ES2620261T3 - Uso de células humanas de origen leucémico mieloide para expresión de anticuerpos - Google Patents

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Abstract

Un método para seleccionar una célula huésped para producir una composición de proteína que tiene al menos una de las siguientes características de glicosilación: (i) tiene una cantidad de estructuras G2 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilación particular de la molécula de proteína de dichas moléculas de proteína en dicha composición molecular de proteína que es al menos 5% más alta en comparación con la misma cantidad de moléculas de proteína en al menos una composición molecular de proteína de la misma molécula de proteína aislada de ATCC Nº CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o (ii) comprende más que 35% de estructuras G2 presentes en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilación particular de la molécula de proteína de las moléculas de proteína en dicha composición de proteína; y/o (iii) tiene una cantidad de estructuras G0 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilación particular de la molécula de proteína de dichas moléculas de proteína en dicha composición molecular de proteína que es al menos 5% más baja en comparación con la misma cantidad de moléculas de proteína en al menos una composición molecular de proteína de la misma molécula de proteína aislada de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o (iv) comprende menos que 22% de estructuras G0 presentes en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilación particular de la molécula de proteína de las moléculas de proteína en dicha composición de proteína; y/o (v) comprende una cantidad de fucosa en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilación particular de la molécula de proteína de dichas moléculas de proteína en dicha composición molecular de proteína que es al menos 5% menos en comparación con la misma cantidad de moléculas de proteína en al menos una composición molecular de proteína de la misma molécula de proteína aislada de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o (vi) comprende al menos 2% de estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilación particular de la molécula de proteína de las moléculas de proteína en dicha composición molecular de proteína que contiene GlcNAc bisectora; y/o (vii) tiene un patrón de sialilación que está alterado en comparación con el patrón de sialilación de al menos una composición molecular de proteína de la misma molécula de proteína aislada de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma, en donde - tiene un grado de sialilación aumentado, con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilación particular de la molécula de proteína de las moléculas de proteína en dicha composición molecular de proteína que es al menos 15% más alta en comparación con la misma cantidad de moléculas de proteína en al menos una composición molecular de proteína de la misma molécula de proteína aislada de ATCC Nº CRL- 9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; o - tiene un grado de sialilación disminuido, con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilación particular de la molécula de proteína de las moléculas de proteína en dicha composición molecular de proteína que es al menos 15% más baja en comparación con la misma cantidad de moléculas de proteína en al menos una composición molecular de proteína de la misma molécula de proteína aislada de ATCC Nº CRL- 9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; mediante las siguientes etapas (a) introducir en al menos dos células huésped diferentes que proporcionan un patrón de glicosilación divergente al menos un ácido nucleico que codifica una proteína o al menos una parte de la misma; en donde al menos una de dichas células huésped es una célula sanguínea humana inmortalizada seleccionada del grupo que consiste en las líneas celulares DSM ACC2858 (GT-2X), DSM ACC2806 (NM-H9D8), DSM ACC2807 (NM-H9D8-E6), DSM ACC2856 (NM-H9D8-E6Q12) o una célula o línea celular derivada de las mismas; y (b) cultivar dichas al menos dos células huésped diferentes, en donde cada célula huésped diferente produce una composición de proteína que tiene un patrón de glicosilación divergente del patrón de glicosilación producido por la otra célula huésped; (c) aislar dichas composiciones de proteína expresadas que llevan un patrón de glicosilación diferente de las al menos dos células huésped diferentes; y (d) seleccionar dicha célula huésped que produce una composición de proteína que tiene al menos una de las características de glicosilación definidas en (i) a (vii).

Description

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DESCRIPCION
Uso de celulas humanas de origen leucemico mieloide para expresion de anticuerpos COMPENDIO
La invencion proporciona metodos biotecnologicamente favorables para la produccion de composiciones moleculares de protelnas y en particular composiciones moleculares de anticuerpos que tienen actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada y una glicosilacion humana. Proporciona ademas metodos para seleccionar celulas huesped para producir composiciones moleculares de protelnas.
INTRODUCCION
Un rasgo y desaflo clave para la industria es la produccion de protelnas recombinantes, y la productividad, coste, homogeneidad y actividad de protelna son elementos clave que quedan por optimizar. La glicosilacion es tambien un elemento clave en la produccion de altos rendimientos de glicoprotelnas recombinantes homogeneas que plantea una serie de problemas crlticos para su produccion. Cada llnea celular de produccion actual ofrece una serie de diferentes desaflos y problemas que son debidos en gran medida a la complejidad y la especie, tejido y especificidad al sitio de la glicosilacion. Por lo tanto, la optimizacion de los sistemas de produccion con respecto a la glicosilacion sigue siendo uno de los aspectos claves para optimizacion. Esta particularmente, ya que las diferencias en el patron de glicosilacion tienen a menudo un impacto considerable en la actividad, inmunogenicidad, biodisponibilidad y semivida de las moleculas de protelna. Se da una vision de conjunto detallada de propiedades de la glicosilacion de diferentes llneas celulares derivadas de diferentes especies y sistemas de produccion no mamlferos en Jenkins et al (Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry, Nat Biotechnology, 1996, 14: 975-981).
Los anticuerpos son grandes herramientas para diagnosis e investigacion, y probablemente llegaran a ser la familia mas grande de terapeuticos. Estan en el mercado mas de diez terapeuticos de anticuerpos recombinantes, y cientos en desarrollo cllnico. Un rasgo y desaflo clave para la industria es la produccion de anticuerpos recombinantes (“rMAbs”), y la productividad, coste, homogeneidad y actividad de anticuerpo son elementos clave que quedan por optimizar. Casi todos los rMAbs terapeuticos en el mercado han sido producidos en las llneas celulares de roedores a partir de hamster (CHO) y ratones (NS0 o Sp2/0). La gran mayorla de los rMAbs en desarrollo son producidos en celulas de roedores, y otros estan en desarrollo, sin embargo, ninguno ha sido suficiente para optimizar la productividad, coste, homogeneidad y actividad de anticuerpo.
La glicosilacion es tambien un elemento clave en la produccion de altos rendimientos de rMAbs homogeneos y potentes que plantea una serie de problemas crlticos para la produccion de rMAbs. Cada llnea celular de produccion actual ofrece una serie de diferentes desaflos y problemas que son debidos en gran medida a la complejidad y la especie, tejido y especificidad al sitio de la glicosilacion [Revision: Royston Jefferis, CCE IX: Glycosylation of Recombinant Antibody Therapeutics; Biotechnol. Prog. 2005, 21, 11-16].
Por lo tanto, la optimizacion de sistemas de produccion de protelnas y en particular de anticuerpos con respecto a la glicosilacion sigue siendo uno de los aspectos clave para la optimizacion.
La presente invencion proporciona nuevos sistemas de expresion basados en celulas sangulneas humanas inmortalizadas, y en particular basados en celulas de origen leucemico mieloide. Estas celulas mejoran sorprendentemente la produccion de protelnas glicosiladas y en particular anticuerpos con respecto a actividad, rendimiento y/o homogeneidad.
ANTECEDENTES DE LA TECNICA
Las protelnas son un grupo diverso cuya funcion y aparicion varla ampliamente de unas a otras. Entre las protelnas de potencial terapeutico, la mayorla de las protelnas estan glicosiladas, tal como muchas hormonas (p.ej. hormona del crecimiento, glucagon, FSH y LH), factores de crecimiento (p.ej. GM-CSF, G-CSF, VEGF y eritropoyetina), citocinas (p.ej. IL-2, IL-7, interferon-alfa y -beta, TNF-alfa), anticoagulantes (p.ej. lepirudina, desirudina), factores de coagulacion sangulnea (p.ej. factores VII, VIII y IX), vacunas (p.ej. antlgeno de hepatitis B) y anticuerpos. Los sistemas celulares de produccion establecidos son incapaces de producir protelnas con la glicosilacion humana original. Los sistemas celulares procarioticos (p.ej. bacterias) y la mayorla de eucarioticos (p.ej. celula de levadura, insecto y planta) sintetizan protelnas que carecen de glicosilacion o llevan glicanos que difieren en gran medida de las cadenas de carbohidrato humanas. Las celulas de ovario de hamster chino (CHO) son un sistema de produccion usado comunmente que es capaz de glicosilar protelnas de una manera similar a las celulas humanas. Sin embargo, siguen habiendo importantes diferencias, tales como en galactosilacion, fucosilacion, glicosilacion particular con N- acetilglucosaminas, y especialmente en diversos aspectos de sialilacion. Estas diferencias influyen en la actividad, la biodisponibilidad, la inmunogenicidad y la semivida.
En el momento en que se establecieron estos sistemas de produccion, era suficiente producir protelnas terapeuticas que fueran al menos hasta cierto punto activas. Sin embargo, hoy se concentran grandes esfuerzos para mejorar la actividad de una protelna terapeutica con el objetivo de (I) reducir el numero y concentracion de las dosis aplicadas de las protelnas terapeuticas, (II) reducir los costes de una terapia, y (III) reducir los efectos secundarios.
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La principal estrategia para mejorar la bioactividad de las protelnas es alargar su semivida en suero y por tanto su biodisponibilidad. Esto se puede hacer p.ej. mediante el procedimiento llamado PEGilacion, donde ciertas formas de polietilenglicol son anadidas/enlazadas qulmicamente a la protelna producida. El PEG aumenta el peso molecular y por tanto la semivida en suero. Sin embargo, estan asociados varios problemas con este procedimiento. Por ejemplo, en casi todos los casos la PEGilacion disminuye la actividad de una protelna por su funcion efectora celular, la administracion repetitiva en seres humanos da como resultado a menudo una respuesta inmune adversa como anticuerpos neutralizantes, y/o el procedimiento de produccion necesita modification qulmica adicional dando como resultado un proceso multietapas con costes adicionales, perdidas y tiempo. Existen sistemas portadores similares (p.ej. HESilacion o union de albumina) que tienen inconvenientes comparables.
Tambien, la modificacion de las cadenas de carbohidrato y por tanto la glicosilacion de protelnas es el centro de atencion para mejorar la semivida en suero de protelnas expresadas de manera recombinante. Las tecnologlas se centran de este modo en la maximization del grado de sialilacion de una glicoprotelna recombinante. Los acidos sialicos son los monosacaridos terminales mas predominantes en la superficie de las celulas eucarioticas, y se cree generalmente que cuanto mas este sialilada una glicoprotelna mas larga es su semivida en suero durante la circulation. Esto se basa en la presencia de ciertos receptores como el asialoprotelna-receptor en el hlgado, que se une a protelnas no sialiladas circulantes y las dirige hacia la celula para degradation.
Estan presentes diversas clases de anticuerpos en el ser humano y la mayorla de los mamlferos, a saber, IgG, IgM, IgE, IgA, IgD. Aunque se usan moleculas de todas las clases de anticuerpos en diagnosis o como herramientas de investigation, la mayorla de los terapeuticos basados en anticuerpos en el mercado y en desarrollo son IgG, y en menor medida IgM. La clase IgG humana se clasifica ademas en cuatro subclases, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La estructura basica de una molecula de IgG consiste en dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que comprenden dos regiones Fab, cada una con un dominio variable que comprende el sitio de union a antlgenos y un dominio constante, una region Fc que comprende mas dominios constantes y los sitios de interaction para ligandos, y la region bisagra flexible que conecta las regiones Fab y Fc. Los anticuerpos pueden existir como moleculas enteras o como fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab o Fv de cadena unica que comprenden las dos regiones variables de la cadena pesada y ligera conectadas por medio de un enlazador. La Fig. 18 muestra un anticuerpo IgG.
Los anticuerpos recombinantes para uso terapeutico son muy a menudo quimericos, humanizados o las llamadas secuencias de protelna totalmente humanas, a fin de reducir su inmunogenicidad. Sin embargo, no se han conseguido facilmente moleculas en realidad totalmente humanas dado que las modificaciones post-translacionales tales como particularmente la glicosilacion no son humanas debido a la produccion en celulas de roedores o CHO, y por tanto pueden diferir de las modificaciones encontradas en anticuerpos humanos en sueros humanos. Las diferencias en la modificacion, en particular el patron de glicosilacion, pueden tener un serio impacto en la actividad y la inmunogenicidad del anticuerpo producido respectivamente.
La actividad de un anticuerpo puede ser debida a e influenciada por una combination de efectos. Por una parte el anticuerpo tiene una cierta especificidad que es mediada por la region variable del anticuerpo (“region V”) ubicada en la region Fab de ciertas secuencias, las regiones CDR, de la region V. Juegan un papel clave en determinar la especificidad y afinidad particulares de un anticuerpo. Las regiones V son por tanto decisivas para las caracterlsticas de union al epltopo, y varlan de anticuerpo a anticuerpo. La afinidad de un anticuerpo describe la fuerza y cinetica de la union de una unica region de union de un anticuerpo a su epltopo. Dado que las diversas clases y subclases de anticuerpos llevan entre dos y diez regiones variables identicas en una molecula de anticuerpo, la fuerza y cinetica de la union de un anticuerpo es influenciada por el numero de sitios de union disponibles para unir y la accesibilidad de los epltopos en el antlgeno o celula diana, y es expresada en su avidez.
Otro factor importante para la calidad de un anticuerpo para su uso en diagnosis y especialmente en terapia es el numero de sitios de union de un anticuerpo en su estructura o celula diana, as! como su velocidad de internalization. Estas calidades influyen en los efectos e idoneidad de un anticuerpo para su uso, especialmente en terapia.
Por otra parte, los mecanismos efectores relevantes para uso terapeutico de un anticuerpo son varios multiplos, por lo que algunos de los anticuerpos actuan por medio de solo un mecanismo y otros por una combinacion de varios mecanismos efectores. Una estrategia es acoplar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos a moleculas efectoras que median en un efecto terapeutico, tal como acoplamiento a una molecula efectora inmune, por ejemplo interleucina 2 para reclutar el sistema inmune, o acoplamiento a toxinas o radioisotopos a fin de matar celulas diana, por ejemplo para terapias antitumorales. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos radiomarcados son tambien valiosos para diagnosis in vivo.
La otra estrategia es usar anticuerpos no marcados, los llamados “desnudos”, que pueden tener importantes ventajas tales como menor toxicologla, loglstica menos complicada, el uso de armas efectoras inmunes naturales o el desencadenamiento de efectos terapeuticos sin necesidad de moleculas efectoras adicionales. Se han realizado un gran numero de estudios para dilucidar los mecanismos de actividad y modo de action de anticuerpos, as! como desarrollar anticuerpos usando estas actividades. Entre las actividades y efectos mas importantes estan la actividad de citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (denominada en la presente memoria “actividad
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ADCC”), la actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (denominada en la presente memoria “actividad CDC”), la actividad de citotoxicidad mediada por fagocitosis (denominada en la presente memoria “actividad de fagocitosis”), actividad mediada por un receptor (denominada en la presente memoria “actividad mediada por receptor”), que comprende un conjunto entero de diferentes efectos y actividades.
Las actividades mediadas por receptor estan basadas principalmente en la union del anticuerpo a una molecula o receptor en una celula diana o por el impedimento de la union de ciertas moleculas a una celula diana, induciendo o inhibiendo de este modo ciertos efectos sobre estas celulas, tales como actividad antagonlstica o agonlstica o bloqueo de receptor de un anticuerpo, conduciendo por ejemplo a la induccion o inhibicion de apoptosis o proliferacion de celulas diana o a la secrecion o inhibicion de la secrecion de ciertas moleculas en una celula diana, o bloqueo o desencadenamiento de ciertos otros eventos mediados por receptor tales como interacciones entre moleculas y celulas o entre celulas. La actividad ADCC, actividad CDC y actividad de fagocitosis son actividades citotoxicas que son mediadas por la region Fc del anticuerpo (denominadas en la presente memoria “actividades mediadas por la parte Fc”) mientras que las actividades, afinidad, avidez y especificidad mediadas por receptor del anticuerpo son mediadas principalmente por la region enlazante del anticuerpo comprendida en la region Fab.
Las actividades mediadas por la parte Fc son mediadas por medio de celulas efectoras inmunologicas tales como celulas asesinas, celulas asesinas naturales y macrofagos activados, o diversos componentes del complemento por union a ligandos efectores tales como Fc-gammaRI, Fc-gammaRII, Fc-gammaRIII, componente Cq1 del complemento, el receptor Fc neonatal (FcRn), etc. Se reporta que la subclase IgG1 humana tiene la actividad ADCC y CDC mas alta entre las moleculas de clase IgG humana. Para IgM la actividad CDC es un mecanismo efector dominante. La actividad ADCC y actividad CDC implican la union de la region Fc, la region constante del anticuerpo, a receptores de Fc tales como Fc-gammaRI, Fc-gammaRII, Fc-gammaRIII de la celula efectora o componentes del complemento tales como C1q. Hay importantes residuos de aminoacidos en la region bisagra, y en particular en el segundo dominio de la region constante (“dominio Cgamma2”). Una cadena de carbohidrato que esta unida a los dominios Cgamma2 es importante para la actividad. La cadena de carbohidrato esta unida al aminoacido asparagina 297 (Asn-297) de Cgamma2 (cadenas de carbohidrato enlazadas por N-glicosido). El termino de la cadena de carbohidrato que se une a la asparagina se llama extremo reductor, y el extremo opuesto se llama extremo no reductor. La region Fc de un anticuerpo IgG tiene dos sitios de union con carbohidratos. La Fig. 18 muestra la estructura de una molecula de IgG e indica la posicion donde se pueden encontrar tlpicamente estructuras de carbohidrato. Ademas, se explica la estructura qulmica y composition de estas estructuras de carbohidrato.
De las actividades mediadas por la parte Fc, se supone que dos estan influenciadas por la glicosilacion del anticuerpo: se ha demostrado que la retirada de la cadena de azucar en la parte Fc del anticuerpo da como resultado la desaparicion de la actividad CDC y ADCC, y tambien una reduction de galactosas en estos N-glicanos causa una disminucion en la actividad CDC [Boyd et al., Molecular Immunol., 32, 1311, (1995); patente de EE.UU. 6.946.292]. Ademas, se describe que la expresion de anticuerpos en celulas de rata da como resultado una actividad ADCC aumentada de ciertos anticuerpos expresados en las mismas [Lifely et al., Glycobiology, 1995 Dec;5(8):813- 22; solicitud de patente internacional WO00/61739] cuando se compara con el mismo anticuerpo expresado en celulas de hamster y de rata. Ambos informes suponen que los cambios en la glicosilacion causan estas diferencias en la actividad ADCC del anticuerpo, sin embargo, esto no esta claro. Lifely et al., 1995, supone que la N- acetilglucosamina bisectora (“bisecGlcNAc”) es responsable de una actividad ADCC aumentada del anticuerpo, mientras que la solicitud de patente internacional WO00/61739 supone que una disminucion drastica de fucosa enlazada en alfa 1-6 a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de N-glicanos (“fucosa nucleo”) es responsable de una actividad ADCC aumentada. Ademas, se describe que la expresion recombinante de la enzima GnTIII en celulas CHO que es responsable de unir la bisecGlcNAc de azucar a N-glicanos da como resultado un aumento de la actividad ADCC de ciertos anticuerpos cuando se expresan en estas celulas cuando se compara con el mismo anticuerpo expresado en celulas CHO no transfectadas de manera recombinante con GnTIII [patente de EE.UU. 6.602.684, Umana et al., Nature Biotechn 17: 176-180 (1999)]. Adicionalmente, se describio que la inactivation del gen FUT8 en celulas CHO, que da como resultado la falta de fucosa nucleo, puede aumentar la actividad ADCC de ciertos anticuerpos cuando se expresa en tales celulas FUT8 KO CHO [patente de EE.UU. 6.946.292]. Estos resultados tambien demuestran la importancia y complejidad del patron de glicosilacion para la actividad del anticuerpo.
Sin embargo, un patron de glicosilacion “extrano” y por tanto no optimizado puede no solo ser perjudicial para la actividad, tambien puede ser inmunogenico. Los sistemas de expresion y production actuales para protelnas y en particular anticuerpos son principalmente llneas celulares derivadas de roedores, y estan basados en llneas celulares de hamster, ratones o rata tales como CHO, BHK, NS0, Sp2/0 e YB2/0. Se sabe que las celulas de roedor pueden producir bajo condiciones no optimas varios productos proteicos anormalmente glicosilados que carecen de potencia o son inmunogenicos. Ademas, se sabe que las celulas de roedor expresan estructuras de carbohidrato con importantes diferencias a las expresadas en celulas humanas que comprenden la presencia de azucares no humanos y la falta de ciertos restos de azucar humanos que pueden hacer a protelnas expresadas en estas celulas por ejemplo inmunogenicas, menos eficaces, de menor rendimiento o requisitos estructurales suboptimos de plegado. La mayorla de celulas de roedor expresan por ejemplo acido N-glicolilneuramlnico (“NeuGc”), una alternativa para el acido N-acetilneuramlnico (“NeuNAc”) no presente en seres humanos que es inmunogenico en seres humanos y/o la modification de galactosa inmunogenica alfa(1-3) galactosa (“Gal alfa1-3Gal”), y/o carecen de
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importantes carbohidratos tales como el importante NeuNAc enlazado en 2-6, o carecen de bisecGIcNAc. Hay tambien otras diferencias conocidas y desconocidas. Ademas, de la produccion de roedores se sabe que los perfiles de glicoforma son mayoritariamente heterogeneos, y tambien el perfil de glicoforma especlfico a clones, que puede variar ampliamente de clon a clon en celulas CHO, NS0 o Sp2/0 y son dependientes del modo de produccion y condiciones de cultivo.
Ademas, existen sistemas de produccion para la produccion de protelnas que incorporan celulas humanas, tales como p.ej. celulas Hek 293, que son derivadas de celulas de rinon embrionario humano, o el sistema celular PerC6®, que es derivado de una unica celula humana derivada de la retina, que fue inmortalizada a proposito usando tecnologla de ADN recombinante. Sin embargo, estas llneas celulares, si bien se prefieren a menudo sobre sistemas celulares no humanos, tienen aun algunos inconvenientes. Tienen un patron de glicosilacion unico, que es atribuible a la maquinaria de glicosilacion de las celulas respectivas. Sin embargo, dependiendo de la protelna a ser producida, podrlan no entregar un perfil de glicosilacion optimizado, p.ej. con respecto a la actividad y /o semivida en suero de la protelna. En particular es diflcil conseguir un cierto grado y patron de sialilacion con estas celulas. P.ej. los sistemas celulares conocidos en el estado de la tecnica a menudo no son capaces de proporcionar una sialilacion enlazada en alfa 2-6 detectable, que, sin embargo, es importante para la semivida en suero.
A partir de estos hechos llega a estar claro que hay aun una necesidad de sistemas de expresion y produccion que puedan optimizar adicionalmente la productividad, homogeneidad y/o actividad de anticuerpo proporcionando alternativas y/o sistemas de expresion mejorados. Ademas, a partir de estos hechos tambien llega a estar claro que no puede decirse que estructuras de carbohidrato y especialmente que estructuras de carbohidrato humanas son optimas para mejorar la actividad u homogeneidad de protelnas y en particular anticuerpos, y que tipo de patron de glicosilacion tiene que proporcionar una llnea celular y especialmente una llnea celular humana para optimizar la actividad de una protelna, en particular un anticuerpo. Por lo tanto, hay una necesidad de sistemas de expresion que proporcionen productos con un patron de glicosilacion divergente en comparacion con los productos obtenidos con los sistemas de expresion conocidos en el estado de la tecnica.
La presente invencion proporciona soluciones a estos problemas proporcionando nuevos sistemas de expresion basados en llneas celulares sangulneas inmortales humanas, y en particular celulas de origen leucemico mieloide. Usar celulas sangulneas humanas inmortalizadas es ventajoso en comparacion con los sistemas conocidos en la tecnica anterior, porque estas celulas proporcionan un perfil de glicosilacion diferente que otros sistemas celulares humanos conocidos derivados de tejido diferente (p.ej. rinon o retina). Estas diferencias pueden ser ventajosas con respecto a actividad, homogeneidad y rendimiento de producto. Ademas, estas celulas pueden ser transfectadas y cultivadas en suspension bajo condiciones exentas de suero.
Los metodos de la invencion se definen en las reivindicaciones. Por tanto, segun una primera realizacion, se proporciona un metodo para seleccionar una celula huesped para producir una composicion de protelna que tiene al menos uno de las siguientes caracterlsticas de glicosilacion:
(i) tiene una cantidad de estructuras G2 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% mas alta en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCc N° CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
(ii) comprende mas que 35% de estructuras G2 presentes en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion de protelna; y/o
(iii) tiene una cantidad de estructuras G0 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% mas baja en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCc No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
(iv) comprende menos que 22% de estructuras G0 presentes en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion de protelna; y/o
(v) comprende una cantidad de fucosa en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% menos en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCc No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
(vi) comprende al menos 2% de estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales o de al
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menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que contiene GlcNAc bisectora; y/o
(vii) tiene un patron de sialilacion que esta alterado en comparacion con el patron de sialilacion de al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma, en donde
- tiene un grado de sialilacion aumentado, con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 15% mas alta en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC N° CRL- 9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; o
- tiene un grado de sialilacion disminuido, con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 15% mas baja en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC N° CRL- 9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma;
mediante las siguientes etapas
(a) introducir en al menos dos celulas huesped diferentes que proporcionan un patron de glicosilacion divergente al menos un acido nucleico que codifica una protelna o al menos una parte de la misma; en donde al menos una de dichas celulas huesped es una celula sangulnea humana inmortalizada seleccionada del grupo que consiste en las llneas celulares DSM ACC2858 (GT-2X), DSM ACC2806 (NM-H9D8), DSM ACC2807 (NM-H9D8-E6), DSM ACC2856 (NM-H9D8-E6Q12) o una celula o llnea celular derivada de las mismas; y
(b) cultivar dichas al menos dos celulas huesped diferentes, en donde cada celula huesped diferente produce una composicion de protelna que tiene un patron de glicosilacion divergente del patron de glicosilacion producido por la otra celula huesped;
(c) aislar dichas composiciones de protelna expresadas que llevan un patron de glicosilacion diferente de las al menos dos celulas huesped diferentes; y
(d) seleccionar dicha celula huesped que produce una composicion de protelna que tiene al menos una de las caracterlsticas de glicosilacion definidas en (i) a (vii).
En una segunda realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para producir una composicion de protelna, que comprende
(a) realizar un metodo para seleccionar una celula huesped para producir una composicion de protelna segun el primer aspecto de la presente invencion; y
(b) cultivar la celula huesped seleccionada bajo condiciones que permiten la produccion de dicha composicion de protelna; y
(c) aislar dicha composicion de protelna.
Este metodo que utiliza celulas sangulneas humanas inmortalizadas mejora la produccion de protelnas y en particular anticuerpos con respecto a actividad, rendimiento y/o homogeneidad. Esto es sorprendente, dado que hasta ahora no se habla demostrado que las celulas sangulneas humanas inmortalizadas y en particular celulas de leucemia mieloide son adecuadas para la produccion de protelnas y particularmente conducen a anticuerpos con propiedades mejoradas respectivamente. Aunque se uso una cierta celula de leucemia de rata para la expresion de anticuerpos, la maquinaria de glicosilacion entre ser humano y rata es crlticamente diferente, por lo que esta ultima puede expresar restos de carbohidratos que pueden ser inmunogenicos en el ser humano, tales como NeuGc y Gal alfa1-3 Gal. Se describio que la celula de leucemia de rata YB2/0 da anticuerpos con actividad ADCC mas alta debido a mayor presencia de bisecGlcNAc o debido a una drastica regulation en descenso de fucosa nucleo.
Fue aun mas sorprendente que el problema podia ser solucionado por esta invencion usando celulas sangulneas humanas inmortalizadas y en particular celulas mieloides, dado que se habla reportado previamente que la llnea celular K562 - una celula de leucemia mieloide - no expresa la enzima para bisecGlcNAc, un hallazgo que fue descrito y mostrado por hibridacion genica de GnTIII [Yoshimura M et al., Cancer Res. 56(2): 412-8 (1996)] y si expresa el gen FUT8, que expresa la fucosiltransferasa que causa la adicion de fucosa nucleo como se muestra por RT-PCR [ejemplo 1]. Fue sorprendente porque K562 no es resistente al tratamiento de lectina, dado que es unida fuertemente por la lectina LCA, la base para celulas negativas o fuertemente reguladas en descenso para fucosilacion de nucleo. Debido a esta information sobre el perfil de glicosilacion de celulas K562, no podia esperarse que esas celulas pudieran mejorar la actividad de anticuerpos expresados en las mismas, ya que se supuso que la maquinaria de glicosilacion necesaria para un patron de actividad favorable no estaba presente. Tambien fue sorprendente que se pueden generar y conseguir protelnas, y en particular anticuerpos, con actividad de union
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aumentada, homogeneidad mejorada y/o rendimientos mas altos con el metodo de produccion de la presente invencion en comparacion con celulas de sistemas de expresion actuales.
La estrategia de la invencion es generar llneas celulares humanas adecuadas a fin de conseguir un sistema que pueda proporcionar productos proteicos con un conjunto entero de modificaciones post-translacionales tan cercano como sea posible al sistema humano y por tanto sin o con menos propiedades inmunogenicas y/o actividad mejorada en el sistema humano. El objetivo es proporcionar un patron de glicosilacion hecho a medida para cada protelna/anticuerpo a ser expresado.
Debido al hecho de que las estructuras de carbohidrato son muy complejas, que la maquinaria de glicosilacion de celulas comprende varios cientos de enzimas que estan implicadas en su slntesis y que esas enzimas son principalmente especies expresadas especlficas y especlficas a tejidos, la principal estrategia de los inventores para conseguir una glicosilacion humana es proporcionar sistemas de expresion humana biotecnologicamente adecuados para expresar protelnas y en particular anticuerpos, con un patron de glicosilacion optimizado. Como el patron de glicosilacion optimizado puede diferir de protelna a protelna y de anticuerpo a anticuerpo, la invencion proporciona llneas celulares que producen diferentes patrones de glicosilacion, permitiendo de este modo seleccionar la llnea celular para la produccion que produce un patron de glicosilacion optimizado para el producto de protelna/anticuerpo respectivo.
Por tanto, la invencion proporciona metodos biotecnologicamente favorables para la produccion de composiciones proteicas y en particular composiciones moleculares de anticuerpos que tienen actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada y glicosilacion totalmente humana. Describe ademas nuevas celulas huesped, acidos nucleicos, y composiciones moleculares.
Por tanto, se describe un metodo para producir una composicion proteica, preferiblemente una composicion molecular de anticuerpos, que tiene un patron de glicosilacion definido, que comprende las siguientes etapas:
(a) introducir en una celula sangulnea humana inmortalizada como celula huesped al menos un acido nucleico que codifica una protelna o al menos una parte de la misma;
(b) cultivar dicha celula huesped bajo condiciones que permiten la produccion de dicha composicion de protelna; y
(c) aislar dicha composicion de protelna que tiene las caracterlsticas de glicosilacion pretendidas.
A fin de obtener una composicion de protelna y particularmente una composicion de anticuerpo que tiene propiedades mejoradas, la celula huesped se selecciona para producir una composicion de protelna/anticuerpo que tiene al menos una de las siguientes caracterlsticas de glicosilacion:
(i) No comprende NeuGc detectable.
Como se bosquejo anteriormente, una glicosilacion NeuGc puede tener propiedades inmunogenicas en los seres humanos. Por tanto, es deseable evitar una glicosilacion respectiva tanto como sea posible. Una glicosilacion respectiva se evita usando celulas sangulneas humanas inmortalizadas, y en particular usando una celula huesped de origen leucemico mieloide.
(ii) Tiene un grado de galactosilacion, esto es, en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna aumentado en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC N° CRL-9096] cuando se expresa en la misma.
Los residuos de galactosa se encuentran principalmente beta enlazados en 1-4 a los residuos GlcNAc en las antenas del complejo de tipo N-glicano de los anticuerpos, pero tambien se han encontrado enlaces beta-1,3. Sin embargo, usualmente aparecen en estructuras triantenarias. La influencia del grado de galactosilacion sobre la actividad es, en particular con respecto a anticuerpos, notable. Se ha demostrado que el agotamiento de galactosa conduce a una actividad CDC reducida. Por tanto, puede preferirse tener un alto grado de galactosilacion. La galactosilacion tambien puede jugar un papel importante para otras protelnas. Cuando se hace referencia a la estructura de carbohidrato totales de una molecula de protelna, se consideran todas las glicosilaciones de la molecula de protelna. En caso de que se analicen las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna, el foco recae en una(s) estructura(s) de carbohidratos especlfica(s), tal como p.ej. la(s) estructura(s) de carbohidratos unida(s) a la Asn 297 de la parte Fc de una molecula de anticuerpo (por favor, vease tambien la Fig. 18). En caso de que se evalue una estructura especlfica respectiva, se determina el contenido/composicion de esta estructura especlfica. Tambien se podrla hacer referencia a unidades carbohidrato totales y cadenas de carbohidrato particulares para definir dichas caracterlsticas (estos son sinonimos).
(iii) Tiene una cantidad de estructuras G2 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% mas alta en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC N° CRL-9096] cuando se expresa en la misma. En particular, en caso
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de que se produzca un anticuerpo segun los metodos de la presente invencion, una cantidad alta de estructuras G2 es beneficiosa. Una “estructura G2” define un patron de glicosilacion en donde se encuentra galactosa en ambos extremos de la estructura biantenaria unida a la region Fc en caso de un anticuerpo (por favor, vease tambien la Fig. 18). Si se encuentra una molecula de galactosa, se llama estructura G1, si no hay galactosa, estructura G0. Se encontro a menudo que un patron de glicosilacion G2 mejora la CDC de anticuerpos. Por tanto, se prefiere que este presente una cantidad al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% o incluso mas que 100% mas alta de estructuras G2 en la composition de protelna/anticuerpo producida. Se describen en la presente memoria llneas celulares adecuadas que consiguen un patron de glicosilacion G2 alto respectivo.
Como un grado de glicosilacion global alto es a menudo beneficioso para la CDC de los anticuerpos, se prefiere a menudo obtener 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% o incluso mas que 95% de estructuras G2 y/o G1 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la protelna, en particular una molecula de anticuerpo.
Segun una realizacion adicional, estan presentes mas que 35% (40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% o mas que 70%) de estructuras G2 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion de protelna.
(iv) Tiene una cantidad de estructuras G0 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% mas baja en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma. Como se bosquejo anteriormente, un alto grado de galactosilacion es usualmente ventajoso. Por tanto, las llneas celulares se seleccionan preferiblemente de tal modo que se eviten estructuras G0. La cantidad de estructuras G0 es preferiblemente menor que 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o la cantidad es incluso mas baja.
Segun una realization adicional, estan presentes menos que 22% (20%, 18%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, menos que 5%) de estructuras G0 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion de protelna.
(v) No comprende Galalfa1-3Gal terminal detectable.
Como se bosquejo anteriormente, una glicosilacion Galalfa1-3Gal puede ser inmunogenica en seres humanos. Esta glicosilacion caracteriza un patron, en donde un segundo residuo de galactosa esta enlazado en position alfa 1,3 al primer residuo de galactosa, dando como resultado el disacarido altamente inmunogenico Galalfa 1-3 Gal. Usando celulas sangulneas humanas inmortalizadas y en particular una celula huesped de origen leucemico mieloide humana, se evita una glicosilacion desventajosa respectiva.
(vi) Comprende una cantidad de fucosa en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% menos en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma. Se encuentran residuos de fucosa en diferentes sitios dentro del arbol de N-glicano, asl, particularmente:
- enlazada en alfa 1,6 al residuo GlcNAc proximal a la cadena de aminoacido;:
- enlazada en alfa 1,3 y alfa 1,4 al residuo GlcNAc antenario;
- enlazada en alfa 1,2 al residuo Gal antenario localizado.
En N-glicanos unidos a anticuerpos la inmensa mayorla de residuos de fucosa se encuentran enlazados en 1,6 al residuo GlcNAc proximal (llamado “fucosa nucleo”). Se ha encontrado que la ausencia de fucosa nucleo en el extremo reductor del N-glicano unido a anticuerpos potencia la actividad ADCC de anticuerpos en el factor 25 a 100. Debido a este efecto beneficioso sobre ADCC, se prefiere que la cantidad de fucosa sea al menos 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% o mas que 2000% menos en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma. La presente invencion tambien proporciona llneas celulares especialmente disenadas que consiguen una fucosilacion global baja respectiva.
Segun una realizacion adicional, dicha celula huesped se selecciona para producir una glicoprotelna, que comprende al menos 10% (15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% o mas que 80%) de carbohidratos de las estructuras de carbohidrato totales o de al menos una estructura de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna, que carecen de fucosa. Con respecto a anticuerpos se prefiere particularmente que las cadenas de carbohidrato enlazadas por N-glicosido unidas a la region Fc comprenda un extremo reductor que comprenda GlcNAc, en donde las cadenas de carbohidrato no contienen fucosa unida a la posicion 6 del GlcNAc en el extremo reductor de la cadena de carbohidrato.
(vii) Comprende al menos una estructura de carbohidrato que contiene GlcNAc bisectora.
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La N-acetilglucosamina bisectora (bisGIcNAc) se encuentra a menudo unida en beta 1,4 al residuo de manosa central de la estructura nucleo de tri-manosilo de los N-glicanos encontrados en los anticuerpos. La presencia de GlcNAc bisectora en el residuo de manosa central del anticuerpo Fc-N-glicano aumenta la actividad ADCC de los anticuerpos.
Segun una realizacion adicional, dicha celula huesped se selecciona de tal modo que dicha protelna producida comprende mas estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales (o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna) de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que no contiene fucosa ni GlcNAc bisectora que las estructuras de carbohidrato respectivas que contienen GlcNAc bisectora y no contienen fucosa. Segun una realizacion adicional, dicha celula huesped se selecciona de tal modo que dicha protelna producida comprende mas estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales (o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna) de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que contiene mas GlcNAc bisectora y fucosa que las estructuras de carbohidrato respectivas que contienen GlcNAc bisectora y no contienen fucosa.
(viii) Tiene un patron de sialilacion que esta alterado en comparacion con el patron de sialilacion de al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma.
La influencia del grado/patron de sialilacion en la actividad, semivida y biodisponibilidad difiere entre diferentes protelnas/anticuerpos. Por tanto, es beneficioso determinar para cada molecula de protelna/anticuerpo el patron de sialilacion optimizado de antemano, usando el metodo de cribado descrito en la presente memoria, antes de establecer la produccion con la celula huesped mas adecuada, que proporciona el patron de glicosilacion deseado. P.ej. existen varias publicaciones que informan de un impacto negativo de residuos de acido sialico presentes en el glicano Fc de anticuerpos en efectos corriente abajo, es decir, CDC y ADCC. Sin embargo, se encontro que una alta sialilacion prolonga la semivida de las moleculas sialiadas. Por tanto, dependiendo de la protelna/anticuerpo producido, un patron de sialilacion diferente podrla ser ventajoso, y las llneas celulares sangulneas humanas inmortalizadas que tienen diferentes actividades de sialilacion permiten obtener protelnas/anticuerpos que presentan un patron de glicosilacion optimizado.
Segun una realizacion, la cpelula huesped se selecciona de tal modo que produce una protelna, que tiene un grado de sialilacion disminuido con al menos una cantidad 10% mas baja (preferiblemente 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, >95%) de acidos sialicos en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma. Segun una realizacion, el producto no comprende incluso NeuNAc detectable. Dependiendo de la protelna/anticuerpo producido, la presencia de acidos sialicos y particularmente NeuNAc puede no contribuir a la actividad de la protelna/anticuerpo. En estos casos, puede ser favorable evitar la glicosilacion de acidos sialicos a fin de hacer al producto mas homogeneo. Este, como el patron de glicosilacion de NeuNAc tambien puede variar en la composicion de protelna resultante. Esto puede causar dificultades en la aprobacion regulatoria del producto, porque el producto es debido al contenido de NeuNAc variante menos homogeneo.
Para protelnas/anticuerpos que no se basan en la presencia de una glicosilacion de NeuNAc para su actividad, una evitacion de una glicosilacion de NeuNAc puede ser beneficiosa a fin de aumentar la homogeneidad. Sin embargo, “NeuNAc no detectable” no significa necesariamente que no hay absolutamente NeuNAc presente. De manera inversa, tambien estan abarcadas realizaciones que tienen un grado bastante bajo de NeuNAc (p.ej. 1 a 10%).
Segun una realizacion, el producto tiene un grado de sialilacion disminuido con una cantidad al menos 15% (20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, >500%) mas baja de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que la misma cantidad de moleculas de protelna de al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma. Esta realizacion es beneficiosa en caso de que se supone que se expresa una protelna/anticuerpo, en donde la sialilacion tiene un efecto negativo sobre la actividad de la protelna/anticuerpo.
Una glicosilacion respectiva (ausencia o grado muy bajo de acido sialico o particularmente NeuNAc) puede conseguirse usando celulas deficientes en sialilacion tales como NM-F9 y NM-D4 en un medio exento de suero.
Segun una realizacion adicional, el producto tiene un grado de sialilacion aumentado, con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos un 15% (20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%,
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450% o mas que 500%) mayor en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma.
Como se bosquejo anteriormente, un grado de sialilacion respectivamente aumentado puede proporcionar un efecto positivo sobre la semivida en suero de la protelna prolongandola. En estos casos se prefiere usar una llnea celular que proporciona un grado mas alto de sialilacion que el que se alcanza en celulas CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] y que tambien proporciona un grado mas alto de sialilacion que el que se alcanza en celulas CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] y que tambien proporciona un grado mas alto de sialilacion que el que se alcanza en celulas deficientes en sialilacion (tales como p.ej. NM-F9 y NM-D4), en donde se necesita anadir un precursor a fin de permitir que ocurra la sialilacion. Sin embargo, si bien se anade un precursor respectivo cuando se cultivan estas celulas deficientes en sialilacion, estas celulas usualmente solo alcanzan 50 a 60% del grado de sialilacion que se obtiene con celulas sangulneas humanas inmortalizadas que no tienen mutacion/defecto genetico en la maquinaria de glicosilacion necesaria para la sialilacion. Por tanto, para realizaciones en donde se tiene como objetivo un grado de sialilacion mas alto, se prefiere usar llneas celulares capaces de proporcionar un grado de sialilacion alto respectivo, y no usar NM-F9 ni NM-D4.
Segun una realizacion adicional, el producto comprende NeuNAc enlazado en alfa2-6. Adicionalmente, puede estar presente en algun grado NeuNAc enlazado en alfa2-3. Con respecto a algunas protelnas/anticuerpos la presencia de una glicosilacion NeuNAc es beneficiosa, en particular con respecto a la semivida de la protelna/anticuerpo. Proporcionar un NeuNAc enlazado en alfa 2-6 es beneficioso, porque este patron de glicosilacion se asemeja a un patron de glicosilacion humano. Las celulas de roedor proporcionan usualmente un NeuNAc enlazado en alfa2-3. Tampoco otras llneas celulares humanas existentes son capaces de proporcionar una glicosilacion de NeuNAc enlazado en alfa 2-6 suficiente.
Son llneas celulares adecuadas para proporcionar un patron de glicosilacion respectivo p.ej. NM-H9D8 y NM-H9D8- E6.
Segun una realizacion adicional, se usa una celula huesped, que produce una protelna que comprende al menos 20% de cadenas de carbohidrato enlazadas N-glicosldicamente mas cargadas de las unidades carbohidrato totales o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma.
El perfil de carga de una cadena de carbohidrato tambien puede influir en las propiedades, y debe por tanto ser considerado. Son grupos qulmicos que cargan las cadenas de carbohidrato p.ej. grupos azufre o acido sialico.
Segun una realizacion alternativa, dicho producto comprende al menos 20% de cadenas de carbohidrato enlazadas N-glicosldicamente menos cargadas de las unidades carbohidrato totales o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL- 9096] cuando se expresa en la misma.
Segun una realizacion adicional, dicha celula huesped se selecciona para producir una glicoprotelna, que comprende al menos 2% (5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, o mas que 45%) de estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que contiene GlcNAc bisectora.
Segun una realizacion, se usa una celula huesped para la produccion de la protelna, que presenta las siguientes propiedades
- tiene una actividad aumentada, rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada en comparacion con al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; y/o
- tiene un rendimiento medio o maximo aumentado que es al menos 10% mas alto que el rendimiento de al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; y/o
- tiene una homogeneidad mejorada, que es una homogeneidad de glicosilacion mejorada en donde dicha composicion molecular de anticuerpo tiene un grado de sialilacion mas bajo que el grado de sialilacion de al menos una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; y/o
- en caso de que dicha molecula de protelna sea una molecula de anticuerpo, tiene una citotoxicidad celular mediada por Fc que es al menos 2 veces mas alta que la citotoxicidad celular mediada por Fc de al menos
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una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; y/o
- en caso de que dicha molecula de protelna sea una molecula de anticuerpo, tiene una union mediada por antlgeno o mediada por Fc aumentada que es al menos 50% mas alta que la union de una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096].
Como se bosquejo anteriormente, las propiedades respectivas pueden ser obtenidas optimizando la glicosilacion de la protelna como se describe en la presente memoria. Fue sorprendente ver que tambien el perfil de union puede ser alterado y mejorado con algunos anticuerpos en base al perfil de glicosilacion. Tambien se describen en la presente memoria celulas huesped adecuadas.
Segun una realizacion adicional, la homogeneidad mejorada de dicha composicion molecular de protelna es una homogeneidad de glicosilacion mejorada de dicha composicion molecular de protelna que comprende al menos una de las siguientes caracterlsticas:
- NeuGc no detectable;
- NeuNAc no detectable;
- mas NeuNAc que una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096];
- NeuNAc enlazado en alfa 2-6 detectable.
Segun una realizacion adicional, dicha celula huesped se selecciona para producir una composicion de protelna que comprende moleculas de protelna que tienen uno de los siguientes patrones de glicosilacion caracterlsticos:
(a)
- no comprende NeuGc detectable
- no comprende Galalfa1-3Gal detectable
- comprende un patron de galactosilacion como se define en la reivindicacion 2
- tiene un contenido de fucosa como se define en la reivindicacion 2
- comprende bisecGlcNAc
- comprende una cantidad aumentada de acido sialico en comparacion con una composicion de protelna de la misma molecula de protelna cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] o en comparacion con una llnea celular deficiente en sialilacion tal como NM-F9 y NM-D4.
(b)
- no comprende NeuGc detectable
- no comprende Galalfa1-3Gal detectable
- comprende un patron de galactosilacion como se define en la reivindicacion 2
- tiene un contenido de fucosa como se define en la reivindicacion 2
- comprende bisecGlcNAc
- comprende una cantidad disminuida de acido sialico en comparacion con una composicion de protelna de la misma molecula de protelna cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096].
(c)
- no comprende NeuGc detectable
- no comprende Galalfa1-3Gal detectable
- comprende un patron de galactosilacion como se define en la reivindicacion 2
- tiene un contenido de fucosa como se define en la reivindicacion 2
- comprende bisecGlcNAc
- comprende 2-6 NeuNAc.
Se describen en la Tabla 9 combinaciones caracterlsticas adecuadas adicionales que conducen a caracterlsticas mejoradas.
Segun la presente invencion el termino “molecula de protelna” significa protelna de interes o fragmentos activos y/o mutantes de la misma, por lo que se puede usar cualquier protelna, preferiblemente cualquier glicoprotelna de origen humano. El termino molecula de protelna significa cualquier molecula polipeptldica o una parte de la misma. Puede ser codificada por uno o varios acidos nucleicos. Puede ser producida de un modo secretorio o una fraccion de la misma o una protelna de fusion con un companero de fusion. Preferiblemente, la protelna es secretada en el sobrenadante. Esta realizacion es en particular beneficiosa con respecto al procedimiento de produccion global, como p.ej. se pueden evitar etapas de liberation (p.ej. con esteres de forbol).
Los ejemplos de glicoprotelnas de mamlferos incluyen moleculas tales como citocinas y sus receptores, por ejemplo los factores de necrosis tumoral TNF-alfa y TNF-beta; renina; hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor liberador de la hormona del crecimiento; hormona paratiroide; hormona estimulante del
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tiroides; lipoprotelnas; alfa-1-antitripsina; cadena A y cadena B de la insulina; gonadotrofinas, p.ej. hormona estimulante del follculo (FSH), hormona luteinizante (LH), tirotrofina, y gonadotrofina corionica humana (hCG); calcitonina; glucagon; factores de la coagulacion tales como factor VIIIC, factor IX, factor VII, factor tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como protelna C; factor natriuretico atrial; surfactante pulmonar; activadores del plasminogeno, tales como urocinasa, activador del plasminogeno de orina humana y de tipo tisular; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyetico; encefalinasa; protelna inflamatoria de macrofagos humanos; una albumina de suero tal como albumina de suero humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A y cadena B de relaxina; prorelaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; factor de crecimiento endotelial vascular; receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; protelna A y D; factores reumatoides; factores neurotroficos tales como factor neurotrofico derivado del hueso, neurotrofina-3, -4, -5, -6 y factor beta del crecimiento de nervios; factor de crecimiento derivado de plaquetas; factores de crecimiento de fibroblastos; factor de crecimiento epidermico; factor de crecimiento transformante tal como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y Ii; protelnas de union al factor de crecimiento similar a la insulina; protelnas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una protelna morfogenetica del hueso; un interferon tal como interferon-alfa, -beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), p.ej. M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (ILs), p.ej. IL-1 a IL-12; superoxido dismutasa; receptores de linfocitos T; protelnas de membrana superficiales; factor acelerador de la degradation; anticuerpos e inmunoadhesinas; Glicoforina A; MUC1.
Muchas de las glicoprotelnas mencionadas anteriormente pertenecen a las citocinas, haciendo referencia en la presente memoria a la clase general de hormonas que aparecen en celulas del sistema inmunitario, tanto linfocinas como monocinas, y otras. La definition pretende incluir, pero no se limita a, las hormonas que actuan localmente y no circulan en la sangre, y que, cuando se usan de acuerdo con la presente invention, daran como resultado una alteration de la respuesta inmune de un individuo. Los ejemplos de citocinas inmunomodulatorias adecuadas adicionales incluyen, pero no se limitan a, interferones (p.ej. IFN-alfa, IFN-beta e IFN-gamma), interleucinas (p.ej. IL- 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 e IL-12), factores de necrosis tumoral (p.ej. TNF-alfa y TNF-beta), eritropoyetina (EPO), ligando FLT-3, factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF), CD2 e ICAM. Tomando la eritropoyetina, se cree que la molecula causa que maduren las celulas progenitoras a eritrocitos, mientras que se piensa que la trombopoyetina conduce a las celulas progenitoras a lo largo de la ruta trombocltica. CSF se refiere a una familia de linfoicinas que inducen a las celulas progenitoras encontradas en la medula osea a diferenciarse en tipos especlficos de celulas sangulneas maduras. El tipo particular de celula sangulnea madura que resulta de una celula progenitora depende del tipo de CSF presente. De manera similar, la formation de colonias de granulocitos-macrofagos es dependiente de la presencia de GM-CSF. Adicionalmente, citocinas de otros mamlferos con homologla sustancial a las formas humanas de IL-2, GM-CSF, TNF-alfa y otros, seran utiles en la invencion cuando demuestren exhibir similar actividad sobre el sistema inmunitario. Se pueden emplear moleculas de adhesion o accesorias o combinaciones de las mismas, solas o en combinacion con las citocinas.
De manera similar, las protelnas que sean sustancialmente analogas a cualquier protelna particular, pero tengan cambios relativamente menores de la secuencia de protelna, tambien encontraran uso en la presente invencion. Es bien sabido que pueden ser posibles a menudo algunas alteraciones pequenas en la secuencia de aminoacidos en la secuencia de protelna, sin alterar las capacidades funcionales de la molecula de protelna, y por tanto se pueden hacer protelnas que funcionen como protelna parental en la presente invencion pero difieran ligeramente de secuencias conocidas actuales. Por tanto tambien estan comprendidas variantes respectivas que mantienen la funcion biologica.
Glicoprotelnas preferidas se seleccionan del grupo que comprende Glicoforina A, EPO, G-CSF, GM-CSF, FSH, hCG, LH, interferones, interleucinas, anticuerpos y/ fragmentos de los mismos.
Todas las moleculas de protelna mencionadas anteriormente pueden ser fusionadas a otras secuencias de peptidos o polipeptidos tales como, pero no limitadas a, enlazadores, moleculas activadoras o toxinas.
En una realization preferida de la invencion el acido nucleico codifica una forma secretora de la protelna o un fragmento de la misma. En una realizacion preferida la forma secretora carece de dominios transmembrana.
De acuerdo con la presente invencion, el termino “composition molecular de protelna” significa las moleculas de cualquier molecula de protelna expresada segun los metodos de la presente invencion y en particular en una celula huesped de la invencion que puede ser aislada. Dicha composicion molecular de protelna comprende al menos una molecula de protelna. Dicha composicion de protelna comprende al menos una glicoforma de una molecula de protelna. Dicha glicoforma de una molecula de protelna significa una molecula de protelna que lleva una glicosilacion particular o cadena de carbohidrato que es diferente en al menos un bloque constructor de azucar, por ejemplo, pero no limitado a, una galactosa adicional, acido sialico, bisecGlcNAc, fucosa, u otra modification de azucar tal como, pero no limitada a, acetilacion o sulfatacion de otra glicoforma de la misma molecula de protelna. En otra realizacion de la invencion la composicion molecular de protelna puede comprender moleculas de mas que una molecula de protelna expresada en una celula huesped. En una realizacion preferida la composicion molecular de protelna de la invencion comprende mas moleculas en porcentaje de tal glicoforma o tales glicoformas de la
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molecula de protelna que median una actividad mas alta que una composition molecular de protelna de la misma molecula de protelna obtenida de al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NS0, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton, preferiblemente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], cuando se expresa en las mismas. En una realization preferida adicional la composicion molecular de protelna comprende mas moleculas de tal glicoforma o glicoformas de la molecula de protelna en porcentaje que median una actividad mas alta que la composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna obtenida de las llneas celulares cHo, o CHOdhfr-, o BHK, o NSO, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton, preferiblemente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], cuando se expresa en las mismas.
De acuerdo con la presente invention el termino “molecula de anticuerpo” significa cualquier anticuerpo entero o fragmento de anticuerpo o una molecula que comprende un fragmento de anticuerpo. Dicho anticuerpo entero puede ser cualquier anticuerpo o molecula de inmunoglobulina de cualquier clase o subclase o cualquier molecula que comprenda al menos un dominio de inmunoglobulina conocido por los expertos en la tecnica, que comprenden, pero no se limitan a, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD de origen animal, tal como, pero no limitado a, origen humano, simio, roedor, raton, rata, hamster, conejo, camello, ave, pollo o tiburon, y tambien puede ser una molecula que comprende secuencias de protelna de anticuerpos que se originan de diversos animales tales como anticuerpos quimericos o humanizados donde diversos porcentajes de por ejemplo secuencias murinas y humanas son combinados a anticuerpos enteros y/o son mutados por ejemplo para disminuir la inmunogenicidad o aumentar la afinidad como saben los expertos en la tecnica. En otra realizacion de la invencion dicho anticuerpo entero tambien puede ser el anticuerpo entero descrito anteriormente con al menos una secuencia de aminoacidos o polipeptidos adicional.
En una realizacion preferida dicho anticuerpo entero es un IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM humano, humanizado o quimerico que comprende una region Fc humana. En una realizacion incluso mas preferida de la invencion dicho anticuerpo entero es un IgG1, IgG4 o IgM humano, humanizado o quimerico con una region Fc humana. Dicha region Fc humana comprende al menos una secuencia de 20 aminoacidos, mas preferiblemente al menos 100 aminoacidos de un dominio constante de la region Fc de un anticuerpo humano, preferiblemente comprende al menos un dominio Fc de un anticuerpo humano, mas preferiblemente comprende el dominio Cgamma2 humano, y mas preferiblemente comprende todos los dominios constantes de la region Fc de un anticuerpo humano de una cierta clase o subclase. Dicha region Fc humana tambien puede comprender secuencias humanas de las que al menos un aminoacido fue mutado.
En la realizacion mas preferida de la invencion la molecula del anticuerpo entero es (i) un anticuerpo totalmente humano generado por ejemplo a partir de una celula o celulas sangulneas productoras de anticuerpos humanos o a partir de un raton transgenico en el que el locus del gen del anticuerpo del raton es al menos parcialmente intercambiado por secuencias de anticuerpo humano, o bien (ii) un anticuerpo entero humanizado en el que al menos partes de las regiones variables de un anticuerpo murino o de rata, tales como las regiones de armazon o al menos un aminoacido de un armazon, fueron intercambiadas a secuencias humanas o mutadas para ser menos inmunogenicas en seres humanos que comprenden dominios constantes humanos, o bien (iii) un anticuerpo entero quimerico en el que la region variable es de murino o rata y comprende dominios constantes humanos.
Dichos anticuerpos totalmente humanos, anticuerpos enteros humanizados y anticuerpos enteros quimericos o partes de los mismos, as! como los metodos para construir, identificar, probar, optimizar y seleccionar estas moleculas de anticuerpo con o sin secuencias adicionales adecuadas, as! como los metodos para construir, identificar, probar, optimizar y seleccionar los acidos nucleicos mas adecuados que codifican estas moleculas de anticuerpo son conocidos por los expertos en la tecnica.
Dicho fragmento de anticuerpo es cualquier fragmento de un anticuerpo que comprende al menos 20 aminoacidos de dicho anticuerpo entero, preferiblemente al menos 100 aminoacidos. En una realizacion preferida el fragmento de anticuerpo comprende la region de union del anticuerpo tal como un Fab, F(ab)2, multicuerpos que comprenden multiples dominios de union tales como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, anticuerpo de dominio unico o aficuerpos. En otra realizacion preferida el fragmento de anticuerpo comprende la region Fc con todo o partes de sus dominios constantes, preferiblemente que comprende el segundo dominio (dominio Cgamma2). En otra realizacion el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo entero truncado donde al menos un aminoacido, tramos de polipeptido o dominios enteros son suprimidos. Esas moleculas pueden ser combinadas con secuencias adicionales para estabilizacion o para mejorar la union de las moleculas tales como enlazadores.
Dicha molecula que comprende un fragmento de anticuerpo es cualquier molecula que comprende cualquiera de dichos fragmentos de anticuerpo u otros dominios de inmunoglobulina de al menos 20 aminoacidos. En una realizacion preferida dicha molecula que comprende un fragmento de anticuerpo son moleculas de fusion donde un fragmento de anticuerpo esta fusionado a otras secuencias de protelna tales como secuencias efectoras, por ejemplo citocinas, factores co-estimulatorios, toxinas o fragmentos de anticuerpo de otros anticuerpos a fin de generar moleculas con multiples especificidades de union tales como anticuerpos bi- o tri-especlficos, o secuencias de multimerizacion tales como dominios MBP (protelna de union a la manosa) para dar como resultado la multimerizacion de dominios de union, o secuencias para la deteccion, purificacion, secrecion o estabilizacion tales como etiquetas, senales de localization o enlazadores, o similares. En otra realizacion preferida dicha molecula que
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comprende un fragmento de anticuerpo son moleculas de fusion que comprenden la region Fc de un anticuerpo entero o partes del mismo, preferiblemente que comprenden el segundo dominio constante (dominio Cgamma2). Dichas moleculas de fusion son fusionadas por medios geneticos, donde las moleculas son codificadas por un acido nucleico o son fusionadas por co-expresion de al menos dos acidos nucleicos, por lo cual la fusion es causada por interacciones de protelna no covalentes o covalentes o son fusionadas por una combinacion de ambos. La fusion genetica entre un fragmento de anticuerpo y otra secuencia de polipeptido o molecula de protelna puede conseguirse por ingenierla genetica donde ambas partes son codificadas por un unico acido nucleico con o sin aminoacidos adicionales entre medias. En una realizacion preferida adicional dichas moleculas de fusion comprenden al menos una region de union de un fragmento de anticuerpo tal como un anticuerpo de dominio unico, o Fab o una secuencia de union no derivada de anticuerpos, tal como un dominio de lectina, y una region Fc o partes de la misma que comprenden el segundo dominio (dominio Cgamma). En otra realizacion preferida, las moleculas de fusion comprenden IL-2, IL-12, IL-15, GM-CSF, una toxina de peptido, o partes de la misma. Son fusionadas p.ej. por medios geneticos, donde las moleculas son codificadas por un acido nucleico o son condensadas por co-expresion de al menos dos acidos nucleicos, por lo cual la fusion es causada por interacciones de protelna no covalentes o covalentes o son fusionadas por un comion de un fragmento de anticuerpo tal como un anticuerpo de dominio unico, Fab o Fab que esta enlazado a secuencia de multimerizacion de MBP.
Todas aquellas moleculas de anticuerpo o partes de las mismas as! como los metodos para construir, identificar, probar y seleccionar estas moleculas de anticuerpo con o sin secuencias adicionales adecuadas, as! como metodos para construir, identificar, probar y seleccionar los acidos nucleicos mas adecuados que codifican estas moleculas de anticuerpo son conocidos por los expertos en la tecnica.
De acuerdo con la presente invencion el termino “composicion molecular de anticuerpo” significa las moleculas de cualquier molecula de anticuerpo expresadas en una celula huesped de la invencion que puede ser aislada. Dicha composicion molecular de anticuerpo comprende al menos una molecula de anticuerpo. Dicha composicion de anticuerpo comprende al menos una glicoforma de una molecula de anticuerpo. Dicha glicoforma de una molecula de anticuerpo significa una molecula de anticuerpo que lleva una glicosilacion particular o cadena de carbohidrato que es diferente en al menos un bloque constructor de azucar, por ejemplo, pero no limitado a, una galactosa adicional, acido sialico, bisecGlcNAc, fucosa, u otra modificacion de azucar tal como, pero no limitada a, acetilacion o sulfatacion de otra glicoforma de la misma molecula de anticuerpo. En otra realizacion de la invencion la composicion molecular de anticuerpo puede comprender moleculas de mas que una molecula de anticuerpo expresada en una celula huesped. En una realizacion preferida la composicion molecular de anticuerpo de la invencion comprende mas moleculas en porcentaje de tal glicoforma o tales glicoformas de la molecula de anticuerpo que median una actividad mas alta que una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo obtenida de al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NS0, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton, preferiblemente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], cuando se expresa en las mismas. En una realizacion preferida adicional la composicion molecular de anticuerpo de la invencion comprende mas moleculas de tal glicoforma o glicoformas de la molecula de anticuerpo en porcentaje que median en una citotoxicidad celular mediada por Fc mas alta y/o una union mejorada que la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo obtenida de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NS0, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton, preferiblemente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], cuando se expresa en las mismas.
De acuerdo con la presente invencion el termino “celula huesped de origen leucemico mieloide” o formulaciones equivalentes significa cualquier celula o llnea celular de origen leucemico mieloide, o cualquier celula o llnea celular mieloide humana o precursora mieloide que pueda ser obtenida de un paciente con leucemia, o cualquier celula o llnea celular mieloide humana o precursora mieloide que pueda ser obtenida de un donante humano, o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, o una mezcla de celulas o llneas celulares que comprenden al menos una de esas celulas mencionadas anteriormente.
En otra realizacion de la invencion dicha celula huesped de origen leucemico mieloide humano o dicha celula sangulnea humana inmortalizada de la invencion tambien comprende tales celulas o llneas celulares que fueron obtenidas fusionando al menos una de las celulas huesped mencionadas anteriormente, en particular las de origen leucemico mieloide, con otra celula de origen humano o animal, tales como, pero no limitadas a, linfocitos B, celulas CHO. Los expertos en la tecnica pueden identificar y usar fuentes y metodos adecuados para obtener, generar y/o inmortalizar celulas adecuadas de seres humanos para celulas huesped adecuadas de origen leucemico mieloide humano.
El termino celula o llnea celular derivada de dicha celula huesped significa cualquier celula o llnea celular que puede ser obtenida por cualquier medio de cultivo y clonacion con o sin mutacion previa o ingenierla genetica de dicha celula huesped de origen leucemico mieloide, y comprende la seleccion de aquellas celulas o llneas celulares derivadas de dicha celula huesped con las propiedades deseadas. Dicho cultivo y clonacion se basa en el hecho de que se pueden obtener clones de celulas con diferentes propiedades a partir de cultivos celulares primarios, cultivos de celulas e incluso cultivos de clones de celulas por rondas multiples de pasaje y clonacion de las celulas usando preferiblemente metodos de clonacion de celula unica tales como dilucion limitada o clasificacion de celulas basada en citometrla de flujo. En una realizacion preferida dicha celula o llnea celular derivada de dichas celulas huesped se selecciona por union a una lectina o anticuerpo de union a carbohidratos. Dicha mutacion puede ser realizada por
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tratamiento conocido por los expertos en la tecnica con mutagenos flsicos, qulmicos o biologicos, tales como, pero no limitados a, radiacion, agentes alquilantes o EMS (metanosulfonato de etilo), protelnas tales como lectinas, o partlculas de virus. Dicha ingenierla genetica puede ser realizada por metodos conocidos por los expertos en la tecnica tales como eliminacion de genes por medio de recombination homologa especlfica a sitio, uso de transposones, mutagenesis especlfica a sitio, transfection de ciertos acidos nucleicos, o silenciamiento de genes, o productos genicos. Los metodos para dicho cultivo y donation, dicha mutation y mutagenos y dicha ingenierla genetica son conocidos por los expertos en la tecnica, y se describen algunos ejemplos en detalle en la solicitud de patente internacional WO2005/017130 A2, la patente de EE.UU. 2003/0115614 A1, o se describen en la presente memoria. Los expertos en la tecnica pueden seleccionar y/o adoptar y/o modificar un metodo adecuado o combination de metodos para la generation de una celula o llnea celular adecuada derivada de dicha celula huesped de la invencion.
Dichas celula o llneas celulares derivadas de dicha celula huesped se seleccionan debido a propiedades de esas celulas que son ventajosas cuando se comparan con su celula o llnea celular parental, tales como, pero no limitadas a, tiempos de doblaje mas cortos, crecimiento mas rapido, posibilidad de crecer bajo densidades mas altas, pueden producir mas, crecen bajo condiciones exentas de suero y/o en medios exentos de protelnas, eficacias de clonacion mas altas, eficacias de transfeccion mas altas para ADN, velocidades de expresion mas altas de composiciones moleculares de anticuerpos, actividades mas altas para una composition molecular de anticuerpo expresada en las mismas, homogeneidades mas altas de una composicion molecular de anticuerpo expresada en la presente memoria, y/o robustez mas alta para aumentar a escala. Los metodos para seleccionar las celulas con propiedades ventajosas son conocidos por los expertos en la tecnica o se describen en la presente memoria. Un metodo para generar una celula huesped de la invencion puede comprender (a) incubar una celula de leucemia mieloide humana con una lectina o un anticuerpo que reconoce un epltopo desialilado o un epltopo que carece de un acido sialico pero que se une no o solo significativamente menos a la forma sialilada del epltopo, y (b) aislar celulas unidas a dicha lectina o anticuerpo, y (c) cultivar las celulas aisladas durante un tiempo adecuado, y (d) seleccionar una celula, celulas o un clon de celula que se une fuertemente a una lectina o un anticuerpo que se une a un epltopo con acido sialico.
Es mas preferido el metodo descrito anteriormente, en donde dicha lectina o dicho anticuerpo que reconoce un epltopo desialilado o un epltopo que carece de un acido sialico es Nemod-TF1, Nemod-TF2, A78-G/A7, o PNA, y en donde dicha celula de leucemia mieloide humana es la llnea celular K562, KG-1, MUTZ-3, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-H9, H9, NM-H10.
El metodo para generar una celula huesped de la invention con alta sialilacion y propiedades biotecnologicas favorables tales como rapido crecimiento celular comprende (i) incubar una celula de leucemia mieloide humana de la invencion como celula originadora, preferiblemente K562, con una lectina o preferiblemente un anticuerpo que reconoce un epltopo desialilado o un epltopo que carece de un acido sialico pero que se une no o menos a la forma sialilada del epltopo, tal como, pero no limitado a, Nemod-TF1, Nemod-TF2, A78-G/A7, o PNA (lectina de Arachis hypogaea, aglutinina de cacahuete), preferiblemente unido a perlas magneticas, y (ii) aislar celulas unidas a dicha lectina o anticuerpo, y (iii) cultivar las celulas aisladas durante un tiempo adecuado, y (iv) seleccionar una celula, celulas o un clon de celulas, preferiblemente despues de clonacion celular unica, que se une fuertemente a una lectina o un anticuerpo que se une a un epltopo con acido sialico, tal como SNA (aglutinina de Sambucus nigra) o MAL (lectina de Maackia amurensis), MAL I (lectina de Maackia amurensis I), preferiblemente SNA.
Un metodo para generar una celula huesped de la invencion con alta sialilacion y propiedades biotecnologicas favorables tales como rapido crecimiento celular puede comprender (i) incubar K562 con Nemod-TF1, Nemod-TF2, A78-G/A7, o PNA unido a perlas magneticas, y (ii) aislar celulas unidas a dicha lectina o anticuerpo, y (iii) cultivar las celulas aisladas durante un tiempo adecuado de aproximadamente una a 6 semanas, y (iv) seleccionar un clon de celulas despues de clonacion celular unica, que se une fuertemente a SNA. Esas celulas pueden unirse mas fuertemente a SNA que la celula originadora, o pueden crecer mas rapido que la celula originadora.
La celula originadora puede ser tratada con metanosulfonato de etilo antes de la etapa (i).
Los expertos en la tecnica pueden seleccionar condiciones y metodos adecuados y optimizarlos para generar estas celulas huesped. Se pueden encontrar mas detalles para algunas de las etapas en las solicitudes de patente internacional WO2005/017130 A2 y WO2005/080585 A1.
Se pueden usar celulas sangulneas humanas inmortalizadas como celulas huesped, que se seleccionan de los siguientes grupos 1 a 4:
(a) grupo 1, que comprende celulas huesped que tienen una alta actividad de sialilacion tal como K562;
(b) grupo 2, que comprende celulas huesped que tienen debido a una deficiencia genetica o medios de
inhibition de la expresion (p.ej. RNAi) una baja o ninguna sialilacion; actividad comparable a y que incluye
NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605] y GTX-2;
(c) grupo 3, que comprende celulas huesped que tienen un grado de sialilacion mas alto que K562 tales como
NM-H9 y NM-H9D8;
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(d) grupo 4, que comprende celulas huesped que tienen una baja o incluso ninguna actividad de fucosilacion tales como NM-H9D8-E6 y NM H9D8-E6Q12.
Dicha llnea celular generada puede ser NM-H9D8. Como clon celular mas preferido generado por el metodo descrito anteriormente, se selecciono NM-H9D8 y se deposito bajo DSM ACC 2806 en el “DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” en Braunschweig (Alemania), por Glycotope GmbH, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin (Alemania) el 15 de septiembre de 2006. Otros clones celulares tales como NM-E-2F9, NM-C-2F5 o NM-H9D8-E6 (DSM ACC 2807) se seleccionaron por incubacion de las celulas parentales con una o mas lectinas y siguiendo clonacion celular unica usando clasificacion celular por citometrla de flujo, por lo que se realizo un procedimiento de seleccion positiva o una combination de selection positiva y negativa. Para obtener clones celulares con caracterlsticas estables los clones celulares obtenidos se reclonaron al menos una vez por dilution limitada como se describe anteriormente.
Dicha celula sangulnea humana inmortalizada, que es preferiblemente una celula huesped de origen leucemico mieloide, puede crecer y producir la composition molecular de protelna/anticuerpo bajo condiciones exentas de suero. Dicha celula sangulnea humana inmortalizada, que es preferiblemente una celula huesped de origen leucemico mieloide, puede crecer bajo condiciones exentas de suero. Ademas, tambien el acido nucleico que codifica la molecula de protelna/anticuerpo puede ser introducido en estas celulas y la composicion molecular de proteina/anticuerpo tambien puede ser aislada bajo condiciones exentas de suero. Poder trabajar bajo condiciones exentas de suero es particularmente importante cuando se preparan proteinas terapeuticas, ya que las contaminaciones de suero son inaceptables en el proceso regulatorio.
La celula huesped de origen leucemico mieloide humano puede ser la celula o linea celular K562, KG1, MUTZ-3, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605] o una celula o linea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, o una mezcla de celulas o lineas celulares que comprende al menos una de esas celulas mencionadas anteriormente. La celula huesped se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 [DSM ACC 2806], o NM-H9D8-E6 DSM ACC 2807, o NM H9D8-E6Q12 (DSM ACC 2856), GT-2X (depositada bajo DSM ACC2858 en el “DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” en Braunschweig (Alemania), por Glycotope GmbH, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin (Alemania) el 7 de septiembre de 2007) o una celula o linea celular derivada de una cualquiera de estas lineas celulares.
Las celulas NM-F9 [DSM ACC2606] y NM-D4 [DSM ACC2605] fueron depositadas por Nemod Biotherapeutics GmbH & Co.KG, Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin (Alemania), que autorizo al solicitante a hacer referencia al material biologico depositado descrito en la presente memoria.
La celula huesped de origen leucemico mieloide humano puede ser la celula o linea celular K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], o una celula o linea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped.
La celula huesped de origen leucemico mieloide humano puede ser la celula o linea celular K562, tal como K562 [ATCC CCL-243], o una celula o linea celular derivada de dicha celula huesped.
La celula huesped de origen leucemico mieloide humano puede ser la celula o linea celular K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, o GT-2X, o NM H9D8- E6Q12 o una celula o linea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped.
La celula huesped de origen leucemico mieloide humano puede ser la celula, celulas o linea celular K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, o GT-2X, o NM H9D8-E6Q12 que crecen y producen una composicion molecular de anticuerpo de la invention bajo condiciones exentas de suero, y lo mas preferido en la presente memoria una celula, celulas o linea celular que crecen bajo condiciones exentas de suero y el acido nucleico que codifica la molecula de anticuerpo puede ser introducido en estas celulas y se aisla una composicion molecular de anticuerpo bajo condiciones exentas de suero.
La celula huesped de origen leucemico mieloide humano puede ser la celula, celulas o linea celular NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, GT-2X, o NM-H9D8-E6, o NM H9D8-E6Q12 que crecen y producen una composicion molecular de anticuerpo de la invencion bajo condiciones exentas de suero, y lo mas preferido en la presente memoria una celula, celulas o linea celular que crecen bajo condiciones exentas de suero y el acido nucleico que codifica la molecula de anticuerpo puede ser introducido en estas celulas y se aisla una composicion molecular de anticuerpo bajo condiciones exentas de suero.
Opcionalmente, la celula sangulnea humana inmortalizada y la celula huesped de origen leucemico mieloide humano no es una de las lineas celulares deficientes en sialilacion NM-F9 y NM-D4 o una celula o linea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped que tienen las mismas propiedades. Esto es beneficioso en caso de que se tenga como objetivo un alto grado de sialilacion. La celula huesped se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en K562, NM H9D8, NM H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12 y celulas huesped derivadas de
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cualquiera de estas celulas huesped.
Las lineas celulares descritas en conjuncion con la presente invencion tiene un tiempo de doblado de 14 a 24 horas, que es muy rapido en comparacion con otros sistemas de expresion mamiferos, dependiendo de la linea celular de la invencion.
Ademas, no se conoce un sistema vectorial de alta expresion adecuado general para expresion de anticuerpos de alto rendimiento en lineas celulares humanas, dado que las celulas humanas normalmente no carecen del gen DHFR y por tanto no permiten el uso del sistema de amplificacion dhfr/metotrexato. Por tanto, segun una realizacion adicional de la presente invencion se proporciona una realizacion que permite aumentar el rendimiento de producto.
Segun esta realizacion, adicionalmente se introduce un acido nucleico en la celula huesped, que codifica una variante DHFR resistente al antifolato. La dihidrofolato reductasa, o DHFR, reduce el acido dihidrofolico a acido tetrahidrofolico, usando DADPH como donador de electrones, que puede ser convertido en los tipos de cofactores de tetrahidrofolato usados en la quimica de la transferencia del carbono 1. Los antifolatos inhiben la enzima DHFR, conduciendo a muerte celular. Para proporcionar un acido nucleico que codifica una variante DHFR resistente al antifolato, se proporciona una herramienta para seleccionar celulas que fueron transfectadas con el acido nucleico y ademas, permite una amplificacion de los acidos nucleicos a ser expresados en las celulas huesped.
El acido nucleico que codifica dicha variante DHFR resistente al antifolato puede ser p.ej. introducido por medio de un vector independiente al acido nucleico que codifica la proteina/anticuerpo a ser expresado en la celula huesped. Se prefiere transfectar el vector que codifica la variante DHFR resistente al antifolato basicamente al mismo tiempo que el vector que comprende el acido nucleico que codifica la proteina/anticuerpo. Esta realizacion estimula que el acido nucleico que codifica dicha proteina/anticuerpo a ser expresada se integre en el genoma de la celula huesped en el mismo sitio genetico que el acido nucleico que codifica la variante DHFR resistente al antifolato, lo que es beneficioso en caso de que se desee una amplificacion del acido nucleico que codifica dicha proteina/anticuerpo.
Alternativamente, se puede usar un sistema vectorial que comprende el acido nucleico que codifica al menos una parte de dicha proteina a ser expresada asi como el acido nucleico que codifica la variante DHFR resistente al antifolato.
Las celulas huesped son cultivadas despues con dicho antifolato. Esto tiene el efecto de que esas celulas huesped, que fueron transfectadas con exito con el acido nucleico que codifica dicha variante DHFr resistente al antifolato, pueden crecer a pesar de la presencia del antifolato. De este modo se pueden seleccionar celulas transfectadas con exito.
Segun una realizacion adicional, la secuencia de acido nucleico que codifica al menos parte de dicha proteina/anticuerpo es amplificada por etapas aumentando la concentracion de antifolato en el cultivo. El aumento de la concentracion de antifolato en el medio de cultivo conduce a un aumento de las copias de la variante DHFR resistente al antifolato en el genoma. Se supone que esto se consigue por eventos de recombinacion en las celulas. De este modo, tambien el numero de copias del acido nucleico que codifica al menos parte de la proteina a ser expresada es tambien aumentado si el acido nucleico que codifica dicha proteina esta situado cerca de la variante DHFR resistente al antifolato en el genoma, lo que puede ser promovido transfectando vectores independientes simultaneos o usando un vector que comprende ambas secuencias de acido nucleico. Mediante este mecanismo se obtienen celulas huesped que expresan la proteina/anticuerpo en un rendimiento mas alto.
Preferiblemente, el antifolato es metotrexato.
La secuencia de acido nucleico que codifica dicha proteina, preferiblemente una molecula de anticuerpo o una parte de la misma, es amplificada preferiblemente cultivando dicha celula huesped con al menos dos rondas sucesivas de antifolato, preferiblemente metotrexato, por lo que la concentracion de dicho antifolato, preferiblemente metotrexato, es aumentada en al menos 100% en cada ronda sucesiva.
Un acido nucleico adecuado para proporcionar dicha variante DHFR resistente al antifolato codifica un polipeptido del grupo de secuencia ID No. 1 a 9, preferiblemente secuencia ID No. 1.
Se describen con mas detalle tambien mas detalles y realizaciones de este sistema de amplificacion a continuation.
Un metodo para producir una proteina, preferiblemente una composition molecular de anticuerpo, puede comprender:
(a) introducir en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano al menos un acido nucleico que codifica una proteina y preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma, y al menos un acido nucleico que comprende al menos una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1; y
(b) amplificar la secuencia de acido nucleico que codifica dicha proteina, preferiblemente una molecula de
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anticuerpo o al menos una parte de la misma, cultivando dicha celula huesped con metotrexato, preferiblemente cultivando dicha celula huesped con al menos dos rondas sucesivas de metotrexato, por lo que la concentration de metotrexato es aumentada preferiblemente en al menos aproximadamente 50%, mas preferiblemente en al menos aproximadamente 100%, en cada ronda sucesiva; y
(c) cultivar dicha celula huesped en condiciones que permiten la production de dicha protelna, preferiblemente una composition molecular de anticuerpo, y
(d) aislar dicha protelna, que preferiblemente es una composicion molecular de anticuerpo.
Un metodo para producir una composicion de protelna, preferiblemente una composicion molecular de anticuerpo, que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada puede comprender:
(a) introducir en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano al menos un acido nucleico que codifica una protelna, preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma; y
(b) cultivar dicha celula huesped en condiciones que permiten la produccion de dicha composicion de protelna, que preferiblemente es una composicion molecular de anticuerpo; y
(c) aislar dicha composicion de protelna, que preferiblemente es una composicion molecular de anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada.
Un metodo para producir una composicion de protelna, preferiblemente una composicion molecular de anticuerpo, que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada puede comprender:
(a) introducir en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano al menos un acido nucleico que codifica una protelna, preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma; y
(b) cultivar dicha celula huesped en condiciones que permiten la produccion de dicha composicion de protelna, que preferiblemente es una composicion molecular de anticuerpo; y
(c) aislar dicha composicion de protelna, que preferiblemente es una composicion molecular de anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada.
Ademas, un metodo para producir una composicion de protelna, preferiblemente una composicion molecular de anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada puede comprender:
(a) introducir en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano al menos un acido nucleico que codifica una protelna, preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma, y al menos un acido nucleico que comprende al menos una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1; y
(b) amplificar la secuencia de acido nucleico que codifica dicha molecula de anticuerpo o una parte de la misma cultivando dicha celula huesped con metotrexato, preferiblemente cultivando dicha celula huesped con al menos dos rondas sucesivas de metotrexato, por lo que la concentracion de metotrexato es aumentada preferiblemente en al menos aproximadamente 50%, mas preferiblemente en al menos aproximadamente 100%, en cada ronda sucesiva; y
(c) cultivar dicha celula huesped en condiciones que permiten la produccion de dicha composicion de protelna, que preferiblemente es una composicion molecular de anticuerpo, y
(d) aislar dicha composicion de protelna, que preferiblemente es una composicion molecular de anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada.
Dicho acido nucleico que codifica una molecula de anticuerpo o al menos una parte de ella y dicho acido nucleico que comprende al menos una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1, puede ser un acido nucleico o dos acidos nucleicos independientes.
Para seleccionar una celula huesped adecuada para obtener una protelna que tiene un perfil de glicosilacion optimizado, es ventajoso realizar el metodo de cribado/seleccion segun la presente invention. Despues de que se ha determinado una celula huesped adecuada por el metodo de selection segun la presente invencion, dicha celula huesped se usa entonces para producir una protelna como se describe en la presente memoria.
Por tanto, la invencion proporciona un metodo para seleccionar una celula huesped para producir una protelna que tiene al menos una de las siguientes caracterlsticas de glicosilacion:
(i) tiene una cantidad de estructuras G2 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% mas alta en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC N° CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
(ii) comprende mas que 35% de estructuras G2 presentes en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas
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(iii) tiene una cantidad de estructuras G0 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% mas baja en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
(iv) comprende menos que 22% de estructuras G0 presentes en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion de protelna; y/o
(v) comprende una cantidad de fucosa en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% menos en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCc No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
(vi) comprende al menos 2% de estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que contiene GlcNAc bisectora; y/o
(vii) tiene un patron de sialilacion que esta alterado en comparacion con el patron de sialilacion de al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma, en donde
- tiene un grado de sialilacion aumentado, con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 15% mas alta en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC N° CRL- 9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; o
- tiene un grado de sialilacion disminuido, con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 15% mas baja en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC N° CRL- 9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma;
mediante las siguientes etapas
(a) introducir en al menos dos celulas sangulneas humanas inmortalizadas diferentes como celulas huesped al menos un acido nucleico que codifica una protelna o al menos una parte de la misma; en donde al menos una de dichas celulas huesped es una celula sangulnea humana inmortalizada seleccionada del grupo que consiste en las llneas celulares DSM ACC2858 (GT-2X), DSM ACC2806 (NM-H9D8), DSM ACC2807 (NM- H9D8-E6), DSM ACC2856 (NM-H9D8-E6Q12) o una celula o llnea celular derivada de las mismas; y
(b) cultivar dichas al menos dos celulas huesped diferentes, en donde cada celula huesped diferente produce una composicion de protelna que tiene un patron de glicosilacion divergente del patron de glicosilacion producido por la otra celula huesped;
(c) aislar dichas composiciones de protelna expresadas que llevan un patron de glicosilacion diferente de las al menos dos celulas huesped diferentes; y
(d) seleccionar dicha celula huesped que produce una composicion de protelna que tiene al menos una de las caracterlsticas de glicosilacion definidas en (i) a (vii).
Los detalles con respecto al patron de glicosilacion y llneas celulares adecuadas para obtener dicho patron se describen anteriormente y son tambien aplicables a y adecuadas para el metodo de cribado para seleccionar una celula huesped adecuada segun la presente invencion.
Realizar una etapa de cribado respectiva antes de establecer el metodo de produccion descrito en la presente memoria es ventajoso, ya que esta realizacion permite la selection de la celula huesped mas adecuada para producir la composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene un patron de glicosilacion optimizado. Segun la idea basica de este sistema de cribado, la protelna de interes es expresada en al menos dos llneas celulares diferentes que tienen un patron de glicosilacion divergente. P.ej. una llnea celular puede presentar un alto grado de sialilacion y la otra puede presentar un bajo grado de sialilacion (o fucosilacion y/o galactosilacion) o incluso caracterlsticas de glicosilacion desconocidas. Los productos obtenidos a partir de las diferentes llneas celulares, por consiguiente, llevan un patron de glicosilacion caracterlstico para la llnea celular respectiva.
Las caracterlsticas de las protelnas producidas en las diferentes llneas celulares p.ej. con respecto a su actividad (p.ej. ADCC y CDC en anticuerpos), afinidad, semivida en suero y otras caracterlsticas importantes pueden ser determinadas entonces. Los resultados permiten elegir la llnea celular que tiene la mejor maquinaria de glicosilacion a fin de obtener una protelna que esta optimizada con respecto a su patron de glicosilacion. Como las caracterlsticas
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decisivas (p.ej., afinidad, semivida en suero, etc.) varlan, este metodo es particularmente ventajoso.
Preferiblemente, dicha protelna a ser producida presenta al menos una de las siguientes caracterlsticas:
(a) en caso de que sea una composicion molecular de anticuerpo, tiene una citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada que es al menos 2 veces mas alta que la citotoxicidad celular mediada por Fc de al menos una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; y/o
(b) en caso de que sea una composicion molecular de anticuerpo, tiene una union mediada por antlgeno o mediada por Fc aumentada que es al menos 50% mas alta que la union de al menos una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; y/o
(c) tiene un rendimiento medio o maximo aumentado de dicha composicion molecular de protelna que es al menos 10% mas alto que el rendimiento de al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096].
Al menos una de dichas celulas huesped es una celula sangulnea humana inmortalizada seleccionada del grupo que consiste en NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de las mismas.
Una celula huesped de origen leucemico mieloide humano se puede seleccionar de uno de los siguientes grupos 1 a 4:
(a) grupo 1, que comprende celulas huesped que tienen una alta actividad de sialilacion tales como K562 o una celula o llnea celular derivada de la misma,
(b) grupo 2, que comprende celulas huesped que tienen debido a una deficiencia genetica o medios de supresion de la expresion (p.ej. RNAi) una baja o ninguna sialilacion, tales como NM-F9 [DSM ACC2606], nM-D4 [DSM ACC2605] y GtX-2 o una celula o llnea celular derivada de las mismas,
(c) grupo 3, que comprende celulas huesped que tienen un grado de sialilacion mas alto que K562, tales como NM-H9 y NM-H9D8 o una celula o llnea celular derivada de las mismas,
(d) grupo 4, que comprende celulas huesped que tienen una baja o ninguna actividad de fucosilacion, tales como NM-H9D8-E6 o una celula o llnea celular derivada de la misma.
Preferiblemente, al menos dos o tres celulas huesped usadas en el procedimiento de cribado se seleccionan de los grupos anteriores. Sin embargo, tambien es posible incluir otras celulas huesped derivadas de otro origen (p.ej. celulas Hek 293) en el sistema de cribado a fin de ampliar mas los diferentes patrones de glicosilacion analizados.
La celula huesped obtenida produce preferiblemente una protelna, en particular un anticuerpo que presenta al menos uno de los patrones de glicosilacion mostrados en la Tabla 9.
Segun la invencion el termino introducir un acido nucleico significa cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica para introducir un acido nucleico, o dos o mas acidos nucleicos en una celula o celulas huesped mamlferas por metodos tales como, pero no limitados a, electroporacion, transfeccion usando llpidos cationicos, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, o infeccion por partlculas de virus tales como adenovirus o retrovirus o una combinacion de los mismos. Los expertos en la tecnica pueden seleccionar y optimizar un metodo adecuado para la introduction de uno o mas acidos nucleicos.
De acuerdo con la presente invencion el acido nucleico que codifica una molecula de anticuerpo es cualquier acido nucleico que codifica la molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma. La molecula de anticuerpo de la invencion puede ser codificada de este modo por una unica o por multiples moleculas de acido nucleico.
Dicha parte de una molecula de anticuerpo codificada por dicho acido nucleico comprende al menos una secuencia de 20 aminoacidos, mas preferiblemente al menos 100 aminoacidos de una molecula de anticuerpo o de un dominio constante y/o variable de la molecula de anticuerpo. La secuencia comprendida que codifica la molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma puede ser separada por al menos otra secuencia, tal como p.ej. un intron. La secuencia de un dominio puede comprender al menos una mutation de aminoacidos.
De acuerdo con la presente invencion el acido nucleico que codifica una molecula de protelna es cualquier acido nucleico que codifica la molecula de protelna o al menos una parte de la misma. La molecula de protelna puede ser codificada de este modo por una unica o por multiples moleculas de acido nucleico. La secuencia que codifica la molecula de protelna o al menos una parte de la misma puede ser separada por al menos otra secuencia, tal como p.ej. un intron. La secuencia de la molecula de protelna puede comprender al menos una mutacion de aminoacidos.
En una realization preferida el acido nucleico que codifica una molecula de anticuerpo o al menos una parte de ella comprende al menos un dominio variable y/o un dominio constante de la molecula de anticuerpo, mas preferiblemente ambos, mas preferiblemente tal que comprende una secuencia humana al menos en la parte del dominio o dominios constantes, e incluso mas preferido tal que comprende el dominio Cgamma2 humano, y lo mas
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preferiblemente comprende todos los dominios constantes de la region Fc de un anticuerpo humano de una cierta clase o subclase y el dominio variable.
Segun una realizacion la protelna y en particular la molecula de anticuerpo es codificada por un unico acido nucleico. En otra realizacion preferida la protelna, en particular una molecula de anticuerpo, es codificada por dos acidos nucleicos o por tres acidos nucleicos.
En una realizacion preferida adicional un acido nucleico codifica una parte de la molecula de anticuerpo que codifica para el dominio variable y/o constante de la cadena ligera, y otro acido nucleico codifica para otra parte de la molecula de anticuerpo que codifica para el dominio variable y/o al menos un dominio constante de la cadena pesada.
De acuerdo con la presente invencion el acido nucleico que comprende al menos una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9 significa que dicho acido nucleico codifica para al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1. Cualquier numero de estas secuencias es adecuado, siempre y cuando pueda ser introducido con exito en la celula huesped de la invencion. En una realizacion preferida dicho acido nucleico codifica para uno, dos o tres polipeptidos del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, mas preferiblemente para un polipeptido, y lo mas preferiblemente para el polipeptido de secuencia #1. En el sentido de la invencion dicho acido nucleico tambien puede codificar para un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1, que tiene al menos una mutacion de aminoacidos, siempre y cuando esta mutacion permita la amplificacion del acido nucleico que codifica una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma mediante metotrexato como se describe en otras partes de la presente memoria.
La secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1, puede ser parte de la misma molecula de acido nucleico que el acido nucleico que codifica una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma como se describe en otras partes de la presente memoria o en moleculas de acido nucleicos independientes.
En otra realizacion preferida de la invencion un acido nucleico independiente que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia seleccionada del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, lo mas preferiblemente secuencia #1, puede ser introducido en la celula huesped de la invencion independientemente de dicho acido nucleico o acidos nucleicos que codifican la molecula de anticuerpo o partes de la misma de la invencion. Esto puede hacerse introduciendo dicho acido nucleico independiente que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia seleccionada del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, junto con, antes o despues de introducir dicho acido nucleico o acidos nucleicos que codifican la molecula de anticuerpo o partes de la misma de la invencion. En una realizacion preferida esto se realiza en paralelo, y en otra realizacion preferida la celula huesped de la invencion ya comprende dicho acido nucleico independiente que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia seleccionada del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, lo mas preferiblemente secuencia #1.
La amplificacion de dicho acido nucleico establemente introducido o varias copias de dicho acido nucleico que codifica la protelna, que es preferiblemente una molecula de anticuerpo o fraccion del mismo, puede ser realizada como se describe en otras partes de la presente memoria y en los ejemplos usando metotrexato.
En una realizacion preferida el acido nucleico que codifica una protelna, que es preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma, comprende al menos otro elemento genetico que permite la seleccion de aquellas celulas en las que el acido nucleico fue introducido con exito, tales como, pero no limitados a, genes con resistencia a antibioticos, tal como, pero no limitado a, el elemento genetico que codifica para una resistencia a puromicina o neomicina. Ademas estos acidos nucleicos comprenden uno o varios elementos geneticos tales como promotores, potenciadores, sitios de poliadenilacion, y/o intrones, para expresion de la molecula de anticuerpo en las celulas huesped de la invencion, y elementos geneticos tales como de origen bacteriano de replicacion, promotores y elementos para seleccion de bacterias transfectadas tales como genes de resistencia a antibioticos para multiplicar el acido nucleico en una bacteria.
Los promotores adecuados incluyen el promotor del gen IE (temprano inmediato) del citomegalovirus (CMV), promotor temprano SV40, el promotor de un retrovirus, promotor de metalotioneina, promotor del choque de calor, promotor SR alfa, promotor EF-1 alfa, etc. El potenciador del gen IE del CMV humano se puede usar en combinacion con el promotor.
Esos y mas elementos geneticos son conocidos por los expertos en la tecnica, y pueden ser seleccionados, combinados, optimizados e introducidos en dicho acido nucleico que codifica una protelna, que es preferiblemente un molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma por los expertos en la tecnica. Las realizaciones preferidas de dicho acido nucleico que codifica una protelna, que es preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma o una combinacion de acidos nucleicos se describen en la presente memoria y en los ejemplos, as! como elementos geneticos preferidos para uso y combinacion, sin embargo, la invencion no esta
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restringida al uso de esos, y pueden ser combinados u optimizados adicionalmente por los expertos en la tecnica.
Los expertos en la tecnica pueden seleccionar y/o combinar el elemento genetico adecuado, construir los consiguientes vectores de acido nucleico o elementos para introducir uno o mas acidos nucleico en una llnea celular segun la invencion.
Dicho acido nucleico o combination de acidos nucleicos que codifican la protelna, que es preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma, as! como dichos elementos geneticos adicionales, as! como los metodos para introducirlos, tal como transfectarlos en las celulas huesped de la invencion para expresion de la composition molecular de anticuerpo o en bacterias para multiplication son conocidos por los expertos en la tecnica, as! como los metodos para construir, identificar, probar, optimizar, seleccionar y combinar estos acido o acidos nucleicos y combinarlos con secuencias adicionales adecuadas para la selection de aquellas celulas que estan transfectadas con exito, as! como metodos para construir, identificar, probar y seleccionar los acidos nucleicos mas adecuados que codifican estas moleculas de anticuerpo son conocidos por los expertos en la tecnica.
Se describen en detalle realizaciones preferidas de la invencion en los ejemplos.
En una realization preferida de la invencion el acido nucleico que codifica una protelna, que es preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma, comprende un elemento genetico para la seleccion de aquellas celulas huesped de la invencion en las que el acido nucleico esta introducido con exito, tal como, pero no limitado a, neomicina o puromicina, mas preferiblemente comprende ademas un promotor tal como EF-1 alfa o promotor CMV, mas preferiblemente comprende ademas un potenciador CMV, mas preferiblemente comprende ademas un elemento genetico que permite la seleccion de bacterias que estan transfectadas con el acido nucleico y un elemento genetico para replication tal como el origen de replication ColEI para multiplicacion de dicho acido nucleico en bacterias, e incluso mas preferiblemente comprende ademas un elemento genetico para multiplicacion de dicho acido nucleico en celulas COS tales como el origen SV40. Estos elementos son conocidos por los expertos en la tecnica y pueden ser seleccionados, combinados, optimizados y usados por los expertos en la tecnica.
En una realizacion incluso mas preferida de la invencion dicho acido nucleico descrito anteriormente que codifica una molecula de protelna o al menos una parte de la misma comprende una secuencia de acido nucleico. Preferiblemente dicho acido nucleico que codifica una molecula de protelna o al menos una parte de la misma codifica adicionalmente para el elemento genetico que codifica resistencia a puromicina, o resistencia a neomicina, o una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una secuencia seleccionada del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, lo mas preferiblemente secuencia #1.
En una realizacion incluso mas preferida de la invencion dicho acido nucleico descrito anteriormente que codifica una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma comprende al menos una secuencia que codifica el dominio variable y al menos un dominio constante de la cadena pesada y/o ligera de la molecula de anticuerpo.
En una realizacion incluso mas preferida de la invencion dicho acido nucleico descrito anteriormente que codifica una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma comprende al menos una secuencia que codifica el dominio variable y el dominio constante de la cadena ligera de la molecula de anticuerpo o el dominio variable y todos los dominios constantes de la cadena pesada de la molecula de anticuerpo entera.
En una realizacion incluso mas preferida de la invencion uno de dicho acido nucleico descrito anteriormente codifica al menos una parte de la molecula de anticuerpo que comprende al menos una secuencia que codifica el dominio variable y el dominio constante de la cadena ligera de la molecula de anticuerpo y un segundo de dicho acido nucleico descrito anteriormente codifica al menos otra parte de la molecula de anticuerpo que comprende al menos una secuencia que codifica el dominio variable y al menos un dominio constante, preferiblemente todos los dominios constantes de la cadena pesada de la molecula de anticuerpo, ambos acidos nucleicos son introducidos en la misma celula huesped de la invencion. Preferiblemente uno de dichos acidos nucleicos codifica adicionalmente para el elemento genetico que codifica resistencia a puromicina y el otro dicho acido nucleico codifica adicionalmente para el elemento genetico que codifica resistencia a neomicina.
En una realizacion incluso mas preferida de la invencion dicho acido nucleico descrito anteriormente que codifica una molecula de protelna o al menos una parte de la misma comprende al menos dos secuencias de acido nucleico que codifican dos secuencias de aminoacidos de la molecula de protelna o al menos una parte de la misma.
Preferiblemente uno de dichos acidos nucleicos codifica adicionalmente para el elemento genetico que codifica resistencia a puromicina, un otro dicho acido nucleico codifica adicionalmente para el elemento genetico que codifica resistencia a neomicina. Mas preferiblemente uno de dichos acidos nucleicos codifica adicionalmente para el elemento genetico que codifica resistencia a puromicina o neomicina, preferiblemente resistencia a puromicina, y el otro dicho acido nucleico comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una secuencia seleccionada del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, lo mas preferiblemente secuencia #1.
En una realizacion incluso mas preferida de la invencion dicho acido nucleico descrito anteriormente que codifica
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una molecula de protelna o al menos una parte de la misma comprende tres secuencias de acido nucleico que codifican tres secuencias de aminoacidos de la molecula de protelna o al menos una parte de la misma.
Preferiblemente uno de dichos acidos nucleicos codifica adicionalmente para el elemento genetico que codifica resistencia a puromicina, otro dicho acido nucleico codifica adicionalmente para el elemento genetico que codifica resistencia a neomicina, y un otro dicho acido nucleico comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una secuencia seleccionada del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, lo mas preferiblemente secuencia #1.
En una realizacion incluso mas preferida uno de dichos acidos nucleicos codifica adicionalmente para el elemento genetico que codifica resistencia a puromicina o neomicina y el otro dicho acido nucleico comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una secuencia seleccionada del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, lo mas preferiblemente secuencia #1. En una realizacion incluso mas preferida uno de dichos acidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican el dominio variable y el dominio constante de la cadena ligera y comprende ademas a una secuencia de acido nucleico que codifica al menos una secuencia seleccionada del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, lo mas preferiblemente secuencia #1, y el otro dicho acido nucleico comprende secuencias que codifican el dominio variable y al menos un dominio constante, preferiblemente todos los dominios constantes, de la cadena pesada de la molecula de anticuerpo y comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica para una resistencia a puromicina o neomicina, preferiblemente resistencia a puromicina.
En una realizacion incluso mas preferida de la invencion dicho acido nucleico que codifica la molecula de anticuerpo
0 al menos una parte de la misma comprende al menos una secuencia que codifica el dominio variable y el dominio constante de la cadena ligera de la molecula de anticuerpo y al menos una secuencia que codifica el dominio variable y al menos un dominio constante, preferiblemente todos los dominios constantes de la cadena pesada de la molecula de anticuerpo.
En una realizacion preferida de la invencion los dominios constantes codificados por acidos nucleicos anteriores o descritos en otras partes son dominios constantes humanos de IgG o IgM, preferiblemente IgG1, IgG4 o IgM humanos, o un dominio o una combinacion de dominios de los mismos, por lo cual preferiblemente se usan secuencias genomicas o secuencias derivadas de secuencias genomicas que comprenden al menos un intron, que se pueden ser seleccionados, construidos y optimizados por los expertos en la tecnica.

En una realizacion preferida adicional de la invencion dicho acido nucleico que codifica una protelna, que es
preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma comprende ademas el promotor EF-
1 alfa / potenciador CMV o un promotor derivado del promotor CMV, preferiblemente CMV-E.

En una realizacion preferida adicional de la invencion dicho acido nucleico que codifica una proteina, que es

preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma comprende ademas un peptido de
senales de secrecion, preferiblemente la senal de secrecion del receptor de linfocitos T.
En una realizacion incluso mas preferida de la invencion dicho acido nucleico que codifica una proteina, que es preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma comprende ademas un peptido de senales de secrecion, preferiblemente la secuencia #10.
Dicho acido nucleico o combinacion de acidos nucleicos que codifica una proteina, que es preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma, as! como dichos elementos geneticos adicionales, as! como los metodos para introducirlos son conocidos por los expertos en la tecnica, as! como los metodos para construir, identificar, probar, optimizar, seleccionar y combinar estos acidos o acidos nucleicos y combinarlos con secuencias adicionales adecuadas para la selection de aquellas celulas que estan transfectadas con exito, as! como metodos para construir, identificar, probar y seleccionar los acidos nucleicos mas adecuados que codifican estas moleculas de anticuerpos son conocidos por los expertos en la tecnica.
Se describen en detalle realizaciones preferidas de la invencion en los ejemplos.
La introduction del acido nucleico puede ser transiente o bien estable.
De acuerdo con la presente invencion el termino amplificar la secuencia de acido nucleico que codifica una protelna o molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma cultivando dicha celula huesped con un antifolato, en particular metotrexato significa que una celula huesped de la invencion descrita en otras partes de la presente memoria en la que al menos un acido nucleico que codifica la protelna a ser expresada tal como p.ej. una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma, y al menos un acido nucleico que comprende al menos una secuencia de acido nucleico que codifica una variante de DHFR resistente al antifolato, preferiblemente al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1, se introdujo y se cultiva mediante al menos una concentration de antifolato, preferiblemente metotrexato. Un tiempo de cultivo tipico es entre una y dos semanas para cada ronda, a concentraciones tipicas de aproximadamente 20 nM a 3.000 nM, preferiblemente entre aproximadamente 50 nM y 2.000 nM, mas preferiblemente entre aproximadamente 100 nM y
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2.000 nM. La duration de un tratamiento de amplification de antifolato/metotrexato, as! como la concentration y los correspondientes vectores de acidos nucleicos pueden ser optimizadas por los expertos en la tecnica, y tambien se describe en una realization preferida en los ejemplos. Las condiciones de amplification optimas pueden diferir entre diferentes moleculas de protelna/anticuerpo codificadas y la utilization de diferentes acidos nucleicos o constructos de acidos nucleicos o combinaciones de los mismos descritas anteriormente. Los expertos en la tecnica pueden seleccionar y optimizar las condiciones y acidos nucleicos mas adecuados. Dicha amplification conduce a una integration de mas copias de acidos nucleicos que codifican la molecula de protelna/anticuerpo o al menos una parte de la misma en el genoma de la celula huesped que sin cultivo con antifolato/metotrexato o que sin la introduction de la secuencia de acido nucleico que codifica al menos una variante de DHFR resistente al antifolato, en particular un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9 y/o conduce a una production aumentada de la composition molecular de protelna/anticuerpo.
Dicha celula huesped para amplification del acido nucleico o acidos nucleicos que codifican una molecula de protelna/anticuerpo o al menos una parte de la misma, que fue introducida en dicha celula huesped en la que al menos un acido nucleico que comprende al menos una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1, fue introducido, como se describe en otras partes de la presente memoria incluyendo sus realizaciones preferidas, son de origen leucemico mieloide humano, preferiblemente la celula o llnea celular KG1, MUTZ-3, K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, mas preferiblemente la celula o llnea celular K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8- E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, e incluso mas preferiblemente la celula o llnea celular NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, Gt-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped.
Dicha celula huesped puede ser cultivada con al menos dos rondas sucesivas de antifolato/metotrexato, por lo que la concentration de antifolato/metotrexato es aumentada preferiblemente en al menos aproximadamente 50%, mas preferiblemente en al menos aproximadamente 100%, en cada ronda sucesiva. Dicha celula huesped se puede cultivar con al menos tres, mas preferiblemente con cuatro, mas preferiblemente con 5, e incluso mas preferiblemente con 6 rondas sucesivas de antifolato/metotrexato, por lo cual la concentration de antifolato/metotrexato es aumentada preferiblemente en al menos aproximadamente 50%, mas preferiblemente en al menos aproximadamente 100%, en cada ronda sucesiva. Incluso mas preferidas son concentraciones de antifolato/metotrexato entre aproximadamente 20 nM y 3.000 nM, mas preferidas entre aproximadamente 50 nM y
2.000 nM, mas preferiblemente entre aproximadamente 100 nM y 2.000 nM, e incluso mas preferidas de aproximadamente 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, que en la realization preferida se usan en rondas sucesivas que se inician a partir de 100 nM.
Es sorprendente que la introduccion de una secuencia de acido nucleico que codifica una variante de DHFR resistente al antifolato y preferiblemente al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9 permite la amplification de la secuencia de acido nucleico que codifica la dicha molecula de protelna/anticuerpo o al menos una parte de la misma en la celula huesped de origen leucemico mieloide humano, y especialmente en K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, por cultivo con antifolato/metotrexato.
Es especialmente sorprendente que la introduction de una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido de secuencia #1 permite la amplification de la secuencia de acido nucleico que codifica la dicha molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma en la celula huesped, y especialmente en K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, por cultivo con metotrexato.
Es incluso mas sorprendente que la introduction de una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9 permite una amplification incluso adicional de la secuencia de acido nucleico que codifica la dicha molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma en la celula huesped, y especialmente en K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, por cultivo de dicha celula huesped con al menos dos rondas sucesivas de metotrexato por lo que la concentration de metotrexato es aumentada en al menos aproximadamente 50%, mas preferiblemente en al menos aproximadamente 100%, en cada ronda sucesiva.
Es incluso mas sorprendente que la introduction de una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 permite una amplification incluso adicional de la secuencia de acido nucleico que codifica la dicha molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma en la celula huesped, y especialmente en K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-
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H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o ilnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, por cultivo de dicha celula huesped con al menos dos rondas sucesivas de metotrexato por lo que la concentracion de metotrexato es aumentada en al menos aproximadamente 50%, mas preferiblemente en al menos aproximadamente 100%, en cada ronda sucesiva.
En una realizacion preferida, el termino que la amplificacion es estable significa que conduce a la produccion de altos rendimientos de la composicion molecular de anticuerpo sobre al menos 35 generaciones de ciclos de division de la celula huesped. La amplificacion de dicho acido nucleico o acidos nucleicos introducidos de manera estable que codifican la molecula de protelna/anticuerpo o fraccion de la misma puede ser realizada como se describe anteriormente y en los ejemplos usando metotrexato.
En una realizacion preferida de la invencion la celula huesped con acidos nucleicos introducidos se usa preferiblemente despues de al menos una ronda de clonacion celular unica y seleccion de los clones celulares con expresion adecuada y secrecion de dicha composicion de protelna/anticuerpo. Preferiblemente dicha clonacion celular unica y seleccion de los clones celulares con expresion adecuada y secrecion de dicha composicion de protelna/anticuerpo ocurre despues de al menos una ronda de amplificacion con metotrexato descrita en otras partes de la presente memoria. En una realizacion preferida adicional, dichos clones celulares son amplificados adicionalmente por al menos una ronda adicional de amplificacion con metotrexato, preferiblemente una concentracion aumentada de metotrexato, preferiblemente al menos aproximadamente la concentracion doble de metotrexato, e incluso mas preferido seguido de una ronda adicional de clonacion celular unica y seleccion de los clones celulares con expresion adecuada y secrecion de dicha composicion de protelna/anticuerpo. Con estas realizaciones preferidas se pueden seleccionar clones celulares con rendimientos de expresion particularmente altos.
De acuerdo con la presente invencion el termino cultivar dicha celula huesped en condiciones que permiten la produccion de dicha composicion molecular de anticuerpo o una formulacion respectiva para protelnas en general significa que la celula huesped de la invencion que comprende al menos un acido nucleico que codifica una molecula de protelna/anticuerpo, preferiblemente las realizaciones preferidas de dicho acido nucleico descritas en otras partes de la presente memoria, se cultiva en condiciones de cultivo que permiten la expresion de la molecula de protelna/anticuerpo en forma de una composicion molecular de protelna/anticuerpo, preferiblemente la secrecion en el medio, preferiblemente con altos rendimientos y/o alta actividad y/o alta homogeneidad como se describe en otras partes de la presente memoria. Los expertos en la tecnica pueden seleccionar las condiciones de cultivo mas adecuadas usando medios adecuados y condiciones de cultivo tales como, pero no limitadas a, tiempo adecuado, temperatura, pH, gasificacion, alimentacion, medio, suplementos del medio, tamanos de recipiente o reactor y principios conocidos por los expertos en la tecnica. Los expertos en la tecnica pueden seleccionar y optimizar las condiciones mas adecuadas. Se describen realizaciones preferidas en los ejemplos, pero no se limitan a estos.
El cultivo de las celulas de la presente invencion se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los metodos de cultivo generales para celulas animales capaces de producir eficazmente la composicion molecular de anticuerpo deseada, por ejemplo, cultivo por lotes, cultivo por lotes repetidos, cultivo por lote alimentado y cultivo por perfusion. Preferiblemente, se emplea cultivo por lote alimentado o cultivo por perfusion, a fin de elevar la productividad de los polipeptidos deseados.
En una realizacion preferida adicional de la invencion dicho cultivo se realiza en condiciones exentas de suero, e incluso mas preferido con medios exentos de protelnas o medios exentos de componentes animales.
La adaptacion de las celulas huesped de la presente invencion a un medio exento de suero de acuerdo con la presente invencion es sorprendentemente rapida y robusta. La adaptacion se puede llevar a cabo, por ejemplo, adaptando celulas subcultivadas en un medio que contiene suero directamente a un medio exento de suero disponible en el mercado, o por adaptacion continua, en donde la adaptacion directa a medio exento de suero es preferida y ventajosa. Durante el proceso de adaptacion a un medio exento de suero, la viabilidad de las celulas disminuye temporalmente, lo que causa a veces la extincion de las celulas. Por lo tanto, se prefiere inocular las celulas en un medio para la adaptacion a un medio exento de suero a una densidad celular de 1 x 10<5> a 5 x 10<5> celulas/ml, preferiblemente 2 x 10<5> celulas/ml, a fin de restaurar la viabilidad de las celulas o mantenerla alta. Despues de 4 a 7 dlas de cultivo, las celulas cuya densidad alcanzo 5 x 10<5> a 10 x 10<5> celulas/ml se seleccionan como las celulas adaptadas a un medio exento de suero. La adaptacion a un medio exento de suero tambien se puede realizar por dilucion sucesiva del medio suplementado con FCS mediante una composicion de medio exento de suero (adaptacion continua). Los expertos en la tecnica pueden seleccionar y optimizar las condiciones mas adecuadas. Se describen realizaciones preferidas en los ejemplos, pero no se limitan a estos.
Despues de que las celulas se han adaptado a un medio exento de suero, se puede preparar una llnea celular clonada usando el metodo de dilucion limitante con una placa de 96 pocillos, el metodo formador de colonias, o similares, y se seleccionan las celulas o llnea celular en base a las propiedades de esas celulas que son ventajosas en comparacion con su celula o llnea celular parental, tales como, pero no limitadas a, tiempos de doblado mas cortos, crecimiento mas rapido, posibilidad de crecer bajo densidades mas altas, pueden producir mas, eficacias de clonacion mas altas, eficacias de transfeccion mas altas para ADN, tasas de expresion mas altas de composiciones
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moleculares de anticuerpos, actividades mas altas para una composicion molecular de anticuerpo expresada en las mismas, y/o robustez mas alta para aumentar a escala. Los metodos para seleccionar la celula con propiedades ventajosas son conocidos por los expertos en la tecnica o descritos en la presente memoria.
De acuerdo con la presente invencion la expresion aislar dicha composicion molecular de anticuerpo o una formulacion correspondiente para protelnas significa en general que la composicion molecular de protelna/anticuerpo expresada por dicha celula huesped que comprende al menos uno de dichos acidos nucleicos que codifican la molecula de protelna/anticuerpo o fraccion de la misma descrita en otras partes de la presente memoria se obtiene usando los medios de cultivo despues de cultivar o enriquecer o purificar adicionalmente la composicion molecular de protelna/anticuerpo o partes de dicha composicion molecular de protelna/anticuerpo por metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Dicha composicion molecular de protelna/anticuerpo, en el sentido de la invencion, tambien significa partes de dicha composicion molecular de protelna/anticuerpo enriquecidas para ciertas moleculas de protelna/anticuerpo descritas en otras partes de la presente memoria.
En una realization preferida la composicion molecular de protelna/anticuerpo es aislada separando el medio, despues del cultivo, de las celulas y/o el residuo celular, por ejemplo por tecnicas de centrifugation.
En una realizacion preferida adicional de la invencion una composicion molecular de protelna/anticuerpo es aislada o enriquecida adicionalmente por ultrafiltracion, metodos de precipitation y otros metodos de concentration conocidos por los expertos en la tecnica.
En una realizacion preferida adicional de la invencion una composicion molecular de protelna/anticuerpo es aislada por purification de la composicion molecular de protelna/anticuerpo por metodos cromatograficos, tales como, pero no limitados a, cromatografla de afinidad usando materiales de afinidad acordes, tales como, pero no limitados a, Protelna A, Protelna G, anticuerpos de isotipo anti-anticuerpo, cromatografla con lectina, anticuerpos contra una cierta etiqueta introducida en la molecula de anticuerpo tal como HIS-tag o myc-tag, o antlgeno, o por cromatografla de intercambio ionico, conocida por los expertos en la tecnica.
Los expertos en la tecnica conocen metodos adicionales para purificar o enriquecer protelnas o ciertas glicoformas de protelnas, y pueden ser seleccionados, adoptados, optimizados y usados solos o en combination con metodos descritos anteriormente por los expertos en la tecnica para aislar o purificar adicionalmente, fraccionar o enriquecer la composicion molecular de protelna o fracciones de la misma.
En una realizacion preferida de la invencion, una composicion molecular de anticuerpo de la invencion de principalmente IgG es aislada mediante cromatografla con Protelna A con o sin ultracentrifugacion previa.
En otra realizacion preferida de la invencion una composicion molecular de anticuerpo de la invencion de principalmente IgM es aislada mediante cromatografla con anticuerpo anti-IgM con o sin ultracentrifugacion previa.
En otra realizacion preferida de la invencion, una composicion molecular de anticuerpo de la invencion enriquecida en ciertas glicoformas de la molecula de anticuerpo es aislada por cromatografla de afinidad con lectina con o sin ultracentrifugacion previa. Los expertos en la tecnica conocen metodos adicionales para purificar o enriquecer protelnas o ciertas glicoformas de protelnas, y pueden ser seleccionados, adoptados, optimizados y usados solos o en combinacion con metodos descritos anteriormente por los expertos en la tecnica para aislar o purificar adicionalmente, fraccionar o enriquecer la composicion molecular de protelna o fracciones de la misma.
En una realizacion preferida la composicion molecular de anticuerpo es aislada usando columnas de Protelna A. En otra realizacion preferida la composicion molecular de anticuerpo es aislada usando una columna anti-IgM.
De acuerdo con la presente invencion, la expresion “actividad aumentada” significa que la actividad de una composicion molecular de protelna y/o anticuerpo expresada en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano es mas alta que la actividad de al menos una composicion molecular de protelna y/o anticuerpo de la misma molecula de protelna/anticuerpo cuando se expresa en al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NSO, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton. En la realizacion preferida de la invencion significa que la actividad de una composicion molecular de protelna y/o anticuerpo expresada en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano es mas alta que la actividad de al menos una composicion molecular de protelna y/o anticuerpo de la misma molecula de protelna/anticuerpo cuando se expresa en CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]. Para anticuerpos, dicha actividad aumentada es una citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada o una actividad de union aumentada.
En el significado de la invencion, “actividad” es tambien una funcion o conjunto de funciones realizadas por una molecula de protelna en un contexto biologico. En el significado de la invencion, la expresion “actividad aumentada”, equivalentes de los contenidos y equivalentes gramaticales de la misma son para entender como una actividad mejorada u optima con respecto a la aplicacion seleccionada, por lo que la actividad podrla ser aproximada a un valor limitante, por ejemplo ser minimizada o maximizada, o bien ajustada a un valor medio que representa una actividad mas alta o mas baja en comparacion con la molecula de protelna correspondiente producida por la tecnica
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anterior. Actividad mejorada o aumentada en el sentido de la invencion tambien significa una actividad favorable en el sentido de su significado biologico y/o farmaceutico como semivida en suero mejorada, farmacocinetica, estabilidad, actividad biologica, union, antigenicidad y/o inmunogenicidad. Por ejemplo, la actividad biologica de una composicion molecular de protelna podrla ser aumentada hasta cierto punto disminuyendo efectos biologicos adversos, p.ej. por la estimulacion reducida de efectos inmunes adversos o una inmunogenicidad disminuida.
La actividad de la composicion molecular de protelna puede ser determinada en un bioensayo adecuado que sea capaz de determinar la actividad de la protelna. Los expertos en la tecnica pueden identificar bioensayos adecuados o construir bioensayos adecuados. Segun la presente invencion tales bioensayos incluyen por ejemplo ensayos biologicos in vitro, que incluyen ensayos celulares o moleculares o mixtos, tales como ensayos de proliferacion, ensayos de apoptosis, ensayos de adhesion celular, ensayos de senalizacion, ensayos de migracion, ensayos de citotoxicidad celular, ensayos de fagocitosis, ensayos de lisis, y ensayos de union. Tales bioensayos tambien incluyen ensayos in vivo que usan modelos animales o humanos, tales como biodistribucion, ensayo farmacocinetico, farmacodinamico, ensayos de semivida en suero, ensayos para biodisponibilidad, ensayo de eficacia, ensayos de localizacion, ensayos de tratamiento y profilaxis de enfermedades, incluyendo estudios cllnicos. Tales bioensayos tambien incluyen ensayos qulmicos, flsicos, fisicoqulmicos, bioflsicos y bioqulmicos, tales como estabilidad a la temperatura, tension de cizallamiento, presion, pH, conjugacion y otros. Tales bioensayos tambien incluyen ensayos para la inmunogenicidad y/o antigenicidad para mejorar las propiedades de la composicion molecular de protelna con respecto a su uso cllnico. Los expertos en la tecnica pueden determinar la actividad o una combinacion de actividades descritas de composiciones moleculares de protelna.
En una realization preferida la actividad mas alta de la composicion molecular de protelna se caracteriza por una actividad mas alta en al menos un modelo in vitro y/o una actividad mas alta en al menos un modelo in vivo y/o una estabilidad mas alta y/o una semivida en suero mas larga y/o una biodisponibilidad mas larga y/o una inmunogenicidad mejorada y/o una antigenicidad mejorada determinadas por al menos un bioensayo. La mejora en la actividad global, que tambien se llama en la presente memoria actividad mas alta, puede conducir por ejemplo a mejoras como dosificaciones mas bajas, intervalos de tiempo mas largos para la administration, menos efectos secundarios y ninguna o mas baja toxicidad del producto cuando se usa en seres humanos u organismos acordes dando como resultado productos farmaceuticos mejorados en gran medida.
En una realizacion preferida de la invencion la actividad de una composicion molecular de protelna expresada en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano es mas alta que la actividad de al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna producida por la tecnica anterior.
Dicha citotoxicidad celular mediada por Fc es una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo aumentada (actividad ADCC), actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (actividad CDC), y/o citotoxicidad causada por fagocitosis (actividad de fagocitosis). La citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada, incluyendo actividad ADCC, actividad CDC o actividad de fagocitosis, puede ser determinada por diversos metodos conocidos por los expertos en la tecnica, y algunos se describen en detalle en los ejemplos sin limitarla a esos metodos, por lo que los metodos descritos en los ejemplos son realizaciones preferidas de la invencion.
Dicha actividad de union aumentada es una union aumentada al epltopo de la molecula de anticuerpo, tal como el epltopo, el antlgeno, otro polipeptido que comprende el epltopo, o una celula que comprende el epltopo de la molecula de anticuerpo, o una union aumentada al menos a un receptor Fc u otro ligando efector, tal como Fc- gammaRI, Fc-gammaRII, Fc-gammaRII, y subclases de los mismos tales como Fc-gammaRIIa, Fc-gammaRIIIa, Fc- gammaRIIIb, o el componente Cq1 del complemento, o FcRn o una molecula o celula que comprende cualquiera de estos receptores Fc o ligandos efectores. La actividad de union aumentada puede ser una afinidad mas alta, una avidez mas alta, y/o un numero mas alto de sitios de union o combinaciones de los mismos. La actividad de union aumentada puede dar como resultado diversos efectos y actividades, tales como, pero no limitados a, formas de actividad mediada por receptor como se describen en los antecedentes de la tecnica. La afinidad de union, avidez y actividad mediada por receptor mas altas pueden ser determinadas por al menos uno de los diversos metodos conocidos por los expertos en la tecnica tales como, pero no limitados a, medicion con Biacore, analisis de Scatchard, medidas basadas en ELISA o RIA, medidas de citometrla de flujo, ensayo para determinar la induction de apoptosis en celulas diana adecuadas, ensayos para la determination de la proliferacion de celulas diana adecuadas, ensayos para el bloqueo antagonistic, agonlstico o de receptor de una composicion molecular de anticuerpo tales como, pero no limitados a, inhibition de union mediada por celula-celula, desencadenamiento de eventos moleculares internos celulares. Los expertos en la tecnica pueden seleccionar y/o adoptar y/o modificar un metodo adecuado o combinacion de metodos para ensayar la afinidad de union, avidez, numero de sitios de union y/o actividad mediada por receptor.
Los metodos descritos en la presente memoria se pueden usar para ensayar la capacidad de un anticuerpo para poder obtener una citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada, preferiblemente actividad ADCC, actividad CDC y/o citotoxicidad causada por fagocitosis, y/o una actividad de union aumentada al epltopo de la molecula de anticuerpo o preferiblemente al a menos un receptor Fc u otro ligando efector, en general y/o en particular con las celulas huesped de la invencion y sus realizaciones preferidas descritas en otras partes de la presente memoria.
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En una realizacion preferida de la invencion la actividad de una composition molecular de protelna/anticuerpo expresada en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano es mas alta que la actividad de al menos una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de protelna/anticuerpo de al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NS0, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton, preferiblemente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], cuando se expresa en la misma.
En una realizacion preferida de la invencion la actividad de una composicion molecular de protelna/anticuerpo expresada en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano es al menos 50% mas alta que la actividad de la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo expresada en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], mas preferiblemente al menos 2 veces, mas preferiblemente al menos 3 veces, mas preferiblemente al menos 4 veces, mas preferiblemente al menos 5 veces, mas preferiblemente al menos 7 veces, mas preferiblemente al menos 10 veces, mas preferiblemente al menos 15 veces, mas preferiblemente al menos 23 veces, mas preferiblemente al menos 30 veces, mas preferiblemente al menos 50 veces, mas preferiblemente al menos 75 veces, mas preferiblemente al menos 100 veces, mas preferiblemente al menos 150 veces, mas preferiblemente al menos 150 veces, mas preferiblemente al menos 230 veces, mas preferiblemente al menos 300 veces, mas preferiblemente al menos 500 veces, mas preferiblemente al menos 750 veces, y lo mas preferiblemente mas que 1.000 veces.
De este modo, no cada bioensayo tiene que mostrar una actividad mas alta, pero dependiendo del uso y los rasgos de una composicion molecular de protelna particular, algunos efectos biologicos favorables pueden compensar otros que son menos favorables y dar aun como resultado una actividad global mas alta de la composicion molecular de protelna en el sentido de la invencion. Por ejemplo, una cierta composicion molecular de protelna puede dar como resultado una actividad mucho mas alta al unirse a sus receptores de celulas, desencadenando de este modo un efecto secundario, tal como induction de proliferation, pero mostrar una semivida en suero ligeramente disminuida. En combination, la actividad mas alta que desencadena mas el receptor compensa entonces la biodisponibilidad mas corta en la bioactividad global. En otro ejemplo, una semivida mas corta y una actividad mas alta hacia el receptor que se desencadena son ambas ventajosas. En aun otro ejemplo la actividad in vivo no es mejorada pero la estabilidad in vitro mejora la production y almacenamiento de la composicion molecular de protelna. En aun otro ejemplo, se necesita una semivida larga pero una actividad mas baja.
En una realizacion preferida de la invencion la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una actividad ADCC aumentada. En otra realizacion preferida la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una CDC aumentada. En otra realizacion preferida la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una citotoxicidad aumentada causada por fagocitosis. En otra realizacion preferida la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una actividad de union al epltopo aumentada. En otra realizacion preferida la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una actividad de union al menos a un receptor Fc aumentada, preferiblemente FcyRIIIA. En una realizacion preferida adicional la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada y una actividad de union al epltopo aumentada. En una realizacion preferida adicional la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una actividad ADCC aumentada y una actividad de union al epltopo aumentada. En una realizacion preferida adicional la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una actividad ADCC aumentada, una actividad CDC aumentada, una actividad de union al epltopo aumentada y una actividad de union al menos a un receptor Fc aumentada. En una realizacion preferida adicional la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una actividad ADCC aumentada, citotoxicidad causada por fagocitosis aumentada, una actividad de union al epltopo aumentada y una actividad de union al menos a un receptor Fc aumentada. En la realizacion mas preferida la actividad aumentada de una composicion molecular de anticuerpo es una ADCC aumentada, citotoxicidad aumentada causada por fagocitosis, una actividad CDC aumentada y una actividad de union al epltopo aumentada y una actividad de union al menos a un receptor Fc aumentada.
De acuerdo con la presente invencion, el termino “homogeneidad mejorada” significa que una composicion molecular de protelna/anticuerpo expresada en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano de la invencion comprende menos glicoformas diferentes, o mas de una glicoforma favorable o de glicoformas favorables, o menos de al menos una glicoforma de una molecula de anticuerpo (preferiblemente en aquellas glicoformas que representan al menos 1% de la composicion molecular de anticuerpo total en si misma) que al menos una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo aislada de al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NS0, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton cuando se expresa en las mismas. En una realizacion preferida de la invencion, significa que una composicion molecular de anticuerpo expresada en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano de la invencion comprende menos glicoformas diferentes, o mas de una glicoforma favorable o de glicoformas favorables, o menos de al menos una glicoforma de una molecula de anticuerpo que una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo aislada de la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma.
Una heterogeneidad particularmente problematica para la produccion y uso en el ser humano es la sialilacion. En una realizacion preferida la composicion molecular de protelna/anticuerpo de la invencion tiene una homogeneidad mejorada al no comprender glicoforma con el acido sialico acido N-glicolilneuramlnico (NeuGc), por lo cual en este
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caso sin glicoforma significa ninguna glicoforma de mas que 1% de todas las cadenas de carbohidratos obtenibles de la composicion molecular de anticuerpo purificada y mas preferiblemente sin cadena de carbohidrato detectable en absoluto como es detectable por los metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Dado que se sabe que NeuGc puede ser inmunogenico en seres humanos, esta es una gran ventaja de las celulas huesped de la invencion sobre otros sistemas de produccion tales como CHO, NSO, SP2/0.
En una realizacion preferida la composicion molecular de protelna/anticuerpo tiene una homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion por comprender menos que 5% de glicoformas, mas preferiblemente menos que 3%, incluso mas preferiblemente menos que 1%, y lo mas preferiblemente ninguna glicoforma de la composicion molecular de protelna/anticuerpo con acido sialico detectable como se describe en los ejemplos. En una realizacion preferida adicional se consigue una composicion molecular de protelna/anticuerpo con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion usando una celula huesped de origen leucemico mieloide humano de la invencion que tiene un defecto en la ruta de precursores de nucleotidos de azucar y por lo tanto es deficiente para o tiene CMP-acido sialico reducido, lo que da como resultado ninguna sialilacion o reducida en gran medida de las cadenas de azucar carbohidratos de las moleculas de protelna/anticuerpo cuando las celulas son cultivadas en un medio exento de suero. En una realizacion incluso mas preferida tal composicion molecular de protelna/anticuerpo con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion puede ser conseguida usando NM-F9 [DSM ACC2606] o NM-D4 [DSM ACC2605] como una celula huesped de la invencion cultivada en un medio exento de suero como se describe en mas detalle en los ejemplos.
En otra realizacion preferida adicional una composicion molecular de protelna/anticuerpo con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion usando una celula huesped de origen leucemico mieloide humano de la invencion que tiene un defecto en el transportador de nucleotidos de azucar de GMP-acido sialico o en al menos una sialiltransferasa, lo que da como resultado ninguna sialilacion o reducida en gran medida de las cadenas de azucar carbohidrato de las moleculas de protelna/anticuerpo cuando las celulas son cultivadas en un medio exento de suero. Son ejemplos NM-F9, NM-D4 y GT-2X.
En otra realizacion preferida adicional una composicion molecular de protelna/anticuerpo con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion usando una celula huesped de origen leucemico mieloide humano de la invencion que tiene un grado de sialilacion aumentado. Dicho grado de sialilacion significa que la cantidad del acido sialico acido N-glicolilneuramlnico (NeuGc o NeuNAc) en las moleculas de protelna/anticuerpo en una composicion molecular de protelna/anticuerpo es al menos 5%, mas preferiblemente al menos 15%, mas preferiblemente al menos 20%, mas preferiblemente al menos 25%, mas preferiblemente al menos 30%, mas preferiblemente al menos 35%, mas preferiblemente al menos 40%, mas preferiblemente al menos 50%, mas preferiblemente al menos 60%, mas preferiblemente al menos 70%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 100%, mas preferiblemente al menos 3 veces, mas preferiblemente al menos 5 veces, mas preferiblemente al menos 10 veces, mas preferiblemente al menos 25 veces, mas preferiblemente al menos 50 veces, y lo mas preferiblemente al menos 100 veces, mas alta que la cantidad del acido sialico acido N- glicolilneuramlnico (NeuGc o NeuNAc) de las unidades carbohidrato totales o la cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna/anticuerpo cuando se comparan con la misma cantidad de moleculas de protelna/anticuerpo de una composicion molecular de protelna/anticuerpo de la misma molecula de protelna/anticuerpo aislada de al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NS0, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton, preferiblemente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en las mismas. El grado de sialilacion puede ser detectado por metodos conocidos por los expertos en la tecnica, tales como, pero no limitados a, analisis inmunoblot o ELISA usando lectinas cuya union depende de la sialilacion de la estructura de carbohidrato, tales como SNA, MAL, MAL I o PNA, por metodos de detection qulmica tales como el metodo del acido tiobarbiturico, por HPLC o espectrometrla de masas o combination de los mismos. Los expertos en la tecnica pueden seleccionar el metodo mas adecuado y adoptarlo y optimizarlo para este fin, y se describen mas detalles en los ejemplos. Se prefiere un analisis inmunoblot usando sNa.
Se puede conseguir una composicion molecular de protelna/anticuerpo con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion usando una celula huesped de origen leucemico mieloide humano, preferiblemente K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X y celulas o llneas celulares derivadas de las mismas, y lo mas preferiblemente K562, NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM- H9D8, NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X que tiene un grado de sialilacion aumentado, y da como resultado una composicion molecular de protelna/anticuerpo que comprende acido sialico enlazado en alfa 2-6, detectable por ejemplo por union a SNA, en una version mas preferida la composicion molecular de protelna/anticuerpo comprende acidos sialicos enlazados en alfa 2-6 y alfa 2-3.
Se puede conseguir una composicion molecular de protelna/anticuerpo con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion usando una celula huesped de origen leucemico mieloide humano que comprende al menos una sialiltransferasa capaz de unir NeuNAc en enlace alfa 2-3 y al menos una sialiltransferasa capaz de unir NeuNAc en alfa 2-6 a grupos de azucar, tales como, pero no limitadas a, K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X y celulas o llneas celulares derivadas de las mismas, dando como resultado una composicion mas preferida de glicoformas de la molecula de protelna/anticuerpo en la composicion molecular de protelna/anticuerpo.
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En una realizacion incluso adicional (preferida) de la invencion dicha composicion molecular de anticuerpo de la invencion con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion comprende al menos una glicoforma de una molecula de anticuerpo con al menos una cadena de carbohidrato unida a otro sitio de glicosilacion de la molecula de anticuerpo que el aminoacido Asn-297 en el segundo dominio (dominio Cgamma2) de la region Fc.
La anterior composicion molecular de anticuerpo con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion se expresa en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano que tiene un grado de sialilacion aumentado y/o comprende al menos una sialiltransferasa capaz de unir acido sialico en alfa 2-3 y al menos una sialiltransferasa capaz de unir acido sialico en enlace alfa 2-6 a grupos de azucar, tales como K562, NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM- H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X y celulas o llneas celulares derivadas de las mismas.
En una realizacion incluso mas preferida la anterior molecula de anticuerpo tiene al menos un sitio de N-glicosilacion (Asn-X-Ser/Thr, en donde X puede ser cualquier aminoacido excepto Pro) y/o al menos un sitio de O-glicosilacion en una secuencia de la region Fab.
En una realizacion preferida adicional la composicion molecular de anticuerpo de la invencion con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion que comprende una molecula de anticuerpo que comprende al menos una cadena de carbohidrato unida a otro sitio de glicosilacion de la molecula de anticuerpo distinto al aminoacido Asn- 297 en el segundo dominio (dominio Cgamma2) de la parte Fc tiene una semivida en suero y/o biodisponibilidad extendida cuando se mide en al menos un mamlfero tal como ratones, ratas, o preferiblemente en seres humanos, que la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo aislada de al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o bHk, o NS0, o SP2/0, NM-F9, NM-d4 o PerC.6 o hibridoma de raton, preferiblemente la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en las mismas.
La biodisponibilidad de los anticuerpos puede ser optimizada usando la presente invencion. La expresion de moleculas de anticuerpo en particular en celulas que tienen una alta o incluso una sialilacion muy alta (grupos 1 y 3 discutidos anteriormente) puede conducir a una composicion de anticuerpo con una biodisponibilidad prolongada, mientras que la expresion de moleculas de anticuerpo en las celulas del grupo 2 puede conducir a una composicion de anticuerpo con una biodisponibilidad prolongada, mientras que la expresion de moleculas de anticuerpo en las celulas del grupo 2 puede conducir a una composicion de anticuerpo con una biodisponibilidad comparablemente acortada. La biodisponibilidad puede ser ensayada como conocen los expertos en la tecnica, y como se describe en los ejemplos usando animales o preferiblemente seres humanos. Los animales incluyen ratones, ratas, conejillos de indias, perros o monos, pero no estan restringidos a esas especies. Debido a la naturaleza humana se prefieren aquellos animales que tienen una glicosilacion y de manera mas importante sialilacion mas cercana a la humana, lo mas preferido son seres humanos.
La composicion molecular de anticuerpo con homogeneidad mejorada con respecto a la sialilacion se expresa en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano que tiene un grado de sialilacion aumentado y/o comprende al menos una sialiltransferasa capaz de unir acido sialico en alfa 2-3 y al menos una sialiltransferasa capaz de unir acido sialico en enlace alfa 2-6 a grupos de azucar, tales como K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, y celulas o llneas celulares derivadas de las mismas, y comprenden al menos una cadena de carbohidrato unida al menos a un sitio de N-glicosilacion y/o al menos un sitio de O-glicosilacion en una secuencia de la region Fab de la molecula de anticuerpo, y tiene una semivida en suero y/o biodisponibilidad extendida cuando se mide en al menos un mamlfero tal como ratones, ratas, o preferiblemente en seres humanos, que la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo aislada de al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NS0, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton, preferiblemente la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en las mismas. En una realizacion preferida adicional la molecula de anticuerpo expresada es Erbitux (Cetuximab).
De acuerdo con la presente invencion la expresion “rendimiento aumentado” significa que el rendimiento medio o maximo de una composicion molecular de protelna/anticuerpo producida en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano es mas alto que el rendimiento medio o maximo respectivo de una composicion molecular de protelna/anticuerpo de la misma molecula de protelna/anticuerpo cuando se expresa en al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NS0, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton. En la realizacion preferida de la invencion significa que el rendimiento medio o maximo de una composicion molecular de protelna/anticuerpo expresada en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano es mas alto que el rendimiento medio o maximo respectivo de una composicion molecular de protelna/anticuerpo de la misma molecula de protelna/anticuerpo cuando se expresa en CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] usando el gen murino dhfr y metotrexato para la amplificacion en CHOdhfr-. El rendimiento medio y maximo se mide en SPR, que refleja la productividad de una celula, mezcla celular o una llnea celular, puede ser determinado por los expertos en la tecnica, y se describe en su realizacion preferida en los ejemplos.
Al menos el rendimiento medio o maximo de una composicion molecular de protelna/anticuerpo expresada en una celula huesped de origen leucemico mieloide humano, preferiblemente K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular
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derivada de las mismas, es al menos 10% mas alto que el correspondiente de la composicion molecular de protelna/anticuerpo de la misma molecula de protelna/anticuerpo cuando se expresa en CHOdhfr- [ATCC No. CRL- 9096] usando el gen murino dhfr y metotrexato para la amplification en CHOdhfr-, mas preferiblemente al menos 15%, mas preferiblemente al menos 20%, mas preferiblemente al menos 25%, mas preferiblemente al menos 30%, mas preferiblemente al menos 35%, mas preferiblemente al menos 45%, mas preferiblemente al menos 50%, mas preferiblemente al menos 55%, mas preferiblemente al menos 60%, mas preferiblemente al menos 70%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 100%, mas preferiblemente al menos 3 veces, mas preferiblemente al menos 4 veces, y lo mas preferiblemente mas que 5 veces.
Ademas se describe un acido nucleico, que comprende
(a) una secuencia que codifica una protelna, preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma como se describe en otras partes de la presente memoria, y
(b) al menos una secuencia que codifica una secuencia del grupo de secuencia #1 a secuencia #9.
El acido nucleico puede comprender
(a) una secuencia que codifica una protelna, preferiblemente una molecula de anticuerpo o al menos una parte de la misma como se describe en otras partes de la presente memoria, y
(b) una secuencia que codifica la secuencia #1.
El acido nucleico descrito anteriormente puede comprender ademas una secuencia que codifica un marcador de selection, preferiblemente una secuencia que codifica para un polipeptido que induce una resistencia a antibioticos de una celula huesped en la que dicho acido nucleico es introducido, tal como, pero no limitado a, neomicina o puromicina.
El acido nucleico descrito anteriormente puede comprender ademas al menos una secuencia de al menos un elemento genetico descrito en otras partes de la presente memoria.
Se describe ademas una celula huesped de origen leucemico mieloide humano o cualquier celula o llnea celular mieloide o precursora mieloide que puede ser obtenida de un paciente de leucemia, o humano o cualquier celula o llnea celular mieloide o precursora mieloide que puede ser obtenida de un donante humano o una mezcla de celulas o llneas celulares que comprende al menos una celula huesped de origen leucemico mieloide humano, o celula, celulas o llnea celular que fue obtenida fusionando al menos una celula, celulas o una llnea celular de origen leucemico mieloide humano o cualquier celula o llnea celular mieloide o precursora mieloide que puede ser obtenida de un paciente de leucemia, o cualquier celula o llnea celular mieloide o precursora mieloide que puede ser obtenida de un donante humano, con otra celula de origen humano o animal, tal como, pero no limitada a, linfocitos B, celulas CHO, que comprende al menos un acido nucleico que codifica una molecula de protelna/anticuerpo o partes de la misma que fue introducido en dichas celulas.
La celula huesped descrita anteriormente puede comprender al menos un acido nucleico que codifica una molecula de protelna/anticuerpo o al menos una parte de la misma.
La celula huesped puede ser K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM- H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, preferiblemente aquellas que crecen en condiciones exentas de suero y de las que se alsla una composicion molecular de protelna/anticuerpo en condiciones exentas de suero, e incluso mas preferido aquellas en las que el acido nucleico que codifica la molecula de anticuerpo fue introducido en condiciones exentas de suero, que comprende al menos un acido nucleico que codifica una molecula de protelna/anticuerpo o partes de la misma, preferiblemente un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica una molecula de protelna/anticuerpo o al menos una parte de la misma como se describe en otras partes de la presente memoria.
La celula huesped descrita anteriormente puede comprender al menos un acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1.
La celula huesped descrita anteriormente puede comprender al menos un acido nucleico que codifica una molecula de anticuerpo o partes de la misma y al menos un acido nucleico que codifica al menos un polipeptido del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1.
La celula huesped puede ser K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM- H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, preferiblemente aquellas que crecen en condiciones exentas de suero y de las que se alsla una composicion molecular de protelna/anticuerpo en condiciones exentas de suero, e incluso mas preferido aquellas en las que el acido nucleico que codifica la molecula de anticuerpo fue introducido en condiciones exentas de suero, que comprende al menos un acido nucleico que codifica una molecula de protelna/anticuerpo o partes de la misma,
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preferiblemente un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica una molecula de protelna/anticuerpo o al menos una parte de la misma como se describe en otras partes de la presente memoria, y al menos una secuencia que codifica una secuencia del grupo de secuencia #1 a secuencia #9, preferiblemente secuencia #1.
En las celulas huesped descritas anteriormente la molecula de anticuerpo codificada puede ser un anticuerpo de la solicitud de patente internacional WO2004/065423.
En las celulas huesped descritas anteriormente la molecula de anticuerpo codificada puede ser el anticuerpo PankoMab [Cancer immunol. Immunother. 2006 Nov;55(11):1337-47. Epub 2006 Feb. PankoMab: a potent new generation anti-tumour MUC1 antibody. Danielczyk et al], preferiblemente una forma quimerica de PankoMab con todos los dominios constantes humanos, y mas preferiblemente un PankoMab humanizado.
Se describe ademas una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada y glicosilacion totalmente humana producida por cualquiera de los metodos descritos en alguna parte de la presente memoria.
Una composicion molecular de protelna/anticuerpo producida por cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria tiene una actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada y glicosilacion totalmente humana producida por cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria cuando se compara con una composicion molecular de protelna/anticuerpo de la misma molecula de protelna/anticuerpo aislada de al menos una de las llneas celulares CHO, o CHOdhfr-, o BHK, o NSO, o SP2/0, o PerC.6 o hibridoma de raton, preferiblemente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], cuando se expresa en las mismas.
La molecula de protelna o parte de la misma expresada puede ser cualquier protelna o parte de protelna o fragmento de protelna. La molecula de anticuerpo o parte de la misma expresada puede ser cualquier anticuerpo o parte de anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Las composiciones moleculares de protelna se pueden usar para tratamiento profilactico y/o terapeutico de enfermedades, tales como leucemia, neutropenia, citopenia, cancer, transplante de medula osea, enfermedades de sistemas hematopoyeticos, infertilidad y enfermedades autoinmunes. El espectro de aplicaciones terapeuticas conocidas por las personas del campo de la tecnica de las composiciones moleculares de protelna es muy amplio. Por ejemplo, G-CSF es un importante terapeutico para tratar la neutropenia, una disminucion de los neutrofilos peligrosa para la vida como consecuencia de una quimioterapia de pacientes de cancer leucemico. GM-CSF se usa especlficamente para el tratamiento de pacientes de AML en edad relativamente alta despues de quimioterapia para conseguir una rapida recuperacion de la neutropenia. GM-CSF esta adicionalmente aprobado como terapeutico para varias aplicaciones en transplantes de medula osea y para inmovilizacion de celulas madre sangulneas perifericas. Ademas, hay varias aplicaciones cllnicas de GM-CSF que estan actualmente en investigacion, tal como para el tratamiento de HIV y cancer. Ciertas enfermedades del sistema hemtopoyetico se tratan con EPO, y IFN-beta es actualmente un importante terapeutico para el tratamiento de la esclerosis multiple, una enfermedad autoinmune. Otro ejemplo es FSH, que se usa ampliamente para el tratamiento de la infertilidad masculina y femenina. La hCG tambien se aplica para el tratamiento de la infertilidad, pero centrandose en la anovulacion en las mujeres. hGH tiene beneficios probados cllnicamente, tales como reduction de la grasa corporal y aumento del tejido muscular.
Las composiciones moleculares de protelna tambien se pueden usar para la fabrication de un medicamento para tratamientos profilacticos y/o terapeuticos de enfermedades seleccionadas del grupo que comprende leucemia, neutropenia, citopenia, cancer, transplante de medula osea, enfermedades de sistemas hematopoyeticos, infertilidad y enfermedades autoinmunes.
En una realization preferida de la invention la molecula de anticuerpo expresada es una molecula de anticuerpo que reconoce psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedades autoinmunes, sLe, esclerosis multiple, trastornos hematologicos autoinmunes, asma, alergia, enfermedad injerto contra huesped, rechazo de aloinjertos, cirugla de glaucoma, infarto de miocardio, virus tales como RSV, HIV, Hep B, o CMV, cancer, sarcoma, CLL, AML o NHL.
En una realizacion aun mas preferida de la invencion la molecula de anticuerpo expresada es una molecula de anticuerpo que reconoce el cancer, tumor o metastasis, al menos una celula de cancer o celula de tumor, en al menos un ser humano, seleccionado preferiblemente del grupo de enfermedades cancerosas o enfermedades tumorales de la region oldo-nariz-garganta, de los pulmones, mediastino, sarcomas, mesoteliomas, melanomas, neoplasmas del sistema nervioso central, enfermedades cancerosas o enfermedades tumorales durante la infancia, linfomas, leucemias, slndromes paraneoplasicos, metastasis con tumor primario desconocido (slndrome CUP), carcinomatosis peritoneales, malignidades relacionadas con inmunosupresion y/o metastasis de tumor.
En una realizacion preferida de la invencion la molecula de anticuerpo o parte de la misma es un anticuerpo anti MUC1.
En una realizacion preferida adicional de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o
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acidos nucleicos es el anticuerpo Rituximab, Herceptin, Erbitux, Campath 1 H o anticuerpos derivados de los mismos.
En una realization aun mas preferida de la invention la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es un anticuerpo de la solicitud de patente internacional W02004/05070 e incluso mas preferida de la solicitud de patente internacional W02004/065423, e incluso mas preferido PankoMab [Cancer immunol. Immunother. 2006 Nov;55(11):1337-47. Epub 2006 Feb. PankoMab: a potent new generation anti-tumour MUC1 antibody. Danielczyk et al], e incluso mas preferido una forma quimerica del mismo que comprende todos los dominios constantes humanos, e incluso mas preferido un anticuerpo humanizado del mismo.
En una realizacion aun mas preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es cualquier anticuerpo entero, preferiblemente Rituximab, Herceptin, Erbitux, mas preferiblemente W02004/065423, lo mas preferiblemente PankoMab, por lo que la composition molecular de anticuerpo aislada de cualquier celula huesped, preferiblemente K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM- C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, no comprende NeuGc detectable. Lo mismo se aplica a protelnas en general.
En una realizacion aun mas preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es cualquier anticuerpo entero o una molecula de anticuerpo que comprende el dominio Cgamma2, preferiblemente Rituximab, Herceptin, Erbitux, mas preferiblemente W02004/065423, lo mas preferiblemente PankoMab, por lo que la composicion molecular de anticuerpo aislada de una celula huesped, preferiblemente K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8- E6Q12, GT-2X, o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, comprende al menos una glicoforma con acido alfa 2-6 sialico. Lo mismo se aplica a protelnas en general.
En una realizacion aun mas preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es cualquier anticuerpo entero o una molecula de anticuerpo que comprende el dominio Cgamma2, preferiblemente Rituximab, Herceptin, Erbitux, Campath 1 H, mas preferiblemente W02004/065423, lo mas preferiblemente PankoMab, por lo que la composicion molecular de anticuerpo aislada de la celula huesped NM-E- 2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped, comprende acido alfa 2-6 sialico, que es detectable por analisis inmunoblot con la lectina SNA como se describe en los ejemplos. Lo mismo se aplica a protelnas en general.
En otra realizacion preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es cualquier molecula de anticuerpo, preferiblemente Rituximab, Herceptin, Erbitux, Campath 1H, mas preferiblemente W02004/065423, lo mas preferiblemente PankoMab, y la composicion molecular de anticuerpo aislada de la celula huesped NM-F9 o NM-D4 despues del cultivo en medio exento de suero y mas preferiblemente exento de protelnas tiene una homogeneidad mejorada, con acidos sialicos no detectables. Lo mismo se aplica a protelnas en general.
En una realizacion preferida adicional de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es el anticuerpo Rituximab, Herceptin, Erbitux, Campath 1H, o anticuerpos derivados de los mismos, y la composicion molecular de anticuerpo aislada de la celula huesped tiene una actividad ADCC
aumentada de al menos 4 veces mas alta que la actividad de la composicion molecular de anticuerpo de la misma
molecula de anticuerpo expresada en la llnea celular CH0dhfr- [ATCC No. CRL-9096].
En una realizacion aun mas preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es un anticuerpo de la solicitud de patente internacional W02004/065423, mas preferiblemente PankoMab, y la composicion molecular de anticuerpo aislada de la celula huesped tiene una actividad ADCC
aumentada de al menos 4 veces mas alta cuando se produce en al menos una de las celulas K562, NM-F9 [DSM
ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped que la actividad de la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo expresada en la llnea celular CH0dhfr- [ATCC No. CRL-9096].
En otra realizacion preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es un anticuerpo de la solicitud de patente internacional W02004/065423, mas preferiblemente
PankoMab, y la composicion molecular de anticuerpo aislada de la celula huesped K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped tiene una actividad de union a su epltopo aumentada de al menos 50% mas alta, preferiblemente 2 veces mas alta que la actividad de la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo expresada en la llnea celular CH0dhfr- [ATCC No. CRL-9096].
En otra realizacion preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es un anticuerpo de la solicitud de patente internacional W02004/065423, mas preferiblemente
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PankoMab, y la composicion molecular de anticuerpo aislada de la celula huesped NM-F9 o NM-D4 despues del cultivo en medio exento de suero y mas preferiblemente exento de protelnas tiene una homogeneidad mejorada, con acidos sialicos no detectables. Lo mismo se aplica a protelnas en general.
En otra realizacion preferida de la invention la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es un anticuerpo de la solicitud de patente internacional WO2004/065423, mas preferiblemente
PankoMab, y la composicion molecular de anticuerpo aislada de la celula huesped K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de una cualquiera de dichas celulas huesped tiene una homogeneidad mejorada con al menos 10% mas acidos sialicos que la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo expresada en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]. Lo mismo se aplica a protelnas en general.
En otra realizacion preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es un anticuerpo de la solicitud de patente internacional WO2004/065423, mas preferiblemente
PankoMab, y la composicion molecular de anticuerpo aislada de la celula huesped tiene una homogeneidad mejorada con un grado mas alto de acidos sialicos no detectables cuando se expresa en NM-F9 o NM-D4 cuando se compara con una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo expresada en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]. Lo mismo se aplica a protelnas en general.
En otra realizacion preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es un anticuerpo de la solicitud de patente internacional WO2004/065423, mas preferiblemente
PankoMab, y la composicion molecular de anticuerpo aislada de la celula huesped tiene una homogeneidad mejorada como se describe anteriormente, y una actividad ADCC aumentada de al menos 4 veces mas alta que la actividad de la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo expresada en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096].
En la realizacion mas preferida de la invencion la molecula de anticuerpo codificada por el acido nucleico o acidos nucleicos es un anticuerpo de la solicitud de patente internacional WO2004/065423, mas preferiblemente
PankoMab.
Se describe ademas una celula huesped para producir una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada y glicosilacion totalmente humana en el sentido de la invencion descrito en otras partes de la presente memoria, en donde la celula huesped es cualquier celula, celulas, o llnea celular de origen leucemico mieloide humano o cualquier celula o llnea celular mieloide o precursora mieloide humana que puede ser obtenida de un paciente de leucemia, o cualquier celula o llnea celular mieloide o precursora mieloide que puede ser obtenida de un donante humano o una mezcla de celulas o llneas celulares que comprenden al menos una celula de origen leucemico mieloide humano, o una celula o llnea celular derivada de la misma como se describe en otras partes de la presente memoria, o una mezcla de celulas o llneas celulares que comprenden al menos una de esas celulas mencionadas anteriormente.
Tambien se describe una celula huesped para producir una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada y glicosilacion totalmente humana en el sentido de la invencion descrito en otras partes de la presente memoria, en donde la celula huesped es cualquier celula, celulas, o llnea celular que se obtuvo fusionando al menos una celula, celulas, o llnea celular de origen leucemico mieloide humano o cualquier celula o llnea celular mieloide o precursora mieloide humana que puede ser obtenida de un paciente de leucemia, o cualquier celula o llnea celular mieloide o precursora mieloide que puede ser obtenida de un donante humano, con otra celula de origen humano o animal, tales como, pero no limitadas a, linfocitos B, celulas CHO.
Dicha celula huesped puede proporcionar producir una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada en el sentido de la invencion como se describe en otras partes de la presente memoria, es la celula o llnea celular KG1, MUTZ-3, K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de las mismas, o una mezcla de celulas o llneas celulares que comprenden al menos una de esas celulas mencionadas anteriormente.
Dicha celula huesped puede proporcionar producir una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada en el sentido de la invencion como se describe en otras partes de la presente memoria, es la celula o llnea celular K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM- H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de las mismas.
Dicha celula huesped puede proporcionar producir una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada en el sentido de la invencion como se describe en otras partes de la presente memoria, es la celula o llnea celular NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM- H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular
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derivada de las mismas o una celula o ilnea celular derivada de las mismas como se describe en otras partes de la presente memoria.
Dicha celula huesped puede proporcionar producir una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada en el sentido de la invencion como se describe en otras partes de la presente memoria, es una celula o llnea celular derivada de KG1, MUTZ-3, K562, NM- F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de las mismas como se describe en otras partes de la presente memoria, que crece en condiciones exentas de suero, y preferiblemente aquellas en las que el acido nucleico que codifica la molecula de protelna/anticuerpo puede ser introducido en estas celulas y una composicion molecular de anticuerpo se alsla en condiciones exentas de suero.
Dicha celula huesped puede proporcionar producir una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada en el sentido de la invencion como se describe en otras partes de la presente memoria, es una celula o llnea celular derivada de K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de las mismas como se describe en otras partes de la presente memoria, que crece en condiciones exentas de suero.
Dicha celula huesped puede proporcionar producir una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada en el sentido de la invencion como se describe en otras partes de la presente memoria, es una celula o llnea celular derivada de K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de las mismas como se describe en otras partes de la presente memoria, que crece en condiciones exentas de suero y en la que el acido nucleico que codifica la molecula de protelna/anticuerpo puede ser introducido en estas celulas y una composicion molecular de protelna/anticuerpo se alsla en condiciones exentas de suero.
En la realization mas preferida dicha celula huesped proporciona producir una composicion molecular de protelna/anticuerpo que tiene actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada en el sentido de la invencion como se describe en otras partes de la presente memoria, es la celula o llnea celular NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, o NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X o una celula o llnea celular derivada de las mismas como se describe en otras partes de la presente memoria, que crece en condiciones exentas de suero, preferiblemente aquellas en las que el acido nucleico que codifica la molecula de protelna/anticuerpo puede ser introducido en estas celulas y la composicion molecular de protelna/anticuerpo se alsla en condiciones exentas de suero.
Una composicion de protelna/protelna puede ser aislada por cualquiera de los metodos descritos en otras partes de la presente memoria.
Una composicion molecular de protelna puede ser aislada por cualquiera de los metodos descritos en otras partes de la presente memoria, que tiene una actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada y glicosilacion totalmente humana en el sentido de la invencion y descrita en otras partes de la presente memoria.
En una realizacion preferida adicional de la invencion la molecula de protelna o parte de la misma tiene un tamano de al menos 10 kDa, preferiblemente un tamano de al menos 15 kDa, mas preferiblemente un tamano de al menos 20 kDa, mas preferiblemente un tamano de al menos 25 kDa, mas preferiblemente un tamano de al menos 30 kDa,
mas preferiblemente un tamano de al menos 35 kDa, mas preferiblemente un tamano de al menos 40 kDa,
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preferiblemente
un tamano de al menos 45 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 50 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 55 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 60 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 65 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 70 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 75 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 80 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 85 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 90 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 95 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 100 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 105 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 110 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 115 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 120 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 125 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 130 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 135 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 140 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 145 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 150 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 155 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 160 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 165 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 170 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 175 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 180 kDa, mas
preferiblemente
un tamano de al menos 185 kDa, mas preferi blemente un tamano de al menos 190 kDa, mas
preferiblemente un tamano de al menos 195 kDa, lo mas preferiblemente un tamano de al menos 200 kDa.
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En una realizacion preferida de la invencion dicha composicion molecular de protelna se origina a partir de cualquiera de las moleculas de protelna del grupo de las citocinas y sus receptores, por ejemplo los factores de necrosis tumoral TNF-alfa y TNF-beta; renina; hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor liberador de la hormona del crecimiento; hormona paratiroide; hormona estimulante del tiroides; lipoprotelnas; alfa-1-antitripsina; cadena A y cadena B de la insulina; gonadotrofinas, p.ej. hormona estimulante del follculo (FSH), hormona luteneizante (LH), tirotrofina, y gonadotrofina corionica humana (hCG); calcitonina; glucagon; factores de la coagulacion tales como factor VIIIC, factor IX, factor VII, factor tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como protelna C; factor natriuretico atrial; surfactante pulmonar; activadores del plasminogeno, tales como urocinasa, activador del plasminogeno de orina humana y de tipo tisular; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyetico; encefalinasa; protelna inflamatoria de macrofagos humanos; una albumina de suero tal como albumina de suero humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A y cadena B de relaxina; prorelaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; factor de crecimiento endotelial vascular; receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; protelna A y D; factores reumatoides; factores neurotroficos tales como factor neurotrofico derivado del hueso, neurotrofina-3, -4, -5, -6 y factor beta del crecimiento de nervios; factor de crecimiento derivado de plaquetas; factores de crecimiento de fibroblastos; factor de crecimiento epidermico; factor de crecimiento transformante tal como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y Ii; protelnas de union al factor de crecimiento similar a la insulina; protelnas CD tales como CD-3, CD-4, cD-8 y CD-19; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una protelna morfogenetica del hueso; un interferon tal como interferon-alfa, -beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), p.ej. M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (ILs), p.ej. IL-1 a IL-12; superoxido dismutasa; receptores de linfocitos T; protelnas de membrana superficiales; factor acelerador de la degradacion; anticuerpos e inmunoadhesinas; Glicoforina A; MUC1.
En una realizacion mas preferida de la invencion dicha composicion molecular de protelna se origina a partir de cualquiera de las moleculas de protelna del grupo de Glicoforina A, EPO, G-CSF, GM-CSF, FSH, hCG, LH, interferones, interleucinas, anticuerpos y/o fragmentos de los mismos.
Tambien se describe una protelna de glicol o composicion de protelna obtenible por los metodos de production segun la presente invencion. Dicha protelna tiene preferiblemente las caracterlsticas de glicosilacion definidas en la presente memoria.
Preferiblemente, dicha composicion de protelna es una composicion molecular de anticuerpo. Se puede aislar una composicion molecular de anticuerpo por cualquiera de los metodos descritos en otras partes de la presente memoria que tiene una actividad aumentada y/o rendimiento aumentado y/o homogeneidad mejorada en el sentido de la invencion y descrito en otras partes de la presente memoria.
Ejemplos de tales anticuerpos incluyen anticuerpos contra gangliosido GD3, cadena alfa del receptor de interleucina- 5 humana, HER2, quimiocina cC receptora 4, CD20, CD22, neuroblastoma, MUC1, receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR).
En una realizacion preferida de la invencion dicha composicion molecular de anticuerpo se origina a partir de cualquiera de las moleculas de anticuerpo del grupo de Muromomab, Daclizumab, Basiliximab, Abciximab, Rituximab, Herceptin, Gemtuzumab, Alemtuzumab, Ibritumomab, Cetuximab (Erbitux), Bevacizumab, Tositumomab, Pavlizumab, Infliximab, Eculizumab, Epratuzumab, Omalizumab, Efalizumab, Adalimumab, Campath-1H, C2B8, Panorex, BrevaRex, Simulect, Antova, OKT3, Zenapax, ReoPro, Synagis, Ostavir, Protovir, OvaRex, Vitaxin.
En una realizacion mas preferida de la invencion dicha composicion molecular de anticuerpo se origina a partir de cualquiera de las moleculas de anticuerpo del grupo de Rituximab, Herceptin, anticuerpo anti-quimiocina CC receptora 4 KM2160, Campath-1H, C2B8, Erbitux, anticuerpo anti-neuroblastoma chCE7. En una realizacion incluso mas preferida de la invencion dicha composicion molecular de anticuerpo se origina a partir de cualquiera de las moleculas de anticuerpo del grupo de WO2004/065423, mas preferiblemente PankoMab, mas preferiblemente su forma quimerica e incluso mas preferiblemente su forma humanizada.
Tambien se describe una protelna o composicion de protelna obtenible por el metodo de produccion de la presente invencion, en donde la protelna es un anticuerpo que se une al epltopo de MUC1, que comprende la secuencia de aminoacidos DTR.
MUC1 es un marcador tumoral establecido expresado en diversos tumores epiteliales, y es una diana tumoral potencial. MUC1 es una glicoprotelna transmembrana grande, altamente O-glicosilada. La portion extracelular consiste en un numero variable de 20 a 120 repeticiones tandem (TR), cada una de las cuales consiste en 20 aminoacidos con cinco sitios de O-glicosilacion potenciales. MUC1 no solo se expresa en tejidos epiteliales sino tambien en celulas hematopoyeticas. Se conocen varios anticuerpos que se unen al motivo DTR de MUC1 que son tambien protelnas/anticuerpos adecuados en el contexto de la presente invencion (para una vision en conjunto vease Karsten et al, 1998). Karsten tambien describio un nuevo epltopo conformacional inducido por carbohidratos en MUC 1 (TA MUC) de la estructura ...PDT*RP... donde T* es O glicosilado. Los glicanos presentes en este sitio son en si estructuras de carbohidrato especlficas a tumores.
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Por tanto, es deseable usar un anticuerpo MUC que pueda discriminar entre el epltopo tumoral TA MUC y el epltopo no glicosilado. Un anticuerpo adecuado capaz de reconocer especlficamente el epltopo TA MUC glicosilado es el anticuerpo PankoMab. Su produccion se describe en detalle en Danielczyk et al 2006, incorporado totalmente en la presente memoria por referencia (PankoMab: a potent new generation anti-tumor MUC-1 antibody). Se usa preferiblemente el anticuerpo PankoMab o una variante del mismo, que se une competitivamente al mismo epltopo TA-MUC 1 como anticuerpo PankoMab parental. Tal variante de anticuerpo tiene al menos una de las siguientes caracterlsticas:
- se une a un epltopo que comprende al menos la secuencia de aminoacidos PDTRP;
- se une a un peptido MUC corto de 30 aminoacidos que comprende 1,5 TRs cuando esta glicosilado con Gal-Nacalfa en la secuencia PDTRP pero no si el mismo peptido no esta glicosilado;
- muestra un efecto de longitud aditiva de mas que 25, preferiblemente 28 (lo mas preferiblemente una relacion de 29,5);
- presenta una baja o incluso ninguna union a celulas del sistema hematopoyetico (con respecto al metodo de deteccion, por favor vease Danielczyk et al 2006, incorporado en la presente memoria por referencia);
- tiene una alta afinidad hacia celulas tumorales que varla de aproximadamente al menos Kass = 0,2 - 1 x 109M-1 determinada por analisis de representacion Scatchard.
Se dan ejemplos de variantes respectivas en los ejemplos. El anticuerpo puede ser de origen murino, quimerico o humanizado.
El anticuerpo que se une al epltopo TA-MUC 1, preferiblemente el anticuerpo PankoMab o los anticuerpos Panko 1 y Panko 2 descritos en la presente memoria, tiene al menos una de las siguientes caracterlsticas de glicosilacion:
(i) tiene un grado de sialilacion aumentado con al menos una cantidad 15% mas alta de acido N- acetilneuramlnico en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de anticuerpo de las moleculas de anticuerpo en dicha composicion molecular de anticuerpo que la misma cantidad de moleculas de anticuerpo de al menos una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma;
(ii) tiene un grado de galactosilacion mas alto con al menos una cantidad 5% mas alta de estructuras G2 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de anticuerpo de las moleculas de anticuerpo en dicha composicion molecular de anticuerpo que la misma cantidad de moleculas de anticuerpo de al menos una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo aislada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] cuando se expresa en la misma;
(iii) comprende una cantidad detectable de bisecGlcNAc;
(iv) no tiene o tiene menos que 2% de estructuras de manosa hlbridas o altas.
Un patron de glicosilacion respectivo da como resultado el siguiente patron de actividad sorprendente y beneficioso:
(i) una actividad CDC que es mas que 15% mas alta que la actividad del mismo anticuerpo expresado en celulas CHO;
(ii) una semivida en suero que es alargada en un factor 2 (mas que 1,5) en comparacion con un anticuerpo que no lleva sialilacion detectable;
(iii) tiene una citotoxicidad celular mediada por Fc aumentada que es al menos 2 veces mas alta que la citotoxicidad celular mediada por Fc de al menos una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo cuando se expresa en la llnea celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096].
Se puede obtener un anticuerpo respectivo produciendolo en llneas celulares segun la presente invention que proporcionan un alto grado de sialilacion y galactosilacion, pero preferiblemente una fucosilacion mas baja. Son ejemplos adecuados NM-H9D8 y NM-H9D8-E6.
Las siguientes tablas y figuras ilustran la presente invencion.
Las siguientes tablas 1 y 8 y figuras 1 a 17 ilustran la presente invencion.
Tabla 1: Rendimiento de PankoMab quimerico expresado en CHOdhfr- y NM-F9 cultivadas en medio suplementado con FCS.
Tabla 2: Rendimiento de PankoMab quimerico expresado en NM-H9D8 [DSM ACC2806] cultivada en medio exento de suero.
Tabla 3: Cuantificacion del contenido de acido sialico en PankoMab y CetuxiMab: los anticuerpos fueron producidos por la llnea celular indicada y cuantificados integrando el area de pico obtenida por cromatografla de fase inversa de las variantes de acido sialico marcadas con DMB. NeuGc y NeuAc fueron diferenciadas usando un patron de acido sialico.
Tabla 4: Cuantificacion de las estructuras diferentemente cargadas en Panko 1 y PankoMab: los N-glicanos
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marcados con 2-AB fueron sometidos a cromatografla de intercambio anionico (columna Asahi-PAK) y los picos correspondientes a las estructuras diferentemente cargadas fueron cuantificadas por integracion.
Tabla 5: El grado de galactosilacion de los anticuerpos Pankol y PankoMab se determino por HPLC de aminofase (columna Luna-NH2) de los glicanos marcados con 2-AB. Los picos fueron cuantificados por integracion y la estructura de glicano subyacente se analizo por espectroscopla de masas.
Tabla 6: Cuantificacion de las estructuras triantenaria y biantenaria+biseccionada en Pankol y PankoMab. Las fracciones que contienen GlcNAc potencialmente biseccionantes de la aminofase-HPLC se recogieron y sometieron a una cromatografla de fase inversa (columna RP-18). Mediante esto las estructuras triantenaria y biantenaria+biseccionada pueden ser distinguidas. El grado de fucosilacion de los anticuerpos se determino por HPLC de aminofase (columna Luna-NH2) de los glicanos marcados con 2-AB. Los picos fueron cuantificados por integracion y la estructura de glicano subyacente se analizo por espectroscopla de masas. Se determinaron las estructuras fucosiladas y no fucosiladas y se cuantificaron las areas de pico integradas. Tabla 7: Rendimiento de hFSH expresado en CHOdhfr- y GT-2x cultivadas en medio suplementado con FCS (CHOdhfr-) o medio exento de suero.
Tabla 8: Rendimiento de hFSH expresado en NM-H9D8 [DSM ACC2806] cultivada en medio exento de suero. Tabla 9: Combinaciones de actividad y glicosilacion adecuadas obtenibles con el metodo descrito en la presente memoria.
Tabla 10: Valores obtenidos de bisecGlcNAc y fucosa en diferentes llneas celulares.
Figura 1: Expresion fut8 mARN de la celula NM-F9, NM-D4 y NM-H9D8 [DSM ACC2806]. Como control sirvieron celulas HepG2.
Figura 2: Ensayo de liberacion en europio con Cetuximab aislado de celulas NM-H9D8-E6, celulas CHOdhfr- o celulas SP2/0 contra celulas LS174T como celulas diana. El ensayo se incubo durante 4 h a una relacion efector a celula diana de 50:1 con concentraciones de anticuerpo de 0 a 100 ng/ml.
Figura 3: La actividad ADCC de PankoMab quimerico aislado de NM-F9 es ~5 veces mas alta que el PankoMab quimerico aislado de las celulas CHOdhfr-.
Figura 4: Ensayo de liberacion en europio con Panko1 quimerico aislado de celulas NM-H9D8-E6, celulas CHOdhfr- y celulas NM-H9D8 contra celulas ZR-75-1 como celulas diana. El ensayo se incubo durante 4 h a una relacion efector a celula diana de 80:1 con concentraciones de anticuerpo de 0 a 1 pg/ml.
Figura 5: Actividad ADCC de Panko2 quimerico en un ensayo de liberacion en europio contra celulas ZR-75-1 despues de incubacion durante una noche con una relacion efector a celula diana de 50:1 y 5.000 celulas diana por pocillo. Las muestras se incubaron por triplicado.
Figura 6: Actividad ADCC de Panko2 quimerico en un ensayo de liberacion en europio contra celulas ZR-75-1 despues de incubacion durante una noche con una relacion efector a celula diana de 50:1 y 10.000 celulas diana por pocillo. Las muestras se incubaron por triplicado.
Figura 7: Ensayo CDC con PankoMab quimerico contra ZR-75-1.
Figura 8: La actividad de union del PankoMab quimerico aislado de NM-F9 al peptido MUC1 30-mer glicosilado sintetico es aproximadamente 50% mas alta que la actividad de union del PankoMab quimerico aislado de las celulas CHOdhfr-.
Figura 9: La actividad de union del Panko2 quimerico aislado de GT-2x y NM-H9D8 al peptido MUC1 30-mer glicosilado sintetico es aproximadamente 50% mas alta que la actividad de union del Panko2 quimerico aislado de las celulas CHOdhfr-.
Figura 10: Se realizo analisis Western blot para identificar la diferentemente sialilada cadena pesada de composiciones moleculares de anticuerpo expresadas en CHOdhfr-, NM-F9 o NM-H9D8 [DSM ACC2806]. Las protelnas fueron transferidas a nitrocelulosa y visualizadas por anticuerpos IgG anti-humanos secundarios (Fig. 10A) o bien SNA (Fig. 10B) que detecta sialilacion 2-6.
Figura 11: Se realizo analisis Western blot para identificar la diferentemente sialilada cadena pesada de composiciones moleculares de anticuerpo expresadas en CHOdhfr- o NM-H9D8. Las protelnas fueron transferidas a nitrocelulosa y visualizadas por SNA que detecta sialilacion 2-6.
Figura 12: Se realizo analisis ELISA para identificar las diferentemente sialiladas composiciones moleculares de anticuerpo expresadas en CHOdhfr-, GT-2x, NM-H9D8 o NM-H9D8-E6.
Figura 13: Se realizo analisis ELISA para identificar las diferentemente sialiladas composiciones moleculares de Cetuximab expresadas en CHOdhfr-, NM-F9 o NM-H9D8. La sialilacion fue analizada (A) por SNA, que detecta sialilacion alfa2-6 con o sin tratamiento con neuraminidasa y (B) por MAL I, que detecta sialilacion alfa2-3.
Figura 14: Puntos “dot blots” tenidos por SNA de los anticuerpos quimericos Panko1 y Panko2 aislados de celulas CHOdhfr-, NM-F9, NM-H9D8 o NM-H9D8-E6.
Figura 15: El PankoMab quimerico aislado de celulas NM-H9D8 esta disponible en el suero de ratones desprovistos de sistema inmune mas tiempo que el aislado de NM-F9.
Figura 16: Analisis SDS-Page de hFSH producida en NM-F9 (calle 1) y GT-2x (calle 2). 5 pg de hFSH purificada fueron separados por SDS-Page en un gel de acrilamida al 10% bajo condiciones reductoras por calle y tenidas por Azul Brillante de Coomasie. El Marcador indica un intervalo de 21-108 kD.
Figura 17: Se realizo analisis Western blot para identificar las diferentemente sialiladas composiciones moleculares de hFSH. 1 pg de composition molecular de hFSH de CHO (calle 1) y GT-2x (calle 2) fueron separados por SDS-Page en un gel de acrilamida al 10% bajo condiciones reductoras. Las protelnas fueron transferidas a nitrocelulosa y visualizadas con SNA que detecta la sialilacion 2-6.
5
10
15
20
25
Figura 18: muestra un anticuerpo IgG, en donde los N-glicanos estan unidos covalentemente en un residuo Asn 297 conservado en el dominio Ch2 de Fc. Como se indico, pueden haber oligosacaricos N-enlazados adicionales en el dominio Fab, que pueden incluso influir en la actividad de union del anticuerpo. Se muestran las estructuras de glicano solo en una mitad del anticuerpo. El carbohidrato Fc es una estructura de cadena ramificada que esta situada principalmente dentro de los dos dominios Ch2, con un brazo/antena de cada oligosacarido interactuando con las areas hidrofobas de los dominios Ch2. El analisis estructural de IgGs humanos policlonales y de mieloma ha demostrado que el Fc contiene diversas cantidades de una estructura central biantenaria base, como se demuestra en la Fig. 18. El significado de los slmbolos se muestra en la tabla correspondiente. Dicha estructura central puede contener ninguno (G0), uno (G1) o dos (G2) residuos de galactosa terminales y/o un residuo GlcNAc bisectora y/o un residuo de fucosa en la GlNAc proximal. Tambien pueden estar presentes mas moleculas de fucosa en los otros residuos GlcNAcc o los residuos de galactosa. La diversidad es aumentada incluso, ya que el acido sialico terminal puede estar presente o no dependiendo de las propiedades del anticuerpo, ya que se reporto que el acido sialico tiene un impacto negativo sobre ADCC.
LISTADO DE SECUENCIAS <110> Glycotope GmbH
<120> Sistema de produccion totalmente humano de alto rendimiento para anticuerpos y protelnas mejorados
<130> 52 916 K
<150> PCT/EP2007/007877
<151 > 2007-09-10
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 187
<212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<223> Variante de DHFR resistente a MTX <400> 1

lie Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Trp 20 25 30

Lys Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gin 35 40 45

Asn Leu Val lie Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser lie Pro Glu Lys 50 55 60

Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg lie Asn lie Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 . 80

Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys ser Leu Asp Asp 85 90 95

Ala Leu Arg Leu lie Glu Gin Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp Met 100 105 110

Val Trp lie Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gin Glu Ala Met Asn Gin 115 120 125

Pro Gly His Leu Arg Leu Phe val Thr Arg lie Met Gin Glu Phe Glu 130 135 140

Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160

Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gin Glu Glu Lys Gly lie 165 170 175

Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185
<<210>2 <211> 187 <212> PRT
5 <213> Desconocido
<220>

lie Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser 20 25 30

Arg Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr ser ser val Glu Gly Lys Gin 35 40 45

Asn Leu Val lie Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser lie Pro Glu Lys 50 55 60

Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg lie Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80

Lys Glu Pro Pro Gin Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp 85 90 95

Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gin Pro Glu Leu Ala Asn Lys val Asp Met 100 105 110

Val Trp lie Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His 115 120 125

Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg lie Met Gin Asp Phe Glu 130 135 140

ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160

Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gin Glu Glu Lys Gly lie 165 170 175

Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp 180 185
<210>3 <211> 187 <212> PRT
5 <213> Desconocido
<220>
Met
Val Gly ser' Leu Asn cys lie
1
5
lie
Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro
20
Arg
Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr
35 40
Asn
Leu Val lie Met Gly Lys Lys
50 55
Asn
Arg Pro Leu Lys Gly Arg lie
65
70
Lys
Glu Pro Pro Gin Gly Ala His
85
Ala
Leu Lys Leu Thr Glu Gin Pro
100
Val
Trp lie Val Gly Gly Ser Ser
115 120
Pro
Gly His Leu Lys Leu Phe Val
130 135
Ser
Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie
145
150
Pro
Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser
165
Lys
Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu
180
Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ala 25 30
Thr ser ser val Glu Gly Lys Gin 45
Thr Trp Phe Ser lie Pro Glu Lys 60

Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu 75 80

Phe Leu ser Arg Ser Leu Asp Asp 90 95

Glu Leu Ala Asn Lys val Asp Met 105 110
Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His 125
Thr Arg lie Met Gin Asp Phe Glu 140

Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 155 160

Asp Val Gin Glu Glu Lys Gly lie 170 175
Lys Asn Asp 185
<210>4 <211> 187 <212> PRT
5 <213> Desconocido
<220>
<223> Variante de DHFR resistente a MTX <400> 4

Met Val Gly Ser Leu Asn Cys lie Val Ala Val Ser Gin Asn Met Gly 15 10 15
lie
Gly Lys Asn • Gly Asp Leu Pro
20
Arg
Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr
35 40
Asn
Leu Val lie Met Gly Lys Lys
50 55
Asn
Arg Pro Leu Lys Gly Arg lie
65
70
Lys
Glu Pro Pro Gin Gly Ala His
85
Ala
Leu Lys Leu Thr Glu Gin Pro
100
Val
Trp lie Val Gly Gly Ser Ser
115 120
Pro
Gly His Leu Lys Leu Phe Val
130 135
ser
Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie
145
150
Pro
Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser
165
Lys
Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu
180
Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gin 45
Thr Trp Phe Ser lie Pro Glu Lys 60

Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu 75 80

Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp 90 95

Glu Leu Ala Asn Lys val Asp Met 105 110
Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn Hi's 125
Thr Arg lie Met Gin Asp Phe Glu 140
Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 155 160
Asp Val Gin Glu Glu Lys Gly lie 170 175
Lys Asn Asp 185
<210>5 <211> 187 <212> PRT
5 <213> Desconocido
<220>
<223> Variante de DHFR resistente a MTX <400>5
Met
Val Gly Ser Leu Asn Cys lie Val Ala
1
5 10
lie
Gly Lys Asn Gly Asp Tyr Pro Trp Pro
20 25
Arg
Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr Ser
35
40
Asn
Leu Val lie Met Gly Lys Lys Thr Trp
50 55
Asn
Arg Pro Leu Lys Gly Arg lie Asn Leu
65
70
Lys
Glu Pro Pro Gin Gly Ala His Phe Leu
85 90
Ala
Leu Lys Leu Thr Glu Gin Pro Glu Leu
100 105
Val
Trp lie Val Gly Gly Ser Ser val Tyr
115 120
Pro
Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg
130 135
ser
Asp Thr Phe Phe pro Glu lie Asp Leu
145
150
Pro
Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val
165 170
Lys
Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn
180 185
Pro Leu Arg Asn Glu Phe 30
Ser Val Glu Gly Lys Gin 45
Phe Ser lie Pro Glu Lys 60
Val Leu Ser Arg Glu Leu 75 80
Ser Arg Ser Leu Asp Asp 95
Ala Asn Lys val Asp Met 110
Lys Glu Ala Met Asn His 125
lie Met Gin Asp Phe Glu 140
Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 155 160
Gin Glu Glu Lys Gly lie 175
Asp
<210>6 <211> 187 <212> PRT
5 <213> Desconocido
<220>

lie Gly Lys Asn Gly Asp Arg Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe 20 25 30

Arg Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gin 35 40 45

Asn Leu val lie Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe ser He pro Glu Lys 50 55 60

Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg lie Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80

Lys Glu Pro Pro Gin Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp 85 90 95

Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gin Pro Glu Leu Ala Asn Lys3val Asp Met 100 105 110

Val Trp lie Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His 115 120 125

Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg lie Met Gin Asp Phe Glu 130 135 140

ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160

Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gin Glu Glu Lys Gly lie 165 170 175

Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp 180 185
<210>7 <211> 187 <212> PRT
5 <213> Desconocido
<220>
Met
Val Gly Ser •Leu Asn cys lie Val Ala
1
5 10
lie
Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro
20 25
Arg
Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr Ser
35 40
Asn
Leu val lie Met Gly Lys Lys Thr Trp
50 55
Asn
Arg Pro Leu Lys Gly Arg lie Asn Leu
65
70
Lys
Glu Pro Pro Gin Gly Ala Hi s Phe Leu
85 90
Ala
Leu Lys Leu Thr Glu Gin Pro Glu Leu
100 105
val
Trp lie Val Gly Gly ser Ser Val Tyr
115 120
Pro
Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg
130 135
ser
Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie Asp Leu
145
150
Pro
Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val
165 170
Lys
Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn
180 185
Pro Leu Arg Asn Glu Phe 30
Ser Val Glu Gly Lys Gin 45
phe ser lie Pro Glu Lys 60
Val Leu Ser Arg Glu Leu 75 80
Ser Arg Ser Leu Asp Asp 95
Ala Asn Lys val Asp Met 110
Lys Glu Ala Met Asn His 125
lie Met Gin Asp Phe Glu 140
Glu Lys Tyr Lys Leu Leu 155 160
Gin Glu Glu Lys Gly lie 175
Asp
<210>8 <211> 187 <212> PRT
5 <213> Desconocido
<220>
Gly Phe Gin
Lys
Leu 80
Asp
Met
Gin
Glu
Leu 160
lie
<210>9 <211> 187 <212> PRT
5 <213> Desconocido
<220>
Met
Val Arg Pro .Leu Asn Cys lie Val Ala Val Ser Gin Asn
Met
1
5 10 15
lie
Gly Lys Asn Gly Asp Arg Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu
20 25 30
Lys
Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser val Glu Gly
Lys
35
40 45
Asn
Leu Val lie Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser He Pro Glu
50 55 60
Asn
Arg Pro Leu Lys Asp Arg lie Asn lie Val Leu Ser Arg Glu
65
70 75
Lys
Gl u Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys ser Leu Asp
85 90 95
Al a
Leu Arg Leu lie Glu Gin Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp
100 105 110
Val
Trp lie Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gin Glu Al a Met Asn
115 120 12 5
Pro
Gly Hi's Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg lie Met Gin Glu Phe
130 135 140
Ser
Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu
145
150 155
Pro
Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gin Glu Glu Lys Gly
165 170 175
Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185

lie Gly Lys Asn Gly Asp Tyr Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe 20 25 30

Lys Tyr Phe Gin Arg Met Thr Thr Thr ser ser val Glu Gly Lys Gin 35 40 45

Asn Leu Val lie Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser lie Pro Glu Lys 50 55 60

Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg lie Asn lie Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80

Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp 85 90 95

Ala Leu Arg Leu lie Glu Gin Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp Met 100 105 110

Val Trp lie Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gin Glu Ala Met Asn Gin 115 120 125

Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg lie Met Gin Glu Phe Glu 130 135 140

ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu lie Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160

Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gin Glu Glu Lys Gly lie 165 170 175

Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185
<210> 10 <211> 18 <212> PRT
5 <213> Desconocido
<220>
<223> peptido senal de secrecion <400> 10
Met Trp Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser lie 15 10 15
10 Ser Ala <210> 11
<211> 117 <212> PRT <213> Desconocido <220>
5 <223> cadena pesada variable del anticuerpo Panko -1
<400> 11
Glu Val Lys 1
Ser Met Lys
Trp Met Asp 35
Ala G"lu lie 50
Ser Val Lys 65
val Tyr Leu
Tyr cys Thr
Thr Leu Thr 115
<210> 12 <211 > 113 10 <212> PRT
<213> Desconocido <220>
<223> cadena ligera variable del anticuerpo Panko 1 <400> 12
Asp lie Val Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15
Leu
val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
5 10 15
Leu
Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20
25 30
Trp
Val Arg Gin ser Pro Gl u Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
Arg
Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
55 60
Gly
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Val Ser Lys Ser Ser
70 75 80
Gin
Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly lie Tyr
85 90 95
Arg
Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100
105 110
Val
Ser
imagen1
Arg
<210> 13 <211> 116 <212> PRT <213> Desconocido <220>
<223> cadena pesada variable del anticuerpo Panko 2 <400> 13
imagen2
5
<210> 14 <211> 113 <212> PRT <213> Desconocido 5 <220>
<223> cadena ligera variable del anticuerpo Panko 2 <400> 14

Asp lie val Met Thr Gin Ala Ala Phe ser Asn Pro val Thr Leu Gly 15 10 15

Thr ser Ala ser lie ser cys Arg ser ser Lys ser Leu Leu His ser 20 25 30

Asn Gly lie Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe ser ser ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg lie

65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg
10 <210> 15
<211> 118 <212> PRT <213> Desconocido <220>
15 <223> cadena pesada variable del anticuerpo Cetuximab
<400> 15

Gin Val Gin Leu Lys Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin 15 10 15

ser Leu ser lie Thr cys Thr val ser Gly Phe ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 50

Gly Val His Trp Val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Val lie Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60

Ser Arg Leu Ser lie Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe 65 70 75 80

Lys Met Asn ser Leu Gin ser Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr cys Ala 85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser 115
5
<210> 16 <211>108 <212> PRT <213> Desconocido <220>
<223> cadena ligera variable del anticuerpo Cetuximab <400> 16
5
10
15
Asp
lie Leu Leif Thr Gin Ser Pro
1
5
Glu
Arg Val ser Phe Ser cys Arg
20
lie
Hi s Trp Tyr Gin Gin Arg Thr
35 40
Lys
Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser
50
55
Ser
Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr
65
70
Glu
Asp lie Al a Asp Tyr Tyr cys
85
Thr
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
100
Val
lie Leu Ser Val Ser Pro Gly
10 15
Ala
ser Gl n Ser lie Gly Thr Asn
25
30
Asn
Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie
45
Gly
lie Pro Ser Arg Phe Ser
Gly
60
Leu
ser lie Asn ser val Glu ser
75 80
Gin
Gin
Asn Asn Asn Trp Pro Thr
90 95
G"lu Leu Lys Arg 105
<210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Cebador para la cadena alfa de FSH <400> 17
aaaggtacca tggattacta cagaaaatat g 31
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> cebador para la cadena alfa de FSH <400> 18
aaaggatcct taagatttgt gataataac 29
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador para la cadena beta de FSH
10
15
20
<400> 19
tttaagctta tgaagacact ccagtttttc 30
<210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> cebador para la cadena beta de FSH <400> 20
tttggatcct tattctttca tttcacc 27 <210> 21 <211 > 399 <212> DNA <213> Artificial <220>
<223> secuencia de cDNA <220>
<221> rasgo misc_
222> (1)..(63)
<223> secuencia llder de TCR <400> 21
atggcctgcc ccggcttcct gtgggccctg gtgatcagca cctgcctgga attctccatg gctaacagct gcgagctgac caacatcacc atcgccatcg agaaagagga atgccggttc tgcatcagca tcaacaccac ctggtgcgcc ggctactgct acacccggga cctggtgtac aaggaccccg ccaggcccaa gatccagaaa acctgcacct tcaaagaact ggtgtacgag
accgtgcggg tgcccggctg cgcccaccac gccgacagcc tgtacaccta ccccgtggcc
acccagtgcc actgcggcaa gtgcgacagc gacagcaccg actgcaccgt gaggggcctg
ggccccagct actgcagctt cggcgagatg aaagagtga
60
120
180
240
300
360
399

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para seleccionar una celula huesped para producir una composicion de protelna que tiene al menos una de las siguientes caracterlsticas de glicosilacion:
    (i) tiene una cantidad de estructuras G2 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% mas alta en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC N° CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
    (ii) comprende mas que 35% de estructuras G2 presentes en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion de protelna; y/o
    (iii) tiene una cantidad de estructuras G0 en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% mas baja en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCc No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
    (iv) comprende menos que 22% de estructuras G0 presentes en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion de protelna; y/o
    (v) comprende una cantidad de fucosa en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 5% menos en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCc No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
    (vi) comprende al menos 2% de estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que contiene GlcNAc bisectora; y/o
    (vii) tiene un patron de sialilacion que esta alterado en comparacion con el patron de sialilacion de al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma, en donde
    - tiene un grado de sialilacion aumentado, con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 15% mas alta en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC N° CRL- 9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; o
    - tiene un grado de sialilacion disminuido, con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 15% mas baja en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC N° CRL- 9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma;
    mediante las siguientes etapas
    (a) introducir en al menos dos celulas huesped diferentes que proporcionan un patron de glicosilacion divergente al menos un acido nucleico que codifica una protelna o al menos una parte de la misma; en donde al menos una de dichas celulas huesped es una celula sangulnea humana inmortalizada seleccionada del grupo que consiste en las llneas celulares DSM ACC2858 (GT-2X), DSM ACC2806 (NM-H9D8), DSM ACC2807 (NM-H9D8-E6), DSM ACC2856 (NM-H9D8-E6Q12) o una celula o llnea celular derivada de las mismas; y
    (b) cultivar dichas al menos dos celulas huesped diferentes, en donde cada celula huesped diferente produce una composicion de protelna que tiene un patron de glicosilacion divergente del patron de glicosilacion producido por la otra celula huesped;
    (c) aislar dichas composiciones de protelna expresadas que llevan un patron de glicosilacion diferente de las al menos dos celulas huesped diferentes; y
    (d) seleccionar dicha celula huesped que produce una composicion de protelna que tiene al menos una de las caracterlsticas de glicosilacion definidas en (i) a (vii).
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde dicha composicion de protelna presenta al menos una de las siguientes caracterlsticas:
    - en caso de que sea una composicion molecular de anticuerpo, tiene una citotoxicidad celular mediada por
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    Fc aumentada que es al menos 2 veces mas alta que la citotoxicidad celular mediada por Fc de al menos una composition molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo cuando se expresa en la llnea celular ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-); y/o
    - en caso de que sea una composicion molecular de anticuerpo, tiene una union mediada por antlgeno o mediada por Fc aumentada que es al menos 50% mas alta que la union de al menos una composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo cuando se expresa en la llnea celular ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-);
    y/o
    - tiene un rendimiento medio o maximo aumentado de dicha composicion molecular de protelna que es al menos 10% mas alto que el rendimiento de al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna cuando se expresa en la llnea celular ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-).
  3. 3. El metodo segun la revindication 1 o 2, en donde al menos una de dichas celulas huesped es capaz de producir una composicion de protelna
    - que tiene un grado de sialilacion aumentado con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion de protelna que es al menos 15% mas alto en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
    - en donde las moleculas de protelna en la composicion tienen un grado mas alto de sialilacion que el que se alcanza en celulas DSM ACC2606 (NM-F9) o DSM ACC2605 (NM-D4); en donde las celulas DSM ACC2606 (NM-F9) y DSM ACC2605 (NM-D4) solo alcanzan aproximadamente 50 a 60% del grado de sialilacion que se obtiene con la celula huesped usada en la etapa (a) del metodo de production.
  4. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde
    (i) al menos una de dichas celulas huesped es capaz de producir una composicion de protelna, preferiblemente una composicion de anticuerpo, que comprende al menos 2%, preferiblemente al menos 5%, mas preferiblemente al menos 10% o al menos 15% de estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de una molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que contiene GlcNAc bisectora; y/o
    (ii) al menos una de dichas celulas huesped es capaz de producir una composicion de protelna, preferiblemente una composicion de anticuerpo, en donde las moleculas de protelna en la composicion tienen un grado de sialilacion aumentado con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular particular de la molecula de protelna de dichas moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 20%, preferiblemente al menos 30% mas alto en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y/o
    (iii) al menos una de dichas celulas huesped es capaz de producir una composicion de protelna, preferiblemente una composicion de anticuerpo, que comprende al menos 50%, preferiblemente al menos 60% y mas preferiblemente al menos 70% de estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales totales o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de una molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna, que carece de fucosa.
  5. 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde al menos una de dichas celulas huesped es capaz de producir una composicion de protelna, preferiblemente una composicion de anticuerpo, que presenta un patron de glicosilacion que tiene las siguientes caracterlsticas:
    (i) no comprende NeuGc detectable;
    (ii) no comprende Galalfa1-3Gal detectable;
    (iii) comprende NeuNAc enlazado en alfa2-6;
    (iv) tiene un grado de sialilacion aumentado con una cantidad de NeuNAc en las estructuras de carbohidrato totales o en las estructuras de carbohidrato en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que es al menos 15% mas alto en comparacion con la misma cantidad de moleculas de protelna en al menos una composicion molecular de protelna de la misma molecula de protelna aislada de de ATCC No. CRL-9096 (CHOdhfr-) cuando se expresa en la misma; y
    (v) comprende al menos 2% de estructuras de carbohidrato de las unidades carbohidrato totales o de al menos una cadena de carbohidrato particular en un sitio de glicosilacion particular de la molecula de protelna de las moleculas de protelna en dicha composicion molecular de protelna que contiene GlcNAc bisectora.
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  6. 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende ademas determinar la actividad, afinidad y/o semivida en suero de las proteinas producidas en las diferentes lineas celulares
  7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proteina se selecciona del grupo que consiste en el grupo de citocinas y sus receptores, tales como los factores de necrosis tumoral TNF-alfa y TNF-beta; renina; hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor liberador de la hormona del crecimiento; hormona paratiroide; hormona estimulante del tiroides; lipoproteinas; alfa-1-antitripsina; cadena A y cadena B de la insulina; gonadotrofinas, tales como hormona estimulante del foliculo (FSH), hormona luteneizante (LH), tirotrofina, y gonadotrofina corionica humana (hCG); calcitonina; glucagon; factores de la coagulacion tales como factor VIIIC, factor IX, factor VII, factor tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como proteina C; factor natriuretico atrial; surfactante pulmonar; activadores del plasminogeno, tales como urocinasa, activador del plasminogeno de orina humana y de tipo tisular; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyetico; encefalinasa; proteina inflamatoria de macrofagos humanos; una albumina de suero tal como albumina de suero humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A y cadena B de relaxina; prorelaxina; peptido asociado a gonadotropina de raton; factor de crecimiento endotelial vascular; receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteina A y D; factores reumatoides; factores neurotroficos tales como factor neurotrofico derivado del hueso, neurotrofina-3, neurotrofina-4, neurotrofina-5, neurotrofina-6 y factor beta del crecimiento de nervios; factor de crecimiento derivado de plaquetas; factores de crecimiento de fibroblastos; factor de crecimiento epidermico; factor de crecimiento transformante tal como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y Ii; proteinas de union al factor de crecimiento similar a la insulina; proteinas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y cD-19; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteina morfogenetica del hueso; un interferon tal como interferon-alfa, -beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), tales como M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (ILs), tales como IL-1 a IL-12; superoxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteinas de membrana superficiales; factor acelerador de la degradacion; anticuerpos e inmunoadhesinas; glicoforina A; MUC1.
  8. 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha proteina es un anticuerpo o un fragmento del mismo.
  9. 9. El metodo segun la reivindicacion 8, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos contra gangliosido GD3, anticuerpos contra cadena alfa del receptor de interleucina-5 humana, anticuerpos contra HER2, anticuerpos contra quimiocina CC receptora 4, anticuerpos contra CD20, anticuerpos contra CD22, anticuerpos contra neuroblastoma, anticuerpos contra MUC1, anticuerpos contra receptor de factor de crecimiento epidermico; en particular un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en PankoMab, Muromomab, Daclizumab, Basiliximab, Abciximab, Rituximab, Herceptin, Gemtuzumab, Alemtuzumab, Ibritumomab, Cetuximab, Bevacizumab, Tositumomab, Pavlizumab, Infliximab, Eculizumab, Epratuzumab, Omalizumab, Efalizumab, Adalimumab, OKT3, anticuerpo KM2160 anti-quimiocina CC receptora 4, y anticuerpo chCE7 anti-neuroblastoma.
  10. 10. El metodo segun la reivindicacion 8, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo contra MUC1; un anticuerpo contra HER2; y un anticuerpo contra EFGR.
  11. 11. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha proteina
    (i) esta fusionada a otra secuencia de peptido o polipeptido tal como un enlazador, una molecula activadora o una toxina; o
    (ii) es un fragmento de anticuerpo fusionado a otra secuencia de proteina, en particular una secuencia de proteina seleccionada del grupo que consiste en citocinas, factores co-estimulatorios, toxinas, fragmentos de anticuerpo de otros anticuerpos, secuencias de multimerizacion, y secuencias para la detection, purification, secretion o estabilizacion tales como etiquetas, senales de localization o enlazadores; o
    (iii) es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo acoplado a una molecula efectora que media un efecto terapeutico, tal como una molecula efectora inmune, una toxina o un radioisotopo.
  12. 12. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde el anticuerpo es de la clase IgG, preferiblemente un IgG humano, humanizado o quimerico que comprende una region Fc humana.
  13. 13. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde la composition de anticuerpo comprende al menos una glicoforma de una molecula de anticuerpo con al menos una cadena de carbohidrato unida a otro sitio de glicosilacion de la molecula de anticuerpo que el aminoacido Asn-297 en el segundo dominio de la region Fc.
  14. 14. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en donde el anticuerpo tiene al menos un sitio de N-glicosilacion que tiene la secuencia de aminoacidos Asn-Xaa-Ser/Thr, en donde Xaa puede ser cualquier aminoacido excepto Pro, y/o al menos un sitio de O-glicosilacion en la secuencia de la region Fab.
  15. 15. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en donde la composicion de anticuerpo comprende
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    (i) una molecula de anticuerpo que comprende al menos una cadena de carbohidrato unida a otro sitio de glicosilacion de la molecula de anticuerpo que el aminoacido Asn-297 en el segundo dominio de la parte Fc, en donde la composicion de anticuerpo tiene una semivida en suero y/o biodisponibilidad extendida, cuando se mide en al menos un mamlfero tal como ratones, ratas o seres humanos, que la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo aislada de al menos una de las llneas celulares CHO, CHOdhfr-, BHK, NSO, SP2/0, DSM ACC2606 (NM-F9), DSM ACC2605 (NM-D4), PerC.6 o hibridoma de raton cuando se expresa en las mismas; o
    (ii) una molecula de anticuerpo que comprende al menos una cadena de carbohidrato unida al menos a un sitio de N-glicosilacion y/o al menos un sitio de O-glicosilacion en una secuencia de la region Fab de la molecula de anticuerpo, en donde la composicion de anticuerpo tiene una semivida en suero y/o biodisponibilidad extendida, cuando se mide en al menos un mamlfero tal como ratones, ratas o seres humanos, que la composicion molecular de anticuerpo de la misma molecula de anticuerpo aislada de al menos una de las llneas celulares CHO, CHOdhfr-, BHK, NSO, SP2/0, DSM ACC2606 (NM-F9), DSM ACC2605 (NM-D4), PerC.6 o hibridoma de raton cuando se expresa en las mismas.
  16. 16. Un metodo para producir una composicion de protelna, que comprende
    (a) realizar un metodo para seleccionar una celula huesped para producir una composicion de protelna segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15; y
    (b) cultivar la celula huesped seleccionada en condiciones que permiten la produccion de dicha composicion de protelna; y
    (c) aislar dicha composicion de protelna.
  17. 17. El metodo segun la reivindicacion 16, en donde dicha protelna es un anticuerpo.
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