ES2714392T3

ES2714392T3 - Vacuna contra el virus respiratorio sincicial

Info

Publication number: ES2714392T3
Application number: ES11781825T
Authority: ES
Inventors: Xavier Saelens; Bert Schepens; Walter Fiers
Original assignee: Universiteit Gent; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Universiteit Gent; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2031-11-15
Also published as: WO2012065997A1; EP2640419A1; AU2011331251B2; GB201019240D0; CN103379916A; EP2640419B1; CN103379916B; US10117926B2; US20190083605A1; US9409973B2; US20130315916A1; AU2011331251A1; JP2013543860A; US20210106673A1; US20160346379A1; JP6016799B2; CA2820614A1

Abstract

Una vacuna para su uso en un procedimiento de vacunacion contra la infeccion por el VRS, comprendiendo la vacuna una composicion inmunogena y un adyuvante, caracterizada por que la composicion inmunogena consiste en el ectodominio de la pequena proteina hidrofoba de un virus respiratorio sincicial (VRS) y un vehiculo, en la que el vehiculo es una molecula que es heterologa para la pequena proteina hidrofoba del virus respiratorio sincicial (VRS) y en la que, ademas, dicho ectodominio esta unido quimica o geneticamente al vehiculo.

Description

DESCRIPCION

Vacuna contra el virus respiratorio sincicial

La presente invencion se refiere a una vacuna para su uso en un procedimiento de vacunacion contra el virus respiratorio sincicial (VRS), como se define en la reivindicacion 1 adjunta. Mas especificamente, la invencion se refiere a una vacuna de subunidad recombinante como se define en la reivindicacion 1 adjunta, para su uso en un procedimiento de vacunacion. El ectodominio de SH se denomina SHe. Preferentemente dicho ectodominio se presents como un oligomero, incluso mas preferentemente como un pentamero. La invencion se refiere ademas a anticuerpos, especificos para dicho ectodominio, para su uso en la proteccion de un sujeto contra la infeccion por el VRS y/o en el tratamiento de un sujeto infectado.

El alcance de la invencion se define por las reivindicaciones.

La infeccion por el VRS es la causa principal de hospitalizacion de lactantes en los paises industrializados.

Despues de la infeccion primaria por el VRS, que, en general, se produce en menores de 2 anos, la inmunidad al VRS permanece incompleta y se puede producir la reinfeccion. Ademas, el VRS puede causar una enfermedad grave en los ancianos y, en general, se asocia con mayor mortalidad que la gripe A en anos no pandemicos (Falsey et al., 1995). La tasa de infeccion anual global estimada por la OMS en la poblacion humana se estima en 64 millones de casos, con una cifra de mortalidad de 160000; solo en EE. UU., de 85000 a 144000 lactantes son hospitalizados cada ano como consecuencia de la infeccion por el VRS (http://www.who.int/vaccine research/diseases/ari/en/index2.html update 2009).

El VRS pertenece a la familia Paramyxoviridae, subfamilia Pneumovirinae, genero Pneumovirus; en humanos, existen dos subgrupos, A y B. Aparte del VRS humano, existe una variante bovina. El genoma del VRS humano tiene aproximadamente 15200 nucleotidos de longitud y es una molecula de ARN de sentido negativo. El genoma del VRS codifica 11 proteinas conocidas: glucoproteina (G), proteina de fusion (F), proteina hidrofoba pequena (SH), nucleoproteina (N), fosfoproteina (P), proteina grande (L), proteina de la matriz (M), proteina M2 ORF-1 (M2-1), proteina M2 ORF-2 (M2-2), proteina 1 no estructural (NS1) y proteina 2 no estructural (NS2). G, F y SH son proteinas de superficie transmembranarias; N, P, L, M, M2-1 son proteinas asociadas a la nucleocapside; y NS1 y NS2 son proteinas no estructurales. Se desconoce el estado de M2-2 como proteina estructural o no estructural. (Flacking y Hull, 2002). Los subgrupos del VRS muestran diferencias en las propiedades antigenicas de las proteinas G, F, N y P (Ogra, 2004). La infeccion por el VRS va seguida de laformacion de anticuerpos especificos IgG e IgA detectables en el suero y algunos otros liquidos corporales. Varios estudios han demostrado que la produccion de anticuerpos se dirige principalmente contra las principales proteinas transmembranarias F y G del VRS; solo los anticuerpos especificos contra F y G son conocidos por tener actividad neutralizante del VRS in vitro. La produccion de anticuerpos contra la proteina F a menudo muestra reactividad cruzada entre los subgrupos A y B, mientras que la produccion de anticuerpos contra la proteina G es especifica de los subgrupos (Orga, 2004). Contrariamente a F y G, la proteina transmembranaria SH se considera no inmunogena (Gimenez et al., 1987; Tsutsumi et al., 1989) y, en algunas vacunas experimentales, SH incluso se ha eliminado para obtener una vacuna atenuada no reversible (Karron et al., 2005).

Pringle C.R. et al., Vaccine, Elsevier Ltd, GB, vol. 11, n.° 4, paginas 473-478, divulgan una composicion inmunogena que comprende un VRS con tres mutaciones sensibles a la temperatura.

Singh et al., Vaccine, Elsevier Ltd, GB, vol. 25, n.° 33, paginas 6211-6223, divulgan una composicion inmunogena que comprende los residuos 412-524 de VRS-F.

Edward E. Walsh: "Respiratory Syncytial Virus Vaccine", Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, 2.a edicion, vol. 12, 2005, paginas 297-322, indica que se han identificado epitopos de linfocitos T y B en la proteina SH del VRS, pero no contiene ninguna referenda a su localizacion dentro de la secuencia de SH.

El desarrollo de vacunas para evitar la infeccion por el VRS se ha complicado por el hecho de que las respuestas inmunitarias del huesped parecen desempehar un papel significativo en la patogenia de la enfermedad. Los primeros intentos de vacunacion de ninos con VRS inactivado con formol mostraron que los ninos vacunados experimentaban una enfermedad mas grave en la exposicion posterior al virus en comparacion con los controles no vacunados (Kapikian et al., 1969). Se han sometido a prueba vacunas vivas atenuadas, pero a menudo muestran una sobre o infraatenuacion en los estudios clinicos (Murata, 2009).

Las vacunas de subunidades, que usan una proteina inmunogena o una combinacion de proteinas inmunogenas, se consideran mas seguras porque no pueden revertir o mutar a un virus virulento. Se han desarrollado vacunas experimentales basadas en la proteina F purificada y se han sometido a prueba en roedores, ratas algodoneras y humanos, y se demostro que son seguras, pero solo moderadamente inmunogenas (Falseyy Walsh, 1996; Falsey y Walsh, 1997; Groothuis et al. 1998). En un estilo similar, se han suspendido en la fase II ensayos clinicos con una mezcla de proteinas F, G y M (base de datos clinicos ADISinsight). Un enfoque alternative consistio en una fusion genetica recombinante del dominio antigenico de la proteina G del VRS humano en el extremo C-terminal del dominio de union a albumina de la proteina G estreptococica (BBG2Na; Power et al., 2001). BBG2Na se investigo hasta un ensayo clinico de fase III en voluntaries sanos, pero el ensayo tuvo que interrumpirse debido a la aparicion de efectos secundarios inesperados de hipersensibilidad de tipo 3 (purpura) en algunos voluntaries inmunizados (Meyer et al., 2008).

Un desarrollo reciente es el uso de virus recombinantes quimericos como vectores para antigenos del VRS. Se genomanipulo un parainfluenzavirus bovino/humano recombinante quimerico de tipo 3 (rB/HPIV-3) mediante la sustitucion en un genoma de BPIV-3 de los genes F y FIN por los genes homologos de HPIBV-3. La cepa de rB/HPIV-3 quimerica resultante se uso a continuacion para expresar los genes F y G del FIRSV (Schmidt et al., 2002). Esta vacuna esta actualmente en investigacion clinica.

Solo existe un numero limitado de opciones de prevencion y tratamiento disponibles para enfermedades graves causadas por el VRS. La intervencion mas ampliamente utilizada se basa en la inmunoprofilaxis pasiva con un anticuerpo monoclonal humanizado que se deriva del anticuerpo monoclonal de raton 1129 (Beeler y van Wyke Coelingh, 1989). Este anticuerpo es especifico contra la proteina F del VRS y neutraliza los virus de los subgrupos A y B. El anticuerpo humanizado recombinante 1129 es conocido como palivizumab (tambien conocido como Synagis) y se usa para el tratamiento profilactico de lactantes que tienen un alto riesgo de desarrollar complicaciones tras la infeccion por el VRS. El anticuerpo se administra por via intramuscular mensualmente para reducir el riesgo de infeccion por el VRS en los lactantes en riesgo debido a prematuridad, enfermedad pulmonar cronica o cardiopatia congenita hemodinamicamente significativa (Bocchini et al., 2009). Algunos estudios han informado de proporciones de coste-efectividad aceptables para la profilaxis del VRS con palivizumab (Prescott et al., 2010).

Como no existe una vacuna aprobada en el mercado, todavia existe una necesidad no cubierta de desarrollo y disponibilidad de una vacuna segura y eficaz contra el VRS. Sorprendentemente, encontramos que la parte extracelular (ectodominio) de la pequena proteina hidrofoba SH, conocida como SHe, se puede usar de manera segura para la vacunacion contra la infeccion por el VRS, especialmente cuando se presents en un vehiculo como un oligomero, preferentemente como un pentamero. Ademas, tambien se pueden usar anticuerpos policlonales o monoclonales, dirigidos contra SHe, de forma profilactica o terapeutica para la prevencion o el tratamiento de la infeccion por el VRS, respectivamente.

Un primer aspecto de la invencion es una vacuna como se define en la reivindicacion 1 adjunta para su uso en un procedimiento de vacunacion contra el VRS. En un modo de realizacion preferente, el VRS es un subgrupo A humano o una cepa del subgrupo B humano; en otro modo de realizacion preferente, el VRS es VRS bovino. La proteina SH es conocida por el experto en la tecnica y contiene 64 (subgrupo A del VRS), 65 (subgrupo B del VRS) residuos de aminoacidos o 81, 77 o 72 residuos de aminoacidos para el VRS bovino. En un modo de realizacion preferente, el ectodominio de SH (SHe) consiste en los 23 aminoacidos carboxiterminales para el subgrupo A (SEQ ID N° 1) y en los 24 aminoacidos carboxiterminales para el subgrupo B (SEQ ID N° 2). Preferentemente, la secuencia del ectodominio se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID N° 1 (subgrupo A del ectodominio) y la SEQ ID N° 2 (subgrupo B del ectodominio). Una molecula vehiculo es una molecula que es heterologa para la proteina SH; un vehiculo puede ser cualquier vehiculo conocido por el experto en la tecnica como adecuado para la presentacion de un antigeno e incluye, pero no se limita a, particulas similiviricas, tal como HBcore (Whitacre et al., 2009), y otras VLP derivadas de proteinas de ensamblaje de la capside o la cubierta del virus. Tambien se puede utilizar cualquier otra construccion molecular, siempre que pueda presentar eficazmente antigenos al sistema inmunitario, tal como la proteina oligomerica de la matriz cartilaginosa pentamerica (comp.; McFarlane et al., 2009), las tromobospondinas 3 y 4 (Malashkevich et al., 1996), la subunidad B de toxinas de tipo AB5 bacterianas (por ejemplo, la subunidad de la toxina del colera o la toxina termolabil de E. co!i\ Williams et al., 2006), una cremallera de triptofano pentamerica (Liu et al., 2004), una cremallera de fenilalanina pentamerica (Liu et al., 2006) o una cremallera de leucinas derivada de GCN4 tetramerica (tGCN4, De Filette et al., 2008) y Lpp-56 (Shu et al, 2000). El vehiculo puede ser de naturaleza proteinica, as! como de naturaleza no proteinica. Los ejemplos de naturaleza no proteinica son, como ejemplo no limitativo, liposomas, construcciones CLIPS™ (Timmerman et al, 2007) y trimetilquitosano (Slutter et al., 2010).

Preferentemente, dicho vehiculo presenta el SHe como un oligomero, incluso mas preferentemente como un pentamero, presentando multiples moleculas de SHe en un supercontigo, presentando un SHe en un supercontigo multimerizante, o mediante una combinacion de ambos. El oligomero de SHe se puede presentar como una estructura lineal repetida, o como unidades de SHe individuales queforman un complejo oligomerico, o como una combinacion de ambos. Preferentemente, dicho vehiculo es un vehiculo oligomerico (dimerico, hasta decamerico). Incluso mas preferentemente, dicho vehiculo es un vehiculo pentamerico. En un modo de realizacion especifico, el dominio transmembranario de SH, preferentemente sin el dominio citoplasmico, se puede usar como dominio de oligomerizacion, fusionado o unido ademas a un vehiculo. No todas las moleculas vehiculo deben ser cargadas por el SHe; de hecho, como ejemplo no limitativo, se puede imaginar que solo 5 unidades de un vehiculo hexamerico se cargan con SHe, presentando de este modo un complejo de SHe pentamerico en un complejo de vehiculo hexamerico. El ectodominio se puede unir geneticamente al vehiculo, formando una proteina de fusion; ambos dominios se pueden fusionar directamente, o se pueden unir por una secuencia bisagra o una secuencia espaciadora. Como se usa en el presente documento, en una construccion geneticamente fusionada, una secuencia bisagra es una secuencia de aminoacidos que une dos dominios entre si; preferentemente, dicha secuencia une los dos dominios de una manera flexible; preferentemente, dicha secuencia bisagra es mas corta que 150 aminoacidos, incluso mas preferentemente mas corta que 100 aminoacidos, incluso mas preferentemente mas corta que 50 aminoacidos, lo mas preferentemente mas corta que 20 aminoacidos. Un espaciador como se usa en el presente documento indica una secuencia bisagra corta mas corta que 15 aminoacidos. En un modo de realizacion preferente, una secuencia bisagra comprende la secuencia (Gly-Ser)n con n igual a uno, 2, 3, ...20. En otro modo de realizacion preferente, la bisagra de genes de inmunoglobulina, tal como la region bisagra de IgG 1 humana, se usa como secuencia bisagra. En el caso de un enlace genetico, dicho enlace se puede producir en el extremo aminoterminal de SHe, asi como en el extremo carboxiterminal.

De forma alternativa, el ectodominio esta quimicamente unido al vehiculo. El enlace quimico es conocido por el experto en la tecnica, e incluye, pero no se limita a, peptidos que estan conjugados con el vehiculo mediante la union covalente de los peptidos a sitios reactivos en la superficie del vehiculo. La estructura resultante es un conjugado. Un sitio reactivo en la superficie del vehiculo es un sitio que es quimicamente activo o que se puede activar y es accesible estericamente para la union covalente con un peptido. Un sitio reactivo preferente es el nitrogeno epsilon del aminoacido lisina. Unido covalentemente se refiere a la presencia de un enlace covalente que es estable a la hidrolisis en condiciones fisiologicas. Preferentemente, el enlace covalente es estable a otras reacciones que se pueden producir en condiciones fisiologicas, incluyendo la formacion de aductos, la oxidacion y la reduccion. A menudo, el enlace de un peptido antigenico con un vehiculo se logra usando reactivos bifuncionales (Hermanson, 1996). Cualquier residuo adecuado en el SHe se puede usar para enlace con el vehiculo quimico; preferentemente, SHe esta unido al vehiculo por su extremo aminoterminal o carboxiterminal. En todavia otro modo de realizacion, el ectodominio se une al vehiculo por una interaccion no covalente, tal como, pero no limitada a, interacciones hidrofobas, interacciones cooperativas de enlaces de H o interacciones de Van der Waals.

La vacuna se puede administrar al sujeto que se va a tratar por cualquier via conocida por el experto en la tecnica, incluyendo, pero no limitado a, administracion intranasal, intraperitoneal, intramuscular e intradermica. Preferentemente, no existe una potenciacion de los sintomas de la enfermedad en la infeccion por el VRS despues de la vacunacion. La vacuna puede ser para uso animal o humano. Un uso animal preferente es para la proteccion de ganado u otros bovidos mediante la vacunacion contra virus respiratorios bovinos relacionados con el VRS humano, tales como, pero no limitado a, VRS bovino. La proteccion contra la infeccion por el VRS cubre usos tanto profilacticos como terapeuticos. Mas particularmente, un uso preferente de la vacuna es para propositos profilacticos. La "preparacion de una vacuna" como se usa en el presente documento significa que la composicion inmunogena de la vacuna de acuerdo con la invencion se puede optimizar mediante la adicion de excipientes adecuados, o se puede formular para, como ejemplo no limitativo, aumentar el periodo de validez o mejorar las caracteristicas farmaceuticas de la vacuna.

Como ejemplo no limitativo, se pueden mezclar composiciones inmunogenas que comprenden SHe del subgrupo A del VRS y SHe del subgrupo B del VRS para obtener una vacuna con una especificidad mas amplia. Dicha vacuna puede ser para uso humano o veterinario. Aparte de la composicion inmunogena, la vacuna comprende uno o mas de otros compuestos, tal como un adyuvante. Preferentemente, la vacuna es una vacuna para la proteccion de seres humanos contra la infeccion por el VRS o, en animales, contra virus respiratorios de los animales relacionados con el VRS humano, tal como, pero no limitado a, VRS bovino.

La composicion inmunogena de la vacuna de la invencion se puede usar para la deteccion y/o purificacion de anticuerpos, dirigida contra el ectodominio del VRS. Dichos anticuerpos se pueden aislar despues de vacunar a un sujeto con la composicion inmunogena de la invencion; de forma alternativa, tambien se pueden obtener anticuerpos similares y/o celulas productoras de anticuerpos de un sujeto humano o animal infectado por el VRS y, despues de un desarrollo apropiado conocido en la tecnica, usar para la produccion de anticuerpos especificos contra SHe, preferentemente anticuerpos de tipo humano que se pueden usar para propositos profilacticos o terapeuticos como se describe anteriormente.

Otro aspecto de la invencion es un anticuerpo monoclonal que inhibe el VRS, dirigido contra el ectodominio de la proteina SH del VRS. La inhibicion del VRS, como se usa en el presente documento, significa que, tras la infeccion, el titulo del virus pulmonar es menor en los animales tratados en comparacion con los animales no tratados, segun lo medido en un modelo animal adecuado. Preferentemente, dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado.

Todavia otro aspecto de la invencion es una composicion farmaceutica, que comprende un anticuerpo monoclonal dirigido contra el ectodominio de la proteina SH del VRS, de acuerdo con la invencion. De hecho, un organo de un animal no humano inmunizado, preferentemente el bazo de dicho animal, o una muestra de sangre de un animal o un sujeto humano inmunizado, se puede usar como material de partida para la produccion de anticuerpos monoclonales y derivados tales como, pero no limitado a, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos multivalentes o anticuerpos unidos a compuestos antiviricos. Dichos anticuerpos monoclonales y derivados se usan para inmunizacion pasiva o para el tratamiento de la infeccion por el VRS.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: A, Las secuencias de aminoacidos del ectodominio de SH del VRS humano de subtipo A (VRSh) (SEQ ID N° 1), del ectodominio de SH del VRS humano del subtipo B (SEQ ID N° 2) y del ectodominio de SH del VHS bovino (VRSb) (SEQ ID N° 17). B, La secuencia de aminoacidos de Flag-COMPcc-She (SEQ ID N° 35). Los nueve primeros aminoacidos representan el epitopo Flag N-terminal. Los aminoacidos (AA) en letra cursiva representan el dominio de superhelice de COMP de rata (AA 25-72). El AA subrayado representa el ectodominio de la pequena proteina hidrofoba del VRS A (SHe). C, Representacion esquematica de la proteina pentamerica Flag-COMPcc-SHe. D, Representacion esquematica de la proteina pentamerica COMPcc-SHe.

Figura 2: Purificacion y determinacion de la masa molecular relativa de Flag-COMPcc-SHe. A, Curvas de elucion de aldolasa (1), conalbumina (2), albumina (3), quimotripsinogeno (4), ribonucleasa A (5) y Flag-COMPcc-SHe (6 en 7) por filtracion en gel en una columna de Superdex 75. B, Tincion con azul de Coomassie de un analisis por SDS-PAGE de Flag-COMPcc-SHe despues de la filtracion en gel (pico 6 del panel A). C, Resumen de las proteinas usadas para calibrar la columna de filtracion en gel, su peso molecular relativo (Mr), el volumen al que se eluyeron de la columna (Ve) y el Kav calculado (Kav = (Ve-V0)/(Vtot-V0), con V0 = el volumen vacio de la columna = 9,05 y Vtot = el volumen del lecho de la columna = 19,816). El Mr de Flag-COMPcc-SHe presente en el pico 6 se calculo en base a su Ve y la curva de calibracion presentada en el panel D. D, La curva de calibracion de la columna de filtracion en gel de Superdex 75 usada para purificar Flag-COMPcc-SHe pentamerica.

Figura 3: La vacunacion de ratones Balb/c con Flag-COMPcc-SHe en combinacion con LTR192G induce anticuerpos especificos contra She. A, B y C, Determinacion basada en ELISA de los titulos de anticuerpos IgG especificos contra peptidos de SHe presentes en la mezcla de sueros de ratones despues de la primera, segunda o tercera inmunizacion con las vacunas indicadas. D, Anticuerpos IgG, IgG 1 y lgG2a especificos contra peptidos de SHe presentes en la mezcla de sueros de ratones a los que se vacuno con PBS, M2e-1GCN4/LTR192G o Flag-COMPcc-SHe/LTR192G.

Figura 4: La vacunacion con Flag-COMPcc-SHe, como en la leyenda de lafigura 3, induce anticuerpos que pueden reconocer el ectodominio de SH en la superficie de las celulas. A, Analisis por citometria de flujo de celulas HEK293T que expresan GFP y SH del VRS tenidas con diferentes diluciones de suero de ratones vacunados con Flag-COMPcc-SHe. B, Analisis por citometria de flujo de celulas HEK que expresan GFP y SH del VRS tenidas con suero de ratones vacunados con Flag-COMPcc-SHe o M2e-tGCN4 (control negativo). C, Analisis por citometria de flujo de celulas HEK que expresan GFP y luciferasa tenidas con suero de ratones vacunados con Flag-COMPcc-SHe o M2e-tGCN4.

Figura 5: La vacunacion con Flag-COMPcc-SHe inhibe la replicacion del VRS. Cuatro dias despues de la exposicion, los ratones de los grupos indicados se sacrificaron para determinar el titulo video en los pulmones mediante un analisis de calvas. El grafico muestra el numero de unidades formadoras de calvas por pulmon de cada raton. El limite de deteccion del analisis de calvas es de 10 UFC por pulmon. La diferencia en el titulo de VRS en los pulmones entre los ratones vacunados con Flag-COMPcc-SHe y los ratones vacunados con M2e-tGCN4 fue altamente significativa (***p so,0005).

Figura 6: La vacunacion con Flag-COMPcc-SHe no induce una enfermedad potenciada tras la infeccion por el VRS. El grafico muestra el peso corporal relativo de cada raton, calculado como la proporcion entre el peso en el dia del sacrificio (cuatro dias despues de la infeccion) y el peso en el dia de la infeccion virica, multiplicado por 100.

Figura 7: Enlace quimico de peptidos SHe(cc4s) con los bucles inmunodominantes de particulas similiviricas de mHBc. Analisis por SDS-PAGE tenido con azul de Coomassie de mHBc en las diferentes etapas del enlace quimico como se indico por encima del gel: mHBc = mHBc purificado, mHBc-SMBS sMBS = mHBc despues de la adicion del conector quimico Sulfo-MBS, mHBc-SMBS = mHBc-SMBS despues la cromatografia de exclusion portamano, mHBC-SHe(cc4s) SHe(cc4s) = mHBc-SMBS purificado despues de incubacion con el peptido de SHe(cc4s), mHBC-SHe(cc4s) = SHe unido a VLP de mHBc despues de purificacion mediante cromatografia de exclusion por tamano.

Figura 8: mHBc-SHe(cc4s) conserva su conformacion de VLP. El grafico representa la distribucion portamano de mHBc-SHe(cc4s) y la VLP 1604 de M2e-mBHc segun lo determinado por dispersion dinamica de la luz. La distribucion portamano se expresa en funcion del volumen.

Figura 9: Purificacion de SHe-tGCN4. Analisis por SDS-PAGE seguido de tincion con azul de Coomassie de SHetGCN4 despues de la purificacion mediante una serie de etapas cromatograficas de columna: intercambio anionico, interaccion hidrofoba y cromatografia de filtracion en gel. Los paneles izquierdo y derecho representan el analisis por SDS-PAGE en condiciones reductoras (en presencia de beta-mercaptoetanol) o no reductoras (en ausencia de beta-mercaptoetanol), respectivamente. Las flechas indican proteinas SHe-tGCN4 monomericas y dimericas.

Figura 10: La vacunacion tanto con SHe-tGCN4 como con mHBc-SHe(cc4s) induce anticuerpos especificos contra peptidos de SHe. A, La figura representa los titulos de los anticuerpos IgG especificos contra SHe presentes en la mezcla de sueros de ratones de los grupos indicados despues de la primera inmunizacion, la primera inmunizacion de refuerzo (refuerzo) y la segunda inmunizacion de refuerzo (refuerzo 2), como se analizo por ELISA de peptidos de SHe. B, La figura representa los titulos de anticuerpos IgG, lgG1 y lgG2a especificos contra SHe presentes en la mezcla de sueros de ratones de los grupos indicados despues de la segunda inmunizacion de refuerzo, segun lo determinado por ELISA de peptidos.

Figura 11: La vacunacion tanto con SHe-tGCN4 como con mHBc-SHe(cc4s) disminuye la replicacion pulmonar del VRS. Tres dias despues de la exposicion, se sacrificaron los ratones para determinar el titulo video en los pulmones mediante QRt-PCR. El grafico superior representa la expresion relativa del ARN genomico del VRS, normalizado a los niveles de ARNm de GADPH presentes en las muestras de cada raton en los grupos indicados. Se indican las diferencias estadisticas entre los grupos vacunados. El panel inferior (B) es identico al panel superior (A), pero tambien incluye los resultados de los ratones vacunados con PBS.

Figura 12: Ni la vacunacion con mHBc-SHe (cc4s) ni con tGCN4-SHe inducen una enfermedad potenciada tras la infeccion por el VRS. La figura muestra el peso corporal relativo promedio de cada grupo de ratones indicado, calculado como la proporcion entre el peso en el dia indicado y el peso en el dia de infeccion (dia 0), multiplicado por 100.

Figura 13: 3D11 y 3G8 son dos Ac monoclonales especificos contra SHe de los subtipos lgG1 e lgG2a, respectivamente. El grafico muestra la union de series de dilucion de 1 pg/pl de los anticuerpos monoclonales 3D11 y 3G8 con el peptido de SHe en un ensayo ELISA detectada por anticuerpos secundarios especificos lgG1 de raton o lgG2a de raton.

Figura 14: Los AcM 3D11 y 3G8 se unen al ectodominio de SH del VRS en celulas vivas que expresan la proteina SH del VRS en su superficie celular. A, Analisis por citometria de flujo de la union de los AcM 3D11 y 3G8 y los respectivos anticuerpos de control emparejados por isotipo con celulas Hek293T que expresan GFP y la proteina SH del VRS. B, Analisis por citometria de flujo de la union de los AcM 3D11 y 3G8 a celulas Hek293T que expresan GFP en combinacion con la proteina SH del VRS o una proteina de control (luciferasa).

Figura 15: Union de los AcM 3D11 y 3G8 a la superficie celular de celulas infectadas por el VRS. Se infectaron celulas Vero con 0,5 MOI de VRS A2. Veinte horas despues de la transfeccion, las celulas se fijaron, se permeabilizaron y se tineron con 3D11 o 3G8 en combinacion con un suero de anticuerpo policlonal anti-VRS para identificar las celulas infectadas y no infectadas. Los paneles superiores representan una vision general de la inmunotincion (tincion nuclear DAPI, 3D11 y suero policlonal de VRS), incluyendo celulas infectadas y no infectadas. Los paneles inferiores representan imagenes confocales de una celula infectada, indicada en el panel superior.

Figura 16: La inmunizacion pasiva con anticuerpos monoclonales especificos contra SHe redujo la infeccion por el VRS en ratones. Se trataron ratones Balb/c con PBS, Acm 3G8 especifico contra SHe o anticuerpos de control por isotipo por medio de administracion intranasal un dia antes y un dia despues de la exposicion al VRS. Cada simbolo representa el titulo de virus en los pulmones de ratones individuales, cuatro dias despues de la exposicion al VRS. (**p <0,01).

Figura 17: La vacunacion intraperitoneal de ratones Balb/c con KLH-SHe en combinacion con adyuvante incomplete de Freund induce anticuerpos especificos contra SHe y reduce la replicacion del VRS. A, Determinacion basada en ELISA de los anticuerpos IgG especificos contra She presentes en los sueros de ratones individuales despues de latercera inmunizacion (refuerzo 2) con las vacunas indicadas. B, Determinacion basada en ELISA de anticuerpos IgG, lgG1 e lgG2a especificos contra SHe presentes en la mezcla de sueros de ratones que se vacunaron con KLH-SHe. C, La vacunacion con KLH-SHe no induce una enfermedad potenciada tras la infeccion por el VRS. El grafico muestra el peso corporal relativo de cada raton, calculado como la proporcion entre el peso en el dia del sacrificio (cinco dias despues de la infeccion) y el peso en el dia de la infeccion vinca, multiplicado por 100. La diferencia en el peso corporal relativo entre los ratones vacunados con KLH-SHe y los ratones vacunados con KLH es significativa (p so,005, prueba de la U de Mann-Whitney). D, La vacunacion con KLH-SHe altera la replicacion del VRS. Cinco dias despues de la exposicion con 106 UFC del VRS, se sacrificaron los ratones de los grupos indicados y se prepararon homogeneizados de pulmon para determinar el titulo virico en los pulmones mediante un analisis de calvas. El grafico muestra el numero de unidades formadoras de calvas por pulmon de cada raton. El limite de deteccion del analisis de calvas es de 20 UFC por pulmon. La diferencia en el titulo de VRS en los pulmones entre los ratones vacunados con KLH-SHe y los ratones vacunados con KLH es significativa (p so,005, prueba de la U de Mann-Whitney). E, Para ratones vacunados con KLH-SHe, unos titulos altos de anticuerpos sericos especificos contra SHe se correlacionan fuertemente con una reduccion de la replicacion del VRS. El grafico muestra para cada raton vacunado con KLH-SHe el titulo de anticuerpos IgG sericos especificos contra SHe y el numero de UFC/pulmon que se podian detectar cinco dias despues de la infeccion. En el grafico se muestran la curva de mejor ajuste (potencia) y su R2 (coeficiente de determinacion).

Figura 18: La vacunacion intranasal de ratones Balb/c con KLH-SHe en combinacion con LTR192G induce anticuerpos especificos contra SHe y reduce la replicacion del VRS. A, Determinacion basada en ELISA de los anticuerpos IgG especificos contra SHe presentes en los sueros de ratones individuales despues de la tercera inmunizacion (refuerzo 2) con las vacunas indicadas. B, Determinacion basada en ELISA de los anticuerpos IgG, lgG1 e lgG2a especificos contra SHe presentes en la mezcla de sueros de ratones que se vacunaron con KLHSHe. C y D, Determinacion basada en ELISA de los anticuerpos IgG e IgA especificos contra SHe presentes en el liquido del LBA de ratones individuales que se vacunaron con las vacunas indicadas y se infectaron por el VRS cinco dias antes de la recogida de liquido del LBA. E, La vacunacion con KLH-SHe altera la replicacion del VRS. Cinco dias despues de la exposicion con 106 UFC del VRS, se sacrificaron los ratones de los grupos indicados para determinar el titulo virico en los pulmones mediante un analisis de calvas. El grafico muestra el numero de unidades formadoras de calvas por pulmon de cada raton. El limite de deteccion del analisis de calvas es de 20 UFC por pulmon. La diferencia en el titulo de VRS en los pulmones entre los ratones vacunados con KLH-SHe y los ratones vacunados con KLH es significativa (p so,05, prueba de la U de Mann-Whitney). E, Para ratones vacunados con KLH-SHe, unos titulos altos de anticuerpos IgG especificos contra SHe presentes en el liquido del LBA se correlacionan fuertemente con una reduccion de la replicacion del VRS. Los graficos muestran para cada raton vacunado con KLH-SHe el titulo de anticuerpos IgG especificos contra SHe en el LBA y el numero de UFC/pulmon que se podian detectar cinco dias despues de la infeccion. En el grafico se muestran la curva de mejor ajuste y su R2 (coeficiente de determinacion).

Figura 19: La inmunizacion pasiva con antisuero de KLH-SHe reduce la infeccion por el VRS en ratones. A, Determinacion basada en ELISA de los anticuerpos IgG especificos contra SHe presentes en los sueros de ratones individuales despues de la tercera inmunizacion (refuerzo 2) con las vacunas indicadas. B, La inmunizacion pasiva con antisuero de KLH-SHe reduce la infeccion por el VRS en ratones. Se administro por via intranasal suero de ratones vacunados con KLH-SHe o KLH, o PBS, a los ratones un dia antes y un dia despues de la exposicion al VRS. Cinco dias despues de la exposicion con 106 UFC del VRS, se sacrificaron los ratones de los grupos indicados y se prepararon homogeneizados de pulmon para determinar el titulo virico en los pulmones mediante un analisis de calvas. El grafico muestra el numero de unidades formadoras de calvas por pulmon de cada raton. El limite de deteccion del analisis de calvas es de 20 UFC por pulmon. La diferencia en el titulo de VRS en los pulmones entre los ratones vacunados con KLH-SHe y los ratones vacunados con KLH es significativa (p so,05, prueba de la U de Mann-Whitney). C, La inmunizacion pasiva con suero de KLH-SHe no induce una enfermedad potenciada tras la infeccion por el VRS. El grafico muestra la media /- EEM del peso corporal relativo de cada raton, calculado como la proporcion entre el peso en un dia especifico y el peso en el dia de la primera inmunizacion pasiva, multiplicado por 100. La diferencia en el peso corporal relativo entre los ratones que se trataron con suero de KLH-SHe y los ratones que se trataron con suero de KLH es significativa (p s0,005, prueba de la U de Mann-Whitney).

Figura 20: Enlace quimico de peptidos de SHeB con los bucles inmunodominantes de particulas similiviricas de mHBc. Analisis por SDS-PAGE tenido con azul de Coomassie de VLP de mHBc, VLP de mHBc unidas al reticulador heterobifuncional de SMBS (mHBc-SMBS) y las VLP de mHBc-SMBS purificadas con peptidos de SHeB unidos quimicamente (mHBc-SHeB).

Figura 21: Union de suero de ratones vacunados con mHBc-SHeB a la superficie de las celulas infectadas por el VRS B. Se infectaron celulas Vero con una cepa clinica del VRS B o se infectaron con inoculos inactivados. Setenta y dos horas despues de la infeccion, las celulas se fijaron y bien se permeabilizaron o no se permeabilizaron. Las celulas infectadas y las infectadas con inoculos inactivados se tineron con suero de un raton vacunado con mHBc-SHeB o con suero de ratones vacunados con KLH, como se indico. La union de los anticuerpos sericos contra mHBc-B o KLH a las celulas se analizo usando anticuerpos contra IgG de raton unidos a Alexa488. A, Para el analisis microscopico, las celulas tambien se tineron con el tinte nuclear DAPI. B, Para el analisis citometrico de flujo, las celulas no permeabilizadas tambien se tineron con un suero de cabra anti-VRS para identificar las celulas infectadas por el VRS B. La union de los anticuerpos sericos anti-VRS de cabra a las celulas se determino usando anticuerpos contra IgG de cabra unidos a Alexa633. Los graficos representan isogramas de intensidad de Alexa488/intensidad de Alexa633 de las celulas indicadas.

Figura 22: La vacunacion con mHBc-SHeB induce anticuerpos especificos contra SHeB y reduce la inflamacion pulmonar inducida por el VRS B. A, Determinacion basada en ELISA de los anticuerpos IgG especificos contra SHeB y SHeA presentes en la mezcla de sueros de ratones despues de la primera (i.m.), la segunda (refuerzo 1) y la tercera inmunizacion con mHBc-SHeB (refuerzo 2). B, Determinacion basada en ELISA de los anticuerpos IgG, lgG1 e lgG2a especificos contra SHe presentes en la mezcla de sueros de ratones que se vacunaron con KLHSHe. C y D, Determinacion basada en ELISA de anticuerpos IgG especificos contra SHeB (C) y SHeA (D) presentes en los sueros de ratones individuales que fueron vacunados con las vacunas indicadas. E, El numero total de celulas presentes en los liquidos del LBA de ratones infectados por el VRS a los que se habia vacunado con las vacunas indicadas. Existen significativamente menos celulas presentes en el liquido de LBA de ratones a los que se habia vacunado con mHBc-SHe en comparacion con el liquido de LBA de ratones a los que se habia vacunado con mHBc. (p so,05, prueba de la U de Mann-Whitney). F, El numero de linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, monocitos, neutrofilos y eosinofilos presentes en los liquidos del LBA. Existen significativamente menos linfocitos CD8+ presentes en el liquido de LBA de ratones a los que se habia vacunado con mHBc-SHe en comparacion con el liquido de LBA de ratones a los que se habia vacunado con mHBc. (p so,05, prueba de la U de Mann-Whitney).

Figura 23: Expresion y purificacion de la proteina LPP(5)-SHe. A, Expresion de la proteina LPP<5)-SHe. Celulas de E. coli transformadas con pLH36-HisDEVD-LPP(5>-SHe se estimularon con 1-tio-p-d-galactoprianosido (IPTG) 1 mM o no. Cuatro horas mas tarde, se prepararon extractos en bruto por sonicacion, seguido de centrifugacion (13000 x g, 30 min, 4 °C). El sobrenadante se analizo mediante SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia usando el anticuerpo monoclonal 3G8 especifico contra SHe. B, Analisis de la proteina LPP(5)-SHe purificada. Despues de la purificacion, se analizo la proteina LPP(5)-SHe mediante SDS-PAGE, tincion con azul de Commassie (izquierda) e inmunoelectrotransferencia (derecha) usando el anticuerpo monoclonal 3G8 especifico contra SHe.

Figura 24: calendario de vacunacion de las ratas algodoneras. Los numeros de grupo se refieren a:

Grupo 1: 6 ratas algodoneras (RA) sin vacuna y expuestas a VRS el dia 63 (control de infeccion)

Grupo 2: 6 RA inoculadas por via intranasal con VRS-Tracy a 2,04 x 105 UFC/RA el dia 0

Grupo 3: 6 RA cada una, vacunadas por via intraperitoneal (i.p.) con KLH-SHe IFA

Grupo 4: 6 RA cada una, vacunadas por via intraperitoneal (i.p.) con KLH IFA (control con vehiculo)

Grupo 5: 6 RA cada una, vacunadas por via intramuscular (i.m.) con 1:10 de Bernett de VRS inactivado con formol (IF) cultivado en celulas Vero (control positivo para exacerbacion inmunitaria tras la exposicion)

EJEMPLOS

Materiales y procedimientos para los ejemplos

donation y construction de plasmidos.

Construction del plasmido de expresion pLT32 Flag-COMPcc-SHe. Se ordeno un plasmido, que contenia la secuencia codificante de Flag-COMPcc-SHe (Figura 1.B) en Genscript (SEQ ID N° 31). La secuencia codificante de Flag-COMPcc-SHe se ligo como un fragmento Ndel/Notl en un vector de expresion bacteriana pLT32H abierto con Ndel/Notl (Mertens et al., 1995)

Construction del vector de expresion pCAGGS-Etag-SH. Se prepare ARN total de celulas Hep-2 infectadas por el VRS A2 usando el kit de tejido de ARN de alta pureza (Roche, Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues de la síntesis del ADNc, la secuencia codificante de SH del VRS A2 se amplified utilizando los siguientes cebadores directos e inversos (5ATAAGAAAGCGGCCGCTATGGAAAATACATCCATAACAATAG3'; 5 AAGATCTCTATGTGTTGACTCGAGCTCTTGGTAACTCAAA3'). El producto de PCR se digirio con Notl y Bglll y se ligo en un vector de expresion pCAGGS-PTB-Etag abierto con Notl/Bglll (Cornells et al., 2005). El vector resultante pLT32-Flag-COMPcc-SHe fue depositado segun el tratado de Budapest en BCCM (BCCM/LMBP: Technologiepark 927, 9052 Zwijnaarde, Belgica) con el numero de deposito LMBP 6817 el 8 de noviembre de 2010.

La construction del vector de expresion pCAGGS-Luc se describio anteriormente (Schepens et al., 2005; denominado pCAGGS-HIF-RLuc)

Construction del vector de expresion pLT32 de mHBc. La secuencia codificante de mHBc, como se describe anteriormente por Jegerlhener et. al. como parte del plasmido "ab1", se ordeno en Geneart (SEQ ID N° 32) (De Filette et al., 2005; Jegerlehner et al., 2002). Esta secuencia codificante se clono como un fragmento Ndel/Notl en un vector de expresion bacteriana pLT32H abierto con Ndel/Notl.

Construction del vector de expresion pLT32 SHe-tGCN4-Flag. Para construir pLT32 SHe-tGCN4, la secuencia codificante de SHe se fusiono con la secuencia codificante de tGCN4-Flag por fusion per. El fragmento SHe para fusion per se amplified usando los cebadores: 5 GAATTCCATATGAACAAGTTATGTGAGTACAACG3' y 5 ATTTGTTTTAAACCTCCTGTATTTACTCGTGCCCGAGGCAA3' y un plasmido de molde que se ordeno a Geneart (SEQ ID N° 33) y que contenia la secuencia codificante del ectodominio de SH del VRS A2 (NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT) (SEQ ID N° 40). El fragmento GCN4 para PCR de fusion se amplified utilizando los cebadores 5 CCAAGCTT CT AACATT GAGATTCCCGAGATT GAGA3' y 5TATTAACCCTCACTAAAGGGAAGG3' y un plasmido de molde que contenia la secuencia codificante tGCN4, fusionada en el extremo C-terminal a la secuencia codificante de 3 secuencias sucesivas del epitopo Flag (SEQ ID N° 34; De Filette et al., 2008). Los dos fragmentos de PCR se fusionaron usando los cebadores: 5'GGAATTCCATATGAACAAGTTATGTGAGTACAACG3' y 5' TATTA ACC CTC ACTA A AG G G A AG G 3'. Este producto de PCR de fusion se clono como un fragmento Ndel/Hindl 11 en un vector de expresion bacteriana pLT32H abierto con Ndel/Hindlll. El pLT32 SHe-tGCN4-Flag resultante se deposito segun el tratado de Budapest en BCCM (BCCM/LMBP: Technologiepark 927, 9052 Zwijnaarde, Belgica) con el numero de deposito LMBP 6818 el 8 de noviembre de 2010.

La construccion del vector de expresion PLT32 M2e-tGCN4 se describio anteriormente (De Filette et al., 2008).

Construction del plasmido de expresion pLH36-HisDEVD-LPP(5)-SHe. Se ordeno en Genscript un plasmido que contenia la secuencia codificante de la cremallera de triptofano LPP(5) fusionada con la secuencia codificante del ectodominio SH separada por la secuencia codificante de un conector GlyGly. Esta secuencia codificante se amplified usando los cebadores directos e inversos siguientes (5 'GCGAAATGGGATCAGTGGAGCAGC-3'; 5'AATATAGGATCCCTAGGTCGCCCAGTTATCCCAGCG-3'), fosforilados y digeridos con BamHl El pLH36-HisDEVD-LPP-SHe se construyo mediante un ligado de tres puntos usando el fragmento de PCR descrito, el fragmento de plasmido pLT32 digerido con BamHVPst\ y el fragmento pLH36 digerido con EcoRV/Pst\. La secuencia del plasmido pLH36-HisDEVD-LPP(5)-SHe construido se muestra en SEQ ID N° 49.

Expresion y purification de SHe-tGCN4, M2e-tGCN4, Fiag-COMPcc-SHe, mHBc y LPP(s>-SHe.

Se cultivo un precultivo de 30 ml de E. coli transformada con pLT32SHe-tGCN4 a 28 °C en caldo de Luria y se usd para inocular 1 litre de medio fresco. A una A600 de 0,6-0,8, las celulas se trataron con 1 mm de isopropil-1 -tiogalactopirandsido, se incubaron durante otras 4 horas y, a continuacion, se recogieron mediante centrifugacion (6000 <x> g, 20 min, 4 °C). El sedimento bacteriano se resuspendio en 20 ml de tampon Tris-HCI (Tris-Hcl 50 mM, NaCI 50 mM y EDTA 1 mM), pH 8, y se sonico. Los residuos bacterianos se sedimentaron por centrifugacion (20000 <x> g, 1 h, 4 °C). El sobrenadante se aplico a una columna de DEAE Sepharose previamente equilibrada con tampon Tris-HCI que contenia NaCI 50 mM (tampon A). Despues de lavar, las proteinas unidas se eluyeron mediante un gradiente en dos etapas que iba desde un 0-40 % de tampon B (Tris-Hcl 50 mM, NaCI 1 M) y un 40-100 % de tampon B. Se combinaron fracciones que contenian SHe-tGCN4, se ajustaron a una saturacion de un 25 % de sulfato de amonio, y se aplicaron a una columna de fenil-Sepharose previamente equilibrada con sulfato de amonio al 25 %, Tris-HCI 50 mm, pH 8. Las proteinas unidas se eluyeron con un gradiente en dos etapas. La elucion en dos etapas se realizo con un 0-40 y 40-100 % de tampon Tris-HCI 50 mM, pH 8 (tampon A). Las fracciones que contenian SHe-tGCN4 se cargaron en una columna Superdex 75. Se realizo filtracion en gel en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y las fracciones que contenian SHe-tGCN4 se combinaron y conservaron a -70 °C.

La expresion y purificacion de flag-COMPcc-SHe fue identica a SHe-tGCN4 aparte del uso de una columna de Q Sepharose para cromatografia de intercambio anionico en lugar de una columna de DEAE Sepharose.

La expresion y purificacion de M2e-tGCN4 se describio antes (De Filette et al., 2008). La expresion y purificacion de mHBc fue identica a SHe-tGCN4 aparte del uso de una columna Sephacryl S400 para cromatografia de filtracion em gel en lugar de una columna Superdex 75.

Expresion y purificacion de LPP(5>-SHe. Se cultivo un precultivo de 30 ml de celulas de E. coli transformadas con pLH36-HisDEVD-LPP(5)-SHe a 28 °C en caldo de Luria con ampicilina y se uso para inocular 3 litros de medio fresco. A una Asoo de 0,6-0,8, las celulas se trataron con isopropil-1 -tio-(B-d-galactopiranosido 1 mM, se incubaron durante otras 4 horas y, a continuacion, se recogieron mediante centrifugacion (6000 <x> g, 20 min, 4 °C). El sedimento bacteriano se resuspendio en 300 ml de tampon que contenia NaH2P04/Na2HP0420 mM, NaCI 300 mM e imidazol 5 mM, pH 7,5 y se sonico. Los residuos bacterianos se sedimentaron por centrifugacion (20000 * g, 1 h, 4 °C). El sobrenadante se cargo en una columna de niquel-Sepharose previamente equilibrada con tampon que contenia imidazol 5 mM. Despues de lavar, las proteinas unidas se eluyeron mediante un gradiente de imidazol en etapas (50 mM, 100 mM, 200 mM y 400 mM). Se combinaron fracciones que contenian LPP<5)-SHe, se desalaron y se purificaron ademas en una columna de Q-Sepharose. La muestra se aplico a una columna de DEAE Sepharose previamente equilibrada con tampon Tris-HCI que contenia NaCI 50 mM (tampon A). Despues de lavar, las proteinas unidas se eluyeron mediante un gradiente en dos etapas que iba desde un 0-40 % de tampon B (Tris-Hcl 50 mM, NaCI 1 ) y un 40-100 % de tampon. Las fracciones que contenian LPP(5)-SHe se cargaron en una columna Superdex 75. Se realizo filtracion en gel en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y las fracciones que contenian LPP(5)-SHe

Adyuvantes

Se uso un mutante bionactivado de enterotoxina de E. coli termolabil, LTR192G, para administracion intranasal (i n.); esta preparacion fue generosamente proporcionada por el Dr. J. Clements (Departamento de Microbiologia e Inmunologia, Tulane University Medical Center, Nueva Orleans, LA, EE. UU.) (Norton et al., 2010).

Enlace quimico y caracterizacion de particulas de She-HBc.

Se ordeno SHe(cc4s), un peptido de SHe purificado por HPLC sintetizado quimicamente en el que la cisteina natural se reemplazo por una serina y al que se le anadio una cisteina en el extremo N, a Pepscan (Pepscan, Lelystad). El peptido SHe(cc4s) se fusiono por medio de su residuo de cisteina N-terminal a una lisina en el bucle inmunodominante de mHBc en la superficie de las VLP de HBc mediante un enlace quimico usando el sulfo-MBS heterobifuccional (Pierce), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, 400 pg de mHBc, disueltos en 200 pi de PBS, se incubaron con Sulfo-MBS (a una concentracion final de 1 mg/ml) durante una hora. Despues de la retirada de moleculas de Sulfo-MBS no unidas mediante cromatografia de exclusion portamano, las VLP de mHBc unidas a sulfo-MBS se diluyeron en 2 ml de H20. Posteriormente, se le anadio 100 pi de peptido SHe(cc4s) (disuelto en 100 ml de PBS) y se incubo durante una hora a temperatura ambiente para permitir la reticulacion del peptido con las VLP de mHBc. Finalmente, se retiro el peptido SHe(cc4s) libre mediante cromatografia de exclusion por tamano. La pureza y eficacia de la reticulacion se sometio a prueba por medio de SDS-PAGE seguido de tincion con Coomassie.

Celulas

Se cultivaron celulas Hep-2 (ATCC, CCL-23), celulas Vero (ATCC, CCL-81), celulas HEK293T (un regalo del Dr. M. Hall) y celulas A549 ATCC, CCL-185) en medio DMEM complementado con de suero de ternera fetal (FCS) inactivado porcalor al 10 %, penicilina al 1 %, estreptomicina al 1 %, L-glutamina2 mM, aminoacidos no esenciales (Invitrogen, Carlsbad, Carlifornia) y piruvato de sodio 1 mM.

Ratones y virus.

Se obtuvieron ratones BALB/c hembra libres de patogenos especificos de Charles River (Charles River Wiga, Sulzfeld, Alemania). Los animales se alojaron en un ambiente de temperatura controlada con ciclos de luz/oscuridad de 12 h; se administraron alimentos y agua a voluntad. Se inmunizaron los ratones a las 8 semanas de edad despues de adaptacion durante 1 semana en la sala de los animales.

La instalacion para animales desarrolla su actividad con el numero de licencia del gobierno flamenco LA1400091. Todos los experimentos se realizaron en las condiciones especificadas por la ley (Directiva Europea y Real Decreto belga de 14 de noviembre de 1993) y fueron autorizados por el Comite de Etica Institucional sobre animales de experimentacion.

Se propago el VRS A2, un subtipo A del RSV, (ATCC, Rockville) infectando monocapas de celulas Vero, con 0,1 MOI en presencia de medio de crecimiento que contenia FCS al 1 %. De cinco a siete dias despues de la infeccion, las celulas y el medio de crecimiento se recogieron, se combinaron y se clarificaron por centrifugacion (450 x g). Para concentrar el virus, el sobrenadante clarificado se incubo durante 4 horas a 4 °C en presencia de polietilenglicol al 10% (PEG6000). Despues de la centrifugacion (30 minutos a 3000 x g), el sedimento se resuspendio en solucion salina equilibrada de Hanks (HBSS), que contenia sacarosa al 20 %, se dividio en partes alicuotas y se conservo a -80 °C.

Inmunizaciones e infecciones intranasales.

Para la inmunizacion o infeccion intranasal, se anestesio ligeramente a los ratones con isoflurano. El volumen final usado para la administracion de vacuna adyuvante o virus fue de 50 pi (25 pi por fosa nasal).

Se formularon vacunas adyuvante en PBS, mientras que el inoculo video se formulo en HBSS.

Determination del titulo video en los pulmones mediante analisis de calvas.

Tres o cuatro dias despues de la exposicion, los ratones fueron sacrificados. Los pulmones de los ratones se extrajeron asepticamente y se homogeneizaron con un homogeneizador Heidolph RZR 2020 durante 30 segundos en 1 ml de HBSS que contenia un 10 % de sacarosa. Los homogeneizados de pulmon se aclararon posteriormente mediante centrifugacion a 4 °C y se usaron para la titulacion del virus en celulas Hep-2. Se infectaron monocapas de celulas Hep-2 con 50 pi de diluciones 1:3 sucesivas de los homogeneizados de pulmon en una placa de 96 pocillos en medio OPTIMEM sin suero (Invitrogen) complementado con penicilina y estreptomicina. Cuatro horas mas tarde, las celulas se lavaron dos veces con medio DEMEM que contenia FCS al 2 % y se incubaron durante 5 dias a 37 °C en 50 pi de medio de recubrimiento (medio DEMEM completo que contenia FCS al 1 %, agarosa al 0,5 %). Las celulas se fijaron anadiendo 50 pi de una solucion de paraformaldehido al 4 % en la parte superior del recubrimiento de agarosa. Despues de fijacion durante la noche a 4 °C, se retiraron el medio de recubrimiento y la solucion de paraformaldehido, las celulas se lavaron dos veces con PBS y se bloquearon con PBS que contenia BSA al 1 % (PBS/BSA). Posteriormente, se anadio suero policlonal de cabra anti-VRS (AB1128, Chemicon International) (1/4000). Despues de lavar tres veces con PBS/BSA, las celulas se incubaron con anticuerpos contra IgG de cabra conjugados con HRP (SC2020, Santa Cruz) durante 30 minutos. Los anticuerpos no fijadores se retiraron lavando cuatro veces con PBS/BSA que contenia Triton-X100 al 0,01 % y una vez con PBS. Finalmente, las calvas se visualizaron mediante el uso de sustrato de peroxidasa TrueBlue (KPL, Gaithersburg). Se contaron las calvas de diferentes diluciones y para cada dilucion se calculo el numero de UFC por pulmon (1 ml) como: numero de calvas presentes en la dilucion x la dilucion x 20 (= 1000 pi de volumen de sobrenadante total/50 pi del volumen de sobrenadante usado para infectar el primer pocillo de la serie de dilucion). El numero de UFC/pulmon se calculo como el numero promedio de UFC/pulmon calculado para las diferentes diluciones. Como cada sobrenadante de los pulmones homogeneizados se sometio a prueba por duplicado, el numero final de UFC/pulmon se calculo como el promedio de estos duplicados.

Determination del titulo virico en los pulmones por qRT-PCR.

Para determinar la carga del VRS en los pulmones mediante qRT-PCR, se prepararon homogeneizados de pulmon y se clarificaron como se describe anteriormente. Se preparo ARN total de estos homogeneizados de pulmon mediante el uso del kit de tejido de ARN de alta pureza (Roche, Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparo ADNc mediante el uso de cebadores hexamericos y el kit de síntesis de ADNc Transcriptor First Strand (Roche, Mannheim). Los niveles relativos de ADNc genomico de M de VRS se determinaron mediante el uso de qRT-PCR usando cebadores especificos para el ARN genomico del gen M del VRS A2 (5TCACGAAGGCTCCACATACA3' y 5 CAGGGTCATCGTCTTTTTC3') y una

sonda de nucleotidos (n.° 150 Universal Probe Library, Roche) marcada con fluoresceina (FAM) en el extremo 5' y con un tinte oscuro extintor de fluorescencia cerca del extremo 3'. La cantidad relativa de ARNm de GADPH se determine mediante qRT-PCR usando cebadores especificos para GADPH de raton (5TGAAGCAGGCATCTGAGGG3' y 5 GAAGGTGGAAGAGTGGGAG3' y LightCycler 480 SYBR Green I Maseter Mix (Roche). La cantidad relativa de ARN genomico del VRS por homogeneizado de pulmon se calculo como la proporcion entre la cantidad relativa de ARN del gen M del VRS y la cantidad relativa de ARNm de GADPH de raton.

ELISA de peptidos

Dos semanas despues de cada inmunizacion, se recogieron muestras de sangre de la vena lateral de la cola. La sangria final se realizo mediante puncion cardiaca de animales anestesiados con avertina. La sangre se dejo coagular durante 30 minutos a 37 °C y se obtuvo suero tomando el sobrenadante de dos centrifugaciones posteriores.

Se determinaron los titulos de anticuerpos sericos mediante ELISA usando mezclas de sueros del grupo. Para determinar los titulos de anticuerpos especificos contra M2e o SHe, se recubrieron placas de microtitulacion (F96 MaxiSorp tipo II, Nunc) con 50 pi de una solucion de 2 pg/ml de peptido de M2e o solucion de 2 pg/ml de peptido de SHe en tampon de bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9.7, respectivamente, y se incubaron durante la noche a 37 °C. Despues de lavar, las placas se bloquearon durante 1 h con 200 pi de BSA al 1 % en PBS. Despues de 1 hora de incubacion, las placas se lavaron de nuevo. Una serie de diluciones 1/3 de las diferentes muestras de suero, comenzando con una dilucion 1/100, se cargaron en las placas recubiertas con peptido. Los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo marcado con peroxidasa dirigido contra los isotipos lgG1 o lgG2a de raton (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, EE. UU.) y se diluyeron 1/6000 en PBS BSA al 1 % Tween 20 al 0,05 %. Despues de lavar, las placas de microtitulacion se incubaron durante 5 minutos con sustrato TMB (tetrametilbenzidina, Sigma-Aldrich). La reaccion se detuvo mediante la adicion de un volumen igual de H3P04 1 M y se midio la absorbancia a 450 nm. Los titulos de punto final se definen como la dilucion mas alta que produce un valor de DO dos veces mayor que el del fondo (suero previo a la inmunizacion).

Analisis citometrico de flujo.

Se transfectaron celulas Hek293T con los vectores de expresion indicados. Veinticuatro horas despues, las celulas se separaron usando un tampon de disociacion libre de enzimas (Invitrogen, Carslbad, California), se lavaron una vez con PBS y se incubaron durante una hora en PBS que contenia BSA al 1 % (PBS/BSA). Posteriormente, las celulas se incubaron con el suero o anticuerpos indicados en las concentraciones indicadas. Una hora despues, las celulas se lavaron 3 veces con PBS/BSA y se incubaron con los anticuerpos secundarios contra IgG de raton Alexa 633 durante 30 minutos. Despues de lavar las celulas cuatro veces con PBS/BSA y una vez con PBS, las celulas se analizaron utilizando un citometro de flujo Becton Dickinson LSR II. Se seleccionaron celulas individuales que expresaban GFP en base a

la superficie del pico de la serial de dispersion lateral, la superficie del pico y la altura del pico de la serial de dispersion frontal y la superficie del pico de la serial de fluorescencia verde. Finalmente, de estas celulas individuales GFP positivas, se midio la serial de fluorescencia de alexa 633.

Inmunotincion

Se infectaron celulas Vero con inoculos inactivados o con 0,5 MOI de VRS A2 en presencia de medio sin suero. Cuatro horas despues, el virus libre se lavo y las celulas se incubaron en medio de crecimiento que contenia FCS al 1 %. Dieciseis horas despues, las celulas se lavaron una vez con PBS y se fijaron con paraformaldehido al 2 % durante 20 minutos. Posteriormente, las celulas se lavaron dos veces con PBS y se permeabilizaron con detergente Triton-X100 al 0,2% durante 5 minutos. Despues de lavar una vez con PBS, las celulas se bloquearon en PBS/BSA. Una hora despues, se le anadio anticuerpo monoclonal 3G8 especifico contra She o anticuerpo de control por isotipo a una concentracion final de 5 pg/ml. Despues de lavar las celulas dos veces con PBS/BSA se le anadio suero de cabra anti-VRS policlonal. Una hora mas tarde, las celulas se lavaron tres veces con PBS/BSA. La union de los anticuerpos indicados a las celulas se analizo mediante el uso de anticuerpos contra IgG de raton y de cabra marcados con los tintes fluorescentes alexa 488 y alexa 568, respectivamente. Se registraron imagenes confocales de las celulas tenidas con un microscopio confocal Zeiss.

Generation de hibridomas que producen AcM contra SHe

Se generaron celulas de hibridoma estables que producian anticuerpos monoclonales especificos contra SHe (AcM) mediante tecnologia de hibridoma (Kohlery Milstein 1975). Brevemente, se derivaron hibridomas especificos de SHe de ratones individuales que se inmunizaron i.p. tres veces a intervalos de tres semanas con 10 pg de la vacuna SHe-tGCN4 con Alhydrogel como adyuvante (Brenntag Biosector). Tres dias antes de la fusion, se administro refuerzo a los ratones un tiempo adicional con la misma formulacion y se aislaron esplenocitos que, a continuacion, se fusionaron con celulas de mieloma SP2/0-Ag14 en presencia de PEG 1500 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Las celulas fusionadas se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con suero fetal bovino al 10%, BM condimed HI al 10% (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), L-glutamina 2 mM, y betamercaptoetanol 24 pM y suplemento 1x HAT (Invitrogen, Carlsbad, Carlifornia). Se identificaron hibridos que secretaban anticuerpos especificos contra SHe mediante cribado con ELISA de peptidos de SHe y se obtuvieron anticuerpos monoclonales que producian hibridos despues de dos rondas de subclonacion mediante un procedimiento de dilucion limitante. Los anticuerpos monoclonales se purificaron en una columna de proteina A-Sepharose (ingenieria electrica, biociencias).

Los hibridomas resultantes se depositaron segun el tratado de Budapest en BCCM (BCCM/LMBP: Technologiepark 927, 9052 Zwijnaarde, Belgica) con los numeros de deposito LMBP 7795CB para 3G8 el 8 de noviembre de 2010 y LMBP 7796CB para 3D11 el 10 de noviembre de 2010, respectivamente.

Ejemplo 1: Diseno, expresion y purificacion de Flag-COMPcc-She

La proteina SH se expresa en la superficie de viriones del VRS y la membrana plasmatica de celulas infectadas por el VRS como un pentamero. La organizacion pentamericana de SH esta organizada por el dominio transmembranario de SH, que se oligomeriza como una superhelice de 5 helices alfa paralelas. Para presentar el ectodominio de SH C-terminal (SHe) del VRS A como un pentamero que imita su conformacion natural, SHe se fusiono geneticamente con el dominio corto de la superhelice pentamerica de la proteina oligomerica de la matriz cartilaginosa de rata (COMPcc) que tambien esta compuesta por 5 helices alfa paralelas (Malashkevich et al., 1996; Figura 1). Se fusiono un epitopo Flag con el extremo N de COMP, dando Flag-COMPcc-SHe. Flag-COMPcc-SHe se clono en un vector de expresion pLT-32 (Mertens et al., 1995), se expreso en E. coliyse purified. El analisis por filtracion en gel revelo que Flag-COMPcc-SHe se eluyo como un complejo de 55-60 kDa, lo que indica que las proteinas Flag-COMPcc-SHe de 11 kDa si se oligomerizan, de hecho, en pentameros (Figura 2).

Ejemplo 2: La vacunacion con Flag-COMPcc-SHe induce anticuerpos especificos contra SHe y proteccion contra infecciones por el VRS

Para someter a prueba si la vacunacion con Flag-COMPcc-SHe podia evocar proteccion contra la infeccion por el VRS, usamos un modelo de infeccion por el VRS en raton BALB/c. Se inmunizaron ratones BALB/c tres veces por via intranasal con 25 pg de Flag-COMPcc-SHe en combinacion con 1 pg de adyuvante LTR192G de enterotoxina termolabil de E. coli. Como controles negativos se usaron PBS y el ectodominio M2 de Influenza A fusionado a un supercontigo de GNC4 tetramerico (M2e-tGNC4) (De Filette et al., 2008). Las inmunizaciones se realizaron cada quince dias. Se usd una unica infeccion por el VRS (5 * 105 UFC) como control positivo. Entre la primera y la segunda semana despues de cada inmunizacion, se recogio sangre para investigar la induccion de anticuerpos IgG especificos contra SHe. La presencia de anticuerpos especificos contra SHe se sometio a prueba por primera vez mediante ELISA de peptidos de SHe. Se usd ELISA de peptido de M2e como control negativo. La figura 3 demuestra que los anticuerpos IgG especificos contra el peptido de SHe se inducen y refuerzan, respectivamente, despues de la segunda y tercera inmunizacion con Flag-COMPcc-SHe. Tres inmunizaciones de Flag-COMPcc-SHe/LTR192G sucesivas dieron como resultado niveles altos de anticuerpos lgG2a especificos contra SHe, pero solo niveles bajos de anticuerpos lgG1 especificos contra SHe, lo que indica una respuesta inmunitaria orientada/impulsada por Th 1. No se pudieron detectar anticuerpos IgG especificos contra SHe en ratones vacunados con PBS o M2e-tGCN4/LTR192G (Figura 3A, B y C). Como se esperaba, no se pudieron detectar anticuerpos especificos contra M2e en los sueros de los datos de ratones vacunados con Flag-COMPcc-SHe/LTR192G o PBS. Los ratones que fueron inmunizados con M2e-tGCN4 acumularon un titulo alto de anticuerpos lgG2a especificos contra M2e, de acuerdo con los resultados anteriores (De Filette et al., 2008).

A continuacion, investigamos si anticuerpos especificos contra SHe presentes en el antisuero de Flag-COMPcc-SHe podian unirse a celulas que expresaban la proteina SH del VRS en su superficie mediante citometria de flujo. Se transfectaron celulas HEK-293T con un vector de expresion GFP, en combinacion con un vector de expresion de SH (pCAGGS-Etag-SH) o un vector de expresion de luciferasa (pCAGGS-Luc)

como control negativo. Veinticuatro horas despues de la transfeccion, las celulas se separaron, se tineron con diferentes diluciones de antisuero de Flag-COMPcc-SHe o M2e-tGCN4 y se analizaron mediante citometria de flujo. La figura 4 ilustra que, a diferencia del antisuero de M2e-tGCN4, el suero de ratones vacunados con Flag-COMPcc-SHe se une especificamente a la proteina SH expresada en la superficie de las celulas vivas.

Para someter a prueba si la vacuna Flag-COMPcc-SHe/LTR192G puede provocar proteccion contra la infeccion por el VRS, los ratones fueron expuestos a 1 * 106 UFC de VRS A2, nueve semanas despues de la ultima inmunizacion. Cuatro dias despues de la infeccion, se sacrificaron los ratones para determinar el titulo virico en los pulmones mediante analisis de calvas. La figura 5 ilustra que, en comparacion con los ratones vacunados con PBS y M2e-tGCN4, la vacunacion con Flag-COMPcc-SHe redujo la replicacion del VRS. No se detecto ningun virus en el raton que fue infectado por VRS vivo antes de la exposicion.

Es bien conocido que la vacunacion con virus inactivado con formol o proteina G del VRS puede inducir la potenciacion de la enfermedad tras la infeccion, lo que da como resultado una morbilidad significativa, por la induccion de una respuesta inmunitaria de Th2 desequilibrada (Prince et al., 1986). Para someter a prueba si tambien la vacunacion con Flag-COMPcc-SHe podria inducir una potenciacion de la enfermedad, monitorizamos el peso corporal antes y despues de la exposicion al VRS (Figura 6). No se observo perdida de peso en ninguno de los grupos de ratones despues de la exposicion al VRS. Esto sugiere firmemente que la vacunacion con Flag-COMPcc-SHe no da como resultado una potenciacion de la enfermedad tras la infeccion por el VRS.

Ejemplo 3: Diseno, construccion y purificacion de mHBc-SHe

La particula similivirica (VLP) de proteina del nucleo del virus de la hepatitis B (HBc) puede presentar antigenos como una matriz densa. De este modo, mHBc-VLP pueden inducir una fuerte respuesta inmunitaria humoral hacia el antigeno presentado (Boisgerault et al., 2002). Por lo tanto, como alternativa a la presentacion de SHe como un pentamero, se presento el ectodominio de SH en el bucle de la region inmunodominante de mHBc-VLP. Se obtuvieron HBc-SHe-VLP mediante enlace quimico de peptidos de SHe con mHBc, un mutante de HBc en el que se introdujo una lisina en la parte superior de la region inmunodominante de HBc (De Filette et al., 2005). Para permitir el enlace quimico, se le anadio un residuo de cisteina al extremo N de SHe. Ademas, el residuo de cisteina, presente en la posicion 4 del peptido de SHe, se reemplazo por un residuo de serina. Este peptido se llamaba SHe-CC4S. Despues de la purificacion de las mHBc-SHe-VLP, mediante cromatografia de exclusion portamaho, se examino el grado de reticulacion mediante SDS PAGE. La figura 7 ilustra que aproximadamente un 50 % de las proteinas HBc esta unido quimicamente a un peptido SHe-CC4S. Las bandas de migracion mas lenta probablemente representan monomeros mHBc a los que se unieron 2 o 3 peptidos SHe(cc4s). Para someter a prueba si las proteinas mHBc unidas a SHeCC4S todavia se ensamblan en VLP del tamano esperado (30-34 nm), se realizaron analisis de dispersion dinamica de la luz en las particulas de mHBc-SHe generadas y la VLP 1604 M2e-HBc como referenda completamente funcional. La figura 8 ilustra que la distribucion por tamano de mHBc-SHe-CC4S se superpone con la del control 1604 M2e-HBc, con un maximo a 30 nm, que se corresponde con el tamano informado de las VLP de HBc (Clarke et al., 1987).

Ejemplo 4: Diseno, construccion y depuracion de SHe-tGCN4-Flag

Ademas de presentar el peptido de SHe en la superficie de las VLP de mHBc, SHe se fusiono tambien con tGCN4, que es conocido que induce una fuerte respuesta humoral hacia peptidos fusionados (Ref marina GCN4). SHe y un epitopo Flag se unieron geneticamente a los extremos 5' y 3', respectivamente, de la secuencia codificante de tGCN4 y se clonaron en un vector de expresion PLT32. Despues de la expresion en E. coli, se purified SHe-tGCN4-Flag recombinante mediante cromatografia de intercambio anionico, de interaccion hidrofoba y de filtracion en gel (Figura 9).

Ejemplo 5: La vacunacion con mHBc-SHe(CC4S) y SHe-tGCN4 induce anticuerpos especificos contra SHe y proteccion frente a infecciones por el VRS

Para someter a prueba si la vacunacion con mHBc-SHe(CC4S) y SHe-tGCN4 puede evocar proteccion frente a infecciones por el VRS, se vacunaron ratones Balb/c tres veces por via intranasal con 10 pg de mHBc-SHe(CC4S) y SHe-tGCN4 en combinacion con 1 ug de adyuvante LTR192G. Se usaron PBS y mHBc vacio, este ultimo en combinacion con 1 ug de LTR192G, como controles negativos. Las inmunizaciones se realizaron cada 3 semanas. Una sola infeccion por el VRS (5. 105 UFC) se usd como control positivo. Entre la segunda y la tercera semana despues de cada inmunizacion, se recogio sangre para investigar la induccion de anticuerpos IgG especificos contra SHe. La presencia de anticuerpos especificos contra SHe se sometio a prueba mediante ELISA de peptidos de SHe. La figura 10A demuestra que los anticuerpos IgG especificos contra el peptido de SHe se inducen y refuerzan, respectivamente, despues de la segunda y tercera inmunizacion con mHBc-SHe(CC4S) y SHe-tGCN4. Tres inmunizaciones de Flag-COMPcc-SHe/LTR192G sucesivas dieron como resultado niveles altos de anticuerpos lgG2a especificos contra SHe y niveles algo mas bajos de anticuerpos lgG1 especificos contra SHe, lo que indica una respuesta inmunitaria orientada/impulsada porThl (Figura 10 B).

Para someter a prueba si la vacunacion con mHBc-SHe(CC4S) o SHe-tGCN4 puede obstaculizar la infeccion por el VRS, se expuso a los ratones a 5.106 UFC de VRS-A23 semanas despues de la ultima inmunizacion de refuerzo. Tres dias despues de la exposicion, se sacrificaron los ratones para determinar los niveles de VRS-A2 en los pulmones mediante «PCR. La figura 11 muestra que todos los ratones que fueron vacunados con mHBcSHe(CC4S) o SHe-tGCN4 o los ratones que se infectaron previamente por el VRS tienen niveles pulmonares mas bajos de ARN genomico del VRS que los ratones que fueron vacunados con mHBc. Estos datos confirman nuestra observacion anterior de que la vacunacion basada en SHe mucosa puede proteger parcialmente a los ratones frente a la replicacion del VRS. Sorprendentemente, todos los ratones que fueron vacunados con un mHBc vacio en combinacion con el adyuvante LTR192G mostraron niveles mas bajos de VRS que los ratones que fueron inmunizados con PBS sin adyuvante LTR192G. Esto podria explicarse por el efecto de

LTR192G en el sistema inmunitario innato del raton. Se ha demostrado que la enterotoxina termolabil de E. coli proporciona proteccion generica frente a las infecciones vincas pulmonares, incluyendo el VRS por medio de la impronta innata (ref. Williams y Hussel 2004). El efecto de la impronta innata por LTR192G en la replicacion vinca pulmonar parece ser pasajero, ya que el impacto de TLR192R en la replicacion del VRS se reduce fuertemente cuando la infeccion vinca se produce nueve semanas despues de la ultima administracion de LTR192G. Nuevamente, ninguno de los ratones mostro una perdida significativa de peso corporal, lo que indica que la vacunacion con SHe cuando se presents mediante VLP o tGCN4 no esta induciendo potenciacion de la enfermedad tras la exposicion (Figura 12).

Ejemplo 6: Produccion y sometimiento a prueba de anticuerpos monoclonales especificos contra SHe.

Para investigar si anticuerpos especificos contra SHe que pueden interactuar con celulas infectadas pueden proporcionar proteccion contra infecciones por el VRS, desarrollamos anticuerpos monoclonales especificos contra SHe basados en ratones inmunizados con SHe-TGCN4. Para la produccion de anticuerpos, se seleccionaron, subclonaron y usaron un hibridoma de subtipo lgG1 (3D11) y uno de lgG2a (3G8) que producian anticuerpos que se unian eficazmente al peptido de SHe en un ELISA. Los 3D11 y 3G8 se purificaron por medio de cromatografia de afinidad con proteins A y se sometieron a prueba para determinar la eficacia de union a SHe por medio de un ELISA. La figura 13 muestra que 3D11 y 3G8 se pueden unir al peptido de SHe recubierto y son, respectivamente, del subtipo lgG1 e lgG2a.

Como los anticuerpos pueden proteger contra infecciones vincas mediante el reconocimiento y la destruccion de celulas infectadas por (ADCC) o CDC, investigamos si los AcM 3D11 y 3G8 especificos contra SHe pueden reconocer SH en la superficie de las celulas. Por lo tanto, se transfectaron celulas Hek293T con un vector de expresion de SH del VRS o con un vector de luciferasa Firefly de control (Schepens et al., 2005), ambos en combinacion con un vector de expresion de GFP. Veinticuatro horas despues de la transfeccion, se tineron celulas vivas con diferentes concentraciones de los anticuerpos monoclonales especificos contra SHe (3D11 y 3G8) o los anticuerpos especificos contra M2e de la gripe emparejados por isotipo (lgG1 14C2 y un AcM IG2a especifico contra M2e). Se uso suero policlonal de ratones inmunizados con Flag-COMPcc-SHe como control positivo. La figura 14 demuestra que el suero policlonal con Flag-COMPcc-SHe, pero tambien los AcM 3D11 y 3G8 se pueden unirfacilmente a celulas que expresan SH pero no a celulas de control. Por el contrario, ninguno de los anticuerpos lgG1 e lgG2a especificos contra M2e de la gripe se podian unirse a celulas que expresan SH. Estos datos demuestran claramente que tanto 3D11 como 3G8 pueden reconocer el ectodominio de SH expresado en la superficie de las celulas.

Durante la infeccion, la proteina SH del VRS se expresa principalmente en el RE, el aparato de Golgi y la membrana celular. Por eso, para investigar mas directamente si los anticuerpos especificos contra SH del VRS pueden reconocer celulas infectadas por medio de SH, expresada en la superficie de estas celulas, realizamos inmunotincion de celulas infectadas por el VRS e infectadas con inoculos inactivados. Se infectaron celulas epiteliales pulmonares A594 humanas con 0,05 MOI de VRS o se infectaron con inoculos inactivados. Veinticuatro horas despues de la infeccion, las celulas se fijaron y se tineron con los AcM 3D11 o 3G8 especificos contra SHe en combinacion con antisuero policlonal anti-VRS.

La figura 15 ilustra que los AcM especificos contra SHe 3D11 y 3G8 pueden reconocer facilmente la SH en la membrana celular y cerca del nucleo (probablemente correspondiente al RE y el aparato Golgi) de las celulas infectadas. Esto indica que los AcM contra SHe protegen contra la infeccion por el VRS al reconocer las celulas infectadas por el VRS. De esta manera, los AcM contra SHe 3D11 y 3G8 descritos en el presente documento se pueden usar como tratamiento profilactico o terapeutico.

Ejemplo 7: La inmunizacion pasiva usando el AcM 3G8 especifico contra SHe reduce la replicacion del VRS.

Para someter a prueba si anticuerpos especificos contra SHe pueden reducir la replicacion del VRS in vivo, se inmunizaron ratones pasivamente con anticuerpos monoclonales especificos contra SHe. Se administraron por via intranasal anticuerpos monoclonales 3G8 especificos contra SHe, anticuerpos de control por isotipo o PBS a ratones un dia antes y un dia despues de la exposicion al VRS. Tres dias despues de la exposicion al VRS, se recogio sangre para someter a prueba la presencia de AcM en el suero de los ratones tratados. Cuatro dias despues de la exposicion al VRS, los ratones se sacrificaron para determinar el titulo video en los pulmones. Un ELISA de peptidos demostro la presencia de concentraciones bajasde anticuerpos especificos contra SHe y de control por isotipo en el suero de ratones tratados con los anticuerpos respectivos (datos no mostrados). La figura 16 ilustra que los ratones que recibieron anticuerpos monoclonales especificos contra SHe tienen titulos reducidos de VRS en los pulmones en comparacion con los ratones que se trataron con PBS o anticuerpos monoclonales de control por isotipo. Estos datos sugieren que la administracion intranasal de anticuerpos especificos contra SHe puede reducir la infeccion por el VRS en ratones.

Ejemplo 8: construction de SHe-KLH

Para someter a prueba si las vacunas basadas en SHe tambien pueden proteger contra infecciones por el VRS cuando esta vacuna se administra por medio de una ruta alternativa con un adyuvante alternative y con un vehiculo diferente, la vacuna se sometio a prueba por via intraperitoneal, con hemocianina de lapa californiana (KLH) como vehiculo. Se unio quimicamente KLH activada con maleimida (Pierce) al peptido fCGGGSNKLSEYNVFHNKTFELPRARVNT (SEQ ID N° 50); la secuencia correspondiente al ectodominio de SH (SHe) del VRS A esta subrayada) correspondiente al ectodominio de SH del VRS A. Para promover el enlace quimico direccional, se le anadio un conector CysGlyGlyGlySer al extremo N del peptido de SHe del VRS A. Ademas, el residuo de cisteina presente en la SHe del VRS A natural se sustituyo por un residuo de serina. El enlace quimico se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce). Las proteinas KLH-SHe reticuladas se aislaron mediante cromatografia de exclusion portamano.

Ejemplo 9: La vacunacion intraperitoneal con KLH-SHe reduce la replicacion del VRS en ratones.

Para someter a prueba si la vacunacion intraperitoneal (i.p.) con una vacuna basada en SHe puede evocar proteccion contra infecciones por el VRS, se vacunaron ratones Balb/c (seis ratones por grupo) tres veces por via intraperitoneal con 20 pg de KLH-SHe o KLH, cada uno en combinacion con 50 pi de adyuvante incomplete de Freund (Milipore). Se uso vacunacion con PBS sin adyuvante como un control negativo adicional. Entre la segunda y tercera semana despues de la vacunacion, se recogio sangre para determinar la induccion de anticuerpos IgG especificos contra SHe. La presencia de anticuerpos especificos contra SHe se determino y cuantifico mediante el ELISA del peptido de SHe. La figura 17 (AB) demuestra que 3 vacunaciones sucesivas con KLH-SHe inducen niveles altos de anticuerpos IgG especificos contra SHe tanto del subtipo lgG1 como del lgG2a. No se pudieron detectar anticuerpos IgG especificos contra SHe en sueros de ratones vacunados con PBS o KLH. Ademas, el analisis citometrico de flujo revelo que el suero derivado de ratones que se habian vacunado por via intraperitoneal con KLH-SHe se puede unir especificamente a celulas HEK293T que expresan la proteina SH del VRS en su superficie, mientras que el suero previo a la inmunizacion no lo hacia.

Para someter a prueba si la vacunacion intraperitoneal con KLH-SHe puede reducir la infeccion por el VRS, los ratones vacunados se infectaron con 1.106 UFC de VRS-A2, 4 semanas despues de la ultima vacunacion. Cinco dias despues de la exposicion, se sacrificaron los ratones para determinar el titulo de VRS-A2 en los pulmones mediante analisis de calvas. La figura 17D ilustra que se pudo detectar significativamente menos virus en los pulmones de los ratones vacunados con SHe-KLH que en los pulmones de los vacunados con KLH (p >0,005, prueba de la U de Mann-Whitney). La observacion de que, entre los ratones vacunados con KLH-SHe, los titulos mas altos de anticuerpos sericos IgG especificos contra SHe se correlacionaron fuertemente (R2 = 0,95) con niveles mas bajos de VRS en los pulmones el dia 5 posterior a la infeccion sugiere que la reduccion de la replicacion del VRS por la vacunacion con KLH esta mediada por anticuerpos especificos contra SHe (Figura 17E). El peso corporal de todos los ratones se monitorizo el dia de la infeccion y el dia del sacrificio. La figura 17C ilustra que los ratones que fueron vacunados con KLH-SHe ganaron significativamente mas peso que los ratones que fueron vacunados con KLH (p >0,005, prueba de la U de Mann-Whitney). Estos datos demuestran que la vacunacion intraperitoneal con una vacuna basada en SHe puede reducir la replicacion del VRS sin inducir morbilidad. Ademas, estos datos ilustran que junto con mHBc, tGCN4 y COMPcc, tambien se puede usar KLH como vehiculo de proteinas para vacunas basadas en peptido de SHe. Ademas, estos datos ilustran que, junto con Titermax, tambien se puede usar adyuvante incomplete de Freund como adyuvante apropiado para inducir inmunidad especifica contra SH.

Ejemplo 10: La vacunacion intranasal con KLH-SHe reduce la replicacion del VRS en ratones.

Para someter a prueba si la vacunacion intranasal con KLH-SHe puede evocar proteccion contra infecciones por el VRS, se vacunaron ratones Balb/c (seis ratones por grupo) tres veces por via intransal con 20 pg de KLH-SHe o KLH, cada uno en combinacion con 1 pg de adyuvante LTR192G. Se uso vacunacion con PBS sin adyuvante como un control negativo adicional. Entre la segunda y tercera semana despues de la vacunacion, se recogio sangre para investigar la induccion de anticuerpos IgG especificos contra SHe.

La presencia de anticuerpos especificos contra SHe se sometio a prueba mediante ELISA de peptidos de SHe. La figura 18 (AB) demuestra que 3 vacunaciones sucesivas con KLH-SHe inducen anticuerpos IgG especificos contra SHe tanto del subtipo lgG1 como del lgG2a. No se pudieron detectar anticuerpos IgG especificos contra SHe en sueros de ratones vacunados con PBS o KLH. Ademas, el analisis citometrico de flujo revelo que el suero derivado de ratones que se vacunaron por via intranasal con suero de KLH-SHe, pero no suero previo a la inmunizacion, se puede unir especificamente a celulas HEK293T que expresan la proteina SH del VRS en su superficie.

Para someter a prueba si la vacunacion intraperitoneal con KLH-SHe puede reducir la infeccion por el VRS, los ratones vacunados se infectaron con 1.106 UFC de VRS-A2, 9 semanas despues de la ultima vacunacion. Cinco dias despues de la exposicion, se sacrificaron los ratones para recoger liquido de LBA (lavado broncoalveolar) (3 ml). El titulo de VRS-A2 en los liquidos de LBA recogidos se determino mediante analisis de calvas. La figura 18E ilustra que se pudo detectar significativamente menos virus en los pulmones de los ratones vacunados con KLH-SHe que en los pulmones de los vacunados con KLH (p >0,05, prueba de la U de Mann-Whitney). La presencia de anticuerpos IgA e IgG especificos contra SHe en los liquidos de LBA recogidos se analizo mediante ELISA de peptido de SHe. Este analisis revelo que, por el contrario que en los ratones vacunados con PBS y KLH, los liquidos del LBA de los ratones vacunados con KLH-SHe contenian anticuerpos especificos contra SHe tanto IgG como IgA (Figura 18C-D). Los niveles de anticuerpos IgG especificos contra SHe presentes en el liquido de LBA de ratones vacunados con KLH-SHe se correlacionaron con los niveles de anticuerpos IgG especificos contra SHe en el suero de los ratones respectivos. La observacion de que, entre los ratones vacunados con KLH-SHe, titulos mas altos de anticuerpos IgG especificos contra SHe presentes en el liquido de LBA se correlacionan fuertemente (R2 = 0,97) con titulos mas bajos de VRS en los pulmones el dia 5 posterior a la infeccion sugiere que la reduccion de la replicacion del VRS por la vacunacion con KLH esta mediada por anticuerpos especificos contra SHe (Figura 18 F). Estos datos demuestran que la vacunacion intranasal con una vacuna basada en SHe puede reducir la replicacion del VRS sin inducir morbilidad. Ademas, estos datos confirman que, junto con mHBc, tGCN4 y COM Pec, tambien se puede usar KLH como vehiculo de proteinas para vacunas basadas en peptido de SHe.

Ejemplo 11: La transferencia pasiva de antisuero de KLH-SHe protege contra la infeccion por el VRS en ratones.

Para investigar mas a fondo si la reduccion de la replicacion del VRS, en ratones que han sido vacunados con una vacuna basada en SHe, puede estar mediada por anticuerpos especificos contra SHe del VRS, se realizaron experimentos de transferencia pasiva. Se vacunaron por via intraperitoneal ratones Balb/c con 20 pg de KLH-SHe o KLH, ambos en combinacion con 75 pi de adyuvante incompleto de Freund. Como control negativo adicional, se vacunaron ratones con PBS sin adyuvante. El ELISA de peptido de SHe ilustro que los sueros de todos los ratones que se habian vacunado con KLH-SHe contienen altos niveles de anticuerpos IgG especificos contra SHe. Despues de la sangria final, los sueros de los ratones de cada grupo se mezclaron y se inactivaron por calor a 56 °C durante 30 minutos. Para someter a prueba si sueros con KLH-SHe pueden proteger contra infecciones por el VRS, se administraron 40 pi de sueros con KLH o KLH-SHe a ratones por via intranasal un dia antes (dia -1) y un dia despues (dia 1) de la exposicion al VRS (2.105 UFC) (dia 0). Como controles adicionales se incluyeron ratones que fueron tratados con PBS. El peso de todos los ratones se monitorizo diariamente (Figura 19C). Cinco dias despues de la infeccion, se sacrificaron los ratones para preparar homogeneizados de pulmon. El analisis del analisis de calvas demostro que los homogeneizados de pulmon de ratones que habian sido tratados con suero de KLH-SHe contenian aproximadamente 40 veces menos (proporcion de medias de titulos videos) virus replicante que los homogeneizados de pulmon originados de ratones tratados con suero de KLH (Figura 19 B). La observacion de que el titulo de VRS en los pulmones de los ratones tratados con suero de KLH no difirio del titulo de VRS en los pulmones de los ratones tratados con PBS ilustra que la administracion de suero de control no afecta a la replicacion pulmonar del VRS en ratones.

Ejemplo 12: construccion de mHBc-SHeB

Aunque altamente conservadas dentro de su subtipo, las secuencias de aminoacidos de SHe de los virus B del VRS difieren de las de los virus del subtipo A del VRS. Por lo tanto, como proteccion contra los virus B del VRS, una vacuna basada en SHe los mas probablemente deba incluir la secuencia de aminoacidos de SHe de VRS B.

Se construyo una vacuna con SHe de VRS B mediante union quimica del peptido consenso de SHe del VRS B (SHeB: CGGGSNKLSEHKTFSNKTLEQGQMYQINT (SEQ ID N° 51) con las particulas similiviricas de mHBc. Para promover el enlace quimico, se le anadio un conector CysGlyGlyGlySer al extremo N del peptido de SHe del VRS B. Ademas, el residuo de cisteina presente en la SHe del VRS B natural se sustituyo por un residuo de serina. El inmunogeno resultante del enlace quimico del peptido de SHe del VRS B con mHBc se denomino mHBc-SHeB. Despues de la purificacion de las VLP mHBc-SHeB mediante cromatografia de exclusion portamano, se analizo el grado de reticulacion mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE y tincion con Commassie. La figura 20 ilustra que mas de la mitad de los monomeros de HBc estan reticulados con al menos un peptido de SHe.

Ejemplo 13: La inmunizacion de ratones con mHBc-SHeB induce AcM especificos contra SHeB quese unen a la superficie de celulas infectadas por VRS B.

Para someter a prueba si VLP mHBc-SHeB eran inmunogenas, se inmunizo a un raton BALB/c por via subcutanea tres veces con 20 pg de mHBc-SHeB combinado con 50 pi de Titermax (Sigma). Las tres inmunizaciones se realizaron con intervalos de dos semanas. Se realizaron sangrias un dia antes de cada inmunizacion y dos semanas despues de la inmunizacion final. Para someter a prueba si el antisuero de mHBc-SHeB puede reconocer proteinas SH de VRS B expresadas en la superficie de celulas infectadas, se infectaron celulas Vero bien con inoculos inactivados o con una cepa clinica de virus B del VRS (amablemente proporcionado por el Dr. Marc van Ranst, Universidad de Lovaina, Lovaina, Belgica). Setenta y dos horas despues de la infeccion, las celulas se fijaron y bien se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % o no se permeabilizaron. A continuacion, las celulas se tineron con antisuero de mHBc-SHeB (dilucion 1/100) o antisuero de control (dilucion 1/100) derivado de ratones BALB/c que habian sido vacunados con KLH (suero de KLH) en combinacion con adyuvante incomplete de Freund. Las muestras se analizaron mediante microscopia de inmunofluorescencia o citometria de flujo. La figura 21A y B ilustra que el antisuero de mHBc-SHeB puede unirse a celulas infectadas por el VRS B permeabilizadas y no permeabilizadas pero no a celulas no infectadas. Por el contrario, el antisuero de control no se unio a celulas infectadas por el VRS B. Esto demuestra que la vacunacion de ratones con mHBc-SHeB induce anticuerpos sericos que pueden reconocer celulas infectadas por el VRS B, lo mas probablemente mediante la union a la proteina SH del VRS B que se expresa en la superficie de celulas infectadas por el VRS B.

Ejemplo 14. La inmunizacion con mHBc-SHeB reduce la replicacion del VRS en ratones.

Para someter a prueba si la vacunacion con mHBc-SHeB puede proteger a los ratones de la infeccion por el VRS B, se inmunizaron dos grupos de 6 ratones con VLP de mHBc o mHBc-SHeB, con 50 pi de adyuvante incomplete de Freund como adyuvante. Como controles adicionales, se vacunaron seis ratones con PBS. Las vacunaciones se realizaron por via intraperitoneal, tres veces con un intervalo de tres semanas. Se realizaron sangrias dos semanas despues de cada inmunizacion. La induccion de anticuerpos especificos contra SHe se determino mediante ELISA de peptidos usando SHeA o SHeB como peptidos de recubrimiento. Este analisis demostro que, en todos los ratones, tres inmunizaciones sucesivas con mHBc-SHeB indujeron titulos elevados de anticuerpos IgG especificos contra She del VRS B de ambos subtipos lgG1 e lgG2a (Figura 22A-C). El antisuero de mHBc-SHeB tambien se unio al peptido SHeA pero en una extension mucho menor (Figura 22A, B y D).

Experimentos previos en nuestro laboratorio y en otros laboratorios han ilustrado que se puede rescatar nada o muy poco del virus replicante en los ratones infectados por el VRS B. No obstante, pudimos observar que las infecciones por cepas clinicas del VRS B inducen inflamacion pulmonar y delgazamiento en ratones BALB/c (datos no mostrados). Por lo tanto, sometimos a prueba si la vacunacion con mHBc-SHeB podia proteger a los ratones de la inflamacion pulmonar inducida por el VRS B. Seis dias despues de la exposicion intranasal de ratones con 2.106 UFC de una cepa clinica del VRS B, se realizo un lavado broncoalveolar (LBA). Se usaron ratones infectados con inoculos inactivados como control negativo para el analisis de la infiltracion celular en el LBA. El liquido del LBA se analizo para determinar la infiltracion de celulas inmunitarias mediante citometria de flujo, como se describe en Bogaert et al., 201 1. La figura 22E-F muestra que la infeccion por el VRS B da como resultado la infiltracion pulmonar de celulas inmunitarias, especialmente linfocitos T CD8+ que son conocidos como responsables de la morbilidad inducida por el VRS en ratones. Sin embargo, en comparacion con los ratones vacunados con PBS o mHBc, los ratones vacunados con mHBc-SHeB mostraron una infiltracion celular pulmonar significativamente menor. Estos datos demuestran que la vacunacion con mHBc-SHeB reduce la patologia inmunitaria relacionada con el VRS.

Ejemplo 15: diseno, expresion y purificacion de la proteina LPP(5)-SHe.

Como supercontigo de proteinas alternativo para presentar SHe como un pentamero, usamos la cremallera de triptofano pentamerica descrita por Liu et al. (LPP(5>), que se deriva de la lipoproteina LPP-56 de E. coli (Liu et al., 2004). La secuencia codificante de la cremallera de triptofano LPP(5) se fusiono geneticamente con la secuencia codificante de SHe y se clono en un vector de expresion de E. coli (pLH36) que contenia un peptido de hexahistidina y un sitio de escision de caspasa como se describe en Mertens et al., 1995. Este plasmido de expresion se denomino pLH36-HisDEVD-LPP-SHe (SEQ ID N° 49). La expresion de este plasmido da la proteina LPPpj-SHe quimerica (SEQ ID N° 52) (MHHHHHHPGGSDEVDAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQ AKDDWARWNQRWDNWAT GGNKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT, la secuencia His-tag esta subrayada, los conectores estan en cursiva, el sitio de escision de caspasa DEVD esta en cursiva subrayado, la cremallera de triptofano LPP pentamerica esta en negrita y el ectodominio de SH del VRS A esta en negrita cursiva). Despues de la induccion de la expresion en E. coli, la proteina LPP<5)-SHe se purified por cromatografia posterior de afinidad con niquel, intercambio anionico y filtracion en gel. La figura 23 demuestra que la proteina LPP(5)-SHe se puede reconocer por anticuerpos monoclonales 3G8 especificos contra She, tanto en un extracto celular en bruto (23A) como en una proteina purificada (24B).

Ejemplo 16: Inmunizacion de ratas algodoneras

Para someter a prueba la eficacia de la vacuna en un modelo animal independiente, se usan ratas algodoneras. Las ratas algodoneras (Sigmondon hispidus) son susceptibles a la infeccion por el VRS (Prince et al., 1978). Se usan cinco grupos de seis ratas algodoneras cada uno. Dos grupos de animales se inmunizan por via intraperitoneal (i.p.) con 100 pg de KLH (control con vehiculo) o 100 pg de KLH-SHe (es decir, un conjugado quimico del peptido de SHe derivado de VRS-A con KLH como vehiculo). Los antigenos de las vacunas con KLH y KLH-SHe se formulan con adyuvante incompleto de Freund y se usan para inmunizar ratas algodoneras los dias 0, 21 y 42. Un tercer grupo de animales se inmuniza por via intramuscular con VRS inactivado con formol (VRS-IF) en presencia de adyuvante de alumbre. El ultimo grupo sirve como control positivo para la induccion de la enfermedad potenciada por la vacuna que se manifiesta tras la exposicion posterior al VRS. Un cuarto grupo se infecta con 2,04 * 105 unidades formadoras de calvas por rata algodonera de VRS-Tracy el dia 0 y sirve como control positivo para la proteccion contra la exposicion posterior. Un quinto grupo de ratas algodoneras permanece sin tratamiento hasta el dia de la exposicion y sirvio como control para la exposicion al VRS. La pauta de la vacunacion se muestra en la figura 24.

Se recogen sueros antes de cada inmunizacion y en el dia de la exposicion. El dia 63, se expusieron las ratas algodoneras por via intranasal a 2,04 x 105 unidades formadoras de calvas de VRS-Tracy. El virus de la exposicion se administra por via intranasal en un volumen de 100 microlitros, mientras que los animales estan ligeramente anestesiados con isoflurano. El dia 68, se recoge suero y se sacrifican todos los animales para recoger los pulmones para la titulacion del virus y el analisis histopatologico. Cada pulmon se divide en dos para realizar un analisis histopatologico y la titulacion del virus. Los pulmones izquierdos se atan y se usan para el analisis histopatologico. Los lobulos del pulmon derecho se lavan usando 3 ml de medio de Iscove con glicerina al 15 %. El liquido de lavado se conserva en hielo hasta la titulacion. Ademas, se preparan lavados nasales con 2 ml (1 ml para cada narina) en el mismo medio.

La carga vinca en el pulmon y los lavados nasales se determina mediante analisis de calvas en celulas HEp2. Se infectan celulas durante 90 minutos con una dilucion sucesiva de las muestras de lavado. Despues de la retirada del inoculo, las celulas se cubren con metilcelulosa al 2 % en MEM que contiene antibioticos. Despues de 6 dias de incubacion a 37 °C en una incubadora de CO², se contratinen las calvas con una solucion de cristal violeta al 0,1 %/formol al 10 % y se dejan a temperatura ambiente durante 24 horas.

Para el analisis histopatologico, el pulmon izquierdo se perfunde con formol tamponada neutro al 10 %. El tejido pulmonar fijo se procesa posteriormente con un microtomo para producir secciones que se tinen con hematoxilina y eosina y se puntuna por el grado de lesiones histopatologicas. Se analizan muestras de suero para determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-SHe y anti-VRS mediante ELISA de peptidos y mediante un ensayo de microneutralizacion. Para el ELISA de peptidos, las placas se recubren durante la noche a 37 °C con 2 pg de peptido de SHe en 50 pi de tampon de carbonato 0,1 M, pH 9,6. Despues del recubrimiento, se bloquean las placas con leche en polvo al 3 % (p/v) en PBS, seguido de la aplicacion de diluciones sucesivas al 3 % en sueros de rata algodonera. Las IgG de rata algodoneras especificas contra SHe retenidas se detectan usando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rabano picante y sustrato de tetrametilbenzidina. El titulo de punto final de IgG contra peptido de SHe en las muestras se define como la dilucion mas alta para la cual la absorbancia es al menos dos veces mas alta que la del suero previo a la inmunizacion.

Los titulos de anticuerpos neutralizantes se determinan para el VRS-A y -B en placas de microtitulacion de 96 pocillos con celulas HEp2. Se mezclan diluciones sucesivas de las muestras de suero de una cantidad fija de virus de inoculo. El titulo de anticuerpos neutralizantes se define como la dilucion serica a la cual se observa una reduccion >50 % del efecto citopatico. Este efecto citopatico se refiere a la destruccion de celulas y se determina visualmente despues de que las celulas se fijen con formol tamponado neutro al 10 % y se tinan con cristal violeta. Los resultados muestran que los animales, vacunados con KLH-SHe en adyuvante de Freund, desarrollan anticuerpos neutralizantes y estan claramente protegidos, mientras que el control con vehiculo no muestra ninguna proteccion.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna para su uso en un procedimiento de vacunacion contra la infeccion por el VRS, comprendiendo la vacuna una composicion inmunogena y un adyuvante, caracterizada por que la composicion inmunogena consiste en el ectodominio de la pequena proteina hidrofoba de un virus respiratorio sincicial (VRS) y un vehiculo, en la que el vehiculo es una molecula que es heterologa para la pequena proteina hidrofoba del virus respiratorio sincicial (VRS) y en la que, ademas, dicho ectodominio esta unido quimica o geneticamente al vehiculo.

2. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho ectodominio se presenta como un oligomero.

3. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que dicho ectodominio consiste en SEQ ID N° 1 o SEQ ID N° 2.

4. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que dicho oligomero es un pentamero.

5. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho vehiculo se selecciona del grupo que consiste en proteina oligomerica de la matriz cartilaginosa (comp), Lpp-56 y una particula similivirica.

6. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho vehiculo es un vehiculo no proteinico.

7. La vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que dicho vehiculo no proteinico es un liposoma o un trimetilquitosano.

8. Un anticuerpo especifico contra el ectodominio de la pequena proteina hidrofoba del VRS, para su uso en un procedimiento para prevenir o tratar la infeccion por el VRS.

9. Una composicion farmaceutica, que comprende un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicacion 8, para su uso en un procedimiento para prevenir o tratar la infeccion por el VRS.