável distribuir os compostos da presente invenção ao indivíduo sobre períodos de tempo prolongados, por exemplo, por períodos de uma semana a um ano proveniente de uma administração única. Várias formas de dosagem de depósito ou implante de liberação lenta podem ser utilizadas. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não-tóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos que tem um grau baixo de solubilidade em fluidos corporais, por exemplo, (a) um sal de adição ácido com um ácido polibásico tal como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartático, ácido tânico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos nafíaleno mono- ou dissulfônicos, ácido poligalacturônico, e outros mais; (b) um sal com um cátion metálico poliva-lente tal como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio, e outros mais, ou com um cátion orgânico formado a partir de por exemplo, Ν,Ν’-dibenzil-etilenodiamina ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b) por exemplo sal de tanato de zinco. Adicional- mente, os compostos da presente invenção ou, preferivelmente um sal relativamente solúvel tal como aqueles já descritos podem ser formados em um gel, por exemplo um gel de monoestearato de alumínio com, por exemplo, óleo de gergelim, adequados para injeção. Sais particularmente preferidos são sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato, e outros mais. Outro tipo de formulação de depósito de liberação lenta para injeção conteria o composto ou sal disperso para encapsulado em um polímero de degradação lenta, não-tóxico, não-antigênico tal como um polímero de ácido poliláti-co/ácido poliglicólico por exemplo como descrito em Patente U.S. N2 3.773.919. Os compostos ou, preferivelmente, sais relativamente solúveis tais como aqueles descritos acima podem também ser formulados em péletes silásti-cos de matriz de colesterol, particularmente para uso em animais. Formulações de depósito ou implante de liberação lenta, por exemplo lipossomas gasosos ou líquidos são conhecidos na literatura (Patente US H- 5.770.222 e "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcei Dekker, Ιηα, N.Y., 1978).

Tendo geralmente descrito a invenção, o mesmo será mais prontamente compreendido por referência aos exemplos seguintes, os quais são fornecidos por via de ilustração e não são pretendidos como limitantes. (TRECHO FALTANDO NO MOMENTO DA PUBLICAÇÃO DO PED. PCT CORRESPONDENTE) O vetor pC4 é usado para a expressão de anticorpo IL-12. Plas-mídeo pC4 é um derivado do plasmídeo pSV2-dhfr (N9 de Acesso ATCC 37146). O plasmídeo contém o gene DHFR de camundongo sob controle do promotor precoce SV40. Células de ovário de hasmter Chinês ou outras necessitando de atividade de dihidrofoiato que são transfectadas com estes plasmídeos podem ser selecionadas cultivando as células em um meio seletivo (por exemplo, alfa MEM negativo, Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado com o metotrexato de agente quimioterapêutico. A amplificação dos genes DHFR em células resistentes a metotrexato (MTX) foi bem-documentada (veja, por exemplo, F. W. Alt, e outros, J. Biol. Chem. 253:13571370 (1978); J. L. Hamlin e C. Ma, Biochem, et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); e M. J. Page e Μ. A, Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Células cultivadas em concentrações crescentes de MTX desenvolvem resistência a droga superproduzíndo a enzima alvo, DHFR, como um resultado de amplificação de gene DHFR. Se um segundo gene é ligado ao gene DHFR, é geralmente co-amplificado e superexpresso. É conhecido na técnica que esta aproximação pode ser usada para desenvolver linhas de células transportando mais do que 1.000 cópias do(s) gene(s) amplificado(s). Sub-seqüentemente, quando o metotrexato é retirado, linhas de células são obtidas as quais contém o gene amplificado integrado em um ou mais cromossomas da célula hospedeira.

Plasmídeo pC4 contém, para expressar o gene de interesse, o promotor forte da repetição terminal longa (LTR) do Vírus de Rous Sarcoma (Cullen, e outros, Molec. Cell. Biol.5:438-447 (1985)) mais um fragmento isolado o acentuador do gene precoce imediato de citomegalovírus humano (CMV) (Boshart, e outros, Cell 41:521-530 (1985)). A montante do promotor são sítios de divisão de enzima de restrição de BamHI, Xbal, e Asp718 que permitem integração dos genes. Por trás destes sítios de clonagem o plasmídeo contem o íntron 3’ e sítio de poliadenilação do gene pré-pró-insulina. Outros promotores de alta eficiência podem também ser usados para a expressão, por exemplo, o promotor de b-actina humano, os promotores precoce e tardio de SV40 ou as repetições terminais longas de outros retrovírus, por exemplo, HIV e HTLVI. Sistemas de expressão de gene Tet-off e Tet-on de Clontech e sistemas similares podem ser usados para expressar o IL-12 em um modo regulado em células de mamífero (M. Gossen, e H. Bujard, Proc. Natl. Acad, Sei. USA 89:5547-5551 (1992)). Para a poliadenilação do mRNA outros sinais, por exemplo do hormônio de crescimento humano ou genes de globina podem ser usados igualmente. Linhas de células estáveis carreando um gene de interesse integrado nos cromossomas podem também ser selecionadas em co-transfecção com um marcador selecionável tal como gpt, G418 ou higromicina. É vantajoso usar mais do que um marcador selecionável no começo, por exemplo G418 mais metotrexato. O plasmídeo pC4 é digerido com enzimas de restrição e então desfosforilado usando fosfatase intestinal de bezerro por procedimentos conhecidos na técnica. O vetor é então isolado de um gel de agarose 1%. A sequência de DNA codificando o anticorpo IL-12 completo é usada, por exemplo, conforme apresentado em SEQ ID N2s: SEQ ID 1 DE INSERÇÃO MAB AA, e SEQ ID NQ 2 DE INSERÇÃO MAB AA, correspondendo a regiões variáveis HC e LC de um anticorpo IL-12 da presente invenção, de acordo com etapas de métodos conhecidos. Ácido nucléico isolado codificando uma região constante humana adequada (isto é, regiões HC e HL) é também usado neste constructo (por exemplo, como fornecido em vetor p1351: NÚMERO DE ACESSO ATCC DE INSERÇÃO E plasmídeos HC/LC ADICIONAL) A região variável e constante isolada codificando DNA e o vetor desfosforilado são então ligados com T4 DNA ligase. Células HB101 ou XL-1 Azul de E. coll são então transformadas e bactérias são identificadas as quais contém o fragmento inserido em plasmídeo pC4 usando, por exemplo, análise de enzima de restrição. Células de ovário de hamster Chinês (CHO) necessitando de um gene DHFR ativo são usados para transfecção. 5 g do plasmídeo pC4 de expressão é co-transfectada com 0,5 g do plasmídeo pSV2-neo usando li-pofectina. O plasmídeo pSV2neo contém um marcador selecionável dominante, o neo gene de Tn5 codificando uma enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos incluindo G418. As células são semeadas em alfa MEM negativo suplementado com 1 g/ml de G418, Após 2 dias, as células são tripsinadas e semeadas em placas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) em alfa MEM negativo suplementado com 10, 25, ou 50 ng/ml de metotrexato mais 1 g/ml de G418. Após aproximadamente 10-14 dias clones simples são tripsinados e então semeados em placas de Petri de 6 cavidades ou frascos de 10 ml usando concentrações diferentes de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Clones cultivando nas concentrações mais altas de metotrexato são então transferidos a novas placas de 6 cavidades contendo ainda concentrações maiores de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). O mesmo procedimento é repetido até que clones sejam obtidos que crescem em uma concentração de 100 - 200 mM. Expressão do produto de gene desejado é analisada, por exemplo, por SDS-PAGE e de Western blot ou por análise de HPLC de fase reversa.

Exemplo 2: Geração de Anticorpos Monoclonais IgG Humano de alta Afinidade Reativos Com IL-12 Humano Usando Camundongos Transgê-nicos Sumário Camundongos transgênicos foram usados os quais contém genes de imunoglobulína de cadeia pesada e cadeia leve para gerar anticorpos monoclonais, de alta afinidade, completamente humanos que podem ser usados terapeuticamente para inibir a ação de IL-12 para o tratamento de uma ou mais doenças mediadas por IL-12. Camundongos híbridos (CBA/J x C57/BL6/J) F2 contendo transgenes de anticorpo de região variável e constante humanos para ambas cadeias pesadas e leves são imunizados com IL-12 recombinante humano-(Taylor e outros, Intl. Immunol. 6:579-591 (1993)); Lonberg, e outros Nature 368:856-859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14:826 (1996); Fishwild, e outros, Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)). Diversas fusões renderam um ou mais painéis de anticorpos monoclonais IgG reativos de IL-2 completamente humano. Os anticorpos anti-IL-12 completamente humanos são além disso caracterizados. Todos são lgG1. Tais anticorpos são encontrados a terem afinidades cmslantes em alguma parte entre 1 x 109 e 9 x 10f2. As afinidades ínesperadamente altas destes anticorpos monoclonais completamente humano torna-os candidatos adequados para aplicações terapêuticas em doenças, patologias ou distúrbios relacionados a IL-12.

Abreviações BSA - albumina de soro bovino C02 - dióxido de carbono DMSO - dimetil sulfóxido EIA - imunoensaio de enzima FBS - soro bovino fetal H202 - peróxido de hidrogênio HRP - peroxidase de rábano silvestre ID - intradérmico Ig - imunoglobulina IL-12 - interleucina-12 IP - intraperitoneal IV - intravenoso Mab * anticorpo monoclonal OD - densidade ótica OPD - dicloridrato de o-fenilenodiamina PEG - polietileno glicol PSA - penicilina, estreptomicina, amfotericina TA - temperatura ambiente SQ - subcutânea v/v - volume por volume p/v - peso por volume Materiais e Métodos Animais Camundongos transgênicos que podem expressar anticorpos humanos são conhecidos na técnica (e estão comercialmente disponíveis (por exemplo, de GenPharm International, San Jose, CA; Abgenix, Free-mont, CA, e outros) que expressam imunoglobuiinas humanas mas não IgM ou Ig de camundongo. Por exemplo tais camundongos transgênicos contém transgenes de sequência humana que suportam união ed V(D)J, mudança de classe de cadeia pesada, e mutação somática para gerar um repertório de imunoglobuiinas de seqüência humana (Lonberg, e outros, Nature 368:856-859 (1994)). O transgene de cadeia leve pode ser derivado, por exemplo, em parte de um clone de cromossoma artificial de levedura que inclui próximo à metade da região V humana de linha de germe. Além disso, o transgene de cadeia pesada pode codificar ambos humana μ ou humana 1 (Fishwild, e outros, Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)) e/ou 3 regiões constantes. Camundongos derivados de linhagens genótipas apropriadas podem ser usados nos processos de imunização e fusão para gerar anticor- pos monoclonais completamente humanos a IL-12.

Imunização Uma ou mais relações de imunização podem ser usadas para gerar os hibridomas humanos anti-IL-12. As primeiras diversas fusões podem ser executadas após o protocolo de imunização exemplar seguinte, mas outros protocolos conhecidos similares podem ser usados. Camundon-gos fêmeas e/ou machos transgênicos cirurgicamente castrados de 14-20 semanas de idade são imunizados IP e/ou ID com 1-1000 pg de 11.-12 humano recombinante emulsificado com um volume igual de TITERMAX ou adjuvante de Freund completo em um volume final de 100-400μΙ_ (por exemplo, 200). Cada camundongo pode também opcionalmente receber 110 pg em 100 pL de solução salina fisiológica em cada um dos 2 sítios SQ. Os camundongos podem então ser imunizados 1-7, 5-12,10-18,17-25 e/ou 21-34 dias após IP (1-400 pg) e SQ (1-400 pg x 2) com IL-2 emulsificado com um volume igual de TITERMAX ou adjuvante de Freund incompleto. Camundongos podem ser sangrados 12-25 e 25-40 dias após punção retro-orbital sem anticoagulante. O sangue é então permitido coagular à TA por uma hora e o soro é coletado e titulado usando um ensaio EIA de IL-12 de acordo com métodos conhecidos. Fusões são executadas quando injeções repetidas não provocam títulos a aumentarem. Naquela hora, aos camundongos podem ser dados uma injeção intensificadora IV final de 1-400 pg IL-12 diluída em 100 pL de solução salina fisiológica. Três dias depois, os camundongos podem ser eutanizados por deslocamento cervical e os baços removidos assepticamente e imersos em 10 mL de solução salina tampona-da de fosfato fria (PBS) contendo 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de e$-treptomicina, e 0,25 pg/mL de anfoterícina B (PSA). Os esplenócitos são colhidos esterilmente borrifando o baço com PSA-PBS. As células são lavadas uma vez em PSA-PBS frio, contadas usando exclusão de tintura azul de Trypan e ressuspensas em meios de RPM11640 contendo 25 mM de Hepes. Fusão Celular Fusão pode ser realizada a razão de 1:1 a 1:10 de células de mieloma de murino a células do baço viáveis de acordo com métodos co- nhecidos, por exemplo, como conhecido na técnica. Como um exemplo não-limitante, células do baço e células de mieloma podem ser peletizados juntas. O pélete pode então ser lentamente ressuspenso, durante 30 segundos, em 1mL de 50% (p/v) de solução de PEG/PBS (peso molecular de PEG, 1.450, Sigma) a 37 C. A fusão pode então ser parada lentamente adicionando 10,5 mL de meio RPMI 1640 contendo 25 mM de Hepes (37 C) durante 1 minuto. As células fundidas são centrifugadas por 5 minutos a 500 -1500 rpm. As células são então ressuspensas em meio HAT (meio 1640 RPMI contendo 25 mM de Hepes, 10% de soro de Clone I Fetal (Hyclone), 1mM de piruvato de sódio, 4 mM de L-glutamina, 10 pg/mL de gentamicina, 2,5% de suplemento de cultura de Origen (Fisher), 10% de meios de RPMI 1640/Hepes condicionado a 653, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 100 μΜ de hipoxantina, 0,4 μΜ de aminopterina, e 16 μΜ de timidina) e então colocado em placa a 200 pL/cavidade em quinze placas de cultura de tecido de fundo plano de 96 cavidades. As placas são então colocadas em um incubador a 37 C umidificado contendo 5% de CO2 e 95% de ar por 7-10 dias.

Detecção de Anticorpos Anti-IL-12 laG Humano em Soro de Camundonqo EIA de fase sólida pode ser usado para peneirar soros de ca-mundongos para anticorpos IgG humanos específicos para IL-12 humano. Resumidamente, placas podem então ser revestidas com IL-12 a 2 pg/mL em PBS por toda a noite. Após lavagem em solução salina 0,15 M contendo 0,02% (v/v) de Tween 20, as cavidades podem ser bloqueadas com 1% (p/v) de BSA, 200 pL/cavidade por 1 hora à TA. Placas são usadas imediatamente ou congeladas a -20 C para uso futuro. Diluições de soro do camun-dongo são incubadas nas placas revestidas com IL-12 a 50 pL/cavidade à TA por 1 hora. As placas são lavadas e então sondadas com 50pL/cavidade de IgG anti-humano de cabra rotulado por HRP, Fc específico diluído 1:30.000 em 1% de BSA-PBS por 1 hora à TA. As placas podem novamente ser lavadas e 100 pL/cavidade da solução de substrato de citrato-fosfato (ácido cítrico 0,1 M e fosfato de sódio 0,2M, H2O2 0,01% e 1 mg/mL de OPD) é adicionado por 15 minutos à TA. Solução de parada (ácido sulfúrico 4N) é então adicionada a 25 pL/cavidade e os OD são lidos a 490 nm via um es- pectrofotômetro de placa automatizado.

Detecção de Imunoglobulinas Completamente Humanas em Sobrenadantes de Hibridoma Hibridomas positivos crescentes secretando imunoglobulinas completamente humanas podem ser detectados usando um EIA adequado. Brevemente, placas ejetáveis de 96 cavidades (VWR, 610744) podem ser revestidas com 10 μ9/π1 de IgG FC anti-humano de cabra em tampão de carbonato de sódio durante a noite 4 C. As placas são lavadas e bloqueadas com BSA-PBS 1 % por uma hora a 37°C e usadas imediatamente ou congeladas a -20C. Sobrenadantes de hibridoma não-diluídos são incubados nas placas por uma hora a 37°C. As placas são lavadas e sondadas com capa anti-humano de cabra rotulado por HRP diluído 1:10,000 em BSA-PBS 1% por uma hora a 37°C. As placas são então incubadas com solução de substrato como descrito acima.

Determinação de Reatividade Anti-IL-12 Completamente Humana Hibridomas, como acima, podem ser simultaneamente analisadas por reatividade a IL-12 usando uma RIA adequado ou outro ensaio. Por exemplo, sobrenadantes são incubados em placas de IgG Fc anti-humano de cabra como acima, lavadas e então sondadas com IL-12 radiorrotulado com contagens apropriadas por cavidade por 1 hora à TA. As cavidades são lavadas duas vezes com PBS e IL-12 radiorotulado ligado é quantificado usando uma contador adequado.

Hibridomas de secreção de anti-IL-12 de lgG1 humano podem ser expandidos em cultura de célula e serialmente clonados limitando diluição. As populações clonais resultantes podem ser expandidas e criopreser-vadas em meio de congelamento (95% de FBS, 5% de DMSO) e armazenadas em nitrogênio líquido.

Isotipaaem Determinação de isótipo dos anticorpos pode ser realizada usando um EIA em um formato similar àqueles usados para peneirar os soros imunológicos de camundongos por títulos específicos. IL-12 pode ser revestido em placas de 96 cavidades como descrito acima e anticorpo purifi- cado a 2pg/mL pode ser incubado na placa por uma hora à TA. A placa é lavada e sondada com IgGi anti-humano de cabra rotulado por HRP ou lgG3 anti-humano de cabra rotulado por HRP diluído a 1:4000 em BSA-PSB 1% por uma hora à TA. A placa é novamente lavada e incubada com solução de substrato como descrito acima.

Cinéticas de Aglutinação de Anticorpos IL-12 Anti-Humanos Humanos com IL-12 Humano Características aglutinantes para anticorpos podem ser adequadamente taxadas usando um EIA de captura de IL-12 e tecnologia de BIAco-re, por exemplo. Concentrações graduadas de anticorpos IL-12 humano purificados podem ser taxados por aglutinação a placas EIA revestidas com 2μg/mL de IL-12 em ensaios como descritos acima. O OD pode ser então apresentado como mapas de semilog mostrando eficiências de aglutinação relativa.

Constantes de aglutinação quantitativas podem ser obtidas, por exemplo, como segue, ou por qualquer outro método conhecido. Um fragmento de CM-5 (carrboximetila) BIAcore é colocado em uma unidade de Bl-Acore 2000. Tampão HBS (0,01 M de HEPES, 0,15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005% v/v de tensoativo P20, pH 7,4) é inundado uma célula de fluxo do fragmento a 5 pL/minuto até uma linha de base estável ser obtida. Uma solução (100 pL) de 15 mg de EDC (cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetií-aminopropil)-carbodiimida) em 200 pL de água é adicionado a 100 pL de uma solução de 2,3 mg de NHS (N-hidroxissuccinimida) em 200 pL de água. Quarenta (40) pL da solução resultante é injetada no fragmento. Seis pL de uma solução de IL-12 humano (15 pg/mL em 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8) é injetada no fragmento, resultando em um aumento de cerca de 500 RU. O tampão é mudado a tampão de passagem TBS/Ca/Mg/BSA (20 mM Tris, 0,15 M de cloreto de sódio, 2 mM de cloreto de cálcio, 2 mM de acetato de magnésio, 0,5% de Triton X-100, 25 pg/mL de BSA, pH 7,4) e inundado o fragmento durante a noite para equilibrá-lo e para hidrolisar ou tamponar quaisquer ésteres de succinimida não-reagidos.

Anticorpos são dissolvidos no tampão de passagem a 33.33, 16.67, 8.33. e 4.17 η Μ. A taxa de fluxo é ajustada a 30 μΙ_Ληίη e a temperatura do instrumento a 25C. Duas células de fluxo são usadas para as passagens cinéticas, uma na qual IL-12 foi imobilizado (amostra) e uma segunda, célula de fluxo não-derivada (branco). 120 μί de cada concentração de anti-coro é injetada sobre as células de fluxo a 30 μΙ/min (fase associada) seguida por uns 360 segundos ininterruptos de fluxo de tampão (fase de dissociação). A superfície do fragmento é regenerada (complexo de interleucina-12/anticorpo dissociado) por duas injeções sequenciais de 30 μι de cada 2M de tiocianato de guanidina.

Análise dos dados é feita usando avaliação de BIA 3,0 ou CLAMP 2,0, como conhecido na técnica. Para cada concentração de anticorpo o sensograma de branco é subtraído do sensograma da amostra. Um ajuste global é feito para ambos dissociação («d s1) e associação (ka, mol'1 s'1) e a constante de dissociação (ko, mol) calculada (kd/ka). Onde a afinidade do anticorpo é alta suficiente que RUs de anticorpo capturado são >100, diluições adicionais do anticorpo são feitas.

Resultados e Discussão Geração de Anticorpos Monoclonaís IL-12 Anti-Humano Diversas fusões são executadas e cada fusão é semeada em 15 placas (1440 ca-vidades/fusão) as quais rendem diversas dúzias de anticorpos específicos para IL-12 humano, Destas, algumas são encontradas a consistir em uma combinação de cadeias Ig humana e de camundongo. Os hibridomas restantes secretam anticorpos anti-IL-12 consistindo somente em cadeias pesadas ou leves humanas. Dos hibridomas humanos todos são esperados a serem lgG1.

Cinéticas de Aglutinação de Anticorpos IL-12 Anti-Humano Humano Análises de ELISA conforma que anticorpo purificado da maioria ou todos destes hibridomas aglutinam IL-12 em um modo dependente da concentração. Figuras 1-2 mostram os resultados da eficiência de aglutinação relativa destes anticorpos. Neste caso, a avidez do anticorpo para seu antígeno cognato (epitopo) é medida. Deveria ser percebido que aglutinando IL-12 diretamente à placa EIA pode causar desnaturação da proteína e as afinidades de aglutinação aparentes não podem ser relativas de aglutinação a proteína não-desnaturada. Cinquenta por cento da aglutinação é encontrada sobre uma faixa de concentrações.

Constantes de aglutinação quantitativas são obtidas usando análise de BlAcore dos anticorpos humanos e revela que vários dos anticorpos monoclonais humanos são de afinidade muito alta com ko no limite de 1 x 10‘9a7x IO'12.

Conclusões Diversas fusões são executadas utilizando esplenócitos de ca-mundongos híbridos contendo transgenes de anticorpos de região variável e constante humana que são imunizados com IL-12 humano. Uma série de diversos anticorpos monoclonais IgG relativos a IL-12 completamente humano do isótipo lgG1 são gerados. Os anticorpos anti-IL-12 completamente humanos são além disso caracterizados. Vários dos anticorpos gerados têm afinidades constantes entre 1x109 e 9x1012. As afinidades inesperadamente altas destes anticorpos monoclonais completamente humanos tornam-os adequados para aplicações terapêuticas em doenças, patologias e condições relacionadas dependentes de IL-12.

Exemplo 3: C340 é um Anticorpo Monoclonal Humano Neutralizante A bioatividade de IL-12 foi mostrada a ser neutralizada por C340 em uma variedade de ensaios de atividade dependentes de IL-12. Já que IL-12 acentua produção de IFN GAMA por células NK e linfócitos T, o efeito de anticorpo C340 na regulação máxima de mRNA de IFN GAMA e o efeito de C340 na produção de proteína de IFN GAMA foi examinada (Trinchieri, G. Current Opiníon in Immunology, 9:17-23 (1997), Morris, S.C. e outros, Journal of Immunology, 152:1047-1056 (1994)). A capacidade de C340 neutralizar indução acionada de IL-12 de atividade de células assassinas ativadas por linfocina (LAK) foi também investigada nestes estudos (Kutza, J. e Mu-rasko, D.M., Mechanisms of Ageing and Development, 90:209-222 (1996), Stern, A. S., e outros, Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 87:6808-6812 (1990)). Finalmente, o efeito de C340 em regulação máxima mediada por IL-12 de expressão de superfície celular de CD95 em células T e NK foram testadas ((Medvedev, A. E., e outros, Cytokine, 9:394-404 (1997)).

Inibição de Transcrição de mRNA de IFN gama Para determinar se C340 inibe transcrição de gene IFN GAMA induzido por IL-12 IL-2 em PBL humano, um ensaio de transcrição reversa-PCR foi executado. Iniciadores específicos para β-actina (um controle para integridade e conteúdo de mRNA) e IFN GAMA foram usadas para amplificar o cDNA obtido de PBL humano estimulado. Figura 3 mostra C340 regulação mínima de mRNA de IFN GAMA em PBMC ativado por IL-12/IL-2 (2 horas). Inibição de IFN GAMA intracelular como Medido por Citometria de Fluxo Em resposta a vários sinais e como uma medição de ativação, células T e células NK podem ser introduzidas para secretar citocinas. Mais especificamente, PBL tratado com IL-2 e IL-12 inicia síntese substancial de IFN gama dentro de 4-8 horas após estimulação. Esta produção pode ser detectada no citoplasma de Brefe!din-A tratado com PBL por citometria de fluxo. Figura 4 demonstra uma redução de 60% em produção de IFN GAMA em tais culturas quando IL-12 de C340 foi adicionado em conjunção com IL-12 por cinco horas.

Inibição de Secreção de IFN GAMA induzida por IL-12 Figura 5 claramente mostra que dois lotes diferentes de C340 inibiu a secreção de IFN GAMA por linfócitos sangüíneos periféricos em um modelo dependente de dose. Quatrocentos picogramas de IL-12 foram pré-misturadas com quantidades variantes ed C340 e então adicionadas a culturas estimuladas por IL-2 de PBL. Quando IFN GAMA foi medido por EIA após uma incubação de 18-24 horas, quantidades acentuadamente diminuídas de IFN GAMA foram detectadas com tão pouco quanto 1?g/mL de anticorpo C340.

Inibição de Citotoxicidade de Célula LAK Induzida por IL-12 Células Raji, uma linha de célula derivada de linfoma de Burkitt sensível a IL-2, é uma célula NK resistente, linha de célula sensível a célula LAK. Células Raji, em triplicado, foram cultivadas por quatro horas com células LAK as quais foram ativadas com 400 pg/mL de IL-12 e 10 U/mL de IL-2 na presença ou ausência do anticorpo monoclonal humano C340 (5000 ng/mL ou 50 ng/mL). Figura 6 mostra os resultados dos três doadores saudáveis normais. Ativação de IL-12 + IL-2 de células efetuadoras resultadas em uma atividade citotóxica crescente sobre aquelas de células ativadas com IL-2 sozinha. O anticorpo C340 inibiu este efeito dependente de IL-12. A magnitude de inibição foi relacionada a concentração de anticorpo, com a maior concentração testada reduzindo citotoxicidade a níveis anteriores.

Inibição de Regulação Máxima de CD95 Relatórios descreveram regulação máxima induzida por IL-12 de CD95 na superfície de CD56+ PBL altamente purificado. Como pode ser visto em Figura 7A e 7B, análise citométrica de fluxo distribucional revelou que expressão de CD95 foi significantemente regulada ao máximo em células de CD3+ T e células de CD56+ NK após tratamento com IL-12 mais IL-2 por 72 horas. Tratamento de anti-IL-12 concomitante inibiu expressão de CD95 em ambas populações CD3+ e CD56+ foram inibidas por -50% (Figura 7A), ao passo que células CD56+ foram inibidas por -85% (Figura 7B), como evidenciado por uma índice MFI diminuído (porcentagem maior então controle não-estímulado).

Exemplo 4: Clonagem de Gene e Caracterização Fragmentos de DNA genômico contendo ou o gene de cadeia pesada ou a cadeia leve de C340 foram clonados e purificados. DNA genômico purificado de células de hibrídoma de C340 foi parcialmente digerido com enzima de restrição Sau3A e selecionado por tamanho por fraciona-mento centrífugo através de um gradiente de sacarose 10-40%. Fragmentos de DNA no limite de tamanho de 15-23 kb foram clonados no vetor bacteri-ófago, EMBL3, [comercialmente disponível?] e empacotado em partículas de fago. Diversas reações de empacotamento resultaram em uma biblioteca em uma biblioteca de 1 milhão de clones de bacteriófago. Aproximadamente 600.000 clones da biblioteca foram peneirados por hibridização de placa usando fragmentos de DNA genômico rotulado por 32P que conteve ou se-qüências de região constante de cadeia pesada de lgG1 humanas ou sequências de região constante de cadeia leve capa humana como sondas.

Treze clones de cadeia pesada e nove de cadeia leve foram detectadas. Destes, três clones de cadeia pesada e quatro clones de cadeia leve foram purificados por duas séries a mais de peneiramento. Um dos clones de cadeia pesada e dois dos clones de cadeia leve foram mostrados a conter as extremidades 5’ e 3’ das sequências de codificação por análise PCR de DNA bacteriófago. A inserção de DNA em clone cadeia pesada (HC) H4 foi 16 kb em tamanho e incluir 3,6 kb de seqüência de flanqueamento 5’ e pelo menos 2 kb de flanqueamento 3’. A inserção de DNA em clone de cadeia leve (LG) LC1 foi 15 kb em tamanho e incluiu 4,4 kb de seqüência de flanqueamento 5’ e 6,0 kb de flanqueamento 3’. As inserções completas foram removidas do vetor de bacteriófago como fragmentos Sall e clonadas entre os sítios Xhol e Sall de vetor de expressão de plasmídeo p1351, o qual forneceu um gene marcador selecionável gpt. Porque existia um sítio interno Sall na seqüência codificadora de região variável de cadeia pesada, dois fragmentos de Sall tiveram que ser transferidos de bacteriófago H4 ao vetor de expressão p1351. Os plasmídeos de expressão de cadeia pesada e leve resultantes foram denominados p1560 e p1558, respectivamente. As orientações dos genes de cadeia pesada e leve nestes dois plasmídeos relativo às seqüên-cias de vetores fó1351 foram determinados usando análise de enzima de restrição e PCR, respectivamente. Em ambos os casos, as orientações foram tais que a extremidade 5’ do fragmento de gene Ab estava próxima à extremidade do gene gpt. Ambos filamentos das regiões codificadoras dos genes clonados foram seqüenciados. As sequências de plasmídeos p1560 e 1558 foram apresentadas em Figuras 11A-11K e Figuras 13A-13J, respectivamente.

Exemplo 5: Preparação de linhas de células recombinantes Plasmídeo de cadeia pesada p1560 foi linearizado por digestão com enzima de restrição Pvul e plasmídeo de cadeia leve p1558 foi linearizado usando enzima de restrição Sall. Células p3X63Ag8.653 (653) e SP2/0-Agl4(SP2/0) foram separadamente tranfectadas com os plasmídeos linearizados pré-misturados por eietroporação e células cultivadas e trans-fectantes selecionados usando ácido micofenólico como descrito (Knight, e outros, Molecular Immunology 30:1443 (1993)). Sobrenadantes de células de colônias resistentes a ácido micofenólico foram analisadas aproximadamente duas semanas depois por IgG humano (isto é recombinante C340 (rC340)). Para isto, sobrenadantes de células foram incubados em placas de ELISA de 96 cavidades que foram revestidas com anticorpos de cabra específicos para a porção de Fc de IgG humano. IgG humano o qual ligado a placa revestida foi detectado usando anticorpo de IgG anti-humano de cabra conjugado com fosfatase (cadeia pesada + cadeia leve) e substratos de fosfatase alcalina como descrito (Knight, e outros, Molecular Immunology 30:1443 (1993)). Células dos maiores clones produtores foram transferidos a pratos de cultura de 25 cavidades em meios padrão e expandidos (IMDM, FBS 5%, 2mM de glutamina, mistura de seleção de ácido micofenólico). A quantidade de anticorpo produzido (isto é, secretado nos meios de culturas gastas) foi cuidadosamente quantificada por ELISA usando mAb C340 purificado como o padrão. Clones selecionados foram então expandidos em frascos T75 e a produção de IgG humano por estes clones foi quantificada por ELISA. Baseado nestes valores, seis transfectantes 653 independentes e três transfectantes SP2/0 independentes foram subclonados (semeando uma média de uma célula por cavidade em placas de 96 cavidades), a quantidade de anticorpo produzido pelos subclones foi determinada analisando (ELISA) sobrenadantes de colônias de subclones individuais. Três subclones, transfectante 653 19-20 (C379B) e os transfectantes SP2/0 84-81 (C381 A) e 22-56 (C389A), foram selecionados para análise adicional.

Análise para aglutinação de antíaeno rC340 Antes de subclonar linhas de células selecionadas como descritas acima, sobrenadantes de células de três linhas parentais (clone 2 e clone 18 de transfectantes 653 e clone 1 de transfectantes SP2/0) foram usadas para testar as características de aglutinação de antígeno de rC340. As concentrações de rC340 nas três amostras de sobrenadante de células foram primeiro determinadas por ELISA. Quantidade de titulação das amostras de sobrenadantes, ou controle positivo de C340 purificado, foram então incubados em placas de 96 cavidades revestidas com 2pg/ml de IL-12 humano. mAb ligado foi então detectado com anticorpo de IgG anti-humano de cabra conjugado com fosfatase alcalina (cadeia pesada + cadeia leve) e os substratos de fosfatase alcalina apropriada. Como mostrado em Figura 8, rC340 ligado especificamente a IL-2 humano em um modo indistinguível do mAb C340 original.

Caracterização de linhagens de células selecionadas Análises de curva de crescimento foram executadas em C379B, C381A, e C389A semeando frascos T75 com uma densidade de célula de partida de 2 x 105 células/ml em meios padrão de culturas sem soro SFM-5 e então monitorando número de célula e concentração de rC340 em uma base diária até as culturas serem usadas. Os resultados de culturas em meios padrão são mostrados em Figuras 9A-9C. Níveis de produção de mAb C340 máximos para C379B, C381A, e C389A foram 135pg/ml, 150 pg/ml, e 110 pg/ml, respectivamente. Tentativas pam_adaptar células C379B a meios SFM-5 não foram bem-sucedidas. Células C381A produziram α mcoma quantidade de rC340 em meios SFM-5 como em meios padrão, ao passo que células C389A produziram somente metade tanto rC340 em meios SFM-5 quanto em meios padrão. A estabilidade de produção de mAb rC340 ao longo do tempo para os três subclones foi taxada cultivando células em pratos de 24 cavidades com meios padrão ou meios padrão sem seleção de ácido micofenólicos para períodos de tempo variantes. Linhas C379B e C381A foram observadas para estavelmente produzir rC340 na presença ou ausência de seleção por um período de 30 dias (o tempo máximo testado) e 75 dias, respectivamente. Linha C389A foi estável e após 43 dias de cultura produziu somente 20% tanto anticorpo quanto no início do estudo, Será claro que a invenção pode ser praticada de outro modo além de como particularmente descrito na descrição e exemplos anteriores.

Modificações e variações numerosas da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do objetivo das reivindicações anexas.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Anticorpo de anti-IL-12 isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (VL) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 8.

2. Anticorpo de anti-IL-12 isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma região 1 determinante de complementaridade de cadeia pesada (CDR1) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 1, uma região 2 determinante de complementaridade de cadeia pesada (CDR2) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 2, uma região 3 determinante de complementaridade de cadeia pesada (CDR3) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 3, uma região 1 determinante de complementaridade de cadeia leve (CDR1) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 4, uma região 2 determinante de complementaridade de cadeia leve (CDR2) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 5, e uma região 3 determinante de complementaridade de cadeia leve (CDR3) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 6.

3. Anticorpo de anti-IL-12 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo aglutina a IL-12 com uma afinidade de um selecionado dentre 10'9 M e 10'12 M.

4. Anticorpo de anti-IL-12 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo substancialmente neutraliza uma atividade de proteína de IL-12.

5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo de anti-IL-12 isolado tendo uma região variável de cadeia pesada (VH) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (VL) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 8, como definida na reivindicação 1, 3 ou 4, e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo de anti-IL-12 isolado com uma região 1 determinante de complementaridade de cadeia pesada (CDR1) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 1, uma região 2 determinante de complementaridade de cadeia pesada (CDR2) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 2, uma região 3 determinante de complementaridade de cadeia pesada (CDR3) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 3, uma região 1 determinante de complementaridade de cadeia leve (CDR1) da sequência de a-minoácido definida na SEQ ID NO: 4, uma região 2 determinante de complementaridade de cadeia leve (CDR2) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 5, e uma região 3 determinante de complementaridade de cadeia leve (CDR3) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 6, como definida em qualquer uma das reivindicações 2, 3 e 4, e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

7. Método para produzir um anticorpo de anti-IL-2, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira isolada compreendendo o vetor de ácido nucléico isolado, que compreende a molécula de ácido nucléico isolado que codifica um anticorpo de anti-IL-12 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (VL) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 8, sob condições tal que o anticorpo de IL-12 seja expresso e recuperável.

8. Método para produzir um anticorpo de anti-IL-2, caracterizado pelo fato de que compreende traduzir a molécula de ácido nucléico que codifica um anticorpo de anti-IL-12 compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica uma região 1 determinante de complementaridade de cadeia pesada (CDR1) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 1, uma região 2 determinante de complementaridade de cadeia pesada (C-DR2) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 2, uma região 3 determinante de complementaridade de cadeia pesada (CDR3) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 3, uma região 1 determinante de complementaridade de cadeia leve (CDR1) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 4, uma região 2 determinante de complementaridade de cadeia leve (CDR2) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 5, e uma região 3 determinante de complementaridade de cadeia leve (C- DR3) da sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 6, sob condições in vitro, in vivo ou in situ tal que o anticorpo de IL-12 seja expresso em quantidades detectáveis ou recuperáveis.