ES2613152T3 - Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/acción extremadamente retardado - Google Patents

Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/acción extremadamente retardado Download PDF

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Gerhard Seipke
Roland Kurrle
Günter Müller
Mark Sommerfeld
Norbert Tennagels
Georg Tschank
Ulrich Werner
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Abstract

Análogo de insulina de la fórmula I**Fórmula** correspondiendo A0 a Arg; A5 a Asp, Gln o Glu; A15 a Asp, Glu o Gln; A18 a Asp, Glu o Asn; B-1 a Asp, Glu o un grupo amino; B0 a Asp, Glu o un enlace químico; B1 a Asp, Glu o Phe; B2 a Asp, Glu o Val; B3 a Asp, Glu o Asn; B4 a Asp, Glu o Gln; B29 a Lys; B30 a Thr; B31 a Arg o Lys; B32 a Arg-NH2 o Lys-NH2 correspondiendo dos restos aminoácido del grupo que contiene A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 y B4, simultánea a independientemente entre sí, a Asp o Glu.

Description

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DESCRIPCION
Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/accion extremadamente retardado
La invencion se refiere a nuevos analogos de insulina con perfil tiempo/accion basal, a su obtencion y empleo.
Durante los ultimos anos ha aumentado el numero de afecciones de diabetes en una medida francamente epidemica. Debido a la afeccion, se puede llegar a un acortamiento agravante de la esperanza de vida. Las personas con diabetes deben administrar frecuentemente insulina a su cuerpo desde fuera. Es razonable optimizar el tratamiento con insulina. Entre tanto, existen diversas insulinas con propiedades farmacologicas especfficas para el tratamiento. De manera practica, las diferentes insulinas se diferencian segun su tiempo de accion en insulinas eficaces a corto plazo, insulinas de accion rapida, insulinas eficaces a largo plazo e insulinas mixtas. Las denominaciones empleadas como sinonimo para insulinas eficaces a largo plazo son insulina retardada, insulina de deposito o insulina basal. Los productos activos de muchos de estos preparados de insulina son los denominados analogos de insulina, que se han derivado de insulina humana mediante substitucion, delecion y/o adicion de uno o varios aminoacidos. Los conceptos “analogos de insulina” e “insulina” se emplean como sinonimos en este caso.
El concepto de terapia por insulina intensificada intenta reducir el riesgo para la salud, pretendiendose un control estable del nivel de azucar en la sangre mediante adicion temprana de insulinas basales. Un ejemplo de una insulina basal de uso comun es el medicamento Lantus® (producto activo: insulina glargina = Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) insulina humana). En general es valido minimizar el numero de episodios hipoglucemicos en el desarrollo de nuevas insulinas basales mejoradas. En este caso, una insulina basal ideal actua de manera segura en cualquier paciente al menos 24 horas. Idealmente, la accion de la insulina se inicia de manera retardada y con un perfil tiempo/accion lo mas plano posible, de modo que el peligro de una hipoglucemia a corto plazo esta claramente minimizado, y la aplicacion se puede efectuar incluso sin ingesta previa de alimentos. Se da un buen abastecimiento de insulina basal si la accion de la insulina permanece constante el mayor tiempo posible, es decir, si el cuerpo se abastece de una cantidad de insulina constante. De este modo, el peligro de episodios hipoglucemicos es reducido, y se minimiza una variabilidad espedfica del paciente y del dfa. Por lo tanto, el perfil farmacocinetico de una insulina basal ideal debfa estar caracterizado por un inicio de accion retardado y por una accion retardada, es decir, de larga duracion y uniforme.
No obstante - a pesar de las ventajas terapeuticas ya conseguidas - ninguna de las insulinas retardadas descritas hasta la fecha muestra las propiedades farmacocineticas de una insulina basal ideal. Son deseables insulinas que tienen un perfil tiempo/accion tan plano y duradero que el peligro de episodios hipoglucemicos y de la variacion dependiente del dfa en pacientes se minimiza adicionalmente, y el tiempo de accion se retrasa ulteriormente, de modo que, bajo ciertas circunstancias, ya no se debe administrar insulina diariamente. Esto posibilitana un tratamiento simplificado de diabeticos, en especial de diabeticos mayores y necesitados de cuidados, que ya no se pueden inyectar insulina por sf mismos, y por lo tanto sena tambien de gran utilidad economica. En la fase temprana de diabetes tipo 2 senan ademas utiles tales insulinas basales. Los clmicos informan de que la fobia a las jeringuillas, presente en muchas personas, se puede detener en las mismas comenzando con la terapia por insulina a tiempo. Como consecuencia resulta un mal ajuste del azucar en la sangre, que conlleva consecuencias diabeticas. Una insulina basal que reduce el numero de dosis de insulina efectuadas mediante inyeccion, podna ocasionar que los pacientes acepten mas facilmente la terapia por insulina.
El documento US 6,100,376 da a conocer derivados de insulina con un punto isoelectrico entre 5 y 8,5, con una estabilidad elevada en medio acuoso ligeramente acido. El documento US 6,100,376 describe la modificacion C- terminal Arg-Arg-OH en la cadena B.
El documento WO 2007/081824 da a conocer analogos de insulina con restos histidina contra fibrilacion en las posiciones A4, A8 y B1.
El documento WO 89/10937 se refiere a la estabilizacion de analogos de insulina contra modificaciones qmmicas, como por ejemplo desamidacion o di- o bien polimerizacion. El documento WO 89/10937 da a conocer modificaciones en las posiciones A15, A18, A21, B3, B4 y B10.
Markussen et al. (Protein Engineering, 1987,1:205-213) dan a conocer analogos de insulina con accion prolongada, y describen substituciones en las posiciones B-1, B1, B29, B30, B31 y B32. Se substituye con los aminoacidos Thr, Lys, Asp, Arg y Phe.
Kohn et al. (Peptides 28 (2007) 935-948) describen que se puede conseguir la optimizacion de la farmacodinamica de insulina obteniendose analogos de insulina cuyo punto isolectrico (pl), mediante adicion de lisina o arginina en el extremo de cadena B o el termino N de la cadena Y a B, esta desplazado en el sentido del intervalo alcalino en comparacion con el punto isoelectrico de insulina humana (pl = 5,6), de modo que la solubilidad bajo condiciones
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fisiologicas es reducida, y resulta un perfil tiempo/accion prolongado. El compuesto 18 de Kohn et al. (Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) insulina humana (pl determinado experimentalmente = 7,3; pl calculado = 7,58) se presenta en este caso como el mejor compuesto en el sentido del concepto. Por lo tanto, el objetivo principal en la configuracion de nuevos analogos de insulina es considerado por Kohn et al. la adicion de aminoacidos cargados positivamente a la secuencia de aminoacidos de insulina humana, con el fin de aumentar el punto isoelectrico de pl = 5,6 al intervalo neutro.
A este objetivo en el acondicionamiento de nuevos analogos de insulina se opone la substitucion de aminoacidos neutros en insulina humana por aminoacidos acidos y/o la adicion de aminoacidos acidos, ya que tal substitucion y/o tales adiciones anulan al menos parcialmente el efecto de la introduccion de aminoacidos cargados positivamente. No obstante, sorprendendentemente ahora se descubrio que conducen al perfil tiempo/accion basal descrito deseable aquellos analogos de insulina que se distinguen por las caractensticas:
• el extremo de cadena B esta constituido por un resto aminoacido amidado basico, como lisina, o bin argininamida, es decir, en el caso del resto aminoacido amidado basico, el grupo carboxilo del aminoacido terminal en el extremo de cadena B se presenta en su forma amidada, y
• el resto aminoacido N-terminal de la cadena de insulina A es un resto lisina o arginina, y
• la posicion de aminoacido A8 esta ocupada por un resto histidina, y
• la posicion de aminoacido A21 esta ocupada por un resto glicina, y
• dos substituciones de aminoacidos neutros por aminoacidos acidos, dos adiciones de restos aminoacido cargados negativamente, o respectivamente una substitucion tal y una substitucion tal, se efectuan respectivamente en las posiciones A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 y B4.
Mientras que las tres primeras caractensticas citadas, mediante introducciones de cargas positivas, o bien la exclusion de cargas negativas, tienden a contribuir a un aumento del valor pl de un correspondiente analogo de insulina, las substituciones y/o adiciones de restos aminoacido cargados negativamente, citadas en ultimo lugar, tienen el efecto contrario y contribuyen a una reduccion del valor pl. De modo sorprendente, precisamente los analogos de insulina descritos anteriormente tienen los perfiles tiempo/accion ventajosos deseados. Los valores pl de estos compuestos son mas reducidos que los del compuesto 18 de Kohn et al. (Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - insulina humana), pero en este caso presentan, no obstante, un inicio de accion retardado y un tiempo de accion mas largo, es decir, un desarrollo de accion extremadamente plano y duradero, uniforme. De este modo se minimiza claramente el peligro de episodios hipoglucemicos. El retardo es tan evidente que el efecto se puede identificar de modo sorprendente incluso en modelos de ensayo en ratas, aunque, en contrapartida, la accion retardada de insulina glargina en la rata no es observable evidentemente. En la figura 1 se representa la accion hipoglucemica del compuesto YKL205 segun la invencion, en comparacion con la de insulina glargina. Se obtienen resultados similares en el perro (vease la figura 2). De este modo se han puesto a disposicion nuevas insulinas basales, que se deben aplicar claramente con menor frecuencia. Ademas de estas ventajas farmacocineticas descritas, los analogos segun la invencion, frente a insulina glargina, presentan propiedades claramente mejores desde el punto de vista farmacologico, como por ejemplo especificidad con el receptor y mitogenicidad in vitro. Ademas, las insulinas reivindicadas tienen tambien ventajas desde el punto de vista ffsico-qmmico.
Por consiguiente, es objeto de la invencion un analogo de insulina de la formula I
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imagen1
B-l B0B1B2B3B4HLCGSHLVEALYLVCGERGFFY 1 5 10 15 20 25
T P B29 B30 B31 B32 (SEQ ID NO: 2)
Cadena B
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correspondiendo
A0
a Arg;
A5
a Asp, Gln o Glu;
A15
a Asp, Glu o Gln;
A18
a Asp, Glu o Asn;
B-1
a Asp, Glu o un grupo amino;
B0
a Asp, Glu o un enlace qmmico;
B1
a Asp, Glu o Phe;
B2
a Asp, Glu o Val;
B3
a Asp, Glu o Asn;
B4
a Asp, Glu o Gln;
B29
a Lys;
B30
a Thr;
B31
a Arg o Lys;
B32
a Arg-NH2 o Lys-NH2
correspondiendo dos restos aminoacido del grupo que contiene A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 y B4, simultanea a independientemente entre sf, a Asp o Glu.
En especial son objetos de la invencion analogos de insulina como se indican anteriormente, en los que, independientemente entre sf, A5 corresponde a Glu, o correspondiendo A15 a Glu, o correspondiendo A18 a Asp, o correspondiendo B-1 a un grupo amino, o correspondiendo B0 a Glu, o correspondiendo B1 a Asp, o correspondiendo B2 a Val, o correspondiendo B3 a Asp, o correspondiendo B4 a Glu.
Es objeto de la invencion especialmente preferente un analogo de insulina seleccionado a partir del grupo que contiene:
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Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu(A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His(A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His(A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His(A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana, Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
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Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg(B32) - NH2 insulina humana,
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Arg (B31) - NH2 insulina humana,
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Lys (B31) - NH2 insulina humana.
Mediante la indicacion del concepto “insulina humana" en las denominaciones de los citados analogos de insulina se hace referencia a las secuencias de aminoacidos de la cadena A y B de insulina humana, y todas las divergencias (adiciones, substituciones, deleciones) de las mismas se indican en una denominacion dada de un analogo de insulina.
Otro objeto de la invencion es un procedimiento para la obtencion de un analogo de insulina, como se cita anteriormente, obteniendose por via recombinante un precursor del analogo de insulina, procesandose el precursor enzimaticamente para dar insulina de dos cadenas, y llevandose a cabo un acoplamiento con argininamida en presencia de un enzima con actividad de tripsina, y aislandose el analogo de insulina.
Otro objeto de la invencion es un empleo de un analogo de insulina, como se describe anteriormente, para la obtencion de un medicamento para el tratamiento de diabetes, en especial de diabetes tipo I o tipo II. Es igualmente objeto de la invencion un empleo de un analogo de insulina, como se describe anteriormente, para la obtencion de un medicamento para el apoyo de la regeneracion de celulas beta.
Otro objeto de la invencion es un medicamento que contiene un analogo de insulina como se describe anteriormente, y/o sales del mismo compatibles fisiologicamente.
Otro objeto de la invencion es una formulacion del analogo de insulina como se describe anteriormente, presentandose la formulacion en forma acuosa, que contiene el analogo de insulina disuelto.
Otro objeto de la invencion es una formulacion del analogo de insulina como se describe anteriormente, presentandose la formulacion en forma de polvo.
Otro objeto de la invencion es una formulacion como se describe anteriormente, estando presente el analogo de insulina como se describe anteriormente en forma cristalina y/o amorfa.
Otro objeto de la invencion es una formulacion del analogo de insulina como se describe anteriormente, presentandose la formulacion en forma de una suspension. Otro objeto de la invencion es una formulacion del analogo de insulina como se describe anteriormente, conteniendo la formulacion adicionalmente una chaperona qrnmica.
Otro objeto de la invencion es un ADN codificante para la cadena A o la cadena B de un analogo de insulina como se describe anteriormente.
Otro objeto de la invencion es un vector que contiene un ADN como se describe anteriormente.
Otro objeto de la invencion es un organismo huesped que contiene un ADN como se describe anteriormente, o un vector como se describe anteriormente.
Otro objeto de la invencion es una formulacion como se describe anteriormente, en la que esta contenido
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adicionalmente un peptido 1 de tipo glucagon (GLP1), o un analogo o derivado del mismo, o exendina-3, o bien -4, o un analogo o derivado del mismo, preferentemente exendina-4.
Otro objeto de la invencion es una formulacion como se describe anteriormente, en la que se selecciona un analogo de exendina-4 a partir de un grupo que contiene
H-desPro36-exendina-4-Lys6-NH2,
H-des(Pro36,37)-exendina-4-Lys4-NH2 y
H-des(Pro36,37)-exendina-4-Lys5-NH2,
o una sal de la misma tolerable desde el punto de vista farmacologico.
Otro objeto de la invencion es una formulacion como se describe anteriormente, en la que se selecciona un analogo de exendina-4 a partir de un grupo que contiene
desPro36 [Asp28]exendina-4 (1-39),
desPro36 [lsoAsp28]exendina-4 (1-39),
desPro36 [Met(O)14, Asp28]exendina-4 (1-39),
desPro36 [Met(o)14, IsoAsp28]exendina-4 (1-39),
desPro36 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-2 (1-39),
desPro36 [Trp(o2)25, IsoAsp28]exendina-2 (1-39),
desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, Asp28]exendina-4 (1-39) y
desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, IsoAsp28]exendina-4 (1-39),
o una sal de la misma tolerable desde el punto de vista farmacologico.
Otro objeto de la invencion es una formulacion como se describe en el anterior parrafo, en la que se ha anadido el peptido -Lys6-NH2 en los extremos de C de los analogos de exendina-4.
Otro objeto de la invencion es una formulacion como se describe anteriormente, en la que se selecciona un analogo de exendina-4 a partir de un grupo que contiene
H-(Lys)6- des Pro36 [Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2 des Asp28Pro36, Pro37, Pro38 exendina-4(1-39) -NH2,
H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39) -NH2,
H-Asn-(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6- des Pro36 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2,
H- des Asp28 Pro36 Pro37 Pro38 [Trp(O2)25Jexendina-4(1-39) -NH2,
H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39) -NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6-des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6- des Pro36 [Met(O)14, Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2, des Met(O)14 Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 exendina-4(1-39) -NH2,
H-(Lys)6- des Pro36, Pro 37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]exendina-4(1-39) -NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] exendina-4(1-39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2,
H-Asn-(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14 Asp28] exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6- des Pro36 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2, des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25]exendina-4(1-39) -NH2,
H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39) -NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O), Asp28] exendina-4(1-39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28] exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
o una sal de la misma tolerable desde el punto de vista farmacologico.
Otro objeto de la invencion es una formulacion como se describe anteriormente, en la que esta contenida adicionalmente Arg34, Lys26 (NE(Y-glutamil(N°-hexadecanoil))) GLP-1 (7-37) [liraglutida], o una sal de la misma
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tolerable desde el punto de vista farmacologico.
En este caso, para el especialista es evidente que las insulinas segun la invencion pueden ser objeto de una formulacion farmaceutica, que actuan ventajosamente tras aplicacion. En este caso se parte de disoluciones acuosas. Correspondientemente, deben ser miscibles varios otros componentes. El peligro de contaminacion viral animal se minimiza al no contener el preparado ningun componente que proceda de fuentes animales. Ademas es ventajoso impedir una impurificacion microbiana mediante adicion de agentes conservantes. Mediante la adicion de agentes isotonicos se puede compensar un posible efecto negativo de la formulacion sobre la fisiologfa de las celulas de tejido en el punto de aplicacion. La adicion de protamina puede tener un efecto estabilizante, de modo que se puede llegar a un preparado de insulina sensiblemente exento de sales si se anade protamina a la formulacion. La adicion de un componente fenolico puede conducir a una estabilizacion de la estructura del analogo de insulina empleado y ocasionar, entre otras cosas, el efecto de retardo en el inicio de la accion. A la formulacion se pueden anadir tambien substancias que estabilizan la estructura espacial de la insulina retardada segun la invencion, y conducen a una mayor estabilidad termica. Tales chaperonas qmmicas pueden comprender, por ejemplo, peptidos sinteticos cortos, que pueden contener tambien analogos de aminoacidos o, por ejemplo, secuencias peptfdicas derivadas del peptido C de insulina.
Para el desarrollo de formas de deposito se pueden integrar las insulinas segun la invencion en nanopartfculas. Tambien son concebibles las denominadas formulaciones de “liberacion lenta“, en las que la insulina retardada segun la invencion se presenta unida a soportes polfmeros de manera reversible.
Las insulinas segun la invencion se pueden administrar paralelamente a insulinas de accion rapida, como Apidra®, NovoRapid®, Humalog®, o derivados de insulina o formulaciones con perfil tiempo/accion correspondiente, que se encuentran en desarrollo, o insulina inhalable, o insulinas aplicadas por via nasal u oral, que se encuentran en desarrollo. En este caso, para el especialista es evidente que, a tal efecto, tambien se pueden emplear mezclas formuladas correspondientemente a partir de insulina retardada de accion rapida y segun la invencion. Ademas se pueden emplear en preparados farmaceuticos los analogos de insulina segun la invencion que contienen peptidos, que se describen mediante una actividad comparable a la de GLP-1 (peptido-1 tipo glucagon), o la exendina-4, o bien exendina 3. Constituyen ejemplos de tales peptidos GLP-1 (7-37), Exenatide (Byetta®) o peptidos cuya obtencion se describe en las solicitudes de patente WO 2006/058620, WO 2001/04156, WO 2004/005342 y WO 98/08871. En este caso son especialmente ventajosas formulaciones que contienen una formulacion de deposito de estos peptidos. En la fase inicial de la enfermedad diabetes tipo II, son ventajosas especialmente formas de terapia que preven paralelamente la administracion de productos farmaceuticos segun la invencion, que aumentan la accion de insulina, como por ejemplo metformina. Son igualmente posibles terapias combinadas con inhibidores de dipeptidil peptidasa-4, que aumentan el nivel de incretinas, como combinaciones con sulfonilureas, que aumentan la distribucion de insulina en el pancreas. Las insulinas retardadas segun la invencion se pueden emplear de modo especialmente ventajoso si, mediante aplicacion de factores de diferenciacion, se induce la regeneracion de celulas beta pancreaticas a partir de correspondientes celulas madre. Todas estas aplicaciones se citan a modo de ejemplo de la terapia de diabetes, y son igualmente objeto de la invencion. Por consiguiente, otro objeto de la invencion es el empleo de las insulinas segun la invencion en combinacion con otros productos activos para el tratamiento de diabetes, en especial diabetes tipo I o tipo II.
Otro objeto de la invencion es un medicamento que contiene un analogo de insulina segun la invencion, que constituye en especial una formulacion acuosa o un polvo.
El medicamento es un preparado farmaceutico que es preferentemente una disolucion o suspension con fines de inyeccion; esta caracterizado por un contenido en al menos un analogo de insulina segun la invencion, y/o al menos una de sus sales compatibles desde el punto de vista fisiologico en forma disuelta, amorfa y/o cristalina - preferentemente disuelta.
El preparado presenta preferentemente un valor de pH entre 2,5 y 8,5, en especial entre aproximadamente 4,0 y 8,5, contiene preferentemente un agente de isotonizacion apropiado, un agente conservante apropiado, y en caso dado un tampon apropiado, asf como preferentemente tambien una determinada concentracion de iones cinc, en disolucion esteril acuosa. El soporte de la preparacion forma la totalidad de componentes del preparado, aparte del producto activo. Agentes de isotonizacion apropiados son, por ejemplo, glicerina, glucosa, manita, NaCl, compuestos de calcio o magnesio, como CaCl2, etc. Mediante la seleccion del agente de isotonizacion y/o del agente conservante se influye sobre la solubilidad de las insulinas segun la invencion, o bien de sus sales compatibles desde el punto de vista fisiologico, a valores de pH ligeramente acidos. Agentes conservantes apropiados son, por ejemplo, fenol, m-cresol, alcohol bendlico y/o p-hidroxibenzoato.
Como substancias tampon, en especial para el ajuste de un valor de pH entre aproximadamente 4,0 y 8,5 se pueden emplear, por ejemplo, acetato sodico, citrato sodico, fosfato sodico, etc. En otro caso, para el ajuste del valor de pH tambien son apropiados acidos diluidos inofensivos desde el punto de vista fisiologico (tfpicamente HCl), o bien hidroxidos (tfpicamente NaOH).
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Si el preparado posee un contenido en cinc, es preferente un contenido de 1 a 2 mg/mol, en especial de 1 pg/ml a 200 pg de cinc/ml. A traves de la adicion de Zn se puede influir de modo sorprendentemente conveniente sobre el perfil de accion de los analogos de insulina segun la invencion. Esto permite preparados, que se diferencian respecto a tiempo de accion total, la velocidad del inicio de accion y el perfil de la curva de accion, y de este modo un ajuste individual del paciente. Otra posibilita resulta del empleo de un “dispositivo de insulina de camara doble“, que permite la aplicacion de una formulacion con inicio de accion rapido y/o inicio de accion lento plano, segun situacion de vida.
Con el fin de la variacion del perfil de productos activos del preparado segun la invencion, tambien se puede anadir insulina no modificada, preferentemente insulina bovina, porcina o humana, en especial insulina humana, o analogos de insulina y derivados de los mismos. Del mismo modo, se pueden anadir uno o varios derivados de exendina-4 o peptidos, que estan caracterizados por una actividad comparable a la de GLP-1 (peptido-1 tipo glucagon), o que corresponden directamente a GLP-1. Tales medicamentos (preparados) son igualmente objeto de la invencion.
Las concentraciones de productos activos preferentes son aquellas que corresponden aproximadamente a 1 - 1500, mas preferentemente aproximadamente 5 - 1000, y en especial aproximadamente 40 - 400 unidades internacionales/ml.
Los analogos de insulina segun la invencion se obtienen en primer lugar como precursor, que no comprende aun la amida, por via biotecnologica. Para el especialista es comun que exista una pluralidad de posibilidades para la obtencion de insulinas. Como sistemas de celula huesped se emplean en este caso bacterias, levaduras y plantas, o bien celulas vegetales a cultivar por fermentacion. Si la consideracion de costes lo permite, tambien son concebibles sistemas de expresion que utilizan celulas animales como sistema huesped. No obstante, es condicion una libertad segura de virus animales. Por consiguiente, es evidente que los sistemas de expresion descritos a modo de ejemplo representan solo una pequena seccion de sistemas huesped/vector desarrollados para la obtencion recombinante de protemas. En la solicitud no se describen, por ejemplo, procedimientos biotecnologicos que tienen como base sistemas de levaduras o vegetales, como musgo, algas o plantas superiores, como tabaco, guisante, cardo, cebada, mafz o colza. Sin embargo, son igualmente objeto de la invencion sistemas huesped/vector, asf como secuencias de ADN codificantes que permiten la obtencion de peptidos objetivo en correspondientes sistemas de expresion biotecnologicos. Por lo tanto, los organismos huesped se pueden seleccionar especialmente a partir del reino vegetal de organismos de la primera seccion Schizophyta que contiene Schizomycetes, bacterias o algas verde- azuladas, organismos de la 2a seccion Phycophyta clase V Chlorophyceae, organismos de la 2a seccion Phycophyta clase VII Rhodophyceae, organismos de la 3a seccion Mycophyta, organismos de la 5a seccion Bryophyta y organismos de la 7a seccion Spermatophyta.
En la solicitud de patente europea EP-A 1 222 207 se describe un plasmido pINT358d, que codifica para una preproinsulina, que comprende un peptido C modificado. Con ayuda de la reaccion en cadena de polimerasa (PCR), ahora es posible modificar selectivamente la secuencia que codifica la proinsulina, de modo que se puedan exprimir preproinsulinas que pueden servir como precursores de las insulinas segun la invencion. Las protemas de fusion correspondientes no se deben obtener necesariamente por via intracelular. Para el especialista es obvio que tales protemas se pueden obtener tambien mediante expresion bacteriana con subsiguiente secrecion en el periplasma y/o en el exceso de cultivo. La solicitud de patente europea EP-A 1 364 029 describe esto a modo de ejemplo. Los precursores de insulina, que conducen a los analogos segun la invencion, son igualmente objeto de la invencion.
Las proinsulinas obtenidas de este modo se pueden transformar en principio en un precursor analogo de insulina, que comprende lisina o arginina en posicion A0, y porta lisina o arginina en el extremo C-terminal de la cadena B.
Si las proinsulinas segun la invencion se presentan como cuerpos de inclusion o en forma soluble tras expresion intracelular, estos precursores se deben plegar mediante plegamiento in vitro en la conformacion correcta, antes de poderse efectuar el procesado y la modificacion bioqmmica. En este caso, la protema de fusion descrita permite un plegamiento directo tras desnaturalizacion por medio de urea o hidrocloruro de guanidinio, en este caso son igualmente objeto de la invencion los intermedios de plegamiento.
Para el enriquecimiento de las etapas intermedias aisladas se emplean metodos bioqmmicos, en especial procedimientos de separacion, cuyos principios basicos estan publicados, y son incluso objeto de libros de texto. Para el especialista es claro que tales principios se pueden combinar en consecuencia, y de este modo pueden conducir a procedimientos que no se publicaron previamente en su secuencia. Por consiguiente, son igualmente objeto de la invencion procedimientos que conducen a la purificacion de los analogos segun la invencion.
Otro objeto de la invencion es un procedimiento para la obtencion de los analogos de insulina segun la invencion, obteniendose por via recombinante un precursor del analogo de insutlina, y transformandose el mismo por via enzimatica en un precursor de insulina de 2 cadenas, que porta arginina, o bien lisina en posicion N-terminal respecto al aminoacido 1 de la cadena A, y presenta un resto lisina o arginina en el extremo C-terminal de la cadena B, que se transforma en la amida con argininamida o lisinamida en presencia de un enzima con actividad de tripsina, y por consiguiente en la insulina retardada segun la invencion, y se sintetiza en pureza elevada a traves de un
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procedimiento de purificacion bioqmmico.
Las protemas que se diferencian debido a substitucion de al menos un resto aminoacido presente naturalmente con otros restos aminoacidos y/o adicion y/o eliminacion de al menos un resto aminoacido de la correspondiente protema, en otro caso igual, presente naturalmente, se denominan “analogos" de protemas. En el caso de los restos aminoacido anadidos y/o substituidos se puede tratar tambien de aquellos que no se presentan naturalmente.
Las protemas que se obtienen mediante modificacion qmmica de determinados restos aminoacido de protemas de partida, se denominan “derivados“ de protemas. La modificacion qmmica puede consistir, por ejemplo, en la adicion de uno o varios grupos qmmicos determinados en uno o varios aminoacidos.
Leyendas de las figuras:
Fig. 1: accion reductora de azucar en la sangre de nuevos analogos de insulina en ratas
Fig. 2: accion reductora de azucar en la sangre de nuevos analogos de insulina en el perro
Fig. 3: accion reductora de azucar en la sangre de YKL205 en el perro
Fig. 4: dependencia de cinc de la accion hipoglucemica de YKL205 en el perro
Los siguientes ejemplos deben ilustrar los conceptos de la invencion, sin tener un efecto limitante en este caso.
Ejemplo 1: obtencion del derivado del vector pINT3580, que codifica para Gly (A21) - insulina y un peptido C modificado, que porta Arg Arg en el lfmite de cadena C/A.
La solicitud de patente europea EP-A 1 222 207 describe los plasmidos pINT358d, pINT91d y la secuencia de cebador Tir. Se emplea ADN de estos productos en la construccion del plasmido pINT3580. El plasmido pINT358d esta caracterizado en este caso por una secuencia genica que codifica para un peptido C modificado con propiedades especiales. Se sintetizan tres secuencias de cebador:
pint3580_glya21rev
5'- CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3' (SEQ ID NO: 3)
Este cebador, tras elaboracion a tal efecto, sirve para introducir glicina (negrita, subrayada) en lugar de asparagina en posicion 21 de la cadena A de la secuencia de proinsulina codificada por pINT358d.
arg_cjuncf
5'-GTCCCTGCAGCGTCGCGGCATCGTGGAGCAG-3' (SEQ ID NO: 4)
Este cebador, como el cebador arg_cjunc_rev, sirve para la introduccion de arginina en lugar de lisina en el lfmite de cadena A/B de insulina.
arg_cjunc_rev
5'- CCACGATGCC GCGACGCTGC AGGGACCCCT CCAGCG-3' (SEQ ID NO: 5)
El codon para la arginina a introducir esta en negrita en ambos cebadores. Con ADN del plasmido pINT358d como matriz se lleva a cabo con los pares de cebadores Tir / arg_cjunc_rev y arg_cjuncf / pint3580_glya21rev respectivamente una PCR correspondientemente a la solicitud de patente europea EP-A 1 222 207. Se combinan almuotas de los productos de ambas reacciones, y se emplean en una tercera pCr junto con el par de cebadores Tir / pint3580_glya21rev. El producto de esta reaccion se purifica tras separacion mediante electroforesis en gel de la mezcla de reaccion, y se digiere con los enzimas de restriccion Sal1 / Nco1, segun datos del fabricante, en una unica reaccion, la mezcla de reaccion se separa mediante electroforesis en gel y el fragmento de ADN que codifica la secuencia de proinsulina se afsla. El fragmento se inserta a continuacion en el vector de ADN pINT91d Nco1/Sal1 abierto a traves de una reaccion de ADN-ligasa.
Con la mezcla de ligandos se transforman celulas bacterianas de E. coli competentes. La mezcla de transformacion se cultiva en placas de seleccion que contienen 25 mg/l de ampicilina. El ADN plasirndico se afsla de las coloinas y
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se caracteriza por medio de analisis de ADN. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3580.
Ejemplo 2: construccion del plasmido pINT3581 codificante para His (A8), Gly (A21) - preproinsulina
La construccion se efectua como se describe en el ejemplo 1 a traves de 3 reacciones en cadena de polimerasa. El producto de la tercera reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplean los cebadores Tir y pint3580_glya21rev. Se sintetizan dos cebadores adicionales:
pint3580_Ha8f
5'-AGCAGTGCTGCCACAGCATCTGCTCCCTCTAC-3' (SEQ ID NO: 6) pint3580_Ha8rev
5'-GAG CAGATGCT GTG GCAGCACTG CTCCACGATG-3' (SEQ ID NO: 7)
El codon que codifica para histidina en posicion 8 de la cadena A se representa en negrita repectivamente. La construccion se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 1. El molde para PCR1 y 2 es ADN del plasmido pINT3580. PCR1 se lleva a cabo con el par de cebadores Tir/ pint3580_Ha8rev y PCR2 se lleva a cabo con el par de cebadores pint3580_Ha8f/ pint3580_glya21rev. En la PCR3 se emplea el par de cebadores Tir/ pint3580_glya21rev. En este caso, el molde es una mezcla de productos de reaccion de PCR1 y PCR2. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3581.
Ejemplo 3: construccion del plasmido pINT3582 codificante para His (A8), Glu (A5), Gly (A21) - preproinsulina
La construccion se efectua como se describe en el ejemplo 1 y 2 a traves de 3 reacciones en cadena de polimerasa. El producto de la tercera reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplean los cebadores Tir y pint3580_glya21rev. Se sintetizan dos cebadores adicionales:
pint3581_Ea5f
5'GCATCGTGGAGGAGTGCTGCCACAGCATCTG 3' (SEQ ID NO: 8) pint3581_Ea5rev 5'-CTGT GGCAGCACTC CTCCACGATG CCGCGACG-3' (SEQ ID NO: 9)
El codon, que codifica para acido glutamico en posicion 5 de la cadena A se representa en negrita respectivamente. La construccion se lleva a cabo como se describe en el ejemplol. El molde es ADN del plasmido pINT3581. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3582.
Ejemplo 4: construccion del plasmido pINT3583 codificante para His (A8), Asp (A18), Gly(A21) - preproinsulina
A diferencia del ejemplo 1, la construccion se efectua a traves de solo una reaccion en cadena de polimerasa. El producto de esta reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplea el cebador Tir. Se sintetiza un cebador adicional:
pint3580_Da18rev
5' CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTCCTCCAGCTGGTAGAGGGAG 3' (SEQ ID NO: 10)
El codon que codifica para acido aspartico en posicion 18 de la cadena A se representa en negrita. El molde es ADN del plasmido pINT3581. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3583.
Ejemplo 5: construccion del plasmido pINT3584 codificante para His (A8), Glu (A5) Asp (A18), Gly (A21) - preproinsulina
A diferencia del ejemplo 1, la construccion se efectua a traves de solo una reaccion en cadena de polimerasa. El producto de esta reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplea el cebador Tir. pint3580_Da18rev (Ej.4). El molde es ADN del plasmido pINT3582. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3584. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del
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compuesto YKL205-1, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Asp(A18), Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-NH2-insulina humana
La correspondiente amidacion con lisinamida conduce al compuesto YKL205-1b:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Asp (A18), Gly(A21), Arg (B31), Lys (B32)-NH2-insulina humana
Ejemplo 6: construccion del plasmido pINT3585 codificante para His (A8), Glu (A15), Gly (A21) - preproinsulina
A diferencia del ejemplo 1, la construccion se efectua a traves de solo una reaccion en cadena de polimerasa. El producto de esta reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplea el cebador Tir. Se sintetiza un cebador adicional:
pint3580_Ea15rev
5'- CAAAGGTCGA CTATTAGCCG CAGTAGTTCTCCAGCTCGTA GAGGGAGCAG ATGCTG -3' (SEQ ID NO: 11)
El codon que codifica para acido glutamico en posicion 15 de la cadena A se representa en negrita. El molde es ADN del plasmido pINT3581. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3585.
Ejemplo 7: construccion del plasmido pINT3586 codificante para His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21) - preproinsulina
A diferencia del ejemplo 1, la construccion se efectua a traves de solo una reaccion en cadena de polimerasa. El producto de esta reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplea el cebador Tir. Se sintetiza un cebador adicional:
pint3585_Ea15_Da18rev
5'- CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTCCTCCAGCTCGTAGAGGGAGCAG ATGCTG -3'(SEQ ID NO: 12)
El codon que codifica para acido glutamico en posicion 15 de la cadena Ay en acido aspartico en posicion A18 de la cadena A se representa en negrita respectivamente. El molde es ADN del plasmido pINT3581. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3586. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 8: construccion del plasmido pINT3587codificante para Glu (A5), His (A8), Glu (A15), Gly (A21) - preproinsulina
La construccion se efectua como se describe en el ejemplo 1 a traves de reacciones en cadena de polimerasa. El producto de la tercera reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplean los cebadores Tir y pint3580_Ea15rev segun el ejemplo 6.
El molde es ADN del plasmido pINT3582. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3587. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-2, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
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Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-2b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 9: construccion del plasmido pINT3588 codificante para His (A8), Gly (A21), Asp (B3)- preproinsulina
La construccion se efectua como se describe en el ejemplo 1 y 2 a traves de 3 reacciones en cadena de polimerasa. El producto de la tercera reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplean los cebadores Tir y pint3580_glya21rev. Se sintetizan dos cebadores adicionales:
pint3581_Db3f
5'- GCACGATTTGTGGACCAGCACCTGTGCGGC -3' (SEQ ID NO: 13) pint3581_Db3rev
5'- CACAGG TGCTGGTCCA CAAATCGTGC CGAATTTC -3' (SEQ ID NO: 14)
El codon que codifica para acido aspartico en posicion 3 de la cadena de insulina B se representa en negrita respectivamente. La construccion se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 1. El molde es ADN del plasmido pINT3581. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3588.
Ejemplo 10: construccion del plasmido pINT3589 codificante para Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B3)- preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 9, pero se emplea en PCR1 y PCR 2 ADN del plasmido pINT3582 como molde, se llega al plasmido pINT3589.
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-3, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-3b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 11: construccion del plasmido pINT3590 codificante para His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3) - preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 9, pero se emplea en PCR1 y PCR 2 ADN del plasmido pINT3585 como molde, se llega al plasmido pINT3590. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-4, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-4b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 12: construccion del plasmido pINT3591 codificante para His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3)- preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 9, pero se emplea en PCR1 y PCR 2 ADN del
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plasmido pINT3586 como molde, se llega al plasmido pINT3591. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-5, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-5b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 13: construccion del plasmido pINT3592 codificante para His (A8), Gly (A21), Asp (B3)- Glu (B4) - preproinsulina
La construccion se efectua como se describe en el ejemplo 1 y 2 a traves de 3 reacciones en cadena de polimerasa. El producto de la tercera reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplean los cebadores Tir y pint3580_glya21rev. Se sintetizan dos cebadores adicionales:
pint3581_Db3_Eb4f
5'- GCACGATTTGTGGACGAGCACCTGTGCGGCTC -3' (SEQ ID NO: 15) pint3581_Db3_Eb4rev
5'- CGCACAGG TGCTCGTCCA CAAATCGTGC CGAATTTC -3' (SEQ ID NO: 16)
El codon que codifica para acido aspartico en posicion 3 y acido glutamico en posicion 4 de la cadena de insulina B se representa en negrita respectivamente. La construccion se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 1. El molde es ADN del plasmido pINT3581. Los plasmidos correctos reciben la denominacion plNT3592. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-6, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-6b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 14: construccion del plasmido pINT3593 codificante para His (A8), Gly (A21), Glu (B4) - preproinsulina
La construccion se efectua como se describe en el ejemplo 1 y 2 a traves de 3 reacciones en cadena de polimerasa. El producto de la tercera reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1 /Sal1 abierto tras disociacion de Nco1 /Sal1. Se emplean los cebadores Tir y pint3580_glya21rev. Se sintetizan dos cebadores adicionales:
pint3581_Eb4f
5'- ACGATTTGTGAACGAGCACCTGTGCGGCTC -3' (SEQ ID NO: 17) pint3581_Eb4rev
5'- CGCACAGG TGCTCGTTCA CAAATCGTGC CGAATTTC -3' (SEQ ID NO: 18)
El codon que codifica para acido glutamico en posicion 4 de la cadena de insulina B se representa en negrita. La construccion se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 1. El molde es ADN del plasmido pINT3581. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3593.
Ejemplo 15: construccion del plasmido pINT3594 codificante para Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B4) - preproinsulina
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Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 9, pero se emplea en PCR1 y PCR 2 ADN del plasmido pINT3582 como molde, se llega al plasmido pINT3594.
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-7, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana.
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-7b, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 16: construccion del plasmido pINT3595 codificante para His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4) - preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 9, pero se emplea en PCR1 y PCR 2 ADN del plasmido pINT3585 como molde, se llega al plasmido pINT3595. La preproinsulina codificada por el plasmido es
precursor del compuesto YKL205-8, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente
estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-8b, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 17: construccion del plasmido pINT3596 codificante para His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4)- preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 9, pero se emplea en PCR1 y PCR 2 ADN del plasmido pINT3586 como molde, se llega al plasmido pINT3596. La preproinsulina codificada por el plasmido es
precursor del compuesto YKL205-9, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente
estructura:
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-9b, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 18: construccion del plasmido pINT3597 codificante para His (A8), Gly (A21), Glu (B0) -preproinsulina
La construccion se efectua a traves de 2 reacciones en cadena de polimerasa. Se emplea el cebador pint3580_glya21rev. Se sintetizan dos cebadores adicionales:
pint3581_Eb0f1
5'- CAACAGGAA ATTCGGCACG AGAGTTTGTG AACCAGCACC TGTG-3' (SEQ
ID NO: 19)
pint3581_Eb01f2
5'- TATCGA CCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCACG AGAG-3' (SEQ ID NO: 20)
En este caso, ambos cebadores se solapan parcialmente. Pint3581_Eb0f2 contiene una secuencia de identificacion de Ncol. Esta se representa subrayada. El codon que codifica para acido glutamico en posicion 0 al comienzo de la
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cadena B, se representa respectivamente en negrita. El molde para PCR1 es ADN del plasmido pINT3581.
PCR1 se lleva a cabo con el par de cebadores pint3581_Eb-1f2 / pint3580_glya21rev. El molde para PCR2 es el producto de PCR1. PCR2 se lleva a cabo con el par de cebadores pint3581_Eb-1f2 / pint3580_glya21rev. El producto de PCR2 cubre la secuencia de preproinsulina completa. El producto de la segunda reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1/Sal1 abierto tras disociacion de Nco1/Sal1. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3597. Si se substituye el codon para acido glutamico en posicion B0 por el codon de acido aspartico y se sigue el ejemplo, se llega a plasmidos que portan acido aspartico en lugar de acido glutamico en posicion B0.
Ejemplo 19: construccion del plasmido pINT3598 codificante para Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B0) - preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 18, pero se emplea en PCR1 ADN del plasmido pINT3582 como molde, se llega al plasmido pINT3598. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-10, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-10b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 20: construccion del plasmido pINT3599 codificante para His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0) - preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 18, pero se emplea en PCR1 ADN del plasmido pINT3585 como molde, se llega al plasmido pINT3599. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-11, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-11b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 21: construccion del plasmido pINT3600 codificante para His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0) - preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 18, pero se emplea en PCR1 ADN del plasmido pINT3586 como molde, se llega al plasmido pINT3600. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-12, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-12b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 22: construccion del plasmido pINT3601 codificante para His (A8), Gly (A21), Asp (B1) - preproinsulina
La construccion se efectua a traves de 2 reacciones en cadena de polimerasa. Se emplea el cebador pint3580_glya21rev. Se sintetizan dos cebadores adicionales:
pint3581_Db1f1
5'-CAACAGGAA ATTCGGCACG AGACGTG AACCAGCACC TGTGCG-3' (SEQ ID NO: 21)
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pint3581_Db1f2
5'-TATCGA CCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCACG AGAC-3' (SEQ ID NO: 22)
En este caso, ambos cebadores se solapan parcialmente. Pint3581_Db-1f2 contiene una secuencia de identificacion de NcoI. Esta se representa subrayada. El codon que codifica para acido glutamico en posicion 1 de la cadena B, se representa respectivamente en negrita. El molde para PCR1 es ADN del plasmido pINT3581. PCR1 se lleva a cabo con el par de cebadores pint3581_Db1f1 / pint358o_glya21rev. El molde para PCr2 es el producto de PCR1. PCR2 se lleva a cabo con el par de cebadores pint3581_Db1f2 / pint3580_glya21rev. El producto de PCR2 cubre la secuencia de preproinsulina completa. El producto de la segunda reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1/Sal1 abierto tras disociacion de Nco1/Sal1. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT360l.
Ejemplo 23: construccion del plasmido pINT3602 codificante para Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B1) - preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 22, pero se emplea en PCR1 ADN del plasmido pINT3582 como molde, se llega al plasmido pINT3602. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-13, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-13b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), Glu (A5), His (A8), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 24: construccion del plasmido pINT3603 codificante para His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1) - preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 22, pero se emplea en PCR1 ADN del plasmido pINT3585 como molde, se llega al plasmido pINT3603. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-14, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-14b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 25: construccion del plasmido pINT3604 codificante para His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1) - preproinsulina
Si las reacciones se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 22, pero se emplea en PCR1 ADN del plasmido pINT3586 como molde, se llega al plasmido pINT36034. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-15, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-15b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 26: construccion del plasmido pINT3605 codificante para His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1) - preproinsulina
La construccion se efectua a traves de 2 reacciones en cadena de polimerasa. Se emplea el cebador pint3580_glya21rev y el cebador pint3581_Eb01f2 descrito en el ejemplo 18. Se sintetiza el cebador pint3597_Db1f:
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5'-CAACAGGAA ATTCGGCACG AGAGGACGTG AACCAGCACC TGTGC-3' (SEQ ID NO: 23)
El codon que codifica para acido glutamico en posicion 0 y el que codifica para acido aspartico respectivamente al inicio de la cadena B se representan en negrita respectivamente. El molde para PCR1 es ADN del plasmido pINT3597. PCR1 se lleva a cabo con el par de cebadores pint3597_Db1f/ pint3580_glya21rev. El molde para PCR2 es el producto de PCR1. PCR2 se lleva a cabo con el par de cebadores pint3581_Eb1f2 / pint3580_glya21rev. El producto de PCR2 cubre la secuencia de preproinsulina completa. El producto de la segunda reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1/Sal1 abierto tras disociacion de Nco1/Sal1. Los plasmidos correctos reciben la denominacion pINT3605. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-16, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-16b, que se produce tras amidacion con lisinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2-insulina humana
Ejemplo 27: construccion del plasmido pINT3606 codificante para His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), desThr (B30) - preproinsulina
La construccion se efectua como se describe en el ejemplo 1 y 2 a traves de 3 reacciones en cadena de polimerasa. Se emplea el cebador Tir y pint3580_glya21rev. Zwei weitere Primer werden synthetisiert:
desB30f
5'-TTCTACACACCCAAGCGCGATGTTCCTCAGGTGG-3' (SEQ ID NO: 24) desB30rev
5'-AGG AACATCGCGC TTGGGTGTGT AGAAGAAGC-3' (SEQ ID NO: 25)
El molde para PCR1 y PCR2 es ADN del plasmido pINT3586. PCR1 se lleva a cabo con el par de cebadores desB30f / pint3580_glya21rev y PCR2 se lleva a cabo con el par de cebadores Tir / desB30rev. Como molde para PCR3 se emplea una mezcla equimolar de productos de PCR1 y PCR2. La reaccion se lleva a cabo con el par de cebadores Tir/ pint3580_glya21rev. El producto de PCR3 cubre la secuencia de preproinsulina completa. El producto de la tercera reaccion se inserta en el vector de ADN pINT91d Nco1/Sal1 abierto tras disociacion de Nco1/Sal1. La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-17, que se produce tras amidacion con argininamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B30), Arg (B31) - NH2-insulina humana
La preproinsulina codificada por el plasmido es precursor del compuesto YKL205-17b, que se produce tras amidacion con lisiinamida, y describe la siguiente estructura:
Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B30), Lys (B31) - NH2-insulina humana Ejemplo 28: expresion de los derivados de proinsulina
La expresion se lleva a cabo correspondientemente al ejemplo 1 de la solicitud de patente europea EP-A 1 222 207. Ejemplo 29: plegamiento de los derivados de proinsulina
El plegamiento se efectua en principio segun el metodo descrito en el documento EP-A 0 668 282.
Ejemplo 30: procesado enzimatico de la preproinsulina plegada para dar el precursor de insulina de 2 cadenas Arg(A0), cuyo extremo C de cadena B terminal esta caracterizado por medio de lisina o arginina.
El procesado enzimatico del precursor de preproinsulina plegado se efectua, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 4 del documento WO91/03550. En este caso se muestra especialmente ventajoso el empleo de las
variantes de tripsina descritas en el documento WO 2007/031187 A1
Ejemplo 31: obtencion de una Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32)-NH2- insulina humana
Independientemente del posicionamiento de los aminoacidos acidos adicionales se lleva a cabo una reaccion estandar como sigue: se disuelven 100 mg de analogo de insulina Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31) en 0,95 ml de 5 disolucion de argininamida (446 g/L), se anaden 0,13 mL de tampon acetato sodico M (pH 5.8) y 2 ml de DMF. La mezcla de reaccion se enfna a 12°C y se activa mediante adicion de 0,094 ml de tripsina (0,075 mg, Roche Diagnostics). Despues de 8 horas se detiene la reaccion mediante adicion de THF hasta pH 2,5, y se analiza por HPLC. Se forma >60 % de insulina humana Arg (A0), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2. Tras adicion de disolucion de inhibidor de tripsina se efectua la purificacion del analogo amidado en analogfa al documento US 10 5,656,722.
La obtencion del correspondiente compuesto de lisinamida se efectua analogamente. Sin embargo se parte de una disolucion madre acuosa de lisinamida, que contiene 366 g/L de lisinamida disuelta.
Ejemplo 32: formulacion de los derivados de insulina amidados
Para examinar los derivados de insulina segun la invencion sobre sus propiedades biologicas, farmacologicas y 15 ffsicas se obtuvo una disolucion de los compuestos como sigue: el derivado de insutlina segun la invencion se disolvio con una concentracion objetivo de 240 ± 5 pM en acido clortudrico 1 mM con 80 pg/mL de cinc (como cloruro de cinc).
Como medio de disolucion se emplearon las siguientes composiciones: a) acido clortudrico 1 mM
20 b) acido clortudrico 1 mM, 5 pg/mL de cinc (anadido como cloruro de cinc o acido clortudrico)
c) acido clortudrico 1 mM, 10 pg/mL de cinc (anadido como cloruro de cinc o acido clortudrico)
d) acido clortudrico 1 mM, 15 pg/mL de cinc (anadido como cloruro de cinc o acido clortudrico)
e) acido clortudrico 1 mM, 30 pg/mL de cinc (anadido como cloruro de cinc o acido clortudrico)
f) acido clortudrico 1 mM, 80 pg/mL de cinc (anadido como cloruro de cinc o acido clortudrico)
25 g) acido clortudrico 1 mM, 120 pg/mL de cinc (anadido como cloruro de cinc o acido clortudrico)
A tal efecto se peso del material liofilizado en primer lugar una cantidad aproximadamente un 30 % mayor que la requerida en base al peso molecular y a la concentracion deseada. Despues se determino la concentracion presente por medio de HPLC analftica, y a continuacion la disolucion se completo al volumen necesario para la consecucion de la concentracion objetivo con acido clortudrico 5 mM con 80 pg/mL de cinc. En caso necesario se reajusto el valor 30 de pH a 3,5 ± 0,1. Tras el analisis definitivo por medio de HPLC para asegurar la concentracion objetivo de 240 ± 5 pM, la disolucion acabada se traslado a una frasco esteril cerrado con un septum y una tapa rebordeada por medio de una jeringa con un elemento de filtracion de 0,2 pm. Para el analisis a corto plazo, unico, de los derivados de insulina segun la invencion no se efectuo una optimizacion de las formulaciones, por ejemplo respecto a una adicion de agentes isotonicos, agentes conservantes o substancias tampon.
35 Ejemplo 33: evaluacion de la accion reductora de azucar en sangre de nuevos analogos de insulina en la rata
La accion reductora de azucar en la sangre de nuevos analogos de insulina seleccionados se analiza en ratas Wistar macho, sanas, normoglucemicas. Se inyecta en los animales macho una dosis de 9 nmol/kg de un analogo de insulina por via subcutanea. Inmediatamente antes de la inyeccion del analogo de insulina y a intervalos regulares, hasta ocho horas tras la inyeccion, se extraen muestras de sangre de los animales, y se determina en las mismas el 40 contenido en azucar de la sangre. El experimento muestra claramente (vease la fig. 1), que el analogo de insulina empleado segun la invencion conduce a un inicio de accion claramente retardado, y a un tiempo de accion mas largo, uniforme.
Ejemplo 34: evaluacion de la accion reductora de azucar en sangre de nuevos analogos de insulina en el perro
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La accion reductora de azucar en la sangre de nuevos analogos de insulina seleccionados se analiza en perros Beagle macho, sanos, normoglucemicos. Se inyecta en los animales macho una dosis de 6 nmol/kg de un analogo de insulina por via subcutanea. Inmediatamente antes de la inyeccion del analogo de insulina y a intervalos regulares, hasta cuarenta y ocho horas tras la inyeccion, se extraen muestras de sangre de los animales, y se determina en las mismas el contenido en azucar de la sangre. El experimento muestra claramente (vease la fig. 2), que el analogo de insulina empleado segun la invencion conduce a un inicio de accion claramente retardado, y a un tiempo de accion mas largo, uniforme.
Ejemplo 35: evaluacion de la accion reductora de azucar en sangre en el perro en el caso de dosis duplicada
La accion reductora de azucar en la sangre de nuevos analogos de insulina seleccionados se analiza en perros Beagle macho, sanos, normoglucemicos. Se inyecta en los animales macho una dosis de 6 nmol/kg y 12 nmol/kg de un analogo de insulina por via subcutanea. Inmediatamente antes de la inyeccion del analogo de insulina y a intervalos regulares, hasta cuarenta y ocho horas tras la inyeccion, se extraen muestras de sangre de los animales, y se determina en las mismas el contenido en azucar de la sangre. El experimento muestra claramente (vease la fig. 3), que el analogo de insulina empleado segun la invencion actuan en dependencia de la dosis, pero a pesar de dosis duplicada el transcurso de reaccion presenta un desarrollo plano, es decir, no se observa ningun punto mmimo pronunciado (Nadir). De ello se puede deducir que las insulinas segun la invencion conducen claramente a menos episodios hipoglucemicos en comparacion con insulinas retardadas conocidas.
Ejemplo 36: evaluacion de la accion reductora de azucar en sangre en el perro en el caso de diversas concentraciones de cinc en la formulacion
Los experimentos se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 35. La figura 4 muestra el resultado. Despues se puede influir sobre la curva tiempo-accion del analogo de insulina segun la invencion mediante el contenido en iones cinc en la formulacion, con concentracion de insulina constante, de modo que con contenido en cinc nulo o reducido se observa un inicio de accion rapido, y la accion se mantiene durante 24 horas, mientras que con contenido en cinc mas elevado se observa un inicio de accion plano, y la accion de insulina se mantiene claramente mas de 24 horas.

Claims (32)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1.- Analogo de insulina de la formula I
    imagen1
    B-l B0B1B2B3B4HLCGSHLVEALYLVCGERGFFY 1 5 10 15 20 25
    T P B29 B30 B31 B32 (SEQ ID NO: 2)
    Cadena B
    30
    correspondiendo A0 a Arg;
    A5 a Asp, Gln o Glu;
    A15 a Asp, Glu o Gln;
    A18 a Asp, Glu o Asn;
    B-1 a Asp, Glu o un grupo amino;
    B0 a Asp, Glu o un enlace qmmico;
    B1 a Asp, Glu o Phe;
    B2 a Asp, Glu o Val;
    B3 a Asp, Glu o Asn;
    B4 a Asp, Glu o Gln;
    B29 a Lys;
    B30 a Thr;
    B31 a Arg o Lys;
    B32 a Arg-NH2 o Lys-NH
    correspondiendo dos restos aminoacido del grupo que contiene A5, A15, A18, B-1, B0, B1, B2, B3 y B4, simultanea a independientemente entre sf, a Asp o Glu.
  2. 2. - Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, correspondiendo A5 a Glu.
  3. 3. - Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, correspondiendo A15 a Glu.
  4. 4. - Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, correspondiendo A18 a Asp.
  5. 5.- Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, correspondiendo B-1 a un grupo
    5
    10
    15
    20
    25
    amino.
  6. 6. - Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, correspondiendo B0 a Glu.
  7. 7. - Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, correspondiendo B1 a Asp.
  8. 8. - Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, correspondiendo B2 a Val.
  9. 9. - Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, correspondiendo B3 a Asp.
  10. 10. -Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, correspondiendo B4 a Glu.
  11. 11. - Analogo de insulina segun una o varias de las reivindicaciones precedentes, seleccionado a partir de un grupo que contiene:
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Asp (A18), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu(A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Glu (A15), Gly (A21), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His(A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His(A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His(A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Asp (B3), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B4), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18),Gly (A21), Glu (B0), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A5), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg(B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Glu (A15), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Arg (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Gly (A21), Glu (B0), Asp (B1), Arg (B31), Lys (B32) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Arg (B31) - NH2 insulina humana,
    Arg (A0), His (A8), Asp (A18), Gly (A21), Asp (B3), Arg (B30), Lys (B31) - NH2 insulina humana.
  12. 12. - Procedimiento para la obtencion de un analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11, obteniendose un precursor del analogo de insulina, obteniendose un percursor del analogo de insulina de modo recombinante, procesandose el precursor por via enzimatica para dar insulina de dos cadenas, y llevandose a cabo un acoplamiento con argininamida en presencia de un enzima con actividad de tripsina, y aislandose el analogo de insulina.
  13. 13. - Empleo de un analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11 para la obtencion de un medicamento para el tratamiento de Diabetes Mellitus.
  14. 14. - Empleo de un analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11 en un procedimiento para la obtencion de un medicamento para el tratamiento de Diabetes Mellitus tipo I o tipo II, o para el apoyo terapeutico de la regeneracion de celulas beta.
  15. 15. - Medicamento que contiene un analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11 y/o sales del mismo compatibles desde el punto de vista fisiologico.
  16. 16. - Formulacion del analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11, presentandose la formulacion en forma acuosa que contiene el analogo de insulina disuelto.
  17. 17. - Formulacion del analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11, presentandose la formulacion en forma de polvo.
  18. 18. - Formulacion segun la reivindicacion 17, estando presente el analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11 en forma cristalina y/o amorfa.
  19. 19. - Formulacion del analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11, presentandose la formulacion en forma de una suspension.
  20. 20. - Formulacion del analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11, conteniendo la formulacion
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    adicionalmente una chaperona qmmica.
  21. 21. - ADN codificante para una preproinsulina de un analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11.
  22. 22. - Vector que contiene un ADN segun la reivindicacion 21.
  23. 23. - Organismo huesped no humano que contiene un ADN segun la reivindicacion 21 o un vector segun la reivindicacion 22.
  24. 24. - Formulacion segun una o varias de las reivindicaciones 16 a 20, en el que aun esta contenido adicionalmente un peptido 1 de tipo glucagon (GLP1), o un analogo o derivado del mismo, o exendina-3, o bien -4, o un analogo o derivado del mismo.
  25. 25. - Formulacion segun la reivindicacion 24, en la que esta contenida adicionalmente exendina-4.
  26. 26. - Formulacion segun la reivindicacion 24, en la que se selecciona un analogo de exendina-4 a partir de un grupo que contiene
    H-desPro36-exendina-4-Lys6-NH2,
    H-des(Pro36,37)-exendina-4-Lys4-NH2 y
    H-des(Pro36,37)-exendina-4-Lys5-NH2,
    o una sal de la misma tolerable desde el punto de vista farmacologico.
  27. 27. - Formulacion segun la reivindicacion 24, en el que se selecciona un analogo de exendina-4 a partir de un grupo que contiene
    desPro36 [Asp28]exendina-4 (1-39),
    desPro36 [lsoAsp28]exendina-4 (1-39),
    desPro36 [Met(O)14, Asp28]exendina-4 (1-39),
    desPro36 [Met(o)14 IsoAsp28]exendina-4 (1-39),
    desPro36 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-2 (1-39),
    desPro36 [Trp(o2)25, IsoAsp28]exendina-2 (1-39),
    desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, Asp28]exendina-4 (1-39) y
    desPro36 [Met(O)14Trp(O2)25, IsoAsp28]exendina-4 (1-39),
    o una sal de la misma tolerable desde el punto de vista farmacologico.
  28. 28. - Formulacion segun la reivindicacion 27, en la que se ha anadido el peptido -Lys6-NH2 en los extremos de C de los analogos de exendina-4.
  29. 29. - Formulacion segun la reivindicacion 24, en la que se selecciona un analogo de exendina-4 a partir de un grupo que contiene
    H-(Lys)6- des Pro36 [Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2 des Asp28Pro36, Pro37, Pro38 exendina-4(1-39) -NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39) -NH2,
    H-Asn-(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36 [Trpi^)25, Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2,
    H- des Asp28 Pro36 Pro37 Pro38 [Trp(O2)25Jexendina-4(1-39) -NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39) -NH2,
    H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-(Lys)6-des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36 [Met(O)14, Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2, des Met(O)14 Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 exendina-4(1-39) -NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36, Pro 37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]exendina-4(1-39) -NH2,
    H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] exendina-4(1-39) -NH2, des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2,
    H-Asn-(Glu)5 des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14 Asp28] exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-Lys6-NH2, des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25]exendina-4(1-39) -NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39) -NH2,
    5 H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28] exendina-4(1-39) -NH2,
    des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Trp(O2)25, Asp28]exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    H-Asn-(Glu)5- des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O), Trp(O2)25, Asp28] exendina-4(1-39)-(Lys)6-NH2,
    o una sal de la misma tolerable desde el punto de vista farmacologico.
    10 30.- Formulacion segun la reivindicacion 24, en la que esta contenida adicionalmente Arg34, Lys26 (NE(Y-glutamil(Na-
    hexadecanoil))) GLP-1 (7-37) [liraglutida], o una sal de la misma tolerable desde el punto de vista farmacologico.
  30. 31. - Formulacion acuosa del analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11, que no contiene, o contiene menos de 15 pg/ml de cinc.
  31. 32. - Formulacion acuosa del analogo de insulina segun una de las reivindicaciones 1 a 11, que no contiene, o 15 contiene menos de 15 pg/ml a 2 mg/ml de cinc.
  32. 33. - Formulacion segun la reivindicacion 32, estando contenidos 200 pg/ml de cinc.
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