JP2023524990A - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する組換えニューカッスル病ウイルス及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(「NDV」)であって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、組換えニューカッスル病ウイルスである。また本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、組換えNDVである。該組換えNDV及びその組成物は、SARS-CoV-2に対する免疫及びCOVID-19の予防に有用である。【選択図】図１
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2020年7月31日に出願された米国仮出願第63/059,924号、2020年7月29日に出願された米国仮出願第63/058,435号、2020年7月27日に出願された米国仮出願第63/057,267号、2020年7月14日に出願された米国仮出願第63/051,858号、及び2020年5月7日に出願された米国仮出願第63/021,677号の恩典を主張するものであり、かつ2021年3月17日に出願された国際出願PCT/US2021/022848号の一部継続出願であり、これらの各々の開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
本出願は、2020年7月31日に出願された米国仮出願第63/059,924号、2020年7月29日に出願された米国仮出願第63/058,435号、2020年7月27日に出願された米国仮出願第63/057,267号、2020年7月14日に出願された米国仮出願第63/051,858号、及び2020年5月7日に出願された米国仮出願第63/021,677号の恩典を主張するものであり、かつ2021年3月17日に出願された国際出願PCT/US2021/022848号の一部継続出願であり、これらの各々の開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
(連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載)
本発明は、米国立衛生研究所(National Institute of Health)により授与された助成金HHSN272201400008Cの下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、米国立衛生研究所(National Institute of Health)により授与された助成金HHSN272201400008Cの下で政府支援を受けて行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
(配列表)
本出願は、2021年5月5日に作成された、170,237バイトのサイズの06923-341-228_SEQ_LISTING.txtというタイトルのテキストファイルとして本出願とともに提出された配列表を引用により組み込んでいる。
本出願は、2021年5月5日に作成された、170,237バイトのサイズの06923-341-228_SEQ_LISTING.txtというタイトルのテキストファイルとして本出願とともに提出された配列表を引用により組み込んでいる。
(1.序論)
一態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(「NDV」)であって、該パッケージングされたゲノムが重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(「SARS-CoV-2」)スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子を含む、組換えニューカッスル病ウイルスである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む導入遺伝子を含む、組換えNDVである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、組換えNDVである。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。また本明細書に記載されるのは、そのような組換えNDVを含む組成物、並びにSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するための及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する抗体の存在を検出するための免疫アッセイにおける、そのような組換えNDVの使用である。
一態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(「NDV」)であって、該パッケージングされたゲノムが重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(「SARS-CoV-2」)スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子を含む、組換えニューカッスル病ウイルスである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む導入遺伝子を含む、組換えNDVである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、組換えNDVである。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。また本明細書に記載されるのは、そのような組換えNDVを含む組成物、並びにSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するための及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質に結合する抗体の存在を検出するための免疫アッセイにおける、そのような組換えNDVの使用である。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質又はその部分をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、組換えNDVである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質又はその部分をコードするコドン最適化された核酸配列を含む導入遺伝子を含む、組換えNDVである。また本明細書に記載されるのは、そのような組換えNDVを含む組成物、並びにSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質に対する免疫応答を誘導するための及びSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質に結合する抗体の存在を検出するための免疫アッセイにおける、そのような組換えNDVの使用である。
別の態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子又はその部分、及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、組換えNDVである。別の態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが、(i)SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質又はその部分をコードするヌクレオチド配列及び(ii)SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、組換えNDVである。また本明細書に記載されるのは、そのような組換えNDVを含む組成物、並びにSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質に対する免疫応答を誘導するための及びSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質に結合する抗体の存在を検出するための免疫アッセイにおける、そのような組換えNDVの使用である。
(2.背景)
COVID-19を治療するため治療法及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)を検出するための診断を開発する差し迫った必要性が存在する。2020年5月7日現在、3,815,561人を超える人々がSARS-CoV-2の検査で陽性と出ている。さらに、2020年5月7日現在、70,802人を超える米国人がCOVID-19で死亡し、世界では267,469人を超える人々がCOVID-19で死亡している。2020年7月26日現在、SARS-CoV-2は、約1630万人の感染をもたらし、死亡は50万人を超え、公衆衛生に脅威を与え続けている。現在、COVID-19を予防するワクチンは存在しない。
COVID-19を治療するため治療法及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2(SARS-CoV-2)を検出するための診断を開発する差し迫った必要性が存在する。2020年5月7日現在、3,815,561人を超える人々がSARS-CoV-2の検査で陽性と出ている。さらに、2020年5月7日現在、70,802人を超える米国人がCOVID-19で死亡し、世界では267,469人を超える人々がCOVID-19で死亡している。2020年7月26日現在、SARS-CoV-2は、約1630万人の感染をもたらし、死亡は50万人を超え、公衆衛生に脅威を与え続けている。現在、COVID-19を予防するワクチンは存在しない。
ニューカッスル病ウイルス(NDV)は、いくつかの鳥類に感染することが示されている、パラミクソウイルス科のアブラウイルス属のメンバーである(Alexander, DJの文献(1988))。ニューカッスル病、ニューカッスル病ウイルス--鳥パラミクソウイルス(Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus.)、Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. 1～22ページ)。NDVは、マイナスセンスに一本鎖RNAゲノムを保有し、宿主ゲノムとの組換えも、他のウイルスとの組換えも起こさない(Alexander, DJの文献(1988))。ニューカッスル病、ニューカッスル病ウイルス--鳥パラミクソウイルス(Newcastle disease, Newcastle disease virus -- an avian paramyxovirus.)、Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands. 1～22ページ)。このゲノムRNAは、以下でさらに詳細に記載される、3'-NP-P-M-F-HN-L-5'という順序で遺伝子を含有する。2つのさらなるタンパク質であるV及びWは、RNA編集によって生成するオルタナティブmRNAにより、P遺伝子からNDVによって産生される。このゲノムRNAはまた、3'末端にリーダー配列を含有する。
ビリオンの構造エレメントは、細胞形質膜に由来する脂質二重層であるウイルスエンベロープを含む。糖タンパク質である血球凝集素-ノイラミニダーゼ(HN)が該エンベロープから突き出ることで、該ウイルスが血球凝集素(例えば、受容体結合/融合)活性とノイラミニダーゼ活性の両方を含有することが可能になっている。同じくウイルス膜と相互作用する融合糖タンパク質(F)が不活性な前駆体としてまず産生され、その後、翻訳後切断されて、2つのジスルフィド結合ポリペプチドを産生する。活性型Fタンパク質は、ウイルスエンベロープと宿主細胞形質膜との融合を容易にすることにより、宿主細胞へのNDVの侵入に関与する。マトリックスタンパク質(M)は、ウイルス集合に関与し、ウイルス膜とヌクレオカプシドタンパク質の両方と相互作用する。
ヌクレオカプシドの主なタンパク質サブユニットは、該カプシドにらせん形の対称性を付与するヌクレオカプシドタンパク質(NP)である。該ヌクレオカプシドと関連しているのは、Pタンパク質とLタンパク質である。リン酸化を受けるホスホタンパク質(P)は、転写において調節的な役割を果たすと考えられており、メチル化、リン酸化、及びポリアデニル化にも関与し得る。RNA依存性RNAポリメラーゼをコードするL遺伝子は、Pタンパク質とともにウイルスRNA合成に必要とされる。ウイルスゲノムのコード容量のほぼ半分を占めるLタンパク質は、ウイルスタンパク質のうちの最大のものであり、転写と複製の両方において重要な役割を果たす。Vタンパク質は、インターフェロン-αを阻害し、NDVの病原性に寄与することが示されている(Huangらの文献(2003))。ニューカッスル病ウイルスVタンパク質はウイルスの発病と関連し、αインターフェロンアンタゴニストとして機能する(Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an Alpha Interferon Antagonist.)、Journal of Virology 77: 8676-8685)。
(3.概要)
一態様において、本明細書に提示されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(「NDV」)であって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、細胞外ドメインもしくはSARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、組換えニューカッスル病ウイルスである。一実施態様において、該導入遺伝子は、全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む(又は該受容体結合ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、該タンパク質は、タグ(例えば、His又はflagタグ)をさらに含む。別の実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインを含む(又は該細胞外ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、該タンパク質は、タグ(例えば、His又はflagタグ)をさらに含む。いくつかの実施態様において、該タンパク質は、四量体化ドメイン及び任意にタグをさらに含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分をコードするヌクレオチド配列を含む。核酸コードの縮重のために、複数の異なる核酸配列が同じSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードし得る。一実施態様において、本明細書に記載されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該導入遺伝子が、配列番号4、6、8、又は10のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該導入遺伝子が、配列番号4、6、8、又は10のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDVである。好ましい実施態様において、導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする核酸配列のコドン最適化バージョンを含む。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、組換えNDVのビリオンに組み込まれる。
一態様において、本明細書に提示されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(「NDV」)であって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、細胞外ドメインもしくはSARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、組換えニューカッスル病ウイルスである。一実施態様において、該導入遺伝子は、全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む(又は該受容体結合ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、該タンパク質は、タグ(例えば、His又はflagタグ)をさらに含む。別の実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインを含む(又は該細胞外ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、該タンパク質は、タグ(例えば、His又はflagタグ)をさらに含む。いくつかの実施態様において、該タンパク質は、四量体化ドメイン及び任意にタグをさらに含む。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分をコードするヌクレオチド配列を含む。核酸コードの縮重のために、複数の異なる核酸配列が同じSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードし得る。一実施態様において、本明細書に記載されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該導入遺伝子が、配列番号4、6、8、又は10のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列を含むSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該導入遺伝子が、配列番号4、6、8、又は10のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDVである。好ましい実施態様において、導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする核酸配列のコドン最適化バージョンを含む。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、組換えNDVのビリオンに組み込まれる。
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む導入遺伝子を含む、組換えNDVである。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)タンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、組換えNDVである。すなわち、キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含まないように、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインがSARS-CoV-2スパイクタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに置き換わっている。一実施態様において、該導入遺伝子は、キメラFタンパク質をコードし、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含むキメラFタンパク質をコードする。別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2タンパク質細胞外ドメイン及びNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該導入遺伝子が配列番号12のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDVである。好ましい実施態様において、導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインをコードする核酸配列のコドン最適化バージョンを含む。好ましい実施態様において、導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインをコードする核酸配列のコドン最適化バージョンを含み、ここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。別の実施態様において、導入遺伝子は、キメラFタンパク質をコードする核酸配列のコドン最適化バージョンを含み、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質及びキメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現され、かつキメラFタンパク質は、NDVビリオンに組み込まれる。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をそのビリオン中に含む組換えNDVであって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDVである。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDVである。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化されている。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号14のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号16のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号18のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該導入遺伝子が配列番号15に示されるアミノ酸配列をコードするRNA配列を含む、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該導入遺伝子が配列番号17に示されるアミノ酸配列をコードするRNA配列を含む、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該導入遺伝子が配列番号19に示されるアミノ酸配列をコードするRNA配列を含む、組換えNDVである。別の実施態様において、導入遺伝子は、キメラFタンパク質をコードする核酸配列のコドン最適化バージョンを含み、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質及びキメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現され、かつキメラFタンパク質は、NDVビリオンに組み込まれる。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をそのビリオン中に含む組換えNDVであって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDVである。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む。
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2タンパク質細胞外ドメイン及びNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインがコドン最適化された核酸配列によってコードされる、組換えNDVである。好ましい実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該導入遺伝子が配列番号12のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDVである。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質及びNDV Fタンパク質は、該組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現され、かつキメラFタンパク質は、NDVビリオンに組み込まれる。
組換えNDVは、限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異ウイルス、再集合体、又は遺伝子改変ウイルス、或いはこれらの任意の組合せを含む、任意のNDVタイプ又は株の骨格を有することができる。具体的な実施態様において、組換えNDVは、長潜伏期性であるNDV骨格を含む。別の具体的な実施態様において、組換えNDVは、NDV LaSota株のNDV骨格を含む。例えば、NDV LaSota株のゲノム配列のcDNA配列については、配列番号1を参照されたい。NDVのゲノム配列の別のcDNA配列については、配列番号25も参照されたい。別の具体的な実施態様において、組換えNDVは、NDV Hitchner B1株のNDV骨格を含む。例えば、NDV Hitchner株のゲノム配列のcDNA配列については、配列番号2を参照されたい。別の具体的な実施態様において、組換えNDVは、NDV Hitchner B1株以外の長潜伏期性株のNDV骨格を含む。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株のゲノムに組み込まれ得る。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、長潜伏期性NDVのゲノムに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、NDV株LaSotaのゲノムに組み込まれる。例えば、NDV LaSota株のゲノム配列のcDNA配列については、配列番号1を参照されたい。NDVのゲノム配列の別のcDNA配列については、配列番号25も参照されたい。導入遺伝子が組み込まれ得るNDV株の別の例は、NDV Hitchner B1株である。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、NDV Hitchner B1株のゲノム配列に組み込まれ得る。例えば、NDV Hitchner B1株のゲノム配列のcDNA配列については、配列番号2を参照されたい。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、NDV Hitchner B1株以外の長潜伏期性株のゲノム配列に組み込まれ得る。該導入遺伝子は、NDVゲノム中、2つの転写ユニットの間(例えば、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子の間)に組み込まれ得る。
具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子の間)に組み込まれ得る。ある実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)以外の異種タンパク質をコードする異種配列を含まない。いくつかの実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子以外の導入遺伝子を含まない。ある実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)或いはキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子、及びSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む。そのような実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、任意の追加の導入遺伝子を含まなくてもよい。
具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれ、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む。キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子の間)に組み込まれ得る。ある実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、キメラFタンパク質以外の異種タンパク質をコードする異種配列を含まず、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む。いくつかの実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子以外の導入遺伝子を含まず、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む。
具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれ、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子の間)に組み込まれ得る。ある実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、キメラFタンパク質以外の異種タンパク質をコードする異種配列を含まず、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。いくつかの実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子以外の導入遺伝子を含まず、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。
具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれ、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基は、プロリンと置換され、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子の間)に組み込まれ得る。ある実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、キメラFタンパク質以外の異種タンパク質をコードする異種配列を含まず、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基は、プロリンと置換され、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。いくつかの実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子以外の導入遺伝子を含まず、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基は、プロリンと置換され、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えNDVを含む組成物(例えば、免疫原性組成物)である。いくつかの実施態様において、該組換えNDVは、生ウイルスである。他の実施態様において、該組換えNDVは、不活化されている。該組換えNDVは、当業者に公知の又は本明細書に記載される技法を用いて不活化することができる(例えば、下の第10節を参照)。組成物(例えば、免疫原性組成物)は、医薬として許容し得る担体をさらに含むことができる。ある実施態様において、組成物(例えば、免疫原性組成物)は、当業者に公知の又は本明細書に記載されるアジュバントをさらに含むことができる(例えば、下の第10節又は第11節を参照)。該組成物は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、SARS-CoV-2に対して免疫するための、及び/又はCOVID-19を予防するための方法において使用することができる。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組換えNDVを含む組成物を投与することを含む、方法である。該組成物は、例えば、第10節又は第11節に記載されている不活化NDVを含むことができる。或いは、該組成物は、生NDVを含むことができる。例えば、組成物に関する第5.4節を参照されたい。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。一実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列を含む。核酸コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が同じSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードすることができる。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、配列番号4、6、8、又は10に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)を組換えNDVに投与することを含み、ここで、該組換えNDVが導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む、方法である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、方法である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。一実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む。核酸コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が同じキメラFタンパク質をコードすることができる。例えば、キメラFタンパク質は、配列番号12に示されるヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2タンパク質に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインをコードするコドン最適化された核酸配列を含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2タンパク質に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、方法である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、該組換えNDVのビリオンに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、方法である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。一実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む。核酸コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が同じキメラFタンパク質をコードすることができる。例えば、キメラFタンパク質は、配列番号14に示されるヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。別の例において、キメラFタンパク質は、配列番号16のヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。別の例において、キメラFタンパク質は、配列番号18のヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、該組換えNDVのビリオンに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して免疫するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組換えNDVを含む組成物を投与することを含む、方法である。該組成物は、例えば、第10節又は第11節に記載されている不活化NDVを含むことができる。或いは、該組成物は、生NDVを含むことができる。例えば、組成物に関する第5.4節を参照されたい。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して免疫するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。一実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列を含む。核酸コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が同じSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードすることができる。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、配列番号4、6、8、又は10の配列を含む核酸配列によってコードされる。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して免疫するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVが導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む、方法である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して免疫するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して免疫するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、方法である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。一実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む。核酸コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が同じキメラFタンパク質をコードすることができる。例えば、キメラFタンパク質は、配列番号12の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされることができる。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して免疫するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインをコードするコドン最適化された核酸配列を含む、方法である。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して免疫する方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、方法である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。一実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む。核酸コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が同じキメラFタンパク質をコードすることができる。例えば、キメラFタンパク質は、配列番号14に示されるヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。別の例において、キメラFタンパク質は、配列番号16に示されるヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。別の例において、キメラFタンパク質は、配列番号18に示されるヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、該組換えNDVのビリオンに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、COVID-19を予防するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組換えNDVを含む組成物を投与することを含む、方法である。該組成物は、例えば、第10節又は第11節に記載されている不活化NDVを含むことができる。或いは、該組成物は、生NDVを含むことができる。例えば、組成物に関する第5.4節を参照されたい。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、COVID-19の予防のための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。一実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列を含む。核酸コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が同じSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードすることができる。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、配列番号4、6、8、又は10の配列を含む核酸配列によってコードされる。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、COVID-19の予防のための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVが導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む、方法である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、該組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、COVID-19の予防のための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、方法である。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、COVID-19の予防のための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、方法である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。一実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む。核酸コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が同じキメラFタンパク質をコードすることができる。例えば、キメラFタンパク質は、配列番号12の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされることができる。具体的な実施態様において、本明細書に提示されるのは、COVID-19の予防のための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインをコードするコドン最適化された核酸配列を含む、方法である。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、該組換えNDVのビリオンに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、COVID-19の予防のための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、方法である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカーを介してSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。一実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む。核酸コードの縮重のために、いくつかの異なる核酸配列が同じキメラFタンパク質をコードすることができる。例えば、キメラFタンパク質は、配列番号14に示されるヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。別の例において、キメラFタンパク質は、配列番号16に示されるヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。別の例において、キメラFタンパク質は、配列番号18に示されるヌクレオチド配列を含む配列によってコードされることができる。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、該組換えNDVに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVである。具体的な実施態様において、該組換えNDVは、例えば、第5.4節に記載されている組成物である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドに対する免疫応答を誘導するための方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVを投与することを含む、方法である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2に対して対象(例えば、ヒト対象)を免疫するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVを投与することを含む、方法である。別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象(例えば、ヒト対象)のSARS-CoV-2ヌクレオカプシドにおけるCOVID-19を予防する方法であって、対象(例えば、ヒト対象)に、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVを投与することを含む、方法である。別の具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト幼児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト小児である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト成人である。別の具体的な実施態様において、対象は、ヒト高齢者である。
本明細書に記載される組換えNDVは、1以上の他の療法と組み合わせて対象に投与することができる。該組換えNDV及び1以上の他の療法は、同じ又は異なる投与経路によって対象に投与することができる。具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内又は筋肉内投与される。例えば、組換えNDVに関する情報については、下の第5.1節及び第6～12節、他の療法に関する情報については、下の第5.5.3節、組成物及び投与経路に関する情報については、下の第5.4節、並びにSARS-CoV-2に対して免疫する方法に関する情報については、下の第5.5.1並びに第6、7、8、10、及び11節を参照されたい。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるNDVゲノム及び導入遺伝子を含むヌクレオチド配列である。該ヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の又は記載されているNDVゲノムの核酸配列(例えば、第5.1節又は下の実施例を参照;配列番号1、2、又は25も参照)及び本明細書に記載される導入遺伝子の核酸配列を含むことができる。具体的な実施態様において、該ヌクレオチド配列は、単離されている。
ある実施態様において、「単離された」核酸配列は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子を指す。すなわち、単離された核酸配列は、天然ではそれと関連しない異種核酸を含むことができる。他の実施態様において、「単離された」核酸配列、例えば、cDNA又はRNA配列は、他の細胞材料、もしくは組換え技法によって産生されるときの培養培地を実質的に含まないものであることができ、又は化学合成されるときの化学前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであることができる。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、核酸配列が、それが単離される又は組換え産生される細胞の細胞成分から分離されている核酸配列の調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まない核酸配列は、(乾燥重量で)約30％、20％、10％、又は5％未満の他の核酸を有する核酸配列の調製物を含む。「培養培地を実質的に含まない」という用語は、培養培地が調製物の容量の約50％、20％、10％、又は5％未満に相当する核酸配列の調製物を含む。「化学前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、核酸配列が核酸配列の合成に関与する化学前駆物質又は他の化学物質から分離されている調製物を含む。具体的な実施態様において、そのような核酸配列の調製物は、対象となる核酸配列以外の(乾燥重量で)約50％、30％、20％、10％、5％未満の化学前駆物質又は化合物を有する。
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、NDVゲノム及び導入遺伝子を含むヌクレオチド配列であって、該導入遺伝子が、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン又は細胞外ドメイン)のコドン最適化されたヌクレオチド配列並びに遺伝子末端配列、遺伝子開始配列、及び5'末端のKozak配列を含む、ヌクレオチド配列である。例えば、使用され得る遺伝子末端配列、遺伝子開始配列、及びKozak配列の例については、配列番号21～23を参照されたい。ある実施態様において、「6のルール」に従うために、さらなるヌクレオチドが3'末端に存在する。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分は、配列番号5、7、9、又は11のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、該導入遺伝子は、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子の間にある。具体的な実施態様において、該ヌクレオチド配列は、単離されている。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、NDVゲノム及び導入遺伝子を含むヌクレオチド配列であって、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むコドン最適化されたもの並びに遺伝子末端配列、遺伝子開始配列、及び5'末端のKozak配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、ヌクレオチド配列である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、「6のルール」に従うために、さらなるヌクレオチドが3'末端に存在する。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号13のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、該導入遺伝子は、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子の間にある。具体的な実施態様において、該ヌクレオチド配列は、単離されている。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、NDVゲノム及び導入遺伝子を含むヌクレオチド配列であって、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むコドン最適化されたもの並びに遺伝子末端配列、遺伝子開始配列、及び5'末端のKozak配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、ヌクレオチド配列である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、「6のルール」に従うために、さらなるヌクレオチドが3'末端に存在する。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号15のアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号17のアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号19のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、該導入遺伝子は、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子の間にある。具体的な実施態様において、該ヌクレオチド配列は、単離されている。
(3.1 用語)
本明細書で使用される場合、数字と一緒に使用される場合の「約(about)」又は「約(approximately)」という用語は、言及された数字の1、5、又は10％以内の任意の数字を指す。
本明細書で使用される場合、数字と一緒に使用される場合の「約(about)」又は「約(approximately)」という用語は、言及された数字の1、5、又は10％以内の任意の数字を指す。
本明細書で使用される場合、「抗体(antibody)」及び「抗体(antibodies)」という用語は、抗原結合部位を含有する分子、例えば、免疫グロブリンを指す。抗体には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合二重特異性Fv(sdFv)、イントラボディ、及び抗イデオタイプ(抗Id)抗体(例えば、抗体に対する抗Id抗体及び抗-抗Id抗体を含む)、並びに上記のもののいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されない。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)又はサブクラスのものであることができる。
本明細書で使用される場合、NDVとの関連における「異種」という用語は、天然のNDVと関連する(例えば、天然のNDVによってコードされるか、天然のNDVのゲノムによって発現されるか、又はその両方である)ことが天然では見出されない実体を指す。具体的な実施態様において、異種配列は、天然のNDVと関連することが見出されないタンパク質をコードする。
本明細書で使用される場合、「ヒト高齢者」という用語は、65歳以上のヒトを指す。
本明細書で使用される場合、「ヒト成人」という用語は、18歳以上のヒトを指す。
本明細書で使用される場合、「ヒト小児」という用語は、1歳から18歳までのヒトを指す。
本明細書で使用される場合、「ヒト幼児」という用語は、1歳から3歳までのヒトを指す。
本明細書で使用される場合、「ヒト乳児」という用語は、新生児から1歳までのヒトを指す。
本明細書で使用される場合、「IFN欠損システム」又は「IFN欠損基体」という語句は、1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNを産生せず、又は任意のタイプのIFNを産生せず、又は低レベルの1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNを産生し、又は低レベルの任意のIFNを産生し(すなわち、同じ条件下のIFNコンピテントなシステムと比較したとき、5～10％、10～20％、20～30％、30～40％、40～50％、50～60％、60～70％、70～80％、80～90％、もしくはそれを上回る任意のIFN発現の低下)、又は1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNに応答せずもしくはあまり効率的には応答せず、又は任意のタイプのIFNに応答せず、1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNに対する応答が遅延し、1つ、2つ、もしくはそれより多くのタイプのIFNによって誘導されるもしくは任意のタイプのIFNによって誘導される抗ウイルス遺伝子の活性が欠損しているか、或いはこれらの任意の組合せである、システム、例えば、細胞、細胞株、及び動物、例えば、マウス、ニワトリ、シチメンチョウ、ウサギ、ラット、ウマなどを指す。
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「対象(subject)」又は「対象(subjects)」という用語は、動物を指す。いくつかの実施態様において、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ウマ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)並びに霊長類(例えば、サル、チンパンジー、及びヒト)を含む哺乳動物である。いくつかの実施態様において、対象は、非ヒト哺乳動物である。ある実施態様において、対象は、ペット(例えば、イヌもしくはネコ)又は家畜(例えば、ウマ、ブタ、もしくはウシ)である。具体的な実施態様において、対象は、ヒトである。ある実施態様において、哺乳動物(例えば、ヒト)は、4～6カ月、6～12カ月、1～5歳、5～10歳、10～15歳、15～20歳、20～25歳、25～30歳、30～35歳、35～40歳、40～45歳、45～50歳、50～55歳、55～60歳、60～65歳、65～70歳、70～75歳、75～80歳、80～85歳、85～90歳、90～95歳、又は95～100歳である。具体的な実施態様において、対象は、鳥ではない動物である。
本明細書で使用される場合、対象への療法(単数又は複数)の投与との関連における「組み合わせて」という用語は、複数の療法の使用を指す。「組み合わせて」という用語の使用は、療法が対象に投与される順序を制限しない。第一の療法を、対象への第二の療法の投与の前、該投与と同時に、又は該投与の後に投与することができる。
本明細書で使用される場合、「SARS-CoV-2ヌクレオカプシド」という用語は、当業者に公知のSARS-CoV-2ヌクレオカプシドを指す。ある実施態様において、ヌクレオカプシドタンパク質は、GenBankアクセッション番号MT081068.1、MT081066.1、又はMN908947.3で見出されるアミノ酸又は核酸配列を含む。例えば、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質及びヌクレオチド配列のアミノ酸配列の例については、GenBankアクセッション番号MN908947.3、MT447160、MT44636、MT446360、MT444593、MT444529、MT370887、及びMT334558も参照されたい。
本明細書で使用される場合、「SARS-CoV-2スパイクタンパク質」及び「SARS-CoV-2のスパイクタンパク質」という用語は、当業者に公知のSARS-CoV-2スパイクタンパク質を指す。例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列のアミノ酸配列の例については、GenBankアクセッション番号MN908947.3、MT447160、MT44636、MT446360、MT444593、MT444529、MT370887、及びMT334558を参照されたい。ある実施態様において、該スパイクタンパク質は、GenBankアクセッション番号MN908947.3で見出されるアミノ酸又は核酸配列を含む。典型的なスパイクタンパク質は、S1ドメイン、受容体結合ドメイン、S2ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む、当業者に公知のドメインを含む。例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質(特に、そのようなタンパク質の構造)の説明については、Wrappらの文献、2020, Science 367: 1260-1263を参照されたい。該スパイクタンパク質は、シグナルペプチド(例えば、GenBankアクセッション番号MN908947.3のアミノ酸配列の1～14アミノ酸残基のシグナルペプチド)、受容体結合ドメイン(例えば、GenBankアクセッション番号MN908947.3の319～541アミノ酸残基の受容体結合ドメイン)、細胞外ドメイン(例えば、GenBankアクセッション番号MN908947.3の15～1213アミノ酸残基の細胞外ドメイン)、並びに膜貫通及び細胞外ドメイン(例えば、GenBankアクセッション番号MN908947.3の1214～1273アミノ酸残基)の膜貫通及び細胞外ドメインを有すると特徴付けることができる。
本明細書で使用される場合、「療法(therapies)」及び「療法(therapy)」という用語は、COVID-19の治療もしくは予防、又はワクチン接種で使用することができる任意のプロトコル、方法、薬剤、又はこれらの組合せを指すことができる。ある実施態様において、「療法(therapy)」という用語は、本明細書に記載される組換えNDVを指す。他の実施態様において、「療法(therapy)」という用語は、本明細書に記載される組換えNDVではない薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、ヌクレオチド及びアミノ酸配列との関連における「野生型」という用語は、自然界に見られるウイルス株のヌクレオチド及びアミノ酸配列を指す。特に、野生型として本明細書に記載される配列は、天然のウイルス分離株由来の配列として公的データベース中で報告されている配列である。
(4.図面の簡単な説明)
図1。NDV LaSota(LS)レスキュープラスミドの構築の描写。配列番号20～23は、SacII制限配列、遺伝子末端配列(GE)、遺伝子開始配列(GS)、及びKozak配列という配列を提供する。出典Gayathri Vijayakumar及びDmitriy Zamarin著、Christine E. Engeland(編)、「腫瘍溶解性ウイルス(Oncolytic Viruses)」、Methods in Molecular Biology, vol. 2058。
(5.詳細な説明)
(5.1 組換えニューカッスル病ウイルス)
一態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2に対して対象(例えば、ヒト対象)を免疫するために使用し得る本明細書に記載される組換えNDVである。該組換えNDVは、生ウイルス又は不活化ウイルスとして投与することができる。実施例に提供されているデータは、SARS-CoV-2に対して免疫するための本明細書に記載される組換えNDVの有用性を示している。例えば、下の第7節のデータは、組換えNDVベクターCOVID-19ワクチンをマウスに投与したとき、高レベルの中和抗体が獲得されることを示している。さらに、組換えNDV COVID-19ワクチンをマウスに投与したとき、それは、マウス適応SARS-CoV-2投与からマウスを防御し、ウイルス力価及びウイルス抗原が肺で検出されない。下の第10節のデータは、例えば、マウス及びハムスターにおける強力なCOVID-19ワクチンとしての膜アンカー型のスパイクタンパク質(NDV-S)を安定発現する不活化NDVキメラを示している。不活化NDV-Sワクチンは免疫原性であり、両方の動物で強い結合及び/又は中和抗体を誘導した。不活化NDV-Sワクチンは、動物をSARS-CoV-2感染から防御した。アジュバントの存在下で、抗原節減を達成することができ、これにより、既存のインフルエンザウイルスワクチンの能力を用いて生産した場合、低コストのワクチンがさらに保証される可能性がある。
(5.1 組換えニューカッスル病ウイルス)
一態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2に対して対象(例えば、ヒト対象)を免疫するために使用し得る本明細書に記載される組換えNDVである。該組換えNDVは、生ウイルス又は不活化ウイルスとして投与することができる。実施例に提供されているデータは、SARS-CoV-2に対して免疫するための本明細書に記載される組換えNDVの有用性を示している。例えば、下の第7節のデータは、組換えNDVベクターCOVID-19ワクチンをマウスに投与したとき、高レベルの中和抗体が獲得されることを示している。さらに、組換えNDV COVID-19ワクチンをマウスに投与したとき、それは、マウス適応SARS-CoV-2投与からマウスを防御し、ウイルス力価及びウイルス抗原が肺で検出されない。下の第10節のデータは、例えば、マウス及びハムスターにおける強力なCOVID-19ワクチンとしての膜アンカー型のスパイクタンパク質(NDV-S)を安定発現する不活化NDVキメラを示している。不活化NDV-Sワクチンは免疫原性であり、両方の動物で強い結合及び/又は中和抗体を誘導した。不活化NDV-Sワクチンは、動物をSARS-CoV-2感染から防御した。アジュバントの存在下で、抗原節減を達成することができ、これにより、既存のインフルエンザウイルスワクチンの能力を用いて生産した場合、低コストのワクチンがさらに保証される可能性がある。
(5.1.1 NDV)
限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異ウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、任意のNDVタイプ又は株を、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変される「骨格」としての役割を果たすことができる。例えば、導入遺伝子の例については、第5.1.2節並びに実施例6、7、9、10、及び12を参照されたい。具体的な実施態様において、ヌクレオチド配列は、長潜伏期性NDVのゲノムに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、ヌクレオチド配列は、NDV株LaSotaのゲノムに組み込まれる。ヌクレオチド配列を組み込むことができるNDV株の別の例は、NDV Hitchner B1株である。いくつかの実施態様において、NDV Hitchner B1株以外の長潜伏期性株が、ヌクレオチド配列を組み込むことができる骨格として使用される。ヌクレオチド配列は、NDVゲノム中、2つの転写ユニットの間(例えば、M転写ユニットとP転写ユニットの間又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。
限定されないが、天然株、変異体もしくは突然変異体、突然変異ウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、任意のNDVタイプ又は株を、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変される「骨格」としての役割を果たすことができる。例えば、導入遺伝子の例については、第5.1.2節並びに実施例6、7、9、10、及び12を参照されたい。具体的な実施態様において、ヌクレオチド配列は、長潜伏期性NDVのゲノムに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、ヌクレオチド配列は、NDV株LaSotaのゲノムに組み込まれる。ヌクレオチド配列を組み込むことができるNDV株の別の例は、NDV Hitchner B1株である。いくつかの実施態様において、NDV Hitchner B1株以外の長潜伏期性株が、ヌクレオチド配列を組み込むことができる骨格として使用される。ヌクレオチド配列は、NDVゲノム中、2つの転写ユニットの間(例えば、M転写ユニットとP転写ユニットの間又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、天然株である。NDV株の具体的な例としては、Hitchner B1株(例えば、GenBank番号AF309418又はNC_002617を参照)及びLa Sota株(例えば、GenBank番号AY845400、AF07761.1、及びJF950510.1並びにGI番号56799463を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、Hitchner B1株である。別の実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、GenBank番号AF309418又はNC_002617によって特定されるB1株である。具体的な実施態様において、Hitchner B1ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号2に示されるcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、La Sota株である。別の実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、AY845400、AF07761.1、又はJF950510.1によって特定されるLaSota株である。具体的な実施態様において、La Sotaゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号1に示されるcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む。別の具体的な実施態様において、La Sotaゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号25に示されるcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む。当業者は、NDVゲノムRNA配列がNDVゲノムをコードするcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列であることを理解しているであろう。したがって、ヌクレオチド配列を作製し、その逆相補配列に変換する任意のプログラムを用いて、NDVゲノムをコードするcDNA配列をゲノムRNA配列に変換することができる(例えば、www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html、www.fr33.net/seqedit.php、及びDNAStarを参照)。したがって、下の表1及び2に提供されているヌクレオチド配列は、当業者によって、NDVゲノムのマイナスセンスRNA配列へと容易に変換されることができる。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、NDV Fタンパク質のアミノ酸位置289のロイシンアミノ残基が(例えば、Sergelらの文献、2000, Journal of Virology 74: 5101-5107によって記載されているように)アラニンに置換されているNDV Fタンパク質をコードするゲノムを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、(LaSota株Fタンパク質によってカウントしたとき)NDV Fタンパク質のアミノ酸位置289のロイシンアミノ残基がアラニンに置換されているNDV Fタンパク質をコードするゲノムを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、LaSota NDV Fタンパク質のアミノ残基289に対応するアミノ酸位置のロイシンがアラニンに置換されているNDV Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むゲノムを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、LaSota NDV Fタンパク質のアミノ残基289のロイシンがアラニンに置換されているNDV Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むゲノムを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、LaSota株(例えば、GenBankアクセッション番号AY845400、AF07761.1、又はJF950510.1)であり、LaSota株のゲノムは、NDV Fタンパク質のアミノ酸位置289のロイシンアミノ残基がアラニンに置換されているNDV Fタンパク質をコードする。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、LaSota株(例えば、GenBankアクセッション番号AY845400、AF07761.1、又はJF950510.1)であり、LaSota株のゲノムは、NDV Fタンパク質のアミノ残基289のロイシンがアラニンに置換されているLaSota NDV Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、Hitchner B1株(例えば、GenBank番号AF309418又はNC_002617)っであり、Hitchner B1株のゲノムは、NDV Fタンパク質のアミノ酸位置289のロイシンアミノ残基がアラニンに置換されているNDV Fタンパク質をコードする。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、当業者に公知の技法によって評価したとき、鳥で病原性がない。ある具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、1日齢のニワトリへのウイルスの頭蓋内注射、並びに8日間スコアリングされる疾患発症及び死亡によって評価したとき、病原性がない。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、0.7未満、0.6未満、0.5未満、0.4未満、0.3未満、0.2未満、又は0.1未満の頭蓋内病原性指数を有する。ある実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、0という頭蓋内病原性指数を有する。例えば、このアッセイの説明については、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、以下のウェブサイトwww.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.14_NEWCASTLE_DIS.pdfに見られる、「ニューカッスル病(ニューカッスル病ウイルスの感染(Newcastle Disease(Infection With Newcastle Disease Virus))というタイトルのOIE陸生動物マニュアル2012(OIE Terrestrial Manual 2012)、第2.3.14章を参照されたい。
ある実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、当業者に公知の技法によって評価したとき、鳥で病原性があるとみなされないように遺伝子改変されている亜病原性株である。
好ましい実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、ヒトで非病原性である。好ましい実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、ヒト及び鳥類で非病原性である。ある実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子をコードするように改変されるNDVは、該NDVが、少なくとも一部感染性を残し、インビボで複製することができるが、低い力価しか生じさせず、結果として、非病原性の不顕性レベルの感染をもたらすように弱毒化される(例えば、Khattarらの文献、2009, J. Virol. 83:7779-7782を参照されたい)。そのような弱毒化NDVは、該ウイルスが、免疫原、例えば、生ワクチンとして作用するために対象に投与される実施態様に特に適する場合がある。該ウイルスは、当技術分野で公知の任意の方法によって弱毒化することができる。具体的な実施態様において、該NDVゲノムは、子孫が産生され、かつ感染レベルが不顕性となるようなウイルスの感染及び複製に必要な配列を含む。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV P転写ユニット、(4)NDV M転写ユニット、(5)NDV HN転写ユニット、(6)NDV L転写ユニット、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列である。ある実施態様において、NDV転写ユニットは、LaSota NDV転写ユニットである。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV P転写ユニット、(4)NDV M転写ユニット、(5)NDV HN転写ユニット、(6)NDV L転写ユニット、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列であり、ここで、該NDV F転写ユニットは、LaSota NDV Fタンパク質のアミノ酸位置289に対応するアミノ残基においてロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を有するNDV Fタンパク質をコードする。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV P転写ユニット、(4)NDV M転写ユニット、(5)NDV HN転写ユニット、(6)NDV L転写ユニット、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列であり、ここで、該NDV F転写ユニットは、LaSota NDV Fタンパク質のアミノ酸位置289に対応するアミノ残基においてロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を有するNDV Fタンパク質をコードする。ある実施態様において、NDV転写ユニットは、LaSota NDV転写ユニットである。ある実施態様において、核酸配列は、ベクター(例えば、プラスミド、例えば、下の実施例に記載されているもの)の一部である。具体的な実施態様において、核酸配列は単離されている。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV Fをコードするヌクレオチド配列、(2)NDV NPをコードするヌクレオチド配列、(3)NDV Pをコードするヌクレオチド配列、(4)NDV Mをコードするヌクレオチド配列、(5)NDV HNをコードするヌクレオチド配列、(6)NDV Lをコードするヌクレオチド配列、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV Fをコードするヌクレオチド配列、(2)NDV NPをコードするヌクレオチド配列、(3)NDV Pをコードするヌクレオチド配列、(4)NDV Mをコードするヌクレオチド配列、(5)NDV HNをコードするヌクレオチド配列、(6)NDV Lをコードするヌクレオチド配列、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列であり、ここで、該NDV Fは、LaSota NDV Fのアミノ残基289に対応するアミノ酸位置においてロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV Fをコードするヌクレオチド配列、(2)NDV NPをコードするヌクレオチド配列、(3)NDV Pをコードするヌクレオチド配列、(4)NDV Mをコードするヌクレオチド配列、(5)NDV HNをコードするヌクレオチド配列、(6)NDV Lをコードするヌクレオチド配列、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列であり、ここで、該NDV Fは、LaSota NDV Fのアミノ酸位置289においてロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、該NDVタンパク質は、LaSota NDVタンパク質である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、当技術分野で公知の又は記載されているNDVゲノムのヌクレオチド配列(例えば、第5.1節又は下記の実施例を参照;配列番号1、2、又は25も参照)及び本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列である。ある実施態様において、該核酸配列は、ベクター(例えば、プラスミド、例えば、下記の実施例に記載されているもの)の一部である。具体的な実施態様において、ヌクレオチド配列は単離されている。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される核酸配列又はヌクレオチド配列は、組換え核酸配列又は組換えヌクレオチド配列である。ある実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、DNA分子(例えば、cDNA)、RNA分子、又はDNA分子とRNA分子の組合せであることができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、DNA分子又はRNA分子の類似体を含むことができる。そのような類似体は、例えば、限定されないが、イノシン、メチルシトシン、シュードウリジン、又はトリチル化塩基を含む、ヌクレオチド類似体を用いて作製することができる。そのような類似体は、分子に、例えば、ヌクレアーゼ抵抗性又は細胞膜を横断する増大した能力などの有益な属性を添える修飾された骨格を含むDNA分子又はRNA分子を含むこともできる。該核酸又はヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であることができ、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含有することができ、かつ三本鎖部分を含有することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、マイナスセンス一本鎖RNAである。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、プラスセンス一本鎖RNAである。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、cDNAである。
(5.1.2 SARS-CoV-2スパイクタンパク質/SARS-COoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを有するキメラFタンパク質)
具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用し得るNDVのタイプ及び株については、下の第5.1.1節を参照されたい。SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)に挿入することができる。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)の例示的な配列及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする例示的な核酸配列については、第3.1節と第5.8節の表3とを参照されたい。当業者であれば、そのような配列情報を用いて、任意のNDVタイプ又は株のゲノムに組み込むための導入遺伝子を産生することができる。核酸コードの縮重を考慮すると、同じSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードすることができるいくつかの異なる核酸配列が存在する。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、コドン最適化される。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、配列番号4、6、8、又は10に示される配列を含む核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、配列番号5、7、9、又は11に示される配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、配列番号7又は9に示される配列のSARS-CoV-2スパイクタンパク質部分を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号11に示される配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号11に示される配列を含むアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたものをコードする核酸配列を含む。SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。
具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用し得るNDVのタイプ及び株については、下の第5.1.1節を参照されたい。SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)に挿入することができる。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)の例示的な配列及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする例示的な核酸配列については、第3.1節と第5.8節の表3とを参照されたい。当業者であれば、そのような配列情報を用いて、任意のNDVタイプ又は株のゲノムに組み込むための導入遺伝子を産生することができる。核酸コードの縮重を考慮すると、同じSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードすることができるいくつかの異なる核酸配列が存在する。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、コドン最適化される。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、配列番号4、6、8、又は10に示される配列を含む核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、配列番号5、7、9、又は11に示される配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、配列番号7又は9に示される配列のSARS-CoV-2スパイクタンパク質部分を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号11に示される配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号11に示される配列を含むアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたものをコードする核酸配列を含む。SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。
ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン、及びSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのC-末端アミノ酸残基、又は5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのC-末端アミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン、及びSARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基、又は5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基を含む。
ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS1ドメインを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS1ドメイン、及びSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのC-末端アミノ酸残基、又は5、10、15、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのC-末端アミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS1ドメイン、及びSARS-CoV-2タンパク質の5～15のN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基、又は5～15のN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基を含む。
ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS2ドメインを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS2ドメイン、及びSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのC-末端アミノ酸残基、又は5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのC-末端アミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS2ドメイン、及びSARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基、又は5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基を含む。
ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS1ドメイン及びS2ドメインを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS1ドメイン及びS2ドメイン、並びにSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、又はそれより多くのC-末端アミノ酸残基、又は5、10、15、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、又はそれより多くのC-末端アミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS1ドメイン及びS2ドメイン、並びにSARS-CoV-2タンパク質の5～15のN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基、又は5～15のN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基を含む。
ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン、及びSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのC-末端アミノ酸残基、もしくは5、10、15、もしくはそれより多くのN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5、10、15、20、30、40、50、75、もしくはそれより多くのC-末端アミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン、及びSARS-CoV-2タンパク質の5～15のN-末端アミノ酸残基、SARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基、又は5～15のN-末端アミノ酸残基とSARS-CoV-2タンパク質の5～25、5～50、25～50、25～75、もしくは50～75のC-末端アミノ酸残基を含む。
ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、200、220、222、250、300、350、400、又はそれより多くのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、又はそれより多くのものを含む。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、該タンパク質は、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインをさらに含む。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の断片は、長さが少なくとも1000、1025、1075、1100、1125、1150、1200、又は1215アミノ酸残基である。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、配列番号11に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号10のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号10のヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号10のヌクレオチド配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。当技術分野で公知の方法/技法を用いて、配列同一性(例えば、Sequence Analysis Software Package、バージョン10; Genetics Computer Group社の「Best Fit」又は「Gap」プログラムを参照)を決定することができる。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸と置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む(又は該タンパク質からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む(又は該タンパク質からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む(又は該タンパク質からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)及び別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む(又は該タンパク質からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。具体的な実施態様において、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、該タンパク質の成熟形態である。他の実施態様において、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、該タンパク質の未成熟形態である。保存的アミノ酸置換の例としては、例えば、あるクラスのアミノ酸と同じクラスの別のアミノ酸との置換が挙げられる。特定の実施態様において、保存的置換は、ポリペプチドの構造もしくは機能、又はその両方を変化させない。アミノ酸のクラスとしては、疎水性のもの(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性親水性のもの(Cys、Ser、Thr)、酸性のもの(Asp、Glu)、塩基性のもの(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、立体構造を破壊するもの(Gly、Pro)、及び芳香族のもの(Trp、Tyr、Phe)を挙げることができる。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む(又は該タンパク質からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、C-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む(又は該タンパク質からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む(又は該タンパク質からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。具体的な実施態様において、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、該タンパク質の成熟形態である。他の実施態様において、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、該タンパク質の未成熟形態である。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個の突然変異(例えば、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、又はこれらの組合せ)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む(又は該タンパク質からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸及び1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸置換を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む(又は該タンパク質からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。具体的な実施態様において、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、該タンパク質の成熟形態である。他の実施態様において、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、該タンパク質の未成熟形態である。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。具体的な実施態様において、タンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン及びHisタグ(例えば、(His)n(ここで、nは6である))を含むか又は該ドメインからなる。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクポリペプチドの受容体結合ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質は、分泌型ポリペプチドである。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、配列番号5又は7に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクポリペプチド受容体結合ドメインを含むタンパク質を設計する場合、結果として得られるタンパク質の安定性を維持するように注意する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号4又は6のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号4のヌクレオチド配列からシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を除いたものと少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号4又は6のヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号4又は6のヌクレオチド配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号5又は7のアミノ酸配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号5のアミノ酸配列からシグナル配列を除いたものと少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号5又は7のアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号5又は7のアミノ酸配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。当技術分野で公知の方法/技法を用いて、配列同一性(例えば、Sequence Analysis Software Package、バージョン10; Genetics Computer Group社の「Best Fit」又は「Gap」プログラムを参照)を決定することができる。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸と置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)及び別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。保存的アミノ酸置換の例としては、例えば、あるクラスのアミノ酸と同じクラスの別のアミノ酸との置換が挙げられる。特定の実施態様において、保存的置換は、ポリペプチドの構造もしくは機能、又はその両方を変化させない。アミノ酸のクラスとしては、疎水性のもの(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性親水性のもの(Cys、Ser、Thr)、酸性のもの(Asp、Glu)、塩基性のもの(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、立体構造を破壊するもの(Gly、Pro)、及び芳香族のもの(Trp、Tyr、Phe)を挙げることができる。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、C-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸及びC-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。ある実施態様において、タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。具体的な実施態様において、タンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン及びHisタグ(例えば、(His)n(ここで、nは6である))を含むか又はこれらからなる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、配列番号9に示されるアミノ酸配列又は配列番号9からヒスチジンタグを除いたものをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクポリペプチド)の細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質は、分泌型ポリペプチドである。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクポリペプチド細胞外ドメインを含むタンパク質を設計する場合、結果として得られるタンパク質の安定性を維持するように注意する。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、該タンパク質は、当業者に公知の1以上の四量体化ドメイン(例えば、ヒト四量体化ドメイン)をさらに含む。いくつかの実施態様において、そのようなタンパク質は、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインをさらに含む。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。具体的な実施態様において、タンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン及び四量体化ドメイン、及び任意に、Hisタグ(例えば、(His)n(ここで、nは6である))を含むか又はこれらからなる。ある実施態様において、そのようなタンパク質は、分泌型ポリペプチドである。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクポリペプチド細胞外ドメインを含むタンパク質を設計する場合、結果として得られるタンパク質の安定性を維持するように注意する。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号8のヌクレオチド配列又は配列番号8からヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列を除いたものと少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号8のヌクレオチド配列又は配列番号8からヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列を除いたものと少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号8のヌクレオチド配列又は配列番号8からヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列を除いたものと少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号8又は配列番号8からヒスチジンタグを除いたもののヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号8のヌクレオチド配列からヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列を除いて、かつシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を除いたものと少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号9のアミノ酸配列又は配列番号9からヒスチジンタグを除いたものと少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号9のアミノ酸配列又は配列番号9からヒスチジンタグを除いたものと少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号9のアミノ酸配列又は配列番号9からヒスチジンタグを除いたものと少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号9のアミノ酸配列からヒスチジンタグ及びシグナル配列を除いたものと少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。当技術分野で公知の方法/技法を用いて、配列同一性(例えば、Sequence Analysis Software Package、バージョン10; Genetics Computer Group社の「Best Fit」又は「Gap」プログラムを参照)を決定することができる。ある実施態様において、該タンパク質は、当業者に公知の1以上の四量体化ドメイン(例えば、ヒト四量体化ドメイン)をさらに含む。
当業者に公知の技法を用いて、2つのアミノ酸配列間又は2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性を決定することができる。通常、2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列を最適比較目的で整列させる(例えば、第二のアミノ酸又は核酸配列との最適アラインメントのために、第一のアミノ酸又は核酸配列の配列中にギャップを導入することができる)。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位置が第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、これらの分子はその位置で同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である(すなわち、％同一性＝同一の重複位置の数/位置の総数×100％)。一実施態様において、2つの配列は同じ長さである。ある実施態様において、パーセント同一性は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の全長にわたって決定される。いくつかの実施態様において、配列同一性比較の長さは、比較されている2つの配列の全長(例えば、遺伝子コード配列又はその断片の全長)にわたるものであることができる。いくつかの実施態様において、ヌクレオチド配列の断片は、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、又は少なくとも100ヌクレオチドである。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質又はその断片の全長にわたって、アミノ酸配列について容易に決定することができる。いくつかの実施態様において、タンパク質の断片は、タンパク質の少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、又はそれより多くの連続的なアミノ酸を含む。ある実施態様において、タンパク質の断片は、タンパク質の少なくとも75、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、又はそれより多くの連続的なアミノ酸を含む。
2つの配列(例えば、アミノ酸配列又は核酸配列)間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin及びAltschulの文献、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877に見られるように改変された、Karlin及びAltschulの文献、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschulらの文献、1990, J. Mol. Biol. 215:403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、本明細書に記載される核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、例えば、スコア＝100、ワード長＝12に設定されたNBLASTヌクレオチドプログラムパラメータを用いて実施することができる。BLASTタンパク質検索は、本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、例えば、スコア＝50、ワード長＝3に設定されたXBLASTプログラムパラメータを用いて実施することができる。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップBLASTを、Altschulらの文献、1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402に記載されている通りに利用することができる。或いは、PSI BLASTを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる(同上)。BLAST、ギャップBLAST、及びPSI Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの(例えば、XBLAST及びNBLASTの)デフォルトパラメータを使用することができる(例えば、ワールドワイドウェブ、ncbi.nlm.nih.govのNational Center for Biotechnology Information(NCBI)を参照)。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers及びMillerの文献、1988, CABIOS 4: 11 17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を使用することができる。
2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容する又は許容しない、上記の技法と同様の技法を用いて決定することができる。パーセント同一性を計算する際、通常、正確な一致のみをカウントする。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸と置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)及び別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。保存的アミノ酸置換の例としては、例えば、あるクラスのアミノ酸と同じクラスの別のアミノ酸との置換が挙げられる。特定の実施態様において、保存的置換は、ポリペプチドの構造もしくは機能、又はその両方を変化させない。アミノ酸のクラスとしては、疎水性のもの(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性親水性のもの(Cys、Ser、Thr)、酸性のもの(Asp、Glu)、塩基性のもの(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、立体構造を破壊するもの(Gly、Pro)、及び芳香族のもの(Trp、Tyr、Phe)を挙げることができる。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。ある実施態様において、該タンパク質は、当業者に公知の1以上の四量体化ドメイン(例えば、ヒト四量体化ドメイン)をさらに含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸置換を有し、かつ欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、C-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。ある実施態様において、該タンパク質は、当業者に公知の1以上の四量体化ドメイン(例えば、ヒト四量体化ドメイン)をさらに含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、C-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。ある実施態様において、該タンパク質は、当業者に公知の1以上の四量体化ドメイン(例えば、ヒト四量体化ドメイン)をさらに含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個の突然変異(例えば、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、又はこれらの組合せ)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸置換を有し、かつ欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを含む(又は該ドメインからなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。ある実施態様において、該タンパク質は、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。1以上のポリペプチドドメインは、C-末端又はN-末端にあることができる。具体的な実施態様において、1以上のポリペプチドドメインは、C-末端にある。有用なポリペプチドドメインとしては、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメインが挙げられる。例えば、Hisタグ(His-His-His-His-His-His)、FLAGエピトープ、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるタンパク質の精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより大きい)を有する。一実施態様において、Hisタグは、配列(His)n(ここで、nは6である)を有する。ある実施態様において、該タンパク質は、当業者に公知の1以上の四量体化ドメイン(例えば、ヒト四量体化ドメイン)をさらに含む。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、導入遺伝子である。すなわち、該NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインはキメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含まないように、該、SARS-CoV-2スパイクタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに置き換わっている。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位(RRAR)のアミノ酸残基は、単一のアラニンと置換されている)。SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインは、当業者に公知の技法を用いて決定することができる。例えば、公開情報、GenBankもしくはウェブサイト、例えば、VIPRウイルス病原体ウェブサイト(www.viprbrc.org)、DTU Bioinformatics領域ウェブサイト(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、又は膜貫通ドメインを決定するために利用可能なプログラムを用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを決定することができる。例えば、NDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインが示されている、下の表2を参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつ該導入遺伝子が配列番号12のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、導入遺伝子である。好ましい実施態様において、導入遺伝子は、キメラFタンパク質をコードする核酸配列のコドン最適化バージョンを含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子は、配列番号13に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質が、C-末端の1、2、3、4、5、6、7、8個、又はそれより多くのアミノ酸残基を付加又は削除したSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、導入遺伝子である。すなわち、キメラFタンパク質によってコードされるSARS-CoV-2スパイクタンパク質の部分は、全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含まない。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位(RRAR)のアミノ酸残基は、単一のアラニンと置換されている)。SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインは、当業者に公知の技法を用いて決定することができる。例えば、公開情報、GenBankもしくはウェブサイト、例えば、VIPRウイルス病原体ウェブサイト(www.viprbrc.org)、DTU Bioinformatics領域ウェブサイト(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、又は膜貫通ドメインを決定するために利用可能なプログラムを用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを決定することができる。例えば、NDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインが示されている、下の表2を参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号12のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号12のヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号12のヌクレオチド配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。当技術分野で公知の方法/技法を用いて、配列同一性(例えば、Sequence Analysis Software Package、バージョン10; Genetics Computer Group社の「Best Fit」又は「Gap」プログラムを参照)を決定することができる。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸と置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)及び別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。他の実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに直接融合されている。保存的アミノ酸置換の例としては、例えば、あるクラスのアミノ酸と同じクラスの別のアミノ酸との置換が挙げられる。特定の実施態様において、保存的置換は、ポリペプチドの構造もしくは機能、又はその両方を変化させない。アミノ酸のクラスとしては、疎水性のもの(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性親水性のもの(Cys、Ser、Thr)、酸性のもの(Asp、Glu)、塩基性のもの(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、立体構造を破壊するもの(Gly、Pro)、及び芳香族のもの(Trp、Tyr、Phe)を挙げることができる。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、C-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、N-末端から欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。他の実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個の突然変異(例えば、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸付加、又はこれらの組合せ)を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸置換を有し、かつ欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有するSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン、並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。他の実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、導入遺伝子である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインは、当業者に公知の技法を用いて決定することができる。例えば、公開情報、GenBankもしくはウェブサイト、例えば、VIPRウイルス病原体ウェブサイト(www.viprbrc.org)、DTU Bioinformatics領域ウェブサイト(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、又は膜貫通ドメインを決定するために利用可能なプログラムを用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを決定することができる。例えば、NDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインが示されている、下の表2を参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号14のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、導入遺伝子である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号16のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、導入遺伝子である。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号18のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、導入遺伝子である。好ましい実施態様において、導入遺伝子は、キメラFタンパク質をコードする核酸配列のコドン最適化バージョンを含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子は、配列番号15に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子は、配列番号17に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子は、配列番号19に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号14のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号14のヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号14のヌクレオチド配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。当技術分野で公知の方法/技法を用いて、配列同一性(例えば、Sequence Analysis Software Package、バージョン10; Genetics Computer Group社の「Best Fit」又は「Gap」プログラムを参照)を決定することができる。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号16のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号16のヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号16のヌクレオチド配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。当技術分野で公知の方法/技法を用いて、配列同一性(例えば、Sequence Analysis Software Package、バージョン10; Genetics Computer Group社の「Best Fit」又は「Gap」プログラムを参照)を決定することができる。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号18のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号18のヌクレオチド配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号18のヌクレオチド配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む(又は該アミノ酸配列からなる)タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。当技術分野で公知の方法/技法を用いて、配列同一性(例えば、Sequence Analysis Software Package、バージョン10; Genetics Computer Group社の「Best Fit」又は「Gap」プログラムを参照)を決定することができる。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み(又は該ドメインからなり)、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、配列番号9、Hisタグを含まない配列番号9、又はHisタグ及びシグナル配列を含まない配列番号9のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み(又は該ドメインからなり)、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含まない、配列番号13のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み(又はガイドメインからなり)、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含まない、配列番号15のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み(又は該ドメインからなり)、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含まない、配列番号17のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み(又は該ドメインからなり)、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含まない、配列番号19のヌクレオチド配列と少なくとも85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を含む、導入遺伝子である。ある実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、別のアミノ酸と置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有し、かつ多塩基性切断部位(例えば、単一のアラニンと置換された多塩基性ドメイン(RRAR)のアミノ酸残基)を欠き、かつGenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されている、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有し、かつ多塩基性切断部位(例えば、単一のアラニンと置換された多塩基性ドメイン(RRAR)のアミノ酸残基)を欠き、かつGenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されている、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有し、かつ多塩基性切断部位(例えば、単一のアラニンと置換された多塩基性ドメイン(RRAR)のアミノ酸残基)を欠き、かつGenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されている、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、別のアミノ酸とC-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有し、別のアミノ酸とN-末端で置換された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸(例えば、保存的アミノ酸置換)を有し、かつ多塩基性切断部位(例えば、単一のアラニンと置換された多塩基性ドメイン(RRAR)のアミノ酸残基)を欠き、かつGenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されている、導入遺伝子である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。他の実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに直接融合されている。保存的アミノ酸置換の例としては、例えば、あるクラスのアミノ酸と同じクラスの別のアミノ酸との置換が挙げられる。特定の実施態様において、保存的置換は、ポリペプチドの構造もしくは機能、又はその両方を変化させない。アミノ酸のクラスとしては、疎水性のもの(Met、Ala、Val、Leu、Ile)、中性親水性のもの(Cys、Ser、Thr)、酸性のもの(Asp、Glu)、塩基性のもの(Asn、Gln、His、Lys、Arg)、立体構造を破壊するもの(Gly、Pro)、及び芳香族のもの(Trp、Tyr、Phe)を挙げることができる。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、アミノ酸残基682～685(RRAR)は、単一のアラニンと置換されている)。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個の欠失したアミノ酸を有し、かつ多塩基性切断部位(例えば、単一のアラニンと置換された多塩基性ドメイン(RRAR)のアミノ酸残基)を欠き、かつGenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されている、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、欠失したC-末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有し、かつ多塩基性切断部位(例えば、単一のアラニンと置換された多塩基性ドメイン(RRAR)のアミノ酸残基)を欠き、かつGenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されている、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、欠失したN-末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有し、かつ多塩基性切断部位(例えば、単一のアラニンと置換された多塩基性ドメイン(RRAR)のアミノ酸残基)を欠き、かつGenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されている、導入遺伝子である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。他の実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個の突然変異(例えば、アミノ酸置換、アミノ酸付加、アミノ酸欠失、又はこれらの組合せ)を有し、かつ多塩基性切断部位(例えば、単一のアラニンと置換された多塩基性ドメイン(RRAR)のアミノ酸残基)を欠き、かつGenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されている、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む(又は該ドメインからなる)キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸置換、欠失した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のアミノ酸を有し、かつ多塩基性切断部位(例えば、単一のアラニンと置換された多塩基性ドメイン(RRAR)のアミノ酸残基)を欠き、かつGenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されている、導入遺伝子である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。他の実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、高い、中等度の、又は通常のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号4、6、8、10、12、又は14に示される核酸配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、高い、中等度～通常のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号5、7、9、11、13、又は15に示されるタンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である(例えば、米国特許出願第2005/0048549号、例えば、段落72及び73)を参照されたい。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、高い、中等度の、又は通常のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号16又は18に示される核酸配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、高い、中等度～通常のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、配列番号17又は19に示されるタンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である(例えば、米国特許出願第2005/0048549号、例えば、段落72及び73)を参照されたい。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、高い、中等度の、又は通常のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、Hisタグを除いた配列番号8に示される核酸配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、高い、中等度～通常のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、Hisタグを除いた配列番号9に示されるタンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子である。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知である(例えば、米国特許出願第2005/0048549号、例えば、段落72及び73)を参照されたい。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該SARS-CoV-2細胞外ドメインが、配列番号13、15、17、又は19に示されるアミノ酸配列のSARS-CoV-2細胞外ドメインである、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該SARS-CoV-2細胞外ドメインが、配列番号13、15、17、又は19に示されるアミノ酸配列のSARS-CoV-2細胞外ドメインと少なくとも85％、少なくとも90％、又は少なくとも95％同一である、導入遺伝子である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該SARS-CoV-2細胞外ドメインが、配列番号13、15、17、又は19に示されるアミノ酸配列のSARS-CoV-2細胞外ドメインと少なくとも95％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一である、導入遺伝子である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインは、当業者に公知の技法を用いて決定することができる。例えば、公開情報、GenBankもしくはウェブサイト、例えば、VIPRウイルス病原体ウェブサイト(www.viprbrc.org)、DTU Bioinformatics領域ウェブサイト(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、又は膜貫通ドメインを決定するために利用可能なプログラムを用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを決定することができる。例えば、NDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインが示されている、下の表2を参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列又はその部分を含む導入遺伝子であって、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分が、例えば、GISAIDに開示されている、SARS-CoV-2変異体のSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分である、導入遺伝子である。具体的な実施態様において、下の表6又は表7に見られるSARS-CoV-2変異体のうちの1つのSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質の細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、導入遺伝子である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインは、当業者に公知の技法を用いて決定することができる。例えば、公開情報、GenBankもしくはウェブサイト、例えば、VIPRウイルス病原体ウェブサイト(www.viprbrc.org)、DTU Bioinformatics領域ウェブサイト(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、又は膜貫通ドメインを決定するために利用可能なプログラムを用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを決定することができる。例えば、NDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインが示されている、下の表2を参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDVゲノムの転写ユニットと同じNDV株に由来するものである。具体的な実施態様において、NDVゲノムは、LaSota株のものである。
別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質の細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、導入遺伝子である。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。SARS-CoV-2変異体としては、GISAIDデータベースに見られるか又は本明細書に記載されるものが挙げられる。SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインは、当業者に公知の技法を用いて決定することができる。例えば、公開情報、GenBankもしくはウェブサイト、例えば、VIPRウイルス病原体ウェブサイト(www.viprbrc.org)、DTU Bioinformatics領域ウェブサイト(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、又は膜貫通ドメインを決定するために利用可能なプログラムを用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びNDV Fタンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを決定することができる。例えば、NDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインが示されている、下の表2を参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。
ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体は、B.1.526、B.1.526.1、B.1.525、又はP.2変異体っである。いくつかの実施態様において、SARS-CoV2変異体は、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.427、又はB.1.429変異体である。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下のアミノ酸置換: L5F、T95I、D253G、S477N、E484K、D614G、及びA701Vのうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、アミノ酸置換: T95I、D253G、及びD614Gを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: D80G、Δ144、F157S、L452R、D614G、T791I、T859N*、及びD950Hのうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: D80G、Δ144、F157S、L452R、D614G、及びD950Hを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: A67V、Δ69/70、Δ144、E484K、D614G、Q677H、及びF888.Lのうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: A67V、Δ69/70、Δ144、E484K、D614G、Q677H、及びF888.Lを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: E484K、F565L、D614G、及びV1176Fのうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: E484K、D614G、及びV1176Fを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異:Δ69/70、Δ144、E484K* S494P、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、及びK1191Nのうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異:Δ69/70、Δ144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、及びD1118Hを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、及びT1027Iのうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、及びT1027Iを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: D80A、D215G、Δ241/242/243、K417N、E484K、N501Y、D614G、及びA701Vのうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: D80A、D215G、Δ241/242/243、K417N、E484K、N501Y、D614G、及びA701Vを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: L452R 及びD614Gのうちの一方又は両方を含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: S13I、W152C、L452R、及びD614Gのうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、以下の突然変異: S13I、W152C、L452R、及びD614Gを含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、アミノ酸置換L452Rを含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質は、アミノ酸置換E484Kを含む。
表6: SARS-CoV-2変異体
表7: SARS-CoV-2変異体(出典Sarkarらの文献、2021, Arch Virol. 19: 1-12)
具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)或いはキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、下の実施例(第6節～第10節)に記載されている通りのものである。別の具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)或いはキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節に記載されているものである。
ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、或いはキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、NDV調節シグナル(例えば、遺伝子末端、遺伝子間、及び遺伝子開始配列)並びにKozak配列を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、或いはキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、NDV調節シグナル(例えば、遺伝子末端、遺伝子間、及び遺伝子開始配列)、Kozak配列、並びにクローニングを容易にするための制限部位を含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、或いはキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子は、NDV調節シグナル(遺伝子末端、遺伝子間、及び遺伝子開始配列)、Kozak配列、クローニングを容易にするための制限部位、並びに6のルールの順守を保証するための非コード領域中の追加のヌクレオチドを含む。例えば、使用され得る制限配列(SacII)、遺伝子末端配列、遺伝子開始配列、及びKozak配列の例については、配列番号20～23を参照されたい。好ましい実施態様において、導入遺伝子は、6のルールに従う。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子は、単離されている。
(5.1.3 SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインを有するキメラFタンパク質をコードする組換えNDV)
一態様において、本明細書に提示されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(「NDV」)であって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子を含む、組換えニューカッスル病ウイルスである。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12節を参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、NDVビリオンに組み込まれる。別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSAR-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)。すなわち、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含まないように、SARS-CoV-2スパイクタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに置き換わっている。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。他の実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDV骨格と同じNDVの株に由来するものである。例えば、NDV骨格がNDV LaSotaである場合、キメラFタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインは、NDV LaSota膜貫通及び細胞質ドメインである。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12を参照されたい。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、NDVビリオンに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現され、かつキメラFタンパク質は、NDVビリオンに組み込まれる。
一態様において、本明細書に提示されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(「NDV」)であって、該パッケージングされたゲノムがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子を含む、組換えニューカッスル病ウイルスである。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12節を参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。ある実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)は、NDVビリオンに組み込まれる。別の実施態様において、本明細書に記載されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSAR-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)、組換えNDVである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)。すなわち、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含まないように、SARS-CoV-2スパイクタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに置き換わっている。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。他の実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、NDV骨格と同じNDVの株に由来するものである。例えば、NDV骨格がNDV LaSotaである場合、キメラFタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインは、NDV LaSota膜貫通及び細胞質ドメインである。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12を参照されたい。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現される。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、NDVビリオンに組み込まれる。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、組換えNDVに感染した細胞によって発現され、かつキメラFタンパク質は、NDVビリオンに組み込まれる。
具体的な実施態様において、組換えNDVは、下の実施例(第6節～第10節)に記載されている通りのものである。具体的な実施態様において、組換えNDVは、下の第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節に記載されているNDVのうちの1つである。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、複製可能である。他の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、例えば、第10節に記載されているように、不活化されている。
ある実施態様において、組換えNDVのゲノムは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)以外の異種タンパク質をコードする異種配列を含まない。いくつかの実施態様において、組換えNDVのゲノムは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子以外の導入遺伝子を含まない。ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、ここで、該ゲノムは、NDVに見られる遺伝子及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子を含む。すなわち、組換えNDVは、NDV Fタンパク質とSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)の両方をコードする。ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、ここで、該ゲノムは、NDVに見られる遺伝子、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子(例えば、第5.1.4節のものを参照)を含むが、別の他の導入遺伝子を含まない。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、ここで、該ゲノムは、NDVに見られる遺伝子及びSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子を含むが、任意の他の導入遺伝子を含まない。
いくつかの実施態様において、NDVのパッケージングされたゲノムは、キメラFタンパク質をコードし、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む。ある実施態様において、NDVのパッケージングされたゲノムは、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)。いくつかの実施態様において、NDVのパッケージングされたゲノムは、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基は、プロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。他の実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに直接融合されている。ある実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、キメラFタンパク質以外の異種タンパク質をコードする異種配列を含まない。いくつかの実施態様において、該組換えNDVのゲノムは、キメラFタンパク質をコードする本明細書に記載される導入遺伝子以外の導入遺伝子を含まない。好ましい実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、パッケージングされたゲノムを含み、ここで、該ゲノムは、は、NDVに見られる遺伝子及びキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。すなわち、組換えNDVは、NDV Fタンパク質とキメラFタンパク質の両方をコードする。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるキメラFタンパク質を含むNDVビリオンである。例えば、組換えNDVのビリオンに組み込まれ得るキメラFタンパク質の例については、第5.1.2節及び実施例(例えば、第10節又は第12節)を参照されたい。具体的な実施態様において、NDVビリオンは、組換え産生される。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をそのビリオン中に含む組換えNDVであって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDVである。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号13に示されるアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、キメラFタンパク質をそのビリオン中に含む組換えNDVであって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDVである。SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンと置換されている結果として、多塩基性切断部位を欠いていてもよい。ある実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、リンカー配列(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに融合されている。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号15に示されるアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号17に示されるアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、配列番号19に示されるアミノ酸配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも98％、又は少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。
(5.1.4 SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質)
具体的な実施態様において、SARS-CoV-2タンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。任意のSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)に組み込まれ得る。当業者であれば、そのような配列情報を用いて、任意のNDVタイプ又は株のゲノムへの組み込みのための導入遺伝子を産生することができる。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。
具体的な実施態様において、SARS-CoV-2タンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株のゲノムに組み込まれる。例えば、使用され得るNDVのタイプ及び株については、上の第5.1.1節を参照されたい。任意のSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意のNDVタイプ又は株(例えば、NDV LaSota株)に組み込まれ得る。当業者であれば、そのような配列情報を用いて、任意のNDVタイプ又は株のゲノムへの組み込みのための導入遺伝子を産生することができる。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化されている。例えば、コドン最適化に関する考察については、下の第5.1.5節を参照されたい。SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子は、任意の2つのNDV転写ユニットの間(例えば、NDV P転写ユニットとNDV M転写ユニットの間、又はHN転写ユニットとL転写ユニットの間)に組み込まれ得る。
ある実施態様において、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子は、NDV調節シグナル(例えば、遺伝子末端、遺伝子間、及び遺伝子開始配列)並びにKozak配列を含む。いくつかの実施態様において、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードする導入遺伝子は、NDV調節シグナル(例えば、遺伝子末端、遺伝子間、及び遺伝子開始配列)、Kozak配列、並びにクローニングを容易にするための制限部位を含む。ある実施態様において、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードする導入遺伝子は、NDV調節シグナル(遺伝子末端、遺伝子間、及び遺伝子開始配列)、Kozak配列、クローニングを容易にするための制限部位、並びに6のルールの順守を保証するための非コード領域中の追加のヌクレオチドを含む。好ましい実施態様において、該導入遺伝子は、6のルールに従う。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される導入遺伝子は、単離されている。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV P転写ユニット、(4)NDV M転写ユニット、(5)NDV HN転写ユニット、(6)NDV L転写ユニット、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列である。ある実施態様において、NDV転写ユニットは、LaSota NDV転写ユニットである。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV P転写ユニット、(4)NDV M転写ユニット、(5)NDV HN転写ユニット、(6)NDV L転写ユニット、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列であり、ここで、該NDV F転写ユニットは、LaSota NDV Fタンパク質のアミノ酸位置289に対応するアミノ残基においてロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を有するNDV Fタンパク質をコードする。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV P転写ユニット、(4)NDV M転写ユニット、(5)NDV HN転写ユニット、(6)NDV L転写ユニット、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列であり、ここで、該NDV F転写ユニットは、LaSota NDV Fタンパク質のアミノ酸位置289においてロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を有するNDV Fタンパク質をコードする。ある実施態様において、NDV転写ユニットは、LaSota NDV転写ユニットである。ある実施態様において、該核酸配列は、ベクター(例えば、プラスミド、例えば、下記の実施例に記載されているもの)の一部である。具体的な実施態様において、該核酸配列は、単離されている。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV Fをコードするヌクレオチド配列、(2)NDV NPをコードするヌクレオチド配列、(3)NDV Pをコードするヌクレオチド配列、(4)NDV Mをコードするヌクレオチド配列、(5)NDV HNをコードするヌクレオチド配列、(6)NDV Lをコードするヌクレオチド配列、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV Fをコードするヌクレオチド配列、(2)NDV NPをコードするヌクレオチド配列、(3)NDV Pをコードするヌクレオチド配列、(4)NDV Mをコードするヌクレオチド配列、(5)NDV HNをコードするヌクレオチド配列、(6)NDV Lをコードするヌクレオチド配列、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列であり、ここで、該NDV Fは、LaSota NDV Fのアミノ残基289に対応するアミノ酸位置においてロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、(1)NDV Fをコードするヌクレオチド配列、(2)NDV NPをコードするヌクレオチド配列、(3)NDV Pをコードするヌクレオチド配列、(4)NDV Mをコードするヌクレオチド配列、(5)NDV HNをコードするヌクレオチド配列、(6)NDV Lをコードするヌクレオチド配列、及び(7)本明細書に記載される導入遺伝子を含む核酸配列であり、ここで、該NDV Fは、LaSota NDV Fのアミノ酸位置289においてロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、NDVタンパク質は、LaSota NDVタンパク質である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、当技術分野で公知の又は記載されているNDVゲノム(例えば、第5.1節又は下記の実施例を参照;配列番号1、2、又は25も参照)及び本明細書に記載される導入遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸配列である。ある実施態様において、該核酸配列は、ベクター(例えば、プラスミド、例えば、下記の実施例に記載されているもの)の一部である。具体的な実施態様において、該ヌクレオチド配列は、単離されている。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される核酸配列又はヌクレオチド配列は、組換え核酸配列又は組換えヌクレオチド配列である。ある実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、DNA分子(例えば、cDNA)、RNA分子、又はDNA分子とRNA分子の組合せであり得る。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、DNA分子又はRNA分子の類似体を含むことができる。そのような類似体は、例えば、限定されないが、イノシン、メチルシトシン、シュードウリジン、又はトリチル化塩基を含む、ヌクレオチド類似体を用いて作製することができる。そのような類似体は、分子に、例えば、ヌクレアーゼ抵抗性又は細胞膜を横断する増大した能力などの有益な属性を添える修飾された骨格を含むDNA分子又はRNA分子を含むこともできる。該核酸又はヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であることができ、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含有することができ、かつ三本鎖部分を含有することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、マイナスセンス一本鎖RNAである。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、プラスセンス一本鎖RNAである。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又は核酸配列は、cDNAである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドをそのビリオン中に含む組換えNDVである。
(5.1.5 コドン最適化)
当業者に公知の任意のコドン最適化技法を用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのドメイン(例えば、その細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする核酸配列をコドン最適化することができる。同様に、任意のコドン最適化技法を用いて、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸配列をコドン最適化することができる。コドン最適化の方法は、当技術分野で公知であり、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、OptimumGene(商標)(GenScript(登録商標))プロトコル及びGenewiz(登録商標)プロトコルがある。コドン最適化の方法については、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第8,326,547号も参照されたい。
当業者に公知の任意のコドン最適化技法を用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのドメイン(例えば、その細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする核酸配列をコドン最適化することができる。同様に、任意のコドン最適化技法を用いて、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸配列をコドン最適化することができる。コドン最適化の方法は、当技術分野で公知であり、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、OptimumGene(商標)(GenScript(登録商標))プロトコル及びGenewiz(登録商標)プロトコルがある。コドン最適化の方法については、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第8,326,547号も参照されたい。
例示的なコドン最適化の方法として、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はそのドメイン(例えば、その細胞外ドメインもしくは受容体結合タンパク質)、或いはSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸配列のオープンフレーム中の各々のコドンは、哺乳動物タンパク質で最も頻繁に使用されるコドンによって置き換えられる。これは、植物遺伝子研究部(Department of Plant Gene Research in Kazusa, Japan)によって維持されているコドン利用データベース(Codon Usage Database)を使用するウェブベースのプログラム(www.encorbio.com/protocols/Codon.htm)を用いて行うことができる。哺乳動物発現用に最適化されたこの核酸配列を、(1)転写終結因子として作用し得る5以上のAのストレッチの存在;(2)サブクローニングを妨害し得る制限部位の存在;(3)6のルールの順守:について検査することができる。検査後、(1)転写終結因子として作用し得る5以上のAのストレッチを同義突然変異によって置き換えることができ;(2)サブクローニングを妨害し得る制限部位を同義突然変異によって置き換えることができ;(3)最適なタンパク質発現のためのNDV調節シグナル(遺伝子末端、遺伝子間、及び遺伝子開始配列)並びにKozak配列を付加することができ;かつ(4)ヌクレオチドを非コード領域中に付加して、6のルールの順守を保証することができる。同義突然変異は、通常、コードされるアミノ酸を変化させないヌクレオチド変化である。例えば、配列がLys-Lysをコードする6個のAのストレッチ(AAAAAA)の場合、同義配列はAAGAAGであり、この配列もLys-Lysをコードする。
(5.2 NDVの構築)
本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節並びに第6節、第7節、第9節、第10節、第11節、及び第12節を参照)は、リバースジェネティックス技法を用いて作製することができる。リバースジェネティックス技法は、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟ビリオンを生成させるのに必要なシグナルのパッケージングに不可欠なマイナス鎖のウイルスRNAの非コード領域を含む合成組換えウイルスRNAの調製を伴う。該組換えRNAは、組換えDNA鋳型から合成され、精製ウイルスポリメラーゼ複合体とともにインビトロで再構築されて、細胞にトランスフェクトするのに使用することができる組換えリボヌクレオタンパク質(RNP)を形成する。より効率的なトランスフェクションは、ウイルスポリメラーゼタンパク質がインビトロ又はインビボのどちらかにおける合成RNAの転写中に存在する場合に達成される。合成組換えRNPは、感染性ウイルス粒子中にレスキューすることができる。前述の技法は、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、1992年11月24日に発行された米国特許第5,166,057号; 1998年12月29日に発行された米国特許第5,854,037号; 2000年11月14日に発行された米国特許第6,146,642号; 1996年2月20日に公開された欧州特許公開EP 0702085A1号;米国特許出願第09/152,845号; 1997年4月3日に公開された国際特許公開PCT WO97/12032号; 1996年11月7日に公開されたWO96/34625号;欧州特許公開EP A780475号; 1999年1月21日に公開されたWO 99/02657号; 1998年11月26日に公開されたWO 98/53078号; 1998年1月22日に公開されたWO 98/02530号; 1999年4月1日に公開されたWO 99/15672号; 1998年4月2日に公開されたWO 98/13501号; 1997年2月20日に公開されたWO 97/06270号;及び1997年6月25日に公開されたEPO 780 475A1号に記載されている。
本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節並びに第6節、第7節、第9節、第10節、第11節、及び第12節を参照)は、リバースジェネティックス技法を用いて作製することができる。リバースジェネティックス技法は、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟ビリオンを生成させるのに必要なシグナルのパッケージングに不可欠なマイナス鎖のウイルスRNAの非コード領域を含む合成組換えウイルスRNAの調製を伴う。該組換えRNAは、組換えDNA鋳型から合成され、精製ウイルスポリメラーゼ複合体とともにインビトロで再構築されて、細胞にトランスフェクトするのに使用することができる組換えリボヌクレオタンパク質(RNP)を形成する。より効率的なトランスフェクションは、ウイルスポリメラーゼタンパク質がインビトロ又はインビボのどちらかにおける合成RNAの転写中に存在する場合に達成される。合成組換えRNPは、感染性ウイルス粒子中にレスキューすることができる。前述の技法は、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、1992年11月24日に発行された米国特許第5,166,057号; 1998年12月29日に発行された米国特許第5,854,037号; 2000年11月14日に発行された米国特許第6,146,642号; 1996年2月20日に公開された欧州特許公開EP 0702085A1号;米国特許出願第09/152,845号; 1997年4月3日に公開された国際特許公開PCT WO97/12032号; 1996年11月7日に公開されたWO96/34625号;欧州特許公開EP A780475号; 1999年1月21日に公開されたWO 99/02657号; 1998年11月26日に公開されたWO 98/53078号; 1998年1月22日に公開されたWO 98/02530号; 1999年4月1日に公開されたWO 99/15672号; 1998年4月2日に公開されたWO 98/13501号; 1997年2月20日に公開されたWO 97/06270号;及び1997年6月25日に公開されたEPO 780 475A1号に記載されている。
ヘルパーフリープラスミド技術を用いて、本明細書に記載されるNDVを改変することもできる。簡潔に述べると、NDV(例えば、Hitchner B1株又はLaSota株)の完全なcDNAを構築し、プラスミドベクターに挿入し、2つの転写ユニット(例えば、NDV P遺伝子とNDV M遺伝子;又はNDV HN遺伝子とNDV L遺伝子)の間にユニークな制限部位を含むように改変することができる。異種アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載される導入遺伝子又は他の配列、例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列、キメラFタンパク質、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質など)を該ユニークな制限部位でウイルスゲノムに挿入することができる。或いは、挿入がウイルスの感染及び複製能力に影響を及ぼさない限り、異種アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載される導入遺伝子又は他の配列、例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメインをコードするヌクレオチド配列など)を改変して、NDV転写ユニット中に挿入することができる。単一のセグメントをT7プロモーターとδ型肝炎ウイルスリボザイムの間に位置付けて、T7ポリメラーゼから正確なマイナス又はプラスの転写物を生成させる。必要なウイルスタンパク質を含むプラスミドベクター及び発現ベクターを細胞にトランスフェクトして、組換えウイルス粒子の産生をもたらす(例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 01/04333号;米国特許第7,442,379号、第6,146,642号、第6,649,372号、第6,544,785号、及び第7,384,774号; Swayneらの文献(2003). Avian Dis. 47:1047-1050;並びにSwayneらの文献(2001). J. Virol. 11868-11873を参照)。
単一のmRNAから多数のタンパク質を産生する二シストロン性技法は当業者に公知である。二シストロン性技法は、IRES配列の使用により、多数のタンパク質のコード配列を単一のmRNAに改変することを可能にする。IRES配列は、RNA分子へのリボゾームの内部動員を誘導し、キャップ非依存的な様式での下流の翻訳を可能にする。簡潔に述べると、あるタンパク質のコード領域を第二のタンパク質のORFの下流に挿入する。挿入の両隣に、IRESと適切な発現及び/又は機能に必要な任意の非翻訳シグナル配列とを配置する。挿入は、第二のタンパク質のオープンリーディングフレームも、ポリアデニル化も、転写プロモーターも破壊してはいけない(例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Garcia-Sastreらの文献、1994, J. Virol. 68:6254-6261及びGarcia-Sastreらの文献、1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246を参照されたい)。
導入遺伝子をコードし、該導入遺伝子によってコードされる異種タンパク質(例えば、導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、キメラFタンパク質、又はSARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードするヌクレオチド配列を含む)を発現する組換えNDVをクローニングする方法は、当業者に公知であり、例えば、NDVゲノムへと改変されている制限部位への導入遺伝子の挿入、NDV RNA依存性RNAポリメラーゼによる認識のための導入遺伝子への適切なシグナル(例えば、NDVポリメラーゼが前の遺伝子の末端及び導入遺伝子の先頭を認識するのを可能にする導入遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にある配列、これは、例えば、単一ヌクレオチド遺伝子間配列によって間隔が空けられていてもよい)の包含、有効なKozak配列の包含(例えば、真核生物リボソーム翻訳を向上させるためのもの); NDVクローニングについての「6のルール」を満たす導入遺伝子の組み入れ;並びに導入遺伝子内の外来遺伝子末端及び/又は遺伝子開始配列を除去するためのサイレント突然変異の包含などがある。6のルールに関して、当業者は、NDV(及びより一般的には、パラミクソウイルス科ファミリーのほとんどのメンバー)の効率的な複製が、「6のルール」として知られる、6の倍数であるゲノム長に依存的であることを理解するであろう(例えば、Calain, P.及びRoux, L.の文献、6のルール、センダイウイルス欠損干渉RNAの効率的な複製の基本的特徴(The rule of six, a basic feature of efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.)、J. Virol. 67, 4822-4830(1993))。したがって、本明細書に記載される組換えNDVを構築する場合、NDVクローニングについての「6のルール」を満たすように注意を払うべきである。NDVクローニングについての6のルールを満たす当業者に公知の方法を使用することができ、これには、例えば、導入遺伝子の下流のヌクレオチドの付加などがある。NDV(例えば、組換えNDV)のクローニング及びレスキューの方法の考察については、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、例えば、Ayllonらの文献、cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー(Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA.)、J. Vis. Exp.(80), e50830, doi:10.3791/50830(2013)を参照されたい。
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDV(例えば、第5.1節及び第6～12節を参照)は、下の第6～10節及び第12節に記載されている方法に従って作製することができる。
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVは、LaSota株骨格を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVは、例えば、第6節、第7節、第9節、第10節、又は第12節に記載されているLaSota株骨格を含む。具体的な実施態様において、LaSota株骨格の(すなわち、導入遺伝子を含まない)ゲノム配列は、配列番号1に示されている通りである。具体的な実施態様において、La Sota株骨格の(すなわち、導入遺伝子を含まない)ゲノム配列は、配列番号25に示されている通りである。当業者であれば、NDVのゲノムがマイナスセンスかつ一本鎖であることを認識しているであろう。配列番号1及び25は、cDNA配列を提供している。
具体的な実施態様において、本明細書に記載されるSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVは、LaSota株骨格を含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載されるSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVは、例えば、第6節、第7節、第9節、第10節、又は第12節に記載されているLaSota株骨格を含む。具体的な実施態様において、LaSota株骨格の(すなわち、導入遺伝子を含まない)ゲノム配列は、配列番号1に示されている通りである。具体的な実施態様において、La Sota株骨格の(すなわち、導入遺伝子を含まない)ゲノム配列は、配列番号25に示されている通りである。当業者であれば、NDVのゲノムがマイナスセンスかつ一本鎖であることを認識しているであろう。配列番号1及び25は、cDNA配列を提供している。
具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする本明細書に記載される導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVは、LaSota株骨格を含む。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質をコードする本明細書に記載される導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVは、例えば、第6節、第7節、第9節、第10節、又は第12節に記載されているLaSota株骨格を含む。具体的な実施態様において、LaSota株骨格の(すなわち、導入遺伝子を含まない)ゲノム配列は、配列番号1に示されている通りである。別の具体的な実施態様において、LaSota株骨格の(すなわち、導入遺伝子を含まない)ゲノム配列は、配列番号25に示されている通りである。当業者であれば、NDVのゲノムがマイナスセンスかつ一本鎖であることを認識しているであろう。配列番号1及び25は、cDNA配列を提供している。
(5.3 NDVの増殖)
本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節及び第6～12節)は、該ウイルスが本明細書に記載されるウイルスの使用を可能にする力価にまで成長するのを可能にする任意の基体で増殖させることができる。一実施態様において、該基体は、本明細書に記載される組換えNDVが対応する野生型ウイルスについて決定された力価と同等の力価にまで成長するのを可能にする。
本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節及び第6～12節)は、該ウイルスが本明細書に記載されるウイルスの使用を可能にする力価にまで成長するのを可能にする任意の基体で増殖させることができる。一実施態様において、該基体は、本明細書に記載される組換えNDVが対応する野生型ウイルスについて決定された力価と同等の力価にまで成長するのを可能にする。
本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節及び第6節～第12節)を、該ウイルスによる感染を起こしやすい細胞(例えば、鳥細胞、ニワトリ細胞など)、有胚卵(例えば、鶏卵もしくはウズラ卵)、又は動物(例えば、鳥類)で成長させることができる。そのような方法は、当業者に周知である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVを、癌細胞、例えば、上皮癌(carcinoma)細胞(例えば、乳癌細胞及び前立腺癌細胞)、肉腫細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、並びに胚細胞腫瘍細胞(例えば、精巣癌細胞及び卵巣癌細胞)で増殖させることができる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVを、細胞株、例えば、癌細胞株、例えば、HeLa細胞、MCF7細胞、THP-1細胞、U87細胞、DU145細胞、Lncap細胞、及びT47D細胞で増殖させることができる。ある実施態様において、該細胞又は細胞株(例えば、癌細胞又は癌細胞株)を、ヒトから入手するか、ヒトから派生させるか、又はヒトから入手し、かつ派生させる。別の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVを、例えば、IFN欠損細胞(例えば、IFN欠損細胞株)又はIFN欠損有胚卵などの、インターフェロン欠損系又はインターフェロン(IFN)欠損基体で増殖させる。別の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVをニワトリ細胞又は有胚鶏卵で増殖させる。代表的なニワトリ細胞としては、ニワトリ胚線維芽細胞及びニワトリ胚腎臓細胞が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVをVero細胞で増殖させる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVを鶏卵又はウズラ卵で増殖させる。ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVウイルスをまず有胚卵で増殖させ、その後、細胞(例えば、細胞株)で増殖させる。
本明細書に記載される組換えNDVを、例えば、6～14日齢、6～12日齢、6～10日齢、6～9日齢、6～8日齢、8～10日齢、9～11日齢、又は10～12日齢の有胚卵(有胚鶏卵)で増殖させることができる。具体的な実施態様において、10日齢の有胚鶏卵を用いて、本明細書に記載される組換えNDVを増殖させる。幼若な又は未成熟な有胚卵(有胚鶏卵)を用いて、本明細書に記載される組換えNDVを増殖させることができる。未成熟な有胚卵は、IFNを欠損している、10日齢未満である卵、例えば、6～9日齢又は6～8日齢の卵を包含する。未成熟な有胚卵は、IFN系が10～12日齢の卵と比較して完全には発達しないような、成長条件の変化、例えば、インキュベーション温度の変化;薬物による処理;又は発育が遅延した卵を生じさせる任意の他の変化の結果として、10日齢までの未成熟卵を人工的に模倣する卵も包含する。本明細書に記載される組換えNDVを、有胚卵の様々な場所、例えば、尿膜腔(例えば、有胚鶏卵の尿膜腔など)で増殖させることができる。ウイルスの成長及び増殖に関する詳細な考察については、例えば、どちらも引用により本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,852,522号及び米国特許第7,494,808号を参照されたい。
具体的な実施態様において、ウイルスを、下記の実施例(例えば、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、又は第12節)のいずれか1つに記載されている通りに増殖させる。
ウイルス単離のために、本明細書に記載される組換えNDVを有胚卵又は細胞培養物から取り出し、通常、例えば、遠心分離、深層濾過、及び精密濾過などの周知の清澄化手順によって、細胞成分から分離することができ、望ましい場合、当業者に周知の手順、例えば、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)、密度勾配遠心分離、差次的抽出、又はクロマトグラフィーを用いて、さらに精製することができる。具体的な実施態様において、ウイルスを、下記の実施例(例えば、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、又は第12節)のいずれか1つに記載されている通りに単離する。
具体的な実施態様において、感染した卵(例えば、鶏卵)の尿膜腔液からのウイルス単離は、尿膜腔液を採取することから始まり、これを、濾過システムを用いて清澄化して、細胞及び他の大きい破片を除去する。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えNDVを含む細胞(例えば、細胞株)又は有胚卵(例えば、有胚鶏卵)である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えNDVを増殖させる方法であって、該組換えNDVに感染した細胞(例えば、細胞株)又は有胚卵(例えば、有胚鶏卵)を培養することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、該方法は、組換えNDVを細胞又は有胚卵から単離及び純化することをさらに含むことができる。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えNDVを増殖させる方法であって、(a)本明細書に記載される組換えNDVに感染した細胞(例えば、細胞株)又は有胚卵を培養すること;及び(b)該細胞又は有胚卵から該組換えNDVを単離することを含む、方法である。該細胞又は有胚卵は、本明細書に記載される又は当業者に公知のものであることができる。いくつかの実施態様において、該細胞又は有胚卵は、IFN欠損性である。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えNDVを含む医薬組成物(例えば、免疫原性組成物)を産生する方法であって、(a)本明細書に記載される組換えNDVを細胞(例えば、細胞株)又は有胚卵で増殖させること;及び(b)該組換えNDVを該細胞又は有胚卵から単離することを含む、方法。該方法は、該組換えNDVを医薬として許容し得る担体と一緒に容器に添加することをさらに含む。
(5.4 組成物及び投与経路)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)を含む組成物である。具体的な実施態様において、該組成物は、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物(例えば、ワクチン組成物)である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)を含む免疫原性組成物である。該組成物は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質に対する免疫応答を誘導する方法において使用することができる。該組成物は、SARS-CoV-2に対する免疫応答を誘導するか又はSARS-CoV-2に対して免疫する方法において使用することができる。該組成物は、COVID-19に対して免疫する方法において使用することができる。該組成物は、COVID-19を予防する方法において使用することができる。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)を含む組成物である。具体的な実施態様において、該組成物は、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物(例えば、ワクチン組成物)である。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)を含む免疫原性組成物である。該組成物は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質に対する免疫応答を誘導する方法において使用することができる。該組成物は、SARS-CoV-2に対する免疫応答を誘導するか又はSARS-CoV-2に対して免疫する方法において使用することができる。該組成物は、COVID-19に対して免疫する方法において使用することができる。該組成物は、COVID-19を予防する方法において使用することができる。
一実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)を含む。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、1以上のさらなる予防剤又は治療剤をさらに含む。具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体中に、有効量の本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)、及び任意に1以上のさらなる予防剤又は治療剤を含む。いくつかの実施態様において、該組換えNDV(例えば、第5.1節、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)は、医薬組成物に含まれる唯一の活性成分である。具体的な実施態様において、2以上の組換えNDVが医薬組成物に含まれる。特定の実施態様において、医薬組成物は、免疫原性組成物である。具体的な実施態様において、本明細書に記載される免疫原性組成物の対象(例えば、ヒト)への投与は、中和抗体(例えば、抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質IgG)を生成させる。ある実施態様において、本明細書に記載される免疫原性組成物の対象(例えば、ヒト)への投与は、COVID-19の発生に対するある程度の防御をもたらす免疫応答を生成させる。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物の対象(例えば、ヒト)への投与は、COVID-19が発生する可能性を、免疫原性組成物を投与されていない同じ種の対象と比べて、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、又は少なくとも95％低下させる、対象における免疫応答を生成させる。
具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、第一の組換えNDV及び第二の組換えNDVを含み、ここで、該第一の組換えNDVは、第一の導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該第一の導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該第二の組換えNDVは、第二の導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該第二の導入遺伝子は、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、第一の組換えNDV及び第二の組換えNDVを含み、ここで、該第一の組換えNDVは、第一の導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該第一の導入遺伝子は、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該第二の組換えNDVは、第二の導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該第二の導入遺伝子は、本明細書に記載されるキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、第一の組換えNDV及び第二の組換えNDVを含み、ここで、該第一の組換えNDVは、第一の導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該第一の導入遺伝子は、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該第二の組換えNDVは、第二の導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、かつここで、該第二の導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含むキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、そのような導入遺伝子をコードする核酸配列については、第5.1節、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節を参照されたい。特定の実施態様において、医薬組成物は、免疫原性組成物である。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物に含まれる組換えNDVは、生ウイルスである。特定の実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物に含まれる組換えNDVは、弱毒化生ウイルスである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物に含まれる組換えNDVは、不活化されている。当業者に公知の任意の技法を用いて、本明細書に記載される組換えNDVを不活化することができる。例えば、ホルマリン又はβ-プロピオラクトンを用いて、本明細書に記載される組換えNDVを不活化することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載される医薬(pharmaceutical)に含まれる組換えNDVは、例えば、下の第10節に記載されている2％β-プロピオラクトン又は当業者に公知の別の技法を用いて不活化される。例えば、ある実施態様において、不活化された濃縮組換えNDVを調製するために、1部の0.5Mリン酸二ナトリウム(DSP)をウイルスに感染した38部の有胚卵の尿膜腔液と混合して、pH安定化することができ、1部の2％β-プロピオラクトン(BPL)を振盪中に混合物に滴加し、氷上で30分間インキュベートし、その後、混合物を37℃の水浴中に約1～3時間入れ、5～30分毎に振盪する。不活化された尿膜腔液を4,000rpmでの遠心分離によって20～40分間清澄化する。具体的な実施態様において、キメラFタンパク質は、下の第10節に記載されている方法を用いて評価したとき、一定の期間、本明細書に記載される不活化された組換えNDV中で安定である。
本明細書に提供される医薬組成物は、該組成物を対象に投与することを可能にする任意の形態であることができる。具体的な実施態様において、該医薬組成物は、獣医学的投与、ヒト投与、又はその両方に好適である。本明細書で使用される場合、「医薬として許容し得る」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局に承認されているか、又は米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、それとともに医薬組成物が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクル体を指す。生理食塩水溶液及び水性デキストロース溶液及びグリセロール溶液は、特に注射用溶液のための液体担体として利用することもできる。好適な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。好適な医薬担体の例は、E. W. Martin著、「レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。製剤は、投与様式に適するべきである。
具体的な実施態様において、医薬組成物は、対象への意図された投与経路に適するように製剤化される。例えば、医薬組成物は、非経口、静脈内、動脈内、胸腔内、吸入、鼻腔内、腹腔内、経口、皮内、結腸直腸、腹腔内、頭蓋内、及び腫瘍内投与に適するように製剤化することができる。一実施態様において、医薬組成物は、静脈内、動脈内、経口、腹腔内、鼻腔内、気管内、胸腔内、頭蓋内、皮下、筋肉内、局所、肺、又は腫瘍内投与用に製剤化することができる。具体的な実施態様において、医薬組成物は、鼻腔内投与用に製剤化することができる。別の実施態様において、医薬組成物は、筋肉内投与用に製剤化することができる。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDV(例えば、第5.1節及び第6～12節を参照)を含む医薬組成物は、対象(例えば、ヒト対象)への鼻腔内投与に好適であるように製剤化される。特定の実施態様において、医薬組成物は、免疫原性組成物である。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物(例えば、本明細書に記載される不活化された組換えNDVを含む医薬組成物)は、アジュバントを含むことができる。ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、アジュバントを含むか、又はアジュバントと組み合わせて投与される。本明細書に記載される組成物と組み合わせて投与するためのアジュバントは、該組成物の投与の前に、該投与と同時に、又は該投与の後に投与することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載される不活化ウイルス免疫原性組成物は、1以上のアジュバントを含む。いくつかの実施態様において、「アジュバント」という用語は、本明細書に記載される組成物と併せて又はその一部として投与されたとき、組換えNDVに対する免疫応答を強化、増強、及び/又はブーストするが、該化合物が単独で投与されたとき、ウイルスに対する免疫応答を生成させない、化合物を指す。いくつかの実施態様において、アジュバントは、組換えNDVに対する免疫応答を生成させ、アレルギー又は他の有害反応を生じさせない。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、B細胞及び/又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含む、いくつかのメカニズムによって、免疫応答を増強することができる。アジュバントの具体的な例としては、アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウム)、3 脱-O-アシル化モノホスホリル脂質A(MPL)(GB 2220211号を参照)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(Tween 80; ICL Americas社)、イミダゾピリジン化合物(国際公開番号WO2007/109812号として公開された国際出願番号PCT/US2007/064857号を参照)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公開番号WO2007/109813号として公開された国際出願番号PCT/US2007/064858号を参照)、並びにQS21などのサポニン(Kensilらの文献、ワクチン設計:サブユニット及びアジュバントアプローチ(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell及びNewman編、Plenum Press, NY, 1995を参照);米国特許第5,057,540号)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、アジュバントは、フロイントのアジュバント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、モノホスホリル脂質Aなどの免疫刺激物質と任意に組み合わせた、水中油型エマルジョン(例えば、スクアレン又はピーナッツ油)である(Stouteらの文献、N. Engl. J. Med. 336, 86-91(1997)を参照)。別のアジュバントは、CpGである(Bioworld Today, Nov. 15, 1998)。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤、例えば、MPLもしくは3-DMP、QS21、ポリマーもしくはモノマーアミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸もしくはポリリジンとともに、又はこれらなしで使用することができる。具体的な実施態様において、アジュバントは、下の第10節に記載されているアジュバントである。ある実施態様において、アジュバントは、リポソーム懸濁液アジュバント(カチオン性脂質DOTAPのR-エナンチオマーであるR-DOTAP)又はMF-59のような水中油型エマルジョンアジュバント(AddaVax)である。いくつかの実施態様において、アジュバントは、toll様受容体9(TLR9)アゴニストアジュバントである。ある実施態様において、アジュバントは、例えば、下の第11節に記載されているCpG 1018である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組成物(例えば、組換え生NDV組成物)は、アジュバントを含有しない。
具体的な実施態様において、医薬組成物(例えば、免疫原性組成物)は、実施例(例えば、第7節、第8節、第9節、又は第10節)に記載されているものである。別の具体的な実施態様において、医薬組成物(例えば、免疫原性組成物)は、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)に記載されているものである。
ある実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物(例えば、免疫原性組成物)は、104～1012 EID50の本明細書に記載される組換えNDVを含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物(例えば、免疫原性組成物)は、本明細書に記載される組換えNDVによって発現される1～15μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物(例えば、免疫原性組成物)は、本明細書に記載される組換えNDVによって発現される1～15マイクログラム/mlのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質を含む。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、2℃～8℃で保存することができる。ある実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、少なくとも1カ月間、少なくとも2カ月間、少なくとも3カ月間、少なくとも4カ月間、少なくとも5カ月間、少なくとも6カ月間、少なくとも9カ月間、又は少なくとも1年間、2℃～8℃で安定である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される医薬組成物は、3～6カ月間、3～9カ月間、6～12カ月間、又は9～12カ月間、2℃～8℃で安定である。ある実施態様において、安定性は、タンパク質変性アッセイ、免疫アッセイ、又はこれらの組合せによって評価される。
(5.5 組換えNDVの使用)
(5.5.1 COVID-19の予防)
本明細書に記載される組換えNDVを用いて、SARS-CoV-2に対して対象を免疫するか、SARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくはヌクレオカプシドタンパク質に対する免疫応答を誘導するか、又はCOVID-19を予防することができる。例えば、本明細書に記載される組換えNDVの使用については、図7を参照されたい。一態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)における免疫応答を誘導するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組換えNDVを含む組成物を投与することを含む、方法である。例えば、組換えNDVの例については、第5.1節及び実施例、並びに組成物については、第5.4節並びに実施例(例えば、第10節及び第11節)を参照されたい。別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)における免疫応答を誘導するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む。別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)における免疫応答を誘導するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインを含む、方法である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位(RRAR)のアミノ酸残基は、単一のアラニンと置換されている)。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対する対象(例えば、ヒト対象)におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)、方法である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～10節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。ある実施態様において、本方法は、該対象に第二の組換えNDVを投与することをさらに含み、ここで、該第二の組換えNDVは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む。
(5.5.1 COVID-19の予防)
本明細書に記載される組換えNDVを用いて、SARS-CoV-2に対して対象を免疫するか、SARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくはヌクレオカプシドタンパク質に対する免疫応答を誘導するか、又はCOVID-19を予防することができる。例えば、本明細書に記載される組換えNDVの使用については、図7を参照されたい。一態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)における免疫応答を誘導するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組換えNDVを含む組成物を投与することを含む、方法である。例えば、組換えNDVの例については、第5.1節及び実施例、並びに組成物については、第5.4節並びに実施例(例えば、第10節及び第11節)を参照されたい。別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)における免疫応答を誘導するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む。別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)における免疫応答を誘導するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインを含む、方法である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位(RRAR)のアミノ酸残基は、単一のアラニンと置換されている)。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対する対象(例えば、ヒト対象)におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)、方法である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～10節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。ある実施態様において、本方法は、該対象に第二の組換えNDVを投与することをさらに含み、ここで、該第二の組換えNDVは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)における免疫応答を誘導するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～10節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.4節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列を含む。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して対象(例えば、ヒト対象)を免疫するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組換えNDVを含む組成物を投与することを含む、方法である。例えば、組換えNDVについては、第5.1節及び実施例、並びに組成物については、実施例(例えば、第10節及び第11節)、第5.4節を参照されたい。別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して対象(例えば、ヒト対象)を免疫するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む。別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して対象(例えば、ヒト対象)を免疫するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインを含む、方法である。一実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して対象(例えば、ヒト対象)を免疫するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して対象(例えば、ヒト対象)を免疫するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)、方法である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～10節並びに第12節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。ある実施態様において、本方法は、該対象に第二の組換えNDVを投与することをさらに含み、ここで、該第二の組換えNDVは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、SARS-CoV-2に対して対象(例えば、ヒト対象)を免疫するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列を含む。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～10節も参照されたい。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)におけるCOVID-19を予防するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組換えNDVを含む組成物を投与することを含む、方法である。例えば、組換えNDVについては、第5.1節及び実施例、並びに組成物については、第5.4節並びに実施例(例えば、第10節及び第11節)を参照されたい。別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)におけるCOVID-19を予防するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～10節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～10節も参照されたい。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするコドン最適化された核酸配列を含む。別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)におけるCOVID-19を予防するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインを含む、方法である。一実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)におけるCOVID-19を予防するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)、方法である。別の実施態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)におけるCOVID-19を予防するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがパッケージングされたゲノムを含み、ここで、該パッケージングされたゲノムがキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)、方法である。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るキメラFタンパク質をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。ある実施態様において、本方法は、該対象に第二の組換えNDVを投与することをさらに含み、ここで、該第二の組換えNDVは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む。
別の態様において、本明細書に提示されるのは、対象(例えば、ヒト対象)におけるCOVID-19を予防するための方法であって、該対象(例えば、ヒト対象)に組換えNDVを投与することを含み、ここで、該組換えNDVがSARS-CoV-2ヌクレオカプシドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む、方法である。例えば、パッケージングされたゲノムが含み得るSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子については、第5.1.2節及び第6～12節を参照されたい。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。具体的な実施態様において、該導入遺伝子は、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列を含む。本方法で使用され得る組換えNDVの例については、第5.1.3節及び第6～12節も参照されたい。
本明細書に記載される組換えNDVは、1以上の他の療法と組み合わせて対象に投与することができる。該組換えNDV及び1以上の他の療法は、同じ又は異なる投与経路によって対象に投与することができる。具体的な実施態様において、該組換えNDVは、対象に鼻腔内投与される。例えば、組換えNDVに関する情報については、下の第5.1節及び第6～12節、他の療法に関する情報については、第5.5.3節、並びに組成物及び投与経路に関する情報については、下の第5.4節を参照されたい。
組換えNDV及び1以上の追加の療法は、同時に又は連続的に対象に投与することができる。ある実施態様において、組換えNDV及び1以上の追加の療法は、同じ組成物中で投与される。他の実施態様において、組換えNDV及び1以上の追加の療法は、異なる組成物中で投与される。組換えNDV及び1以上の他の療法は、同じ又は異なる投与経路によって対象に投与することができる。当業者に公知の又は本明細書に記載される任意の経路を用いて、組換えNDV及び1以上の他の療法を投与することができる。具体的な実施態様において、組換えNDVは、鼻腔内又は筋肉内投与され、1以上の他の療法は、同じ又は異なる投与経路によって投与される。具体的な実施態様において、組換えNDVは、鼻腔内投与され、1以上の他の療法は、静脈内投与される。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、COVID-19の1つ、2つ、又はそれより多くの症状の開始を予防するために、患者に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、COVID-19の1つ、2つ、もしくはそれより多くの症状の開始もしくは発症を予防するか、COVID-19の1つ、2つ、もしくはそれより多くの症状の重症度を軽減するか、又はCOVID-19の1つ、2つ、もしくはそれより多くの症状の開始もしくは発症を予防し、かつCOVID-19の1つ、2つ、もしくはそれより多くの症状の重症度を軽減する。COVID-19の症状としては、鼻詰まり又は鼻水、咳、発熱、咽頭痛、頭痛、喘鳴、呼吸促迫もしくは浅促呼吸又は呼吸困難、酸素不足による皮膚の青みがかった色、悪寒、筋肉痛、味覚及び/又は嗅覚の喪失、吐き気、嘔吐、並びに下痢が挙げられる。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、SARS-CoV-2感染の拡大を予防する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、入院を予防する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、COVID-19を予防する。別の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、入院期間を低下させる。別の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、気管挿管の可能性を低下させる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、再発性のSARS-CoV-2感染を予防する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、無症候性のSARS-CoV-2感染を予防する。
別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDV又はその組成物の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体を誘導する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDV又はその組成物の投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質に対する粘膜抗体と全身抗体(例えば、中和抗体)の両方を誘導する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和IgG抗体を誘導する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、患者標本中の抗体を測定するためのFDAによって承認されたELISAで相当に中程度から高いレベルのSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対するIgG抗体を誘導する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を誘導する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、強力で長続きする(例えば、6カ月、1年、2年、3年、又はそれより長い)抗原特異的液性免疫を誘導する。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の対象への投与は、T細胞免疫を誘導する。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、防御免疫を対象(例えば、ヒト対象又は非ヒト対象)で誘導する。特に、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、SARS-CoV-2によるその後の感染が原因の疾患(例えば、COVID-19)から対象を(部分的に又は完全に)防御する免疫を対象(例えば、ヒト対象又は非ヒト対象)で誘導する。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、COVID-19に罹患する素因があるか又はCOVID-19に罹患しやすい対象に投与される。
ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒトに投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト乳児に投与される。別の具体的な実施態様において、対象は、6カ月以上のヒト乳児である。他の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト幼児に投与される。他の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト小児に投与される。他の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト成人に投与される。また他の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、ヒト高齢者に投与される。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、COVID-19又はSARS-CoV-2感染のリスクが増大した個体と密に接触している対象(例えば、ヒト対象)に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、SARS-CoV-2合併症への罹患性を増大させる疾病又はSARS-CoV-2が該疾病と関連する合併症を増大させる疾病を有する対象(例えば、ヒト対象)に投与される。SARS-CoV-2合併症への罹患性を増大させる疾病又はSARS-CoV-2が該疾病と関連する合併症を増大させる疾病の例としては、肺に影響を及ぼす疾病、例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気腫、喘息、又は細菌感染(例えば、インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、及びクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatus)によって引き起こされる感染症);心血管疾患(例えば、先天性心疾患、鬱血性心不全、及び冠動脈疾患);並びに内分泌障害(例えば、糖尿病)が挙げられる。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、ナーシングホームなどのグループホームに居住する対象(例えば、ヒト対象)に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、グループホーム、例えば、ナーシングホームで働くか、又はそこでかなりの時間を費やす対象(例えば、ヒト対象)に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、医療従事者(例えば、医師又は看護師)である対象(例えば、ヒト対象)に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、喫煙者である対象(例えば、ヒト対象)に投与される。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、(1)例えば、ヒト乳児(例えば、6カ月未満の乳児)を含む家族を含む、高リスク対象を含む家族のメンバーなどの、合併症のリスクが高い者にSARS-CoV-2を伝染させ得る対象(例えば、ヒト対象)、(2)ヒト乳児(例えば、6カ月齢未満の乳児)と接触することになる対象、(3)ナーシングホーム又は他の長期介護施設に住む対象と接触することになる対象、(4)ヒト高齢者と接触しているか又は接触することになる対象、或いは(5)肺、心臓、又は循環の長期障害を有する対象;代謝性疾患(例えば、糖尿病)を有する個体又は免疫系の衰弱(薬剤、癌などの悪性腫瘍、臓器移植、もしくはHIV感染によって引き起こされる免疫抑制を含む)を有する個体と接触することになる対象に投与される。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、下の第11節に記載されている組入れ基準のうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを満たす対象(例えば、ヒト)に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、下の第11節に記載されている組入れ基準のうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを満たし、かつ下の第11節に記載されている除外基準のうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを満たす対象(例えば、ヒト)に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、下の第11節に記載されている基準のうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを満たす対象(例えば、ヒト)に投与される。
(5.5.2 投薬量及び頻度)
COVID-19の予防、又はSARS-CoV-2に対する免疫において有効である組換えNDV又はその組成物の量は、投与経路、対象の全体的な健康などによって決まる。投薬量範囲の特定を助けるために、インビトロアッセイなどの標準的な臨床的技法を任意に利用することができる。しかしながら、投与用の組換えNDVの好適な投薬量範囲は、通常、約104～約1012であり、かつ必要に応じた間隔で、1回、2回、3回、4回、又はそれより多くの回数、対象に投与することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、104～約1012 EID50の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、1～15μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、1～10μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、1マイクログラム、3マイクログラム、又は10μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、4マイクログラム、5マイクログラム、6マイクログラム、7マイクログラム、8マイクログラム、又は9μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、1～15μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組成物は、1～10μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDVの組成物は、1マイクログラム、3マイクログラム、又は10μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組成物は、4マイクログラム、5マイクログラム、6マイクログラム、7マイクログラム、8マイクログラム、又は9μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、下の第11節に記載されている用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。ある実施態様において、NDVの臨床試験で現在使用されている投薬量と同様の投薬量が対象に投与される。
COVID-19の予防、又はSARS-CoV-2に対する免疫において有効である組換えNDV又はその組成物の量は、投与経路、対象の全体的な健康などによって決まる。投薬量範囲の特定を助けるために、インビトロアッセイなどの標準的な臨床的技法を任意に利用することができる。しかしながら、投与用の組換えNDVの好適な投薬量範囲は、通常、約104～約1012であり、かつ必要に応じた間隔で、1回、2回、3回、4回、又はそれより多くの回数、対象に投与することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、104～約1012 EID50の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、1～15μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、1～10μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、1マイクログラム、3マイクログラム、又は10μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、4マイクログラム、5マイクログラム、6マイクログラム、7マイクログラム、8マイクログラム、又は9μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載される組成物は、1～15μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組成物は、1～10μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。具体的な実施態様において、本明細書に記載されるNDVの組成物は、1マイクログラム、3マイクログラム、又は10μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組成物は、4マイクログラム、5マイクログラム、6マイクログラム、7マイクログラム、8マイクログラム、又は9μgのSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくは部分又はキメラFタンパク質の用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVは、下の第11節に記載されている用量で対象(例えば、ヒト)に投与される。ある実施態様において、NDVの臨床試験で現在使用されている投薬量と同様の投薬量が対象に投与される。
ある実施態様において、組換えNDV又はその組成物は、単一用量として、次いで、1～6週間後、1～5週間後、1～4週間後、1～3週間後、1～2週間後、6～12週間後、3～6カ月後、6～9カ月後、6～12カ月後、又は6～9カ月後に第二の用量として、対象に投与される。これらの実施態様に従って、追加免疫接種物を、2回目の接種後3～6カ月又は6～12カ月の間隔で、対象に投与することができる。ある実施態様において、対象に、1回以上の追加免疫を投与する。各々の追加免疫に使用される組換えNDVは、同じであっても、異なっていてもよい。
ある実施態様において、同じ組換えNDV又はその組成物の投与を繰り返すことができ、該投与は、7日、10日、14日、15日、21日、28日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月の間隔を空けることができる。他の実施態様において、同じ組換えNDV又はその組成物の投与を繰り返すことができ、該投与は、1～14日、1～7日、7～14日、1～30日、15～30日、15～45日、15～75日、15～90日、1～3カ月、3～6カ月、3～12カ月、又は6～12カ月の間隔を空けることができる。いくつかの実施態様において、第一の組換えNDV又はその組成物を対象に投与し、次いで、第二の組換えNDV又はその組成物を投与する。いくつかの実施態様において、第一の組換えNDV及び第二の組換えNDVは、互いに異なる。ある実施態様において、第一の医薬組成物をプライミング用量として対象に投与し、一定期間(例えば、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、又は1～6カ月)後、ブースター用量の第二の医薬組成物を投与する。例えば、第一の組換えNDVは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、第二の組換えNDVは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージゲノムを含むことができ、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む。別の例において、第一の組換えNDVは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、第二の組換えNDVは、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージゲノムを含むことができ、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位(RRAR)のアミノ酸残基は、単一のアラニンと置換されている)。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。別の例において、第一の組換えNDVは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、第二の組換えNDVは、キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージゲノムを含むことができ、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基は、プロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインは、多塩基性切断部位を欠く(例えば、多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685が単一のアラニンに置換されている)。具体的な実施態様において、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインは、リンカー(例えば、GGGGS(配列番号24))を介して、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに融合されている。リンカーは、細胞外ドメインのフォールディング、細胞外ドメインの機能、又はその両方を妨害しない任意のリンカーであることができる。いくつかの実施態様において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれを上回るアミノ酸長であるアミノ酸配列(例えば、ペプチド)である。いくつかの実施態様において、リンカーは、グリシン(G)リンカー又はグリシン及びセリン(GS)リンカーである。例えば、リンカーは、(GGGGS)n(ここで、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい)という配列を含むことができる。別の例において、リンカーは、(G)n(ここで、nは、3、4、5、6、7、8又はそれより大きい)を含むことができる。具体的な実施態様において、リンカーは、配列GGGGS(配列番号24)を含む。いくつかの実施態様において、NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインに直接融合されている。例えば、組換えNDVの例については、第5.1節及び第6～12節を参照されたい。別の例において、第一の組換えNDVは、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含むことができ、第二の組換えNDVは、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージゲノムを含むことができ、ここで、該キメラFタンパク質は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む。ある実施態様において、第一の組換えNDV及び第二の組換えNDV又はこれらの組成物は、少なくとも7日、10日、14日、15日、21日、28日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月の間隔を空けることができる。他の実施態様において、第一の組換えNDV及び第二の組換えNDV又はこれらの組成物は、1～14日、1～7日、7～14日、1～30日、15～30日、15～45日、15～75日、15～90日、1～3カ月、3～6カ月、3～12カ月、又は6～12カ月の間隔を空けることができる。
ある実施態様において、第一の用量の本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組成物を対象(例えば、ヒト)に投与することができ、第二の用量の該組換えNDV又は組成物を3～6週間後に該対象に投与することができる。いくつかの実施態様において、対象は、2回以上の該組換えNDVの追加免疫を投与される。具体的な実施態様において、対象(例えば、ヒト)は、下の実施例に記載されているレジメンを用いて、本明細書に記載される組換えNDVを投与される。別の具体的な実施態様において、対象(例えば、ヒト)は、下の第11節に記載されているレジメンを用いて、本明細書に記載される組換えNDV又はその組成物を投与される。別の具体的な実施態様において、対象(例えば、ヒト)は、下の第11節に記載されているレジメンを用いて、本明細書に記載される組換えNDV又は下の第11節に記載されているその組成物を投与される。
ある実施態様において、組換えNDV又はその組成物は、1以上の追加の療法、例えば、下の第5.5.3節に記載されている療法と組み合わせて対象に投与される。他の1以上の追加の療法の投薬量は、例えば、療法、投与経路、対象の全体的な健康などを含む、様々な因子によって決まり、かつ医師の判断に従って決定されるべきである。具体的な実施態様において、他の療法の用量は、本明細書に開示される方法に従って使用される単剤として使用するための療法に推奨される療法の投与の用量及び/又は頻度である。承認された療法についての推奨用量は、医師の卓上参考書(Physician's Desk Reference)に見出すことができる。
ある実施態様において、組換えNDV又はその組成物は、1以上の追加の療法の投与と同時に対象に投与される。いくつかの実施態様において、組換えNDVを含む第一の医薬組成物及び1以上の追加の療法を含む第二の医薬組成物は、同時に、又は互いの前もしくは後に投与することができる。ある実施態様において、第一の医薬組成物及び第二の医薬組成物は、対象に同時に、又は1分、2分、5分、10分、15分、20分、30分、45分、60分、1.5時間、2時間、3時間、4時間、5時間、もしくは6時間間隔で投与される。ある実施態様において、第一の医薬組成物及び第二の医薬組成物は、7日、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、又は12週間間隔で、対象に投与される。ある実施態様において、第一の医薬組成物及び第二の医薬組成物は、3～6カ月、6～9カ月、6～12カ月、又は3カ月、4カ月、6カ月、9カ月、もしくは12カ月間隔で対象に投与される。
(5.5.3 追加の療法)
本明細書に記載される組換えNDV又はその組成物と組み合わせて使用することができる追加の療法として、アセトアミノフェン、イブプロフェン、喉飴、鎮咳薬、吸入器、抗生物質、及び酸素が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、追加の療法は、本明細書に記載される第二の組換えNDVである。別の具体的な実施態様において、追加の療法としては、レムデシビル、バムラニビマブ＋エテセビマブ(AIIa)、カシリビマブ＋イムデビマブ(AIIa)、デキサメタゾン、トシリズマブ、酸素、又はこれらの組合せを挙げることができる。
本明細書に記載される組換えNDV又はその組成物と組み合わせて使用することができる追加の療法として、アセトアミノフェン、イブプロフェン、喉飴、鎮咳薬、吸入器、抗生物質、及び酸素が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施態様において、追加の療法は、本明細書に記載される第二の組換えNDVである。別の具体的な実施態様において、追加の療法としては、レムデシビル、バムラニビマブ＋エテセビマブ(AIIa)、カシリビマブ＋イムデビマブ(AIIa)、デキサメタゾン、トシリズマブ、酸素、又はこれらの組合せを挙げることができる。
(5.5.4 組換えNDVの他の用途)
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVを非ヒト対象(例えば、マウス、ラットなど)に投与し、ポリペプチドに応答して生成された抗体を単離する。当業者に公知の通りに、ハイブリドーマを作製し、モノクローナル抗体を産生することができる。抗体を最適化することもできる。いくつかの実施態様において、産生された抗体をヒト化又はキメラ化する。ある実施態様において、非ヒト対象がヒト抗体を産生する。本明細書に記載される組換えNDVを用いて産生された抗体を、当業者に公知の技法を用いて最適化することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVを用いて産生された抗体を用いて、COVID-19を予防するか、治療するか、又は予防し、かつ治療することができる。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVを非ヒト対象(例えば、マウス、ラットなど)に投与し、ポリペプチドに応答して生成された抗体を単離する。当業者に公知の通りに、ハイブリドーマを作製し、モノクローナル抗体を産生することができる。抗体を最適化することもできる。いくつかの実施態様において、産生された抗体をヒト化又はキメラ化する。ある実施態様において、非ヒト対象がヒト抗体を産生する。本明細書に記載される組換えNDVを用いて産生された抗体を、当業者に公知の技法を用いて最適化することができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVを用いて産生された抗体を用いて、COVID-19を予防するか、治療するか、又は予防し、かつ治療することができる。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVを当業者に公知の又は本明細書に記載される免疫アッセイ(例えば、ELISAアッセイ)で用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質に特異的な抗体を検出することができる。一実施態様において、標本を免疫アッセイ(例えば、ELISA)で本明細書に記載される組換えNDVと接触させることを含む、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドに特異的な抗体の存在を検出する方法。いくつかの実施態様において、標本は、生物学的標本である。具体的な実施態様において、生物学的標本は、対象(例えば、ヒト対象)由来の血液、血漿、又は血清である。他の実施態様において、標本は、抗体又は抗血清である。使用され得るELISAアッセイについては、下の実施例を参照されたい。
(5.6 生物学的アッセイ)
具体的な実施態様において、第6節～第12節に記載されているアッセイのうちの1つ、2つ、又はそれより多くを用いて、本明細書に記載される組換えNDV、又はSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくはその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質、又はキメラFタンパク質を特徴付けることができる。別の具体的な実施態様において、第6節～第12節に記載されているアッセイのうちの1つ、2つ、又はそれより多くを用いて、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組成物、例えば、下の実施例(例えば、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)に記載されているものなどを投与された対象(例えば、ヒト対象)由来の免疫グロブリン試料を特徴付けることができる。例えば、IgG力価及びIgGのマイクロ中和は、下記の実施例(例えば、第6節、第7節、第8節、又は、第10節)に記載されている通りに評価することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組成物を投与された対象は、抗NDV抗体及び抗SARS-CoV-2スパイク又はヌクレオカプシド抗体について評価される。
具体的な実施態様において、第6節～第12節に記載されているアッセイのうちの1つ、2つ、又はそれより多くを用いて、本明細書に記載される組換えNDV、又はSARS-CoV-2スパイクタンパク質もしくはその部分(例えば、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質、又はキメラFタンパク質を特徴付けることができる。別の具体的な実施態様において、第6節～第12節に記載されているアッセイのうちの1つ、2つ、又はそれより多くを用いて、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組成物、例えば、下の実施例(例えば、第6節、第7節、第8節、第9節、第10節、第11節、又は第12節)に記載されているものなどを投与された対象(例えば、ヒト対象)由来の免疫グロブリン試料を特徴付けることができる。例えば、IgG力価及びIgGのマイクロ中和は、下記の実施例(例えば、第6節、第7節、第8節、又は、第10節)に記載されている通りに評価することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDV又は本明細書に記載される組成物を投与された対象は、抗NDV抗体及び抗SARS-CoV-2スパイク又はヌクレオカプシド抗体について評価される。
(5.6.1 インビトロウイルスアッセイ)
ウイルスアッセイには、ウイルス複製(例えば、プラーク形成により決定される)又はウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット解析により決定される)又はウイルスRNAの産生(例えば、RT-PCRもしくはノーザンブロット解析により決定される)を、当技術分野で周知の方法を用いて、インビトロで、培養細胞で直接測定するアッセイが含まれる。
ウイルスアッセイには、ウイルス複製(例えば、プラーク形成により決定される)又はウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット解析により決定される)又はウイルスRNAの産生(例えば、RT-PCRもしくはノーザンブロット解析により決定される)を、当技術分野で周知の方法を用いて、インビトロで、培養細胞で直接測定するアッセイが含まれる。
本明細書に記載される組換えNDVの成長は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される任意の方法によって(例えば、細胞培養(例えば、BSTT7又は有胚ニワトリ細胞の培養物)中で)評価することができる(例えば、第6節、第7節、又は第10節を参照)。ウイルス力価は、本明細書に記載される組換えNDVの段階希釈液を、細胞培養物(例えば、BSTT7もしくは有胚ニワトリ細胞)、ニワトリ胚(例えば、9～11日齢の有胚卵)、又は生きた非ヒト動物に接種することにより決定することができる。ウイルスを規定の時間インキュベートした後、標準的な方法を用いて、該ウイルスを単離する。ウイルス力価の物理的定量は、ウイルス上清に適用されるPCR(Quinn及びTrevorの文献、1997; Morganらの文献、1990)、血球凝集アッセイ、組織培養感染用量(TCID50)、又は卵感染用量(EID50)を用いて実施することができる。ウイルス力価を評価する例示的な方法は、下の第6節、第7節、又は第10節に記載されている。
本明細書に記載される組換えNDVのゲノムへの異種ペプチド又はタンパク質(例えば、導入遺伝子)をコードするヌクレオチド配列の組込みは、当技術分野で公知の又は本明細書に記載される任意の方法によって(例えば、細胞培養、動物モデル、又は有胚卵中のウイルス培養で)評価することができる。例えば、有胚卵の尿膜腔液の細胞培養物由来のウイルス粒子を、スクロースクッションに通す遠心分離によって精製し、その後、当技術分野で周知の方法を用いて、ウェスタンブロッティングによって、タンパク質発現について解析することができる。具体的な実施態様において、下の第6節、第7節、第9節、又は第10節に記載されている方法を用いて、組換えNDVのゲノムへの導入遺伝子の組込みを評価する。
免疫蛍光に基づく手法を用いて、ウイルスを検出し、ウイルス成長を評価することもできる。そのような手法は、当業者に周知であり、例えば、蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーがある(下の第6節、第7節、又は第10節を参照)。蛍光活性化細胞選別(FACS)を含む、フローサイトメトリーの方法が利用可能である(例えば、Owensらの文献(1994)、臨床実験室実践のためのフローサイトメトリー原理(Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice)、John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givanの文献(2001)、フローサイトメトリー(Flow Cytometry)、第2版; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiroの文献(2003)、実践的フローサイトメトリー(Practical Flow Cytometry)、John Wiley and Sons, Hoboken, NJを参照)。例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマー及びプローブを含む核酸、ポリペプチド、並びに抗体を修飾するのに好適な蛍光試薬が利用可能である(Molecular Probesy(2003)、カタログ、Molecular Probes社、Eugene, OR; Sigma-Aldrich(2003)、カタログ、St. Louis, MOを参照)。例えば、下の第6節又は第7節に記載されているアッセイを参照されたい。
免疫系の組織学的検査の標準的な方法が記載されている(例えば、Muller-Harmelink(編)(1986)、ヒト胸腺:組織病理学及び病理学(Human Thymus: Histopathology and Pathology)、Springer Verlag, New York, NY; Hiattらの文献(2000)、組織学のカラーアトラス(Color Atlas of Histology)、Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louisらの文献(2002)、基礎組織学:テキスト及びアトラス(Basic Histology: Text and Atlas)、McGraw-Hill, New York, NYを参照)。使用され得る組織学及び免疫組織化学アッセイについては、下の第6節、第7節、又は第10節も参照されたい。
(5.6.2 インターフェロンアッセイ)
本明細書に記載される組換えNDVによるIFN誘導及び放出は、当業者に公知の技法を用いて決定することができる。例えば、本明細書に記載される組換えNDVへの感染後に細胞で誘導されるIFNの量を、免疫アッセイ(例えば、ELISA又はウェスタンブロットアッセイ)を用いて決定して、IFN発現を測定し、又はその発現がIFNによって誘導されるタンパク質の発現を測定することができる。或いは、誘導されるIFNの量は、当業者に公知のアッセイ、例えば、ノーザンブロット及び定量的RT-PCRによって、RNAレベルで測定することができる。具体的な実施態様において、放出されるIFNの量は、ELISPOTアッセイを用いて測定することができる。さらに、サイトカイン及び/又はインターフェロン刺激遺伝子の誘導及び放出は、例えば、免疫アッセイ又はELISPOTアッセイによって、タンパク質レベルで、及び/又は定量的RT-PCRもしくはノーザンブロットによって、RNAレベルで決定することができる。
本明細書に記載される組換えNDVによるIFN誘導及び放出は、当業者に公知の技法を用いて決定することができる。例えば、本明細書に記載される組換えNDVへの感染後に細胞で誘導されるIFNの量を、免疫アッセイ(例えば、ELISA又はウェスタンブロットアッセイ)を用いて決定して、IFN発現を測定し、又はその発現がIFNによって誘導されるタンパク質の発現を測定することができる。或いは、誘導されるIFNの量は、当業者に公知のアッセイ、例えば、ノーザンブロット及び定量的RT-PCRによって、RNAレベルで測定することができる。具体的な実施態様において、放出されるIFNの量は、ELISPOTアッセイを用いて測定することができる。さらに、サイトカイン及び/又はインターフェロン刺激遺伝子の誘導及び放出は、例えば、免疫アッセイ又はELISPOTアッセイによって、タンパク質レベルで、及び/又は定量的RT-PCRもしくはノーザンブロットによって、RNAレベルで決定することができる。
(5.6.3 毒性研究)
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、細胞傷害性について、哺乳動物、好ましくは、ヒト細胞株で試験する。ある実施態様において、細胞傷害性を、1以上の以下の非限定的な細胞株例: U937、ヒト単球細胞株;初代末梢血単核細胞(PBMC); Huh7、ヒト肝芽腫細胞株; HL60細胞、HT1080、HEK 293T、及び293H、MLPC細胞、ヒト胚性腎臓細胞株;ヒトメラノーマ細胞株、例えば、SkMel2、SkMel-119、及びSkMel-197; THP-1、単球細胞; HeLa細胞株;並びに神経芽腫細胞株、例えば、MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y、及びBE(2)-Cで評価する。いくつかの実施態様において、ToxLiteアッセイを用いて、細胞傷害性を評価する。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、細胞傷害性について、哺乳動物、好ましくは、ヒト細胞株で試験する。ある実施態様において、細胞傷害性を、1以上の以下の非限定的な細胞株例: U937、ヒト単球細胞株;初代末梢血単核細胞(PBMC); Huh7、ヒト肝芽腫細胞株; HL60細胞、HT1080、HEK 293T、及び293H、MLPC細胞、ヒト胚性腎臓細胞株;ヒトメラノーマ細胞株、例えば、SkMel2、SkMel-119、及びSkMel-197; THP-1、単球細胞; HeLa細胞株;並びに神経芽腫細胞株、例えば、MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y、及びBE(2)-Cで評価する。いくつかの実施態様において、ToxLiteアッセイを用いて、細胞傷害性を評価する。
当技術分野で周知の多くのアッセイを用いて、本明細書に記載される組換えNDV又はその組成物への感染後の細胞又は細胞株の生存を評価し、それにより、該組換えNDV又はその組成物の細胞傷害性を決定することができる。例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン(BrdU)の取込み、(3H)チミジンの取込みを測定することによるか、直接的な細胞カウントによるか、又は既知の遺伝子、例えば、癌原遺伝子(例えば、fos、myc)もしくは細胞周期マーカー(Rb、cdc2、サイクリンA、D1、D2、D3、Eなど)の転写、翻訳、もしくは活性の変化を検出することによりアッセイすることができる。そのようなタンパク質及びmRNA及び活性のレベルは、当技術分野で周知の任意の方法により決定することができる。例えば、市販の抗体を含む抗体を用いる公知の免疫診断方法、例えば、ELISA、ウェスタンブロッティング、又は免疫沈降により、タンパク質を定量することができる。当技術分野で周知かつルーチンの方法を用いて、例えば、ノーザン解析、RNアーゼ保護、又は逆転写と関連するポリメラーゼ連鎖反応を用いて、mRNAを定量することができる。細胞の生存は、トリパンブルー染色又は当技術分野で公知の他の細胞生死マーカーを用いて評価することができる。具体的な実施態様において、細胞のATPレベルを測定して、細胞の生存を決定する。好ましい実施態様において、本明細書に記載される組換えNDV又はその組成物は、健常な(すなわち、非癌性の)細胞を殺傷しない。
具体的な実施態様において、細胞の生存は、細胞内ATPレベルを測定する、当技術分野で標準的なアッセイ、例えば、CellTiter-Gloアッセイキット(Promega)を用いて、3日及び7日の期間で測定することができる。細胞ATPの低下は、細胞毒性効果を示すものである。別の具体的な実施態様において、細胞の生存は、ニュートラルレッド取込みアッセイで測定することができる。他の実施態様において、形態変化の目視観察には、肥大、粒状度、ギザギザの縁を有する細胞、薄膜状の外観、円形化、ウェル表面からの剥離、又は他の変化が含まれ得る。
本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は併用療法を、インビボ毒性について、動物モデルで試験することができる。例えば、例えば、動物に、様々なpfuの本明細書に記載される組換えNDVを投与し、その後、該動物を、様々なパラメータ、例えば、以下のもの:致死率、体重減少又は体重増加失敗、及び組織損傷を示し得る血清マーカーのレベル(例えば、全般的な組織損傷の指標としてのクレアチンホスホキナーゼレベル、肝損傷の可能性の指標としてのグルタミン酸シュウ酸トランスアミナーゼ又はピルビン酸トランスアミナーゼのレベル)のうちの1つ、2つ、又はそれより多くについて経時的にモニタリングする。これらのインビボアッセイは、投薬量の他に、様々な投与様式及び/又はレジメンの毒性を試験するために適合させることができる。例えば、毒性を評価するために使用され得るアッセイについては、下の実施例を参照されたい。
本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の毒性、効力、又はその両方は、例えば、LD50(集団の50％に致死的な用量)及びED50(集団の50％で治療的に有効な用量)を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、これは、比LD50/ED50と表すことができる。大きい治療指数を示す療法が好ましい。
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、対象で使用される療法の投薬量の範囲を定める際に使用することができる。そのような薬剤の投薬量は、循環濃度の範囲内にあることが好ましく、この範囲には、ほとんど又は全く毒性のないED50が含まれる。投薬量は、利用される剤形及び利用される投与経路によって、この範囲内で異なり得る。本明細書に記載される任意の療法について、治療有効用量を、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。
(5.6.4 生物学的活性アッセイ)
本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、COVID-19を阻害するための動物モデル、組換えNDVに対する抗体応答などを用いて、生物学的活性について試験することができる(例えば、第6節、第7節、第8節、又は第10節を参照)。そのような動物モデル系としては、ラット、マウス、ハムスター、コットンラット、ニワトリ、ウシ、サル(例えば、アフリカミドリザル)、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法は、COVID-19を阻害するための動物モデル、組換えNDVに対する抗体応答などを用いて、生物学的活性について試験することができる(例えば、第6節、第7節、第8節、又は第10節を参照)。そのような動物モデル系としては、ラット、マウス、ハムスター、コットンラット、ニワトリ、ウシ、サル(例えば、アフリカミドリザル)、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されない。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質に結合する特定の幾何平均力価の抗体を誘導する能力についての動物モデルを用いて試験することができる。下の第7節もしくは第10節に記載されている、又は当業者に公知の免疫アッセイ、例えば、ELISAを用いて、抗体力価を測定することができる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、マイクロ中和アッセイでSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質に対する中和活性を有する抗体を誘導する能力についての動物モデルを用いて試験することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、例えば、本明細書(例えば、第7節又は第10節)に記載されるマイクロ中和アッセイでSARS-CoV-2を中和する抗体を誘導する能力についての動物モデルを用いて試験することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質に結合し、かつマイクロ中和アッセイでSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質を中和する特定の幾何平均力価の抗体を誘導する能力についての動物モデルを用いて試験することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質に結合し、かつ例えば、本明細書(例えば、第7節又は第10節)に記載されるマイクロ中和アッセイでSARS-CoV-2を中和する特定の幾何平均力価の抗体を誘導する能力についての動物モデルを用いて試験することができる。ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、防御的免疫応答を誘導する能力についての動物モデルを用いて試験することができる(例えば、第10節を参照)。
具体的な実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、例えば、下の第11節に記載されている臨床試験で試験することができる。ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、下の第11節に記載されている通りに、ヒト対象に投与する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を投与されたヒト対象を、下の第11節に記載されているもののうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てについて評価することができる。例えば、以下のもの: GMT、抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質Ig(例えば、IgG、IgA、IgMなど)、T細胞応答、NT50血清反応陽性応答、NT80血清反応陽性応答、T細胞応答、抗NDV HN抗体、及び抗NDV F抗体のうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てを、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法の投与後に評価することができる。ある実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVもしくはその組成物、又は本明細書に記載される併用療法を、下の第11節に記載されている通りに、ヒト対象に投与し、該対象を下の第11節に記載されているもののうちの1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てについて評価する。
(5.6.5 導入遺伝子の発現)
それぞれ、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、キメラFタンパク質、又はSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVに感染した細胞におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、キメラFタンパク質、又はSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質の発現を試験するためのアッセイは、例えば、ウェスタンブロット、免疫蛍光、及びELISAなどの当技術分野で公知の任意のアッセイ、又は本明細書に記載される任意のアッセイ(例えば、第6節、第7節、第8節、第9節、又は第10節を参照)を用いて実施することができる。
それぞれ、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、キメラFタンパク質、又はSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVに感染した細胞におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、キメラFタンパク質、又はSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質の発現を試験するためのアッセイは、例えば、ウェスタンブロット、免疫蛍光、及びELISAなどの当技術分野で公知の任意のアッセイ、又は本明細書に記載される任意のアッセイ(例えば、第6節、第7節、第8節、第9節、又は第10節を参照)を用いて実施することができる。
具体的な態様において、ELISAを用いて、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、キメラFタンパク質、或いはSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVに感染した細胞におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、キメラFタンパク質、或いはSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質の発現を検出する。具体的な実施態様において、実施例の1つに記載されているELISAを用いて、本明細書に記載される組換えNDVに感染した細胞におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、キメラFタンパク質、或いはSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質の発現を検出することができる。
一実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVのパッケージングされたゲノムによってコードされたSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質、或いはキメラFタンパク質を、当技術分野で公知の抗体-抗原相互作用のための任意のアッセイを用いて抗SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシド抗体に特異的に結合するその能力を試験することにより、適切なフォールディングについてアッセイする。別の実施態様において、本明細書に記載される組換えNDVのパッケージングされたゲノムによってコードされるSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質、或いはキメラFタンパク質、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質、或いはキメラFタンパク質を、それぞれ、例えば、NMR、X線結晶学的方法、又は二次構造予測法、例えば、円二色性などの当技術分野で公知の任意の方法を用いる、SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質、或いはキメラFタンパク質の構造又は立体構造の決定よって、適切なフォールディングについてアッセイする。SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はその部分(例えば、SARS-CoV-2細胞外ドメインもしくは受容体結合ドメイン)、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質、或いはキメラFタンパク質の立体構造及び抗原性を評価するさらなるアッセイとしては、例えば、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、ウェスタンブロットを挙げることができ、ELISAを使用してもよい。
(5.7 キット)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組成物(例えば、医薬組成物)の成分のうちの1つ又は複数が充填された1以上の容器を含む医薬パック又はキットである。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、容器を含む医薬パック又はキットであり、ここで、該容器は、本明細書に記載される組換えNDVを含む。医薬品又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって定められた形での注意書きを、そのような容器に任意に関連付けることができ、この注意書きは、該機関による、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の認可を示すものである。
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組成物(例えば、医薬組成物)の成分のうちの1つ又は複数が充填された1以上の容器を含む医薬パック又はキットである。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、容器を含む医薬パック又はキットであり、ここで、該容器は、本明細書に記載される組換えNDVを含む。医薬品又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって定められた形での注意書きを、そのような容器に任意に関連付けることができ、この注意書きは、該機関による、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の認可を示すものである。
別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、1以上の本明細書に記載される組換えNDVが充填された1以上の容器を含むキットである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、1以上の本明細書に記載される導入遺伝子を1以上の容器中に含むキットである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、NDVのゲノム及び本明細書に記載される導入遺伝子を含む1以上のヌクレオチド配列を1以上の容器中に含むキットである。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される導入遺伝子を含むベクターを容器中に含むキットである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される導入遺伝子、並びに(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV M転写ユニット、(4)NDV L転写ユニット、(5)NDV P転写ユニット、(6)NDV HN転写ユニットを含むヌクレオチド配列を容器中に含むキットである。いくつかの実施態様において、NDV F転写ユニットは、LaSota NDV株のアミノ残基289に対応するアミノ残基におけるロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含むNDV Fタンパク質をコードする。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、ヌクレオチド配列を含むベクターを容器中に含むキットであり、ここで、該ヌクレオチド配列は、本明細書に記載される導入遺伝子、並びに(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV M転写ユニット、(4)NDV L転写ユニット、(5)NDV P転写ユニット、(6)NDV HN転写ユニットを含む。いくつかの実施態様において、NDV F転写ユニットは、LaSota NDV株のアミノ残基289に対応するアミノ残基におけるロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含むNDV Fタンパク質をコードする。
(5.8 配列)
表1: NDV株のゲノムのcDNA
表2: NDV LaSota Fタンパク質
表3: SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列
表8:他の配列
(5.8 配列)
表1: NDV株のゲノムのcDNA
(6.実施例1: SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現する組換えNDV)
本実施例は、全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質、SARS-CoV-2スパイク細胞外ドメインを含むタンパク質、SARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含むタンパク質の発現を示している。特に、本実施例は、SARS-CoV-2のスパイクの受容体-結合ドメイン(RBD)、細胞外ドメイン、又は全長を発現する長潜伏期性ニューカッスル病ウイルス(NDV)ベクターの人工作製を記載している。これらのタンパク質を発現するNDVは、診断試薬又はワクチン候補として使用することができる。
本実施例は、全長SARS-CoV-2スパイクタンパク質、SARS-CoV-2スパイク細胞外ドメインを含むタンパク質、SARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインを含むタンパク質の発現を示している。特に、本実施例は、SARS-CoV-2のスパイクの受容体-結合ドメイン(RBD)、細胞外ドメイン、又は全長を発現する長潜伏期性ニューカッスル病ウイルス(NDV)ベクターの人工作製を記載している。これらのタンパク質を発現するNDVは、診断試薬又はワクチン候補として使用することができる。
ニューカッスル病ウイルス(NDV)は、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)のファミリーのアブラウイルス(Avulavirus)の属に属する。NDVが重大な鳥類病原体であるという事実にもかかわらず、それは、ヒトで軽度のインフルエンザ様症状又は結膜炎を引き起こすだけである。過去に、長潜伏期性NDV株が人工作製され、腫瘍溶解因子又は外来抗原を発現するウイルスベクターワクチンとして試験された。NDV-LaSota(LS)野生型又はL289A突然変異体株のリバースジェネティクスシステムを用いて、導入遺伝子をコードするようにNDVを遺伝子改変した。
SARS-CoV-2診断試薬を提供するために、1)可溶性RBD(S_RBD 6×His)又は2)スパイクの細胞外ドメイン(S_Ecto 6×His)を精製タグとともに発現するNDVベクター(野生型又はL289A突然変異体)を作製した。これら2つのタンパク質を発現させ、NDV_LS_S_RBD 6×His又はNDV_LS_S_Ecto 6×Hisウイルスが接種された有胚鶏卵の尿膜腔液から精製することができた。これらのタンパク質をELISAなどの血清学的検査で基体として用いて、SARS-CoV-2スパイク特異的抗体力価を測定することができた。NDVタンパク質発現系を使用する利点は、NDVが有胚鶏卵中で高力価にまで成長し、高収率であるが、コストの低いタンパク質産生を可能にするということである。
SARS-CoV-2ワクチンの緊急の必要性を満たすために、1)分泌型RBD(S_RBD); 2)全長スパイク(S);並びに3)スパイクの細胞外ドメインがNDVのFタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールに融合されている修飾されたキメラスパイク(S-F)を発現するNDVベクター(WT又はL289A突然変異体)を作製した。これらは、それぞれ、NDV_LS_S_RBD、NDV_LS_S、及びNDV_LS_S-Fと命名された。3つ全てのNDVベクターを弱毒化生ワクチンとして使用することができるが、2)及び3)は、NDVビリオンへのスパイクタンパク質の組込みのために、アジュバント添加不活化ワクチンとして使用することができる。NDVのRNAゲノムは、ヒトゲノムに組み込まれないという利点を有する。ヒトで非病原性である鳥類病原体として、NDVベクターは安全であり、かつヒトにおける何らかの既存免疫によって妨げられない。
T7プロモーターの下流にNDV LaSota株のアンチゲノムcDNAを含有するレスキュープラスミドを構築した。S_RBD、S_Ecto、又は全長SのDNA配列を、ホスホタンパク質(P)遺伝子とマトリックス(M)タンパク質遺伝子の間の遺伝子間領域に挿入した。NDV LaSotaプラスミドの構築の描写については、図1を参照されたい。ウイルスをレスキューするために、BSRT7細胞を、核タンパク質(N)、Pタンパク質、及び巨大ポリメラーゼ(L)タンパク質、並びにT7ポリメラーゼを発現するヘルパープラスミドとともに、アンチゲノムcDNAレスキュープラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞の上清を回収し、9～11日齢の有胚鶏卵に注入した。これらの卵を37℃で48～96時間インキュベートし、その後、4℃で一晩冷却した。尿膜液を回収し、ウイルスのレスキューを赤血球凝集(HA)アッセイによって調べた。1)可溶性RBD(S_RBD 6×His)、2)スパイクの細胞外ドメイン(S_Ecto 6×His)、3)分泌型RBD(S_RBD); 4)全長スパイク(S);又は5)スパイクの細胞外ドメインがNDVのFタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質テールに融合されている修飾されたキメラスパイク(S-F)を発現するNDVをレスキューするために使用された方法の描写については、図2を参照されたい。HA陽性試料のRNAを抽出し、導入遺伝子の存在をRT-PCRによって確認した。図3A、4A、及び5Aを参照されたい。ウイルスゲノム中の導入遺伝子をサンガーシークエンシングによってシークエンシングした。S_RBD、S_Ecto、及び全長Sの発現を、スパイク特異的モノクローナル抗体又はマウス抗血清を用いる免疫アッセイ、例えば、ELISA、免疫蛍光アッセイ、又はウェスタンブロットによって確認した。図3B、4B、4C5、5B、及び6を参照されたい。正しく発現された導入遺伝子を有するウイルスを有胚鶏卵中でさらに増幅させて、大きなウイルスストックを拡大した。ウイルスストックを分注し、-80℃で保存した。ウイルスストックの感染力価を感染したVero細胞に対する免疫蛍光アッセイによって決定した。
(7.実施例2:ワクチン候補としてのSARS-CoV-2の スパイクタンパク質を発現するニューカッスル病ウイルス(NDV))
新たに出現したSARS-CoV-2に対するヒトの防御的免疫の欠如のために、このウイルスは、世界中で大規模なパンデミックを引き起こし、数十万人の死をもたらしている。したがって、ウイルスの拡大を封じ込めるためのワクチンが緊急に必要とされる。本実施例は、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質をその野生型又は融合前膜アンカー型フォーマットで発現するニューカッスル病ウイルス(NDV)ベクターワクチンを記載している。記載されているNDVベクターワクチンは全て、有胚鶏卵中で高力価にまで成長する。原理実証マウス研究の証明において、本実施例は、ワクチンが筋肉内投与されたとき、NDVベクターワクチンが高レベルの中和抗体を誘発することを報告している。重要なことに、これらのCOVID-19ワクチン候補は、肺におけるウイルス力価及びウイルス抗原の検出を伴わずに、マウスをマウス適合性SARS-CoV-2投与から防御する。
新たに出現したSARS-CoV-2に対するヒトの防御的免疫の欠如のために、このウイルスは、世界中で大規模なパンデミックを引き起こし、数十万人の死をもたらしている。したがって、ウイルスの拡大を封じ込めるためのワクチンが緊急に必要とされる。本実施例は、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質をその野生型又は融合前膜アンカー型フォーマットで発現するニューカッスル病ウイルス(NDV)ベクターワクチンを記載している。記載されているNDVベクターワクチンは全て、有胚鶏卵中で高力価にまで成長する。原理実証マウス研究の証明において、本実施例は、ワクチンが筋肉内投与されたとき、NDVベクターワクチンが高レベルの中和抗体を誘発することを報告している。重要なことに、これらのCOVID-19ワクチン候補は、肺におけるウイルス力価及びウイルス抗原の検出を伴わずに、マウスをマウス適合性SARS-CoV-2投与から防御する。
本研究で記載されているSARS-CoV-2に対するNDVベクターワクチンは、他のウイルスベクターワクチンの利点と同様の利点を有する。しかし、該NDVベクターは、有胚鶏卵中で増幅させることができ、これにより、用量当たりの高い収率及び低いコストが可能になる。また、該NDVベクターは、ヒト病原体ではなく、それゆえ、外来抗原の送達は、ヒトにおける何らかの既存免疫によって妨げられない。最後に、NDVは、多くの腫瘍溶解性ウイルス治験で使用されているので、ヒトで非常に良好な安全性記録を有する。本研究は、費用効果の高いSARS-CoV-2ワクチンに対する重要な選択肢を提供する。
本研究は、SARS-CoV-2に対するウイルスベクターワクチンの価値を伝えるものである。具体的に、このNDVベースのSARS-CoV-2ワクチンについて、米国及び全世界における既存の卵ベースのインフルエンザウイルスワクチン製造は、進行中のCOVID-19パンデミックの影響を緩和するために、何億もの用量を迅速に生産する能力を有する。
(7.1 背景)
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされた前例のないコロナウイルス疾患2019(COVID-19)パンデミックは、2020年7月26日時点で、2019年末以来、50万人を超える死亡とともに、約1630万人の感染をもたらし、公衆衛生に脅威を与え続けている。ウイルスの拡大を軽減するために、対人距離の確保、マスクの着用、及び都市、州、又は国さえもの封鎖が実施され、医療と経済の両方に高い代償を払った。不幸なことに、このウイルスに対するヒトの既存免疫の相対的な欠如のために、いかなる対策も、ワクチンなしでは完全には効果的でない。効果的なSARS-CoV-2ワクチンが緊急に必要とされているため、多くの候補が、mRNAワクチン(1,2)、不活化全ウイルスワクチン(3)、サブユニットワクチン、DNAワクチン、及びウイルスベクターワクチン(4)を含む、様々なワクチンプラットフォームを用いて開発されている。これらのワクチン候補は、基本的には、SARS-CoV-2の表面に提示される主な構造タンパク質であるSARS-CoV-2のスパイク(S)タンパク質を標的とするように設計されている(5)。Sタンパク質は、ヒトにおけるアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)受容体への結合を介したウイルスの侵入を媒介する。Sタンパク質は、多くのB細胞及びT細胞エピトープを保有するウイルスの最も重要な抗原でもある(6～9)。そのほとんどが受容体-結合ドメイン(RBD)を標的とする中和抗体は、Sタンパク質によって誘導されることができる(9,10)。しかしながら、全世界のウイルス拡大を最終的に封じ込めるためには、ワクチンの効力だけでなく、とりわけ、限られた資源を有する中低所得国における、コスト及びスケーラビリティも極めて重要である。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされた前例のないコロナウイルス疾患2019(COVID-19)パンデミックは、2020年7月26日時点で、2019年末以来、50万人を超える死亡とともに、約1630万人の感染をもたらし、公衆衛生に脅威を与え続けている。ウイルスの拡大を軽減するために、対人距離の確保、マスクの着用、及び都市、州、又は国さえもの封鎖が実施され、医療と経済の両方に高い代償を払った。不幸なことに、このウイルスに対するヒトの既存免疫の相対的な欠如のために、いかなる対策も、ワクチンなしでは完全には効果的でない。効果的なSARS-CoV-2ワクチンが緊急に必要とされているため、多くの候補が、mRNAワクチン(1,2)、不活化全ウイルスワクチン(3)、サブユニットワクチン、DNAワクチン、及びウイルスベクターワクチン(4)を含む、様々なワクチンプラットフォームを用いて開発されている。これらのワクチン候補は、基本的には、SARS-CoV-2の表面に提示される主な構造タンパク質であるSARS-CoV-2のスパイク(S)タンパク質を標的とするように設計されている(5)。Sタンパク質は、ヒトにおけるアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)受容体への結合を介したウイルスの侵入を媒介する。Sタンパク質は、多くのB細胞及びT細胞エピトープを保有するウイルスの最も重要な抗原でもある(6～9)。そのほとんどが受容体-結合ドメイン(RBD)を標的とする中和抗体は、Sタンパク質によって誘導されることができる(9,10)。しかしながら、全世界のウイルス拡大を最終的に封じ込めるためには、ワクチンの効力だけでなく、とりわけ、限られた資源を有する中低所得国における、コスト及びスケーラビリティも極めて重要である。
本実施例は、SARS-CoV-2 Sタンパク質を発現するニューカッスル病ウイルス(NDV)ベクターの構築及び特徴付けを報告している。NDVは、パラミクソウイルス科のファミリーのアブラウイルスの属に属し、これは、通常はヒトで症状を引き起こさない鳥類病原体であるが、軽度のインフルエンザ様症状又は結膜炎がごく稀に記載されている。鳥で無発病性であることに加え、長潜伏期性のNDVワクチン株、例えば、LaSota株は、腫瘍溶解因子及びワクチンベクターとして使用されている(11～15)。巨大なマイナス鎖RNAウイルスとして、NDVは安定であり、導入遺伝子がそのゲノムに入るのを十分に許容する。NDVベクターは、他のコロナウイルスのスパイクタンパク質を発現するために使用されることに成功している(16,17)。NDVプラットフォームも魅力的であるが、その理由は、該ウイルスがインフルエンザウイルスワクチンを産生するためにも使用される有胚鶏卵中で高力価にまで成長するからである。ヒトは、通常、NDVに対する既存免疫を欠いており、そのため、該ウイルスが、ヒトアデノウイルス、麻疹ウイルス、又は改変ワクシニア・アンカラ(MVA)などの、ヒト病原体である他のウイルスベクターよりも好ましいものとなる。長潜伏期性NDVベクターは、ヒト治験で大規模に試験されているので、ヒトで安全であることが証明されている(18～20)。最も重要なことに、低コストで、NDVベクターワクチンを、バイオセーフティーレベル2(BSL-2)条件下、有胚鶏卵中で迅速に生成させて、世界的規模での莫大な需要を満たすことができる。本研究は、野生型(WT) S、並びにスパイクの細胞外ドメイン(多塩基性切断部位が欠失している)とNDV Fの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインとを含有するキメラバージョン(融合前S-Fキメラ)というSARS-CoV-2のスパイクタンパク質の2つの形態を発現する良好にレスキューされたNDVベクターを報告している。本実施例で提供されるデータは、WT S及びS-Fが感染細胞で導入遺伝子としてNDVから良好に発現されたことを示している。WT SとS-Fは両方ともNDV粒子の表面に提示されたが、NDV粒子へのS-Fの組込みは、予想通り、WT Sの組込みと比較して、大幅に改善された。スパイクタンパク質を発現する3つの生NDVベクター(NDV_LS_S、NDV_LS_S-F、及びNDV_LS/L289A_S-F)を用いたマウスにおける概念実証研究は、高力価の結合及び中和抗体が誘導されることを示した。3つのNDVベクターワクチンは全て、SARS-CoV-2マウス適合株の投与からマウスを完全に防御し、投与から4日後に、ウイルス力価及びウイルス抗原が肺で検出されないことを示した。結論として、NDV LaSota株を、BSL-2条件下で高収率に生成させることができるウイルスベクターとして用いて、費用効果の高い有望なSARS-CoV-2ワクチン候補が開発された。
(7.2 材料及び方法)
(プラスミド)
野生型Sの配列を、遺伝子末端(GE)、遺伝子開始点(GS)、及び5'末端のKozak配列を含有するプライマー(22)を用いるPCRによって、SARS-CoV-2分離株のスパイク遺伝子のコドン最適化されたヌクレオチド配列(GenBank: MN908947.3)をコードするpCAGGSプラスミド(21)から増幅させた。S-Fキメラを構築するために、多塩基性切断部位(CS、682RRAR685～A)を含まないSの細胞外ドメイン(22)をPCRによって作製した。NDV LaSota融合体(F)タンパク質の膜貫通ドメイン(TM)及び細胞質テール(CT)の哺乳動物細胞コドン最適化されたヌクレオチド配列は、商業的に合成した(gBlock, Integrated DNA technologies)。S細胞外ドメイン(CSなし)を、GSリンカー(GGGGS(配列番号24))を介して、FのTM/CTに融合させた。この配列を、GE、GS、及び5'のKozak配列を付加することにより再び修飾した。「6のルール」に従うために、追加のヌクレオチドを両方の挿入物の3'に付加した。導入遺伝子を、in-Fusionクローニング(Clontech)によって、pNDV LaSota(LS)野生型又はL289A(15、22、23)突然変異体(NDV_LS/L289A)アンチゲノムcDNAのP遺伝子とM遺伝子の間に挿入した。組換え産物をNEB(登録商標)の安定コンピテント大腸菌(NEB)に入れて形質転換し、NDV_LS_S、NDV_LS_S-F、及びNDV_LS/L289A_S-Fレスキュープラスミドを作製した。これらのプラスミドを、サンガーシークエンシング(Macrogen)用に、QIAprepスピンミニプレップキット(Qiagen)を用いて精製した。レスキュープラスミドのマキシプレップを、PureLink(商標) HiPureプラスミドマキシプレップキット(Thermo Fisher Scientific) を用いて精製した。
(プラスミド)
野生型Sの配列を、遺伝子末端(GE)、遺伝子開始点(GS)、及び5'末端のKozak配列を含有するプライマー(22)を用いるPCRによって、SARS-CoV-2分離株のスパイク遺伝子のコドン最適化されたヌクレオチド配列(GenBank: MN908947.3)をコードするpCAGGSプラスミド(21)から増幅させた。S-Fキメラを構築するために、多塩基性切断部位(CS、682RRAR685～A)を含まないSの細胞外ドメイン(22)をPCRによって作製した。NDV LaSota融合体(F)タンパク質の膜貫通ドメイン(TM)及び細胞質テール(CT)の哺乳動物細胞コドン最適化されたヌクレオチド配列は、商業的に合成した(gBlock, Integrated DNA technologies)。S細胞外ドメイン(CSなし)を、GSリンカー(GGGGS(配列番号24))を介して、FのTM/CTに融合させた。この配列を、GE、GS、及び5'のKozak配列を付加することにより再び修飾した。「6のルール」に従うために、追加のヌクレオチドを両方の挿入物の3'に付加した。導入遺伝子を、in-Fusionクローニング(Clontech)によって、pNDV LaSota(LS)野生型又はL289A(15、22、23)突然変異体(NDV_LS/L289A)アンチゲノムcDNAのP遺伝子とM遺伝子の間に挿入した。組換え産物をNEB(登録商標)の安定コンピテント大腸菌(NEB)に入れて形質転換し、NDV_LS_S、NDV_LS_S-F、及びNDV_LS/L289A_S-Fレスキュープラスミドを作製した。これらのプラスミドを、サンガーシークエンシング(Macrogen)用に、QIAprepスピンミニプレップキット(Qiagen)を用いて精製した。レスキュープラスミドのマキシプレップを、PureLink(商標) HiPureプラスミドマキシプレップキット(Thermo Fisher Scientific) を用いて精製した。
(細胞)
T7ポリメラーゼを安定発現するBSRT7細胞は、ISMMSのBenhur Lee博士から提供していただいた。この細胞を、10％(vol/vol)胎仔ウシ血清(FBS)及び100ユニット/mlのペニシリン/ストレプトマイシン(P/S; Gibco)を含有するダルベッコの改変イーグル培地(DMEM; Gibco)中、37℃、5％CO2で維持した。Vero E6細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC, CRL-1586)から入手した。Vero E6細胞も、100ユニット/mlのP/Sとともに10％FBSを含有するDMEM中、37℃、5％CO2で維持した。
T7ポリメラーゼを安定発現するBSRT7細胞は、ISMMSのBenhur Lee博士から提供していただいた。この細胞を、10％(vol/vol)胎仔ウシ血清(FBS)及び100ユニット/mlのペニシリン/ストレプトマイシン(P/S; Gibco)を含有するダルベッコの改変イーグル培地(DMEM; Gibco)中、37℃、5％CO2で維持した。Vero E6細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC, CRL-1586)から入手した。Vero E6細胞も、100ユニット/mlのP/Sとともに10％FBSを含有するDMEM中、37℃、5％CO2で維持した。
(SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を発現するNDV LaSotaのレスキュー)
トランスフェクションの前日に、BSRT7細胞の6-ウェルプレートに、ウェル当たり3×105個の細胞を播種した。翌日、4μgのpNDV_LS_S又はpNDV_LS_S-F又はpNDV_LS/L289A_S-F、2μgのpTM1-NP、1μgのpTM1-P、1μgのpTM1-L、及び2μgのpCI-T7optを含む250μlのOpti-MEM(Gibco)からなるトランスフェクションカクテルを調製した。30μlのTransIT LT1(Mirus)をプラスミドカクテルに添加し、3回のピペッティングによって穏やかに混合し、室温(RT)で30分間インキュベートした。インキュベーションの終わり頃に、培地を1mlのOpti-MEMと交換した。トランスフェクション複合体を各々のウェルに滴加し、プレートを、37℃、5％CO2でインキュベートした。トランスフェクションから48時間後、上清及び細胞を回収し、インスリンシリンジを用いる数回のストロークによって、短くホモジナイズした。200μlの細胞/上清混合物を8～10日齢の特定病原体不在(SPF)の有胚鶏卵の尿膜腔に注入した。これらの卵を37℃で3日間インキュベートし、その後、4℃で一晩冷却した。尿膜腔液を回収し、低回転遠心分離によって清澄化して、破片を除去した。レスキューされたNDVの存在を、0.5％ニワトリ又はシチメンチョウ赤血球を用いる赤血球凝集(HA)アッセイによって決定した。陽性試料のRNAを抽出し、DNアーゼI(Thermo Fisher Scientific)で処理した。逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実施して、導入遺伝子を増幅させた。導入遺伝子の配列をサンガーシークエンシング(Genewiz)によって確認した。
トランスフェクションの前日に、BSRT7細胞の6-ウェルプレートに、ウェル当たり3×105個の細胞を播種した。翌日、4μgのpNDV_LS_S又はpNDV_LS_S-F又はpNDV_LS/L289A_S-F、2μgのpTM1-NP、1μgのpTM1-P、1μgのpTM1-L、及び2μgのpCI-T7optを含む250μlのOpti-MEM(Gibco)からなるトランスフェクションカクテルを調製した。30μlのTransIT LT1(Mirus)をプラスミドカクテルに添加し、3回のピペッティングによって穏やかに混合し、室温(RT)で30分間インキュベートした。インキュベーションの終わり頃に、培地を1mlのOpti-MEMと交換した。トランスフェクション複合体を各々のウェルに滴加し、プレートを、37℃、5％CO2でインキュベートした。トランスフェクションから48時間後、上清及び細胞を回収し、インスリンシリンジを用いる数回のストロークによって、短くホモジナイズした。200μlの細胞/上清混合物を8～10日齢の特定病原体不在(SPF)の有胚鶏卵の尿膜腔に注入した。これらの卵を37℃で3日間インキュベートし、その後、4℃で一晩冷却した。尿膜腔液を回収し、低回転遠心分離によって清澄化して、破片を除去した。レスキューされたNDVの存在を、0.5％ニワトリ又はシチメンチョウ赤血球を用いる赤血球凝集(HA)アッセイによって決定した。陽性試料のRNAを抽出し、DNアーゼI(Thermo Fisher Scientific)で処理した。逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実施して、導入遺伝子を増幅させた。導入遺伝子の配列をサンガーシークエンシング(Genewiz)によって確認した。
(免疫蛍光アッセイ(IFA))
Vero E6細胞を、96-ウェル組織培養プレートに、ウェル当たり2.5×104細胞で播種した。翌日、細胞を100μlの温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、50μlの尿膜腔液を37℃で1時間感染させた。接種源を除去し、100μlの成長培地と交換した。その後、プレートを37℃でインキュベートした。感染から16～18時間後、細胞を100μlの温PBSで洗浄し、4％メタノール非含有パラホルムアルデヒド(PFA)(Electron Microscopy Sciences)で、4℃で15分間固定した。PFAを廃棄し、細胞をPBSで洗浄し、0.5％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBS中、4℃で1時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを廃棄し、表面タンパク質を抗NDVウサギ血清又はSARS-CoV-2スパイク受容体-結合ドメイン(RBD)特異的ヒトモノクローナル抗体CR3022(24,25)で、RTで2時間染色した。一次抗体を廃棄し、その後、細胞をPBSで3回洗浄し、ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488又はヤギ抗ヒトAlexa Fluor 488二次抗体(Thermo Fisher Scientific)とともにRTで1時間インキュベートした。二次抗体を廃棄し、細胞をPBSで再び3回洗浄し、EVOS fl倒立蛍光顕微鏡(AMG)を用いて、画像を取り込んだ。
Vero E6細胞を、96-ウェル組織培養プレートに、ウェル当たり2.5×104細胞で播種した。翌日、細胞を100μlの温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、50μlの尿膜腔液を37℃で1時間感染させた。接種源を除去し、100μlの成長培地と交換した。その後、プレートを37℃でインキュベートした。感染から16～18時間後、細胞を100μlの温PBSで洗浄し、4％メタノール非含有パラホルムアルデヒド(PFA)(Electron Microscopy Sciences)で、4℃で15分間固定した。PFAを廃棄し、細胞をPBSで洗浄し、0.5％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBS中、4℃で1時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを廃棄し、表面タンパク質を抗NDVウサギ血清又はSARS-CoV-2スパイク受容体-結合ドメイン(RBD)特異的ヒトモノクローナル抗体CR3022(24,25)で、RTで2時間染色した。一次抗体を廃棄し、その後、細胞をPBSで3回洗浄し、ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 488又はヤギ抗ヒトAlexa Fluor 488二次抗体(Thermo Fisher Scientific)とともにRTで1時間インキュベートした。二次抗体を廃棄し、細胞をPBSで再び3回洗浄し、EVOS fl倒立蛍光顕微鏡(AMG)を用いて、画像を取り込んだ。
(ウイルス力価測定)
S又はS-Fタンパク質を発現するNDVのストックを、免疫蛍光アッセイ(IFA)を用いて力価測定した。簡潔に述べると、感染前日に、Vero細胞を、96-ウェル(Denville)組織培養プレートに、2.5×104細胞/ウェルで播種した。翌日、各々のウイルスストックの5倍段階希釈液を別々の96-ウェルプレート中でOpti-MEM(Gibco)に入れて調製した。96-ウェルプレート中の培地を除去し、細胞を100μLの温PBSで洗浄した。50μLのウイルス希釈液を各々のウェルに添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、細胞が均一に感染することを保証するために、15分毎に振盪させた。接種源を除去し、100ユニット/mlのP/Sとともに10％FBSを含有する100μLのDMEMを添加した。プレートを、37℃で16～18時間、終夜インキュベートした。翌日、培地を吸引除去し、細胞を100μLの温PBSで1回洗浄した。IFAを上記のように実施して、NDV表面糖タンパク質を染色した。未希釈のウェルから、希釈を進めて、計数可能な数の細胞を有するウェルが見つかるまで、感染した蛍光細胞を計数した。ウェル全体の蛍光細胞を計数した。ウイルスの力価(1ml当たりのフォーカス形成単位、FFU)を、以下の式:力価(FFU/ml)＝蛍光細胞の数×希釈係数×(1000uL/感染容量)によって決定した。
S又はS-Fタンパク質を発現するNDVのストックを、免疫蛍光アッセイ(IFA)を用いて力価測定した。簡潔に述べると、感染前日に、Vero細胞を、96-ウェル(Denville)組織培養プレートに、2.5×104細胞/ウェルで播種した。翌日、各々のウイルスストックの5倍段階希釈液を別々の96-ウェルプレート中でOpti-MEM(Gibco)に入れて調製した。96-ウェルプレート中の培地を除去し、細胞を100μLの温PBSで洗浄した。50μLのウイルス希釈液を各々のウェルに添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、細胞が均一に感染することを保証するために、15分毎に振盪させた。接種源を除去し、100ユニット/mlのP/Sとともに10％FBSを含有する100μLのDMEMを添加した。プレートを、37℃で16～18時間、終夜インキュベートした。翌日、培地を吸引除去し、細胞を100μLの温PBSで1回洗浄した。IFAを上記のように実施して、NDV表面糖タンパク質を染色した。未希釈のウェルから、希釈を進めて、計数可能な数の細胞を有するウェルが見つかるまで、感染した蛍光細胞を計数した。ウェル全体の蛍光細胞を計数した。ウイルスの力価(1ml当たりのフォーカス形成単位、FFU)を、以下の式:力価(FFU/ml)＝蛍光細胞の数×希釈係数×(1000uL/感染容量)によって決定した。
(ウイルス濃縮)
尿膜液を、Sorvall Legend RT Plus冷蔵ベンチトップ式遠心分離機(Thermo Fisher Scientific)を用いる4,000rpmでの遠心分離によって、4℃で30分間清澄化した。尿膜腔液中のウイルスを、Beckman SW28ローター(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)を用いる、25,000rpm、4℃、2時間のBeckman L7-65超遠心分離機での遠心分離により、NTEバッファー(100mM NaCl、10mM Tris-HCl、1mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH 7.4)中の20％スクロースクッションに通してペレット化した。上清を吸引し、ペレットをPBS(pH 7.4)に再懸濁させた。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(Thermo Fisher Scientific)を用いて、タンパク質含量を決定した。
尿膜液を、Sorvall Legend RT Plus冷蔵ベンチトップ式遠心分離機(Thermo Fisher Scientific)を用いる4,000rpmでの遠心分離によって、4℃で30分間清澄化した。尿膜腔液中のウイルスを、Beckman SW28ローター(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)を用いる、25,000rpm、4℃、2時間のBeckman L7-65超遠心分離機での遠心分離により、NTEバッファー(100mM NaCl、10mM Tris-HCl、1mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH 7.4)中の20％スクロースクッションに通してペレット化した。上清を吸引し、ペレットをPBS(pH 7.4)に再懸濁させた。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(Thermo Fisher Scientific)を用いて、タンパク質含量を決定した。
(ウェスタンブロット)
濃縮ウイルス試料を、NuPAGE(商標)試料還元剤(10×)(Thermo Fisher Scientific)を含むNovex(商標) Tris-グリシンSDS試料バッファー(2×)(Thermo Fisher Scientific)と混合した。試料を95℃で5分間加熱した。2μgの濃縮ウイルスを、Novex(商標)Sharpプレステインドタンパク質標準(Thermo Fisher Scientific)をマーカーとして用いて、4-20％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲル(Biorad)上で分解した。タンパク質を二フッ化ポリビニリデン(PVDF)メンブレン(GE healthcare)に転写した。メンブレンを、0.1％v/v Tween 20(PBST)を含有するPBS中の5％粉ミルクで、RTで1時間ブロッキングした。メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄し(毎回、RTで10分)、1％BSAを含有するPBSTに希釈した一次抗体とともに、4℃で一晩インキュベートした。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を検出するために、ISMMSのThomas Moran博士から提供していただいたマウスモノクローナル抗体2B3E5を使用し、その一方で、HNタンパク質は、マウスモノクローナル抗体8H2(MCA2822, Bio-Rad)によって検出した。その後、メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄し(毎回、RTで10分)、5％粉ミルクを含有するPBSTに希釈した(1:2000)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と連結されたヒツジ抗マウスIgGとともに、RTで1時間インキュベートした。二次抗体を廃棄し、メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄した(毎回、RTで10分)。Pierce(商標) ECLウェスタンブロッティング基質(Thermo Fisher Scientific)をメンブレンに添加し、Bio-Rad Universal Hood Ii分子イメージャー(Bio-Rad)を用いて、ブロットをイメージングし、Image Labソフトウェア(Bio-Rad)によって処理した。
濃縮ウイルス試料を、NuPAGE(商標)試料還元剤(10×)(Thermo Fisher Scientific)を含むNovex(商標) Tris-グリシンSDS試料バッファー(2×)(Thermo Fisher Scientific)と混合した。試料を95℃で5分間加熱した。2μgの濃縮ウイルスを、Novex(商標)Sharpプレステインドタンパク質標準(Thermo Fisher Scientific)をマーカーとして用いて、4-20％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲル(Biorad)上で分解した。タンパク質を二フッ化ポリビニリデン(PVDF)メンブレン(GE healthcare)に転写した。メンブレンを、0.1％v/v Tween 20(PBST)を含有するPBS中の5％粉ミルクで、RTで1時間ブロッキングした。メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄し(毎回、RTで10分)、1％BSAを含有するPBSTに希釈した一次抗体とともに、4℃で一晩インキュベートした。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を検出するために、ISMMSのThomas Moran博士から提供していただいたマウスモノクローナル抗体2B3E5を使用し、その一方で、HNタンパク質は、マウスモノクローナル抗体8H2(MCA2822, Bio-Rad)によって検出した。その後、メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄し(毎回、RTで10分)、5％粉ミルクを含有するPBSTに希釈した(1:2000)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と連結されたヒツジ抗マウスIgGとともに、RTで1時間インキュベートした。二次抗体を廃棄し、メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄した(毎回、RTで10分)。Pierce(商標) ECLウェスタンブロッティング基質(Thermo Fisher Scientific)をメンブレンに添加し、Bio-Rad Universal Hood Ii分子イメージャー(Bio-Rad)を用いて、ブロットをイメージングし、Image Labソフトウェア(Bio-Rad)によって処理した。
(マウス免疫)
10週齢の雌BALB/cJマウス(Jackson Laboratories)を使用した。実験は、マウントサイナイ医科大学(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに準拠して実施した。マウスを、4種の異なる濃縮生ウイルスが2つの用量(10μg及び50μg)で筋肉内(i.m)投与される9グループ(n=5)に分けた。具体的には、グループ1(マウス当たり10μg)及び2(マウス当たり50μg)には、野生型NDV_LSを投与し;グループ3(マウス当たり10μg)及び4(マウス当たり50μg)には、NDV_LS_Sを投与し;グループ5(10μg)及び6(50μg)には、NDV_LS_S-Fを投与し、グループ7(マウス当たり10μg)及び8(マウス当たり50μg)には、NDV_LS/L289A_S-Fを投与した。PBSが投与されるグループ9を陰性対照として使用した。プライム-ブースト免疫レジメンを全てのグループに3週間間隔で使用した。
10週齢の雌BALB/cJマウス(Jackson Laboratories)を使用した。実験は、マウントサイナイ医科大学(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに準拠して実施した。マウスを、4種の異なる濃縮生ウイルスが2つの用量(10μg及び50μg)で筋肉内(i.m)投与される9グループ(n=5)に分けた。具体的には、グループ1(マウス当たり10μg)及び2(マウス当たり50μg)には、野生型NDV_LSを投与し;グループ3(マウス当たり10μg)及び4(マウス当たり50μg)には、NDV_LS_Sを投与し;グループ5(10μg)及び6(50μg)には、NDV_LS_S-Fを投与し、グループ7(マウス当たり10μg)及び8(マウス当たり50μg)には、NDV_LS/L289A_S-Fを投与した。PBSが投与されるグループ9を陰性対照として使用した。プライム-ブースト免疫レジメンを全てのグループに3週間間隔で使用した。
(酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA))
免疫されたマウスをブースト前及びブーストから8日後に採血した。血清を低速遠心分離によって単離した。ELISAを実施するために、Immulon 4 HBX 96-ウェルELISAプレート(Thermo Fisher Scientific)を、コーティングバッファー(SeraCare Life Sciences社)中の2μg/mlの組換え三量体Sタンパク質(ウェル当たり50μl)で、4℃で一晩コーティングした(21)。翌日、全てのプレートを、0.1％(v/v) Tween-20(PBST)を含有する220μLのPBSで3回洗浄し、220μLのブロッキング溶液(3％ヤギ血清、0.5％粉ミルク、96.5％PBST)を各々のウェルに添加し、RTで1時間インキュベートした。マウス血清を、1:30から始めて、ブロッキング溶液に3倍段階希釈し、その後、RTで2時間インキュベートした。ELISAプレートをPBSTで3回洗浄し、50μLのヒツジ抗マウスIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体(GE Healthcare)を1:3,000の希釈でブロッキング溶液中に添加した。その後、プレートをRTで1時間再びインキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのo-フェニレンジアミン二塩酸塩(SigmaFast OPD, Sigma)基質をウェル毎に添加した。10分後、50μLの3M塩酸(HCl)を各々のウェルに添加して、反応を停止させ、光学密度(OD)をSynergy 4プレートリーダー(BioTek)で492nmで測定した。ブランクウェルのOD値の平均＋3標準偏差を用いて、プレートブランク外れ値のカットオフを設定した。カットオフ値を、終点力価を計算するために使用される各々のプレートについて確定した。GraphPad Prism 7.0を用いて、血清IgG応答の終点力価をグラフ化した。
免疫されたマウスをブースト前及びブーストから8日後に採血した。血清を低速遠心分離によって単離した。ELISAを実施するために、Immulon 4 HBX 96-ウェルELISAプレート(Thermo Fisher Scientific)を、コーティングバッファー(SeraCare Life Sciences社)中の2μg/mlの組換え三量体Sタンパク質(ウェル当たり50μl)で、4℃で一晩コーティングした(21)。翌日、全てのプレートを、0.1％(v/v) Tween-20(PBST)を含有する220μLのPBSで3回洗浄し、220μLのブロッキング溶液(3％ヤギ血清、0.5％粉ミルク、96.5％PBST)を各々のウェルに添加し、RTで1時間インキュベートした。マウス血清を、1:30から始めて、ブロッキング溶液に3倍段階希釈し、その後、RTで2時間インキュベートした。ELISAプレートをPBSTで3回洗浄し、50μLのヒツジ抗マウスIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体(GE Healthcare)を1:3,000の希釈でブロッキング溶液中に添加した。その後、プレートをRTで1時間再びインキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのo-フェニレンジアミン二塩酸塩(SigmaFast OPD, Sigma)基質をウェル毎に添加した。10分後、50μLの3M塩酸(HCl)を各々のウェルに添加して、反応を停止させ、光学密度(OD)をSynergy 4プレートリーダー(BioTek)で492nmで測定した。ブランクウェルのOD値の平均＋3標準偏差を用いて、プレートブランク外れ値のカットオフを設定した。カットオフ値を、終点力価を計算するために使用される各々のプレートについて確定した。GraphPad Prism 7.0を用いて、血清IgG応答の終点力価をグラフ化した。
(マウスにおけるSARS-CoV-2投与)
SARS-CoV-2投与は、Ralph Baric博士のグループにより、ノースカロライナ大学(University of North Carolina)のバイオセーフティーレベル3(BSL-3)施設内で実施された。ブーストから11日後、104プラーク形成単位(PFU)のマウス適合SARS-CoV-2株を、以前に記載されている通りに、ケタミン/キシラジン麻酔下、鼻腔内(i.n)で用いて、マウスに投与した(1,26)。
SARS-CoV-2投与は、Ralph Baric博士のグループにより、ノースカロライナ大学(University of North Carolina)のバイオセーフティーレベル3(BSL-3)施設内で実施された。ブーストから11日後、104プラーク形成単位(PFU)のマウス適合SARS-CoV-2株を、以前に記載されている通りに、ケタミン/キシラジン麻酔下、鼻腔内(i.n)で用いて、マウスに投与した(1,26)。
(肺力価)
マウスの肺葉を回収し、PBS中でホモジナイズした。プラークアッセイを実施して、以前に記載されている通りに、肺ホモジネート中のウイルス力価を測定した(1,26)。GraphPad Prism 7.0を用いて、葉当たりのプラーク形成単位(PFU)の幾何平均力価を計算した。
マウスの肺葉を回収し、PBS中でホモジナイズした。プラークアッセイを実施して、以前に記載されている通りに、肺ホモジネート中のウイルス力価を測定した(1,26)。GraphPad Prism 7.0を用いて、葉当たりのプラーク形成単位(PFU)の幾何平均力価を計算した。
(マイクロ中和アッセイ)
中和アッセイは全て、以前に記載されている施設ガイドラインに従って、バイオセーフティーレベル3(BSL-3)施設で実施した(21,27)。簡潔に述べると、血清試料を使用前に56℃で60分間熱非働化した。グルタミン、炭酸水素ナトリウム、4-(2-ヒドロキシエチル)1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、及び抗生物質P/Sが補充された2×最小必須培地(MEM)をアッセイに使用した。Vero E6細胞を、10％胎仔ウシ血清(FBS)が補充されたDMEMを用いて、培養下で維持した。前日の夜に、ウェル当たり20,000個の細胞を96-ウェル細胞培養プレートに播種した。1×MEMを2×MEMから調製し、2％FBSを補充した。1:20のプール血清から始めた3倍段階希釈液を96-ウェル細胞培養プレート中で調製し、各々の希釈液を50％組織培養感染用量(TCID50)の600倍のSARS-CoV-2(USA-WA1/2020, BEI Resources NR-52281)と混合した。血清-ウイルス混合物を室温で1時間インキュベートした。ウイルス-血清混合物を細胞に1時間添加し、37℃インキュベーター中で保持した。次に、ウイルス-血清混合物を除去し、対応する血清希釈液を、1×MEMを添加しながら、細胞に添加した。細胞を2日間インキュベートし、ウェル当たり100μLの10％ホルムアルデヒドで24時間固定し、その後、BSL-3施設から持ち出した。細胞の染色は、バイオセーフティーキャビネット(BSL-2)内で実施した。ホルムアルデヒドを細胞から慎重に除去した。細胞を200μLのPBSで1回洗浄し、その後、0.1％Triton X-100を含有するPBSで、RTで15分間透過処理した。細胞をPBSで洗浄し、3％粉ミルクを含有するPBS中、RTで1時間ブロッキングした。その後、細胞を、ウェル当たり100μLのマウスモノクローナル抗NP抗体(1C7)(ISMMSのThomas Moran博士から提供していただいたもの)で、1μg/mlで、RTで1時間染色した。細胞をPBSで洗浄し、ウェル当たり100μLの抗マウスIgG HRP(Rockland、カタログ番号610-4302)二次抗体とともに、1％粉ミルクを含有するPBS中1:3,000希釈で、RTで1時間インキュベートした。最後に、細胞をPBSで2回洗浄し、100μLのSigmaFast OPD基質を用いて、プレートを顕色させた。10分後、ウェル当たり50μLの3M HCIを用いて、反応を停止させた。OD 492nMを、Biotek SynergyH1マイクロプレートリーダーで測定した。希釈曲線に対する非線形回帰曲線フィット解析(上下の制約は100％及び0％に設定)を、GraphPad Prism 7.0を用いて実施して、血清の阻害希釈の50％(ID50)を計算した。
中和アッセイは全て、以前に記載されている施設ガイドラインに従って、バイオセーフティーレベル3(BSL-3)施設で実施した(21,27)。簡潔に述べると、血清試料を使用前に56℃で60分間熱非働化した。グルタミン、炭酸水素ナトリウム、4-(2-ヒドロキシエチル)1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、及び抗生物質P/Sが補充された2×最小必須培地(MEM)をアッセイに使用した。Vero E6細胞を、10％胎仔ウシ血清(FBS)が補充されたDMEMを用いて、培養下で維持した。前日の夜に、ウェル当たり20,000個の細胞を96-ウェル細胞培養プレートに播種した。1×MEMを2×MEMから調製し、2％FBSを補充した。1:20のプール血清から始めた3倍段階希釈液を96-ウェル細胞培養プレート中で調製し、各々の希釈液を50％組織培養感染用量(TCID50)の600倍のSARS-CoV-2(USA-WA1/2020, BEI Resources NR-52281)と混合した。血清-ウイルス混合物を室温で1時間インキュベートした。ウイルス-血清混合物を細胞に1時間添加し、37℃インキュベーター中で保持した。次に、ウイルス-血清混合物を除去し、対応する血清希釈液を、1×MEMを添加しながら、細胞に添加した。細胞を2日間インキュベートし、ウェル当たり100μLの10％ホルムアルデヒドで24時間固定し、その後、BSL-3施設から持ち出した。細胞の染色は、バイオセーフティーキャビネット(BSL-2)内で実施した。ホルムアルデヒドを細胞から慎重に除去した。細胞を200μLのPBSで1回洗浄し、その後、0.1％Triton X-100を含有するPBSで、RTで15分間透過処理した。細胞をPBSで洗浄し、3％粉ミルクを含有するPBS中、RTで1時間ブロッキングした。その後、細胞を、ウェル当たり100μLのマウスモノクローナル抗NP抗体(1C7)(ISMMSのThomas Moran博士から提供していただいたもの)で、1μg/mlで、RTで1時間染色した。細胞をPBSで洗浄し、ウェル当たり100μLの抗マウスIgG HRP(Rockland、カタログ番号610-4302)二次抗体とともに、1％粉ミルクを含有するPBS中1:3,000希釈で、RTで1時間インキュベートした。最後に、細胞をPBSで2回洗浄し、100μLのSigmaFast OPD基質を用いて、プレートを顕色させた。10分後、ウェル当たり50μLの3M HCIを用いて、反応を停止させた。OD 492nMを、Biotek SynergyH1マイクロプレートリーダーで測定した。希釈曲線に対する非線形回帰曲線フィット解析(上下の制約は100％及び0％に設定)を、GraphPad Prism 7.0を用いて実施して、血清の阻害希釈の50％(ID50)を計算した。
(免疫組織化学(IHC))
マウスの肺葉を灌流し、10％リン酸緩衝ホルマリン中で7日間固定し、その後、BSL-3施設から移動させた。固定された肺をパラフィン包埋し、免疫組織化学(IHC)染色(HistoWiz)のために、5μmで切片化した。ウサギSARS-CoV-2ヌクレオカプシド(N)タンパク質(NB100-56576, Novus Biologicals)を用いて、IHCを実施した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。スライドは全て、有資格の動物病理学者(HistoWiz)によって調べられた。
マウスの肺葉を灌流し、10％リン酸緩衝ホルマリン中で7日間固定し、その後、BSL-3施設から移動させた。固定された肺をパラフィン包埋し、免疫組織化学(IHC)染色(HistoWiz)のために、5μmで切片化した。ウサギSARS-CoV-2ヌクレオカプシド(N)タンパク質(NB100-56576, Novus Biologicals)を用いて、IHCを実施した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。スライドは全て、有資格の動物病理学者(HistoWiz)によって調べられた。
(統計)
統計解析を、GraphPad Prism 7.0を用いて実施した。肺におけるウイルス力価の統計的差異を、一元配置分散分析(ANOVA)を用いて決定し、多重比較用のダネット検定を用いて補正した。
統計解析を、GraphPad Prism 7.0を用いて実施した。肺におけるウイルス力価の統計的差異を、一元配置分散分析(ANOVA)を用いて決定し、多重比較用のダネット検定を用いて補正した。
(7.3 結果)
(SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を発現するNDV LaSotaの設計及びレスキュー)
防御的免疫のために、Sタンパク質は、SARS-CoV-2の最も重要な抗原である。NDV LaSotaワクチン株によってS抗原を発現させるために、2つのコンストラクトを設計した。1つは、野生型スパイク(S)であり、もう1つは、スパイク-Fキメラ(S-F)である。S-Fは、タンパク質をその融合前の立体構造で安定させるために、多塩基性切断部位682RRAR685が3つのアルギニンを欠失させることにより除去されているSの細胞外ドメインからなる(21)。重要なことに、NDVビリオンの表面でのスパイクの膜固定を増大させるために、該スパイクの膜貫通ドメイン(TM)及び細胞質テール(CT)をNDVの融合(F)タンパク質由来のものと置き換えた(図8A)(28)。各々のコンストラクトのヌクレオチド配列を、WT NDV LaSota株及び/又はFタンパク質中の突然変異L289AがHN非依存的な融合を支持するNDV LaSota/L289A突然変異体株のアンチゲノムcDNAのP遺伝子とM遺伝子の間に挿入した(23)。後者のNDV突然変異体は、ヒトで安全に使用されている(15)(図8B)。該スパイクタンパク質を発現するNDVをBSRT7細胞の一過性トランスフェクションによってレスキューし、その後、有胚鶏卵中で増幅させた。S又はS-Fを発現するウイルスは全て、有胚鶏卵中で高力価(～108FFU/ml)にまで成長し(図8C)、これは、低コストワクチンの開発にとって有利である。
(SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を発現するNDV LaSotaの設計及びレスキュー)
防御的免疫のために、Sタンパク質は、SARS-CoV-2の最も重要な抗原である。NDV LaSotaワクチン株によってS抗原を発現させるために、2つのコンストラクトを設計した。1つは、野生型スパイク(S)であり、もう1つは、スパイク-Fキメラ(S-F)である。S-Fは、タンパク質をその融合前の立体構造で安定させるために、多塩基性切断部位682RRAR685が3つのアルギニンを欠失させることにより除去されているSの細胞外ドメインからなる(21)。重要なことに、NDVビリオンの表面でのスパイクの膜固定を増大させるために、該スパイクの膜貫通ドメイン(TM)及び細胞質テール(CT)をNDVの融合(F)タンパク質由来のものと置き換えた(図8A)(28)。各々のコンストラクトのヌクレオチド配列を、WT NDV LaSota株及び/又はFタンパク質中の突然変異L289AがHN非依存的な融合を支持するNDV LaSota/L289A突然変異体株のアンチゲノムcDNAのP遺伝子とM遺伝子の間に挿入した(23)。後者のNDV突然変異体は、ヒトで安全に使用されている(15)(図8B)。該スパイクタンパク質を発現するNDVをBSRT7細胞の一過性トランスフェクションによってレスキューし、その後、有胚鶏卵中で増幅させた。S又はS-Fを発現するウイルスは全て、有胚鶏卵中で高力価(～108FFU/ml)にまで成長し(図8C)、これは、低コストワクチンの開発にとって有利である。
(スパイクタンパク質はNDV粒子に組み込まれる)
導入遺伝子としてのS及びS-Fの発現を検証するために、Vero E6細胞をWT NDV又はSもしくはS-Fを発現するNDVに感染させた。該細胞の表面を抗NDVウサギ血清又はRBDを認識するスパイク特異的モノクローナル抗体CR3022で染色した。S又はS-Fを発現するNDVのみが細胞表面でのスパイクの強力な発現を示す一方、NDVタンパク質は、全てのウイルス感染細胞で検出されることが確認された(図9A)。これは、S及びS-FがNDVによって良好に発現されることを示している。S及びS-FのNDVビリオンへの組込みを調べるために、NDV_LS_S、NDV_LS_S-F、及びNDV_LS/L289A_S-Fを20％スクロースクッションに通して濃縮した。ペレットをPBSに再懸濁させた。WT NDV_LSを同じ方法で調製し、陰性対照として使用した。各々の濃縮ウイルスのタンパク質含量をBCAアッセイによって決定した。2μgの各々のウイルスをSDS-PAGEで分解した。ウェスタンブロットを実施し、S1タンパク質の線状エピトープに結合するマウスモノクローナル抗体2B3E5を用いて、スパイクの存在量を調べた。NDVウイルスヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ(HN)タンパク質の発現も濃縮ウイルスの内部対照として示した(図9B)。予想通り、SとS-Fは両方とも、NDV粒子に組み込まれた。注目すべきは、多塩基性切断部位(CS)を保有するWT Sが完全に切断されて、S1のみを示す一方、S-Fは、その融合前のS0段階で維持されたということである。重要なことに、WT又はL289A NDV_LS骨格のいずれかによって発現されたS-Fは、WT Sから切断されるS1よりも遙かに大きいS-Fの存在量によって示されるWT Sよりも優れたビリオンへの組込みを示した(図9B)。これは、S-Fキメラ中のFのTM/CTがスパイクの膜固定を実際に促進することを裏付けている。抗NDVウサギ血清は、これら3つのNDVベクターワクチンのフォーカス形成を完全に中和するので、及びS-Fコンストラクトは多塩基性切断部位を有さないという事実があるため、導入遺伝子の発現がこれらのウイルスの向性を変化させる可能性は低い。
導入遺伝子としてのS及びS-Fの発現を検証するために、Vero E6細胞をWT NDV又はSもしくはS-Fを発現するNDVに感染させた。該細胞の表面を抗NDVウサギ血清又はRBDを認識するスパイク特異的モノクローナル抗体CR3022で染色した。S又はS-Fを発現するNDVのみが細胞表面でのスパイクの強力な発現を示す一方、NDVタンパク質は、全てのウイルス感染細胞で検出されることが確認された(図9A)。これは、S及びS-FがNDVによって良好に発現されることを示している。S及びS-FのNDVビリオンへの組込みを調べるために、NDV_LS_S、NDV_LS_S-F、及びNDV_LS/L289A_S-Fを20％スクロースクッションに通して濃縮した。ペレットをPBSに再懸濁させた。WT NDV_LSを同じ方法で調製し、陰性対照として使用した。各々の濃縮ウイルスのタンパク質含量をBCAアッセイによって決定した。2μgの各々のウイルスをSDS-PAGEで分解した。ウェスタンブロットを実施し、S1タンパク質の線状エピトープに結合するマウスモノクローナル抗体2B3E5を用いて、スパイクの存在量を調べた。NDVウイルスヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ(HN)タンパク質の発現も濃縮ウイルスの内部対照として示した(図9B)。予想通り、SとS-Fは両方とも、NDV粒子に組み込まれた。注目すべきは、多塩基性切断部位(CS)を保有するWT Sが完全に切断されて、S1のみを示す一方、S-Fは、その融合前のS0段階で維持されたということである。重要なことに、WT又はL289A NDV_LS骨格のいずれかによって発現されたS-Fは、WT Sから切断されるS1よりも遙かに大きいS-Fの存在量によって示されるWT Sよりも優れたビリオンへの組込みを示した(図9B)。これは、S-Fキメラ中のFのTM/CTがスパイクの膜固定を実際に促進することを裏付けている。抗NDVウサギ血清は、これら3つのNDVベクターワクチンのフォーカス形成を完全に中和するので、及びS-Fコンストラクトは多塩基性切断部位を有さないという事実があるため、導入遺伝子の発現がこれらのウイルスの向性を変化させる可能性は低い。
(スパイクタンパク質を発現するNDV LaSotaによるマウスの免疫は強力な結合及び中和抗体を誘発した)
S又はS-Fを発現するNDVベクターのSARS-CoV-2に対するワクチン候補としての免疫原性を評価するために、原理実証研究をマウスで実施した。具体的には、生NDVが筋肉内でほとんど複製せず、哺乳動物で症状を引き起こさないので、BALB/cマウスを、生NDV_LS_S、NDV_LS_S-F、及びNDV_LS/L289A_S-Fで筋肉内免疫した。ここでは、プライム-ブースト免疫レジメンを3週間間隔で使用した。インビトロの血清学的アッセイのために、マウスをブースト前(プライム後)及びブーストから8日後に採血した(図10A)。NDV_LS_S(グループ3及び4)、NDV_LS_S-F(グループ5及び6)、並びにNDV_LS_S-F(グループ7及び8)を含む各々のNDVコンストラクトの2つの用量(10μg及び50μg)を図10Aに示されている通りに試験した。導入遺伝子を発現しないWT NDVでワクチン接種された動物(グループ1及び2)をベクターのみの対照として使用した。PBSのみを投与されたマウス(グループ9)を陰性対照として使用した。2回の採血からのマウス血清を回収した。血清IgG力価及び中和抗体力価を、それぞれ、ELISA及びマイクロ中和アッセイによって測定した。ELISAを実施するために、全長三量体スパイクタンパク質をELISAプレートにコーティングした。血清IgGの終点力価を読出しとして使用した(図10B)。1回目の免疫の後、スパイクタンパク質を発現する全てのNDVコンストラクトがS結合抗体を誘発したのに対し、WT NDVコンストラクト及びPBS対照はごくわずかな抗体結合シグナルしか示さなかった。2回目の免疫は、ブーストから約1週間後に、3つのNDVコンストラクト間で有意な差を示すことなく、抗体力価を有意に増大させた(図10B)。抗体の中和活性を、USA-WA1/2020 SARS-CoV-2株を用いて、マイクロ中和アッセイで測定した。各々のグループからのプール血清を技術的デュプリケートで試験した。ID50値をブースト後(29日目)血清の中和活性の読出しとして計算した。ワクチン接種された全てのグループからの血清が中和活性を示した。NDV_LS_S高用量(50μg)ワクチン接種グループからの血清の中和力価(ID50≒444)は、低用量(10μg)ワクチン接種グループからの血清の中和力価(ID50≒178)よりもわずかに高いように見えた。NDV_LS_S-F及びNDV_LS/L289A_S-Fコンストラクトを用いて、低用量グループと高用量グループの間に大きな差は認められなかった(図10C)。これらグループの中和力価は、NDV_LS_S高用量(50μg)グループと同等である。まとめると、S又はS-Fを発現するように改変されているNDVベクターは全て、高力価の結合及び中和抗体をマウスで誘発した。WT S及びS-Fコンストラクトは、マウスに筋肉内投与される生NDVベクターによって発現されたとき、同様の免疫原性を示すように見えた。
S又はS-Fを発現するNDVベクターのSARS-CoV-2に対するワクチン候補としての免疫原性を評価するために、原理実証研究をマウスで実施した。具体的には、生NDVが筋肉内でほとんど複製せず、哺乳動物で症状を引き起こさないので、BALB/cマウスを、生NDV_LS_S、NDV_LS_S-F、及びNDV_LS/L289A_S-Fで筋肉内免疫した。ここでは、プライム-ブースト免疫レジメンを3週間間隔で使用した。インビトロの血清学的アッセイのために、マウスをブースト前(プライム後)及びブーストから8日後に採血した(図10A)。NDV_LS_S(グループ3及び4)、NDV_LS_S-F(グループ5及び6)、並びにNDV_LS_S-F(グループ7及び8)を含む各々のNDVコンストラクトの2つの用量(10μg及び50μg)を図10Aに示されている通りに試験した。導入遺伝子を発現しないWT NDVでワクチン接種された動物(グループ1及び2)をベクターのみの対照として使用した。PBSのみを投与されたマウス(グループ9)を陰性対照として使用した。2回の採血からのマウス血清を回収した。血清IgG力価及び中和抗体力価を、それぞれ、ELISA及びマイクロ中和アッセイによって測定した。ELISAを実施するために、全長三量体スパイクタンパク質をELISAプレートにコーティングした。血清IgGの終点力価を読出しとして使用した(図10B)。1回目の免疫の後、スパイクタンパク質を発現する全てのNDVコンストラクトがS結合抗体を誘発したのに対し、WT NDVコンストラクト及びPBS対照はごくわずかな抗体結合シグナルしか示さなかった。2回目の免疫は、ブーストから約1週間後に、3つのNDVコンストラクト間で有意な差を示すことなく、抗体力価を有意に増大させた(図10B)。抗体の中和活性を、USA-WA1/2020 SARS-CoV-2株を用いて、マイクロ中和アッセイで測定した。各々のグループからのプール血清を技術的デュプリケートで試験した。ID50値をブースト後(29日目)血清の中和活性の読出しとして計算した。ワクチン接種された全てのグループからの血清が中和活性を示した。NDV_LS_S高用量(50μg)ワクチン接種グループからの血清の中和力価(ID50≒444)は、低用量(10μg)ワクチン接種グループからの血清の中和力価(ID50≒178)よりもわずかに高いように見えた。NDV_LS_S-F及びNDV_LS/L289A_S-Fコンストラクトを用いて、低用量グループと高用量グループの間に大きな差は認められなかった(図10C)。これらグループの中和力価は、NDV_LS_S高用量(50μg)グループと同等である。まとめると、S又はS-Fを発現するように改変されているNDVベクターは全て、高力価の結合及び中和抗体をマウスで誘発した。WT S及びS-Fコンストラクトは、マウスに筋肉内投与される生NDVベクターによって発現されたとき、同様の免疫原性を示すように見えた。
(スパイクタンパク質を発現するNDV LaSotaによる免疫はマウス適合SARS-CoV-2の投与からマウスを防御する)
NDVコンストラクトによって誘導されるS特異的抗体のインビボ活性及び潜在的な細胞媒介性防御を評価するために、本発明者らは、BALB/cマウスで効率的に複製するマウス適合SARS-CoV-2株を利用した(1,26)。ブーストから11日後、免疫されたマウスに、104PFUのマウス適合SARS-CoV-2を投与し、投与から4日後の肺におけるウイルス力価を測定した。WT NDV及びPBSを投与されたマウスは、肺における高いウイルス力価を示した一方、S又はS-Fを発現するNDVを投与されたグループは全て、肺における検出可能なウイルス量を示さなかった(図11A)。これは、S及びS-Fを発現するNDVを用いるマウスのワクチン接種がSARS-CoV-2感染からマウスを防御することを示した。感染マウスの肺を、抗SARS-CoV-2 NP抗体を用いるIHC染色のために、10％中性緩衝化ホルマリン中で固定した。IHC染色は、SARS-CoV-2 NPタンパク質がNDV_LS WT又はPBSを投与されたマウスの肺で主に検出されることを示した。SARS-CoV-2 NPは、S又はS-Fタンパク質を発現する3つのNDVコンストラクトでワクチン接種されたマウスの肺には存在しなかった(図11B)。これらのデータは、3つ全てのNDVベクターワクチンがマウスモデルでSARS-CoV-2感染を効率的に予防することができることを示した。
NDVコンストラクトによって誘導されるS特異的抗体のインビボ活性及び潜在的な細胞媒介性防御を評価するために、本発明者らは、BALB/cマウスで効率的に複製するマウス適合SARS-CoV-2株を利用した(1,26)。ブーストから11日後、免疫されたマウスに、104PFUのマウス適合SARS-CoV-2を投与し、投与から4日後の肺におけるウイルス力価を測定した。WT NDV及びPBSを投与されたマウスは、肺における高いウイルス力価を示した一方、S又はS-Fを発現するNDVを投与されたグループは全て、肺における検出可能なウイルス量を示さなかった(図11A)。これは、S及びS-Fを発現するNDVを用いるマウスのワクチン接種がSARS-CoV-2感染からマウスを防御することを示した。感染マウスの肺を、抗SARS-CoV-2 NP抗体を用いるIHC染色のために、10％中性緩衝化ホルマリン中で固定した。IHC染色は、SARS-CoV-2 NPタンパク質がNDV_LS WT又はPBSを投与されたマウスの肺で主に検出されることを示した。SARS-CoV-2 NPは、S又はS-Fタンパク質を発現する3つのNDVコンストラクトでワクチン接種されたマウスの肺には存在しなかった(図11B)。これらのデータは、3つ全てのNDVベクターワクチンがマウスモデルでSARS-CoV-2感染を効率的に予防することができることを示した。
(7.4 考察)
2019年末以来の進行中のCOVID-19パンデミックの結果は、失望させるものである。元凶であるSARS-CoV-2の高い伝播率、及びこのウイルスに対するヒトの実質的な既存免疫の欠如のために、多くの人々、とりわけ、高齢者及び基礎疾患を有する人々がCOVID-19で亡くなった。治療対策と予防対策(29～31)はどちらも、今なお、急ぎ開発中であるが、限られた資源で大きな負担を抱えた医療システムにとって十分な効果があると思われる治療は、現在、利用できない。ワクチンは、COVID-19を予防するか、又は少なくともその症状を軽減するために必要である。多くのワクチン候補が前臨床試験又は臨床試験で試験中であるので、低中所得国における費用効果の高い生産のためのワクチンはまだ開発されておらず、今なお非常に不足している。また、ワクチンを買う余裕がある少数の高所得者層のワクチン接種が世界人口における疾患の拡大を効率的に予防することはなかった。本報告では、SARS-CoV-2の主要な抗原を発現するNDVをベースにした有望なウイルスベクターワクチン候補が記載されている。このNDVベクターは、野生型S又は膜固定が改良された融合前スパイク(S-F)のいずれかを発現するように改変された。これらのNDVベクターワクチンは、巨大な導入遺伝子がNDVゲノムに挿入されるという事実にもかかわらず、有胚鶏卵中での強い成長を示した。重要なことに、スパイクタンパク質は、感染細胞で良好に発現され、S-Fコンストラクトは、NDV粒子への優れた組込みを示し、これは、不活化ウイルスワクチンとしても同様に使用することができる可能性があった。
2019年末以来の進行中のCOVID-19パンデミックの結果は、失望させるものである。元凶であるSARS-CoV-2の高い伝播率、及びこのウイルスに対するヒトの実質的な既存免疫の欠如のために、多くの人々、とりわけ、高齢者及び基礎疾患を有する人々がCOVID-19で亡くなった。治療対策と予防対策(29～31)はどちらも、今なお、急ぎ開発中であるが、限られた資源で大きな負担を抱えた医療システムにとって十分な効果があると思われる治療は、現在、利用できない。ワクチンは、COVID-19を予防するか、又は少なくともその症状を軽減するために必要である。多くのワクチン候補が前臨床試験又は臨床試験で試験中であるので、低中所得国における費用効果の高い生産のためのワクチンはまだ開発されておらず、今なお非常に不足している。また、ワクチンを買う余裕がある少数の高所得者層のワクチン接種が世界人口における疾患の拡大を効率的に予防することはなかった。本報告では、SARS-CoV-2の主要な抗原を発現するNDVをベースにした有望なウイルスベクターワクチン候補が記載されている。このNDVベクターは、野生型S又は膜固定が改良された融合前スパイク(S-F)のいずれかを発現するように改変された。これらのNDVベクターワクチンは、巨大な導入遺伝子がNDVゲノムに挿入されるという事実にもかかわらず、有胚鶏卵中での強い成長を示した。重要なことに、スパイクタンパク質は、感染細胞で良好に発現され、S-Fコンストラクトは、NDV粒子への優れた組込みを示し、これは、不活化ウイルスワクチンとしても同様に使用することができる可能性があった。
原理実証研究において、生NDVベクターワクチンを2回筋肉内投与されたマウスは、高レベルのスパイク特異的な中和抗体を発生させた。S又はS-Fを発現するNDVベクターを投与されたマウスは、マウス適合SARS-CoV-2株の投与から同様に良好に防御され、肺における検出可能な感染性ウイルス又はウイルス抗原を示さなかった一方、高いウイルス力価が導入遺伝子を発現しないWT NDV又はPBSを投与されたマウスの肺で観察された。本研究において、顕著な用量依存的抗体応答は見られず、これは、ヒト治験で様々な用量(100μg及び250μg)のmRNAワクチンについて観察されたものと同様であった(2)。投与研究のためにマウスをノースカロライナ大学に移動させなければならないという問題が原因で、ピーク抗体応答が測定されなかったか、又は低用量の10μgの濃縮ウイルスをマウスで用いて、抗体応答上限に達した可能性がある。本研究において、細胞性免疫は測定されなかったが、これは、今後の研究で検討すべき対象となるであろう。それでもやはり、本研究は、NDVベクターワクチンが高レベルの防御抗体を誘導するSARS-CoV-2の免疫原性スパイクタンパク質を発現するので、このワクチンが有望であることを強く支持している。ヒトが曝露され得る他のウイルスベクターとは異なり、NDVベクターは、ヒトにおける既存の免疫応答に直面することなく、スパイク抗原をより効率的に送達する。重要なことに、NDVベクターワクチンは、大規模製造に関して費用効果が高いだけでなく、インフルエンザウイルスワクチン生産技術を用いて、BSL-2条件下で生産することもできる。まとめると、NDVベクターのSARS-CoV-2ワクチンは、既存のインフラを用いて費用効果の高い方法で生産することができる安全でかつ免疫原性のある他のSARS-CoV-2ワクチンの代替物である。
(7.5 実施例2で引用されている参考文献)
(7.5 実施例2で引用されている参考文献)
(8.実施例3: SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を発現するニューカッスル病ウイルス(NDV)で免疫されたマウスの血清における血清IgG力価)
C57BL/6マウスを、105ffu/マウスのNDV_LS_S、NDV_LS_S-F、NDV_LS/L289A_S-F、又はNDV_LS_RBD(分泌型RBDは導入遺伝子として発現された)で鼻腔内(i.n.)免疫した。NDV_LS_S、NDV_LS_S-F、NDV_LS/L289A_S-Fコンストラクトの説明については、実施例2を参照されたい。野生型NDV_LSを、陰性対照として、マウスのグループに105ffu/マウスで投与した。ここでは、プライム-ブースト免疫レジメンを使用した。マウスをプライミングし、6週間後、マウスの各々のグループを採血し、その後、同じ用量の同じウイルスでブーストした。インビトロの血清学的アッセイのために、マウスをブースト前(プライム後)に採血した(図12A)。導入遺伝子を発現しないWT NDVでワクチン接種された動物(グループ5)をベクターのみの対照として使用した。血清IgG力価をELISAによって測定した。ELISAを実施するために、全長三量体スパイクタンパク質をELISAプレートにコーティングした。血清IgGの終点力価を読出しとして使用した(図12B)。1回の免疫の後、スパイクタンパク質を発現する全てのNDVコンストラクトがS結合抗体を誘発したのに対し、WT NDVコンストラクト(グループ5)及びNDV_LS_RBDコンストラクト(グループ4)は、ごくわずかな抗体結合シグナルしか示さない。
C57BL/6マウスを、105ffu/マウスのNDV_LS_S、NDV_LS_S-F、NDV_LS/L289A_S-F、又はNDV_LS_RBD(分泌型RBDは導入遺伝子として発現された)で鼻腔内(i.n.)免疫した。NDV_LS_S、NDV_LS_S-F、NDV_LS/L289A_S-Fコンストラクトの説明については、実施例2を参照されたい。野生型NDV_LSを、陰性対照として、マウスのグループに105ffu/マウスで投与した。ここでは、プライム-ブースト免疫レジメンを使用した。マウスをプライミングし、6週間後、マウスの各々のグループを採血し、その後、同じ用量の同じウイルスでブーストした。インビトロの血清学的アッセイのために、マウスをブースト前(プライム後)に採血した(図12A)。導入遺伝子を発現しないWT NDVでワクチン接種された動物(グループ5)をベクターのみの対照として使用した。血清IgG力価をELISAによって測定した。ELISAを実施するために、全長三量体スパイクタンパク質をELISAプレートにコーティングした。血清IgGの終点力価を読出しとして使用した(図12B)。1回の免疫の後、スパイクタンパク質を発現する全てのNDVコンストラクトがS結合抗体を誘発したのに対し、WT NDVコンストラクト(グループ5)及びNDV_LS_RBDコンストラクト(グループ4)は、ごくわずかな抗体結合シグナルしか示さない。
(9.実施例4: NDV_LS/L289A骨格によって発現されるS-FキメラHexaProタンパク質のビリオンへの組込み)
実施例2に記載されているNDVコンストラクトNDV_LS/L289A_S-FによってコードされるS-Fタンパク質を、6つのプロリン置換を含むように修飾した。特に、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基をプロリンと置換した。S-FキメラHexaProタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びS-FキメラHexaProタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号14及び15に提供されている。S-FキメラHexaProタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むNDVコンストラクトは、「NDV_LS/L289A_S-F HexaPro」と称される。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を発現するNDVを実施例2に記載されている通りにレスキューし、S-F導入遺伝子のビリオンへの組込みを、実施例2に記載されている技法を用いて確認した。特に、NDV_LS/L289A_S-F及びNDV_LS/L289A_S-F HexaProを20％スクロースクッションに通して濃縮した。ペレットをPBSに再懸濁させた。WT NDV_LSを同じ方法で調製し、陰性対照として使用した。各々の濃縮ウイルスタンパク質含量をBCAアッセイによって決定した。5～10μgの各々のウイルスを4-20％SDS-PAGEで分解し、ゲルをクマシーG-250で染色した。図13に示されているように、NDV_LS/L289A骨格によって発現されたS-F HexaProは、NDV_LS/L289Aによって発現されたS-Fよりも優れたビリオンへの組入れを示した。
実施例2に記載されているNDVコンストラクトNDV_LS/L289A_S-FによってコードされるS-Fタンパク質を、6つのプロリン置換を含むように修飾した。特に、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基をプロリンと置換した。S-FキメラHexaProタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びS-FキメラHexaProタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号14及び15に提供されている。S-FキメラHexaProタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むNDVコンストラクトは、「NDV_LS/L289A_S-F HexaPro」と称される。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を発現するNDVを実施例2に記載されている通りにレスキューし、S-F導入遺伝子のビリオンへの組込みを、実施例2に記載されている技法を用いて確認した。特に、NDV_LS/L289A_S-F及びNDV_LS/L289A_S-F HexaProを20％スクロースクッションに通して濃縮した。ペレットをPBSに再懸濁させた。WT NDV_LSを同じ方法で調製し、陰性対照として使用した。各々の濃縮ウイルスタンパク質含量をBCAアッセイによって決定した。5～10μgの各々のウイルスを4-20％SDS-PAGEで分解し、ゲルをクマシーG-250で染色した。図13に示されているように、NDV_LS/L289A骨格によって発現されたS-F HexaProは、NDV_LS/L289Aによって発現されたS-Fよりも優れたビリオンへの組入れを示した。
(10.実施例5:費用効果の高い不活化SARS-CoV-2ワクチンとしての膜固定型スパイクを発現するニューカッスル病ウイルス(NDV))
良好なSARS-CoV-2ワクチンは、安全かつ防御的でなければならないだけでなく、低コストでの世界的規模での需要にも応えなければならない。現在のインフルエンザウイルスワクチン生産能力を用いて、卵ベースの不活化ニューカッスル病ウイルス(NDV)/SARS-CoV-2ワクチンを製造すれば、その課題に応えられるであろう。本実施例は、マウス及びハムスターにおける強力なCOVID-19ワクチンとしてのスパイク(NDV-S)の膜固定型形態を安定発現する不活化NDVキメラの前臨床評価を報告している。不活化NDV-Sワクチンは免疫原性であり、両方の動物モデルで強い結合及び/又は中和抗体を誘導した。より重要なことに、不活化NDV-Sワクチンは、SARS-CoV-2感染から動物を防御するか、又はSARS-CoV-2誘導性疾患を顕著に軽減した。アジュバントの存在下において、抗原節減を達成することができ、これは、ワクチンの防御効力を維持しながら、コストをさらに低下させた。
良好なSARS-CoV-2ワクチンは、安全かつ防御的でなければならないだけでなく、低コストでの世界的規模での需要にも応えなければならない。現在のインフルエンザウイルスワクチン生産能力を用いて、卵ベースの不活化ニューカッスル病ウイルス(NDV)/SARS-CoV-2ワクチンを製造すれば、その課題に応えられるであろう。本実施例は、マウス及びハムスターにおける強力なCOVID-19ワクチンとしてのスパイク(NDV-S)の膜固定型形態を安定発現する不活化NDVキメラの前臨床評価を報告している。不活化NDV-Sワクチンは免疫原性であり、両方の動物モデルで強い結合及び/又は中和抗体を誘導した。より重要なことに、不活化NDV-Sワクチンは、SARS-CoV-2感染から動物を防御するか、又はSARS-CoV-2誘導性疾患を顕著に軽減した。アジュバントの存在下において、抗原節減を達成することができ、これは、ワクチンの防御効力を維持しながら、コストをさらに低下させた。
(10.1 序論)
SARS-CoV-2ワクチンは、現在の世界的なCOVID-19パンデミックを軽減するために緊急に必要とされている。多くのワクチンアプローチが開発されているが(1～4)、その多くは、費用効果的である可能性が低く、かつ低所得国及び十分な保険に入っていない集団に安く手に入る価格である可能性が低い。ウイルスの拡大を効果的に封じるためには、少数の高所得者よりも大きい集団にワクチン接種することが極めて重要であるので、これは、長い目で見れば、懸念となり得る。全てのSARS-CoV-2ワクチン候補のうち、不活化ワクチンは、一般の人々にとってより受け入れやすい安全性プロファイルを有し、かつより良好な防御効果及び大きな世界的需要に応える用量節減のためにアジュバントと組み合わせることができるので、魅力的である。不活化全ビリオンSARS-CoV-2ワクチンを産生するための現在のプラットフォームは、BSL-3条件下の細胞培養におけるウイルスの増殖を必要とする(3)。ウイルスの完全な不活化を保証するために、ワクチンの抗原性を失うリスクを承知の上で、過大な不活化手順を履行しなければならない。コロナウイルスに対する多くのウイルスベクターワクチンが開発されているが、それらは、生ワクチンとしてのみ試験することができる(4～9)。さらに、特定のウイルスベクターの効力は、ヒト集団におけるウイルス骨格に対する既存免疫によって抑制され得る。
SARS-CoV-2ワクチンは、現在の世界的なCOVID-19パンデミックを軽減するために緊急に必要とされている。多くのワクチンアプローチが開発されているが(1～4)、その多くは、費用効果的である可能性が低く、かつ低所得国及び十分な保険に入っていない集団に安く手に入る価格である可能性が低い。ウイルスの拡大を効果的に封じるためには、少数の高所得者よりも大きい集団にワクチン接種することが極めて重要であるので、これは、長い目で見れば、懸念となり得る。全てのSARS-CoV-2ワクチン候補のうち、不活化ワクチンは、一般の人々にとってより受け入れやすい安全性プロファイルを有し、かつより良好な防御効果及び大きな世界的需要に応える用量節減のためにアジュバントと組み合わせることができるので、魅力的である。不活化全ビリオンSARS-CoV-2ワクチンを産生するための現在のプラットフォームは、BSL-3条件下の細胞培養におけるウイルスの増殖を必要とする(3)。ウイルスの完全な不活化を保証するために、ワクチンの抗原性を失うリスクを承知の上で、過大な不活化手順を履行しなければならない。コロナウイルスに対する多くのウイルスベクターワクチンが開発されているが、それらは、生ワクチンとしてのみ試験することができる(4～9)。さらに、特定のウイルスベクターの効力は、ヒト集団におけるウイルス骨格に対する既存免疫によって抑制され得る。
融合前S-Fキメラを発現するニューカッスル病ウイルス(NDV)ベースのウイルスベクターの構築が以前に報告されている。これらのNDVベクターワクチンは、有胚鶏卵中で良好に成長することが示されており、その上、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、NDVビリオンに大量に組み込まれる。鳥類病原体をベースにしたNDVベクターは、ウイルスベクターワクチンの上述の限界を克服し、BSL-2条件下でのワクチンの製造を可能にする。本研究においては、膜固定型S-Fキメラ(NDV-S)を発現するNDV LaSota L289A突然変異体を、アジュバントを含む及びアジュバントを含まない不活化SARS-CoV-2ワクチン候補として、マウス及びハムスターで検討した。NDVキメラによって発現されるS-Fキメラは、尿膜腔液中、4℃で3週間保存した後、抗原性を失うことなく、非常に安定であることが分かった。β-プロピオラクトン(BPL)不活化NDV-Sワクチンは免疫原性であり、両方の動物モデルで高力価のS特異的抗体を誘導する。さらに、臨床段階の治験用リポソーム懸濁剤アジュバント(カチオン性脂質DOTAPのR-エナンチオマー、R-DOTAP)(10～13)、及びMF-59様水中油型エマルジョンアジュバント(AddaVax)の効果もマウスで評価した。両方のアジュバントは、マウスで用量節減(＞10倍)を達成することが示された。ワクチン接種された動物は、SARS-CoV-2感染又はSARS-CoV-2誘導性疾患から防御された。不活化インフルエンザウイルスワクチンの既存の世界的な卵ベースの製造をすぐに利用して、生産パイプラインに最小限の修正を加えるだけで、卵ベースのNDV-Sワクチンを迅速に生産することができるので、これは励みになる。より重要なことに、この部類の製品は、低コストでの大規模生産に適しており、かつ乳児、妊婦、及び高齢者で優れた安全性プロファイルを有する(14～16)。或いは、NDV-S及び他のキメラNDVワクチンは、Vero細胞を含む、組織培養物中で産生することもできる。
(10.2 材料及び方法)
(プラスミド)
NDV_LS/L289A_S-Fレスキュープラスミドの構築は、以前の研究に記載されている。簡潔に述べると、多塩基性切断部位を含まない(682RRAR685からAにした)Sの細胞外ドメインの配列を、遺伝子末端(GE)、遺伝子開始点(GS)、及びのKozak配列5'末端(18)を含有するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、SARS-CoV-2分離株のスパイク遺伝子(GenBank: MN908947.3)のコドン最適化されたヌクレオチド配列をコードするpCAGGSプラスミド(17)から増幅させた。NDV_LaSota融合(F)タンパク質の膜貫通ドメイン(TM)及び細胞質テール(CT)のヌクレオチド配列を哺乳動物細胞用にコドン最適化し、IDT(gBlock)によって合成した。増幅したS細胞外ドメインを、GSリンカー(GGGGS(配列番号24))を介して、FのTM/CTに融合した。パラミクソウイルスゲノムの「6のルール」に従うために、さらなるヌクレオチドを3'末端に付加した。S-F遺伝子を、in-Fusionクローニング(Clontech)によって、pNDV_LaSota(LS) L289A突然変異体(NDV_LS/L289A)アンチゲノムcDNAのP遺伝子とM遺伝子の間に挿入した。組換え産物をNEB(登録商標)安定コンピテント大腸菌(New England Biolabs社)に入れて形質転換して、NDV_LS/L289A_S-Fレスキュープラスミドを作製した。このプラスミドを、PureLink(商標) HiPureプラスミドマキシプレップキット(Thermo Fisher Scientific)を用いて精製した。
(プラスミド)
NDV_LS/L289A_S-Fレスキュープラスミドの構築は、以前の研究に記載されている。簡潔に述べると、多塩基性切断部位を含まない(682RRAR685からAにした)Sの細胞外ドメインの配列を、遺伝子末端(GE)、遺伝子開始点(GS)、及びのKozak配列5'末端(18)を含有するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、SARS-CoV-2分離株のスパイク遺伝子(GenBank: MN908947.3)のコドン最適化されたヌクレオチド配列をコードするpCAGGSプラスミド(17)から増幅させた。NDV_LaSota融合(F)タンパク質の膜貫通ドメイン(TM)及び細胞質テール(CT)のヌクレオチド配列を哺乳動物細胞用にコドン最適化し、IDT(gBlock)によって合成した。増幅したS細胞外ドメインを、GSリンカー(GGGGS(配列番号24))を介して、FのTM/CTに融合した。パラミクソウイルスゲノムの「6のルール」に従うために、さらなるヌクレオチドを3'末端に付加した。S-F遺伝子を、in-Fusionクローニング(Clontech)によって、pNDV_LaSota(LS) L289A突然変異体(NDV_LS/L289A)アンチゲノムcDNAのP遺伝子とM遺伝子の間に挿入した。組換え産物をNEB(登録商標)安定コンピテント大腸菌(New England Biolabs社)に入れて形質転換して、NDV_LS/L289A_S-Fレスキュープラスミドを作製した。このプラスミドを、PureLink(商標) HiPureプラスミドマキシプレップキット(Thermo Fisher Scientific)を用いて精製した。
(細胞及びウイルス)
T7ポリメラーゼを安定発現するBSRT7細胞は、ISMMSのBenhur Lee博士から提供していただいた。この細胞を、10％(vol/vol)胎仔ウシ血清(FBS)及び100ユニット/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(P/S; Gibco)を含有するダルベッコの改変イーグル培地(DMEM; Gibco)中、37℃、5％CO2で維持した。ハムスターへの投与に使用されるSARS-CoV-2分離株USA-WA1/2020(WA-1, BEI Resources NR-52281)を、2％胎仔ウシ血清(FBS)、4.5g/L D-グルコース、4mM L-グルタミン、10mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、及び10mM HEPESが補充されたダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)中、37℃で、Vero E6細胞(ATCC CRL-1586)で増殖させた。生SARS-CoV-2を用いる実験は全て、米国疾病予防管理センター(Centers for Disease Control and Prevention)(CDC)/米国農務省(US Department of Agriculture)(USDA)によって承認されたマウントサイナイ医科大学の国際衛生・新興病原体研究所(Global Health and Emerging Pathogens Institute at the Icahn School of Medicine at Mount Sinai)のバイオセーフティーレベル3(BSL-3)の生物学的封じ込め施設で、施設内バイオセイフティー要件に準拠して実施された。
T7ポリメラーゼを安定発現するBSRT7細胞は、ISMMSのBenhur Lee博士から提供していただいた。この細胞を、10％(vol/vol)胎仔ウシ血清(FBS)及び100ユニット/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(P/S; Gibco)を含有するダルベッコの改変イーグル培地(DMEM; Gibco)中、37℃、5％CO2で維持した。ハムスターへの投与に使用されるSARS-CoV-2分離株USA-WA1/2020(WA-1, BEI Resources NR-52281)を、2％胎仔ウシ血清(FBS)、4.5g/L D-グルコース、4mM L-グルタミン、10mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、及び10mM HEPESが補充されたダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)中、37℃で、Vero E6細胞(ATCC CRL-1586)で増殖させた。生SARS-CoV-2を用いる実験は全て、米国疾病予防管理センター(Centers for Disease Control and Prevention)(CDC)/米国農務省(US Department of Agriculture)(USDA)によって承認されたマウントサイナイ医科大学の国際衛生・新興病原体研究所(Global Health and Emerging Pathogens Institute at the Icahn School of Medicine at Mount Sinai)のバイオセーフティーレベル3(BSL-3)の生物学的封じ込め施設で、施設内バイオセイフティー要件に準拠して実施された。
(SARS-CoV-2のスパイクを発現するNDV LaSotaのレスキュー)
NDV_LS/L289A_S-Fをレスキューするために、トランスフェクションの前日に、BSRT7細胞の6-ウェルプレートに、ウェル当たり3×105個の細胞を播種した。翌日、4μgのpNDV_LS/L289A_S-F、2μgのpTM1-NP、1μgのpTM1-P、1μgのpTM1-L、及び2μgのpCI-T7optを250μlのOpti-MEM(Gibco)に再懸濁した。その後、プラスミドカクテルを30μLのTransIT LT1トランスフェクション試薬(Mirus)と穏やかに混合した。混合物を室温(RT)で30分間インキュベートした。インキュベーションの終わり頃に、各々のウェルの成長培地を1mlのOpti-MEMと交換した。トランスフェクション複合体を各々のウェルに滴加し、プレートを、37℃、5％CO2でインキュベートした。トランスフェクションから48時間後、トランスフェクトされたウェルの上清及び細胞を回収し、インスリンシリンジを用いる数回のストロークによって、短くホモジナイズした。200μlのホモジナイズした混合物を8～10日齢の特定病原体不在(SPF)の有胚鶏卵の尿膜腔に注入した。これらの卵を37℃で3日間インキュベートし、その後、4℃で一晩冷却した。尿膜腔液を回収し、遠心分離によって清澄化した。NDVのレスキューを、0.5％ニワトリ又はシチメンチョウ赤血球を用いる赤血球凝集(HA)アッセイによって決定した。陽性試料のRNAを抽出し、DNアーゼI(Thermo Fisher Scientific)で処理した。逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実施して、導入遺伝子を増幅させた。導入遺伝子の配列をサンガーシークエンシング(Genewiz)によって確認した。組換えDNA実験は、マウントサイナイ医科大学(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)の施設内バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認されたプロトコルに準拠して実施した。
NDV_LS/L289A_S-Fをレスキューするために、トランスフェクションの前日に、BSRT7細胞の6-ウェルプレートに、ウェル当たり3×105個の細胞を播種した。翌日、4μgのpNDV_LS/L289A_S-F、2μgのpTM1-NP、1μgのpTM1-P、1μgのpTM1-L、及び2μgのpCI-T7optを250μlのOpti-MEM(Gibco)に再懸濁した。その後、プラスミドカクテルを30μLのTransIT LT1トランスフェクション試薬(Mirus)と穏やかに混合した。混合物を室温(RT)で30分間インキュベートした。インキュベーションの終わり頃に、各々のウェルの成長培地を1mlのOpti-MEMと交換した。トランスフェクション複合体を各々のウェルに滴加し、プレートを、37℃、5％CO2でインキュベートした。トランスフェクションから48時間後、トランスフェクトされたウェルの上清及び細胞を回収し、インスリンシリンジを用いる数回のストロークによって、短くホモジナイズした。200μlのホモジナイズした混合物を8～10日齢の特定病原体不在(SPF)の有胚鶏卵の尿膜腔に注入した。これらの卵を37℃で3日間インキュベートし、その後、4℃で一晩冷却した。尿膜腔液を回収し、遠心分離によって清澄化した。NDVのレスキューを、0.5％ニワトリ又はシチメンチョウ赤血球を用いる赤血球凝集(HA)アッセイによって決定した。陽性試料のRNAを抽出し、DNアーゼI(Thermo Fisher Scientific)で処理した。逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実施して、導入遺伝子を増幅させた。導入遺伝子の配列をサンガーシークエンシング(Genewiz)によって確認した。組換えDNA実験は、マウントサイナイ医科大学(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)の施設内バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認されたプロトコルに準拠して実施した。
(濃縮ウイルスの調製)
ウイルスを濃縮する前に、尿膜液を、Sorvall Legend RT Plus冷蔵ベンチトップ式遠心分離機(Thermo Fisher Scientific)を用いる4,000rpmでの遠心分離によって、4℃で30分間清澄化して、破片を除去した。尿膜腔液中の生ウイルスを、Beckman SW28ローター(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)を用いる、25,000rpm、4℃、2時間のBeckman L7-65超遠心分離機での超遠心分離により、NTEバッファー(100mM NaCl、10mM Tris-HCl、1mM EDTA)、pH 7.4)中の20％スクロースクッションに通してペレット化した。上清を吸引し、ペレットをPBS(pH 7.4)に再懸濁させた。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(Thermo Fisher Scientific)を用いて、タンパク質含量を決定した。不活化濃縮ウイルスを調製するために、1部の0.5Mリン酸二ナトリウム(DSP)を38部の尿膜腔液と混合して、pHを安定化した。1部の2％β-プロピオラクトン(BPL)を、振盪している間に、混合物に滴加し、これにより、最終濃度0.05％のBPLが得られた。処理された尿膜腔液を徹底的に混合し、氷上で30分間インキュベートした。その後、混合物を37℃の水浴中に2時間入れ、15分毎に振盪させた。不活化尿膜腔液を4,000rpmでの遠心分離によって30分間清澄化した。ウイルスの不活化を、不活化ウイルス調製物を接種された10週齢の有胚鶏卵からのウイルスの成長の欠如によって確認した。不活化ウイルスは、上記の通りに濃縮した。
ウイルスを濃縮する前に、尿膜液を、Sorvall Legend RT Plus冷蔵ベンチトップ式遠心分離機(Thermo Fisher Scientific)を用いる4,000rpmでの遠心分離によって、4℃で30分間清澄化して、破片を除去した。尿膜腔液中の生ウイルスを、Beckman SW28ローター(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)を用いる、25,000rpm、4℃、2時間のBeckman L7-65超遠心分離機での超遠心分離により、NTEバッファー(100mM NaCl、10mM Tris-HCl、1mM EDTA)、pH 7.4)中の20％スクロースクッションに通してペレット化した。上清を吸引し、ペレットをPBS(pH 7.4)に再懸濁させた。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(Thermo Fisher Scientific)を用いて、タンパク質含量を決定した。不活化濃縮ウイルスを調製するために、1部の0.5Mリン酸二ナトリウム(DSP)を38部の尿膜腔液と混合して、pHを安定化した。1部の2％β-プロピオラクトン(BPL)を、振盪している間に、混合物に滴加し、これにより、最終濃度0.05％のBPLが得られた。処理された尿膜腔液を徹底的に混合し、氷上で30分間インキュベートした。その後、混合物を37℃の水浴中に2時間入れ、15分毎に振盪させた。不活化尿膜腔液を4,000rpmでの遠心分離によって30分間清澄化した。ウイルスの不活化を、不活化ウイルス調製物を接種された10週齢の有胚鶏卵からのウイルスの成長の欠如によって確認した。不活化ウイルスは、上記の通りに濃縮した。
(尿膜腔液中のS-Fの安定性の評価)
NDV_LS/L289A_S-Fウイルスを含有する尿膜腔液を回収し、遠心分離によって清澄化した。清澄化された尿膜腔液を15mlの容量に分注した。0週目(wk)の尿膜腔液を、上記の通りに、遠心分離の直後に、20％スクロースクッションに通して濃縮した。ペレット化したウイルスを300μLのPBSに再懸濁させ、-80℃で保存した。S-Fコンストラクトの安定性を試験するために、尿膜腔液の他の3つのアリコートを4℃で維持した。Wk 1、2、及び3の試料を毎週連続して回収し、濃縮ウイルスを、同じ方法を用いて、300μLのPBS中で調製した。-80℃からの1回の自由融解の後、wk 0、1、2、及び3の濃縮ウイルスのタンパク質含量を、BCAアッセイを用いて決定した。1μgの各々の濃縮ウイルスを4-20％SDS-PAGE(Bio-Rad)で分解し、S-Fタンパク質及びHNタンパク質をウェスタンブロットによって検出した。
NDV_LS/L289A_S-Fウイルスを含有する尿膜腔液を回収し、遠心分離によって清澄化した。清澄化された尿膜腔液を15mlの容量に分注した。0週目(wk)の尿膜腔液を、上記の通りに、遠心分離の直後に、20％スクロースクッションに通して濃縮した。ペレット化したウイルスを300μLのPBSに再懸濁させ、-80℃で保存した。S-Fコンストラクトの安定性を試験するために、尿膜腔液の他の3つのアリコートを4℃で維持した。Wk 1、2、及び3の試料を毎週連続して回収し、濃縮ウイルスを、同じ方法を用いて、300μLのPBS中で調製した。-80℃からの1回の自由融解の後、wk 0、1、2、及び3の濃縮ウイルスのタンパク質含量を、BCAアッセイを用いて決定した。1μgの各々の濃縮ウイルスを4-20％SDS-PAGE(Bio-Rad)で分解し、S-Fタンパク質及びHNタンパク質をウェスタンブロットによって検出した。
(ウェスタンブロット)
濃縮された生又は不活化ウイルス試料を、NuPAGE(商標)試料還元剤(10×)(Thermofisher Scientific)を含むNovex(商標) Tris-グリシンSDS試料バッファー(2×)(Thermofisher Scientific)と混合した。1又は2μgの濃縮ウイルスを95℃で5分間加熱し、その後、Novex(商標) Sharpプレステインドタンパク質標準(ThermoFisher Scientific)をタンパク質マーカーとして用いて、4-20％SDS-PAGE(Bio-Rad)で分解した。ウェスタンブロットを実施するために、タンパク質を二フッ化ポリビニリデン(PVDF)メンブレン(GE healthcare)に転写した。メンブレンを、0.1％v/v Tween 20(PBST)を含有するPBS中の5％脱脂粉乳で、RTで1時間ブロッキングした。メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄し(毎回、RTで10分)、1％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSTに希釈したS特異的マウスモノクローナル抗体2B3E5(ISMMSのThomas Moran博士から提供されたもの)又はHN特異的マウスモノクローナル抗体8H2(MCA2822, Biorad)とともに、4℃で一晩インキュベートした。その後、メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄し(毎回、RTで10分)、5％脱脂粉乳を含有するPBSTに希釈した(1:2000)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と連結された二次ヒツジ抗マウスIgGとともにインキュベートした。二次抗体を廃棄し、メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄した(毎回、RTで10分)。Pierce(商標) ECLウェスタンブロッティング基質(Thermo Fisher Scientific)をメンブレンに添加し、Bio-Rad Universal Hood Ii分子イメージャー(Bio-Rad)を用いて、ブロットをイメージングし、Image Labソフトウェア(Bio-Rad)によって処理した。
濃縮された生又は不活化ウイルス試料を、NuPAGE(商標)試料還元剤(10×)(Thermofisher Scientific)を含むNovex(商標) Tris-グリシンSDS試料バッファー(2×)(Thermofisher Scientific)と混合した。1又は2μgの濃縮ウイルスを95℃で5分間加熱し、その後、Novex(商標) Sharpプレステインドタンパク質標準(ThermoFisher Scientific)をタンパク質マーカーとして用いて、4-20％SDS-PAGE(Bio-Rad)で分解した。ウェスタンブロットを実施するために、タンパク質を二フッ化ポリビニリデン(PVDF)メンブレン(GE healthcare)に転写した。メンブレンを、0.1％v/v Tween 20(PBST)を含有するPBS中の5％脱脂粉乳で、RTで1時間ブロッキングした。メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄し(毎回、RTで10分)、1％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSTに希釈したS特異的マウスモノクローナル抗体2B3E5(ISMMSのThomas Moran博士から提供されたもの)又はHN特異的マウスモノクローナル抗体8H2(MCA2822, Biorad)とともに、4℃で一晩インキュベートした。その後、メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄し(毎回、RTで10分)、5％脱脂粉乳を含有するPBSTに希釈した(1:2000)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と連結された二次ヒツジ抗マウスIgGとともにインキュベートした。二次抗体を廃棄し、メンブレンをシェーカー上でPBSTで3回洗浄した(毎回、RTで10分)。Pierce(商標) ECLウェスタンブロッティング基質(Thermo Fisher Scientific)をメンブレンに添加し、Bio-Rad Universal Hood Ii分子イメージャー(Bio-Rad)を用いて、ブロットをイメージングし、Image Labソフトウェア(Bio-Rad)によって処理した。
(BALB/cマウスにおける免疫及び投与研究)
7週齢の雌BALB/cJマウス(Jackson Laboratories)を本研究で使用した。実験は、マウントサイナイ医科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに準拠して実施した。マウスを、3つの異なる用量で、アジュバントあり又はなしで、不活化ウイルスを筋肉内投与される10のグループ(n=5)に分けた。ワクチン接種は、2週間間隔のプライム-ブーストレジメンに従った。具体的には、グループ1、グループ2、及びグループ3には、それぞれ、アジュバントなしで、5μg、10μg、及び20μgの不活化NDV-Sワクチン(全タンパク質)を投与し;グループ4、グループ5、及びグループ6には、マウス当たり300μgのR-DOTAP(PDS Biotechnology)と組み合わせた、それぞれ、0.2μg、1μg、及び5μgの低用量の不活化NDV-Sワクチンを投与し;グループ7、グループ8、及びグループ9のマウスには、AddaVax(Invivogen)をアジュバントとして用いて、それぞれ、0.2μg、1μg、及び5μgの不活化NDV-Sワクチンを投与した。グループ10には、20μgの不活化WT NDVをベクターのみの対照として投与した。SARS-CoV-2投与は、Ralph Baric博士のグループにより、ノースカロライナ大学のバイオセーフティーレベル3(BSL-3)施設内で実施された。ブーストから19日後、7.5×104プラーク形成単位(PFU)のマウス適合SARS-CoV-2株を鼻腔内(i.n)で用いて、マウスに投与した。体重減少を4日間モニタリングした。
7週齢の雌BALB/cJマウス(Jackson Laboratories)を本研究で使用した。実験は、マウントサイナイ医科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに準拠して実施した。マウスを、3つの異なる用量で、アジュバントあり又はなしで、不活化ウイルスを筋肉内投与される10のグループ(n=5)に分けた。ワクチン接種は、2週間間隔のプライム-ブーストレジメンに従った。具体的には、グループ1、グループ2、及びグループ3には、それぞれ、アジュバントなしで、5μg、10μg、及び20μgの不活化NDV-Sワクチン(全タンパク質)を投与し;グループ4、グループ5、及びグループ6には、マウス当たり300μgのR-DOTAP(PDS Biotechnology)と組み合わせた、それぞれ、0.2μg、1μg、及び5μgの低用量の不活化NDV-Sワクチンを投与し;グループ7、グループ8、及びグループ9のマウスには、AddaVax(Invivogen)をアジュバントとして用いて、それぞれ、0.2μg、1μg、及び5μgの不活化NDV-Sワクチンを投与した。グループ10には、20μgの不活化WT NDVをベクターのみの対照として投与した。SARS-CoV-2投与は、Ralph Baric博士のグループにより、ノースカロライナ大学のバイオセーフティーレベル3(BSL-3)施設内で実施された。ブーストから19日後、7.5×104プラーク形成単位(PFU)のマウス適合SARS-CoV-2株を鼻腔内(i.n)で用いて、マウスに投与した。体重減少を4日間モニタリングした。
(ゴールデンシリアンハムスターにおける免疫及び投与研究)
8週齢の雌ゴールデンシリアンハムスターを本研究で使用した。実験は、マウントサイナイ医科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに準拠して実施した。5つのグループ(n=8)のハムスターが含まれた。不活化ワクチンを、プライム-ブーストレジメンに従って、2週間間隔で、筋肉内投与した。グループ1には、10μgの不活化NDV-Sワクチンを投与し;グループ2には、AddaVaxと組み合わせた5μgの不活化NDV-Sワクチンを投与し;グループ3のハムスターには、10μgの不活化WT NDVをベクターのみの対照として投与した。ワクチンを投与しない健常対照グループも含めた。ブーストから24日後、ハムスターに、104PFUのUSA-WA1/2020 SARS-CoV-2株を鼻腔内投与した。体重減少を5日間モニタリングした。
8週齢の雌ゴールデンシリアンハムスターを本研究で使用した。実験は、マウントサイナイ医科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに準拠して実施した。5つのグループ(n=8)のハムスターが含まれた。不活化ワクチンを、プライム-ブーストレジメンに従って、2週間間隔で、筋肉内投与した。グループ1には、10μgの不活化NDV-Sワクチンを投与し;グループ2には、AddaVaxと組み合わせた5μgの不活化NDV-Sワクチンを投与し;グループ3のハムスターには、10μgの不活化WT NDVをベクターのみの対照として投与した。ワクチンを投与しない健常対照グループも含めた。ブーストから24日後、ハムスターに、104PFUのUSA-WA1/2020 SARS-CoV-2株を鼻腔内投与した。体重減少を5日間モニタリングした。
(肺力価)
マウスの肺葉を回収し、PBS中でホモジナイズした。プラークアッセイを実施して、以前に記載されている通りに、肺ホモジネート中のウイルス力価を測定した(1,19)。葉当たりのプラーク形成単位(PFU)の幾何平均力価を、GraphPad Prism 7.0を用いて計算した。
マウスの肺葉を回収し、PBS中でホモジナイズした。プラークアッセイを実施して、以前に記載されている通りに、肺ホモジネート中のウイルス力価を測定した(1,19)。葉当たりのプラーク形成単位(PFU)の幾何平均力価を、GraphPad Prism 7.0を用いて計算した。
(ELISA)
ブースト前及びブーストから11日後に、マウスを採血した。ブースト前及びブーストから26日後に、ハムスターを採血した。血清を低速遠心分離によって単離した。ELISAを以前に記載されている通りに実施した(17)。簡潔に述べると、Immulon 4 HBX 96-ウェルELISAプレート(Thermo Fisher Scientific)を、コーティングバッファー(SeraCare Life Sciences社)中の2μg/mlの組換え三量体Sタンパク質(ウェル当たり50μl)で、4℃で一晩コーティングした。翌日、全てのプレートを、0.1％(v/v) Tween-20(PBST)を含有する220μLのPBSで3回洗浄し、220μLのブロッキング溶液(3％ヤギ血清、0.5％脱脂粉乳、96.5％PBST)中、RTで1時間ブロッキングした。マウス血清とハムスター血清の両方を、1:30から始めてブロッキング溶液に3倍段階希釈し、その後、RTで2時間インキュベートした。ELISAプレートをPBSTで3回洗浄し、ブロッキング溶液に(1:3,000)希釈したウェル当たり50μLのヒツジ抗マウスIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体(GE Healthcare)又はヤギ抗ハムスターIgG-HRPコンジュゲート抗体(Invitrogen)中でインキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのo-フェニレンジアミン二塩酸塩(SigmaFast OPD, Sigma)基質をウェル毎に添加した。プレートを10分間顕色させた後、50μLの3M塩酸(HCL)を各々のウェルに添加して、反応を停止させた。光学密度(OD)を、Synergy 4プレートリーダー(BioTek)又は同等品で、492nmで測定した。ブランクウェルのOD値の平均＋3標準偏差を用いて、プレートブランク外れ値のカットオフを設定した。カットオフ値を、終点力価を計算するために使用される各々のプレートについて確定した。GraphPad Prism 7.0を用いて、血清IgG応答の終点力価をグラフ化した。
ブースト前及びブーストから11日後に、マウスを採血した。ブースト前及びブーストから26日後に、ハムスターを採血した。血清を低速遠心分離によって単離した。ELISAを以前に記載されている通りに実施した(17)。簡潔に述べると、Immulon 4 HBX 96-ウェルELISAプレート(Thermo Fisher Scientific)を、コーティングバッファー(SeraCare Life Sciences社)中の2μg/mlの組換え三量体Sタンパク質(ウェル当たり50μl)で、4℃で一晩コーティングした。翌日、全てのプレートを、0.1％(v/v) Tween-20(PBST)を含有する220μLのPBSで3回洗浄し、220μLのブロッキング溶液(3％ヤギ血清、0.5％脱脂粉乳、96.5％PBST)中、RTで1時間ブロッキングした。マウス血清とハムスター血清の両方を、1:30から始めてブロッキング溶液に3倍段階希釈し、その後、RTで2時間インキュベートした。ELISAプレートをPBSTで3回洗浄し、ブロッキング溶液に(1:3,000)希釈したウェル当たり50μLのヒツジ抗マウスIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体(GE Healthcare)又はヤギ抗ハムスターIgG-HRPコンジュゲート抗体(Invitrogen)中でインキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのo-フェニレンジアミン二塩酸塩(SigmaFast OPD, Sigma)基質をウェル毎に添加した。プレートを10分間顕色させた後、50μLの3M塩酸(HCL)を各々のウェルに添加して、反応を停止させた。光学密度(OD)を、Synergy 4プレートリーダー(BioTek)又は同等品で、492nmで測定した。ブランクウェルのOD値の平均＋3標準偏差を用いて、プレートブランク外れ値のカットオフを設定した。カットオフ値を、終点力価を計算するために使用される各々のプレートについて確定した。GraphPad Prism 7.0を用いて、血清IgG応答の終点力価をグラフ化した。
(マイクロ中和アッセイ)
中和アッセイは全て、以前に記載されている施設ガイドラインに従って、バイオセーフティーレベル3(BSL-3)施設で実施した(17,20)。簡潔に述べると、血清試料を使用前に56℃で60分間熱非働化した。Vero E6細胞を、10％胎仔ウシ血清(FBS)が補充されたDMEMを用いて、培養下で維持した。アッセイの前日の夜に、ウェル当たり20,000個の細胞を96-ウェル細胞培養プレートに播種した。技術的デュプリケートのプール血清を96-ウェル細胞培養プレート中で1:20から始めて3倍段階ずつ段階希釈し、各々の希釈液を50％組織培養感染用量(TCID50)の600倍のSARS-CoV-2(USA-WA1/2020, BEI Resources NR-52281)と混合した。血清-ウイルス混合物をRTで1時間インキュベートし、その後、細胞に添加し、37℃インキュベーター中で、もう1時間インキュベーションした。ウイルス-血清混合物を除去し、対応する血清希釈液を細胞に添加した。細胞を2日間インキュベートし、ウェル当たり100μLの10％ホルムアルデヒドで24時間固定し、その後、BSL-3施設から持ち出した。細胞の染色は、バイオセーフティーキャビネット(BSL-2)内で実施した。ホルムアルデヒドを細胞から慎重に除去した。細胞を200μLのPBSで1回洗浄し、その後、0.1％Triton X-100を含有するPBSで、RTで15分間透過処理した。細胞をPBSで洗浄し、3％粉ミルクを含有するPBS中、RTで1時間ブロッキングした。その後、細胞を、ウェル当たり100μLのマウスモノクローナル抗NP抗体(1C7)(ISMMSのThomas Moran博士から提供していただいたもの)で、1μg/mlで、RTで1時間染色した。細胞をPBSで洗浄し、ウェル当たり100μLの抗マウスIgG HRP(Rockland)二次抗体とともに、1％粉ミルクを含有するPBS中1:3,000希釈で、RTで1時間インキュベートした。最後に、細胞をPBSで2回洗浄し、100μLのSigmaFast OPD基質を用いて、プレートを顕色させた。10分後、ウェル当たり50μLの3M HCIを用いて、反応を停止させた。OD 492nmを、Biotek SynergyH1マイクロプレートリーダーで測定した。希釈曲線に対する非線形回帰曲線フィット解析(上下の制約は100％及び0％に設定)を、GraphPad Prism 7.0を用いて行って、血清の阻害希釈の50％(ID50)を計算した。
中和アッセイは全て、以前に記載されている施設ガイドラインに従って、バイオセーフティーレベル3(BSL-3)施設で実施した(17,20)。簡潔に述べると、血清試料を使用前に56℃で60分間熱非働化した。Vero E6細胞を、10％胎仔ウシ血清(FBS)が補充されたDMEMを用いて、培養下で維持した。アッセイの前日の夜に、ウェル当たり20,000個の細胞を96-ウェル細胞培養プレートに播種した。技術的デュプリケートのプール血清を96-ウェル細胞培養プレート中で1:20から始めて3倍段階ずつ段階希釈し、各々の希釈液を50％組織培養感染用量(TCID50)の600倍のSARS-CoV-2(USA-WA1/2020, BEI Resources NR-52281)と混合した。血清-ウイルス混合物をRTで1時間インキュベートし、その後、細胞に添加し、37℃インキュベーター中で、もう1時間インキュベーションした。ウイルス-血清混合物を除去し、対応する血清希釈液を細胞に添加した。細胞を2日間インキュベートし、ウェル当たり100μLの10％ホルムアルデヒドで24時間固定し、その後、BSL-3施設から持ち出した。細胞の染色は、バイオセーフティーキャビネット(BSL-2)内で実施した。ホルムアルデヒドを細胞から慎重に除去した。細胞を200μLのPBSで1回洗浄し、その後、0.1％Triton X-100を含有するPBSで、RTで15分間透過処理した。細胞をPBSで洗浄し、3％粉ミルクを含有するPBS中、RTで1時間ブロッキングした。その後、細胞を、ウェル当たり100μLのマウスモノクローナル抗NP抗体(1C7)(ISMMSのThomas Moran博士から提供していただいたもの)で、1μg/mlで、RTで1時間染色した。細胞をPBSで洗浄し、ウェル当たり100μLの抗マウスIgG HRP(Rockland)二次抗体とともに、1％粉ミルクを含有するPBS中1:3,000希釈で、RTで1時間インキュベートした。最後に、細胞をPBSで2回洗浄し、100μLのSigmaFast OPD基質を用いて、プレートを顕色させた。10分後、ウェル当たり50μLの3M HCIを用いて、反応を停止させた。OD 492nmを、Biotek SynergyH1マイクロプレートリーダーで測定した。希釈曲線に対する非線形回帰曲線フィット解析(上下の制約は100％及び0％に設定)を、GraphPad Prism 7.0を用いて行って、血清の阻害希釈の50％(ID50)を計算した。
(統計)
統計解析を、GraphPad Prism 7.0を用いて実施した。肺におけるウイルス力価の統計的差異を、多重比較用のダネット補正を伴うクラスカル・ワリス検定を用いて決定した。
統計解析を、GraphPad Prism 7.0を用いて実施した。肺におけるウイルス力価の統計的差異を、多重比較用のダネット補正を伴うクラスカル・ワリス検定を用いて決定した。
(10.3 結果)
(NDVベースの不活化SARS-CoV-2ワクチンの設計及び概念)
NDVベースのSARS-CoV-2ワクチン候補の構築は、以前に報告されており、その中で、多塩基性切断部位を含まないスパイク(NDV Fの膜貫通領域及び細胞質テール)を発現するNDVベクターは、野生型(WT) Sタンパク質だけを発現するNDVベクターよりも多量のNDV粒子中のスパイクタンパク質を示した。最終的なコンストラクトは、NDV Fタンパク質中に突然変異(L289A)も有しており(図14A)、これは、ウイルスのHN非依存的融合を促進することが示された。インフルエンザウイルスとNDVは両方とも、有胚鶏卵中で高力価にまで成長するので、NDVベースの不活化SARS-CoV-2ワクチンを開発するために、既存の世界的なインフルエンザウイルスワクチン生産能力を利用することができる。不活化インフルエンザウイルスワクチンの製造プロセスにほとんど修正を加えることなく、NDV-Sワクチンをゾーンスクロース密度遠心分離によって精製することができる。インフルエンザウイルスワクチンのためのホルマリン不活化の代わりに、β-プロピオラクトン(BPL)不活化を実施することができる(より穏やかな不活化プロセスのため)。そのような不活化NDV-Sワクチンは、NDVのHN及びFタンパク質よりも免疫優性である可能性が高い巨大なスパイクタンパク質を、全不活化ビリオンの表面に提示する。不活化NDV-Sワクチンを、用量節減のためのアジュバントとともに、筋肉内投与することができる。このアプローチは、スパイク特異的防御抗体を安全に誘導するのに適しているはずである(図14B)。
(NDVベースの不活化SARS-CoV-2ワクチンの設計及び概念)
NDVベースのSARS-CoV-2ワクチン候補の構築は、以前に報告されており、その中で、多塩基性切断部位を含まないスパイク(NDV Fの膜貫通領域及び細胞質テール)を発現するNDVベクターは、野生型(WT) Sタンパク質だけを発現するNDVベクターよりも多量のNDV粒子中のスパイクタンパク質を示した。最終的なコンストラクトは、NDV Fタンパク質中に突然変異(L289A)も有しており(図14A)、これは、ウイルスのHN非依存的融合を促進することが示された。インフルエンザウイルスとNDVは両方とも、有胚鶏卵中で高力価にまで成長するので、NDVベースの不活化SARS-CoV-2ワクチンを開発するために、既存の世界的なインフルエンザウイルスワクチン生産能力を利用することができる。不活化インフルエンザウイルスワクチンの製造プロセスにほとんど修正を加えることなく、NDV-Sワクチンをゾーンスクロース密度遠心分離によって精製することができる。インフルエンザウイルスワクチンのためのホルマリン不活化の代わりに、β-プロピオラクトン(BPL)不活化を実施することができる(より穏やかな不活化プロセスのため)。そのような不活化NDV-Sワクチンは、NDVのHN及びFタンパク質よりも免疫優性である可能性が高い巨大なスパイクタンパク質を、全不活化ビリオンの表面に提示する。不活化NDV-Sワクチンを、用量節減のためのアジュバントとともに、筋肉内投与することができる。このアプローチは、スパイク特異的防御抗体を安全に誘導するのに適しているはずである(図14B)。
(NDVによって発現されるスパイクタンパク質は尿膜腔液中で安定である)
ワクチンは温度制御された(～4℃)プロセスを通じて精製及び不活化される必要があるので、抗原の安定性は関心事であり得る。最終製品は、液体バッファー中、4℃で製剤化及び保存されることが多い。S-Fタンパク質の安定性を調べるために、NDV-S生ウイルスを含有する尿膜腔液を分注して等容量(15ml)にし、4℃で保存した。試料を毎週(wk 0、1、2、3)回収し、20％スクロースクッションに通して濃縮した。濃縮ウイルスを等量のPBSに再懸濁させた。4つのアリコートの全タンパク質含量は、調製物間で同等であった(wk 0: 0.94mg/ml; wk 1: 1.04mg/ml; wk 2: 0.9mg/ml; wk 3: 1.08mg/ml)。S-Fコンストラクトの安定性をウェスタンブロットによって評価し、その一方で、NDV HNタンパク質を対照として使用した。興味深いことに、HNタンパク質は時間とともにわずかに分解したので、S-Fは、尿膜液中、4℃で保持したとき、並外れた安定性を示した(図15A)。0.05％BPLによる不活化は、有胚鶏卵中への不活化ウイルスの接種後のHA活性の欠如によって確認された(図15C)。さらに、0.05％BPLを用いる不活化手順は、ウェスタンブロットによって評価したとき、S-Fの抗原性の喪失を引き起こさなかった(図15B)。これらの観察は、NDVベクターによって発現される膜固定型S-Fキメラが非常に安定であり、4℃で数週間の保存又は不活化のためのBPLによる処理によって分解が引き起こされないことを示した。
ワクチンは温度制御された(～4℃)プロセスを通じて精製及び不活化される必要があるので、抗原の安定性は関心事であり得る。最終製品は、液体バッファー中、4℃で製剤化及び保存されることが多い。S-Fタンパク質の安定性を調べるために、NDV-S生ウイルスを含有する尿膜腔液を分注して等容量(15ml)にし、4℃で保存した。試料を毎週(wk 0、1、2、3)回収し、20％スクロースクッションに通して濃縮した。濃縮ウイルスを等量のPBSに再懸濁させた。4つのアリコートの全タンパク質含量は、調製物間で同等であった(wk 0: 0.94mg/ml; wk 1: 1.04mg/ml; wk 2: 0.9mg/ml; wk 3: 1.08mg/ml)。S-Fコンストラクトの安定性をウェスタンブロットによって評価し、その一方で、NDV HNタンパク質を対照として使用した。興味深いことに、HNタンパク質は時間とともにわずかに分解したので、S-Fは、尿膜液中、4℃で保持したとき、並外れた安定性を示した(図15A)。0.05％BPLによる不活化は、有胚鶏卵中への不活化ウイルスの接種後のHA活性の欠如によって確認された(図15C)。さらに、0.05％BPLを用いる不活化手順は、ウェスタンブロットによって評価したとき、S-Fの抗原性の喪失を引き起こさなかった(図15B)。これらの観察は、NDVベクターによって発現される膜固定型S-Fキメラが非常に安定であり、4℃で数週間の保存又は不活化のためのBPLによる処理によって分解が引き起こされないことを示した。
(不活化NDV-Sワクチンはマウスで高力価の結合及び中和抗体を誘導した)
不活化NDV-Sワクチンの前臨床評価のために、該ワクチンの免疫原性並びにアジュバントの用量節減能力をマウスで検討した。ワクチンを、プライム-ブーストレジメンに従って、2週間間隔で、筋肉内投与した。具体的には、3つの非アジュバント添加グループについて、マウスを、マウス当たり5μg、10μg、又は20μgの不活化NDV-Sワクチンで筋肉内免疫した。ここでは、カチオン性脂質DOTAPの純粋なR-エナンチオマー(R-DOTAP)の臨床段階の治験用リポソーム懸濁剤及びMF59様水中油型エマルジョンアジュバントAddaVaxという2つのアジュバントを試験した。各々のアジュバントを、0.2μg、1μg、及び5μgの低用量のNDV-Sワクチンと組み合わせた。20μgの不活化WT NDVを投与されたマウスをベクターのみの(陰性)対照として使用した。ブースト前(プライムから2週間後)及びブーストから11日後に、マウスを採血して、三量体全長Sタンパク質を基質として用いるELISA(17)及びSARS-CoV-2のUSA-WA1/2020株を用いるマイクロ中和アッセイによって、抗体応答を調べた(図16A)。1回の免疫の後、全てのグループがS特異的抗体を発生させた。ブーストは、全てのNDV-S免疫の抗体力価を大いに増大させた。5μgのワクチンと組み合わせたR-DOTAPは、最も高い抗体力価を示した。R-DOTAP又はAddaVaxを含む1μgのワクチン及びAddaVaxを含む5μgのワクチンは、同等のレベルの結合抗体を誘導した。これは、アジュバントなしの20μgのワクチンによって誘導される力価とも同様である。予想通り、不活化野生型NDVのみは、ベースラインレベルの抗体応答を誘導した(図16B)。さらに、マイクロ中和アッセイを実施して、ワクチン接種されたマウスから回収された血清抗体の中和活性を決定した。WT NDVグループを除く全てのグループからの血清は、SARS-CoV-2 USA-WA1/2020株に対する中和活性を示した。R-DOTAPを含む1μgのワクチングループの中和力価(ID50 ～476)及びAddaVaxを含む5μgのワクチングループの中和力価(ID50 ～515)が最も高く、互いに同等であるように見える。興味深いことに、R-DOTAPを含む5μgのワクチンを投与されたグループはELISAで最大量の結合抗体を発生させたが、これらの血清は、最大中和抗体ではなく、R-DOTAPがAddaVaxの作用機序と異なる作用機序を有する可能性があることを示唆した。R-DOTAPは、重要なサイトカイン及びケモカインの産生を誘導し、かつタンパク質と組み合わせたときに、細胞溶解性T細胞を増強する免疫モジュレーターである。抗原がより多い場合、免疫応答がR-DOTAPによってCD8+ T細胞応答に傾斜し、非中和抗体が誘導された可能性が高い(図16C)。これらの結果は、膜固定型S-Fを発現する不活化NDV-Sワクチンが免疫原性であり、強力な結合及び中和抗体を誘導することを示した。重要なことに、アジュバントを用いて、マウスで少なくとも10倍の用量節減を達成した。
不活化NDV-Sワクチンの前臨床評価のために、該ワクチンの免疫原性並びにアジュバントの用量節減能力をマウスで検討した。ワクチンを、プライム-ブーストレジメンに従って、2週間間隔で、筋肉内投与した。具体的には、3つの非アジュバント添加グループについて、マウスを、マウス当たり5μg、10μg、又は20μgの不活化NDV-Sワクチンで筋肉内免疫した。ここでは、カチオン性脂質DOTAPの純粋なR-エナンチオマー(R-DOTAP)の臨床段階の治験用リポソーム懸濁剤及びMF59様水中油型エマルジョンアジュバントAddaVaxという2つのアジュバントを試験した。各々のアジュバントを、0.2μg、1μg、及び5μgの低用量のNDV-Sワクチンと組み合わせた。20μgの不活化WT NDVを投与されたマウスをベクターのみの(陰性)対照として使用した。ブースト前(プライムから2週間後)及びブーストから11日後に、マウスを採血して、三量体全長Sタンパク質を基質として用いるELISA(17)及びSARS-CoV-2のUSA-WA1/2020株を用いるマイクロ中和アッセイによって、抗体応答を調べた(図16A)。1回の免疫の後、全てのグループがS特異的抗体を発生させた。ブーストは、全てのNDV-S免疫の抗体力価を大いに増大させた。5μgのワクチンと組み合わせたR-DOTAPは、最も高い抗体力価を示した。R-DOTAP又はAddaVaxを含む1μgのワクチン及びAddaVaxを含む5μgのワクチンは、同等のレベルの結合抗体を誘導した。これは、アジュバントなしの20μgのワクチンによって誘導される力価とも同様である。予想通り、不活化野生型NDVのみは、ベースラインレベルの抗体応答を誘導した(図16B)。さらに、マイクロ中和アッセイを実施して、ワクチン接種されたマウスから回収された血清抗体の中和活性を決定した。WT NDVグループを除く全てのグループからの血清は、SARS-CoV-2 USA-WA1/2020株に対する中和活性を示した。R-DOTAPを含む1μgのワクチングループの中和力価(ID50 ～476)及びAddaVaxを含む5μgのワクチングループの中和力価(ID50 ～515)が最も高く、互いに同等であるように見える。興味深いことに、R-DOTAPを含む5μgのワクチンを投与されたグループはELISAで最大量の結合抗体を発生させたが、これらの血清は、最大中和抗体ではなく、R-DOTAPがAddaVaxの作用機序と異なる作用機序を有する可能性があることを示唆した。R-DOTAPは、重要なサイトカイン及びケモカインの産生を誘導し、かつタンパク質と組み合わせたときに、細胞溶解性T細胞を増強する免疫モジュレーターである。抗原がより多い場合、免疫応答がR-DOTAPによってCD8+ T細胞応答に傾斜し、非中和抗体が誘導された可能性が高い(図16C)。これらの結果は、膜固定型S-Fを発現する不活化NDV-Sワクチンが免疫原性であり、強力な結合及び中和抗体を誘導することを示した。重要なことに、アジュバントを用いて、マウスで少なくとも10倍の用量節減を達成した。
(不活化NDV-Sワクチンはマウス適合SARS-CoV-2の投与からマウスを防御した)
ワクチン誘導性防御を評価するために、ブーストから19日後に、マウス適合SARS-CoV-2ウイルスを用いて、マウスに投与した(図16A)。体重減少を4日間モニタリングした。WT NDVを投与された陰性対照グループのみが4日目までに相当な体重(～10％)を失うことが観察された一方で、ワクチン接種されたグループは全て、体重減少を示さなかった(図17A)。投与から4日後の肺におけるウイルス力価も測定した。予想通り、WT NDVを投与された陰性対照グループは、＞104pfu/葉という最大のウイルス力価を示した。5μgの非アジュバント添加ワクチン及びR-DOTAPを含む0.2μgのワクチンを投与されたグループは、肺における検出可能ではあるが、低いウイルス力価を示し、一方、他のグループは全て、完全に防御された(図17B)。図22も参照されたい。AddaVaxを含む0.2μgのワクチンだけでなく、アジュバントを含まない10μgのワクチンも防御したので、これらの結果は励みになるものである。R-DOTAPを含む0.2μgのワクチンは殺菌免疫を誘導しなかったが、肺における約1000倍のウイルス力価の低下が達成された。結論として、不活化NDV-Sは、アジュバントを含む非常に低い用量でSARS-CoV-2に対する防御免疫を誘導するので、費用効果が高いワクチンとしての大きな可能性を示している。
ワクチン誘導性防御を評価するために、ブーストから19日後に、マウス適合SARS-CoV-2ウイルスを用いて、マウスに投与した(図16A)。体重減少を4日間モニタリングした。WT NDVを投与された陰性対照グループのみが4日目までに相当な体重(～10％)を失うことが観察された一方で、ワクチン接種されたグループは全て、体重減少を示さなかった(図17A)。投与から4日後の肺におけるウイルス力価も測定した。予想通り、WT NDVを投与された陰性対照グループは、＞104pfu/葉という最大のウイルス力価を示した。5μgの非アジュバント添加ワクチン及びR-DOTAPを含む0.2μgのワクチンを投与されたグループは、肺における検出可能ではあるが、低いウイルス力価を示し、一方、他のグループは全て、完全に防御された(図17B)。図22も参照されたい。AddaVaxを含む0.2μgのワクチンだけでなく、アジュバントを含まない10μgのワクチンも防御したので、これらの結果は励みになるものである。R-DOTAPを含む0.2μgのワクチンは殺菌免疫を誘導しなかったが、肺における約1000倍のウイルス力価の低下が達成された。結論として、不活化NDV-Sは、アジュバントを含む非常に低い用量でSARS-CoV-2に対する防御免疫を誘導するので、費用効果が高いワクチンとしての大きな可能性を示している。
(不活化NDV-SワクチンはハムスターモデルでSARS-CoV-2投与に対する防御を付与する)
ゴールデンシリアンハムスターは、SARS-CoV-2感染に罹患しやすく、かつSARS-CoV-2誘導性疾患を生じるので、COVID-19の有用な小動物モデルと特徴付けられている(21,22)。ここでは、ハムスターにおける不活化NDV-Sワクチンの予備的な免疫原性及び有効性研究を実施した。このワクチン接種も、プライム-ブーストレジメンに従って、2週間間隔で、筋肉内投与経路を介して行った。ブーストから24日後、ハムスターに、動物当たり104pfuのSARS-CoV-2 USA-WA1/2020を鼻腔内投与した。4グループのハムスターが本研究に含まれた。グループ1には、動物当たり10μgの不活化NDV-Sワクチンをアジュバントなしで投与した。グループ2には、AddaVaxをアジュバントとして含む5μgの不活化NDV-Sワクチンを投与した。グループ3は、10μgの不活化WT NDVで免疫されたベクターのみの陰性対照であった。ワクチンを投与せず、PBSを模擬投与したグループ4は、健常対照として使用した(図18A)。ブースト前及び感染後(dpi)2日の動物の血清IgG力価をELISAによって測定した。NDV-Sワクチン±アジュバントを用いる1回の免疫は、スパイク特異的抗体の誘導に成功した。2dpiでの感染による血清変換がベースラインレベルのWT NDV血清によって示されなかったので、ワクチンプライミング後の力価と比較したときの2dpiでの力価の増大は、ブースト後のワクチン誘導性抗体レベルを表すものであった可能性が最も高い。予想通り、ブーストがNDV-Sワクチン接種グループで抗体力価を大幅に増大させたのに対し、WT NDV血清は、ごくわずかな結合シグナルしか示さなかった(図18B)。それでもなお、本発明者らは、SARS-CoV-2への曝露後のワクチン誘導性メモリーB細胞によるS抗体の迅速な産生による寄与を排除することができない。ハムスターに投与し、体重減少を5日間モニタリングした。WT NDVグループは、5dpiまでに体重の最大15％を失った。10μgの不活化NDV-Sワクチンを投与された動物は、3dpiまでに体重の～10％を失い、回復し始めた。AddaVaxを含む5μgの不活化NDV-Sワクチンを投与された動物は、2dpiにのみ体重を失い、素早く回復した(図18C)。右上(UR)の肺葉及び右下(LR)の肺葉におけるウイルス力価も測定した。肺葉を1mLのPBS中でホモジナイズした。肺ホモジネート中のウイルス力価をプラークアッセイによって測定した。アジュバントあり又はなしのNDV-Sでワクチン接種された動物が2dpiでのウイルス力価の大幅な低下を示した一方で、5dpiでのこれら2つのグループのウイルス力価は、検出限界未満であった(図18D)。これらのデータは、不活化NDV-SワクチンがハムスターにおけるSARS-CoV-2誘導性疾患の症状を効果的に軽減することができることを示唆した。
ゴールデンシリアンハムスターは、SARS-CoV-2感染に罹患しやすく、かつSARS-CoV-2誘導性疾患を生じるので、COVID-19の有用な小動物モデルと特徴付けられている(21,22)。ここでは、ハムスターにおける不活化NDV-Sワクチンの予備的な免疫原性及び有効性研究を実施した。このワクチン接種も、プライム-ブーストレジメンに従って、2週間間隔で、筋肉内投与経路を介して行った。ブーストから24日後、ハムスターに、動物当たり104pfuのSARS-CoV-2 USA-WA1/2020を鼻腔内投与した。4グループのハムスターが本研究に含まれた。グループ1には、動物当たり10μgの不活化NDV-Sワクチンをアジュバントなしで投与した。グループ2には、AddaVaxをアジュバントとして含む5μgの不活化NDV-Sワクチンを投与した。グループ3は、10μgの不活化WT NDVで免疫されたベクターのみの陰性対照であった。ワクチンを投与せず、PBSを模擬投与したグループ4は、健常対照として使用した(図18A)。ブースト前及び感染後(dpi)2日の動物の血清IgG力価をELISAによって測定した。NDV-Sワクチン±アジュバントを用いる1回の免疫は、スパイク特異的抗体の誘導に成功した。2dpiでの感染による血清変換がベースラインレベルのWT NDV血清によって示されなかったので、ワクチンプライミング後の力価と比較したときの2dpiでの力価の増大は、ブースト後のワクチン誘導性抗体レベルを表すものであった可能性が最も高い。予想通り、ブーストがNDV-Sワクチン接種グループで抗体力価を大幅に増大させたのに対し、WT NDV血清は、ごくわずかな結合シグナルしか示さなかった(図18B)。それでもなお、本発明者らは、SARS-CoV-2への曝露後のワクチン誘導性メモリーB細胞によるS抗体の迅速な産生による寄与を排除することができない。ハムスターに投与し、体重減少を5日間モニタリングした。WT NDVグループは、5dpiまでに体重の最大15％を失った。10μgの不活化NDV-Sワクチンを投与された動物は、3dpiまでに体重の～10％を失い、回復し始めた。AddaVaxを含む5μgの不活化NDV-Sワクチンを投与された動物は、2dpiにのみ体重を失い、素早く回復した(図18C)。右上(UR)の肺葉及び右下(LR)の肺葉におけるウイルス力価も測定した。肺葉を1mLのPBS中でホモジナイズした。肺ホモジネート中のウイルス力価をプラークアッセイによって測定した。アジュバントあり又はなしのNDV-Sでワクチン接種された動物が2dpiでのウイルス力価の大幅な低下を示した一方で、5dpiでのこれら2つのグループのウイルス力価は、検出限界未満であった(図18D)。これらのデータは、不活化NDV-SワクチンがハムスターにおけるSARS-CoV-2誘導性疾患の症状を効果的に軽減することができることを示唆した。
(10.4 考察)
SARS-CoV-2に対するウイルスベクターワクチンを開発するために、スパイクタンパク質の2つの形態(S及びS-F)を発現するNDVベースのSARS-CoV-2ワクチンが以前に報告されている。S-FはNDV粒子への優れた組込みを示したので、不活化ワクチンとして使用されるその可能性を本研究で検討した。NDV-Sは、4℃で3週間保存したとき、非常に安定であり、S-Fタンパク質の抗原性を失わないことが分かった。ここでは、マウスにおいて、わずか0.2μgの総量の不活化NDV-Sワクチンが、R-DOTAPと組み合わせたときに約1000倍、肺におけるウイルス力価を顕著に低下させることができ、その一方、アジュバントAddaVaxは、さらにより良好な防御を付与したことが示されている。いずれかのアジュバントを含む1μgのNDV-Sワクチンは、強力な中和抗体を誘発し、結果として、肺におけるウイルス力価が検出不可能となった。これらの前臨床的結果は、10倍を超える抗原節減をマウスモデルで達成することができることを示し、ヒトにおける臨床試験についての価値ある情報を提供する。予備的なハムスター実験において、不活化NDV-Sワクチンは、同じく免疫原性であり、高力価のスパイク特異的抗体を誘導する。ハムスターはSARS-CoV-2感染に遙かにより罹患しやすいので、WT NDVを投与されるグループは、5日目までに体重の最大15％を失い、一方、両方のNDV-Sワクチン接種グループ±アジュバントは、体重減少によって決定されるSARS-CoV-2誘導性疾患を大いに軽減した。AddaVaxアジュバントは、この場合も、ワクチン誘導性防御を増強し、2dpiのグループでのみ体重減少をもたらした。アジュバントR-DOTAPの投与は、ワクチン接種時までに、このモデルのために十分に決定されていなかった。それゆえ、それは、本実験で使用されなかった。しかしながら、今後の研究において、R-DOTAP及びさらなるアジュバントを不活化NDV-Sワクチンと組み合わせて評価することになる。さらに、ハムスターにおけるSARS-CoV-2誘導性疾患の他の結果、例えば、鼻洗浄液又は肺におけるウイルス力価を調べることになる。
SARS-CoV-2に対するウイルスベクターワクチンを開発するために、スパイクタンパク質の2つの形態(S及びS-F)を発現するNDVベースのSARS-CoV-2ワクチンが以前に報告されている。S-FはNDV粒子への優れた組込みを示したので、不活化ワクチンとして使用されるその可能性を本研究で検討した。NDV-Sは、4℃で3週間保存したとき、非常に安定であり、S-Fタンパク質の抗原性を失わないことが分かった。ここでは、マウスにおいて、わずか0.2μgの総量の不活化NDV-Sワクチンが、R-DOTAPと組み合わせたときに約1000倍、肺におけるウイルス力価を顕著に低下させることができ、その一方、アジュバントAddaVaxは、さらにより良好な防御を付与したことが示されている。いずれかのアジュバントを含む1μgのNDV-Sワクチンは、強力な中和抗体を誘発し、結果として、肺におけるウイルス力価が検出不可能となった。これらの前臨床的結果は、10倍を超える抗原節減をマウスモデルで達成することができることを示し、ヒトにおける臨床試験についての価値ある情報を提供する。予備的なハムスター実験において、不活化NDV-Sワクチンは、同じく免疫原性であり、高力価のスパイク特異的抗体を誘導する。ハムスターはSARS-CoV-2感染に遙かにより罹患しやすいので、WT NDVを投与されるグループは、5日目までに体重の最大15％を失い、一方、両方のNDV-Sワクチン接種グループ±アジュバントは、体重減少によって決定されるSARS-CoV-2誘導性疾患を大いに軽減した。AddaVaxアジュバントは、この場合も、ワクチン誘導性防御を増強し、2dpiのグループでのみ体重減少をもたらした。アジュバントR-DOTAPの投与は、ワクチン接種時までに、このモデルのために十分に決定されていなかった。それゆえ、それは、本実験で使用されなかった。しかしながら、今後の研究において、R-DOTAP及びさらなるアジュバントを不活化NDV-Sワクチンと組み合わせて評価することになる。さらに、ハムスターにおけるSARS-CoV-2誘導性疾患の他の結果、例えば、鼻洗浄液又は肺におけるウイルス力価を調べることになる。
マウスモデルとハムスターモデルの両方における不活化NDV-Sでの免疫による有望な防御が示されている。殺菌免疫が必ずしも誘導されるわけではないものの、COVID-19の症状を軽減する手頃な価格でかつ広く利用できる効果的なワクチンを有することのトレードオフは、高所得者層に限定される費用の高いワクチンよりも遙かに好ましいはずである。最も重要なことに、卵ベースのNDV-Sワクチン生産だけが、現在の不活化インフルエンザウイルスワクチン製造手順の変更をほとんど必要としない。商品の費用は、一価の不活化インフルエンザウイルスワクチンの費用と同じくらい(四価の季節性インフルエンザウイルスワクチンの何分の1かの費用)であるか、又は製造するのに費用がかからないアジュバントによる用量節減のために、さらにより低いはずである。
(10.5 実施例5で引用されている参考文献)
(11.実施例6: NDV-HXP-Sのワクチン接種)
第10節に記載されている生及び不活化NDV-HXP-Sウイルスは、現在、臨床試験中である。NDV-HXP-Sは、6-プロリンで安定化され、切断部位が欠失しているスパイク(Hexapro)を保有する膜固定型の融合前の安定化された三量体SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現する卵ベースの不活化された又は生の全キメラニューカッスル病ウイルス(NDV)である。ラテンアメリカの製造業者(ブラジルのButantan Institute;メキシコのAviMex)及び東南アジアの製造業者(タイの政府製薬公社(Government Pharmaceutical Organization)[GPO]及びベトナムのInstitute of Vaccines and Medical Biologicals[IVAC])は、第1/2相試験を開始した。数百人の対象に、不活化NDV-HXP-Sワクチンが投与されており、副作用の報告はない。
第10節に記載されている生及び不活化NDV-HXP-Sウイルスは、現在、臨床試験中である。NDV-HXP-Sは、6-プロリンで安定化され、切断部位が欠失しているスパイク(Hexapro)を保有する膜固定型の融合前の安定化された三量体SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現する卵ベースの不活化された又は生の全キメラニューカッスル病ウイルス(NDV)である。ラテンアメリカの製造業者(ブラジルのButantan Institute;メキシコのAviMex)及び東南アジアの製造業者(タイの政府製薬公社(Government Pharmaceutical Organization)[GPO]及びベトナムのInstitute of Vaccines and Medical Biologicals[IVAC])は、第1/2相試験を開始した。数百人の対象に、不活化NDV-HXP-Sワクチンが投与されており、副作用の報告はない。
(11.1 NDV-HXP-S臨床試験)
1つの臨床試験が第2相で実行される。第1相は、健常な成人(18～59歳)(約210人の対象)の間で、アジュバントなしで、様々な用量レベル(1、3、及び10μg)で、及びアジュバントCpG 1018ありで、2つの異なる用量レベル(1及び3μg)で投与されるNDV-HXP-Sワクチンの安全性、忍容性、及び免疫原性を評価する。対象は、D1及びD29(V1及びV3)に2用量の割り当てられた治験薬(IP)を投与され、かつ各々のワクチン接種から7日後(ワクチン接種日として1日目)に、安全性及び反応原性について診療所で評価される。NDV-HXP-S又はプラセボ(0.9％注射用標準生理食塩水)を反復ワクチン接種スケジュールに従って筋肉内(IM)投与する(28日空けて投与する)。さらに、合計36人の対象を、プラセボ及び2つの高用量グループ、すなわち、NDV-HXP-S 10μg及びNDV-HXP-S 3μg＋CpG 1018から無作為に選択して(1:1:1の比)、さらなる血液を、T細胞媒介性免疫(CMI)の評価のために、V1、V5、及びV7で提供する。第1相臨床試験の治療群及び介入については、表4を参照されたい。第1相データの中間解析を、臨床試験の第2相への進展に関する及び治療グループのダウンセレクションに関する決定のための基準として実施する。
表4
1つの臨床試験が第2相で実行される。第1相は、健常な成人(18～59歳)(約210人の対象)の間で、アジュバントなしで、様々な用量レベル(1、3、及び10μg)で、及びアジュバントCpG 1018ありで、2つの異なる用量レベル(1及び3μg)で投与されるNDV-HXP-Sワクチンの安全性、忍容性、及び免疫原性を評価する。対象は、D1及びD29(V1及びV3)に2用量の割り当てられた治験薬(IP)を投与され、かつ各々のワクチン接種から7日後(ワクチン接種日として1日目)に、安全性及び反応原性について診療所で評価される。NDV-HXP-S又はプラセボ(0.9％注射用標準生理食塩水)を反復ワクチン接種スケジュールに従って筋肉内(IM)投与する(28日空けて投与する)。さらに、合計36人の対象を、プラセボ及び2つの高用量グループ、すなわち、NDV-HXP-S 10μg及びNDV-HXP-S 3μg＋CpG 1018から無作為に選択して(1:1:1の比)、さらなる血液を、T細胞媒介性免疫(CMI)の評価のために、V1、V5、及びV7で提供する。第1相臨床試験の治療群及び介入については、表4を参照されたい。第1相データの中間解析を、臨床試験の第2相への進展に関する及び治療グループのダウンセレクションに関する決定のための基準として実施する。
表4
第2相試験において、18～75歳の約250人の対象をプラセボ(0.9％注射用標準生理食塩水)に無作為に割り当てるか(1:2:2)、又は第1相で評価されているNDV HXP Sの2つの選択された製剤のうちの1つを第2相試験に登録する。(2つの年齢層の間に分布する)3つの第2相グループの各々における約12人の対象を無作為に割り当てて、さらなる血液を、T細胞媒介性免疫(CMI)の評価のために、V1、V5、及びV7で提供する。
臨床試験への組入れ基準としては、以下のものが挙げられる:
(第1相のみ:)
・18～59歳の成人(スクリーニング時を含む)
・病歴、身体検査、スクリーニング臨床検査の結果、及び治験責任医師の臨床的評価によって判定したとき、急性又は慢性のいずれかの臨床的に重大な病状がないことをもって定義されるような、健康であること
(第2相のみ:)
・18～75歳の成人(スクリーニング時を含む)
・病歴、身体検査、スクリーニング臨床検査の結果、及び治験責任医師の臨床的評価によって判定したとき、臨床的に重大な急性の病状がなく、無作為化後90日以内にコントロールされていない慢性の病状もないこと
(第1相と第2相の両方:)
・17～40kg/m2のボディマス指数(BMI)を有すること(スクリーニング時を含む)
・妊娠可能な女性の場合、授乳中又は妊娠中であってはならず(スクリーニング時の血清妊娠検査陰性及びIPの初回投与を受ける前の24時間の尿中妊娠検査陰性に基づく)、IPの最終投与後少なくとも28日間は妊娠を避ける計画を立て、適切な避妊方法を一貫して使用する意思があり、IPの2回目の(最後の)投与前に妊娠検査を繰り返し受けなければならない。
(第1相のみ:)
・18～59歳の成人(スクリーニング時を含む)
・病歴、身体検査、スクリーニング臨床検査の結果、及び治験責任医師の臨床的評価によって判定したとき、急性又は慢性のいずれかの臨床的に重大な病状がないことをもって定義されるような、健康であること
(第2相のみ:)
・18～75歳の成人(スクリーニング時を含む)
・病歴、身体検査、スクリーニング臨床検査の結果、及び治験責任医師の臨床的評価によって判定したとき、臨床的に重大な急性の病状がなく、無作為化後90日以内にコントロールされていない慢性の病状もないこと
(第1相と第2相の両方:)
・17～40kg/m2のボディマス指数(BMI)を有すること(スクリーニング時を含む)
・妊娠可能な女性の場合、授乳中又は妊娠中であってはならず(スクリーニング時の血清妊娠検査陰性及びIPの初回投与を受ける前の24時間の尿中妊娠検査陰性に基づく)、IPの最終投与後少なくとも28日間は妊娠を避ける計画を立て、適切な避妊方法を一貫して使用する意思があり、IPの2回目の(最後の)投与前に妊娠検査を繰り返し受けなければならない。
臨床試験からの除外基準としては、以下のものが挙げられる:
(第1相のみ:)
・SARS-CoV-2 IgG検査のための血清検査で陽性
(第1相と第2相の両方:)
・試験用ワクチン投与前28日以内にいずれかの非試験用ワクチンの投与歴がある、又は試験参加期間中のワクチン接種を計画している。タイで認可又は緊急使用許可を得ているいずれかのCOVID-19ワクチンの試験参加期間中の接種は、ビジット5後に投与されても、除外とならない場合がある。
・SARSもしくはMERSの治験用ワクチン、又は治験結果の解釈に影響を与える可能性があるいずれかの治験用もしくは認可済ワクチンの過去の接種
・いずれかの事前のワクチン接種に対する過敏症反応の履歴、又は試験用ワクチンのいずれかの成分に対する既知の過敏症の履歴
・卵又はニワトリのアレルギーの履歴
・血管性浮腫の履歴
・アナフィラキシーの履歴
・急性疾患(中等度もしくは重度)及び/又は発熱(口腔内で測定した体温が38℃以上)
・PIによって臨床的に重要であると判断されたいずれかの異常なバイタルサイン
・PIによって除外と判断されたスクリーニング臨床検査の異常
・SARS-CoV-2 IgM検査、ヒト免疫不全ウイルス(HIV 1/2Ab)、B型肝炎(HBsAg)、C型肝炎(HCV Ab)の血清検査で陽性
・実験室で確認されたCOVID-19の履歴(SAR-CoV-2に対するRT-PCRで陽性)
・悪性腫瘍(非黒色腫皮膚癌及び子宮頸部上皮内癌は除外してもよい)の履歴
・免疫抑制状態又は免疫不全状態の確認又は疑いがあるもの
・最初の試験注射前90日以内の免疫グロブリンもしくはいずれかの血液製剤の投与、又は試験期間中の計画された投与
・いずれかの長時間作用型免疫修飾薬(例：インフリキシマブもしくはリツキシマブ)の投与、又は最初の試験注射前6カ月以内の免疫抑制物質の長期投与(14日を超えるものと定義される)、又は試験期間中の計画された投与(≧0.5mg/kg/日のプレドニゾンに相当する用量の全身性コルチコステロイドを含む;吸入及び鼻腔内ステロイドを含む局所ステロイドの使用は許可される)。
・貧血又は過剰出血を引き起こす可能性がある既知の凝固障害又は血液障害の履歴(例えば、サラセミア、凝固因子欠乏症)
・アルコール又は薬物乱用の最近の履歴(過去1年以内)又は兆候
・PIの意見では、試験目的を妨げるか、対象に危険を及ぼすか、又は対象が試験フォローアップを完了するのを妨げる可能性があるいずれかの病状、精神状態、又は行動状態
(第1相のみ:)
・SARS-CoV-2 IgG検査のための血清検査で陽性
(第1相と第2相の両方:)
・試験用ワクチン投与前28日以内にいずれかの非試験用ワクチンの投与歴がある、又は試験参加期間中のワクチン接種を計画している。タイで認可又は緊急使用許可を得ているいずれかのCOVID-19ワクチンの試験参加期間中の接種は、ビジット5後に投与されても、除外とならない場合がある。
・SARSもしくはMERSの治験用ワクチン、又は治験結果の解釈に影響を与える可能性があるいずれかの治験用もしくは認可済ワクチンの過去の接種
・いずれかの事前のワクチン接種に対する過敏症反応の履歴、又は試験用ワクチンのいずれかの成分に対する既知の過敏症の履歴
・卵又はニワトリのアレルギーの履歴
・血管性浮腫の履歴
・アナフィラキシーの履歴
・急性疾患(中等度もしくは重度)及び/又は発熱(口腔内で測定した体温が38℃以上)
・PIによって臨床的に重要であると判断されたいずれかの異常なバイタルサイン
・PIによって除外と判断されたスクリーニング臨床検査の異常
・SARS-CoV-2 IgM検査、ヒト免疫不全ウイルス(HIV 1/2Ab)、B型肝炎(HBsAg)、C型肝炎(HCV Ab)の血清検査で陽性
・実験室で確認されたCOVID-19の履歴(SAR-CoV-2に対するRT-PCRで陽性)
・悪性腫瘍(非黒色腫皮膚癌及び子宮頸部上皮内癌は除外してもよい)の履歴
・免疫抑制状態又は免疫不全状態の確認又は疑いがあるもの
・最初の試験注射前90日以内の免疫グロブリンもしくはいずれかの血液製剤の投与、又は試験期間中の計画された投与
・いずれかの長時間作用型免疫修飾薬(例：インフリキシマブもしくはリツキシマブ)の投与、又は最初の試験注射前6カ月以内の免疫抑制物質の長期投与(14日を超えるものと定義される)、又は試験期間中の計画された投与(≧0.5mg/kg/日のプレドニゾンに相当する用量の全身性コルチコステロイドを含む;吸入及び鼻腔内ステロイドを含む局所ステロイドの使用は許可される)。
・貧血又は過剰出血を引き起こす可能性がある既知の凝固障害又は血液障害の履歴(例えば、サラセミア、凝固因子欠乏症)
・アルコール又は薬物乱用の最近の履歴(過去1年以内)又は兆候
・PIの意見では、試験目的を妨げるか、対象に危険を及ぼすか、又は対象が試験フォローアップを完了するのを妨げる可能性があるいずれかの病状、精神状態、又は行動状態
臨床試験に登録された対象は、主要転帰、副次転帰、及び他の転帰について評価されることができる。例えば、臨床試験に登録された対象は、特定の血液検査における有害作用及び変化について評価されることができる。特に、臨床試験に登録された対象は、以下の主要転帰尺度のうち1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てについて評価されることができる:
・1回目のワクチン接種後の非自発的な報告義務のある局所有害事象の頻度[時間枠: 1日目から7日目まで]
・1回目のワクチン接種の非自発的な報告義務のある局所有害事象(疼痛もしくは圧痛、紅斑、腫脹、又は硬結)の頻度
・2回目のワクチン接種後の非自発的な報告義務のある局所有害事象の頻度[時間枠: 1日目から7日目まで]
・2回目のワクチン接種の非自発的な報告義務のある局所有害事象(疼痛もしくは圧痛、紅斑、腫脹、又は硬結)の頻度
・1回目のワクチン接種後の非自発的な報告義務のある全身性有害事象の頻度[時間枠: 1日目から7日目まで]
・1回目のワクチン接種の非自発的な報告義務のある全身性有害事象(発熱、頭痛、疲労もしくは不快感、筋肉痛、関節痛、吐き気、又は嘔吐)の頻度
・2回目のワクチン接種後の非自発的な報告義務のある全身性有害事象の頻度[時間枠: 1日目から7日目まで]
・2回目のワクチン接種の非自発的な報告義務のある全身性有害事象(発熱、頭痛、疲労もしくは不快感、筋肉痛、関節痛、吐き気、又は嘔吐)の頻度
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したヘモグロビンの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したヘモグロビン(g/dl)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したヘモグロビンの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したヘモグロビン(g/dl)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した白血球の測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した白血球(10^3細胞/ul)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した白血球の測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した白血球(10^3細胞/ul)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した血小板数の測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した血小板数の測定(10^3細胞/ul)
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した血小板数の測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した血小板数の測定(10^3細胞/ul)
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したクレアチニンの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したクレアチニン(mg/dl)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したクレアチニンの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したクレアチニン(mg/dl)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したASTの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したAST(U/L)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したASTの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したAST(U/L)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したALTの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したALT(U/L)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したALTの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したALT(U/L)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した総ビリルビンの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した総ビリルビン(mg/dl)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した総ビリルビンの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した総ビリルビン(mg/dl)の測定
・全ての自発的なAEの頻度[時間枠: 56日目]
・全ての自発的なAEの頻度
・SAEの頻度[時間枠: 365日目]
・試験期間全体を通したSAEの頻度
・受診を要した有害事象(MAAE)の頻度[時間枠: 365日目]
・試験期間全体を通した受診を要した有害事象(MAAE)の頻度
・AESIの頻度[時間枠: 365日目]
・COVID-19に関連するAESIを含む、試験期間全体を通したAESIの頻度、並びに数及びパーセンテージとして提示される潜在的な免疫介在性病状(PIMMC)
・1回目のワクチン接種後の非自発的な報告義務のある局所有害事象の頻度[時間枠: 1日目から7日目まで]
・1回目のワクチン接種の非自発的な報告義務のある局所有害事象(疼痛もしくは圧痛、紅斑、腫脹、又は硬結)の頻度
・2回目のワクチン接種後の非自発的な報告義務のある局所有害事象の頻度[時間枠: 1日目から7日目まで]
・2回目のワクチン接種の非自発的な報告義務のある局所有害事象(疼痛もしくは圧痛、紅斑、腫脹、又は硬結)の頻度
・1回目のワクチン接種後の非自発的な報告義務のある全身性有害事象の頻度[時間枠: 1日目から7日目まで]
・1回目のワクチン接種の非自発的な報告義務のある全身性有害事象(発熱、頭痛、疲労もしくは不快感、筋肉痛、関節痛、吐き気、又は嘔吐)の頻度
・2回目のワクチン接種後の非自発的な報告義務のある全身性有害事象の頻度[時間枠: 1日目から7日目まで]
・2回目のワクチン接種の非自発的な報告義務のある全身性有害事象(発熱、頭痛、疲労もしくは不快感、筋肉痛、関節痛、吐き気、又は嘔吐)の頻度
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したヘモグロビンの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したヘモグロビン(g/dl)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したヘモグロビンの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したヘモグロビン(g/dl)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した白血球の測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した白血球(10^3細胞/ul)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した白血球の測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した白血球(10^3細胞/ul)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した血小板数の測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した血小板数の測定(10^3細胞/ul)
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した血小板数の測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した血小板数の測定(10^3細胞/ul)
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したクレアチニンの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したクレアチニン(mg/dl)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したクレアチニンの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したクレアチニン(mg/dl)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したASTの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したAST(U/L)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したASTの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したAST(U/L)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したALTの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したALT(U/L)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したALTの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化したALT(U/L)の測定
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した総ビリルビンの測定[時間枠: 8日目]
・1回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した総ビリルビン(mg/dl)の測定
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した総ビリルビンの測定[時間枠: 36日目]
・2回目のワクチン接種から7日後のベースラインから変化した総ビリルビン(mg/dl)の測定
・全ての自発的なAEの頻度[時間枠: 56日目]
・全ての自発的なAEの頻度
・SAEの頻度[時間枠: 365日目]
・試験期間全体を通したSAEの頻度
・受診を要した有害事象(MAAE)の頻度[時間枠: 365日目]
・試験期間全体を通した受診を要した有害事象(MAAE)の頻度
・AESIの頻度[時間枠: 365日目]
・COVID-19に関連するAESIを含む、試験期間全体を通したAESIの頻度、並びに数及びパーセンテージとして提示される潜在的な免疫介在性病状(PIMMC)
臨床試験に登録された対象は、中和抗体及び血清応答について評価されることができる。特に、臨床試験に登録された対象は、以下の副次転帰尺度のうち1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てについて評価されることができる:
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50[時間枠: 29日目]
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50[時間枠: 365日目]
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80[時間枠: 29日目]
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80[時間枠: 365日目]
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したNT50血清応答[時間枠: 29日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した1回目のワクチン接種から28日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT50血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したNT50血清応答[時間枠: 43日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から14日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT50血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したNT50血清応答[時間枠: 197日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT50血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したNT50血清応答[時間枠: 365日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT50血清応答を有する対象の頻度
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したNT80血清応答[時間枠: 29日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した1回目のワクチン接種から28日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT80血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したNT80血清応答[時間枠: 43日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から14日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT80血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したNT80血清応答[時間枠: 197日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT80血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したNT80血清応答[時間枠: 365日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT80血清応答を有する対象の頻度
・1回目のワクチン接種から28日後のGMT 抗S IgG[時間枠: 29日目]
・ベースライン時に抗S IgG血清反応陰性である対象における1回目のワクチン接種から28日後のGMT 抗S IgG
・2回目のワクチン接種から14日後のGMT 抗S IgG[時間枠: 43日目]
・ベースライン時に抗S IgG血清反応陰性である対象における2回目のワクチン接種から14日後のGMT 抗S IgG
・2回目のワクチン接種から6カ月後のGMT 抗S IgG[時間枠: 197日目]
・ベースライン時に抗S IgG血清反応陰性である対象における2回目のワクチン接種から6カ月後のGMT 抗S IgG
・2回目のワクチン接種から12カ月後のGMT 抗S IgG[時間枠: 365日目]
・ベースライン時に抗S IgG血清反応陰性である対象における2回目のワクチン接種から12カ月後のGMT 抗S IgG
・1回目のワクチン接種から28日後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR[時間枠: 29日目]
・1回目のワクチン接種から28日後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR
・2回目のワクチン接種から14日後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR
・2回目のワクチン接種から6カ月後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR
・2回目のワクチン接種から12カ月後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR[時間枠: 365日目]
・2回目のワクチン接種から12カ月後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化した抗S IgG血清応答[時間枠: 29日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)1回目のワクチン接種から28日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、抗S IgG力価における血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化した抗S IgG血清応答[時間枠: 43日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)2回目のワクチン接種から14日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、抗S IgG力価における血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化した抗S IgG血清応答[時間枠: 197日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、抗S IgG力価で血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化した抗S IgG血清応答[時間枠: 365日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、抗S IgG力価で血清応答を有する対象の頻度
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50[時間枠: 29日目]
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50[時間枠: 365日目]
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価50
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80[時間枠: 29日目]
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80[時間枠: 365日目]
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したGMT中和抗体力価80
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したNT50血清応答[時間枠: 29日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した1回目のワクチン接種から28日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT50血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したNT50血清応答[時間枠: 43日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から14日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT50血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したNT50血清応答[時間枠: 197日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT50血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したNT50血清応答[時間枠: 365日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT50血清応答を有する対象の頻度
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化したNT80血清応答[時間枠: 29日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した1回目のワクチン接種から28日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT80血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したNT80血清応答[時間枠: 43日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から14日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT80血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したNT80血清応答[時間枠: 197日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT80血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化したNT80血清応答[時間枠: 365日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)ベースラインと比較した2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、SARS-CoV-2シュードウイルスに対するNT80血清応答を有する対象の頻度
・1回目のワクチン接種から28日後のGMT 抗S IgG[時間枠: 29日目]
・ベースライン時に抗S IgG血清反応陰性である対象における1回目のワクチン接種から28日後のGMT 抗S IgG
・2回目のワクチン接種から14日後のGMT 抗S IgG[時間枠: 43日目]
・ベースライン時に抗S IgG血清反応陰性である対象における2回目のワクチン接種から14日後のGMT 抗S IgG
・2回目のワクチン接種から6カ月後のGMT 抗S IgG[時間枠: 197日目]
・ベースライン時に抗S IgG血清反応陰性である対象における2回目のワクチン接種から6カ月後のGMT 抗S IgG
・2回目のワクチン接種から12カ月後のGMT 抗S IgG[時間枠: 365日目]
・ベースライン時に抗S IgG血清反応陰性である対象における2回目のワクチン接種から12カ月後のGMT 抗S IgG
・1回目のワクチン接種から28日後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR[時間枠: 29日目]
・1回目のワクチン接種から28日後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR
・2回目のワクチン接種から14日後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR
・2回目のワクチン接種から6カ月後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR
・2回目のワクチン接種から12カ月後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR[時間枠: 365日目]
・2回目のワクチン接種から12カ月後の抗S IgG GMTにおけるベースラインから変化したGMFR
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化した抗S IgG血清応答[時間枠: 29日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)1回目のワクチン接種から28日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、抗S IgG力価における血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化した抗S IgG血清応答[時間枠: 43日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)2回目のワクチン接種から14日後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、抗S IgG力価における血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化した抗S IgG血清応答[時間枠: 197日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、抗S IgG力価で血清応答を有する対象の頻度
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化した抗S IgG血清応答[時間枠: 365日目]
・(1)ベースラインからの4倍以上の増加、及び(2)2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインからの10倍以上の増加によって定義される、抗S IgG力価で血清応答を有する対象の頻度
臨床試験に登録された対象は、T細胞応答及び抗NDV抗体について評価されることができる。特に、臨床試験に登録された対象は、以下の副次転帰尺度のうち1つ、2つ、もしくはそれより多く、又は全てについて評価されることができる:
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したSタンパク質特異的T細胞応答[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインと比べたSタンパク質特異的T細胞の頻度
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したSタンパク質特異的T細胞応答[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインと比べたSタンパク質特異的T細胞の頻度
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化した抗NDV HN GMT[時間枠: 29日目]
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化した抗NDV HN GMT
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT[時間枠: 365日目]
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化したSタンパク質特異的T細胞応答[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインと比べたSタンパク質特異的T細胞の頻度
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化したSタンパク質特異的T細胞応答[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインと比べたSタンパク質特異的T細胞の頻度
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化した抗NDV HN GMT[時間枠: 29日目]
・1回目のワクチン接種から28日後のベースラインから変化した抗NDV HN GMT
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT[時間枠: 43日目]
・2回目のワクチン接種から14日後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT[時間枠: 197日目]
・2回目のワクチン接種から6カ月後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT[時間枠: 365日目]
・2回目のワクチン接種から12カ月後のベースラインから変化した抗NDV HN IgG GMT
(12.実施例7:新世代ワクチンとしてのSARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質を発現するニューカッスル病ウイルス(NDV))
本実施例は、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質を発現するニューカッスル病ウイルス(NDV)ベクターの産生を記載している。
本実施例は、SARS-CoV-2変異体のスパイクタンパク質を発現するニューカッスル病ウイルス(NDV)ベクターの産生を記載している。
SARS-CoV-2変異体、特に、B.1.351(南アフリカ)、P.1(ブラジル)、及びさらなるE484K突然変異を有するB.1.1.7(UK)の出現は、米国で緊急使用許可を受けている既存のワクチンの効力に関する懸念を引き起こした(1～5)。これらの変異体は、武漢プロトタイプのSARS-CoV-2スパイクによって誘発される中和抗体に対する増大した抵抗性を示すように見えた。本実施例は、多塩基性切断部位が除去され、hexa pro(HXP)安定化突然変異(6)が導入され、かつ膜貫通ドメイン/細胞質テールがNDV融合(F)タンパク質由来のものと交換された(7,8)、SARS-CoV-2変異体の融合前安定化スパイクタンパク質を発現するNDVベクターの構築を記載している。ワクチンとして使用され得るNDV-HXP-Sベクターの設計の模式図については、図19Aを参照されたい。特に、B.1.351及びP.1変異体のHXP-Sを発現するNDVベクター(表5を参照)を作製した。これらのNDVベクターを、これらの変異体が主に循環している国で使用されることになる一価NDV-HXP-S変異体ワクチン又は二価NDV-HXP-Sワクチンとして使用した。
(12.1 材料及び方法)
(NDV-HXP-S変異体の設計及び発現)
図19Aは、NDV-HXP-S(B.1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)の設計模式図を提供している。NDV-HXP-S(B.1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)に導入された突然変異は、図19Bに示されており、配列は、表5に示されている。ウイルスを2回の継代による有胚鶏卵中での限界希釈によって精製した。これは、GMP MVS産生のためのプレマスターウイルスシード(MVS)として使用される。NDV-HXP-S変異体におけるスパイクタンパク質の発現を調べるために、NDV-HXP-S(B.1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)のプレ-MVSを卵中で継代し、採取された尿膜腔液中のウイルスを超遠心分離によって20％スクロースクッションに通して濃縮した。濃縮ウイルスを、プロトタイプNDV-HXP-Sを用いるSDS-PAGEで分解し、次いで、クマシーブルー染色を行った。
(NDV-HXP-S変異体の設計及び発現)
図19Aは、NDV-HXP-S(B.1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)の設計模式図を提供している。NDV-HXP-S(B.1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)に導入された突然変異は、図19Bに示されており、配列は、表5に示されている。ウイルスを2回の継代による有胚鶏卵中での限界希釈によって精製した。これは、GMP MVS産生のためのプレマスターウイルスシード(MVS)として使用される。NDV-HXP-S変異体におけるスパイクタンパク質の発現を調べるために、NDV-HXP-S(B.1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)のプレ-MVSを卵中で継代し、採取された尿膜腔液中のウイルスを超遠心分離によって20％スクロースクッションに通して濃縮した。濃縮ウイルスを、プロトタイプNDV-HXP-Sを用いるSDS-PAGEで分解し、次いで、クマシーブルー染色を行った。
(NDV-HXP-S変異体の特徴付け)
プロトタイプ(武漢)又はB.1.351スパイクタンパク質の両方と交差反応するヒト又はマウスモノクローナル抗体は、以前に単離され、特徴付けられた。NDV-HXP-S変異体によって発現されるスパイクタンパク質のヒトモノクローナル抗体(mAb) 1D07(RBD)、2B12(NTD)、及びCR3022(RBD)並びにマウスモノクローナル抗体(mAb) 3A7(RBD)を含む交差反応性抗体への結合を、図20Aに示されている濃縮ウイルス調製物を用いるELISAによって決定した。
プロトタイプ(武漢)又はB.1.351スパイクタンパク質の両方と交差反応するヒト又はマウスモノクローナル抗体は、以前に単離され、特徴付けられた。NDV-HXP-S変異体によって発現されるスパイクタンパク質のヒトモノクローナル抗体(mAb) 1D07(RBD)、2B12(NTD)、及びCR3022(RBD)並びにマウスモノクローナル抗体(mAb) 3A7(RBD)を含む交差反応性抗体への結合を、図20Aに示されている濃縮ウイルス調製物を用いるELISAによって決定した。
(NDV-HXP-S変異体B.1.351及びP.1の突然変異生成プロファイル)
特異的突然変異をNDV-HXP-S変異体B.1.351及びP.1に導入した。例えば、A701V突然変異を、NDV-HXP-S変異体B.1.351中で、もとのA701に戻した。図19BのレスキューされたP.1変異体については、D614を突然変異させなかった。D614N突然変異はスパイク三量体安定化することが報告されているので、これをP.1スパイクに導入した。このD614N突然変異は、D614Gよりもわずかに効果的であった(12)。D614NをS2突然変異(T1027I)の非存在下又は存在下で導入した。本実施例で実施された突然変異は、図21A～21Bに示されている。
特異的突然変異をNDV-HXP-S変異体B.1.351及びP.1に導入した。例えば、A701V突然変異を、NDV-HXP-S変異体B.1.351中で、もとのA701に戻した。図19BのレスキューされたP.1変異体については、D614を突然変異させなかった。D614N突然変異はスパイク三量体安定化することが報告されているので、これをP.1スパイクに導入した。このD614N突然変異は、D614Gよりもわずかに効果的であった(12)。D614NをS2突然変異(T1027I)の非存在下又は存在下で導入した。本実施例で実施された突然変異は、図21A～21Bに示されている。
(12.2 結果)
2つのNDVベクター(NDV-HXP-S(B1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)を、図19Aに示されているように設計した。図19Bは、この2つのベクターのスパイクタンパク質中の突然変異を提供している。この2つのベクターをレスキューするのに成功し、図20Aに示されているように、NDV-HXP-S(B.1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)によるスパイクタンパク質の発現をSDS-PAGEによって検出した。2つの変異体によって発現されたスパイクタンパク質が特定のモノクローナル抗体に結合する能力を調べた。5μg/mLの各々のウイルスをELISAプレートにコーティングしたとき(同量のスパイクを含有しない可能性もある)、B.1.351スパイクが、ヒトmAb 1D07及び2B12への結合のわずかな低下を示したのに対し、P.1は、mAb 1D07への結合の顕著な低下及びB.1351の結合と同様のmAb 2B12への結合を示した(図20B)。変異体P.1とB.1.351の両方及び第10節に記載されているNDV-HXP-S(野生型又はWT)は、ヒトmAb CR3022及びマウスmAb 3A7に同等に結合した(図20B)。これらは、NDV-HXP-S(B.1.351)によって発現されるB.1.351スパイクがこれらの交差反応性抗体によって認識されるエピトープを維持することを示している。さらに、これらの抗体へのNDV-HXP-S(P.1)によって発現されるP.1スパイクの結合情報が得られ、mAbの2B12、CR3022、及び3A7がP.1スパイクと交差反応するように見えることが観察された(図20B)。
2つのNDVベクター(NDV-HXP-S(B1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)を、図19Aに示されているように設計した。図19Bは、この2つのベクターのスパイクタンパク質中の突然変異を提供している。この2つのベクターをレスキューするのに成功し、図20Aに示されているように、NDV-HXP-S(B.1.351)及びNDV-HXP-S(P.1)によるスパイクタンパク質の発現をSDS-PAGEによって検出した。2つの変異体によって発現されたスパイクタンパク質が特定のモノクローナル抗体に結合する能力を調べた。5μg/mLの各々のウイルスをELISAプレートにコーティングしたとき(同量のスパイクを含有しない可能性もある)、B.1.351スパイクが、ヒトmAb 1D07及び2B12への結合のわずかな低下を示したのに対し、P.1は、mAb 1D07への結合の顕著な低下及びB.1351の結合と同様のmAb 2B12への結合を示した(図20B)。変異体P.1とB.1.351の両方及び第10節に記載されているNDV-HXP-S(野生型又はWT)は、ヒトmAb CR3022及びマウスmAb 3A7に同等に結合した(図20B)。これらは、NDV-HXP-S(B.1.351)によって発現されるB.1.351スパイクがこれらの交差反応性抗体によって認識されるエピトープを維持することを示している。さらに、これらの抗体へのNDV-HXP-S(P.1)によって発現されるP.1スパイクの結合情報が得られ、mAbの2B12、CR3022、及び3A7がP.1スパイクと交差反応するように見えることが観察された(図20B)。
スパイクの株特異的抗原性を変化させることなく、NDVによって発現されるスパイクの最適発現、安定性、及び完全性を保証するために、NDV-HXP-S変異体B.1.351及びP.1の突然変異生成プロファイルを検証する。B.1.351スパイクにおいて、A701V突然変異は、2番目のフーリン切断部位の近くにあるように見えた(11)。これは、タンパク質の切断に影響を及ぼす可能性がある(とは言え、主な多塩基性フーリン切断部位は除去されている)。それゆえ、A701V突然変異をもとのA701に戻した。図19BのレスキューされたP.1変異体については、D614を突然変異させなかった。スパイク三量体を安定化すると報告されているD614N突然変異をP.1スパイクに導入した。このD614N突然変異は、D614Gよりもわずかに効果的であった(12)。図21Aに示されているあと3つのウイルスをレスキューした。これらのウイルスの発現、安定性、及び免疫原性を図19Bに示されているものと比較する。P.1スパイクについて後に確認された突然変異プロファイルには、D614G及びV1176Fも含まれた。これらの突然変異を有するNDV-HXP-S(P.1)をE48K突然変異を含む又はE48K突然変異を含まないB.1.17株のスパイクを発現するNDV-HXP-Sと一緒にレスキューする(図21B)。
表5: B.1.351及びP.1変異体のHXP-Sを発現するNDVベクターの配列
(12.3 実施例6で引用されている参考文献)
表5: B.1.351及びP.1変異体のHXP-Sを発現するNDVベクターの配列
(13.実施態様)
以下は、例示的な実施態様である:
1. SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
2. SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
3.前記タンパク質がタグをさらに含む、実施態様2の組換えNDV。
4.前記タグがヒスチジン又はflagタグである、実施態様3の組換えNDV。
5. SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインを含む分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
6.前記タンパク質がタグをさらに含む、実施態様5の組換えNDV。
7.前記タグがヒスチジン又はflagタグである、実施態様6の組換えNDV。
8.パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)であって、該パッケージゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該導入遺伝子が、配列番号4、6、8、又は10のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
9.パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)であって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該導入遺伝子が、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列をコードするRNA配列を含む、組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
10.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、組換えNDV。
11.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDV。
12. GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質の多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、実施態様11の組換えNDV。
13.前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインがリンカー(例えば、配列番号24)を介して前記NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに連結されている、実施態様10～12のいずれか1つの組換えNDV。
14.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号12のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDV。
15.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質が配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む、組換えNDV。
16.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号14のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDV。
17.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質が配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む、組換えNDV。
18.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDV。
19. GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、実施態様18の組換えNDV。
20.前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインがリンカー(例えば、配列番号24)を介して前記NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに連結されている、実施態様18又は19の組換えNDV。
21.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号16のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDV。
22.導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質が配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む、組換えNDV。
23.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号18のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDV。
24.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで該キメラFタンパク質が配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む、組換えNDV。
25.前記NDVビリオンが前記キメラFタンパク質を含む、実施態様10～24のいずれか1つの組換えNDV。
26.前記ゲノムが、NDV F転写ユニット、NDV NP転写ユニット、NDV M転写ユニット、NDV L転写ユニット、NDV P転写ユニット、及びNDV HN転写ユニットを含む、実施態様1～25のいずれか1つの組換えNDV。
27.前記NDV F転写ユニットがLaSota NDV株のアミノ残基289に対応するアミノ残基におけるロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含むNDV Fタンパク質をコードする、実施態様26の組換えNDV。
28.前記導入遺伝子が前記パッケージングされたゲノムの2つのNDV転写ユニットの間にある、実施態様1～27のいずれか1つの組換えNDV。
29.前記パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットが前記NDV P遺伝子及び前記NDV M遺伝子の転写ユニットである、実施態様28の組換えNDV。
30.前記ゲノムがSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子をさらに含む、実施態様1～29のいずれか1つの組換えNDV。
31.長潜伏期性であるNDV骨格を含む、実施態様1～30のいずれか1つの組換えNDV。
32. LaSota株のNDV骨格(例えば、配列番号1又は25)を含む、実施態様1～30のいずれか1つの組換えNDV。
33. Hitchner B1株のNDV骨格(例えば、配列番号2)を含む、実施態様1～30のいずれか1つの組換えNDV。
34. SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
35.キメラFタンパク質を含む組換えNDVビリオンであって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDVビリオン。
36. GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、実施態様35の組換えNDVビリオン。
37.前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインがリンカー(例えば、配列番号24)を介して前記NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに連結されている、実施態様35又は36の組換えNDVビリオン。
38.キメラFタンパク質を含み、ここで、該キメラFタンパク質が、配列番号15、17、又は19のアミノ酸配列を含む、組換えNDVビリオン。
39.実施態様1～38のいずれか1つの組換えNDVを含む組成物。
40.実施態様1～38のいずれか1つの組換えNDVを含む免疫原性組成物。
41.前記組換えNDVが不活化されている、実施態様36の免疫原性組成物。
42.アジュバントをさらに含む、実施態様40又は41の免疫原性組成物。
43. SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドに対する免疫応答を誘導するための方法であって、実施態様40～42のいずれか1つの免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
44. COVID-19を予防するための方法であって、実施態様40～42のいずれか1つの免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
45. SARS-CoV-2に対して対象を免疫する方法であって、実施態様40～42のいずれか1つの免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
46.前記組成物が対象に鼻腔内又は筋肉内投与される、実施態様43～45のいずれか1つの方法。
47.前記対象がヒトである、実施態様43～46のいずれか1つの方法。
48.実施態様1～38のいずれか1つの組換えNDVを含むキット。
49.実施態様1～34のいずれか1つの組換えNDVを増殖させることを含む、細胞株又は有胚鶏卵。
50.実施態様1～34のいずれか1つの組換えNDVを増殖させるための方法であって、実施態様49の細胞又は有胚卵を培養することを含む、方法。
51.前記組換えNDVを前記卵又は有胚卵から単離することをさらに含む、実施態様50の方法。
52. SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドに特異的な抗体の存在を検出する方法であって、標本を免疫アッセイにおいて実施態様1～38のいずれか1つの組換えNDVと接触させることを含む、方法。
53.前記標本が生物学的標本である、実施態様52の方法。
54.前記生物学的標本が、対象由来の血液、血漿、又は血清である、実施態様52の方法。
55.前記対象がヒトである、実施態様54の方法。
56.前記標本が抗体又は抗血清である、実施態様53の方法。
57.キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、導入遺伝子。
58.キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、導入遺伝子。
59.キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、導入遺伝子。
60. GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、実施態様58又は59の導入遺伝子。
61.キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質が配列番号13、15、17、又は19に示されるアミノ酸配列を含む、導入遺伝子。
62.配列番号12、14、16、又は18に示されるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子。
63.実施態様57～62のいずれか1つの導入遺伝子を含むベクター。
64.実施態様57～62のいずれか1つの導入遺伝子、並びに(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV M転写ユニット、(4)NDV L転写ユニット、(5)NDV P転写ユニット、及び(6)NDV HN転写ユニットを含むヌクレオチド配列。
65.前記NDV F転写ユニットがLaSota NDV株のアミノ残基289に対応するアミノ残基におけるロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含むNDV Fタンパク質をコードする、実施態様64のヌクレオチド配列。
66.実施態様64又は65のヌクレオチド配列を含むベクター。
67.実施態様64もしくは65のヌクレオチド配列、実施態様57～62のいずれか1つの導入遺伝子、又は実施態様63もしくは66のベクターを含むキット。
以下は、例示的な実施態様である:
1. SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
2. SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
3.前記タンパク質がタグをさらに含む、実施態様2の組換えNDV。
4.前記タグがヒスチジン又はflagタグである、実施態様3の組換えNDV。
5. SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインを含む分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
6.前記タンパク質がタグをさらに含む、実施態様5の組換えNDV。
7.前記タグがヒスチジン又はflagタグである、実施態様6の組換えNDV。
8.パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)であって、該パッケージゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該導入遺伝子が、配列番号4、6、8、又は10のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
9.パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)であって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該導入遺伝子が、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列をコードするRNA配列を含む、組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
10.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、組換えNDV。
11.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDV。
12. GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質の多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、実施態様11の組換えNDV。
13.前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインがリンカー(例えば、配列番号24)を介して前記NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに連結されている、実施態様10～12のいずれか1つの組換えNDV。
14.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号12のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDV。
15.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質が配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む、組換えNDV。
16.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号14のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDV。
17.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質が配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む、組換えNDV。
18.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDV。
19. GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、実施態様18の組換えNDV。
20.前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインがリンカー(例えば、配列番号24)を介して前記NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに連結されている、実施態様18又は19の組換えNDV。
21.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号16のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDV。
22.導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質が配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む、組換えNDV。
23.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号18のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、組換えNDV。
24.パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで該キメラFタンパク質が配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む、組換えNDV。
25.前記NDVビリオンが前記キメラFタンパク質を含む、実施態様10～24のいずれか1つの組換えNDV。
26.前記ゲノムが、NDV F転写ユニット、NDV NP転写ユニット、NDV M転写ユニット、NDV L転写ユニット、NDV P転写ユニット、及びNDV HN転写ユニットを含む、実施態様1～25のいずれか1つの組換えNDV。
27.前記NDV F転写ユニットがLaSota NDV株のアミノ残基289に対応するアミノ残基におけるロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含むNDV Fタンパク質をコードする、実施態様26の組換えNDV。
28.前記導入遺伝子が前記パッケージングされたゲノムの2つのNDV転写ユニットの間にある、実施態様1～27のいずれか1つの組換えNDV。
29.前記パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットが前記NDV P遺伝子及び前記NDV M遺伝子の転写ユニットである、実施態様28の組換えNDV。
30.前記ゲノムがSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子をさらに含む、実施態様1～29のいずれか1つの組換えNDV。
31.長潜伏期性であるNDV骨格を含む、実施態様1～30のいずれか1つの組換えNDV。
32. LaSota株のNDV骨格(例えば、配列番号1又は25)を含む、実施態様1～30のいずれか1つの組換えNDV。
33. Hitchner B1株のNDV骨格(例えば、配列番号2)を含む、実施態様1～30のいずれか1つの組換えNDV。
34. SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
35.キメラFタンパク質を含む組換えNDVビリオンであって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、組換えNDVビリオン。
36. GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、実施態様35の組換えNDVビリオン。
37.前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインがリンカー(例えば、配列番号24)を介して前記NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに連結されている、実施態様35又は36の組換えNDVビリオン。
38.キメラFタンパク質を含み、ここで、該キメラFタンパク質が、配列番号15、17、又は19のアミノ酸配列を含む、組換えNDVビリオン。
39.実施態様1～38のいずれか1つの組換えNDVを含む組成物。
40.実施態様1～38のいずれか1つの組換えNDVを含む免疫原性組成物。
41.前記組換えNDVが不活化されている、実施態様36の免疫原性組成物。
42.アジュバントをさらに含む、実施態様40又は41の免疫原性組成物。
43. SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドに対する免疫応答を誘導するための方法であって、実施態様40～42のいずれか1つの免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
44. COVID-19を予防するための方法であって、実施態様40～42のいずれか1つの免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
45. SARS-CoV-2に対して対象を免疫する方法であって、実施態様40～42のいずれか1つの免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
46.前記組成物が対象に鼻腔内又は筋肉内投与される、実施態様43～45のいずれか1つの方法。
47.前記対象がヒトである、実施態様43～46のいずれか1つの方法。
48.実施態様1～38のいずれか1つの組換えNDVを含むキット。
49.実施態様1～34のいずれか1つの組換えNDVを増殖させることを含む、細胞株又は有胚鶏卵。
50.実施態様1～34のいずれか1つの組換えNDVを増殖させるための方法であって、実施態様49の細胞又は有胚卵を培養することを含む、方法。
51.前記組換えNDVを前記卵又は有胚卵から単離することをさらに含む、実施態様50の方法。
52. SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドに特異的な抗体の存在を検出する方法であって、標本を免疫アッセイにおいて実施態様1～38のいずれか1つの組換えNDVと接触させることを含む、方法。
53.前記標本が生物学的標本である、実施態様52の方法。
54.前記生物学的標本が、対象由来の血液、血漿、又は血清である、実施態様52の方法。
55.前記対象がヒトである、実施態様54の方法。
56.前記標本が抗体又は抗血清である、実施態様53の方法。
57.キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、導入遺伝子。
58.キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、導入遺伝子。
59.キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、導入遺伝子。
60. GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、実施態様58又は59の導入遺伝子。
61.キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質が配列番号13、15、17、又は19に示されるアミノ酸配列を含む、導入遺伝子。
62.配列番号12、14、16、又は18に示されるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子。
63.実施態様57～62のいずれか1つの導入遺伝子を含むベクター。
64.実施態様57～62のいずれか1つの導入遺伝子、並びに(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV M転写ユニット、(4)NDV L転写ユニット、(5)NDV P転写ユニット、及び(6)NDV HN転写ユニットを含むヌクレオチド配列。
65.前記NDV F転写ユニットがLaSota NDV株のアミノ残基289に対応するアミノ残基におけるロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含むNDV Fタンパク質をコードする、実施態様64のヌクレオチド配列。
66.実施態様64又は65のヌクレオチド配列を含むベクター。
67.実施態様64もしくは65のヌクレオチド配列、実施態様57～62のいずれか1つの導入遺伝子、又は実施態様63もしくは66のベクターを含むキット。
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載されているものに加えた、本発明の様々な変更が前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが意図される。
本明細書で引用された全ての参考文献、あたかも各々の個々の刊行物又は特許又は特許出願が、あらゆる目的のために引用により完全に本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個別的に示されるのと同じ程度まで、引用により完全に及びあらゆる目的のために本明細書中に組み込まれる。
Claims (67)
- SARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
- SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含む分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
- 前記タンパク質がタグをさらに含む、請求項2記載の組換えNDV。
- 前記タグがヒスチジン又はflagタグである、請求項3記載の組換えNDV。
- SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインを含む分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
- 前記タンパク質がタグをさらに含む、請求項5記載の組換えNDV。
- 前記タグがヒスチジン又はflagタグである、請求項6記載の組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)であって、該パッケージゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該導入遺伝子が、配列番号4、6、8、又は10のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、前記組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)であって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がSARS-CoV-2スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該導入遺伝子が、配列番号5、7、9、又は11に示されるアミノ酸配列をコードするRNA配列を含む、前記組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、かつここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、前記組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、前記組換えNDV。
- GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質の多塩基性切断部位のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、請求項11記載の組換えNDV。
- 前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインがリンカーを介して前記NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに連結されている、請求項10～12のいずれか一項記載の組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号12のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、前記組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質が配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む、前記組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号14のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、前記組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質が配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む、前記組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、前記組換えNDV。
- GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、請求項18記載の組換えNDV。
- 前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインがリンカーを介して前記NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに連結されている、請求項18又は19記載の組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号16のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、前記組換えNDV。
- 導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該キメラFタンパク質が配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む、前記組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子が配列番号18のcDNA配列のマイナスセンスに対応するRNA配列を含む、前記組換えNDV。
- パッケージングされたゲノムを含む組換えNDVであって、該パッケージングされたゲノムが導入遺伝子を含み、ここで、該導入遺伝子がキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで該キメラFタンパク質が配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む、前記組換えNDV。
- 前記NDVビリオンが前記キメラFタンパク質を含む、請求項10～24のいずれか一項記載の組換えNDV。
- 前記ゲノムが、NDV F転写ユニット、NDV NP転写ユニット、NDV M転写ユニット、NDV L転写ユニット、NDV P転写ユニット、及びNDV HN転写ユニットを含む、請求項1～25のいずれか一項記載の組換えNDV。
- 前記NDV F転写ユニットがLaSota NDV株のアミノ残基289に対応するアミノ残基におけるロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含むNDV Fタンパク質をコードする、請求項26記載の組換えNDV。
- 前記導入遺伝子が前記パッケージングされたゲノムの2つのNDV転写ユニットの間にある、請求項1～27のいずれか一項記載の組換えNDV。
- 前記パッケージングされたゲノムの2つの転写ユニットがNDV P遺伝子及びNDV M遺伝子の転写ユニットである、請求項28記載の組換えNDV。
- 前記ゲノムがSARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子をさらに含む、請求項1～29のいずれか一項記載の組換えNDV。
- 長潜伏期性であるNDV骨格を含む、請求項1～30のいずれか一項記載の組換えNDV。
- LaSota株のNDV骨格を含む、請求項1～30のいずれか一項記載の組換えNDV。
- Hitchner B1株のNDV骨格を含む、請求項1～30のいずれか一項記載の組換えNDV。
- SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質をコードする導入遺伝子を含むパッケージングされたゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス(NDV)。
- キメラFタンパク質を含む組換えNDVビリオンであって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、前記組換えNDVビリオン。
- GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、請求項35記載の組換えNDVビリオン。
- 前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインがリンカーを介して前記NDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインに連結されている、請求項35又は36記載の組換えNDVビリオン。
- キメラFタンパク質を含む組換えNDVビリオンであって、該キメラFタンパク質が、配列番号15、17、又は19のアミノ酸配列を含む、前記組換えNDVビリオン。
- 請求項1～38のいずれか一項記載の組換えNDVを含む組成物。
- 請求項1～38のいずれか一項記載の組換えNDVを含む免疫原性組成物。
- 前記組換えNDVが不活化されている、請求項36記載の免疫原性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項40又は41記載の免疫原性組成物。
- SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドに対する免疫応答を誘導するための方法であって、請求項40～42のいずれか一項記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
- COVID-19を予防する方法であって、請求項40～42のいずれか一項記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
- SARS-CoV-2に対して対象を免疫する方法であって、請求項40～42のいずれか一項記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記組成物が前記対象に鼻腔内又は筋肉内投与される、請求項43～45のいずれか一項記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項43～46のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1～38のいずれか一項記載の組換えNDVを含むキット。
- 請求項1～34のいずれか一項記載の組換えNDVを増殖させることを含む、細胞株又は有胚鶏卵。
- 請求項1～34のいずれか一項記載の組換えNDVを増殖させる方法であって、請求項49記載の細胞又は有胚卵を培養することを含む、前記方法。
- 前記組換えNDVを前記卵又は有胚卵から単離することをさらに含む、請求項50記載の方法。
- SARS-CoV-2スパイクタンパク質又はヌクレオカプシドに特異的な抗体の存在を検出する方法であって、標本を免疫アッセイにおいて請求項1～38のいずれか一項記載の組換えNDVと接触させることを含む、前記方法。
- 前記標本が生物学的標本である、請求項52記載の方法。
- 前記生物学的標本が、対象由来の血液、血漿、又は血清である、請求項52記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項54記載の方法。
- 前記標本が抗体又は抗血清である、請求項53記載の方法。
- キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含む、前記導入遺伝子。
- キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、かつ該SARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、前記導入遺伝子。
- キメラFタンパク質をコードする導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質がSARS-CoV-2スパイクタンパク質細胞外ドメイン並びにNDV Fタンパク質膜貫通及び細胞質ドメインを含み、ここで、GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基817、892、899、942、986、及び987に対応するアミノ酸残基がプロリンと置換されており、かつここで、該SARS-CoV-2スパイクタンパク質の細胞外ドメインが多塩基性切断部位を欠く、前記導入遺伝子。
- GenBankアクセッション番号MN908947で見出されるスパイクタンパク質のアミノ酸残基682～685に対応するアミノ酸残基が単一のアラニンと置換されている、請求項58又は59記載の導入遺伝子。
- キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子であって、該キメラFタンパク質が、配列番号13、15、17、又は19に示されるアミノ酸配列を含む、前記導入遺伝子。
- 配列番号12、14、16、又は18に示されるヌクレオチド配列を含む導入遺伝子。
- 請求項57～62のいずれか一項記載の導入遺伝子を含むベクター。
- 請求項57～62のいずれか一項記載の導入遺伝子、並びに(1)NDV F転写ユニット、(2)NDV NP転写ユニット、(3)NDV M転写ユニット、(4)NDV L転写ユニット、(5)NDV P転写ユニット、及び(6)NDV HN転写ユニットを含む、ヌクレオチド配列。
- 前記NDV F転写ユニットがLaSota NDV株のアミノ残基289に対応するアミノ残基におけるロイシンからアラニンへのアミノ酸置換を含むNDV Fタンパク質をコードする、請求項64記載のヌクレオチド配列。
- 請求項64又は65記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
- 請求項64もしくは65記載のヌクレオチド配列、請求項57～62のいずれか一項記載の導入遺伝子、又は請求項63もしくは66記載のベクターを含むキット。
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