ES2599859T3 - Proceso enzimático para producir I-P-P a partir de caseína kappa - Google Patents

Abstract

Proceso para producir IPP (Ile-Pro-Pro) a partir de GMP (glicomacropéptido de caseína kappa) que consiste en incubar primero el GMP con una aminopeptidasa y a continuación con una proteasa específica de prolina.

Description

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DESCRIPCION

Proceso enzimatico para producir I-P-P a partir de casema kappa Ambito de la presente invencion

La presente invencion se refiere a la produccion enzimatica de IPP a partir de glicomacropeptido de casema kappa. Antecedentes de la presente invencion

La hipertension es una enfermedad bastante comun en las personas y tiene prevalencia como factor de riesgo de enfermedades cardiovasculares, fallo renal y apoplejfa. La disponibilidad de una larga serie de farmacos tales como bloqueadores de calcio, bloqueadores beta, diureticos, bloqueadores alfa, antagonistas alfa centrales, antagonistas de angiotensina II e inhibidores de ECA ilustra que los mecanismos fisiologicos subyacentes a la hipertension tienen multiples aspectos.

Uno de los mecanismos fisiologicos de la hipertension, en concreto el sistema renina- angiotensina, ha recibido mucha atencion cientffica. En este mecanismo la angiotensina es secretada por el hugado y partida por la peptidasa renina para dar el decapeptido angiotensina I biologicamente inactivo. Cuando la angiotensina I pasa a traves de los capilares pulmonares, otra peptidasa llamada enzima convertidor de angiotensina (en lo sucesivo citado como ECA) actua sobre la angiotensina I eliminando los dos ultimos residuos de angiotensina (His-Leu) para dar el octapeptido angiotensina II. El octapeptido angiotensina II tiene una gran actividad vasoconstrictora y por lo tanto aumenta la presion sangumea. Como la inhibicion del ECA rebaja los niveles de angiotensina II, evita la vasoconstriccion y por consiguiente las presiones sangumeas elevadas.

Ademas de escindir la angiotensina I, el ECA tambien puede hidrolizar la bradiquinina - un nonapeptido que interviene asimismo en la regulacion de la presion sangumea. En este ultimo mecanismo la inhibicion del ECA da lugar a mayores niveles de bradiquinina, que pueden promover la vasodilatacion y tambien una presion sangumea mas baja. Asf pues, la inhibicion del ECA tiene efectos reductores de la presion sangumea mediante al menos dos mecanismos independientes.

Tambien es sabido que el octapeptido angiotensina II estimula la liberacion de aldosterona por el cortex adrenal. El organo diana de la aldosterona es el rinon, donde la aldosterona promueve un aumento de la reabsorcion del sodio de los tubulos renales. La inhibicion del ECA tambien disminuye la presion sangumea por este tercer mecanismo, pero este caso reduciendo la reabsorcion de sodio.

Gracias a sus multiples efectos fisiologicos la inhibicion de la actividad proteolftica del ECA es un modo efectivo de rebajar la presion sangumea. Esta observacion ha dado origen a una serie de productos farmaceuticos eficaces para reducir la presion sangumea, tales como el captopril y el enalapril (Ondetti, M.A. y otros, 1977, Science, Washington DC, 196, 441-444).

Como la hipertension es una enfermedad bastante comun, sena conveniente contrarrestar este resultado indeseable del estilo de vida moderno con ingredientes naturales ligeramente activos que, sobre todo, pudieran incorporarse a productos alimenticios o bebidas de consumo regular. Como alternativa estos ingredientes naturales ligeramente activos se podnan incorporar a suplementos dieteticos. En las ultimas decadas se ha averiguado que en la leche fermentada hay unos peptidos espedficos capaces de inhibir el ECA e inducir descensos de presion sangumea en sujetos hipertensos. Hoy en dfa numerosos ensayos in vitro y algunos experimentos con animales han demostrado los efectos inhibidores del ECA de distintos peptidos obtenidos de diversas fuentes proteicas. Aunque los ensayos in vitro de inhibicion del ECA han revelado muchas secuencias peptfdicas diferentes, debe hacerse hincapie en que los peptidos inhibidores del ECA tienen que circular por la sangre para poder ejercer un efecto in vivo. De ah se deduce que, para ser inhibidores eficaces del ECA, los peptidos deben resistir la degradacion por el sistema de digestion proteolftica gastrointestinal y permanecer intactos durante el subsiguiente transporte sobre la pared intestinal.

Un estudio de estructura-funcion de los diversos peptidos inhibidores del ECA ha sugerido que a menudo poseen una secuencia Pro-Pro, Ala-Pro o Ala-Hyp en su C terminal (Maruyama, S. y Suzuki, H., 1982; Agric Biol Chem., 46(5): 1393-1394). Este hallazgo se explica parcialmente por el hecho de que el ECA es una peptidil dipeptidasa (EC3.4.15.1) incapaz de partir enlaces peptfdicos que incluyen prolina. Asf, de los tripeptidos que tienen la estructura Xaa-Pro-Pro no se puede eliminar el dipeptido Pro-Pro, porque el enlace Xaa-Pro no puede escindirse. Por tanto es concebible que si estan presentes en concentraciones relativamente altas, los tripeptidos que tienen la estructura Xaa-Pro-Pro inhibiran la actividad del ECA. Como no solo el ECA, sino casi todos los enzimas proteolfticos tienen dificultades para partir los enlaces Xaa-Pro o Pro-Pro, la idea de que la presencia de (multiples) residuos de prolina en el extremo carboxiterminal de los peptidos produce moleculas relativamente resistentes a las proteasas es casi obvia. De modo similar, los peptidos que contienen hidroxiprolina (Hyp) en lugar de prolina son bastante resistentes a las proteasas. A partir de aim se puede inferir que los peptidos que llevan uno o mas residuos de (hidroxi)prolina en su extremo carboxiterminal tienen posibilidad de escapar a la degradacion proteolftica en el tracto gastrointestinal. Estas conclusiones nos ayudaran a entender el notable efecto reductor in vivo de la presion sangumea que tienen

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los peptidos espedficos de inhibicion del ECA: no solo cumplen los requisitos estructurales para inhibir el ECA, sino que tambien resisten la degradacion por el sistema de digestion proteolftica gastrointestinal y permanecen intactos durante el subsiguiente transporte sobre la pared intestinal.

Se ha referido que los tripeptidos Leu-Pro-Pro (JP 02036127), Val-Pro-Pro (EP 0 583 074) e IIe-Pro-Pro (J. Dairy Sci., 78: 777-783 1995) tienen una fuerte accion inhibidora del ECA. Al principio todos los peptidos inhibidores del ECA se caracterizaron basandose en su efecto in vitro sobre la actividad del ECA y los tripeptidos IIe-Pro-Pro (en lo sucesivo citado como IPP), Val-Pro-Pro (en lo sucesivo citado como VPP) y Leu-Pro-Pro (en lo sucesivo citado como LPP) destacaron por su fuerte efecto inhibidor del ECA, que daba bajos valores IC50. Posteriormente los supuestos efectos antihipertensivos de los tripeptidos VPP e IPP se pudieron confirmar en ratas espontaneamente hipertensas (Nakamura y otros, J. Dairy Sci., 78: 1253-1257 (1995)). En estos ensayos los tripeptidos inhibidores procedfan de leche bovina fermentada por bacterias de acido lactico. Durante la fermentacion de la leche los peptidos deseables son producidos por proteinasas generadas por las bacterias de acido lactico en crecimiento. Un inconveniente de este metodo de fermentacion es que las bacterias de acido lactico son organismos vivos para la cuales es diffcil de controlar el tipo y la cantidad de enzimas excretados. Por lo tanto la produccion de los peptidos inhibidores del ECA es diffcilmente reproducible y tambien es improbable que se produzca la serie optima de enzimas que asegure el maximo rendimiento de los peptidos requeridos. Ademas los tiempos de fermentacion necesarios son relativamente largos, lo cual, junto con los bajos rendimientos, supone una estructura de costes desfavorable para los peptidos bioactivos. Por otra parte un producto fermentado es menos adecuado para incorporarlo directamente a alimentos solidos, entre otros, y crea estrictas limitaciones organolepticas. En la patente US 6,428,812 se ha descrito la poca palatabilidad de tales productos lacteos fermentados y las numerosas dificultades de proceso encontradas para recuperar los peptidos inhibidores del ECA de estos caldos fermentados. A pesar de estas desventajas los productos lacteos fermentados han sido empleados en la practica como vasodepresores de administracion oral. Los peptidos inhibidores del ECA se han concentrado por electrodialisis, por dialisis con membranas de fibra hueca o por metodos cromatograficos a partir de los productos lacteos fermentados, con el fin de hacer posible su comercializacion como suplementos dieteticos concentrados en forma de tabletas o de pastillas masticables.

Los inconvenientes de la via de produccion fermentativa arriba citados han sido reconocidos en las solicitudes de patente WO 01/68115 y EP 1 231 279, entre otras. En la segunda se describe un proceso puramente enzimatico para recuperar los tripeptidos Val-Pro-Pro e IIe-Pro-Pro de la casema lactea. La solicitud de patente reivindica un metodo para producir estos tripeptidos por digestion de un material que contiene una casema lactea mediante una proteinasa y una peptidasa, a traves de un peptido intermedio. Cada una de estas incubaciones enzimaticas puede durar hasta 12 horas y tienen lugar en condiciones que favorecen el brote de contaminantes microbianos. El peptido intermedio se purifica preferiblemente antes de incubarlo con la peptidasa y solo pueden obtenerse concentraciones finales elevadas de peptidos inhibidores del ECA tras una etapa adicional de purificacion cromatografica del peptido intermedio.

La patente WO 2004/098309 A1 revela un producto de casema hidrolizada que comprende tripeptidos IPP y/o VPP.

Janhiainen, Valio Foods & Functionals, vol. 1, 2003, 1-22, revela que los peptidos bioactivos en Evolus disminuyen la presion sangumea de sujetos hipertensos.

Manso y otros, J. of Food Protection, vol. 66, 2003, 1686 - 1692, revelan la accion inhibidora del enzima convertidor de angiotensina I que tienen los macropeptidos de casema kappa bovina, ovina y caprina y sus hidrolizados tnpticos. Silva y otros, International Dairy Review, vol. 15, 2005, 1-15, proporcionan un resumen de secuencias peptidicas antihipertensivas en las casemas.

Resumen de la presente invencion

Muchos peptidos e hidrolizados diferentes han sido relacionados en la literatura cientffica con efectos reductores de la presion sangumea. Asimismo se conocen muchos mecanismos fisiologicos que intervienen en la regulacion de la presion sangumea. De acuerdo con la presente invencion, los peptidos y los mecanismos fisiologicos involucrados se minimizan eligiendo un substrato proteico adecuado que tras la hidrolisis produzca una fraccion peptfdica en la cual haya IPP como principal componente reductor de la presion sangumea. Hemos encontrado que para dicha fraccion peptfdica la casema kappa y con mayor preferencia el glicomacropeptido (GMP) de casema kappa es un punto de partida preferido. En la mezcla peptfdica reductora de la presion sangumea o en la fraccion asf generada el IPP, especialmente, juega un papel importante. Contrariamente a los procesos hidroltticos del estado tecnico previo, que producen mezclas de IPP, VPP y muchos otros peptidos potencialmente bioactivos, el proceso de la presente invencion esta dirigido a la produccion de IPP, evitando por ejemplo la de VPP. Segun la presente invencion el GMP es el substrato proteico. El GMP se puede obtener de la casema kappa tal como se describe abajo. La leche de vaca es el origen preferido de casema kappa. Tambien se puede usar leche de otros mairnferos, por ejemplo de cabras, si el GMP que forma parte de la molecula de casema kappa incluye una secuencia -IPP-. Como no todas las casemas kappa pueden ser escindidas por la quimosina bovina, la obtencion del GMP puede requerir el uso de un enzima de coagulacion mas apropiado.

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Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un proceso enzimatico que produzca selectivamente IPP a partir de GMP, incubando primero el GMP con una aminopeptidasa y a continuacion, preferiblemente en condiciones en que la aminopeptidasa ya no sea activa, con una proteasa espedfica de prolina.

La presente invencion tambien proporciona un proceso para elaborar un producto alimenticio, una bebida o un suplemento dietetico que comprenda la produccion de una composicion de la presente invencion o producida por el proceso de la presente invencion y la incorporacion de dicha composicion a un producto alimenticio, a una bebida o a un suplemento dietetico

Este producto alimenticio, bebida o suplemento dietetico se elige del grupo constituido por margarinas, pastas para untar, mantequilla, productos lacteos o bebidas que contienen suero de leche, preferiblemente yogur o productos lacteos tales como yogur o leche.

Descripcion detallada de la presente invencion

La presente invencion se refiere a un proceso en el cual el peptido IPP es generado con gran rendimiento a partir de la fraccion GMP de la casema kappa. Se emplea una endoproteasa espedfica de prolina en combinacion con una aminopeptidasa adecuada. Primero se incuba la fraccion que lleva el GMP con la aminopeptidasa, preferiblemente en condiciones casi neutras, por ejemplo de pH 5 a 8. Este metodo permite el uso de substratos que contengan una secuencia -X-I-P-P-, en la cual X puede representar cualquier residuo de aminoacido. La molecula de GMP partida por su extremo N-terminal se incuba con la proteasa espedfica de prolina, preferiblemente despues de inactivar la aminopeptidasa o en unas condiciones de pH en las cuales la aminopeptidasa no sea activa. La proteasa que corta por el extremo carboxiterminal de la prolina, como la endoproteasa espedfica de prolina, asf como la actividad de la aminopeptidasa estan preferiblemente libres de cualquier actividad contaminante de endoproteasa. La proteasa que corta por el extremo carboxiterminal de la prolina, como la endoproteasa espedfica de prolina, asf como la actividad de la aminopeptidasa estan preferiblemente libres de actividades contaminantes de carboxipeptidasa. La endoproteasa espedfica de prolina, libre de actividad contaminante de endoproteasa, es una preparacion enzimatica que tiene preferiblemente una relacion de Prol Spec act/Endo superior a 1, con mayor preferencia superior a 100.

La actividad de aminopeptidasa que esta exenta de actividad contaminante de endoproteasa es una preparacion enzimatica que tiene preferiblemente una relacion de AP/Endo de al menos 0,1, con mayor preferencia de al menos 0,5 y sobre todo de 1.

La endoproteasa espedfica de prolina que esta exenta de actividad contaminante de carboxil peptidasa es una preparacion enzimatica que tiene preferiblemente una relacion de Pro Spec act/CPD de al menos 1, con mayor preferencia de al menos 10.

La actividad de aminopeptidasa que esta exenta de actividad contaminante de carboxil peptidasa es una preparacion enzimatica que tiene preferiblemente una relacion de AP/CPD de al menos 0,1, con mayor preferencia de al menos 0,3. Las relaciones arriba citadas se determinan del modo descrito en el ejemplo 5.

Preferiblemente al menos el 20%, con mayor preferencia al menos el 40% o con aun mayor preferencia al menos el 60% y sobre todo al menos el 70% de las secuencias -I-P-P- presentes en la secuencia proteica se convierte en el peptido IPP. La proteasa espedfica de prolina es capaz preferiblemente de hidrolizar moleculas grandes de protema como el propio substrato proteico. El proceso segun la presente invencion tiene en general un tiempo de incubacion inferior a 24 horas, preferiblemente inferior a 10 horas y con mayor preferencia inferior a 4 horas. La temperatura de incubacion es en general superior a 30°C, preferiblemente superior a 40°C y con mayor preferencia superior a 50°C.

En el estado tecnico anterior los tripeptidos IPP, VPP y LPP han sido descritos como inhibidores efectivos del ECA. Como puede juzgarse por las secuencias de aminoacido conocidas, las protemas de suero de leche bovina no llevan las secuencias de aminoacidos correspondientes a cualquiera de estos tres tripeptidos inhibidores del ECA. Por lo tanto los peptidos IPP, VPP y LPP no se pueden aislar de las protemas de suero de leche. Sin embargo estos peptidos sf se encuentran en la fraccion casemica de la leche bovina. Por ejemplo, la casema beta comprende la secuencia -I-P-P- (74-76), la -V-P-P- (84-86) y tambien la -L-P-P- (151-153). Por otra parte la casema kappa tambien incluye una secuencia -I-P-P-, pero no las otras dos. La secuencia -I-P-P- presente en la casema kappa se halla en la posicion 109-110, esto es, en el extremo carboxiterminal a unos pocos aminoacidos del unico sito de corte Phe (105)-Met (106) de la casema kappa por quimosina. Asf, en la casema kappa, la secuencia IPP se encuentra en la parte GMP de esta molecula. Los presentes inventores han averiguado que la entidad IPP derivada de la casema kappa de la leche cuajada enzimaticamente se puede encontrar en el suero de queso y en la parte de casema que precipita al cuajar la leche con acido.

Aunque la casema kappa no es ponderalmente una fraccion importante de la casema, los presentes inventores han observado que desde un punto de vista molecular su presencia es muy importante. Por ejemplo, la casema beta esta presente en una concentracion de casi 400 milimoles por metro cubico de leche y la casema kappa en una concentracion de 180 milimoles por metro cubico de leche. El GMP tambien constituye una fraccion importante del

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suero de queso. Mientras la concentracion de protemas sericas combinadas es de 320 milimoles por metro cubico, el GMP esta presente en una concentracion de 400 milimoles por metro cubico de suero de queso.

Sorprendentemente el GMP es facil de obtener. El GMP se puede liberar selectivamente de casemas precipitadas con acido mediante un tratamiento enzimatico con quimosina en condiciones escogidas de pH. Aunque aislar GMP del suero de queso es mas diffcil, se conocen procesos industriales en los cuales se obtienen fracciones de suero de queso enriquecidas en GMP. Estas fracciones enriquecidas en GMP, comercialmente disponibles, obtenidas por medio de estos procesos conocidos suelen utilizarse para varias aplicaciones nutraceuticas.

En la presente solicitud describimos el empleo del GMP como material de partida para obtener el IPP reductor de la presion sangumea en un estado altamente purificado.

La fraccion proteica de la leche lleva normalmente una fraccion micelar de casema y una fraccion solubilizada de protema de suero de leche. Entre las protemas de suero de leche la beta-lactoglobulina y la alfa-lactoalbumina son cuantitativamente las mas importantes. Entre las protemas de casema predominan cuantitativamente las casemas alfa y beta, que son bastante hidrofobas. Las micelas de casema se mantienen en solucion mediante la casema kappa. Una parte hidrofila de la casema kappa, el llamado glicomacropeptido (GMP), sobresale de la superficie de la micela estabilizando las casemas hidrofobas en la solucion acuosa.

Segun un numero de procesos industriales bien establecidos la fraccion de casema se puede aislar de la leche, p.ej. para elaborar queso. En uno de estos procesos la leche se acidifica para precipitar selectivamente la fraccion de casema de la leche. El producto precipitado con acido incluye todas las casemas, es decir las casemas alfa, beta, kappa y gamma. La fraccion de la leche acidificada no precipitada se denomina “suero de leche”. En otro proceso la leche se incuba con un enzima coagulante de la leche, por ejemplo con quimosina de ternero (“cuajo”). La quimosina es una proteasa que corta muy selectivamente el enlace peptfdico Phe (105)-Met (106) de la casema kappa. En esta reaccion se escinde la parte de GMP hidrofila de la casema kappa y como resultado la fraccion micelar de casema se agrega y precipita inmediatamente. En este caso la fraccion de casema precipitada se denomina “cuajada”. Como la parte de GMP de la casema kappa esta escindida, en este proceso enzimatico el fragmento hidrofilo de GMP permanece en solucion junto con las diversas protemas sericas que constituyen el llamado “suero de queso” o “suero dulce”.

Hay varias publicaciones que reivindican los beneficios fisiologicos de consumir fracciones de leche enriquecida con GMP. Ademas existen numerosas publicaciones que describen vfas rentables para aislar las fracciones de suero de queso enriquecido con GMP. Por ejemplo, en la patente EP 1037537 se describe el empleo de la ultrafiltracion y en la patente Us 6787158 el uso de una resina anionica.

El hidrolizado de GMP se puede usar como agente reductor de la presion sangumea. Hemos encontrado que el nivel relativamente alto de IPP y de otros peptidos que tienen una prolina carboxiterminal en el GMP pueden relacionarse con un efecto reductor de la presion sangumea.

Se entiende por hidrolizado el producto resultante de la hidrolisis del substrato proteico (hidrolizado de protemas o protema hidrolizada), siendo el hidrolizado soluble la fraccion disuelta (en agua) del hidrolizado de protemas que aqrn tambien se describe como composicion peptfdica soluble o composicion que lleva peptidos solubles, o como una mezcla de un hidrolizado de protemas y un hidrolizado soluble.

Tal como se define aqrn, un “peptido” u “oligopeptido” es una cadena de al menos dos aminoacidos unidos mediante enlaces peptfdicos. Los terminos “peptido” y “oligopeptido” se consideran sinonimos (como se admite generalmente) y cada termino se puede usar indistintamente segun lo requiera el contexto. “Polipeptido” o “protema” se define aqrn como una cadena que comprende mas de 30 residuos de aminoacido. Todas las formulas o secuencias de (oligo)- peptidos y polipeptidos se escriben aqrn de izquierda a derecha, desde el extremo aminoterminal hasta el extremo carboxiterminal, de acuerdo con la practica corriente. El codigo de una letra empleado aqrn para los aminoacidos es comunmente conocido dentro de la especialidad y se puede encontrar en Sambrook y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Los peptidos opioides son peptidos que se puede unir a receptores opiaceos.

Los programas de la IUMB internacionalmente admitidos para la clasificacion y nomenclatura de todos los enzimas incluyen las proteasas. El texto actualizado de la IUMB para los numeros EC de las proteasas se puede ver en la pagina de internet:

http://www.chem.gmw/ac.uk/iubmb/enzima/EC3/4/11/. En este sistema los enzimas se definen por el hecho de catalizar una sola reaccion, lo cual tiene como consecuencia importante que varias protemas diferentes sean descritas como el mismo enzima y que una protema que cataliza mas de una reaccion sea tratada como mas de un enzima. El sistema clasifica las proteasas en endo- y exoproteasas. Las endoproteasas son aquellos enzimas que hidrolizan enlaces peptfdicos internos; las exoproteasas hidrolizan enlaces peptfdicos adyacentes a un grupo

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a-amino terminal (“aminopeptidasas”) o un enlace peptidico entre el grupo terminal carboxilo y el penultimo aminoacido (“carboxipeptidasas”). Las endoproteasas se dividen en subclases, basandose en el mecanismo catalftico. Hay subclases de serina endoproteasas (EC 3.4.21), cistema endoproteasas (EC 3.4.22), aspartico endoproteasas (EC 3.4.23), metaloendoproteasas (EC 3.4.24) y treonina endoproteasas (EC 3.4.25).

Las aminopeptidasas figuran en la clase 3.4.11. La subclasificacion esta basada en la eficiencia relativa con la que se escinden los 20 distintos aminoacidos. Se puede distinguir entre aminopeptidasas de especificidad reducida y amplia. Las aminopeptidasas pueden eliminar secuencialmente un solo aminoacido amino-terminal de substratos proteicos y peptfdicos. Las aminopeptidasas de especificidad reducida muestran una fuerte preferencia por el tipo de residuo de aminoacido en la posicion P1 que se libera del substrato peptfdico. Las aminopeptidasas de especificidad amplia son capaces de liberar una serie de aminoacidos diferentes en las posiciones N-terminal o P1 (de acuerdo con la nomenclatura de Schechter: Schechter, I. And Berger, A. 1967. Biochem Biophys Res Commun 27:157-162). Las carboxipeptidasas pueden eliminar secuencialmente aminoacidos individuales carboxiterminales de substratos proteicos y peptfdicos. De manera comparable a las endoproteasas, las carboxipeptidasas se dividen en subclases basandose en el mecanismo de catalisis. Las carboxipeptidasas de tipo serina estan en la clase EC 3.4.16, las metalocarboxipeptidasas en la clase EC 3.4.17 y las carboxipeptidasas de tipo cistema en la clase EC 3.4.18. En el caso de las proteasas, la lista de EC tiene el valor de proporcionar una terminologfa estandar para los varios tipos de actividad de proteasa y especialmente para asignar un numero de identificacion unico y un nombre recomendado a cada proteasa.

La parte de GMP de la molecula de casema kappa es un polipeptido cuya longitud es de 64 residuos de aminoacido. Si se recupera cuantitativamente todo el IPP, una preparacion de GMP puro puede dar una concentracion de IPP de casi un 5% (p/p), sin contaminaciones significativas de VPP o LPP. En la presente solicitud describimos varios procesos proteoltticos para aislar el tripeptido IPP del GMP, opcionalmente en una sola etapa de incubacion con elevados rendimientos. Por lo tanto, segun el proceso de la presente invencion, se puede obtener una composicion que contenga IPP, en la cual la concentracion de IPP sea suficientemente elevada para utilizarla directamente o tras una etapa sencilla de purificacion, es decir sin necesidad de un proceso de purificacion complejo y costoso como la separacion o purificacion cromatografica.

Segun el proceso proteolftico, la molecula de GMP aislada se incuba primero con una aminopeptidasa para eliminar los aminoacidos N-terminales (Met y Ala) del GMP que preceden a la secuencia de IPP en el gMp. Solo despues de esta incubacion se incorpora a la mezcla reactiva la proteasa espedfica de prolina para liberar el peptido IPP. Es preferible que la aminopeptidasa no siga activa durante o tras la incubacion con la proteasa espedfica de prolina. Hemos encontrado que este metodo proporciona mayores rendimientos de IPP, ademas no deja ningun regusto y apenas contribuye a la suma de aminoacidos libres presentes en el producto final. Asimismo el IpP esta presente en una proporcion elevada respecto a otros peptidos, especialmente respecto a los tripeptidos. El IPP preparado puede seguir separandose de los peptidos mas grandes. Como las aminopeptidasas pueden eliminar secuencialmente aminoacidos del extremo N-terminal de los peptidos, se requiere una actividad enzimatica aminopeptidolttica capaz de liberar eficientemente los residuos de metionina (“M”) y alanina (“A”) que preceden a la secuencia de IPP. Se encontro que los enlaces peptfdicos I-P y P-P presentes en los tripeptidos IPP resistfan la division enzimatica y que despues de incubar una molecula intacta de GMP dicha actividad aminopeptidolftica partfa el extremo N-terminal de la molecula de GMP para empezar con la secuencia IPP.

Una preparacion enzimatica comercial que tiene la deseada actividad de aminopeptidasa es la Corolasa LAP (AB Enzimas). La Corolasa LAP representa una actividad de leucina aminopeptidasa relativamente pura, clonada y sobreexpresada procedente de Aspergillus. Como esta preparacion no tiene actividades endoproteolfticas y caboxi- peptidoltticas inespedficas se evita la division indeseada de la molecula de substrato GMP. Otra aminopeptidasa clonada y sobreexpresada con una especificidad relativamente amplia es la aminopeptidasa de A. niger (SEQ ID 171 de la patente WO 02/068623).

Por ultimo hemos notado que el GMP tambien se usa ventajosamente en procesos donde se produce IPP por una via fermentativa. Tal como se ilustra en los ejemplos, la incubacion del GMP con lactobacilos espedficos produce IPP sin generar los regustos caractensticos de las fermentaciones de leche entera.

Todos los aspectos mencionados arriba son de especial importancia porque permiten obtener un producto altamente estandarizado sin caractensticas indeseables de bioactividad, sabor u olor. Un producto altamente estandarizado de este tipo se puede incorporar sin etapas subsiguientes de purificacion a diversas elaboraciones alimenticias o a productos dieteticos concentrados como tabletas o pastillas masticables. Se pueden obtener productos altamente estandarizados con concentraciones aun mayores de IPP, p.ej. para producir tabletas o pastillas masticables mas pequenas, eliminando selectivamente peptidos distintos del IPP. Esta eliminacion de los peptidos que no tienen una actividad reductora importante de la presion sangumea se puede llevar a cabo, p.ej., precipitando estos peptidos no activos y a continuacion realizando una etapa de (ultra)filtracion o decantacion. Pero segun otro procedimiento los ingredientes bioactivos se pueden concentrar aun mas mediante una purificacion posterior en la cual se aprovecha el caracter muy hidrofobo del peptido IPP. Estos metodos de purificacion comprenden la nanofiltracion, la extraccion con butanol, por ejemplo, seguida de evaporacion/precipitacion o la puesta en contacto del hidrolizado acidificado resultante con aglomerantes como carbon activo o resinas cromatograficas de la serie Amberlite XAD (Rohm) por

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ejemplo. Tambien se pueden emplear resinas de butil-sefarosa como las que suministra por ejemplo Pharmacia. Los peptidos reductores de la presion sangumea se pueden desorber de dichos materiales con disolventes organicos como mezclas de metanol/etanol o con propanol. Asimismo se puede usar la extraccion supercntica con CO2 o N2O para obtener peptidos bioactivos altamente purificados.

En la patente EP 1 231 279 se describe un proceso puramente enzimatico para recuperar los tripeptidos VPP e IPP de la casema lactea. La solicitud reivindica un metodo para producir tripeptidos digiriendo un material que contiene una casema lactea con una proteinasa y una peptidasa mediante un llamado “peptido intermedio” elegido del grupo formado por un peptido que lleva una secuencia -V-P-P- pero ninguna otra Pro aparte de las de esta secuencia, asf como un peptido que lleva una secuencia -I-P-P- pero ninguna otra Pro aparte de las de esta secuencia. Tal como se describe en los ejemplos de la patente EP 1 231 279, el metodo incluye un proceso de dos etapas. Primero se producen los peptidos intermedios que contienen VPP o IPP. Esto se realiza incubando casema con una proteinasa adecuada, segun uno de los ejemplos a 37°C durante un periodo de 12 horas. Luego la proteinasa usada se inactiva calentando este primer hidrolizado a 100°C durante 3 minutos y despues de enfriar se agrega otra preparacion enzimatica (de hecho una preparacion con actividad exoproteolttica). Tras otras 12 horas de incubacion a 37°C con esta otra preparacion enzimatica se puede demostrar la presencia de los tripeptidos VPP e IPP. Para lograr unos rendimientos superiores de estos peptidos inhibidores del ECA, la patente EP 1 231 279 tambien propone purificar y concentrar el peptido intermedio antes de exponerlo a la actividad exoproteolftica. La patente EP 1 231 279 sugiere asimismo que despues de obtener el peptido intermedio y antes de ponerlo en contacto con la peptidasa se pueden efectuar opcionalmente varias operaciones en el procedimiento, como por ejemplo la eliminacion de la protema no reaccionada, p.ej. por centrifugacion a 5000 hasta 20000 rpm durante 3 a 10 minutos. De este modo se obtiene la mezcla compleja de los tripeptidos deseados en un proceso enzimatico de dos etapas bastante diffcil de manejar industrialmente. Como cada una de las incubaciones enzimaticas puede durar hasta 12 horas a pH 4,5 a 7,0 y a una temperatura de 25 hasta 50°C, es evidente que este procedimiento tampoco es aceptable desde un punto de vista microbiologico. Estos largos tiempos de incubacion, en combinacion con una baja temperatura de incubacion, de 25 hasta 50°C, pueden producir facilmente infecciones en la solucion que contiene las protemas.

En comparacion con los metodos descritos en la patente EP 1 231 279 resulta evidente la elegancia de las etapas especificadas en el presente proceso. En primer lugar la presente solicitud de patente describe el empleo de solo un fragmento GMP de la casema kappa. Como resultado solo se libera IPP y no se generan muchos otros peptidos conocidos, potencialmente muy amargos, que lleva la casema. En segundo lugar la incubacion segun la presente invencion, en la cual el fragmento GMP de la casema se incuba primero con una aminopeptidasa pura y despues con la proteasa especifica de prolina, difiere esencialmente de la ruta descrita en la patente Ep 1 231 279 y ademas libera IPP con gran eficiencia y con mmimos niveles de peptidos contaminantes y aminoacidos libres. La incubacion preferida se inicia con una aminopeptidasa (una “peptidasa” de acuerdo con la patente EP 1 231 279) en vez de una proteinasa y no produce ningun “peptido intermedio”. En la etapa siguiente se usa una endoproteasa en vez de una proteinasa y tampoco se forma ningun “peptido intermedio”.

A pesar de todos los inconvenientes mencionados de los productos del estado tecnico anterior, los productos lacteos fermentados se han aplicado en la practica como vasodepresor de administracion oral. Los peptidos inhibidores del ECA tambien se han concentrado por electrodialisis, por dialisis con membranas de fibra hueca o por metodos cromatograficos a partir de productos lacteos fermentados, a fin de permitir su comercializacion como suplementos dieteticos concentrados en forma de tabletas o pastillas masticables. Tal como se usa aqrn, el termino nutraceutico denota utilidad, tanto en el sector de aplicacion nutricional como en el farmaceutico. Por lo tanto las composiciones nutraceuticas se pueden emplear como suplemento de alimentos y bebidas, y como formulaciones farmaceuticas o medicamentos de aplicacion enteral o parenteral, que pueden ser formulaciones solidas tales como capsulas o tabletas o formulaciones lfquidas tales como soluciones o suspensiones. Como se deduce de lo anterior, el termino composicion nutraceutica tambien incluye alimentos y bebidas que llevan la presente composicion de peptidos y opcionalmente carbohidratos, asf como composiciones suplementarias, por ejemplo suplementos dieteticos, que contienen los antedichos ingredientes activos.

Tal como se emplea aqrn, el termino suplemento dietetico denota un producto de ingestion oral que contiene un “ingrediente dietetico” pensado para suplementar la dieta. Los “ingredientes dieteticos” de estos productos pueden incluir: vitaminas, minerales, hierbas u otros vegetales, aminoacidos, y sustancias tales como enzimas, tejidos organicos, glandulares, y metabolitos. Los suplementos dieteticos tambien pueden ser extractos o concentrados, y pueden hallarse en muchas formas, como por ejemplo tabletas, capsulas, perlas, capsulas de gelatina, lfquidos o polvos. Tambien pueden encontrarse en otras formas, como por ejemplo una barra, pero en tal caso la informacion que aparece en la etiqueta del suplemento dietetico no presentara el producto como un alimento corriente o como un artmulo exclusivo de una comida o dieta.

Se puede incorporar un suplemento multivitammico y mineral a las composiciones nutraceuticas para obtener una cantidad adecuada de algun nutriente esencial ausente en algunas dietas. El suplemento multivitammico y mineral tambien puede servir para prevenir enfermedades y proteger contra perdidas y deficiencias nutricionales debidas a modelos de estilo de vida y patrones dieteticos usuales, inadecuados, que se han observado a veces en la diabetes. El estres oxidativo tambien se ha relacionado con el desarrollo de resistencia a la insulina. Las especies reactivas del oxfgeno pueden afectar a la absorcion de glucosa estimulada por la insulina, alterando la cascada senalizadora

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del receptor de insulina. El control del estres oxidativo con antioxidantes tales como el a-tocoferol (vitamina E) y el acido ascorbico (vitamina C) puede ser valioso en el tratamiento de la diabetes. Por consiguiente se puede anadir un suplemento multivitammico a las sustancias activas arriba mencionadas para mantener una nutricion equilibrada.

Ademas la composicion peptfdica se puede combinar con minerales como el magnesio (Mg2+), el calcio (Ca2+) y/o el potasio (K+) para mejorar la salud.

La composicion nutraceutica puede contener las composiciones peptidicas. El IPP esta presente en la composicion en una proporcion tal que aporte una dosis diaria aproximada de 0,001 g por kg de peso corporal hasta 1 g por kg de peso corporal del sujeto al cual debe administrarse. Un producto alimenticio o bebida contiene adecuadamente unos 0,05 g hasta 50 g de IPP por racion. Un producto alimenticio o bebida contiene adecuadamente unos 0,1 g hasta 100 g de hidrolizados proteicos por racion. Si la composicion nutraceutica es una formulacion farmaceutica, esta puede contener composiciones peptfdicas en una proporcion aproximada de 0,01 g hasta 5 g por dosis unitaria, es decir por capsula o tableta, o de aproximadamente 0,7 g hasta 210 g por dosis diaria de una formulacion ftquida.

Un producto alimenticio o bebida contiene adecuadamente unos 0,5 g hasta 200 g de carbohidratos por racion.

Intervalos de dosificacion (para una persona de 70 kg)

IPP: 0,005-70 g/dfa (ambos)

Hidrolizados proteicos: 0,07-210 g/dfa Protemas no hidrolizadas: 0,07-210 g/dfa Carbohidratos: 0,1-490 g/dfa

Los “agentes beneficiosos para la salud” son sustancias que proporcionan un provecho saludable, es decir, que tienen un efecto positivo en un aspecto de la salud o que ayudan a mantener un aspecto de buena salud cuando se ingieren; estos efectos saludables son la prevencion de la obesidad, el control del peso corporal y la conservacion de la salud cardiovascular. “Beneficio saludable” significa tener un efecto positivo en un aspecto de la salud o ayudar a mantener un aspecto de buena salud.

Los “productos alimenticios funcionales” se definen como productos alimenticios (incluyendo bebidas para evitar dudas) adecuados para el consumo humano en los cuales la composicion peptfdica se usa como ingrediente en una proporcion efectiva, a fin de obtener un beneficio saludable importante para el consumidor del producto alimenticio.

Tal como se emplea aqrn, el termino “comprende” no tiene el significado de limitarse a unos elementos enumerados sucesivamente, sino mas bien el de englobar elementos no especificados de mayor o menor importancia funcional. En otras palabras, la relacion de etapas, elementos u opciones no tiene por que ser exhaustiva. Dondequiera que se usen las palabras “incluye” o “tiene”, el significado de estos terminos es equivalente al de “comprende” tal como se ha definido arriba.

El peptido IPP, eficaz para rebajar la presion sangumea, tiene dos residuos de prolina en el extremo carboxiterminal del peptido. Como es sabido que los enlaces peptfdicos con residuos prolilo son resistentes a la escision proteolftica, la presencia de dos residuos de prolina en los peptidos reductores de la presion sangumea dara a dichos peptidos una mayor resistencia a la degradacion proteolftica. Este aspecto incrementa la probabilidad de que el tripeptido relevante escape a la hidrolisis total durante la incubacion con preparaciones enzimaticas complejas. Analogamente es probable que el IPP subsista a la digestion gastrointestinal y por lo tanto que estos peptidos tengan una mayor probabilidad de llegar intactos al torrente sangumeo. Para obtener peptidos que lleven en su extremo carboxiterminal al menos un residuo de prolina, pero preferiblemente varios, el uso de una proteasa capaz de cortar por el extremo carboxiterminal de los residuos de prolina ofrece una opcion interesante. Las denominadas prolil oligopeptidasas (EC 3.4.21.26) tienen la posibilidad unica de escindir preferentemente los peptidos por el extremo carboxflico de los residuos de prolina y con menor eficiencia por el extremo carboxflico de alanina. En todas las proteasas espedficas de prolina adecuadamente caracterizadas, aisladas de fuentes mairftferas asf como de fuentes microbianas, se ha identificado un solo dominio de peptidasa que excluye peptidos grandes del sitio activo del enzima. En efecto estos enzimas son incapaces de degradar polipeptidos que contengan mas de unos 30 residuos de aminoacido, y por tanto estos enzimas se designan ahora como “prolil oligopeptidasas” (Fulop y otros: Cell, vol. 94, 161-170, 24 de julio de 1998). Por consiguiente estas prolil oligopeptidasas requieren una prehidrolisis amplia con otras endoproteasas antes de que puedan ejercer su accion hidrolftica. No obstante, tal como se describe en la patente WO 02/45523, la combinacion de una prolil oligopeptidasa con una de dichas endoproteasas sigue produciendo unos hidrolizados caracterizados por una proporcion significativamente incrementada de peptidos con un residuo carboxiterminal de prolina. Por ello estos hidrolizados forman un excelente punto de partida para aislar peptidos con efecto inhibidor del ECA in vitro y mejor resistencia a la degradacion proteolftica gastrointestinal. A pesar de estos beneficios potenciales no tenemos conocimiento de ninguna solicitud que especifique el uso de proteasas espedficas de prolina para la recuperacion de los peptidos reductores de la presion sangumea y menos aun para la produccion selectiva de IPP.

La patente WO 02/45524 describe una proteasa espedfica de prolina que puede obtenerse de Aspergillus niger. El enzima derivado de A. niger corta preferentemente por el extremo carboxiterminal de prolina, pero tambien lo puede

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hacer por el extremo carboxiterminal de hidroxiprolina y, con menor eficiencia, por el extremo carbox^lico de alanina. La patente WO 02/45524 tambien revela que no existe ninguna homologfa clara entre este enzima derivado de A. niger y las prolil oligopeptidasas conocidas, procedentes de otras fuentes microbianas o mairnferas. Al contrario que las prolil oligopeptidasas conocidas, el enzima de A. niger tiene un valor optimo de pH acido. Aunque las prolil oligopeptidasas conocidas y el enzima derivado de A. niger se conocen como serina proteasas, en el ejemplo 1 demostramos que el enzima de A. niger pertenece a una subfamilia completamente diferente. El enzima de A. niger secretado parece ser un miembro de la familia S28 de serina peptidasas, mas que de la familia S9 en la cual se ha agrupado la mayona de prolil oligopeptidasas citosolicas (Rawlings,N.D. y Barrett, A.J.; Biochim. Biophys. Acta 1298 (1996) 1-3).

En el ejemplo 2 mostramos los valores optimos de pH y temperatura de la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger en comparacion con una oligopeptidasa espedfica de prolina obtenida del microorganismo Flavobacterium meningosepticum. Las soluciones acuosas que llevan protemas son muy susceptibles de infecciones microbianas, sobre todo si se mantienen durante muchas horas a valores de pH superiores a 5,0 y a temperaturas de 50 grados o inferiores, especialmente por toxinas microbianas que pueden generarse durante dichas etapas prolongadas de incubacion y que probablemente sobreviven a etapas sucesivas de calentamiento y constituyen una amenaza potencial para los procesos de calidad alimentaria. A diferencia de las condiciones descritas en la patente EP 1 231 279, el proceso segun la presente invencion utiliza preferiblemente una temperatura de incubacion por encima de 50°C. En combinacion con el proceso enzimatico de una etapa en que el enzima se incuba durante un periodo inferior a 24 horas, preferiblemente inferior a 8 horas, con mayor preferencia inferior a 4 horas, el proceso segun la presente invencion ofrece la ventaja de una mejor estabilidad microbiologica.

En el ejemplo 3 demostramos que la preparacion enzimatica derivada de A. niger, tal como se usa en el proceso de la presente invencion, muestra una especificidad muy estrecha para el substrato, lo cual significa la ausencia de cualquier otra actividad endoproteolttica importante que no vaya dirigida hacia los enlaces peptfdicos que incluyen residuos de prolina o alanina. En el ejemplo 4 de la presente solicitud demostramos que el enzima de Aspergillus no es una oligopeptidasa, sino una autentica endopeptidasa capaz de hidrolizar protemas intactas, grandes peptidos, asf como moleculas peptfdicas mas pequenas, sin necesidad de una endoproteasa auxiliar. Este hallazgo nuevo y sorprendente nos permite prescindir del uso de una endoproteasa auxiliar, de tal manera que se pueden generar hidrolizados con unos elevados contenidos, sin precedentes, de peptidos con un residuo carboxiterminal de prolina. Ademas es preferible prescindir de una endoproteasa auxiliar, a fin de generar un numero muy limitado de peptidos al hidrolizar polipeptidos u oligopeptidos. Como resultado se obtienen mezclas peptfdicas bastante simples que se caracterizan por el hecho de que la mayona de los peptidos presentes tienen un residuo carboxiterminal de prolina.

En el ejemplo 5 describimos las preparaciones enzimaticas utilizadas teniendo en cuenta si la actividad desplegada es endoproteolftica, aminopeptidolttica o carboxipeptidolftica. Asf como la endoproteasa espedfica de prolina tiene actividades secundarias inapreciables, las preparaciones de Sumizyme FP y Flavourzyme forman una fuente rica en muchos tipos diferentes de enzimas.

En el ejemplo 6 describimos una ruta alternativa para aislar el GMP, esto es, a partir de caseinato comercialmente disponible. Usando la endoproteasa espedfica de prolina tambien recuperamos IPP del GMP aislado de este modo. El hecho de que el enzima derivado de A. niger no tenga una actividad importante de aminopeptidasa (vease el ejemplo 5) sugiere fuertemente que el IPP formado se libera de la secuencia -A107-I108-P109-P110- presente en la casema kappa. Presuntamente el enlace peptfdico carboxiterminal del IPP es escindido por la actividad principal de la prolil endoproteasa derivada de A. niger, mientras que la escision del enlace AIa-IIe precedente es debida a su actividad secundaria espedfica de Ala. La ventaja de esta ruta es que, tras la separacion selectiva del GMP, la fraccion restante de caseinato se puede utilizar para otras aplicaciones.

En el ejemplo 7 demostramos que tanto la endoproteasa espedfica de prolina como la preparacion compleja de Sumizyme FP se pueden utilizar para liberar IPP del GMP obtenido comercialmente. Esta composicion comprende preferiblemente entre 0,1 y 100 mg/g de IPP (referido a materia seca y a protema), con mayor preferencia entre 1 y 50 mg/g de IPP (referido a materia seca y a protema) y sobre todo entre 2 y 35 mg/g de IPP (referido a materia seca y a protema). Asimismo hemos encontrado que la hidrolisis del GMP da lugar a una composicion que contiene el tripeptido IPP y el tetrapeptido TSTP en proporciones casi identicas, en caso de emplear endoproteasa espedfica de prolina. Por tanto aqrn tambien se revela una composicion que comprende IPP y TSTP, en la cual la relacion molar de IPP:TSTP esta comprendida entre 1,5 y 0,5, preferiblemente entre 1,3 y 0,7, y con mayor preferencia entre 1,2 y 0,8. Esta composicion contiene preferiblemente entre 0,1 y 100 mg/g de IPP (referido a materia seca y a protema), con mayor preferencia entre 1 y 50 mg/g de IPP (referido a materia seca y a protema) y sobre todo entre 2 y 35 mg/g de IPP (referido a materia seca y a protema).

En el ejemplo 8 demostramos las ventajas organolepticas del uso de un hidrolizado del GMP.

En el ejemplo 9 ilustramos que el uso del GMP tambien permite preparar productos que contienen IPP, empleando un metodo de fermentacion.

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Por consiguiente la presente invencion tiene varias ventajas respecto al estado tecnico anterior. Los mas importante es que el proceso segun la presente invencion produce una menor variedad de peptidos solubles en agua y que entre estos peptidos solubles en agua el IPP se encuentra en mayores proporciones. Esto tiene especial importancia en el caso de que se necesite una concentracion elevada de IPP para un producto de gusto insfpido. De acuerdo con el presente proceso, al menos un 20%, con mayor preferencia al menos un 30% y sobre todo al menos un 40% de una secuencia -A-I-P-P existente en una protema se convierte en IPP.

Despues de la hidrolisis la solucion se puede calentar. Opcionalmente se puede modificar el pH de la solucion o bien se puede mezclar la solucion con disolventes.

Segun un aspecto de la presente invencion, los peptidos solubles, incluyendo el IPP, que se forman durante la hidrolisis de la fuente proteica son separados y opcionalmente secados. Por ejemplo, despues de una decantacion, filtracion o centrifugacion a baja velocidad para eliminar el precipitado resultante, los sobrenadantes que contienen los peptidos solubles biologicamente activos se pueden recuperar, por ejemplo, por osmosis inversa o evaporacion, opcionalmente combinada con una etapa de filtracion adicional y seguida de una etapa de secado por pulverizacion, a fin de disponer de una ruta economica para obtener una pasta o un producto en polvo con una gran bioactividad y una buena solubilidad en agua. Al digerir un substrato proteico adecuado, tal como el GMP, con una endoproteasa espedfica de prolina se obtiene un polvo blanco e inodoro con una alta concentracion de IPP y un grado de hidrolisis sorprendentemente bajo.

En aplicaciones nutraceuticas y en aplicaciones de productos alimenticios y bebidas, los hidrolizados de la presente invencion tienen un uso ventajoso. Un hidrolizado proteico, un hidrolizado soluble, asf como una mezcla de ellos se puede usar para una aplicacion nutraceutica o de productos alimenticios o bebidas. El hidrolizado soluble se usa preferiblemente en un producto nutraceutico, en un producto alimenticio o en una bebida, por el alto contenido de peptidos activo que lleva.

Si se diluye apropiadamente a la concentracion correcta de tripeptidos, se obtiene un material de partida versatil con una excelente palatabilidad, que sirve para conferir propiedades reductoras de la presion atmosferica a toda clase de productos alimenticios y bebidas.

La mezcla peptfdica obtenida antes o despues de una etapa adicional de purificacion, cromatografica por ejemplo, se puede incorporar a productos alimenticios ampliamente consumidos de manera usual. Como ejemplos de tales productos cabe citar las margarinas, los pates, diversos productos lacteos como mantequilla o yogures o las bebidas que contienen leche o suero de leche, productos de repostena tales como pasteles y galletas, alimentos lfquidos tales como las sopas y tambien caramelos, edulcorantes y terrones de azucar. Gracias al gusto tan insfpido de los hidrolizados que llevan IPP es posible incorporarlos a todo tipo de bebidas, incluyendo agua de mesa embotellada, refrescos, bebidas deportivas, zumos de fruta, limonadas y tes instantaneos y cafes.

Una bebida deportiva es aquella que supuestamente rehidrata a los atletas y tambien restablece electrolitos, azucar y otros nutrientes. Las bebidas deportivas son usualmente isotonicas, lo cual significa que contienen las mismas proporciones de nutrientes que hay en el cuerpo humano. (Fuente:
http://en.wikipedia.org/wiki/Sports_drink).

Las bebidas energeticas son aquellas que contienen estimulantes (legales), vitaminas (especialmente vitaminas B) y minerales, con el proposito de aportar al consumidor un impulso de energfa. Los ingredientes comunes incluyen cafema, guarana (cafema de la planta de Guarana), taurina, varias formas de ginseng, maltodextrina, inositol, carnitina, creatina, glucuronolactona y ginkgo biloba. Algunas pueden contener altos niveles de azucar o glucosa. Muchas de estas bebidas estan aromatizadas y/o coloreadas. (Fuente:
http://en.wikipedia.org/wiki/Energy_drink).

Un refresco es una bebida que no contiene alcohol, en contraposicion a las bebidas alcoholicas. En general el termino se emplea solamente para las bebidas fnas. El chocolate caliente, el te y el cafe no se consideran refrescos. Originalmente el termino se refena solo a las bebidas carbonatadas y aun suele emplearse de este modo. (Fuente:
http://en.wikipedia.org/wiki/Soft_drink).

Aunque estas composiciones suelen administrarse a seres humanos tambien se pueden administrar a animales, preferiblemente mairnferos, para aliviar la hipertension. Ademas la elevada concentracion de peptido reductor de la presion sangumea en los productos asf obtenidos hace que sean muy utiles para su incorporacion a suplementos dieteticos en forma de pfldoras, tabletas, soluciones muy concentradas, pastas o polvos. Son de especial interes los suplementos dieteticos de liberacion lenta que aseguran una cesion continua de los peptidos. Los peptidos pueden formularse en forma de polvo seco, por ejemplo en pfldoras, tabletas, granulos, sobres o capsulas. Alternativamente la mezcla peptfdica se puede formular en forma lfquida, por ejemplo en jarabes o capsulas. Las composiciones que contienen los enzimas y se utilizan para las diversas formulaciones tambien pueden llevar al menos un compuesto del grupo formado por vehmulos, adyuvantes, excipientes, estabilizantes, tampones o diluyentes fisiologicamente aceptables, cuya terminologfa se usa en su sentido ordinario refiriendose a sustancias auxiliares para al envasado, suministro, absorcion, estabilizacion o, en caso de adyuvantes, para aumentar el efecto fisiologico. La informacion basica relevante de los diversos compuestos utilizables en combinacion con la mezcla peptfdica en polvo puede encontrarse en “Pharmaceutical Dosage Forms”, segunda edicion, volumenes 1, 2 y 3, ISBN 0-8247-8044-2 Marcel

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Dekker, Inc. o en bien Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edicion, Williams & Wilkins, PA, USA. Para la administracion oral se emplean preferiblemente tabletas y capsulas que contienen un aglutinante adecuado, p.ej. gelatina o polivinil pirrolidona, un relleno idoneo, p.ej. lactosa o almidon, un lubricante apropiado, p.ej. estearato magnesico, y opcionalmente otros aditivos.

Un tipo de aplicacion oral relativamente nuevo es el uso de varios tipos de capsulas de gelatina o de tabletas a base de gelatina.

Se prepara un hidrolizado exento de fenilalanina, triptofano y tirosina. Utilizando el GMP como protema de partida se obtiene un hidrolizado que carece de fenilalanina, triptofano y tirosina, lo cual lo hace seguro para personas con fenilcetonuria (FCU).

Vista la importancia de los peptidos naturales para combatir la hipertension, la presente ruta, nueva y rentable, constituye un punto de partida atractivo para obtener productos alimenticios moderadamente hipotensivos o incluso productos veterinarios. Como la presente ruta incluye una etapa de purificacion sorprendentemente simple, tambien se amplfan las posibilidades de disponer de suplementos dieteticos concentrados para rebajar la presion sangumea.

El proceso segun la presente invencion se puede realizar utilizando cualquier oligo- o endoproteasa espedfica de prolina. Por oligopeptidasas espedficas de prolina conforme a la presente invencion se entienden los enzimas que pertenecen a la clase EC 3.4.21.26. La endoproteasa espedfica de prolina usada segun la presente invencion se refiere a una endoproteasa espedfica de prolina que pertenecen a la familia S28 de las serina proteasas ((Handbook of Proteolytic Enzymes; Barrett A. J.; Rawlings N.D.; Woessner J.F., Eds.; Academic Press, London, UK, 1998, 369415) o, con mayor preferencia, al polipeptido citado en las reivindicaciones 1-5, 11 y 13 de la patente WO 02/45524. Por consiguiente esta endoproteasa espedfica de prolina es un polipeptido que posee una actividad endoproteolttica espedfica de prolina y esta seleccionado del grupo formado por:

(a) un polipeptido cuya secuencia de aminoacidos tiene al menos un 40% de identidad con los aminoacidos 1 a 526 de la SeQ ID NO:2 o con un fragmento de ella;

(b) un polipeptido codificado por un polinucleotido que bajo condiciones poco estrictas se hibrida con (i) la secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO:1 o con un fragmento de la misma que es al menos un 80% o 90% identica a lo largo de 60 nucleotidos, preferiblemente a lo largo de 100 nucleotidos, con mayor preferencia a lo largo de 200 nucleotidos, o bien con (ii) una secuencia de acido nucleico complementaria de la SEQ ID NO:1. Las secuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 se indican en la patente WO 02/45524. El polipeptido se encuentra preferiblemente en forma aislada.

El polipeptido empleado preferentemente segun la presente invencion tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 65%, preferiblemente al menos un 70%, con mayor preferencia al menos un 80%, con todavfa mayor preferencia al menos un 90%, con mucha mayor preferencia al menos un 95% y con la maxima preferencia al menos un 97% identica con los aminoacidos 1 a 526 de la SEQ ID NO:2 o que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:2.

Preferiblemente el polipeptido es codificado por un polinucleotido que se hibrida en condiciones poco estrictas, mas preferiblemente en condiciones medio estrictas y sobre todo en condiciones muy estrictas con (i) la secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO:1 o con un fragmento de la misma, o con (ii) una secuencia de acido nucleico que es complementaria de la SEQ ID NO:1.

El termino “capaz de hibridarse” significa que el polinucleotido diana de la presente invencion se puede hibridar con el acido nucleico utilizado como sonda (por ejemplo la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEQ. ID NO: 1, o con un fragmento de ella o con el complemento de SEQ ID NO: 1), a un nivel significativamente superior al ruido de fondo. Se revelan unos polinucleotidos que codifican la endoproteasa espedfica de prolina, asf como secuencias de nucleotidos complementarias de ella. La secuencia nucleotida puede ser ARN o ADN, incluyendo ADN genomico, ADN sintetico o ADNc. Preferiblemente la secuencia nucleotida es ADN y con mayor preferencia una secuencia de ADN genomico. Un polinucleotido incluye normalmente una secuencia contigua de nucleotidos capaz de hibridarse en condiciones selectivas con la secuencia codificadora de SEQ ID NO: 1 o con el complemento de dicha secuencia codificadora. Tales nucleotidos se pueden sintetizar por metodos bien conocidos del estado tecnico.

Un polinucleotido apto para el proceso de la presente invencion se puede hibridar con la secuencia codificadora de SEQ ID NO: 1, o con el complemento de dicha secuencia codificadora, a un nivel significativamente superior al ruido de fondo. Puede haber hibridacion inespedfica debido, por ejemplo, a la presencia de otros ADNc en una biblioteca de ADNc. El nivel de la senal generada por la interaccion entre un polinucleotido y la secuencia codificadora de SEQ ID NO: 1 o el complemento de dicha secuencia codificadora es tfpicamente al menos 10 veces, preferiblemente al menos 20 veces, con mayor preferencia al menos 50 veces y con aun mayor preferencia al menos 100 veces tan intenso como el de las interacciones entre otros polinucleotidos y la secuencia codificadora de SEQ ID NO: 1. La intensidad de la interaccion se puede medir, por ejemplo, marcando radiactivamente la sonda, por ejemplo con P32. Normalmente se puede conseguir una hibridacion selectiva en condiciones poco estrictas (cloruro sodico 0,3 M y citrato sodico 0,03 M a 40°C aproximadamente), medio estrictas (por ejemplo cloruro sodico 0,3 M y citrato sodico

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0,03 M a 50°C aproximadamente) y muy estrictas (por ejemplo cloruro sodico 0,3 M y citrato sodico 0,03 M a 60°C aproximadamente).

El paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT, que puede utilizarse para calcular la identidad (empleado por ejemplo con sus ajustes por defecto).

Los algoritmos PILEUP y BLAST N tambien se pueden utilizar para calcular la identidad de las secuencias o para alinearlas (como identificar secuencias equivalentes o correspondientes, por ejemplo con sus ajustes por defecto).

El programa informatico para efectuar los analisis BLAST es asequible publicamente a traves del National Center for Biotechnology Information (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo consiste primero en identificar pares de secuencias de alta puntuacion (HSPs) mediante la identificacion de palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que igualan o satisfacen cierta puntuacion T umbral de valoracion positiva cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T hace referencia al valor umbral de la palabra vecina. Estas coincidencias iniciales de palabras vecinas sirven de germen para iniciar busquedas de HSPs que contengan estas palabras. Las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mientras pueda incrementarse la puntuacion acumulada de la alineacion. Las extensiones de dichas coincidencias en cada direccion cesan cuando: la puntuacion acumulada de la alineacion cae una cantidad X por debajo de su valor maximo alcanzado; la puntuacion baja cero o por debajo de cero, debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuos con puntuacion negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parametros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineacion. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, unas alineaciones de la matriz de puntuacion BLOSUM62 (B) de 50, una probabilidad (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparacion de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST efectua un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad minima total (P(N)), que indica la probabilidad de una coincidencia al azar entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra si la probabilidad minima total al comparar la primera secuencia con la segunda es aproximadamente inferior a 1, preferiblemente inferior a 0,1, con mayor preferencia inferior a 0,01 y sobre todo inferior a 0,001.

Las cepas del genero Aspergillus tienen estatus de calidad alimentaria y es sabido que los enzimas derivados de estos microorganismos proceden de una fuente de calidad alimentaria libre de toda sospecha. Segun otra forma de ejecucion preferida, el enzima utilizable en el proceso reivindicado es un enzima secretado por su celula productora mas que un enzima no secretado, del tipo denominado citosolico. De este modo los enzimas se pueden recuperar del cultivo celular en un estado casi puro, sin costosas etapas de purificacion. El enzima tiene preferiblemente una gran afinidad hacia su substrato en las condiciones predominantes de pH y temperatura.

Descripcion de las figuras

Figura 1: curvas de actividad de la oligopeptidasa espedfica de prolina procedente de F. meningosepticum y de la endoproteasa espedfica de prolina procedente de A. niger medida sobre el substrato fluorescente Z-Gly-Pro- AMC en diversas condiciones de pH. La fluorescencia se midio despues de 30 minutos a 37°C.

Figura 2: perfil de especificidad de la prolil endoproteasa derivada de A. niger.

Figura 3: SDS-PAGE de ovoalbumina intacta y un peptido 27-mero sintetico tras la incubacion con endoproteasa espedfica de prolina procedente de A. niger purificada cromatograficamente.

Materiales y metodos

Los casematos sodico y potasico comestibles en espray (88%) se obtuvieron de DMV International, Holanda. El GMP se obtuvo de Aria, Dinamarca (Lacprodan CGMP-10, lot # P340205). Los peptidos cromogenicos sinteticos se obtuvieron de Pepscan Systems B.V., Holanda, o de Bachem, Suiza. El Flavourzyme 1000L Batch HPN00218 se obtuvo de Novozymes (Dinamarca), el Sumizyme FP de Shin Nihon (Japon) y la Corolasa LAP Ch.: 4123 de AB Enzymes (UK).

Endoproteasa espedfica de prolina procedente de A. niger

La sobreproduccion de endoproteasa espedfica de prolina derivada de Aspergillus niger se logro del modo descrito en la patente WO 02/45524. La actividad del enzima se comprobo sobre el peptido sintetico Z-Gly-Pro-pNA a 37°C en un tampon de citrato/fosfato disodico a pH 4,6. El producto de la reaccion se controlo espectrofotometricamente a 405 nM. Una unidad se define como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de p-nitroanilida por minuto en estas condiciones de ensayo, con una concentracion de substrato de 0,37 mM de Z-Gly-Pro-pNA.

Purificacion cromatografica de la endoproteasa derivada de A. niger

El caldo de cultivo obtenido de una cepa de A. niger sobreproductora se uso para la purificacion cromatografica de la proteasa, a fin de eliminar cualquier actividad endo- y exoproteolttica contaminante. A tal fin, primero se centrifugo el

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caldo de fermentacion para eliminar la mayor parte de la masa fungica y el sobrenadante se paso luego a traves de varios filtros de tamano de poro decreciente para separar todos los fragmentos celulares. Por ultimo el ultrafiltrado obtenido se diluyo diez veces en acetato sodico, 20 milimoles/litro, pH 5,1 y se aplico a una columna de Q-Sefarosa FF. Las protemas se eluyeron en gradiente, desde 0 hasta 0,4 moles/litro de NaCl en 20 milimoles/litro de acetato sodico a pH 5,1. Las fracciones correspondientes a los picos que revelaron actividad de escision del Z-Gly-Pro-pNA se recogieron y agruparon siguiendo el protocolo descrito en el World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209 - 212 (1995), pero en unas condiciones de ensayo ligeramente modificadas. Teniendo en cuenta el pH acido optimo para la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger, el ensayo enzimatico se realizo a pH 4,6 en un tampon de citrato/fosfato a 37°C. Despues de agrupar y concentrar las fracciones activas se obtuvo por ultimo una preparacion que mostraba solamente una banda en la SDS-PAGE y un pico en la HP-SEC. Otros analisis por cromatograffa de interaccion hidrofoba confirmaron la pureza de la preparacion enzimatica resultante.

Determinacion de nitrogeno por Kjeldahl

El nitrogeno Kjeldahl total se midio mediante analisis por inyeccion en flujo. Usando un sistema de inyeccion en flujo Tecator FIASTAR 5000 equipado con un TKN Method Cassette 5000-040, un ordenador Pentium 4 con el programa SOFIA y un cargador automatico de muestras Tecator 5027 se cuantifico a 590 nm el amoniaco desprendido de las soluciones que conteman protemas. En el tubo digestor se introduce una cantidad de muestra correspondiente al rango dinamico del metodo (0,5-20 mg N/I) junto con acido sulfurico al 97% y una tableta catalizadora Kjeltab, y se somete a un programa de digestion de 30 minutos a 200°C, seguido de 90 minutos a 360°C. Tras la inyeccion en el sistema FIASTAR 5000 se mide el pico de nitrogeno, de cuya magnitud se puede deducir la cantidad de protema.

Analisis de aminoacidos

Se disolvio en acido diluido una muestra del material proteico pesada con exactitud y los precipitados se separaron por centrifugacion en una centnfuga Eppendorf. El analisis de los aminoacidos se llevo a cabo en el sobrenadante claro, segun el metodo PicoTag especificado en el manual del operador del Sistema de analisis de aminoacidos de Waters (Milford MA, USA). Para ello se obtuvo una muestra adecuada del lfquido, la cual se seco y se sometio a una hidrolisis acida en fase vapor, y despues se transformo por reaccion qmmica empleando isotiocianato de fenilo. Los diversos aminoacidos derivados resultantes se cuantificaron por metodos de HPLC y se sumaron para calcular el nivel total de aminoacidos libres, incluyendo la IIe transformada, en la muestra pesada. Los aminoacidos Cys y Trp no estan incluidos en los datos obtenidos de este analisis.

Analisis por LC/MS/MS

Se utilizo un HPLC con un espectrometro de masas dotado de trampa de iones (Thermoquest®, Breda, Holanda) acoplado a una bomba P4000 (Thermoquest®, Breda, Holanda) para cuantificar los peptidos de interes, entre ellos los tripeptidos IPP, LPP y VPP, en los hidrolizados enzimaticos de protemas producidos por la mezcla enzimatica de la presente invencion. Los peptidos resultantes se separaron empleando una columna Inertsil 3 ODS 3, de 3 mm, 150*2,1 mm (Varian Belgium, Belgica) en combinacion con un gradiente de 0,1% de acido formico en agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA; solucion A) y 0,1% de acido formico en acetonitrilo (solucion B) para la elucion. El gradiente empezo con 100% de solucion A y se mantuvo asf durante 5 minutos, luego se fue anadiendo linealmente solucion B hasta un 5% en 10 minutos y despues se incremento tambien linealmente hasta un 45% de solucion B en 30 minutos, a continuacion se volvio a las condiciones iniciales y se mantuvo asf durante 15 minutos para estabilizar. El volumen inyectado fue de 50 microlitros, el caudal de 200 microlitros por minuto y la temperatura de la columna se mantuvieron a 55°C. La concentracion de protema en la muestra inyectada fue de aprox. 50 microgramos/mililitro.

Se obtuvo informacion detallada de cada peptido mediante MS/MS dedicada para los peptidos de interes, utilizando una energfa de colision optima de aproximadamente el 30%. La cuantificacion se lleva a cabo en modo LC/MS/MS usando ionizacion positiva por electrospray con un patron de IPP marcado con C13 + N15 y una lmea de calibracion tambien con un patron interno marcado para corregir el efecto matriz. La identificacion se efectua mediante el tiempo de retencion, el ion precursor y la proporcion de iones fragmentados caractensticos.

El tripeptido LPP (M = 325,2) se uso para ajustar la sensibilidad optima en modo MS y la fragmentacion optima en modo Ms/MS, con una infusion constante de 5 mg/ml, dando como resultado una molecula protonada en modo MS y una energfa de colision optima de aproximadamente el 30% en modo MS/MS, y generando una serie de iones B e Y.

Antes de la LC/MS/MS los hidrolizados enzimaticos de protemas se centrifugaron a temperatura ambiente y a 13000 rpm durante 10 minutos, se pasaron por un filtro de 0,22 pm y el sobrenadante se diluyo 1:100 con agua Milli Q.

El grado de hidrolisis (GH) obtenido durante la incubacion con las diversas mezclas proteoltticas se controlo por medio de un ensayo rapido OPA (JFS, vol. 66, n° 5, 2001).

Ejemplo 1

El enzima obtenido de A. niger representa una nueva clase de enzimas espedficos de prolina.

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De toda la secuencia codificadora de la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger, proporcionada en la patente WO 02/45524, se puede determinar una secuencia proteica de 526 aminoacidos. La novedad del enzima fue confirmada por busquedas BLAST de bases de datos tales como SwissProt, PIR y trEMBL. Para sorpresa nuestra no se pudo detectar ninguna homologfa clara entre el enzima de A. niger y las prolil oligopeptidasas conocidas. Sin embargo una inspeccion mas rigurosa de la secuencia de aminoacidos revelo una pequena pero significativa homologfa con las Pro-X carboxipeptidasas (EC3.4.16.2), las dipeptidil aminopeptidasas I (EC3.4.14.2) y la serina proteasa espedfica del timo. Todos estos enzimas se han asignado a la familia s28 de serina peptidasas (Handbook of Proteolytic Enzymes; Barrett A. J.; Rawlings N.D.; Woessner J.F., Eds.; Academic Press, Londres, UK, 1998, 369415). La configuracion GxSYxG alrededor del sitio activo de serina tambien se conserva entre estos enzimas y la endoproteasa derivada de A. niger. Ademas los miembros de la familia S28 tienen un valor acido de pH optimo, una especificidad para cortar por el extremo carboxiterminal de los residuos de prolina y son sintetizados con una secuencia senalizadora y propeptida igual que la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger. El tamano del enzima de A. niger es tambien similar al de los miembros de la familia S28. Por consiguiente la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger parece ser un miembro de la familia S28 de las serina proteasas mas que de la familia S9, en la cual se ha agrupado la mayona de prolil oligopeptidasas citosolicas, incluyendo el enzima obtenido de Flavobacterium meningosepticum. Sobre la base de estas caractensticas estructurales y fisiologicas hemos concluido que el enzima de A. niger pertenece a la familia S28 mas que a la familia S9 de serina proteasas. Otra caractenstica que diferencia el enzima derivado de A. niger de las prolil oligopeptidasas pertenecientes a la familia S9 es el hecho de que, contrariamente a las prolil oligopeptidasas citosolicas pertenecientes a esta ultima familia, el enzima de A. niger es secretado en el medio de cultivo. Este es el primer informe sobre el aislamiento y la caracterizacion de un miembro de la familia S28 a partir de un eucariota inferior.

Ejemplo 2

Espectros de pH para la actividad de la endoproteasa espedfica de prolina de A. niger y la oligopeptidasa de F. meningosepticum.

Para demostrar la diferencia de valores optimos de pH que hay entre la endoproteasa espedfica de prolina derivada de Aspergillus y la oligopeptidasa espedfica de prolina derivada de Flavobacterium meningosepticum medimos sus actividades en varias condiciones de pH. La endoproteasa derivada de Aspergillus se obtuvo del modo descrito en el apartado Materiales y metodos. La oligopeptidasa derivada de Flavobacterium se adquirio de ICN Biomedicals (35 unidades/mg; n° de cat. 32082; Ohio, Us).

Para establecer los espectros de pH de actividad de los dos enzimas se prepararon tampones con distintos valores de pH. Se prepararon tampones de pH 2,0 hasta 7,0 utilizando 0,1 moles/l de citrato, tampones de pH 6,0 hasta 9,0 utilizando 0,1 moles/l de tris y tampones de pH 8,0 hasta 12,0 utilizando 0,2 mol/l de glicina. Los valores requeridos de pH se ajustaron usando Hcl o NaOH. Como substrato para ambos enzimas se empleo el peptido cromogenico sintetico Z-Gly-Pro-AMC (Bachem, Suiza). En cada pocillo (placas Costar n° 3631) se introdujeron 85 uL de tampon, 10 uL de solucion enzimatica y 5 uL del substrato (Z-Gly-Pro-AMC 4 mM en metanol al 60%). La concentracion final del enzima derivado de A. niger fue de 32 ug/ml (3,2 miliunidades/ml), la concentracion final del enzima derivado de F. meningosepticum fue de 0,21 ug/ml (7,4 miliunidades/ml). Despues de mezclar se dejo reaccionar durante 30 minutos a 37°C y luego se midio la fluorescencia en un lector de placas multipocillo CytoFluor de PerSeptive Biosciences. Los datos correspondientes se muestran en la figura 1. Tambien se establecio la temperatura optima de la prolil endoproteasa. Para ello, la preparacion del enzima purificado se incubo en Na-acetato 0,1 moles/l que contema 0,02 moles/l de CaCl2 a pH 5,0 durante 2 horas a diferentes temperaturas, usando Caseine Resorufine (Roche version 3) como substrato, y se cuantifico la actividad enzimatica midiendola a 574 nm. De acuerdo con los resultados obtenidos, el valor optimo de temperatura para la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger es de 50°C aproximadamente.

Ejemplo 3

Especificidad de la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger.

Se ensayaron muestras de enzimas, tanto crudos como purificados cromatograficamente, obtenidos de una cepa de A. niger que contema multiples copias del casete de expresion (vease patente WO 02/45524), en comparacion con una coleccion de substratos peptfdicos cromogenicos para establecer la especificidad de la endoproteasa codificada. La actividad endoproteolttica del enzima se comprobo sobre un substrato de AAXpNA. Los substratos de “pNA” (p- nitroanilida) producen cambios de color cuando el enlace peptfdico X-pNA esta escindido; “X” representa diferentes residuos de aminoacidos naturales. Las soluciones madre de los substratos de AAXpNA (150 mmoles/l) se diluyeron 100x en tampon de acetato 0,1 M de pH 4,0 que contema CaCl2 20 mM. Las mediciones cineticas de 10 minutos a 40°C en un lector TECAN Genios MTP (Salzburg, Viena) a 405 nm registraron unos aumentos de densidad optica que por procesamiento de datos en Excel dieron el grafico representado en la figura 2. Del resultado es evidente que la endoproteasa procedente de A. niger tiene una gran especificidad para los enlaces peptfdicos de prolilo y una actividad secundaria hacia los enlaces de alanina. Las preparaciones crudas y las purificadas cromatograficamente mostraron curvas de actividad similares. Se pudo demostrar que la contaminacion de la endoproteasa procedente de

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A. niger con aminopeptidasas, carboxipeptidasas o endoproteasas no espedficas de prolina era insignificante (vease el ejemplo 5).

Ejemplo 4

La endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger puede hidrolizar protemas grandes y peptidos pequenos y por tanto es una verdadera endoproteasa.

Debido a una caractenstica estructural espedfica, las prolil oligopeptidasas pertenecientes a la familia S9 no pueden digerir peptidos de tamano superior a 30 aminoacidos. Esta limitacion es una clara desventaja para un enzima que supuestamente hidroliza distintas protemas del modo mas rapido y eficiente posible. Para ver si la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger revela las mismas limitaciones respecto al tamano molecular del substrato, hemos incubado la prolil endopeptidasa purificada cromatograficamente derivada de A. niger con un peptido sintetico pequeno y con la molecula grande de ovoalbumina y hemos analizado por SDS-PAGE los productos resultantes de la hidrolisis.

Como peptido sintetico se uso un 27-mero con la secuencia NH2-FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR-COOH, que fue un obsequio de la compafna Pepscan (Lelystad, Holanda). Como puede verse en su secuencia de aminoacidos, este peptido contiene 2 residuos de prolina, uno en medio y el otro cerca del extremo carboxiterminal del peptido.

La molecula intacta de ovoalbumina (Pierce Imject, viales que contienen 20 mg de material liofilizado) esta formada por 385 aminoacidos y tiene un peso molecular de 42.750 Da. Esta molecula contiene 14 residuos de prolina, uno de los cuales esta situado junto al ultimo extremo C-terminal de la molecula y no es escindible por una endoproteasa espedfica de prolina. La ovoalbumina y el oligopeptido se incubaron por separado a 50°C con la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger. Se tomaron muestras a varios intervalos de tiempo y luego se analizaron por SDS-PAGE.

Una endoproteasa espedfica de prolina procedente de A. niger purificada cromatograficamente, con una actividad de 4,5 unidades/ml, se diluyo 100 veces con un tampon de acetato 0,1 M de pH 4 que contema CaCl2 20 mM. La ovoalbumina se disolvio en tampon de acetato de pH 4 a una concentracion de 1 mg/ml (22 jM). El peptido 27-mero se disolvio en el mismo tampon hasta una concentracion de 0,48 mg/ml (152 jM). La molaridad de la ovoalbumina y de la solucion del peptido 27-mero se escogio de manera que ambas soluciones contuvieran la misma molaridad de residuos de prolina escindibles. La ovoalbumina contiene 13 sitios potenciales de escision de prolina, mientras que el peptido 27-mero solo tiene dos. Se incubaron 0,5 ml de cada solucion de substrato con 10 jl (0,45 miliU) de la solucion enzimatica en un termomezclador Eppendorf a 50°C. A varios intervalos de tiempo se tomaron muestras de 10 jl de la mezcla incubada y se conservaron a 20°C hasta el analisis por SDS-PAGE. Todos los materiales usados para la SDS-PAGE y la tincion se adquirieron de Invitrogen. Las muestras se prepararon con tampon SDS segun las instrucciones del fabricante y se separaron sobre geles de Bis-Tris al 12%, usando el sistema de tampon MES-SDS segun las instrucciones del fabricante. La tincion se realizo con el colorante Simply Blue Safe (Collodial Coomassie G250).

Como puede verse en la figura 3, el enzima derivado de Aspergillus escinde una banda discreta de unos 35 a 36 kD de la ovoalbumina en las primeras 4,75 horas de incubacion (calle 3). Los periodos de incubacion mas largos dan como resultado una nueva descomposicion en productos mas pequenos de distintos pesos moleculares (calle 7).

El peptido 27-mero tambien resulta descompuesto, tal como se deduce por las varias bandas debiles en las calles 4, 6 y 8 en comparacion con la calle 2. La desviacion muy pequena del peso molecular del producto (comparense las calles 9 y 8) se debe muy probablemente a la escision del residuo de arginina en el extremo carboxflico del peptido. La diferencia es de unos 200 D (medida mediante el programa Alphalmager en un sistema Alphalmager 2000) y la arginina tiene un PM de 174. Esta pequena desviacion de peso molecular es probablemente el primer paso en la descomposicion del peptido.

La posterior descomposicion del producto solo puede apreciarse por el descenso de intensidad de la banda sobre el gel de SDS. Los productos de esta descomposicion adicional no son visibles, porque en el gel no es posible la tincion de componentes de PM aproximadamente igual a 1000 con el colorante Coomassie Brillant Blue. A partir de este experimento se puede concluir que, a diferencia de las prolil oligopeptidasas pertenecientes a la familia S9, la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger no tiene ninguna preferencia especial por la escision de peptidos de pequeno tamano sobre protemas mucho mas grandes. Por consiguiente el enzima derivado de A. niger representa una verdadera endoproteasa y es un enzima preferido para hidrolizar diferentes tipos de protemas.

Ejemplo 5

Cuantificacion de actividades enzimaticas deseables y contaminantes durante la produccion de peptidos reductores de la presion sangumea.

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Se puede obtener IPP bastante puro en un proceso de una sola etapa recuperando IPP de GMP. La fraccion que contiene IPP se puede obtener a partir de gMp mediante varias preparaciones enzimaticas diferentes. Por ejemplo, incubando GMP con una endoproteasa pura espedfica de prolina o con una endoproteasa pura espedfica de prolina mas una aminopeptidasa pura, o con una oligopeptidasa pura espedfica de prolina en combinacion con trazas de otra endopeptidasa pura tal como una subtilisina o una metaloproteasa (con el fin de partir el GMP en fragmentos mas pequenos formando unos substratos mejorados para la oligopeptidasa), o con una aminopeptidasa pura en combinacion con una tripeptidil aminopeptidasa espedfica de prolina (como la existente en la preparacion comercial “Umamizyme” de Amano, Japon), o con preparaciones enzimaticas complejas que contienen diferentes tipos de actividades proteoftticas. En este ejemplo se ensayaron las diversas actividades proteoftticas de tres preparaciones enzimaticas comerciales: Flavourzyme 1000L lote HPN00218 (Novozymes), Sumizyme FP (Shin Nihon, Japon) y Corolasa LAP Ch.: 4123 (AB Enzymes, UK). Tanto Flavourzyme como Sumizyme FP son preparaciones enzimaticas complejas conocidas que contienen diversas actividades enzimaticas aminopeptidoftticas ademas de actividades endoproteoftticas y carboxipeptidoftticas no espedficas. La Corolasa LAP comporta una actividad de aminopeptidasa de leucina relativamente pura, clonada y sobreexpresada, procedente de Aspergillus.

Esencialmente pura significa que en las condiciones de incubacion empleadas la actividad de las endoproteasas contaminantes, asf como de las carboxieptidasas o aminopeptidasas contaminantes, es minima o preferiblemente inexistente. El siguiente procedimiento de ensayo fue planeado para cuantificar estas actividades contaminantes de las endo-, amino- y carboxipeptidasas.

La base del procedimiento de ensayo esta formada por una coleccion de varios peptidos cromogenicos selectivos. Como solo las oligo- y endoproteasas espedficas de prolina pueden liberar pNA del peptido Z-AAAP-pNA, se uso este peptido concreto para cuantificar la deseada actividad endoproteolftica espedfica de prolina. Como hay muchas endoproteasas que pueden liberar pNA de los peptidos Z-AAAP-pNA y Z-AAAR-pNA, se usaron estos dos peptidos para cuantificar la actividad contaminante endoproteolftica no espedfica de prolina. Como la conversion de los peptidos QNIPP y VVVPP presentes en la molecula de beta-casema a IPP y VPP respectivamente requiere unas aminopeptidasas que puedan eliminar eficientemente residuos de Gln y Val, se usaron los peptidos Q-pNA y V-pNA para cuantificar las deseadas actividades de aminopeptidasa. Como existen muchas carboxipeptidasas que pueden liberar residuos de Phe y Arg de los peptidos, se escogieron peptidos que conteman estos residuos para cuantificar actividades contaminantes de carboxieptidasa. Sin embargo no se dispone de grupos cromogenicos adecuados para medir las actividades de carboxieptidasa, por lo cual hubo que desarrollar un metodo alternativo usando los peptidos sinteticos Z-AF y Z-AR. Este metodo alternativo se ofrece mas abajo. En todos los peptidos sinteticos empleados “Z” representa benciloxicarbonilo y “pNA” el cromoforo para-nitroanilida. Todos los peptidos cromogenicos se obtuvieron de Pepscan (Lelystad, Holanda). Los peptidos Z-AF y Z-AR se compraron a Bachem (Suiza). Todas las incubaciones se efectuaron a 40°C. Las preparaciones enzimaticas diluidas se recalcularon para la concentracion del producto comercial.

Medicion de las actividades de aminopeptidasa

Se diluyeron 80 veces en tampon BisTris 0,1 M de pH 6 unas soluciones madre de 150 mmoles/l de V-pNA y Q- pNA en DMSO 100% para preparar una solucion de 3,75 mmoles/l de substrato de V-pNA+ Q-pNA que contema V-pNA y Q- pNA en relacion 1:1. Se pipeteo un aftcuota de 200 pl de esta solucion de substrato de aminopeptidasa en pocillos separados de una placa de microvaloracion (MTP). La MTP se preincuba a 40°C en un Tecan Genios MTP (Salzburg, Viena) dirigido por el programa Magellan4. La reaccion se inicio anadiendo 50 pl de la solucion enzimatica apropiada, de manera que las incubaciones tuvieron lugar a una concentracion de substrato igual a 3 mM. Se uso tfpicamente una dilucion 1:50 de las muestras enzimaticas ftquidas Flavourzyme, Corolasa LAP y endoproteasa espedfica de prolina. Del producto seco Sumizyme FP se uso una solucion al 1%.

El color amarillo desarrollado como resultado de la escision del enlace aminoacido-pNA y medido a 405 nm por el Tecan Genios MTP fue seguido de al menos 20 ciclos cineticos (aproximadamente 10 minutos). El programa genero los datos como DOWmin.

Medicion de la actividad de la endoproteasa espedfica de prolina

Esta medicion se realizo basicamente del mismo modo que en el ensayo de aminopeptidasa, pero en este caso se empleo Z-AAAPpNA como unico substrato a una concentracion final de 3 mmoles/l. Este substrato se solubilizo calentando a 50-55°C una suspension en tampon de pH 6, con lo cual se obtuvo una solucion transparente a la temperatura ambiente. Las mediciones se efectuaron a 40°C.

Se empleo tfpicamente una dilucion 1:50 de las muestras enzimaticas ftquidas Flavourzyme y Corolase LAP. El Sumizyme FP se uso en una solucion al 1%. La endoproteasa espedfica de prolina se uso tfpicamente una dilucion 1:5000.

El programa genero los datos como DOWmin.

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Medicion de las actividades contaminantes de endoproteasa no espedfica de prolina

Esta medicion tambien se realizo basicamente del modo descrito en el ensayo de aminopeptidasa, pero en este experimento se emplearon como substrato Z-AAAF-pNA y Z-AAAR-pNA en relacion 1:1 y a una concentracion final de 3 mmoles/l. El substrato Z-AAAF-pNA resulto ser poco soluble a pH 6, segun las condiciones del ensayo, pero una prueba de incubacion con subtilisina dio como resultado una rapida solubilizacion del substrato paralelamente a la liberacion de pNA. Las mediciones se efectuaron a 40°C. No obstante, para compensar esta baja solubilidad el lector de MTP se programo con agitacion entre los ciclos cineticos.

El programa genero de nuevo los datos como DOWmin.

Medicion de las actividades contaminantes de carboxipeptidasa

Como no se dispone de peptidos cromogenicos sensibles para medir actividades de carboxipeptidasa, se uso un metodo basado en un protocolo de Boehringer para cuantificar carboxipeptidasa C.

Dos soluciones madre de 150 mmoles/l de Z-A-F y Z-A-R en etanol se diluyeron 80 veces en un tampon BisTris de 0,1 moles/l y pH 6 para preparar una solucion de 3,75 mmoles/l de substrato Z-A-F + Z-A-R que contema Z-A-F y Z- A-R en relacion 1:1. Luego se pipetearon 200 pl de la solucion de substrato en un vial eppendorf y se preincubaron a 40°C. La reaccion se inicio anadiendo 50 pl de una dilucion enzimatica apropiada. Se uso tfpicamente una dilucion 1:50 de Flavourzyme y Corolase LAP y de la endoproteasa espedfica de prolina. Para el Sumizym FP se uso una solucion al 1%. Transcurridos 5 minutos se paro la reaccion anadiendo 250 pl de reactivo de ninhidrina. El reactivo de ninhidrina se preparo con 400 mg de ninhidrina (Merck) y 60 mg hidrindantina disueltos en 15 ml de DMSO, a los que se agregaron 5 ml de tampon de acetato de litio de 4,0 moles/l a pH 5,2. El tampon de acetato de litio de 4,0 moles/l se preparo disolviendo LiOH (Sigma) y ajustando el pH a 5,2 con acido acetico glacial (Merck).

Despues de parar la reaccion, cada muestra se calento a 95°C durante 15 minutos para facilitar la formacion de color y a continuacion se diluyo 10 veces con etanol puro. El color formado se midio a 578 nm en un espectrofotometro Uvikon. Se prepararon blancos del mismo modo que las muestras de actividad, pero invirtiendo la adicion de reactivo de ninhidrina y enzima. Con el fin de cuantificar la cantidad de aminoacidos libres generados por la carboxipeptidasa se uso el aminoacido L-fenilalanina para crear una curva de calibracion. De la misma manera que las muestras se trataron unas soluciones en tampon de pH 6 que conteman 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5 y 3,0 mmoles/l de L-fenilalanina (Sigma), es decir 250 pl en un vial. Con los valores de DO578 obtenidos se construyo una curva en Excel. Usando esta curva se calcularon las concentraciones de los aminoacidos libres presentes en las muestras que conteman los substratos Z-A-F y Z-A-R. A partir de los valores resultantes se calculo la actividad de carboxipeptidasa en micromoles por minuto respecto a la cantidad de enzima ensayada.

Calculo de las actividades relativas

A fin de determinar la idoneidad de las distintas preparaciones enzimaticas para el proceso de la presente invencion se calcularon los cocientes de las actividades enzimaticas relevantes. En los ensayos basados en el lector de MTP las actividades enzimaticas se caracterizan por la liberacion de pNA a lo largo del tiempo, es decir como ADOWmin. Los cocientes de las actividades enzimaticas obtenidos por el lector de MTP se calcularon dividiendo simplemente los valores de ADOWmin resultantes por cantidades identicas de enzima.

Sin embargo en el caso del ensayo de carboxipeptidasa se genera una DO que no se puede comparar directamente con la ADO/min resultante de los ensayos basados en MTP-pNA. En este caso la DO se convirtio primero a pmoles de aminoacido liberados por minuto (pmoles/min). Luego la ADO/min de pNA liberada se convirtio a pmoles/min. Para ello se genero una curva de calibracion en el lector de MTP con las mediciones de diluciones de pNA (Sigma) a 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312 y 0,015 mmoles/l y 250 pl por pocillo. Con los datos obtenidos se construyo una curva de calibracion en Excel. A partir de esta curva de calibracion la ADO/min se convirtio en pmoles/min, de manera que las mediciones basadas en pNA se pudieran comparar con las mediciones basadas en ninhidrina.

Sobre la base de los datos generados en los ensayos arriba referidos se caracterizaron las distintas preparaciones enzimaticas. En la columna “Actividad esp. de prol.” de la tabla 1 se muestran los datos de las actividades oligo- o endoproteolfticas espedficas de prolina presentes en cada preparacion enzimatica tal como hada sido suministrada. Los datos de las actividades de aminopeptidasa deseadas (AP/Act. esp. prol.) y de las actividades contaminantes de carboxipeptidasa (CPD/Act. esp. prol.) y endoproteolfticas (Endo/Act. esp. prol.) estan indicadas respecto a las actividades espedficas de prolina presentes. La actividad deseada de aminopeptidasa respecto a la actividad contaminante de carboxipeptidasa presente en cada preparacion esta indicada como (AP/CPD).

Es evidente que ninguna de las preparaciones enzimaticas comerciales ensayadas tiene alguna actividad importante oligo- o endoproteolftica espedfica de prolina. Ademas todas las preparaciones enzimaticas comerciales ensayadas tienen actividades de carboxipeptidasa y endoproteolfticas. La preparacion enzimatica C1 consiste en una mezcla de 4 unidades de endoproteasa espedfica de prolina mas 130 microlitros de Corolasa LAP comercial, para ser aplicada por gramo de substrato proteico presente, que produce unos elevados rendimientos de los peptidos IPP, VPP y LPP

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

inhibidores del ECA gracias a sus niveles muy reducidos de actividades de carboxipeptidasa y endoproteolfticas contaminantes.

Tabla 1:

Actividad esp. prol.* CPD/Act. esp. prol. AP/Act. esp. prol. Endo/Act. esp. prol. AP/CPD

Sumizyme

0,004 21,7 1,2 1,7 0,06

Flavourzyme

0,0007 253,5 25,6 35,5 0,10

Corolasa LAP

0,0 0,74

Esp. prol. A. niger

100 0,005 0,00001 0,000004 0,00

C1

75 0,001 0,00031 0,000391 0,25

* El Sumizyme se midio en solucion al 1%, el Flavourzyme y la Corolasa LAP en dilucion 1:50. La actividad espedfica de prolina obtenida de A. niger se midio en dilucion 1:5000 y la de la C1 en dilucion 1:3773. Despues se calcularon los datos para la actividad presente en el producto suministrado.

Sobre la base de su alto contenido de actividades de amino- y carboxipeptidasa cabe esperar que las incubaciones del GMP con las mezclas enzimaticas complejas Sumizyme FP y Flavourzyme generen altos niveles de aminoacidos libres. Es de esperar que estos aminoacidos libres impartan un regusto caldoso como resultado de un incremento de reacciones de Maillard. Ademas la presencia de actividades endoproteolfticas no espedficas de prolina o alanina en estas preparaciones enzimaticas producira la solubilizacion de otros peptidos quizas bioactivos en el producto final, desdibujando el efecto reductor puro de la presion sangumea del IPP. Para minimizar todas estas reacciones secundarias no deseadas es preferible combinar una proteasa espedfica de prolina esencialmente pura con una aminopeptidasa esencialmente pura. Se prefiere sobre todo el uso unico de una endoproteasa espedfica de prolina esencialmente pura

Ejemplo 6

Separacion de GMP e IPP del casemato

El GMP comercialmente disponible se obtiene de suero de queso. En este proceso se incuba leche con quimosina para liberar el GMP de la parte hidrosoluble de la casema kappa. Como resultado precipita el caseinato formando la cuajada y la parte del GMP va a parar al suero de queso, de donde se puede aislar por varios procesos diferentes. En este ejemplo describimos una via alternativa para aislar el GMP, esto es, su separacion del caseinato disponible en el comercio. La ventaja de esta via es que tras la separacion selectiva del GMP, la fraccion restante de caseinato se puede utilizar para otras aplicaciones. En el proceso de la presente invencion la leche (descremada) se acidifica segun metodos conocidos del sector para precipitar selectivamente la fraccion de casema. La fraccion precipitada incluye todas las casemas, es decir las casemas alfa, beta, kappa (con la parte de GMP) y gamma. Esta cuajada de casema formada se separa de la fraccion de “suero de queso” y se lava para eliminar los componentes restantes del suero y los iones que genera el proceso de acidificacion. Una vez deshidratada, la cuajada de casema se redisuelve por neutralizacion, usando por ejemplo KOH, para obtener el “caseinato” relevante.

Una solucion al 10% (p/v) de caseinato potasico (de pH 6,4 aprox.) se incubo a 31°C durante 1 hora con quimosina de ternero para liberar la parte del GMP de la casema kappa. En este caso se utilizo 2.2 IMCU Maxiren (DSM Food Specialities, Delft, Holanda) por gramo de caseinato. La solucion resultante se sometio a una o varias etapas de filtracion para separar la parte disuelta de GMP, de bajo peso molecular, de la fraccion de molecular peso elevado que contema las casemas y la quimosina. El filtrado que contema el GMP se acidifico a pH 4,5 y se le anadio la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger a una concentracion de 4 unidades por gramo de protema presente. La temperatura se subio hasta 55°C para maximizar la actividad del enzima y se siguio incubando durante 3 horas. Despues la solucion resultante se concentro por evaporacion y se calento durante 5 minutos a 95°C para inactivar la endoproteasa espedfica de prolina. Por ultimo el concentrado caliente se sometio a ultrafiltracion para separar lo maximo posible las protemas precipitadas y se seco por pulverizacion. Segun los analisis de LC/MS/MS del material secado por pulverizacion, la concentracion de IPP determinada cuantitativamente fue de 0,6 miligramos de IPP por gramo de caseinato como material de partida.

Ejemplo 7

Liberacion de IPP del GMP en una sola etapa de incubacion

Se llevo a cabo una serie de incubaciones para demostrar que la endoproteasa espedfica de prolina derivada de A. niger y el Sumizyme FP son adecuados para liberar del GMP el tripeptido IPP reductor de la presion sangumea. En este ensayo se utilizo una preparacion de GMP comercialmente disponible Lacprodan CGMP-10, lot # P340205 de Arla, Dinamarca). De acuerdo con sus especificaciones el polvo obtenido lleva aproximadamente 85% de protema con un contenido aproximado de GMP del 80% (de la protema presente), es decir, 1 gramo de Lacprodan CGMP-10 en polvo contiene aproximadamente 0,85 x 0,8 = 0,7 gramos de GMP puro.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El GMP se disolvio en agua desmineralizada (50 gramos de GMP en 450 ml). El pH de esta solucion es 6,7. De esta solucion se llevaron 135 ml hasta pH 4 con HCl 4 N y se anadio agua para llegar a un volumen de 150 ml y a una concentracion de GMP del 10% de solidos. De la solucion de pH 6,7 se llevaron 45 ml a pH 6 con HCl 4 N y 90 ml a pH 8 con KOH 4 N. Se anadio mas agua a amabas soluciones para llegar a una concentracion de GMP del 10% de solidos. En la incubacion con la endoproteasa espedfica de prolina se selecciono el pH 4 porque representa el valor optimo para este enzima. Como el Sumizyme FP es una mezcla de diversas endoproteasas, aminopeptidasas y carboxipeptidasas, todas ellas con sus valores optimos de pH, esta incubacion se realizo en diferentes condiciones de pH.

Con estas tres soluciones ajustadas a varios valores de pH se llevaron a cabo las incubaciones con los diferentes enzimas, tal como se muestra en la tabla. La endoproteasa espedfica de prolina se empleo a una concentracion de 0,4 U/ml (~ 4,2 U/g de protema) y el Sumizyme FP a una concentracion final de 1 mg/ml (~ 10,4 mg/g de protema). Todas las incubaciones se hicieron en tubos conicos Greiner de 50 ml en un bano de agua puesto a 40°C durante 6 horas, con agitacion suave. Despues de las incubaciones, las muestras se conservaron congeladas a -20°C hasta el analisis por LC/MS/MS. Los datos obtenidos en este ultimo analisis estan indicados en la tabla y fueron medidos mediante el uso de soluciones de referencia de IPP, VPP y LPP.

Tabla 2: esquema de incubacion de soluciones de GMP con MaxiPro y Sumizyme FP

N° de incubacion

ml de solucion de GMP al 10% ml de solucion enzimatica esp. de prol. a 10 unidades/ml ml de solucion de Sumizyme FP a 25 mg/ml pH de la mezcla de incubacion

1

48 - 6,7

2

48 2 4

3

48 - 2 4

4

48 - 2 6

5

48 - 2 8

Tabla 3: produccion de peptidos tras la incubacion enzimatica con las diversas soluciones de GMP

N° de incubacion

IPP VPP LPP

microg/ml microg/g microg/ml microg/g microg/ml microg/g

1

nd nd nd nd nd nd

2

1657 2367 nd nd

3

41 59 3 4 6 9

4

389 556 36 51 nd

5

570 814 44 63 nd

microg/ml = microgramo del tripeptido relevante por ml de solucion de GMP al 10% microg/g = microgramo del tripeptido relevante por gramo de protema GMP nd = no detectable

De los resultados obtenidos es evidente que la incubacion con la endoproteasa espedfica de prolina da un producto que contiene IPP libre de los peptidos VPP y LPP. La cantidad de IPP liberado en esta incubacion no optimizada representa aprox. el 50% del fragmento de IPP presente en el GMP.

Lo mas importante es que las incubaciones con el enzima complejo Sumizyme FP tambien producen la formacion de IPP a partir de GMP. Segun nuestros datos mas eficientemente a pH 8. El hecho de que los rendimientos de IPP con Sumizyme FP sean menores que en la incubacion con la endoproteasa espedfica de prolina refleja meramente un estado de subdosificacion del enzima Sumizyme FP en este ensayo. De modo totalmente sorprendente el Sumizyme FP no solo genero IPP, sino tambien VPP y LPP a partir del material de Lacprodan. Como los tripeptidos VPP y LPP solo existen en la secuencia de aminoacidos de la casema beta, su presencia ilustra claramente el hecho de que el material de GMP obtenido esta contaminado con casema beta.

Ejemplo 8

Para demostrar las ventajas organolepticas de un hidrolizado que contenga IPP, obtenido a partir de GMP, se realizo un ensayo de cata. En este experimento se incubaron tres substratos distintos, GMP, caseinato potasico y leche descremada, con la endoproteasa espedfica de prolina de A. niger. Usando este enzima puro solo se pudo escindir el IPP presente en la molecula de casema kappa (vease la patente WO 2006/005757). Todas las tres incubaciones conteman la misma concentracion de protema del 3,5% (p/p) y la misma cantidad de enzima, es decir 4 unidades/gramo de protema. Para evitar la precipitacion de las casemas, el pH de las soluciones se ajusto a 6,2. La incubacion se dejo proseguir durante 3 horas y luego se termino mediante un breve tratamiento termico.

En los tres hidrolizados hubo un precipitado importante. Despues de centrifugar para eliminar estos precipitados, los sobrenadantes transparentes (que conteman IPP) fueron catados por un panel entrenado formado por 5 personas. Los miembros del panel fueron entrenados con disoluciones de sulfato de quinina a las concentraciones siguientes:

5

10

15

20

25

30

35

15 mg/l de sulfato de quinina > amargor de intensidad = 1; 20 mg/l de sulfato de quinina > amargor de intensidad = 2; 30 mg/l de sulfato de quinina > amargor de intensidad = 3 y 50 mg/l de sulfato de quinina > amargor de intensidad = 4. El panel puntuo el amargor de cada hidrolizado en una escala de 0 (no amargo) a 4 (muy amargo). Antes de iniciar la sesion de cata se dio a cada panelista una muestra de referencia de 15 mg/l de sulfato de quinina, a la cual se asigno un valor de amargor de intensidad = 1. El hidrolizado de casema fue calificado de muy amargo, es decir con el valor 4, por todos los miembros del panel de cata. El hidrolizado de leche descremada tambien fue valorado como amargo por todos los miembros del panel, con una puntuacion de 3. Al catar el hidrolizado de GMP el panel dio unanimemente una puntuacion de 1. Teniendo en cuenta que del hidrolizado de GMP tambien cabe esperar la mayor concentracion de IPP, los sorprendentes beneficios del proceso segun la presente invencion quedan claramente demostrados.

Ejemplo 9

Liberacion de IPP del GMP por fermentacion

En la patente US 6,428,812 se ha descrito la pobre palatabilidad de los productos de leche fermentada y las muchas dificultades encontradas durante la recuperacion de peptidos inhibidores del ECA a partir de caldos fermentados. En este ejemplo demostramos que la molecula de GMP tambien es un substrato adecuado para la produccion de IPP por fermentacion.

En este estudio se usaron dos cepas de lactobacilos, el Lactobacillus acidophilus LAFTI® L10 y el Lactobacillus casei LAFTI® L26 (DSM Food Specialties, Australia). Ambas cepas se cultivaron en frascos anaerobicos bajo atmosfera de CO2 + N2 (AnaeroGen®, Oxoid) a 37°C en caldo MRS (Oxoid) durante 24 h. Los precultivos resultantes se inocularon luego en un caldo de fermentacion “a” o en un caldo de fermentacion “ay”. El caldo de fermentacion “a” contema: Tween 80 (1 ml/l), K2HPO4 (2 g/l), NaAc (3 g/l), (NH4)aCitrate (2 g/l), MgSO4'7 H2O (0,2 g/l), MnSO4'4 H2O (0,05 g/l), glucosa (20 g/l), GMP (Lacprodan, Aria; 22 g/l). El caldo de fermentacion “ay” contema ademas extracto de levadura (4,0 g /l). Los caldos de fermentacion “a” y “ay” recien inoculados se incubaron otras 24 horas en las condiciones arriba descritas. Luego se centrifugaron estos caldos de fermentacion y los sobrenadantes se analizaron por LC/MS para determinar la presencia de los tripeptidos IPP, LPP y VPP. Como ilustra la tabla 4 la presencia de IPP solo se pudo detectar en las incubaciones con la cepa L10 a un nivel de 0,3 mg/l. No hubo presencia de LPP ni de VPP. La cata de las muestras 1 y 5 no revelo ningun regusto significativo.

Tabla 4: liberacion de IPP del GMP por fermentacion

Tubo

Caldo de fermentacion Cepa Produccion de IPP

1

a L10 sf

2

ay L10 sf

3

a L26 no detectado

4

ay L26 no detectado

5

a control sin inoculo no detectado

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Proceso para producir IPP (Ile-Pro-Pro) a partir de GMP (glicomacropeptido de casema kappa) que consiste en incubar primero el GMP con una aminopeptidasa y a continuacion con una proteasa espedfica de prolina.
2. 2. Proceso segun la reivindicacion 1, en el cual la proteasa espedfica de prolina es una endoproteasa espedfica de prolina.
3. 3. Proceso segun la reivindicacion 1 o 2, en el cual la aminopeptidasa no esta activa cuando se anade la proteasa espedfica de prolina.
4. 4. Proceso segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los peptidos solubles, incluyendo el IPP, que se forman durante la hidrolisis de la fuente proteica se separan y opcionalmente se secan.
5. 5. Proceso para preparar un producto alimenticio, una bebida o un suplemento dietetico, que consiste en

   (a) producir una composicion que comprende IPP mediante un proceso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y

   (b) incorporar dicha composicion que contiene IPP a un producto alimenticio, a una bebida o a un suplemento dietetico.
6. 6. Proceso segun la reivindicacion 5 que tambien incluye una etapa (c) para separar los peptidos solubles de la protema hidrolizada.
7. 7. Proceso segun la reivindicacion 6, en el cual la etapa (c) tiene lugar despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b).
8. 8. Proceso segun la reivindicacion 5, en el cual el producto alimenticio, la bebida o el suplemento dietetico se elige del grupo formado por margarinas, pastas para untar, mantequilla, productos lacteos o bebidas que contienen suero de leche, yogur o leche.