KR100823576B1 - 항 ｉｌ-12 항체, 조성물, 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 항-IL-12 항체를 암호화하는 단리된 핵산, IL-12, 벡터, 숙주세포, 형질전환 동물 또는 식물, 그의 제조방법 및 용도, 치료적 조성물 방법 및 장치를 포함하는 적어도 하나의 신규한 항-IL-12에 관한 것이다.

Description

항 ＩＬ-12 항체, 조성물, 방법 및 용도{ANTI-IL-12 ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USED}
본 출원은 2000년 8월 7일에 출원된 U. S. 가출원 60/223,358 및 2000년 9월 29일에 출원된 60/236,827 호에 부분적으로 기초하고, 우선권 주장을 하였고, 각각은 모두 참고문헌으로서 본 명세서에 첨가되었다.
본 발명은 최소한 하나의 인터루킨-12(IL-12)단백질 또는 그의 단편에 대해 특이적인, 특이적 부분 또는 변이체를 포함하는 항체, 및 그러한 항-IL-12 항체를 엔코드하는 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 그를 제조 및 사용하는 방법, 약제학적 제제,투여 및 장치에 관한 것이다.
인터루킨-12 (IL-12)는 디설파이드 결합된 35 및 40kD의 글리코실레이트호된 폴리펩티드 사슬로 구축된 헤테로다이머 시토킨이다. 이 시토킨은 수상 세포, 단구, 대식세포, B 세포, 랑게르한스 세포 및 케라틴세포뿐만 아니라, 천연 킬러(NK)세포를 포함하는 항원 제시세포에 의해 합성되고 분비된다. IL-12는 다양한 생물학적 과정을 매개하고 NK 세포 자극 인자 (NKSF), T-세포 자극 인자, 세포독성 T-림프구 숙성 인자 및 EBV-형질전환된 B-세포계 인자로도 언급되었다(Curfs, J. H. A. J., et al., Clinical Microbiology Reviews, 10: 742-780 (1997)).
인터루킨-12는 세포(예를 들면, T세포, NK 세포)의 원형질 막 상에서 발현된 IL-12 수용체에 결합할 수 있고, 이에 의해 생물학적 과정을 변경시킨다(예를 들면, 개시, 저해). 예를 들면, IL-12의 IL-12 수용체에 대한 결합은 예비-활성화된 T세포 및 NK 세포의 증식을 자극하고, 세포독성 T 세포(CTL), NK 세포 및 LAK(림포킨 활성화된 킬러)세포의 세포분해 활성을 증가시키고, T 세포 및 NK 세포에 의한 감마 인터페론(IFN GAMMA)의 생성을 유도한다(Trinchieri, G., Annual Review of Immunology, 13: 251- 276 (1995)). 특히, IL-12는 세포분해 세포(예를 들면, NK, CTL)의 생성 및 세포 면역 반응의 상승(예를 들면 Th1 세포 매개된 면역 반응) 에 절대적이다. 그러므로, IL-12는 보호적 면역(예를 들면 감염의 박멸) 및 병적 면역 반응(예를 들면, 자가면역)에 극히 중요하다(Hendrzak, J. A. 및 Brunda, M. J., Laboratory Investigation, 72: 619-637 (1995)). 따라서,면역 반응(예를 들면 보호적 또는 병적) 은 IL-12의 생물학적 활성을 인비보에서 조작하여, 예를 들면 항체에 의해 증가,억제 및 저해될 수 있다.
비-인간 포유동물, 키메릭, 다중클론(예를 들면, 항-혈청) 및/또는 단클론 항체((Mabs) 및 단편(예를 들면, 단백분해 소화 및 그의 융합 단백 생성물)은 특정 질병을 치료하기위해 시도된 몇몇 케이스에서 연구되는 잠재적 치료제이다. 그렇지만, 그러한 항체 또는 단편은 인간에게 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러한 면역 반응은 순환계로부터 항체 또는 단편의 면역-복합체 매개된 클리어린스를 유도하고, 치료에 부적합한 반복적 투여를 유발하고, 이에 의해 환자에 대한 치료적 장점을 감소시키고 항체 또는 단편의 재투여를 제한한다. 예를 들면, 비-인간 부분을 포함하는 항체 또는 단편의 반복 투여는 혈청병 및/또는 아나필락시스를 유도할 수 있다. 이러한 여러 문제들을 방지하지 위해, 다수의 연구가 그러한 항체 및 그의 부분의 면역원성을 감소하기위해 수행되어 왔는데, 이는 널리 공지된 바와 같이 키메라화 및 인간화를 포함한다. 그렇지만 이러한 연구 및 기타 연구는, 약간의 면역원성, 낮은 친화도, 낮은결합도를 갖거나, 또는 세포 배양, 증량, 생산 및/또는 낮은 수율을 갖는 문제를 갖는항체 또는 단편을 낳는다. 그러므로, 그러한 항체 또는 단편이 제조에 이상적으로 적합한 것 또는 치료단백질로서 사용에 못미칠 수 있다.
따라서, 이러한 하나 이상의 문제를 극복하는 항-IL-12 항체 또는 단편과 더불어 공지된 항체 또는 단편보다 더욱 개선시키는 것을 제공할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 본명세서에 의해 기술되어 가능하게된 바와 같이 당분야에서 공지된 것과 조합하여, 분리된 인간, 영장류, 설치류, 포유동물, 카메라, 인간화된 및/또는 CDR-이식된 항-IL-12 항체, 이뮤노글로불린, 분해 생성물 및 기타 이들의 특정 부분 및 변이체와 더불어, 항-IL-12 항체 조성물, 엔코팅 또는 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제제, 장치, 형질전환된 동물, 형질전환된 식물, 및 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
본발명은 또한 본명세서에 기술된 바와 같이 최소한 하나의 분리된 항-IL-12 항체를 제공한다. 본 발명에 따른 항체는 최소한 일부분의 이뮤노글로불린 분자를 포함하는 분자를 함유하는 단백질 또는 펩티드, 예를 들면 중사슬 또는 경사슬 의 최소한 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중사슬 또는 경사슬 가변 영역, 중사슬 또는 경사슬 불변 영역, 골격 영역, 또는 이들의 부분을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다, 이들은 본 발명의 항체에 함입될 수 있다. 본 발명의 항체는 인간, 마우스, 토끼, 래트, 설치류, 영장류, 또는이들의 조합등고 같은 포유동물로부터 유도되거나 이들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 한 측면으로, 적어도 하나의 특정 서열, 도메인, 단백질 또는 변이체를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 코딩 특정 항-IL-12 항체를 포함하거나, 상보적이거나 하이브리드화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 항-IL-12 항체 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포 및/또는 재조합 벡터 뿐만 아리나 이러한 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포의 제조방법 및 사용방법을 제공한다.
본 발명의 적어도 하나의 항체는 적어도 하나의 IL-12 단백질, 서브유니트, 단편, 단백질 또는 이들의 조합에 특이적인 적어도 하나의 특정 에피토프에 결합한다. 적어도 하나의 에피토프는 상기 단백질의 적어도 한 부분을 가지는 적어도 하나의 항체 결합 영역을 포함할 수 있으며, 에피토프는 상기 단백질의 적어도 한 부분의 바람직하게는 적어도 1-5개의 아미노산으로 구성되며, 이는 상기 단백질의 적어도 하나의 기능성, 세포외, 가용성, 친수성, 외부 또는 세포질 도메인, 또는 이들 부분이나 이들로 한정되는 것은 아니다.
적어도 하나의 항체는 임의로 적어도 하나의 상보 결정 영역(CDR)(예; 장 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3) 및/또는 적어도 하나의 고정 또는 가변 골격 영역의 적어도 하나의 특정 부분 또는 이들 부분을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 항체 아미노산 서열은 또한 본 원에 기술되었거나 당업계에 알려진 임의로 적어도 하나의 특정 치환, 삽입 또는 결찰을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 원에 기술된 것으로, (i) IL-12 유도된 IFN-감마 분비 억제; (ii) LAK 세포 세포독성의 억제; (iii) IFN 감마 mRNA 전사의 억제; (iv) 세포내 IFN 감마 CD3+ 세포의 억제; 및/또는 (v) CD95 발현과 같은 것으로, 이로 한정하지 않는 적어도 하나의 활성을 갖는 적어도 하나의 분리된 항-IL-12 항체를 제공한다(참조예: Chan, et al., (1992). J. Immunol. 148(1): 92-98: Chan, et al., (1991). J. Exp. Med. 173(4): 869-79; Chehimi, et al., (1992) J. Exp. Med. 175(3):789-96; Medvedev, et al., (1997) Cytokine 9(6):394-404. 항-IL-12 항체는 공지된 방법에 따라 상응하는 활성(IL-12 단백질에 대한 적어도 하나의 생물학적 활성이 예시되나 이로 한정되지 않는다)에 대해 스크리닝될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 IL-12 항체에 대한 적어도 하나의 IL-12 항-이디오타입(idiotype) 항체를 제공한다. 항-이디오타입 항체는 면역글로불린 분자의 적어도 한 부분을 가지는 단백질 또는 펩타이드 함유 분자를 포함하며, 이는 본 발명의 항체내로 도입될 수 있는 장 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보 결정 영역(CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 고정 영역, 골격 영역, 또는 이들의 임의 영역이나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 포유 동물을 포함하거나, 이들로부터 유도될 수 있으며, 이들로는 인간, 마우스, 토끼, 랫트, 영장류 등을 포함하나 이들로만 한정되는 것은 아니다.
일면에서, 본 발명은 최소한 하나의 특정 서열, 도메인, 또는 이들의 부분 또는 변이체를 포함하는 최소한 하나의 IL-12 항-이디오타입 항체를 엔코드하는 폴리누클레오펩티드를 포함하거나, 상보적이거나, 또는 하이브리다이즈하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 IL-12 항-이디오타입 항체를 엔코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 그러한 핵산을 함유하는 숙주 세포 및/또는 재조합 벡터, 더불어 그러한 항이디오타입 항체 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포를 제조 및/또는 사용하는 방법을 제공한다..
본 발명은 또한 최소한 하나의 항-IL-12 항체가 검출가능한 및/또는 회수가능한 양으로 발현되는 조건하에서 본명세서에 기술된 바와 같이 숙주세포를 배양ㅅ키는 것을 포함하는, 숙주 세포 내에서 최소한 하나의 항-IL-12 항체, 또는 IL-12 항-이디오타입 항체를 발현시키는 최소한 하나의 방법을 제공한다.
본 발명 또한 (a) 본명세서에 기술된 바와 같은 분리된 항-IL-12 항체를 엔코드하는 핵산 및/또는 항체; 및 (b) 적절한 담체 또는 희석제를 포함하는 최소한 하나의 조성물을 또한 제공한다. 담체 또는 희석제는 공지의 담체 또는 희석제에 따라서, 임의적으로 약제학적으로 허용가능할수 있다. 본 조성물은 최소한 하나의 추가의 화합물, 단백질 또는 조성물을 임의로 포함할 수도 있다.
본 발명은 추가로 본명세서에 기술된 바와 같이, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자 내의 최소한 하나의 IL-12 관련 조건에서, 및/또는 관련된 조건 이전, 연이어, 또는 도중에 약제학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 최소한 하나의 항-IL-12 항체 방법 또는 조성물을 제공한다.
본 발명 또한 본발명에 따른 최소한 하나의 조성물, 장치 및/또는 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양의 최소한 하나의 항-IL-12 항체를 전달하는 방법을 포함한다.
본 발명은 추가로 본명세서에서 기술된 바와 같이 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자 내의 최소한 하나의 IL-12 관련 조건에서, 및/또는 관련된 조건 이전, 연이어, 또는 도중에 진단하기 위한 최소한 하나의 항-IL-12 항체 방법 또는 조성물을 제공한다.
본 발명 또한 본발명에 따른 최소한 하나의 항-IL-12 항체를 진단하기 위한 최소한 하나의 조성물, 장치 및/또는 전달 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1A 및 1B는 고정화된 인간 IL-12에 대한 인간 항-IL-12의 농도-의존성 결합을 보여주는 그래프이다. 항-IL-12 항체는 1% BSA/PBS 내에 일련적으로 희석되고 IL-12 피복된 플레이트 상에서 1 시간 동안 37 C에서 인큐베이션된다. 플레이트는 0.02% Tween 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate), 0. 15M 식염 주로 두번 세척되고, 이후 horse radish peroxidase (HRP) 라벨된 염소 항-인간 IgG kappa 특이적 항체로 1 시간 동안 실온에서 프로브되었다. 플레이트를 다시 세척하고, o-phenylenediamine (OPD) 기질로 다시 디벨럽하고 각 웰의 광학 밀도(OD)를 490 nm에서 측정하였다.
도 2: 도 A 및 B에서 외쪽부터 오른쪽으로의 레인은 인간 IL-12, 인간 IL-12 p40, 뮤린 IL-12, 및 미리염색된 분자량 마커를 포함한다. 도 2A 총 단백질로부터 염색된 밴드를 보여준다. 각 레인의 주요 밴드는 인간 IL-12 (75 kd), p40 인간 IL-12 (40 kd), 및 뮤린 IL-12 (75 kd)이다. 도 2B는 도 2A에서 도시된 것과 동일한 겔로부터 제조된 웨스턴 블롯을 보여준다. 블롯은 C340과 반응시키고 뒤이어 HRP 표지된 염소 항-인간 IgG 및 특이적으로 검출된 인간 IL-12 (모노머 및 멀티머) 및 인간 IL-12 p40과만 반응시킨다. HRP 표지된 염소 항-인간 IgG와 반응시킨 대조 블롯 (도시되지않음)은 어떠한 밴드도 보이지 않았다.
도 3: 인간에서의 IFNγ 유전자 발현의 역전사-PCR 분석
PBL이 IL-2, IL-12, IL-2+IL-12 로, 항-IL-12 항체 C340,8.6.2, 이소타입 대조 항체와 함께 또는 없이 처리되었다. 총 RNA는 역전사되었고,유전자특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭되었다. 각 샘플 내의 β-액틴 mRNA 수준은 mRNA 일체성 및 함량에 대한 대조구로서의 역할을 하도록 결정되었다.
도 4는 인간 항-IL-12 mAb (C340)가 IL-2 플러스 IL-12로 자극된 단구 고갈된 CD3+ 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 의해 인터페론-γ (IFNγ) 생성을 저해하는 것을 보여주는 히스토그램이다. PBMC는 대조 배지(시토킨 부가 안됨) 에서 5 시간 배양되었고, 배지는 IL-12 (0.1 ng/ml) 플러스 IL-2 (50 IU/ml) (IL-12/IL-2)로 보충되었고, 대조 배지는 mAb C340 (10㎍/ml)를 함유하고 IL-12/IL-12 배지는 mAb C340 (10㎍/ml)를 함유한다. 세포내 IFNγ는 CD3-PE 및 IFNγ-FITC로 이색 면역염색하여 측정되었다. 데이타는 하나의 도너에 대해 도시되었다.
도 5는 두 개의 서로다른 인간 항-IL-12 mAb (C340)를 갖는, IL-2 플러스 IL-12자극된 말초 혈액 림프구에 의한 IFNγ의 용량-의존성 저해를 도시한다. 인간 PBL (8 x 106/ml)는 24시간 동안 표시된 바와 같은 10 U/ml IL-2, IL-2 플러스 400 pg/ml IL-12, 또는 IL-2 플러스 IL-12 및 mAb C340와 함께 배양되었다. 배양 상청액은 제거되고 IFNγ에 대해 EIA에 의해 평가되었다.
도 6 인간 항-IL-12 mAb (C340)에 의한, IL-12 플러스 IL-2 유도된 LAK 세포 세포독성의 용량-의존적 저해를 도시하는 히스토그램이다. LAK 주효 세포 (인간 PBL, 8 x 106/ml)를 IL-12 (400 pg/ml) 플러스 IL-2 (10 U/ml) 및 mAbC340 (5000 ng/ml 또는 50 ng/ml, 표시된 대로)와 함께 24시간 동안 배양되었다. LAK 주효 세포는 세척되었고 51 Cr 표지된 Raji 표적 세포와 함께 4시간 동안 배양되어 표적 비 (E: T)가 80: 1이 되었고, Raji 세포 용해에 의해 배지로 방출된 5 1 Cr 의 양이 측정되었다.
결과는 세 개의 정상 도너 표준 에러의 평균으로서 표현된다. IL-12 양성 대조구 (IL-12)는 IL-12와 함께 항체 없이 배양된 주효 세포이다. 배경(BKGD)은 IL-12 또는 항체 없이 배양된 주효 세포이다.
도 7A 및 7B는 CD3+ 말초 혈액 단핵 세포에 대해 CD95의 IL-12 플러스 IL- 2-유도된 발현이 인간 항-IL-12 mAb (C340)에 의해 저해되는 것을 도시하는 히스토그램이다. PBMC는 72시간동안 0.1 ng/ml IL-12 및 서브최적량의 IL-2 (50 IU/ml) 를 함유하는 배지 내에서 mAb C340 (10 pg/ml)의 존재 또는 부존재 하에서 배양되었다.
CD95 발현은 항-CD95-FITC로 염색된 세포의 플로우 사이토메트리에 의해 측정되었다. 게이팅이 이색 분석 (CD3 또는 CD56-PE vs. CD95-FITC) 및 전방 대 직각 광 산란을 사용하여 수행되었다.
도 8은 재조합 인간 항-인간 IL-12 항체 (rC340)가 고정화된 IL-12에 정제된 mAb C340와 유사한 방법으로 결합하는 것을 도시하는 그래프이다. rC340의 세 개의 rC340-생성 재조합 세포계 상청액 내의 농도가 결정되었고 상청액은 IL-12 결합에 대해 ELISA에 의해 평가되었다. 플레이트는 2 ㎍/ml 인간 IL-12로 피복되었고 최초 하이브도마(표준) 또는 재조합 세포계의 상청액으로부터의 정제된 mAb C340과 함께 인큐베이션되었다. IL-12-결합된 항체는 알칼린 포스파타제-컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG (중사슬 + 경사슬)를 사용하여 검출되었다.
도 9A-9C는 세 개의 독립적으로 유래된 rC340-생성 재조합 세포 서브클론 (도 9A, 서브클론 C379B; 도 9B, 서브클론 C381A; 도 9C, 서브클론 C389A)에 의해 분비된 항체의 성장 동력학 및 양을 보여주는 그래피이다. 재조합 세포는 표준 배지 내에서 2 x 105 세포/ml 출발 농도에서 T75 플라스크 내로 뿌려졌다. 다양한 시간에서, 세포가 재현탁되었고, 배지 내의 rC340의 생 세포의 수 및 양(ug/ml)이 결정되었다.
본 발명은 분리된 인간, 영장류, 설치류, 포유동물, 카메라, 인간화된 및/또는 CDR-이식된 항-IL-12 항체, 이뮤노글로불린, 분해 생성물 및 기타 이들의 특정 부분 및 변이체와 더불어, 항-IL-12 항체 조성물, 엔코딩 또는 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제제, 장치, 형질전환된 동물, 형질전환된 식물, 및 그의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 그러한 핵산 및 항체 및 항-이디오타입 항체를 사용 및 제조하는 방법에 관한 것이고, 진단용 약제학적 조성물, 방법 및 장치를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "항-인터루킨-12 항체," "항-IL-12 항체," "항-IL-12 항체 부분," 또는 "항-IL-12 항체 단편" 및/또는"항-IL-12 항체 변이체" 등은 최소한 일부분의 이뮤노글로불린 분자를 포함하는 분자를 함유하는 단백질 또는 펩티드, 예를 들면 중사슬 또는 경사슬 의 최소한 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중사슬 또는 경사슬 가변 영역, 중사슬 또는 경사슬 불변 영역, 골격 영역, 또는 이들의 부분을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 그러한 항체는, 이러한 항체가 인 비트로,인 시투 및/또는 인 비보에서, 최소한 하나의 IL-12 활성 또는 결합과, 또는 IL-12 활성 또는 결합과 조절, 감소, 증가, 길항, 효능, 완화, 폐기 및/또는 저해하도록, 특정 리간드에 영향을 미친다. 비제한적 예로서, 본발명의 적절한 항-IL-12 항체, 특정화된 부분 또는 변이체는 최소한 하나의 IL-12, 또는 그의 특정화된 부분, 변이체 또는 도메인과 결합할 수 있다. 적절한 항-IL-12 항체, 특정화된 부분, 또는 변이체는 또한 RNA, DNA 또는 단백질 합성, IL-12 방출, IL-12 수용체 신호화, 막 IL-12 분해, IL-12 활성, IL-12 생성 및/또는 합성과 같은 최소한 하나의 IL-12 활성 또는 기능에 임의로 영향을 미칠 수 있다. 용어 "항체"는 항체, 소화 단편, 그의 특정화된 부분 및 변이체 를 모두 포괄하고, 항체 유사물 또는 항체의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분 또는 특정화된 단편 또는 부분을 포함한다. 기능성 단편은 포유동물 IL-12에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들면, IL-12 또는 그의 부분에 결합하는 항체 단편은 Fab (예를 들면, 파파인 소화에 의한), Fab' (예를 들면, 펩신 소화 및 부분적 환원에 의한) 및 F (ab')2. (예를 들면, 펩신 소화에 의한), facb (예를 들면, 플라스민 소화에 의한), pFc' (예를 들면, 펩신 또는 플라스민 소화에 의한), Fd (예를 들면, 펩신 소화, 부분적 환원 및 재응집에 의한), Fv 또는 scFvr (예를 들면, 분자생물학 기술에 의한) 단편을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니며 본 발명에 의해 포괄된다. (참조, 예를 들면,Colligan, Immunology, supra).
그러한 단편은 업계에 공지되었거나 본 명세서에 기술된 바와 같은 효소적 분해, 합성 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 주단 코돈이 자연적 중단 부위보다 위쪽에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단(truncated) 형태로 제조될 수 있다. 예를 들면, F (ab') 2 중사슬 부분을 엔코드하는 조합 유전자는 중사슬의 CH, 도메인 및/또는 힌지 영역을 엔코드하는 중사슬 DNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 항체의 다양한 부분은 종래 기술에 의해 화학적으로 서로 결합할 수 있고, 또는 유전공학 기술을 사용하여 인접 단백질로서 제조될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "인간 항체"는 단백질 (예를 들면, CDR, 골격, CL, CH 도메인 (예를 들면, CH1, CH2, CH3), 힌지,(VL, VH))의 실질적인 모든 부분이 단지 마이너한 서열 변화 또는 변경만 있는, 인체 내에서 실질적으로 비-이뮤노젠인 항체를 의미한다. 유사하게 항체는 영장류(원숭이, 비비, 침팬지, 등), 설치류(마우스, 래트, 토끼, 기니아 픽, 햄스터 등)에 대한 것이고 기타 포유동물은 종, 하위속, 속, 하위군, 군 특이적 항체에 대한 것이다. 또한, 키메라 인간 항체는 상기한 것의 어떠한 조합을 포함한다. 그러한 변경 또는 변이는 임의적으로 및 바람직하게는 비-변형된 항체와 상대적으로 인간 또는 다른 종 내에서 면역원성을 억제 또는 감소시킨다. 그러므로, 인간 항체는 키메라 또는 인간화된 항체와 구분된다. 인간 항체는 기능적으로 재배치된 인간 이뮤노글로불린(예를 들면, 중사슬 및/또는 경사슬) 유전자를 발현할 수있는 인간 외 동물 또는 진핵 또는 원핵 세포에 의해 제조될 수 있다. 또한, 인간 항체는 단사슬 항체이고, 천연 인간 항체 내에서 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, Fv는 2 내지 8 글리신 또는 기타 아미노산 잔기와 같은 링커 펩티드를 포함할 수 있고, 중사슬의 가변영역 및 경사슬의 가변 영역에 결합한다. 그러한 링커 펩티드는 인간 유래인 것으로 생각된다.
이특이적, 헤테로특이적, 헤테로컨쥬게이트 또는 유사 항체는 최소한 두 개의 서로다른 항원에 대해 결합 특이성을 갖는, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체로서 사용될 수 있다. 이 경우, 결합 특이성 중 하나는 최소한 하나의 IL-12 단백질이고, 다른 하나는 다른 항원에 대한 것이다. 이특이적 항원 제조방법은 업 계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이특이적 항체의 재조합 제조는 서로 다른 특이성을 갖는 두 개의 이뮤노글로불린 중사슬-경사슬 쌍의 공동-발현에 기초한다.(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)). 이뮤노글로불린 중사슬 및 경사슬의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10 개의 서로다른 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하고, 그 중 단지 하나만이 이특이적 구조를 갖는다. 올바론 분자의 정제는 보통 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는데 다소 번거롭고, 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 예를 들면 WO 93/08829, US 특허 Nos, 6210668,6193967,6132992,6106833,6060285,6037453,6010902,5989530,5959084, 5959083,5932448,5833985,5821333,5807706,5643759,5601819,5582996,5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986)에 개시되어 있고,이들은 모두 참고문헌으로서 본명세서에 포함되었다.
본발명의 방법 및 조성물에서 유용한 항-IL-12 항체 (또한 IL-12 항체라고도 부름)는 IL-12에 대한 높은 친화성 결합 및 저 독성을 임의로 및 바람직하게 갖는 것에 의해 임의적으로 특성화될 수 있다. 가변 영역, 불변 영역 및 골격과 같은 각 성분이 각각 및/또는 함께, 임의로 및 바람직하게는 저 면역원성을 갖는 본발명의 항체, 특정화된 단편 또는 변이체는 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 사용가능한 항체는 증상의 상당한 감소 및 적거나 및/또는 허용가능한 독성으로 연장된 시간 동안 환자를 치료하는 능력에 의해 특성화된다. 적거나 허용가능한 면역원성 및 또는 높은 친화성은, 다른 적절한 특성과 함께 달성하고자 하는 치료적 결과에 기여할 수 있다. "저 면역원성"은 상당한 HAHA. HACA 또는 HAMA 반응을 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50% 미만의 치료할 환자에서 상당히 증가시키거나 및/또는 치료할 환자에서 낮은 적정량을 증가시키는 것으로 정의된다(이중 항원 효소 면역분석으로 측정하여 약 300, 바람직하게는 100 미만임)(참조, 예를 들면, Elliott er al., Lancet 344 : 1125-1127 (1994), 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨).
유용성
본발명의 분리된 핵산은 최소한 하나의 항-IL-12 항체 또는 그의 특정화된 변이체의 생산에 사용될 수 있고, 최소한 하나의 면역 장애 또는 질병, 심장혈관 장애 또는 질병, 감염, 악성종양, 및/또는 신경 장애 또는 질병, 또는 기타 공지도거나 특정된 IL-12 관련 이상으로부터 선택된 초소한 하나의 IL-12 이상을 진단, 모니터, 조절, 치료, 경감, 발생 방지 도움을 위해, 세포, 조직, 장기 또는 동물(포유동물 및 인간 포함) 내에서 측정하거나 작용하는데 사용될 수 있다.
그러한 방법은 최소한 하나의 항-IL-12 항체를 그러한 조절, 치료, 경함,예방, 또는 증상, 작용 또는 메카니즘 감소를 필요로 하는, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에 대해 최소한 하나의 항-IL-12 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 유효량은 1회량(예를 들면 볼루스) 당 약 0.001 내지 500 mg/kg 양, 여러번 또는 연속 투여, 또는 1회량 당 0.01-5000 g/ml 혈청 농도를 이루기 위해, 여러번 또는 연속 투여, 또는 그 범위 내의 유효 범위 또는 값이고, 공지의 방법을 사용하거나, 본명세서에 기술된 바와 같이 또는 관련 분야에서 공지된 바와 같이 결정되고 수행될 수 있다.
언급
본명세서에서 언급된 모든 간행물 또는 특허는 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함되고 본 발명 당시의 기술 상태를 보여주거나 및/또는 본발명의 기술 및 실현가능성을 제공한다. 간행물은 어더한 고학적 또는 특허 간행물, 또는 어떠한 매체 형태로 이용가능한 그 밖의 정보를 언급하고, 모든 기록된, 전자적 또는 프린트된 형태를 포함한다. 다음 문헌은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,Inc., NY, NY (1987-2001) ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001) ; Colligan et al., Current Protocols in protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
본 발명의 항체
본 발명의 최소한 하나의 항-IL-12 항체는 업계에 공지된 세포계, 호합 세포계, 고정화된 세포 또는 고정화된 세포의 클론 집단에 의해 임의로 제조될 수 있다. 참조, 예를 들면, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001) ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2"'Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989) ; Harlow 및 Lane, ; antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989) ; Colligan, et al., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001) ; Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), 각각은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
인간 IL-12 단백질 또는 그의 단편에 대해 특이적인 인간 항체는 분리된 및/또는 단백질 또는 그의 부분(합성 펩티드와 같은 합성 분자 포함)과 같은 적절한 명역원적 항체에 대해 생성될 수 있다. 다른 특이적 또는 일반 포유동물 항체는 유사하게 생성될 수 있다. 면역원적 항원의 제조, 및 단클론 항체 생성은 적절한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
한 연구에서, 하이브리도마가 적절한 불멸 세포주를 (예를 들면, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L. 5, > 243, P3X63Ag8. 653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A 등과 같은 골수암 세포주 또는 헤테로골수종양, 그의 융합 생성물, 또는 이로부터 유래된 어떠한 세포 또는 융합 세포, 또는 업계에 알려진 적절한 다른 세포주, 참조, 예를 들면, www. atcc. org, www. lifetech. com., 등), 분리된 또는 클론된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도선, 또는 기타 면역 또는 B 세포 함유 세포, 또는 중사슬 또는 경사슬 가변 또는 불변 영역 또는 골격,또는 CDR 서열을 발현하는 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 재조합 또는 내인성, 바이러스, 박테리아, 조류, 진핵, 양서류, 곤축, 파충류, 어류, 포유동물, 설치류, 말, 양, 염소, 양, 영장류, 원핵, 게놈 DNA,cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 사슬, 혼성화된 등의 형태로서의 항체 생성 세포와 융합하여 생성된다, 참조, 예를 들면, Ausubel, supra, 및 Colligan, Immunology, supra, chapter 2, 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
항체 생성 세포는 대상 항원으로 면역화된 인간 또는 기타 적절한 동물의 말초 혈액 또는, 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 얻어질 수 있다. 어떠한 적절한 숙주 세포는 본발명의 항체를 엔코드하는 외인성 또는 내인성 핵산 , 그의 특정화된 단편 또는 변이체의 발현에 사용될 수 있다. 융합 세포(하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적 배양 조건 또는 공지된 적절한 방법을 사용하여 분리될 수 있고, 제한 조건 또는 세포 소팅, 또는 기타 공지 방법을 사용하여 클로닝된다. 원하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 세포는 적절한 분석 (예를 들면, ELISA)에 의해 선택될 수 있다.
요구되는 특이성을 갖는 항체를 생성 또는 분리하는 기타 적절한 방법은 펩티드 또는 단백질 라이브러리로부터 재조합 항체를 선택하거나(예를 들면, 박테리오파지, 리보솜, 올리고누클레오티드, RNA, cDNA, 등 디스플레이 라이브러리 ; 예를 들면, Cambridge Antibody Technologies, Cambridaeshire. UK ; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK: BioInvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite ;Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. 참조, 예를 들면, EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755 ;PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883 ; PCT/GB93/00605 ; US 08/350260 (5/12/94); PCT/GB94/01422 ; PCT/GB94/02662 ; PCT/GB97/01835 ; (CAT/MRC); W090/14443 ;W090/14424 ; WO90/14430 ; PCT/US94/1234 ; W092/18619 ; W096/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); W095/16027 (BioInvent) ; W088/06630; W090/3809 (Dyax); US 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); W089/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT, 07149 (Ixsys); 또는 stochastically generated peptides or protein-US 5723323,5763192,5814476,5817483,5S24514,5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, now Applied Molecular Evolution (ANIE), 각각은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨) 또는 형질전환된 동물의 면역화에 의존하거나 (예를 들면, SCID mice, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41: 901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93: 154-161 (1998), 각각은 전체가 관련 특허 및 출원과 함께 참고문헌으로서 포함됨) 그러한 기술은 리보솜 디스플레이(Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14130-14135 (Nov. 1998)) ; 단일 세포 항체 생성 기술 (예를 들면, selected lymphocyte antibody method ("SLAM") (US pat. No. 5,627,052, Wen et al., J. Immunol. 17: 887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 93: 7843-7848 (1996)); 겔 마이크로드로플렛 및 플루오 시토메트리 (Powell et al.,Biotechnol. 8: 333-337 (1990); 단일 세포 시스템, Cambridge, MA; Gray et al., J. Imm. Meth.182: 155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); B-세포 선택 (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19: 125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech,Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988))는 방법을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
비인간 또는 인간 항체를 설계 또는 인간화하는 방법이 또한 사용될 수 있고 업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화된 또는 설계된 항체는 비-인간 , 예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류 또는 기타 포유동물인 공급원으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이들 인간 아미노산 잔기는 종종 "중요한" 잔기로 언급되는데, 이들은 공지된 인간 서열의 "중요한" 가변, 불변 또는 기타 도메인으로부터 대표적으로 취급된다. 알려진 인간 Ig 서열은 예를 들면 다음에 개시되어 있다: www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/query. fcgi: wnvw. atcc. orgiphageXhdb. html; www. sciquest. com/ ; www. abcam. com/; www. antibodyresource. com/onlinecomp. html ; www. public. iastate. edu/-pedro/researchtools. html : www. mgen. uniheidelberg. de/SD/IT/IT. html; www. whfreeman. com/immunology/CH05/kuby05. htm; www. library. thinkquest. org/12429/Immune/Antibody. html ; www. hhmi. org/grants/lectures/1996/vlab/; www. path. cam. ac. uk/-mrc7/mikeimages. html; www. antibodyresource. com/ ; mcb. harvard. edu/BioLinks/Immunology. html. www. immunologylink. com/ ; pathbox. wustl. edu/-hcenter/index. html; www. biotech. ufl. edu/-hcl/ ; www. pebio. com/pa/340913/340913. html ; www. nal. usda. gov/awic/pubs/antibody/ ; www. m. ehime-u. ac. jp/-yasuhito/Elisa. html ; www. biodesign. com/table. asp; www. icnet. uk/axp/facs/davies/links. html ; www. biotech., ufl. edu/-fccl/protocol. html ; www. isacnet. org/sites~geo. html; aximtl. imt. uni-marburg. de/-rek/AEPStart. html ; baserv. uci. kun. nl/#jraats/linksl. html; www. recab. uni-hd. de/immuno. bme. nwu. edu/ ; www. mrc-cpe. cam. ac. uk/imt-doc/public/INTRO. html : www. ibt. unam. mx/vir/V~mice. html; imgt. cnusc. fr: 8104/; www.biochem. ucl. ac. uk/-martin/abs/index. html ; antibody. bath. ac. uk/ ; abgen. cvm. tamu. edu/lab/wwwabgen. html ; www. unizh. ch/-honegger/AHOseminar/Slide0l. html ; www. cryst. bbk. ac. uk/-ubcg07s/ ; www. nimr. mrc. ac. uk/CC/ccaewg/ccaewg. htm ; www. path. cam. ac. uk/-mrc7/humanisation/TAHHP. html ; www. ibt. unam. mx/vir/structure/stat~aim. html; www. biosci. missouri. edu/smithgp/index. html; www. cryst. bioc. cam. ac. uk/-fmolina/Web-pages/Pept/spottech. html; www.jerini.e/fr~products. htm ; www. patents. ibm. com/ibm. html. Kabat et al., sequences of protein of Immunological Interest, U. S. Dept. Health (1983), 각각은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨. 이러한 중요 서열은 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나, 또는 결합, 친화성, 온-속도,오프-속도, 결합도, 특이성, 반감기, 기타 적절한 특성을 감소, 증가 또는 변형하는데 사용될 수 있다. 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는유지되는 반면 가 변 및 불변 영역의 비-인간 서열은 인간 또는 기타 아미노산으로 대체된다. 항체는 항원에 대해 고친화성의 보유력으로 및 기타 유리한 생물학적 특성을 가진 채로 인간화된다. 이 목적을 이루기 위해, 인간화된 항체는 부모 서열의 분석 방법 및 부모 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용한 다양한 개념적 인간화된 생성물에의해 임의로 제조될 수 있다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 업계 숙련자에게 공지되어있다. 컴퓨터 프로그램이 선택된 후부 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 컨포메이션 구조를 예시하고 나타내는데 사용된다. 이러한 디스플레이 검사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 대한 잔기의 역할 분석, 즉, 후보 이뮤노글로불린의 항원에의 결합 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이런 식으로, FR 잔기는 콘센서스 및 중요 서열로부터 선택 및 조합되어 증가된 표적 항원 친화성과 같은 소기의 항체 특성이 얻어진다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 주는데 직접적으로 또는거의 상당히 관련된다. 본발명의 항체의 인간화 또는 설계는 다음에 기술된 바와 같은 비제한적 공지의 방법을 사용하여 수행될 수 있다, Winter (Jones et al., Nature 321: 522 (1986);Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151 : 2623 (1993),US patent Nos : 5723323,5976862,5824514,5817483,5814476,5763192,5723323,5,766886,5714352,6204023,6180370,5693762,5530101,5585089,5225539; 4816567, PCT/ : US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01134,GB91/01134, GB92/01755 ; W090/14443, W090/14424, W090/14430, EP 229246, 각각은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
항-IL-12 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같거나 및/또는 공지된 바와 같이 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 비인간 영장류 등)의 면역화에 의해서도 또한 임의로 발생될 수 있다. 인간 항-IL-12 항체를 생성하느 세포는 그러한 동물로부터 분리될 수 있고 본 명세서에 기술된 방법과 같은 적절한 방법을 사용하여 고정될 수 있다.
인간 항원에 결합하는 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 마우스는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(비제한적으로, 예를 들면, U. S. Pat. Nos: 5,770,428, 5,569,825,5,545,806,5,625,126,5,625,825,5,633,425,5,661,016 및 5, 789,650 issued to Lonberg et al. ; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B 1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 Al, Surani et al. US. Pat. No. 5,545,807, Bruggemann et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B 1, Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature 368: 856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6 (4) 579-591 (1994), Green et al, Nature genetics 7: 13-21 (1994), Mendez et al., Nature genetics 15: 146-156 (1997), et al., nucleic acid Research 20 (23): 6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sci USA 90 (8) 3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13 (1) : 65-93 (1995) and Fishwald et al., Nat Biotechnol 14 (7): 845-851 (1996), 각각은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨). 일반적으로, 이들 마우스는 기능적으로 재배치되거나, 또는 기능적 재배치를 거친 최소한 하나의 인간 이뮤노글로불린 로커스에서 최소한 하나의 트렌스유전자를 포함한다. 그러한 마우스에서 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 동물이 내인성 유전자에 의해 엔코드된 항체를 생성하는 능력을 제거하도록 결실 또는 교란될 수 있다.
유사 단백질 또는 단편에 대한 특이적 결합을 위한 항체의 스크리닝은 펩티드 디스플레이 라이브러리를 사용하여 편리하게 달성될 수 있다. 이 방법은 소기의 기능 또는 구조를갖는 각 구축원에 대한 펩티드의 큰 집단의 스크리닝을 수반한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리의 항체 스크리닝은 업계에 널리 공지되어 있다. 디스플레이된 펩티드 서열은 3 내지 5000 또는 그 이상의 아미노산 길이, 종종 5-100 아미노산 길이, 종종 약 8 내지 25 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드 라이브러리 발생을 위한 직접적 화학 합성 방법에 부가하여, 몇몇 재조합 DNA 방법이 기술되어 있다. 한 형태는 박테리오파지 또는 세포 표면 상에 펩티드 서열의 디스플레이를 수반한다. 그러한 방법은 PCT 특허 출원 번호91/17271,91/18980,91/19818, 및 93/08278에 기재되어 있다. 펩타이드 발생 라이브러리에 대한 시스템은 인비트로 화학 합성 및 재결합 방법의 모든 면을 가지고 있다. 참조, PCT 특허 출원 번호 92/05258,92/14843, 및 96/19256. 참조 또한, U. S. 특허 번호 5,658,754; 및 5,643,768. 펩타이드 디스플레이 라이브러리, 벡터 ㅁ미및 스크리닝 키트는 Invitrogen과 같은 공급자로부터 상업적으로 이용 가능(Carlsbad, CA), 및 Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). 참조, 예를 들면, U. S. Pat. Nos. 4704692,4939666,4946778,5260203,5455030,5518889,5534621,5656730,5763733,5767260,5856456, assigned to Enzon; 5223409,5403484,5571698,5837500, assigned to Dyax, 5427908,5580717, Affymax에 할당된; 5885793, Cambridge Antibody Technologies에 할당된; 5750373, assigned to genentech, 5618920,5595898,5576195,5698435,5693493,5698417, assigned to Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra ; 또는 Sambrook, supra, 상기 특허 각각 및 출원 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
본발명의 항체는 최소한 하나의 항-IL-12 항체를 엔코드하는 핵산을 사용하여 젖 내에 항체를 생성하는 염소, 소, 말, 양 같은 형질전환 포유동물 또는 동물 을 제공하도록 제조될 수 있다. 그러한 동물은 공지된 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 참조, 비제한적으로, 예를 들면, US patent nos. 5,827,690;5,849,992; 4,873,316; 5, 849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489, 등, 각각은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
본발명의 항체는 최소한 하나의 항-IL-12 항체를 엔코드하는 핵산을 사용하여 그러한 항체를 생산하는 형질전환된 식물 및 배양된 식물 세포 (예를 들면, 비제한적으로 담배 및 옥수수), 세포 부분 또는 배양된 세포 내의 특정 부분 또는 변 이체를 제공하도록 제조될 수 있다. 비제한적 예로서, 형질전환 담배잎은 예를 들면 유도 프로모터를 사용하여 재조합 단백질이 대량 재조합 단백질의 제공에 성공적으로 사용되었다 참조, 예를 들면, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 (1999) 및 거기에 언급된 참고문헌들. 또한, 형질전환 옥수수는 상업적 생산 수준에서, 다른 재조합 시스템 또는 천연 공급원으로부터 정제된 것과 동등한 생물학적 활성을 가지고, 포유동물 단백질을 발현하는데 사용되었다. 참조. 예를 들면, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 (1999) 및 거기에 언급된 참고문헌들. 항체는 단사슬 항체 (scFv's)와 같은 항체 단편을 포함하는 담배 씨 및 감자 줄기를 포함하는 형질전환 식물 씨로부터 대량으로 생산되었다. 참조, 예를 들면, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38: 101- 109 (1998) 및 이들에서 언급된 참고문헌. 그러므로, 본발명의 항체는 공지된 방법에 따라 형질전환된 식물을 사용하여 제조될 수도 있다. 참조 또한, 예를 들면, Fischer et al.,Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108 (Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma et al., Plant Physiol. 109: 341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22: 940-944 (1994); 이들에서 언급된 참고문헌. 참고, 또한 일반적으로 식물 발현, 항체에 관한 문헌, 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
본발명의 항체는 넓은 범위의 친화성(KD)을갖는 인간 IL-12와 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본발명의 최소한 하나의 인간 mAb는 비제한적으로 0.1-9.9 (또는 어느 범위 또는 값) X 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 , 10-11, 10-12, 10-13 또는 어느 범위 또는 값과 같이 약 10-7 M과 동등하거나 그 이하의 KD로 인간 IL-12에 결합할 수 있다.
항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합도는 적절한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수있다 (참조, 예를 들면, Berzofsky, et al.,"항체-antigen Interactions,"In Furadamental Intnutnology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY(1984) ; Kuby, Janis Irnrnunology, W. H. Freeman 및 Company: New York, NY (1992); 및 여기에 기술된 방법). 특정 항원-항체 상호작용의 치노화성은 서로 다른 조건에서 측정될 경우 변화할 수 있다 (예를 들면, 염 농도, pH). 그러므로 친화성 및 기타 항원-결합 파라미터 (예를 들면, KD, Ka, Kd)가 바람직하게는 항원 및 항체의 표준화된 용액, 본 명세서에 기술된 바와 같은 표준화된 버퍼로 제조된다.
핵산 분자
최소한 하나의 서열 식별 번호: 1,2,3,4,5,6,7,8의 인접 아미노산의 최소한 70-100%, 그의 특정화된 단편, 변이체 또는 컨센서스 서열, 또는 이들 서열을 최소한 하나 포함하는 기탁된 벡터와 같은 본명세서에서 제공된 정보를 사용하여, 항-IL-12 항체가 본 명세서에 기술되거나 또는 공지된 방법을 사용하여 얻어진다.
본발명의 핵산 분자는 mRNA, hnRNA. tRNA 또는 어떤 형태의 RNA 형태 또는 cDNA 및 클로닝에 의해 얻어지거나 또는 합성에 의해 생성된 게놈 DNA 또는 이들의 조합을 포합하는 DNA의 형태일 수있다. DNA는 삼중사슬, 이중사슬 또는 단일사슬, 또는 이들의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 최소한 한 가닥의 어느 부분은 센스 가닥으로 공지된 코딩 가닥일 수 있고, 안티-센스 가닥으로 공지된 비-코팅 가닥일 수도 있다.
본발명의 분리된 핵산 분자는 최소한 하나의 중사슬(서열 식별 번호: 1-3) 또는 경사슬 (예를 들면, 서열 식별 번호: 4-6)의 최소한 하나의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 로서의 CDR의 최소한 하나의 특정 부분; 항-IL-12 항체 또는 가변 영역(예를 들면, 서열식별번호:7,8)에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 상기에서 기술된 것과 상당히 다른 핵산 서열을 포함하지만 유전 코드의 퇴호로 인해 본명세서에 기술된 바와 같이 및/또는 공지 기술과 같이 최소한 하나의 항-IL-12 항체를 여전히 엔코드 하는 핵산 분자와 같은 하나 이상의 인트론을 임의로 갖는 개방 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전 코드는 업계에 널리 공지되어 있다. 그러므로, 당업자가 본 발명의 특정 항-IL-12에 대해 코드하는 핵산 변이체를 퇴화시키는 것은 루틴한 일이다. 참조, 예를 들면, Ausubel, et al., supra, 및 그러한 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다.
또다른 면에서, 날짜에 각각 본발명은 지정된 클론명 및 ATCC 기탁번호 로 기탁된 플라스미드 내에 함유된 핵산에 의해 엔코드된 아미 노산 서열을 갖는 항-IL-12 항체를 엔코드하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에 표시된 바와 같이, 본발명의 핵산 분자는 항-IL-12 항체를 엔코드하는 핵산을 포함하고, 비제한적으로, 그 자신에 의해 항체 단편의 아미노산 서열을 엔코드하는 것; 전체 항체 또는 부분에 대한 코딩 서열; 항체, 단편 또는 부분과 더불어 최소한 하나의 신호 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열과 같은 부가적 서열에 대한 코딩 서열도, 최소한 하나의 인트론같은 상기한 부가적 코딩 서열과 함께 또는 없이, 전사, mRNA 처리, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예를 들면, mRNA의 리보솜결합 및 안정화); 부가적 기능을 제공하는 것과 같은 부가적 아미노산을 코드하는 부가적 코딩 서열에서 역할을 하는 전사된 비-번역 서열과 같은 비-코딩 5' 및 3' 서열을 포함할 수 있다. 그러므로, 항체를 엔코드하는 서열은 항체 단편 또는 부분을 포함하는 융합된 항체의 정제를 촉진하는 펩티드를 엔코드하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다.
본명세서에 기술된 바와 같은 폴리누클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 폴리누클레오티드
본 발명은 여기서 기술된 폴리누클레오티드에 대한 선택적인 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 분리된 핵산을 제공한다. 그러므로, 이 구체예의 폴리누클레오티드는 그러한 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산을 분리, 검출, 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 폴리누클레오티드는 분리된 게놈 또는 cDNA, 또는 인간 또는 포유동물 핵산 라이브러리로부터 상보적인 cDNA이다.
바람직하게는, cDNA 라이브러리는 최소한 80% 전장 서열, 바람직하게는 최소한 85% 또는 90% 전장 서열, 및 더욱 바람직하게는 최소한 95% 전장 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 드문 서열의 제시를 증가시키도록 정상화될 수 있다. 낮거나 적당한 스트린젠시 혼성화 조건은 대표적이고, 비독점적으로, 상보적 서열에 상대적으로 감소된 서열을 갖는 서열과 함께 사용된다. 중간 및 높은 스트린젠시 조건은 더 큰 동일성의 서열에 대해 임의적으로 사용될 수 있다. 낮은 스트린젠시 조건은 약 70% 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적인 혼성화를 허용하고 오솔로구스(orthologous) 또는 이원성(paralogous) 서열을 확인하는데 사용될 수 있다.
임의로, 본발명의 폴리누클레오티드는 본명세서에 기술된 폴리누클레오티드에 의해 엔코드된 항체의 최소한 부분을 엔코드한다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 본발명의 항체를 엔코드하는 폴리누클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 데 사용될 수 있다. 참조, 예를 들면, Ausubel, supra; Colligan, supra, 각각은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
핵산의 구축
본발명의 분리된 핵산은 널리 공지된 바와 같이 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 제조될 수있다.
핵산은 본발명의 폴리누클레오티드에 부가적으로 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나이상의 엔도누클레아제 제한 부위를 포함하는 다중-클로닝 부위는 폴리누클레오티드의 분리를 돕는 핵산 내로 삽입될 수 있다. 또한, 번역가능한 서열은 본 발명의 번역된 폴리누클레오티드의 분리를 돕도록 삽입될 수 있다. 예를 들면, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 발명의 핵산은 본 발명의 폴리누클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어뎁터, 또는 링커일 수 있다.
부가적인 서열은 폴리누클레오티드의 분리를 돕거나 또는 폴리누클레오티드가 세포내로의 도입을 향상시키기위해, 클로닝 및/또는 발현에서 그 기능을 최적화하는 서열의 클로닝 및/또는 발현 서열에 부가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어뎁터, 및 링커의 사용은 업계에 널리 공지되어 있다 (참조, 예를 들면, Ausubel, supra ; 또는 Sambrook, supra)
핵산 구축을 위한 재조합 방법
RNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이들의 조합과 같은 본발명의 분리된 핵산 조성물은 업계의 당업자에게 공지된 클로닝 방법을 사용하여 생물학적 공급원으로부터 얻어질 수있다. 어떤 구체예에서, 본발명의 폴리누클레오티드에 엄격 조건하에서, 선택적으로 혼성화하는 올리고누클레오티드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 소기의 서열을 학인하는데 사용된다. RNA의 분리 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축은 당업자에게 널리 공지되있다 (참조, 예를 들면, Ausubel, supra ; 또는 Sambrook. supra)
핵산 스크리닝 및 분리 방법
cDNA 또는 게놈 라이브러리는 본명세서에 기술된 것과 같이, 본발명의 폴리누클레오티드의 서열에 기초한프로브를사용하여 스크리닝될 수 있다. 프러브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화하여 같거나 동일한 생명체 내의 상동 유전자를 분리하는데 사용될 수있다. 당업자는 다양한 정도의 혼성화 스트린젠시가 분석에서 사용될 수 있음; 또는 세척 배지의 혼성화가 엄격할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱 엄격하기 위한 혼성화 조건에 대해 프로브 및 포적 사이에 발생되는 두플렉스 형성에 대해 상보성 정도가 커야만 한다. 스트린젠시 정도는 하나 이상의 온도, 이온강도, pH 및 포름아미드같은 부분 변성 용매의 존재하에서 제어될 수 있다. 예를 들면, 혼성화 스트린젠시는, 예를 들면 포름아미드의 농도를 0 내지 50% 범위 내에서 조작하여 반응 용액의 극성을 바꿔 편리하게 변경할 수 있다. 검출가능한 결합에 대해 요구되는 상보성 정도는 혼성화 배지 및또는 세척 배치의 스트린젠시에 따라 변한다. 상보성의 정도는 100%, 또는 70-100%에서 최적화된다. 그렇지만, 프로브 및 프라이머에서의 약간의 변경은 혼성화의 스트린젠시 및/또는 세척 배지를 감소시켜 보상될 수 있음을 이해해야 한다.
RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 업계에 널리 공지되어 있고 불필요한 실험없이, 본명세서의 교시사항 및 가이드에 기초하여 본발명에 따라서 사용될 수 있다.
DNA 또는 RNA 증폭의 공지된 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 방법(참조, 예를 들면, U. S. Patent Nos. 4,683,195,4,683,202, 4,800, 159,4,965.188, to Mullis, et al. ; 4,795.699 및 4,921,794 to Tabor, et al; 5,142,033 to Innis : 5,122, 464 to Wilson, et al.; 5,091,310 to Innis; 5,066,584 to Gyllensten, et al; 4,889,818 to Gelfand, et al ; 4,994,370 to Silver, et al ; 4,766,067 to Biswas; 4,656,134 to Ringold) 및, 표적 서열에 대해 이중-가닥 DNA합성을 위한 템플레이트로서 안티-센스 RNA를 사용하는 RNA 매개된 증폭(U. S. Patent No. 5,130,238 to Malek, et al, with the tradename NASBA),을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다, 참고문헌의 전체 내용이 참고문헌으로서 명세서에 포함됨 (참조, 예를 들면, Ausubel, supra ; 또는 Sambrook, supra.)
예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술은 본발명의 폴리누클레오티드 서열 및 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터의 관련 유전자를 증폭하는데 사용될 수있다. PCR 및 기타 인 비트로 증폭 방법은 또한 예를 들면, 발현되는 단백질을코드하는 핵산을 콜론하고, 샘플 내의 소망 mRNA의 존재를 검출하귀 위한 프로브로서 사용하는 핵산을 제조하거나, 핵산 시퀀싱 또는 기타 목적에 유용하다. 인 비트로 증폭방법을 통한 당업자에게 충분한 기술의 예는 Berger, supra, Sambrook, supra, 및 Ausubel, supra, 및 Mullis, et al., U. S. Patent No. 4,683,202 (1987); 및 Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods 및 Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990)에서 찾을 수 있다. PCR 증폭을 위한 상업적으로 이용가능한 키트도 업계에 공지되어 있다. 참조, 예를 들면, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). 부가적으로, 예를 들면, T4 유전자 32 단백질 (Boehringer Mannheim)은 긴 PCR 생성물을 만드는데 사용될 수 있다.
핵산 구축을 위한 합성 방법
본발명의 분리된 핵산은 또한 공지 방법에 의해 직접적 화학 합성으로 제조될 수 있다(참조, 예를 들면, Ausubel, et al., supra). 화학적 합성은 일반적으로 단일-가닥 올리고누클레오티드를 생성하는데, 이는 상보적 서열과의 혼성화, 또는 단일 가닥을 템플레이트로서 사용하여 DNA 폴리머라제에 의해 폴리머화에 의해 이중-가닥 DNA로 전환된다. 당업자라면 DNA의 화학적 합성이 약 100 또는 그 이상의 염기의 서열에 제한될 수 있는 반면, 더 긴 서열이 더 짧은 서열의 결찰에의해 얻어질 수 있다는 인식할 것이다.
재조합 발현 카세트
본발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 추가로 제공한다. 본 발명의 핵산 서열은, 예를 들면 본 발명의 항체를 엔코드하는 cDNA 또는 게놈 서열은 최소한 하나의 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수있는 재조합 발현 카세트를 구축하는데 사용될 수있다. 재조합 발현 카세트는 원하는 숙주 세포 내에서 폴리누클레오티드의 전사를 명령하는 전사 개시 조절 서열에 기능적으로 연결되는 본 발명의 폴리누클레오티드를 전형적으로 포함한다. 이인성 및 비-이인성(즉, 내인성) 프로모터는 본 발명의 핵산의 발현을 지시하는데 사용될 수 있다.
어떤 구체예에서, 프로모터, 인핸서, 또는기타 요소로서 작용하는 분리된 핵산은 본 발명의 폴리누클레오티드의 비-외인성 형태의 적절한 위치(위쪽, 아래쪽 또는 인트론 내)에서 도입될 수 있어 본 발명의 폴리누클레오티드의 발현을 높거나 낮게 조절한다. 예를 들면, 내인성 프로모터는 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 인비보 또는 인 비트로에서 변경될 수 있다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 본 발명의 분리된 핵산 분자, 재조합 벡터와 유전공학적으로 설계 적된 숙주 세포, 및 널리 알려진 재조합 기술에 의해 최소한 하나의 항-IL-12 항체의 생산에 관한 것이다. 참조, 예를 들면, Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra, 각각은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
폴리누클레오티드는 숙주 내에서 전파를 위한 선택가능한 마커를 함유한 벡터에 임의로 결합될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 칼슘 인산염 침전물같은 침전물 내, 또는 대전된 지방과의 복합체 내에 도입된다. 벡터가 바이러스라면, 적절한 충전 세포주를 이용하여 인비트로에서 충전되고, 이후 숙주 세포 내로 형질변환된다.
DNA 삽입물은 적절한 프로모터에 기능적으로 연결되어야 한다. 발현구성체는 전사 개시, 종결요 부위 및 전사된 영역에서, 번역에 대한 리보솜 결합 부위 를 추가로 포함한다. 구성체에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은 포유동물 또는 진핵 세포 발현에 대해 바람직한 UAA 및 UAG와함께, 번역될 mRNA의 말단에 적절히 위치한 개시 및 종결 코돈 (예를 들면, UAA, UGA 또는 UAG)에서 개시하는 번역부위를 포함한다.
발현 벡터는 최소한 하나의 선택가능한 마커를 바람직하게는 임의적으로 포함한다. 그러한 마커는 예를 들면, 메토트랙세이트 (MTX), 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR, US Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017), 진핵 세포 배양에 대한 암피실린, 네오마이신(G418), 마이코페놀산, 또는 글루타민 신테타제 (GS,US Pat. Nos. 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739) 내성, 및 E. coli 및 기타 박테리아 또는 진핵세포 배양에서의 테트라 사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다(상기 특허는 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨). 상기 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 업계에 공지되 있다. 적절한 벡터는 당업자에게 명백하다. 숙주 세포로의 벡터 구성체의 도입은 칼슘 포스페이트 형질전환, DEAE-텍스트란 매개된 형질감염, 양이온 지질-매개된 형질감염, 전기영동,형질전환, 감염 기타 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 방법은 Sambrook, supra, Chapters 1-4 및 16-18 ; Ausubel. supra, Chapters 1,9,13,15,16과 같은 선행기술에 기술되어 있다.
최소한 하나의 본발명의 항체는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현되고, 분비 신호뿐만 아니라 부가적 외인성 기능 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 부가적 아미노산, 특히 대전된 아미노산의 영역은 정제 도중, 또는 연속적인 취급 및 저장 도중, 숙주 세포 내에서 안정성 및 일관성을 향상시키는 항체의 N-말단에 부가될 수있다. 또한, 펩티드 부분은 항체 또는 그의 최소한 하나의 단편의 최종 제조 이전에 제거될 수 있다. 그러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어 있다. Sambrook, supra, Chapters 17.29-17.42 및 18.1-18.74; Ausubel, supra, Chapters 16,17 및 18.
당업자는 본 발명의 단백질을 엔코드하는 핵산의 발현에 이용가능한 수많은 발현 시스템에 대해 잘 알고 있다.
택일적으로, 본 발명의 핵산은 본 발명의 항체를 엔코드하는 내인성 DNA를 함유한 숙주 세포 내에서 턴온(조작에 의해)에 의해 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다. 그러한 방법은 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, US patent Nos. 5,580,734,5,641,670,5,733,746, 및 5,733,761, 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
항체, 그의 특이적 부분 또는 변이체의 생산에 유용한 세포 배양물의 예는 포유동물 세포이다. 포유동물 세포계는 종종 포유 동물 세포 현탁액 또는 바이오리액터가 사용될 지라도 세포의 단층 형태이다. 완전 글리코실레이트화된 단백질을 발현할 수 있는 수많은 적절한 세포주가 업계에 개발되어 있고, COS-1 (예를 들면, ATCC CRL 1650), COS-7 (예를 들면, ATCC CRL1651), HEK293, BHK21 (예를 들면, ATCC CRL-10), CHO (예를 들면, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1 (예를 들면,ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하는데, 이들은 예를 들면, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www. atcc. org)으로부터 구입가능하다. 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8. 653 세포 (ATCC Accession Number CRL-1580) 및 SP2/0-Agl4 세포 (ATCC Accession Number CRL-1851)이다. 특히 바람직한 구체예에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8. 653 또는 a SP2/0-Agl4 세포이다.
이들 세포에 대한 발현 벡터는 복제 기원; 프로모터(예를 들면, 후기(late) 또는 추기(early) SV40 프로모터, CMV 프로모터 (US Pat. Nos. 5, 168, 062 ; 5, 385. 839), HSV tk 프로모터, a pgk (포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터 (US Pat. No.5, 266,491), 최소한 하나의 인간 이뮤노글로불린 프로모터; 인핸서, 및/또는 RNA 스플라이스 부위같은 처리 정보 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들면, SV40 large T Ag poly A 부가 부위), 및 전사 종결자 서열 같은 다음 발현 조절 서열을 하나 이상 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 참조, 예를 들면, Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra. 본발명의 핵산 또는 단백질의 생산에 유용한 다른 세포는 예를 들면 the American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines 및 Hybridomas(www. atcc. org) 또는 기타 공지된 또는 상업적 공급원으로부터 공지되었거나 구입가능하다.
진핵 숙주 세포가 사용된 때, 폴리아데닐화 또는 전사 종결자 서열은 벡터에 전형적으로 함입된다. 종결자 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데일화 서열이다. 전자의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함된다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40으로부터의 VPI 인트론이다 (Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-781 (1983)). 부가적으로, 숙주 세포 내의 복제를 조절하는 유전자 서열은 널리 공지된 바와 같이 벡터내로 합입될 수 있다.
항체의 정제
항-IL-12 항체는 단백질 A 정제, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교한 크로마토그래피, 포스포셀루롤스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파티트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포하하지만 이에 제한되지 않는 널리 공저된 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제된다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")는 정제를 위해 또한 사용될 수 있다 참조, 예를 들면, Colligan, Current Protocols in Immunology, 또는 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), 예를 들면, Chapters 1, 4,6,8,9,10, 각각은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
본발명의 항체는 자연적으로 정제된 생성물, 화하 합성 절차의 생서움ㄹ, 예를 들면, 이스트, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포와 같은 진핵 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생성 절차에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실레이트되거나 또는 비-글리코실레이트될 수 있다. 그러한 방법은 많은 표준 매뉴얼에 기술되어 있다. Sambrook, supra,Sections 17.37-17.42; Ausubel, supra, Chapters 10,12,13,16,18 및 20, Colligan, Protein Science, supra, Chapters 12-14, all 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함됨.
항-IL-12 항체
분리된 본발명의 항체는 본 명세서에서 논의된 바와 같이 본 발명의 폴리누클레오티드의 최소한 하나에 의해 엔코드된 항체, 또는 분리되거나 제조된 항체를 포함한다. 바람직하게는, 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IL-12에 결합하고, 이에 의해 부분적으로 또는 상당히 단백질의 최소한 하나의 생물학적 활성을 중화시킨다. 항체, 그의 특이적 부분 또는 변이체는, 최소한 하나의 IL-12 단백질 또는 단편의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 상당히 중화시키고 단백질 또는 단편에 결합하여 IL-12의 IL-12 수용체에 대한 결합 또는 기타 IL-12-의존적 또는 매개된 매카니즘에 의해 활성을 저해한다. 본 명세서에서, 용어 "중화 항체"는 약 20-120%, 바람직하게는 최소한 약 10,20,30,40,50,55,60,65,70,75,80, 85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100% 또는 더욱 시험에 의존적으로 IL-12-의존적 활성을 저해할 수 있다. IL-12-의존성 활성을 저해하는 항-IL-12 항체의 용량은 본명세서에 기술된 및또는 업계에 널리 공지되어 있는 바와 같이 최소한 하나의 적절한 IL-12 단백질 또는 수용체 분석에 의해 바람직하게는 평가된다. 본 발명의 인간 항체는 어떠한 종류(IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) 또는 이소타입일 수 있고 kappa 또는 lambda 경사슬을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 항체는 IgG 중사슬 또는 정의된 단편, 예를 들면, 최소한 하나의 이소타입, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함한다. 이 타입의 항체는 최소한 하나의 인간 경사슬 (예를 들면, IgG, IgA 및 IgM (예를 들면, γl, γ2, γ3, γ4) 을 포함하는, 형질전환 마우스 또는 기타 형질전환 비-인간 포유동물을 사용하여 제조될 수있다. 또다른 구체예에서, 항-인간 IL-12 인간 항체는 IgG1 중사슬 및 IgG1 경사슬을 포함한다.
본발명의 최소한 하나의 항체는 최소한 하나의 IL-12 단백질, 서브유닛, 단편, 부분 또는 이들의 조합에 대해 특이적인 최소한 하나의 특정화된 에피토프에 결합한다. 최소한 하나의 에피토프는 최소한 하나의 부분의 상기 단백질을 포함하는 최소한 하나의 항체 결합 영역을 포함하고 에피토프는 바람직하게는 최소한 하나의 세포외, 가용, 친수성, 외부 또는 상기 단백질의 세포기질부분으로 구축된다. 최소한 하나의 특정화된 에피토프는 서열 식별 번호 : 9의 인접한 아미노산 특정화된 부분에 대한 최소한 1-3 아미노산의 최소한 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 항원-결합 영역은 최소한 하나의 중사슬 가변 영역의 최소한 하나의 인간 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3) 또는 변이체 및 최소한 하나의 경사슬 가변 영역의 최소한 하나의 인간 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3) 또는 변이체를 포함한다. 비제한적 예로서 항체 또는 항원-결합 부분 또는 변이체는 서열 식별 번호 : 3의 아미노산 서열을 갖는 최소한 하나의 중사슬 CDR3 및/또는 서열 식별 번호 : 6의 아미노산 서열을 갖는 경사슬 CDR3를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서 항체 또는 항원-결합 단편은 CDRs 1, 2 및/또는 3 (예를 들면. 서열 식별 번호: 1. 2, 및/또는 3)에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 최소한 일부분의 최소한 하나의 중사슬 CDR (즉, CDR1, CDR2 및 : 또는 CDR3)를 포함하는 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. 특히 일면에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 상응하는 CDR 1,2 및/또는 3의 아미노산 서열 (예: 서열번호: 1, 2, 및/또는 3)을 갖는 적어도 하나의 중쇄 CDRs (즉, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)을 포함하는 항원-결합 부위를 가질 수 있다. 또다른 일면으로 항체 또는 항원-결합 부위 또는 변이체는 상응하는 CDR 1,2 및/또는 3의 아미노산 서열 (예: 서열번호: 1, 2, 및/또는 3)을 갖는 적어도 하나의 경쇄 CDRs (즉, CDR4, CDR5 및/또는 CDR6)을 포함하는 항원-결합 부위를 가질 수 있다. 바람직한 일면에서 항체 또는 항원-결합 단편의 3개의 중쇄 CDRs 및 3개의 경쇄 CDRs는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 mAb 12B75M C340의 상응하는 CDRs의 아미노산 서열을 갖는다. 그러한 항체는 통상의 기술을 사용하여 항체의 다양한 부위(예: CDRs, 프레임워크)를 함께 화학적으로 연결시키거나, 재조합 DNA 기술의 통상의 방법을 사용하여 항체를 코딩하는 (하나 이상의) 핵산 분자를 제조하고 발현시키거나 다른 적절한 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
항-IL-12 항체는 정의된 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 가변 부위을 포함할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 일면에서 항-IL-12 항체는 임의로 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 중쇄 가변 부위 및/또는 임의로 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 경쇄 가변 부위를 포함한다. 인간 IL-12에 결합하고 정의된 중 또는 경쇄 가변 부위를 포함하는 항체를 적절한 방법, 예로서 파지 디스플레이(Katsube, Y., et al., Int JMol. Med, 1 (5) : 863-868 (1998)) 또는 본 분야에 공지되었고/거나 본 명세서에 기재된 유전자도입 동물을 사용하는 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 기능상 재배열된 인간 이뮤노글로블린 중쇄 트랜스진 및 기능상 재배열될 수 있는 인간 이뮤노글로블린 경쇄 로커스로부터의 DNA를 포함하는 트랜스진을 포함하는 유전자도입 마우스를 인간 IL-12 또는 그의 단편으로 면역화하여 항체의 생산을 유도할 수 있다. 원하는 경우, 항체 생산 세포가 분리될 수 있고 하이브리도마 또는 다른 무한증식 항체-생산 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같고/거나 본 분야에 공지된 바와 같이 제조될 수 있다. 또한, 항체, 특정 부위 또는 변이체는 적절한 숙주 세포에서 코딩 핵산 또는 그의 부위를 사용하여 발현시킬 수 있다.
본 발명은 또한 항체, 항원-결합 단편, 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로블린 쇄 및 CDRs에 관한 것이다. 바람직하게 상기 항체 또는 항원-결합 단편 및 상기 쇄 또는 CDRs를 포함하는 항체는 고결합능(예: KD 약 10-9 M 보다 적거나 동일)으로 인간 IL-12와 결합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환, 및 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 첫 번째 아미노산의 것과 유사한 화학적 및/또는 물리적 성질(예: 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 갖는 두 번째 아미노산에 의해 첫 번째 아미노산의 대체를 언급한다. 보존적 치환은 하나의 아미노산을 하기 그룹내 또다른 것으로 대체하는 것을 포함한다: 리신 (K), 아르기닌(R) 및 히스티딘 (H); 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E); 아스파라긴 (N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신 (I), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C) 및 글리신(G); F, W 및 Y; C, S 및 T.
아미노산 코드
본 발명의 항-IL-12 항체를 구성하는 아미노산을 때로 약어로 기재한다. 아미노산 명칭은 본 기술에서 잘 이해되듯이 아미노산을 그의 단일 문자 코드, 그의 세 문자 코드, 명칭, 또는 3개의 뉴클레오타이드 코돈에 의해 표시될 수 있다(참조예, Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994).
단일 문자 코드 3 문자 코드 명칭 3 뉴클로에타이드 코돈
A Ala 알라닌 GCA, GCC, GCG, GCU
C Cys 시스테인 UGC, UGU
D Asp 아스파르트산 GAC, GAU
E Glu 글루탐산 GAA, GAG
F Phe 페닐알라닌 UUC, UUU
G Gly 글리신 GGA, GGC, GGG, GGU
H His 히스티딘 CAC, CAU
I Ile 이소류신 AUA, AUC, AUU
K Lys 리신 AAA, AAG
L Leu 류신 UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M Met 메티오닌 AUG
N Asn 아스파라긴 AAC, AAU
P Pro 프롤린 CCA, CCC, CCG, CCU
Q Gin 글루타민 CAA, CAG
R Arg 아르기닌 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S Ser 세린 AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T Thr 트레오닌 ACA, ACC, ACG, ACU
V Val 발린 GUA, GUC, GUG, GUU
W Trp 트립토판 UGG
Y Tyr 티로신 UAC, UAU
본 발명의 항-IL-12 항체는 본 명세서에 구체화된 것과 같이 자연발생 돌연변이 또는 인간 조작으로부터 하나 이상의 아미노산 치한, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다.
물론, 기술자에 의한 아미노산 치환의 수는 예로서 상기 기재된 것을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 일반적으로 말하면 주어진 항-IL-12 항체에 대한 아미노산 치환, 삽입 또는 결실의 수는 본 명세서에 구체화된 바와 같이 40 보다 크지 않을 것이며, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, l, 이를테면 1-30 또는 그 값 또는 범위내일 것이다.
기능상 필수적인 본 발명의 항-IL-12 항체내 아미노산은 본 분야에 공지된 방법, 예로서, 위치-유도 돌연변이(site-directed mutagenesis) 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이(예: Ausubel, supra, Chapters 8,15; Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989))에 의해 동정할 수 있다. 후자의 방법은 분자내 모든 잔기마다 단일 알라닌을 도입한다. 이어서 생성된 돌연변이 분자를 생물학적 활성, 예로서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 IL-12 중화 활성에 대하여 시험한다. 항체 결합에 중요한 위치를 구조 분석, 예로서 결정화, 핵자기공명 또는 광친화성 표식법(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255 : 306-312 (1992)에 의해 동정할 수 있다.
본 발명의 항-IL-12 항체는 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6의 인접 아미노산 중 5개 내지 모두로부터 선택되는 적어도 하나의 부위, 서열 또는 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 IL-12 항체 또는 특정 부분 또는 변이체는 서열 번호: 1, 5 내지 17의 인접한 아미노산, 서열 번호: 2, 5 내지 10의 인접한 아미노산, 서열 번호: 3, 5 내지 11의 인접한 아미노산, 서열 번호: 4, 5 내지 7의 인접한 아미노산, 서열 번호: 5, 5 내지 9의 인접한 아미노산, 서열 번호: 6의 인접한 아미노산; 서열 번호:7의 류신 21, 리신 76, 메티오닌 83, 세린 85의 적어도 3 내지 5로부터 선택된 하나의 부분, 서열 또는 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한하지는 않는다.
추가로 항-IL-12 항체는 임의로 적어도 하나의 70-100%의 적어도 하나의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 5, 17, 10, 11, 7, 9, 119, 또는 108 인접한 아미노산의 폴리펩티드를 포함한다.
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일면에서, 이뮤노글로블린 쇄, 또는 그의 부분(예: 가변 부위, CDR)의 아미노산 서열은 적어도 하나의 서열번호: 7, 8의 상응하는 쇄의 아미노산 서열에 대하여 약 70-100% 아이덴터티 (예: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 값 또는 범위내)를 갖는다. 예를 들면, 경쇄 가변 부위의 아미노산 서열을 서열번호 : 8과 비교할 수 있거나, 중쇄 가변 부위의 아미노산 서열을 서열번호 : 3과 비교할 수 있다. 바람직하게, 70-100% 아미노산 아이덴터티 (즉, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 값 또는 범위내)는 본 분야에 공지된 바와 같이 적절한 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 측정한다.
실례의 중쇄 및 경쇄 가변 부위 서열은 서열번호: 7, 8에 제공된다. 본 발명의 항체, 또는 특정 변이체는 어느 갯수의 본 발명의 항체로부터의 인접한 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 여기에서 갯수는 항-TNF 항체내 인접하는 잔기 갯수의 10-100%로 구성된 정수 그룹으로부터 선택된다. 임의로 인접하는 아미노산의 이 서열의 길이는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250개 이상의 아미노산또는 그 값 또는 범위내이다. 추가로 상기 서열의 갯수는 1 내지 20, 예로서 적어도 2, 3, 4, 또는 5으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 정수일 수 있다.
숙련자가 이해하듯이, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 항체를 포함한다. 생물학적으로 활성인 항체는 본래의(비-합성), 내인성 또는 관련되고 공지된 항체의 것과 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 및 바람직하게 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 및 가장 바람직하게 적어도 80%, 90%, 또는 95%-1000%로 특이 활성을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성을 평가하고 측량하는 방법은 본 분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있다.
또다른 일면으로 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 유기 부위의 공유결합에 의해 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 상기 변형으로 개선된 약동학적 성질(예: 생체내 혈청 반감기 증가)을 갖는 인간 항체 및 항원-결합 단편을 생산할 수 있다. 유기 부위는 선형 또는 분지형 친수성 폴리머 그룹, 지방산 그룹, 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 있다. 특정 일면에서, 친수성 폴리머 그룹 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고 폴리알칸 글리콜 ( 예: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)), 카보하이드레이트 폴리머, 아미노산 폴리머 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹은 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 항체 및 항원-결합 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 하나 이상의 유기 부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 결합하는 각각의 유기 부위는 독립적을 폴리머 그룹, 지방산 그룹 또는 지방산 에스테르 그룹일 수 이다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "지방산"은 모노-카복실산 및 디-카복실산을포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어로서 "친수성 폴리머 그룹"은 옥탄보다 물중에서 더욱 가용성인 유기 폴리머를 언급한다. 예를 들면, 폴리리신은 옥탄보다 물중에서 더욱 가용성이다. 따라서, 폴리리신의 공유결합에 의해 변형된 항체가 본 발명에 포함된다. 폴리리신의 공유결합에 의해 변현된 항체는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체를 변형시키기에 적절한 친수성 폴리머 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들면, 폴리알칸 글리콜 (예: PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), PPG 등), 카보하이드레이트 (예: 덱스트란, 셀룰로스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 등), 친수성 아미노산의 폴리머(예: 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트 등), 폴리알칸 옥사이드 (예: 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 항체를 변형하는 친수성 폴리머는 분리된 분자 엔터티로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들면, PEG5000 및 PEG20000(여기에서, 아랫첨자는 폴리머의 평균 분자량(달톤)이다)이 사용될 수 있다. 친수성 폴리머 그룹은 1 내지 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 그룹으로 치환된 친수성 폴리머를 적절한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 아민 그룹으로 포함하는 폴리머는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르상의 활성화된 카복실레이트(예: N, N-카보닐 디이미다졸로 활성화됨)는 폴리머상의 하이드록실 그룹과 커플링될 수 있다.
본 발명의 항체를 변형하는데 적합한 지방산과 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체를 변형하는데 적합한 지방산은 예를 들어 n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-아이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), 시스-Δ9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 모든 시스-Δ5,8,11,14-아이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄디오익 산, 테트라데칸디오익 산, 옥타데칸디오익 산, 도코산디오익 산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 직쇄 또는 측쇄 저급 알킬 그룹을 포함하는 디카복실산의 모노-에스테르를 포함한다. 저급 알킬 그룹은 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소원자를 포함할 수 있다.
변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 이를테면 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "변형제"는 활성화 그룹을 포함하는 적합한 유기 그룹(예, 친수성 폴리머, 지방산, 지방산 에스테르)을 뜻한다. "활성화 그룹"은 적당한 조건하에, 제 2의 화학 그룹과 반응하여 변형제와 제 2의 화학 그룹 사이의 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 부분 또는 작용 그룹이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화 그룹은 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시석신이미딜 에스테르(NHS), 등과 같은 친전자성 그룹을 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 그룹은 예를 들어 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴롤일, 피리딜 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올), 등을 포함한다. 알데히드 작용 그룹은 아민- 또는 하이드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있으며, 아지드 그룹은 3가 인 그룹과 반응하여 포스포라미데이트 또는 포스포이미드 결합을 형성할 수 있다. 활성화 그룹을 분자로 도입하는 적합한 방법은 본 기술에 알려져 있다(참조예, Hermanson, G. T., Bioconjtzgate Techniques. Academic Press: San Diego, CA (1996)). 활성화 그룹은 유기 그룹(예, 친수성 포리머, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접, 또는 링커 부분, 예를 들어 2가 C1-C12 그룹(여기서 아니 이상의 탄소원자는 산소, 질소 또는 황과 같은 헤테로원자에 의해 대체될 수 있음)을 통해 결합될 수 있다. 적합한 링커 부분은 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- 및 -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-를 포함한다. 링커 부분을 포함하는 변형제는 예를 들어 모노-Boc-알킬디아민(예, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)의 존재하에 지방산과 반응시켜 유리 아민과 지방산 카복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. Boc 보호 그룹을 트리플루오로아세트산(TFA)과의 처리에 의해 생성물로부터 제거하여 기재된 바와 같이 또다른 카복실레이트에 커플링될 수 있거나, 무수 말레산과 반응시키고 생성된 생성물을 고리화 하여 지방산의 활성화 말레이미도 유도체를 제조할 수 있는 1차 아민을 노출시킬 수 있다(참조예, Thompson, et al., WO 92/16221, 전체 교시 내용은 본 발명에서 참고문헌에 속함).
본 발명의 변형된 항체는 인간 항체 또는 항원-결합 단편을 변형제와 반응시켜 제조될 수 있다. 예를 들어, 유기 부분은 아민-반응성 변형제, 예를 들어, PEG의 NHS 에스테르를 사용함으로써 위치-특이성이 없는 방식으로 항체에 결합될 수 있다. 변형된 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 항체 또는 항원 단편의 디설파이드 결합(예, 사슬내 디설파이드 결합)을 환원시킴으로써 제조될 수 있다. 환원된 항체 또는 항원-결합 단편을 티올-반응성 변형제와 반응시켜 본 발명의 변형된 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 항체의 특이 부위에 결합되는 유기 부분을 포함하는 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 이를테면 리버스 단백질가수분해를 이용하여 제조될 수 있다(Fisch et al., Bioconjtzgate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen etal., Bioconfugate Chem., 5: 411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6 (10): 2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24 (1) : 59-68 (1996) ; Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56 (4): 456-463 (1997)), and the methods described in Hermanson, G. T., Bioconjzlgate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)).
항-IL-12 항체 조성물로 항-아이디오타이프 항체
모노클로날 또는 키메릭 항-TNF 항체에 더하여, 본 발명은 또한 이와 같은 본 발명의 항체에 대해 특이한 항-아이디오타이프(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 일반적으로 다른 항체의 항원-결합 영역에 연관된 유일한 디터미넌트를 인식하는 항체이다. 항-Id는 항체 또는 그의 CDR 함유 영역을 가진 Id 항체원으로서 동일 종 및 유전형(예 생쥐 스트레인)의 동물을 면역화 하여 제조될 수 있다. 면역화 동물은 면역화 항체의 아이디오타이픽 디터미넌트를 인식하고 반응하여 항-Id 항체를 생성할 것이다. 항-Id 항체는 또한 소위 항-항-Id 항체를 생성하는, 또다른 동물의 면역 반응을 유발하도록 "이뮤노겐"으로서 사용될 수 있다.
항-IL-12 항체 조성물
본 발명은 또한 본 발명에서 기재되고/되거나 본 기술에서 알려진, 적어도 하나, 적어도 두 개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 이상의 항-IL-12 항체를 함유하며 비자연적 발생 조성물, 혼합물 또는 형태로 제공되는 적어도 하나의 항-TNF 항체 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그의 특정 단편, 도메인 또는 변이체의 인접 아미노산 70-100%로 구성된 그룹 중에서 선택된 항-IL-12 항체 아미노산 서열의 적어도 하나 또는 2개의 완전 길이, C- 및/또는 N-말단 삭제 변이체, 도메인, 단편, 또는 특정 변이체를 포함한 비자연적 발생 조성물을 함유한다. 바람직한 항-IL-12 항체 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그의 특정 단편, 도메인 또는 변이체 70-100%의 항-IL-12 항체 서열 중 적어도 하나의 CDR 함유 부분으로서 적어도 하나 또는 2개의 완전 길이, 단편, 도메인 또는 변이체를 포함한다. 더욱 바람직한 조성물은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그의 특정 단편, 도메인 또는 변이체 70-100% 중 적어도 하나의 40-99%를 포함한다. 이러한 조성물 퍼센트는 본 기술에 공지되거나 본 발명에서 기재된 바와 같이, 액체 또는 무수 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀전 또는 콜로이드로서 중량, 부피, 농도, 몰농도, 몰랄농도에 의한 것이다.
본 발명의 항-IL-12 항체 조성물은 또한 이러한 조작, 처리 또는 치료가 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 하나의 항-TNF 항체를 함유한 적어도 하나의 조성물 또는 의약 조성물의 적당량 및 유효량을 포함할 수 있으며, 임의로 적어도 하나의 TNF 안타고니스트(예, TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 리셉터 또는 그의 단편, 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 안타고니스트, 그러나 이들에 한정되지 않음), 항류머티즘제(예, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 소듐 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 설파잘진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제(예, 아미노글리코사이드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 또다른 항균제), 건선치료제, 크르티코스테로이드, 아나볼릭 스테로이드, 당노병 관련 치료제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀(GM-CSF, Leukine), 면역제, 이뮤노글로블린, 면역억제제(예, 바실릭시마브, 사이클로스포린, 다클리주마브), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 리셉터 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사약물, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항울제, 항조병제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 아고니스트, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도나제 알파(Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 안타고니스트 중에서 선택된 적어도 하나를 포함한다. 이러한 사이토카인의 비제한적인 일예는 IL-1 내지 IL-23을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 적합한 투여량은 본 기술에서 잘 알려져 있다(Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), 각 문헌은 본 발명에서 전적으로 참고문헌에 속한다).
그러한 항암제 또는 항감염제는 최소한 하나의 본발명의 항체와 결합, 조합, 투여 또는 공동-제제화된 톡신 분자를 포함할 수 있다. 톡신은 병원 세포 또는 조직을 선택적으로 죽이는 작용을 할 수 있다. 병원은 톡신의 최소한 하나의 기능적 세포독성 도메인, 예를 들면, 리신, 디프테리아 톡신, 베놈 톡신, 또는 박테리아 톡신으로부터 선택된 것을 포함하는 정제된 또는 재조합 톡신 또는 톡신 단편일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 톡신은 어떠한 자연적으로 발생한, 인간 및 기타 포유동물에서, 죽음에 이를 수도 있는 톡신 쇼크를 포함하는 병적 이상을 일으킬 수 있는 돌연변이 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스에 의해 생성될 수 있는 엔도톡신 또는 엑소톡신을 모두 포함할 수 있다. 그러한 톡신은, 장독성 E. coli 열-불안정 엔테로톡신(LT), 열-안정 엔테로톡신(heat-stable 엔테로톡신 (ST)), Shigella 시토톡신, Aeromonas 엔테로톡신, 독성 쇼크증상 톡신-1 (TSST-1), Staphylococcal 엔테로톡신 A (SEA), B (SEB), 또는 C (SEC), Streptococcal 엔테로톡신 등. 그러한 박테리아는 장독성 E. coli (ETEC), 장출혈 E. coli (예를 들면, strains of serotype 0157: H7), Staphylococcus 종 (예를 들면, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogrnrs), shigella 종 (예를 들면, Sltigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, 및 Shigella sonnei), Salmonella 종 (예를 들면, Salmonella typhi Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), Clostridium 종 (예를 들면, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), Camphlobacter 종 (예를 들면, Camphlobacterjejuni, Camphlobacter fetus), Heliobacter 종, (예를 들면, Heliobacter pylori), Aeroinonas 종 (예를 들면, Aeromonas sobria, Aerornonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisornonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrios 종 (예를 들면, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), Klebsiella 종, Pseudomonas aeruginosa, 및 Streptococci를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 참조, 예를 들면, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown 및 Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology 및 대조(Contol), 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991) ; Mandell et al, Principles 및 Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone. New York (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck 및 Co., Rahway, N. J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76: 121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248 : 705-711 (1990), 참고문헌의 내용은 전체가 본명세서에 참고문헌으로서 포함된다.
본 발명의 항-IL-12 항체 화합물, 조성물 또는 이들의 조합은 희석제, 결합제, 안정화제, 버퍼, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 최소한 하나의 보조제를 추가로 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 보조제가 바람직하다. 그러한 무균 용액의 제조 방법의 비제한적 예는 Gennaro, Ed., Rentington's Pharrnaceutical Sciences, 18h Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 선행기술에 널리 공지되어 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 업계에 널리공지되거나 본명세서에 기술된 바와 같이 투여방법, 항-IL-12 항체, 단편 또는 변이체 조성물의 용해도 및또는 안정성에 적합하도록 루틴하게 선택될 수있다.
본발명에 유용한 약제학적 부형제 및 첨가제는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지방, 및 탄수화물(예를 들면, 모노사카리드, 디-, 트리-, 테트라-, 및 올리고사카리드 같은 당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등 유도된 당류; 및 다당류 및 당 폴리머)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 사용되고, 단독 또는 1-99.99% 중량 또는 부피%의 조합을 포함한다. 예시적 단백 부형체는 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카제인 등과 같은 혈청 알부민을 포함한다. 버퍼 용량에서도 역할을 갖는, 대표적 아미노산/항체 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파라트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함한다. 바람직한 아미노산은 글리신이다.
본발명에 사용에 적합한 탄수화물 부형제는, 예를 들면 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등의 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스등의 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등의 다당류; 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 솔비톨(글루시톨), 미오이노시톨 등의 알디톨을 포함한다. 본발명에서 사용에 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스, 및 라피노스이다.
항-IL-12 항체 조성물은 버퍼 또는 pH 조절제를 포함할 수 있다; 대표적으로, 버퍼는 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 버퍼는 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염과 같은 유기산염; Tris, 트로메타민 염산, 또는 포스페이트 버퍼를 포함한다. 본발명에의 사용에 바람직한 버퍼는 시트레이트와 같은 유기산염이다.
부가적으로, 본발명의 항-IL-12 항체 조성물은 폴리비닐피롤리돈, 피콜스(중합 슈거), 덱스트레이트(예를 들면, 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 같은 시클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향료, 살균제, 감미제, 항산호제, 정균제, 계면활성제(예를 들면, "TWEEN 20" 및"TWEEN 80" 같은 폴리소르베이트), 지방 (예를 들면, 포스포리피드, 지방산), 스테로이드 (예를 들면, 콜레스테롤), 및 킬레이트제 (예를 들면, EDTA)와 같은 폴리머 부형제/첨가제를 포함할 수있다.
본 발명의 항-IL-12 항체, 부분 또는 변이체에 사용하는데 적합한 이들 및 부가적 공지 약제학적 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들면, "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19'h ed., Williams & Williams, (1995), 및 in the"Physician's Desk Reference", 52"d ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)에 공지되어 있고, 그 개시내용은 전체가 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물 (예를 들면, 당류 및 알디톨) 및 버퍼 (예를 들면, 시트레이트) 또는 폴리머제이다.
제제
상기한 바와 같이, 본발명은 안정한 제제를 제공하는데, 이는 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 갖는 포스페이트 버퍼와 더불어 보존된 용액 및 보존제를 함유하는 제제와 더불어 약제학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도 보존된 제제이고, 약제학적으로 허용가능한 제제 내에 최소한 하나의 항-IL-12 항체를 포함한다. 보존된 제제는 최소한 하나의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 페닐머큐릭 니트리트, 페녹시에탄올, 포름알데히드 클로로부탄올, 마그네슘 클로라이드(예를 들면, 6수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 디히드로아세테이트 및 티머로살, 또는 수성 희석제 내의 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 임의로 선택된 최소한 하나의 공지된 보존제를 포함한다. 적절한 농도 또는 혼합물은 0.001-5%, 또는 그 범위내의 어떤 범위 또는 값과 같이 업계에 공지된 바대로 사용될 수 있고, 0.001,0.003,0.005,0.009,0.01,0.02,0.03,0.05, 0.09,0.1,0.2,0.3,0.4.,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7, 3.8,3.9,4.0,4.3,4.5, 4.6,4.7,4.8,4.9, 또는 그 범위내의 어떤 범위 또는 값을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 비제한적 예는 보존제를 포함하지 않거나, 0.1-2% m-크레졸 (예를 들면, 0.2,0.3.0.4,0.5,0.9,1.0%), 0.1-3% 벤질 알콜 (예를 들면, 0.5,0.9,1.1., 1.5,1.9,2.0,2.5%), 0.001-0.5% 티머로살 (예를 들면, 0.005,0.01), 0.001-2.0% 페놀 (예를 들면, 0.05,0.25,0.28,0.5,0.9,1.0%), 0.0005-1.0% 알킬파라벤 (s) (예를 들면, 0.00075, 0.0009,0.001,0.002,0.005,0.0075,0.009,0.01,0.02,0.05,0.075,0.09,0.1,0.2,0.3,0.5,0.75, 0. 9,1.0%), 등을 포함한다.
상기한 바와 같이, 본발명은 충전 물질 및 임의로 수성 희석제 내의 처방된 버퍼 및/또는 보존제와 함께 최소한 하나의 항-IL-12 항체의 용액을 포함하는 최소한 하나의 바이알을 포함하는, 제조기술을 제공하는데, 여기서 충전 물질은 그러한 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 시간 또는 그 이상의 시간 동안 사용가능함을 표시하는 라벨을 포함한다. 본발명은 충전 물질 및 동결건조된 항-IL-12 항체를 포함하는 제 1 바이알 및, 처방된 버퍼 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제 2 바이알을 포함하는 제조기술을 제공하는데, 충전물질은 수성 희석제 내의 최소한 하나의 항-IL-12 항체는 24 시간 또는 그 이상의 시간 동안 사용가능한 용액을 형성함을 표시하도록 재구성한다는 것을 환자에게 알려주는 라벨을 포함한다.
본발명에 따라 사용되는 최소한 하나의 항-IL-12항체는 포유동물 세포 또는 형질전환 제제를 포함하는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있고, 또는 본명세서에서 기술되거나 업계에 공지된 바와 같 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.
본발명의 생산에서 최소한 하나의 항-IL-12 항체의 범위는 습윤/건조 시스템인 경우, 비록 더 낮거나 높은 농도가 사용가능하고 원하는 전달 매체에 의존적이기, 예를 들면 용액 제제는 피부통과 패취, 폐, 점막투과, 또는 삼투암 또는 마이크로 펌부 방법과 다르지만, 재구성에 의해 약 1.0μg/ml 내지 약 1000 mg/ml 농도의 수율을 포함한다.
바람직하게는 수성 희석제는 약제학적으로 허용가능한 보존제를 포함한다. 바람직한 보존제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 페닐머큐릭 니트리트, 페녹시에탄올, 포름알데히디ㅡ 클로로부탄올, 마그네슘 클로라이드(예를 들면, 6수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 디히드로아세테이트 및 티머로살, 또는 수성 희석제 내의 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 것이다. 제제 내에 사용된 보존제의 농도는 항-미생물 효과를 내기에 충분한 농도이다. 그러한 농도는 선택된 보존제에 의존하고 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
다른 부형제, 예를 들면 등장화제, 버퍼, 항산화제, 보존성 증강제는 희석제에 부가되는 것이 임의적이고 바람직하다. 그리세린과 같은 등장화제는 공지된 농도에서 통상 사용된다. 생리학적으로 허용되는 버퍼는 향상된 pH 제어를 제공하도록 바람직하게는 부가된다. 제제는 약 pH4 내지 약 pH10의 넓은 범위의 pH를 포함하고, 바람직하느 범위는 약 pH5 내지 약 pH이고, 가장 바람직하나 범위는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 바람직하게는 본발명의 제제는 약 6.8 내지 약 7.8 사이의 pH를 갖는다. 바람직한 버퍼는 포스페이트 버퍼, 더욱 바람직하게는 소듐 포스페이트, 특히포스페이트 버퍼된 식염수(PBS)를 포함한다.
Tween 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate), Tween 40 (polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate), Tween 80 (polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate), Pluronic F68 (polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymers), 및 PEG (polyethylene glycol) 또는 polysorbate 20 또는 80 또는 poloxamer 184 또는 188, PIuronic® polyls 같은비이온 계면활성제 , 기타 블록 코-폴리머, EDTA 및 EGTA 같은 킬레이트제 같은 다른 첨가제는 응집을 감소시키기 위해 제제 또는 조성물에 임의로 부가될 수 있다. 이들 첨가제는 펌프 또는 플라스틱 용기가 제제를 투여하는데 사용되면 특히 유용하다. 약제학적으로 허용가능한 계면활성제의 존재는 단백질 응집 성향을 완화한다.
본발명의 제제는 최소한 하나의 항-IL-12 항체 및, 페놀, m-크레졸, p-크레 졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 페닐머큐릭 니트리트, 페녹시에탄올, 포름알데히디ㅡ 클로로부탄올, 마그네슘 클로라이드(예를 들면, 6수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸등), 벤잘코늄 클로라이드, 소듐 디히드로아세테이트 및 티머로살 및 수성 희석제 내의 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 보존재를 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 내의 최소한 하나의 항-IL-12 항체 및 보존제의 혼합은 통상의 용해 및 혼합 절차를사용하여 수행한다. 적절한 제제를 제조하기 위해, 예를 들면, 계량된 양의 버퍼 용액 내의 최소한 하나의 항-IL-12 항체가 소기의 농도에서 단백질 및보존제를 제공하는데 충분한 양의 버퍼된 용액 내의 소기의 보존제와 조합시킨다. 이 방법의 변형법은 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를들면, 성분의 순서가 부가되고, 부가적 첨가제가 사용되는지 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용된 투여 수단 및 농도에 대해 최적화될 수 있는 인자이다.
청구된 제제는 밝은 용액으로서, 또는, 물, 보존제 및또는 부형제, 바람직하게는 포스페이트 버퍼 및/또는 식염수 및 선택된 염을 수성 희석제 내에서 포함하는 제 2 바이얼과 함께 재구성되는 동결건조된 최소한 하나의 항-IL-12 항체를 포함하는 이중 바이알로서 환자에 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요구하는 이중 바이알은 여러번 재사용될 수 있고 단일 또는 여러 주기의 환자 치료에 충분하고 따라서 현재 사용되는 것보다 더욱 편리한 치료 레짐을 제공할 수 있다.
본발명의 제조 기술은 즉시 부터 24 시간 또는 그 이상에 걸쳐 투여하는데 유용하다. 따라서, 현재 청구된 제조 기술은 환자에 상당한 이점을 준다. 본발명의 제제는 약 2 내지 약 40℃의 온도에서 안정하게 보존될 수있고 연장된 시간 동안 생물학적 단백질 활성을 유지하고, 따라서 용액이 6, 12,18, 24,36,48,72, 또는 96 시간 또는 그 이상에 걸쳐 사용될 수 있는 용액을 표시하는 패키지 라벨을 허용한다. 보존된 희석제가 사용된 경우, 그러한 라벨은 1-12 달, 반년, 1년 반, 및/또는 2년의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에서 적어도 하나의 항-IL-12 항체의 용액은 수성 희석제에 적어도 하나의 항체를 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 혼합은 통상의 용해 및 혼합법을 사용하여 수행한다. 적절한 희석제를 제조하기 위하여 예를 들면, 물 또는 완충액중 적절한 적어도 하나의 항체를 단백질 및 임의로 방부제 또는 완충액을 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 배합한다. 본 공정의 변형을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들면, 성분을 가하는 순서, 추가의 첨가제의 첨가 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH 모두 사용되는 투여 방법 및 농도에 최적화될 수 있는 모든 요소이다.
청구하는 제품은 수성 희석제를 포함하는 두번째 바이알과 재구성된 동결된 적어도 하나의 항-IL-12 항체의 바이알을 포함하는 투명한 액제 또는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 액제 또는 재구성될 필요가 있는 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단일 또는 다중 싸이클을 충족시킬 수 있고 따라서 현재 이용할 수 있는 더욱 우수한 통상의 치료 요법을 제공하다.
청구하는 제품은 약국, 병원, 또는 다른 기관 및 기구에 수성 희석제를 포함하는 두번째 바이알과 재구성된 동결된 적어도 하나의 항-IL-12 항체의 바이알을 포함하는 투명한 액제 또는 이중 바이알을 제공하여 환자에 간접적으로 제공될 수 있다. 이 경우 투명 액제는 1리터 이상 일 수 있고, 이는 소량의 적어도 하나의 항체 액제가 소량의 바이알로 전달되기 위해 단회 또는 다회 회수될 수 있고 약국 또는 병원에 의해 손님 및/또는 환자에게 제공되는 다량 저장고를 제공한다.
이들 단일 바이알 시스템을 포함하는 인식 장치는 액제 투여를 위한 펜-인젝터 예로서, BD Pens, BD AutojectorpenR, HumajectR; NovoPenR, B-DRPen, AutoPenR, 및 OptiPenR;, GenotropinPenR, Genotronorm PenR;, Humatro PenR;, Reco-PenR, Roferon PenR, BiojectorR;, ijectR, J-tip Needle-Free InjectorR, IntrajectR, Medi-JectR;, 예: Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www. bectondickenson. com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www. disetronic. com; Bioject, Portland, Oregon (www. bioject. com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK, www. weston-medical. com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www. mediject. com)로부터 제조되거나 개발된 것을 포함한다. 이중 바이알 시스템을 포함하는 인식 장치는 HumatroPenR과 같인 재구성 액제의 투여를 위한 카트리지내 동결 약물을 재구성하기 위한 펜인제터를 포함한다.
청구하는 제품은 패킹 재료를 포함한다. 패킹 재료는 조절 기구에 의해 요구되는 정보외에 세품을 사용할 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 패킹 재료는 2개의 바이알, 습윤/건식 제품에 대하여 적어도 하나의 항-IL-12 항체를 수성 희석제에서 재구성하여 액제를 제조하고 상기 액제를 2-24시간 이상의 기간동안 사용하도록하는 지시사항을 환자에게 제공한다. 단일 바이알, 액제 제품에 대하여 라벨은 상기 액제를 2-24시간 이상의 기간동안 사용할 수 있음을 지시한다. 청구하는 제품은 인간 약제학적 제품 용도로 유용하다.
본 발명의 제제는 적어도 하나의 항-IL-12 항체 및 선택된 완충액, 바람직하게 염수 또는 선택된 염을 포함하는 인산 완충액과 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제내 적어도 하나의 항체 및 완충액을 혼합하는 것은 통상의 희석법 및 혼합법에 의해 수행된다. 적절한 제제를 제조하기 위하여 물 또는 완충액중 적절한 양의 적어도 하나의 항체를 원하는 농도로 단백질 및 완충액을 제공하기 충분한 양으로 물중 원하는 완충제와 혼합한다. 이 과정의 변형법을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들면, 성분을 가하는 순서, 추가의 첨가제의 첨가 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH 모두 사용되는 투여 방법 및 농도에 최적화될 수 있는 모든 요소이다.
청구하는 안정 또는 보존 제제는 수성 희석제를 포함하는 두번째 바이알과 재구성된 동결된 적어도 하나의 항-IL-12 항체의 바이알을 포함하는 투명한 액제 또는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 액제 또는 재구성될 필요가 있는 이중 바이알은 수회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단일 또는 다중 싸이클을 충족시킬 수 있고 따라서 현재 이용할 수 있는 더욱 우수한 통상의 치료 요법을 제공하다.
청구하는 안정 또는 보존 제제 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 액제로 적어도 하나의 항-IL-12 항체는 본 분야에 공지된 바와 같이 SC 또는 IM 주사; 경피, 경점막, 임플란트, 삼투펌프, 카트리지, 마이크로 펌프, 또는 기술자에 이해되는 다른 방법에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
치료적 적용
본 발명은 또한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 류마치스(성) 관절염, 연소성 류마치스(성) 관절염, 전신 발현 연소성(onset juvenile 류마치스(성) 관절염), 건선 관절염, 강직성 척추염, 위궤양. 혈청반응음성 관절병증, 골관절염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 항인지질증후군, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신 혈관염/베게너육아종증, 유육종증, 고환염/정관 절제술 역전 과정, 알레르기성/아토피성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기 접촉피부염, 알레르기결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관이식거부반응, 이식편대숙주병, 전신 염증성 반응 증후군, 폐혈증 증후구, 그람 양성 패혈증, 그람 음성 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구감소성 열, 요로성패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리방사선 노출, 급성 췌장염, 성인성 호흡곤란증후군, 류마치스(성) 관절염, 알코올-유도성 간염, 만성 염증성 병, 유육종증, 크론 병, 겸상적혈구성 빈혈, 당뇨, 신증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 다년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 담마진, 전신성 아나필락시스(systemic anaphalaxis), 피부염, 악성빈혈, 용혈성 질환, 혈소판감소증, 기관 또는 조직의 이식편거부반응, 신장 이식거부반응, 심장 이식거부반응, 간이식거부반응, 췌장이식거부반응, 폐이식거부반응, 골수이식(BMT) 거부반응, 피부동종이식거부반응, 연골이식거부거부반응, 뼈이식거부반응, 소장이식거부거부반응, 태아 흉선 임플란트 거부반응, 부갑상선이식거부반응, 기관 또는 조직의 이종이식거부반응, 동종이식거부반응, 항-수용에 과민반응, 그레이브스 병, 레이노 질환, B형 인슐린-내성 당뇨볍, 천식, 중증 근무력증, 항체 관련성 세포독성, III형 과민반응, 전신성 홍반성 루푸스, POEMS 증후군(폴리신경병증, 장기거대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 및 피부변성 증후군), 폴리신경병증, 장기거대증, 내분비병증, 단일클론 감마병증, 및 피부변성 증후군, 항인지질증후군, 천포창, 피부경화증, 혼재성 결합조직 질환, 특발성 애디슨병, 당뇨병, 만성 활성 당뇨, 원발성 담낭 경변증, 백반, 혈관염, MI 심장절개 증후군, IV형 거부반응, 접속성 피부염, 거부반응, 폐렴, 동종이식거부반응, 세포내 유기체에 의한 흑색종, 약물 과민증, 대사성/특발성, 윌슨병, 혈색(소)증, 알파-1-항트립신 결핍증, 당뇨병(성) 망막병증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 시상하부하수체부신계 평가, 원발성 담낭 경변증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성섬유증, 신생아 만성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 피부이상, 건선, 탈모증, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 급성 신부전증, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 치료법, 항-cd3 치료법, 사이토카인 치료법, 화학요법, 방사선 요법(예: 제한하는 것은 아니지만, 토스트헤니아(toasthenia), 빈혈, 악액질 등), 만성 살리실산 중독등의 조절 또는 치료법에 관한 것이다. 참조: 예: the Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972,1977,1982,1987,1992,1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998,2000)(각각 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다).
본 발명은 또한 심인성 졸도 증후군, 심근경색, 울혈성 심부전, 뇌졸증, 허혈성 뇌졸증, 출혈, 동맥경화(증), 죽상경화, 재협착, 당뇨성 죽상경화증 질환, 고혈압, 동맥(성) 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관계 매독, 심부전증, 폐성심, 원발성 폐 고혈압, 심부정맥, 심방이소성 박동, 심방조동, 심방세동(지효성 또는 발작성), 관류후증후군, 심폐회로 염증 반응, 혼동 또는 다소성 심방 빈맥, 정상협착 QRS 빈맥, 특이 부정맥, 심실세동, 히스속부정맥, 방실차단, 각차단, 심근허혈 질환, 관(상)동맥질환, 협심증, 심근경색, 심근증, 확장형 울혈성 심근증, 제한성 심근병증, 판막성 심장질환, 심내막염, 심낭(심막)질환, 심장암, 대동맥 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 배대동맥 및 그의 가지 폐색, 말초혈관질환, 폐색성 동맥 질환, 말초 아테롬성 동맥 경화성 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 질환, 레이노 현상 및 질환, 말단청색증, 지단홍통증, 정맥질환, 정맥혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥루, 림프부종, 지방(성) 부종, 불안정형협심증, 재관류 손상, 펌프후 증후군, 허혈성 재관류 손상 등 중 1종 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 하나 이상의 심장혈관 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의로는, 상기 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 하나 이상의 항-TNF 항체를 함유하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 또는 만성 기생충성 또는 감염성 발생과정, 예로서 박테리아, 바이러스 및 진균 감염, HIV 감염/HIV 신경병증, 수막염, 간염(A, B 또는 C 등), 화농성관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, E. coli 0157: h7, 용혈성 요독증 증후군/혈전성 혈소판감소성 자반증, 말라리아, 뎅구 출혈성 열, 리슈마니아증, 나병, 독 쇼크 증후군, 연쇄구균 근염, 가스괴저, 마이코박테리움(mycobacterium) 결핵증, 마이코박테리움(mycobacterium) 아븀 인트라셀룰라, 뉴모시스티스 카리니 폐렴, 골반염증성 질환, 고환염/부고환염, 라지오넬라(Lagionella) 감염, 라임 질환 , 인플루엔자 a, 엡스타인 바 바이러스, 생명-관련 혈액 식세포성 증후군, 생명 뇌염/무균성 뇌막염 등의 1종 이상을 포함하나 이에 한정되지는 않는, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서의 1종 이상의 감염질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
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본 발명은 또한 또한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 악성 질환, 적어도 하나의 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프모세포성 백혈병 (CLL), 모발상세포 백혈병, 골수이형성 증후군(myelodyplastic syndrome)(MDS), 림프종, 호긴 질환, 악성 림프종, 비-호킨 림프종, 버키트림프종, 다중 흑색종, 카포시육종, 결장직장암종, 췌장암종, 비인강악성종양, 악성조직구증, 종양부수증후군/악성종양의 과칼슘혈증, 충실성 종양(solid tumors), 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 뼈의 재흡수, 암관련 골통 등을 조절 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 제한하는 것은 아니지만 적어도 하나의 신경퇴행성 질환, 다발성 경화증, 편두통, AIDS 치매 컴플렉스, 탈수초(성) 질환, 예로서 다발성 경화증 및 급성 횡단성 척수염; 추체외로 및 소뇌성 질환 예로서 피질척수계 병변; 대뇌기저핵 또는 소뇌질환; 과다운동성 질환 예로서 헝틴통 무도병 및 노인성 무도병; 약물-유도성 운동 질환, 예로서 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 것; 과소운동성 질환, 예로서 파킨슨 질환; 진행성 핵상 마비(Progressive supranucleo Palsy); 소뇌의 구조상 병변; 척수소뇌변성, 예로서 척수성 운동실조증, 프리이드라이히 운동실조(증), 소뇌 피질변성, 다중계 변성(Mencel, Dejerine-Thomas, Shi Drager, and Machado-Joseph) ; 전신 질환(레프섬병, 아베타리포프로테미아, 운동실조, 모세혈관확장증, 및 미토콘드리아 다중계질환); 탈수초 중심성 질환, 예로서 다발성 경화증, 급성 횡단성 척수염; 및 운동 단위 질환 예로서 신경성 근육 위축증(앞뿔 세포 변성, 예로서 근위축성 측삭 경화증, 영아 척수성 근육 위축증 및 연소성 척수성 근육 위축증); 알츠하이머 질환; 다운증후군; 산재성 루이소체 질환; 루리소페형 노인성 치매; 베르니케-코르사코프증후군; 만성 알코중독 ; 크로이츠펠트야콥병; 아급성 경화성 범뇌염, Hallerrorden-Spatz 질환; 및 권투선수치매 등의 조절 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 임의로 적어도 하나의 TNF 항체 또는 그의 특이 부위를 또는 변이체를 포함하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 투여하는 것을 포함할 수 있다.참조, 예: the Merck Manual, 16'h Edition, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).
본 발명의 방법은 또한 이러한 조작, 처리 또는 치료가 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적당량 및 유효량의 적어도 하나의 항-IL-12 항체를 함유한 적어도 하나의 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 임의로 적어도 하나의 TNF 안타고니스트(예, TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 리셉터 또는 그의 단편, 융합 단백질, 또는 소분자 TNF 안타고니스트, 그러나 이들에 한정되지 않음), 항류머티즘제(예, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 소듐 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 설파잘진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제(예, 아미노글리코사이드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 또다른 항균제), 건선치료제, 크르티코스테로이드, 아나볼릭 스테로이드, 당노병 관련 치료제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀(GM-CSF, Leukine), 면역제, 이뮤노글로블린, 면역억제제(예, 바실릭시마브, 사이클로스포린, 다클리주마브), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 리셉터 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사약물, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항울제, 항조병제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 아고니스트, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사 체, 도나제 알파(Pulmozyme), 사이토카인 또는 사이토카인 안타고니스트 중에서 선택된 적어도 하나를 포함한다. 적합한 투여량은 본 기술에서 잘 알려져 있다(Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), 각 문헌은 본 발명에서 전적으로 참고문헌에 속한다).
본 발명의 조성물 복합 치료 장치 및/또는 방법(또한 본 발명의 적어도 하나의 항체, 특정 부분 그의 변이체를 포함함) 적합한 TNF 길항제는 제한되지는 않지만, 항-TNF 항체, 그의 항원-결합 단편 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자 ;TNF 합성, TNF 유리 또는 표적 세포에 대한 그의 작용을 예방 및/또는 저해하는 화합물, 예컨대, 탈리도마이드(thalidomide), 테니댑, 포스포디에스터레이즈 저해제 (예, 펜톡시필린 및 로립람(rolipram)), A2b 아데노신 수용체 효능제 및 A2b 아데노신 수용체 증진제; TNF 수용체 시그날링을 예방 및/또는 저해하는 화합물, 예컨대, 미토겐 활성화 단백질 (MAP) 키네이즈 저해제; 막 TNF 절단을 차단 및/또는 저해하는 화합물, 예컨대, 메탈로프로테이네이즈 저해제; TNF 활성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대, 안지오텐신 변환 효소 (ACE) 저해제 (예, 캡토프릴); 및 TNF 생성 및/또는 합성을 차단 및/또는 예방하는 화합물, 예컨대, MAP 키네이즈 저해제를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 "종양 괴사 인자 항체," "TNF 항체," "TNFα 항체," 또는 단편 등은 TNFα 활성은 인비트로, 원장소 및/또는 바람직하게는 인비보에서 감소, 차단, 억제, 폐지 또는 방해한다. 예컨대, 본 발명의 적절한 TNF 인간 항체 는 TNFα를 결합할 수 있고, 항-TNF 항체, 그의 항원결합 단편 및 특정 돌연변이체 또는 TNFα에 결합하는 그의 도메인을 포함한다. 적합한 TNF 항체 또는 단편은 TNF RNA, DNA 또는 단백질 합성, TNF 유리, TNF 수용체 시그날링, 막 TNF 절단, TNF 활성, TNF 생성 및/또는 합성을 감소, 차단, 폐지, 방해, 예방 및/또는 저해할 수 있다.
키메릭 항체 cA2는 A2로 명명되는 고-친화성 중성화 마우스 항-인간 TNFα IgGI 항체의 항원 결합 가변 부분 및 카파 면역글로블린인 인간 IgG I으로 구성된다. 상기 인간 IgG1 Fc 부분은 동종이형의 항체 작동체 기능을 개선하고, 혈청 반감기의 순환을 증가시키고, 항체의 면역원성을 감소시킨다. 키메릭 항체 cA2의 결합성 및 에피토프 특이성은 쥐 항체 A2의 가변 부분에서 유도된다. 특정 실시예에서, 쥐 항체 A2의 가변 부분을 암호화하는 핵산의 바람직한 소스는 A2 하이브리도마 세포주이다.
키메릭 A2 (cA2)는 용량의 의존하에 천연 및 재조합 인간 TNFα 양자의 세포독성 효과를 중성화한다. 키메릭 항체 cA2 및 재조합 인간 TNFα의 결합 분석으로 부터, 키메릭 항체 cA2의 친화성 상수는 1.04 x 1010M-1로 계산된다. 경쟁적 저해에 의해 모노클론성 항체 특이성 및 친화성을 결정하는 바람직한 방법은 하기에서 찾을 수 있다. Harlow, 등, 항체 : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan 등, eds., Current Protocols in Irnnzunology, Greene Publishing Assoc. 및 Wiley Interscience, New York, (1992-2000); Kozboretal., Immunol. Today, 4 : 72-79 (1983); Ausubel 등, eds. Current Protocols in MolecμLar Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2000); 및 MμLler, Meth. Erazyrnol., 92 : 589-601 (1983), 이들은 본 명세서의 참고문헌에 수록된다.
특정 실시예에서, 쥐의 모노클론성 항체 A2는 c134A로 명명된 세포주에서 생산된다. 키메릭 항체 cA2는 c168A로 명명된 세포주에서 생산된다.
본 발명에서 사용할 수 있는 모노클론성 항-TNF 항체의 추가적인 예는 하기 공지문헌에서 나타나있다(참조, 예, U. S. Patent No. 5,231,024; Moller, A. 등, Cytokine 2 (3): 162-169 (1990); U. S. Application No. 07/943,852 (filed September 11, 1992); Rathjen 등, International Publication No. WO 91/02078 (published February 21, 1991) ; Rubin 등, EPO Patent Publication No. 0 218 868 (published April 22,1987) ; Yone 등, EPO Patent Publication No. 0 288 088 (October 26. 1988) Liang, 등, Biochem. BiopAlys. Res. Coinin. 137 : 847-854 (1986); Meager, 등, 하이브리도마 6: 305-311 (1987); FENDly 등, 하이브리도마 6: 359-369 (19S7) ; Bringman, 등, 하이브리도마 6 : 489-507 (1987); 및 Hirai, 등, J. lmrnunol. MeμLi. 96 : 57-62 (1987), which references are entirely incorporated herein by reference).
TNF 수용체 분자
본 발명에서 유용한 바람직한 TNF 수용체 분자는 고 친화성으로 TNFα에 결합하고(참조, 예, Feldmann 등, International Publication No. WO 92/07076 (published April 30,1992); Schall 등, 세포 61 : 361-370 (1990); 및 Loetscher 등, 세포 61 : 351-359 (1990), 이들은 본 명세서의 참고문헌에 수록된다. ), 임의의 저 면역원성을 갖는 것이다. 특히, 55 kDa (p55 TNF-R) 및 75 kDa (p75 TNF-R) TNF 세포 표면 수용체가 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 또는 그의 기능성 부분를 포함하는 이들 수용체의 잘려진(Truncated) 형태(참조, 예, Corcoran 등, Eur. J. Biochem. 223 : 831-840 (1994))도 본 발명에 또한 유용하다. ECD를 포함하는 TNF 수용체의 잘려진 형태는 소변 및 혈청에서 30 kDa 및 40 kDa TNFα 저해성 결합 단백질로서 검출될 수 있다(Engelmann, H. 등, J. Biol. C/aem. 265 : 1531-1536 (1990)). TNF 수용체 다중 결합성 분자 및 TNF 면역수용체 융합 분자 및 그의 유도체 및 단편 또는 부분은 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 수용체 분자의 추가적 예이다. 본 발명에 사용할 수 있는 TNF 수용체 분자는 기대되는 기간동안 증상의 우수한 경감 및 저 독성을 갖고 환자는 칠할 수 있는 능력에 의해 특징지어 진다. 저 면역원성 및/또는 고 친화성 뿐만 아니라 다른 정의되지 않는 특성은 치료적 결과를 달성하기에 기여할 수 있다. .
본 발명의 유용한 TNF 수용체 다중 결합성 분자는 하나 이상 폴리펩타이드 링커 또는 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다른 비펩타이드 링커를 통해 결합된 두개 이상의 TNF 수용체의 ECD의 모든 또는 하나의 기능성 부분을 포함한다. 다중 결합성 분자는 또한 다중 결합성 분자를 직접저긍로 발현하는 분비된 단백질의 신호 펩타이드를 또한 포함할 수 있다. 상기 다중 결합성 분자 및 그의 생 산 방법은 U. S. Application No. 08/437, 533 (filed May 9,1995)에 기재되고 있고, 이는 본 명세서의 참고문헌에 수록된다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 TNF 면역수용체 융합 분자는 하나 이상 면역글로블린 분자 및 하나 이상 TNF 수용체의 모든 또는 하나의 기능성 부분의 적어도 하나의 부분을 포함한다. 상기 면역수용체 융합 분자는 단량체 또는 이종- 또는 동종-다중체로 모을 수 있다. 상기 면역수용체 융합 분자는 또한 1가 또는 다가 일 수 있다. 상기 TNF 면역수용체 융합 분자의 예는 TNF 수용체/IgG 융합 단백질이다. TNF 면역수용체 융합 분자 및 그의 생산 방법은 공지기술에 기재되어 있다(Lesslauer 등, Eur. J. Immunol. 21 : 2883-2886 (1991) ; Ashkenazi 등, Proc. NaμL. Acad. Sci. USA 88 : 10535-10539 (1991); Peppel etal., J. E, rp. Med. 174 : 1483-1489 (1991); Kolls 등, Proc. iVclμL., Ictzcl. Sci. C SA 91 : 215-219 (1994) ; BuμLer 등, Cytokine 6(6) : 616623 (1994); Baker 등, eur. J. Immunol. 24 : 2040-2048 (1994); BeuμLer 등, U. S. Patent No. 5,447,851; 및 U. S. Application No. 08/442,133 (filed May 16,1995), 이들은 본 명세서의 참고문헌에 수록된다). 면역수용체 융합 분자를 생산하는 방법은 또한 하기 문헌에서 찾을 수 있다: Capon 등, U. S. Patent No. 5,116,964; Capon 등, U. S. Patent No. 5,225,538; 및 Capon 등, Nature 337 : 525-531 (1989), 이들은 본 명세서의 참고문헌에 수록된다.
TNF 수용체 분자의 기능성 균등체, 유도체, 단편 또는 부분는 TNF 수용체 분자의 부분 또는 충분한 크기이고, 본 발명에서 사용할 수 있는 기능상 유사한 TNF 수용체 분자에 대한 서열인, TNF 수용체 분자을 암호화하는 TNF 수용체 분자 서열의 부분(예, 고 친화성 및 저 면역원성을 갖는 결합 TNFα)을 말한다. TNF 수용체 분자 기능성 균등체는 또한 본 발명에 사용할 수 있는 기능상 유사한 TNF 수용체 분자인 변형된 TNF 수용체 분자(예, 고 친화성 및 저 면역원성을 갖는 결합 TNFα)를 포함한다. 예컨대, TNF 수용체 분자의 기능성 균등체는 "SILENT" 코돈 또는 하나 이상 아미노산 치환, 결실 또는 부가(예, 하나의 산성 아미노산 을 다른 산성 아미노산으로 치환; 또는 같거나 다른 소수성 아미노산을 암호화하는 코돈을 다른 소수성 아미노산을 암호화하는 코돈으로 치환)을 포함한다. 참조: Ausubel 등, Current Protocols in MolecμLar Biology, Greene Publishing Assoc. and, Wiley-Interscience, New York (1987-2000).
사이토카인은 공지의 사이토카인을 모두 포함한다. 참조, 예, www. Copewithcytokines. com. 사이토카인 길항제는 제한되지는 않지만, 모든 항체, 단편 또는 모방성 모든 용해성 수용체, 단편 또는 모방성 모든 소형 분자 길항제, 또는 그의 모든 조합을 포함한다.
치료학적 치료.
본 발명의 모든 방법은 조절, 처치 또는 치료가 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 적어도 하나의 항-IL-12 항체를 포함하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 IL-12 매개된 질환을 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 상기 면역질환을 치료하기 위해 공동 투여 또는 병용 치료를 할 수 있고, 상기 적어도 하나의 항-IL-12 항체, 그의 특정 부분 또는 변이체의 투여는 적어도 하나의 TNF 길항제 (예, 제한되지는 않지만, TNF 항체 또는 단편, 용해성 TNF 수용체 또는 그의 단편, 융합 단백질, 또는 소형 분자 TNF 길항제),항류마티즘제(예, 메토트렉세이트, 아우라노핀, 아우로티오글루코스, 아자티오프린, 에타네르셉트, 금 소듐 티오말레이트, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노마이드, 설파잘진), 근육 이완제, 마약, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제(예, 아미노글리코사이드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카바페넴, 세팔로스포린, 플루오르퀴놀론, 마크롤라이드, 페니실린, 설폰아미드, 테트라사이클린, 또다른 항균제), 건선치료제, 크르티코스테로이드, 아나볼릭 스테로이드, 당노병 관련 치료제, 미네랄, 영양제, 갑상선제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해약, 구토방지제, 항궤양제, 완하제, 항응고제, 에리트로포이에틴(예, 에포에틴 알파), 필그라스팀(예, G-CSF, Neupogen), 사르그라모스팀(GM-CSF, Leukine), 면역제, 이뮤노글로블린, 면역억제제(예, 바실릭시마브, 사이클로스포린, 다클리주마브), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 리셉터 조절제, 산동제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사약물, 유사분열 억제제, 방사성 의약품, 항울제, 항조병제, 항정신병약, 불안 완화제, 수면제, 교감신경흥분제, 흥분제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 아고니스트, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도나제 알파(Pulmozyme), 사이트카인 또는 사이트카인 길항제에서 선택되는 적어도 하나의 적어도 하나로 부터 선택되는 적어도 하나의 투여를 추가적으로 병용전 및/또는 후에 포함할 수 있다.
일반적으로, 병리적 질환의 치료는 적어도 하나의 항-IL-12 항체 조성물의 유효량 또는 용량에 의해 유효하고, 전체, 평균 범위는 용량당 환자의 킬로그램당 0.01∼500 밀리그램의 적어도 하나의 항-IL-12항체, 바람직하게는 조성물에 포함된 특정 활성의 따라 단일 또는 다중 투여당 적어도 약 0.1 내지 100 밀리그램 항체/환자의 킬로그램이다. 또한 유효 혈청 농도는 단일 또는 다중 투여당 0.1-5000μg/ml 혈청 농도를 포함할 수 있다. 적합한 용량은 특정 질환의 상태, 투여되는 조성물의 특정활성 및 치료될 특정환자에 따라 임상의가 알 수 있다. 예컨대, 목적하는 치료학적 용량을 얻기 위해, 반복된 투여, 즉, 특정 모니터된 또는 미터된 용량을 반복하여 개인에게 투여하는 것이 필요하며, 여기서, 개인 투여는 원하는 하루 용량 또는 효과가 달성될 때까지 반복한다.
바람직한 용량은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및/또는 100-500mg/kg/투여 또는 모든 범위, 그의 값 또는 분수 또는 단일 또는 다중 투여당 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 및/또는 5000 μg/ml 혈청 농도 또는 모든 범위, 그의 값 또는 분수의 혈청 농도를 달성하기 위한 용량을 임의로 포함할 수 있다. .
또한 상기 용량은 공지의 인자, 예컨대, 특정 시약의 약물동력학적 특성, 그의 투여 방식 및 경로; 연령, 건강 및 수용체의 무게; 증상의 특징 및 정도, 병행 치료의 종류, 치료의 횟수, 원자는 효과에 의해 변화될 수 있다. 일반적으로, 활성 물질의 용량은 체중의 킬로그램당 약 0.1 내지 100 밀리그램일 수 있다. 통상 투여당 킬로그램당 0.1 내지 50, 및 바람직하게는 0.1 내지 10 밀리그램 또는 서방성 유출 형태가 목적하는 결과를 당성하기에 효과적이다.
비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는 단일 또는 0.1 내지 100 mg/kg의 본 발명의 적어도 하나의 항체의 일회 또는 기간적인 용량으로서 제공될 수 있고, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40의 적어도 하나의 일, 또는 교대하거나 추가적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 52의 적어도 하나의 주, 또는 교대하거나 추가적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 적어도 하나의 년에 대해, 1일당 0. 5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg이다.
체내 투여에 적합한 용량 형태(조성물)은 일반적으로 유니트 또는 용기당 활성 성분의 약 0.1 밀리그램 내지 약 500 밀리그램을 포함한다. 약제학적 조성물에서, 활성 성분은 일반적으로 조성물의 전체 무게에 기초하여 약 0.5-99.999중량% 의 양으로 존재한다.
비경구 투여를 위해, 상기 항체는 약제학적으로 허용되는 비경구 비히클과 복합 또느 분리되어 제공되는 용액, 현탁액, 유액 또는 냉동건조된 분말로 제제화된다. 상기 비히클의 예는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로즈 용액 및 1-10% 인간 혈청 알부민이다. 리포좀 및 고정된 오일과 같은 비수성 비히클도 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성을 유지하기 위한 첨가제(예, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성을 유지하기 위한 첨가제(예, 버퍼 및 보존제)를 포함할 수있다. 상게 제제는 공지 또는 적절한 기술로서 멸균할 수 있다.
적절한 약제학적 담체는 본 기술의 표준 참고 문헌인 Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol의 최근판에 기재되어 있다.
대체 투여
많은 공지 및 개발된 유형을 본 발명에 따른 적어도 하나의 항-IL-12 항체의 약제학적으로 유효량을 투여하기 위해 본 발명에서 사용할 수 있다. 폐 투여가 하기와 같이 사용될 때, 다른 투여 유형을 적절한 결과를 위해 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명의 IL-12 항체는 흡입에 의한 투여에 적합한 다양한 모든 장치 및 방법 또는 공지된 다른 방법을 사용하여 용액, 에멀젼, 콜로이드 또는 서스펜션 또는 건조 분말과 같은 담체내에서 운발될 수 있다.
비경구 제제 및 투여
비경구 투여를 위한 제제는 통상의 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리알킬렌글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지의 방법에 따라 적절한 유화제 도는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 주사용 시약은 용매중에서 수용액 또는 멸균 주사용액 또는 현탁액과 같은 비독성의, 비경구 투여가능한 희석제일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장성 식염수가 허용된다; 보통의 용매 또는 현탁화제로서, 멸균 비휘발성 오일을 사용할 수 있다. 이들 목적을 위하여, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산을 포함하여 모든 종류의 비휘발성 오일과 지방산을 사용할 수 있다. 비경구 투여가 당업계에 알려져 있으며, 미국특허 제5,851,198호에 기재된 바와 같은 가스 가압 무-바늘 주사 장치 및 미국특허 제5,839,446호에 기재된 바와 같은 레이저 천공 장치와 같은 통상적인 주사 수단을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
대체 전달
본 발명은 또한 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복부내, 캡슐내, 모세혈관내, 공동내, 세포내, 뇌내, 뇌강내, 대장내, 쇄골내, 위내, 간내, 근육내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전랍선내, 폐내, 결장내, 신장내, 레티날내, 척수내, 활액내, 흉부내, 자궁내, 소포내, 볼루스, 질, 결장, 바칼, 설하, 비내, 또는 경피 수단에 의해 적어도 하나의 항-IL-12 항체의 투여에 관한 것이다. 적어도 하나의 항-IL-12 항체 조성물은 비경구(피하, 근육내 또는 정맥내) 또는 다른 투여를 위해 액체 용액 또는 현탁액 형태로; 질 또는 결장 투여를 위해 크림과 좌약을 포함하지만 제한되지는 않는 반고체 형태로; 정제 도는 캡슐제의 형태를 포함하지만 제한되지는 않는 박칼 또는 설하 투여를 위해; 분말, 비내 드롭 또는 에어로졸 또는 특정 제제 형태를 포함하지만 제한되지는 않는 비내로; 겔, 연고, 로션, 현탁액 또는 피부 구조를 변형시키거나 경피 패치에서 약물 농도를 증가시키기 위하여 디메틸설폭사이드와 같은 화학적 증진제(Jnginger, et al. In "Drμg Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90(Marcel Dekker, Inc. New York 1994, 전체를 참조로서 인용함), 또는 단백질과 펩타이드를 함유하는 제제를 피부로 적용할 수 있게 하는 산화제(WO 98/53847), 또는 전기천공과 같은 일시적인 수송 경로를 만들거나, 이온토포레시스와 같은 피부를 통한 전하를 띤 약물의 이동성을 증가시키는 전기장의 적용, 또는 소노포레시스와 같은 초음파의 적용(미국특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호)를 갖는 패치 전달 시스템과 같은(이들로 제한되지는 않음) 경피로 사용할 수 있도록 제조될 수 있다(상기 간행물 및 특허는 전체가 참조로서 인용된다).
폐내/비내 투여
폐 투여를 위해, 바람직하게는 적어도 하나의 항-IL-12 항체 조성물은 폐 또는 시누스의 하부 기도에 도달하기 위해 유효한 입자 크기로 전달된다. 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 항-IL-12 항체는 흡입에 의해 치료제를 투여하기 위한 당업계에 알려진 모든 다양한 흡입 또는 비내 장치에 의해 전달된다. 환자의 시누스 강 또는 폐포에서 에어로졸화된 제제를 침적할 수 있는 이들 장치는 계측 용량 흡입기, 분무기, 건조 분말 생성기, 스프레이어 등을 포함한다. 항체의 폐 또는 비내 투여를 유도하는데 적당한 다른 장치 또한 당업계에 알려져 있다. 모든 그러한 장치는 에어로졸중의 항체의 분배를 위한 투여에 적당한 제제를 사용할 수 있다. 그러한 에어로졸은 용액(수성 및 비수성) 또는 고체 입자로 구성될 수 있다. Ventolin® 계측 용량 흡입기와 같은 계측 용량 흡입기는 전형적으로 추진 가스를 사용하고 흡입중 작동을 요구한다(예를 들어 WO94/16970, WO98.35888 참조). Turbuhaler™(Astra), Rotahaler®(Glaxo), Diskus®(Glaxo), Spiros™ 흡입기(Dura), Inhale Therapeutics에 의해 시판된 장치, 및 Spinhaler® 분말 흡입기(Fisons)와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합 물말의 호흡-작동을 사용한다(US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, 전체가 참조로서 인용된다). AUERx™ Aradigm, μLtravent® 분무기(Mallinckrodt), 및 Acorn Ⅱ® 분무기(Marquest Medical Products)(US 5404871 Aradigm, WO 97/22376)(상기 참조문헌들은 전체가 참조로서 인용된다)는 계측 용량 흡입기, 건조 분말 흡입기 등이 소입자 에어로졸을 생성하는데 비해, 용액으로부터 에어로졸을 생산한다. 상업적으로 입수가능한 흡입 장치의 이들 특정 예들은 본 발명의 실시를 위해 적당한 특정 장치의 대표적인 예이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 바람직하게는 적어도 하나의 항-IL-12 항체를 포함하는 조성물은 건조 분말 흡입기 또는 스프레이어에 의해 전달된다. 본 발명의 적어도 하나의 항체를 투여하기 위한 흡입 장치의 몇몇 바람직한 특징이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 우수하게는 신뢰할 수 있고, 재현가능하며, 정확하다. 흡입 장치는 임의로 양호한 호흡성을 위해 예를 들어, 약 10 ㎛, 바람직하게는 약 1-5 ㎛의 소 건조 입자를 전달한다.
스프레이로서 IL-12 항체 조성물의 투여
IL-12 항체 조성물 단백질을 포함하는 스프레이는 적어도 하나의 항-IL-12 항체의 현탁액이나 용액을 가압하의 노즐을 통해 통과시켜 제조할 수 있다. 노즐 크기와 형태, 적용되는 압력과, 액체 유입 속도를 원하는 아웃풋과 입자 크기를 얻을 수 있도록 선택할 수 있다. 전기스프레이를 예를 들어 모세관 또는 노즐 피드와 연결된 전기장에 의해 제조할 수 있다, 우수하게는, 스프레이어에 의해 전달되는 적어도 하나의 항-IL-12 항체 조성물의 입자는 약 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 가장 바람직하게는 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛의 입자 크기를 갖는다.
스프레이어와 사용하기에 적당한 적어도 하나의 항-IL-12 항체 조성물의 제제는 전형적으로 용액 ㎖당, 또는 ㎎/gm으로 약 0.1 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 적어도 하나의 항-IL-12 항체 조성물 단백질, 예를 들어 제한되지는 않지만, .1, .2, .3, .4, .5, .6, .7, .8, .9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 ㎎/㎖ 또는 ㎎/gm의 농도로 수용액중에 항체 조성물 단백질을 포함한다. 제제는 부형제, 완충제, 등장화제, 보존제, 계면활성제 및 바람직하게는 아연과 같은 시약을 포함할 수 있다. 제제는 또한 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 시약, 예를 들어 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 탄수화물을 포함할 수 있다. 항체 조성물 단백질을 제제화하는데 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질을 제제화하는데 유용한 전형적인 탄수화물은 슈크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 항체 조성물 단백질 제제는 또한 에에토졸 형성에서 용액의 분무에 의해 유발된 항체 조성물 단백질의 표면-유도된 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 및 폴리옥시에틸렌 솔비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 보편적인 계면활성제를 사용할 수 있다. 양은 일반적으로 제제의 0.001 내지 14중량% 범위이다. 본 발명의 목적에 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트, 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20 등이다. IL-12 항체, 또는 특정 부분 또는 변이체와 같은 단백질 제제를 위해 당업계에 알려진 부가적인 시약 또한 제제에 포함될 수 있다.
분무기에 의한 IL-12 항체 조성물의 투여
항체 조성물 단백질은 제트 분무기 또는 초음파 분무기와 같은 분무기에 의 해 투여될 수 있다. 전형적으로는, 제트 분무기에서, 압축 공기 소스를 사용하여 구멍을 통하여 고-속도 공기 제트를 생성시킨다. 가스가 노즐을 넘어 팽창함에 따라, 저-압력 부분이 생겨, 항체 조성물 단백질 용액을 액체 저장소에 연결된 모세관 튜브를 통해 끌어낸다. 모세관 튜브로부터의 액체 흐름은 튜브를 나갈 때 불안정한 필라멘트와 드롭렛으로 전단되어, 에어로졸을 생성시킨다. 일정 범위의 형태, 유속과 배플 유형을 사용하여 주어진 제트 분무기로부터 원하는 행동 특성을 얻을 수 있다. 초음파 분무기에서는, 고-주파 전기 에너지를 사용하여 전형적으로 압전성 튜랜스듀서를 사용하여 진동의, 기계적 에너지를 생성시킨다. 이 에너지는 직접 또는 커플링 유체를 통해 항체 조성물 단백질 제제로 전달되어 항체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 생성시킨다. 우수하게는, 분무기에 의해 전달된 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 ㎛, 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 가장 바람직하게는 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛ 범위의 입자 크기를 갖는다.
제트 또는 초음파 분무기로 사용하기에 적당한 적어도 하나의 항-IL-12 항체 제제는 전형적으로 용액 ㎖당 약 0.1 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 적어도 하나의 항-IL-12 단백질을 포함한다. 제제는 부형제, 완충액, 등장화제, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하는 아연을 포함할 수 있다. 제제는 또한 적어도 하나의 항-IL-12 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 시약, 예를 들어 완충제, 환원제, 벌크 단백질, 탄수화물을 포함할 수 있다. 항-IL-12 항체 조성물 단백질을 제제화하는데 유용한 벌크 단백질은 알부민, 프로타민 등을 포함한다. 항-IL-12 항체 조성물 단백질을 제제화하는데 유용한 전형적인 탄수화물은 슈크로스, 만니톨, 락토스, 트 레할로스, 글루코스 등을 포함한다. 항-IL-12 항체 조성물 단백질 제제는 또한 에에토졸 형성에서 용액의 분무에 의해 유발된 항체 조성물 단백질의 표면-유도된 응집을 감소시키거나 방지할 수 있는 계면활성제를 포함할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 및 폴리옥시에틸렌 솔비톨 지방산 에스테르와 같은 다양한 보편적인 계면활성제를 사용할 수 있다. 양은 일반적으로 제제의 0.001 내지 4중량% 범위이다. 본 발명의 목적에 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트, 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20 등이다. 항체 단백질과 같은 단백질 제제를 위해 당업계에 알려진 부가적인 시약 또한 제제에 포함될 수 있다.
계측 용량 흡입기에 의한 IL-12 항체 조성물의 투여
계측 용량 흡입기(MDI)에서, 추진제, 적어도 하나의 항-IL-12 항체, 및 어떠한 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압축 가스를 포함하는 혼합물로서 상자에 함유된다. 계측 밸브의 작동은 혼합물을 바람직하게는 약 10 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 1 ㎛ 내지 5 ㎛, 가장 바람직하게는 약 2 ㎛ 내지 약 3 ㎛ 범위 크기의 입자를 함유하는 에어로졸로서 방출한다. 원하는 에어로졸 입자 크기는 제트-밀링, 분무 건조, 임계점 응축 등을 포함하는 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 제조된 항체 조성물 단백질 제제를 사용하여 제조될 수 있다. 바람직한 계측 용량 흡입기는 하이드로플루오로카본 추진제를 사용하는 3M이나 글락소에 의해 제작된 것들을 포함한다.
계측-용량 흡입기 장치로 사용하기 위한 적어도 하나의 항-IL-12 항체 제제 는 일반적으로 예를 들어 계면활성제의 도움으로 추진제중에 현탁된, 비수성 매질중의 현탁액으로서 적어도 하나의 항-IL-12 항체를 함유하는 미세 분할 분말을 포함한다. 추진제는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134a(하이드로플루로알칸-134a), HFA-227(하이드로플루로알칸-227) 등을 포함하는, 클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 하이드로플루오로카본 또는 탄화수소와 같은 이 목적을 위해 사용되는 모든 통상적인 재료일 수 있다. 바람직하게는 추진제는 하이드로플루오로카본이다. 계면활성제는 추진제중에 현탁액으로서 적어도 하나의 항-IL-12 항체를 안정화하거나, 활성 약물을 화학적 분해에 대해 보호하기 위하여 선택될 수 있다. 적당한 계면활성제는 솔비탄 트리올레에이트, 콩 레시틴, 올래산 등을 포함한다. 일부 경우 에탄올과 같은 용매를 사용하는 용액 에어로졸이 바람직하다. 단백질과 같은 단백질 제제를 위해 당업계에 알려진 부가적인 시약 또한 제제에 포함될 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법이 여기에 기재되지 않은 장치를 통해 적어도 하나의 항-IL-12 항체 조성물의 폐 투여에 의해 달성될 수 있음을 인지할 것이다.
경구 제제 및 투여
경구 제제는 소장 벽의 투과성을 인공적으로 증가시키는 애쥬번트(예를 들어, 레조르시놀 및 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르와 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르와 같은 비이온성 계면활성제)의 공동-투여, 및 효소 분해를 저해하는 효소 저해제(예를 들어, 십이지장 트립신 저해제, 디이소프로필플루오로포스페이트(DFF) 및 트라실롤)의 공동-투여에 의존한다. 경구 투여를 위한 고형 제형의 활성 성분 화합물은 슈크로스, 락토스, 셀룰로스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 아가, 아르기네이트, 키틴, 키토산, 펙틴, 트라가칸트 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 알부민, 합성 또는 반합성 고분자, 및 글리세라이드를 포함하는 적어도 하나의 첨가제와 혼합될 수 있다. 이들 제형은 또한 다른 유형의 첨가제, 예를 들어 불활성 희석제, 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제, 파라벤, 소르브산, 아스코르브산, 알파-토코페롤과 같은 보존제, 시스테인과 같은 항산화제, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충화제, 감미제, 향료, 방향제 등을 함유할 수 있다.
정제와 환제는 추가로 장용 제제로 가공될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 의학적 용도에 허용되는 용액 제제를 포함한다. 이들 제제는 동 분야에서 보통 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물을 함유할 수 있다. 리포좀이 또한 인슐린과 헤파린의 약물 전달 시스템으로서 기재된 바 있다(미국특허 제4,925,673호). 더욱이, 미국특허 제5,879,681호 및 미국특허 제5,871,753호에 기재된 담체 화합물이 당압계에 알려진 바와 같이 경구로 생물학적 활성 약물을 전달하는데 사용된다.
점막 제제 및 투여
점막 표면을 통한 흡수를 위해, 적어도 하나의 항-IL-12 항체를 투여하기 위한 조성물 및 방법은 복수의 서브마이크론 입자, 점막점착성 매크로분자, 생물활성 펩타이드, 및 에멀젼 입자의 점막점착을 이루어 점막 표면을 통한 흡수를 촉진하는 수성 연속 상(미국특허 제5,514,670호)을 포함하는 에멀젼을 포함한다. 본 발며의 에멀젼의 적용에 적당한 점막 표면은 각막, 결막, 구강, 설하, 코, 질, 폐, 위, 소장 및 직장 경로의 투여를 포함할 수 있다. 질 또는 직장 투여용 제제, 예를 들어 좌약은 부형제로서, 예를 들어 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 포함할 수 있다. 비내 투여용 제제는 고체일 수 있고 부형제로서, 예를 들어 락토스를 포함할 수 있거나 수성 또는 유성 코 드롭 용액일 수 있다. 구강 투여를 위해 부형제는 슈가, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 예비젤라틴화 전분 등을 포함한다(미국특허 제5,849,695호).
경피 제제 및 투여
경피 투여를 위해, 적어도 하나의 항-IL-12 항체는 리포좀 또는 고분자성 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 또는 마이크로스피어와 같은 전달 장치에 캡슐화된다(다르게 언급하지 않는 한 총괄적으로 마이크로입자라 한다). 폴리락트산과 같은 폴리하이드록시산, 폴리글리콜산 및 그의 공고분자, 폴리오르소에스테르, 폴리언하이드라이드, 및 폴리포스파진과 같은 합성 고분자 및 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 기타 단백질, 알기네이트 및 다른 다당류와 같은 천연 고분자, 및 그들의 배합물로 제조된 마이크로입자를 포함하여 많은 적당한 장치가 알려져 있다(U.S.Pat. Nos. 5,814,599).
지속 투여 및 제제
때때로 본 발명의 화합물을 대상에게 장시간, 예를 들어 단일 투여로부터 1 주 내지 1 년에 걸쳐 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 서방성, 데포 또는 이식 제형을 사용할 수 있다. 예를 들어, 제형은 체약에서 낮은 용해도를 갖는 화합물의 약제학적으로 허용되는 비독성 염, 예를 들어 (a) 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알킨산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디-설폰산, 폴리갈락튜론산 등과 같은 다염기 산과의 산 부가염; (b) 아연, 칼슘, 비스무스, 바륨, 마그네슘, 알부민, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온, 또는 예를 들어 N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온과의 염; 또는 (c) (a)와 (b)의 배합물, 예를 들어 아연 탄네이트 염을 함유할 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는 상기한 바와 같은 상대적 불용성 염은 젤, 예를 들어, 주사에 적합한, 예를 들어 참깨유를 이용하여 알루미늄 모노스테아레이트 젤에서 제제화될 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 주사용의 또 다른 유형의 서방성 데포 제제는 예를 들어 미국특허 제3,773,919호에 기재된 바와 같이 폴리락트산/폴리글리콜산 고분자와 같은 서서히 분해되고, 비독성이며, 비-항원성인 고분자에서 캡슐화되기 위해 분산된 화합물 또는 염을 함유한다. 화합물, 또는 바람직하게는 상기한 바와 같은 상대적 불용성 염은 또한 특히 동물에서 사용하기 위하여 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛으로 제제화될 수 있다. 부가적인 서방성 데포 또는 이식 제제, 예를 들어 가스 또는 액체 리포좀이 문헌에 알려져 있다(미국특허 제5,770,222호 및 "Sustained and Controlled Release Drμg Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).
일반적으로 발명을 기재하였으며, 동일한 것이 설명을 위해 제공되며 제한하 고자 하는 것이 아닌 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 잘 이해될 것이다.
실시예 1: 포유 세포에서 IL-12 항체의 클로닝 및 발현
전형적인 포유류 발현 벡터는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 적어도 하나의 프로모터 요소, 항체 코딩 서열, 및 전사 종결과 전사체의 폴리아네틸화를 위해 요구되는 신호를 함유한다. 부가적인 요소는 인핸서, 코작 서열 및 RNA 스플라이싱의 공여체 및 수용체 위치로 연결되는 중간 서열을 포함한다. 고 효율 전사는 SV40으로부터의 초기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HμLVI, HIVI로부터의 말단 반복 서열(LTRs), 및 사이토메갈로바이러스(CMV)의 초기 프로모터로 달성될 수 있다. 그러나, 세포성 인자 또한 사용될 수 있다(예: 인간 액틴 프로모터). 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합한 발현 벡터는 예를 들어, pIRES1 neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, 또는 pLNCX(클론tech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1(+/-), pcDNA/Zeo(+/-) 또는 pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen), PSVL 및 PMSG(Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat(ATCC37152), pSV2dhfr(ATCC 37146) 및 pBC12MI(ATCC 67109)와 같은 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 포유류 숙주 세포는 인간 HeLa 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 세포 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7, 퀘일 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다.
다르게는, 유전자는 염색체로 도입된 유전자를 함유하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. dhfr, gpt, 네오마이신, 또는 하이그로마이신과 같은 선별 마커 로의 공동-형질감염은 형질감염된 세포의 확인 및 분리를 가능하게 한다.
형질감염된 유전자는 또한 대량의 코딩된 항체를 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR(디하이드로폴레이트 환원효소) 마커는 관심 있는 유전자의 수백 또는 수천 카피를 운반하는 세포주를 발생시키는데 유용하다. 다른 유용한 선별 마커는 효소 글루타민 합성효소(GS)(Murphy 등, Biochem J. 227: 277-279(1991); Bebbington 등, Bio/Technology 10: 169-175(1992))이다. 이들 마커를 사용하여, 포유 세포를 선별 배지에서 증식시키고 최고의 내성을 갖는 세포를 선별한다. 이들 세포주는 염색체로 도입된 증폭 유전자(들)을 함유한다. 중국 햄스터 난소(CHO) 및 NSO 세포는 자주 항체 생산에 사용된다.
발현 벡터 pC1 및 pC4는 라우스 사르코마 바이러스의 강력한 프로모터(LTR)(CμLlen 등, Molec. Cell. Biol. 5: 438-447(1985))와 CMV-인핸서(Boshart 등, Cell 41: 521-530(1985)의 단편을 함유한다. 예를 들어 제한효소 절단 위치 BamHⅠ, XbaⅠ 및 Asp718을 갖는, 다중 클로닝 위치는 관심 있는 유전자의 클로닝을 용이하게 한다. 벡터들은 부가적으로, 랫트 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론, 폴리아데닐화 및 종결 신호를 함유한다.
CHO 세포에서의 클로닝 및 발현
벡터 pC4를 IL-12 항체의 발현을 위해 사용하였다. 플라스미드 pC4는 플라스미드 pSV2-dhfr (ATCC Accession No. 37146)의 유도체이다. 상기 플라스미드는 SV40 초기 프로모터의 조절되는 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 상기 플라스미드에 감염되어 디히드로폴레이트 활성을 상실한 중국 햄스터 난소 또는 다른 세포는 선택적 배지에서 화학치료제인 메토트렉세이트(MTX)를 첨가하여 세포를 생육하여 선택할 수 있다(예, 알파 마이너스 MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD). 메토트렉세이트(MTX)에 내성인 세포에서 DHFR 유전자의 증폭은 문헌에 잘 나타나있다(참조, 예, F. W. Alt, 등, J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978) ; J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107-143 (1990); 및 M. J. Page 및 M. A. Sydenham, Biotechnology 9: 64-68 (1991)). 목적 효소, DHFR 유전자의 증폭의 결과로서, DHFR를 과생산함에 의해 약물에 내성을 만든 MTX 농도의 증가에서 세포를 길렀다. 만일 2차 유전자가 DHFR 유전자에 결합하면, 일반적으로 공동 발현 및 과발현된다. 증식된 유전자의 1,000 복제 이상을 운반하는 세포주의 개발을 위한 이같은 연구는 공지이다. 계속하여, 메토트렉세이트를 철회하면 세포주는 숙주세포의 하나 이상의 크로모좀내로 결합된 증폭된 유전자를 포함하여 얻어진다.
플라스미드 pC4 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR)의 강력한 목적하는 프로모터를 발현하는 유전자 (CμLlen 등, Molec. 세포. Biol. 5: 438-447 (1985)) 더하기 인간 사이토메칼로바이러스 (CMV)의 인접 초기 유전자의 인헨서로부터의 단리된 단편(Boshart, 등, 세포 41: 521-530 (1985))을 포함한다. 프로모터의 하류는 유전자의 결합을 위한 BamHI, Xbal, 및 Asp718 제한 효소 절단 부위이다. 상기 클로닝 부위의 뒤에는 플라스미드는 3' 인트론 및 래트 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 다른 고 효율 프로모터가 발현에 사용하기 위해 또한 사용될 수 있다. 예, 인간 β-악틴 프로모터, SV40 초기 또는 후기 프로모터 또는 다른 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복, 예, HIV 및 HμLVI Clontech's Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 및 유사한 시스템을 포유동물 세포에서 조절된 방법으로 IL-12를 발현하기 위해 사용될 수 있다(M. Gossen, 및 H. Bujard, Proc. NaμL. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)). mRNA 다른 신호의 폴리아데닐화를 위해, 예컨대, 인간 성장 호르몬으로부터 다른 시그날 또는 글로빈 유전자가 사용될 수 있다. 크로모좀내로 도입된 목적 유전자를 운반하는 안정한 세포주는 선별할 수 있는 마커, 예컨대, gpt, G418 또는 히그로마이신를 사용하여 공동형질감염하여 선별할 수 있다. 시작에서 하나이상의 선별 마커, 예, G418 플러스 메토트렉세이트를 사용하는 것이 바람직하다.
플라스미드 pC4를 제한 효소로 분해하고, 그후 송아지 내장 포스파테이즈를 사용하여 공지의 방법으로 탈인산화한다. 벡터를 그후 1% 아가로즈 겔로부터 단리한다.
완전한 IL-12 항체를 암호화하는 DNA 서열을 사용하고, 예컨대, 공지의 단계에 따라, 본 발명의 IL-12 항체의 HC 및 LC 가변 부분에 상응하는 서열 번호: INSERT MAB AA SEQ ID 1, 및 INSERT MAB AA SEQ ID N02로 나타낸다. 안정한 인간 고정 부분 (즉, HC 및 LC 부분)을 암호화하는 단리된 핵산도 또한 본 작제물에서 사용된다(예, 벡터 p 1351에서 제공되는 것처럼 : INSERT ATCC ACCESSION NμMBER AND ADDITIONAL HC/LC plasmds)
상기 단리된 가변 및 고정 부분을 암호화하는 DNA 및 탈인산화된 벡터를 그후 T4 DNA 리게이즈로 연결한다. E. coli HB 101 또는 XL-1 Blue 세포를 형질전환 하고, 예컨대, 제한 효소 분석을 사용하여 플라스미드 pC4가 삽입된 단판을 포함하는 세균을 동정하였다.
DHFR 유전자가 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 형질감염에 사용한다. 5 ㎍의 발현 플라스미드 pC4를 0.5 ㎍의 플라스미드 pSV2-네오에 리포펙틴을 사용하여 공동형질감염하였다. 플라스미드 pSV2네오는 주된 선택 마터, G418를 포함하는 항생체 그룹에 내성을 부혀하는 효소를 암호화하는 Tn5로부터의 네오 유전자를 포함한다. 세포는 1 ㎍/ml G418가 첨가된 알파 마이너스 MEM에서 배양하였다. 2일후, 세포를 트립신화하고, 10, 25 또는 50 ng/ml의 메토트렉세이트 플러스 1 ㎍/ml G418를 첨가한 알파 마이너스 MEM에서 하이브리도마 클로닝 플레이트에서 배양하였다(Greiner,Germany). 약 10-14일 후에, 단일 클론을 트립신화하고, 다른 농도의 메토트렉세이트 (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 사용한 6-웰 페트리 디쉬 또는 10 ml 플레이트에서 배양하였다. 메토트렉세이트의 높은 농도에서 자란 클론을 그후 더 높은 농도의 메토트렉세이트(1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM)를 포함하는 새로운 6-웰 플레이트로 옮겼다. 같은 방법을 100-200 mM에서 자란 클론이 얻어질 때까지 반복하였다. 목적하는 유전자 생성물의 발현을 예컨대, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 또는 역상 HPLC 분석법에 의해 분석하였다.
실시예 2: 형질전환 마우스를 사용한 인간 IL-12에 반응하는 고 친화성 인간 IgG 모노클론성 항체의 생성
개요
하나 이상 IL-12-매개된 질병의 치료를 위한 IL-12의 작용의 저해를 위해 치료적으로 사용할 수 있는 고 친화성, 완전한 인간, 모노클론성 항체를 생성하기 위 해 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로블린 유전자를 포함하는 것을 사용할 수 있다. 중쇄 및 경쇄에 대한 인간 가변 및 고정 부분 항체 트랜스유전자를 포함하는 (CBA/J x C57/BL6/J) F2 하이브리드 마우스를 인간 재조합 IL-12 로 면역화하였다(Taylor 등, InμL. Immunol. 6: 579-591 (1993); Lonberg, 등, Nature 368: 856-859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14: 826 (1996); Fishwild, 등, Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)). 수개의 융합은 완전한 인간 IL-12 반응성 IgG 모노클론성 항체의 하나 이상의 패널을 생성한다. 완전한 인간 항-IL12 항체는 더욱 특징지워진다. 모두 IgG1k이다. 상기 항체가 1 x 109 및 9 x 1012사이의 친화성 상수를 갖는 것을 확인하였다. 이러한 완전한 인간 모노클론성 항체의 기대치 않은 고 친화성은 IL-12 관련된 질병, 병리 또는 질환에 치료적 적용을 위한 적합한 후보로 만든다. .
약어
BSA - 소 혈청 알부민
CO2 - 이산화탄소
DMSO - 디메틸 설폭사이드
EIA - 효소 면역어세이
FBS - 소태아 혈청
H202 - 과산화수소
HRP - 양고추냉이 퍼옥시데이즈
ID - 피내
Ig - 면역글로블린
IL-12 - 인터루킨-12
IP - 복강내
IV - 정맥내
Mab - 모노클론성 항체
OD - 광학 정도
OPD - o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드
PEG - 폴리에틸렌 글리콜
PSA - 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신
RT - 상온
SQ - 피하
v/v - 부피 대 부피
w/v - 부피 대 무게
물질 및 방법
동물
인간 항체를 발현할 수 있는 형질전환 마우스는 공지이며(상업적으로 구입가능 (예, from GenPharm International, San Jose, CA ; Abgenix, Freemont, CA, 및 others), mouse IgM 또는 Igk가 아닌 인간 면역글로블린을 발현한다. 예컨대, 인간 서열 트랜스유전자를 포함하는 상기 형질전환 마우스는 V(D)J 결합, 중쇄 클래스 전환 및 인간 서열 면역글로블린의 레파토리를 생성하기 위한 체돌연변이를 수행한다(Lonberg, 등, Nature 368: 856-859 (1994)). 상기 경쇄 트랜스유전자는 예컨대, 인간 Vk 부분의 유전자주의 거의 절반을 포함하는 이스트 인공 크로모좀에서부터의 일부에서 유도될 수 있다. 추가로, 중쇄 트랜스유전자는 인간 마이크로 및 λ1(Fishwild, 등, Nature Biotechnology 14: 845-851 (1996)) 및/또는 λ3 고정 부분을 암호화할 수 있다. 적합한 유전자자극성 혈통에서 유래된 마우스가 IL-12 면역화에 대한 완전한 인간 모노클론성 항체를 생성하기 위한 면역화 및 융합 방법에 사용될 수 있다.
하나 이상 면역화 스케쥴을 항-IL-12 인간 하이브리도마을 생성하기 위해 사용할 수 있다. 제1 다수 융합은 하기 예시적 면역화 프로토콜에 따라 수행할 수 있고, 다른 유사한 프로토콜을 사용할 수 있다. 다수의 14-20주 기른 암컷 및/또는 수술로 거세한 형질전환 수컷 마우스를 100-400μL(예, 200)의 최종 부피에서 TITERMAX의 같은 부피 또는 완전한 Freund 보조제를 사용하여 증폭된 1-1000μg의 재조합 인간 IL-12를 사용하여 IP 및/또는 ID로 면역화한다. 각각의 마우스를 각각의 2 SQ 사이트에서 100μL의 생리적 식염수를 임의로 1-10㎍또한 받을 수 있다. 마우스는 그후 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 및/또는 21-34일 후에 같은 부피의 TITERMAX 또는불완전한 Freund 보조제를 사용하여 에멀젼화한 IL-12를 사용하여 IP (1-400 Hg) 및 SQ (1- 400 μg x 2)로 면역화할 수 있다. 마우스는 항-응고제 없이 뒤-오비탈 구멍에 의해 12-25 및 25-40일 후에 채혈할 수 있다. 상기 혈액을 그후 RT에서 1시간동안 덩어리로 한후, 혈청을 수집하고, 공지의 방법에 따른 IL-12 EIA 에세이를 사용하여 적정하였다. 반복된 주사가 적정을 증가하지 않을 때 융합을 수행하였다. 그 때, 마우스는 100 μL의 생리식염수에 희석한 1-400μg의 IL-12의 최종 IV 부스터(booster) 주사을 주입할 수 있다. 3일 후, 마우스는 경부 탈골로 죽이고, 비장을 무균적으로 제거하고, 100U/mL 페니실린, 100 pLg/mL 스트렙토마이신, 및 0.25 μgimL 암포테리신 B (PSA)을 포함하는 10 mL의 찬 인산 버퍼화 식염수(PBS)에 넣었다. 비장세포는 PSA-PBS로 비장을 관류하여 멸균적으로 배양한다. 세포를 찬 PSA-PBS로 세척하고, 트리판 블루 염색 배제(Trypan blue dye exclusion)를 사용하여 계수하고, 25 mM Hepes를 포함하는 RPMI 1640 배지에 재현탁하였다.
세포 융합
융합은 공지의 방법, 예컨대, 공지기술의 방법에 따라 쥐 골수종 세포 대 생육할 수 있는 비장 세포의 1: 1 내지 1: 10의 비율에서 수행할 수 있다. 비제한적은 예로서, 비장 세포 및 골수종 세포를 함께 펠렛화할 수 있다. 상기 펠렛은 그후 PEG/PBS 용액 (PEG 분자량 1.450, Sigma)에서 30초간 37℃에서 천천히 재현탁할 수 있다. 상기 융합은 그후 25 mM Hepes (37℃)를 포함하는 10.5 mL의 RPMI 1640 배지를 1분간 천천히 첨가하여 멈출 수 있다. 상기 융합된 세포는 500-1500 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상기 세포를 HAT 배지 (RPMI 1640 배지 containing 25 mM Hepes, 10% Fetal 클론 I 혈청 (Hyclone), 1 mM 소듐 피루베이트, 4 mM L-글루타민, 10 μg/mL 겐타마이신, 2.5% Origen 배양 보충제(Fisher), 10% 653-컨디션화된 RPMI 1640/Hepes 배지, 50 μM 2-머캅토에탄올, 100 μM 히포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16 μM 티미딘)에서 재현탁하고, 15개의 96-웰 평판 조직 배양 플레이트에서 200 gL/웰로 도말하였다. 상기 플레이트를 다시 5% CO2 및 95% 공기를 포함하는 습윤화한 37℃의 배양기에서 7-10 일간 두었다.
마우스 혈청에서 인간 IgG 항-IL-12 항체의 탐지
고상 EIA를 인간 IL-12에 특이적 인간 IgG 항체에 대한 마우스의 혈청을 스크린하기 위해 사용할 수 있다. 간단하게 플레이트를 PBS에서 2 μg/mL의 IL-12로 밤새 도말할 수 있다. 0.02% (v/v) Tween 20를 포함하는 0.15M 식염수로 세척한 후, 상기 웰을 RT에서 1시간동안 200μL/웰 PBS중의 1% (w/v) BSA로 차단할 수 있다. 플레이트를 미래의 사용을 위해 즉시 또는 -20℃에서 얼려서 사용하였다. 마우스 혈청 희석물을 RT에서 1시간동안 50 μL/웰로 IL-12로 코팅된 플레이트상에 배양하였다. 상기 플레이트를 세척하고, 그후, 50 μL/웰의 HRP-표지된 고우트 항-인간 IgG, 1% BSA-PBS에서 1 : 30,000로 특이적 희석된 Fc로 RT에서 1시간동안 프로브하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 100 μL/웰의 시트레이트-인산 기질 용액 (0.1M 시트르산 및 0.2M 소듐 포스페이트, 0.01% H2O2, 및 1 mg/mL OPD)를 RT에서 15분간 첨가하였다. 스톱 용액 (4N 황산)을 그후 25 ㎕/웰에 첨가하고, OD를 자동 플레이트 분광광도계(automated plate spectrophotometer)를 통해 490 nm에서 판독하였다.
완전한 인간 항-IL-12 활성의 측정
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상기한 하이브리도마를 적합한 RIA 또는 다른 어세이를 사용하여 IL-12에 반응성을 동시에 어세이할 수 있다. 예컨대, 상청액을 상기한 고우트 항-인간 IgG Fc 플레이트상에서 배양하고, 세척하고, 그후 RT에서 1시간동안 웰당 적합한 계수로 방사성 표지된 IL-12를 프로브하였다. 이 웰을 PBS로 두번 세척하고 방사성 동위 원소와 결합된 IL-12는 적합한 계수기를 이용하여 정량하였다. 하이브리도마를 분비하는 인간 IgG1k 항-IL-12를 세포 배양액에 펼치고, 제한된 희석으로 계열적으로 서브클론하였다. 생성된 클론성 집단을 펼치고, 냉동배지 (95% FBS, 5% DMSO)에 ㅈ저온보관(cryopreserve)한 후, 질소액체중에 보관하였다.
이소타입핑
항체의 이소타입 결정은 특이적 정량을 위한 마우스 면역 혈청을 검색하는데 사용된 것과 유사한 형식으로 EIA를 사용하여 수행할 수 있다. IL-12를 상기화 같이 96-웰 플레이트에 도말하고, 항체를 정제하고, 2 Ag/mL에서 RT에서 1시간동안 플레이트상에서 배양하였다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA-PBS로 1 : 4000로 희석된 HRP 표지된 고우트 항-인간 IgG, 또는 HRP 표지된 고우트 항-인간 IgG3 로 1시간동안 RT에서 프로브하였다. 상기 플레이트를 다시 세척하고, 상기한 기질 용액에서 배양하였다.
인간 IL-12와 인간 항-인간 IL-12 항체의 결합 동력학
항체에 대한 결합 특성을 IL-12 캡쳐 EIA 및 예컨대, BIAcore 기술를 사용하여 적절하게 평가할 수 있다. 정제된 인간 IL-12 항체의 농도 구배는 상기한 에서이에서 IL-12의 2μg/mL로 코팅된 EIA 플레이트에 결합을 평가할 수 있다. OD로 상대적 결합 효과를 나타내기 위해 세미-로그 플롯을 나타낼 수 있다.
정량적 결합 상수를 예컨대, 하기 또는 공지의 방법으로 얻을 수 있다. BIAcore CM-5 (carboxymethyl) 칩을 BIAcore 2000 유니트상에 둔다. HBS 버퍼 (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v P20 계면활성제, pH 7.4)를 안정한 기준성이 얻어질 때 까지 칩의 세포에 5 μL/분으로 흘렸다. 200 μL의 물중의 15 mg의 EDC(N-에틸-N'-(3-디메틸-아미노프로필)-카보디이미드 염산)의 용액 (100 ㎕)을 200㎕ 물 중의 2.3 mg의 NHS (N-히드록시석신이미드) 용액 100 μL에 첨가하였다. 40㎕의 생성 용액을 칩상에 주사하였다. 6 μL의 인간 IL-12 (15 μg/mL in 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8)용액을 칩상에 주사하였고, ca. 500 RU 의 증가를 나타내었다. 버퍼를 버퍼 (20 mM 트리스, 0.15 M 소듐 클로라이드, 2 mM 칼슘 클로라이드, 2 mM 마그네슘 아세테이트, 0.5% Triton X-100,25 μg/mL BSA, pH 7.4)를 러닝하여 TBS/Ca/Mg/BSA로 바꾸고, 반응하지 않은 숙신이미드 에스테르를 가수분해 및 안정화하기 위해 밤새 칩상에 흘렸다.
항체를 33. 33, 16.67, 8.33, 및 4.17 nM의 러닝버퍼에 용해하였다. 유속을 30 ㎕/min으로 조정하고, 기구 온도를 25℃로 하였다. 하나는 IL-12를 고정화하고(샘플) 및 2번째의 비유도성 플로우 세포 (블랭크), 2개의 플로우 세포를 동력학 실험을 위해 사용하였다. 120μL의 각각의 항체 농도를 30㎕/min (연합상(association phase))로 흐름 세포에 주사한 후, 비저지된 360초의 버퍼 흐름(해리상(dissociation phase))으로 주사하였다. 칩상의 표면은 30㎕ 각각의 2M 구아니딘 티오시아네이트의 2개의 연속적인 주사에 의해 생성하였다(인터루킨-12/ 해리된 항체 복합체).
데이타 분석은 공지의 BIA 평가 3.0 또는 CLAMP 2.0을 사용하여 수행하였다. 각각의 항체 농도에 대해, 블랭크 센소그램(sensogram)을 샘플 센소그램으로부터 공제하였다. 글로발 피트를 양 분리(kd sec-1) 및 결합(ka, mol-1 sec-1) 및 분리상수 (Kp, mol) 계산 값 (kd/ka)에 대해 수행하였다. 항체 친화성이 항체 부착의 RU가 100 이상으로 충분히 높으면, 항체의 추가적 희석을 수행하였다.
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결과 및 토론
항-인간 IL-12 모노클론성 항체의 생성
다수의 융합이 수행되고, 각각의 융합을 15 플레이트 (1440 웰s/융합)에서 배양하여 인간 IL-12에 특이적인 수십개의 항체를 생성하였다. 물론, 일부는 인간 및 마우스 Ig 쇄의 결합으로 구성된 것을 발견할 수 있었다. 생성된 하이브리도마는 인간 중쇄 및 경쇄로 구성된 항-IL-12 항체를 분비한다. 인간 하이브리도마 모두는 IgG1k가 될 것으로 기대한다.
인간 항-인간 IL-12 항체의 결합 동역학
ELISA 분석은 농도에 의존하는 방법으로 IL-12에 결합하는 상기 일부 또는 모든 하이브리도마로부터 정제된 항체를 확인 할 수 있다. 도 1-2는 상기 항체의 상대적 결합 효율의 결과를 나타내다. 이 경우에, 그의 코그네이트(cognate) 항원 (에피토프)에 대한 항체의 결합성을 특정하였다. EIA 플레이트에 직접 결합된 IL-12는 단백질의 변성을 일으켜서, 명백한 결합 친화성은 비변성된 단백질의 결합을 반영할 수 없다. 50% 결합을 농도의 범위에서 관찰하였다.
정량 결합 상수를 인간 항체의 BIAcore 분석을 사용하여 얻었고, 다수의 인간 모노클론성 항체는 lx10-9 내지 7x10-12 범위의 매우 높은 KD 를 나타내었다.
결론
다수의 융합은 인간 IL-12가 면역화된 인간 가변 및 고정 부분 항체 트랜스유전자를 포함하는 하이브리드 마우스 로 부터 비자세포(splenocyte)를 사용하여 수행하였다. IgG1k 이소타입을 생성하였다. 완전한 인간 항-IL-12 항체를 더욱 특징화하였다. 다수의 생성된 항체는 lx109 및 9x1012 사이의 친화성 상수를 나타내었다. 기대하지 않는 상기 완전 인간 모노클론성 항체의 고 부착성은 IL-12-의존하는 질병, 병리 또는 관련 질환의 치료의 적용에 이들을 적합하게 한다.
실시예 3: C340은 인간 모노클론성 항체를 중성화함
IL-12의 바이오활성은 다양한 IL-12 의존성 활성에서 C340에 의해 중성화(neutralized)를 나타낸다. IL-12가 NK 세포 및 T 임파구에 의한 IFN 감마 생산을 증가하기 때문에, IFN 감마 mRNA의 상승조절에 대한 C340 항체의 효과 및 IFN 감마 단백질의 생산에 대한 C340의 효과를 조사하였다(Trinchieri, G., Current Opinion in Immunology, 9: 17-23 (1997), Morris, S. C., 등, Journal of Immunology, 152: 1047-1056 (1994)). 리포카인 활성화 킬러(LAK) 세포 활성의 유도를 유도하는 IL-12를 중성화하는 C340의 능력을 본 연구에서 또한 조사하였다(Kutza, J. 및 Murasko, D. M., Mechanisms of Ageing 및 Development, 90: 209-222 (1996), Stem, A. S., 등, Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A., 87 : 6808-6812 (1990)). 최근에는, T 및 NK 세포에서 CD95 세포 표면 발현의 IL-12-매개된 상승조절에 대한 C340의 효과를 조사하였다(Medvedev, A. E., 등, Cytokine, 9: 394404 (1997)).
IFN 감마 mRNA 전자의 저해
C340가 IL-12를 저해하는지를 측정하기 위해, 인간 PBL에서 IL-2 유도된 IFN 감마 유전자 전사, 역전사-PCR 어세이를 수행하였다. β-악틴에 대한 특정 프라이머(a control for mRNA integrity 및 content) 및 IFN 감마를 자극된 인간 PBL로부터 얻어진 cDNA를 증폭하기 위해 사용하였다. 도 3은 PBMC로 활성화된 (2 시간) IL-12/IL-2 에서 C340 의 IFN 감마 mRNA 감소조절를 나타낸다.
흐름 세포측정(Flow Cytometry)에 의해 측정된 세포내 IFN 감마의 저해
다양한 시그날 및 활성의 특정에 반응하여, T 세포 및 NK 세포는 사이토카인의 분비를 유도할 수 있다. 보다 특히, 자극 후에 4-8 시간 내에 IL-2로 처리된 PBL 및 IL-12는 IFN 감마의 실직적인 합성을 시작하였다. 상기 생성은 흐름 세포측정에 의해 Brefeldin-A 처린된 PBL의 세포질내에서 측정될 수 있다. 도 4는 C340 IL-12를 5시간동안 IL-12와 함께 첨가할 때, 상개 배양액중에 IFN 감마 생성의 60% 감소를 증명한다.
IL-12 유도된 IFN 감마 분비의 저해
도 5는 농도에 의존하여 말초 혈액 임파구에 의해 IFN 감마의 분비를 저해하는 두개의 다른 C340의 lot를 명백히 나타낸다. IL-12의 400 피코그램을 C340의 다양한 양으로 미리 혼합하고, 자극된 PBL 배양액을 첨가하였다. IFN 감마를 18-24시간 배양후에 EIA에 의해 측정할 때, 현저히 감소된 양의 IFN 감마를 1g/mL 의 C340 항체와 같은 적은 량으로 측정하였다.
IL-12 유도된 LAK 세포 세포독성의 저해
IL-12 자극성 Burkitt lymphom 유도된 세포주이고, NK 세포 저항성인 Raji 세포, LAK 세포 민감성 세포주, Raji 세포를 인간 모노클론성 항체 C340 (5000 ng/mL 또는 50 ng/mL)의 존재 또는 비존재에서 400 pg/mL IL-12 및 10 U/mL IL-2으로 활성화한 LAK 세포와 4시간동안 배양하였다. 도 6은 3개의 정상 건강 도우너로부터의 결과를 나타낸다. IL-12 + 효능체 세포의 IL-2 활성화는 IL-2 단독으로 활성화된 세포보다 세포 톡성 활성의 증가를 나타내었다. C340 항체는 상기 IL-12 의존성 효과를 저해하였다. 저해의 강도는 항체의 농도에 관련되고, 세포독성을 감소하는 것을 테스트하는 고 농도의 것을 배경 수준으로 하였다.
CD95 상승조절의 저해
고 정제된 CD56+ PBL의 표면상에서 CD95의 IL-12-유도된 상승조절이 보고되었다. 도 7A 및 7B에 나타난 것 처럼, 분포적 흐름 세포 측정 분석에서 CD95 발현이 72시간동안 IL-12 플러스 IL-2로 처리한 후 CD3+ T 세포 및 CD56+ NK 세포상세서 상당히 상승조절하는 것으로 나타났다. 항-IL-12의 동시 처리는 CD3+ 및 CD56+ 양자 집단에서 CD95 발현을 저해하였다. 감소된 MFI 지수에 의해 증명되듯이, CD3+ 세포는 ~50% 저해된 반면(도 7A), CD56+ 세포는 ~85% 저해되었다(도 7B)(비자극된 콘트롤보다 큰 퍼센트).
실시예 4: 유전자 클로닝 및 특성화
C340 중쇄 유전자 또는 C340 경쇄를 포함하는 게놈 DNA 단편을 클론하고, 정제하였다. C340 하이브리도마 세포로부터 정제된 게놈 DNA을 Sau3A 제한 효소로 부분적으로 분해하고, 10-40%의 수크로스 농도 구배를 통해 원심분리 분획화에 의해 크기 선별하였다. 15-23 kb의 범위의 크기의 DNA 단편을 박테이로파지 벡터, EMBL3, [상업적으로 구입가능]내오 클론하고, 파지 입자로 포장하였다. 다수의 포장 반응은 1 백만개의 박테이로파지 큭론의 라이브러리의 결과이다. 라이브러리로부터 약 600,000개의 클론을 프로브로서 인간 IgGI 중쇄 고정 부분 서열 또는 인간 kappa 경쇄 고정 부분 서열을 포함하는 32P-표지된 게놈 DNA 단편을 사용하여 플래크(plaque) 하이브리드화에 의해 선별하였다. 13개의 중쇄 및 9개의 경쇄 클론을 검출하였다. 이들중 3개의 중쇄 클론 및 4개의 경쇄 클론을 2번의 선별에 의해 정제하였다. 하나의 중쇄 클론 및 두개의 경쇄 클론은 박테이오파지 DNA의 PCR 분석에 의해 코딩 서열의 5' 및 3' 말단을 포함하는 것으로 나타났다. 중쇄 (HC) 클론 H4에 도입된 DNA는 16 kb 크기 였고, 5' 플래킹의 3.6 kb 및 3' 플래킹 서열의 2 kb를 포함한다. 경쇄 (LC) 클론 LC1에 삽입된 DNA는 15 kb의 크기이고, 5' 플래킹의 4.4 kb 및 3' 플래킹 서열의 6.0 kb를 포함한다. 완전한 삽입물을 SalI 단편으로서 박테이오파지 벡터로부터 제거하고, gpt 선택 마커 유전자를 제공하는 플라스미드 발현 벡터 p 1351의 XhoI 및 Sail 사이에 클론하였다. 중쇄 가변 부분 코딩 서열내에 내부 SalI site가 있기 때문에, 2개의 SalI 단편을 박테이오파지 H4로부터 p 1351 발현 벡터로 이전해야 한다. 생성 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 pl560 및 pl558로 각각 명명하였다. p 1351 벡터 서열에 관련된 2개의 플라스미드내의 중쇄 및 경쇄 유전자의 오리엔테이션을 제한 효소 분석 및 PCR을 각각 사용하여 측정하였다. 양자의 경우에, 상기 오리엔테이션은 Ab 유전자 단편의 5' 말단은 gpt 유전자의 3'말단과 입접하는 것으로 나왔다. 클론된 유전자의 코딩 부분의 양 스트랜드을 서열화하였다. 상기 플라스미드 pl560 및 pl558의 서열을 도 11A-11K 및 도 13A-13J에 각각 나타내었다.
실시예 5: 재조합 세포주의 제조
중쇄 플라스미드 p 1560 를 PvuL 제한 효소로 분해하여 선형화하고, 경쇄 플라스미드 pl558를 SalI 제한 효소를 사용하여 선형화하였다. p3X63Ag8.653 (653) 및 SP2/0-Agl4(SP2/0) 세포를 전기천공(electroporation)에 의해 미리 혼합된 선형화 플라스미드에 각각 형질감염하고, 세포를 배양하고, 형질감염체를 선행기술과 같이 미코페놀산(mycophenolic acid)을 사용하여 선별하였다(Knight, 등. MolecμLar Immunology 30: 1443 (1993)). 미코페놀산-저항성 콜로니로부터 세포 상청액을 인간 IgG에 대해 약 2주간 후에 분석하였다(즉, 재조합 C340 (rC340)). 이것에 대해, 세포 상청액을 인간 IgG의 Fc 부분에 특이적 고우트 항체로 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트상에서 배양하였다. 상기 코팅된 플레이트상에 결합된 인간 IgG을 알칼리 포스파테이즈-컨쥬게이트된 고우트 항-인간 IgG (중쇄 + 경쇄) 항체 및 기질로서 알칼리 포스파테이즈를 사용하여 선행문헌과 같이 검출하였다(Knight, 등, MolecμLar Immunology 30: 1443 (1993)). 고 생산 클론의 세포를 표준 배지내의 24-웰 배양 접시로 옮기고, 펼쳤다(IMDM, 5% FBS, 2 mM glutamine, mycophenolic acid selection mix). 생산된 항체의 양(즉, 소비된 배양 배지내로 분비된)을 조스럽게 표준으로서 정제된 C340 mAb를 사용하여 ELISA에 의해 정량하였다. 선택된 클론을 그후 T75 플라스크에 펼치고, 상기 클론에 의한 인간 IgG의 생성을 ELISA에 의해 정량하였다. 상기 값에 기초하여 6개의 비의존 653 형질감염체 및 3개의 비의존 SP2/0 형질감염체를 서브클론 하고(96 웰 플레이트중의 웰 당 하나의 세포의 평균을 시딩(seeding)하여), 서브클론에 의해 생성된 항체의 양을 각각의 서브클론 콜로니로부터 상청액을 (ELISA) 어세이하여 측정하였다. 3개의 서브클론, 653 형질감염체 19-20 (C379B) 및 SP2/0 형질감염체 84-81 (C381A) 및 22-56 (C389A)을 추가적 분석을 위해 선별하였다.
rC340 항원 결합을 위한 어세이
상기화 같이 선별된 세포주의 서브클로닝전에, 3개의 모세포주(653 형질감염체 클론 2 및 클론 18 및 SP2/0 형질감염체)의 세포 상청액을 rC340의 항원 결합 특성을 시험하기 위해 사용하였다.
3개의 세포 상청액 샘플내의 rC340의 농도를 우선 ELISA에 의해 측정하였다. 상청액 샘플 또는 정제된 C340 양성 콘트롤의 적정한 양을 2μg/ml의 인간 IL-12로 코팅된 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 부착된 mAb를 알칼리 포스파테이즈-컨쥬케이트된 고우트 항-인간 IgG (중쇄 + 경쇄) 항체 및 적절한 알칼리 포스파테이즈 기질을 사용하여 검출하였다. 도 8에 나타난 것과 같이, rC340은 초기 C340 mAb과 비구별되는 모양으로 인간 IL-12에 특이적으로 결합하였다.
선별된 세포주의 특성화
성장 커브 분석을 표준 배지 또는 SFM-5 혈청-free 배지내의 2 X 105 세포/ml의 출발 세포 농도로 T75 플라스크에 접종한 C379B, C381A, 및 C389A상에서 수행하고 배양물이 소비될 때까지 매일 세포 수 및 rC340농도를 측정하였다. 표준 배지 내의 배양의 결과를 도 9A-9C에 나타내었다. C379B C381A, 및 C389A에 대한 최대 C340 mAb 생산 수준은 각각 135 μg/ml, 150 μg/ml, 및 110 pLg/ml였다. C379B 세포를 SFM-5 배지에의 적용은 성공하지 못했다. C381A 세포는 표준 배지로서 SFM-5 배지에서 rC340의 동량을 생산한 반면, C389A 세포는 표준 배지로서 SFM-5 배지에서 오직 절반의 rC340를 생산하였다.
3개의 서브클론에 대한 시간상 rC340 mAb 생산의 안정성을 기간의 변화하면서 표준 배지 또는 미코페놀산 없는 표준 배지에서 24-웰 접시에서 배양 세포를 분석하였다. C379B 및 C381A 세포주를 30 일 (the maximμM time tested) 및 75 일 각각의 기간동안 선별의 있거나 없는 상태에서 안정하게 rC340를 생산하는 가를 관찰하였다. C389A 세포주는 불안정하고, 배양 43 일후에 연구의 초기보다 20% 많은 항체를 생산하였다.
본 발명은 상기 명세서 및 실시예에 특히 기술된 것과 다르게 실시할 수 있다는 것은 명백하다.
본 발명의 다수의 변경 및 변화가 상기 기술의 비추어 가능하여 첨부된 청구항의 범위내에 속한다.
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Claims (101)

  1. 서열 번호 7의 중쇄 가변부분 아미노산 서열 및 서열 번호 8의 경쇄 가변부분 아미노산 서열을 포함하는 단리된 포유동물 항-IL-12 항체.
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  4. 서열 번호 7의 중쇄 가변부분 아미노산 서열 및 서열 번호 8의 경쇄 가변부분 아미노산 서열을 포함하는 단리된 포유동물 항-IL-12 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
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  6. 제4항에 따른 단리된 핵산을 가지는 단리된 핵산 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
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  9. 서열 번호 7의 중쇄 가변부분 아미노산 서열 및 서열 번호 8의 경쇄 가변부분 아미노산 서열을 포함하는 단리된 포유동물 항-IL-12 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 건선, 다발성 경화증 및 크론병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병의 진단 또는 치료용 약제학적 조성물.
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  12. 서열 번호 7의 중쇄 가변부분 아미노산 서열 및 서열 번호 8의 경쇄 가변부분 아미노산 서열을 포함하는 유효량의 단리된 포유동물 항-IL-12 항체를 포함하는, 건선, 다발성 경화증 및 크론병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병의 진단 또는 치료용 약제.
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  21. (i) 서열 번호 1, 2, 및 3의 모든 중쇄 상보성 결정 부위 (CDR) 아미노산 서열 ; 및 (ii) 서열 번호 4, 5, 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 단리된 포유동물 항-IL-12 항체.
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  24. (i) 서열 번호 1, 2, 및 3의 모든 중쇄 CDR 아미노산 서열 ; 및 (ii) 서열 번호 4, 5, 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 단리된 포유동물 항-IL-12 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
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  26. 제24항에 따른 단리된 핵산을 가지는 단리된 핵산 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
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  29. (i) 서열 번호 1, 2, 및 3의 모든 중쇄 CDR 아미노산 서열 ; 및 (ii) 서열 번호 4, 5, 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열를 포함하는 단리된 포유동물 항-IL-12 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 건선, 다발성 경화증 및 크론병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병의 진단 또는 치료용 약제학적 조성물.
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  32. (i) 서열 번호 1, 2, 및 3의 모든 중쇄 CDR 아미노산 서열 ; 및 (ii) 서열 번호 4, 5, 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 유효량의 단리된 포유동물 항-IL-12 항체를 포함하는, 건선, 다발성 경화증 및 크론병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병의 진단 또는 치료용 약제.
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  81. 서열 번호 9의 1 내지 88 잔기를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는, (i) 서열 번호 1, 2, 및 3의 모든 중쇄 CDR 아미노산 서열 ; 및 (ii) 서열 번호 4, 5, 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 단리된 포유동물 항-IL-12 항체.
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  84. 서열 번호 9의 1 내지 88 잔기를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는,(i) 서열 번호 1, 2, 및 3의 모든 중쇄 CDR 아미노산 서열 ; 및 (ii) 서열 번호 4, 5, 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 단리된 포유동물 항-IL-12 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
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  86. 제84항에 따른 단리된 핵산을 가지는 단리된 핵산 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
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  89. 서열 번호 9의 1 내지 88 잔기를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는, (i) 서열 번호 1, 2, 및 3의 모든 중쇄 CDR 아미노산 서열 ; 및 (ii) 서열 번호 4, 5, 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 단리된 포유동물 항-IL-12 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 건선, 다발성 경화증 및 크론병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병의 진단 또는 치료용 약제학적 조성물.
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  92. 서열 번호 9의 1 내지 88 잔기를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는, (i) 서열 번호 1, 2, 및 3의 모든 중쇄 CDR 아미노산 서열 ; 및 (ii) 서열 번호 4, 5, 및 6의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 유효량의 단리된 포유동물 항-IL-12 항체를 포함하는, 건선, 다발성 경화증 및 크론병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병의 진단 또는 치료용 약제.
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