ES2622394T3 - Formas solubles de la glicoproteína g del virus hendra - Google Patents

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Abstract

Una proteína de fusión que comprende un dominio de la proteína G del virus Hendra soluble que comprende los aminoácidos del 71 al 604 de la proteína G nativa del virus Hendra y un dominio de la cadena IgK que comprende la secuencia de aminoácidos de la Sec. con núm. de ident.: 10.

Description

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DESCRIPCION
Formas solubles de la glicoprotema g del virus hendra
1. Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a formas solubles de una glicoprotema G del virus Hendra y a protemas de fusion y composiciones que las comprenden.
2. Descripcion de los antecedentes
El virus Nipah y el virus Hendra son virus emergentes responsables de enfermedades fatales no reconocidas previamente en animales y seres humanos. Estos virus son miembros estrechamente relacionados de un nuevo genero, el Henipavirus, en la familia Paramyxoviridae, un grupo diverso de virus de RNA de sentido negativo, grandes, envueltos, que incluye una variedad de patogenos humanos y animales importantes. La aparicion reciente de estos dos virus parece ser el resultado de la exposicion de nuevos huespedes precipitada por ciertos cambios ambientales y de comportamiento. El virus Hendra se identifico en primer lugar, a partir de casos de enfermedad respiratoria grave que afecto fatalmente tanto a caballos como al hombre. Posterior a esa aparicion, un brote de encefalitis febril grave asociada con muertes humanas ocurrio en Malasia. Estudios posteriores identificaron un virus similar al Hendra, ahora conocido como virus Nipah, como el agente etiologico de ese episodio. Estos virus son inusuales entre los paramixovirus por su capacidad de infectar y causar enfermedades con altas tasas de mortalidad en una serie de especies huespedes, lo que incluye a los humanos, y son agentes zoonoticos de Nivel Biologico de Seguridad 4. En la actualidad, el gato parece ser el modelo animal pequeno ideal capaz de reproducir la patologfa observada en los humanos infectados.
Los virus Nipah y Hendra son virus seleccionados por el NIAID, de categona C y poseen varias caractensticas que los hacen altamente adaptables para su uso como agentes de guerra biologica. Por ejemplo, ambos crecen facilmente en cultivos celulares o huevos embrionados de pollo, producen tftulos altos no concentrados cercanos a 1x108 TCIDso/ml, (14), son altamente infecciosos y se transmiten a traves del tracto respiratorio (22, 27), y pueden amplificarse y extenderse en el ganado que sirve como una fuente para la transmision a los seres humanos. La evidencia reciente indica, ademas, que es posible la transmisibilidad nosocomial del NiV a partir de pacientes con encefalitis a trabajadores de la salud (45, 60).
La fusion de la membrana de los virus envueltos con la membrana plasmatica de una celula huesped receptiva es un requisito previo para la entrada e infeccion viral y un paso esencial en el ciclo de vida de todos los virus envueltos. La investigacion hacia la diseccion y comprension de los mecanismos de este proceso es un area detrabajo importante. No solo proporciona una vision de las interacciones complejas entre los patogenos virales y sus celulas huespedes, sino que, ademas, puede arrojar luz sobre el proceso bioqmmico complejo y esencial de la fusion de membrana mediada por protemas, y conducir, ademas, al desarrollo de nuevas estrategias de intervencion y de vacunas. Esto se demostro en el campo de la investigacion del VIH, donde el descubrimiento de los coreceptores buscados desde hace mucho tiempo involucrados en la entrada y la infeccion abrio una nueva era en el desarrollo de farmacos para bloquear el proceso de infeccion en el nivel de entrada (revisado en (3, 18)).
Los paramixovirus son virus envueltos de RNA de sentido negativo y abarcan una variedad de patogenos humanos y animales importantes, lo que incluye al virus del sarampion (MeV), virus de la parotiditis, virus Sendai (SeV), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la peste bovina, virus del moquillo canino (CDV), virus parainfluenza humano (hPIV) 1-4, virus sincitial respiratorio (RSV), y virus de simios 5 (SV5) (revisado en (36)). En contraste con los retrovirus, los paramixovirus contienen dos glicoprotemas principales ancladas en la membrana, que aparecen como esproulas que sobresalen de la membrana de la envoltura de la partroula viral cuando se observan bajo el microscopio electronico. Una glicoprotema se asocia con la union del virion a la celula huesped, y, en dependencia del virus particular, se designo como la protema hemaglutinina-neuraminidasa (HN), la hemaglutinina (H), o la protema G que no tiene actividad hemaglutinante ni neuraminidasa (revisado en (44)). La otra glicoprotema es la protema de fusion (F) que participa directamente en facilitar la fusion de las membranas de las celulas huesped y del virus (revisado en (36)). Despues de la union del virus a una celula huesped permisiva, se produce una fusion a pH neutro (o independientemente del pH) entre las membranas plasmatica y del virion, lo que resulta en la entrada de la nucleocapsida al citoplasma. En un proceso relacionado, las celulas que expresan estas glicoprotemas virales en sus superficies pueden fusionarse con celulas que portan el receptor, lo que resulta en la formacion de celulas gigantes multinucleadas (sincitios) bajo condiciones fisiologicas o de cultivo celular.
Las glicoprotemas de la envoltura. La glicoprotema de la envoltura HN es responsable de la union del virion a su receptor, acido sialico, en la celula objetivo como es el caso del hPIVs, NDV, SV5 y otros. Por el contrario, los morbilivirus, como el MeV y el CDV, tienen una protema de union (H) que posee solo actividad hemaglutinante y no se unen al acido sialico. El MeV fue el primer morbilivirus que se demostro que es capaz de utilizar una protema de la superficie celular como un receptor (19, 47), y fue la demostracion de la interaccion predicha entre la glicoprotema H del MeV y el receptor CD46 del MeV mediante el uso de experimentos co-ip y CD46 soluble (48). Ademas, los aislamientos
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de campo del MeV asf como las cepas vacunales demostraron ser capaces de utilizar la molecula linfocitaria activadora de senales (SLAM; CD150) (61). La SLAM es capaz, ademas, de servir como receptor de varios otros morbilivirus, lo que incluye al CDV (62).
Una tercera clase de glicoprotemas de union de los paramixovirus, que poseen los Pneumovirinae tales como el RSV, se denominan G, y no tienen actividades hemaglutinantes ni neuraminidasas (revisado en (44)). Las glicoprotemas de union son protemas de membrana de tipo II en las que el extremo amino (N) de la molecula se orienta hacia el citoplasma y el extremo carboxi (C) de la protema es extracelular. La otra glicoprotema de la envoltura principal es la glicoprotema de fusion (F), y las F de estos virus son mas similares, donde en todos los casos participa directamente en la mediacion de la fusion entre el virus y la celula huesped a pH neutro.
La glicoprotema F de los paramixovirus es una glicoprotema integral de membrana tipo I donde el extremo N de la protema es extracelular. Esta comparte varias caractensticas conservadas con otras protemas de fusion viral, lo que incluye la glicoprotema de la envoltura (Env) de los retrovirus como la gp120/gp41 del VIH-I y hemaglutinina (HA) del virus de la influenza (revisado en (26)). La protema F biologicamente activa consiste en dos subunidades unidas por disulfuro, F1 y F2, que se generan por la escision proteolttica de un polipeptido precursor que se conoce como F0 (revisado en (34, 55)). De la misma manera, la Env del VIH-I y la HA de la influenza se activan proteoltticamente por una proteasa de la celula huesped, lo que conduce a la generacion de una subunidad distal de la membrana analoga a F2 y a una subunidad anclada a la membrana analoga a F1. En todos los casos, la subunidad anclada en la membrana contiene un nuevo extremo N que es hidrofobico y altamente conservado a traves de las familias de virus y se denomina peptido de fusion (revisado en (30)). Todos los paramixovirus estudiados hasta la fecha requieren una protema F y una de union para la fusion eficiente, con la excepcion del SV5 que puede mediar alguna fusion en ausencia de la HN (50). La evidencia de una asociacion ffsica entre estas glicoprotemas se observo solo con un exito limitado y solo con el NDV (57), hPIV (73) y recientemente con el MeV (51), pero estas observaciones fueron a menudo con la ayuda de agentes qmmicos de reticulacion. Se hipotetiza que despues del acoplamiento del receptor, la protema de union debe de alguna manera senalar e inducir un cambio conformacional en F que conduce a la fusion virion/celula (35, 53). Se observo desde hace bastante tiempo que existen diferencias conformacionales en la HN y la F de un paramixovirus en dependencia de si se expresaron solas o en combinacion (13).
Las glicoprotemas de la envoltura F de los Paramyxovirus, como las de los retrovirus, se consideran protemas detipo de fusion de membrana de clase I. Una caractenstica importante de las glicoprotemas de fusion de estos virus es la presencia de 2 dominios de alfa helices que se denominan heptadas de repeticion que participan en la formacion de una estructura de tnmeros de horquillas durante o inmediatamente despues de la fusion (29, 56). Estos dominios se denominan, ademas, heptadas de repeticion del extremo amino (N) y del extremo carboxilo (C) (o HR1 y HR2), y los peptidos correspondientes a cualquiera de estos dominios pueden inhibir la actividad de la glicoprotema de fusion viral cuando estan presentes durante el proceso de fusion, lo que se observo primero con secuencias derivadas de la subunidad gp4l de la glicoprotema de la envoltura del VIH-I (32, 67). De hecho, los peptidos inhibidores de la fusion del VIH-I tienen exito clmico y es probable que sean los primeros farmacos inhibidores de fusion aprobados. Se demostro, ademas, que las secuencias peptfdicas de las heptadas N o C de la F del SV5, MeV, RSV, hPIV, NDV y SeV son potentes inhibidores de la fusion (33, 37, 52, 68, 74, 75). Se acepta generalmente que se producina un cambio conformacional significativo durante la activacion de la actividad fusogenica de la F de los paramixovirus. Las reactividades de union a anticuerpos diferenciales de las formas precursoras y procesadas proteoltticamente de la F del SV5 (20) y en conjuncion con la estructura del paquete de 6 helices de posfusion de la F del SV5 (2), apoyan fuertemente el modelo de cambio conformacional, no solamente respecto al cambio estructural que tiene lugar de la prefusion a la posfusion, si no, ademas, del precursor F0 a la protema madura F2-F1. El hecho de que la estructura posfusion de un nucleo de la F del paramixovirus probablemente se conserve a traves de otros paramixovirus resulta respaldada adicionalmente por las estructuras del nucleo de la F del RSV (79) y del MeV (80). Sin embargo, estudios estructurales recientes sobre la glicoprotema F del NDV produjeron algunos hallazgos diferentes e interesantes. La estructura del tnmero oligomerico de la F del NDV (en quizas el estado de prefusion o metaestable) ofrecio alguna informacion alternativa que la distingue de la estructura clasica de la HA de la influenza, esto se refleja principalmente en la orientacion completamente opuesta de las helices superenrolladas centrales formadas por los segmentos HRl (denominados, ademas, HRA) del tnmero (9, 10). Hasta la fecha, esta es la unica informacion estructural sobre la forma prefusion (o metaestable) de la F de un paramixovirus (de hecho la unica otra estructura metaestable, clase I, distinta a la HA de la influenza), y tal vez representa una posible tercera clase de protemas de fusion viral.
Aun hay que dilucidar la forma en que funcionan conjuntamente las glicoprotemas de fusion y de union en mediar la fusion, pero hay dos modelos centrales propuestos para la funcion de la glicoprotema de union en el proceso de fusion de membrana mediada por los paramyxovirus, los cuales se detallaron recientemente por Morrison y colaboradores (41), en el contexto de la glicoprotema HN del NDV. En el primer modelo, las glicoprotemas de fusion y union no se asocian ffsicamente en la membrana, pero despues del acoplamiento al receptor hay una alteracion en la glicoprotema de union que facilita su asociacion con F y al hacerlo imparte o facilita el cambio conformacional de F que conduce a la fusion de membrana. En el segundo modelo, la F y la glicoprotema de union se preasocian y el acoplamiento al receptor induce una alteracion conformacional en la glicoprotema de union, y este proceso altera o libera una interaccion con F que permite que F avance hacia su estado activo de fusion - formacion del paquete de 6 helices justo antes o concomitante con la fusion de membrana. Los hallazgos en el NDV demuestran la accesibilidad variable del dominio HRl
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durante el proceso, donde los HRI de la F son accesibles a un anticuerpo inhibidor de la fusion espedfico cuando F se presenta en el contexto de la HN, sin embargo la expresion de F sola resulta en una version no fusogenica de F con una conformacion claramente alterada que tiene un dominio HRl que ya no es accesible al anticuerpo (41). El segundo modelo es que la glicoprotema de union sostiene a F en su conformacion no fusogenica y tras el acoplamiento del receptor y el cambio conformacional en la glicoprotema de union F se libera para experimentar cambios conformacionales que conducen a formacion de paquetes de 6 helices y a la facilitacion de la fusion de membrana. Esto se respalda por observaciones de que la F del paramixovirus expresada sola no media la fusion (con la excepcion del SV5 bajo ciertas condiciones) y tiene accesibilidad variable a los anticuerpos de ciertos dominios tales como el dominio HRl de la F del NDV (41). Esto es debido quizas a que F sola pasa a una conformacion intermedia o de fusion activada en un momento inapropiado, lo que sena coherente con las observaciones de la fusion defectuosa o activada de la gp41 del VIH-1 conocida, ademas, como espmulas-muertas (17). Los hallazgos preliminares con el HeV y el NiV apoyan este segundo modelo. Finalmente, se revelo recientemente a nivel molecular a partir de estudios sobre la glicoprotema HN del NDV que la glicoprotema de union de un paramixovirus experimenta una alteracion de conformacion espedfica cuando se une al receptor (58, 59). Estos estudios revelaron diferencias claras en la estructura de la HN cuando la glicoprotema unida al receptor se compara con la estructura de la HN no unida al receptor. Ademas, todas las glicoprotemas de la envoltura viral conocidas son homo o heterooligomeros en sus formas maduras y funcionales (revisado en (16)). Las protemas multimericas, como estas, generalmente interaction en grandes areas, lo que hace probable que existan diferencias estructurales entre las subunidades monomericas y el oligomero maduro (31). Esta caractenstica puede, ademas, traducirse en diferencias en la estructura antigenica y se demostro para una serie de protemas, mas notablemente para la glicoprotema HA de la influenza trimerica (69) y la gpl20/gp41 del VIH-1 (7). De hecho, se mapeo un determinante neutralizante potente, espedfico del tnmero, para la interfaz entre las subunidades adyacentes de HA, y se identificaron y mapearon anticuerpos anti Env del VIH-1 especificos del oligomero para epitopos dependientes de la conformacion en la gp41 (7). Hasta el momento, todas las glicoprotemas de fusion de los paramixovirus, retrovirus, y del virus de la influenza parecen ser homotnmeros (8, 9, 21, 54, 71), y se demostro que varias protemas de union HN son tetramericas, compuestas por un dfmero de homodfmeros. Por ejemplo, la HN del NDV puede formar dfmeros y tetrameros en la superficie viral (40, 43), y recientemente se resolvio la estructura cristalina de la region de la cabeza globular del dfmero de HN del NDV (15). Finalmente, y de importancia para la comprension de ciertos aspectos de la respuesta inmune a estos virus y para el desarrollo de vacunas, encontramos estas glicoprotemas de envoltura principales de estos virus contra las que virtualmente se dirigen todos los anticuerpos neutralizantes de virus.
Paramyxovirus patogenos emergentes. En 1994, se aislo un nuevo paramixovirus, a partir de casos fatales de enfermedad respiratoria en caballos y seres humanos, y se demostro que se relacionaba distantemente con el MeV y otros miembros del genero morbillivirus; se denomino provisionalmente morbillivirus equino (EMV) pero desde entonces se renombro virus Hendra (HeV) (46). El primer brote de enfermedad respiratoria severa en el suburbio de Brisbane de Hendra Australia resulto en la muerte de 13 caballos y su entrenador, y la infeccion no fatal de un caballerizo y de otros 7 caballos. Aproximadamente al mismo tiempo, en un incidente no relacionado a casi 100 km al norte de Hendra, un hombre de 35 anos experimento una breve enfermedad meningttica aseptica despues de cuidar y ayudar en las necropsias de dos caballos que se demostro posteriormente que habfan muerto como resultado de una infeccion por HeV. Trece meses despues este individuo sufrio una recurrencia de encefalitis grave caracterizada por actividad epileptica focal y generalizada no controlada. Una variedad de estudios que se realizaron en la evaluacion de esta fatalidad, que incluyo serologfa, PCR, microscopfa electronica (EM) e inmunohistoqmmica, sugirio fuertemente que el HeV fue de hecho la causa de la encefalitis de este paciente, y que el virus se adquirio a partir de los caballos infectados con HeV 13 meses antes (49). En total, quince caballos y dos personas murieron en los dos episodios. Hasta el momento la fuente del virus emergente era indeterminada, pero mas recientemente se encontro que aproximadamente el 50 % de ciertas especies de murcielagos frutales australianos, comunmente conocidos como zorros voladores, tienen anticuerpos contra el HeV y se aislaron virus similares al Hendra a partir de fluidos uterinos de los murcielagos. Parece que estos animales son el huesped natural del virus (22, 24, 25, 76). Recientemente, la secuencia de acidos nucleicos de los genes del HeV se analizo y comparo con la de otros paramixovirus (64, 77, 78). Estos estudios confirmaron que el HeV es miembro de los Paramyxoviridae, subfamilia Paramyxovirinae.
Posteriormente a estos acontecimientos, se produjo en 1998 un brote de encefalitis grave en personas con contacto directo con cerdos en Malasia y Singapur (1). El brote se observo por primera vez en septiembre de 1998 y para mediados de junio de 1999, se reportaron en Malasia mas de 265 casos de encefalitis, que incluyeron 105 muertes, y se reportaron 11 casos de enfermedad con una muerte en Singapur. Este brote tuvo un enorme impacto economico negativo, que continua hasta la fecha. Aunque resultaron exitosas, las medidas tomadas en los primeros dfas del brote resultaron en el sacrificio de aproximadamente 1.3 millones de cerdos y el cierre virtual de la industria porcina en la Malasia peninsular. Los estudios de EM, serologicos y geneticos indicaron que este virus es, ademas, un paramixovirus y estaba estrechamente relacionado con el HeV. Este virus se denomino virus Nipah (NiV) por la pequena ciudad de Malasia de la cual se obtuvo el primer aislado a partir de lfquido cefalorraqrndeo de un caso humano fatal (11, 12, 23, 38, 39).
La mayona de los pacientes humanos presentan encefalitis aguda, que en el brote de Malasia de 1998-1999 resulto en una tasa de mortalidad de aproximadamente el 40 %, pero la infeccion puede presentarse, ademas, como un episodio no encefalttico o asintomatico con seroconversion. Curiosamente, la infeccion con el NiV puede, ademas, tomar un
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curso mas cronico donde la enfermedad neurologica mas grave ocurre tarde (mas de 10 semanas) despues de una infeccion noencefalttica o asintomatica. Por otro lado, se observo, ademas, la recurrencia de manifestaciones neurologicas (encefalitis recidivante) en pacientes que se recuperaron previamente de encefalitis aguda. Los casos de encefalitis recidivante se presentaron desde varios meses hasta casi dos anos despues de la infeccion inicial (72). En conjunto, hubo una tasa de incidencia cercana al 10 % de manifestaciones encefaltticas tardfas con una tasa de mortalidad del 18 %. As^ tanto con el NiV como con el HeV, es posible un penodo prolongado de infeccion antes de que se produzca una enfermedad neurologica grave. Los mecanismos subyacentes que permiten a estos virus, especialmente al NiV, escapar de la eliminacion por el sistema inmunologico durante un penodo tan prolongado, se desconocen completamente.
En el caso del NiV, la presentacion tardfa de la enfermedad neurologica y la respuesta de subclase IgG mostraron similitudes con la panencefalitis esclerosante subaguda (SSPE), una manifestacion tardfa rara de la infeccion por el MeV (72). Fue la caracterizacion molecular del HeV y del NiV lo que los distinguio como paramyxovirus claramente nuevos. Las familias Paramyxoviridae, Filoviridae, Rhabdoviridae, y Bornaviridae son todas de virus envueltos de RNA de sentido negativo que comparten una organizacion del genoma, estrategias de replicacion y estructura del dominio de la polimerasa similares (63). Estas familias se agrupan en el orden Mononegavirales, el primer taxon por encima de la taxonoirna de virus a nivel familiar. El tamano del genoma en los Mononegavirales es amplio, -8.9-19. 1kb. Los genomas de los paramixovirus, como grupo, se consideran generalmente de magnitud estrecha, con tamanos en el intervalo de 15.1-15.9 kb, excepto para el HeV y el NiV cuyos genomas de 18.2 kb, estan mucho mas cerca en tamano a los Filoviridae. Gran parte de esta longitud anadida son regiones no traducidas en el extremo 3' en las seis unidades de transcripcion, de nuevo muy similar a los Filoviruses Ebola y de Marburgo (63). Ademas, la protema P es mayor por 100 residuos (la mas larga conocida), y existe una pequena protema basica (SB) en el HeV de funcion desconocida. En conjunto, las caractensticas moleculares del HeV y el NiV los convierten en paramixovirus poco comunes, al igual que su capacidad para causar enfermedades potencialmente fatales en varias especies, lo que incluye a los humanos.
Patogenesis. El desarrollo o caracterizacion de modelos animales para estudiar estas nuevas zoonosis virales es importante para comprender sus caractensticas patogenicas y en el desarrollo de farmacos. De los dos casos fatales de infeccion por HeV en humanos, el primero fue el resultado de una enfermedad respiratoria grave despues de varios dfas con soporte de vida ventilado. Los pulmones del paciente presentaban lesiones macroscopicas de congestion, hemorragia y edema asociados con una alveolitis cronica histologica con sincitios. El segundo caso fatal fue uno de leptomeningitis con linfocitos y celulas plasmaticas y focos de necrosis en varias partes del parenquima cerebral, despues de la infeccion inicial mas de un ano antes (revisado en 27). Se observaron, ademas, celulas endoteliales multinucleadas tanto en las vfsceras como en el cerebro. En contraste, hubo muchos mas casos humanos de infeccion con NiV. Mas de 30 individuos resultantes del gran brote de NiV en Malasia y Singapur se sometieron a autopsia, y las caractensticas inmunologicas e histologicas incluyeron la infeccion endotelial sistemica acompanada de vasculitis, trombosis, isquemia y necrosis (revisado en 27). Estos cambios se observaron especialmente en el sistema nervioso central (CNS). El analisis inmunohistoqmmico mostro, ademas, la presencia generalizada de antfgenos del NiV en neuronas y otras celulas parenquimatosas en focos necroticos observados en el CNS, asf como en celulas endoteliales y medios de vasos afectados (27). En humanos infectados, se observo, ademas, evidencia de vasculitis e infeccion endotelial en la mayona de los organos examinados. La infeccion de celulas endoteliales diseminada, vasculitis y la infeccion de celulas parenquimatosas del CNS desempenan una funcion esencial en el desenlace fatal de la infeccion por el NiV en los seres humanos (revisado en (27)). Los principales episodios zoonoticos en la naturaleza implicaron a caballos en los casos del HeV y al cerdo en el caso del NiV. Ambos virus presentan un tropismo por celulas huespedes notablemente amplio en estudios in vitro (4, 5). Estas observaciones correlacionan con lo que se observo en la infeccion natural y experimental.
Se llevaron a cabo infecciones experimentales de caballos y cerdos con HeV y NiV respectivamente y se examino un caballo naturalmente infectado con NiV. La patologfa causada por cualquiera de los virus en caballos parece ser mas severa que la causada por el NiV en cerdos. Ademas de en los cerdos, tambien se practico la infeccion por HeV de gatos y en este caso la enfermedad se asemeja a la observada en los caballos, que se caracteriza por una enfermedad vascular generalizada con los efectos mas graves observados en el pulmon (28). Ademas, se infectaron experimentalmente curieles con HeV (28) y la patologfa observada difirio significativamente en varios aspectos en comparacion con los casos humanos asf como con los caballos natural y experimentalmente infectados. En curieles el HeV causo una enfermedad vascular generalizada pero, a diferencia de en caballos y gatos, hubo poco o ningun edema pulmonar. Histologicamente, la enfermedad vascular fue prominente en las arterias y venas, y en muchos organos tales como el pulmon, rinon, bazo, ganglios linfaticos, tracto gastrointestinal y musculos esqueletico e intercostal. La infeccion por NiV del curiel todavfa no se describe bien.
Con respecto a otros modelos de animales de laboratorio pequenos, el NiV y el HeV no causan enfermedad en los ratones incluso despues de la administracion subcutanea, sin embargo, y no sorprendentemente, mataran a ratones si se administran intracranealmente. Ademas, no hay evidencias serologicas de NiV en roedores en Malasia, y varios cientos de sueros se comprobaron durante el brote. Se observo, ademas, evidencia de infecciones naturales por NiV en perros y gatos.
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En la infeccion experimental por NiV del gato, las lesiones macroscopicas en animales con signos clmicos graves se asemejaban mucho a las de los gatos infectados con HeV. Estas consistfan en hidrotorax, edema en los pulmones y ganglios linfaticos pulmonares, espuma en los bronquios, y consolidacion densa de color rojo purpura en el pulmon. Hubo, ademas, caractensticas similares en la apariencia histologica, hemorragia alveolar y peribronquial, perivascular difusa, y edema, vasculitis que afectaba arterias y arteriolas, alveolitis, formacion de sincitios dentro de las celulas endoteliales y celulas epiteliales alveolares (revisado en (27)). En conjunto, la evidencia hasta la fecha indica que el gato representa un modelo animal en el que la patologfa vista se asemeja mas estrechamente al curso letal de la enfermedad humana. Ademas, la infeccion de gatos con NiV o HeV es uniformemente fatal. El NiV y el HeV parecen causar enfermedades similares pero con algunas variaciones notables, y aunque los procesos patologicos basicos se describen bien, se conoce menos sobre los factores que influyen claramente en el curso de la enfermedad en dependencia de la especie infectada. Esta es una preocupacion especial en las infecciones humanas, donde existe una notable capacidad de estos virus para persistir en el huesped (hasta 2 anos) antes de causar una recurrencia de la enfermedad grave y a menudo fatal. Los gatos sucumben en 6-8 dfas a la infeccion subcutanea con 5,000, y a la administracion subcutanea u oral de 50,000, TCID50 de HeV purificado, de un pase bajo (65, 66, 70). La infeccion experimental de gatos con NiV confirmo la susceptibilidad de esta especie a la infeccion oronasal con 50,000 TCID50 de NiV (42). En resumen, el smdrome clmico y patologico inducido por el NiV en gatos fue comparable con el asociado a la infeccion por HeV en esta especie, excepto que en la infeccion fatal con NiV hubo una extensa inflamacion del epitelio respiratorio, asociada con la presencia de antfgeno viral.
En resumen, recientemente se confirmaron brotes recurrentes de NiV que resultan en un numero significativo de muertes humanas (Fatal fruit bat virus sparks epidemics in southern Asia. Nature 429, 7, 06 de mayo de 2004). El HeV se conoce, ademas, por causar muertes en humanos y animales y se relaciona geneticamente e inmunologicamente estrechamente con el NiV. En la actualidad no existen vacunas ni farmacos para la prevencion de infecciones o enfermedades causadas por el virus Nipah o el virus Hendra. Tanto el virus Nipah como el virus Hendra son agentes prioritarios categona C de preocupacion de biodefensa del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, de Estados Unidos. Ademas, dado que estos virus son agentes zoonoticos de Nivel de Seguridad Biologica 4 (BSL-4), la produccion de vacunas y/o diagnosticos, con seguridad es muy costosa y diffcil. Asf, existe la necesidad de vacunas y diagnosticos para los virus Nipah o Hendra que permitan una produccion de alto rendimiento de vacunas y/o diagnosticos.
Resumen de la invencion
La presente invencion supera los problemas y desventajas asociadas con las estrategias y disenos actuales y proporciona nuevas herramientas y metodos para el diseno, produccion y uso de formas solubles de la glicoprotema de la envoltura G del virus Hendra.
En un primer aspecto, la invencion se refiere a una protema de fusion que comprende un dominio de la protema G del virus Hendra soluble que comprende los aminoacidos del 71 al 604 de la protema G nativa del virus Hendra y un dominio de la cadena IgK que comprende la secuencia de aminoacidos de la Sec. con num. de ident.: 10.
En un segundo aspecto, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende la protema de fusion.
Ademas, en la presente descripcion se describen polinucleotidos y polipeptidos o fragmentos de estos que codifican una protema G soluble derivada del virus Hendra.
Ademas, en la presente descripcion se describen polinucleotidos o polipeptidos o fragmentos de estos que codifican una protema G soluble derivada del virus Nipah.
Ademas, en la presente descripcion se describen metodos para producir la protema G soluble derivada del virus Hendra y/o del virus Nipah.
Ademas, en la presente descripcion se describen vectores de expresion que comprenden los polinucleotidos que codifican una protema G soluble derivada del virus Hendra y/o Nipah.
Otra modalidad se refiere a una protema de fusion que comprende uno o mas polipeptidos que potencian la estabilidad del dominio de la protema G del virus Hendra, potencian la inmunogenicidad del dominio de la protema G del virus Hendra y/o ayudan en la purificacion del dominio de la protema G del virus Hendra.
Ademas, en la presente descripcion se describen anticuerpos y fragmentos de estos, tales como anticuerpos neutralizantes, espedficos para una protema G soluble derivada del virus Hendra y/o Nipah y aplicaciones de diagnostico y/o terapeuticas de tales anticuerpos.
Ademas, en la presente descripcion se describe una vacuna de subunidades que comprende la protema de fusion de la invencion.
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Ademas, en la presente descripcion se describen metodos para prevenir la infeccion con virus Hendra y/o Nipah en un sujeto o mitigar una infeccion de virus Hendra y/o Nipah en un sujeto.
Ademas, en la presente descripcion se describen estuches de diagnostico que comprenden la protema de fusion de la invencion.
Otras modalidades y ventajas de la invencion se exponen en parte en la descripcion, que sigue, y en parte, pueden ser obvias a partir de esta descripcion, o puede aprenderse de la practica de la invencion.
Descripcion de las Figuras y Tablas
La Figura 1 muestra la expresion de la glicoprotema de la envoltura G del HeV soluble. El virus Vaccinia que codifica una protema G del HeV con etiqueta myc o etiqueta S se produjo por marcado metabolico en celulas HeLa. El control es la protema G del HeV de tipo salvaje. La precipitacion espedfica de cada construccion sG se muestra por precipitacion a partir de lisados o sobrenadantes mediante el uso de MAb para myc o perlas S.
La Figura 2 muestra la inhibicion de la fusion mediada por HeV y NiV por la sG con etiqueta S. Se infectaron celulas HeLa con virus vaccinia recombinantes que codificaban las glicoprotemas G y F del HeV o F y G del NiV, junto con un vaccinia recombinante que codifica una RNA polimerasa T7 (celulas efectoras). Cada tipo de celula objetivo designada se infecto con el virus vaccinia vCB21R reportero codificante de la LacZ de E. coli. Cada tipo de celula objetivo (1 X 105) se sembro en pocillos duplicados de una placa de 96 pocillos. Se anadieron los sobrenadantes de control o de la sG con etiqueta S y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Las celulas que expresan la glicoprotema del HeV o del NiV (1 x 105) se mezclaron despues con cada tipo de celula objetivo. Despues de 2.5 h a 37 °C, se anadio Nonidet P-40 y se cuantifico la actividad p-Gal. Paneles A y B: Inhibicion de la fusion mediada por el HeV por el sobrenadante infectado por la sG con etiqueta S o el sobrenadante infectado con el WR en celulas U373 (Panel A) o celulas PCI 13 (Panel B). Paneles C y D: Inhibicion de la fusion mediada por el HeV y el NiV por la sG con etiqueta S en celulas U373 (Panel C) o celulas PCI 13 (Panel D). Paneles E y F: Inhibicion de la fusion mediada por el HeV y el NiV por la sG con etiqueta myc purificada en celulas U373 (Panel E) o celulas PCI 31 (Panel F).
La Figura 3 muestra una inmunofluorescencia indirecta de lmeas celulares permisivas y no permisivas tenidas con la glicoprotema de la envoltura G del sHeV. Las celulas se sembraron en placas de laboratorio de 8 pocillos Lab-Tek II en el medio apropiado y se incubaron durante 3 dfas. Las celulas se fijaron con acetona durante 2 minutos. Las celulas HeLa representan una lmea celular no permisiva de fusion mientras que las U373, PCI 13 y Vero representan lmeas de celulas permisivas de fusion. Las celulas se tineron con la sG con etiqueta S seguido de un antisuero de conejo espedfico antiprotema G de HeV y un conjugado Alexa Fluor 488 anticonejo de burro. Las muestras se examinaron con un microscopio Olympus con un accesorio de luz fluorescente reflejada y un filtro Olympus U-M41001. Todas las imagenes se obtuvieron con una camara digital SPOT RT CCD con un aumento original de 40 *. Panel A: sG con etiqueta S y conjugado Alexa Fluor 488 anticonejo de burro. Panel B: sG con etiqueta S, antisuero antiprotema G del HeV, y conjugado Alexa Fluor 488 anticonejo de burro.
La Figura 4 muestra la expresion de la glicoprotema de la envoltura G del NiV soluble. El virus vaccinia que codifica la protema G del HeV soluble con etiqueta S, o los vectores de expresion plasmfdicos que codifican la protema G del HeV o del NiV soluble con etiqueta S se produjeron por marcaje metabolico en celulas HeLa. La precipitacion espedfica de cada construccion sG se muestra por precipitacion a partir de lisados o sobrenadantes mediante el uso de perlas S.
La Figura 5 muestra el analisis de las estructuras oligomericas de la glicoprotema de la envoltura G del HeV soluble. Las celulas HeLa se infectaron con la protema G del sHeV (con etiqueta S) que codifica el virus vaccinia y se incubaron 16 h a 37 °C (4 pocillos de una placa de 6 pocillos). Con comienzo a las 6 h posinfeccion, las celulas se marcaron metabolicamente durante la noche con [35S]-met/cis. Los sobrenadantes se eliminaron, se clarificaron por centrifugacion, se concentraron, se intercambio la solucion amortiguadora en PBS. Una mitad (400 jl) de la protema G del sHeV se reticulo luego con DTSSP [3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato)] (4 mM/RT°/15 min) apagado con 100 mM de Tris pH 7.5. Las preparaciones reticuladas y no reticuladas se dividieron despues en dos porciones iguales y se colocaron en capas sobre gradientes de sacarosa continua (5-20 %) (4 gradientes) y se fraccionaron. Todas las fracciones se precipitaron despues con agarosa de protema S, y las muestras de sG metabolicamente marcadas se separaron mediante SDS-PAGE al 10 % en condiciones reductoras y no reductoras y se detectaron por autorradiograffa.
La Figura 6 muestra un esquema de construcciones de la glicoprotema G del Hev soluble. Enlazador de la cadena IgK (Sec. con num. de ident.: 10); enlazador de 15 aa (Sec. con num. de ident.: 11); etiqueta del peptido S (Sec. con num. de ident.: 12); etiqueta del epitopo c-myc (Sec. con num. de ident.: 13); enlazador de 15aa (Sec. con num. de ident.: 14).
La Figura 7 muestra un perfil de peso molecular de la sG del HeV. Se separo un panel de patrones de alto peso molecular en una columna de exclusion por tamano Superdex 200 y se genero una curva de calibracion. Las muestras de la sG con etiqueta S purificada y de la sG con etiqueta myc se separaron en la columna Superdex 200 calibrada y se fraccionaron. Se calcularon los valores de Kav de los picos mayores de la sG y se determinaron sus pesos moleculares aparentes mediante el uso de la curva de calibracion de los patrones de peso molecular. La figura muestra los tres picos
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principales observados con la sG con etiqueta S. Las estimaciones moleculares mostradas asociadas con cada uno de los tres picos (pico 1, 2 y 3) son los promedios de siete separaciones independientes de tres diferentes preparaciones de la sG con etiqueta S.
La Figura 8 muestra las formas oligomericas de la sG con etiqueta S. Se infectaron celulas HeLa con virus vaccinia que codifica para la sG con etiqueta S y se incubaron 16 h a 37 °C. Con inicio a las 6 h despues de la infeccion, las celulas se marcaron metabolicamente durante la noche con {35S}-metionina/cistema. Los sobrenadantes se eliminaron, se clarificaron por centrifugacion, se concentraron, se intercambio la solucion amortiguadora a PBS. Despues se reticulo una mitad (200 jl) de la sG con etiqueta S con DTSSP [3,3'-Ditiobis(sulfosuccinimidilpropionato)] (4 mM/RT°/30 min) atenuado con Tris 100 mM pH 7.5. Las preparaciones reticuladas y no reticuladas se colocaron en capas sobre gradientes continuos (5-20 %) de sacarosa (2 gradientes) y se fraccionaron. Todas las fracciones se dividieron en dos tubos (para condiciones reductoras y no reductoras), las fracciones se precipitaron despues con agarosa para protema S y las muestras de la sG marcadas metabolicamente se separaron mediante SDS-PAGE al 7.5 % en condiciones reductoras y no reductoras y se detectaron por autorradiograffa. Se indican la parte inferior y la parte superior de los gradientes. A: no reticulado y no reducido, B: no reticulado y reducido, C: reticulado y no reducido, D: reticulado y reducido.
La Figura 9 muestra la forma oligomerica de la protema G de cadena completa del HeV. Las celulas HeLa se infectaron con el virus vaccinia que codifica la protema G del HeV y se incubaron 16 h a 37 °C. Con inicio a las 6 h despues de la infeccion, las celulas se marcaron metabolicamente durante la noche con {35S}-metionina/cistema. Los sobrenadantes se eliminaron y las celulas se mantuvieron durante 2 h en medio completo, se lavaron dos veces en PBS y se recuperaron. Las celulas que expresaban la protema G del HeV no reticulada se lisaron en solucion amortiguadora que contema Triton-X, se clarificaron por centrifugacion, y se colocaron en capas sobre un gradiente continuo de sacarosa (5-20 %) y se fraccionaron. Todas las fracciones se dividieron en 2 tubos (para condiciones reductoras y no reductoras), despues las fracciones se precipitaron con antisuero anti HeV y despues se pasaron por sefarosa de protema G, y las muestras de la protema G del HeV metabolicamente marcadas se separaron por SDS-PAGE al 7.5 % bajo condiciones reductoras y no reductoras y se detectaron por autorradiograffa. Se indican la parte inferior y la parte superior de los gradientes. A: no reticulado y no reducido, B: no reticulado y reducido.
La Figura 10 muestra el ensayo de sincitios basado en inmunofluorescencia del HeV y del NiV. Las celulas Vero se sembraron en placas de 96 pocillos y se crecieron hasta una confluencia del 90 %. Las celulas se pretrataron con la sG con etiqueta S por 30 min a 37 °C antes de la infeccion con 1.5 x 103 TCID50/ml y 7.5 x 102 TCID50/ml del HeV o NiV vivos (combinados con la sG con etiqueta S). Las celulas se incubaron durante 24 horas, se fijaron en metanol y se marcaron inmunofluorescentemente por la protema P antes de la microscopfa digital. Las imagenes se obtuvieron mediante el uso de un microscopio invertido Olympus IX71 acoplado a una camara a color de alta resolucion Olympus DP70 y todas las imagenes se obtuvieron con un aumento original de 85*. Imagenes representativas de la inmunofluorescencia con FITC de los HeV y NiV marcados con anti-P. A: infecciones de control no tratadas, B: infecciones en presencia de 100 jg/ml de la sG con etiqueta S.
La Figura 11 muestra la inhibicion de la infeccion con HeV y NiV por la sG con etiqueta S. Las celulas Vero se sembraron en placas de 96 pocillos y se crecieron hasta una confluencia del 90 %. Las celulas se pretrataron con la sG con etiqueta S por 30 min a 37 °C antes de la infeccion con 1.5 x 103 TCID50/ml y 7.5 x 102 TClD50/ml de HeV o NiV vivos (combinados con la sG con etiqueta S). Las celulas se incubaron durante 24 horas, se fijaron en metanol y se marcaron inmunofluorescentemente por la protema P antes de la microscopfa digital y el analisis de imagenes para determinar el area relativa de cada sincitio. La figura muestra el area relativa sincitial (pixel2) frente a la concentracion de la sG con etiqueta S para el HeV (drculos) y el NiV (triangulos).
La Figura 12 muestra la estructura lineal de la protema sG.
La Figura 13 muestra una estructura tridimensional de la protema sG.
La Figura 14 muestra la secuencia de aminoacidos de la protema sG (Sec. con num. de ident.: 15).
La Tabla 1 muestra la neutralizacion de la infeccion por HeV y NiV. Los antisueros antiprotema G del HeV se generaron en conejos por 3 inoculaciones con la sG con etiqueta S purificada. Los sueros que se colectaron 2 semanas despues de la tercera inyeccion se analizaron en un ensayo de neutralizacion de virus contra el HeV y el NiV. Los tttulos de neutralizacion de suero se determinaron por la presencia de CPE (indicada por +) y se registraron como la dilucion de suero en la que al menos uno de los pocillos duplicados no mostraba CPE.
Descripcion de la invencion
Tecnicas generales
La practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologfa molecular (lo que incluye tecnicas recombinantes), microbiologfa, biologfa celular, bioqmmica e inmunologfa, que estan
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dentro del estado de la materia. Tales tecnicas se explican completamente en la literatura, tales como, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (Sambrook, y otros, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, y otros, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, y otros, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan y otros, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (CA. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies : a practical approach (P. Shepherd y C Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
Como se usa en la presente descripcion, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, "una" glicoprotema G incluye una o mas glicoprotemas G.
Generalmente esta descripcion proporciona formas solubles de la protema de la envoltura de la glicoprotema G del HeV. Se describen, ademas, los polinucleotidos que codifican las protemas y los metodos para usar estas protemas en el diagnostico, deteccion y tratamiento. Espedficamente esta descripcion proporciona formas solubles de las protemas de la envuelta de la glicoprotema G del HeV que retienen caractensticas de la glicoprotema G viral nativa lo que permite una rapida produccion de alto rendimiento de vacunas, diagnosticos y pruebas de seleccion.
Generalmente, las formas solubles de las glicoprotemas G del HeV y el NiV comprenden todo o parte del ectodominio (p. ej., extracelular) de la glicoprotema G de un HeV o NiV y generalmente se producen al suprimir todo o parte del dominio transmembrana de la glicoprotema G y todo o parte de la cola citoplasmatica de la glicoprotema G. A modo de ejemplo, una glicoprotema G soluble puede comprender el ectodominio completo de una glicoprotema G del HeV o el NiV. Adicionalmente a modo de ejemplo, y no como limitacion una glicoprotema G soluble puede comprender todo o parte del ectodominio y parte del dominio transmembrana de una glicoprotema G del HeV o el NiV.
Las glicoprotemas G del HeV solubles descritas en la presente descripcion generalmente conservan una o mas caractensticas de la glicoprotema viral nativa correspondiente, tales como, capacidad para interaccionar o unirse al receptor de la celula huesped viral, pueden producirse en forma o formas oligomericas, o la capacidad de inducir anticuerpos (lo que incluye, pero no se limita a, anticuerpos neutralizantes virales) capaces de reconocer la glicoprotema G nativa. Ejemplos de caractensticas adicionales incluyen, pero no se limitan a, la capacidad de bloquear o prevenir la infeccion de una celula huesped. Puede utilizarse una metodologfa convencional para evaluar las glicoprotemas G del HeV o del NiV solubles en cuanto a una o mas de las caractensticas. Ejemplos de metodologfas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, los ensayos que se describen en la presente descripcion en los Ejemplos.
Polinucleotidos
El termino polinucleotido se usa ampliamente y se refiere a nucleotidos polimericos de cualquier longitud (p. ej., oligonucleotidos, genes, RNA inhibidores pequenos, fragmentos de polinucleotidos que codifican una protema etc.). A modo de ejemplo, los polinucleotidos de la invencion pueden comprender todo o parte del ectodominio o todo o parte del ectodominio y parte del dominio transmembrana. El polinucleotido de la invencion puede ser, por ejemplo, lineal, circular, superenrollado, monocatenario, bicatenario, ramificado, parcialmente bicatenario o monocatenario. Los nucleotidos que comprenden el polinucleotido pueden ser nucleotidos de origen natural o nucleotidos modificados. Generalmente los polinucleotidos de la invencion codifican para todo o parte del ectodominio (p. ej., extracelular) de la glicoprotema G de un HeV.
Ejemplos no limitantes de secuencias que pueden usarse para construir una glicoprotema G del HeV soluble pueden encontrarse en Wang, L.F. y otros, J. Virol. 74 (21), 9972-9979 (2000) y Yu, M. y otros, Virology 251 (2), 227-233 (1998). Ejemplos no limitantes de secuencias que pueden usarse para construir una glicoprotema G del NiV soluble pueden encontrarse en Harcourt, BH y otros, Virology 271: 334-349, 2000 y Chua, K.B. y otros, Science 288 (5470), 1432-1. Generalmente, las secuencias de la glicoprotema G de cualquier aislamiento o cepa de virus Hendra y virus Nipah puede utilizarse para derivar los polinucleotidos y polipeptidos que se describen en la presente descripcion.
A modo de ejemplo, y no como limitacion, un polinucleotido que codifica una glicoprotema G del HeV soluble puede comprender una secuencia polinucleotfdica que codifica aproximadamente de los aminoacidos 71 al 604 de la secuencia de aminoacidos de una Glycoprotema G del HeV en Wang, LF y otros, J. Virol. 74 (21), 9972-9979 (2000) (ver, ademas, p. ej., Yu, M. y otros, Virology 251 (2), 227-233 (1998)). Adicionalmente a modo de ejemplo, y no como limitacion, un polinucleotido que codifica una glicoprotema G del HeV soluble puede comprender los nucleotidos del 9048 a 10727 de la secuencia polinucleotfdica de una glicoprotema G del HeV en Wang, L.F. y otros, J. Virol. 74 (21), 9972-9979 (2000) (ver, ademas, p. ej., Yu, M. y otros, Virology 251 (2), 227-233 (1998)).
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A modo de ejemplo, y no como limitacion, un polinucleotido que codifica una glicoprotema G del NiV soluble puede comprender una secuencia polinucleotidica que codifica aproximadamente los aminoacidos del 71 al 602 de la secuencia de aminoacidos de una Glicoprotema G del NiV en Harcourt, BH y otros, Virology 271: 334-349, 2000 (ver, ademas, Chua, K. B. y otros, Science 288 (5470), 1432-1). Adicionalmente a modo de ejemplo, y no como limitacion, un polinucleotido que codifica una glicoprotema G del NiV soluble puede comprender los nucleotidos del 9026 al 10696 de la secuencia polinucleotfdica de una glicoprotema G del HeV en Harcourt, BH y otros, Virology 271: 334-349, 2000 (ver, ademas, Chua, K. B. y otros, Science 288 (5470), 1432-1).
A modo de ejemplo y no como limitacion los polinucleotidos funcionalmente equivalentes codifican una glicoprotema G soluble de un HeV o NiV y poseen una o mas de las siguientes caractensticas: capacidad de interaccionar o unirse al receptor de la celula huesped viral, pueden producirse en forma o formas oligomericas, la capacidad de provocar anticuerpos (lo que incluye, pero no se limita a, anticuerpos neutralizantes virales) capaces de reconocer la glicoprotema G nativa y/o la capacidad de bloquear o prevenir la infeccion de una celula huesped.
Las secuencias de polinucleotidos que son funcionalmente equivalentes pueden identificarse, ademas, por metodos que se conocen en la tecnica. Una variedad de programas de softwares de alineacion de secuencias estan disponibles en la tecnica para facilitar la determinacion de homologfa o equivalencia. Ejemplos no limitantes de estos programas son los programas de familia BLAST que incluyen BLASTN, BlAsTP, BLASTX, TbLASTN y TBLASTX (BLAST esta disponible en la web mundial en ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), FastA, Compare, DotPlot, BestFit, GAP, FrameAlign, ClustalWy PileUp. Estos programas se obtienen comercialmente disponibles en un paquete completo de software de analisis de secuencias como GCG Inc.'s Wisconsin Package. Otros programas de analisis y alineacion similares pueden adquirirse de diversos proveedores tales como el MegAlign de DNA Star, o los programas de alineacion en GeneJockey. Alternativamente, puede accederse a los programas de analisis de secuencias y de alineacion a traves de la world wide web en sitios tales como el CMS Molecular Biology Resource en sdsc.edu/ResTools/cmshp.html. Puede utilizarse cualquier bases de datos de secuencias que contenga secuencias de ADN o de protema correspondientes a un gen o un segmento de este para el analisis de secuencia. Las bases de datos comunmente empleadas incluyen, pero no se limitan a, GenBank, EMBL, DDBJ, PDB, SWISS-PROT, EST, STS, GSS, y HTGS.
Los parametros para determinar el grado de homologfa establecidos para uno o mas de los programas de alineacion antes mencionados se conocen bien en la tecnica. Estos incluyen pero no se limitan al valor de p, porcentaje de identidad de secuencia y el porcentaje de similitud de secuencia. El valor de P es la probabilidad de que la alineacion se produzca por casualidad. Para una unica alineacion, el valor de p puede calcularse de acuerdo con Karlin y otros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 2246. Para las alineaciones multiples, el valor de p puede calcularse mediante el uso de un enfoque heunstico tal como el programado en el BLAST. El porcentaje de identificacion de secuencia se define por la relacion del numero de nucleotidos o aminoacidos coincidentes entre la secuencia de consulta y la secuencia conocida cuando las dos se alinean optimamente. El porcentaje de similitud de secuencia se calcula de la misma manera que el porcentaje de identidad excepto porque puntuan como positivos al calcular el porcentaje de similitud aminoacidos que son diferentes pero similares. Asf, los cambios conservadores que se producen frecuentemente sin alterar la funcion, tales como un cambio de un aminoacido basico a otro similar o un cambio de un aminoacido hidrofobico a otro similar se puntuan como si fueran identicos.
Polipeptidos
Otro aspecto se refiere a polipeptidos de la glicoprotema G soluble del HeV. El termino polipeptido se usa ampliamente en la presente descripcion para incluir un peptido o protema o fragmentos de estos. A modo de ejemplo, y no como limitacion, una glicoprotema G del HeV soluble puede comprender los aminoacidos del 71 al 604 de la secuencia de aminoacidos para una glicoprotema G del HeV en Wang, L.F. y otros, J. Virol. 74 (21), 9972-9979 (2000) (ver, ademas, p. ej., Yu, M. y otros, Virology 251 (2), 227-233 (1998)). Adicionalmente a modo de ejemplo y no como limitacion, una glicoprotema G del NiV soluble puede comprender los aminoacidos del 71 al 602 de la secuencia de aminoacidos de una glicoprotema G del NiV en Harcourt, BH y otros, Virology 271: 334-349, 2000 (ver, ademas, Chua, K. B. y otros, Science 288 (5470), 1432-1).
A modo de ejemplo y no como limitacion los polipeptidos funcionalmente equivalentes poseen una o mas de las siguientes caractensticas: capacidad para interaccionar o unirse al receptor de la celula huesped viral, puede producirse en forma o formas oligomericas, la capacidad para inducir anticuerpos (lo que incluye, pero no se limita a, anticuerpos neutralizantes virales) capaces de reconocer la Glicoprotema G nativa y/o la capacidad de bloquear o prevenir la infeccion de una celula huesped.
Se pretende abarcar, ademas, los peptidomimeticos, que incluyen peptidos modificados qmmicamente, moleculas similares a peptidos que contienen aminoacidos que son de origen natural, peptidos y lo similar, y conservan las caractensticas de los polipeptidos de la glicoprotema G soluble que se proporcionan en la presente descripcion. ("Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" 5ta ed., vols. 1 al 3 (ed. M. E. Wolff; Wiley Interscience 1995).
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En la presente descripcion se describen, ademas, polipeptidos o analogos de estos que tienen sustancialmente la misma funcion que los polipeptidos de esta invencion. Tales polipeptidos incluyen, pero no se limitan a, un mutante por sustitucion, adicion o delecion del polipeptido. Esta descripcion abarca, ademas, protemas o peptidos que son sustancialmente homologos a los polipeptidos. En la tecnica se dispone de una variedad de programas de software de alineacion de secuencias que se describen en la presente descripcion anteriormente para facilitar la determinacion de homologfa o equivalencia de cualquier protema a una protema de la invencion.
El termino "analogo" incluye cualquier polipeptido que tiene una secuencia de residuos de aminoacidos sustancialmente identica a un polipeptido de la invencion en la que uno o mas residuos se sustituyen conservativamente con un residuo funcionalmente similar y que muestra los aspectos funcionales de los polipeptidos como se describen en la presente descripcion. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitucion de un residuo no polar (hidrofobico) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro similar, la sustitucion de un residuo polar (hidrofflico) por otro similar tal como de entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitucion de un residuo basico tal como lisina, arginina o histidina por otro similar, o la sustitucion de un residuo acido, tal como acido aspartico o acido glutamico u otro.
La frase "sustitucion conservativa" incluye, ademas, el uso de un residuo qmmicamente derivatizado en lugar de un residuo no derivatizado. "Derivado qmmico" se refiere a un polipeptido sujeto que tiene uno o mas residuos qmmicamente derivatizados por reaccion de un grupo lateral funcional. Ejemplos de tales moleculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, aquellas moleculas en las que los grupos amino libres se derivatizaron para formar hidrocloruros de amina, grupos p-toluensulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, esteres de metilo y etilo u otros tipos de esteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El nitrogeno imidazolico de la histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencil-histidina. Se incluyen como derivados qmmicos, ademas, aquellas protemas o peptidos que contienen uno o mas derivados de aminoacidos de origen natural de los veinte aminoacidos estandar. Por ejemplo: 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; La homoserina puede sustituirse por serina; Y la ornitina puede sustituir a la lisina. Los polipeptidos de la presente invencion tambien incluyen cualquier polipeptido que tenga una o mas adiciones y/o supresiones o residuos con relacion a la secuencia de uno cualquiera de los polipeptidos cuyas secuencias se describen en la presente descripcion.
Se dice que dos secuencias de polinucleotidos o polipeptidos son "identicas" si la secuencia de nucleotidos o aminoacidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para obtener la correspondencia maxima como se describe a continuacion. Las comparaciones entre dos secuencias se realiza tfpicamente mediante al comparar las secuencias mediante una ventana de comparacion para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparacion", como se usa en la presente descripcion, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, usualmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de que las dos secuencias se alinean optimamente.
La alineacion optima de las secuencias para la comparacion puede realizarse mediante el uso del programa Megalign en el conjunto de Lasergene de softwares de bioinformatica (DNASTAR, Inc., Madison, WI), mediante el uso de los parametros que se establecen por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineacion descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, pag. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pag. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
Preferentemente, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina mediante la comparacion de dos secuencias alineadas optimamente sobre una ventana de comparacion de al menos 20 posiciones, en donde la porcion de la secuencia polipeptfdica en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) del 20 por ciento o menos, usualmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparacion con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o supresiones) para la alineacion optima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinacion del numero de posiciones en las que se observa un residuo de aminoacido r identico en ambas secuencias para dar el numero de posiciones coincidentes, mediante la division del numero de posiciones coincidentes por el numero total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamano de ventana) y la multiplicacion de los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
Vectores de Expresion
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En la presente descripcion se describen, ademas, vectores que comprenden al menos un polinucleotido que codifica una protema de la glicoprotema G soluble descrita en la presente descripcion. Los vectores de expresion se conocen bien en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a vectores o plasmidos virales. Los vectores basados en virus para la entrega de un polinucleotido deseado y la expresion en una celula deseada se conocen bien en la tecnica. Vehmulos basados en virus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, retrovirus recombinantes (ver, p. ej., las Publicaciones del PCT num. WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes de los EE.UU. nums. 5,219,740 and 4,777,127), vectores basados en alfavirus (p. ej., vectores del virus de Sindbis, virus del bosque Semliki), virus del Rm Ross, vectores de virus adenoasociados (AAV) (ver, p. ej., las Publicaciones del PCT nums. PCT Publication Nos. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655), virus vaccinia (p. ej., virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) o viruela aviar), sistema recombinante de Baculovirus y virus del herpes.
Los vectores no virales, tales como los plasmidos, se conocen bien tambien en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, plasmidos basados en levaduras y bacterias.
Los metodos para introducir los vectores en una celula huesped y aislar y purificar la protema expresada se conocen bien en la tecnica tambien (p. ej., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (Sambrook, y otros, 1989) Cold Spring Harbor Press). Ejemplos de celulas huesped incluyen, pero no se limitan a, celulas de mairnfero, tales como celulas HeLa y CHO.
A modo de ejemplo el vector que comprende el polinucleotido que codifica la protema G soluble puede comprender ademas una secuencia de polinucleotido de la etiqueta para facilitar el aislamiento y/o la purificacion. Ejemplos de etiquetas incluyen pero no se limitan al, epitopo myc, etiqueta S, etiqueta his, epitopo de HSV, epitopo V5, FLAG y CBP. Dichas etiquetas estan comercialmente disponibles o se preparan facilmente por metodos que se conocen en la tecnica.
El vector puede comprender ademas una secuencia polinucleotidica que codifica una secuencia enlazadora. Generalmente la secuencia de enlace se situa en el vector entre la secuencia polinucleotidica de la protema G soluble y la secuencia polinucleotidica de la etiqueta. Las secuencias de enlace pueden codificar aminoacidos aleatorios o pueden contener sitios funcionales. Ejemplos de secuencias enlazadoras que contienen sitios funcionales incluyen pero no se limitan a, secuencias que contienen el sitio de escision de la trombina o el sitio de escision de la enterocinasa.
A modo de ejemplo, y no como limitacion, puede generarse una glicoprotema G soluble como se describe en la presente descripcion mediante el uso de virus vaccinia recombinantes en un sistema de cultivo de celulas de marnffero. Ejemplos de cebadores que pueden usarse para amplificar la secuencia de ectodominio deseada a partir de un molde de cDNA del virus Hendra o del virus Nipah, incluyen, pero no se limitan a, los cebadores de los Ejemplos.
Anticuerpos
En la presente descripcion se describen, ademas, ejemplos de anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos espedficos para la glicoprotema G del HeV, anticuerpos espedficos para la glicoprotema G del NiV, anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con la glicoprotema G del HeV y la glicoprotema G del NiV y anticuerpos neutralizantes. A modo de ejemplo una caractenstica de un anticuerpo neutralizante incluye, pero no se limita a, la capacidad de bloquear o prevenir la infeccion de una celula huesped. Los anticuerpos que se describen en la presente descripcion pueden caracterizarse mediante el uso de metodos que se conocen bien en la tecnica.
Los anticuerpos utiles en la presente descripcion pueden abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (p. ej., Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticuerpos quimericos, anticuerpos biespedficos, anticuerpos heteroconjugados, de simple cadena (ScFv), mutantes de estos, protemas de fusion que comprenden una porcion de anticuerpo, anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuracion modificada de la molecula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento del antfgeno de la especificidad requerida, lo que incluye variantes de glicosilacion de los anticuerpos, variantes de secuencia de aminoacidos de los anticuerpos, y anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos preferidos se derivan de ongenes murino, de rata, humano, de primate, o cualquier otro origen (lo que incluye anticuerpos quimericos o humanizados).
Los metodos para preparar anticuerpos monoclonales y policlonales se conocen bien en la tecnica. Los anticuerpos policlonales pueden inducirse en un mamffero, por ejemplo, mediante una o mas inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea un adyuvante. Ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, la lapa de ojo de cerradura, hemocinina, albumina de suero, tromboglubina bovina, inhibidor de la tripsina de soja, adyuvante de Freund completo y adyuvante MPL-TDM. El protocolo de inmunizacion puede determinarse por un experto en la tecnica.
Los anticuerpos pueden alternativamente ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse al usar metodos de hibridoma(ver, p. ej., Kohler, B. y Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 o segun se modifico por Buck, D. W., y otros, In Vitro, 18:377-381 (1982).
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Si se desea, el anticuerpo de interes puede secuenciarse y la secuencia polinucleotidica puede clonarse despues en un vector para su expresion o propagacion. La secuencia que codifica el anticuerpo de interes puede mantenerse en el vector en una celula huesped y la celula huesped puede expandirse y congelarse despues para uso futuro. En una alternativa, la secuencia polinucleotfdica puede usarse por manipulacion genetica para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad, u otras caractensticas del anticuerpo (p. ej., manipular geneticamente la secuencia de anticuerpos para obtener mayor afinidad por la glicoprotema G y/o mayor eficacia en la inhibicion de la fusion del virus Hendra o Nipah al receptor de la celula huesped).
Los anticuerpos tambien pueden humanizarse por metodos conocidos en la tecnica.( Ver, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. nums. 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; y 6,180,370). Aun en otra alternativa, pueden obtenerse anticuerpos completamente humanos mediante el uso de ratones comercialmente disponibles que se modificaron geneticamente para expresar protemas de inmunoglobulinas humanas espedficas.
En otra alternativa, los anticuerpos pueden fabricarse de forma recombinante y expresarse mediante el uso de cualquier metodo que se conozca en la tecnica. A modo de ejemplo, los anticuerpos pueden fabricarse de forma recombinante mediante la tecnologfa de presentacion en fagos. Ver, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. Nums. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; y 6,265,150; y Winter y otros, Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Alternativamente, la tecnologfa de presentacion en fagos (McCafferty y otros, Nature 348: 552-553 (1990)) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro. La presentacion en fagos puede realizarse en una variedad de formatos; para una revision ver, p. ej., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). A modo de ejemplo, puede usarse una glicoprotema G soluble como se describe en la presente descripcion como antfgeno con el proposito de aislar anticuerpos recombinantes mediante estas tecnicas.
Los anticuerpos pueden hacerse recombinantemente mediante el aislamiento primero de los anticuerpos y de las celulas productoras de anticuerpos de los animales huesped, la obtencion de la secuencia genica y el uso de la secuencia genica para expresar el anticuerpo recombinantemente en celulas huesped (por ejemplo, celulas CHO). Otro metodo que puede emplearse es expresar la secuencia del anticuerpo en plantas (p. ej., tabaco) o leche transgenica. Se describieron metodos para expresar anticuerpos recombinantemente en plantas o leche. Ver, por ejemplo, Peeters, y otros Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. y D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65 (1995); y Pollock, y otros, J Immunol Methods 231:147(1999). En la tecnica se conocen metodos para fabricar derivados de anticuerpos, p. ej., humanizados, de cadena sencilla, etc.
Los anticuerpos que se describen en la presente descripcion pueden unirse a un vehmulo por metodos convencionales, para usarse en, por ejemplo, aislar o purificar glicoprotemas G del Hendra o el Nipah o detectar glicoprotemas G del Hendra o el Nipah en una muestra o especimen biologico. Alternativamente, a modo de ejemplo, los anticuerpos neutralizantes que se describen en la presente descripcion pueden administrarse como inmunoterapia pasiva a un sujeto infectado con o sospechosos de infectarse con virus Hendra o Nipah. Un "sujeto", incluye pero no se limita a humanos, simios, animales de granja, animales de deporte y mascotas. Los usos veterinarios tambien se abarcan por la descripcion.
Diagnosticos
Las glicoprotemas G solubles de la invencion pueden usarse en una variedad de inmunoensayos para los virus Hendra y Nipah. Las glicoprotemas G solubles recombinantes expresadas de la invencion pueden producirse con un control de alta calidad y son adecuadas como antfgenos con el proposito de detectar anticuerpos en muestras biologicas. A modo de ejemplo, y no como limitacion, una glicoprotema G soluble del HeV o del NiV o combinaciones de estas podnan usarse como antfgenos en un ensayo ELISA para detectar anticuerpos en una muestra biologica de un sujeto.
Vacunas
Esta descripcion se refiere, ademas, a vacunas para los virus Hendra y Nipah. En un aspecto las vacunas son vacunas basadas en ADN. Un experto en la tecnica esta familiarizado con la administracion de vectores de expresion para obtener la expresion de una protema exogena in vivo. Ver, p. ej., las patentes de los EE.UU. nums. 6,436,908; 6,413,942; y 6,376,471. Los vectores basados en virus para la entrega de un polinucleotido deseado y la expresion en una celula deseada se conocen bien en la tecnica y se describen ejemplos no limitantes en la presente descripcion. En otro aspecto, las vacunas se basan en protemas y comprenden uno o mas fragmentos de la protema G del virus Hendra o Nipah. Los fragmentos preferidos son el ectodominio, y porciones funcionales de este, y ademas, porciones que son espedficamente reactivas a anticuerpos neutralizantes. Las porciones que son reactivas de esta manera se representan en la Figura 14. Las vacunas pueden ser, ademas, vacunas basadas en anticuerpos para un tratamiento mas inmediato asf como para la profilaxis contra la infeccion.
La administracion de vectores de expresion incluye la administracion local o sistemica, lo que incluye la inyeccion, administracion oral, pistola de partmulas o administracion cateterizada, y administracion topica. Puede usarse, ademas, la entrega dirigida de composiciones terapeuticas que contienen un vector de expresion, o polinucleotidos
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subgenomicos. Las tecnicas de entrega de DNA mediadas por un receptor se describen en, por ejemplo, Findeis y otros, Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou y otros, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu y otros, J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu y otros, J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu y otros, J. Biol. Chem. (1991) 266:338.
Pueden emplearse, ademas, vehmulos y metodos de entrega no virales, lo que incluye, pero no se limita a, el ADN condensado policationico enlazado o no enlazado a un adenovirus muerto solo (ver, p. ej., Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147); DNA enlazado a un ligando (ver, p. ej., Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985); celulas de vehmulos de entrega de celulas eucariotas (ver, p. ej., la patente de los EE.UU. 5,814,482, las Publicaciones del PCT nums. WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; y WO 97/42338) y la fusion o neutralizacion de carga nucleica con las membranas celulares. Puede emplearse, ademas, ADN desnudo. Los metodos ilustrativos de introduccion de DNA desnudo se describen en la Publicacion del PCT Num. WO 90/11092 y en la Patente de los EE.UU. num 5,580,859. Los liposomas que pueden actuar como vehmulos de entrega de genes se describen en la Patente de los EE.UU. num. 5,422,120; las Publicaciones del PCT nums. WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; y EP 0524968. Se describen enfoques adicionales en Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411, y en Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581.
Para la administracion humana, los codones que comprenden el polinucleotido que codifica una glicoprotema G soluble pueden optimizarse para uso humano.
En otra que se describe en la presente descripcion se usa una glicoprotema G del HeV soluble como una vacuna de subunidades. La glicoprotema G soluble del HeV puede administrarse por sf misma o en combinacion con un adyuvante. Ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, saponina, QuilA y derivados, iscoms, liposomas, citocinas lo que incluye interferon gamma o interleucina 12, DNA, microencapsulacion en una partmula solida o semisolida, adyuvante completo e incompleto de Freund o ingredientes activos de este, lo que incluye muramil dipeptido y analogos, DEAE dextrano/aceite mineral, Alhidrogel, adyuvante Auspharm, y Algammulina.
La vacuna de subunidades que comprende la glicoprotema G del HeV soluble puede administrarse oralmente, intravenosamente, subcutaneamente, intraarterialmente, intramuscularmente, intracardialmente, intraespinalmente, intratoracicamente, intraperitonealmente, intraventricularmente, sublingualmente y/o transdermicamente.
La dosificacion y el esquema de administracion pueden determinarse por metodos que se conocen en la tecnica. La eficacia de la glicoprotema G soluble del HeV o el NiV o combinaciones de estas como una vacuna para los virus Hendra, Nipah o Henipavirus relacionados puede evaluarse, ademas, por metodos que se conocen en latecnica.
Composiciones farmaceuticas
Los polinucleotidos, polipeptidos y anticuerpos pueden comprender ademas estabilizadores, excipientes o vehmulos farmaceuticamente aceptables que se conocen en la tecnica (Remington: The Science and practice of Pharmacy, 20va Ed. (2000) Lippincott Williams y Wilkins, Ed. KE Hoover.), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehmulos, excipientes o estabilizadores aceptables no son toxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones, y pueden comprender soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato, y otros acidos organicos; antioxidantes lo que incluye acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butflico o bendlico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); protemas, tales como albumina serica, gelatina, o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofflios tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros carbohidratoslo que incluye glucosa, manosa o dextranos; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; complejos de protema-Zn formadores de sales); y/o surfactantes no ionicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Algunos excipientes farmaceuticamente aceptables se describen adicionalmente en la presente descripcion.
Las composiciones que se usan en los metodos descritos en la presente descripcion generalmente comprenden, a modo de ejemplo y no como limitacion, la cantidad eficaz de un polinucleotido o polipeptido (p. ej., una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune) de la invencion o anticuerpo de la invencion (p. ej., una cantidad de un anticuerpo neutralizante suficiente para mitigar la infeccion, aliviar un smtoma de infeccion y/o prevenir la infeccion).
La composicion farmaceutica de la presente invencion puede comprender ademas agentes adicionales que sirven para mejorar y/o complementar el efecto deseado. A modo de ejemplo, para potenciar la inmunogenicidad de un polipeptido G soluble de la invencion que se administra como una vacuna de subunidad, la composicion farmaceutica puede comprender ademas un adyuvante. En la presente descripcion se proporcionan ejemplos de adyuvantes.
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Tambien a modo de ejemplo, y no como limitacion, si se administra un polipeptido de protema G soluble descrito en la presente descripcion para aumentar la respuesta inmune en un sujeto infectado o sospechoso de infectarse con Hendra o Nipah y/o si se administran los anticuerpos descritos en la presente descripcion como una forma de inmunoterapia pasiva la composicion puede comprender, ademas, por ejemplo, otros agentes terapeuticos (p. ej., agentes antivirales)
Estuches de diagnostico
En la presente descripcion se describen estuches de diagnostico para uso en los metodos de la presente invencion. Los estuches pueden incluir uno o mas recipientes que comprenden una protema de fusion de la invencion e instrucciones para el uso de conformidad con cualquiera de los metodos descritos en la presente descripcion.
Generalmente, estas instrucciones comprenden una descripcion de la administracion o instrucciones para la realizacion de un ensayo. Los envases pueden ser dosis unitarias, envases a granel (p. ej., envases multidosis) o dosis de subunidades. Las instrucciones suministradas en los estuches son tfpicamente instrucciones escritas en una etiqueta o inserto del envase (p. ej., una hoja de papel incluida en el estuche), pero son aceptables, ademas, las instrucciones legibles por maquina (p. ej., instrucciones en un disco de almacenamiento optico o magnetico).
Los estuches descritos en la presente descripcion se encuentran en un envase adecuado. Los envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales, botellas, tarros, envases flexibles (p. ej., bolsas de Mylar o plastico selladas), y lo similar. Se contemplan, ademas, paquetes para su uso en combinacion con un dispositivo espedfico, tal como un inhalador, un dispositivo de administracion nasal (p. ej., un atomizador) o un dispositivo de infusion tal como una minibomba. El estuche puede tener un puerto de acceso (por ejemplo, el recipiente puede ser un vial o una bolsa de la solucion intravenosa que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica). El recipiente puede contener, ademas, un puerto de acceso (por ejemplo, el recipiente puede ser un vial o bolsa de la solucion intravenosa que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica). Los estuches pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como soluciones amortiguadoras e informacion interpretativa. Normalmente, el estuche comprende un recipiente y una etiqueta o inserto(s) del recipiente en o asociado con el recipiente.
Los siguientes ejemplos ilustran solo ciertas y no todas las modlidades de la invencion, y asf, no deben considerarse limitantes del alcance de la invencion.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Construcciones del vector

Los vectores se construyeron para expresar las protemas G del HeV o del NiV con la cola de
transmembrana/citoplasmica eliminada. Los cDNAs clonados de la protema G del HeV o del NiV de longitud completa se amplificaron mediante PCR para generar fragmentos de aproximadamente 2600 pb que codificaban la protema G del HeV con el dominio transmembrana/cola citoplasmica eliminada.

Se sintetizaron los siguientes cebadores de oligonucleotidos para la amplificacion de la protema G del HeV. sHGS: 5'- GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3' (Sec. con num. de ident.: 1). sHGAS: 5'-
GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTG GGCAGGTATC-3'. (Sec. con num. de ident.: 2)

Los siguientes oligonucleotidos cebadores se sintetizaron para la amplificacion de la protema G del NiV. sNGS: 5'- CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3' (Sec. con num. de ident.: 3). sNGAS: 5'-
CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATT GCTCTGGTATC-3'. (Sec. con num. de ident.: 4)
Todas las reacciones de PCR se realizaron mediante el uso de la DNA polimerasa Accupol (PGS Scientifics Corp., Gaithersburg, MD) con las siguientes configuraciones: 94 °C por 5 minutos inicialmente y despues 94 °C por 1 minuto, 56 °C por 2 minutos, 72 °C por 4 minutos; 25 ciclos. Estos cebadores generaron un producto de PCR para el ORF de la protema G del sHeV flanqueado por los sitios Sal 1 y la protema el ORF de la protema G del sNiV flanqueada por sitios Xho 1. Los productos de PCR se purificaron en gel (Qiagen, Valencia, CA). Despues de la purificacion en gel, las protemas G del sHeV y del sNiV se subclonaron en un vector TOPO (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).
Se adquirio el PSectag2B (Invitrogen Corp.) y se modifico para contener una etiqueta del peptido S o una etiqueta del epitopo myc. Se sintetizaron oligonucleotidos solapados que codificaban la secuencia para el peptido S y los extremos salientes digeridos por EcoRI y Kpn 1. SPEPS: 5'-CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATT CT-3' (Sec. con num. de ident.: 5) SPEPAS: 5'AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTT
AGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3'. (Sec. con num. de ident.: 6)
Se sintetizaron los oligonucleotidos solapantes que codificaban la secuencia para la etiqueta del epitopo myc y los extremos salientes digeridos por Kpn1 y EcoRI.
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MTS: 5'-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3' (Sec. con num. de ident.: 7). MTAS 5'-
AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3'. (Sec. con num. de ident.: 8)
Se mezclaron 64 pmol de SPEPS y 64 pmol de SPEPAS y se calentaron a 65 °C por 5 minutos y se enfriaron lentamente hasta 50 °C. Se mezclaron 64 pmol de MTS y 64 pmol de MTAS y se calentaron a 65 °C por 5 minutos y se enfriaron lentamente hasta 50 °C. Las dos mezclas se diluyeron y se clonaron en el pSecTag2B digerido con Kpn1- EcoRI para generar un pSecTag2B modificado con el peptido S o un pSecTag2B modificado con el epitopo myc. Todas las construcciones se seleccionaron inicialmente por digestion de restriccion y se verificaron adicionalmente por secuenciacion.
La construccion TOPO sG se digirio con Sal 1 purificada en gel (Qiagen) y se subclono en marco en el sitio Xho 1 del pSecTag2B modificado con el peptido S o del pSecTag2B modificado con el epitopo myc. Todas las construcciones se seleccionaron inicialmente por digestion de restriccion y se verificaron adicionalmente por secuenciacion.
Las construcciones IgK lfder-peptido-S-s HeVG (sG con etiqueta S) y IgK lfder-etiqueta myc-sHeVG (sG con etiqueta myc) se subclonaron en el vector lanzadera vaccinia pMCO2 [Carroll, 1995]. SEC. de oligonucleotidos: 5'- TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3' (Sec. con num. de ident.: 9) se sintetizo y se uso en combinacion con el oligonucleotido sHGAS para amplificar por PCR la sG con etiqueta S y la sG con etiqueta myc. Todas las reacciones de PCR se realizaron mediante el uso de la ADN polimerasa Accupol (PGS Scientifics Corp.) con las siguientes configuraciones: 94 °C por 5 minutos inicialmente y despues 94 °C por 1 minuto, 56 °C por 2 minutos, 72 °C por 4 minutos; 25 ciclos. Estos cebadores generaron productos de PCR flanqueados por sitios Sal 1. Los productos de PCR se purificaron en gel (Qiagen). Despues de la purificacion en gel, se subclonaron la sG con etiqueta S y la sG con etiqueta myc en un vector TOPO (Invitrogen Corp.). La sG con etiqueta S y la sG con etiqueta myc se digirieron con Sal 1 y subclonaron en el sitio Sal 1 del pMCO2. Todas las construcciones se seleccionaron inicialmente por digestion de restriccion y se verificaron adicionalmente por secuenciacion. Las estructuras polipeptfdicas de la sG con etiqueta S del HeV y de la sG con etiqueta myc del HeV se representan en un dibujo representativo en la Figura 6.
Ejemplo 2: Produccion de las protemas de la protema G soluble
Para la produccion de protemas las construcciones geneticas se usaron para generar vectores de poxvirus recombinantes (virus vaccinia, cepa WR). El poxvirus recombinante se obtuvo despues mediante el uso de tecnicas estandar que empleaban la seleccion tk y la tincion GUS (6). Brevemente, las celulas CV-1 se transfectaron con la fusion pMCO2 sHeV G o la fusion pMCO2 sNiV G mediante el uso de un estuche de transfeccion de fosfato de calcio (Promega, Corp., Madison, WI). Estas monocapas se infectaron despues con la cepa tipo salvaje Western Reserve (WR) del virus vaccinia a una multiplicidad de infeccion (MOI) de 0.05 PFU/celula. Despues de 2 dfas los precipitados de celulas se recolectaron como reservas de virus recombinantes crudas. Se infectaron celulas TK con las existencias crudas recombinantes en presencia de 25 pg/ml de 5-Bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (Calbiochem, La Jolla, CA). Despues de 2 horas el virus se reemplazo con una capa de EMEM-10 que contema 1 % de agarosa de bajo punto de fusion (LMP)(Life Technologies, Gaithersburg, MD) y 25pg/ml de BrdU. Despues de 2 dfas de incubacion, se anadio una capa adicional de EMEM-10 que contema 1 % de agarosa LMP, 25 pg/ml de BrdU y 0.2 mg/ml de acido 5-bromo-4- cloro-3-indolil-p-D-glucuronico (X-GLUC ) (Clontech, Palo Alto, CA). En 24-48 horas las placas azules fueron evidentes, se seleccionaron y se sometieron a dos rondas mas de doble seleccion de la placa de purificacion. Los virus vaccinia recombinantes vKB16 (fusion de protema G del sHeV) y vKB22 (fusion de protema G del sNiV) se amplificaron despues y se purificaron por metodos estandar. Brevemente, los virus vaccinia recombinantes se purifican mediante la purificacion de placas, amplificacion en cultivos celulares, sedimentacion con cojm de sacarosa en una ultracentnfuga y titulacion mediante ensayo en placa. La expresion de la protema G del sHeV se verifico en lisados celulares y sobrenadantes de cultivo (Figura 1).
Como se muestra en la Figura 1, el virus vaccinia que codifica una protema G del HeV soluble con etiqueta S o etiqueta myc se produjo por marcaje metabolico en celulas HeLa. El control es la protema G del HeV de tipo salvaje. La precipitacion espedfica de cada construccion sG se muestra por precipitacion a partir de lisados o sobrenadantes mediante el uso de MAb para myc o perlas S.
Ejemplo 3: Propiedades de la protema G soluble
Para demostrar que la protema G expresada recombinante, soluble, purificada (sHeV G) conservaba las propiedades deseables (p. ej., caractensticas estructurales nativas tales como la competencia de union al receptor), se demostro que la preincubacion de celulas objetivo con la protema G del sHeV purificada por afinidad resulta en una inhibicion dependiente de la dosis de la fusion mediada por virus en varias lmeas celulares diferentes que son susceptibles a la infeccion y fusion mediada por el virus (Figura 2).
Para la purificacion de las glicoprotemas G solubles, se infectaron celulas HeLa con vKB15 o vKB16 (moi=3) por 2 horas. Despues de la infeccion el virus se elimino y se anadio medio OptiMem libre de suero (Invitrogen, Corp.). Despues de 36 horas, los sobrenadantes se eliminaron y se clarificaron por centrifugacion. Se vertio en una columna de protema S 15 ml de agarosa de protema S (Novagen) en una columna XK26 (Amersham Pharmacia Biotech,
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Piscataway, NJ). La columna de protema S se lavo con 10 volumenes de lecho de PBS. El sobrenadante de las celulas infectadas con vKB16 se paso por la columna de agarosa de protema S, la columna se lavo con 10 volumenes de lecho de PBS, y se eluyo la protema sG con etiqueta S con 1 volumen de lecho de citrato 0.2 M pH=2 en 20 ml de Tris 1 M PH=8. Se adquirio Sefarosa B de lectina de lenteja (Amersham Pharmacia Biotech) y se vertio en una columna XK26 de 25 ml. Los sobrenadantes de las celulas infectadas con vKB15 se pasaron por la columna de lectina de lentejas, la columna se lavo con 10 volumenes de lecho de PBS, y la protema sG con etiqueta myc se eluyo con 1 volumen de lecho de glicina 0.2M pH=2.5 en 2 ml de Tris 1M pH=8. Ambos eluatos se concentraron despues mediante el uso de unidades de filtro centnfugo Centricon de 30 kDa (Millipore, Billerica, MA) y se esterilizaron por filtracion. Las concentraciones de protema se calcularon mediante el uso de una SDS/PAGE, tincion con Coomassie R-250 azul brillante y analisis de densitometna con el software NIH image 1.62.
Como se muestra en la Figura 2, la glicoprotema de la envoltura G del HeV soluble (ya sea la version con la etiqueta S o la version con a etiqueta myc) bloquea tanto la fusion de celulas a celula mediada por el HeV y por el NiV. La inhibicion de la respuesta a la dosis de la fusion de celulas a celulas por el HeV y el NiV se llevo a cabo mediante la preincubacion de las celulas objetivo con la cantidad indicada de sG purificada durante 30 min a temperatura ambiente. Se anadieron celulas efectoras que expresan las protemas f y G del HeV o el NiV y se permitio que la fusion prosiguiera por 2.5 h a 37 °C. Las mezclas de reaccion se procesaron en cuanto a la produccion de (3-gal mediante el uso del ensayo del gen reportero p-gal. Los ensayos se realizaron por duplicado. Los paneles A y B muestran que el sobrenadante que contiene la protema G del sHeV (con etiqueta S) crudo puede bloquear potentemente la fusion mediada por el HeV en dos tipos de celulas alternantes, mientras que un sobrenadante de control de celulas infectadas con el WR (virus vaccinia no recombinante infectado) no tiene efecto. Paneles C y D: Inhibicion de la fusion mediada por el HeV y el NiV por la protema sG con etiqueta S en celulas U373 (Panel C) o celulas PCI 13 (Panel D). Paneles E y F: Inhibicion de la fusion mediada por HeV y NiV por la sG con etiqueta myc purificada en celulas U373 (Panel E) o celulas PCI 31 (Panel F).
Como evidencia adicional, se realizo una inmunofluorescencia indirecta que demostro que la protema G del sHeV puede unirse espedficamente a lmeas celulares que son susceptibles a la fusion e infeccion mediada por virus (Figura 3). La protema G del sHeV es incapaz de unirse a celulas HeLa, una lmea celular no permisiva para la fusion e infeccion viral mediada por el HeV y el NiV. Estos datos sugieren que la protema G del sHeV inhibe la fusion mediada por el HeV por union al receptor putativo sobre las celulas objetivo, con lo que bloquea la union y fusion subsiguientes de las celulas efectoras que expresan las protemas G y F del HeV. La interaccion de la protema G del sHeV con el receptor de HeV putativo puede ser una herramienta util para la purificacion e identificacion de receptores. Dado que la glicoprotema G soluble puede expresarse y purificarse y que exhibe, ademas, caractensticas bioqmmicas similares a las que se esperana de la glicoprotema G nativa esto la hace un inmunogeno de subunidades ideal para la obtencion de anticuerpos neutralizantes del virus. Se construyo una construccion de la sG similar mediante el uso del mismo enfoque de la etiqueta S (ver metodos anteriores) mediante el uso de la secuencia codificante de la glicoprotema de la envoltura G del virus Nipah. Esta protema G del sNiV (con etiqueta S) se clono y expreso y se muestra en la Figura 4.
Se realizo un analisis final de la glicoprotema de la envoltura G del sHeV con etiqueta S para evaluar la naturaleza oligomerica predicha de la protema. La retencion de algunas propiedades oligomericas de una glicoprotema G soluble y secretada puede ser importante para retener caractensticas inmunologicas o bioqmmicas cnticas como se discute en la introduccion anterior. La Figura 5 muestra un analisis de la glicoprotema G del sHeV con etiqueta S secretada por fraccionamiento con gradiente de sacarosa que identifica formas monomericas, dimericas y tetramericas de la glicoprotema G. Se analizaron tanto materiales reticulados como no reticulados. Los resultados indican que la protema sG monomerica, dimerica y alguna tetramerica comprende la preparacion de sG, y esto esta de acuerdo con los hallazgos en versiones solubles y de longitud completa de otras glicoprotemas de union H y HN de los paramixovirus (que se discuten anteriormente). Estas tres especies podnan separarse por tecnicas de cromatograffa preparativa de exclusion portamano si se desea.
Ejemplo 4: Caracterizacion de la protema G del HeV soluble y secretada
Se busco a continuacion determinar si la sG secretada era de naturaleza oligomerica. El peso molecular aparente del material de la sG purificada se examino primero mediante el uso de una cromatograffa de exclusion portamano con una columna de grado analttico Superdex 200 calibrada 10/300. Se paso una almuota de 500 |jg de la sG con etiqueta S o de sG con etiqueta myc por la Superdex 200 y se recolectaron las fracciones mediante el uso de los mismos metodos empleados para los estandares de alto peso molecular. Se observaron resultados esencialmente identicos con las glicoprotemas sG con etiqueta S y etiqueta myc, y los resultados que se muestran en la Figura 7 son los de la sG con etiqueta S. En la figura se indican las ubicaciones de los patrones de protemas y de las tres especies principales de sG. El recuadro muestra el perfil de la sG separado. El analisis de la sG con etiqueta S purificada en siete experimentos independientes de separacion indico dos picos principales con pesos moleculares aparentes de ~372 KDa +/- 19 KDa (~60 % del material) y ~261 KDa +/- 47 KDa (-35 % del material), y un pico menor de - 741 KDa +/- 40 KDa (-5 % del material). Estos resultados indicaron que al menos parte del material sena de naturaleza oligomerica, consistente con la estructura esperada de la glicoprotema. Sin embargo, a partir de la experiencia previa en la preparacion y analisis de glicoprotemas solubles de membrana derivadas de virus, tales como la gp120 del HIV-1, tales calculos de peso molecular derivados del analisis de cromatograffa de exclusion portamano pueden sobreestimarse.
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Para caracterizar adicionalmente las especies oligomericas aparentes de la sG, se analizo la sG con etiqueta S mediante el uso de la densitometna de gradiente de sacarosa. Para este analisis, se escogio la glicoprotema sG con etiqueta S porque puede precipitarse por afinidad con agarosa de protema S y evita la necesidad de un MAb espedfico. La Figura 8 representa los perfiles oligomericos de la protema G con etiqueta S marcada metabolicamente aislada del sobrenadante de las celulas que se expresan. Despues de una breve centrifugacion para eliminar cualquier desecho celular se concentro el sobrenadante y se sustituyo la solucion amortiguadora por PBS como se describe en la presente descripcion. Antes de la separacion en el gradiente de sacarosa, la mitad del sobrenadante se reticulo con DTSSP, un reticulante reducible, y el material reticulado y no reticulado se cargo en dos gradientes separados de sacarosa. Despues del fraccionamiento de cada gradiente, las fracciones se dividieron en 2 tubos, se precipitaron con agarosa de protema S, se lavaron y se resuspendieron en solucion amortiguadora de muestra de SDS, un conjunto con y un conjunto sin S-mercaptoetanol y los cuatro conjuntos de fracciones se analizaron despues por SDS-PAGe. Las Figuras 8A y 8B son protemas sG con etiqueta s no reticuladas separadas en gradiente de sacarosa, fraccionadas, e inmunoprecipitadas. En la Figura 8A, las fracciones se separaron en SDS-PAGE en ausencia de S-mercaptoetanol, mientras que en la Figura 8B, las fracciones se separaron en SDS-PAGE en presencia de S-mercaptoetanol. Las Figuras 8C y 8D son protemas sG con etiqueta S reticuladas separadas en el gradiente de sacarosa, fraccionadas, e inmunoprecipitadas. En la Figura 8C, las fracciones se sepraron en SDS-PAGE en ausencia de S-mercaptoetanol, mientras que en la Figura 8D, las fracciones se separaron en SDS-PAGE en presencia de S-mercaptoetanol. El material de partida para cada gradiente tambien se puso en cada gel en presencia o ausencia de S-mercaptoetanol y se ilustra como control. A partir de los datos mostrados en las Figuras 8A y 8C, se determino que para la protema G con etiqueta S no reticulada y reticulada hay tres especies distintas de sG presentes. Basados en los pesos moleculares aparentes de la sG en cada una de las fracciones a traves de cada uno de los gradientes, estas tres especies representan probablemente un monomero, dfmero y tetramero. Ademas, la reticulacion inmediata de la sG con DTSSP antes de la centrifugacion en gradiente no aumento significativamente la cantidad de las especies tetramericas o dimericas. El analisis de la sG no reticulada, no reducida y reducida indica claramente que el oligomero dimerico se une por disulfuro, lo que se anticipo con base en datos derivados de otras glicoprotemas de union de los paramixovirus (36, 44). Se demostro que los dfmeros de otras glicoprotemas de union de los paramixovirus forman un tetramero en la superficie de las celulas infectadas, y generalmente se cree que la estructura oligomerica nativa es un dfmero de dfmeros. Para analizar esta posibilidad aqrn, se expreso la protema G del HeV de longitud completa y se marco metabolicamente en celulas HeLa (una lmea celular negativa para el receptor) y se realizo un experimento similar y un analisis de gradiente de sacarosa. Despues de un procedimiento de reticulacion, o sin tratamiento, de la protema G del HeV expresada en la superficie en celulas intactas, las celulas se lisaron con un detergente no ionico, se clarificaron los lisados por centrifugacion, y las preparaciones de protema G del HeV expresadas en la superficie se analizaron mediante centrifugacion en gradiente de sacarosa. Las fracciones se analizaron por inmunoprecipitacion con sueros de conejo policlonales antiHeV seguidos por Sefarosa de protema G y se separaron en SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras como antes. En la Figura 9 se muestra el analisis de gradiente de sacarosa de la protema G de HeV radiomarcada de longitud completa no reticulada expresada en la superficie. Aqrn se observa que en las fracciones no reducidas, >95 % de la protema G del HeV de longitud completa existe como la especie tetramerica aparente (Figura 9A, carriles 2-5) y esta especie oligomerica depende claramente de los enlaces disulfuro como se ilustra por las correspondientes fracciones reducidas que son monomericas (Figura 9B, carriles 2-5). Ademas, se observaron perfiles de gradiente de sacarosa identicos independientemente de si se utilizo o no el reactivo de reticulacion lo que indica que las formas de la mprotema G expresadas en la superficie celular nativa forman un oligomero tetramerico muy estable. El dominio de anclaje a la membrana natural de la protema y su cola citoplasmatica pueden contribuir a esta estabilidad. Sin embargo, la mayona (~ 60-70 %) del producto de la glicoprotema sG con etiqueta S que se produce aqrn es un dfmero oligomerico lo que indica que puede retener caractensticas estructurales nativas importantes y utiles.
Ejemplo 5: Inhibicion de la infeccion por HeV y NiV por la protema G del HeV soluble.
Se evaluo a continuacion si la protema sG con etiqueta S produce efectos sobre la infeccion por virus vivo de celulas Vero en el cultivo. En este caso, despues de la preincubacion de celulas Vero con diversas concentraciones de la protema sG con etiqueta S, las celulas se infectaron con 1.5 x 103 TCIDso/ml y 7.5 x 102 TCIDso/ml de HeV o NiV vivos, respectivamente, en presencia de la protema sG con etiqueta S por 30 min, seguido por la eliminacion del inoculo del virus y la incubacion con la protema sG con etiqueta S. Despues de 24 horas en cultivo, el numero de focos de infeccion por HeV y NiV se cuantifico por inmunotincion espedfica de monocapas celulares con una antifosfoprotema (P) como se detalla en los metodos. Ejemplos representativos de celulas Vero infectadas en presencia o ausencia de la protema sG con etiqueta S se muestran en la Figura 10. Tfpicamente, la infeccion de celulas Vero con HeV o NiV vivos produce morfologfas de sincitios caractensticas para cada virus. La inmunofluorescencia para la protema P del HeV en sincitios por HeV demostro que el HeV infecta de forma reproducible e incorpora las celulas circundantes en cada sincitio con nucleos celulares y protemas virales igualmente detectables en la mayona de las celulas infectadas (Figura 10A). Las celulas infectadas con NiV inicialmente muestran una apariencia similar a los sincitios por Hev, pero finalmente los nucleos incorporados dentro de cada celula gigante son secuestrados juntos hacia la periferia mientras que los restos celulares restantes se disponen, ademas, alrededor del exterior y deja la region central en gran parte vada. Asf, la inmunofluorescencia para la protema P del HeV en los sincitios por NiV a menudo aparece como esferas huecas recubiertas de antfgeno viral (Figura 10B) y por comparacion, las infecciones de HeV de control no tratadas producen sincitios mas pequenos en relacion con el control de NiV no tratado (Figuras 10A y 10B). Las figuras 10C y 10D son ejemplos representativos de celulas Vero infectadas con HeV y NiV en presencia de 100 pg/ml de la protema sG con
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etiqueta S. Aunque todavfa hada algunas celulas infectadas presentes como se detecta por inmunofluorescencia, la formacion de sincicios se bloqueo completamente en las celulas infectadas con el HeV y con el NiV (Figuras 10C y 10D, respectivamente). Ademas, el analisis cuantitativo de la inhibicion de la infeccion por HeV y NiV por la glicoprotema sG con etiqueta S purificada revelo una respuesta dependiente de la dosis, lo que demuestra ademas su especificidad, como se muestra en la Figura 11. Juntos estos datos proporcionan una fuerte evidencia de que el HeV y el NiV utilizan un receptor comun en la superficie de la celula huesped. Adicionalmente, la inhibicion espedfica de ambos virus mediante la protema sG con etiqueta S demostro, ademas, que la construccion de la protema sG con etiqueta S mantiene importantes elementos estructurales nativos. Curiosamente, la infeccion por HeV se inhibio significativamente mejor que la del NiV de modo que la IC50 determinada para la protema sG con etiqueta S fue cuatro veces mayor para el NiV (13.20 |jg/ml) que para el HeV (3.3 jg/ml) (Figura 11). Dada la evidencia actual que sugiere que ambos virus utilizan un receptor comun, las razones de las diferencias observadas en la inhibicion por la protema sG con etiqueta S de la infeccion por virus frente a la fusion celular permanecen desconocidas. No se observo una diferencia similar en la capacidad de la protema sG con etiqueta S para inhibir la fusion celular mediada por el HeV y el NiV, como se demuestra en la Fig. 3. Aunque la fusion mediada por el HeV fue mas potente que la fusion mediada por el NiV, lo que se ilustra por los niveles mas altos de rotacion del sustrato, la IC50 con la protema sG con etiqueta S en ambos ensayos de fusion celular permanecio constante. En informes anteriores, se demostro mediante funcion heterotfpica que la diferencia en las tasas de fusion celular entre el HeV y el NiV dependfa de la protema de fusion. Aqrn, se demuestra que la infeccion natural por el NiV parece ser mas vigorosa que la infeccion por el HeV. Tal vez otras protemas virales presentes durante la infeccion influyen en la cinetica de la infeccion lo que altera asf la susceptibilidad a la inhibicion, o pueden existir diferencias en la afinidad de la protema sG del HeV frente a la protema G del NiV por el receptor expresado en la superficie celular.
Ejemplo 6: La protema G del HeV soluble induce una potente respuesta de anticuerpos policlonales neutralizantes del virus.
Con pocas excepciones, son las glicoprotemas de la envoltura del virus a las que practicamente se dirigen todos los anticuerpos neutralizantes y todas las vacunas virales humanas exitosas inducen anticuerpos neutralizantes que pueden reaccionar de forma cruzada con cepas inmunologicamente relevantes de un virus. Mas espedficamente, los anticuerpos neutralizantes del virus son el mecanismo protector principal inducido por vacunas en el caso de los paramixovirus de la parotiditis y el sarampion, y se demostro que las glicoprotemas de la envoltura del NiV de longitud completa expresadas en el virus vaccinia pueden provocar anticuerpos neutralizantes del virus. Los datos indican que la glicoprotema sG con etiqueta S retiene caractensticas estructurales importantes basadas en sus capacidades para unirse espedficamente a las celulas positivas a los receptores y bloquear la fusion e infeccion mediadas por el HeV y el NiV. Asf, la inmunizacion de animales con la sG debena potencialmente generar potentes anticuerpos neutralizantes del virus. Para probar esta posibilidad, se utilizo la protema sG con etiqueta S purificada para inmunizar conejos y el antisuero antiG resultante se evaluo en ensayos de neutralizacion de virus con el HeV y el NiV. La Tabla 1 resume la neutralizacion de la infeccion por HeV y NiV por los sueros policlonales anti G de conejo. Los sueros de ambos conejos eran capaces de una neutralizacion completa del HeV a una dilucion de 1: 1280. El NiV tambien se neutralizo mediante el antisuero de la protema sG con etiqueta S, con neutralizacion completa a una dilucion de 1:640. Una diferencia de dos veces en el tftulo es consistente con la reactividad cruzada parcial del anticuerpo de las glicoprotemas G del HeV y el NiV. Se comprobaron, ademas, presangrados de ambos conejos en cuanto a su capacidad para neutralizar el HeV y el NiV. Aunque hubo una ligera neutralizacion a la concentracion mas alta, esta actividad se anulo completamente tras la dilucion de los sueros. Estudios previos demostraron que los antisueros contra el HeV y el NiV se neutralizan cruzadamente, con cada suero ligeramente menos eficaz contra el virus heterotfpico (14). Ademas, se demostro una tendencia similar en la neutralizacion cruzada mediante el uso del ensayo de fusion celular para el HeV y el NiV (4,81). Debido a que la protema sG con etiqueta S fue capaz de inducir una respuesta inmune tan potente con altos niveles de anticuerpos neutralizantes, esta puede proporcionar una via para las estrategias de desarrollo de vacunas.
Otras modalidades y usos de la invencion resultaran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la consideracion de la descripcion y la practica de la invencion descrita en la presente descripcion.
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10
15
20
25
Tabla 1
HeV NiV
Dilucion
Conejo 405 Conejo 406 Conejo 405 Conejo 406
1:10
- - - - - - - -
1:20
- - - - - - - -
1:40
- - - - - - - -
1:80
- - - - - - - -
1:160
- - - - - - - -
1:320
- - - - - - - -
1:640
- - - - - - - -
1:1,280
- - - - + + - +
1:2,560
- - - + + + + +
1:5,120
- - + + + + + +
1:10,240
+ + + + + + + +
1:20,480
+ + + + + + + +

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    Reivindicaciones
    1. Una protema de fusion que comprende un dominio de la protema G del virus Hendra soluble que comprende los aminoacidos del 71 al 604 de la protema G nativa del virus Hendra y un dominio de la cadena IgK que comprende la secuencia de aminoacidos de la Sec. con num. de ident.: 10.
  2. 2. La protema de fusion de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el dominio de la protema G del virus Hendra soluble se constituye por los aminoacidos del 71 al 604 de una protema G nativa del virus Hendra.
  3. 3. La protema de fusion de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, en donde el dominio de la cadena de IgK consiste en la secuencia de aminoacidos de Sec. con num. de ident.: 10.
  4. 4. La protema de fusion de conformidad con la reivindicacion 1 que comprende, ademas, un enlazador de 15 aminoacidos que comprende la secuencia de aminoacidos de AAQPARRARRTKLGT.
  5. 5. La protema de fusion de conformidad con la reivindicacion 1, que comprende ademas una etiqueta de peptido S que comprende la secuencia de aminoacidos de Sec. con num. de ident.: 12.
  6. 6. La protema de fusion de conformidad con la reivindicacion 1, que comprende ademas una etiqueta del epftopo c-myc que comprende la secuencia de aminoacidos de Sec. con num. de ident.: 13.
  7. 7. La protema de fusion de conformidad con la reivindicacion 6, que comprende ademas un enlazador de 15 aminoacidos que comprende la secuencia de aminoacidos de AAQPARRARRTKLGT.
  8. 8. La protema de fusion de conformidad con la reivindicacion 6, que comprende ademas un enlazador de 15 aminoacidos que comprende la secuencia de aminoacidos de NSADIQHSGGRSTTM que enlaza la etiqueta del epftopo c-myc con el extremo N de la protema G soluble.
  9. 9. La protema de fusion de conformidad con la reivindicacion 1, en donde la secuencia de aminoacidos de Sec. con num. de ident.: 10 se une a la secuencia de aminoacidos de AAQPARRARRTKLGT que se une a la secuencia de aminoacidos de Sec. con num. de ident.: 12 que se une a la secuencia de aminoacidos de NSADIQHSGGRSTTM para formar un peptido, en donde el peptido se une al extremo N de la protema G del virus Hendra soluble.
  10. 10. La protema de fusion de conformidad con la reivindicacion 1, en donde la secuencia de aminoacidos de Sec. con num. de ident.: 10 se une a la secuencia de aminoacidos de AAQPARRARRTKLGT que se une a la secuencia de aminoacidos de Sec. con num. de ident.: 13 que se une a la secuencia de aminoacidos de NSADIQHSGGRSTTM para formar un peptido, en donde el peptido se une al extremo N de la protema G del virus Hendra soluble.
  11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende una protema de fusion G del virus Hendra soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10.
  12. 12. La composicion farmaceutica de conformidad con la reivindicacion 11, que comprende ademas un adyuvante.
  13. 13. La composicion farmaceutica de conformidad con la reivindicacion 11, en donde la composicion se formula para la administracion oral, intravenosa, subcutanea, intraarterial, intracardiaca intramuscular, intraespinal, intratoracica, intraperitoneal, intraventricular, sublingual y/o transdermica.
    y U U U U V
    > >■ >- > > E is\ E is* E vi E i/i E </) E
    imagen1
    lisado sobrenadante lisado sobrenadante lisa do sobrenadante
    antJ-HeV anb-myc Agarosa de proteina S
    FIG.1
    imagen2
    Dilucion Reciproca del Sobrenadante
    FIG.2A
    {uju/oooi x^AK-iflx) MMMJ-tfM
    imagen3
    Dilucion Reciproca del Sobrenadante
    FIG.2B
    imagen4
    Virus
    Hendra
    Virus
    Nip ah
    sG
    etqueta
    del
    virus Hendra (pg/ml)
    c an
    FIG
    2 C
    Virus Hendra
    Virus Nipah
    « 300
    40 !
    3D A
    sG con etiqueta S del virus Hendra (pgAnl)
    FIG.2D
    imagen5
    sG con etiqueta myc del virus Hendra (pg/ml)
    FIG.2E
    sc
    Virus Herdra
    Vims
    Nipah
    etiqueta
    de
    Hendra (pg/ml)
    :: r
    myc
    v rus
    FIG.2F
    Virus Hendra
    Vims Nipah
    o
    15 o
    Vero PCI 13 U373
    imagen6
    FIG.3A
    imagen7
    FIG.3B
    CO
    cn
    imagen8
    o
    imagen9
    7C
    a
    tu
    vector+WR
    p-sNiV G etiquetaS
    p-sHeV G etiqueta S
    WR
    w-sHeV G etiqueta S
    vector+WR
    p-sNiV G etiqueta S p-sHeV G etiqueta S
    WR
    w-sHeV G etiqueta S
    ■O
    u» <U
    fD
    O 3
    a-
    CD
    <S)
    ?
    on
    1
    2l
    <t
    CO
    G)
    O
    cji
    CD
    Parte inferior
    33
    rt>
    CL
    C
    O
    CL
    Cl.
    3
    o
  14. 8.
    3
    fD
    —t
    O
    Parte superior
    Control
    Q-
    3'
    n>
    o
    imagen10
    imagen11
    FIG.5A
    imagen12
    T]
    CD
    CJl
    a
    imagen13
    ;*■
    O
    QJ
    imagen14
    Parte inferior
    50 • T1 Q i
    O
    51
    Cl.
    in
    Parte superior Control
    CD.
    3
    CD
    o
    </»
    o
    imagen15
    Protelna sG con etiqueta S del HeV
    N~term
    35
    imagen16
    ilia
    Proteina G del HeV con el dominio transmembranal/cola citoplasmMica eliminados (aa71-604)
    Protelna sG con etiqueta myc del HeV
    N-term
    imagen17
    Protelna G del HeV con el dominio transmembranal/cola cltoplasm4tica eliminados (aa71-604)
    imagen18
    K~ cadena k secuencia lider:
    METDTLLLWVULLWVPGSTGD (21 go)
    imagen19
    enlazador de 15 aa: AAQPARRARRTKLGT
    imagen20
    etiqueta del peptido S: KETAAAKFERQHMDS (15 aa)
    imagen21
    etiqueta delepltopo myc: EQKUSEEDL(10 aa)
    imagen22
    enlazador do 15aa: NSADIQHSGGRSTTM
    C-term
    C-term
    FIG.6
    imagen23
    0 100 200 300 400 500 600 700 300
    Peso Molecular (KDo)
    FIG.7
    No reticulada No reticulada
    No reducidas
    parte inferior parte superior
    imagen24
    FIG.8A
    . . Reducidas
    parte inferior parte supenor
    imagen25
    FIG.8B
    Reticulada
    No reducidas
    parte inferior parte superior
    imagen26
    FIG.8C
    Reducidas
    parte inferior parte superior
    imagen27
    FIG.8D
    imagen28
    monomero
    FIG.9A
    imagen29
    HeV
    imagen30
    FIG. 10A
    CO
    HeV
    c * ^
    imagen31
    FIG.10C
    imagen32
    NiV
    imagen33
    FIG.10D
    imagen34
    imagen35
    Vims Hendra Virus NiDah
    imagen36
    /ig/ml Proteina sG con etiqueta S del virus Hendra
    FIG.11
    oat J3J-185
    Cola Tallo
    imagen37
    191-195
    Caboza Globular
    517 570
    FIG.12
    imagen38
    03S1-4
    CA3EZA GLOBULAR 422aa
    05S1
    06S1-3
    r-r 7 r r/
    Region del tallo 112ao 1
    ______________c:t//
    Region de transmembrana 25oa<Sl
    Cola citoplasmatica 45aa
    FIG.13
    imagen39
    NSNQT A£
    mm
    W.iT
    l&M
    ____01S1 01S2
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    F G.1 4
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