ES2328424T3 - Vectores de alfavirus recombinantes. - Google Patents

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Thomas W. Dubensky Jr.
Carlos E. Ibanez
Stephen M.W. Chang
Douglas J. Jolly
David A. Driver
John M. Polo
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NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC
Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA CASSETTES DE EXPRESION PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS ESTRUCTURALES DE ALFAVIRUS EN CELULAS HOSPEDADORAS, INCLUYENDO EL EMPAQUETAMIENTO DE CELULAS PARA EMPAQUETAR VECTORES DE RNA DE ALFAVIRUS QUE CONTIENEN DICHOS CASSETTES DE EXPRESION.

Description

Vectores de alfavirus recombinantes.
Campo técnico
La presente invención se refiere, en general, al uso de virus recombinantes como vectores y, más específicamente, a alfavirus recombinantes, tales como el virus Sindbis, que son capaces de expresar una secuencia heteróloga en las células diana.
Antecedentes de la invención
Los alfavirus comprenden un conjunto de virus transmitidos a través de artrópodos serológicamente relacionados de la familia de los Togavirus. De manera resumida, los alfavirus se distribuyen por todo el mundo, y persisten en la naturaleza a través de un mosquito en el ciclo de los vertebrados. Pájaros, roedores, caballos, primates, y seres humanos están entre los hospedadores/huéspedes vertebrados definidos de los alfavirus.
Se han clasificado veintiséis virus y subtipos de virus dentro del género alfavirus utilizando el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI). De manera resumida, el ensayo HI secreta los 26 alfavirus en tres complejos principales: el complejo de la encefalitis de Venezuela (VE), el complejo del bosque Semliki (SF), y el complejo de la encefalitis occidental (WE). Además, cuatro virus más, encefalitis oriental (EE), Bosque Barmah, Middelburg, y Ndumu, reciben una clasificación individual en función del ensayo serológico HI.
Los miembros del género alfavirus se clasifican también en función de sus características clínicas con respecto a los seres humanos; alfavirus asociados principalmente con encefalitis, y alfavirus asociados principalmente con fiebre, sarpullido, y poliartritis. Incluidos en el grupo más antiguo están los complejos VE y WE, y EE. En general, la infección con este grupo puede dar como resultado secuelas permanentes, que incluyen cambios en el comportamiento y discapacidades en el aprendizaje, o muerte. En el último grupo está el complejo SF, comprendido por los alfavirus individuales Chikungunya, O'nyong-nyong, Sindbis, Ross River, y Mayaro. Con respecto a este grupo, aunque se ha informado de epidemias graves, la infección es, en general, autolimitante, sin secuelas permanentes.
El virus Sindbis es el miembro prototipo del género alfavirus de la familia Togavirus. Aunque no usualmente aparentes, las manifestaciones clínicas de la infección por virus Sindbis incluyen fiebre, artritis, y sarpullido. El virus Sindbis se distribuye por Europa, África, Asia, y Australia, con los mejores datos epidemiológicos provenientes de Sudáfrica en el que un 20% de la población es seropositiva. (Para una revisión, véase Peters y Dalrymple, Fields Virology (2d ed), Fields y col. (eds.), B.N. Raven Press, New York, NY. capítulo 26. pp. 713-762). Se ha aislado el virus Sindbis infeccioso del suero de seres humanos únicamente durante un brote en Uganda y en un único caso en África Central.
La morfología y la morfogénesis del género alfavirus es generalmente muy uniforme. En concreto, la mayor parte de células de vertebrados se infectan por partículas con envolturas de 60-65 nm, en las que la infección productora es citopática. Por otra parte, la infección de células de invertebrados, por ejemplo, las derivadas de mosquitos, no da como resultado ninguna citopatología manifiesta. Normalmente, los alfavirus se propagan sobre células BHK-21 o vero, en las que el crecimiento es rápido, alcanzando un rendimiento máximo en las 24 horas de la infección. Las cepas de campo se aíslan normalmente en embriones primarios de aves, por ejemplo, cultivos de fibroblastos
de pollo.
El ARN genómico (ARN de 49S) de los alfavirus es no segmentado, de polaridad positiva, de aproximadamente 11-12 kb de longitud, y contiene una caperuza en el extremo 5' y una cola poliadenilada en un extremo 3'. El virus con envoltura infecciosa se produce mediante el ensamblaje de las proteínas de la nucleocápsida vírica sobre el ARN genómico en el citoplasma, y brota a través de la membrana celular embebida con glicoproteínas víricas codificadas. La entrada del virus en las células se produce mediante endocitosis a través de los poros recubiertos con claterina, fusión de la membrana vírica con el endosoma, liberación de la nucleocápsida y liberación del genoma vírico. Durante la replicación vírica, el ARN genómico de 49S sirve como plantilla para la síntesis de la cadena negativa complementaria. La cadena negativa sirve a la vez como plantilla para el ARN genómico y para un ARN subgenómico iniciado internamente. Las proteínas no estructurales se traducen a partir del ARN genómico. Las proteínas estructurales alfavíricas se traducen a partir del ARN subgenómico de 26S. Todos los genes víricos se expresan en forma de poliproteínas y se procesan a proteínas individuales mediante rotura proteolítica después de la traducción.
El uso de vectores de alfavirus recombinantes para tratar individuos requiere que sean capaces de transportarse y almacenarse durante largos periodos de tiempo a una temperatura deseada, de tal manera que se mantenga la infectividad y la viabilidad del virus recombinante. Los procedimientos actuales para almacenar virus recombinantes implican generalmente el almacenamiento en forma líquida a bajas temperaturas. Dichos procedimientos presentan problemas en los países del Tercer Mundo, que normalmente no disponen de capacidades de refrigeración adecuadas. Por ejemplo, cada año en África, millones de niños mueren por enfermedades infecciosas tales como el sarampión. Las vacunas necesarias para la prevención de estas enfermedades no se pueden distribuir a la mayoría de estos países debido a que la refrigeración no es fácilmente accesible.
Además del almacenamiento en forma de líquido y a bajas temperaturas, las formulaciones víricas actuales contienen a menudo componentes de los medios que no son deseables para la inyección en pacientes. En consecuencia, hay una necesidad en la técnica de un procedimiento para preservar el vector vírico recombinante purificado (y en concreto, los vectores de alfavirus) en forma liofilizada a elevadas temperaturas y de esta forma, y que además sea adecuado para la inyección en pacientes.
La presente invención desvela vectores de alfavirus recombinantes que son adecuados para el uso en una variedad de aplicaciones, que incluyen por ejemplo, la terapia génica, y proporciona además otras ventajas relacionadas.
El documento WO 92/10578 desvela sistemas de expresión de ADN basados en alfavirus. Describe una molécula una molécula de ARN auxiliar transcrita in vitro procedente un vector de ADN auxiliar que comprende la región que codifica las proteínas estructurales víricas.
Suomalainen y col. (Journal of Virology 1992, 66(8): 4737-4747) describen un ADNc que dirige la síntesis de un ARN que codifica únicamente la proteína de la cápsida de un alfavirus.
Frolov y Schlesinger (Journal of Virology 1994, 68(3): 1721-1727) describen varios ADNc que codifican la proteína de la cápsula de un alfavirus y parte de la proteína E3.
Resumen de la invención
La invención proporciona casetes de expresión de proteína estructural de un ADN de alfavirus según se define en las reivindicaciones.
En un aspecto, la invención proporciona un casete de expresión de proteína estructural de un ADN de alfavirus que comprende un promotor que dirige la síntesis de una molécula de ARN en una célula eucariota, comprendiendo dicha molécula de ARN la secuencia de codificación de la proteína de la cápsida de un alfavirus, pero no las secuencias de codificación de las glicoproteínas E1 y E2 del alfavirus.
En otro aspecto, la invención proporciona un casete de expresión de proteína estructural de un ADN de alfavirus que comprende un promotor que dirige la síntesis de una molécula de ARN en una célula eucariota, comprendiendo dicha molécula de ARN las secuencias de codificación de las glicoproteínas E1 y E2 del alfavirus, pero no una secuencia de codificación de la proteína de la cápsida de un alfavirus.
Los aspectos de la siguiente divulgación que no se refieren específicamente a la invención reivindicada se incluyen únicamente por comparación e ilustración.
Resumen de la divulgación
Definida en resumen, la presente divulgación se refiere a constructos de vector de alfavirus y partículas de alfavirus, así como a los procedimientos para preparar y utilizar los mismos. Comprendidos dentro de un aspecto de la presente divulgación se proporcionan constructos de vector de alfavirus que comprenden un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis del ARN vírico in vitro a partir del ADNc. Una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una región de unión vírica que se ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, y una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus. En otros aspectos de la presente divulgación, la región de unión vírica se ha modificado de tal manera que se reduce la transcripción vírica del fragmento
subgenómico.
En otros aspectos más de la presente divulgación, se desvela que los constructos de vector de alfavirus comprenden un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis del ARN vírico in vitro a partir del ADNc, un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis del ARN vírico in vitro a partir de la secuencia 5' del ADNc que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una primera región de unión vírica que se ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, una segunda región de unión vírica que se ha modificado de tal manera que se reduce la transcripción vírica del fragmento subgenómico, y una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus.
En otros aspectos adicionales de la presente divulgación, se desvelan constructos de vector de ADNc de alfavirus que comprenden un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico in vitro a partir del ADNc, un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del ADNc seguido por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una región de unión que se ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa, y una secuencia 3' que controla la terminación de la transcripción.
En otro aspecto de la presente divulgación, se desvelan constructos de vector de ADNc, que comprenden un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del ADNC seguido por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una región de unión vírica que se ha modificado de tal manera que se reduce la transcripción vírica del fragmento subgenómico, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus, y una secuencia 3' que controla la terminación de la transcripción.
En otro aspecto de la presente divulgación, se desvelan constructos de vector de ADNc, que comprenden un promotor que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del ADNC seguido por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una primera región de unión vírica que se ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, seguido por una segunda región de unión vírica que se ha modificado de manera que se reduce la transcripción vírica del fragmento subgenómico, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus, y una secuencia 3' que controla la terminación de la transcripción.
En una forma de realización, los constructos de vector descritos anteriormente contienen una secuencia heteróloga. Normalmente, dicho constructo de vector contiene una secuencia de nucleótidos heteróloga de más de 100 bases, generalmente, la secuencia de nucleótidos heteróloga es mayor de 3 kb, y preferiblemente la secuencia de nucleótidos heteróloga es mayor de 5 kb, y más preferiblemente la secuencia de nucleótidos heteróloga es mayor de 8 kb. En diversas formas de realización, la secuencia heteróloga es una secuencia que codifica una proteína seleccionada entre el grupo constituido por IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, \alpha, \beta, y \gamma-IFN, G-CSF, y GM-CSF.
En otras formas de realización más, los constructos de vector descritos anteriormente incluyen una secuencia heteróloga seleccionada que puede ser de un virus seleccionado entre el grupo constituido por el virus de la gripe, VPH, VHB, VHC, VEB, VIH, VHS, FeLV, VIF, virus Hanta, HTLV I, HTLV II y CMV. En una forma de realización preferida, la secuencia heteróloga obtenida de VPH codifica una proteína seleccionada entre el grupo constituido por E5, E6, E7 y L1.
En otras formas de realización más, los constructos de vector descritos anteriormente incluyen una secuencia heteróloga seleccionada que codifica una proteína VIH seleccionada entre el grupo constituido por VIH gp 120 y gag.
Las secuencias heterólogas seleccionadas descritas anteriormente pueden ser secuencias de sentido contrario. En las formas de realización preferidas, la secuencia de sentido contrario se seleccionan entre el grupo constituido por las secuencias que codifican el virus de la gripe, VPH, VHB, VHC, VEB, VIH, VHS, FeLV, VIF, virus Hanta, HTLV I, HTLV II y CMV.
En otra forma de realización, los constructos de vector descritos anteriormente no contienen proteínas estructurales de alfavirus. En otras formas de realización, la secuencia heteróloga seleccionada se localiza en la dirección 3' de la región de unión vírica. En los constructos de vector descritos anteriormente que tienen una segunda unión vírica, la secuencia heteróloga seleccionada puede, dentro de algunas formas de realización, localizarse en la dirección 3' de la segunda región de unión vírica. Cuando la secuencia heteróloga se localiza en la dirección 3' de la región de unión vírica, el constructo de vector puede comprender además un poliligante localizado posteriormente en la región de unión vírica. En las formas de realización de realización preferidas, dichos poliligantes no contienen una secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción del virus alfavirus de tipo natural.
En otra forma de realización más, en los constructos de vector descritos anteriormente la secuencia heteróloga seleccionada puede localizarse en el interior de la secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus.
En formas de realización concretas, los constructos de vector descritos anteriormente incluyen una región de unión vírica constituida por la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Figura 1, desde el nucleótido número 7579, al nucleótido número 7597 (SEC DE ID Nº 1). En las formas de realización alternativas, cuando el constructo de vector incluye una segunda región de unión vírica, el constructo de vector incluye un gen de adenovirus E3 localizado en la dirección 3' de la segunda región de unión vírica, y puede comprender además una secuencia de empaquetado retrovírico localizada entre la primera región de unión vírica y la segunda región de unión vírica.
En aspectos adicionales, se desvela en el presente documento un vector de alfavirus recombinante aislado que no contiene una región de unión vírica funcional, y que en las formas de realización preferidas produce la transcripción vírica reducida del fragmento subgenómico.
En un aspecto adicional más, se desvela en el presente documento un casete de expresión, que comprende un promotor y una o más proteínas estructurales de alfavirus, siendo el promotor capaz de dirigir la expresión de las proteínas estructurales de alfavirus.
En diversas formas de realización, el casete de expresión es capaz de expresar la proteína de la cápsida del alfavirus, tal como la proteína estructural Sindbis seleccionada entre el grupo constituido por 6K, E3, E2, y E1.
En otro aspecto más, se desvela en el presente documento un casete de expresión que comprende un promotor, una o más proteínas estructurales de alfavirus, y una secuencia ligando heteróloga, siendo el promotor capaz de dirigir la expresión de las proteínas estructurales de alfavirus y la secuencia heteróloga. En diversas formas de realización, la secuencia ligando heteróloga se selecciona entre el grupo constituido por VSVG, HIH gp120, el anticuerpo, insulina, y CD4.
En algunas formas de realización, los casetes de expresión descritos anteriormente incluyen un promotor seleccionado entre el grupo constituido por MuL V, MMTV, la región de unión del alfavirus, CMV y el ARN de VA1.
En otro aspecto adicional más, se desvela en el presente documento una partícula de alfavirus que, tras introducción en una célula diana, produce una célula infectada que es viable al menos 72 horas después de la infección. Se desvelan también células diana que, tras la infección mediante una partícula de alfavirus de la presente invención, son viables al menos 72 horas después de la infección.
En otro aspecto, se desvela en el presente documento una partícula de alfavirus recombinante que, tras la introducción en una célula diana, produce una célula infectada que es viable al menos 72 horas después de la infección, transportando también la partícula un constructo de vector que dirige la expresión de un antígeno o su forma modificada en las células diana infectadas con la partícula de alfavirus, siendo capaz el antígeno o su forma modificada de estimular una respuesta inmune en el interior de un animal. En diversas formas de realización, el antígeno o su forma modificada expresada estimula una respuesta inmune mediada por células, preferiblemente una respuesta inmune restringida a la clase I de HLA.
En otro aspecto más, se desvela en el presente documento una partícula de alfavirus recombinante que transporta un constructo de vector capaz de dirigir la expresión de un agente patogénico necesario para la patogenicidad. En diversas formas de realización, el agente patogénico es un virus, hongo, protozoo, o bacteria, y la función inhibida se selecciona entre el grupo constituido por adsorción, replicación, expresión génica, ensamblaje, y salida del agente patogénico de las células infectadas. En otras formas de realización, el agente patogénico es una célula cancerosa, un factor de crecimiento que promueve el cáncer, un trastorno autoinmune, trastornos cardiovasculares tales como restenosis, osteoporosis, modelo de calvicie masculina, y la función inhibida se selecciona entre el grupo constituido por viabilidad celular y replicación celular. En otras formas de realización, el constructo de vector dirige la expresión de un tóxico paliativo en células diana infectadas en respuesta a la presencia en dichas células de una entidad asociada con el agente patogénico; preferentemente el paliativo es capaz de inhibir selectivamente la expresión de un gen patogénico o inhibir la actividad de una proteína producida por el agente patogénico. En formas de realización más adicionales, el paliativo comprende un péptido de inhibición específico de la proteasa vírica, un ARN de sentido contrario complementario con las secuencias de ARN necesarias para la patogenicidad, un ARN de sentido directo complementario con las secuencias de ARN necesarias para la patogenicidad, o una proteína estructural defectiva de un agente patogénico, siendo capaz dicha proteína de inhibir el ensamblaje del agente patogénico.
En formas de realización más adicionales, la partícula de alfavirus descrita anteriormente dirige la expresión de un paliativo, más concretamente, dirige la expresión de un producto génico capaz de activar un precursor inactivo de otra manera en un inhibidor activo del agente patogénico, por ejemplo, el producto génico de la timidina quinasa del herpes, un gen supresor del tumor, o una proteína que activa un compuesto con poca o ninguna citotoxicidad en un producto tóxico en presencia de un agente patogénico, efectuando por tanto una terapia localizada del agente patogénico. Alternativamente, la partícula de alfavirus dirige la expresión de una proteína que es tóxica tras el procesamiento o la modificación por una proteína derivada de un agente patogénico, un producto indicador en la superficie de las células diana infectadas con el alfavirus y que contiene el agente patogénico, o una molécula de ARN que funciona como de sentido contrario o ribozima específica de una molécula de ARN patogénica.
En algunas formas de realización, en la partícula de alfavirus descrita anteriormente, la proteína es la timidina quinasa o CD4 de herpes.
En aspectos más adicionales, se desvela en el presente documento una partícula de alfavirus que dirige la expresión de un gen capaz de suprimir uno o más elementos del sistema inmune en la células diana infectadas con el alfavirus, y una partícula de alfavirus que dirige la expresión de un elemento de bloqueo en las células infectadas con el virus Sindbis, siendo capaz el elemento de bloqueo de unirse tanto a un receptor como a un agente de tal manera que se bloquea la interacción receptor/agente.
En otros aspectos, se desvela en el presente documento un procedimiento para estimular una respuesta inmune a un antígeno, que comprende infectar las células diana susceptibles con una partícula de alfavirus que dirige la expresión de al menos un antígeno o su forma modificada en las células diana infectadas con el alfavirus, siendo capaz el antígeno o su forma modificada de estimular una respuesta inmune en el interior de un animal. En una forma de realización preferida, las células diana se infectan in vivo.
En aspectos más adicionales de la presente divulgación, se desvela un procedimiento de estimulación de una respuesta inmune da un agente patogénico, que comprende infectar células diana susceptibles con una partícula de alfavirus que dirige la expresión de una forma modificada de un agente patogénico en las células diana infectadas con el alfavirus, siendo capaz el antígeno modificado de estimular una respuesta inmune en el interior de un animal pero teniendo patogenicidad reducida con respecto al antígeno patogénico.
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En otros aspectos adicionales de la presente divulgación, se desvela un procedimiento para estimular una respuesta inmune a un antígeno, que comprende infectar las células diana susceptibles con una partícula de alfavirus que dirige la expresión de un péptido que tiene múltiples epitopos, derivados uno o más de los epitopos de diferentes proteínas.
En otro aspecto más de la divulgación, se desvela la estimulación de una respuesta inmune en un animal de sangre caliente, que comprende infectar las células diana susceptibles asociadas con un animal de sangre caliente con secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las proteínas MHC de clase I o clase II, o sus combinaciones, e infectar las células con una partícula de alfavirus que dirige la expresión de al menos un antígeno o su forma modificada en las células diana infectadas con la partícula de alfavirus, siendo capaz el antígeno o su forma modificada de estimular una respuesta inmune en el interior del animal.
En otro aspecto de la presente divulgación, se desvela un procedimiento para inhibir un agente patogénico, que comprende infectar células diana susceptibles con una partícula de alfavirus que dirige la expresión de un paliativo en las células infectadas con la partícula de alfavirus, siendo el paliativo capaz de inhibir una función de un agente patogénico necesaria para la patogenicidad.
En otros aspectos de la presente divulgación, se desvelan sistemas de iniciación de vectores eucarióticos en capas. De manera resumida, En una forma de realización de la divulgación, el sistema de iniciación del vector eucariótico en capa comprende un promotor 5', un constructo que es capaz de expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga que es capaz de la replicación en una célula tanto de manera autónoma, como en respuesta a uno o más factores, y una secuencia de terminación de la transcripción. En otro aspecto, se desvela un sistema de iniciación del ADD de un vector en capas eucariótico, que comprende un promotor 5', un constructo que es capaz de expresar una secuencia de ARN heteróloga que es capaz de la replicación en una célula tanto de manera autónoma como en respuesta a uno o más factores, y una secuencia de terminación de la transcripción. En una forma de realización preferida, el constructo que es capaz de expresar una o más secuencias de nucleótidos heterólogas es un constructo de un vector de ADNc de Sindbis. En otras formas de realización, el constructo es un vector vírico seleccionado entre el grupo constituido por poliovirus, rinovirus, pox virus, retrovirus, virus de la gripe, adenovirus, virus adeno asociado, virus del herpes, virus SV40, VIH, sarampión, astrovirus, Virus del Bosque Semliki y coronavirus. En otra forma de realización de realización, el sistema de iniciación de vector en capas eucariótico comprende además una secuencia de poliadenilación.
En otro aspecto más, se desvela en el presente documento una molécula de vector de ARN de alfavirus descrita anteriormente, capaz de dirigir la expresión de un paliativo en una célula diana. El paliativo en esta configuración de vector de expresión de ARN de alfavirus, cuando se expresa, tiene el mismo efecto que los aspectos descritos anteriormente para una partícula de alfavirus. El vector de expresión de ARN de alfavirus incluye, en orden, una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una región de unión vírica, una secuencia heteróloga, una secuencia de reconocimiento de las ARN polimerasa del alfavirus, y una extensión de 25 restos poliadenilados consecutivos, y se introduce en las células diana directamente mediante medios físicos como una molécula de ARN, como un complejo con diversas formulaciones de liposomas, o como un complejo de ligando de ARN que incluye la molécula del vector de ARN del alfavirus, un compuesto policatiónico tal como polilisina, un ligando específico del receptor, y, opcionalmente, un virus inactivado con psoraleno tal como Sendai o Adenovirus: Se desvelan también en el presente documento las líneas celulares de empaquetado y las líneas celulares productoras adecuadas para producir partículas de alfavirus recombinante. Dichas líneas celulares de empaquetado o productoras pueden ser tanto de mamíferos como de no mamíferos (por ejemplo, células de insecto tales como células de mosquito).
Se pueden utilizar una amplia variedad de alfavirus dentro del contexto de la presente invención. Los ejemplos representativos incluyen, Aura, Encefalitis Equina de Venezuela, Fort Morgan, Ross River, Virus del Bosque Semliki y Mayaro.
Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos. Además, se muestran a continuación diversas referencias que describen con más detalle algunos procedimientos o composiciones (por ejemplo, plásmidos, etc.).
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras que no se refieren específicamente a la invención reivindicada son únicamente para comparación e ilustración.
La Figura 1 es una ilustración esquemática de la organización genómica del virus Sindbis.
La Figura 2 es una ilustración que representa gráficamente un procedimiento para la amplificación del genoma de ARN de Sindbis mediante la RT-PCR.
Las Figuras 3A-H muestran la secuencia de un Sistema de Iniciación de Vector en Capas Eucariótico representativo derivado de Sindbis (véase también la SEC DE ID Nº 89).
La Figura 4 es una ilustración esquemática de un Vector Sindbis Básico y un Vector Sindbis-Luciferasa.
La Figura 5 es una ilustración de la Construcción del Vector Auxiliar de Sindbis.
La Figura 6 es una representación gráfica que ilustra la expresión y el rescate de un Vector Sindbis-Luciferasa.
La Figura 7 es una ilustración de un procedimiento para modificar una región de unión de Sindbis.
La Figura 8 es una ilustración esquemática de los Casetes de Expresión de Empaquetado de Sindbis.
La Figura 9 es un gráfico de barras que ilustra el Empaquetamiento del Vector Sindbis-luciferasa en células LTR/SinddLBspE.
Las 20 bases 3' terminales del primer producto amplicón de la PCR primaria solapan con las 20 bases 5' terminales del segundo producto de amplicón de la PCR primaria, los 2.742 pb que solapaban del producto de amplicón de la PCR secundaria se purificaron mediante electroforesis con agarosa/TBE al 0,8%, se digirieron con BglII, y el producto de 2.734 pb se ligó en pcDNAS-INbgl/xba (véase el Ejemplo 3) y se trató con BglII y CIAP. La construcción resultante tiene 16.641 pb y se conoce como ELVIS-PySIN. Con el fin de construir un vector de expresión de la proteína estructural similar a pLTR/Sind1Bsp para la derivación de las líneas celulares de empaquetado del vector, la construcción ELVIS-PySIN se digirió hasta finalización con Bsp EI, y se volvió a ligar en condiciones de dilución, con el fin de llevar a cabo la delección de las proteínas no estructurales entre las bases 422-7054. Esta construcción se conoce como ELVIS-PySINdIBspE.
Se complejó el ADN plásmido de ELVIS-PySIN con Lipofectamina (GIBCO-BRL, Gaithersbery, MD) de acuerdo con las condiciones sugeridas por el suministrador (circa 5 \mug de ADN/8 mg de reactivo lípido) y se añadió a pocillos de 35 mm que contenían células PCC4 o F9 no diferenciadas con una confluencia aproximadamente del 75%. El desarrollo de efectos citopáticos (CPE), y el nivel de infección productiva de Sindbis, cuantificados mediante el ensayo de placas de los medios sobrenadantes, se determinan a intervalos regulares de 5 días en células PCC4 o F9 no diferenciadas y diferenciadas. La diferenciación de las células F9 y PCC4 se lleva a cabo mediante la adición de ácido retinoico (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), hasta una concentración final de 1 \muM.
Si las células EC no diferenciadas demuestran una respuesta heteróloga a la transfección con ELVIS-PySIN, las células restantes no lisadas por la propagación del virus Sindbis tras la selección de G418, se clonan y expanden las células EC no diferenciadas transfectadas con pVGELVIS. A continuación se ensayan los clones celulares para la producción del virus Sindbis tras la diferenciación, mediante la adición de ácido retinoico (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), hasta una concentración final de 1 \muM.
El aislamiento de las líneas celulares de empaquetado del vector transfectadas de manera estable con ELVIS-PySINd1BspE, que tienen un estado de diferenciación celular dependiente del modelo de expresión de las proteínas estructurales en presencia de Sindbis NSP, se lleva a cabo tal como se ha descrito anteriormente para el plásmido pLTR/SindIBspE.
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2. Uso de promotores celulares
El tercer ejemplo de esta estrategia usa la región control del locus de la \beta-globina. El grupo multigen de la \beta-globina contiene cinco genes regulados de forma desarrollada. En las primeras etapas del desarrollo humano, el saco vitelino embriónico es el tejido hematopoyético y expresa el gen de la \varepsilon-globina. Esto va seguido por un cambio en el gen de la \gamma-globina.
La Figura 10 es una ilustración esquemática de cómo se pueden usar Astrovirus u otros virus heterólogos para expresar las proteínas estructurales Sindbis.
La Figura 11 es una ilustración esquemática del mecanismo de activación de una región de unión vírica inactivada por el "ARN de bucle externo".
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Descripción detallada de la invención
Antes de establecer la invención, puede ser útil para su comprensión establecer en primer lugar las definiciones de algunos términos que se usarán más adelante en el presente documento.
"Constructo de vector de alfavirus" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de una(s) secuencia(s) o gen(es) de interés. El constructo de vector debería incluir un promotor 5' que sea capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico in vitro a partir del ADNc, una secuencia 5' que sea capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, así como una(s) secuencia(s) que cuando se expresa(n), codifica(n) las proteínas no estructurales del alfavirus biológicamente activo (es decir, NSP1, NSP2, NSP3, y NSP4). Además, el constructo de vector debería incluir una región de unión vírica que puede, en algunas formas de realización, modificarse con el fin de evitar, inhibir o reducir la transcripción vírica del fragmento subgenómico, y una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus. El constructo de vector puede incluir también una(s) molécula(s) de ácido nucleico que son de tamaño suficiente para permitir la producción del virus viable, así como uno o más emplazamientos de restricción. Cuando el constructo de vector de alfavirus es un constructo de vector de ADNc, debería incluir adicionalmente un promotor 5' que sea capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del ADNc, y una secuencia 3' que controle la terminación de la transcripción y el reconocimiento del corte y empalme.
"Casete de expresión" se refiere a una molécula producida de manera recombinante que es capaz de expresar la(s) proteína(s) estructural(es) del alfavirus. El casete de expresión debe incluir un promotor y una secuencia que codifique la(s) proteína(s) estructural(es) del alfavirus. Opcionalmente, el casete de expresión puede incluir la terminación de la transcripción, el reconocimiento del corte y empalme, y los emplazamientos de adición de la poliadenilación. Los promotores preferidos incluyen los promotores CMV y VAIRNA de adenovirus. Además, el casete de expresión puede contener marcadores seleccionables tales como Neo, SV2Neo, higromicina, fleomicina, histidinol, y DHFR.
"Partícula de alfavirus" se refiere a una cápsida que contiene un vector de alfavirus. Una variedad de vectores puede estar contenida en el interior de la partícula de alfavirus, incluyendo los constructos de vector de alfavirus de la presente invención. Preferiblemente, la cápsida del alfavirus está contenida en el interior de una bicapa lípida, tal como una membrana celular, en la que están embebidas las proteínas víricas codificadas.
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A. Fuentes de alfavirus
Tal como se ha señalado anteriormente, la presente invención se refiere a constructos de vector de alfavirus, las partículas de alfavirus que contienen dichos constructos, así como a los procedimientos para usar dichos constructos y partículas de vector. De manera resumida, las secuencias que codifican los alfavirus de tipo natural adecuados para uso en la preparación de los constructos de vector y partículas anteriormente descritos se pueden obtener fácilmente dada la divulgación proporcionada en el presente documento a partir de fuentes que se producen naturalmente, o a partir de depositantes (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland).
Los ejemplos representativos de alfavirus adecuados incluyen Aura (ATCC VR-368), virus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), virus Chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), virus de la encefalomielitis equina oriental (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), virus Mayaro (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), virus Ross River (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), virus del Bosque Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), encefalomielitis equina de Venezuela (ATCC VR-69), virus de la encefalomielitis equina de Venezuela (ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), encefalomielitis equina occidental (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926), e Y-62-33 (ATCC VR-375).
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B. Secuencias que codifican el virus Sindbis de tipo natural
Dentro de un aspecto particularmente preferido de la presente divulgación, se pueden obtener las secuencias que codifican el alfavirus de tipo natural a partir del virus Sindbis. En concreto, En una forma de realización de la divulgación (y tal como se describe con más detalle a continuación en el Ejemplo 1), se puede obtener un clon de ADNc de Sindbis uniendo el extremo 5' de un clon de ADNc del virus Sindbis a un promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago, y el extremo 3' del clon de ADNc a una extensión de poli-adenosina (poli A) de al menos 25 nucleótidos. En concreto, la síntesis de la primera cadena de ADNc a partir de la plantilla de ARN vírico puede llevarse a cabo con un cebador de oligonucleótido 3' que tiene una secuencia consecutiva que comprende una secuencia de reconocimiento de la enzima, una secuencia de 25 nucleótidos de desoxitimidina, y una extensión de aproximadamente 18 nucleótidos que es complementaria del extremo 3' vírico y del cebador 5' que contiene los nucleótidos tampón, una secuencia de reconocimiento de la enzima, un promotor de bacteriófago, y una secuencia complementaria del extremo 5' vírico. Los emplazamientos de reconocimiento de la enzima presentes en cada uno de estos cebadores deberían ser diferentes entre sí, y no se encuentran en el virus Sindbis. Además, el primer nucleótido unido al extremo 3' del promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago debería ser el primer nucleótido auténtico del virus de ARN. El ARN transcrito in vitro a partir del clon de ADNc vírico, que tiene la construcción descrita anteriormente y se linealizó mediante digestión con el único enzima de restricción 3' distal dT:dA iniciará, tras la introducción en la célula eucariota apropiada, el mismo ciclo de infección que es característico de la infección por el virus de tipo natural a partir del cual se clonó el ADNc. Este clon de ADNc vírico, que da como resultado ARN capaz de iniciar la infección después de la transcripción in vitro, se denomina a continuación como "clon de ADNc infeccioso".
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C. Producción de constructos de vector de alfavirus recombinante con regiones de unión vírica inactivadas
Se puede utilizar fácilmente un clon de ADNc infeccioso preparado tal como se ha descrito anteriormente (o utilizando secuencias que codifican un alfavirus obtenido, procedentes de otras fuentes) para preparar constructos de vector de alfavirus tal como se describe en el presente documento. De manera resumida, dentro de un aspecto de la presente divulgación, se proporcionan constructos de vector de alfavirus recombinante, que comprenden una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de alfavirus que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una región de unión vírica que se ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, y una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus. Tal como se discutirá con más detalle a continuación, los constructos de vector de alfavirus que han inactivado las regiones de unión vírica no transcriben el fragmento subgenómico, haciéndoles adecuados para una amplia variedad de aplicaciones.
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1. Promotor de la ARN polimerasa
Tal como se ha señalado anteriormente, dentro de algunas formas de realización de la divulgación, los constructos de vector de alfavirus de la presente divulgación contienen un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico in vitro a partir del ADNc. Concretamente, los promotores 5' preferidos incluyen promotores de la ARN polimerasa tales como T7, T3 y SP6.
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2. Secuencias que inician la transcripción
Tal como se ha señalado anteriormente en las formas de realización de realización preferidas, los constructos de vector de alfavirus de la presente divulgación contienen una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus. Los ejemplos representativos de dichas secuencias incluyen los nucleótidos 1-60 del virus Sindbis de tipo natural (véase la Figura 3), los nucleótidos 10-75 de la Asparagina del ARNt (Schlesinger y col., Patente de los Estados Unidos Nº. 5.091.309), y las secuencias 5' de otros Togavirus que inician la transcripción.
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3. Proteínas no estructurales de alfavirus
Los constructos de vector de alfavirus de la presente divulgación deberían contener también las secuencias que codifican las Proteínas No Estructurales de Alfavirus (NSP). Como ejemplo, para el virus Sindbis existen cuatro proteínas no estructurales: Sindbis, NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4, que codifican las proteínas que permiten al virus autorreplicarse. Las proteínas no estructurales 1 a 3 (NSP1-NSP3) están, En una forma de realización de la divulgación, codificadas por los nucleótidos 60 a 5750 del virus Sindbis de tipo natural (véase la Figura 3). Estas proteínas se producen en forma de poliproteína y posteriormente se rompen en las proteínas no estructurales NSP1, NSP2, y NSP3. NSP4 está, En una forma de realización, codificada por los nucleótidos 5928 a 7579 (véase la Figura 3).
Será evidente para una persona normalmente experta en la técnica que se pueden utilizar una amplia variedad de secuencias que codifican las proteínas no estructurales de alfavirus además de las descritas anteriormente, y por tanto, considerarse comprendidas dentro del alcance de la frase "Proteínas No Estructurales de Alfavirus". Por ejemplo, en una forma de realización de la divulgación, debido a la degeneración del código genético, más de un codón puede codificar un aminoácido dado. Por tanto, se pueden generar una amplia variedad de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas no estructurales de alfavirus. En otras formas de realización de la divulgación, se pueden preparar una variedad de diferentes derivados de proteínas no estructurales, que incluyen por ejemplo, diversas sustituciones, inserciones, o delecciones, el resultado neto de las cuales no altera la actividad biológica de las proteínas no estructurales de alfavirus. Dentro del contexto de la presente divulgación se considera que las proteínas no estructurales de alfavirus son "biológicamente activas" in toto si promueven la autorreplicación del constructo de vector. La autorreplicación, que se refiere a la replicación de ácidos nucleicos víricos y no a la producción de virus infecciosos, se puede determinar fácilmente mediante los ensayos de protección de la RNasa llevados a cabo durante un periodo de tiempo. Se pueden llevar a cabo fácilmente los procedimientos para preparar dichos derivados por una persona normalmente experta en la técnica dada la divulgación proporcionada en el presente documento (véase también, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press).
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4. Regiones de unión vírica
Dentro de este aspecto de la divulgación, los constructos de vector de alfavirus incluyen también una región de unión vírica que se ha inactivado, de tal manera que se evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico. De manera resumida, la región de unión vírica del alfavirus controla normalmente la iniciación de la transcripción del fragmento subgenómico. En el caso del virus Sindbis, la región de unión vírica normal comienza usualmente en aproximadamente el nucleótido número 7579 y continúa hasta al menos el nucleótido número 7612 (y posiblemente más allá). Como mínimo, se creen necesarios los nucleótidos 7579 a 7602 (5'-ATC TCT ACG GTG GTC CTA AAT AGT-SEC DE ID Nº. I) para la transcripción del fragmento subgenómico. Esta región (nucleótidos 7579 a 7602) se denomina a partir de ahora en el presente documento como "núcleo mínimo de la región de unión".
En las formas de realización de realización preferidas de la divulgación (y tal como se describe con más detalle a continuación), la región de unión vírica está inactivada con el fin de evitar la transcripción vírica del fragmento subgenómico. Tal como se utiliza dentro del contexto de la presente divulgación, "inactivada" significa que el fragmento correspondiente al punto de iniciación del fragmento subgenómico, tal como se mide mediante el ensayo de protección de la RNasa, no se detecta. (Se describen los ensayos representativos por Melton y col., Nuc. Acids Res. 12: 7035-7056, 1984; Calzon y col., Methods in Enz. 152:611-632, 1987; y Kekule y col., Nature 343: 457-461, 1990.)
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En una forma de realización de la divulgación, la región de unión vírica está inactivada por el truncamiento de la región de unión vírica en el nucleótido 7597 (es decir, la región de unión vírica estará constituida entonces por la secuencia que se muestra en la Figura 3, desde el nucleótido 7579 al nucleótido 7597). Este truncamiento evita la transcripción del fragmento subgenómico, y adicionalmente permite la síntesis de la región NSP4 completa (que está codificada por los nucleótidos 5928 a 7579).
Como será evidente para una persona normalmente experta en la técnica dada la divulgación proporcionada en el presente documento, se puede preparar una amplia variedad de diferentes delecciones, sustituciones o inserciones con el fin de inactivar la región de unión vírica. Por ejemplo, En otras formas de realización de la divulgación, la región de unión vírica puede estar truncada además en la región que codifica NSP4, evitando por tanto la transcripción vírica del fragmento subgenómico mientras que retiene la actividad biológica de NSP4. Alternativamente, En otras formas de realización, debido a la redundancia del código genético, se pueden realizar sustituciones de nucleótidos en la secuencia que codifica NSP4, el efecto neto de las cuales no altera aún la actividad biológica de NSP4, sin embargo, evita la transcripción del fragmento subgenómico.
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5. Secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de alfavirus, y cola poli A
Tal como se ha señalado anteriormente, los constructos de vector de alfavirus de la presente divulgación deberían incluir también una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de alfavirus (denominada también "secuencia de reconocimiento de la replicasa de alfavirus"). De manera resumida, la secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de alfavirus proporciona un emplazamiento de reconocimiento en el que el virus comienza la replicación de la cadena negativa. Se puede utilizar una amplia variedad de secuencias tal como una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de alfavirus. Por ejemplo, en una forma de realización, los constructos de vector Sindbis de la presente divulgación incluyen una secuencia de reconocimiento de la polimerasa de Sindbis que está codificada por los nucleótidos 11.647 a 11.703 (véase la Figura 3). En otras formas de realización, el reconocimiento de la polimerasa de Sindbis está truncado en una región más pequeña que puede funcionar aún como secuencia de reconocimiento (por ejemplo, los nucleótidos 11.684 a 11.703 de la Figura 3).
En las formas de realización de realización preferidas de la divulgación, el constructo de vector puede contener adicionalmente una cola poli A. de manera resumida, la cola poli A puede ser de cualquier tamaño con tal de que sea suficiente para promover la estabilidad en el citoplasma, aumentando por tanto la eficiencia de iniciación del ciclo de vida vírico. En diversas formas de realización de la divulgación, la cola poli A comprende al menos 10 nucleótidos adenosina, y lo más preferible, al menos 25 nucleótidos adenosina.
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D. Otros constructos de vector de alfavirus
Además de los constructos de vector que han descrito en general anteriormente, se puede preparar también una amplia variedad de otros constructos de vector de alfavirus utilizando la divulgación proporcionada en el presente documento.
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1. Regiones de unión vírica modificadas
Dentro de un aspecto de la presente divulgación, se desvelan constructos de vector de alfavirus en los que se ha modificado la región de unión vírica, de tal manera que la transcripción vírica del fragmento subgenómico está reducida. De manera resumida, la infección de células con alfavirus de tipo natural da como resultado normalmente la muerte celular como resultado de la abundante transcripción vírica del fragmento subgenómico iniciada desde la región de unión vírica. Esta gran abundancia de moléculas de ARN puede arrollar la maquinaria transcripcional de la célula infectada, dando como resultado finalmente la muerte de la célula. En las aplicaciones en las que se desea que la infección de la célula diana deba dar como resultado un efecto terapéutico (por ejemplo, la escisión de la cadena de un ácido nucleico diana o la expresión prolongada de una proteína heteróloga) en lugar de la muerte de la célula, se pueden hacer diversas modificaciones en el constructo de vector de alfavirus (además de inactivar el constructo de vector, tal como se describe anteriormente) con el fin de reducir el nivel de transcripción vírica del fragmento subgenómico, y prolongar por tanto la vida de la célula diana infectada con el vector. Dentro del contexto de la presente divulgación, se considera que la transcripción vírica del fragmento subgenómico se va a "reducir" si esta produce menos fragmento subgenómico que un alfavirus estándar de tipo natural (por ejemplo, virus Sindbis ATCC Nº VR-1248) tal como se determina mediante el ensayo de protección de la RNasa.
Se pueden modificar las regiones de unión vírica mediante una variedad de procedimientos con el fin de reducir el nivel de la transcripción vírica del fragmento subgenómico. Por ejemplo, en una forma de realización de la divulgación, debido a la redundancia del código genético, se pueden realizar sustituciones de nucleótidos en la región 7579 a 7597 de unión vírica, el efecto neto de las cuales no altera la secuencia de aminoácidos de NSP4 (o, En otras formas de realización, la actividad biológica de NSP4), y reduce además el nivel de la transcripción vírica del fragmento subgenómico. Si el constructo de vector modificado incluye nucleótidos más allá del 7597 (por ejemplo, a 7602 0 7612), se pueden hacer además igualmente sustituciones de nucleótidos, aunque, debido a que NSP4 termina en el 7597, dichas sustituciones no necesitan estar basadas en la redundancia genética. Los ejemplos representativos de regiones de unión vírica modificada se describen con más detalle a continuación en el Ejemplo 3.
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2. Regiones de unión vírica en tándem
En otros aspectos de la divulgación, se desvelan constructos de vector de alfavirus, que comprenden una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una primera región de unión vírica que se ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, una segunda región de unión vírica que se ha modificado de tal manera que se reduce la transcripción vírica del fragmento subgenómico, y una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus. Dichos constructos de vector se denominan como constructos de vector "en tándem" debido a que comprenden una primera región de unión vírica inactivada (o "deshabilitada"), así como una segunda región de unión vírica modificada (o "sintética"). En las formas de realización de realización preferidas de la divulgación, la región de unión inactivada está seguida directamente por la segunda región de unión vírica modificada.
En aplicaciones en las que se requiere un bajo nivel de transcripción subgenómica, se puede insertar un núcleo mínimo de región de unión en la dirección 3' en tándem a la región de unión inactivada. Con el fin de aumentar gradualmente el nivel de transcripción subgenómica para el efecto deseado, se pueden añadir secuencias que corresponden a la región de unión completa a la región de unión en tándem, en incrementos.
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3. El gen E3 de adenovirus
En otro aspecto de la divulgación, un gen E3 de adenovirus se inserta en un constructo de vector en tándem tras la segunda región de unión vírica, con el fin de infrarregular la expresión de HLA en las células infectadas con alfavirus. De manera resumida, en diversas formas de realización de la divulgación, son deseables las inoculaciones repetidas de una terapéutica génica en el mismo individuo. Sin embargo, las inoculaciones repetidas de alfavirus tales como el virus Sindbis pueden conducir al desarrollo de anticuerpos específicos o la respuesta inmune mediada por células contra a la proteína vírica no estructural Sindbis (NSP). De esta manera, puede ser necesario disminuir la respuesta inmune del huésped dirigida a las proteínas específicas del vector con el fin de administrar dosis repetidas al mismo individuo.
Por tanto, En una forma de realización de la divulgación, se utilizan los productos del gen 3 de la región temprana de tipo 2 de Adenovirus con el fin de infrarregular la expresión de los antígenos de histocompatibilidad integrales expresados sobre la superficie de las células infectadas. De manera resumida, la proteína E3 de 19.000 dalton (E3/19K) se une a, y forma un complejo molecular con, los antígenos H-2/HLA de tipo I en el retículo endoplásmico, evitado la glicosilación terminal de las rutas necesarias para la maduración completa y el posterior transporte de los antígenos H-2/HLA de tipo I a la membrana celular. En las células diana infectadas con un vector de alfavirus que codifica la proteína Ad 2 E3 no se producirá la expresión simultánea de las proteínas no estructurales víricas en el contexto de los antígenos de tipo I. de esta manera, es posible administrar dosis repetidas de un vector de alfavirus que expresa la proteína Ad 2 E3 como componente de su paliativo terapéutico en el mismo individuo. Un ejemplo representativo del uso del gen E3 de Adenovirus se muestra con más detalle a continuación en el Ejemplo 4A.
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4. El gen H301 de CMV
Se pueden utilizar también otros procedimientos con el fin de disminuir una respuesta inmune del huésped contra las NSP víricas. Por ejemplo, en otro aspecto de la divulgación, el gen H301 de Citomegalovirus Humano ("HCMV") se clona en un constructo de vector de alfavirus, preferiblemente inmediatamente después de la segunda región de unión vírica en un vector en tándem, con el fin de inhibir la respuesta CTL del huésped dirigida contra las proteínas específicas víricas expresadas en las células infectadas del vector.
De manera resumida, la proteína \beta2-Microglobulina (\beta2m) se une a las regiones \alpha1, \alpha2 y \alpha3 de la cadena a de las moléculas de histocompatibilidad mayor de tipo I de los eucariotas superiores. Evitar la interacción entre \beta2m y los productos MHC de tipo I vuelve las células infectadas no reconocibles por las células T citotóxicas. Por tanto, tal como se describe con mayor detalle a continuación en el Ejemplo 4B, se puede utilizar la expresión del producto génico H301 de HCMV como componente de un paliativo terapéutico con el fin de disminuir la respuesta inmune del huésped a la NSP vírica.
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5. Secuencia de empaquetado retrovírico
En otro aspecto de la divulgación, una secuencia de empaquetado retrovírico se inserta en un vector en tándem y se sitúa entre la primera región de unión vírica (inactivada) y la segunda región de unión vírica modificada. De manera resumida, las secuencias de empaquetado retrovírico señalan el empaquetamiento de un genoma de ARN en una partícula retrovírica. Tal como se describe con más detalle a continuación, se puede utilizar una secuencia de de empaquetado retrovírico con el fin de empaquetar un vector de alfavirus en una partícula retrovírica usando una línea celular de empaquetado retrovírico. Esto se lleva a cabo con el fin de aumentar la eficiencia de la transferencia del vector de alfavirus en una línea celular que empaqueta el alfavirus.
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6. Expresión de múltiples genes heterólogos
La longitud genómica y la longitud subgenómica de los ARNm transcritos en las células infectadas con alfavirus de tipo natural son policistrónicas, codificando, respectivamente, las cuatro proteínas no estructurales víricas (NSP) y las cuatro proteínas estructurales (SP). Los ARNm genómicos y subgenómicos se traducen en forma de poliproteínas, y el procesamiento en proteínas no estructurales y estructurales individuales se lleva a cabo mediante rotura proteolítica post traduccional catalizada por las proteasas específicas de NSP y SP codificadas víricas.
En algunas aplicaciones de los vectores de alfavirus descritos en el presente documento, se desea la expresión de más de un gen heterólogo. Por ejemplo, con el fin de tratar trastornos metabólicos tales como el síndrome de Gaucher, se pueden requerir administraciones múltiples de vectores o partículas de alfavirus, debido a que la duración de la terapéutica paliativa puede ser limitada, Por tanto, con algunas formas de realización de la divulgación puede ser deseable expresar simultáneamente en una célula diana el gen Ad 2 E3 (véase el Ejemplo 4), junto con una terapéutica paliativa, tal como el gen de la glucocerbrocidasa (véase el Ejemplo 11). En el virus de tipo natural, sin embargo, el mensaje policistrónico de la proteína estructural ("SP") se traduce en una poliproteína única que se procesa posteriormente en proteínas individuales mediante rotura con las proteasas codificadas por SP. De esta manera, la expresión de múltiples genes heterólogos a partir de un mensaje policistrónico requiere un mecanismo diferente del virus de tipo natural, debido a que el gen de la proteasa SP, o los péptidos reconocidos para la rotura, no están presentes en la región de sustitución de los vectores de alfavirus.
Por tanto, en una forma de realización de la divulgación, se pueden construir vectores de alfavirus mediante la colocación de señales apropiadas tanto en la lectura del ribosoma como en la entada interna del ribosoma entre los cistrones. Se muestra más adelante en el Ejemplo 5 uno de dichos procedimientos representativos de expresión de múltiples genes heterólogos.
En otra forma de realización más de la divulgación, se describe la colocación de señales promotoras tanto en la lectura del ribosoma como en la entrada interna del ribosoma inmediatamente en la dirección 3' del vector pKSSINBdlJR de la región de unión inactivada (véase el Ejemplo 3). En esta configuración del vector, no se puede producir la síntesis del mensaje subgenómico; sin embargo, las proteínas heterólogas se expresan a partir del ARNm de longitud genómica tanto en la lectura ribosómica (detección) como en la entrada interna del ribosoma. Con respecto al tipo natural, el bajo nivel de transcripción vírica con este vector de alfavirus prolongaría la vida de la célula diana infectada.
En otra forma de realización más de la divulgación, se describe la colocación de señales promotoras tanto en la lectura del ribosoma como en la entrada interna del ribosoma inmediatamente en la dirección 3' de los vectores pKSSINBVdIJRsjr o pKSSINBV. De manera resumida, debido a que la síntesis de ARNm subgenómico se produce en las células infectadas con los vectores pKSSINBVdIJRsjr y pKSSINBV la colocación tanto de una secuencia de lectura del ribosoma como de una secuencia de entrada interna del ribosoma entre dos genes heterólogos permite la traducción de ambas proteínas codificadas mediante el mensaje policistrónico del ARNm subgenómico. Además, se pueden colocar genes heterólogos adicionales en la región del ARNm subgenómico, con la condición de que una señal de iniciación de la traducción adecuada resida en el extremo 5' del codón de inicio AUG traduccional: el número de gene(s) heterólogos que se puede insertar en la región del ARNm subgenómico, tal como se describe aquí, está limitado únicamente por las restricciones de empaquetado del vector.
Se pueden colocar diferentes secuencias que permiten tanto la lectura del ribosoma, la traducción independiente de la caperuza, como la entrada interna del ribosoma en los vectores Sindbis pKSSINBVdIR, pKSSINBV, o pKSSrNBVdIRsjrc, en las configuraciones que se desvelan anteriormente. La fuente de estas secuencias control de la traducción son los picornavirus de la polio y EMCV, la región 50 no codificada de la proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, y la secuencia sintética de al menos 15 pb que corresponde en parte a la secuencia consenso de Kozak para la iniciación traduccional eficiente. Aunque no se describe en detalle aquí, estas señales que afectan la iniciación de la traducción se pueden colocar también en la dirección 3' de la región de unión y entre los genes heterólogos en todos los vectores de la región de unión modificada descritos en el Ejemplo 3.
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7. Constructos de vector de ADNc de alfavirus
Tal como se ha señalado anteriormente, se desvelan en el presente documento constructos de vector de ADNc de alfavirus. Por ejemplo, dentro de un aspecto de la divulgación se desvelan constructos de vector de ADNc de alfavirus que comprenden un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del ADNc, seguido por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, una región de unión vírica que es o bien activa o que se ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus, y una secuencia 3' que controla la terminación de la transcripción. En diversas formas de realización, se puede modificar la región de unión vírica, de tal manera que se puede reducir únicamente la transcripción vírica del fragmento subgenómico, más bien que inactivarla. En otras formas de realización, se puede insertar una segunda región de unión vírica tras la primera región de unión vírica inactivada, modificándose la segunda región de unión vírica de tal manera que se reduce la transcripción vírica del fragmento subgenómico.
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Se han descrito anteriormente diversos aspectos de los constructos de vector de ADNc de alfavirus, incluyendo la secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, la secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, la región de unión vírica que se ha inactivado de tal manera que se evita la transcripción vírica del fragmento subgenómico, y la secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de alfavirus. Además, se han descrito también anteriormente las regiones de unión modificadas y las regiones de unión en tándem. Los constructos de vector de ADNc de alfavirus, sin embargo, difieren por la adición de un promotor 5' que es capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico a partir del ADNc. Los ejemplos representativos de promotores adecuados incluyen el promotor lac, el promotor de la metalotiona, el promotor CMV y el promotor del choque térmico.
Tal como se ha señalado anteriormente, el constructo de vector de ADNc de alfavirus incluye también una secuencia 3' que controla la terminación de la transcripción. Se muestra con más detalle a continuación en el Ejemplo 2 un ejemplo representativo de dicha secuencia.
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8. Expresión específica del tejido
En otros aspectos de la presente divulgación, se desvelan constructos de vector de alfavirus que son capaces de expresar una secuencia heteróloga deseada únicamente en un tejido seleccionado. Se muestra en la Figura 11 uno de dichos ejemplos representativos. De manera resumida, tal como se muestra en la Figura 11A, se construye un vector de alfavirus recombinante de tal manera que tras la introducción del vector (Figura 11 A) en la célula diana, las secuencias de repetición invertidas internas que flanquean las regiones de control transcripcional (por ejemplo, la región de unión modificada) forman un bucle externo (véase la Figura 11B), evitando por tanto la transcripción vírica de las secuencias subgenómicas ("G.O.I.") de la región de unión sintética.
Por otra parte, se puede conseguir la activación del vector si se diseñan las repeticiones invertidas para hibridar también una secuencia de ARN celular específica que es característica de un tejido o tipo celular seleccionado. Dicho ARN celular interrumpe la estructura de tallo y bucle inactivada, permitiendo por tanto la formación de una estructura de tallo y bucle secundaria más estable (Figuras 11C y 11D). Esta estructura de tallo y bucle secundaria permite la transcripción del mensaje subgenómico colocando la región de unión posterior en su correcta configuración posicional.
Se pueden transcribir también vectores de alfavirus de longitud completa usando la estructura de tallo y bucle secundaria aprovechando la ventaja de la capacidad de la polimerasa vírica de cambiar las plantillas durante la síntesis de la cadena negativa usando un mecanismo de salto de cadena denominado selección de la copia (King. RNA genetics II, CRC Press, Inc., Boca Raton Fla. Domingo y col. (ed.), pp. 150-185, 1988). Una vez se ha producido una vuelta satisfactoria única de la transcripción, el transcripto de ARN resultante no contiene repeticiones invertidas puesto que se borran debido al episodio de selección de la copia de la polimerasa. Esta molécula de ARN nuevamente sintetizada funciona ahora como transcripto de vector de ARN primario que se transcribirá y expresará como cualquier otro vector de alfavirus genómico inactivado anteriormente descrito. En esta configuración de vector de ARN, se puede conseguir la activación específica de célula o tejido del vector Sindbis inactivado si las secuencias específicas de ARN, que están presentes sólo en los tipos de células o tejidos diana, se usan en el diseño de las repeticiones invertidas. De esta manera, se pueden diseñar alfavirus tales como Sindbis mediante ingeniería genética para que sean vectores de expresión específicos de tejido usando secuencias invertidas similares a las descritas anteriormente.
El uso de este sistema de vector para conseguir la expresión específica de tejido permite a un terapeuta liberar sistemáticamente el vector o la partícula de alfavirus en un paciente. Si el vector debe infectar una célula que no expresa las especies de ARN apropiadas, el vector sólo será capaz de expresar las proteínas no estructurales y no el gen de interés. Eventualmente, el vector se degradará perjudicialmente.
El uso de los vectores anteriormente descritos permite la expresión virtual específica del tejido para una variedad de aplicaciones terapéuticas, que incluyen por ejemplo, el direccionamiento de vectores para el tratamiento de diversos tipos de cánceres. Este fundamento depende de la expresión específica de marcadores específicos del tumor tales como el antígeno específico del tumor carcinoembriónico (CEA) y el marcador tumoral de la alfa-fetoproteína. De manera resumida, utilizar dicho ARN específico del tumor en tumores diana específicos permite la expresión de moléculas tóxicas específicas del tumor, linfoquinas o profármacos descritos a continuación. Se pueden utilizar dichos procedimientos para una amplia variedad de tumores, que incluyen por ejemplo, los cánceres colorrectal, de pulmón, de mama, de ovarios, de vejiga y de próstata debido a que estos tumores expresan el CEA. Se muestra con más detalle a continuación en el Ejemplo 15 una ilustración representativa de los vectores adecuados para el uso comprendido en este aspecto de la presente divulgación.
De manera resumida, CEA fue uno de los primeros marcadores específicos de tumor que se describió, junto con el marcador tumoral de la alfa-fetoproteína. CEA es una glicoproteína normal en el tejido embriónico del intestino, páncreas e hígado durante los dos primeros trimestres del desarrollo fetal (Pathologic Basis of Disease, 3ª edición 1984, Robbins y col. editor). Anteriormente, se pensaba que CEA era específico de los adenocarcinomas de colon, sin embargo, con el desarrollo posterior de radioinmunoensayos más sensibles ha llegado a ser evidente que CEA estaba presente en el plasma de muchos cánceres endodérmicamente derivados, concretamente el pancreático, gástrico y broncogénico.
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Dentro de los aspectos relacionados de la presente divulgación, se pueden construir vectores de expresión específicos de células de alfavirus para expresar antígenos víricos, ribozimas, secuencias de sentido contrario o factores inmunoestimuladores tales como el interferón gamma (\gamma-IFN) o IL-2 para el tratamiento dirigido de los tipos celulares infectados con virus. En concreto, con el fin de dirigir vectores de alfavirus a organismos extraños específicos o células infectadas con patógenos, se pueden seleccionar repeticiones invertidas del vector de alfavirus para hibridar cualquier ARN específico de patógeno, por ejemplo, las células dianas infectadas por patógenos tales como VIH, CMV, VHB, VPH y VHS.
En otros aspectos más de la divulgación, se pueden dirigir tejidos específicos de órganos para el tratamiento de enfermedades metabólicas específicas de tejidos utilizando las terapias de sustitución génica. Por ejemplo, el hígado es un tejido diana importante debido a que es responsable de muchas funciones metabólicas corporales y se asocia con muchos trastornos genéticos metabólicos. Dichas enfermedades incluyen muchas de las enfermedades de almacenamiento de glicógeno, fenilcetonuria, enfermedad de Gaucher e hipercolesterolemia familiar. Actualmente, existen muchos enzimas y marcadores específicos de hígado que se han secuenciado, que se pueden usar para diseñar mediante ingeniería genética repeticiones invertidas apropiadas para los vectores de alfavirus: Dichos ADNc específicos de hígado incluyen las secuencias que codifican la S-adenosilmetiona sintetasa (Horikawa y col., Biochem. Int. 25: 81, 1991); lecitina: colesterolacil transferasa (Rogne y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 148: 161, 1987); así como otros ADNc específicos de hígado (Chin y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 478:120, 1986). Dicho vector de alfavirus específico de hígado se podría usar para liberar el receptor de la lipoproteína de baja densidad (Yamamoto y col., Cell 39: 27, 1984) en las células de hígado para el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar (Wilson y col., Mol. Biol. Med. 7: 223, 1990).
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E. Secuencia heteróloga
Tal como se ha señalado anteriormente, los constructos de vector de alfavirus de la presente divulgación pueden transportar una amplia variedad de secuencias de nucleótidos. Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos deberían ser de un tamaño suficiente para permitir la producción de virus viables. Dentro del contexto de la presente divulgación, la producción de cualquier título medible de virus infeccioso en monocapas susceptibles se considera que es "producción de virus viable". Esto puede ser, como mínimo, un constructo de vector de alfavirus que no contiene ninguna secuencia heteróloga adicional. Sin embargo, En otras formas de realización, el constructo de vector puede contener secuencias externas o heterólogas adicionales. En las formas de realización de realización preferidas, la secuencia heteróloga comprenderá una secuencia heteróloga de al menos aproximadamente 100 bases, 2 kb, 3,5 kb, 5 kb, 7 kb, o incluso una secuencia heteróloga de al menos aproximadamente 8 kb.
Como será evidente para una persona normalmente experta en la técnica, dada la divulgación proporcionada en el presente documento, la eficiencia del empaquetado y, por tanto, el título vírico, es dependiente en algún grado del tamaño de la secuencia que se va a empaquetar. De esta manera, con el fin de aumentar la eficiencia del empaquetado y la producción del virus viable, se pueden añadir secuencias no codificantes adicionales al constructo de vector. Además, dentro de algunas formas de realización de la divulgación se puede desear aumentar o disminuir el título vírico. Este aumento o disminución se puede llevar a cabo aumentando o disminuyendo el tamaño de la secuencia heteróloga, y por tanto, la eficiencia del empaquetado.
Se puede incluir una amplia variedad de secuencias heterólogas en el constructo de vector, incluyendo por ejemplo las secuencias que codifican paliativos tales como linfoquinas, toxinas, profármacos, antígenos que estimulan una respuesta inmune, ribozimas, y proteínas que ayudan o inhiben una respuesta inmune, así como secuencias de sentido contrario (o secuencias de sentido directo para "aplicaciones de sentido contrario"). Tal como se ha señalado anteriormente, en diversas formas de realización de la divulgación los constructos de vector de alfavirus desvelados en el presente documento pueden contener (y expresan, dentro de algunas formas de realización) dos o más secuencias heterólogas.
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1. Linfoquinas
En una forma de realización de la divulgación, la secuencia heteróloga codifica una linfoquina. De manera resumida, las linfoquinas actúan para proliferar, activar o diferenciar las células efectoras inmunes. Los ejemplos representativos de linfoquinas incluyen el interferón gamma, el factor de necrosis tumoral, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CSF, CSF-1 y G-CSF.
En las formas de realización de realización relacionadas de la divulgación, la secuencia heteróloga codifica un cofactor inmunomodulador. De manera resumida, tal como se utiliza dentro del contexto de la presente divulgación, "cofactor inmunomodulador" se refiere a los factores que, cuando se fabrican por una o más de las células implicadas en una respuesta inmune, o cuando se añaden exógenamente a las células, hacen que la respuesta inmune sea diferente en calidad o potencia de la que se produciría en ausencia del cofactor. Se puede medir la calidad o potencia de una respuesta mediante una variedad de ensayos conocidos por una persona experta en la técnica que incluyen, por ejemplo, ensayos in vitro que miden la proliferación celular (por ejemplo, captación de ^{3}H timidina), y ensayos citotóxicos in vitro (por ejemplo, que miden la liberación de ^{51}Cr) (véase Warner y col., AIDS Res. and Human Retroviruses 7: 645-655, 1991).
Los ejemplos representativos de cofactores inmunomoduladores incluyen (Finter y col., Drugs 42(5): 749-765, 1991; Patente de los Estados Unidos Nº. 4.892.743; Patente de los Estados Unidos Nº. 4.966.843; documento WO 85/02862; Nagata y col., Nature 284: 316-320, 1980; Familletti y col., Methods in Enz. 78: 387-394, 1981; Twu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 2046-2050, 1989; Faktor y col., Oncogene 5: 867-872, 1990), interferón beta (Seif y col., J. Virol. 65:664-671, 1991), interferones gamma (Radford y col., American Society of Hepatology: 2008.2015, 1991; Watanabe y col. PNAS 86: 9456-9460, 1989; Gansbacher y col., Cancer Research 50:7820-7825. 1990. Maio y col., Can. Immuno/.Immunother. 30: 34-42, 1989; Patentes de los Estados Unidos N^{os}. 4.762.791 y 4.727.138), G-CSF (Patentes de los Estados Unidos N^{os}. 4.999.291 y 4.810.643), GM-CSF (documento WO 85/04188), TNFs (Jayaraman y col., J. Immunology 144: 942-951, 1990), Interleuquina-2 (IL-2) (Karupiah y col., J. Immunology 144: 290-298, 1990; Weber y col., J Exp. Med 166: 1716-1733, 1987; Gansbacher y col., J. Exp. Med. 172: 1217-1224, 1990; Patente de los Estados Unidos Nº. 4.738.927), IL-4 (Tepper y col., Cell 57: 503-512, 1989; Golumbek y col., Science 254: 713-716, 1991; Patente de los Estados Unidos Nº. 5.017.691), IL-6 (Brakenhof y col., J. Immuno/. 139: 4116-4121, 1987; documento WO 90/06370), IL-12, IL-15, ICAM-1 (Altman y col., Nature 338: 512-514, 1989), ICAM-2, LFA-1, LFA-3, moléculas MHC de tipo I, moléculas MHC de tipo II, \beta_{2}-microglobulina, chaperonas, CD3, B7/BB1, proteínas transportadoras unidas a MHC o sus análogos.
La elección de qué cofactor inmunomodulador incluir dentro de un constructo de vector de alfavirus puede basarse en los efectos terapéuticos conocidos del cofactor, o en los determinados experimentalmente. Por ejemplo, en infecciones por hepatitis B crónicas se ha encontrado que el interferón alfa es eficaz para compensar el déficit inmunológico de un paciente y ayuda por tanto a la recuperación de esta enfermedad. Alternativamente se puede determinar experimentalmente un cofactor inmunomodulador adecuado. De manera resumida, se toman en primer lugar muestras de sangre de pacientes con enfermedad hepática. Se vuelven a estimular in vitro los linfocitos de la sangre periférica (PBL) con células autólogas o compatibles con HLA (por ejemplo, células EBV transformadas), y se transducen con un constructo de vector de alfavirus que dirige la expresión de una porción inmunogénica de un antígeno de la hepatitis y el cofactor inmunomodulador. Los PBL estimulados se usan como efectores en un ensayo CTL con las células transducidas compatibles con HLA como dianas. Un aumento de la respuesta CTL sobre el observado en el mismo ensayo llevado a cabo usando el estimulador compatible con HLA y las células dianas transducidas con un vector que codifica únicamente el antígeno, indica un cofactor inmunomodulador útil.
Otro ejemplo de un cofactor inmunomodulador es el factor coestimulador B7/BB1. De manera resumida, la activación de la actividad funcional completa de las células T requiere dos señales. Una señal se proporciona mediante la interacción del receptor de células T específico de antígeno con péptidos que se unen a las moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC), y la segunda señal, denominada como coestimulación, se libera en la célula T mediante las células que presentan el antígeno. De manera resumida, se necesita la segunda señal para la producción de interleucina-2 (IL-2) por las células T y parece implicar la interacción de la molécula B7/BB1 con las células que presentan antígeno con los receptores CD28 y CTLA-4 en los linfocitos T (Linsley y col., J Exp. Med. 173: 721-730. 1991a. y J. Exp Med., 174: 561-570, 1991). En una forma de realización de la divulgación, se puede introducir B7/BB1 en células tumorales con el fin de producir la coestimulación de las células CD8^{+} T, de tal manera que las células T CD8^{+} produzca suficiente IL-2 para expandirse y llegar a activarse completamente. Estas células T CD8^{+} pueden eliminar células tumorales que no expresan B7 debido a que no se requiere una coestimulación más larga para la función CTL adicional. Se pueden hacer vectores que expresen el factor B7/BB1 coestimulador y, por ejemplo, una proteína de núcleo HBV inmunogénica, utilizando los procedimientos que se desvelan en el presente documento. Las células transducidas con estos vectores volverán más efectivas las células que presentan antígenos. La respuesta CTL específica del núcleo de VHB aumentará a partir de la célula T CD8^{+} completamente activada mediante el ligando coestimulador B7/BB1.
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2. Toxinas
En otra forma de realización de realización de la divulgación, la secuencia heteróloga codifica una toxina. De manera resumida, las toxinas actúan inhibiendo directamente el crecimiento de una célula. Los ejemplos representativos de toxinas incluyen ricina (Lamb y col., Eur. J. Biochem. 148: 265-270, 1985), abrina (Wood y col., Eur. J. Biochem. 198: 723-732, 1991; Evensen y col., J. of Biol. Chem. 266: 6848-6852, 1991; Collins y col., J. of Biol. Chem. 265: 8665-8669, 1990; Chen y col., Fed. of Eur. Biochem Soc. 309:115-118, 1992), toxina de la difteria (Tweten y col., J. Biol. Chem. 260: 10392-10394, 1985), toxina de cólera (Mekalanos y col., Nature 306: 551-557, 1983; Sanchez y Holmgren, PNAS 86:481-485, 1989), gelonina (Stirpe y col., J. Biol. Chem. 255:6947-6953, 1980), hierba carmín (Irvin, Pharmac. Ther. 21: 371-387, 1983), proteína antivírica (Barbieri y col., Biochem. J. 203: 55-59, 1982; Irvin y coll., Arch. Biochem. & Biophys. 200: 418-425, 1980; Irvin, Arch. Biochem. & Biophys. 169: 522-528, 1975), tritina, toxina de Shigella (Calderwood y col., PNAS 84:4364-4368, 1987; Jackson y col., Microb. Path. 2: 147-153, 1987), exotoxina A de Pseudomonas (Carroll y Collier, J. Biol. Chem. 262: 8707-8711, 1987), timidina quinasa del virus del herpes simple (HSVTK) (Field y col., J. Gen. Virol. 49:115-124, 1980), y guanina fosforibosil transferasa de E. coli.
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3. Profármacos
En otras formas de realización de la divulgación, la secuencia heteróloga codifica un "profármaco". De manera resumida, tal como se utiliza dentro del contexto de la presente divulgación, "profármaco" se refiere a un producto génico que activa un compuesto con poca o ninguna citotoxicidad en un producto tóxico. Los ejemplos representativos de dichos productos génicos incluyen HSVTK y VZVTK, que monofosforilan selectivamente algunos arabinósidos de purina y los compuestos de pirimidina sustituidos, convirtiéndolos en metabolitos citotóxicos o citostáticos. Más específicamente, la exposición a los fármacos ganciclovir, aciclovir, o cualquiera de sus análogos (por ejemplo, FIAU, FIAC, DHPG) y HSVTK fosforila el fármaco en su forma de nucleótido trifosfato activo correspondiente.
Los ejemplos representativos de otros profármacos que se pueden utilizar dentro del contexto de la presente divulgación incluyen guanina fosforibosil transferasa de E. coli que convierte la tioxantina en monofosfato de tioxantina tóxico (Besnard y col., Mol. Cell. Biol. 7: 4139-4141, 1987); fosfatasa alcalina, que convertirá los compuestos fosforilados inactivos tales como fosfato de mitomicina y fosfato de doxorubicina en compuestos desfosforilados tóxicos, citosina desaminasa fúngica (por ejemplo, Fusarium oxysporum) o bacteriana, que convertirá la 5-fluorocitosina en el compuesto tóxico 5-fluoroacilo (Mullen, PNAS 89:33, 1992); carboxipeptidasa G2, que romperá el ácido glutámico del ácido para-N-bis (2-cloroetil) aminobenzoil glutámico, creando por tanto una mostaza de ácido benzoico tóxica; y Penicilina-V amidasa, que convertirá los derivados de fenoxiacetabida de doxorubicina y melfalan en compuestos tóxicos (véanse generalmente, Vrudhula y col., J. of Med. Chem. 36(7): 919-923, 1993; Kern y col., Canc. Immun. Immunother. 31(4): 202-206, 1990).
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4. Secuencias de sentido contrario
En otra forma de realización de realización de la divulgación, la secuencia heteróloga es una secuencia de sentido contrario. De manera resumida, las secuencias de sentido contrario se diseñan para unirse a los transcriptos de ARN, y evitan por tanto la síntesis celular de una proteína concreta o evitan el uso de esta secuencia de ARN por la célula. Los ejemplos representativos de dichas secuencias incluyen la timidina quinasa de sentido contrario, la dihidrofolato reductasa de sentido contrario (Maher y Dolnick, Arch. Biochem. & Biophys. 253: 214-220, 1987; Bzik y col., PNAS 84: 8360-8364, 1987), HER2 de sentido contrario (Coussens y col., Science 230: 1132-1139, 1985), ABL de sentido contrario (Fainstein y col., Oncogene 4: 1477-1481, 1989), Myc de sentido contrario (Stanton y col., Nature 310:423-425, 1984) y ras de sentido contrario, así como las secuencias de sentido contrario que bloquean cualquiera de las enzimas en la ruta biosintética de los nucleótidos. Además, En otras formas de realización de la divulgación, se pueden utilizar las secuencias de sentido contrario del interferón \gamma y \beta-2 microglobulina con el fin de disminuir la respuesta inmune.
Además, en una forma adicional de la divulgación, se puede utilizar ARN de sentido contrario como agente antitumoral con el fin de inducir una potente respuesta restringida de Tipo I. De manera resumida, además de unirse al ARN y evitar por tanto la traducción de un ARNm específico, se cree que niveles elevados de secuencias de sentido contrario específicas inducen el aumento de expresión de los interferones (incluyendo el interferón gamma) debido a la formación de grandes cantidades de ARN de doble cadena. El aumento en la expresión del interferón gamma, a la vez, estimula la expresión de los antígenos MHC de Tipo I. Las secuencias de sentido contrario preferidas para el uso a este respecto incluyen el ARN de actina, el ARN de miosina, y el ARN de histona. El ARN de sentido contrario que forma un emparejamiento incorrecto con el ARN de actina es particularmente preferido.
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5. Ribozimas
En otros aspectos de la presente divulgación, se desvelan vectores de alfavirus que producen ribozimas tras la infección de una célula huésped. De manera resumida, las ribozimas se usan para romper ARN específicos y se diseñan de tal manera que sólo pueden afectar un ARN específico. Generalmente, la secuencia de unión al sustrato de una ribozima está entre 10 y 20 nucleótidos de longitud. La longitud de esta secuencia es suficiente para permitir una hibridación con el ARN diana y la disociación de la ribozima a partir del ARN roto. Los ejemplos representativos para crear ribozimas incluyen los descritos en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 5.116.742; 5.225.337 y 5.246.921. Las ribozimas particularmente preferidas para el uso dentro de la presente divulgación incluyen las desveladas con más detalle a continuación en los Ejemplos (por ejemplo, Ejemplo 18).
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6. Proteínas y otros constituyentes celulares
En otros aspectos de la presente divulgación, el constructo de vector de alfavirus puede transportar una amplia variedad de proteínas u otros constituyentes celulares. Los ejemplos representativos de dichas proteínas incluyen los componentes celulares naturales o alterados; así como proteínas o constituyentes celulares extraños, que se encuentran por ejemplo en, virus, bacterias, parásitos u hongos.
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(a) Componentes celulares alterados
En una forma de realización, se desvelan constructos de vector de alfavirus que dirigen la expresión de un componente celular alterado inmunogénico no tumorogénico. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmunogénico" se refiere a componentes celulares alterados que son capaces, en las condiciones apropiadas, de producir una respuesta inmune. Esta respuesta debe ser mediada por células, y puede incluir también una respuesta humoral. El término "no tumorogénico" se refiere a componentes celulares alterados que no producirán la transformación celular o inducen la formación del tumor en ratones sin pelo. La frase "componente celular alterado" se refiere a proteínas y otros constituyentes celulares que están asociados tanto con la reversión de una célula tumorogénica como asociados con las células tumorogénicas en general, pero no se requiere o son esenciales para revertir la célula tumorogénica.
Antes de la alteración, los componentes celulares pueden ser esenciales para el crecimiento y regulación celular normal e incluyen, por ejemplo, proteínas que regulan la degradación de las proteínas intracelulares, la regulación transcripcional, el control del ciclo celular, y la interacción célula-célula. Tras la alteración, los componentes celulares no llevan a cabo durante más tiempo sus funciones reguladoras y, por tanto, la célula puede experimentar un crecimiento no controlado. Los ejemplos representativos de componentes celulares alterados incluyen ras*, p53*, Rb*, la proteína alterada codificada por el gen del tumor de Wilms, ubiquitina*, mucina*, la proteína codificada por los genes DCC, APC, y MCC, el gen BRCA1* del cáncer de mama, así como los receptores o estructuras similares a receptores tales como neu, receptor de la hormona tiroidea, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el receptor de la insulina, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el receptor del factor de estimulación de colonias (CSF).
En una forma de realización de la presente divulgación, se desvelan constructos de vector de alfavirus que dirigen la expresión de un gen ras alterado (ras*) no tumorogénico. De manera resumida, el gen ras* es una diana atractiva debido a que se une causalmente al fenotipo neoplásico, y a la vez, puede ser necesario para la inducción y mantenimiento de la tumorogénesis en una amplia variedad de distintos cánceres, tales como carcinoma pancreático, carcinoma de colon y adenocarcinoma de pulmón. Además, los genes ras* se encuentran en tumores pre-neoplásicos y, por tanto, se puede aplicar la terapia de intervención inmune antes de la detección de un tumor maligno.
Los genes ras normales son no tumorogénicos y ubicuos en todos los mamíferos. Están muy conservados en la evolución y parecen jugar un importante papel en el mantenimiento del ciclo celular y las propiedades de crecimiento normales. La proteína ras normal es una proteína G que se une a GTP y tiene actividad GTPasa, y está implicada en la transmisión de las señales desde el medio externo al interior de la célula, permitiendo por tanto a una célula responder a su entorno. Los genes ras*, por otra parte, alteran la regulación del crecimiento normal de las células neoplásicas mediante un desacoplamiento del comportamiento celular respecto de su entorno, conduciendo de esta manera a la proliferación no controlada de células neoplásicas. Se cree que la mutación del gen ras es un episodio temprano en la carcinogénesis (Kumar y col., Science 248: 1101-1104, 1990) que, si se trata pronto, puede evitar la tumorogénesis.
Los genes ras* se producen en una amplia variedad de cánceres, que incluyen, por ejemplo, los adenocarcinomas pancreático, de colon, y de pulmón.
El espectro de mutaciones que se producen en los genes ras* que se encuentra en una variedad de cánceres es muy limitado. Estas mutaciones alteran la actividad de la GTPasa de la proteína ras convirtiendo el interruptor normal de on/off en una posición ON constitutiva. Las mutaciones tumorogénicas en ras* se producen principalmente (in vivo) en sólo 3 codones, 12, 13 y 61. Las mutaciones del codón 12 son las más prevalentes en los tumores de seres humanos y animales.
La Tabla 1 a continuación resume las mutaciones in vivo conocidas (codones 12, 13 y 61) que activan el ras humano, así como las mutaciones potenciales que tienen actividad transformante in vitro. Las mutaciones potenciales con actividad transformante in vitro se produjeron por la sustitución sistemática de aminoácidos para el codón normal (por ejemplo, se sustituyeron otros aminoácidos por la glicina normal en la posición 12). Las mutaciones in vitro, aunque no se sabe actualmente que se produzcan en seres humanos o animales, pueden servir como base para una inmunoterapéutica anticancerosa si se encontrara eventualmente que se producen in vivo.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos que activan las proteínas ras humanas
1
Las alteraciones que se describen anteriormente dan como resultado la producción de proteínas que contienen secuencia(s) de codificación novedosas. Las proteínas novedosas codificada por estas secuencia(s) se pueden usar como un marcador de células tumorogénicas, y se puede utilizar una respuesta inmune dirigida contra estas regiones de codificación novedosas para destruir las células tumorogénicas que contienen las secuencias alteradas (ras*).
En otra forma de realización de realización de la presente divulgación, se desvelan constructos de vector de alfavirus que dirigen la expresión de un gen p53 (p53*) alterado. De manera resumida, p53 es una fosfoproteína nuclear que se descubrió originalmente en extractos de células transformadas y de esta manera, se clasificó inicialmente como un oncogén (Linzer y Levine, Cell 17: 43-52, 1979; Lane y Crawford, Nature 278: 261-263, 1979). Se descubrió posteriormente que los clones de ADNc de p53 originales eran formas mutantes de p53 (Hinds y col., J. Virol. 63: 739-746, 1989). Parece ahora que p53 es un gen supresor tumoral que regula negativamente el ciclo celular, y que la mutación de este gen puede conducir a la formación del tumor. De los carcinomas que se han estudiado, el 75%-80% muestra una pérdida de ambos alelos p53, uno mediante delección y el otro mediante mutación puntual. Mutaciones similares se encuentran en el cáncer de pulmón, y en tumores de cerebro y mama.
La mayoría de las mutaciones de p53 (por ejemplo, p53*^{1}, p53*^{2}, etc.) se agrupan entre los restos de los aminoácidos 130 a 290 (véase Levine y col., Nature 351: 453-456, 1991; véanse también las siguientes referencias que describen las mutaciones específicas con más detalle. Baker y col., Science 244: 217-221, 1989; Nigro y col., Nature 342: 705-708, 1989 (grupo de mutaciones p53 en cuatro "puntos calientes" que coinciden con las cuatro regiones muy conservadas de los genes y estas mutaciones se observan en tumores de cerebro, mama, pulmón y colon humanos); Vogelstein, Nature 348: 681-682, 1990; Takahashi y col., Science 246: 491-494, 1989; Iggo y col., Lancet 335: 675-679, 1990; James y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 2858-2862, 1989; Mackay y col., Lancet 11: 1384-1385,1988; Kelman y col., Blood 74: 2318-2324, 1989; Malkin y col., Science 250: 1233-1238, 1990; Baker y col., Cancer Res. 50: 7717-7722, 1991; Chiba y col., Oncogene 5: 1603-1610, 1990 (La patogénesis del cáncer de pulmón de células no pequeñas en la Etapa temprana se asocial con mutaciones somáticas en el gen p53 entre los codones 132 a 283); Prosser y col., Oncogene 5: 1573-1579, 1990 (se identificaron en el gen p53 que codificaba los aminoácidos 126 a 224 en cáncer de mama primario); Cheng y Hass, Mol. Cell. Biol. 10: 5502-5509, 1990; Bartek y col. Oncogene 5: 893-899, 1990; Rodrigues y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 7555-7559, 990; Menon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 5435-5439, 1990; Mulligan y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 87: 5863-5867, 1990; y Romano y col. Oncogene 4: 1483-1488, 1990 (identificación de una mutación p53 en el codón 156 en la línea celular HOS-SL derivada de osteosarcoma humano).
Algunas alteraciones del gen p53 pueden ser debidas a algunas toxinas específicas. Por ejemplo, Bressac y col. (Nature 350: 429-431, 1991) describen mutaciones de G a T específicas en el codón 249 en pacientes afectados con carcinoma hepatocelular. Un agente causante sugerido de esta mutación es la alfatoxina B_{1}, un carcinógeno del hígado del que se sabe que es un contaminante de los alimentos en África.
Cuatro regiones del gen que están particularmente afectadas se producen en los restos 132-145, 171-179, 239-248, y 272-286. Tres "puntos calientes" que se encuentran en el interior de estas regiones que son de particular interés se producen en los restos 175, 248 y 273 (Levine y col., Nature 351: 453-456, 1991). Estas alteraciones, así como otras que se desvelan anteriormente dan como resultado la producción de proteína(s) que contienen secuencia(s)
de codificación novedosas. Se pueden usar las novedosas proteínas codificadas por estas secuencias como un marcador de células tumorogénicas y se puede utilizar una respuesta inmune dirigida contra estas novedosas regiones de codificación para destruir las células tumorogénicas que contienen la secuencia alterada (p53*).
Una vez que se ha obtenido una secuencia que codifica el componente celular alterado, es necesario asegurar que la secuencia codifica una proteína no tumorogénicas. Se conocen diversos ensayos y se pueden llevar a cabo fácilmente para evaluar la tumorogenicidad de un componente celular concreto. Los ensayos representativos incluyen un ensayo de fibroblastos de ratas, la formación del tumores en ratones o ratas sin pelo, la formación de colonias en agar blando, y la preparación de animales transgénicos, tales como ratones transgénicos.
La formación de tumor en ratones o ratas sin pelo es un procedimiento particularmente importante y sensible para determinar la tumorogenicidad de un componente celular concreto. Los ratones sin pelo carecen de un sistema inmune celular funcional (es decir, no poseen CTL), y proporcionan por tanto un modelo in vivo útil en el que ensayar el potencial tumorogénico de las células. Las células no tumorogénicas normales no muestran propiedades de crecimiento no controladas si se infectan en ratones sin pelo. Sin embargo, las células transformadas proliferarán rápidamente y generarán tumores en ratones sin pelo. De manera resumida, en una forma de realización el constructo de vector de alfavirus se administra se administra a células de murino sigénico, seguido por la inyección en ratones sin pelo. Los ratones se examinan visualmente durante un periodo de 2 a 8 semanas tras la inyección con el fin de determinar el crecimiento del tumor. Se pueden sacrificar también los ratones y someterse a autopsia con el fin de determinar si están presentes los tumores. (Giovanella y col., J. Natl. Cancer Inst. 48: 1531-1533, 1972; Furesz y co., Abnormal Cells, New Products and Risk, Hopps y Petricciani (eds.). Tissue Culture Association, 1985; y Levenbook y col., J. Biol. Std. 13: 135-141, 1985.).
Se puede evaluar también la tumorogenicidad visualizando la formación de colonias en agar blando (Macpherson y Montagnier, Vir. 23 :291-294, 1964). De manera resumida, una propiedad de las células no tumorogénicas normales es la "inhibición por contacto" (es decir, células que detienen la proliferación cuando tocan las células adyacentes). Si se plaquean las células en medio de soporte de agar semisólido, las células normales entrarán rápidamente en contacto inhibiendo y deteniendo la proliferación, mientras que las células tumorogénicas continuarán proliferando y formando colonias en agar blando.
Se pueden utilizar también animales transgénicos, tales como ratones transgénicos, para evaluar la tumorogenicidad de un componente celular alterado. (Stewart y col., Cell 38: 627-637, 1984; Quaife y col., Cell 48: 1023-1034, 1987; y Koike y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 5615-5619, 1989.). En animales transgénicos, se puede expresar el gen de interés en todos los tejidos del animal. Esta expresión desregulada del transgen puede servir como modelo para el potencial tumorogénico del gen nuevamente introducido.
Si el componente celular alterado está asociado con la preparación de la célula tumorogénica, entonces es necesario preparar el componente celular alterado no tumorogénico. Por ejemplo, en una forma de realización, la secuencia o gen de interés que codifica el componente celular alterado está truncado con el fin de volver el producto génico no tumorogénico. El gen que codifica el componente celular alterado puede estar truncado en una variedad de tamaños, aunque es preferible retener tanto como sea posible el componente celular alterado. Además, es necesario que cualquier truncamiento deje intacta al menos algunas de las secuencias inmunogénicas del componente celular alterado. Alternativamente, se pueden introducir múltiples codones de terminación traduccionales en la dirección 3' de la región inmunogénica. La inserción de codones de terminación finalizará prematuramente la expresión de la proteína, evitando de esta manera la expresión de la porción transformante de la proteína.
En una forma de realización, el gen ras* está truncado con el fin de volver la proteína ras* no tumorogénica. De manera resumida, los aminoácidos carboxi-terminales de la funcionalidad ras* permiten a la proteína unirse a la membrana celular. El truncamiento de estas secuencias vuelve el componente celular alterado no tumorogénico. Preferiblemente, el gen ras* está truncado en el emplazamiento de unión al anillo de la purina, por ejemplo alrededor de la secuencia que codifica el aminoácido número 110. La secuencia del gen ras* que puede estar truncada de tal manera que sea tan pequeñas como de aproximadamente 20 aminoácido (que incluyen el(los) aminoácido(s) alterado(s))
que están codificados por el constructo de vector de alfavirus, aunque preferiblemente, deberían expresarse tantos aminoácidos como sea posible (manteniendo a la vez la tumorogenicidad).
En otra forma de realización de realización, la proteína p53* está modificada por truncamiento con el fin de volver el componente celular no tumorogénico. Tal como se ha señalado anteriormente, no todas las mutaciones de la proteína p53 son tumorogénicas, y por tanto, no todas las mutaciones tendrían que truncarse. Sin embargo, En una forma de realización preferida, p53* está truncado en una secuencia que codifica los aminoácidos 100 a 300, incluyendo por tanto los cuatro "puntos calientes" mayores.
Otros componentes celulares alterados que son oncogénicos pueden estar truncados con el fin de volverlos no tumorogénicos. Por ejemplo neu y bcr/abl pueden estar truncados con el fin de volverlos no tumorogénicos. Se puede confirmar la no tumorogenicidad ensayando el componente celular alterado truncado tal como se describe anteriormente.
Debería señalarse, sin embargo, que si el componente celular alterado está únicamente asociado con células no tumorogénicas en general, y no se requiere o es esencial para preparar la célula tumorogénica, entonces no es necesario volver el componente celular no tumorogénico. Los ejemplos representativos de dichos componentes celulares alterados que no son tumorogénicos incluyen Rb*, ubiquitina*, y mucina*.
Tal como se ha señalado anteriormente, con el fin de generar una respuesta inmune apropiada, el componente celular alterado debe ser también inmunogénico. La inmunogenicidad de una secuencia concreta es a menudo difícil de predecir, aunque los epitopos de las células T poseen a menudo un componente alfa hélice anfifático inmunogénico. En general, sin embargo, es preferible determinar la inmunogenicidad en un ensayo. Los ejemplos representativos incluyen un ELISA, que detecta la presencia de anticuerpos contra el vector nuevamente introducido, así como los ensayos que ensayan las células T auxiliares tales como loe ensayos del interferón gamma, los ensayos de producción de IL-2, y los ensayos de proliferación.
Tal como se ha señalado anteriormente, en otro aspecto de la presente divulgación, algunos componentes celulares alterados diferentes se pueden expresar simultáneamente con el fin de formar una terapéutica anticancerosa general. Generalmente, será evidente para una persona normalmente experta en la técnica que se pueden hacer una variedad de combinaciones. En las formas de realización de realización preferidas, se puede dirigir esta terapéutica a un tipo concreto de cáncer. Por ejemplo, casi todos los cánceres de colon poseen en los genes mutaciones en ras, p53, DCC, APC o MCC. Se puede administrar un constructo de vector de alfavirus que expresa simultáneamente numerosos de estos componentes celulares alterados a un paciente con cáncer de colon con el fin de tratar todas las mutaciones posibles. Se puede utilizar también esta metodología para tratar otros cánceres. De esta manera, se puede utilizar el constructo de vector de alfavirus que expresa simultáneamente la mucina*, ras*, neu, BRCA1* y p53* para tratar el cáncer de mama.
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(b) Antígenos derivados de organismos extraños u otros patógenos
En otros aspectos de la presente divulgación, se proporcionan constructos de vector de alfavirus que dirigen la expresión de porciones inmunogénicas de antígenos de organismos extraños u otros patógenos. Los ejemplos representativos de antígenos extraños incluyen antígenos bacterianos (por ejemplo, E. coli, estreptocócico, estafilocócico, micobacteriano, etc), antígenos fúngicos, antígeno parasíticos, y antígenos víricos (por ejemplo, virus de la gripe, Virus de la Inmunodeficiencia Humana ("VIH"), Virus de la Hepatitis A, B y C ("VHA", "VHB2" y "VHC", respectivamente. Virus del Papiloma Humano ("VPH"), Virus de Epstein-Barr/"VEB"), Virus del Herpes Simple ("VHS", virus Hanta, HTLV I, HTLV II y Citomegalovirus ("CMV"). Tal como se utiliza dentro del contexto de la presente divulgación, "porción inmunogénica" se refiere a una porción del antígeno respectivo que es capaz, en las condiciones apropiadas, de producir una respuesta inmune, es decir, mediada por células o humoral). "Porciones" puede ser de tamaño variable, pero tienen preferiblemente al menos 9 aminoácido de longitud, y pueden incluir el antígeno completo. Las respuestas inmunes mediadas por células pueden ser mediadas a través de la presentación del Complejo De Histocompatibilidad Mayor ("MHC") de Tipo I, la presentación de MHC de Tipo II, o ambos.
Dentro de un aspecto de la divulgación, se proporcionan constructos de vector de alfavirus que dirigen la expresión de porciones inmunogénicos de antígenos de la Hepatitis B. de manera resumida, el genoma de la Hepatitis B está comprendido por ADN circular de aproximadamente 3,3 kilobases de longitud y se ha caracterizado bien (Tiollais y col., Science 213: 406-411, 1981; Tiollais y col., Nature 317: 489-495, 1985; y Ganem y Varmus, Ann. Rev. Biochem. 56: 651-693, 1987; véanse también los documentos EP 0 278.940, EP 0 241.021, WO 88/10301, y las Patentes de los Estados Unidos N^{os}. 4.696.898 y 5.024.938).
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El virus de la Hepatitis B presenta algunos antígenos diferentes, que incluyen entre otros, tres antígenos HB "S" (HBsAg), un antígeno HBc (HBcAg), un antígeno HBe (HBeAg) u un antígeno HBx (HBxAg) (véase Blum y col., TIG 5(5): 154-158, 1989). De manera resumida, HBeAg es el resultado de la rotura proteolítica del intermedio pre-núcleo P22 y se secreta a partir de la célula. HBeAg se encuentra en el suero como una proteína de 17 kD. HBcAg es una proteína de 183 aminoácidos, y HBxAg es una proteína de 145 a 154 aminoácidos, dependiendo del subtipo.
Los HBsAg (designados "grande", "mediano" y "pequeño") están codificados por tres regiones del genoma de la Hepatitis B: S, pre-S2 y pre-S1. La proteína grande, que tiene una longitud que varía entre 389 y 400 aminoácidos, está codificada por las regiones pre-S1, pre-S2, y S, y se encuentra en las formas glicosilada y no glicosilada. La proteína mediana tiene 281 aminoácidos de longitud y está codificada por las regiones pre-S2 y S. la proteína pequeña tiene 226 aminoácidos de longitud y está codificada por la región S. Existe en dos formas, glicosilada (GP 27^{S}) y no glicosilada (P24^{S}). Si cada una de estas regiones se expresa separadamente, la región pre-S1 codificará una proteína de aproximadamente 119 aminoácidos, la región pre-S2 codificará una proteína de aproximadamente 55 aminoácidos, y la región S codificará una proteína de aproximadamente 226 aminoácidos.
Como será evidente por una persona normalmente experta en la técnica, se pueden combinar diversas porciones inmunogénicas de los antígenos S anteriormente descritos con el fin de inducir una respuesta inmune cuando se administran mediante uno de los constructos de vector descritos en el presente documento. Además, debido a la gran variabilidad inmunológica que se encuentra en diferentes regiones geográficas para el marco de lectura abierto S de VHB, se pueden preferir combinaciones concretas de antígenos para la administración en regiones geográficas concretas. De manera resumida, se definen los epitopos que se encuentran en todas las muestras S del virus de la hepatitis B humano como determinante "a". Se han identificado también, sin embargo, determinantes mutuamente exclusivos de subtipo mediante inmunodifusión doble bidimensional (Ouchterlony, Progr. Allergy 5:1, 1958). Se han designado estos determinante "d" o "y" y "w" o "r" (LeBouvier, J. Infect. 123: 671, 1971; Bancroft y col., J. Immunol. 109: 842, 1972; y Courouce y col., Bibl. Haematol. 42: 1-158, 1976). La variabilidad inmunológica es debida a las sustituciones de nucleótidos únicos en dos zonas del marco de lectura abierto S del virus de la hepatitis B, dando como resultado los siguientes cambios de aminoácidos: (1) intercambio de lisina-122 por arginina en el marco de lectura abierto S del virus de la hepatitis B que produce un cambio de subtipo de d a y, y (2) intercambio de arginin-160 por lisina que produce el cambio del subtipo r a w. En africanos, es predominante el subtipo ayw, mientras que en los estados unidos y Europa del Norte es más abundante el subtipo adw_{2} (Molecular Biology of the Hepatitis B Virus, McLachlan (ed.), CRC Press, 1991). Como será evidente para una persona normalmente experta en la técnica, se prefiere generalmente construir un vector para la administración que sea apropiado para el subtipo concreto de virus de la hepatitis B que es prevalente en la región geográfica de administración. Se pueden determinar los subtipos de una región concreta mediante inmunodifusión doble bidimensional o, preferiblemente, mediante secuenciación del marco de lectura abierto S del virus VHB aislado de individuos dentro de esta región.
Presentados también por VHB están los antígenos pol ("VHB pol"), ORF 5, y ORF 6. De manera resumida, el marco de lectura abierto de la polimerasa de VHB codifica la actividad de la transcriptasa inversa que se encuentra en viriones y partículas similares a núcleo en hígados infectados. La proteína polimerasa está constituida al menos por dos regiones. La región amino terminal que codifica la proteína que ceba la transcripción inversa, y la región carboxiterminal que codifica la actividad de la trancriptasa inversa y RNasa H. se pueden determinar las regiones inmunogénicas de VHB pol utilizando los procedimientos descritos en el presente documento (por ejemplo, a continuación y en los Ejemplos 12Aii y 13), utilizando los constructos de vector de alfavirus descritos a continuación, y administrados con el fin de generar una respuesta inmune en el interior de un animal de sangre caliente. Similarmente, se pueden expresar otros antígenos de VHB, tales como ORF 5 y ORF 6 (Miller y col., Hepatology 9: 322-327, 1989) utilizando los constructos de vector de alfavirus que se desvelan en el presente documento. Se muestran a continuación los ejemplos representativos de constructos de vector de alfavirus que utilizan ORF 5 y ORF 6 en los ejemplos.
Tal como se ha señalado anteriormente, al menos una porción inmunogénica de un antígeno de la hepatitis B se incorpora en un constructo de vector de alfavirus. La(s) porción(es) inmunogénica(s) que se incorporan en el constructo de vector de alfavirus puede(n) ser de longitud variable, aunque se prefiere generalmente que la porciones sean al menos de 9 aminoácidos de longitud y puedan incluir el antígeno completo. La inmunogenicidad de una secuencia concreta es a menudo difícil de predecir, aunque se pueden predecir los epitopos de las células T utilizando algoritmos informáticos tales como TSITES (MedImmune, Maryland), con el fin de escanear las regiones de codificación de los emplazamientos T auxiliares potenciales y los emplazamientos CTL. A partir de este análisis se sintetizan los péptidos y se usan como dianas como dianas en un ensayo citotóxico in vitro. Se pueden utilizar también, sin embargo, otros ensayos, que incluyen, por ejemplo, ELISA, que detecta la presencia de anticuerpos contra el vector nuevamente introducido, así como ensayos que ensayan las células T auxiliares, tales como los ensayos del interferón gamma, los ensayos de producción de IL-2 y los ensayos de proliferación.
Se pueden seleccionar también porciones inmunogénicas mediante otros procedimientos. Por ejemplo, se ha demostrado que el ratón transgénico HLA A2.1 es útil como modelo para el reconocimiento de antígenos víricos en las células T humanas. De manera resumida, en los sistemas víricos de la gripe y la hepatitis B, el repertorio de receptores de las células T de murino reconoce los mismos determinantes antigénicos reconocidos por las células T humanas. En ambos sistemas, la respuesta CTL generada en el ratón transgénico HLA A2.1 se dirige virtualmente hacia el mimo epitopo que la reconocida por los CTL humanos del haplotipo HLA A2.1 (Vitiello y col., J Exp. Med 173: 1007-1015, 1991; Vitiello y col., Abstract of Molecular Biology of Hepatitis B Virus Symposia, 1992).
Se pueden obtener las porciones inmunogénicas particularmente preferidas del virus de la hepatitis B en los constructos de vector de alfavirus que incluyen HBeAg, HBcAg y HBsAg, tal como se describe en mayor detalle a continuación en el Ejemplo 10.
Se pueden obtener porciones inmunogénicas adicionales del virus de la hepatitis B truncando la secuencia de codificación en diversas localizaciones que incluyen, por ejemplo, los siguientes emplazamientos: Bst UI, SspI, Ppu M1, y MspI (Valenzuela y col., Nature 280: 815-19, 1979; Valenzuela y col., Animal Virus Genetics: ICN/UCLA Symp. Mol. Cell Biol., 1980, B. N. Fields y R. Jaenisch (eds.), pp. 57-70, New York: Academic). Se describen también a continuación procedimientos adicionales para determinar las porciones inmunogénicas adecuadas así como los procedimientos en el contexto de la hepatitis C.
Tal como se ha señalado anteriormente, se puede incorporar más de una porción inmunogénica en el constructo de vector de alfavirus. Por ejemplo, un constructo de vector de alfavirus puede expresar (tanto separadamente como un constructo) todas o las porciones inmunogénicas de HBcAg, HBeAg, los HBsAg, HBxAg, así como las porciones inmunogénicas de los antígenos de VHC.
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7. Fuentes de secuencia heterólogas
Las secuencias que codifican las proteínas anteriormente descritas se pueden obtener fácilmente de una variedad de fuentes, que incluyen por ejemplo, depositantes tales como la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), o de fuentes comerciales tales como British Bio-Technology Limited (Cowley, Oxford, Inglaterra). Los ejemplos representativos incluyen BBG 12 (que contiene el gen GM-CSF que codifica la proteína madura de 127 aminoácidos); BBG 6 (que contiene las secuencias que codifican el interferón gamma), ATCC Nº 39656 (que contiene las secuencias que codifican TNF), ATCC Nº 20663 (que contiene las secuencias que codifican el interferón alfa), ATCC N^{os} 31902, 31902 y 39517 (que contienen las secuencias que codifican el interferón beta), ATCC Nº 67024 (que contiene una secuencia que codifica la Interleucina-1b); ATCC N^{os} 39405, 39452, 39516, 39626 y 39673 (que contienen las secuencias en codifican la Interleucina-2); ATCC N^{os} 59399, 59398 y 67326 (que contienen las secuencias que codifican la Interleucina-3); ATCC Nº 57592 (que contiene las secuencias que codifican la Interleucina-4), ATCC N^{os} 59394 y 59395 (que contienen las secuencias que codifican la Interleucina-5), y ATCC Nº 67153 (que contiene las secuencias que codifican la Interleucina-6).
Las secuencias que codifican los componentes celulares alterados que se desvelan anteriormente se pueden obtener fácilmente de una variedad de fuentes. Por ejemplo, los plásmidos que contienen las secuencias que codifican los productos celulares alterados se pueden obtener de un depositante tal como la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), o de fuentes comerciales tales como Advanced Biotechnologies (Columbia, Maryland). Los ejemplos representativos de plásmidos que contienen alguna de las secuencias anteriormente descritas incluyen ATCC Nº 41000 (que contiene una mutación de G a T en el codón 12º de ras) y ATCC Nº 41049 (que contiene una mutación de G a A en el codón 12º).
Alternativamente, los plásmidos que codifican componentes celulares normales se pueden obtener también de depositantes, tales como la ATCC (véase, por ejemplo, ATCC Nº 41001, que contiene una secuencia que codifica la proteína ras normal; ATCC Nº 57103, que codifica abl, ATCC N^{os} 59120 o 59121, que codifica el locus bcr) y mutarse para formar el componente celular alterado. Los procedimientos para mutagenizar emplazamientos concretos se pueden llevar a cabo fácilmente usando procedimientos conocidos en la técnica (véase Sambrook y col., más arriba, 15.3 y sig.). En concreto, se pueden llevar fácilmente a cabo mutaciones puntuales de componentes celulares normales tales como ras, mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento del codón concreto, por ejemplo, los codones 12, 13 ó 61.
Las secuencias que codifican los antígenos víricos anteriormente descritos pueden igualmente obtenerse de una variedad de fuentes. Por ejemplo, los genomas clonados molecularmente que codifican el virus de la hepatitis B se pueden obtener de fuentes tales como la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland). Por ejemplo, ATCC Nº 45020 contiene el ADN genómico total de la hepatitis B (extraído de partículas Dane modificadas) (véase la Figura 3 de Blum y coll., TIG 5(5): 154-158, 1989) en el emplazamiento BamHI de pBR322 (Moriarty y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 78: 2606-2610, 1981).
Alternativamente, las secuencias de ADNc que codifican las secuencias heterólogas anteriormente descritas se pueden obtener de células que expresan o contienen las secuencias. De manera resumida, En una forma de realización, el ARNm de una célula que expresa el gen de interés se transcribe de manera inversa con la transcriptasa inversa usando el oligonucleótido dT o cebadores aleatorios. A continuación, se puede amplificar el ADNc de cadena única mediante la PCR (véanse las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.683.202; 4.683.195 y 4.800.159. Véase también PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich (ed.), Stockton Press, 1989) que utiliza cebadores de oligonucleótidos complementarios con las secuencias sobre cualquier lado de las secuencias deseadas. En concreto, un ADN de doble cadena se desnaturaliza calentando en presencia de la polimerasa Taq térmicamente estable, los cebadores de ADN específicos de secuencia, dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Se produce ADN de doble cadena cuando finaliza la síntesis. Este ciclo se puede repetir muchas veces, dando como resultado una amplificación factorial del ADN deseado.
Se pueden sintetizar también las secuencias que codifican las proteínas descritas anteriormente, por ejemplo, en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems Inc. (por ejemplo, sintetizador de ADN de APB modelo 392 (Foster City, CA)).
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F. Sistemas de iniciación de vector eucariota en capas
Tal como se ha señalado anteriormente, se desvelan también en el presente documento los sistemas de iniciación de vector eucariota en capas, que están comprendidos por un promotor 5', un constructo (por ejemplo, un constructo de vector de alfavirus) que es capaz de expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga que es capaz de replicación en una célula tanto de manera autónoma como en respuesta a uno o más factores, y una secuencia de terminación de la transcripción. De manera resumida, los sistemas de iniciación de vector eucariota en capas proporcionan un mecanismo en dos etapas o "en capa" que controla la expresión de las secuencias de nucleótidos heterólogas. La primera capa inicia la transcripción de la segunda capa, y comprende un promotor 5', el emplazamiento de terminación de la transcripción, así como, si se desea, uno o más emplazamientos de corte y empalme y un emplazamiento de poliadenilación. Los ejemplos representativos de promotores adecuados para el uso a este respecto incluyen cualquiera de los promotores víricos o celulares tales como CMV, los LTR retrovíricos, SV40, \beta-actina, los promotores de la inmunoglobulina, y los promotores inducibles tales como el promotor de la metalotioneína y el promotor glucocorticoide. La segunda capa comprende un constructo que es capaz de expresar una o más secuencias de nucleótidos heterólogas, y de replicación en una célula tanto de manera autónoma como en respuesta de uno o más factores. En una forma de realización de la divulgación, el constructo puede ser un constructo de vector de ADNc de Sindbis tal como se describe anteriormente.
Se puede utilizar también una amplia variedad de otros constructos de vector de ADNc y ADN en los sistemas de iniciación de vector eucariota en capas que incluyen, por ejemplo, constructos de vectores víricos desarrollados a partir de poliovirus (Evans y col., Nature 339: 385-388, 1989; y Sabin, J. Biol. Standardization 1:115-118, 1973); rinovirus; poxvirus, tales como el virus del canario o el virus de vaccinia (Fisher-Hoch y col., PNAS 86: 317-321, 1989; Flexner y col., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner y col., Vaccine 8: 17-21, 1990; Patentes de los Estados Unidos N^{os}. 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; documento WO 89/01973); SV40 (Mulligan y col., Nature 277: 108-114, 1979); retrovirus (Patente de los Estados Unidos Nº. 4.777.127, documentos GB 2.200.651, EP 0.345.242 y WO 91/02805); virus de la gripe (Luytjes y col., Cell 59: 1107-1113, 1989; McMicheal y col., N. Eng. J. Med. 309: 13-17, 1983; y Yap y col., Nature 273:238-239, 1978); adenovirus (Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld y col., Science 252: 431-434, 1991); parvovirus tales como los virus adeno asociados (Samulski y col., J Vir. 63: 3822-3828, 1989; Mendelson y col., Virol. 166: 154-165, 1988; PA 7/222,684); herpes (Kit, Adv. Exp. Med. Biol. 215: 219-236, 1989); SV40; VIH (Poznansky, J. Virol. 65: 532-536, 1991); sarampión (documento EP 0.440.219); astrovirus (Munroe y coll., J. Vir. 67: 3611-3614, 1993); Virus del Bosque Semliki, y coronavirus, así como otros sistemas víricos (por ejemplo, documentos EP 0.440.219; WO 92/06693; Patente de los Estados Unidos Nº. 5.166.057).
Tal como se ha señalado anteriormente, En otras formas de realización de la divulgación, se desvelan sistemas de iniciación de vector eucariota en capas que comprenden una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción in vitro de un alfavirus en un extremo 5' auténtico, una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un virus de alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales de alfavirus, una región de unión vírica, una secuencia de nucleótidos heteróloga, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de alfavirus, y una secuencia poliadenilada. Tras la transcripción in vitro de un constructo de vector de ADNc de alfavirus, la molécula de vector de ARN de alfavirus resultante está comprendida por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales de alfavirus, una región de unión vírica, una secuencia de nucleótidos heteróloga, un alfavirus, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa, y una secuencia poliadenilada.
En otros aspectos de la presente divulgación se desvelan los procedimientos para liberar una secuencia de nucleótidos heteróloga en un animal de sangre caliente, que comprende la etapa de administrar un sistema de iniciación de vector eucariota en capas a un animal de sangre caliente. Se pueden administrar los sistemas de iniciación de vector eucariota en capas a animales de sangre caliente tanto directamente (por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, oral, rectal, intraocular, intranasal), como mediante diversos procedimientos físicos tales como lipofección (Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84: 7413-7417, 1989), inyección directa de ADN (Acsadi y col., Nature 352:815-818. 1991); bombardeo de microproyectiles (Williams y col., PNAS 88: 2726-2730, 1991); liposomas de diversos tipos (véase, por ejemplo, Wang y col., PNAS 84: 7851-7855, 1987); CaPO_{4} (Dubensky y col., PNAS 81: 7529-7533, 1984); ligando de DNA (Wu y col, J. of Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989); administración de ácidos nucleico sólo (documento WO 90/11092); o administración de ADN unido a adenovirus inductor de muerte (Curiel y col., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992); compuestos de policatión tales como polilisina, ligandos específicos de receptor; así como virus inactivados con psoraleno tales como Sendai o Adenovirus.
Se pueden administrar los sistema de iniciación de vector eucariota en capas a un animal de sangre caliente para los objetivos de estimular una respuesta inmune específica; inhibir la interacción de un agente con un receptor celular del huésped, expresar un paliativo tóxico, incluyendo por ejemplo, paliativos tóxicos condicionales; regular inmunológicamente un sistema inmune; expresar marcadores, y para la terapia génica de sustitución. Estos y otros usos se desvelan con más detalle a continuación.
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G. Líneas celulares que empaquetan Sindbis
En otras formas de realización adicionales de la divulgación, se desvelan líneas celulares que empaquetan el alfavirus. En concreto, dentro de un aspecto de la presente divulgación se desvelan líneas celulares que empaquetan el alfavirus en las que las proteínas estructurales víricas se suministran en trans procedentes de un vector de expresión integrado de manera estable. La transfección o infección posterior de los transcriptos de ARN de vector de alfavirus crea una línea celular que produce el vector de alfavirus. Por ejemplo, en una forma de realización de la divulgación, las moléculas de vector de ARN de alfavirus se producen inicialmente usando un sistema de ARN polimerasa T6 in vitro para transcribir a partir de un clon de ADNc que codifica el gen de interés y las proteínas no estructurales de alfavirus. A continuación se puede transfectar el ARN del vector en una línea celular que empaqueta el alfavirus, en la que los transcriptos de ARN del vector se replican a altos niveles, y se empaquetan posteriormente mediante las proteínas estructurales víricas, dando como resultado partículas víricas infecciosas. Por la naturaleza de la longitud extendida de la molécula de ADNc del alfavirus, el proceso de transcripción in vitro es ineficiente. Además, sólo el 1%-10% de las células contenidas en una placa petri se pueden transfectar satisfactoriamente. En consecuencia, para optimizar el rendimiento y el título de la línea celular productora del vector, se pueden llevar a cabo dos ciclos sucesivos de transferencia génica. Para llevar a cabo esto, se puede transfectar en primer lugar el vector en una línea celular primaria que empaqueta el alfavirus. Esta línea celular transfectada produce a continuación títulos bajos de partículas víricas infecciosas en los sobrenadantes del cultivo. Estos sobrenadantes infecciosos se usan a continuación para transducir una monocapa fresca de células que empaquetan el alfavirus. Se prefiere la infección del vector de alfavirus en la línea celular de empaquetado sobre la transfección debido a su mayor eficiencia de transferencia de ARN en las células y a la colocación biológica optimizada del vector en la célula. Esta solución en dos etapas conduce a una mayor expresión y título mayor del vector Sindbis recombinante infeccioso empaquetado.
Dentro de algunas formas de realización de la divulgación, las partículas de alfavirus pueden fracasar en transducir la misma línea celular de empaquetado debido a que la línea celular produce un aumento en las proteínas de la envoltura celular que bloquean los receptores celulares para la unión del vector de alfavirus. En dichos casos, se puede crear un segundo tipo de partícula vírica de alfavirus que es capaz de infectar las células que empaquetan el alfavirus. Este segundo tipo de partícula vírica debe producirse mediante una línea celular de empaquetado conocida como "línea celular de salto", que produce partículas de vector transitoria como resultado de transfectarse con transcriptos de vector de ARN de alfavirus transcritas in vitro. Esta línea celular de salto se diseña mediante ingeniería genética para redirigir el tropismo de la envoltura de la partícula de vector producida transitoriamente proporcionando proteínas de envoltura vírica alternativas que redirige los vectores de alfavirus hacia diferentes receptores celulares en un proceso denominado pseudotipificación. Actualmente, se han concebido dos soluciones para la pseudotipificación de partículas de vector de alfavirus. La primera solución está constituida por una línea celular que empaqueta alfavirus (descrita anteriormente) que expresa simultáneamente la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G). Se ha demostrado que la pseudotipificación de VSV-G infecta una amplia variedad de tipos celulares (Marsh, Adv. Virus Res. 36: 107-151, 1989). La segunda solución para producir una partícula de vector de alfavirus pesudotipificada es utilizar líneas celulares de empaquetado retrovírico (por ejemplo, documento WO 92/05266) que contienen secuencias gag/pol y env retrovíricas que son capaces de empaquetar un vector de ARN de alfavirus que contiene una secuencia de empaquetado retrovírico.
En otros aspectos de la presente divulgación, se usan vectores de expresión de ADN de alfavirus integrado de manera estable par producir la molécula de ARN de vector de alfavirus que mantiene la capacidad de autoreplicarse. Esta solución puede probarse útil para mantener altos niveles de expresión durante largos periodos de cultivo debido a que el vector de ADN integrado expresará constitutivamente vectores de ARN no alterado. En esta configuración, los vectores anteriormente transcritos a partir de un plásmido que contiene el emplazamiento de reconocimiento de la ARN polimerasa SP6 se sustituyen con la secuencia del promotor apropiado definida por la línea celular parental usada. Esta secuencia de plásmido puede contener también un marcador seleccionable diferente de los usados para crear la línea celular de empaquetado. En esta configuración, los vectores de alfavirus basados en ADN se introducen mediante transfección en la línea celular de empaquetado, tal como se ha descrito anteriormente seguido por la clonación por dilución para encontrar las líneas celulares que producen títulos más elevados.
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1. Vector suicida
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a la expresión de vectores suicida de alfavirus para evitar la diseminación de alfavirus de tipo natural en las líneas celulares de empaquetado/productoras. De manera resumida, En una forma de realización el vector suicida de alfavirus comprendería una secuencia de ribozima o de sentido contrario, específica de la secuencia de alfavirus de tipo natural generada a partir de un episodio de recombinación del ARN entre las secuencias 3' de la región de unión del vector, y las secuencias estructurales 5' del alfavirus del vector de expresión de la línea celular de empaquetado. La molécula de ribozima o de sentido contrario sería únicamente termoestable en presencia de la secuencia de recombinación específica y no tendría ningún otro efecto en la línea celular de empaquetado/productora de alfavirus. Alternativamente, se puede expresar también una molécula tóxica (tal como la descrita a continuación) en el contexto de un vector que se expresaría únicamente en presencia del alfavirus de tipo natural.
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2. Vectores de alfavirus para evitar la diseminación de tumores metastásicos
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere al uso de vectores de alfavirus para inhibir o reducir la invasividad de los neoplasmas malignos. De manera resumida, la extensión de la neoplasia maligna se refiere normalmente a la vascularización del tumor. Una causa de la vascularización del tumor es la producción de factores de angiogénesis tumoral solubles (TAF) (Paweletz y col., Crit. Rev. Oncol. Hematol 9: 197, 1989) expresados por algunos tumores. Dentro de un aspecto de la presente divulgación, se puede ralentizar la vascularización del tumor usando vectores de alfavirus para expresar las moléculas de ARN de ribozima o de sentido contrario específicas de TAF. Alternativamente, se pueden expresar factores anti-angiogénesis (Moses y col., Science 248: 1408, 1990; Shapiro y col., PNAS 84: 2238, 1987) tanto sólo como en combinación con la ribozimas o secuencias de sentido contrario anteriormente descritas con el fin de ralentizar o inhibir la vascularización del tumor. Alternativamente, se pueden usar también vectores de alfavirus para expresar un anticuerpo específico de los receptores TAF o los tejidos que los rodean.
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H. Procedimientos para utilizar vectores de alfavirus 1. Inmunoestimulación
En otros aspectos de la presente divulgación, se proporcionan composiciones y procedimientos para administrar un constructo de vector de alfavirus que sea capaz de evitar, inhibir, estabilizar, o revertir enfermedades infecciosas, cancerosas, autoinmunes o inmunes. Los ejemplos representativos de dichas enfermedades incluyen infecciones víricas tales como VIH; VHB, HTLV I, HTLV II, CMV, VEB y VPH, melanomas, diabetes, injerto frente a enfermedad del huésped, enfermedad de Alzheimer y enfermedad cardíaca.
Más específicamente, dentro de un aspecto de la presente divulgación, se proporcionan composiciones y procedimientos para estimular una respuesta inmune (tanto humoral como mediada por células) a un agente patogénico, de tal manera que el agente patogénico sea tanto muerto como inhibido. Los ejemplos representativos de agentes patogénicos incluyen bacterias, hongos, parásitos, virus y células cancerosas.
En una forma de realización de la divulgación el agente patogénico es un virus, y se desvelan los procedimientos para estimular una respuesta inmune específica e inhibir la diseminación vírica usando partículas víricas de alfavirus recombinante diseñadas para liberar un constructo de vector que dirige la expresión de un antígeno o su forma modificada en células diana susceptibles capaces tanto de (1) iniciar una respuesta inmune a un antígeno vírico como (2) evitar la diseminación vírica mediante los receptores celulares ocupantes requeridos para las interacciones víricas. La expresión de la proteína codificada por el ácido nucleico del vector puede ser transitoria o estable con el tiempo. Cuando se va a estimular una respuesta inmune a un antígeno patogénico, el alfavirus recombinante se diseña preferiblemente para expresar una forma modificada del antígeno que estimulará una respuesta inmune y que tiene patogenicidad reducida con respecto al antígeno natural. Se consigue esta respuesta inmune cuando las células presentan antígenos en la manera correcta, es decir, en el contexto de las moléculas MHC de tipo I y/o II junto con moléculas accesorias tales como CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, o sus análogos (por ejemplo., Altmann y col., Nature 338:512, 1989). Se espera que las células infectadas con Vectors de alfavirus hagan esto eficazmente porque imitan estrechamente una infección vírica genuina y porque: (a) son capaces de infectar células no replicantes, (b) no se integran en el genoma celular del huésped, (c) no se asocian con ninguna enfermedad que amenaza la vida, y (d) expresan altos niveles de proteínas heterólogas. Debido a estas diferencias, puede pensarse fácilmente en los vectores de alfavirus como vectores víricos seguros que se pueden usar sobre individuos sanos para uso de vacunas.
Este aspecto de la divulgación tiene una ventaja adicional sobre otros sistemas que puede esperarse que funcionen de una manera similar, en que las células presentadoras son completamente viables y sanas y se expresan bajos niveles de antígenos víricos, con respecto a los genes heterólogos. Esto presenta una ventaja distinta debido a que los epitopos antigénicos expresados se pueden alterar mediante clonación selectiva de subfragmentos del gen para el antígeno en el alfavirus recombinante, conduciendo a respuestas contra los epitopos inmunogénicos que pueden de otra manera empequeñecerse mediante epitopos inmunodominantes. Dicha solución se puede extender a la expresión de un péptido que tiene múltiples epitopos, estando uno o más de los epitopos derivados de proteínas diferentes. Además, este aspecto de la divulgación permite la estimulación eficiente de los linfocitos T citotóxicos (CTL) dirigida contra los epitopos antigénicos, y los fragmentos de péptidos de los antígenos codificados por los subfragmentos de genes, mediante la síntesis y asociación intracelular de estos fragmentos de péptidos con moléculas MHC de Tipo I. Se puede utilizar esta solución para mapear los epitopos inmunodominantes mayores para la inducción de CTL. Se puede conseguir también una respuesta inmune transfiriendo a una célula inmune apropiada (tal como un linfocito T) el gen del receptor específico de las células T que reconoce el antígeno de interés (en el contexto de una molécula MHC apropiada si es necesario), de una inmunoglobulina que reconoce el antígeno de interés, o de un híbrido de los dos que proporcionan una respuesta CTL en ausencia del contexto MHC: de esta manera, se pueden usar células infectadas con alfavirus recombinante como inmunoestimulante, inmunomodulador, o vacuna.
En otra forma de realización de la divulgación, se desvelan los procedimientos para producir paliativos inhibidores en los que los vectores de alfavirus liberan y expresan proteínas estructurales víricas interferentes defectivas, que inhiben el ensamblaje vírico, dichos vectores pueden codificar gag, pol, env defectivos u otras proteínas o péptidos de partículas víricas, y estos inhibirían de manera dominante el ensamblaje de las partículas víricas. Esto se produce debido a que a la interacción de subunidades normales de la partícula vírica está perturbado por la interacción con las subunidades defectivas.
En otra forma de realización de la divulgación, se desvelan los procedimientos para la expresión de la inhibición de los péptidos o proteínas específicos de la proteasa vírica. De manera resumida, la proteasa vírica rompe las proteínas gag y gag/pol víricas en numerosos péptidos más pequeños. El fracaso de esta rotura en todos los casos conduce a la inhibición completa de la producción de partículas retrovíricas infecciosas. Como ejemplo, se sabe que la proteasa de VIH es un aspartil proteasa y se sabe que ésta se inhibe por los péptidos preparados a partir de los aminoácidos de la proteína o los análogos. Los vectores para inhibir VIH expresarán una o múltiples copias fusionadas de dichos inhibidores péptidos.
Otra forma de realización implica la liberación de genes supresores que, cuando se borran, mutan o no se expresan en un tipo celular, conducen a la tumorogénesis en este tipo celular: La reintroducción del gen borrado por medio de un vector vírico conduce a la regresión del fenotipo del tumor en estas células. Los ejemplos de dichos cánceres son retinoblastoma y Tumor de Wilms. Debido a que las neoplasias malignas se pueden considerar que son una inhibición de la diferenciación celular terminal en comparación con el crecimiento celular, la liberación del vector de alfavirus y la expresión de los productos génicos que conducen a la diferenciación de un tumor, deberían también, en general, conducir a la regresión.
En otra forma más de realización, el vector de alfavirus proporciona un efecto terapéutico codificando una ribozima (una enzima de ARN) (Haseloff y Gerlach, Nature 334: 585, 1989) que romperá e inactivará por tanto las moléculas de ARN que corresponden a una función patogénica. Debido a que las ribozimas funcionan reconociendo una secuencia específica en el ARN diana y esta secuencia es normalmente de 12 a 17 pb, esto permite el reconocimiento específico de una especie de ARN concreta tal como un ARN o un genoma retrovírico. Se puede conseguir especificidad adicional en algunos casos teniendo ésta un paliativo tóxico condicional.
Un medio para aumentar la efectividad de los paliativos inhibidores es expresar los genes inhibidores víricos en conjunción con la expresión de los genes que aumentan la probabilidad de infección de la célula resistente por el virus en cuestión. El resultado es un episodio "final con muerte" que competería para los episodios de infección productiva. En el caso específico de VIH, se pueden liberar vectores que inhiben la replicación de VIH (expresando tat de sentido contrario, etc, tal como se describe anteriormente) y también sobreexpresando las proteínas requeridas para la infección, tales como CD4. De esta manera, un número relativamente pequeño de células resistentes a VIH infectadas con el vector actúan como un "colector" o "imán" de los múltiples episodios de fusión no productivos con virus libres o células infectadas víricamente.
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2. Agentes de bloqueo
Muchas enfermedades infecciosas, cánceres, enfermedades autoinmunes, y otras enfermedades implican la interacción de partículas víricas con células, células con células, o células con factores. En las infecciones víricas, los virus entran en las células mediante receptores sobre la superficie de células susceptibles. En los cánceres, las células pueden responder inapropiadamente o no a todas las señales de otras células o factores. En la enfermedad autoinmune, hay un reconocimiento inapropiado de "automarcadores". Dentro de la presente divulgación, dichas interacciones pueden estar bloqueadas produciendo, in vivo, un análogo a cualquiera de los compañeros en una interacción.
Se puede producir esta acción de bloqueo intracelularmente, en la membrana celular, o extracelularmente. La acción de bloqueo de un virus o, en concreto, un vector de alfavirus que transporta un gen de un agente de bloqueo, se puede mediar tanto desde el interior de una célula susceptible como secretando una versión de, la proteína de bloqueo para bloquear localmente la interacción patogénica.
En el caso de VIH, los dos agentes de interacción son la proteína de envoltura gp 120/gp 41 y la molécula del receptor CD4. De esta manera un bloqueante apropiado sería un constructo de vector que expresara cualquiera de un análogo env de VIH que bloquea la entrada de VIH sin producir efectos patogénicos, o un análogo del receptor CD4. El análogo de CD4 se secretaría y funcionaría para proteger las células adyacentes, mientras que gp 120/gp 41 se secreta o produce sólo intracelularmente de tal manera que protege únicamente la célula que contiene el vector. Puede ser ventajoso añadir cadenas pesadas de inmunoglobulina humana u otros componentes a CD4 con el fin de potenciar la estabilidad o complementar la lisis. La liberación de un vector de alfavirus que codifica dicho CD4 soluble-híbrido en un huésped da como resultado un suministro continuo de una molécula híbrida estable. Se puede ensayar la eficacia del tratamiento midiendo los indicadores normales de progresión de la enfermedad, que incluyen el nivel de anticuerpos, la producción de antígeno vírico, los niveles de VIH infeccioso, o los niveles de infecciones no específicas.
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3. Expresión de paliativos
Se pueden usar técnicas similares a las descritas anteriormente para producir alfavirus recombinante con constructos de vector que dirija la expresión de un agente (o "paliativo") que sea capaz de inhibir una función de un agente o gen patogénico. Dentro de la presente divulgación, "capaz de inhibir una función" significa que el paliativo inhibe tanto directa como indirectamente la función, esto es, por ejemplo, convirtiendo un agente presente en las células de uno que no inhibiría normalmente una función del agente patogénico en uno que sí. Los ejemplos de dichas funciones para las enfermedades víricas incluyen la adsorción, la replicación, la expresión génica, el ensamblaje, y la salida del virus de las células infectadas. Los ejemplos de dichas funciones para una célula cancerosa o factor de crecimiento que promueve el cáncer incluyen la viabilidad, la replicación celular, susceptibilidad alterada a señales externas (por ejemplo, la inhibición por contacto) y la ausencia de producción de formas mutadas de proteínas anti-oncogénicas.
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(a) Paliativos inhibidores
En un aspecto de la presente divulgación, el constructo de vector de alfavirus dirige la expresión de un gen que puede interferir con una función de un agente patogénico, por ejemplo, en enfermedades víricas o malignas. Dicha expresión puede ser tanto esencialmente continua como en respuesta de la presencia en la célula de otro agente asociado tanto con la dolencia patogénica como con un tipo celular específico (un "agente de identificación"). Además, se puede controlar la liberación del vector dirigiendo la entrada del vector específicamente en el tipo celular deseado (por ejemplo, una célula maligna o víricamente infectada) tal como se describe anteriormente.
Un procedimiento de administración es la leucoforesis, en la que aproximadamente el 20% de un PBL individual se retira en un momento cualquiera y se manipula in vitro. De esta manera, se pueden tratar y sustituir aproximadamente 2 x 10^{9} células. Se pueden llevar a cabo también tratamientos repetidos. Alternativamente, se puede tratar la médula ósea y permitir amplificar el efecto tal como se describe anteriormente. Además, se pueden inyectar directamente en un sujeto líneas celulares de empaquetado que producen un vector, permitiendo la producción continua de viriones recombinantes.
En una forma de realización, Se pueden usar vectores de alfavirus que expresan ARN complementario para los transcriptos génicos patogénicos clave (por ejemplo, un producto génico vírico o un oncogen celular activado) para inhibir la traducción de este transcripto en la proteína, tal como la inhibición de la traducción de la proteína tat de VIH. Debido a que la expresión de esta proteína es esencial para la replicación vírica, las células que contienen el vector deberían ser resistentes a la replicación de VIH.
En una segunda forma de realización, en la que el agente patogénico es un virus de cadena única que tiene una señal de empaquetado, se expresa el ARN complementario con la señal de empaquetado vírica (por ejemplo, una señal de empaquetado de VIH cuando el paliativo se dirige contra VIH), de tal manera que la asociación de estas moléculas con la señal de empaquetado vírica, en el caso de los retrovirus inhibe la formación del talo y bucle o la unión con el cebador de ARNt requerida para la encapsidación o replicación apropiadas del genoma de ARN de alfavirus.
En una tercera forma de realización, se puede introducir un vector de alfavirus que exprese un paliativo capaz de inhibir selectivamente la expresión de un gen patogénico, o un paliativo capaz de inhibir la actividad de una proteína producida por el agente patogénico. En el caso de VIH, un ejemplo es una proteína tat mutante que carece de la capacidad de transactivar la expresión del LTR de VIH e interfiere (de una manera transdominante) con el funcionamiento normal de la proteína tat. Se ha identificado dicho mutante de la proteína tat de HTLV II (mutante "XII Leu^{5}"; véase Wachsman y col., Science 235: 674, 1987). Un mutante transrepresor que debería inhibir la replicación tanto como se ha mostrado para un represor mutante análogo en el VHS-1 (Friedmann y col., Nature 335: 452, 1988).
Se puede seleccionar dicha proteína represora transcripcional para un cultivo de tejido usando cualquier promotor transcripcional específico vírico cuya expresión esté estimulada por una proteína transactivadora específica de virus (tal como se describe anteriormente). En el caso específico de VIH, una línea celular que expresa la proteína tat de VIH y el gen HSVTK impulsado por el promotor de VIH desaparecerá en presencia de ACV. Sin embargo, si una serie de genes tat mutados se introducen en el sistema, un mutante con las propiedades apropiadas (es decir, reprimir la transcripción a partir del promotor de VIH en presencia de tat de tipo natural) crecerá y se seleccionará. El gen mutante puede, a continuación, volver a aislarse a partir de estas células. Se puede usar una línea celular que contenga múltiples copias del sistema vector/tat condicionalmente letal para asegurar que los clones celulares que sobreviven no se producen mediante mutaciones endógenas en estos genes. A continuación se introduce una batería de genes tat aleatoriamente mutagenizados usando un vector de alfavirus "rescatable" (es decir, uno que expresa la proteína tat mutante y que contiene un origen bacteriano de replicación y un marcador de la resistencia a fármacos para el crecimiento y la selección en la bcteria). Esto permite evaluar un gran número de mutaciones aleatorias y permite una fácil clonación molecular posterior de la línea celular mutante deseada. Se puede usar este procedimiento para identificar y utilizar las mutaciones en una variedad de sistemas de activador/promotor vírico transcripcional vírico para terapias antivíricas potenciales.
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4. Paliativos tóxicos condicionales
Otra solución para inhibir un agente patogénico es expresar un paliativo que sea tóxico para la célula que expresa la dolencia patogénica. En este caso, la expresión del paliativo a partir del vector debería estar limitada por la presencia de una entidad asociada con el agente patogénico, tal como una secuencia de ARN vírico específica que identifica el estado patogénico, con el fin de evitar la destrucción de células no patogénicas.
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En una forma de realización de este procedimiento, un vector de alfavirus recombinante transporta un constructo de vector que contiene un gen tóxico (tal como se describe anteriormente) expresado a partir de un vector responsable específico de célula. De esta manera, las células que se replican rápidamente, que contienen secuencias de ARN capaces de activar los vectores responsables específicos de célula, se destruyen preferentemente por el agente citotóxico producido por el constructo de vector de alfavirus.
De una manera similar a la forma de realización anterior, el constructo de vector de alfavirus puede transportar un gen para la fosforilación, fosforibosilación, ribosilación, u otro metabolismo de un fármaco basado en purina o pirimidina. Este gen puede no tener equivalente en células de mamíferos y puede provenir de organismos tales como virus, bacterias, hongos, o protozoos. Un ejemplo de esto sería el producto génico de la guanina fosforibosil transferasa de E. coli , que es letal en presencia de tioxantina (véase Besnard y col., Mol. Cell. Biol. 7: 4139-4141, 1987). Los productos génicos condicionalmente letales podrían también metabolizar un fármaco no tóxico que no sea un análogo de purina o pirimidina a una forma citotóxica (véase Searle y col., Brit. J Cancer 53: 377-384, 1986). Los virus de mamíferos en general tienden a tener genes "tempranos inmediatos" que son necesarios para la activación transcripcional posterior de oros elementos promotores víricos. Las secuencias de ARN de esta naturaleza con candidatos excelentes para la activación de las señales intracelulares de vectores de alfavirus (o "agentes de identificación") de la infección vírica. De esta manera, los genes condicionalmente letales de los vectores específicos de células de alfavirus responsables de estos productos génicos ``tempranos inmediatos víricos matarían específicamente las células infectadas con cualquier virus concreto. Adicionalmente, debido a que los elemento promotores del interferón \alpha y \beta humano están trancripcionalmente activados en respuesta a la infección mediante una amplia variedad de virus no relacionados, la introducción de vectores que expresan un producto génico condicionalmente letal de tipo HSVTK, por ejemplo, en respuesta a la produc-
ción de interferón daría como resultado la destrucción de las células infectadas con una variedad de virus diferentes.
En otro aspecto de la presente divulgación, el vector vírico de alfavirus recombinante transporta un constructo de vector que dirige la expresión de un producto génico capaz de activar o inactivar de otra manera el precursor en un inhibidor activo del agente patogénico. Por ejemplo, se puede usar el producto génico HSVTK para metabolizar más efectivamente análogos de nucleósidos potencialmente antivíricos tales como AZT o ddC. El gen HSVTK se puede expresar bajo el control de un vector responsable específico de célula e introducirse en estos tipos celulares. AZT (y otros antivíricos nucleósidos) deben metabolizarse mediante mecanismos celulares en forma del nucleótido trifosfato con el fin de inhibir específicamente la transcriptasa inversa retrovírica, y de esta manera, la replicación de VIH (Furmam y col., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 83: 8333-8337, 1986). La expresión constitutiva de HSVTK (un nucleósido y la nucleósido quinasa con una especificidad por el sustrato muy amplia) da como resultado un metabolismo más efectivo de estos fármacos, toxicidad menos generalizada y mayor potencia contra la infección productiva. Los análogos de nucleósido adicionales, cuyas formas de nucleótido trifosfato muestran selectividad por la transcriptasa inversa retrovírica pero, como resultado de la especificidad por el sustrato del nucleósido celular, y las nucleótido quinasas que no están fosforiladas, se prepararán más eficazmente.
La administración de estos vectores de alfavirus en células T humanas y líneas celulares de macrófagos/monocitos puede aumentar su resistencia a VIH en presencia de AZT y ddC en comparación a las mismas células sin tratamiento del vector retrovírico.
El tratamiento con AZT podría ser a niveles inferiores al normal para evitar efectos secundarios tóxicos pero inhibir aún de manera eficiente la diseminación de VIH. El curso del tratamiento sería tal como se describe para el bloqueante.
En una forma de realización, el vector de alfavirus recombinante que transporta un gen que especifica un producto que no es en sí mismo tóxico, cuando se procesa o modifica por una proteína tal como una proteasa específica de un patógeno vírico u otro, se convierte en una forma tóxica. Por ejemplo, el alfavirus recombinante transportaría un gen que codifica una proproteína de la cadena A de ricino, que se vuelve tóxico tras el procesamiento por la proteasa de VIH. Más específicamente, una forma de proproteína inactiva sintética de la toxina ricina o de las cadenas de difteria A se rompería en la forma activa disponiendo que la proteasa codificada víricamente por VIH reconozca y elimine por rotura un elemento "pro" apropiado.
En otra forma de realización, el constructo de alfavirus puede expresar un "producto indicador" en la superficie de las células diana en respuesta a la presencia de un agente de identificación en las células (tal como la expresión de un gen vírico). Esta proteína superficial puede ser reconocida por un agente citotóxico, tal como anticuerpos de la proteína indicadora, o mediante células T citotóxicas. De una manera similar, se puede usar dicho sistema como sistema de detección (véase a continuación) para identificar de manera simple aquellas células que tienen un gen concreto que expresa una proteína de identificación.
Similarmente, en otra forma de realización, una proteína superficial expresaría que podría ser por sí misma terapéuticamente beneficiosa, En el caso concreto de VIH, la expresión de la proteína CD4 humana específicamente en células infectadas por VIH puede ser beneficiosa de dos maneras:
1.
La unión de CD4 y env de VIH intracelularmente inhibiría la formación de partículas víricas viables, por mucho que se haya demostrado que CD4 soluble acabe con los virus libres, pero sin el problema del aclaramiento sistemático y la posible inmunogenicidad, debido a que la proteína permanecerá unida a la membrana y es estructuralmente idéntica a la CD4 endógena (a la cual el paciente debería ser inmunológicamente tolerante).
2.
Debido a que el complejo env de CD4/VIH se ha implicado como una causa de la muerte celular, la expresión adicional de CD4 (en presencia de VIH-env en exceso presente en las células infectadas con VIH) conduce a una muestre celular más rápida e inhibe de esta manera la diseminación vírica. Esto puede ser particularmente aplicable a monocitos y macrófagos, que actúan como reservorio para la producción de virus como resultado de su refractilidad relativa a la citotoxicidad inducida por VIH (que, a la vez, se debe aparentemente a la ausencia relativa de CD4 sn sus superficies celulares.
En otra forma de realización, el vector de alfavirus codifica una ribozima que romperá e inactivará las moléculas de ARN esenciales para la viabilidad de las células infectadas por el vector. Haciendo la producción de ribozima dependiente de una secuencia de ARN específica que corresponde al estado patogénico, tal como tat de VIH, la toxicidad es específica del estado patogénico.
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5. Expresión de marcadores
Se puede modificar también la técnica anteriormente descrita de expresar un paliativo en una célula en respuesta a una secuencia de ARN específica para permitir la detección de un gen concreto en una célula que expresa una proteína de identificación (por ejemplo, un gen transportado por un virus concreto), y por tanto, permitir la detección de células que transportan este virus. Además, esta técnica permite la detección de virus (tales como VIH) en una muestra clínica de células que transportan una proteína de identificación asociada con el virus.
Se puede llevar a cabo esta modificación proporcionando un genoma que codifica un producto, la presencia del cual se puede identificar fácilmente (el "marcador del producto"), en un vector de alfavirus que responde a la presencia de una proteína de identificación en las células infectadas. Por ejemplo, VIH, cuando infecta las células adecuadas crea tat y rev. Se pueden proporcionar de esta manera células indicadoras con un genoma (tal como mediante infección con un alfavirus recombinante apropiado) que codifica un gen marcador, tal como el gen de la fosfatasa alcalina, el gen de la \beta-galactosidasa, o el gen de la luciferasa que se expresa mediante el alfavirus recombinante tras la activación por el transcripto de ARN de tat y/o rev. En el caso de la \beta-galactosidasa o de la fosfatasa alcalina, la exposición de las células a los análogos del sustrato da como resultado un cambio de color o fluorescencia si la muestra es positiva para VIH. En el caso de la luciferasa, la exposición de la muestra a la luciferina dará como resultado luminiscencia si la muestra es positiva para VIH. Para las enzimas celulares tales como la \beta-galactosidasa, se puede medir el título vírico directamente por recuento de las células coloreadas o fluorescentes, o preparando extractos de células y llevando a cabo un ensayo adecuado. Para la forma de unión a la membrana de la fosfatasa alcalina, se puede medir también el título vírico llevando a cabo los ensayos de enzima en la superficie celular usando un sustrato fluorescente. Para las enzimas secretadas, tales como en una forma diseñada mediante ingeniería de la fosfatasa alcalina, se ensayan muestras pequeñas de sobrenadante del cultivo para la actividad, permitiendo el seguimiento continuo de un cultivo único a lo largo del tiempo. De esta manera, se pueden usar diferentes formas de este sistema marcador para diferentes objetivos. Estos incluyen el recuento de virus activos, o la medida sensible y simple de la diseminación vírica en un cultivo y la inhibición de esta diseminación mediante diversos fármacos.
Se puede incorporar especificidad adicional en el sistema anterior ensayando la presencia del virus tanto con cómo sin anticuerpos neutralizantes para este virus. Por ejemplo, en una porción de la muestra clínica que se está ensayando, pueden estar presentes anticuerpos neutralizantes de VIH; mientras que en otra porción no habría anticuerpos neutralizantes. Si los ensayos fueron negativos en el sistema en el que hubo anticuerpos y positivo cuando no hubo anticuerpos, esto ayudará a confirmar la presencia de VIH.
Dentro de un sistema análogo para un ensayo in vitro, se puede determinar la presencia de un gen concreto, tal como un gen vírico en una muestra de células. En este caso, las células de la muestra se infectan con un vector de alfavirus adecuados que transporta el gen indicador que sólo se expresa en presencia del transcripto de ARN vírico apropiado. El gen indicador, tras penetrar en las células de la muestra, expresará su producto indicador (tal como la \beta-galactosidasa o la luciferasa) sólo si la célula huésped expresa las proteínas víricas apropiadas.
Estos ensayos son más rápidos y sensibles, debido a que el gen indicador puede expresar una cantidad mayor de producto indicador que el agente de identificación presente, lo que da como resultado un efecto de amplificación.
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6. Infrarregulación inmune
Tal como se describe anteriormente de manera resumida, se desvelan en el presente documento alfavirus recombinantes que transportan un constructo de vector capaz de suprimir uno o más elementos del sistema inmune en células diana infectadas con el alfavirus.
De manera resumida, la infrarregulación específica de respuestas inmunes inapropiadas o no buscadas, tales como en la hepatitis crónica o en los trasplantes de tejidos heterólogos tales como médula ósea, se puede diseñar mediante ingeniería genética usando productos génicos víricos inmunosupresores que suprimen la expresión superficial del antígeno de trasplante (MHC). Los adenovirus Ad2 y Ad5 del grupo C poseen una glicoproteína de 19 kd (gp 19) codificada por la región E3 del virus. Esta molécula gp 19 se une a las moléculas MHC de tipo I en el retículo endoplásmico de las células, y evita la glicosilación terminal y la translocación de MHC de tipo I en la superficie celular. Por ejemplo, antes del trasplante de médula ósea, las células de médula ósea donantes pueden estar infectadas con los constructos del vector que codifica gp 19 que, tras la expresión de gp 19, inhiben la expresión superficial de los antígenos de trasplante MHC de tipo I. estas células donantes se pueden trasplantar con riesgo bajo de rechazo al injerto y pueden requerir un régimen inmunosupresor mínimo para el paciente del trasplante. Esto puede permitir un estado quimérico donante-huésped aceptable que existe con pocas complicaciones. Se pueden usar tratamientos similares para tratar el intervalo de las así denominadas enfermedades autoinmunes que incluyen lupus eritematoso, esclerosis múltiple, artritis reumatoide o infección por hepatitis B crónica.
Un procedimiento alternativo implica el uso del mensaje de sentido contrario, la ribozima u otra expresión génica específica inhibidora específica de los clones de células T que son autoreactivos en la naturaleza. Estos bloquean la expresión del receptor de las células T de clones no deseados concretos responsables de una respuesta autoinmune. La ribozima de sentido contrario, u otro gen se pueden introducir usando el sistema de liberación de vector vírico.
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7. Sustitución o aumento de la terapia génica
Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a las células transformantes de un animal con vectores de alfavirus recombinantes que sirven como vehículos de transferencia génica para suministrar secuencias genéticas capaces de expresar una proteína terapéutica. En una forma de realización de la presente divulgación, del constructo de vector vírico se diseña para expresar una proteína terapéutica capaz de evitar, inhibir, estabilizar o revertir un defecto genético heredado o no heredado en el metabolismo, la regulación inmune, la regulación hormonal, y la función estructural enzimática o asociada a la membrana. Esta forma de realización describe también dicho vector vírico capaz de transducir células individuales, por lo cual la proteína terapéutica es capaz de expresarse sistemáticamente o localmente a partir de una célula o tejido específico, por lo cual, la proteína terapéutica es capaz de (a) la sustitución de una proteína o enzima celular ausente o defectivo, o (b) suplementar la producción de una proteína o enzima celular expresado de manera defectiva o baja. Dichas enfermedades pueden incluir fibrosis cística, enfermedad de Parkinson, hipercolesterolemia, deficiencia de adenosina desaminasa, trastornos de la \beta-globina. Hemofilia A y B. Enfermedad de Gaucher, diabetes y leucemia.
Como ejemplo, se puede usar un vector vírico de alfavirus recombinante para tratar la enfermedad de Gaucher. De manera resumida, la enfermedad de Gaucher es un trastorno genético que está caracterizado por la deficiencia de la enzima glucocerebrosidasa. Este tipo de terapia es un ejemplo de una terapia de sustitución génica única que proporciona una enzima celular funcional. Esta deficiencia dl enzima conduce a la acumulación de glucocerebrósido en los lisosomas de todas las células en el cuerpo. Sin embargo, el fenotipo de la enfermedad se manifiesta únicamente en los macrófagos, excepto en formas neuropáticas muy raras de la enfermedad. La enfermedad condice normalmente a un engrosamiento del hígado y del bazo y a lesiones en los huesos (para una revisión, véase Science 256: 794, 1992 y The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6ª ed., Scriver y col., vol. 2, p. 1677).
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8. Administración de partículas de alfavirus
En otros aspectos de la presente divulgación, se desvelan los procedimientos para administrar vectores o partícula de alfavirus recombinantes. De manera resumida, el modo final de administración del vector vírico depende de la aplicación terapéutica específica, el mejor modo de aumentar la potencia del vector, y la ruta más conveniente de administración. Generalmente, esta forma de realización incluye vectores de alfavirus recombinante que se pueden diseñar para ser liberados mediante, por ejemplo, (1) inyección directa en la corriente sanguínea; (2) inyección directa en un tejido o tumor específico; (3) administración oral, (4) inhalación nasal; (5) aplicación directa a tejidos mucosales; o (6) administración ex vivo de células autólogas transducidas en el animal. De esta manera, el vector de alfavirus terapéutico se puede administrar de tal manera que el vector pueda (a) transducir una célula sana normal y, y transformar la célula en una productora de proteína o agente terapéutico que se secreta sistémicamente o localmente, (b) transformar una célula anormal o defectiva, transformar la célula en un fenotipo de funcionamiento normal, (c) transformar una célula anormal de tal manera que se destruya, y/o (d) transducir células para manipular la respuesta inmune.
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I. Modulación de la actividad del factor de transcripción
En otra forma más de realización, se pueden utilizar vectores de alfavirus para regular la actividad de control del crecimiento de los factores de transcripción en la célula infectada. De manera resumida, los factores de transcripción influencian directamente el modelo de expresión génica a través de la trans-activación o la represión específica de secuencia (Karin, New Biologist 21:126-131, 1990). De esta manera, no es sorprendente que los factores de transcripción mutados represente una familia de oncogenes. Se puede usar la terapia de transferencia génica de alfavirus, por ejemplo, para volver a controlar las células tumorales cuyo crecimiento no regulado está activado por los factores de transcripción oncogénicos, y las proteínas que promueven o inhiben la unión cooperativamente en la formación de homo y heterodímeros que trans-activan o reprimen la transcripción de complejos de factores.
Un procedimiento para revertir la proliferación celular sería inhibir la trans-activación potencial del complejo de factor de transcripción del heterodímero c-myc/Max. De manera resumida, el oncogen nuclear c-myc se expresa mediante células proliferante y se puede activar mediante diversos mecanismos distintos, que incluyen la inserción retrovírica, la amplificación, y la translocación cromosómica. La proteína Max que se expresa en células quiescentes y, independientemente de c-myc, tanto sólo como en conjunción con un factor no identificado, funciona para reprimir la expresión de los mismos genes activados por el heterodímero myc/Max (Cole, Cell 65: 715-716, 1991).
La inhibición de la proliferación de c-myc o c-myc/Max de las células tumorales se puede llevar a cabo mediante la sobreexpresión de Max en las células diana controladas por los vectores de alfavirus. La proteína Max tiene sólo 160 aminoácidos (que corresponden a una longitud de 480 nucleótidos del ARN) y se incorpora fácilmente en un vector de alfavirus tanto independientemente, como en combinación con otros genes y/o restos de sentido contrario/ribozimas dirigidos a los factores que liberan el control del crecimiento de la célula.
La modulación del complejo homo/hetero en asociación es otra solución para controlar la expresión génica activada por el factor de transcripción. Por ejemplo, se evita a la vez el transporte desde el citoplasma al núcleo del factor de transcripción trans-activante NF-\kappaB en un complejo heterodímero con la proteína inhibidora NF-\kappaB. tras la inducción por una variedad de agentes, que incluyen algunas citoquinas, I\kappaB llega a fosforilarse y se libera NF-\kappaB y se transporta al núcleo, en el que puede ejercer su función de trans-activación específica de secuencia (Baeuerle y Baltimore, Science 242:540-546, 1988). Se puede evitar la disociación del complejo NF-\kappaB/I\kappaB enmascarando con un anticuerpo el emplazamiento de fosforilación de I\kappaB. esta solución inhibiría efectivamente la actividad de trans-activación del factor de transcripción NF-I\kappaB evitando su transporte al núcleo. Se puede llevar a cabo la expresión del anticuerpo o la proteína específicos del emplazamiento de fosforilación de I\kappaB en las células diana con un vector de transferencia génica de alfavirus. Se podría usar una solución similar a la descrita aquí para evitar la formación del factor del heterodímero de transcripción trans-activante AP-1 (Turner y Tijan, Science 243: 1689-1694, 1989), inhibiendo la asociación entre las proteínas jun y fos.
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J. Composiciones farmacéuticas
Tal como se ha señalado anteriormente se desvelan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden una partícula o virus Sindbis recombinante, o constructo de vector Sindbis, en combinación con un vehículo, diluyente, o huésped farmacéuticamente aceptable.
De manera resumida, se puede preservar el virus recombinante infecciosos (denominado también y anteriormente como partículas) tanto en bruto como en formas purificadas: Con el fin de producir virus en forma bruta, se pueden cultivar en primer lugar células que producen virus en un biorreactor, en el que las partículas víricas se liberan a partir de las células en los medios de cultivo. A continuación se pueden preservar los virus en forma bruta añadiendo en primer lugar una cantidad suficiente de una formulación tampón a los medios de cultivo que contienen el virus recombinante para formar una suspensión acuosa. Dentro de algunas formas de realización preferidas, la formulación tampón es una solución acuosa que contiene un sacárido, un aditivo estructural de elevado peso molecular, y un componente tamponante en agua. La solución acuosa puede contener también uno o más aminoácidos.
Se puede preservar también el virus recombinante en forma purificada. Más específicamente, antes de la adición de la formulación tampón, se puede clarificar el virus recombinante bruto descrito anteriormente pasando éste a través de un filtro y a continuación concentrándolo, tal como mediante un sistema de concentración de flujo cruzado (Filtron Technology Corp., Nortborough, Mass.). En una forma de realización, se añade DNasa al concentrado para digerir el ADN exógeno. El digerido se diafiltra a continuación con el fin de eliminar los componentes de los medios en exceso y establecer el virus recombinante en una solución tamponada más deseable: A continuación se pasa el diafiltrado sobre una columna de gel Sephadex S-500 y se eluye un virus recombinante purificado. A continuación se añade a este eluato una cantidad suficiente de formulación tampón con el fin de alcanzar una concentración final deseada de los constituyentes y diluir mínimamente los virus recombinantes. A continuación se puede almacenar la solución acuosa, preferiblemente a -70ºC, o secarse inmediatamente. Tal como anteriormente, la formulación tampón puede ser una solución acuosa que contiene un sacárido, un aditivo estructural de elevado peso molecular, y un componente tamponante en agua. La solución acuosa puede contener también uno o más aminoácidos.
Se puede purificar el virus recombinante bruto mediante cromatografía en columna de intercambio iónico. De manera resumida, el virus recombinante bruto se puede clarificar pasando en primer lugar éste a través de un filtro, seguido por cargar el filtrado sobre una columna que contiene una matriz de celulosa altamente sulfonada. A continuación se puede eluir el virus recombinante de la columna en forma purificada usando un tampón de sal alta, e intercambiar el tampón de sal alta por un tampón más deseable pasando el eluato sobre una columna de exclusión molecular. A continuación se añade una cantidad suficiente de formulación tampón, tal como se describe anteriormente, al virus recombinante purificado y la suspensión acuosa se seca inmediatamente o se almacena, preferiblemente a -70ºC.
La suspensión acuosa en forma bruta o purificada se puede secar mediante liofilización o evaporación a temperatura ambiente. De manera resumida, la liofilización implica las etapas de enfriar la suspensión acuosa por debajo de la temperatura de transición vítrea o por debajo de la temperatura del punto eutéctico de la suspensión acuosa, y eliminar el agua de la suspensión enfriada mediante sublimación para formar un virus liofilizado. En una forma de realización, se colocan alícuotas del virus recombinante formulado en una Cámara Refrigerada Edwards (unidad RC3S estantería 3) unida a un criocongelador (Supermodulyo 12K). Se usa un procedimiento de criocongelación multietapas tal como se describe por Phillips y col. (Cryobiology 18: 414, 1981) para liofilizar el virus recombinante formulado, preferiblemente entre una temperatura de -40ºC a -45ºC. la composición resultante contiene menos de un 10% de agua en peso del virus liofilizado. Una vez liofilizado, el virus recombinante es estable y se puede almacenar a -20ºC a 25ºC, tal como se describe con más detalle a continuación.
Dentro del procedimiento evaporativo, se elimina el agua de la suspensión acuosa a temperatura ambiente mediante evaporación. En una forma de realización, se elimina el agua mediante secado por pulverización (documento EP 520.748). Dentro del procedimiento de secado por pulverización, la suspesión acuosa se libera en un flujo de gas precalentado, usualmente aire, en el que el agua se evapora rápidamente a partir de gotitas de la suspensión. El equipo de secado por pulverización está disponible de numerosos fabricantes (por ejemplo, Drytec, Ltd., Tonbridge, England; Lab-Plant, Ltd., Huddersfield, Inglaterra). Una vez deshidratado, el virus recombinante es estable y se puede almacenar a -20ºC a 25ºC. dentro de los procedimientos descritos en el presente documento, se puede determinar el contenido de humedad resultante del virus seco o liofilizado mediante el uso de un equipo Karl-Fischer (titulador volumétrico Aquastar^{TM} V 1 B de EM Science, Cherry Hill, NJ), o mediante un procedimiento gravimétrico.
La suspensión acuosa usada para la formulación, tal como se ha descrito anteriormente, se compone preferiblemente de un sacárido, un aditivo estructural de elevado peso molecular, un componente tamponante, y agua. La solución puede incluir también uno o más aminoácidos. La combinación de estos componentes actúa para preservar la actividad del virus recombinante tras la congelación y la liofilización o el secado mediante evaporación. Aunque un sacárido preferido es lactosa, se pueden usar otros sacáridos, tales como sacarosa, manitol, glucosa, trehalosa, inositol, fructosa, maltosa o galactosa. Además, se pueden usar combinaciones de sacáridos, por ejemplo, lactosa y manitol, o sacarosa y manitol. Una concentración particularmente preferida de lactosa es 3%-4% en peso. Preferiblemente, la concentración del sacárido oscila entre 1% y 12% en peso.
El aditivo estructural de elevado peso molecular ayuda en la prevención de la agregación vírica durante la congelación y proporciona soporte estructural en el estado liofilizado o seco. Dentro del contexto de la presente divulgación, se consideran los aditivos estructurales por ser de "elevado peso molecular" si son mayores de un PM mayor de 5000. Un aditivo estructural de elevado peso molecular preferido es la albúmina de suero humano. Sin embargo, se pueden usar también otras sustancias, tales como hidroxietilcelulosa, hidroximetilcelulosa, dextrano, celulosa, gelatina, o povidona. Una concentración particularmente preferida de albúmina de suero humano es 0,1% en peso. Preferiblemente, la concentración de aditivo estructural de elevado peso molecular oscila entre 0,1% y 10% en peso.
Los aminoácidos, si están presentes, funcionan para preservar además la infectividad vírica tras el enfriamiento y la descongelación de la suspensión acuosa. Además, los aminoácidos funcionan para preservar además la infectividad vírica durante la sublimación de la suspensión acuosa enfriada y a la vez en el estado liofilizado. Un aminoácido preferido es arginina, pero se pueden usar también otros aminoácidos tales como lisina, ornitina, serina, glicina, glutamina, asparagina, ácido glutámico o ácido aspártico. Una concentración de arginina particularmente preferida es 0,1% en peso. Preferiblemente, la concentración de aminoácidos oscila entre 0,1% y 10% en peso.
El componente tamponante actúa para tamponar la solución manteniendo un pH relativamente constante. Se puede usar una variedad de tampones, dependiendo del intervalo de pH deseado, preferiblemente entre 7,0 y 7,8. Los tampones adecuados incluyen tampón fosfato y tampón citrato. Un pH particularmente preferido de la formulación de virus recombinante es 7,4, y un tampón preferido es trometamina.
Además, es preferible que la solución acuosa contenga una sal neutra que se usa para ajustar el alfavirus recombinante formulado final en una concentración de sal isoosmótica apropiada. Las sales neutras adecuadas incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio o cloruro de magnesio. Una sal preferida es cloruro de sodio.
Se pueden preparar soluciones acuosas que contengan la concentración deseada de los componentes descritos anteriormente como soluciones de almacenamiento concentradas.
Será evidente para las personas expertas en la técnica, dada la divulgación proporcionada en el presente documento, que puede ser preferible utilizar algunos sacáridos dentro de la solución acuosa cuando se pretende almacenar el virus liofilizado a temperatura ambiente. Más específicamente, es preferible utilizar disacáridos, tales como lactosa o trehalosa, particularmente para el almacenamiento a temperatura ambiente.
Los virus liofilizados o deshidratados desvelados en el presente documento se pueden reconstituir usando una variedad de sustancias, pero se reconstituyen preferiblemente usando agua. En algunos ejemplos, se pueden usar también soluciones de sal diluida que llevan la formulación final a la isotonicidad. Además, puede ser ventajoso usar soluciones acuosas que contengan componentes conocidos para potenciar la actividad del virus reconstituido. Dichos componentes incluyen citoquinas, tales como IL-2, policationes, tales como sulfato de protamina, u otros componentes que potencian la eficiencia del virus reconstituido. El virus recombinante liofilizado o deshidratado puede reconstituirse con cualquier volumen conveniente de agua o de los agentes de reconstitución señalados anteriormente que permiten sustancial y preferiblemente la solubilización total de la muestra liofilizada o deshidratada.
Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración, y no a modo de limitación. Los aspectos de los ejemplos que no se refieren específicamente a la invención reivindicada son únicamente para ilustración y comparación.
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Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de un ADNc de longitud genómica de Sindbis
La naturaleza de los virus que tienen un genoma de ARN con polaridad positiva es tal que cuando se introducen en una célula eucariota que sirve como huésped permisivo, el ácido nucleico genómico purificado sirve como una molécula de ARN mensajero funcional (ARNm). De esta manera, este ARN genómico, purificado a partir del virus, puede iniciar el mismo ciclo de infección que es característico de la infección del virus de tipo natural a partir del cual se purificó el ARN.
La cepa Ar-339 del virus Sindbis (ATCC Nº VR-1248, Taylor y col., Am. J. Trop. Med Hyg. 4: 844 1955), aislada del mosquito Culexus univittatus se propagó en células de riñón de cría de hámster (BHK), infectadas a baja multiplicidad (0,1 UFP/cél). Alternativamente, se puede usar la cepa hr del virus Sindbis (Lee Biomolecular, San Diego, CA) y propagarse mediante los mismos procedimientos. Los viriones Sindbis se precipitan de un lisado clarificado a las 48 horas después de la infección con 10% (p/v) de polietilenglicol (PEG-8000) a 0ºC, tal como se ha descrito anteriormente. Los viriones Sindbis contenidos en el aglomerado de PEG se lisaron con SDS al 2%, y se aisló el ARNm poliadenilado mediante cromatografía usando columnas de oligo dT comercialmente disponibles (Invitrogen). Se llevaron a cabo dos vueltas de síntesis de la primera cadena de ADNc sobre el ARNm seleccionado con poliA, usando un cebador de oligonucleótidos con la secuencia que se muestra a continuación:
5'-TATATTCTAGA(dT)25-GAAATG-3' (SEC DE ID Nº. 2)
El cebador contiene en su extremo 5' una "secuencia tampón" de cinco nucleótidos para la digestión eficiente de la endonucleasa de restricción, seguido por la secuencia de reconocimiento XbaI, 25 nucleótidos dT consecutivos y seis nucleótidos que son precisamente complementarios con el extremo 3' de Sindbis extremo. De esta manera, la selección para la primera vuelta de síntesis del ADNc es a dos niveles: (1) moléculas poliadeniladas, un prerrequisito para el ARNm funcional, y (2) cebado selectivo de las moléculas de ARNm de Sindbis, en una mezcla que contiene múltiples especies de ARNm. Adicionalmente, la transcripción inversa se lleva a cabo en presencia de MeHgOH 10 mM para mitigar la frecuencia de las paradas artificiales durante la transcripción inversa.
El ADNc primario de longitud genómica de Sindbis se amplificó mediante la PCR en seis segmentos distintos usando seis pares de cebadores solapantes. Además de las secuencias complementarias víricas, el cebador directo del extremo 5' de Sindbis contiene la secuencia de 19 nucleótidos que corresponde al promotor de la ARN polimerasa de SP6 bacteriano y la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción ApaI unida en su extremo 5' a una "secuencia tampón" de cinco nucleótidos para la digestión eficiente que precede a la secuencia de reconocimiento de ApaI. La ARN polimerasa de SP6 bacteriano se equilibró de tal manera que la transcripción in vitro dio como resultado la inclusión de sólo un ribonucleótido G no vírico único unido al ribonucleótido A, que corresponde al extremo 5' de Sindbis auténtico. La inclusión de la secuencia de reconocimiento ApaI facilita la inserción del amplicón de la PCR en la secuencia poliligante del vector plásmido (pKS II^{+}, Strategene). Se muestran a continuación la secuencia del cebador directo SP6-5' de Sindbis y todas las parejas de cebadores necesarias para amplificar el genoma de Sindbis completo. La secuencia de referencia (GenBank nº de acceso. SINCG) es de Strauss y col., Virology 133:92-110.
3
(Continuación)
4 
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Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR del ADNc de Sindbis con los seis primeros conjuntos que se muestran anteriormente en reacciones separadas, usando la ADN polimerasa termoestable Thermalase (Amresco Inc., Solon, Ohio) y el tampón que contenía MgCl_{2} 1,5 mM, proporcionados por el suministrador. Adicionalmente, las reacciones contienen DMSO al 5%, y las perlas Hot Start Wax (Perkin-Elmer), usando el siguiente protocolo de amplificación mediante la PCR que se muestra a continuación:
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Tras la amplificación, los seis productos de la reacción se insertaron en primer lugar en el vector pCR II (Invitrogen), usando a continuación las enzimas apropiadas que se muestran anteriormente, se insertaron, por etapas, en el vector pKS II^{+} (Stratagene), entre los emplazamientos ApaI y XbaI. Este clon se designó como pVGSP6GEN.
El clon pVGSP6GEN del ADNc genómico de Sindbis se linealizó mediante digestión con XbaI, que corta
pVGSP6GEN una vez, inmediatamente adyacente y en la dirección 3' de la extensión poli dA:dT de 25 nucleótidos de longitud. El clon pVGSP6GEN linealizado se purificó con Gene Clean (BIO 101, La Jolla, CA), y se ajustó a una concentración de 0,5 mg/ml. Se llevó a cabo la transcripción del clon pVGSP6GEN linealizado in vitro a 40ºC durante 90 min de acuerdo con las siguientes condiciones de reacción: 2 ml de ADN/4,25 ml de H_{2}O/10 ml de NTP 2,5 mM (UTP, ATP, GTP, CTP)/1,25 ml de análogo de caperuza m7G(5')ppp(5')G 20 mM/1,25 ml de DTT 100 mM/5 ml de tampón de transcripción 5X (Promega)/0,5 ml de RNasin (Promega)/0,25 ml 10 mg/ml de albúmina de suero bovino/0,5 ml de ARN polimerasa de SP6 (Promega). Los productos de la reacción de transcripción in vitro se pueden digerir con DNasaI (Promega) y purificarse mediante extracción secuencial de fenol/CHCl_{3} y éter, seguido por precipitación con etanol, o alternativamente, se puede usar directamente para la transfección. Los productos de la reacción de transcripción in vitro o el ARN purificado se complejaron con un compuesto lípido catiónico comercial (Lipofectin, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), y se aplicaron a células de Riñón de Cría de Hámster-21 (BHK-21) mantenidas a 60 mM en una placa petri en una confluencia del 75%. Las células transfectadas se incubaron a 30ºC. tras 94 horas después de la transfección, se observaron citopatológicos extensos (CPE). No se observó CPE obvio en las placas que no recibieron el ARN transcrito a partir del clon de ADNc de Sindbis. Adicionalmente, 1 ml de sobrenadante tomada de las células transfectadas, añadido a las monocapas frescas de las células BHK-21, e incubado a 30ºC o 37ºC dio como resultado CPE obvio en 18 horas. Esto demuestra que el clon pVGSP6GEN del ADNc de Sindbis es de hecho infeccioso.
El análisis de la secuencia de pVGSP6GEN, que se muestra en la Tabla 1, revela diferencias de secuencia múltiples entre el clon genómico de Sindbis descrito en el presente documento, y el clon vírico contenido en el Genbank. Muchas diferencias de secuencia dan como resultado cambios de sustitución de aminoácidos no conservativos en las proteínas de Sindbis. Para resolver qué cambios de secuencia son únicos en el clon descrito en el presente documento, o son un resultado del artefacto de la clonación, se amplificó el virión de ARN mediante la RT-PCR tal como se ha descrito anteriormente, y se determinó la relación de la secuencia con los nucleótidos en cuestión mediante secuenciación directa del producto de amplicón de la RT-PCR, usando un kit comercialmente disponible (Promega, Madison WI) y se comparó con la secuencia PVGSP6GEN correspondiente. En la Tabla 2, se facilitan los resultados de este estudio. De manera resumida, se observaron cambios de tres aminoácidos no conservativos Gly->Glu, Asp->Gly, y Tyr->Cys, que son como resultado del artefacto de la clonación respectivamente en los nucleótidos víricos 2245, 6193, y 6730. Estos cambios de nucleótidos dan como resultado cambios en los aminoácidos no conservativos en todo el mapa del gen de la proteína no estructural vírica (NSP), nt 2245 de NSP 2, y nt 6193 y 6730 de NSP4.
Se llevó a cabo la reparación de los genes NSP 2 y NSP 4 mediante la RT-PCR, tal como se ha descrito anteriormente, usando ARN de virión de un depósito purificado en placa 5 veces. Se usó la pareja de cebadores SP6-1A/1B descrita anteriormente para reparar el cambio en el nt 2245. El producto amplicón de la RT-PCR se digirió con Eco 47III y BglII, y se purificó el fragmento de 882 pb mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%/TBE, y se intercambió en la región correspondiente del clon pVGSP6GEN, preparado mediante digestión con Eco 47III y BglII, y tratamiento con CIAP. Se usó la pareja de cebadores 3A/7349R descrita anteriormente para reparar los cambios en el nt 6193 y el nt 6730. El producto amplicón de la RT-PCR se digirió con EcoRI y HpAI, y se purificó el fragmento de 1.050 pb mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%/TBE, y se intercambió en la región correspondiente del clon pVGSP6GEN. Se conoce este clon como pVGSP6GENrep. La transfección de células BHK con ARN transcrito in vitro del ADN de pVGSP6GENrep linealizado mediante digestión con XbaI, tal como se describe anteriormente, dio como resultado un CPE extenso 18 horas después de la transfección.
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TABLA 1 Diferencias del clon genómico de Sindbis entre las secuencias de Viagene y del GenBank
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TABLA 1 (continuación)
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TABLA 2 Análisis del artefacto del clon genómico de Sindbis
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Ejemplo 2 Generación de vectores de ADN Plásmido que inician la infección de Sindbis
Debido al tamaño del clon de ADNc genómico de longitud completa de Sindbis, la transcripción in vitro de moléculas de longitud completa es más bien poco eficiente. Esto da como resultado una eficiencia de transfección disminuida, en términos de centros infecciosos del virus, tal como se midió mediante la formación de placas, con respecto a la cantidad de ARN transfectado transcrito in vitro. Esta preocupación es también relevante en la transcripción in vitro de los vectores de expresión de Sindbis. Los clones de ADNc y otros vectores de expresión de ADNc de Sindbis candidatos de ensayo para su capacidad de iniciar un ciclo infeccioso o para dirigir la expresión de una secuencia heteróloga se facilitarían mucho si el clon de ADNC se transfectó en células susceptibles como una molécula de ADN que dirige a continuación la síntesis de ARN in vivo. Se ha informado de eficiencias de transfección tan altas como un 100% en células transfectadas con ADN complejado con diversas preparaciones lípidas sintéticas comerciales o mediante electroporación. También, se ha demostrado que el ADNc de los picornavirus es capaz de iniciar un ciclo infeccioso cuando se transfecta en células susceptibles (van der Werf y col., PNAS 83: 2330-2334, 1986). No se ha descrito en la bibliografía, sin embargo, si el ADNc genómico de Sindbis, cuando se coloca próximo a un promotor de mamíferos y se transfecta en las células, da como resultado ARN que es capaz de iniciar el ciclo infeccioso característico del virus de tipo natural.
Se sabe bien que las moléculas de ADN que tienen las señales apropiadas se pueden replicar in vivo cuando se introduce directamente en animales (Dubensky y col., PNAS 81: 7429-7533, 1984). La administración de vectores de ADNc de Sindbis directamente como moléculas de ADN es factible en algunas aplicaciones en las que la expresión de paliativos dirigida a Sindbis tiene un efecto trans.
Estas aplicaciones incluyen la inmunomodulación y la expresión de citoquinas u otras proteínas terapéuticas. Dentro del alcance de Sindbis, la administración directa de vectores de expresión de ADNc de Sindbis ofrece una utilidad que es más simple que la generación de una partícula de Sindbis.
Los constructos de vector de ADNc de Sindbis que contienen una secuencia paliativa terapéutica heteróloga se insertan en el interior de un casete de expresión de la ARN polimerasa II eucariota. Esta construcción se conoce como Sistema de Inicio del Vector Eucariota en Capas y está comprendida por los siguientes elementos ordenados: un promotor 5' eucariota capaz de iniciar la síntesis de ARN vírico en el extremo 5' de Sindbis auténtico, una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un virus Sindbis, una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas no estructurales de Sindbis, una región de unión vírica, una secuencia heteróloga, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de Sindbis, una secuencia de terminación de la transcripción y una señal 3' de poliadenilación. El vector de expresión del ADNc de Sindbis descrito en el presente documento puede incluir también las señales de corte y empalme apropiadas localizadas, por ejemplo, entre Sindbis y las regiones génicas heterólogas.
Se determinó en primer lugar la capacidad del clon pVGSP6GENrep del ADNc de Sindbis se iniciar un ciclo infeccioso característico del virus de tipo natural mediante la colocación del ADNc vírico genómico en el interior de un casete de expresión de la ARN polimerasa II de mamífero. Se llevó a cabo esta construcción tal como se describe seguidamente en detalle. Se digirió el clon pVGSP6GENrep con BglII y XbaI, los productos de la reacción se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa/TBE al 0,8%, y el fragmento de 9.438 pb resultante se escindió, se purificó con Gene Clean (BIO 101, Vista, CA), y se ligó en el fragmento de vector de 4.475 pb resultante del tratamiento de pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) con BglII, XbaI, y CIAP. Esta construcción se conoce como pcDNASINbgI/xba.
La repetición de longitud terminal (LTR) del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV) se situó en el extremo 5' vírico de tal manera que el primer nucleótido transcrito es un resto G único, que se completó in vivo, seguido por el extremo 5' de Sindbis Se sabe que los ARN transcritos in vitro que contienen tres nucleótidos no víricos en su extremo 5' son infecciosos (Rice y col., J. Virol. 61: 3809-3819, 1987). La yuxtaposición de la LTR de Mo-MLV y el extremo 5' de Sindbis se lleva a cabo mediante la PCR solapante tal como se describe seguidamente en detalle. La amplificación de la LTR de Mo-MLV en la reacción primaria de la PCR se lleva a cabo en una reacción que contiene el vector BAG (Price y col., PNAS 84:156-160, 1987) y la siguiente pareja de cebadores:
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Cebador directo: BAGBg12F1 (secuencia tampón/secuencia de reconocimiento de BglII/LTR de Mo-MLV nt 1-22):
5'-TATATAGATCTAATGAAAGACCCCACCTGTAGG
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Cebador inverso: BAGwt441 R2 (SIN nt 5-1/LTR de Mo-MLV nt 441-406):
5'-TCAATCCCCGAGTGAGGGGTTGTGGGCTCTTTTATTGAGC
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Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR de la LTR de Mo-MLV con la pareja de cebadores que se muestra anteriormente usando la ADN polimerasa termoestable Thermalase (Amresco Inc., Solon, Ohio) y el tampón que contenía MgCl_{2} 1,5 mM, facilitado por el suministrador. Adicionalmente, la reacción contiene DMSO al 5%, y las perlas Hot Start Wax (Perkin-Elmer), usando el siguiente protocolo de amplificación mediante la PCR que se muestra a continuación:
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Se llevó a cabo la amplificación del extremo 5' de Sindbis en la segunda reacción primaria de la PCR en una reacción que contenía el clon pVGSP6GENrep y la siguiente pareja de cebadores:
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Cebador directo: LTR de Mo-MLV nt 421-441/SIN nt 1-16):
5'-CCACAACCCCTCACTCGGGGATTGACGGCGTAGTAC
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Cebador inverso: (SIN nt 3182-3160):
5'-CTGGCAACCGGTAAGTACGATAC
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La amplificación mediante la PCR de la LTR de Mo-MLV es con la pareja de cebadores y las condiciones de reacción de la amplificación que se muestran anteriormente, y usando el siguiente protocolo de amplificación mediante la PCR que se muestra a continuación:
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Los productos del pb 457 y el pb 3202 de las reacciones primarias de la PCR se purificaron con Gene Clone, y se usaron conjuntamente en una reacción mediante la PCR con la siguiente pareja de cebadores
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Cebador directo: BAGBgl2F (secuencia tampón/secuencia de reconocimiento de BglII/LTR de Mo-MLV nt 1-22):
5'-TATATAGATCTAATGAAAGACCCCACCTGTAGG
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Cebador inverso: (SIN nt 2300-2278):
5'-GGTAACAAGATCTCGTGCCGTG
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La amplificación mediante la PCR de los productos del amplicón de la PCR del cebador es con la pareja de cebadores y las condiciones de reacción de la amplificación que se muestran anteriormente, y usando el siguiente protocolo de amplificación mediante la PCR que se muestra a continuación:
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Las 25 bases 3' terminales del primer producto amplicón de la PCR primaria solapan con las 25 bases 5' terminales del segundo producto amplicón de la PCR primaria. Los 2.752 pb resultantes que solapan con el producto amplicón de la PCR secundaria se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa/TBE al 0,8%, se digirieron con BglII, y el producto de los 2.734 pb se ligó en pcDNASINbgI/xba tratado con BglII y CIAP. La construcción resultante tiene 16.656 pb y se conoce como pVGELVIS. Se proporciona la secuencia de pVGELVIS en la Figura 3. Los nucleótidos de Sindbis están contenidos en el interior de las bases 1-11.700 de la secuencia.
El ADN plásmido de pVGELVIS se complejó con Lipofectamina (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) de acurdo con las condiciones sugeridas por el suministrador (circa 5 \mug de ADN/8mg de reactivo lípido) y se añadió a pocillo de 35 mm que contenían células BHK-21 en una confluencia aproximadamente del 75%. Se observaron efectos citopáticos (CPE), característicos de la infección por virus Sindbis de tipo natural en las 48 horas después de la infección. Estos datos demuestran la correcta yuxtaposición de las señales del casete de expresión del ADNc vírico y la ARN polimerasa II en el constructo pVGELVIS, dando como resultado el inicio de novo de un virus de ARN a partir de un módulo de expresión de ADN. Esta innovación no sólo potencia la utilidad del sistema Sindbis en general, sino que también proporciona otro procedimiento para un Vector Físico de Transferencia Génica.
La eficiencia de la replicación del vector tras la transcripción inicial del ARN de longitud genómica de pVGELVIS se potencia también por las modificaciones que dan como resultado un extremo 3' más auténtico. Para este objetivo, se llevan a cabo dos modificaciones diferentes en el constructo de vector ELVIS. La primera utiliza la secuencia de la ribozima antigenómica del virus de la hepatitis delta (VHD), situado adyacente a la extensión poliadenilada de Sindbis. El segundo implica una delección de la extensión poliadenilada de Sindbis y las secuencias del vector en la dirección 3'. Dando como resultado la fusión de 11.700 nucleótidos de Sindbis en la secuencia de terminación de la transcripción del gen de la hormona del crecimiento bovina/de poliadenilación.
El constructo que contiene la ribozima de VHD se genera usando las técnicas de la PCR y solapando los cebadores de oligonucleótidos que contienen la secuencia completa de la ribozima antigenómica de 84 nucleótidos (Perotta y Been, Nature 350: 434-6, 1991). Además de la secuencia del VHD, los cebadores contienen los emplazamientos que flanquean la enzima de restricción para los objetivos de la inserción en el vector ELVIS. Se llevaron a cabo dos vueltas de la PCR. La primera usando los cebadores de oligonucleótidos HDV49-XC y HDV17-68 (se muestran a continuación).
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seguido por la dilución de la primera reacción de la PCR, y su uso posterior como plantilla en una segunda vuelta de la PCR con los cebadores HDV49-XC (de la primera reacción) y HDVX-36 (se muestra a continuación).
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Tras la síntesis, el fragmento de la ribozima HDV se digirió con XbaI, que rompe en las secuencias que flanquean (itálicas), y se liga en el ADN del vector ELVIS, que se ha digerido parcialmente con XbaI para romper sólo uno de sus dos emplazamientos. Se lleva a cabo la detección sistemática para la inserción en el emplazamiento apropiado y la correcta orientación mediante el emplazamiento de restricción y el análisis de la secuencia. Esta construcción se conoce como pVGELVISHDV.
En el segundo procedimiento, se lleva a cabo la fusión de 11.700 nucleótidos de Sindbis con la secuencia de terminación de la transcripción del gen de la hormona del crecimiento bovina/poliadenilación mediante la delección de la extensión poliadenilada de Sindbis y se llevó a cabo la secuenciación del vector pVGELVIS en la dirección 3' mediante la PCR solapante. Se llevó a cabo la amplificación del extremo 3' de Sindbis en la primera reacción de la PCR primaria en una reacción que contenía pVGELVIS y la siguiente pareja de cebadores:
Cebador directo: SIN10349F (SIN nt 10394-10372):
5'-GACAGTGAGAACAGCCAGATGAG
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Cebador inverso: SINBGH11700R (BGH nt 13-1/SIN nt 11700-11675):
5'-CAGCGAGCTCTAGGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGTTG
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Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR de pVGELVIS con la primera pareja de cebadores que se muestra anteriormente usando la ADN polimerasa termoestable Thermalase (Amresco Inc., Solon, Ohio) y el tampón que contenía MgCl_{2} 1,5 mM, facilitada por el suministrador. Adicionalmente, la reacción contiene DMSO al 5%, y las perlas Hot Start Wax (Perkin-Elmer), usando el siguiente protocolo de amplificación mediante la PCR que se muestra a continuación:
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Se llevó a cabo la amplificación de la secuencia de terminación de la transcripción del gen BGH/poliadenilación en la segunda reacción de la PCR primaria en una reacción que contenía el clon pVGELVIS y la siguiente pareja de cebadores:
Cebador directo: pCSIN1018F (SIN nt 11.687-11.700/PCDNA3 nt 1018-1039):
5'-CCACAACCCCTCACTCGGGGATTGACGGCGTAGTAC
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Cebador inverso: pCDNA1633R (pCDNA3 nt 1633-1608):
5'-GTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCAC
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La amplificación mediante la PCR del extremo 5' del gen BGH es con la primera pareja de cebadores y las condiciones de la reacción de la amplificación que se muestran anteriormente, y usando el siguiente protocolo de amplificación mediante la PCR que se muestra a continuación:
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Se purificaron los productos de 1.634 pb y 629 pb de las reacciones de la PCR primaria con Gene Clean, y se usaron conjuntamente en una reacción de la PCR con la siguiente pareja de cebadores
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Cebador directo: SIND310374F (tampón de 5 nt/emplazamiento de reconocimiento de HindIII/SIN nt 10374-10394):
5'-TATATAAGCTTGAGGCGTACGTCGAATTGTCAG
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Cebador inverso: pCDNA1575R (pCDNA3 nt 1575-1552):
5'-GAAAAACCGTCTATCAGGGCGATG
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La amplificación mediante la PCR de los productos del amplicón de la PCR del cebador es con la pareja de cebadores y las condiciones de la reacción de la amplificación que se muestran anteriormente, y usando el siguiente protocolo de amplificación de la PCR que se muestra a continuación.
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Las 27 bases 3' terminales del producto amplicón de la PCR primaria solapan con las 27 bases 5' terminales del producto amplicón de la PCR primaria; los 1.976 pares de bases resultantes que solapan el producto amplicón de la PCR secundaria se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa/TBE al 0,8%, se digirieron con HindIII y DraIII, y el producto de 1,941 pb se ligó en pcDNA3 digerido con HindIII y DraIII, y se trató con CIAP. Se conoce esta construcción como pCDNAELVIS3'. La construcción pCDNAELVIS3' se digirió con Bsi WI y PvuI y el fragmento de 5197 pb resultante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa/TBE al 0,8%, y se ligó con el fragmento de 11.398 pb aislado mediante digestión de pVGELVIS con Bsi WI y PvuI, y tratamiento con CIAP, seguido por electroforesis en gel de agarosa/TBE al 0,8% y Gene Clean. La construcción resultante tiene 16.595 pb y se conoce como pVGELVISHDVd13'.
Para ensayar la capacidad de los plásmidos pVGELVISHDV y pVGELVISd13' de iniciar las características de infección del virus Sindbis de tipo natural, se complejaron los clones de ADN con Lipofectamina (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las condiciones sugeridas por el suministrador (circa 5 \mug de ADN/8 mg de reactivo lípido) y se añadieron a pocillos de 35 mm que contenían células BHK-21 en una confluencia aproximadamente del 75%. Si se observó CPE mediante este procedimiento, se puede usar 1 ml de sobrenadante de la transfección para infectar monocapas de BHK-21 frescas, o alternativamente, se puede cuantificar el nivel de virus Sindbis en los sobrenadantes directamente mediante el ensayo de placas.
En otras aplicaciones, es deseable situar el promotor CMV contenido en el plásmido pCDNA3 próximo al ADNc genómico de Sindbis, de tal manera que el inicio de la transcripción in vivo corresponde al nucleótido vírico auténtico del extremo 5'. El emplazamiento inicial del promotor CMV en el plásmido pcDNA3 se determina mapeando el punto de inicio de la transcripción in vitro. Esto se lleva a cabo digiriendo en primer lugar el plásmido pcDNA3 con la endonucleasa de restricción DraIII (New England Biolabs Inc., Beverly, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. DraIII rompe el plásmido una vez en el nucleótido 1546 dando como resultado una molécula de ADN lineal con 5446 pares de bases. Se purificó el ADN usando el kit Geneclean II (BIO 10 San Diego, CA) exactamente como se establecía en las instrucciones. pcDNA3 linealizado se transcribió con el Sistema de Transcripción in vitro del Extracto Nuclear HeLa (Promega Corp., Madison, WI) en una reacción que contenía 3 \mug de pcDNA3 linealizado, 400 \muM de cada ribonucleótido en MgCl_{2} 3 mM, y 8 unidades de extracto nuclear celular HeLa. Los 25 \mul de la reacción se incubaron durante una hora a 35ºC. Se añadieron una unidad de ADNsa RQ1 (Promega Corp., Madison, WI) y 40 unidades de RNasin (Promega Corp. Madison, WI) a la reacción y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos para eliminar la plantilla de ADN. Se finalizó la reacción mediante la adición de 175 \mul de Stop Mix (suministrado con el extracto HeLa). Se extrajo la reacción con un volumen igual de alcohol de fenolcloroformisoarnilo (25:24:1) seguido por una extracción con alcohol de cloroformisoarnilo (24:1). Se precipitó la reacción con 500 \mul de etanol absoluto. Se aglomeró el ARN mediante centrifugación a 12.000 x G durante 15 minutos. El aglomerado se enjuagó con etanol al 80% y se volvió a suspender en 20 \mul de agua.
Se marcó un cebador complementario para el promotor SP6 (ATTTAGGTGACACTATAG, BRL Corp., Bethesda, MD) en el extremo 5' con ^{32}P mezclando 10 pmol de cebador con un exceso de dos veces de gamma ^{32}P ATP (ICN Corp. Irvine, CA), diez unidades de Polinucleótido Quinasa T4 (Promega Corp., Madison, WI), y Tampón Quinasa 1X (suministrado con la Quinasa T4). Se incubó la reacción durante 30 minutos a 37ºC y a continuación durante 5 minutos a 95ºC.
El ARN transcrito in vitro se templó con el cebador marcado mezclando 10 \mul del ARN con 1,5 pmol de cebador. Se calentó la mezcla a 90ºC y se dejó enfriar lentamente. Se llevó la mezcla a Tris-HCl 50 mM pH 8,3, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, 40 mM de cada dNTP, y 15 unidades de Transcriptasa Inversa AMV (USB Corp., Cleveland, OH). Se incubó la mezcla de reacción a 42ºC durante 30 minutos. Se finalizó la reacción mediante la adición de un tercio del volumen de Formamida al 95%, EDTA 20 mM, Azul de Bromofenol al 0,05%, y Xileno Cianol FF al 0,05%.
Se secuenció el plásmido pcDNA3 usando el mismo cebador marcado con ^{32}P descrito anteriormente, utilizando el Sistema de Secuenciamiento del ADN fmol (Promega Corp., Madison, WI) exactamente tal como se describe en las instrucciones. Las reacciones de secuenciación se introdujeron en un gel de desnaturalización al 6% adyacente a 2 \mul del cebador extendido en la reacción in vitro del ARN. Se sometió a electroforesis el gel durante una hora a 1600 V, se secó, y se expuso a la película durante la noche. Se puede comparar la banda de ADNc de longitud completa con las hileras de la secuencia de pcDNA3 para determinar el emplazamiento de inicio de la transcripción. Usando este procedimiento, se puede determinar que el emplazamiento de inicio de la transcripción del promotor CMV es exactamente de 39 bases en la dirección 3' del promotor CMV en el resto G del nucleótido número 858 (de acuerdo con la numeración del vector pcDNA3 de Invitrogen).
A continuación se yuxtapuso el promotor CMV procedente del plásmido pCDNA3 en el ADNc de Sindbis mediante la PCR solapante, usando los procedimientos descritos anteriormente para la construcción de pVGELVIS. Se puede determinar el punto preciso de inicio de la transcripción de cualquier promotor de la ARN polimerasa 11 mediante los procedimientos descritos anteriormente, permitiendo la yuxtaposición apropiada del promotor en la configuración ELVIS. El uso de promotores inducibles en la configuración ELVIS permite el inicio de la infección en las líneas celulares transfectadas que se van a controlar.
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Ejemplo 3 Preparación de vectores Sindbis con ARN y ADN plásmido A. Construcción del Vector SINDBIS Básico
La primera etapa en la construcción del vector Sindbis básico es la generación de dos subclones plásmidos que contienen elementos separados de los extremos 5' y 3' víricos que se usan posteriormente para ensamblar el vector básico de transferencia génica. El primer subclón plásmido contiene 40 nucleótidos terminales en el extremo 3' vírico y una extensión de 25 bases de nucleótidos dA:dT. El extremo 3' del vector se sintetizó químicamente para tener la secuencia de la pareja de cebadores que se muestra a continuación.
Cebador directo: SIN11664F: (secuencia tampón/emplazamiento NotI/SIN nt 11664-11698):
5'-TATATGCGGCCGCTTTCTTTTATTAATCAACAAAATTTTGTTTTTAA
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Cebador inverso: SINXba11700R (secuencia tampón/emplazamiento SacI dT25/SIN nt 11700-11692):
5'-TATATGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAATGTTAAAA
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Los anteriores oligonucleótidos se mezclaron juntos a concentraciones molares iguales en presencia de MgCl_{2} 10 mM, se calentaron a 100ºC durante 5 min y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente. La molécula parcialmente de doble cadena se rellenó a continuación usando ADN polimerasa Klenow y los dNTP 50 \muM. A continuación se digirió la molécula de 89 pb con NotI y SacI, se purificó en un gel de NuSieve al 2%/agarosa al 1%, se ligó en el plásmido pKS II+, se digirió con NotI y SacI, y se trató con CIAP en un exceso molar 10:1 de la relación inserto:vector. La construcción se conoce como pKSII3'SIN.
El segundo subclón plásmido contiene 7.643 pb 5' que incluyen un promotor de la ARN polimerasa 5' de Sindbis. El extremo 3' de este clon se derivó mediante amplificación mediante la PCR con un cebador inverso que tenía la secuencia que se muestra a continuación.
Cebador inverso: Primer: SINXho7643R (secuencia tampón/emplazamiento XhoI/SIN nt 7643-7621):
5'TATATCTCGAGGGTGGTGTTGTAGTATTAGTCAG
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El cebador inverso mapea los nucleótidos víricos 7643-762 y tiene 42 pb en la dirección 3' del extremo 3' del elemento del núcleo de unión. Adicionalmente, el nucleótido vírico 7643 tiene 4 nucleótidos en la dirección 5' del punto de inicio de la traducción de las proteínas estructurales. Los primeros cinco nucleótidos 5' en este cebador, que están seguidos por 6 nucleótidos que comprenden la secuencia de reconocimiento de XhoI, se incluyen para servir como "secuencia tampón" para la digestión eficiente de los productos del amplicón de la PCR.
El cebador directo en esta reacción es el cebador 2A (descrito en el Ejemplo 1) que tiene la siguiente secuencia:
ATACTAGCCACGGCCGGTATC
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El producto amplicón de 4510 pb, resultante del experimento de la PCR que usa los cebadores tal como se muestra anteriormente con el plásmido pVGSP6GENrep, se digirió con las enzimas SfiI y XhoI. El fragmento de 2526 pb resultante se purificó en gel. El clon pVGSP6GENrep del ADNc de Sindbis se digirió con ApaI y SfiI. El fragmento de 5144 pb se purificó en gel y se ligó junto con el fragmento digerido de Sfi/XhoI de 2526 pb y los plásmidos pKS II+ tratados con CIAP digerido con ApaI y XhoI. se aisló un clon que tenía los nucleótidos I-7643 de Sindbis que incluía el promotor de la ARN polimerasa en el extremo 5' contenido en el plásmido pKSII+. Se conoce esta construcción como pKSII5'SIN. Se llevó a cabo el ensamblaje del vector básico completo digiriendo pKS5'SIN con XhoI y SacI, tratándolo con CIAP, y la purificación en gel del fragmento grande de 10.533 pb. El fragmento pKS5'SIN de 10.533 pb se ligó junto con el fragmento pequeño de 168 pb resultante de la digestión de pKSII3'SIN con XhoI y SacI. Se conoce esta construcción como pKSSINBV, y se muestra esquemáticamente en la Figura 4.
Se insertó el gen indicador de la luciferasa de la luciérnaga en el vector Sindbis básico con el fin de demostrar la expresión de un gen heterólogo en las células transfectadas con ARN resultantes de la transcripción in vitro del clon del vector Sindbis. Este experimento demuestra la funcionalidad total del vector Sindbis.
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B. Construcción del vector SINDBIS luciferasa
Se llevó a cabo la construcción del vector Sindbis luciferasa ensamblando conjuntamente los componentes de 3 plásmidos independientes pKSII5'SIN, pKSII3'SIN, y el vector pGL2 básico. El plásmido del vector pGL2 básico (Promega, Madison, WI) contiene el gen completo de la luciferasa de luciérnaga. El gen de la luciferasa se insertó en primer lugar en el plásmido pKSII3'SIN. Esto se llevó a cabo mediante la purificación en gel del fragmento que contenía los 2689 pb de la luciferasa resultante de la digestión del vector pGL2 básico con BamHI e HindIII, y la ligadura del fragmento grande de 3008 pb purificado en gel resultante de la digestión con BamHI e HindII y el tratamiento con CIAP de pKSII3'SIN. Se conoce esta construcción como pKSII3'SIN-luc.
Se llevó a cabo el ensamblaje final del vector Sindbis luciferasa digiriendo pKS5'SIN con XhoI y SacI, tratando con CIAP, y la purificación en gel del fragmento grande de 10.533 pb. El fragmento de 10.533 pb de pKS5'SIN se ligó junto con el fragmento pequeño de 2854 pb resultante de la digestión de pKSII3'SIN-luc con XhoI y SacI. esta construcción contiene la región de codificación del gen no estructural de Sindbis completo y los elementos 3' víricos necesarios para la replicación del genoma. El gen de la luciferasa de luciérnaga se colocó entre estos dos elementos 5' y 3' víricos. Se conoce este vector como pKSSINBVluc, y se muestra esquemáticamente en la Figura 4. Los constructos SIN-BV entre FfiI y SacI se intercambiaron en pGVELVIS entre los emplazamientos FfiI y XbaI. Se observó la expresión de genes heterólogos tras la transfección en células BHK.
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C. Expresión de la luciferasa en células BHK transfectadas e infectadas
Con el fin de ensayar la funcionalidad del vector Sindbis básico, se linealizó la expresión de la luciferasa en células transfectadas con ARN transcrito in vitro, tal como se describe en el Ejemplo 1, a partir de pKSSINBV-luc mediante digestión con SacI. Además, se construyó un vector de empaquetado complementario, que se eliminó de la mayor parte de la región génica no estructural mediante digestión de pVGSP6GENrep con Bsp EI y se ligó en condiciones de dilución. Se conoce esta construcción como pVGSP6GENd1Bsp y está eliminada de las secuencias génicas no estructurales entre las bases 422-7.054. Este clon tiene 8.008 pb y se muestra esquemáticamente en la Figura 5. La transcripción in vitro de pVGSP6GENd1Bsp es tal como se describe en el Ejemplo 1; la linealización es con XbaI. Se ensayó la expresión de la luciferasa en las células transfectadas en las 24 horas después de la transfección. Se llevaron a cabo transfecciones y transfecciones simultáneas complejando directamente los productos de la transcripción in vitro con lipofectina (Gibco-BRL, Gaithersberg, MD). Adicionalmente, se usó 1 ml de sobrenadante para infectar una monocapa confluente de células BHK y se ensayó la expresión de la luciferasa en las 24 horas después de la infección. En la Figura 6 se muestran los resultados de este experimento. Los resultados demuestran claramente la abundante expresión del gen indicador tras la transfección de células BHK, y la transferencia (por ejemplo, empaquetado) de la actividad de la expresión cuando las células se transfectan simultáneamente con pVGSP6GENd1Bsp transcrito in vitro.
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D. Construcción de vectores SINDBIS con la región de unión alterada
1. Con el fin de inactivar la región de unión, se cambiaron los nucleótidos en el interior del término carboxi de NSP4 y el solapamiento de la región de unión, y se finalizaron los nucleótidos del vector que correspondían a Sindbis antes del punto de inicio subgenómica en el nt 7598 de Sindbis. En la Figura 7, se muestra esta construcción esquemáticamente.
De manera resumida, se amplificó un fragmento mediante la PCR procedente del clon pKSSINBV en condiciones no restrictivas del ciclo de reacción utilizando un cebador inverso que tenía la siguiente secuencia:
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TATATGGGCCCTTAAGACCATCGGAGCGATGCTTTATTTCCCC
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Todas las bases subrayadas en el cebador inverso se refieren a cambios de nucleótidos en la región de unión sin que afecten a los aminoácidos codificados (véase a continuación). Todos los cambios de nucleótidos son transversiones.
Extremo 3' de NSP 5 (nt víricos 7580-7597).
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TCT CTA CGG TGG TCC TAA
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(que dan como resultados cambios de nucleótidos en el cebador inverso)
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El cebador inverso es complementario con los nt 7597-7566 de Sindbis (excepto en los nucleótidos, tal como se muestra, en los que se hicieron cambios en la región de unión), e incluye en su extremo 5' la secuencia de reconocimiento de ApaI en el nucleótido 6 a la que sigue una "secuencia tampón" de la cola TATAT 5' terminal para la digestión eficiente de la enzima.
El cebador directo en esta reacción es el cebador 2A (descrito en el Ejemplo 1), que tiene la siguiente secuencia:
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ATACTAGCCACGGCCGGTATC
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El amplicón de 4.464 pb resultante de una reacción de la PCR con pKSSfNBV usando la pareja de cebadores descrita anteriormente se digirió con SfiI y ApaI y el fragmento de 2.480 pb purificado en gel se ligó junto con el fragmento de 5.142 pb purificado en gel resultante de la digestión de pKSSINBV con ApaI y SfiI, y con el fragmento de 2.961 pb purificado en gel resultante de la digestión de pKSII+ con ApaI y del tratamiento con CIAP. Esta construcción, comprendida por los nucleótidos 1-7597 de Sindbis, que incluye los cambios en la región de unión descrita anteriormente, y que incluye el promotor T7 bacteriano unido al nt. 1 de Sindbis se denomina como pKS5'SINdIJR.
La construcción final del vector de la región de unión inactivada se llevó a cabo mediante ligadura del fragmento grande de 7.622 pb de Sindbis resultante de la digestión de pKS5'SINdIJR con ApaI, con el fragmento de 3.038 pb resultante de la digestión con ApaI y tratamiento con CIAP de pKSII3'SIN. Se confirmó la orientación positiva del elemento 5' de Sindbis, con respecto al elemento 3' de Sindbis mediante el análisis de la endonucleasa de restricción. Esta construcción se denomina como pKSSINBVdIJR.
No se puede producir el inicio y la síntesis de ARNm subgenómico a partir del vector pKSSINBVdIJR. Con el fin de probar esta suposición, se llevaron a cabo ensayos comparativos de protección de la RNasa en los vectores pKSSINBV y pKSSINBVdIJR.
Se usó una sonda de ARN marcada en el extremo con ^{32}P complementaria en parte con la región de unión, que incluía el punto de inicio del ARN subgenómico en el nt vírico 7.589 para hibridar con el ARN vírico resultante de la transfección de células BHK-21 con los vectores pKSSINBV y pKSSINBVdIJR. El ensayo de protección de la RNasa demuestra que las células transfectadas con pKSSINBV tienen dos fragmentos, de especificidad genómica y subgenómica, mientras que las células transfectadas con pKSSINBVdIJR tienen sólo un fragmento único de especificidad genómica. Estos resultados prueban que la región de unión en el vector pKSSINBVdIJR esta así mismo inactivada.
2. Con el fin de ensayar esta traducción del ARN genómico de la región que corresponde al ARN mensajero subgenómico, se insertó el gen indicador de la luciferasa en la región de unión inactivada del vector pKSSINBVdIJR descrito anteriormente. Se llevó a cabo esta construcción digiriendo con XhoI y SacI y tratando con CIAP el plásmido pKSSINBVdIJR y purificando en gel el fragmento 10 de 197 pb resultante. El fragmento pKSSINBVdIJR se ligó junto con el fragmento pequeño de 2854 pb resultante de la digestión de pKSII3'SIN-luc con XhoI y SacI. esta construcción contiene la región de codificación completa del gen no estructural de Sindbis que termina en una región de unión inactivada en el nt 7597 de Sindbis, y los elementos 3' víricos necesarios para la replicación del genoma; se colocó el gen de la luciferasa de luciérnaga entre estos dos elementos 5' y 3' víricos. Se conoce este vector como pKSSINBVdIJR-luc.
Se ensayó la expresión del gen indicador procedente del vector pKSSINBVdIJR-luc en células BHK-21 transfectadas. Se determinó la traducción de la proteína de la luciferasa funcional mediante el ensayo luminiscente de la luciferina, usando un luminómetro para la detección. La sensibilidad en este ensayo es de 1 x 10-20 moles de luciferasa. Dado que el peso molecular de la luciferasa es de 62.000 daltons, este límite de detección transforma a 6.020 moléculas. De esta manera, en un experimento típico si sólo un 0,6% de las 1 x 10^{6} células contenidas en una placa petri a 60 mM se transfectan con el vector pKSSINBVdIJR-luc, y si estas células transfectadas expresan únicamente una molécula funcional única de luciferasa, la actividad enzimática es detectada por el ensayo usado. Es importante demostrar en este experimento que la región de unión del vector pKSSINBVdIJR-luc está inactivada. Esto se llevó a cabo mediante un ensayo de protección de la RNasa, comparando los ARN víricos sintetizados en las células transfectadas con los vectores pKSSINBVdIJR-luc y el pKSSINBV-luc, usando la sonda descrita anteriormente.
3. Se sintetizó la pareja de oligonucleótidos del núcleo mínimo de la región de unión -19->+5, comprendida por los nt. 7579-7602 de Sindbis, tal como se ha definido anteriormente (Levis y col., J. Virol. 64: 1726-1733, 1990), y se flanqueó con las secuencias de reconocimiento de ApaI y XhoI tal como se muestra:
oligonucleótido 1:
CATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTC
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oligonucleótido 2:
TCGAGACTATTTAGGACCACCGTAGAGATGGGCC
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron conjuntamente en presencia de Mg^{2+} 10 mM, se calentaron a 100ºC durante 5 min. y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente, los oligonucleótidos templados se ligaron en una relación molar 25:1 para insertarlos al vector pKSSINBVdIJR, se prepararon de acuerdo con esto: digestión completa con XhoI, seguida por digestión con ApaI en condiciones parciales, dando como resultado una rotura por molécula inducida por ApaI (o dos roturas posibles) purificación en gel del fragmento de 10.655 pb, y tratamiento con CIAP. Este vector que contiene la región de codificación de NSP completa que termina en un núcleo de la región de unión inactivada, unido al núcleo de la región de unión sintética y seguido por los elemento 3' víricos necesarios para la replicación, y contenido en el plásmido pKSII+, se conoce como pKSSINdIJRsjrc.
Con el fin de regular el nivel de síntesis de ARNm subgenómico, se llevaron a cabo modificaciones adicionales del núcleo de la región de unión sintética insertada en tándem en el plásmido pKSSINdIJRsjrc. Estas modificaciones del núcleo de la región de unión se llevaron a cabo mediante dos soluciones; cambios de nucleótidos en el interior del núcleo de la región de unión, o extensión en los términos 5' y 3' del núcleo de la región de unión de los nucleótidos que flanquean Sindbis, de acuerdo con la secuencia vírica auténtica. Se muestra a continuación el núcleo mínimo de la región de unión, que se extiende desde los nt. víricos 7579-7602:
ATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGT
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Comparando la secuencia genómica entre ocho alfavirus, se ha demostrado anteriormente que existe diversidad de la secuencia en el interior del núcleo de la región de unión. Lo que se muestra a continuación, para localizaciones concretas de la región de unión, es el nucleótido de Sindbis seguido por el nucleótido correspondiente en otros alfavirus.
16
(Continuación)
17
Los cambios en la región de unión de los nt. 7579, 7580, 7581, 7583, 7589, 7590, 7591, 7592, de Sindbis, dan como resultado cambios potenciales en la codificación de los aminoácidos en interior de los 5 codones del término carboxi de NSP 4 que solapa en la región de unión.
Estos cambios observados en la región de unión entre los alfavirus al nivel de la codificación potencial de NSP 4 y al nivel de la actividad cis de la región de unión pueden representar cualquiera, o ambos, de cambios permitidos en NSP 4 y la región de unión que no afectan la funcionalidad, o por otra parte, virus simplemente diferentes. En cualquier episodio, los cambios en la región de unión presentados en el presente documento son con respecto al núcleo de la región de unión insertada en tándem, a partir de los cuales no se produce la síntesis de la proteína NSP. Descrita anteriormente, se produce la traducción de la región de NSP completa procedente del constructo pKSSINBVdIJR. Los cambios en la región de unión en los nt. 7600 y 7602 de Sindbis son en la dirección 3' del codón de terminación de NSP 4 y en la dirección 5' del codón de inicio de las proteínas estructurales.
Las localizaciones de las diferencias de nucleótidos en el interior del núcleo de la región de unión observadas entre diversas cepas de alfavirus se denominan aquí como cambios permitidos. Las localizaciones de nucleótidos en el interior del núcleo de la región de unión que corresponden a las secuencias conservadas entre las diversas cepas de alfavirus se denominan aquí como cambio no permitidos.
Para disminuir el nivel de inicio del ARNm subgenómico procedente del núcleo de la región de unión sintética, los cambios se llevan a cabo separadamente en el interior de los nucleótidos que corresponden a cambios permitidos, y en el interior de los nucleótidos que corresponden a cambios no permitidos. Se facilitan en la tabla anterior los nucleótidos de la región de unión que corresponden a los cambios permitidos. Se facilitan a continuación catorce nucleótidos de la región de unión para los cuales no se observaron cambios entre los ocho alfavirus secuenciados (virus del Bosque Semliki, virus Middleburg, virus Ross River, virus O'Nyong Nyong, virus de la Encefalitis Equina Oriental, virus de la Encefalitis Equina Occidental, y virus de la Encefalitis Equina de Venezuela):
18
Los cambios en el interior de la región de unión observados entre los alfavirus pueden reflejar una interacción específica entre una ARN polimerasa vírica dada y su región de unión análoga. De esta manera, los cambios entre los nucleótidos "permitidos" pueden dar como resultado una marcada disminución el los niveles de síntesis de ARNm subgenómico como cambios entre nucleótidos "no permitidos" de la región de unión. Por otra parte, estos pueden ser por tanto emplazamientos de cambios permitidos en el interior del núcleo de la región de unión.
El cambio no permitido auténtico único en el interior del núcleo de la región de unión es probablemente en el nt. 7598 de Sindbis, que corresponde al punto de inicio del ARNm subgenómico. No se describen aquí los cambios de este nucleótido en el núcleo de la región de unión insertada en tándem del plásmido pKSSINdIJRsjrc.
La sustitución de los nucleótidos permitidos in toto en el núcleo mínimo de la región de unión -19->+5 sintética, se llevaron a cabo con la siguiente pareja de oligonucleótidos, sintetizada in vitro, y flanqueda con las secuencias de reconocimiento de ApaI y XhoI, tal como se muestra:
oligonucleótido 1:
CCCTTGTACGGCTAACCTAAAGGAC
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oligonucleótido 2:
TCGAGTCCTTTAGGTTAGCCGTACAAGGGGGCC
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron conjuntamente en presencia de Mg mM, se calentaron a 100ºC durante 5 min, y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente. Los oligonucleótidos templados se ligaron en una relación molar 25: 1 para insertar al vector pKSSINBVdIJR, preparado de acuerdo con esto: digestión completa con XhoI seguida por digestión con Apa en condiciones parciales, dando como resultado una rotura por molécula inducida por ApaI (de dos roturas posibles), purificación en gel del fragmento de 10.655 pb, y tratamiento con CIAP. Se conoce este vector como pKSSINdIJRsjrPc.
Cada uno de los 13 (nt. 7598 no cambiado) nucleótidos no permitidos en el núcleo de la región de unión están intercambiados individualmente, usando las siguientes reglas, dando como resultado una sustitución transversional más drástica.
A -> C
T -> G
G -> T
C -> A
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Por ejemplo, el nt. 7582 está cambiado de T -> G, usando la siguiente pareja de oligonucleótidos, sintetizados in vitro, y flanqueada con las secuencia de reconocimiento de ApaI y XhoI tal como se muestra:
oligonucleótido 1
CATCGCTACGGTGGTCCTAAATAGTC
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oligonucleótido 2
TCGAGACTATTTAGGACCACCGTAGCGATGGGCC
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(Los nucleótidos que efectúan la transversión en los emplazamientos no permitidos de la región de unión se muestran en negrita).
Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron conjuntamente en presencia de Mg^{2+} 10 mM, se calentaron a 100ºC durante 5 min. y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente. Los oligonucleótidos templados se ligaron en una relación molar 25:1 para insertar el vector pKSSINBVdIJR, preparado de acuerdo con esto: digestión completa con XhoI, seguida por digestión con Apa 1 en condiciones parciales, dando como resultado una rotura por molécula inducida por ApaI (de dos roturas posibles), purificación en gel del fragmento de 10.655 pb, y tratamiento con CIAP. Se conoce este vector como pKSSINdIJRsjrNP7582.
\newpage
Usando las reglas de cambio de la transversión que se muestran anteriormente, se llevaron a cabo cambios en cada uno de los 12 emplazamientos no permitidos restantes en el núcleo de la región de unión con 12 parejas de oligonucleótidos diferentes, flanquedas con las secuencias de reconocimiento de ApaI y XhoI, tal como se describe anteriormente. Se conocen estos vectores como:
pKSSINdIJRsjrNP7584
pKSSINdIJRsjrNP7585
pKSSINdIJRsjrNP7586
pKSSINdIJRsjrNP7587
pKSSINdIJRsjrNP7588
pKSSINdIJRsjrNP7593
pKSSINdIJRsjrNP7594
pKSSINdIJRsjrNP7595
pKSSINdIJRsjrNP7596
pKSSINdIJRsjrNP7597
pKSSINdIJRsjrNP7599
pKSSINdIJRsjrNP7601
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Con el fin de ensayar los niveles relativos de síntesis de ARNm subgenómico, se insertó el gen indicador de la luciferasa en los vectores en tándem modificados de la región de unión. Se llevó a cabo esta construcción digiriendo con XhoI y SacI y tratando co CIAP los vectores insertados en tándem del núcleo de la región de unión sintética y purificando en gel el fragmento de aproximadamente 10.200 pb resultante. Este fragmento de vector tratado de esta manera se ligó conjuntamente con el fragmento pequeño de 2854 pb resultante de la digestión de pKSII3'SIN-luc con XhoI y SacI. Estas construcciones contienen el gen completo no estructural de Sindbis que codifica la región que finaliza en una región de unión inactivada en el nt. 7597 de Sindbis, el núcleo de la región de unión sintética insertado en tándem (modificado o no modificado), el gen de la luciferasa de luciérnaga, y los elementos 3' víricos necesarios para la replicación del genoma. Siguen los nombres de estos vectores:
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Suponiendo que las eficiencias de la traducción sean equivalentes en todos los vectores de la luciferasa que se muestra inmediatamente antes, se determinaron los niveles relativos de síntesis subgenómica comparando los niveles de producción de luciferasa a las 16 h. después de la transfección de las células BHK-21. Los niveles relativos de transcripción subgenómica se determinaron comparando la producción de luciferasa por los vectores pKSSINBV-luc y pKSSINdIJRsjrc-luc con todos los vectores de la luciferasa de la región de unión modificada que se muestran anteriormente.
Se espera que los vectores que contiene el núcleo de la región de unión sintética insertado en tándem (pKSSINdIJRsjrc, y sus derivados) tendrán un nivel bajo de expresión del ARNm subgenómico, con respecto al constructo pKSSINBV. En algunas formas de realización, puede ser necesario aumentar el nivel de expresión del ARNm subgenómico observado procedente del vector pKSSINdIJRsjrc vector. Esto se llevó a cabo en los términos 5' y 3' del núcleo de la región de unión sintética con 11 nucleótidos adicionales que flanquean Sindbis, de acuerdo con la secuencia vírica auténtica.
La pareja de oligonucleótidos sintéticos que se muestra a continuación se sintetizó in vitro y contiene los 46 nt de Sindbis, que incluyen los 24 nt. del núcleo mínimo de la región de unión. Los nt. de Sindbis están flanqueados con las secuencias de reconocimiento ApaI y XhoI tal como se muestra:
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oligonucleótido 1
CGGAAATAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAAATAGTCAGCATAGT
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oligonucleótido 2
TCGAGGTACTATGCTGACTATTTAGGACCACCGTAGAGATGCTTTA TTTC-CGGGC
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Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron conjuntamente en presencia de Mg 10 mM, s calentaron a 100ºC durante 5 min. y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente, Los oligonucleótidos templados se ligaron en una relación molar 25:1 para insertar el vector pKSSINBVdIJR, preparado de acuerdo con esto: digestión completa con XhoI, seguida por digestión con ApaI en condiciones parciales, dando como resultado una rotura por molécula inducida por ApaI (de dos roturas posibles), purificación en gel del fragmento de 10.655 pb, y tratamiento con CIAP. Este vector que contiene la región de codificación de NSP completa que termina en un núcleo de la región de unión inactivada, unido a una región de unión sintética extendida, y seguido por los elementos 3' víricos necesarios para la replicación, y contenida en el plásmido pKSII+, se conoce como pKSSINdIJRsexjr.
Con el fin de ensayar los niveles relativos de síntesis de ARNm subgenómico, se insertó el gen indicador de la luciferasa en el vector pKSSINdIJRsexjr de la región de unión en tándem extendida. Se llevó a cabo esta construcción digiriendo con XhoI y SacI y tratando con CIAP el plásmido pKSSINdIJRsexjr y purificando en gel el fragmento de aproximadamente10.2000 pb resultante. El fragmento de vector tratado de esta manera se ligó conjuntamente con el fragmento pequeño de 2854 pb resultante de la digestión de pKSII3'SIN-luc con XhoI y SacI. Esta construcción contiene la región de codificación del gen no estructural de Sindbis completo que termina en una región de unión inactivada en el nt. 7597 de Sindbis, la región de unión sintética extendida insertada en tándem, el gen de la luciferasa de luciérnaga, y los elementos 3' víricos necesarios para la replicación del genoma. El nombre de este vector es pKSSINd-IJRsexjr-luc.
Se determinaron los niveles relativos de transcripción subgenómica comparando la producción de luciferasa por el vector pKSSINdIJRsexjr-luc con los vectores pKSSINBV-luc y pKSSINdIJRsjrc-luc.
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Ejemplo 4 A. Inserción del gen E3 de la región desinhibida de adenovirus en vectores Sindbis
Con el fin de inhibir la respuesta CTL dirigida del huésped contra las proteínas específicas víricas expresadas en las células infectadas con el vector en aplicaciones en las que se desea la administración repetida del agente terapéutico, se clonó el Adenovirus de tipo 2 (Ad 2) gen E3/19K ATCC Nº VR-846 en el plásmido pKSSINdIJRsjrc, inmediatamente en la dirección 3' del núcleo de la región de unión.
De manera resumida, Ad 2 se propagó en una línea celular permitida, por ejemplo, células HeLa o Vero, y tras la evidencia de efectos citopatológicos, se purificaron los viriones del lisado celular, y se purificó el ADN de Ad 2 procedente del virus.
El gen E3/19K del ADN de Ad 2, que incluye la secuencia amino terminal de la señal, seguido por la región intraluminal y la cola citoplásmica carboxiterminal que permite a la proteína E3 19K embeberse por sí misma en el retículo endoplásmico, se localizó entre los nucleótidos víricos 28.812 y 29.288. El aislamiento del gen E3 19K de Ad2 procedente del ADN genómico vírico se llevó a cabo mediante amplificación mediante la PCR, con la pareja de cebadores que se muestra a continuación:
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Cebador directo Ad 2 E3 (nucleótidos 28.812-28.835 de Ad 2):
5'-TAT ATC TCC AGA TGA GGT ACA TGA TTT TAG GCT TG-3' (SEC DE ID Nº. 14) 
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Cebador inverso Ad 2 E3 (nucleótidos 29.241-29.213 de Ad 2):
5'-TAT ATA TCG ATT CAA GGC ATT TTC TTT TCA TCA ATA AAA C-3' (SEC DE ID Nº. 15) 
\vskip1.000000\baselineskip
Además de la secuencia complementaria de Ad 2, ambos cebadores contienen una "secuencia tampón" de cinco nucleótidos en sus extremos 5' para la digestión eficiente de la enzima de los productos del amplicón de la PCR. Ésta secuencia en el cebador directo está seguida por el emplazamiento de reconocimiento de XhoI, y en el cebador inverso ésta secuencia está seguida por el emplazamiento de reconocimiento ClaI. De esta manera, en la dirección 5' a 3', el gen E3/19k está flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de XhoI y ClaI. Se llevó a cabo la amplificación del gen E3/19K del ADN de Ad 2 con el siguiente protocolo de ciclo de la PCR.
20
Tras la amplificación, se purificó el amplicón de 451 pb sobre un gel de agarosa al 1,5%, y se digirió posteriormente con las enzimas XhoI y ClaI y se ligó en el plásmido pKSSINdIJRsjrc tratado con CIAP, digerido previamente con XhoI y ClaI, Este clon se designó pKSSINdIJRsjrcAdE3. Usando la misma estrategia de clonación, el gen E3/19K de Ad 2 se insertó en todos los vectores de la región de unión sintética modificada descritos en el Ejemplo 2.
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B. Inserción del gen H301 de citomegalovirus humano en vectores Sindbis
Con el fin de inhibir la respuesta CTL dirigida del huésped contra las proteínas específicas víricas expresadas en las célula infectadas con el vector en aplicaciones en las que se desea la administración repetida del agente terapéutico, se clonó el gen H301 de citomegalovirus (HCMV) en el plásmido pKSSINdIJRsjrc, inmediatamente en la dirección 3' del núcleo de la región de unión.
De manera resumida, la cepa AD 169 de HCMV (ATCC No. VR-538), se propagó en una línea celular permitida, por ejemplo, fibroblastos primarios de prepucio humano (HFF) (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), y tras la evidencia de efectos citopatológicos, se purificaron los viriones procedentes del lisado celular, y se purificó posteriormente el ADN de HCMV procedente de los viriones.
El gen H301 de HCMV se localizó entre los nucleótidos víricos 26.637 y 24.742. Se llevó a cabo el aislamiento del gen H301 de HCMV a partir del ADN genómico mediante la amplificación mediante la PCR, con la pareja de cebadores que se muestra a continuación:
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Cebador inverso HCMV H301 (secuencia tampón/emplazamiento de XhoI/nucleótidos 23.637-23.660 de HCMV):
5'-TAT ATC TCC AGA TGA TGA CAA TGT GGT GTC TGA CG-3' (SEC DE ID Nº. 16) 
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Cebador inverso HCMV H301 (secuencia tampón/emplazamiento de ClaI/nucleótidos 24.744-24.722 de HCMV):
5'-TAT ATA TCG ATT CAT GAC GAC CGG ACC TTG CG-3' (SEC DE ID Nº. 17) 
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Además de las secuencias complementarias del gen H301 de HCMV, ambos cebadores contienen una "secuencia tampón" de cinco nucleótidos en sus extremos 5' par la digestión eficiente de la enzima de los productos del amplicón de la PCR. Esta secuencia en el cebador directo estás seguidas por el emplazamiento de reconocimiento de XhoI, y en el cebador inverso ésta secuencia está seguida por el emplazamiento de reconocimiento de ClaI. De esta manera, en la dirección 5' a 3', el gen H301 de HCMV está flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de XhoI y ClaI. Se llevó a cabo la amplificación del gen H301 de HCMV a partir del ADN de HCMV con el siguiente protocolo de ciclo de la PCR:
21
Tras la amplificación, se purificó el producto amplicón de 1.129 pb sobre un gel de agarosa al 1,0%, y se digirió posteriormente con las enzimas de XhoI y ClaI y se ligó en el plásmido pKSSINdIJRsjrc tratado con CIAP, digerido previamente con XhoI y ClaI. Se designó este clon como pKSSINdIJRsjrcH301. Usando la misma estrategia de clonación, el gen H301 de HCMV se insertó en todos los vectores de la región de unión sintética modificada descritos en el Ejemplo 3.
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Ejemplo 5 Expresión de múltiples genes heterólogos de vectores Sindbis
El plásmido pBS-ECAT (Jang y col., J. Virol 63:1651, 1989) incluye la región 5' no traducida del virus de la Encefalomiocarditis (EMCV) de los nt 260-848 del genoma vírico, que contienen el emplazamiento interno de entrada al ribosoma (IRES). Los nucleótidos 260-827 de EMCV se amplificaron a partir de pBS-ECAT mediante la PCR, usando la siguiente pareja de cebadores:
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Cebador directo A EMCV IRES (para inserción próxima a la región de unión inactivada en el vector pKSSINBVdIJR en el emplazamiento de ApaI):
5'-TAT ATG GGC CCC CCC CCC CCC CCC AAC G-3' (SEC DE ID Nº. 18) 
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Cebador inverso EMCV IRES (Que se va a usar con cualquier cebador A o B):
5'-TAT ATC CAT GGC TTA CAA TCG TGG TTT TCA AAG G-3' (SEC DE ID Nº. 20) 
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El amplicón resultante de la amplificación con el cebador directo A y el cebador inverso está flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de ApaI y NcoI, en el interior de una "secuencia tampón" de 5 pb.
El amplicón resultante de la amplificación con el cebador directo B y el cebador inverso está flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de ClaI y NcoI, en el interior de la "secuencia tampón" de 5 pb.
\newpage
Se llevó a cabo la amplificación de la secuencia IRES DE EMCV procedente del plásmido pBS-ECAT con el siguiente protocolo de ciclo de la PCR:
22
Para la inserción en el vector pKSSINBVdIJR, el amplicón de 589 pb se digirió con ApaI y NcoI, se purificó sobre un gel de agarosa al 1%, y se ligó en el vector tratado con CIAP diferido con ApaI y NcoI. El ATG correspondiente al codón de inicio del gen heterólogo que se va a insertar inmediatamente en la dirección 3' del inserto de IRES DE EMCV está modificado para contener un emplazamiento de NcoI (CCATGG).
Para la inserción en los vectores pKSSINBV o pKSSrNBVdIJRsjrc entre los genes heterólogos, se digirió el amplicón de 589 pb con ClaI y NcoI, se purificó sobre un gel de agarosa al 1%, y se ligó en el vector del gen heterólogo bicistrónico digerido con ClaI y NcoI y se trató con CIAP. En una configuración del gen heterólogo bicistrónico, el extremo 3' del gen heterólogo en la dirección 5' está modificado para finalizar en un emplazamiento de reconocimiento de ClaI. El ATG correspondiente al codón de inicio del segundo gen heterólogo en la dirección 3' que se va a insertar inmediatamente en la dirección 3' del inserto de IRES DE EMCV está modificado para contener un emplazamiento de NcoI (CCATGG). De esta manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc- gen nº 1- Cla/Nco gen EMCV IRES nº 2-3' SIN. La inserción en todos los vectores de la región de unión modificada descritos en el Ejemplo 2 siguen la estrategia dada aquí para los vectores pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc.
El vector pKSSINBVdIJR que contiene una configuración heteróloga bicistrónica está construido con cada uno de los amplicones IRES de EMCV descritos anteriormente. El primer amplicón IRES de EMCV está flanqueado por los emplazamientos de ApaI y de Nco y se inserta inmediatamente en la dirección 3' de la región de unión inactivada en el emplazamiento de APAI, tal como se describe anteriormente. Esta secuencia IRES DE EMCV está seguida por el primer gen heterólogo, que termina en un emplazamiento de reconocimiento de ClaI. El primer gen heterólogo está seguido por la segunda secuencia IRES de EMCV, que usa el amplicón flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de ClaI y de NcoI. El segundo gen heterólogo sigue a la segunda secuencia IRES de EMVC. De esta manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es SINBVdIJR-Apa/Nco gen EMCV IRES Nº 1-Cla/Nco EMCV IRES Nº 2-3' SIN.
El plásmido pP2-5' (Pelletier y col., Mol. Cell Biol. 8: 1103. 1988) incluye la región 5' no traducida de la de cepa P2/Lansing de poliovirus procedente de los nucleótidos 1-1.872 del genoma vírico, que contiene el IRES de polio. Los nucleótidos 320-631 de poliovirus se amplificaron a partir de pP2-5' mediante la PCR, usando la siguiente pareja de cebadores:
Cebador directo A Polio IRES (Para la inserción próxima a la región de unión inactivada en el vector pKSSINBVdIJR en el emplazamiento de ApaI):
5'-TAT ATG GGC CCT CGA TGA GTC TGG ACG TTC CTC-3' (SEC DE ID Nº. 21) 
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Cebador directo B Polio IRES (Para la inserción entre los genes heterólogos que finalizan con los emplazamientos de ClaI y que se inician con los emplazamientos de NcoI):
5'-TAT ATA TCG ATT CGA TGA GTC TGG ACG TTC CTC-3' (SEC DE ID Nº. 22) 
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Cebador inverso Polio IRES (Que se va a usar con cualquiera de los cebadores A o B):
5'-TAT ATC CAT GGA TCC AAT TTG CTT TAT GAT AAC AAT C-3' (SEC DE ID Nº. 23) 
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El amplicón resultante de la PCR con el Cebador inverso A Polio IRES/pareja de cebadores inversos que se muestra anteriormente está flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de ApaI y de NcoI, en el interior de una "secuencia tampón" de 5 pb.
El amplicón resultante de la PCR con el cebador directo B Polio IRES/pareja de cebadores inversos que se muestra anteriormente está flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de ClaI y de NcoI, en el interior de una "secuencia tampón" de 5 pb.
Se llevó a cabo la amplificación de la secuencia polio IRES a partir del plásmido pP2-5' con el protocolo de la PCR que se muestra en el Ejemplo 5:
Para la inserción en el vector pKSSINBVdIJR, se digirió el amplicón de 333 pb con ApaI y NcoI, se purificó sobre un gel de agarosa al 1,5%, y se ligó en el vector digerido con ApaI y NcoI y se trató con CIAP. El ATG correspondiente al codón de inicio del gen heterólogo que se va a insertar inmediatamente en la dirección 3' del inserto polio IRES está modificado para contener el emplazamiento de NcoI (CCATGG).
Para la inserción en los vectores pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc entre los genes heterólogos, se digirió el amplicón de 333 pb con ClaI y NcoI purificado sobre un gel de agarosa al 1,5%, y se ligó en el vector del gen heterólogo bicistrónico digerido con ClaI y NcoI y se trató con CIAP. En una configuración del gen heterólogo bicistrónico, el extremo 3' del gen heterólogo en la dirección 5' está modificado para finalizar en un emplazamiento de reconocimiento de ClaI. El ATG correspondiente al codón de inicio del segundo gen heterólogo en la dirección 3' que se va a insertar inmediatamente en la dirección 3' del inserto polio IRES está modificado para contener un emplazamiento de NcoI (CCATGG). De esta manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc- gen nº 1- Cla/Nco gen polio IRES nº 2-3' SIN. La inserción en todos los vectores de la región de unión modificada descritos en el Ejemplo 3 sigue la estrategia proporcionada aquí para los vectores pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc.
El vector pKSSINBVdIJR que contiene una configuración heteróloga bicistrónica está construido con cada uno de los amplicones polio IRES descritos anteriormente. El primer amplicón polio IRES está flanqueado por los emplazamientos de ApaI y de NcoI y se inserta inmediatamente en la dirección 3' de la región de unión inactivada en el emplazamiento de ApaI, tal como se describe anteriormente. El primer gen heterólogo está seguido por la segunda secuencia polio IRES, que usa el amplicón flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de ClaI y NcoI. El segundo gen heterólogo sigue a la segunda secuencia polio IRES. De esta manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es: SINBVdIJRApa/Nco gen polio IRES nº 1-Cla/Nco EMCV IRES nº 2-3' SIN.
El ADNc de BiP de 220 pb, correspondiente a la región 5' líder del ARNm de la proteína de unión de cadena pesada de la inmunoglobulina humana, está amplificado a partir del clon pGEM5ZBiP5', usando la PCR. Se determinó la secuencia correspondiente al ADNc de BiP originalmente en el clon del bacteriófago lambda hu28-1 del gen GRP78 humano (Ting y Lee, DNA 7: 275-286, 1988). El cebador directo que se va a usar en la reacción de la PCR varía, dependiendo del vector Sindbis en el que se inserta el ADNc de BiP. El cebador inverso de la reacción de la PCR es el mismo para todos los vectores Sindbis. La amplificación de la secuencia de ADNc de BiP procedente del plásmido pGEM5ZBiP5' para la inserción en el vector pKSSINBVdIJR de Sindbis inmediatamente en la dirección 3' de la región de unión inactivada, se llevó a cabo mediante la amplificación con el siguiente cebador directo:
5'-TAT ATG GGC CCG GTC GAC GCC GGC CAA GAC-3' (SEC DE ID Nº. 24) 
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En adición a las secuencias complementarias del ADNc de BiP, comenzando en el nucleótido 12, el cebador contiene una "secuencia tampón" de cinco nucleótidos en su extremo 5' para la digestión eficiente de la enzima de los productos del amplicón de la PCR. Esta secuencia está seguida por el emplazamiento de reconocimiento de ApaI.
Se llevó a cabo la amplificación de la secuencia del ADNc de BiP procedente del plásmido pGEM5ZBiP5 para la inserción en los vectores Sindbis pKSSINBV, o pKSSrNBVdIJRsjrc, mediante la amplificación con el siguiente cebador directo que se muestra a continuación. Para estos vectores, el ADNc de Bip se inserta entre dos genes heterólogos, que se colocan en la región correspondiente a los genes estructurales de Sindbis.
5'-TAT ATA TCG ATG GTC GAC GCC GGC CAA GAC-3' (SEC DE ID Nº. 25) 
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En adición a las secuencias complementarias del ADNc de BiP, comenzando en el nucleótido 12, el cebador contiene una "secuencia tampón" de cinco nucleótidos en su extremo 5' para la digestión eficiente de la enzima de los productos del amplicón de la PCR.
El cebador inverso para la amplificación de la secuencia de ADNc de BiP procedente de pGEM5ZBiP5' para la inserción en los vectores pKSSINBVdIJR, pKSSINBV, o pKSSINBVdIJRsjrc, de Sindbis, es:
5'-TAT ATC CAT GGT GCC AGC CAG TTG GGC AGC AG-3' (SEC DE ID. 26) 
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En adición a las secuencias complementarias del ADNc de BiP, comenzando en el nucleótido 12, el cebador inverso contiene una "secuencia tampón" de cinco nucleótidos en su extremo 5' para la digestión eficiente de la enzima de los productos del amplicón de la PCR. Esta secuencia está seguida por el emplazamiento de reconocimiento de NcoI.
Se llevó a cabo la amplificación del ADNc de BiP procedente de pGEM5ZBiP5' con el protocolo de la PCR que se describe anteriormente:
Para la inserción en el vector pKSSINBVdIJR, se digirió el amplicón de 242 pb con ApaI y NcOI, purificado en un gel de agarosa al 2%, y se ligó en el vector digerido con ApaI y NcoI y tratado con CIAP. El ATG correspondiente al codón de inicio del gen heterólogo que se va a insertar inmediatamente en la dirección 3' del inserto de ADNc de BiP está modificado para contener un emplazamiento de NcoI (CCATGG).
Para la inserción en los vectores pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc entre los genes heterólogos, se digirió el amplicón de 242 pb con ClaI y NcoI, se purificó sobre un gel de agarosa al 2%, y se ligó en el vector del gen heterólogo bicistrónico digerido con ClaI y NcoI y se trató con CIAP. En una configuración del gen heterólogo bicistrónico, el extremo 3' del gen heterólogo en la dirección 5' está modificado para finalizar en un emplazamiento de reconocimiento de ClaI. El ATG correspondiente al codón de inicio del segundo gen heterólogo en la dirección 3' que se va a insertar inmediatamente en la dirección 3' del inserto de ADNc de BiP para contener un emplazamiento de NcoI (CCATGG). De esta manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es: pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc-gen nº 1-Cla/Nco BiP-gen nº 2-3' SIN. La inserción en todos los vectores de la región de unión modificada descritos en el Ejemplo 2 sigue la estrategia proporcionada aquí para los vectores pKSSINBV o pKSSINBVdIJRsjrc.
El vector pKSSINBVdIJR que contiene una configuración heteróloga bicistrónica está construido con cada uno de los amplicones de ADNc de BiP descritos anteriormente. El primer amplicón de ADNc de BiP está flanqueado por los emplazamientos de ApaI y Nco y se inserta inmediatamente en la dirección 3' de la región de unión inactivada en el emplazamiento de ApaI, tal como se describe anteriormente. Esta secuencia BiP está seguida por el primer gen heterólogo, que finaliza en el emplazamiento de reconocimiento de ClaI. El primer gen heterólogo está seguido por la segunda secuencia del ADNc de BiP, que usan el amplicón flanqueado por los emplazamientos de reconocimiento de ClaI y NcoI. El segundo gen heterólogo sigue a la segunda secuencia BiP. De esta manera, de 5' a 3', el orden de los componentes es: SINBVdIJRApa/Nco BiP-gen nº 1-Cla/Nco BiP-gen nº 2-3' SIN.
Las secuencias que promueven la lectura ribosómica se colocan inmediatamente en la dirección 3' de la región de unión inactivada en el vector pKSSINBVdIJR, lo que permite el escaneo en el ARNm genómico de la terminación de los genes no estructurales de los genes heterólogos. Las proteínas heterólogas se expresan a partir del ARNm de longitud genómica mediante el escaneo ribosómico. Esto debería extender la vida de la célula diana infectada debido a que no se produce la transcripción subgenómica en las células infectadas con este vector. Además, estas mismas secuencias de escaneo ribosómico se colocan entre los genes heterólogos contenidos en los ARNm subgenómicos policistrónicos. La secuencia de expansión ribosómica que se va a usar en el vector pKSDINBVdIJR y entre los genes heterólogos en la región del ARNm policistrónico es:
5'-TTA ATT AAC GGC CGC CAC CAT GG-3' (SEC DE ID Nº. 27) 
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Los codones en negrita se refieren al codón de detención ocre y al codón de inicio AUG, respectivamente. Las bases subrayadas que rodean el codón de detención se refieren al emplazamiento de reconocimiento de PacI y las bases subrayadas que rodean el codón de inicio se refieren al emplazamiento de reconocimiento de NcoI. la distancia intercistrónica de 15 pb entre los codones de inicio y de detención permiten la lectura ribosómica eficiente, tal como se muestra anteriormente (Levine y col., Gene 108: 167-174, 1991). Las secuencias que rodean el codón de inicio ATG entre las bases -9 a +1 conforman la secuencia consenso de Kozak para el inicio eficiente de la traducción (Kozak, Cell 44: 283-292, 1986). Cuando es posible, el nucleótido 3' terminal que corresponde al aminoácido carboxiterminal se cambia por T, mediante la mutagénesis dirigida al emplazamiento. También, el nucleótido 5' terminal que corresponde al aminoácido amino terminal en la dirección 3' del cistrón, se cambia por G, mediante la mutagénesis dirigida al emplazamiento.
La inserción de la secuencia intercistrónica entre los genes heterólogos, o en la dirección 3' de la región de unión inactivada en el vector pKSDINBVdIJR, modificado tal como se describe anteriormente, se lleva a cabo mediante la inserción de la pareja de oligonucleótidos de doble cadena, en los extremos compatibles PacI/NcoI compatibles:
Oligonucleótido de sentido directo de lectura:
5'-TAA CGG CCG CCA C-3' (SEC DE ID Nº. 28) 
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Oligonucleótido de sentido contrario de lectura:
5'-CCA TGG TGG CGG CCG TTA AT-3' (SEC DE ID Nº. 29) 
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Los oligonucleótidos anteriores se mezclaron en cantidades molares iguales en presencia de MgCl_{2} 10 mM, se calentaron a 95ºC durante 5 min, y a continuación se dejaron enfriar lentamente a temperatura ambiente, dando como resultado la secuencia intercistrónica deseada flanqueda por los emplazamientos de PacI y NcoI. A continuación se ligó la secuencia intercistrónica en el vector apropiado que contenía los emplazamientos PacI y NcoI compatibles.
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Ejemplo 6 Expresión de múltiples genes heterólogos mediante empaquetamiento simultáneo
Tal como se ha señalado anteriormente dentro de un aspecto de la divulgación, los genes de las proteínas no estructurales y los genes de las proteínas estructurales de Sindbis se pueden empaquetar simultáneamente como moléculas de ARN de sentido directo positivas que mantienen su replicación-competencia, si cada uno de los ARN contiene las secuencias cis-actuantes requeridas para la replicación y el empaquetado. Por tanto, dentro de este aspecto todos los fragmentos de ARN de virus Aura empaquetados simultáneamente deberían contener también una secuencia 5' que sea capaz de iniciar la transcripción del ARN de Aura, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del virus Aura, y al menos una copia de la secuencia de empaquetamiento del ARN. Al menos una de las moléculas de ARN empaquetada simultáneamente debe contener las secuencias que codifican las proteínas no estructurales del virus Aura: En las formas de realización de realización preferidas de la divulgación, uno o más de los fragmentos de ARN que se van a empaquetar simultáneamente puede contener también una región vírica seguida por un gen heterólogo.
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A. Construcción de casetes de expresión de empaquetamiento simultáneo para la expresión de múltiples genes heterólogos
Con el fin de demostrar la factibilidad del empaquetamiento simultáneo para permitir la expresión de múltiples genes heterólogos, se crearon dos constructos de vector. El primer constructo constituido por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción del ARN de Sindbis, las secuencias de ARN de Sindbis requeridas para el empaquetamiento, las secuencias que codifican la síntesis de las proteínas no estructurales 1-4, una región de unión de Sindbis, el gen de la luciferasa, y las secuencias 3' de Sindbis requeridas para la síntesis del ARN de la cadena -. El segundo constructo constituido por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un virus Sindbis, una región de unión de Sindbis, las secuencias de Sindbis requeridas para el empaquetamiento, las secuencias que codifican el gen LacZ y las secuencias 3' requeridas para la síntesis del ARN de cadena menos. Los transcriptos de ARN de estos constructos transfectados en una línea celular de empaquetamiento se empaquetaron simultáneamente para producir una partícula de vector capaz de transferir la expresión de la luciferasa y la \beta-galactosidasa en la misma célula eucariota.
Se insertó el gen indicador de la \beta-galactosidasa en el Vector Sindbis Básico (pKSSINBV) seguido por la delección de una porción de las proteínas no estructurales de Sindbis procedentes del vector. El ARN de este constructo se transfectó simultáneamente con ARN del Vector de la Luciferasa de Sindbis (pKSSINBV-luc) y se empaquetó simultáneamente mediante uno de los procedimientos descritos a continuación. La infección de las células BHK-21 frescas con las partículas del vector que contenían los casetes de expresión del ARN empaquetado simultáneamente deberían dar como resultado la expresión de la luciferasa y la \beta-galactosidasa en la misma célula.
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B. Construcción del casete de expresión de la \beta-galactosidasa
Se obtuvo el gen lacZ mediante digestión del ADN del vector pSV-\beta-galactosidasa (Promega Corp., Madison, WI) con las enzimas HindIII y SAlI. El fragmento de 3749 pb que contenía el gen LacZ se purificó en un gel de agarosa al 1%. Posteriormente, se ligó este fragmento en el plásmido pSP72 (Promega Corp.) que está también digerido con HindIII y SalI y se purificó usando Geneclean (Bio101 Corp., San Diego, CA). Se conoce este constructo como pSP72-lacZ. Se digirió el plásmido pSP72 con las enzimas XhoI y XbaI, y el fragmento de 3767 pb que contenía LacZ se purificó en un gel de agarosa al 1%. A continuación se ligó este fragmento en pKSSINBV que está también digerido con XhoI y XbaI y se purificó usando Geneclean. Este constructo de Sindbis, que contenía LacZ, se conoce como pKSSINBV-lacZ. El plásmido pKSSINBV-lacZ se digirió posteriormente con la enzima Agel, que corta en los nucleótidos 3172 y 6922 de las secuencias génicas de la proteína no estructural de Sindbis. El fragmento restante del vector se purificó mediante Geneclean y se volvieron a ligar sus extremos. El plásmido tiene ahora una delección de 3750 pb en los genes de la proteína no estructural de Sindbis, que los inactivan funcionalmente. Se conoce este constructo como pKSSINBVdINSP-lacZ.
Se prepararon los transcriptos SP6 de pKSSINBVdINSP-lacZ y pKSSINBV-luc tal como se describe anteriormente. Estos transcriptos de ARN se transfectaron simultáneamente en las células de empaquetamiento que expresan las proteínas estructurales de Sindbis mediante uno de los mecanismos descritos anteriormente. Cada transcripto de ARN contiene una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un virus Sindbis, las secuencias de ARN requeridas para el empaquetamiento, una región de unión de Sindbis, un gen indicador, y las secuencias 3' de Sindbis requeridas para la síntesis del ARN de la cadena menos. El transcripto pKSSINBV-luc contiene también las proteínas no estructurales de Sindbis. En las células transfectadas simultáneamente, ambos transcriptos de ARN se replican y algunas partículas víricas contendrán ambos transcriptos de ARN empaquetados simultáneamente en la misma partícula. La infección de las células frescas con las partículas de ARN empaquetadas simultáneamente dará como resultado una célula que expresa la luciferasa y la \beta-galactosidasa.
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C. Empaquetamiento simultáneo de casetes de múltiple expresión para aumentar la capacidad de empaquetado
Grandes genes tales como el Factor VIII pueden beneficiarse del empaquetamiento simultáneo. La inserción del ADNc que codifica el Factor VIII en el Vector Sindbis Básico (pKSSINBV) da como resultado un transcripto de ARN de aproximadamente 16 kb de longitud, Debido al aumento de longitud, este ARN puede no replicarse o empaquetarse eficientemente. Usando las soluciones descritas anteriormente, las proteínas no estructurales de Sindbis y el gen del Factor VIII se dividirían en moléculas de ARN diferenciadas de aproximadamente 8 kb y 9 kb de longitud, y empaquetadas simultáneamente en las mismas partículas.
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D. Construcción de un casete de expresión del factor VIII
El constructo pKSSINBV se digirió con la enzima SacI, que rompe inmediatamente después el extremo 3' y la secuencia poli A de Sindbis. Se prepararon los extremos 3' sobresalientes enromados mediante la adición de la enzima ADN polimerasa T4 y los dNTP e incubación durante 10 minutos a 16ºC. El fragmento digerido se purificó usando Geneclean y se ligó a un ligante autocomplementario de 12 nucleótidos (5'-GTCACCGGTGAC-3') (SEC DE ID Nº. 30) que contenía el emplazamiento de reconocimiento de SgrAI. Esta etapa es necesaria debido a que el Factor VIII contiene los emplazamientos de SacI, y el emplazamiento de reconocimiento de SgrAI está sustituido por el emplazamiento de SacI con el fin de crear un emplazamiento para la linealización del plásmido antes de la transcripción de SP6. Se conoce este constructo como pKSSINBV-SgrAI. El constructo pKSSINBV-SgrAI se digirió con las enzimas XbaI y NotI, y se purificó usando Geneclean. Se obtuvo la secuencia de ADNc del Factor VIII mediante digestión con las enzimas XbaI y NotI. El fragmento de 8 kb que codificaba el Factor VII se purifico en un gel de agarosa al 1% y se ligó posteriormente con el pKSSINBV-SgrAI digerido con XbaI/NotI. Se conoce este constructo como pKSSINBV-Factor VIII.
El constructo pKSSINBV-Factor VIII se digirió con AgeI, que corta en las proteínas no estructurales de Sindbis en los nucleótidos 3172 y 6922, se purificó usando Geneclean, y se volvió a ligar por sí mismo. El constructo tiene ahora una delección de 3750 pb en las proteínas no estructurales de Sindbis que lo inactiva funcionalmente. Se conoce este constructo como pKSSINBVdINSP-Factor VIII. Se prepararon los transcriptos SP6 de pKSSINBVdINSP-Factor VIII y de pKSSINBV tal como se describe anteriormente. Estos transcriptos de ARN se transfectaron simultáneamente en células de empaquetado que expresan las proteínas estructurales de Sindbis mediante uno de los mecanismos descritos anteriormente. Ambos transcriptos de ARN contiene una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción del ARN de Sindbis, las secuencias requeridas para el empaquetado del ARN, una región de unión de Sindbis, y las secuencias 3' de Sindbis requeridas para la síntesis del ARN de cadena menos. Además, el transcripto pKSSINBV contiene los genes de la proteína no estructural de Sindbis, y el constructo pKSSINBV-Factor VIII contiene el gen del Factor VIII, pero no los genes de la proteína no estructural de Sindbis. En las células transfectadas simultáneamente, ambos transcriptos de ARN están replicados y algunas partículas víricas contendrán ambos transcriptos de ARN empaquetados simultáneamente en la misma partícula del vector. La infección de células BHK-21 frescas con el ARN empaquetado simultáneamente dará como resultado la expresión del Factor VIII únicamente si están presentes ambas moléculas de ARN en la misma célula.
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E. Construcción de un vector empaquetado simultáneamente de virus aura
Para desarrollar sistemas de expresión del virus Aura análogos a los descritos para Sindbis, se utilizarán las técnicas estándar conocidas en la técnica, así como las soluciones específicas descritas en el interior de esta patente, para las construcciones. Se obtendrá el virus de la ATCC, células cultivadas propagadas, su ARN de virión extraído, y expandiendo el ADNc del genoma completo sintetizado y clonado siguiendo las técnicas convencionales. Se usará este ADNc para construir los sistemas del vector de transferencia génica similares en lo principal a los descritos para la patente de Sindbis, incluyendo, pero sin limitarse a, un replicón capaz de transportar el(los) gen(es) heterólogo(s), las líneas celulares de empaquetado que expresan los genes de la proteína estructural, y único en este sistema, un vector subgenómico competente para empaquetado separado capaz de transportar el(los) gen(es) heterólogo(s) adicional(es).
Debido a que el ARN subgenómico del virus Aura contiene una señal de empaquetado, deben llevarse a cabo experimentos preliminares para identificar esta secuencia, con el fin de evitar su inactivación durante las sustituciones con el(los) gen(es) heterólogo(s). Tras la identificación de la secuencia de empaquetado, se generarán los elementos individuales de este sistema basado en Aura.
Se construirá un vector de replicón básico para contener los siguientes requisitos mínimos: las secuencias 5' de Aura necesarias para la replicación, las regiones de codificación de la proteína no estructural, una región de unión modificada o no modificada para la síntesis del ARNm subgenómico, un emplazamiento de clonación múltiple para la inserción del(de los) gen(es) heterólogo(s), una o más copias de la señal de empaquetado, y las secuencias 3' de Aura necesarias para la replicación, incluyendo una secuencia poliadenilada. Se utilizará una ARN polimerasa de bacteriófago en la dirección 5' para la transcripción in vitro del ARN del replicón; alternativamente, se utilizará un promotor de la ARN polimerasa de eucariota para la transcripción directamente a partir del ADNc.
Se construirá un vector subgenómico competente para el empaquetado para contener los siguientes requisitos mínimos: una región de unión modificada o no modificada, un emplazamiento de clonación múltiple para la inserción del(de los) gen(es) heterólogos, una o más copias de la señal de empaquetado, y las secuencias 3' de Aura necesarias para la replicación/síntesis de la cadena menos, incluyendo una secuencia poliadenilada. El vector subgenómico puede, en algunos casos, construirse con las secuencias 5' de replicación de Aura situadas en la dirección 5' de la región de unión, de tal manera que el vector funcionará como un amplicón. Se llevará a cabo la transcripción del ARN del vector subgenómico in vitro usando un promotor de ARN polimerasa de bacteriófago. Además, el transcripto inicial puede ser de configuración de sentido directo o de configuración de sentido contrario.
Se construirán líneas celulares de empaquetado tal como se ha descrito anteriormente para los vectores Sindbis, de tal manera, de tal manera que el ARNm de una o más de las proteínas estructurales se transcribirá a partir de la región de unión y será inducible por el replicón de Aura. En otros casos, una o más de las proteínas estructurales se expresarán bajo el control de un promotor eucariota inducible o constitutivo. En cada caso, se llevarán a cabo mutaciones inactivantes específicas en cualquier secuencia de empaquetado presentes en los genes de la proteína estructural, con el fin de evitar la encapsidación de estas secuencias con el replicón. Estas mutaciones serán cambios silenciosos, normalmente en la tercera posición del codón, que no afectarán al aminoácido codificado.
Se explotará la capacidad para empaquetar múltiples genes heterólogos para muchas aplicaciones terapéuticas, que incluyen, pero no se limitan a, la expresión de múltiples citoquinas, múltiples epitopos CTL, combinaciones de citoquinas y epitopos CTL para potenciar la presentación inmune, múltiples subunidades de una proteína terapéutica, combinaciones de proteínas terapéuticas y ARN de sentido contrario. En adición a su utilidad para la expresión de múltiples genes heterólogos, el empaquetado de ARNm subgenómicos en viriones permitirá a este sistema de vector la transferencia de secuencias extremadamente largas, que pueden ser imposibles en otros sistemas de alfavirus. Adicionalmente, la solución multipartido puede ser útil en el desarrollo de líneas celulares productoras, en las que se expresan de manera estable proteínas replicasa y proteínas estructurales, y cualquier gen heterólogo contenido en el interior de un vector subgenómico podría entonces introducirse fácilmente como un integrante estable.
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Ejemplo 7 Construcción de líneas celulares que empaquetan el virus Sindbis
Una forma de realización adicional del sistema de transferencia génica de Sindbis inmediatamente anterior al desarrollo de las líneas de empaquetado de Sindbis. Debido a que el ciclo de replicación normal de Sindbis tiene lugar completamente en el citoplasma, una solución para crear un sistema de línea celular que empaqueta Sindbis es modelar el sistema tras su ciclo de replicación natural. Usando esta solución, se diseña el sistema de línea celular que empaqueta Sindbis en el que las proteínas estructurales, suministradas en trans a partir de uno o más vectores de expresión integrados de manera estable, son capaces de encapsidar los transcriptos del ARN del vector transfectado o transducido en el citoplasma y liberar partículas infecciosas empaquetadas del vector a través de la membrana celular, creando de esta manera una línea celular productora del vector Sindbis. Las moléculas del vector de ARN de Sindbis, capaces de replicarse en el citoplasma de la célula se producen inicialmente mediante un sistema de la ARN polimerasa T7 usado para transcribir in vitro un clon de vector de ADNc que codifica el gen de interés y las proteínas no estructurales de Sindbis (descritas anteriormente). Los transcriptos de ARN del vector se transfectan a continuación en la línea celular empaquetada de Sindbis, de tal manera que el ARN del vector se replica a altos niveles, y se empaqueta posteriormente por las proteínas estructurales víricas, dando como resultado partículas de vector infecciosas. Debido a la longitud extendida de la molécula de ADNc de Sindbis, el proceso de transcripción in vitro es ineficiente. Además, sólo una fracción de las células contenidas en una monocapa se transfecta normalmente mediante la mayoría de procedimientos. En un esfuerzo por optimizar el rendimiento y la valoración de la línea celular productora del vector, se llevaron a cabo dos ciclos sucesivos de transferencia génica. Más bien que transfectando directamente las moléculas del vector de ARN de Sindbis en la línea celular productora, se transfectó el vector en primer lugar en una línea celular primaria de empaquetado de Sindbis. La línea celular transfectada secreta partículas de vector infecciosas en los sobrenadantes del cultivo y estos sobrenadantes infecciosos se usan a continuación para transducir una monocapa fresca de células empaquetadas de Sindbis, Se prefiere la transducción del vector Sindbis en la línea celular de empaquetado sobre la transfección debido a su mayor eficiencia de transferencia de ARN en las células, y la sustitución biológica optimizada del vector en la célula. Esto conduce a una mayor expresión y mayor valoración del vector Sindbis recombinante infeccioso empaquetado.
En el ejemplo en el que las partículas del vector Sindbis fracasan en transducir la misma línea celular de empaquetado, la línea celular produce las proteínas de la envoltura extracelular que bloquean los receptores celulares para la unión del vector Sindbis, debe crearse un segundo tipo de partícula vírica Sindbis que sea capaz de transducir las células de empaquetado de Sindbis. Este segundo tipo de partícula vírica debe producirse mediante una línea celular de empaquetado conocida como "línea celular de salto", que produce partículas de vector transitorias como resultado de transfectarse con transcriptos del vector de ARN de Sindbis transcritos in vitro. La línea celular de salto se diseña mediante ingeniería genética par redirigir el tropismo del receptor de las partículas del vector producido transitoriamente proporcionando proteínas de la envoltura vírica alternativas que redirigen los vectores Sindbis a receptores celulares diferentes en un proceso denominado pseudotipificación. Actualmente se han propuesto dos soluciones para la pseudotipificación de las partículas del vector Sindbis. La primera solución consiste en una línea celular que empaqueta Sindbis que expresa simultáneamente la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G). Para los inventores, ha funcionado anteriormente bien la pseudotipificación de VSV-G para redirigir el tropismo del receptor de los vectores retrovíricos y se ha demostrado que infecta una amplia variedad de tipos celulares. La segunda solución para producir una partícula de vector Sindbis pesudotipificada es usar las líneas celulares de empaquetado retrovírico actualmente disponibles que contienen las secuencias gag/pol y env retrovíricas que serían capaces de empaquetar un vector de ARN de Sindbis que contiene una secuencia de empaquetado retrovírica.
La modelación de la línea celular de empaquetado de Sindbis tras el ciclo de replicación natural del virus Sindbis debería dar como resultado en una línea celular altos niveles de rendimiento de la expresión génica basados en el número de moléculas de ARN disponibles para la traducción que se generan a partir de la molécula de ARN que se replica. Por otra parte, los virus de ARN de cadena positiva tienden a producir ARN interferentes defectivos que pueden tender a alterar el vector de ARN, disminuyendo de esta manera la efectividad global de las partículas del vector, y que pueden disminuir también los altos niveles de expresión durante períodos de cultivo extendidos. Por tanto, se ha propuesto una segunda solución en la que se usa un vector de expresión de ADN integrado de manera estable para producir la molécula de ARN del vector Sindbis, que, como en la primera solución, mantiene la capacidad de autoreplicarse. Esta solución permite la expresión continua del vector durante largos periodos de cultivo debido a que el sistema integrado de expresión del vector de ADN se mantiene mediante un marcador de selección del fármaco y el sistema de ADN expresará constitutivamente los vectores de ARN no alterado que no se pueden diluir por las copias de ARN defectivo. En esta configuración celular productora, el vector Sindbis basado en ADN se introduce inicialmente en la línea celular de empaquetado mediante transfección, debido a que las restricciones de tamaño podrían evitar el empaquetado del vector de expresión en una partícula de vector vírica para la transducción. También, para esta configuración, el emplazamiento de reconocimiento de la ARN polimerasa T7 del plásmido, usado anteriormente para transcribir el ARN del vector, está sustituido con otra secuencia promotora apropiada definida por la línea celular parental usada. Esta secuencia de plásmido contendría también un marcador de selección diferente del usado para crear la línea celular de empaquetado.
La expresión de las proteínas de Sindbis y/o el ARN del replicón a ciertos niveles pude dar como resultado efectos citotóxicos en las líneas celulares de empaquetado. Por tanto, en algunos ejemplos, puede ser deseable para estos elementos expresarse sólo después que las células se han propagado hasta una cierta densidad crítica. Para este objetivo, se llevaron a cabo modificaciones adicionales en las que las proteínas estructurales necesarias para el empaquetado se sintetizaron sólo después de la inducción mediante el vector de ARN por sí mismo o algún otro estímulo. También, algunas modificaciones permiten la expresión individual de estas proteínas bajo el control de elementos inducibles diferentes, utilizando vectores de expresión que separan los genes que codifican estas proteínas. Además, se puede controlar la expresión de la molécula integrada del vector por sí misma mediante otro sistema inducible adicional. Esta configuración da como resultado una cascada de episodios tras la inducción, que conduce de manera última a la producción de partículas de vector empaquetadas.
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A. Elección de una línea celular parental para el desarrollo de la línea celular que empaqueta Sindbis 1. Células infectables persistente o crónicamente
Un criterio importante para seleccionar potenciales líneas celulares parentales para crear líneas celulares que empaquetan Sindbis, es la elección de las líneas celulares que no se lisan durante la replicación y producción del vector Sindbis. Este criterio es esencial para el desarrollo de un vector Sindbis que produzca que la línea celular se pueda propagar durante largos periodos de tiempo y usarse como fuente estable del vector: Se sabe que la infección por Sindbis de la mayor parte de células de mamíferos da como resultado la lisis de la célula; sin embargo, la utilización de diversas líneas celulares de insectos debería solventar este problema. Como ejemplo, la infección de células del mosquito Aedes albopictus con virus Sindbis da como resultado el crecimiento persistente o crónico del virus no citopático en el que las células infectadas permanecen viables y el virus difunde continuamente. Otras líneas celulares de insectos, tales como Aedes albopictus o la línea celular de Drosophila, contienen un vector de expresión transfectado de manera estable que expresa las proteínas estructurales de Sindbis bajo el control de promotores inducibles o no inducibles activos en estos tipos celulares, y expresan simultáneamente un marcador seleccionable.
Recientemente, se ha identificado y purificado una proteína de origen celular inducida por el virus Sindbis, que se ha asociado con la infrarregulación de la producción de virus Sindbis en células de Aedes albopictus infectadas (Virology 194:44). La proteína es un péptido hidrófobo pequeño de aproximadamente 3200 Da., que puede inducir el estado antivírico e inhibir la síntesis de ARN vírico de 49S y 26S. Las células tratadas con el péptido antivírico demuestran normalmente la detención inactiva de la división celular durante 96 horas en células no infectadas, y a continuación se restauran las velocidades de crecimiento normales. Las células que se han expuesto a este péptido antes de la infección son incapaces de replicar el virus Sindbis y parecen mantener este fenotipo produciendo constitutivamente la proteína antivírica durante 10 meses de paso continuo.
Se reconoce que esta respuesta celular a la infección por Sindbis en células de Aedes albopictus puede disminuir la eficiencia óptima de un sistema de producción de vector Sindbis recombinante. Para mejorar la eficiencia de producción del vector Sindbis, se han propuesto dos procedimientos para inactivar la proteína antivírica celular inducida por virus, evitando de esta manera cualquier reducción de los títulos de partículas del vector. El primer procedimiento implica la purificación de esta proteína celular descrita anteriormente, y la determinación de una porción de la secuencia de aminoácidos primaria a partir de su término carboxi usando las técnicas establecidas conocidas en la técnica. A continuación se usa la secuencia de aminoácidos resultante para derivar las posibles secuencias genómicas correspondientes permitiendo diseñar una pareja de cebadores de la PCR degenerados que se puede usar para amplificar la secuencia celular específica. A continuación se clona esta secuencia amplificada usando las técnicas estándar conocidas en la técnica, para obtener una región discreta del gen que codifica esta proteína inhibidora. La determinación de la secuencia de nucleótidos de este clon permite a continuación diseñar un vector que se integrará específicamente en el interior del gen inhibidor de Sindbis mediante recombinación homóloga, y "desactivar" su capacidad para expresar una proteína funcional. Se pueden seleccionar clones que contengan la secuencia de desactivación mediante la inserción de un marcador seleccionable en la región clonada discreta de la proteína inhibidora, antes de transfectar las células con el vector.
Un segundo procedimiento par inactivar esta proteína inhibidora del virus Sindbis implica la mutagénesis de las células de Aedes albopictus con, por ejemplo, BUDR (5-bromodesoxiuridina). Esta población de la línea celular empaquetada mutagenizada se infecta a continuación con un vector Sindbis, que es capaz de expresar el marcador de la resistencia a la neomicina. Con elevadas concentraciones de fármaco G418, sólo aquellas células que producen grandes cantidades de vector Sindbis, y de esta manera incapaces de expresar el gen inhibidor Sindbis, serán capaces de sobrevivir. Tras la selección, las colonias resistentes se combinan, se clonan por dilución, y se ensayan par la producción de de elevados títulos de Sindbis.
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2. Modificación de las células par disminuir la susceptibilidad a la expresión de Sindbis: Supresión de la apoptosis
Aunque la mayor parte de líneas celulares de mamíferos se lisan normalmente durante la infección por el virus Sindbis, recientes experimentos han demostrado la conversión de la infección de lítica a persistente de Sindbis en una línea celular de adenocarcinoma prostático (AT-3) de rata.
Se llevó a cabo esta conversión expresando constitutivamente el producto del oncogen bcl-2 en la línea celular anterior de infección por Sindbis. La infección por Sindbis de las células AT-3 que expresan el oncogen bcl-2 da como resultado la producción de virus sin citopatología obvia (Nature 361:739).Esta modificación de la línea celular podría probar ser útil para convertir líneas celulares tales como las líneas celulares caninas D-17 y Cf2; las líneas celulares humanas HT1080 y 293; la línea celular de codorniz QT6; la línea celular de riñón de cría de hámster BHK-21; la línea celular de neuroblastoma de ratón N18; y el adenocarcinoma prostático de rata AT-3 en el estado infectable persistentemente para uso como líneas celulares productoras y que empaquetan Sindbis potenciales similares a los de las líneas celulares de retrovectores.
Se ha descrito anteriormente un vector de expresión retrovírica del oncogen bcl-2 (Nature 361:739). Se construyó un nuevo vector de expresión bcl-2 usando las técnicas estándar de ADN recombinante conocidas en la técnica para insertar el fragmento de ADNc de EcoRI de 910 parejas de bases del fragmento derivado del plásmido p84 (Nature 336:259) en cualquier vector de expresión comercialmente disponible que contenga un promotor constitutivo y codifique un marcador seleccionable. Debe tomarse una consideración cuidadosa en evitar cualquier tipo de homología entre las secuencias de ácido nucleico de Sindbis y otros vectores transducidos. Debería tomarse esta precaución con el fin de evitar episodios de recombinación que puedan conducir a marcadores seleccionables de empaquetado indeseables del oncogen bcl-2 en las partículas de Sindbis recombinantes. Este es un punto importante a realizar debido a que el sistema de vector Sindbis descrito en el presente documento se diseña para el uso como terapéutica biológica. Una vez que se construye el vector de expresión bcl-2, la línea celular parental de mamífero (es decir, las células BHK-21) se transfecta usando cualquier técnica estándar y se selecciona para el marcador apropiado. A continuación se combinan las colonias resistentes, seguido por la clonación por dilución. A continuación se propagan los clones individuales y se detectan sistemáticamente para la expresión de bcl-2. Una vez se ha verificado la expresión, se ensaya la infección persistente de Sindbis, seguido por su uso como línea celular parental para el desarrollo de la línea celular que empaqueta Sindbis.
La infección por Sindbis de células BHK da como resultado cambios morfológicos y modelos de fragmentación del ADN diagnósticos de la apoptosis y la conversión de la infección de lítica a persistente por el oncogen bcl-2, que puede mediar mediante una supresión de esta muerte celular programada (Nature 361:739). Además, la infección de células de mamíferos con otros virus que incluyen adenovirus, Poliomavirus, SV40, y VIH a dado como resultado citotoxicidad debida a la apoptosis. Por tanto, otros productos génicos, además del oncogen bcl-2, que suprime la apoptosis serían deseables para la expresión en una línea celular productora o que empaqueta Sindbis. Inicialmente, tres genes víricos, que muestran suprimir la apoptosis, se expresarán en las líneas celulares que empaquetan Sindbis: el gen E1B de adenovirus que codifica la proteína de 19-kD (Rao y col., PNAS 89: 7742-7746. 1992), el gen g_{1} 34.5 de tipo 1 del virus del herpes simple (Chou y Roizman. PNAS 89: 3266-3270, 1992), y el gen p35 de baculovirus AcMNPV (Clem y col., Science 254.1: 1388-1390, 1991). Los genes individuales se insertan en vectores de expresión plásmida, bajo el control de promotores transcripcionales eucariotas constitutivos y que contienen un marcador seleccionable, usando las técnicas estándar conocidas en la técnica. Estos vectores de expresión se transfectan posteriormente en líneas celulares tal como se ha descrito anteriormente, y se aplica la selección apropiada. La selección para la integración estable de estos genes y la expresión constitutiva de sus productos debería permitir una producción del vector más extensa en las líneas celulares conocidas por ser susceptibles a los episodios apópticos inducidos por Sindbis. Además, es factible que cada producto génico pueda inhibir la apoptosis mediante su propio mecanismo único. Por tanto, los genes se introducirán también en las líneas celulares de empaquetado en diversas combinaciones para obtener un efecto supresor más fuerte. Finalmente, otros productos génicos que tienen efectos similares sobre la apoptosis se pueden incorporar fácilmente en las líneas celulares de empaquetado que se han descubierto.
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Se establecen líneas celulares transformadas de SV40 y Py, y la cinética y el nivel de producción de Sindbis, y la citopatología tras la infección vírica determinada. Si los episodios apópticos característicos de la proliferación de Sindbis en células de hámster están disminuidos, cada prototipo de línea celular que empaqueta Sindbis se transforma posteriormente con Py o SV40 con el fin de aumentar el rendimiento del vector empaquetado procedente de estas células.
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3. Modificación de las células para disminuir la susceptibilidad a la expresión de Sindbis: Producción de partículas de vector dependientes de activación
La glicoproteína E2 de Sindbis se sintetiza como precursor, PE2. Este Precursor PE2 y la segunda glicoproteína vírica, E1, se asocian en el retículo endoplásmico y se procesan y transportan a la membrana celular infectada como un heterodímero para la incorporación del virión En algún punto durante este procesamiento, PE2 se rompe en E3 y E2 maduras. E3 tiene 64 restos amino terminales de PE2 y se pierde en el espacio extracelular durante la maduración. El producto de la rotura más grande, E2, se asocia con E1 y se ancla en lo que se convierte en la envoltura vírica. Una proteasa celular del huésped es responsable del procesamiento del precursor de PE2, que rompe en el emplazamiento que sigue inmediatamente a un motivo de resto de cuatro aminoácidos (aa) clásicamente muy conservados, los aa básico-X-básico-básico. Una línea celular mutante de la cepa CHO-K1, designada RPE.40 (Watson y col., (1991) J. Virol 65: 2332-2339), es defectiva en la producción de la cepa AR339 de virus Sindbis, debido a su incapacidad para procesar el precursor PE2 en las formas E3 y E2 maduras. Las envueltas de los viriones Sindbis producidos en la línea celular RPE.40 contienen por tanto el heterodímero PE2/E1 Las células RPE.40 son al menos 100 veces más resistentes a la infección por virus Sindbis que las células CHO-K1 parentales, sugiriendo una ineficiencia en la capacidad de PE2 de contener viriones para infectar las células. Estos viriones defectivos producidos por la línea celular RPE.40 se pueden convertir en formas completamente infecciosas mediante tratamiento con
tripsina.
En las líneas celulares de empaquetado o productoras, cualquier virus de tipo natural producido mediante recombinación reinfectará las células y se amplificará rápidamente: contaminando significativamente, de esta manera, las preparaciones de vector empaquetadas. Las células productoras desarrolladas a partir de la línea RPE.40 serían una mejora significativa sobre otras líneas permitidas para la infección del virus Sindbis, debido a la amplificación ineficiente de cualquier virus de tipo natural generado durante la producción y empaquetado del vector. De esta manera, las preparaciones de vector no están significativamente contaminadas con el virus de tipo natural. Además, se puede extender este sistema a otras líneas celulares mediante el desarrollo de mutantes "de desactivación" en la proteasa celular análoga.
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4. Desarrollo de la línea celular de salto
Se usan líneas celulares de salto de Sindbis, tal como se ha descrito anteriormente, para producir transitoriamente partículas de vector de ARN infecciosas que se han pseudotipificado para un tropismo diferente del receptor celular. Una vez que la línea celular de salto produce las partículas del vector, no se requiere más debido a que sólo se necesitan los sobrenadantes de los cultivos infecciosos para transducir las líneas celulares originales que empaquetan Sindbis tal como se describe anteriormente.
Por tanto, la línea celular de salto no necesita presentar infección persistente por Sindbis con el fin de producir transitoriamente partículas de vector. En este ejemplo, la línea celular parental puede ser tanto una línea celular de insecto que presente infección persistente, como una línea celular de mamífero que probablemente lise en las 72 horas después de una infección productora de Sindbis. El único criterio es que las líneas celulares sean capaces de expresar y procesar las proteínas estructurales de Sindbis expresando simultáneamente a la vez tanto la proteína VSV-G como las proteínas gag-pol y env retrovíricas sin afectar el crecimiento celular antes de la transfección con el vector de ARN de Sindbis. Por tanto, la línea celular de salto de Sindbis puede ser cualquiera de las líneas celulares parentales anteriormente mencionadas capaces de soportar tanto a Sindbis como la replicación retrovírica, sin modificaciones celulares adicionales, tal como se ha descrito anteriormente, tales como la expresión del oncogen bcl-2.
La creación del vector Sindbis pseudotipificado con VSV-G requiere la transfección simultánea del ARN del vector Sindbis transcrito in vitro o el ADN, junto con el vector pMLP-G, que expresa la proteína de la envoltura VSV-G en la línea celular que empaqueta Sindbis. Se describen las condiciones de crecimiento celular y los procedimientos de transfección bajo el encabezado "ensamblaje de los componentes" y se usan cualquiera de las configuraciones celulares de empaquetado descritas. Los sobrenadantes, que contienen el vector Sindbis pseudotipificado con VSV-G se cosechan a las 24 horas después de la transfección y se usan a continuación para transducir monocapas frescas de la línea celular idéntica que empaqueta Sindbis, para superar la reducción en la eficiencia de la transducción.
Para la pseudotipificación de los vectores Sindbis en las líneas celulares de empaquetado retrovírico, se puede usar cualquier línea celular referenciada en la bibliografía que exprese las secuencias gag-pol y env retrovíricas para empaquetar un vector de ARN de Sindbis, que se han diseñado mediante ingeniería genética para contener una secuencia de empaquetado retrovírico. La secuencia psi de empaquetado retrovírico se inserta entre la región de unión inactivada y una repetición en tándem de la región de unión sintética, de tal manera que sólo el vector de longitud genómica, y el ARNm no subgenómico, se empaqueten mediante las proteínas de la envoltura retrovírica. Las partículas retrovíricas que contienen un ARN del vector Sindbis se producen transfectando in vitro el ARN transcrito del vector Sindbis usando los procedimientos que se han descrito anteriormente. Los sobrenadantes con partículas víricas pseudotipificadas que contienen el vector de ARN de Sindbis se cosechan a las 24 horas después de la transfección, y a continuación se pueden usar estos sobrenadantes para transducir una línea celular que empaqueta Sindbis.
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B. Constructos de expresión de la proteína estructural 1. Constructos de vector de proteína estructural inducibles y constitutivos
El desarrollo de las líneas celulares que empaquetan Sindbis es dependiente de la capacidad para sintetizar altos niveles intracelulares de las proteínas estructurales necesarias; la cápsida, E2, y E1. Desafortunadamente, el elevado nivel de expresión de estas proteínas, en concreto, las glicoproteínas E2 y E2 de la envoltura, puede conducir a citopatología concomitante y muerte celular eventual. Por tanto, se han diseñado casetes de expresión de la proteína estructural con elementos reguladores inducibles que controlan los niveles de expresión génica, además de otros que mantienen los niveles de expresión constitutivos.
En la primera configuración, la expresión de las proteínas estructurales de Sindbis está bajo el control del LTR de RSV, en conjunción con las secuencias inducibles del operón lac. Esto se consigue mediante la inserción de ADNc de Sindbis correspondiente a los genes de la proteína estructural vírica en los vectores pOP13 y pOPRSV1 (Stratagene). Estos vectores, usados separadamente, se transfectan simultáneamente con el vector p3'SS (Stratagene), que expresa la proteína "i" del represor de lac. En ausencia de inductor, por ejemplo Isopropil-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG), se ha informado que el nivel de expresión, basal, o constitutivo, de un gen indicador de la luciferasa es de 10-20 copias por célula. La adición de IPTG, da como resultado un cambio conformacional de la proteína represora, que da como resultado una disminución en la afinidad de la proteína i de lac para las secuencias del operador lac, permitiendo un elevado nivel de expresión del gen heterólogo. Se ha informado de niveles de inducción en presencia de IPTG de 95 veces para los genes heterólogos contenidos en el vector pOP13.
Específicamente, el ADNc del gen de la proteína estructural de Sindbis (SP) se inserta en los vectores pOP13 y pORVSV1 como sigue. La región de codificación de SP se amplifica in toto con una pareja de cebadores cuyos extremos 5' mapean, respectivamente, el codón traduccional AUG auténtico y los emplazamientos de detención traduccional UGA, que incluyen los nucleótidos que los rodean, que corresponden a la secuencia consenso de Kozak, para el inicio traduccional eficiente en el nt. 7638 de Sindbis. El cebador directo es complementario de los nucleótidos 7638-7661 de Sindbis y el cebador inverso es complementario de los nt. 11.384-11.364 de Sindbis. Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR del ADNc de Sindbis correspondiente a los genes de la proteína estructural mediante un protocolo de ciclación estándar a doble temperaturas, usando la siguiente pareja de oligonucleótidos:
Cebador directo (7638F):
5'-TATATGCGGCCGCACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGC-3' (SEC DE ID Nº. 38) 
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Cebador inverso (11384R):
5'-TATATGCGGCCGCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG-3' (SEC DE ID Nº. 39) 
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Además de sus complementariedades respectivas con los nt. de Sindbis indicados, una "secuencia tampón" de 5 nucleótidos seguida por la secuencia de reconocimiento de NotI se une a los extremos 5' de cada cebador. Tras la amplificación mediante la PCR, se purificó el fragmento de 3.763 pb en un gel de agarosa al 1%, y a continuación se digirió posteriormente con la enzima NotI. El fragmento de 3.749 pb se ligó a continuación, separadamente, en los vectores pOP13 y POPRSV1, que se digirieron con NotI y se trataron con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. Estos vectores de casete de expresión, que contienen la capacidad completa de codificación de las proteínas estructurales de Sindbis se conocen como pOP13-SINSP y pOPRSV1-SINSP.
Se pueden construir también variaciones de los casetes de expresión génica de la proteína estructural operón lac-Sindbis usando otros promotores víricos, celulares o de insectos. Usando las técnicas de biología molecular comunes en la técnica, el operón lac y el promotor LTR de RSV, o sólo el promotor LTR de RSV, se pueden interrumpir las secuencias de los vectores pOP13 y pORSV1 de Stratagene y sustituirse por otras secuencias de promotores, tales como el promotor inmediato mayor de citomegalovirus (pOCMV-SINSP), el promotor tardío mayor de adenovirus (pOPAMLP-SINSP); o las secuencias promotoras de insectos, que incluyen el promotor inducible de la metalotioneína de Drosophila (pMET-SINSP), el promotor distal 5C de la actina de Drosophila (pOPASC-SINSP), los promotores del choque térmico HSP65 o HSP70 (pHSP-SINSP), o el promotor de la polihedrina de baculovirus
(pPHED-SFNSP).
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2. Modificación de los casetes para aumentar los niveles de expresión de la proteína
Se puede aumentar la expresión de la proteína estructural de Sindbis si se aumenta el nivel de transcriptos de ARNm. Se puede llevar a cabo el aumento del nivel de los transcriptos de ARNm modificando el casete de expresión de tal manera que las proteínas no estructurales de Sindbis reconozcan estos transcriptos, y a la vez, repliquen el mensaje a niveles mayores. Se lleva a cabo esta modificación añadiendo el núcleo mínimo de la región de unión de tipo natural (nucleótidos 7579 a 7602) al extremo 5' de la región de codificación de la proteína estructural de Sindbis, entre el primer emplazamiento ATG de inicio para la traducción y el casete de expresión de las secuencias del promotor. Se puede llevar a cabo esto siguiendo la misma técnica de amplificación mediante la PCR descrita anteriormente para colocar el ADNc de la proteína estructural de Sindbis en los vectores de expresión pOP13 y pOPRSV1. La única modificación de este procedimiento es la sustitución del cebador directo 7638F con un cebador similar que incluya los nucleótidos 7579-7602 del núcleo de la región de unión entre el emplazamiento de la enzima de restricción NotI y el primer ATG de la región de codificación como sigue:
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Tras la amplificación mediante la PCR, el fragmento de 3.787 pb resultante se purificó en un gel de agarosa al 1%, y a continuación se digirió posteriormente con la enzima NotI. A continuación se ligó el fragmento de 3.773 pb resultante, separadamente, en los vectores pOP13 y pOPRSV1 que se digirieron con NotI y se trataron con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. Los vectores de casete de expresión resultantes se conocen como pOP13-JUNSINSP y pOPRSV1-JUNSINSP. Sin embargo, debe establecerse que la introducción de las secuencias de la región de unión en los casetes de expresión de la proteína estructural introducirán secuencias que pueden conducir posiblemente a episodios de recombinación indeseables, conduciendo a la generación de virus Sindbis de tipo natural.
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3. Expresión inducible de proteínas estructurales mediante el vector Sindbis
Debido a los potenciales efectos citotóxicos de la expresión de la proteína estructural, el establecimiento de líneas celulares de empaquetado inducibles que expresen incluso niveles basales modestos de estas proteínas puede no ser el mejor procedimiento. Por tanto, los casetes de expresión de la línea celular de empaquetado se construyen de tal manera que contengan elementos reguladores para la inducción elevada del nivel de la síntesis de proteína estructural mediante las proteínas no estructurales suministradas en trans por el vector Sindbis, pero sin nivel basal de síntesis hasta que se estimuló apropiadamente.
En esta configuración, se construyó un casete génico de proteína estructural, en el que la transcripción de los genes de la proteína estructural se produce a partir de una secuencia adyacente a la región de unión de Sindbis. Las características principales de este casete son: un promotor de la ARN polimerasa II situado inmediatamente adyacente al nucleótido 1 de Sindbis, de tal manera que el inicio de la transcripción comienza con el nucleótido 1 de Sindbis auténtico, las secuencias del extremo 5' de Sindbis requeridas para el reconocimiento de la transcripción, la secuencia de la región de unión de Sindbis para la expresión del ARNm del gen de la proteína estructural, las secuencias del gen de la proteína estructural de Sindbis, las secuencias del extremo 3' de Sindbis requeridas para la replicación, y una secuencia de terminación/poliadenilación de la transcripción. Debido al marco de lectura abierto en la dirección 5' que finaliza en los codones de terminación de la traducción antes del emplazamiento de inicio de AUG de los gens de la proteínas estructurales, se puede producir la expresión de las proteínas estructurales de Sindbis únicamente después de la síntesis de ARNm de cadena menos mediante la proteínas no estructurales suministradas con el vector y la transcripción posterior de un ARNm del gen de la proteína estructural a partir de la región de unión. Por tanto, la inducibilidad de este sistema es dependiente completamente de la presencia de proteínas no estructurales, suministradas por el vector Sindbis por sí mismo, introducidas en cualquier ARN transcrito in vitro, o ADNc situado en la dirección 3' de un elemento promotor apropiado. Además, las secuencias Sindbis de los extremos 5' y 3' permiten amplificarse al transcripto de ARN del casete génico de la proteína estructural mediante las mismas proteínas no estructurales suministradas con el vector.
Específicamente, la construcción de un casete de empaquetado inducible mediante vector, de sentido directo positivo se llevó a cabo como sigue. El vector pVGELVIS descrito anteriormente se digirió con la enzima BspEI para eliminar los nucleótidos 422 a 7054 que incluían la mayor parte de las secuencias de codificación de los genes no estructurales, y el fragmento de 9925 pb restantes se purificó en un gel de agarosa al 0,8%, y se volvió a ligar posteriormente por sí mismo para generar el constructo conocido como pLTR/SindIBspE. Esta delección deja el codón auténtico de inicio de la traducción en el extremo de los nt 60-62 intactos, y crea codones de detención UAA y UGA en la dirección 3' en marco en los nt. 7130-7132 y 7190-7192 (numeración original), respectivamente, evitando de esta manera la traducción del marco de lectura abierto del gen de la proteína estructural en la dirección 3'. El constructo del casete de empaquetado pLTR/SindIBspE se transfectó posteriormente en células BHK (ATCC nº CCL 10) y se seleccionaron los transfectantes positivos usando el fármaco G418 a 400 \mug/ml tal como se ha descrito anteriormente. Los datos que se muestran en la figura 4 demuestran que la transfección del ARN del vector Sin-luc en estas células que empaquetan LTR/SindIBspE da como resultado la producción de partículas de Sindbis infecciosas que contienen el ARN de Sin-luc, como se muestran los sobrenadantes recuperados para transferir el ARN del vector Sin-luc a las monocapas frescas de las células BHK.
Se preparó también un constructo de empaquetado similar usando el clon pVg-ELVIS (descrito anteriormente) como material inicial par creación de la delección de BspEI. En este clon, la secuencia del extremo 3' de Sindbis está seguida por una secuencia de ribozima catalítica para permitir un procesamiento más preciso del transcripto primario adyacente a las secuencias dl extremo 3' de Sindbis. Además, se pueden llevar a cabo variaciones de estas construcciones de casete de empaquetado usando las técnicas estándar conocidas en la técnica, que incluyen: la sustitución de otros promotores de la ARN polimerasa para el LTR de MuLV actual, la adición de 1 o más nucleótidos entre el promotor de la ARN polimerasa y el primer nucleótido de Sindbis, o la sustitución de un marco de lectura abierto no codificado por Sindbis en la dirección 5' de las secuencias génicas de la proteína estructural, que puede o no retener las secuencias del extremo 5' de Sindbis requeridas para el reconocimiento de la transcriptasa.
En otra configuración de empaquetado inducible mediante vector, los casetes de expresión contienen una copia de ADNc de las secuencias génicas de la proteína estructural de Sindbis flanqueadas por su unión natural y las regiones 3' no traducidas, e insertadas en un vector de expresión en una orientación, de tal manera que la transcripción primaria del promotor produce las moléculas de ARN del gen de la proteína estructural. Adicionalmente, estos constructos también contienen, adyacentes a la región de unión las secuencias del extremo 5' de Sindbis necesarias para el reconocimiento mediante la transcriptasa vírica, y una secuencia de la ribozima catalítica situada inmediatamente adyacente al nucleótido 1 de Sindbis de la secuencia del extremo 5'. Como tal, esta ribozima rompe el transcripto de ARN primario precisamente después del primer nucleótido de Sindbis. En esta orientación de sentido contrario, no se pueden traducir los genes de la proteína estructural, y son completamente dependientes se la presencia de las proteínas no estructurales del virus Sindbis para la transcripción en el ARNm de cadena positiva, antes de su expresión. Se proporcionan estas proteínas no estructurales por el propio vector Sindbis. Además, debido a que esta configuración contiene el genoma y las secuencias 5' y 3' precisas de Sindbis, los transcriptos del gen de la proteína estructural experimentan la amplificación utilizando las mismas proteínas no estructurales proporcionadas por el vector Sindbis.
Específicamente, el ADNc del gen de la proteína estructural de Sindbis se eliminó del clon pVGSP6GEN genómico y se digirió con las enzimas ApaI y BamHI para eliminar todas las secuencias de Sindbis debidas al nucleótido 7335, que incluyen los genes que codifican las proteínas no estructurales 1, 2, 3 y la mayor parte de 4. El fragmento de vector de 7285 pb restante, que contiene los genes de la proteína estructural de Sindbis, se purificó en un gel de agarosa al 0,8%, y se ligó posteriormente con una secuencia poliligante, denominada SinMCS, que se obtuvo templando dos oligonucleótidos sintéticos. Los oligonucleótidos SinMCSI y SinMCSII, contienen los emplazamientos de reconocimien-
to para ClaI, BglII, y SpeI, y tienen los extremos de ApaI y BamHI tras el templado. Sus secuencias son como sigue:
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El constructo resultante, conocido como pMCS-26s, se modificó a continuación para contener los 229 nucleótidos del extremo 5' de Sindbis, fusionados con una secuencia de ribozima de 84 nucleótidos procedente de la cadena antigenómica del virus de la hepatitis delta (VHD) (Nature 350: 434), usando la amplificación mediante la PCR solapante. Se usaron dos parejas de cebadores inicialmente en reacciones separadas, seguido por su síntesis solapante en una segunda vuelta de la PCR. En la reacción nº 1, el cebador directo (HDV49-XC) es complementario a los nucleótidos 823-859 del genoma de VHD, y el cebador inverso (HDV17-68) es complementario a los nucleótidos 839-887 del genoma de VHD, con las secuencias como sigue:
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Además de sus complementariedades respectivas, el cebador HDV49-XC contiene las secuencias de reconocimiento que flanquean XbaI y ClaI en el extremo 5'. Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR de las secuencias de VHD mediante un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura con estos cebadores y la polimerasa Vent. En la reacción nº 2, el cebador directo (SIN-HDV), que se une precisamente con las secuencias de VHD y Sindbis, e complementario a los nucleótidos 1-21 de Sindbis, y los nucleótidos 871-903 genómicos de VHD, y solapa la secuencia del cebador HDV 17-68 (de la anterior) en 20 nucleótidos, y el cebador inverso (SIN276-SP6) es complementario con los nucleótidos 299-276 de Sindbis, con las secuencias como sigue:
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Además de sus complementariedades respectivas, el cebador SIN276-SPE contiene un codón de inicio de la traducción que flanquea UAA y la secuencia de reconocimiento de SpeI en su extremo 5'. Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR del fragmento que contenía las secuencias del extremo 5' de Sindbis fusionadas a las secuencias de la ribozima de VHD mediante un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura, usando la polimerasa Vent, estos cebadores y el plásmido pVGSP6GEN como plantilla. Tras la primera vuelta de la amplificación mediante la PCR 1/20º de las cantidades totales de cada reacción nº 1 y reacción nº 2 se combinaron y usaron como plantilla en una segunda vuelta de amplificación mediante la PCR con entradas adicionales de los cebadores HDV49-XC y SIN276-SPE y un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura. Tras la segunda vuelta de la PCR, se purificó el amplicón de 414 pb con el Kit Mermaid (Bio101, La Jolla, CA), y se digirió con las enzimas ClaI y SpeI. El amplicón digerido se purificó en un gel de agarosa al 1%, y se ligó posteriormente en el plásmido pMCS-26s, que se digirió también con ClaI y SpeI y se purificó en un gel de agarosa al 1%. El constructo resultante, que contenía los elementos del casete de expresión de la ribozima antigenómica de VHD/los 229 nt. del extremo 5' de Sindbis/la región de unión de Sindbis/los genes de la proteína estructural de Sindbis/la región no traducida del extremo 3' de Sindbis, se conoce como p\delta5'26s.
La inserción del casete génico de la proteína estructural de p\delta5'26s en el vector pcDNA3 se llevó a cabo como sigue. Se digirió el plásmido p\delta5'26s. con la enzima XbaI y los extremos 3' rebajados se enromaron mediante la adición de enzima Klenow y los dNTp: El casete génico completo de la proteína estructural de 4798 pb se purificó en un gel de agarosa al 1%. El plásmido pcDNA3 se digirió con las enzimas HindIII y ApaI y se enromaron los extremos mediante la adición de la enzima ADN polimerasa T4 y los dNTP, y el vector de 5342 pb se purificó en geles de agarosa al 1%. Los dos purificados, los fragmento de ADN del extremo enromado, se ligaron posteriormente, y el vector del casete de expresión génica de la proteína estructural resultante se conoce como pCMV-p\delta5'26s (véase la figura 8). La transfección de este ADNc en células y la selección para la resistencia a G418 se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente.
Se pueden construir también modificaciones del vector promotor CMC/proteína estructural de Sindbis de sentido contrario usando otros promotores víricos, celulares, o basados en insectos. Usando las técnicas de biología molecular comunes conocidas en la técnica, se puede interrumpir el promotor CMV del vector pcDNA3 de Invitrogen y sustituirse por promotores tales como los relacionados anteriormente. Otra variaciones de este casete de empaquetado de sentido contrario puede incluir, pero no limitarse a: la adición de 1 o más nucleótidos entre el primer nucleótido de Sindbis y la ribozima catalítica, el uso de otras secuencia de ribozima catalítica para el procesamiento del transcripto, la sustitución de una señal de terminación de la transcripción precisa par la secuencia de la ribozima catalítica, o la expresión de sentido contrario de los casetes génicos de la proteína estructural usando cualquier secuencia en la dirección 3' reconocida por una ARN polimerasa que da como resultado la transcripción de un ARNm del gen de la proteína estructural.
Además, debería señalarse que cada uno de los constructos inducibles mediante vector contiene las secuencias homólogas del propio vector Sindbis. Por tanto, existe el potencial para la generación del virus de tipo natural mediante la recombinación entre las dos moléculas de ARN. Se hicieron modificaciones adicionales para eliminar esta posibilidad tal como se describe a continuación.
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4. Separación de los genes de la proteína estructural para evitar la recombinación
Tras demostrar la utilidad de las soluciones descritas aquí, se generaron líneas celulares de empaquetado adicionales basadas en estos principios. Estas líneas adicionales secretan la integración y la expresión de los genes de la proteína estructural, permitiendo su transcripción como moléculas de ARN independientes no solapantes. La expresión de la proteína de la cápsida independientemente de las glicoproteínas E2 y E1, de cada una de las tres proteínas independientes entre sí, elimina la posibilidad de recombinación con el ARN del vector y la posterior generación de virus de tipo natural contaminante.
Específicamente, la proteína de la cápsida se expresa independientemente de un vector de expresión inducible, de tal manera que se eliminan las secuencias que pueden dar como resultado la recombinación con el ARN del vector. Como ejemplo, se amplificó el gen de la proteína de la cápsida a partir del plásmido pVGSP6GEN con una pareja de cebadores complementaria a los nucleótidos 7632-7655 (cebador directo) y 8415-8439 (cebador inverso), con las secuencia como sigue:
Cebador directo:
5'-GTCAAGCTTGCTAGCTACAACACCACCACCATGAATAGAG-3' (SEC DE ID Nº. 37) 
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Cebador inverso:
5'-CAGTCTCGAGTTACTACCACTCTTCTGTCCCTTCCGGGGT-3' (SEC DE ID Nº. 41) 
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Además de sus respectivas complementariedades, el cebador directo contiene las secuencias de reconocimiento de NheI e HindIII en su extremo 5', y el cebador inverso contiene ambos codones de detención de la traducción UAG y UAA y la secuencia de reconocimiento de XhoI en su extremo 5'. Se llevó a cabo la amplificación usando un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura, y el amplicón resultante se digirió con las enzimas NheI y XhoI, y se purificó en un gel de agarosa al 1%. El plásmido de expresión pMAM (Clontech), que contiene la secuencia del promotor LTR de MMTV inducible por dexametasona, se digirió con las enzimas NheI y XhoI, y el ADN plásmido se purificó en un gel de agarosa al 1%. El fragmento génico de la proteína de la cápsida s ligó en el vector pMAM, y el constructo resultante se conoce como pMAM-SinC. El plásmido pMAM-SinC se transfectó en la línea celular apropiada tal como se describe anteriormente y se llevó a cabo la selección de los transfectantes estables usando medios HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) tal como se describe por el fabricante.
Los genes de la glicoproteína, E1 y E2, se expresaron conjuntamente usando uno de los sistemas inducibles anteriormente descritos. Por ejemplo, los genes E1 y E2 se amplificaron a partir del plásmido pVGSP6GEN usando una pareja de cebadores complementaria con los nucleótidos 8440-8549 de Sindbis (cebador directo) y los nt. 11.384-11.364 de Sindbis (cebador inverso). Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR usando un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura y la siguiente pareja de oligonucleótidos:
Cebador inverso (11384R):
5'-TATATGCGGCCGCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG-3' (SEC DE ID Nº. 39) 
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Cebador directo (8440F):
5'-TATATGCGGCCGCACCACCATGTCCGCAGCACCACTGGTCACG-3' (SEC DE ID Nº. 42) 
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Además de sus respectivas complementariedades, el cebador directo contiene un codón de inicio de la traducción AUG "en marco", y ambos cebadores contienen una secuencia de reconocimiento de NotI en sus extremos 5'. Tras la amplificación mediante la PCR, se digirió el amplicón con la enzima NotI y se purificó en un gel de agarosa al 1%. A continuación se ligó el fragmento resultante separadamente en los vectores pOP13 y pOPRSV1 (Stratagene), se digirió con NotI y se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternero, tal como se ha descrito anteriormente. Estos vectores de expresión de la glicoproteína se usaron para transfectar las células que se habían transfectado anteriormente con el constructo de expresión de la proteína de la cápsida.
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5. Ensamblaje de los componentes para crear la línea celular que empaqueta Sindbis
Para los objetivos del ejemplo, se usará la línea celular del mosquito Aedes albopictus para demostrar el ensamblaje de los componentes. Sin embargo, se pueden usar otras posibles líneas celulares parentales para crear las líneas celulares que empaquetan Sindbis y que se han descrito anteriormente. Se hicieron crecer células del mosquito Aedes albopictus (ATCC No. CRL 1660) a 28ºC en CO_{2} al 5% en medio esencial mínimo (Eagle) con aminoácidos no esenciales, L-glutamina 2 mM, solución de sal equilibrada de Earle, bicarbonato de sodio al 0,11%, y suero bovino fetal al 10% (medios óptimos). Aproximadamente, 5 x 10^{5} células de mosquito, se hicieron crecer en placas petri a 35 mM, se transfectaron con 5 \mug de p3'SS usando 5 \mul del reactivo lípido catiónico Transfectam (Promega), en condiciones de los medios libres de suero, tal como sugirió el suministrador. Se puede llevar a cabo, sin embargo, cualquier procedimiento de transfección, es decir, mediante electroporación, precipitación con fosfato de calcio, o usando cualquiera de las formulaciones de liposomas catiónicos comercialmente disponibles y los procedimientos comúnmente conocidos en la técnica. A las 24 h. después de la transfección, las células se recubrieron con 4 ml de medios óptimos, tal como se describe anteriormente, se suplementaron con 200 \mug/ml del antibiótico higromicina y se seleccionaron durante un periodo de 10 a 14 días. A continuación se aislaron los clones expandidos y se ensayaron para la expresión del represor Lac mediante la hibridación de transferencia Northern. A continuación se volvió a transfectar un clon individual que expresaba niveles satisfactorios del ARNm del represor Lac con un constructo de vector del operón Lac que expresaba las proteínas estructurales de Sindbis (es decir, pOP13-SINSP o pOPRSV1-SINSP), seguido por la selección del fármaco con 200-800 \mug/ml de geneticina y se continuó la selección con higromicina. A continuación se combinaron las colonias que mostraron resistencia a ambos antibióticos, se clonaron por dilución, y se propagaron. A continuación se indujeron los clones individuales con 5 mM de IPTG durante 12 horas y se detectaron sistemáticamente elevados niveles de expresión de la proteína estructural de Sindbis. Se pudo ensayar la expresión mediante análisis de transferencia western usando anticuerpos específicos (disponible en la bibliografía), o mediante cuantificación del ARN específico de Sindbis en un ensayo de protección de la RNasa, usando sondas de ARN marcadas en el extremo con ^{32}P complementarias con el ARN de la región génica de la proteína estructural de Sindbis. Estos procedimientos de ensayo revelan clones con niveles muy altos de expresión de la proteína estructural en respuesta a la inducción con IPTG. A continuación se ensayaron varios de los clones de mosquito que expresaban los más altos (denominados como células Albopictus SINpak) para la actividad funcional. Se ensayó la actividad funcional demostrando la capacidad de la línea celular de empaquetar el vector que expresa la luciferasa, y la posterior capacidad del sobrenadante de los medios para volver a infectar las células BHK-21 y transferir la actividad de la luciferasa.
Específicamente, se hicieron crecer células Albopictus SINpak en placas petri de 35 mm con los medios de selección descritos anteriormente, que contenían higromicina y geneticina, se transfectaron con ARN sintetizado mediante transcripción in vitro (Promega) del ADNc de pSKSINBV-luc descrito anteriormente. 1 h. después de la transfección, los medios se suplementaron con IPTG 5 mM. Se cosechó el sobrenadante a las 24 h. después de la transfección y se usó para infectar células BHK-21 directamente y se indujo una monocapa fresca de células Albopictus SINpak tal como anteriormente con IPTG mM durante al menos 12 h. Se cosecharon los sobrenadantes de la infección a las 24 h. después de la infección y se usaron a continuación para infectar una segunda monocapa de células BHK-21, creciendo en placas petri de 35 mm. A las 16 h. después de la infección, las células BHK-21 se lisaron y se ensayaron para la actividad de la luciferasa tal como se ha descrito (Promega). La comparación de las actividades de la luciferasa obtenida de las células BHK-21 infectadas tras la primera vuelta de producción del vector frente a las células BHK-21 infectadas tras la segunda vuelta de producción del vector debería demostrar al menos una diferencia de diez veces en los niveles de expresión. Si las diferencias en los niveles son menores de las diez veces, la reducción en la eficiencia de la transducción tras la transferencia puede ser debida a los receptores celulares ocupados en la línea celular idéntica que empaqueta Sindbis a partir de la cual se produjo el vector transitorio. Esto puede indicar la necesidad de regeneración de los vectores Sindbis pseudotipificados para mejorar la eficiencia de la transducción en las líneas celulares de empaquetado relacionadas con la envoltura.
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C. Expresión del vector inducible y la proteína estructural para la expresión de líneas celulares productoras de Sindbis 1. Uso de promotores víricos
El estímulo para desarrollar líneas celulares productoras del vector Sindbis queda en la pregunta de si un virus cuya infección en células de mamíferos da como resultado casi exclusivamente la muerte celular lítica productiva puede de algún modo convertirse en infección persistente establecida en estas mismas células. Una posibilidad es generar líneas celulares productoras del vector Sindbis a partir de células de mosquito, en las que la persistencia vírica resulta después de la infección. Sin embargo, el título de virus infeccioso producido en las células de mosquito infectadas persistentemente es sólo de aproximadamente 1 x 10^{4} UFP/ml, al menos cinco órdenes de magnitud menos que el observado tras la infección lítica de las células BHK. De esta manera, puede no ser comercialmente factible desarrollar líneas celulares productoras del vector Sindbis derivadas de mosquito.
Se han descrito muchas estrategias para la inducción las líneas celulares productoras del vector Sindbis, contienen el vector y los casetes del gen estructura, de tal manera que la infección citolítica productiva se produce sólo después del estímulo correcto. Debido a que estas soluciones operan sobre un nivel de "alimentación hacia delante", cualquier debilidad en el sistema dará como resultado el inicio del ciclo de vida de Sindbis y la muerte celular.
El hito del desarrollo es el estado de diferenciación dependiente del modelo de expresión génica. Los modelos de expresión génica difieren ampliamente entre los estados no diferenciados y terminalmente diferenciados. De esta manera, es posible que una célula, cuyo estado de diferenciación se puede controlar sea un huésped ideal en el que derivar una línea celular productora del vector Sindbis. En dicha configuración, el vector y los componentes estructurales se acoplan a los promotores que inducen el estado de diferenciación terminal, de acuerdo con la estrategia ELVIS descrita, y se usan para transformar de manera estable una célula huésped no diferenciada. La diferenciación terminal de la célula huésped productora tras la inducción con los estímulos apropiados da resultados coincidentes en la inducción del ciclo de replicación de Sindbis y la producción del vector empaquetado. Otras estrategias descritas en el presente documento, que incluyen los genes estructurales de sentido contrario y los sistemas de expresión vírica heterólogos, se acoplarían con los promotores dependientes del estado de diferenciación celular descritos a continuación.
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En esta solución, se describen tres ejemplos, usando tanto un promotor vírico como uno celular que son activos sólo en células terminalmente diferenciadas.
Se ha demostrado que Poliomavirus de ratón (Py), SV40, y el virus de la leucemia murina de Moloney) (M-MuLV), son capaces de infectar y entrar en las células no diferenciadas de carcinoma embriónico de ratón (EC), pero está bloqueada la expresión de sus genes (y los genes heterólogos) y el establecimiento de la infección productiva (Swartzendruber y Lehman, J. Cell. Physiol. 85: 179-188, 1975; Peries y col., J. Natl. Cancer Inst. 59: 463-465, 1977). Está propiedades de crecimiento vírico se han demostrado en dos líneas celulares, PCC4 y F9, que se derivan de las células troncales malignas de teratocarcinomas de ratón. El bloqueo de la propagación vírica se produce al nivel de la transcripción y la replicación, y lo mapas de los potenciadores, contenidos en el interior de las regiones de control de la no codificación (Linney y col., Nature 308: 470-472, 1984; Fujimura y col., Cell 23: 809-814, 1981; Katinka y Yaniv, Cell 20: 393-399, 1980).
Cuando M-MuLV infecta células EC no diferenciadas, el ADN vírico se integra en el genoma. Sin embargo, tal como se ha establecido anteriormente, la expresión de los genes víricos o de los genes heterólogos está bloqueada. Este bloqueo de la expresión vírica se libera de la diferenciación terminal de las células EC mediante la adición de ácido retinoico al medio de crecimiento.
Para ensayar las propiedades de expresión del ARN del constructo pVGELVIS en las células EC, se complejó ADN plásmido con Lipofectamina (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las condiciones sugeridas por el suministrador circa 5 \mug de ADN/8 mg de reactivo lípido) y se añadió a pocillos de 35 mm que contenían células PCC4 o F9 no diferenciadas (Fujimura y col. 1981. Cell 23: 809-814) a aproximadamente una confluencia del 75%. El desarrollo de efectos citopáticos (CPE), y el nivel de infección productiva de Sindbis, cuantificado mediante el ensayo de placas del sobrenadante de los medio, se determinó a intervalos regulares durante 5 días en células PCC4 o F9 transfectadas no diferenciadas y diferenciadas. Se llevó a cabo la diferenciación de las células F9 y PCC4 mediante la adición de ácido retinoico (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), a una concentración final de 1 \muM.
Se ha propuesto que la jerarquía de la expresión relativa de los genes heterólogos observada en células EC no diferenciadas con vectores M-MuLV puede ser en parte dependiente de la inserción (Linney y col. 1987. J. virol. 61: 3248-3253). De esta manera, las células EC no diferenciadas transfectadas co pVGELVIS producirán probablemente diferentes resultados, en términos de transcripción del ADNc genómico de Sindbis y, a la vez, las células restantes se clonaron y expandieron. Los clones celulares se ensayaron a continuación para la producción de virus Sindbis tras la diferenciación mediante la adición de ácido retinoico (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), a una concentración final de 1 \muM.
Para aislar las líneas celulares que empaquetan el vector, cuya producción de proteínas estructurales en presencia de NSP de Sindbis es dependiente del estado de diferenciación celular, se transfectaron células P9 o PCC4 no diferenciadas con pLTR/SINdIBspE y G418 seleccionados tal como se describe anteriormente. Los clones sensibles al estado de diferenciación se seleccionaron mediante infección de elevada multiplicidad con el vector SIN-luc empaquetado: Los clones que son resistentes a la lisis celular o que no producen partículas de vector SIN-LUC empaquetado son los clones candidatos que empaquetan el vector. Estos clones candidatos se ensayaros para la producción de partículas del vector SIN-luc tras la diferenciación terminal con ácido retinoico, tal como se describe.
El poliomavirus de tipo natural de murino (Py) es incapaz de replicarse en las líneas celulares PCC4 o F9 de teratocarcinoma. Este bloqueo de la replicación se produce en células no diferenciadas al nivel de la transcripción de los genes de la región temprana (es decir, el antígeno T), y se libera mediante la inducción de la diferenciación terminal con vitamina A. Los mutantes Py que son capaces de establecer la infección productiva en células PCC4 y F9 no diferenciadas mapean la región potenciadora vírica. La génesis de un elemento potenciador transcripcional específico del tejido embriónico ha dado como resultado estos mutantes. Con el fin de aprovechar esta propiedad de inhibición de la replicación de Py en líneas celulares no diferenciadas de teratocarcinoma, la región no codificante reguladora vírica, que incluye el potenciador, se acopla al ADN genómico del virus Sindbis, de acuerdo con la estrategia ELVIS. Se ha determinado el emplazamiento de inicio transcripcional preciso de la región temprana de Py (véase Tooze, DNA Tumor Viruses). La líneas celulares PCC4 y F9 se transforman de manera estable con los vectores Py-Sindbis. En este modelo, se produce la infección productiva de Sindbis tras la adición de ácido retinoico al medio de cultivo y la inducción de la diferenciación terminal.
La región no codificante de Py entre las bases 5021-152, que incluye las secuencias que corresponden a los potenciadores víricos, las repeticiones de 21 pb, el origen de la replicación, las secuencias CAAT y TATA, y el emplazamiento de la caperuza 5' de transcripción del ARNm temprano, se sitúan en el extremo 5' vírico tal como in vivo, únicamente se añade un resto C en caperuza único al extremo 5' de Sindbis. Se llevo á cabo la yuxtaposición de la región no codificante de Py y el extremo 5' de Sindbis solapando la PCR tal como se describe con el siguiente detalle. Se llevó a cabo la amplificación de la región no codificante de Py en la primera reacción de la PCR primaria en una reacción que contenía el plásmido pBR322/Py de la cadena A2 (ATCC número 45017-p53.A6.6 (pPy-1)) y la siguiente pareja de cebadores:
Cebador director: Pybg15021F (Secuencia tampón/secuencia de reconocimiento de BglII/Py nt 5021-5043):
5'-TATATAGATCTCTTGATCAGCTTCAGAAGATGGC (SEC DE ID Nº. 43) 
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Cebador inverso: SINPy152R (SIN nt 5-1/Py nt 152-134):
5'-TCAATGGCGGGAAGAGGCGGTTGG (SEC DE ID Nº. 44) 
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Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR de la región no codificante de Py con la pareja de cebadores que se muestra anteriormente usando la ADN polimerasa termoestable Thermalase (Amresco Inc., Solon, Ohio) y el tampón que contenía MgCl_{2} 1,5 mM, facilitado por el suministrador. Adicionalmente, la reacción contiene DMSO al 5%, y las perlas Hot Start Wax (Perkin-Elmer), usando el siguiente protocolo de amplificación de la PCR que se muestra a continuación:
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Se llevó a cabo la amplificación del extremo 5' de Sindbis en la segunda reacción de la PCR primaria en una reacción que contenía el clon pVGSP6GEN y la siguiente pareja de cebadores:
Cebador directo: (Py nt 138-152/SIN nt 1-16):
5'-CCGCCTCTTCCCGCCATTGACGGCGTAGTAC (SEC DE ID Nº. 45) 
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Cebador inverso: (SIN nt 3182-3160):
5'-CTGGCAACCGGTAAGTACGATAC (SEC DE ID Nº. 46) 
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La amplificación mediante la PCR de la región del extremo 5' de Sindbis con la pareja de cebadores que se muestra anteriormente es con las condiciones de reacción descritas anteriormente, usando el siguiente protocolo de amplificación de la PCR que se muestra a continuación:
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Los productos de 442 pb y 3202 pb de las reacciones de la PCR primaria se purificaron con Gene Clean (BIO 101), y se usaron conjuntamente en una reacción de la PCR con la siguiente pareja de cebadores:
Cebador directo: Pybg15021F (Secuencia tampón secuencia de reconocimiento de BglII/Py nt 5021-5043):
5'-TATATAGATCTCTTGATCAGCTTCAGAAGATGGC (SEC DE ID Nº. 47) 
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Cebador inverso: (SIN nt 2300-2278):
5'-GGTAACAAGATCTCGTGCCGTG (SEC DE ID Nº. 48) 
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La amplificación de la PCR de los productos del amplicón de la PCR del cebador con la pareja de cebadores que se muestra anteriormente es con las condiciones de reacción descritas anteriormente, usando el siguiente protocolo de amplificación de la PCR que se muestra a continuación:
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el hígado fetal y los genes \delta y \beta-globina en médula ósea de adulto (Collins y Weissman, 1984, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Bio.31: 315).
Al menos dos líneas de eritroleucemia de ratón, MEL y Friend, sirven como modelos para la expresión dependiente de la diferenciación terminal de \beta-globina. Se observó la expresión de \beta-globina en éstas líneas sólo tras la inducción de la diferenciación terminal mediante la adición de DMSO al 2% al medio de crecimiento.
El locus completo de la \beta-globina está regulado por la región control del locus (LCR). En el interior de LCR está la región control dominante (DCR) que reside en el interior de la región de la DNasaI hipersensible, que es la región de codificación de 5'. La DCR contiene cinco emplazamientos de la DNAsaI hipersensible (HS1-HS5). La DCR dirige el emplazamiento de alto nivel independiente de la integración, el número de copias dependiente de la expresión en un gen de \beta-globina humano unido en ratones transgénicos y células de eritroleucemia de ratón transfectadas de manera estable (MEL) (Grosveld y col., 1993, CSHSQB 58: 7-12). En un reciente estudio (Ellis y col. 1993 EMBO 12: 127-134), concatámeros de un núcleo sintético coincidentes en las secuencias en el interior de HS2 demostraron funcionar como una región control del locus.
Con el fin de llevar a cabo la expresión dependiente del estado de diferenciación de los vectores Sindbis, se yuxtapuso el ADNc genómico vírico con un promotor que contenía un núcleo sintético en tándem que correspondía al emplazamiento HS2 de LCR. Alternativamente, se puede insertar el constructo de vector Sindbis deseado en la dirección 3' de la LCR en el gen de la \beta-globina endógeno mediante recombinación homóloga. En dicha estrategia, se determinaría en primer lugar el emplazamiento de inicio de la transcripción de la \beta-globina tras la diferenciación terminal, con el fin de que el vector Sindbis se colocara precisamente en el emplazamiento de inicio.
La estrategia propuesta en el presente documento en el que la iniciación de un ciclo de vida lítico vírico está controlada por el estado de diferenciación de las células del huésped debería encontrar aplicación en otros sistemas, en los que se desea el control de la citopatología vírica inducida.
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3. Inserción de constructos de vector en los promotores inducibles controladores del estado de diferenciación
Se llevó a cabo la generación de clones cuya expresión de los genes heterólogos a partir de los vectores Sindbis situados en la configuración ELVIS tal como se describe en el Ejemplo 3 es dependiente del estado de diferenciación, tal como se describe a continuación para los plásmidos pVGELVIS, pLTR/Sind1BspE. Se llevó a cabo la generación de clones cuya producción de partículas de vector es dependiente del estado de diferenciación transfectando los clones aislados que empaquetan el vector dependiente de la diferenciación descritos anteriormente con vectores de expresión de genes heterólogos ELVIS. Los clones que tenían el fenotipo deseado o la producción del vector tras la diferenciación inducida por ácido retinoico se aislaron tal como se ha descrito anteriormente.
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D. Expresión de la proteína estructural procedente de una región heteróloga de unión del Astrovirus
Entre las propiedades críticas de un sistema que empaqueta un vector están una línea celular que expresa los componentes estructurales necesarios para generar una partícula infecciosa, sin la creación del virus de tipo natural mediante la recombinación entre el vector y los componentes del gen estructural. Estas dos propiedades deseadas de la línea celular de empaquetado se llevaron a cabo en los sistemas basados en retrovirus mediante la expresión constitutiva de los genes gag/pol y env en casetes de expresión heterólogos individuales de la ARN polimerasa II.
Otro aspecto importante de las líneas celulares que empaquetan vectores es derivar un sistema que mimetice tan estrechamente como sea posible la estrategia de replicación normal del virus de tipo natural. Esta característica es importante en términos del nivel del título observado del vector recombinante empaquetado. Se llevó a cabo la síntesis de proteínas estructurales víricas durante la infección de Sindbis tras la transcripción de altos niveles de ARNm subgenómico procedente del promotor de la región de unión, seguido por la traducción eficiente en las proteínas estructurales. El promotor de la región de unión es funcional únicamente en la orientación de sentido contrario y se produce la síntesis del ARN antigenómico tras la traducción de la proteínas no estructurales, retrasando de esta manera la expresión de la proteínas estructurales. Resulta que, con respecto a Sindbis, sería deseable construir una línea celular de empaquetado cuya síntesis de proteínas estructurales se inicie desde el promotor de la región de unión, que a la vez está activado por las proteínas no estructurales expresadas procedentes de la molécula del vector recombinante.
Se sabe que se produce una frecuencia relativamente alta de recombinación entre las moléculas de ARN genómico durante la infección con el virus Sindbis mediante un mecanismo de elección de la copia (PNAS 1991 88:3253-3257). La recombinación entre el vector y la región de unión/casetes del gen estructural daría como resultado la generación de virus Sindbis de tipo natural, quizás a un nivel de 1 virus de tipo natural por millón de partículas de vector empaquetadas (Liljestrom Bio/Technology 1991 9: 1356-1361). Una manera de mitigar la generación de virus de tipo natural es separar los genes estructurales en casetes de expresión separados, una solución que se ha usado muy satisfactoriamente con líneas celulares que empaquetan retrovirus, y se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7.
Una solución adicional para disminuir el nivel de producción de virus de tipo natural en las líneas celulares que empaquetan el vector Sindbis sería expresar las proteínas estructurales bajo el control de los elementos genéticos de Astrovirus. En la figura 10 se representa gráficamente un esquema de esta configuración. Virus similar a Sindbis, la expresión de las proteínas estructurales de Astrovirus incorpora una estrategia de región de unión, en la que se sintetizan altos niveles de proteínas estructurales procedentes de un mensajero subgenómico. El casete de expresión de Astrovirus podría estar constituido por uno de los siguientes elementos ordenados: (1) Promotor inducible/extremo 5' de Astrovirus/región de unión de Astrovirus/gen estructural de Sindbis/extremo 3' de Astrovirus, o (2) extremo 3' de Astrovirus de sentido contrario/gen estructural de Sindbis de sentido contrario/región de unión de Astrovirus de sentido contrario/extremo 5' de Astrovirus de sentido contrario/ribozima del virus de la Hepatitis Delta, u otras configuraciones descritas en el Ejemplo 7. En ambas configuraciones, la unidad de expresión está amplificada por las proteínas no estructurales de Astrovirus mediante el mimo mecanismo que se produce durante la replicación vírica. Debido a las múltiples vueltas de síntesis del ARNm subgenómico iniciadas desde la región de unión que se produce de cada unidad de expresión, la amplificación de la unidad de expresión por las proteínas no estructurales de Astrovirus dará como resultado la producción de niveles muy altos de proteínas estructurales de Sindbis. La segunda configuración del casete de expresión de la proteína estructural de Sindbis descrito anteriormente puede funcionar mejor que la primera, debido a que el transcripto primario del gen estructural de Sindbis tóxico es de sentido contrario. Aunque no se debería producir la expresión de los genes estructurales en la primera configuración hasta la síntesis de la cadena negativa seguida por la síntesis del ARN subgenómico procedente de la región de unión, la naturaleza de sentido contrario del transcripto primario en la segunda configuración representa un nivel adicional de control para evitar la expresión de la proteína citotóxica.
Es probable que no se generara virus de tipo natural en una línea celular de empaquetado en la que s sintetizaron las proteínas estructurales del virus Sindbis individualmente procedentes de los casetes de expresión de la región de unión de Astrovirus. La recombinación entre la región de la proteína no estructural del vector y un casete de expresión de la proteína estructural de Astrovirus daría como resultado una molécula en la que los elementos cis de Astrovirus se acoplarían con los genes del virus Sindbis, una combinación no viable. El acoplamiento correcto de los elementos cis y trans de Sindbis requeriría dos episodios precisos de recombinación entre el vector y el casete de expresión de Astrovirus, entre la región de unión de Astrovirus y el ATG del gen estructural, y entre el codón de terminación del gen estructural y el extremo 3' de Astrovirus. Con el fin de generar el virus de tipo natural, este episodio de doble recombinación tendría que producirse tres veces en la misma molécula (seis episodios en total), para incorporar los tres genes separados de Sindbis.
Con el fin de disminuir cualquier posible toxicidad de las proteínas de Astrovirus, la síntesis de los casetes de expresión de Astrovirus está controlada por promotores inducibles. Una posibilidad es usar el operón lac, de acuerdo con el sistema "lac-interruptor" descrito anteriormente en el Ejemplo 7 (Stratagene). El nivel constitutivo de expresión del gen controlado por el operón lac en ausencia del inductor IPTG gratuito es aproximadamente de 10 copias de ARN por célula. El promotor inducible correspondiente al casete de expresión de Astrovirus/gen estructural de Sindbis puede ser el operón lac u otros promotores adecuados que tienen un nivel muy bajo de expresión constitutiva. La construcción de líneas celulares de empaquetado de estas configuraciones, en las que el control de las proteínas de Sindbis está dirigido por un virus heterólogo debería dar como resultado la generación de un título elevado de partículas de vector empaquetadas libres de virus de tipo natural.
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Ejemplo 8 Técnicas que empaquetan el vector vírico alternativo
Se pueden usar diversos sistemas alternativos para produciré los virus Sindbis recombinantes que transportan el constructo de vector. Cada uno de estos sistemas tiene la ventaja del hecho de que el baculovirus, y los virus de mamíferos, vaccinia y adenovirus, se han adaptado recientemente para preparar grandes cantidades de cualquier proteína dada para lo cual se ha clonado el gen (Smith y col., Mol. Cell. Biol. 3: 12, 1983; Piccini y coll., Meth. Enzymology 153: 545, 1987; y Mansour y coll., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 82: 1359, 1985.)
Se pueden usar estos vectores víricos para producir proteínas en células de cultivo de tejidos mediante la inserción de los genes apropiados en el vector vírico y se pueden adaptar para preparar partículas de vector Sindbis.
Los vectores de adenovirus se derivan de virus de replicación nuclear y pueden ser defectivos. Se pueden insertar genes en los vectores y usarse para expresar proteínas en células de mamíferos tanto mediante construcción in vitro (Ballay y col.; EMBO J. 4: 3861, 1985), como mediante recombinación en células (Thummel y col., J. Mol. Appl. Genetics 1:435, 1982).
Una forma de realización preferida es construir plásmidos usando el impulso del promotor tardío mayor de adenovirus (MLP): (1) las proteínas no estructurales de Sindbis, y (2) un constructo de vector Sindbis modificado. Un vector Sindbis modificado en esta configuración podría contener aún una región de unión modificada, que permitiría al vector de ARN transcrito, autorreplicarse como sería en un escenario natural.
A continuación s pueden usar estos plásmidos para preparar genomas de adenovirus in vitro (Ballay y col. Embo. J. 4: 3861, 1985). Estos genomas adenovíricos, que son de replicación defectiva, se transfectan en células 293 (una línea celular humana que fabrica la proteína E1A de adenovirus), para dar como resultado depósitos de proteínas estructurales de Sindbis y el vector Sindbis se transporta separadamente en los vectores de adenovirus defectivos. Debido a que los títulos de dichos vectores son normalmente de 10^{7}-10^{11}/ml, se pueden usar estos depósitos para infectar células de cultivo de tejidos a una elevada multiplicidad de infección. A continuación las células producen proteínas Sindbis y genomas del vector Sindbis en niveles elevados. Debido a que los vectores de adenovirus son defectivos, no se producirán grandes cantidades de lisis celular directa y se pueden cosechar los vectores Sindbis procedentes de los sobrenadantes del cultivo.
Se pueden usar también otros vectores víricos tales como los derivados de vectores Sindbis no relacionados (por ejemplo, VSR, MMTV o VIH) de la misma manera para generar vectores de células primarias. En una forma de realización, estos vectores adenovíricos se usan en conjunción con las células primarias, proporcionando un aumento de las preparaciones de vector Sindbis.
Se han descrito sistemas de expresión alternativos en los que genomas quiméricos de VIH/poliovirus dan como resultado la generación de minireplicones quiméricos (J. Virol. 65: 2875, 1991), capaces de expresar proteínas de fusión. Estos minireplicones de poliovirus quiméricos se demostró posteriormente que se encapsidaban y producían partículas infecciosas usando un virus de vaccinia recombinante (VV-P1) que expresa la proteína P1 precursora de la cápsida del poliovirus sustituido que es defectiva en el minireplicón quimérico (J. Virol. 67: 3712. 1993). En el estudio se sustituyeron secuencia gag-pol de VIH-1 por los genes de la cápsida VP2 y VP3 de la cápsida P1 de poliovirus. De una manera similar, se puede sustituir el genoma del vector Sindbis por las secuencias de la cápsida P1 y usarse en este sistema como un medio para proporcionar vectores Sindbis polio pseudotipificados tras transfectar in vitro los transcriptos de ARN de Sindbis transcritos en la línea celular. A la inversa, se pueden sustituir también proteínas estructurales de Sindbis por las secuencias de VP2 y VP3, proporcionando posteriormente un sistema alternativo de línea celular de empaquetado para los vectores basados en Sindbis.
En un sistema alternativo, se usan los siguientes componentes:
1.
proteínas estructurales de Sindbis preparadas en el sistema del baculovirus de una manera similar a la descrita en Smith y col. (más arriba) (o en otros sistemas de producción de proteínas, tales como levaduras o E. coli);
2.
ARN de vector vírico preparado en el conocido T7 o SP6 u otro sistema de generación de ARN in vitro (Flamant y col., J. Virol. 62: 1827, 1988);
3.
ARNt preparado como en (2) o purificado de células de levadura o de cultivo de tejidos de mamíferos;
4.
liposomas (con proteína env embebida); y
5.
componentes necesarios de extracto celular o purificado cuando se identifican (normalmente de células de ratón) para proporcionar el procesamiento del ARN, y cualquiera de otras funciones necesarias derivadas de células.
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Dentro de este procedimiento, se mezclaron (1), (2) y (3) y a continuación se añadieron las proteínas de Sindbis asociadas con env, el extracto celular y una mezcla de preliposomas (lípido en un disolvente adecuado). Puede ser necesario embeber las proteínas env de Sindbis en los liposomas antes de añadir el env embebido con liposomas resultante a la mezcla de (1), (2), y (3). Se trató la mezcla (por ejemplo, mediante sonicación, manipulación de la temperatura, o diálisis rotatoria) para permitir la encapsidación de las partículas víricas nascentes con la proteína env de Sindbis embebida más el líquido de una manera similar a la de para la encapsidación de los liposomas de los compuestos farmacéuticos (Gould-Fogerite y col., Anal. Biochem. 148: 15, 1985). Este procedimiento produce títulos elevados de replicación de vectores víricos de Sindbis incompetentes sin la necesidad de establecer líneas celulares de empaquetado intermedias.
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Ejemplo 9 Vectores Sindbis específicos de la línea celular o del tejido-"envolturas híbridas"
Se determinó la especificidad del tejido y del tipo celular de virus Sindbis principalmente mediante las proteínas de la envoltura codificadas por el virus, E1 y E2. Estas proteínas estructurales de virión son glicoproteínas trasnsmembrana embebidas en una envoltura lípida derivada de la célula huésped que se obtiene cuando la partícula vírica brota de la superficie de la célula infectada. La envoltura rodea una nucleocápsida icosahédrica, comprendida por ARN genómico complejado con múltiples copias muy ordenadas de una proteína de cápsida única. Las glicoproteínas de envoltura E1 y E2 están complejadas como heterodímeros que parecen ensamblarse en estructuras triméricas, formando las características "espigas" sobre la superficie del virión. Además, las colas citoplásmicas de estas proteínas interactúan con las nucleocápsidas, iniciando el ensamblaje de nuevas partículas víricas (Virology 193: 424, 1993). Las propiedades adscritas a las glicoproteínas Sindbis individuales, unión al receptor mediante la glicoproteína E2 (Virology 181: 694, 1991), y fusión mediada por la glicoproteína E1 de la envoltura del virión y la membrana endosómica, dando como resultado la liberación de la partícula de nucleocápsida en el citoplasma (New Aspects of Positive-Stranded RNA Virus, pp. 166-172, 1990).
La presente divulgación reconoce que perturbando la actividad de la glicoproteína (en concreto, pero sin limitarse a E2) y expresan simultáneamente una glicoproteína heteróloga intacta, o creando productos génicos de envoltura híbrida (es decir, específicamente una glicoproteína de envoltura de Sindbis que tiene sus regiones citoplásmicas y de expansión de la membrana naturales y las regiones de unión exógena que no se encuentran naturalmente en la misma molécula de proteína), o sustituyendo las glicoproteínas E2 y/o E1 con los otros alfavirus o sus derivados que difieren de Sindbis en su tropismo de tejido, se puede alterar el intervalo de especificidad del huésped sin interrumpir las funciones citoplásmicas requeridas para el ensamblaje del virión. De esta manera, se pueden producir partículas de vector Sindbis recombinante que se unirán específicamente a las células diana preseleccionadas, dependiendo del tropismo de la molécula de proteína o la región introducida.
En la primera configuración, se usó la sustitución de las glicoproteínas E1 y/o E2 de envoltura análoga procedentes de otros alfavirus o de sus variantes para alterar el tropismo del tejido. Por ejemplo, el virus de la encefalitis equina de Venezuela (VEE) es un alfavirus que presenta tropismo para las células de origen linfoide, a diferencia de su contraparte del virus Sindbis. Por tanto, los vectores Sindbis empaquetados en las líneas celulares que expresan la proteínas estructurales VEE mostrarán las mismas propiedades linfotrópicas que el virus VEE parental del cual se obtuvo el casete del gen de la proteína estructural celular empaquetada.
Específicamente, la cepa del mono de Trinidad del virus VEE (ATCC Nº VR-69) se propagó en células BHK, y se extrajo el ARN del virión usando procedimientos similares a los descritos para la clonación de Sindbis. La región de clonación de la proteína estructural completa se amplificó con una pareja de cebadores cuyos extremos 5' mapean, respectivamente, el emplazamiento de inicio traduccional AUG auténtico, que incluye la secuencia consenso de Kozak circundante, y el emplazamiento de detención traduccional UGA. El cebador directo es complementario con los nucleótidos 7553-7579 de VEE, y el cebador inverso es complementario con los nucleótidos 11206-11186 de VEE (secuencia procedente de Virology 170: 19). Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR del ADNc de VEE correspondiente a los genes de la proteína estructural usando un protocolo de la transcriptasa inversa-PCR en dos etapas tal como se describe para Sindbis, el ARN del genoma de VEE como plantilla, y la siguiente pareja de oligonucleótidos:
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Cebador directo (VEE 7553F):
5'-TATATGCGGCCGCACCGCCAAGATGTTCCCGTTCCAGCCA-3' (SEC DE ID Nº. 49) 
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Cebador inverso (VEE 11206R):
5'-TATATGCGGCCGCTCAATTATGTTTCTGGTTGGT-3' (SEC DE ID Nº. 50) 
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Además de sus complementariedades respectivas con los nucleótidos VEE indicados, cada cebador incluye una secuencia de reconocimiento de NotI en sus extremos 5'. Tras la amplificación mediante la PCR, se purificó el fragmento de 3800 pb en un gel de agarosa al 1%, y a continuación se digirió posteriormente con la enzima NotI. A continuación se ligó el fragmento resultante separadamente en los vectores pOP13 y pOPRSV1 (Stratagene) descritos anteriormente, que se digirieron con NotI y se trataron con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. Estos vectores resultantes, que contienen la secuencia de codificación de la proteína estructural de VEE completa se conocen como pOP13-VEESP y pOPRSV1-VEESP. El uso de estos clones en el desarrollo de las líneas celulares de empaquetado sigue al descrito para las líneas de empaquetado de Sindbis. Además, se construyeron también variaciones de los vectores de expresión del gen de la proteína estructural de operón lac-VEE usando los sistemas destacados para Sindbis en esta patente, y las técnicas estándar conocidas en la técnica. Además, las variantes de VEE, y otros alfavirus y sus variantes que difieren en el tropismo del tejido, son útiles cuando se sigue esta solución.
En la segunda configuración, se expresa una glicoproteína heteróloga o ligando celular en la bicapa lípida de una línea celular que es capaz de producir partículas de vector Sindbis envueltas. Esta configuración es similar a una descrita en el Ejemplo 6, para la producción de vectores Sindbis pseudotipificados con VSV-G, excepto que en esta configuración, la función de unión al receptor de E2 está inactivada para restringir el tropismo de la partícula del vector a la cual se suministra por la glicoproteína heteróloga o ligando celular. Además del ejemplo de la pseudotipificación de VSV-G, se utilizaron otras glicoproteínas víricas que dirigen receptores celulares específicos (tales como la proteína gp120 de VIH retrovírico para el direccionamiento de las células CD4) cuando se expresaron de vectores estándar transfectados de manera estable en las líneas celulares que empaquetan Sindbis.
En la tercera configuración, se prepararon también glicoproteínas quiméricas, que permiten el direccionamiento de los vectores víricos Sindbis en líneas células concretas in vitro o tipos de tejidos in vivo. Para construir dicha glicoproteína quimérica, se usaron oligocebadores específicos que contenían la región de unión al ligando del receptor deseado, más las secuencias de Sindbis homólogas (que incluyen un emplazamiento único de la endonucleasa de restricción específica), para amplificar una secuencia de inserto que se puede sustituir en el vector de expresión de la proteína estructural de Sindbis. Alternativamente, se llevaron a cabo digestiones de Bal-31 limitadas de un emplazamiento de enzima de restricción conveniente, con el fin de volver a digerir un emplazamiento de inserción permitido, seguido por el enromado del extremo de la ligadura de un fragmento que codifica la región pequeña de unión al receptor, o una glicoproteína vírica completa o ligando superficial celular. Como ejemplo, se pueden usar los péptidos correspondientes a la región de neutralización principal de la proteína de envoltura gp120 de VIH (Virology 185:820, 1991) para interrumpir el tropismo normal de E2 y proporcionar el direccionamiento celular de CD4.
Mientras que el ejemplo de la gp120 de VIH ilustra una proteína híbrida, la posibilidades no se limitan a las glicoproteínas híbridas. Por ejemplo, la porción de unión al receptor de la interleucina-2 humana está combinada con la(s) proteína(s) de la envoltura de Sindbis para dirigir los vectores en las células con los receptores de Il-2- Además, se usó la técnica anterior para crear una partícula de vector Sindbis recombinante con las proteínas de la envoltura que reconocen las porciones Fc de los anticuerpos. A continuación se unieron los anticuerpos monoclonales que reconocían únicamente las células diana preseleccionadas e infectaron únicamente aquellas células diana preseleccionadas (por ejemplo, células tumorales). Alternativamente, se usó una envoltura híbrida con la región de unión de la avidina para dirigir las células que se habían recubierto con anticuerpos biotinilados u otros ligandos. El paciente es inundado en primer lugar con anticuerpos, y a continuación se permitió eliminar el anticuerpo no enlazado y no específicamente enlazado antes de administrar el vector. La elevada afinidad (10-15) del emplazamiento de unión de la avidina para la biotina permitirá el direccionamiento parecido y eficiente del tejido original identificado mediante la "imagen" monoclonal.
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Ejemplo 10 Determinación de las unidades de vector en una preparación mediante la infeccón de una línea celular que expresa \beta-galaxctosidasa bajo el control de la región de unión de Sindbis Determinación de las unidades de vector en una preparación mediante la infección de una línea celular indicadora que expresa \beta-galactosidasa
Con el fin de administrar la dosis terapéutica apropiada de vectores a individuos, es deseable derivar un procedimiento por el cual se puedan determinar fácilmente las unidades infecciosas del vector contenidas en una preparación. Se lleva esto a cabo mediante la generación de una línea celular que expresa \beta-galactosidasa u otro gen indicador únicamente cuando la proteínas no estructurales de Sindbis funcional están presentes en la célula. Se puede infectar la línea celular con diluciones crecientes de una preparación de vector Sindbis de tal manera que las células individuales no se infecten con más de una partícula de vector, permitiendo determinar el título, o las unidades de vector, De esta manera, la línea celular es un ensayo de las partículas funcionales presentes en una preparación de vector.
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A. Generación de una línea celular que expresa la proteína \beta-galactosidasa funcional bajo el control de las proteínas no estructurales de Sindbis
En una configuración, se construyó un casete de expresión eucariota que contenía la secuencia del extremo 5' capaz de iniciar la transcripción del ARN de Sindbis, una región de unión de Sindbis, un gen indicador, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del extremo 3' de Sindbis para la síntesis de la cadena menos. Este casete se sitúa en una orientación de sentido contrario, adyacente al promotor transcripcional eucariota. Adicionalmente, estos constructos pueden contener también una secuencia de ribozima catalítica inmediatamente adyacente al nucleótido 1 de la secuencia del extremo 5' de Sindbis que dará como resultado la rotura del transcripto de ARN primario precisamente después del nucleótido de Sindbis. En esta orientación de sentido contrario, no se puede traducir el gen indicador y es dependiente completamente de la presencia de las proteínas no estructurales de Sindbis para la transcripción en el ARNm de la cadena positiva antes de la expresión del gen indicador. Estas proteínas no estructurales proporcionarán que se titule la preparación del vector Sindbis. Además, esta configuración, si se diseña para contener el genoma y las secuencias 5' y 3' precisas de Sindbis, permitirá a los transcriptos del gen indicador experimentar la amplificación utilizando las mismas proteínas no estructurales proporcionadas por el vector Sindbis.
Un ejemplo de esta construcción de valoración de sentido contrario es como sigue. Se digirió el plásmido pSKSINB V-lacZcon la enzima SacI, que rompe inmediatamente después del extremo 3' y la secuencia poli A de Sindbis. Se enromó el extremo 3' sobresaliente, mediante la adición de la enzima ADN polimerasa T4 y los dNTP, seguido por la incubación durante 10 minutos a 16ºC. Se inactivó térmicamente la ADN polimerasa T4 mediante la incubación a 75ºC durante 15 minutos. El plásmido linealizado posteriormente se digirió con la enzima BamHI, se cortó en el nucleótido 7335, en la dirección 5' de la región de unión de Sindbis. El fragmento resultante se purificó en un gel de agarosa al 1% y se ligó con pMCS-26s (descrito en el Ejemplo 7) que se había digerido con la enzima XbaI, con el extremo enromado tal como se describe anteriormente, se digirió con el BamHI, se purificó en un gel de agarosa al 1%, y se desfosforiló con fosfatasa alcalina de intestino de ternero.
El constructo resultante, conocido como pMCS-LacZ, se modificó a continuación para contener los 299 nucleótidos del extremo 55' de Sindbis, fusionados con una secuencia de ribozima de 84 nucleótidos procedente de la cadena antigenómica del virus de la hepatitis delta (VHD), usando la amplificación mediante la PCR solapante (descrita en detalle, Ejemplo 7). Se usaron dos parejas de cebadores inicialmente en las reacciones separadas de la PCR, seguido por su síntesis solapante en la segunda vuelta de la PCR. La reacción nº 1 contiene los cebadores HDV17-68 y HDV49-XC y la reacción nº 2 contiene los cebadores SIN-HDV y SIN276-SPE y el plásmido pVGSP6GEN como plantilla. Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR mediante un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura. Tras la primera vuelta de amplificación mediante la PCR, 1/20º de las cantidades totales de cada reacción nº 1 y reacción nº 2 se combinó y se usó como plantilla en una segunda vuelta de amplificación mediante la PCR con los cebadores HDV49-XC y SIN276-SPE y un protocolo de ciclación estándar a doble temperatura. Tras la segunda vuelta de la PCR, se purificó el amplicón de 414 pb con el Kit Mermaid (Bio101, La Jolla, CA), y se digirió con las enzimas Cla y SpeI. El amplicón digerido se purificó en un gel de agarosa al 1%, y se ligó posteriormente en el plásmido pMCS-LacZ, que se digirió también con ClaI y SpeI y se purificó en un gel de agarosa al 1%. El constructo resultante, que contenía los elementos del casete de expresión de la ribozima antigenómica de VHD/299 nt del extremo 5' de Sindbis/región de unión/gen LacZ/región no traducida del extremo 3', se conoce como pd5'LacZ.
El casete de expresión de LacZ del plásmido pd5'LacZ se insertó posteriormente en pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA).El plásmido pd5'LacZ se digirió con la enzima NotI, con el extremo enromado tal como se describe anteriormente, y se digirió a continuación con la enzima XbaI. Se purificó el fragmento en un gel de agarosa al 1% y se ligó con pcDNA3 que se digirió con la enzima HindIII, con el extremo enromado, y a continuación se digirió con XbaI. El constructo resultante, que contenía un promotor CMV que transcribe un ARN del casete indicador de sentido contrario de la configuración secuencia del extremo 3' de Sindbis/gen LacZ/región de unión/secuencia del extremo 5' de Sindbis/ribozima de VHD, se conoce como pSINjra\beta-gal.
Se derivaron las células BHKSINjra\beta-gal mediante transfección de 5 x 10^{5} células BHK-21, se hicieron crecer en una placa petri de 60 mm, con 5 \mug del vector pSINjra\beta-gal complejado con el reactivo policatiónico Transfectam (Promega, Madison WI). A las 24 h después de la transfección, se suplementaron los medios con 400 \mug/ml de G418 (GibcoBRL, Gaithersburg, MD). Después que hubieran muerto todas las células transfectadas y las colonias resistentes a G418 comenzaran a dividirse, se retiraron las células de la placa mediante tripsinización, se combinaron, y a continuación se clonaron por dilución limitante. Se ensayaron varios clones par la producción de \beta-galactosidasa funcional, mediante la infección con un título conocido de un depósito de virus Sindbis de tipo natural. Se determinó la producción de \beta-galactosidasa en los clones BHKSINjra\beta-gal candidatos a la 6 h. después de la infección fijando en primer lugar células creciendo en PBS con una solución que contenía formaldehído al 2% (solución madre al 37%)/glutaraldehído al 0,2%, tiñendo a continuación la células con una solución que contenía ferricianuro de potasio 0,5 mM/ferrocianuro de potasio 0,5 mM/MgCl_{2} 2 mM/1 mg/ml de X.gal. Son claramente visible células azules a las 3 h. con la condición de que el depósito de virus Sindbis no contenga un nivel elevado de partículas interferentes defectivas (DI), se determinó que el título del virus mediante el ensayo de placas en células BHK-21 debería ser similar al del título observado mediante la tinción X-gal en las células BHKSINjra\beta-gal.
Se determinó el título de diversas preparaciones de vector Sindbis, en unidades de vector, producidas de líneas celulares de empaquetado tales como las descritas en el Ejemplo 7, mediante la infección de monocapas confluentes de células BHKSINjra\beta-gal.
Con varias diluciones del vector. Se determinó el título de la preparación del vector a las 6 h. después de la infección mediante la visualización de las células que producen la proteína \beta-galactosidasa, tal como se describe anteriormente. Debido a que los vectores Sindbis descritos no contienen la región vírica correspondiente a los genes estructurales, no es posible determinar el título de una preparación de vector mediante el ensayo de placas en células BHK-21.
Alternativamente, se produjo una línea celular de valoración usando una configuración de casete indicador diferente, que está constituida por un promotor eucariota/secuencia del extremo 5' de Sindbis reconocida por la transcriptasa vírica/región de unión de Sindbis/gen indicador/secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa de Sindbis para la síntesis de la cadena menos, y se expresa en una orientación de sentido directo. Este casete de expresión indicador requiere la síntesis, mediante las proteínas no estructurales de Sindbis suministradas por el vector, en una molécula de ARN de sentido contrario, antes de la transcripción del mensajero subgenómico que codifica el gen indicador.
Específicamente, se creó el constructo empaquetado con orientación de sentido directo como sigue. Se digirió el plásmido PVGELVIS con la enzima ApaI, que rompe en el nucleótido 11737, justo en la dirección 3' del extremo 3' de Sindbis. El ADN digerido con ApaI se enromó en el extremo mediante la adición de ADN polimerasa T4 y los DNTp y la incubación a 16ºC durante 10 minutos. Tras la inactivación térmica de la polimerasa, el fragmento de ADN se digirió con la enzima SfiI, y el fragmento de 10041 pb se purificó en un gel de agarosa al 1%. El plásmido pSKSINBV-lacZ se digirió con la enzima SacI y s enromó en el extremo tal como se describe anteriormente. A continuación se digirió el fragmento con SfiI, y el fragmento de 7pkb se purificó en un gel de agarosa al 1%. El fragmento pSKSINBVlacZ de 7 kb se ligó a continuación en el fragmento pVGELVIS purificado para crear el plásmido pELVIS-bgaI. Este plásmido contiene las proteínas no estructurales de Sindbis completo, la región de unión, el gen LacZ y la secuencia de reconocimiento de la replicasa del extremo 3' de Sindbis, bajo el control del promotor LTR de MuLV. El plásmido pELVIS-bgaI se digirió con BspEI, se purificó mediante Geneclean (Bio 101 corp., San Diego, CA) y se volvió a ligar por sí mismo. BspEI elimina las secuencias génicas de la proteína no estructural de Sindbis entre los nt 422-7054. El constructo vuelto a enlazar contiene una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción del ARN de Sindbis, la región de unión de Sindbis, las secuencias que codifican el gen LacZ, y las secuencias del extremo 3' de Sindbis necesarias para la síntesis de un ARN de cadena menos, todas en la dirección 3', y bajo el control transcripcional de un promotor MuLV-LTR. Se conoce este constructo como pELVISdINSP-bgal.
Se transfectó el plásmido pELVISdINSP-bgal en células BHK y se ensayó tal como se ha descrito anteriormente. Las células BHK pELVISdINSP-bgal producen un transcripto de ARN con una secuencia del extremo 5' que está reconocida por la transcriptasa de Sindbis, una región de unión de Sindbis, las secuencias que codifican el gen LacZ, y las secuencias del extremo 3' de Sindbis necesarias para la síntesis del ARN de la cadena menos. Se evitó la expresión de la \beta-galactosidasa del transcripto primario a que el marco de lectura abierto y los codones de detención en la dirección 5' creados, darán como resultado la transcripción de los transcriptos de LacZ activos procedentes de la región de unión de Sindbis, tras la síntesis inicial de un intermedio de sentido contrario. Además, esta configuración, se diseña para contener el genoma y las secuencias 5' y 3' precisas de Sindbis, que permitirán a los transcriptos del gen indicador experimentar la amplificación utilizando las mismas proteínas no estructurales proporcionadas por el vector Sindbis.
En otra configuración, se produjo una línea celular de valoración usando un casete de expresión que contenía un gen indicador de sentido contrario seguido por las secuencias de reconocimiento de la replicasa del extremo 3' de Sindbis, situadas en la orientación de sentido directo. Este constructo, bajo el control de un promotor eucariota, produce un transcripto de ARN que está reconocido y se transcribe mediante las proteínas no estructurales de Sindbis proporcionadas por el vector que se va a valorar. Las proteínas no estructurales de Sindbis reconocen las secuencias en el transcripto indicador primario, y a la vez, sintetizan un transcripto indicador de sentido directo. Este constructo no se beneficia de la amplificación del transcripto del gen indicador, pero debería proporcionar aún suficientes transcriptos para permitir la valoración del vector.
La construcción de este tipo de casete de valoración es como sigue. Se digirió el vector pSV-B-galactosidasa (Promega Corp., Madison, WI) con la enzima HindIII y se enromó el extremo tal como se describe anteriormente. Se digirió adicionalmente el plásmido con las enzimas BamHI y XmnI para eliminar el gen LacZ, y reducir el tamaño del fragmento restante. El fragmento de 3737 nt., que contiene el gen LacZ, se purificó en un gel de agarosa al 1% y se ligó en pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) que se había digerido con las enzimas BamHI y EcoRV. El nuevo constructo de plásmido se conoce como pcDNAaLacZ. Se digirió el plásmido con la enzima ApaI, se enromó en el extremo tal como anteriormente, y se digirió adicionalmente con la enzima XhoI. El plásmido pSKSINBV (descrito anteriormente) se digirió con SacI, se enromó en el extremo tal como anteriormente, y a continuación se digirió con XhoI.
El fragmento de 146 nt. resultante que contenía la secuencia de reconocimiento 3' de la replicasa de Sindbis se purificó en un gel de agarosa al 1,2%, se ligó en el vector pcDNAaLacZ digerido. El constructo vuelto a enlazar contiene un gen LacZ de sentido contrario y una secuencia de reconocimiento 3' de la proteína replicasa de Sindbis en la dirección 3' de un promotor CMV. Se conoce el constructo resultante como pcDNAaLacZ-3'Sin. Se transfectó el constructo en células BHK y se utilizó tal como se ha descrito anteriormente.
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Ejemplo 11 Generación de constructos de vector que expresan antígenos de vhb para la inducción de una respuesta inmune A. Aislamiento de la secuencia de VHB e/core
Se obtuvo un fragmento de BamHI de 1,8 kb que contenía la región precore/core completa de la hepatitis B procedente del plásmido pAM6 (ATCC Nº 45020) y se ligó en el emplazamiento BamHI de KS II^{+} (Stratagene, La Jolla, CA). Se designó este plásmido como KS II+ HBpc/c. Se añadieron los ligantes XhoI al emplazamiento Stu del prenúcleo/núcleo en el KS II^{+} HBpc/c (en el nucleótido 1.704 de la secuencia), seguido por rotura con HincII (en el nucleótido 2.592 de la secuencia). Se clonó el fragmento precore/core XhoI-HincII de 877 pares de bases resultante en el emplazamiento XhoI/HincII de SK II^{+}. Se designó este plásmido como SK^{+}HBe.
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B. Preparación de las secuencias utilizando la PCR 1. Mutagénesis dirigida al emplazamiento de la secuencia VHB e/core utilizando la PCR
Se secuenció el gen precore/core en el plásmido KS II^{+} HB pc/c para determinar si la región de codificación precore/core es correcta. Se encontró que esta secuencia tenía una delección en la pareja de bases única que producía un cambio de marco en el codón 79 que daba como resultado dos codones de detención TAG en marcos consecutivos en los codones 84 y 85. Se corrigió esta delección mediante la extensión del solapamiento de la PCR (Ho y col., Gene 77: 51, 1989) de la región de codificación precore/core en el plásmido SK^{+} HBe. Se usaron cuatro oligonucleótidos para las 3 reacciones de la PCR llevadas a cabo para corregir la delección.
La primera reacción utiliza dos cebadores: La secuencia del cebador de sentido directo corresponde a la secuencia de los nucleótidos 1.805 a 1.827 de la cadena adw y contiene dos emplazamientos de restricción XhoI en el extremo 5'. La numeración de la secuencia de nucleótidos se obtuvo del Genbank (Intelligenics, Inc., Mountain View, CA).
5' CTC GAG CTC GAG GCA CCA GCA CCA TGC AAC TTT TT-3' (SEC DE ID Nº. 51) 
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La secuencia del segundo cebador corresponde a la secuencia de los nucleótidos de sentido contrario 2.158 a 2.130 de la cadena adw del virus de la hepatitis B, e incluye los codones 79, 84 y 85.
5'-CTA CTA GAT CCC TAG ATG CTG GAT CTT CC-3' (SEC DE ID Nº. 52) 
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La segunda reacción utiliza también dos cebadores. El cebador de sentido directo corresponde a la secuencia de los nucleótidos 2.130 a 2.158 de la cadena adw, e incluye los codones 79, 84 y 85.
5'-GGA AGA TCC AGC ATC TAG GGA TCT AGT AG-3' (SEC DE ID Nº. 53) 
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El segundo cebador corresponde a la secuencia de nucleótido de sentido contrario del poliligante del plásmido SK^{+} y contiene un emplazamiento ClaI de 135 pb en la dirección 3' del codón de detención de la región de codificación precore/core de VHB.
5'-GGG CGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CG-3' (SEC DE ID Nº. 54) 
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La tercera reacción utiliza también dos cebadores. El cebador de sentido directo corresponde a la secuencia de los nucleótidos 5 a 27 de la cadena adw, y contiene dos emplazamientos de restricción XhoI en el extremo 5'
5'-CTC GAG CTC GAG GCA CCA GCA CCA TGC AAC TTT TT (SEC DE ID Nº. 55) 
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La segunda secuencia del cebador corresponde a la secuencia de nucleótidos de sentido contrario del poliligante del plásmido SK^{+} y contiene un emplazamiento ClaI de 135 pb en la dirección 3' del codón de detención de la región de codificación precore/core de VHB
5'-GGG CGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CG-3' (SEC DE ID Nº. 56) 
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La primera reacción de la PCR corrige la delección en la cadena de sentido contrario y la segunda reacción corrige la delección en las cadenas de sentido directo. Las reacciones de la PCR una y dos corrigen la mutación de CC a CCA que se produce en el codón 79 y la sustitución de un par de bases de TCA a TCT en el codón 81. El cebador 1 contiene dos emplazamientos XhoI consecutivos de 10 pb en la dirección 5' del codón ATG de la región de codificación de VHB e y el cebador 4 contiene un emplazamiento ClaI de 135 pb en la dirección 3' del codón de detención de la región de codificación precore/core de VHB. Los productos de la primera y segunda reacciones de la PCR se extienden en una tercera reacción de la PCR para generar una región de codificación precore/core completa de VHB con la secuencia correcta.
Las reacciones de la PCR se llevaron a cabo usando las siguientes condiciones de ciclación: la muestra se calentó inicialmente a 94ºC durante 2 minutos. Esta etapa, denominada etapa de fusión, separa el ADN de doble cadena en cadenas únicas par la síntesis. A continuación se calentó la muestra a 56ºC durante 30 segundos. Esta etapa, denominada etapa de templado, permite a los cebadores templar el ADN de cadena única producido en la primera etapa. A continuación se calentó la muestra a 72ºC durante 30 segundos. Esta etapa, denominada etapa de extensión, sintetiza la cadena complementaria del ADN de cadena única producido en la primera etapa. Se llevó a cabo una segunda etapa de fusión a 94ºC durante 30 segundos, seguida por una etapa de templado a 56ºC durante 30 segundos que se continuó por una etapa de extensión a 72ºC durante 30 segundos. A continuación se repitió este procedimiento durante 35 ciclos dando como resultado la amplificación del producto de ADN deseado.
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El producto de reacción de la PCR se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y se transfirió sobre un papel NA 45 (Schleicher and Schuell, Keene, New Hampshire). El fragmento de ADN de 787 pb deseado se eluyó del papel NA 45 incubando durante 30 minutos a 65ºC en 400 \mul de tampón de sal alta (NaCl 1,5 M, Tris 20 mM, pH 8,0, y EDTA 0,1 mM). Tras la elución, se añadieron 500 \mul de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) a la solución. Se sometió la mezcla a vortización y a continuación se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 minutos en centrífuga Brikmann Eppendorf (5415L). La fase acuosa, que contenía el fragmento de ADN deseado, se transfirió a un tubo de micrófuga de 1,5 ml nuevo y se añadieron 1,0 ml de EtOH al 100 %. Se incubó la solución en hielo seco durante 5 minutos, y a continuación se centrifugó durante 20 minutos a 10.000 rpm. Se decantó el sobrenadante, y se enjuagó el residuo con 500 \mul de EtOH al 70%. Se secó el residuo mediante centrifugación a 10.000 rpm a vacío, en un concentrador Savant-Speed-Vac, y a continuación se volvió a suspender en 10 \mul de H_{2}O desionizada. Se analizó un microlitro del producto de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% El fragmento amplificado mediante la PCR precore/core de XhoI-ClaI de 787 pb se clonó en el emplazamiento XhoI-ClaI del plásmido SK^{+}. Se designó este plásmido como SK^{+}HBe-c. Se transformó E. coli (DH5 alpha, Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD) con el plásmido SK^{+}HBe-c y se propagó para generar el ADN plásmido. A continuación se aisló y purificó el plásmido, esencialmente tal como se describe por Bimboim y col. (Nuc. Acid Res. 7: 1513, 1979; véase también Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook y col. (eds.), Cold Spring Harbor Press, 1989). Se analizó el plásmido SK+HBec para confirmar la secuencia del gen precore/core (figura 4).
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2. Aislamiento se la secuencia Core de VHB
La delección del par de bases único en el plásmido SK^{+} HBe se corrigió mediante la extensión del solapamiento de la PCR tal como se describe en el Ejemplo 9B. Se usaron cuatro cebadores de oligonucleótidos para las reacciones de la PCR llevadas a cabo para corregir la mutación.
La primera reacción utiliza dos cebadores. El cebador de sentido directo corresponde a la secuencia de nucleótidos del promotor T-7 del plásmido SH^{+}HBe.
5'-AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' (SEC DE ID Nº. 57) 
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La segunda reacción corresponde a la Secuencia de sentido contrario de 2.158 a 2.130 de la cadena adw, e incluye los codones 79, 84 y 85.
5'-CTA CTA GAT CCC TAG ATG CTG GAT CTT CC-3' (SEC DE ID Nº. 58) 
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La segunda reacción utiliza dos cebadores. El cebador de sentido contrario corresponde a la secuencia de nucleótidos del promotor T-3 presente en el plásmido SK^{+}HBe.
5'-3': ATT AAC CCT CAC TAA AG (SEC DE ID Nº. 59) 
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El segundo cebador corresponde a la secuencia de nucleótidos de sentido directo 2.130 a 2.158 de la cadena adw, e incluye los codones 79, 84 y 85.
5'-GGA AGA TCC AGC ATC TAG GGA TCT AGT AG-3' (SEC DE ID Nº. 60) 
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La tercera reacción utiliza dos cebadores. El cebador de sentido contrario corresponde a la secuencia de nucleótidos del promotor T-3 presente en el plásmido SK^{+}HBe.
5'-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3' (SEC DE ID Nº. 61) 
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El segundo cebador corresponde a la secuencia de sentido directo del promotor T-7 presente en el plásmido SK^{+}HBe.
5'-AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' (SEC DE ID Nº. 62) 
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El producto de la PCR de la tercera reacción dio como resultado la secuencia correcta de la región de codificación precore/core de VHB.
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Para aislar la región de codificación core de BHB, se diseñó un cebador para introducir el emplazamiento de restricción XhoI en la dirección 5' del codón de inicio ATG de la región de codificación core, y eliminar los 29 aminoácidos de la secuencia líder de la región de codificación precore de VHB. En una cuarta reacción, se produjo la región de codificación core de VHB usando el producto de la PCR de la reacción y los dos siguientes cebadores.
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El cebador de sentido directo corresponde a la secuencia de los nucleótidos 1.885 a 1.905 de la cadena adw y contiene dos emplazamientos XhoI en el extremo 5'.
5'-CCT CGA GCT CGA GCT TGG GTG GCT TTG GGG CAT G-3' (SEC DE ID Nº. 63) 
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El segundo cebador corresponde a la secuencia de nucleótidos de sentido contrario del promotor T-3 presente en el plásmido SK^{+} HBe. El producto de la PCR de aproximadamente 600 pb de la cuarta reacción contiene la región de codificación core de VHB y emplazamientos de restricción XhoI novedosos en el extremo 5' y los emplazamientos de restricción ClaI en el extremo 3' que estaban presente en el emplazamiento multiclonación del plásmido SK+ HBe
5'-ATT ACC CCT CAC TAA AG-3' (SEC DE ID Nº. 64) 
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Tras la cuarta reacción de la PCR, se transfirió la solución a un tubo de micrófuga de 1,5 ml nuevo. Se añadieron cincuenta microlitros de acetato de sodio 3 M a esta solución seguido por 500 \mul de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Se sometió la mezcla a vortización y a continuación se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 minutos. La fase acuosa se transfirió a un tubo de micrófuga reciente y se añadieron 1,0 ml de EtOH al 100%. Se incubó esta solución a -20ºC durante 4,5 horas, y a continuación se centrifugó a 10.000 rpm durante 20 minutos.
Se decantó el sobrenadante, y se enjuago el residuo con 500 \mul de EtOH al 70%. Se secó el residuo mediante centrifugación a 10.000 rpm a vacío y a continuación se volvió a suspender en 10 \mul de H_{2}O desionizada. Se analizó un microlitro del producto de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
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3. Aislamiento del antígeno X de VHB
Se obtuvo un fragmento NCOI TaqI de 642 pb que contenía el marco de lectura abierto X del virus de la hepatitis B procedente del plásmido pAM6 (adw) (ATCC 45020), enromado mediante el fragmento Klenow, y se ligó en el emplazamiento HincII de SK^{+} (Stratagene, La Jolla, California). Se transformó E. coli (DH5 alpha, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) con la reacción de ligadura y se propagó. A continuación se aisló y purificó ADN miniprep, esencialmente tal como se describe por Birnboim y col. (Nuc. Acid Res. 7: 15134, 1979; Molecular Cloning A Laboratory Manual, Sambrook y col. (eds.), Cold Spring Harbor Press, 1989).
Debido a que este fragmento se puede insertar en cualquier orientación, se seleccionaron clones que tenían la orientación de sentido directo con respecto a los emplazamientos XhoI y ClaI en el emplazamiento multiclonación SK^{+}. Más específicamente, se digirieron los ADN miniprep con la enzima de restricción diagnóstico, BamHI. Los insertos en la orientación correcta dieron como resultado dos fragmentos de 3,0 kb y 0,6 kb de tamaño. Los insertos en la orientación incorrecta dieron como resultado dos fragmentos de 3,6 kb y 0,74 kb. Se seleccionó un clon con la orientación correcta y se designó como SK-X Ag.
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4. Construcción de vectores Sindbis que expresan VHBe-c, VHB Core y VHB X
Se llevó a cabo la construcción de un vector Sindbis que expresaba la secuencia VHBe-c digiriendo el plásmido SK^{+}HBe-c con los emplazamientos de las enzimas de restricción XhoI y ClaI para liberar un fragmento de ADNc que codifica las secuencias VHBe-c. A continuación se aisló el fragmento mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificó con Gene Clean^{TM} (BIO101, San Diego, CA), y se insertó en el esqueleto del vector Sindbis deseado, preparado mediante digestión con XhoI y ClaI, y se trató con CIAP. Los vectores Sindbis descritos en el Ejemplo 2, son adecuados para la inserción de las secuencias del antígeno de VHB. Dichos vectores Sindbis incluyen pKSSINBV, pKSSINdIJRsjrc, pKSSINdIJRsjrPC, pKSSINdIJRsjrNP(7582-7601) y pKSSINdIJRsexjr.
Se llevó a cabo la construcción de un vector Sindbis que expresaba la secuencia core de VHB mediante tratamiento con Gene Clean^{TM} del producto de la PCR descrito anteriormente. A continuación se digirió el producto amplificado con los emplazamientos de la enzima de restricción XhoI y ClaI, se aisló con electroforesis en gel de agarosa, se purificó mediante Gene Clean^{TM} y se ligó en los mismos vectores Sindbis descritos anteriormente pretratados con las enzimas XhoI y ClaI.
[Se llevó a cabo la construcción de un vector Sindbis que expresaba la secuencia del antígeno de VHB-X digiriendo el plásmido SK-X Ag con los emplazamientos de la enzima de restricción XhoI y ClaI para liberar el fragmento de ADNc que codificaba las secuencias VHB-X. Se aisló el fragmento mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificó usando Gene Clean^{TM}, y se insertó en los esqueletos de los vectores Sindbis deseados, descritos anteriormente, pretratados con las enzimas XhoI y ClaI.
Los vectores que expresan VHB de Sindbis anteriores se pueden también modificar para expresar simultáneamente un marcador de la resistencia a un fármaco seleccionable dependiente de las necesidades del experimento o el tratamiento de las células infectadas con el vector. Se puede diseñar cualquiera de los vectores de expresión de VHB de Sindbis anteriores descritos para expresar simultáneamente la resistencia a G418. Se llevó esto a cabo mediante la incorporación de un emplazamiento interno de entrada de la ribozima (Ejemplo 5) seguido por el gen de la neomicina fosfotransferasa bacteriano colocado a 3' de las secuencias de codificación de VHB y a 5' del extremo 3' terminal del vector que usa el emplazamiento de clonación múltiple del vector. Se pueden usar estos constructos de vector resistentes a G418 para seleccionar células infectadas con vectores par la generación de dianas CTL específicas de VHB en las siguientes secciones.]
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D. Expresión de células infectadas con vectores Sindbis 1. ELISA
Se prepararon lisados celulares de células infectadas mediante cualquiera de los vectores que expresan VHB lavando 1,0 x 10^{7} células cultivadas con PBS, volviendo a suspender las células en un volumen total de 600 \mul en PBS, y sonicandolas durante dos periodos de 5 segundos en un sonicador Branson Modelo 350 (Fisher, Pittsburgh, PA) con un ajuste de 30 in, o mediante congelación y descongelación tres veces. Los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 5 minutos.
Se ensayaron el antígeno core y el antígeno precore en los lisados celulares y se secretó antígeno e en el sobrenadante del cultivo usando el kit rDNA EIA para HBe de Abbot (Abbott Laboratories Diagnostic Division, Chicago, IL). Se llevó a cabo otro ensayo EIA sensible para antígeno precore en lisados celulares y antígeno e secretado en el sobrenadante del cultivo usando el kit ETI-EB de Incstar (Incstar Corporation, Stillwater, MN). Se generó una curva patrón de las diluciones del antígeno core de hepatitis B recombinante y el e obtenido de Biogen (Ginebra, Suiza).
Usando estos procedimientos se expresaron aproximadamente 10 ng/ml de antígeno e en las líneas celulares transducidas.
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2. Inmunoprecipitación/transferencia Western
Se llevó a cabo la caracterización de los antígenos precore/core y e expresado por células infectadas con vector mediante inmunoprecipitación seguida por análisis de transferencia Western. Específicamente, se mezclaron 0,5-1,0 ml de lisado celular en PBS o el sobrenadante del cultivo con antígeno core de anti-hepatitis B de conejo policlonal (DAKO Corporation, Carpinteria, California) unido a G-Sefarosa (Pharmacia LKB, Uppsala, Suecia) y se incubaron durante la noche a 4ºC. Las muestras se lavaron dios veces en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM y se hirvieron en tampón de carga de muestra con \beta 2-mercaptoetanol al 0,5%: En primer lugar se resolvieron las proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, y a continuación se transfirieron a Immobilon (Millipore Corp., Bedford, ME) y se sondaron con el antígeno core anti-hepatitis de conejo policlonal DAKO, seguido por ^{125}I-proteína A.
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E. Ensayo de respuesta inmune 1. Ensayos de citotoxicidad (a) Ratones innatos
Ratones hembra Balb/C, C57B1/6 y C3H de seis a ocho semanas de edad (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN) se inyectaron dos veces por vía intraperitoneal (i.p.) a intervalos de 1 semana con 1 x 10^{7} L-M(TK^{-}) (ATCC CLL 1.3) células irradiadas (10.000 rads a temperatura ambiente) infectadas con el vector Sindbis. Se sacrificaron los animales 7 días después y se cultivaron los esplenocitos in vitro con sus respectivas células (6 x 10^{4}/ml) irradiadas infectadas con el vector Sindbis en matraces T-25 (Corning, Coming, NY). El medio de cultivo estaba constituido por RPMI 1640, suero bovino fetal inactivado con calor al 5%, piruvato de sodio 1 mM, 50 \mug/ml de gentamicina y \beta 2 mercaptoetanol 10^{-5} M (Sigma, St. Louis, MO). Se cosecharon las células efectoras 4-7 días después y se ensayaron usando diversas relaciones efector:células diana en placas de microvaloración de 96 pocillos (Coming, Corning, NY) en un ensayo estándar de liberación de cromo. Las dianas son las células L-M(TK^{-}) infectadas con vectores y las células no infectadas con vectores mientras que las líneas celulares no transducidas se usaron como controles negativos. Específicamente, células diana (1 x 10^{4} células/pocillo) marcadas con Na_{2}^{51}CrO_{4} (Amersham, Arlington Heights, IL) (100 uCi, 1 hora a 37ºC) se mezclaron con células efectoras a diversas relaciones de efector a célula diana en un volumen final de 200 \mul. Tras la incubación, se retiraron 100 \mul del medio de cultivo y se analizaron en un espectrómetro gamma de Beckman (Beckman, Dallas, TX). Se determinó la liberación espontánea (SR) en forma de CPM de las diana más el medio y se determinó la liberación máxima (MR) en forma de CPM de las diana más HCl 1 M. Se calculó el porcentaje de lisis de las célula diana como: [(Célula efectora + diana CPM) - (SR)/(MR) - (SR)] x 100. Los valores de liberación espontáneos de las dianas son normalmente 10%-20% de la MR. Para algunos ensayos CTL, se pueden estimular in vitro los efectores múltiples veces, por ejemplo, en el día 8-12 después de la primera estimulación in vitro. Más específicamente, 10^{7} células efectoras se mezclaron con 6 x 10^{5} células estimuladoras irradiadas (10.000 rads) y 2 x 10^{7} células de "relleno" irradiadas (3.000 rads) preparadas tal como se describe a continuación en 10 ml de medio RPMI "completo". (RPMI que contenía Suero Bovino Fetal térmicamente inactivado al 5%. L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio I mM, aminoácidos no esenciales 1X, y \beta 2 mercaptoetanol 5 x 10^{5} M): Se generaron células estimuladores para la estimulación in vitro de las células efectoras para infectar las células L-M (TK-) con un vector VHB de Sindbis que expresaban simultáneamente la resistencia a G418: Las células infectadas con vector se seleccionaron para la selección del marcador usando 800 \mug/ml de G418 durante dos semanas. Las células resistentes a G418 se irradiaron a continuación a 10.000 rads y se usaron a continuación para volver a estimular las células efectoras in vitro tal como se ha descrito. Se prepararon células de "relleno" procedentes de células de bazo de ratones singénicos sin tratamiento previo y vueltas a suspender en RPMI, irradiadas con 3.000 rads a temperatura ambiente. Se lavaron los esplenocitos con RPMI, se centrifugaron a 3.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente, y el aglomerado se volvió a suspender en RPMI. Las células vueltas a suspender se trataron con 1,0 ml de tricloruro de amonio (100 ml de base tris 0,17 M, pH 7,65, más 900 ml de NH_{4}Cl 0,155 M; la solución final se ajustó a un pH de 7,2) a 37ºC durante 3-5 minutos. La reestimulación secundaria in vitro se cultivó a continuación durante 5-7 días antes de ensayar en un ensayo CTL. Cualquier reestimulación posterior se cultivó tal como se ha descrito anteriormente con la adición
de 2-10 U de IL-2 humana recombinante (200 U/ml, nº de catálogo 799068, Boehringer Mannheim, W. Alemania).
Usando estos procedimientos, se puede demostrar que se pueden inducir las CTL en el antígeno e de VHB.
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(b) Ratones transgénicos HLA A2.1
Ratones transgénicos HLA A2.1 hembras de seis a ocho semanas de edad (V. Engelhard, Charlottesville, VA) se inyectaron dos veces por vía intraperitoneal (i.p.) a intervalos de una semana con 1,0 x 10^{7} células EL4 A2/K^{b} (ATCC Nº TIB-39) irradiadas (10.000 rads a temperatura ambiente) transducidas con vector. Se sacrificaron los animales 7 días después y los esplenocitos (3 x 10^{6}/ml) cultivados in vitro con células A2/K^{b} irradiadas (10.000 rads) transducidas o con células Jurkat A2/K^{b} (6 x 10^{4}/ml) recubiertas con péptido en matraces (T-25, Coming, Corning, NY). Se llevó a cabo el resto del ensayo de liberación de cromo tal como se describe e el Ejemplo 9E 1.a en el que las dianas se transdujeron y las células EL4A2/K^{b} y Jurkat A2/K^{b} no se transdujeron. Las líneas celulares no transducidas se utilizaron como controles negativos. Las dianas pueden ser células EL4 A2/K^{b} recubiertas con péptido.
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(c) Transducción de células humanas con constructos de vector
Se establecieron líneas celulares linfoblastoides (LCL) para cada paciente infectando (transformando) sus células B con virus de Epstein-Barr (VBE) reciente tomado del sobrenadante de un cultivo de 3 semanas de leucocitos B95-8 de monos tití transformados con VEB (ATCC CRL 1612). Tres semanas después de la transformación con VEB, las LCL se infectaron con vector Sindbis que expresaba el antígeno core ó e de VHB y resistencia a G418. Se llevó a cabo la infección con el vector de las LCL mediante cultivo simultáneo de 1,0 x 10^{6} células LCL con 1,0 x 10^{6} productoras de vector Sindbis irradiadas (10.000 rads) en una placa de 6 cm que contenía 4,0 ml de medio o añadiendo sobrenadante con el vector infeccioso. El medio de cultivo está constituido por RPMI 1640, suero bovino fetal térmicamente inactivado al 20% (Hyclone, Logan, UT), piruvato de sodio 5,0 mM y aminoácidos no esenciales 5,0 mM. Tras el cultivo simultáneo durante la noche a 37ºC y CO_{2} al 5 %, la suspensión de células LCL se retiró de las células productoras de vector Sindbis irradiadas (10.000). Se seleccionaron las células LCL infectadas añadiendo 800 \mug/ml de G418. Las células Jurkat A2/K^{b} (L. Sherman, Scripps Institute, LCL. San Diego, CA) se infectaron esencialmente tal como se describe para la infección de las células.
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(d) Ensayos CTL humanos
PBMC humanas se separaron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll (Sigma, St. Louis, MO). Específicamente, las células se centrifugaron a 3.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las PBMC se volvieron a estimular in vitro con sus LCL autólogas transducidas, Ejemplo 9E 1.c, en una relación efector:diana de 10:1 durante 10 días. El medio de cultivo está constituido por RPMI 1640 con lotes predetectados sistemáticamente de suero bovino fetal térmicamente inactivado al 5%, piruvato de sodio 1 mM y 50 \mug/ml de gentamicina. Los efectores CTL estimulados resultantes se ensayaron para la actividad CTL usando células LCL autólogas o emparejadas con HLA infectadas como dianas en el ensayo de liberación de cromo estándar, Ejemplo 9E 1.a. Debido a que la mayor parte de pacientes tienen inmunidad al VEB , las células B transformadas (LCL) con VEB no transducido se usaron como controles negativos, que serán reconocidas también como dianas por los CTL específicos de VEB con las LCL transducidas. Con el fin de reducir los elevados antecedentes debidos a muerte de las células dianas marcadas por los CTL específicos, es necesario añadir LCL no transducidas a las células diana marcadas en una relación 50:1.
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2. Detección de la respuesta inmune humoral
Se detectaron en ratones las respuestas inmunes humorales específicas de los antígenos core y e de VHB mediante ELISA. El protocolo ELISA utiliza 100 \mug/pocillo de antígeno core de VHB recombinante y e de VHB recombinante (Biogen, Ginebra, Suiza) para recubrir placas de 96 pocillos. Los sueros de ratones inmunizados con células o antígeno core de VHB ó e de VHB que expresan el vector de manera directa se diluyeron en serie a continuación en los pocillos recubiertos con antígeno y se incubaron durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Tras la incubación, se añadió a los pocillos una mezcla de IgGI, IgG2a, gG2b, e IgG3 de conejo anti-ratón con títulos equivalentes. Se añadió antisuero de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante ("HRP") a cada pocillo y se incubaron durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Tras la incubación, se visualizó la reactividad añadiendo la sustancia apropiada. Se desarrollará color en los pocillos que contienen los anticuerpo IgG específico del antígeno core de VHB ó é de VHB.
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3. Proliferación de células T
Se midió in vitro la actividad T auxiliar inducida por el antígeno resultante de dos o tres inyecciones de preparaciones directas de vector que expresaba el antígeno core ó e de VHB. Específicamente, esplenocitos de ratones inmunizados se volvieron a estimular in vitro a una relación predeterminada con células que expresaban el antígeno core ó e de VHB o con células que no expresaban el antígeno core ó e de VHB como control negativo. Tras cinco días a 37ºC y CO_{2} al 5% en medio de cultivo RPMI 1640 que contenía FBS al 5%, piruvato de sodio 1,0 mM y \beta 2-mercaptoetanol 10^{-5,} se ensayó el sobrenadante para la actividad de IL-2. IL-2 se secretó específicamente por las células T auxiliares estimuladas por el antígeno core ó e de VHB, y se midió su actividad usando el clon CTL CTLL-2 (ATCC TIB 214). De manera resumida, el clon CTLL-2 es dependiente de IL-2 para el crecimiento y no proliferará en ausencia de IL-2. Se añadieron células CTLL-2 a diluciones en serie de las muestras de ensayo del sobrenadante en una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC y CO_{2} al 5%; CO_{2} durante 3 días. Posteriormente, se añadieron 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina a las células CTLL-2. Se incorporaron 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina únicamente en el proliferado de células CTLL-2. Tras incubación durante la noche, se cosecharon las células usando un cosechador celular PHD (Cambridge Technology Inc., Watertown, MA) y se contaron en un contador beta de Beckman. Se determinó la cantidad de IL-2 en una muestra procedente de una curva patrón generada a partir de una IL-2 estándar recombinante obtenida de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN).
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F. Protocolos de administración 1. Ratones (a) Administración directa del vector
Se puede usar también el sistema ratón para evaluar la inducción de respuestas inmunes humorales y mediadas por células con la administración directa del vector que codifica el antígeno core ó e de VHB. De manera resumida, ratones hembra Balb/C, C57B16 o C3H de seis a ocho semanas de edad se inyectaron intramuscularmente (i.m.) con 0,1 ml de vector Sindbis que expresaba core de VHB ó e de VHB liofilizado reconstituido (con agua destilada desionizada estéril). Se proporcionaron dos inyecciones con una separación de una semana. Siete días después de la segunda inyección, se sacrificaron los animales. Se llevaron a cabo a continuación los ensayos CTL de liberación de cromo esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 9E 1.a.
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2. Protocolo de administración a chimpancés
Se usaron los datos generados en el sistema ratón descrito anteriormente para determinar el protocolo de administración del vector en chimpancés crónicamente infectados con el virus de la hepatitis B. Basándose en la inducción de CTL específicos de VHB en ratones, los sujetos en los ensayos con chimpancés recibieron tres dosis de antígeno core ó e que codificaba el vector en intervalos de 28 días proporcionados en dos grupos de dosificación escalonados sucesivamente. Los sujetos control recibieron un placebo comprendido por medios de formulación HBV-IT (V). La dosificación será tanto de 10^{6} como de 10^{7} ufc de HBV-IT (V) proporcionadas en cuatro inyecciones de 0,5 ml i.m. en cada día de inyección. Se extraerán muestras de sangre en los días 4, 12, 24, 36, 52, 70 y 84 y los meses 6, 12, 18, 24, 30, y 36 con el fin de medir los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) en suero, la presencia de antígeno e de la hepatitis B, la presencia de anticuerpos dirigidos contra el antígeno e de la hepatitis B y para evaluar la seguridad y tolerabilidad del tratamiento. El antígeno e de la hepatitis B y los anticuerpos para el antígeno e de HB se detectaron mediante el kit rDNA EIA para Hb e de Abbott (Abbott Laboratories Diagnostic Division, Chicago, IL). Se puede determinar
la eficacia de la inducción de los CTL contra el antígeno core ó e de la hepatitis B tal como en el Ejemplo 9E 1.c.
Basándose en los resultados de seguridad y eficacia de los estudios en chimpancés, se determino la dosificación y el calendario de inoculación para la administración del vector a los sujetos en ensayos en seres humanos. Se siguieron estos sujetos para los niveles de ALT en suero, presencia de antígeno e de VHB y presencia de anticuerpos dirigidos contra el antígeno e de VHB, esencialmente tal como se describe anteriormente. Se determinó la inducción de los CTL humanos contra el antígeno core ó e de la hepatitis B tal como en el Ejemplo 9E 1.c.
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Ejemplo 12 Vectores Sindbis que expresan proteínas víricas para la inducción de la respuesta inmune o para el bloqueo de las interacciones de la célula huésped del virus
El siguiente ejemplo describe los procedimientos para construir vectores Sindbis capaces de generar una respuesta inmune expresando un antígeno vírico de VIH. Se proporcionan también procedimientos para ensayar la expresión y la inducción de una respuesta inmune.
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Vectores Sindbis usados para estimular una respuesta inmune A. Vector de expresión ENV de VIH IIIB
Se aisló un fragmento de ADN de KpnI-XhoI de 2,7 Kb procedente del clon provírico BH10-R3 de VIH (para la secuencia, véase Ratner y col., Nature 313: 277, 1985) y un fragmento de ADN de SalI-KpnI de \sim 400 pb de IIIexE7deltaenv (una delección en Bal31 en el nt 5496) se ligó en el emplazamiento SalI en el plásmido SK^{+}. De este clon, se purificó un fragmento de ADN de env de 3,1 kb (XhoI-ClaI) y se ligó en los vectores Sindbis anteriormente descritos predigeridos con XhoI y ClaI.
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B. Creación de una línea celular productora que expresa antígenos específicos de VIH
Para construir una línea celular productora de vector que exprese env derivado de VIH IIIB a partir del vector descrito anteriormente, se transfectaron transcriptos de ARN transcritos in vitro en una línea celular que empaqueta Sindbis (Ejemplo 7). Específicamente, las moléculas de vector de ARN de Sindbis se produjeron inicialmente usando un sistema de ARN polimerasa transcrito in vitro de SP6 usado para trascribir de un clon de ADNc de vector Sindbis que codificaba las secuencias específicas de VIH. Los productos de vector de ARN generados in vitro, se transfectaron a continuación en una línea celular de salto o empaquetado de Sindbis que conduce a la producción de partículas de vector infecciosas transitorias en 24 horas. A continuación, estas partículas de vector se recogieron de los sobrenadantes de los cultivos de la línea celular y a continuación se filtraron a través de un filtro de 0,45 micrómetros para evitar la contaminación celular. Los sobrenadantes filtrados se usaron a continuación para infectar una monocapa reciente de células que empaquetan Sindbis. En las 24 horas de la infección, se produjeron partículas de vector Sindbis que contenían ARN recombinante de Sindbis de cadena positiva que codificaba proteínas no estructurales de Sindbis y secuencias específicas de VIH.
Una configuración alternativa de un vector env de VIH IIIB de Sindbis es un promotor que impulsa el ADNc del constructo Sindbis que contiene un marcador seleccionable. En esta configuración, el fragmento XhoI a ClaI descrito anteriormente que contenía la secuencia env de VIH IIIB se colocó en un ADNc de vector Sindbis similar impulsado por un promotor constitutivo en lugar de una secuencia de reconocimiento de la polimerasa de bacteriófago. Usando esta configuración, los plásmidos del vector de expresión se transfectaron en la línea celular de empaquetado y se seleccionaron para la resistencia l fármaco 24 a 48 horas después de la transfección. A continuación las colonias resistentes se combinaron 14 días después (dependientes del marcador de selección usado) y se clonó por dilución. A continuación se propagaron varios clones por dilución, y se ensayaron para el título más alto del vector. Los clones con el título más alto se expandieron a continuación y se almacenaron congelados. Los clones almacenados se ensayaron para la producción de proteína específica de VIH y la inducción de la respuesta inmune.
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C. Ensayo de producción de proteína específica de VIH y una respuesta inmune
Los lisados celulares de la línea productora de VIH de Sindbis se ensayaron para la producción de proteína específica de VIH mediante análisis de transferencia Western. Para ensayar la capacidad del vector para transferir la expresión in vitro, se infectaron células BHK-21 con sobrenadante filtrado que contenía el vector vírico y se ensayó mediante el análisis de transferencia Western 24 hora después de la infección. Una vez que se ha verificado la expresión in vivo de la proteína en ratón y primates, se llevaron a cabo los estudios para demostrar la capacidad de las células singénicas de expresar un gen extraño tras el tratamiento del vector para. (a) estimular una respuesta CTL en ratones inyectando tanto células singénicas infectadas como preparaciones de vector infeccioso; (b) estimular respuestas CTL en un sistema de cultivo in vitro en seres humanos; (c) para infectar células humanas, de chimpancés y macacos, incluyendo las células primarias, de tal manera que se puedan usar éstas para estimular respuestas CTL y puedan servir como dianas en ensayos CTL; (d) mapear los epitopos de respuestas inmunes; y (e) estimular y medir respuestas CTL y otras de antígenos no de VIH tales como CMV de ratón (MCMV).
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1. Respuesta inmune a antígenos codificados por el vector vírico Sindbis
Para ensayar la respuesta inmune estimulada procedente de una línea celular transducida con un vector env de VIH IIIB de Sindbis, se infectó una línea celular de tumor en murino (B/C10ME) (H-2^{d}) (Patek y col., Cell. Immunol. 72: 113, 1982) con un virus Sindbis recombinante que transportaba el vector VIH IIIB. La línea celular que expresaba env de VIH (B/C10ME-IIIB) se utilizó a continuación para estimular ratones Balb/c (H-2^{d}) singénicos (es decir, MHC idéntico) en CTL específico de env de VIH. Se inmunizaron los ratones con células B/C10MEIIIB (1 x 10^{7} células) y se estimularon en el día 7-14. (La estimulación puede no ser necesaria) Se prepararon suspensiones respondedoras de células de bazo procedentes de estos ratones inmunizados y se cultivaron las células in vitro durante 4 días en presencia tanto de células B/C10MEIIIB (BCenv) como de B/C10ME (BC) tratadas con mitomicina C a una relación de estimulador: respondedor de 1:50. Se cosecharon las células efectoras procedentes de estos cultivos, se contaron, y se mezclaron con células diana radiomarcadas (^{51}Cr) (es decir, B/C10MEenv-29 o B/C10ME) a diversas relaciones de células efectoras: respondedoras (E:T) en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr de 4-5 horas. Tras la incubación, las placas de microvaloración se centrifugaron, se retiraron 100 \mul del sobrenadante del cultivo, se cuantificó la cantidad de células lisadas de las retiradas radiomarcadas en un espectrómetro gamma de Beckman. Se calculó la lisis de las células diana como% de Lisis de Dianas = CPM Exp - SR CPM/MR CPM - SR CPM x 100, en el que los recuentos experimentales por minuto (CPM Exp) representan los efectores más las dianas; la liberación espontánea/SR CPN representa las dianas únicamente; y la liberación máxima (MR) CPM representa las dianas en presencia de HCl 1 M.
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2. Estimulación de una respuesta inmune en ratones mediante inyección directa de virus Sindbis recombinante
Se llevaron a cabo experimentos para evaluar la capacidad de los vectores víricos de Sindbis recombinantes de inducir la expresión de las proteínas de la envoltura de VIH tras la inyección directa en ratones. Se inyectaron aproximadamente 10^{4} a 10^{5} (ufp) de virus recombinante Sindbis que transportaba el constructo de vector env de VIH IIIB dos veces (2x) a intervalos de 3 semanas tanto mediante ruta intraperitoneal (i.p.) como intramuscular (i.m.). Se determinó que esta cantidad de virus Sindbis era inferior a la cantidad considerada para estimular una respuesta inmune. Se prepararon células de bazo para CTL aproximadamente de 7 a 14 días después de la segunda inyección de vector.
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D. Agentes de bloqueo derivados de análogos de proteína vírica expresados a partir de vectores Sindbis recombinantes
Muchas enfermedades infecciosas, cánceres, enfermedades autoinmunes, y otras enfermedades implican la interacción de partículas víricas con células, células con células, o células con factores. En las infecciones víricas, los virus entran habitualmente en las células mediante los receptores de la superficie de las células susceptibles. En Los cánceres, las células pueden responder inapropiadamente o no a todas las señales procedentes del resto de células o factores. En la enfermedad autoinmune, existe un reconocimiento de los "auto" marcadores. Estas interacciones pueden estar bloqueadas produciendo un análogo de cualquiera de los compañeros en la interacción, in vivo.
Esta acción de bloqueo se puede producir intracelularmente, en la membrana celular, o extracelularmente. La acción de bloqueo de un virus o, en particular, un vector Sindbis que transporta un gen de un agente de bloqueo, puede estar mediada tanto desde el interior de una célula susceptible como por la secreción de la proteína de bloqueo para bloquear localmente la interacción patogénica.
En el caso de VIH, los dos agentes de la interacción son la proteína de envoltura gp 120 (gp 41 y la molécula del receptor CD4. De esta manera, un bloqueante adecuado sería un constructo de vector que expresa cualquiera de un análogo de env de VIH que bloquea la entrada de VIH sin producir efectos patogénicos, o un análogo del receptor CD4. El análogo de CD4 se secretaría y funcionaría para proteger las células adyacentes, mientras que gp 120/gp 141 se secreta o produce únicamente intracelularmente de tal manera que protege sólo la células que contiene el vector. Esto puede ser ventajoso para añadir cadenas pesadas de inmunoglobulina humana u otros componentes de CD4 con el fin de potenciar la estabilidad o complementar la lisis. La liberación de un vector retrovírico que codifica dicho CD4 soluble híbrido en un huésped da como resultado un suministro continuo de una molécula híbrida estable.
Se pueden construir también partículas de vector que conducen a la expresión de análogos de env de VIH tal como se describe anteriormente. Será evidente para una persona experta en la técnica que las porciones son capaces de bloquear la adsorción del virus sin manifestar efectos secundarios patogénicos (Willey y col., J. Virol. 62: 139, 1988; Fisher y col., Science 233: 655, 1986).
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Ejemplo 13 Terapia de sustitución génica que usa vectores Sindbis recombinantes para la producción sistémica de proteínas. un tratamiento para la enfermedad de gaucher A. Creación de una glucocerebrosidasa de vector Sindbis
Se generó en primer lugar un clon de ADNc de glucocerebrosidasa (GC) que contenía una enzima de restricción XhoI en el emplazamiento 5' de la secuencia de codificación del ADNc y una enzima de restricción ClaI en el emplazamiento 3' de la secuencia de codificación del ADNc. Se puede generar el clon digiriendo pMFG-GC (Ohashi y col., PNAS 89: 11332, 1992) con NcoI, se enromó con ADN polimerasa Vent (New England Biolabs, Beverly, MA), y se ligó a continuación con los ligantes XhoI. A continuación se digirió el plásmido con BamHI, se enromó con ADN polimerasa Vent, y se ligó a continuación con los ligantes ClaI. A continuación se digirió el fragmento con XhoI y ClaI y se ligó en el emplazamiento XhoI-ClaI del vector Sindbis deseado.
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B. Construcción de una línea celular productora de vector GC de Sindbis
Se presentaron dos soluciones para crear la línea celular productora, dependiendo del clon de vector de ADNc de Sindbis usado. Un tipo de vector Sindbis usa una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa SP6 para la producción de transcriptos de ARN in vitro de replicación competente. Se usó este tipo de vector para crear una línea celular productora de vector basada en un vector no integrante que se replicaría persistentemente en la línea celular de empaquetado. El segundo tipo de vector usa un promotor heterólogo (Ejemplo 7) en un constructo de plásmido que permitió la integración estable en la línea celular de empaquetado. A continuación se transcribieron los transcriptos de vector de replicación competente en la línea celular de empaquetado transfectada.
Si el vector vírico GC de Sindbis usa una secuencia de reconocimiento del ARN de SP6, el ADNc debe transcribirse in vitro en primer lugar usando cualquiera de los sistemas de transcripción in vitro disponibles comercialmente (kit de transcripción Megascript^{TM}; Ambion Inc., Austin, TX) seguido por la transfección del ARN de longitud completa mediante liposomas o precipitación con fosfato de calcio en la línea celular que empaqueta Sindbis. Tal como se ha descrito anteriormente, los sobrenadantes filtrados que contenían partículas de vector infecciosas de la línea celular de empaquetado transfectada se usaron a continuación para volver a infectar una monocapa reciente de células que empaquetan Sindbis que sirvió a continuación como fuente del vector vírico. Aproximadamente, deberían usarse 10 ml de sobrenadante infeccioso para infectar 5 x 10^{6} células en una placa de 10 cm.
Si el vector vírico GC de Sindbis usa un promotor heterólogo en una configuración de plásmido de expresión con un marcador seleccionable (gen de resistencia a la neomicina), entonces el vector de ADNc debe transfectarse en la línea celular de empaquetado seguido por la selección de la resistencia al fármaco. A continuación se combinaron las colonias resistentes y se clonaron por dilución. A continuación se propagaron los clones individuales y se congelaron. Los clones se detectaron sistemáticamente individualmente, para título alto, expresión de GC mediante análisis de transferencia Western, y para la actividad funcional de la proteína.
Para aquellos vectores que no tienen un marcador seleccionable, se debe llevar a cabo la selección de clones transfectados de manera estable o persistente mediante clonación por dilución de las células transducidas con DA uno o dos días después de la transfección de las células con el vector Sindbis. A continuación, los clones por dilución se detectaron sistemáticamente para la presencia de GC usando la transcripción inversa del ARN mensajero, seguido por la amplificación del mensaje del ADNc mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa. Se conoce este procedimiento como la técnica R-PCR y está disponible un kit comercial para llevar a cabo este ensayo de Invitrogen Corp. (San Diego, CA). Se llevó a cabo la RT-PCR sobre clones que se habían propagado durante al menos 10 días. Se detectaron sistemáticamente aproximadamente de 50 a 100 clones con el fin de encontrar un número razonable de clones estables infectados persistentemente. Con el fin de llevar a cabo la RT-PCR, se necesitaron cebadores específicos para que el mensaje deseado sea detectado sistemáticamente mediante la amplificación del producto de ARN. Los cebadores designados para amplificar un producto de 521 pares de bases para la detección sistemática son:
Cebadores para la detección sistemática de GC
GC PCR cebador nº 1: 5'-TTT CTG GCT CCA GCC AAA GCC ACC CTA GGG GAG-3' (SEC DE ID Nº. 69)
GC PCR cebador nº 2: 5'-AAT GGA GTA GCC AGG TGA GAT TGT CTC CAG GAA-3' (SEC DE ID Nº. 70)
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Estos clones que demuestran una expresión y título muy altos se ensayaron a continuación para la transferencia de la expresión en células BHK-2 seguido por el análisis de transferencia Western y un ensayo funcional para la actividad de GC. Se usó un anticuerpo monoclonal específico (8E4) contra la GC humana para el análisis de transferencia Western para determinar la presencia de la proteína (Ohashi y col., PNAS 89: 11332, 1992; Barneveld y col. Eur. J. Biochem. 134:310, 1983. ). Se ensayó la actividad enzimática de GC tal como se describe por Correll y col. (Blood 80: 331, 1992). Se realizaron estudios animales un vez se hubo identificado el clon apropiado.
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Ejemplo 14 Administración de partículas de Sindbis recombinantes
Se puede administrar un vector Sindbis terapéutico usado para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher (Ejemplo 13) mediante las células CD34^{+} autólogas transductoras en un protocolo ex vivo o mediante inyección directa del vector en la médula ósea del paciente. Para conseguir la expresión terapéutica más larga de GC procedente del vector multivalente recombinante, el mejor modo de administración es transducir precursores celulares de vida larga del tipo celular clínicamente afectado, por ejemplo, monocitos o macrófagos.
Transduciendo los precursores más tempranos, los precursores celulares son capaces de autorenovarse y repoblar la sangre periférica con células GC positivas en maduración.
Las células troncales hematopoyéticas pluripotentes más tempranas estudiadas hasta el momento son las células CD34^{+} que constituyen hasta un 1%-4% de la población sana de la médula ósea o un 0,1% en la población de la sangre periférica. Ser capaz de transducir células CD34^{+} es importante para sostener la expresión a largo plazo no sólo para el linaje monocito/macrófago sino para cualquier célula hematopoyética dirigida por una proteína terapéutica. Dos soluciones par transducir células CD34^{+} incluyen un protocolo ex vivo y un in vivo. El protocolo in vivo se centra en transducir una población indiscriminada de células de médula ósea mediante inyección directa del vector en la médula ósea de los pacientes. El protocolo ex vivo se centra en el aislamiento de células troncales CD34^{+} positivas, procedentes de la médula ósea del paciente, o de la sangre del cordón umbilical de un paciente recién nacido, transduciendo las células con el vector, y a continuación, inyectando posteriormente las células autólogas en el paciente. Ambas soluciones son factibles, pero el protocolo ex vivo permite usar el vector más eficientemente transduciendo una población cultivada específica de células CD34^{+}. En la siguiente sección, se proporcionan los detalles de un procedimiento ex vivo.
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Administración ex vivo de un vector Sindbis GC multivalente
Se recogieron células CD34^{+} de la médula ósea de un paciente mediante evacuación de jeringa llevada a cabo por un médico familiarizado con la técnica. Alternativamente, se pueden obtener también células CD34^{+} de la sangre del codón umbilical de un recién nacido si el paciente se diagnostica antes del nacimiento. Generalmente, si la médula ósea es la fuente de células CD34^{+}, se obtuvieron 20 aspiraciones de la médula ósea mediante punción del eje femoral o de la cresta ilíaca posterior bajo anestesia local o general. A continuación se combinaron las aspiraciones de la médula ósea, se suspendieron en solución salina equilibrada de Hank tamponada con Herpes que contenía heparina a 100 unidades por ml y desoxirribonucleasa I a 100 \mug/ml y a continuación se sometió separación mediante gradiente de Ficoll. A continuación se recogieron las células de la capa leucocitaria de la médula ósea y se lavaron de acuerdo con el sistema de Separación CellPro's CEPRATE^{TM} LC (CellPro. Bothell, WA) (CD34). A continuación se tiñeron secuencialmente las células de la capa leucocitaria con anticuerpo monoclonal anti-CD34, a continuación se lavaron y se tiñeron con anticuerpo secundario biotinilado suministrado con el sistema CEPRATE^{TM}. A continuación se introdujo la mezcla celular en la columna de avidina de CEPRATE^{TM}. Las células marcadas con biotina se adsorbieron en la columna mientras que las células no marcadas pasaron a través de ella. A continuación se lavó la columna de acuerdo con las instrucciones del sistema CEPRATE^{TM} y se eluyeron las células CD34^{+} mediante agitación de la columna apretando manualmente el lecho de gel. Una vez que se purificaron las células CD34^{+}, se contaron las células troncales purificadas y se plaquearon a una concentración de 1 x 10^{5} células/mil en un medio de Dulbecco modificado por Iscove (JMDM; Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contenía suero AB humano no inactivado térmicamente combinado al 20% (suero hAB).
Tras la purificación, [?] se pueden llevar a cabo diversos procedimientos para transducir células troncales purificadas. Una solución implica la transducción inmediata de la población de células troncales modificadas con las células que producen el vector derivadas de los cultivos del sobrenadante que contienen el vector. Una segunda solución implica el cultivo simultáneo de una monocapa irradiada de células que producen el vector con la población purificada de células CD34^{+} no adherentes. Una tercera y preferida solución implica una solución de cultivo simultáneo similar, sin embargo, la células CD34^{+} se preestimulan con diversas citoquinas y se cultivan 48 horas antes del cultivo simultáneo con las células que producen el vector irradiado. Publicaciones recientes han demostrados que la preestimulación de las células troncales antes de la transducción de las células con vectores retrovíricos aumenta el nivel de transferencia génica en estos tipos celulares (Nolta y col., Exp. Hematol. 20:1065, 1992). El aumento del nivel de la transducción se atribuye a un aumento en la proliferación de células troncales necesarias para la eficiente transducción retrovírica. Debido a que los vectores Sindbis son capaces de infectar células no replicantes, puede no necesitarse la preestimulación de estas células, sin embargo, la preestimulación de estos cultivos que producen la proliferación proporcionará un aumento de las poblaciones celulares para la reinfusión en el paciente. Se llevó a cabo la preestimulación de las células CD34^{+} incubando la células con una combinación de citoquinas y factores de crecimiento que incluyen IL-1, IL-3, IL-6 y el factor de crecimiento celular de los mastocitos (MGF). Se llevó a cabo la preestimulación cultivando 1-2 x 10^{5} células CD34^{+}/de medio en matraces de cultivo de tejido T25 que contenían medio de estimulación de la médula ósea durante 48 horas. El medio de estimulación de la médula ósea está constituido por IMDM que contiene suero hAB no inactivado térmicamente al 30%, L-glutamina 2 mM, \beta 2-mercaptoetanol 0,1 mM, hidrocortisona 1 \muM, y albúmina de suero bovino desionizada al 1%. Todos los reactivos usados en los cultivos de médula ósea deberían detectarse sistemáticamente para su capacidad de soportar números máximos de granulocitos, eritrocitos, macrófagos, megacariocitos, unidades formadoras de colonias de la médula normal. Se deberían usar citoquinas humanas recombinantes purificadas y factores de crecimiento (Immunex Corp., Seattle. WA) para la preestimulación a las siguientes concentraciones: IL-1\alpha derivada de E. coli (100 U/ml), IL-3 derivada de levadura (5 ng/ml), IL-6 (50 U/ml), y MGF (50 ng/ml) (Anderson y col., Cell Growth Differ. 2: 373,1991).
Tras la preestimulación de las células CD34^{+}, se infectaron a continuación mediante cultivo simultáneo con la línea celular productora de Sindbis irradiada (que expresa el vector terapéutico GC) en presencia continua de medio de estimulación. En primer lugar, se tripsinizó la línea celular que producía el vector DA, se irradió (10.000 Rads) y se volvió a plaquear a 1-2 x 10^{5} células/ml de medio de estimulación de médula ósea. El siguiente día, se añadieron 1-2 x 10^{5} células CD34^{+} preestimuladas a la monocapa de la línea celular que producía el vector Sindbis. Se llevó a cabo el cultivo simultáneo de las células durante 48 horas. Tras el cultivo simultáneo, se recogieron las células CD34^{+} de la monocapa celular productora de vector Sindbis adherente mediante lavado vigoroso con medio y se plaquearon durante 2 horas para permitir la adherencia de cualquier célula que produzca el desalojo del vector. A continuación se recogieron las células y se expandieron durante 72 horas más. A continuación se recogieron las células y se congelaron en nitrógeno líquido usando un crioprotector en alícuotas de 1 x 10^{7} células por vial. Una vez se han ensayado las células CD34^{+} transformadas para la ausencia de agentes eventuales, se pueden descongelar las células CD34^{+} transformadas congeladas, plaquear hasta una concentración de 1 x 10^{5} células/ml y se cultivaron durante 48 horas más en medio de estimulación de médula ósea. A continuación se recogieron las células transformadas, se lavaron dos veces y se volvieron a suspender en solución salina normal.
El número de células transducidas usado para volver a infundir en el paciente por infusión se proyecto que fuera un mínimo de 1-10 x 10^{7} células por paciente por punto de la inyección requiriendo hasta de cuatro puntos de inyección. Se puede devolver la infusión directamente a la médula ósea del paciente o directamente en el torrente sanguíneo periférico. Los pacientes que reciben células de médula ósea transducidas autólogas pueden ser tanto parcial como completamente irradiados corporalmente, para disminuir las poblaciones de médula ósea existentes. Se puede evaluar el tratamiento en diversos puntos temporales después de la infusión para determinar la actividad de GC para alargar la expresión en los tipos celulares diferenciados. Si en algún momento durante el curso de los procedimientos de seguimiento, disminuyen o son no existentes, se pueden volver a inyectar en el paciente células autólogas transducidas.
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Ejemplo 15 Expresión específica de tejido mediante la activación de vectores Sindbis inactivados usando ARN celular específico de tejido Construcción de vectores Sindbis de expresión específica tumoral para el tratamiento de cáncer colorrectal A. Construcción de un vector Sindbis recombinante (SIN-CEA) dependiente de la expresión del marcador tumoral CEA
Para producir una partícula de vector Sindbis inactivada, en una línea celular de empaquetado de Sindbis, se debe impulsar el vector Sindbis mediante un promotor de la ADN polimerasa. La opción de usar la transcripción in vitro del ARN del vector, seguido por la transfijación del ARN en la línea celular que empaqueta Sindbis, no se recomienda debido a que la estructura terciaria generada por el transcripto de ARN inactivado puede evitar que los transcriptos genómicos completos limiten la replicación del vector y los títulos en la línea celular de empaquetado. Por esta razón, se usó un vector Sindbis de inicio que contenía el promotor MIEP de CMV (pCMV-SIN) o el promotor de la metalotioneína de Drosophila (pMET-CMV) dependiendo de la línea celular de empaquetado (es decir, insecto o mamífero).
Tal como se ha descrito anteriormente, se construyó el modelo de bucle externo de unión desactivado con la región de unión del vector flanquedas por secuencias de repetición invertidas que son homólogas al ARN de elección. En este ejemplo, se usaron las secuencias del ADNc del antígeno tumoral CEA (Beauchemin y col., Molec. and Cell. Biol. 7: 3221, 1987) en las repeticiones invertidas. Para construir un vector Sindbis responsable del ARN de CEA, la región de unión estaba precedida por dos regiones con secuencias de sentido contrario de CEA (A^{1} y B^{1}) separadas por una región bisagra de seis pares de bases. Una secuencia de sentido directo (CEA) de veinte pares de bases (A2), que es complementaria a A1, se coloca en el extremo 3' de la región de unión. En la elección correcta de las secuencias de sentido contrario A1 y B1, los únicos requerimientos son que sean específicas de la secuencia de ARN dirigida y que las secuencias de sentido contrario hibriden las dos regiones de la secuencia de ARN separadas por tres nucleótidos. Estas tres caperuzas de nucleótidos servirán como una región bisagra para que la polimerasa salte e interrumpa la lectura que une la región de la proteína no estructural del vector con la región de unión del vector (Figura 5). Para construir dicha configuración, se sintetizaron dos oligonucleótidos complementarios entre sí para crear un fragmento de inserto que contiene los emplazamientos de la enzima de restricción convenientes al final de los extremos 5' y 3'. A continuación se ligó el inserto del fragmento de oligonucleótido en el vector Sindbis entre la región de unión inactivada y los emplazamientos de clonación múltiples del vector Sindbis. La cadena de oligonucleótidos de sentido directo, entre 5' y 3', debería contener un emplazamiento de restricción ApaI, seguido por la región A1 de sentido contrario, una región bisagra de seis pb, una región B1 de sentido contrario, un dominio sintético de la región de unión, y la región A2 de sentido directo, seguida por un emplazamiento de la enzima de restricción XhoI. Se usó la siguiente secuencia de oligonucleótidos para diseñar un vector Sindbis responsable del ARN de CEA. El número de nucleótidos de la secuencia se obtuvo de Beauchemin y col., Molec. and Cell Biol. 7: 3221, 1987.
Cadena de sentido directo 5'-3' CEA
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La cadena de sentido contrario 5'-3' CEA es complementaria del oligonucleótido anterior. Después que se sintetizaran ambos nucleótidos, los oligonucleótidos se mezclaron conjuntamente en presencia de Mg 10 mM, se calentaron a 1000ºC durante 5 min y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente. A continuación se digirió la pareja de oligonucleótidos con las enzimas de restricción ApaI y XhoI, se mezclaron y ligaron a una relación molar de 25:1 de inserto a plásmido, pCMV-SIN o pMET-SIN predigerido con los mismos enzimas. Estos constructos se designaron pCMV/SIN-CEA y pMET/SIN-CEA, respectivamente.
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Construcción de un vector SIN-CEA y línea celular productora que expresa gamma interferón (SIN-CEA/gIFN)
Se derivó el ADNc de g-IFN humano de ARN aislado de células T de Jurkat estimuladas con PHA mediante extracción de tiocianato de guanidinio seguido por ultracentrifugación con un gradiente de CsCl. A continuación, se transcribió de manera inversa el ARN (Sigma, St. Louis, MO) in vitro y se usó una pareja de oligonucleótidos específica del gen para amplificar el ADNc de g-IFN mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando polimerasa Tac. Se reparo el ADN mediante la PCR con la ADN polimerasa T4 y Klenow y se clonó en el emplazamiento HincII del plásmido SK^{+} (Stratagene, San Diego, CA) tratado con CIAP. En la orientación de sentido directo, el extremo 5' del ADNc es adyacente al emplazamiento XhoI del poliligante SK^{+} y el extremo 3' adyacente al emplazamiento ClaI. Se colocó el fragmento de 512 pares de bases que codificaba la molécula \gamma-IFN humana en el emplazamiento XhoI/ClaI de cualquiera de los vectores pCMV/SIN-CEA o pMET/SIN-CEA. Estos nuevos plásmidos se designaron pCMV/SIN-CEA/\gammaIFN o pMET/SIN-CEA/\gammaIFN, respectivamente.
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B. Construcción de un vector SIN-CEA y la línea celular productora que expresa timidina quinasa (SIN-CEA/TK)
Se obtuvo un producto amplificado mediante la PCR que contenía el clon de ADNc de la timidina quinasa del herpes simple ("HSVTK"), flanqueado con los emplazamientos de las enzimas de restricción 5' XhoI y 3' ClaI usando el clon pHSITK3KB (Mcknight y col., Nuc. Acids Res. 8: 5949, 1980) como ADN diana. Las secuencias de los cebadores usados para la amplificación mediante la PCR se obtuvieron de secuencias publicadas (Wagner y col., PNAS 78:1442, 1981). A continuación se digirió el producto amplificado de 1.260 pares de bases con XhoI y ClaI ligado en el emplazamiento XhoI/ClaI de cualquiera de los vectores pCMV/SIN-CEA o pMET/SIN-CEA. Estos nuevos plásmidos se designaron pCMV/SIN-CEA/HSVTK o pMET/SIN-CEA/HSVTK, respectivamente.
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C. Creación de líneas celulares productoras de vector SIndbis dependientes de ARN de CEA
A diferencia de los ejemplos anteriores de creación de líneas productoras (Ejemplo 7) puede que sólo sea posible una única vuelta de transferencia génica en la línea celular de empaquetado mediante la transfección del vector. Debido a que estos vectores se inactivarán y evitarán la síntesis de vectores genómicos completos, la reinfección de una capa reciente de líneas celulares que empaquetan Sindbis terminará en una infección abortada debido a que estos vectores son ahora dependientes de la presencia de ARN de CEA para llegar a ser activos. Se pueden conseguir títulos mayores mediante clonación por dilución de líneas celulares productoras transfectadas usando la técnica de la RT-PCR descrita anteriormente en el Ejemplo 11.
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Ejemplo 16 Terapia de sustitución génica que usa vectores Sindbis recombinantes para la producción sistémica de proteínas. un tratamiento para la enfermedad de la hemofilia a deficiente en factor VIII
La enfermedad de la hemofilia A se caracteriza por la ausencia de factor VIII, un factor de coagulación en el plasma sanguíneo. Aproximadamente 1 de cada 20.000 varones tiene hemofilia A en la que el estado de enfermedad se presenta como un trastorno de sangrado, debido a la incapacidad de los individuos afectados de completar la cascada de coagulación de la sangre.
El tratamiento de los individuos con hemofilia A es la sustitución con la proteína del factor VIII. La única fuente de factor VIII humano es el plasma humano. Con el fin de procesar plasma humano para la purificación del factor VIII, se combinaron muestras de donantes humanos en lotes de aproximadamente 1000 donantes. Debido a la inestabilidad de la proteína del factor VIII, los productos farmacéuticos resultantes son muy impuros y con una pureza en peso estimada de aproximadamente 0,04%. Además, existe un riesgo serio de que dichas enfermedades infecciosas como el virus de la hepatitis B y el Virus de la Inmunodeficiencia Humana, entre otros, contaminen el suministro de sangre y de esta manera se puedan purificar simultáneamente con la proteína del factor VIII.
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Por las razones presentadas anteriormente, una fuente de producción recombinante de factor VII marcaría un progreso seminal hacia el tratamiento de la hemofilia A.
El tratamiento ideal de la hemofilia A sería la terapia de sustitución génica; esto es, la sustitución en los individuos afectados del gen del factor VIII normal, lo que permitiría asegurar la cascada de coagulación normal.
La divulgación presentada anteriormente es bien conocida por las personas expertas en la técnica del posible tratamiento del trastorno de la hemofilia A. Los retrovirus son un vector de terapia génica posible que se ha desarollado para la expresión del factor VIII. Sin embargo, por razones que se entienden mal el nivel de expresión de factor VIII recombinante con este y otros procedimientos es relativamente bajo.
Una posibilidad para la baja expresión del factor VIII recombinante en las células transducidas por el retrovirus y otros vectores es la baja eficiencia relativa de procesamiento y trasporte del ARN del factor VII maduro desde el núcleo hasta el citoplasma. Conocida por aquellos en el área, la delección en la región B del factor VIII aumenta el nivel al cual se produce y secreta este factor de coagulación. Para evitar los problemas asociados con los bajos niveles de producción de proteína del factor VIII, debidos a los bajos niveles de expresión del ARN y al procesamiento ineficiente, se describió la inserción de ADNc del factor VIII en vectores Sindbis; Debido a que el ciclo de vida de Sindbis se produce completamente en el citoplasma de las células infectadas, se solventan los problemas asociados con el factor VII expresados a partir del núcleo. Además, dada la eficiencia con la que Sindbis se autorreplica, en teoría, el nivel de producción de factor VII en células infectadas con Sindbis/factor VII podría ser tan alto como 1 x 10^{8} moléculas/célula de proteína del factor VIII.
Un problema potencial asociado con la inserción del factor VIII en vectores Sindbis es el tamaño físico resultante de la construcción del gen del vector/heterólogo, y la posible restricción del empaquetado del constructo de vector de factor VII en una partícula de Sindbis infecciosa funcional. El tamaño genómico de Sindbis de tipo natural es de 11.703 nucleótidos, más una cola poli A. El tamaño del constructo de vector Sindbis básico (pKSSINBV, véase el Ejemplo 2) es de 7.830 nucleótidos, incluyendo una cola poli A de 25-mer. De esta manera, el tamaño permisible del material genético heterólogo que se va a insertar en pKSSINBV que da como resultado en un complemento genómico el mismo tamaño físico que el del virus de tipo natural, es de 3.898 nucleótidos.
Sin embargo, una pieza clave de evidencia sugiere que la capacidad del material genético heterólogo que se puede insertar en pKSSINBV y empaquetarse en una partícula de Sindbis infecciosa funcional es considerablemente mayor de 3.898 pb. En un trabajo publicado en la bibliografía (Geigenmuller-Gnirke y col., PNAS 88: 3253-3257, 1991), se describe el empaquetado de dos moléculas, conteniendo cada una la señal de empaquetado cis requerida, en las partículas de Sindbis funcionales únicas. El tamaño físico total de los dos genomas empaquetados en este estudio es de 14.600 pb. Este resultado indica fuertemente que la capacidad de los vectores Sindbis para el material genético heterólogo es mucho mayor que el anteriormente previsto. El potencial de inserción de grandes genes celulares en los vectores Sindbis extiende sustancialmente la utilidad de este sistema.
El clon de ADNc del factor VIII tiene aproximadamente 8.000 pb. La inserción del ADNc del factor VII en pKSSINBV da como resultado un tamaño genómico de vector/heterólogo de aproximadamente 15.830 pb. Si el empaquetado de esta partícula es ineficiente, se puede disminuir el tamaño del inserto eliminando adicionalmente la "región" del inserto del factor VIII. Se ha demostrado que la región del dominio B del factor VIII se puede eliminar desde el ADNc sin afectar la funcionalidad de la proteína expresada posteriormente. La fuente de ADNc del factor VIII es el clon pSP64-VIII, un clon de la ATCC con el número de acceso 39812 que tiene un ADNc que codifica la proteína humana de longitud completa: Se digirió pSP64-VIII con SalI, se enromaron los extremos con ADN polimerasa T4 y 50 \muM de cada dNTP y el fragmento de circa 7700 pb se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1%/TBE y se purificó con Gene Clean^{TM}. A continuación se ligó el ADNc del factor VII que contenía los extremos enromados en pKSII3'SIN (Ejemplo 2), preparado mediante digestión con HincII, tratado con CIAP, y se purificó con Gene Clean^{TM}. Se conoce este plásmido como pF83'SIN.
Para la inserción del factor VIII en los diversos vectores Sindbis descritos en el Ejemplo 2, se digirió el plásmido pF83'SIN con XhoI y SacII, y se aisló el fragmento de 7.850 pb resultante en un gel de agarosa al 1%/TBE y se purificó mediante Gene Clean^{TM}. Este fragmento factor VII-3'SIN se insertó en cada uno de los vectores relacionados a continuación. Antes de la inserción de este fragmento se prepararon los plásmidos mediante digestión con XhoI y SacII, se trataron con CIAP, se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%/TBE, y se purificaron con Gene Clean^{TM}.
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Tras la inserción del ADNc del factor VIII, estos vectores se designaron
pKSSINBVF8
pKSSINdIJRsjrcF8
pKSSINdIJRsjrPCF8
pKSSINdIJRsjrNP(7,582-7,601)F8
pKSSINdIJRsexjrF8
respectivamente.
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El empaquetado del ADNc del factor VIII que contenía los vectores se llevó a cabo infectando células transfectadas tanto con vector/factor VIII: virus de tipo natural con ARN transcrito in vitro:, como alternativamente mediante transfección con ARN de vector/factor VIII transcrito in vitro de las líneas células de empaquetado descritas en el Ejemplo 7. Se determinó la eficiencia del empaquetado midiendo el nivel de expresión del factor VIII en las células infectadas y comparándolo con los niveles de expresión observados en los mismos experimentos llevados a cabo con el vector pKSSIN-luc descrito en el Ejemplo 3.
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Ejemplo 17 A. Creación de un vector Sindbis de glucocerebrosidasa
Se generó en primer lugar un clon de ADNc de glucocerebrosidasa (GC) que contenía un emplazamiento 5' de la enzima de restricción del ADNc que codifica la secuencia y un emplazamiento 3' de la enzima de restricción ClaI del ADNc que codifica la secuencia. Se puede generar el clon digiriendo pMFG-GC (PNAS 89: 11332; 1992) con NcoI, enromado con la ADN polimerasa Vent, a continuación se ligó con los ligantes XhoI. A continuación se digirió el plásmido con BamHI, enromado con la ADN polimerasa Vent, y a continuación se ligó con los ligantes ClaI. Para la inserción del factor VII en los diversos vectores Sindbis descritos en el Ejemplo 2, a continuación se digirió el fragmento con XhoI y ClaI y se aisló el gel en un gel de agarosa al 1%/TBE y se purificó mediante Gene Clean. El fragmento GC se insertó en cada uno de los vectores a continuación, preparados mediante digestión con XhoI y ClaI, tratamiento con CIAP, aislamiento mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%/TBE, y purificación con Gene Clean:
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Tras la inserción del ADNc del factor VII, estos vectores se conocen tal como se muestra a continuación:
pKSSINBV-GC
pKSSINdIFRsjrc-GC
pKSSINdIFRsjrPC-GC
pKSSINdIFRsjrNP(7582-7601)-GC
pKSSINdIFRsexjr-GC
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El vector Sindbis de glucocerebrosidasa (GC) se usará para expresar el ADNc de GC en estudios animales y se usará eventualmente para tratar seres humanos mediante inyección directa. Si se requieren múltiples inyecciones para sostener la expresión de GC en el individuo tratado sería ideal si el vector Sindbis se diseñara para que fuera mínimamente antigénico o se diseñara de tal manera que no indujera una respuesta inmune en el vector: Los ejemplos de vectores Sindbis que se diseñan de tal manera y son capaces de expresar múltiples proteínas se describen en los Ejemplos 3 (Región E3 Temprana de Adenovirus), Ejemplo 4 (HCMV H301); Ejemplo 5 (Expresión de genes múltiples) y Ejemplo 17 (Expresión de la ribozima de interferón A). Usando los anteriores ejemplos, se puede diseñar un vector Sindbis para expresar el ADNc de GC en dicha configuración en la que la ribozima de horquilla del interferón A se sigue por el gen E3 de AD o H301 de CMV, seguido por un emplazamiento de entrada de la ribozima interna seguido por el ADNc de GC u otro paliativo terapéutico, usando los mismos emplazamientos de clonación XhoI y ClaI en el emplazamiento de clonación múltiple del vector.
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B. Construcción de una línea celular productora de vector Sindbis de glucocerebrosidasa
Se presentaron dos soluciones para crear la línea celular productora dependiendo del tipo de clon de vector de ADNc de Sindbis, descrito en el Ejemplo 7. Un tipo de vector Sindbis usa la secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa SP6 para la síntesis de los transcriptos in vitro. Este tipo de vector se usa para crear una línea celular productora de vector basándose en el vector no integrante que se replicaría persistentemente en la línea celular de empaquetado. El segundo tipo de vector usa un promotor heterólogo en lugar de la secuencia Sp6 en un constructo de plásmido lo que podría permitir la integración estable en la línea celular de empaquetado (véase el Ejemplo 7 para revisión). A continuación se expresó la replicación de los transcriptos de vector Sindbis competentes a partir del nivel del ADN y se transfectarían en la línea celular que empaqueta Sindbis.
Si el vector vírico GC de Sindbis usa una secuencia de reconocimiento del ARN T7, el ADNc debe transcribirse in vitro en primer lugar usando cualquiera de los sistemas de transcripción in vitro comercialmente disponibles (Megascript transcription kit; Ambion Inc., Austin, Texas) seguido por la transfección del transcripto de ARN de longitud completa mediante liposomas o precipitación con fosfato de calcio en la línea celular que empaqueta Sindbis. Tal como se describe anteriormente (Ejemplo 7), se filtraron los sobrenadantes que contenían las partículas de vector infecciosas procedentes de la línea celular de empaquetado transfectada y se usaron a continuación para volver a infectar una monocapa reciente de células que empaquetan Sindbis que sirve a continuación como fuente del vector vírico. Deberían usarse aproximadamente 10 ml de sobrenadante infeccioso para infectar 5 x 10^{6} células en placas de 10 cm.
Si el vector vírico GC de Sindbis usa un promotor heterólogo en una configuración de plásmido de expresión con un marcador seleccionable (gen de resistencia a la neomicina), entonces, el vector de ADNc debe transfectarse en la línea celular de empaquetado seguido por la selección de resistencia al fármaco, A continuación se combinaron las colonias resistentes y se clonaron por dilución. A continuación de propagaron los clones individuales y se congelaron. A continuación se detectaron sistemáticamente los clones individuales para título alto tal como se describe en el Ejemplo 9, para la expresión de la glucocerebrosidasa mediante análisis de transferencia Western, y a continuación se ensayaron para la actividad funcional de la proteína (Correll y col.; Blood 80:331, 1992).
Para aquellos vectores que no tienen un marcador seleccionable, se debe llevar a cabo la selección de los clones transfectados de manera estable o persistente mediante clonación por dilución de la línea celular de empaquetado uno o dos día después de transfectar las células con el vector Sindbis. A continuación se detectaron sistemáticamente los clones por dilución para la presencia de glucocerebrosidasa usando la transcripción inversa del ARN mensajero seguido por la amplificación del mensaje del ADNc mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa. Este procedimiento se conoce como la técnica RT-PCR y está disponible un kit comercial para llevar a cabo este ensayo de Invitrogen Corp. (San Diego, CA). Se llevó a cabo la RT-PCR sobre clones que se habían propagado durante al menos 10 días. Se detectaron sistemáticamente aproximadamente 50 a 100 clones con el fin de encontrar un número razonable de clones infectados de manera estable, persistente. Con el fin de llevar a cabo la RT-PCR, se requieren cebadores específicos para el mensaje deseado que se van a detectar sistemáticamente mediante la amplificación del producto del ARN. Los cebadores designados para amplificar un producto de 521 pares de bases para la detección sistemática de la glucocerebrosidasa son:
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Aquellos clones que demostraron la expresión y título más altos se ensayaron a continuación para la transferencia de expresión infectando células BHK-2 seguida por análisis de transferencia Western y un ensayo funcional para la actividad de la glucocerebrosidasa (GC) en las células BHK-2. Se usó un anticuerpo monoclonal (8E4) contra GC humana para las transferencias Western (PNAS 89:11332, 1992) y se describe en Barneveld, R.A. y col (Eur. J. Biochem. 134: 310, 1983). Una vez se ha identificado el clon apropiado, se usaron los sobrenadantes procedentes de los cultivos de crecimiento para obtener el vector, se filtraron a través de un filtro de 45 \muC para comenzar los estudios animales mediante la inyección directa en animales. Después que se llevaron a cabo los estudios animales, se pueden usar protocolos de inyección directa escalados derivados de los estudios animales, para el tratamiento de pacientes humanos con Enfermedad de Gaucher. Se proporcionan protocolos de administración para este vector en el siguiente ejemplo.
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Ejemplo 18 Inhibición de la patogenicidad del virus del papiloma humano mediante moléculas de sentido contrario o de ribozima específicas de la secuencia expresadas a partir de vectores de virus Sindbis
Hasta la fecha se han aislado y caracterizado más de sesenta tipos del virus del papiloma humano (VPH), que tiene un pronunciado tropismo por las células de origen epitelial. Entre el grupo de VPH se encuentran un número sustancial de virus de los tipos que infectan el tracto anogenital humano. Este grupo de VPH se pueden subdividir adicionalmente en tipos que están asociados con la proliferación benigna o maligna en el tracto anogenital.
Se producen cada año en los Estados Unidos entre 13.000 y 20.000 fallecimientos por cáncer. En los países en desarrollo, el cáncer cervical es la neoplasia maligna más frecuente, y en los países desarrollados el cáncer cervical se coloca detrás de los cánceres de mama, pulmón, útero y ovario. Una estadística que apoya especialmente la noción de que la proliferación anogenital es un problema sanitario creciente es que las consultas médicas por problemas genitales se incrementaron de 169.000 en 1966 a más de 2 millones en 1988.
Existen varias líneas de evidencia que relacionan el VPH con la patogénesis de enfermedades proliferativas cervicales. Un subconjunto de tipos, denominado específicamente "VPH de bajo riesgo", se han asociado con dolencias proliferativas benignas del cérvix (por ejemplo, VPH 6, 11, 43, 44), mientras que otro subconjunto de tipos los "VPH de alto riesgo" se asocian con lesiones que pueden progresar hacia el estado maligno (por ejemplo, VPH 16, 18, 31, 33, 35, etc.). Aproximadamente un 95% de los tumores cervical cervicales contienen VPH, encontrándose el tipo de ADN del VPH tipo 16 ó 18 DNA en aproximadamente el 70% de estos.
La frecuencia de VPH entre la población de jóvenes sexualmente activas parece ser bastante elevado. De esta manera, en un reciente estudio entre 454 universitarias, 213, o 46% eran VPH positivas. Entre el grupo VPH positivo, un 3% era VPH 6/11 positivo, y un 14% era VPH 16/18 positivo. De estas 454 mujeres, 33 (7,3%) tenían una proliferación cervical anormal, según se determinó mediante citología.
Con respecto al diseño de agentes terapéuticos de sentido contrario y ribozimas dirigidos al VPH, se deben considerar parámetros importantes relacionados con los tipos de VPH a los que dirigirse (es decir, tipos asociados con condiloma acuminatum o tipos asociados con la proliferación cervical maligna) y los genes expresados por VPH a los que dirigirse, incluyendo pero sin limitarse a, genes de E2, E6, o E7. En general, la expresión de los genes de VPH está definida temporalmente en dos fases, genes expresados tempranamente (E) antes de la replicación del ADN vírico, y genes expresados tardíamente (L) tras la replicación del ADN vírico. Existen 7 genes enzimáticos tempranos de VPH y 2 genes estructurales tardíos de VPH.
Basándose en la discusión presentada más arriba, se pueden construir moléculas terapéuticas de sentido contrario/ribozima enviadas contra los grupos de VPH 6/11 que se dirigen al gen vírico E2. Parece posible que la diana génica E2 pueda resultar precaria con respecto al grupo de VPH 16/18 debido a un mecanismo de integración impulsada del virus con respecto a la inhibición de la expresión de la proteína E2. De esta manera, parece que los genes E6/E7 de los tipos de VPH 16/18 deberían ser dianas directas. Se describe a continuación la construcción de una molécula terapéutica de sentido contrario y ribozima en vectores de virus Sindbis (descritos en el Ejemplo 2) específicos para el ARN de E6 y E7 en VPH tipo 16. La inserción de los restos de sentido contrario y ribozima de VPH entre los emplazamientos ClaI y XbaI del vector Sindbis.
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A. Construcción de una molécula terapéutica de sentido contrario para E6/E7 de un VPH 16
El clon genómico vírico de VPH 16, pHPV-16 [0540] (número ATCC 45113) se usó como plantilla en una reacción de la PCR para la amplificación de secuencias específicas procedentes de los genes víricos E6/E7. El resto de sentido contrario de VPH 16 se inserta en primer lugar en el vector plásmido pKSII^{+}; la eliminación de la molécula terapéutica de sentido contrario del vector plásmido y la inserción en los diferentes esqueletos del vector Sindbis se lleva a cabo mediante en único resto terminal de sentido contrario ClaI y los emplazamientos de la endonucleasa de restricción XbaI. La amplificación de una parte de los genes E6/E7 de VPH 16 se lleva a cabo con el par de cebadores mostrado a continuación:
Cebador directo (secuencia tampón/emplazamiento XbaI/VPH 16 nucleótidos 201-222):
TATATTCTAGAGCAAGCAACAGTTACTGCGACG (SEC DE ID Nº. 76) 
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Cebador inverso (secuencia tampón/emplazamiento ClaI/nucleótidos 759-738 de VPH 16):
TATATATCGATCCGAAGCGTAGAGTCACACTTG (SEC DE ID Nº. 77) 
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El producto amplicón de 580 bp de E6/E7 de VPH 16 se purificó en primer lugar mediante Gene Clean (Bio 101, San Diego, CA), digerido con las enzimas de restricción ClaI y XbaI, y sometido a electroforesis en gel de agarosa al 1%/TBE. La banda de 568 bp se escindió del gel, el ADN se purificó mediante Gene Clean, y se ligó en el plásmido pKSII^{+} preparado a partir de la digestión con ClaI y XbaI, tratamiento con CIAP, y tratamiento con Gene Clean. Este plásmido se conoce como pKSaHPV16E6/E7.
Además de las secuencias complementarias de E6/E7 de VPH 16, ambos cebadores contienen "secuencias tampón" de cinco nucleótidos en sus extremos 5' para una digestión enzimática eficaz de los productos amplicón de la PCR. La generación del amplicón de VPH 16 con los cebadores anteriormente mostrados se lleva a cabo con el protocolo de la PCR descrito en el Ejemplo 4. Se ha demostrado anteriormente que el ARNm de E6/E7 en epitelios cervicales infectados está presente de tres formas, no cortado y empalmado y dos alternativas cortadas y empalmadas (E6* y E6**), una con los nucleótidos 226-525 de E6 que no está presente en el mensaje maduro (Smotkin y col, J. Virol 63:1441-1447, 1989). La región de complementariedad entre el resto de sentido contrario descrito aquí u el genoma de VPH 16 son los nucleótidos víricos 201-759. Así, el resto de sentido contrario será capaz de unirse e inhibir la traducción del mensaje no cortado y empalmado de E6/E7 y los mensajes cortados y empalmados de E6* y E6**.
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B. Construcción de una ribozima de horquilla de sentido contrario terapéutica para E6/E7 de un VPH
Con el fin de inhibir eficazmente la expresión de las proteínas E6 y E7 de VPH 16 se construyó una ribozima de horquilla (HRBZ) con diana específica en el ARNm de E6. El resto ribozima de VPH 16 se inserta en primer lugar en el vector plásmido pKSII^{+}; la retirada de la molécula terapéutica de ribozima del vector plásmido y la inserción en los diferentes esqueletos del vector Sindbis se lleva a cabo vector La inserción de los restos de sentido contrario y ribozima de VPH entre los emplazamientos ClaI y XbaI.
HRBZ es homóloga del ARN E6 de VPH 16 (nt. 414-431) mostrado a continuación:
TT AACTGTCAAAAGCCAC (SEC DE ID Nº. 78) 
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HRBZ está diseñada para escindirse tras el resto T de TCTC en el bucle 5 del sustrato motivo de la ribozima de horquilla, mostrado subrayado más adelante. Tras la escisión, la HRBZ se recicla y es capaz de hibridarse con, y escindirse de, otra molécula de ARNm no cortada y empalmada de E6/E7 o la molécula de ARNm de E6* cortada y empalmada.
La HRBZ de doble cadena, como se ha definido anteriormente (Hampel y col, Nucleic Acids Research 18:299-304, 1990), que contiene el "tetrabucle" 3 de 4 bases y una hélice extendida 4, con especificidad para el ARN de E6 de VPH 16 RNA anteriormente mostrado, se sintetiza químicamente e incluye ambos extremos 5' y 3', respectivamente, los emplazamientos ClaI y XbaI. La secuencia de las cadenas de la HRBZ de E6 de VPH 16 químicamente sintetizada se muestran a continuación:
108 
\newpage
Con el fin de formar la HRBZ de doble cadena específica de E6 de VPH 16 con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se mezclaron cantidades iguales de oligonucleótidos en Mg^{2+} 10 mM, se calentó hasta 95ºC durante 5 min, a continuó se enfrió lentamente hasta temperatura ambiente para permitir la fusión de las cadenas.
La HRBZ de doble cadena específica de E6 de VPH 16 con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se ligó en el plásmido pKSII^{+} preparado a partir de la digestión con ClaI y XbaI, tratamiento con CIAP, y tratamiento con Gene Clean. Este plásmido se conoce como pKSHPV16E6HRBZ.
Los restos ribozima de horquilla y de sentido contrario de VPH 16 se liberaron de sus vectores plásmidos, pKSaHPV16E6/E7 y pKSHPV16E6HRBZ, respectivamente, por digestión con ClaI y XbaI, purificación mediante electroforesis en gel de agarosa y Gene Clean, e inserción en el esqueleto del vector deseado, preparado por digestión con ClaI y XbaI, y tratamiento con CIAP. Algunos posibles vectores Sindbis, alguno de los cuales se muestra a continuación, y cuya construcción detallada se describe en el Ejemplo 2, son adecuados para la inserción de los restos terapéuticos de sentido contrario y ribozima de VPH 16:
32
Puesto que los agentes terapéuticos de sentido contrario y ribozimas operan en el ARN, no es necesario que los vectores que contienen estos restos contengan una región de unión funcional. Esto es, la traducción de la región correspondiente a las proteínas estructurales de Sindbis se produce únicamente a partir del ARN subgenómico. Sin embargo, debido a que la traducción de los agentes terapéuticos sentido contrario y ribozima de horquilla no es un problema, estos restos ejercerán su efecto desde el nivel de ARN de cadena positiva del vector genómico de Sindbis.
Por otra parte, puede desearse administrar dosis repetidas a un individuo; así, el paliativo de horquilla se insertaría en la dirección 3' de los genes E3 de adenovirus o H301 de citomegalovirus humano, que infrarregulan la expresión de las moléculas MHC de clase I en células infectadas. La inserción de los paliativos de sentido contrario y horquilla se lleva a cabo en los vectores de los Ejemplos 3 y 4 mostrados a continuación, entre los emplazamientos ClaI y XbaI:
33
Se sintetizó ARNm subgenómico a partir de estos vectores, que sirven como plantilla de traducciones para los genes E3 de Ad y H301 de CMV. De esta manera, en estas construcciones los paliativos de sentido contrario y ribozimas de horquilla de VPH 16 estarán presenten en los niveles tanto subgenómico como genómico de cadena positiva del ARN del vector Sindbis vector.
Además, los paliativos de sentido contrario y ribozima de horquilla de VPH 16 se pueden insertar en la dirección 3' de un gen heterólogo insertado en los vectores Sindbis descritos. Por ejemplo, se puede insertar los paliativos de sentido contrario y ribozima de horquilla de VPH 16 en la dirección 3' de un gen heterólogo que codifica un epitopo inmunogénico de VPH 16 procedente de, por ejemplo, las proteínas E6/E7 o L1. En estos vectores, no sería deseable incluir los genes inmunorreguladores E3 de Ad y H301 de CMV.
La expresión de los genes E6/E7 durante la infección con los grupos de VPH de riesgo tanto alto como bajo es necesaria para la proliferación en el epitelio cervical. La proteína E7 de VPH procedente de todos los tipos de VPH ensayados forma un complejo con la proteína del retinoblastoma, y la proteína E6 del VPH tipos 16 y 18 se asocia con y degrada la proteína celular p53. Los genes celulares de p53 y retinoblastoma están implicados en el control del crecimiento de las células, y la alteración de la expresión o el funcionamiento de estas proteínas puede liberar el control del crecimiento de las células afectadas. Así, un agente terapéutico de sentido contrario o ribozima para ambos grupos de VPH debería directa o indirectamente disminuir la expresión de uno o ambos de estos genes. La expresión de los genes E6/E7 está trans-activada por la proteína vírica E2. Sin embargo, utilizando una estrategia alternativa de corte y empalme, la proteína E2 puede actuar también como transrepresor. La integración de los tipos oncogénicos de VPH se produce en la región vírica E2 e impide la expresión de la proteína E2. La integración de los tipos oncogénicos de VPH parece ser un episodio clave en la inducción completa y/o mantenimiento del carcinoma cervical. Este episodio da como resultado la expresión constitutiva de los genes E6/E7. En el estado integrado, la expresión de los genes E6/E7 está trans-activada por factores presentes en los queratinocitos infectados. La inactivación del mecanismo de control de E2 vírico en respuesta al factor de activación celular de queratinocitos de la expresión de E6/E7 debería ser un episodio crítico en la integración vírica.
Se describe a continuación la construcción de los agentes terapéuticos de sentido contrario y ribozimas, dentro de vectores de virus Sindbis (descritos en el Ejemplo 2) específico para ARN de E6 y E7 de VPH de 16. La inserción de los restos de sentido contrario y ribozima de VPH se produce entre los emplazamientos ClaI y XbaI del vector Sindbis.
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C. Construcción de un agente terapéutico de sentido contrario de E6/E7 de VPH 16
El clon genómico vírico de VPH 16, pHPV-16 (número ATCC 45113) se usó como plantilla en una reacción de la PCR para la ampliación de secuencias específicas procedentes de los genes víricos E6/E7. El resto de sentido contrario de VPH 16 se insertó en primer lugar en el vector plásmido pKSII^{+}; la eliminación del agente terapéutico de sentido contrario del vector plásmido y la inserción en los diferentes esqueletos del vector Sindbis se lleva a cabo mediante el único resto de sentido contrario terminal ClaI y los emplazamientos de la endonucleasa de restricción XbaI. La amplificación de una parte de los genes de E6/E7 VPH 16 se lleva a cabo con el par de cebadores siguiente:
VPH 16 Cebador directo (secuencia tampón/emplazamiento XbaI/nucleótidos 201-222 de VPH 16):
5'-TAT ATT CTA GAG CAA GCA ACA GTT ACT GCG ACG-3' (SEC DE ID Nº. 81) 
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VPH 16 Cebador inverso (secuencia tampón/emplazamiento ClaI/nucleótidos 759-738 de VPH 16):
5'-TAT ATA TCG ATC CGA AGC GTA GAG TCA CAC TTG-3' (SEC DE ID Nº. 82) 
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El producto amplicón de 580 bp de E6/E7 de VPH 16 se purificó en primer lugar con Gene Clean (Bio 101, San Diego CA), se digirió con las enzimas de restricción ClaI y XbaI, y se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%/FBE. La banda de 568 bp se escindió del gel, se purificó con Gene Clean^{TM}, y se ligó en el plásmido pKSII^{+} preparado mediante digestión con ClaI y XbaI, se trató con CIAP, y se purificó mediante Clean^{TM}. Este plásmido se designa como pKS\alphaHPV16E6/E7.
Además de las secuencias complementarias de E6/E7 de VPH 16, ambos cebadores contienen "secuencias tampón" de cinco nucleótidos en sus extremos 5' para una digestión enzimática eficaz de los amplicones producto de la PCR. La generación del amplicón de VPH 16 con los cebadores anteriores se lleva a cabo usando el protocolo de la PCR descrito en el Ejemplo 4. Se sabe que el ARNm de E6/E7 del epitelio cervical infectado está presente entre formas, no cortado y empalmado y dos alternativas (E6* y E6**), en las que los nucleótidos 226-525 de E6 no están presentes en el mensaje maduro (Smotkin y col, J. Virol 63:1441, 1989). La región de complementariedad entre el de sentido contrario y el genoma de VPH 16 son los nucleótidos víricos 201-759. Así, el resto de sentido contrario será capaz de unirse e inhibir la traducción del mensaje de E6/E7 no cortado y empalmado y los mensajes cortados y empalmados de E6* y E6**.
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D. Construcción de un ribozima de horquilla E6/E7 de VPH 16 terapéutico
Con el fin de inhibir de manera eficaz la expresión de las proteínas E6 y E7 de VPH 16, se construyó un ribozima de horquilla (HRBZ) con diana específica en el ARNm de E6. El resto ribozima de VPH 16 se insertó en primer lugar en el vector plásmido pKSII^{+}; la eliminación de la ribozima terapéutica del vector plásmido e inserción en los diferentes esqueletos del vector Sindbis se lleva a cabo mediante el único el resto ribozima terminal ClaI y los emplazamientos de la endonucleasa de restricción XbaI.
HRBZ es homóloga de la secuencia de nucleótidos 16 414-431 de ARN de E6 de VPH mostrada a continuación:
5'-TTA ACT GTC AAA AGC CAC-3' (SEC DE ID Nº. 83) 
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HRBZ está diseñada para escindirse tras el resto T de TCTC en el bucle 5 del sustrato motivo de la ribozima de horquilla, mostrado subrayado anteriormente. Tras la escisión, la HRBZ se recicla y es capaz de hibridarse con, y escindirse de, otra molécula de ARNm no cortada y empalmada de E6/E7 o la molécula de ARNm de E6* cortada y empalmada.
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La HRBZ de doble cadena (Hampel y col, Nucleic Acids Research 18:299-304, 1990), que contiene el "tetrabucle" 3 de 4 bases y una hélice extendida 4, con especificidad para el ARN de E6 de VPH 16 anteriormente mostrado, se sintetiza químicamente e incluye los emplazamientos ClaI y XbaI en ambos extremos 5' y 3', respectivamente. La secuencia de las cadenas de la HRBZ de E6 de VPH 16 químicamente sintetizada se muestra a continuación:
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Con el fin de formar la HRBZ de doble cadena específica de E6 de VPH 16 con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se mezclaron cantidades iguales de oligonucleótidos en MHCl_{2}10 mM, se calentó hasta 95ºC durante 5 min, a continuó se enfrió lentamente hasta temperatura ambiente para permitir la fusión de las cadenas.
La HRBZ de doble cadena con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se ligó en el vector plásmido pKSII^{+} El vector preparado pKSII^{+} se digirió en primer lugar con ClaI y XbaI, se trató con CIAP, y se purificó con Gene Clean antes de la ligadura. Este plásmido se denominó pKSHPV16E6HRBZ.
Los restos ribozima de horquilla y de sentido contrario de VPH 16 se liberaron de sus vectores plásmidos, pKSaHPV16E6/E7 y pKSHPV16E6HRBZ,, respectivamente, por digestión con ClaI y XbaI, aislamiento mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando Gene Clean^{TM}. Se ligaron en el esqueleto del vector deseado. El esqueleto del vector se preparó por digestión con ClaI y XbaI, y se trató con CIAP. Algunos posibles vectores Sindbis son adecuados para la inserción de los restos terapéuticos de sentido contrario y ribozima de VPH 16. Alguno de los vectores del Ejemplo 2 se presenta a continuación:
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Puesto que los terapéuticos de sentido contrario y ribozima operan en el ARN, no es necesario que los vectores que contienen estos restos contengan también una región de unión funcional. Específicamente, la traducción de la región correspondiente a las proteínas estructurales de Sindbis se produce únicamente a partir del ARN subgenómico. Sin embargo, debido a que la traducción de los agentes terapéuticos de sentido contrario y ribozima de horquilla no es un problema, estos restos ejercerán su efecto desde el nivel de ARN de cadena positiva del vector genómico de Sindbis.
Por otra parte, puede desearse administrar dosis repetidas a un individuo; así, el paliativo de horquilla se insertaría en la dirección 3' de los genes E3 de adenovirus o H301 de citomegalovirus humano, que infrarregulan la expresión de las moléculas MHC de clase I en células infectadas. La inserción de los paliativos de sentido contrario y horquilla se lleva a cabo en los vectores de los Ejemplos 3 y 4 mostrados a continuación, entre los emplazamientos ClaI y XbaI:
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Se sintetizó ARNm subgefnómico en estos vectores, que sirven como plantilla de traducciones para los genes E3 de Ad y H301 de CMV. De esta manera, en estas construcciones los paliativos de sentido contrario y ribozima de horquilla de VPH 16 estarán presenten en los niveles tanto subgenómico como genómico de cadena positiva del ARN del vector Sindbis vector.
Además, los paliativos de sentido contrario y ribozima de horquilla de VPH 16 se pueden insertar en la dirección 3' de un gen heterólogo insertado en los vectores Sindbis descritos. Por ejemplo, se puede insertar los paliativos de sentido contrario y ribozima de horquilla de VPH 16 en la dirección 3' de un gen heterólogo que codifica un epitopo inmunogénico de VPH 16 procedente de, por ejemplo, las proteínas E6/E7 o L1. En estos vectores, no sería deseable incluir los genes inmunorreguladores E3 de Ad y H301 de CMV.
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Ejemplo 19 Inhibición de la expresión de interferón A humano en células infectadas mediante moléculas ribozima específicas de la secuencia expresadas a partir de vectores de virus Sindbis
Los interferones (IFN) comprenden una familia de pequeñas proteínas que realizan un amplio intervalo de actividades biológicas en las células de mamífero, incluyendo la expresión de antígenos de MHC, la expresión de varios genes que modulan el control del crecimiento celular y la resistencia a las infecciones víricas (Pestka y col, Ann. Rev. Biochem. 56:727-777, 1987). De las tres clases de IFN, a, b, y g, IFN-a, o interferón leucocítico, es responsable de la actividad que limita la replicación vírica en la célula infectada.
Los efectos antivirales del IFN-a se han asociado con la inducción de dos enzimas celulares que inhiben el ciclo de vida vírico en la célula infectada. Una enzima es una proteína quinasa de 68 kDa dependiente de un ARN de doble cadena que cataliza la fosforilación de la subunidad a del factor de iniciación de la síntesis de proteínas eIF-2. El Segundo enzima inducido por el IFNa es la 2',5'-oligoadenilato sintetasa (2',5'-OAS), que en presencia del ARN de doble cadena activa la endonucleasa latente, RNasa L, que es responsable de la degradación de los ARN víricos y celulares (Johnston y Torrence, Interferons 3:189-298, Friedman (ed.), Elsevier Science Publishers, B.V., Ámsterdam, 1984).
Debido a que su estrategia de replicación incluye un intermedio de ARN de doble cadena, los virus de ARN en particular son fuertemente inductores de interferón. Con respecto al virus Sindbis, las moléculas de ARN de doble cadena están presentes durante la replicación de las moléculas de longitud genómica de cadenas tanto positiva como negativa y durante la transcripción del ARNm subgenómico. Se ha demostrado que la infección de células por el virus Sindbis da como resultado la inducción de interferón (Saito, J. Interferon Res. 9:23-24, 1989).
En aplicaciones en las que se desea una expresión extendida del paliativo terapéutico, se inhibe la expresión de IFN en la célula infectada mediante la inclusión de un ribozima de horquilla con especificidad para el ARNm de IFN-a h en el vector Sindbis vector. La inhibición de la expresión IFN-a mitiga de esta manera la inducción de la cascada de proteínas celulares, incluyendo la proteína quinasa de IF-2 y 2'.5'-OAS, que inhiben la extensión en la que el virus se puede replicar en la célula infectada. Se desea una expresión prolongada del paliativo sin inducción de una respuesta inmune dirigida hacia la célula infectada por el vector para todas las aplicaciones distintas de la presentación de antígeno e incluye, por ejemplo, producción sistémica de proteínas, de sentido contrario y ribozima, y moléculas ocasionales.
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A. Construcción de una ribozima de horquilla con especificidad dirigida al ARNM de interferón A
Con el fin de inhibir eficazmente la expresión de la proteína interferón A en células infectadas con vectores Sindbis, se construyó un ribozima de horquilla (HRBZ) con especificidad dirigida al ARNm de interferón A. El resto ribozima de IFN-a se inserta en primer lugar en el vector plásmido pKSII^{+} (Stratagene, La Jolla, CA); la eliminación de la ribozima terapéutica del vector plásmido e inserción en los diferentes esqueletos del vector Sindbis se lleva a cabo mediante el único el resto ribozima terminal ClaI y los emplazamientos de la endonucleasa de restricción XbaI.
HRBZ es homóloga de la secuencia de nucleótidos 1026-1041 del gen alfa del interferón humano IFN-alfa 4b mostrado a continuación, de todos los genes de IFN-a secuenciados, incluyendo 5, 6, 7, 8, y 14, pero no el gen 16 (Henco y col. J. Mol. Biol. 185:227-260, 1985):
TCT CTG TCC TCC ATG A (SEC DE ID Nº. 86) 
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HRBZ está diseñada para escindirse tras el resto T de TCTC en el bucle 5 del sustrato motivo de la ribozima de horquilla, mostrado subrayado anteriormente. Tras la escisión, la HRBZ se recicla y es capaz de hibridarse con, y escindirse de, otra molécula de ARNm.
La HRBZ de doble cadena como se ha definido anteriormente (Hampel y col, Nucleic Acids Research 18:299-304, 1990), contiene un tetrabucle 3 de 4 bases, y una hélice extendida 4, con especificidad para el ARNm de IFN-a anteriormente mostrado, se sintetiza químicamente e incluye en los extremos 5' y 3', respectivamente, los emplazamientos ClaI y XbaI. La secuencia de las cadenas de la HRBZ de IFN-a se muestran a continuación:
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Con el fin de formar la HRBZ de doble cadena específica de IFN-a con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se mezclaron cantidades iguales de oligonucleótidos en Mg^{2+} 10 mM, se calentó hasta 95ºC durante 5 min, a continuó se enfrió lentamente hasta temperatura ambiente para permitir la fusión de las cadenas.
La HRBZ-IFN-a de doble cadena con extremos cohesivos ClaI y XbaI, se ligó en primer lugar en el vector plásmido pKSII+, preparado por digestión con ClaI y XbaI, tratamiento con CIAP, y tratamiento con Gene Clean. Este plásmido se conoce como pKSIFNaHRBZ.
El resto ribozima de horquilla de IFN-a se liberó del plásmido pKSIFNaHRBZ por digestión con purificación mediante electroforesis en NuSieve al 2%/agarosa al 1% y Gene Clean, e inserción en el esqueleto del vector deseado, preparado por digestión con ClaI y XbaI, y tratamiento con CIAP. Algunos posibles vectores Sindbis alguno de los cuales se muestra a continuación, y cuya construcción detallada se describe en los Ejemplos 2, 3, y 4 son adecuados para la inserción en el resto ribozima de horquilla de IFN-a:
36
Puesto que la actividad de la ribozima opera en el ARN, no es necesario que esta región se exprese en forma de ARNm de una porción subgenómica. Sin embargo, cuando se ubica en la dirección 3' de una región funcional de unión, el nivel de ribozima sintetizada es mucho mayor y quizás más eficaz para escindir la diana ARN de IFN-a.
Además, en algunas aplicaciones, por ejemplo la expresión sistémica de proteínas, se necesita una administración de dosis múltiple a un individuo. En estas aplicaciones se desea una expresión prolongada del paliativo sin inducción de una respuesta inmune dirigida hacia la célula infectada por el vector. En esta configuración, el resto IFN-aHRBZ podría insertarse en dirección 5' de los genes E3 de adenovirus o de H301 de citomegalovirus humano que infrarregulan la expresión de las moléculas MHC de clase I en células infectadas. Siguiendo al gen que modula la expresión de las moléculas MHC de clase I, consecutivamente, se encuentra un elemento IRES seleccionado entre el grupo descrito en el Ejemplo 5, y el terapéutico paliativo. La inserción ordenada de los componentes ribozima de horquilla, Ad E3 o CMV H301, IRES, y gen heterólogo de interés a lo largo de la secuencia de clonación múltiple localizada en el vector entre la región de unión del vector y el extremo 3' se lleva a cabo por modificación con los emplazamientos de reconocimiento adecuados de la enzima de restricción en los extremos 5' y 3' de los componentes. En estas construcciones los paliativos funcionales de ribozima de horquilla de INF-a estarán presentes a nivel tanto subgenómico como genómico de cadena positiva en el ARN del vector Sindbis RNA.
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Ejemplo 20 Formulación en lactosa de un vector de alfavirus recombinante
El vector de alfavirus recombinante bruto se obtuvo en un biorreactor Celligan (New Brunswick, NJ) conteniendo células de empaquetado transfectadas o transducidas con el vector de alfavirus recombinante, y unido a las perlas de la matriz del biorreactor. Las células liberaron el vector de alfavirus recombinante al medio de crecimiento que pasa por las células en un procedimiento de flujo continuo. Se recogió el medio que sale del biorreactor y se hizo pasar inicialmente por un filtro de 0,8 micrómetros y posteriormente por un filtro de 0,65 micrómetros para tamizar el vector de alfavirus recombinante bruto. El filtrado se concentró utilizando un sistema de concentración de flujo cruzado (Filtron, Boston, MA). Se añadieron aproximadamente 50 unidades de DNasa (Intergen, Nueva York, NY) por ml de concentrado para digerir el ADN exógeno. El digerido se diafiltró usando el mismo sistema de flujo cruzado hasta NaCl 150 mM, trometamina 25 mM, pH 7,2. El diafiltrado se cargó en una columna de gel Sephadex S-500 (Pharmacia, Piscataway, NJ), se equilibró en NaCl 50 mM, trometamina 25 mM, pH 7,4. El vector de alfavirus recombinante purificado se eluyó de la columna de gel Sephadex S-500 en NaCl 50 mM, trometamina 25 mM, pH 7,4.
Se preparó el tampón de formulación conteniendo lactosa en forma de disolución de almacenamiento 2X. El tampón de formulación contenía trometamina 25 mM, NaCl 70 mM, 2 mg/ml de arginina, 10 mg/ml de albúmina de suero humano (HSA), y 100 mg/ml de lactosa en un volumen final de 100 ml a pH 7,4.
El vector de alfavirus recombinante purificado se formula añadiendo una parte del tampón de formulación de lactosa 2X a una parte del vector de alfavirus recombinante purificado mediante S-500. El vector de alfavirus recombinante formulado se puede almacenar de -70ºC a -80ºC o seco.
El vector de alfavirus formulado se liofilizó en una cámara refrigerante Edwards (Unidad RC3S de 3 baldas) unido a un criodesecador Supermodulyo 12K (Edwards High Vacuum, Tonawanda. NY). Cuando se completó el ciclo de criodesecación, los viales se detuvieron bajo vacío tras un ligero purgado con nitrógeno. Tras la retirada, los tapones se sellaron con cápsulas de aluminio. El retrovirus recombinante liofilizado se reconstituyó con 1,0 ml de agua.
A partir de lo anterior, se apreciara que, aunque se han descrito en el presente documento formas de realización específicas de la invención a efectos de ilustración, se pueden hacer varias modificaciones. Según esto, la invención no está limitada salvo por las reivindicaciones adjuntas.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
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(A)
NOMBRE: CHIRON CORPORATION
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(B)
CALLE: 4650 Horton Street
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(C)
CITY: Emeryville
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(D)
ESTADO: California
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(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92121
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VECTORES DE ALFAVIRUS RECOMBINANTES
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 89
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A9
NÚMERO DE LA SOLICITUD: WO US95/07994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCTCTACGG TGGTCCTAAA TAGT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATTCTAG ATTTTTTTTT TTTTTTGAAA 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATGGGCC CGATTTAGGT GACACTATAG ATTGACGGCG TAGTACAC 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGCAACCG GTAAGTACGA TAC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA; SEC DE ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATACTAGCCA CGGCCGGTAT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCTCTTTCG ACGTGTCGAG C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCTTGGAGC GCAATGTCCT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTTTTCAGG GGATCCGCCA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGCGGATC CCCTGAAAAG G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGGCCGTGT GGTCGCATG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGGTCTTCA ACTCACCGGA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAATTCGACG TACGCCTCAC TC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGTGAGGCG TACGTCGAAT TG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATCTCCA GATGAGGTAC ATGATTTTAG GCTTG 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATATCGA TTCAAGGCAT TTTCTTTTCA TCAATAAAAC 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATCTCCA GATGATGACA ATGTGGTGTC TGACG 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATATCGA TTCATGACGA CCGGACCTTG CG 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATGGGCC CCCCCCCCCC CCCCAACG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATATCGA TCCCCCCCCC CCCCCCAACG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATCCATG GCTTACAATC GTGGTTTTCA AAGG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATGGGCC CTCGATGAGT CTGGACGTTC CTC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATATCGA TTCGATGAGT CTGGACGTTC CTC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATCCATG GATCCAATTT GCTTTATGAT AACAATC 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATGGGCC CGGTCGACGC CGGCCAAGAC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATATCGA TGGTCGACGC CGGCCAAGAC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATCCATG GTGCCAGCCA GTTGGGCAGC AG 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTAATTAACG GCCGCCACCA TGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAACGGCCGC CAC 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCATGGTGGC GGCCGTTAAT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCACCGGTG AC 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCATCGATC AGATCTGACT AGTTG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCAACTA GTCAGATCTG ATCGATGAGG GCC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTTATCGAT GGTTCTAGAC TCCCTTAGCC ATCCGAGTGG ACGTGCGTCC TCCTTC 
\hfill
56 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCACCTCCT CGCGGTCCGA CCTGGGCATC CGAAGGAGGA CGCACGTCCA CT 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGGACCGCG AGGAGGTGGA GATGCCATGC CGACCCATTG ACGGCGTAGT ACACACT 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGACTAGT TAATACTGGT GCTCGGAAAA CATTCT 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCAAGCTTG CTAGCTACAA CACCACCACC ATGAATAGAG 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATGCGGC CGCACCACCA CCATGAATAG AGGATTCTTT AACATGC 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATGCGGC CGCTCATCTT CGTGTGCTAG TCAG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 61 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 40:
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCTCGAG TTACTACCAC TCTTCTGTCC CTTCCGGGGT 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATGCGGC CGCACCACCA TGTCCGCAGC ACCACTGGTC ACG 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATAGATC TCTTGATCAG CTTCAGAAGA TGGC 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAATGGCGG GAAGAGGCGG TTGG 
\hfill
24 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGCCTCTTC CCGCCATTGA CGGCGTAGTA C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGCAACCG GTAAGTACGA TAC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATAGATC TCTTGATCAG CTTCAGAAGA TGGC 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTAACAAGA TCTCGTGCCG TG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATGCGGC CGCACCGCCA AGATGTTCCC GTTCCAGCCA 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATGCGGC CGCTCAATTA TGTTTCTGGT TGGT 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCGAGCTCG AGGCACCAGC ACCATGCAAC TTTTT 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTACTAGATC CCTAGATGCT GGATCTTCC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAAGATCCA GCATCTAGGG ATCTAGTAG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGATATC AAGCTTATCG ATACCG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCGAGCTCG AGGCACCAGC ACCATGCAAC TTTTT 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGATATC AAGCTTATCG ATACCG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATACGACTC ACTATAGGG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTACTAGATC CCTAGATGCT GGATCTTCC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTAACCCTC ACTAAAG 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAAGATCCA GCATCTAGGG ATCTAGTAG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTAACCCTC ACTAAAG 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATACGACTC ACTATAGGG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCGAGCTC GAGCTTGGGT GGCTTTGGGG CATG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTACCCCTC ACTAAAG 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCACCTCCT CGCGGTCCGA CCTGGGCATC CGAAGGAGGA CGCACGTCCA CT 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTTATCGAT GGTTCTAGAC TCCCTTAGCC ATCCGAGTGG ACGTGCGTCC TCCTTC 
\hfill
56 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGGACCGCG AGGAGGTGGA GATGCCATGC CGACCCATTG ACGGCGTAGT ACACACT 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGACTAGT TAATACTGGT GCTCGGAAAA CATTCT 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTCTGGCTC CAGCCAAAGC CACCCTAGGG GAG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATGGAGTAG CCAGGTGAGA TTGTCTCCAG GAA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGCGGGCC CTGTGACATT GAATAGAGTG AGGGTCCTGT TGGG 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGGTTTCA CATTTGTAGC TTGCTGTGTC ATTGCGATCT CTACG 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGTCCTAA ATAGTTCACT CTATTCAATG TCACACTCGA GCCGG 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTCTGGCTC CAGCCAAAGC CACCCTAGGG GAG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATGGAGTAG CCAGGTGAGA TTGTCTCCAG GAA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATTCTAG AGCAAGCAAC AGTTACTGCG ACG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATATCGA TCCGAAGCGT AGAGTCACAC TTG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTAACTGTCA AAAGCCAC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATTCTAG AGCAAGCAAC AGTTACTGCG ACG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATATCGA TCCGAAGCGT AGAGTCACAC TTG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTAACTGTCA AAAGCCAC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 85:
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTCTGTCCT CCATGA 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 87:
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
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(C)
CADENAS: única
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TOPOLOGÍA: lineal
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC DE ID Nº: 88:
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44 
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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC DE ID Nº: 89:
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CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 16656 pares de bases
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(B)
TIPO: ácido nucleico
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(C)
CADENAS: única
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TOPOLOGÍA: lineal
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Claims (7)

1. Un casete de expresión de proteína estructural de un ADN de alfavirus que comprende un promotor que dirige la síntesis de una molécula de ARN en una célula eucariota, comprendiendo dicha molécula de ARN la secuencia de codificación de la proteína de la cápsida de un alfavirus, pero no las secuencias de codificación de las glicoproteínas E1 y E2 del alfavirus.
2. Un casete de expresión de proteína estructural de un ADN de alfavirus que comprende un promotor que dirige la síntesis de una molécula de ARN en una célula eucariota, comprendiendo dicha molécula de ARN las secuencias de codificación de las glicoproteínas E1 y E2 del alfavirus, pero no una secuencia de codificación de la proteína de la cápsida de un alfavirus.
3. Un casete de expresión como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende además una cola poli A.
4. Un casete de expresión como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es capaz de dirigir la expresión de una o más proteínas estructurales del alfavirus derivadas de un alfavirus seleccionado entre el virus de la encefalitis equina de Venezuela, el virus Ross River o el virus del Bosque Semliki.
5. Un casete de expresión como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es capaz de dirigir la expresión de una o más proteínas estructurales derivadas del virus Sindbis.
6. Un casete de expresión como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el promotor es un promotor eucariota inducible.
7. Un casete de expresión como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el promotor es un promotor eucariota constitutivo.
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