EA016396B1

EA016396B1 - Способ получения пептидного гидролизата, содержащего ipp, и применение указанного гидролизата для производства функционального пищевого продукта, предназначенного для поддержания здоровья сердечно-сосудистой системы

Info

Publication number: EA016396B1
Application number: EA200701778A
Authority: EA
Inventors: Андре Леонардус Де Рос; Питер Маринус Ван Ден Броке; Люппо Эденс
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2005-02-24
Filing date: 2006-02-23
Publication date: 2012-04-30
Also published as: CN101128596B; BRPI0608273B8; PL1851323T3; CN103463615A; AU2006217901B2; EP1851323B1; CN103463615B; AU2006217901A1; EA200701778A1; CN101128596A; KR20070114141A; WO2006089921A1; NZ560601A; ES2599859T3; JP5770411B2; US20080161227A1; BRPI0608273B1; KR101244995B1; EP1851323A1; JP2008537476A

Abstract

Заявлен способ получения пептидного гидролизата, содержащего IPP, из белкового источника, содержащего белок, имеющий в составе аминокислотной последовательности по меньшей мере в 6 раз больше -I-P-P- по сравнению с -V-P-P- (на молярной основе), включающий гидролиз белкового источника с целью высвобождения по меньшей мере 40% трипептида IPP с помощью протеолитического фермента, преимущественно пролинспецифичной эндопротеазы или пролинспецифичной олигопептидазы и, при необходимости, аминопептидазы. Изобретение также относится к применению указанного гидролизата для производства функционального пищевого продукта, предназначенного для поддержания здоровья сердечно-сосудистой системы.

Description

Настоящее изобретение относится к получению ΙΡΡ.

Предшествующий уровень техники

Гипертензия является относительно распространенной болезнью у человека и представляет преобладающий фактор риска для сердечно-сосудистых заболеваний, почечной недостаточности и инсульта. Наличие большого ряда фармацевтических продуктов, таких как блокаторы кальция, бета-блокаторы, диуретики, альфа-блокаторы, альфа-антагонисты центрального действия, антагонисты ангиотензина II и АСЕ-ингибиторы, иллюстрирует то, что лежащие в основе гипертензии механизмы являются многосторонними.

Из физиологических механизмов гипертензии особое внимание в научных кругах привлек ренинанигиотензиновый механизм. В этом механизме анигиотензин секретируется печенью и расщепляется пептидазой ренином с образованием биологически неактивного декапептида анигиотензина I. При прохождении анигиотензина через легочные капилляры другая пептидаза, называемая конвертирующим анигиотензин ферментом (далее называемым АСЕ), действует на анигиотензин I, удаляя два последних остатка анигиотензина I (Шк-Ьеи) с образованием октапептида анигиотензина II. Октапептид ангиотензин II проявляет сильную сосудосужающую активность и, следовательно, повышает кровяное давление. Ингибирование АСЕ, приводящее к более низким уровням ангиотензина II, предотвращает сужение сосудов и соответственно высокое кровяное давление.

Наряду с расщеплением анигиотензина I АСЕ может также гидролизовать брадикинин - нонапептид, также участвующий в регуляции кровяного давления. В последнем механизме ингибирование АСЕ приводит к повышенным уровням брадикинина, что способствует расширению сосудов и снижает кровяное давление. Таким образом, ингибирование АСЕ приводит к снижающим кровяное давление эффектам, по крайней мере двум отдельным механизмам.

Известно также, что октапептид ангиотензин II стимулирует выделение альдостерона корой надпочечника. Органом-мишенью для альдостерона является почка, где альдостерон вызывает усиленную реабсорбцию натрия из почечных канальцев. И через этот третий механизм ингибирование АСЕ также снижает кровяное давление, но в этом случае за счет уменьшения реабсорбции натрия.

Благодаря своим многочисленным физиологическим эффектам ингибирование протеолитической активности АСЕ является эффективным путем снижения кровяного давления. Результатом этого наблюдения стало появление ряда эффективных фармацевтических понижающих кровяное давление продуктов, таких как каптоприл и еналаприл (ОибеШ М.А., 1977, 8с1еисе, ^а8Ыид1ои ΌΟ, 196, 441-444).

Поскольку гипертензия является относительно распространенным болезненным состоянием, было бы полезно противодействовать этому нежелательному результату современного стиля жизни с помощью умеренно активных природных ингредиентов, в особенности умеренно активных природных ингредиентов, которые могут вводиться в пищевые продукты и напитки, поскольку эти продукты употребляются на регулярной основе. Альтернативным образом, такие умеренно активные природные ингредиенты могли бы вводиться в пищевые добавки. За последние десятилетия было установлено, что специфические пептиды, присутствующие в сброженном молоке, обладают АСЕ-ингибирующей способностью и могут способствовать снижению кровяного давления у лиц, страдающих гипертензией. В настоящее время многочисленными испытаниями ίη νίίτο и в нескольких испытаниях на животных продемонстрированы ингибирующие АСЕ эффекты различных пептидов, получаемых из разных источников белка. Хотя анализы ингибирования АСЕ ίη νίίτο выявили множество разных пептидных последовательностей, следует подчеркнуть, что ингибирующие АСЕ пептиды для проявления своего эффекта ίη νίνο должны циркулировать в крови. Следствием этого является то, что эффективные ингибирующие АСЕ пептиды должны быть устойчивы к распаду в результате действия желудочно-кишечной протеолитической системы переваривания и должны оставаться интактными при последующем транспорте через кишечную стенку.

Структурно-функциональное исследование различных АСЕ-ингибирующих пептидов привело к мысли, что их С-концевой последовательностью часто бывает Рго-Рго, А1а-Рго или А1а-Нур (Магиуата 8. апб 8ихик| Н., 1982; Лдпс. Вю1. Сйет., 46(5), 1393-1394). Это обнаружение частично объясняется тем фактом, что АСЕ является пептидилдипептидазой (ЕС3.4.15.1), не способной расщеплять пептидные связи, в которых участвует пролин. Таким образом, из трипептида со структурой Хаа-Рго-Рго дипептид РгоРго не может быть удален из-за невозможности разрыва связи Хаа-Рго. Отсюда можно допустить, что, если трипептиды со структурой Хаа-Рго-Рго присутствуют в относительно высоких концентрациях, они будут ингибировать активность АСЕ. Поскольку не только АСЕ, но и почти все протеолитические ферменты с трудом расщепляют связи Хаа-Рго и Рго-Рго, идея о том, что присутствие (множества) пролиновых остатков на карбокситерминальном конце пептидов придает молекулам относительную устойчивость к протеазе, является почти самоочевидной. Аналогичным образом, относительно протеазоустойчивыми являются пептиды, содержащие вместо пролина гидроксипролин (Нур). Из этого можно заключить, что пептиды, имеющие на своем карбокситерминальном конце один или более гидроксипролиновых остатков, имеют возможность избежать протеолитического распада в желудочно-кишечном тракте. Эти заключения помогут нам понять замечательный понижающий кровяное давление ίη νί\Ό эффект

- 1 016396 специфических АСЕ-ингибирующих пептидов: они не только отвечают структурным требованиям для ингибирования АСЕ, но и устойчивы к разрушению желудочно-кишечной протеолитической пищеварительной системой и остаются интактными при последующем транспорте через кишечную стенку.

Имеются сообщения о высокой АСЕ-ингибирующей активности трипепдидов Ееи-Рго-Рго (ЛР 02036127), Уа1-Рго-Рго (ЕР 0583074) и 11е-Рго-Рго (1. Иану 8сЦ 78: 777-783 (1995)). Вначале все АСЕингибирующие пептиды характеризовали на основе их ίη у1уо эффекта на активность АСЕ и из них выделялись трипептиды 11е-Рго-Рго (далее обозначаемые 1РР), Уа1-Рго-Рго (далее обозначаемые УРР) и ЕеиРго-Рго (далее обозначаемые ЬРР) по их сильному АСЕ-ингибирующему эффекту, результатом чего являются относительно низкие значения концентрации ингибирования 1С50. Позднее предполагаемые антигипертензивные эффекты трипептидов УРР, так же как и 1РР, удалось подтвердить на спонтанно гипертензивных крысах (Иакашига е1 а1., 1. Иа1ту 8ск, 78: 1253-1257 (1995)). В этих экспериментах ингибирующие трипептиды получали из сброженного молочно-кислыми бактериями коровьего молока. В процессе брожения молока целевые пептиды продуцируются с помощью протеиназ, продуцируемых растущими молочно-кислыми бактериями. Недостатком этого ферментативного метода является то, что молочно-кислые бактерии являются живыми организмами, у которых трудно контролировать тип и количество экскретируемых ферментов. Продуцирование АСЕ-ингибирующих пептидов является, таким образом, трудно воспроизводимым и при этом мало вероятно, что продуцируется оптимальный набор ферментов, обеспечивающих максимальный выход требуемых пептидов. К тому же относительно велико необходимое время ферментации, что в сочетании с низкими выходами определяет неблагоприятную стоимостную структуру для биоактивных пептидов. Более того, сброженный продукт в меньшей степени пригоден для непосредственного введения в твердые пищевые продукты и создает строгие органолептические ограничения. Плохая вкусовая привлекательность таких сброженных молочных продуктов и множество связанных с переработкой трудностей, возникающих при выделении АСЕ-ингибирующих пептидов из таких ферментационных бульонов, описаны в И8 6428812. Несмотря на эти недостатки, сброженные молочные продукты нашли свое практическое применение в качестве применяемого внутрь вазодепрессанта. АСЕ-ингибирующие пептиды концентрируют из сброженных молочных продуктов с помощью электродиализа, диализа на мембранах полых волокон или хроматографических методов, позволяющих вывод этих пептидов на рынок в виде концентрированных пищевых добавок типа таблеток или лепешек.

Названные выше недостатки способа ферментативного производства были признаны, в частности, в патентных заявках \¥О 01/68115 и ЕР 1231279. В последней заявке описан чисто ферментный способ выделения из молочного казеина трипептидов Уа1-Рго-Рго и 11е-Рго-Рго. Заявка претендует на способ продуцирования этих трипептидов перевариванием материала, содержащего казеин молока, протеиназой и пептидазой через некоторый промежуточный пептид. Каждая из таких ферментных инкубаций может занять до 12 ч и осуществляется в условиях, благоприятствующих разрастанию микробных загрязнителей. Перед инкубацией с пептидазой промежуточный пептид предпочтительно очищают и высокие концентрации АСЕ-ингибирующих пептидов могут быть получены только после дополнительной стадии хроматографической очистки промежуточного пептида.

Краткое описание изобретения

В научной литературе много различных пептидов и гидролизатов коррелировали с эффектами снижения кровяного давления. Кроме того, известно много физиологических механизмов, участвующих в регулировании кровяного давления. Согласно настоящему изобретению вовлеченные пептиды и физиологические механизмы минимизируются в результате выбора подходящего белкового субстрата, который после гидролиза даст пептидную фракцию, содержащую 1РР в качестве главного снижающего кровяное давление компонента. Установлено, что предпочтительным исходным материалом для такой пептидной фракции является каппа-казеин и более предпочтительно гликомакропептид (СМР) из каппаказеина. В получаемой таким образом снижающей кровяное давление пептидной смеси или фракции особенно важную роль играет 1РР. В отличие от способов гидролиза предшествующего уровня техники, которые дают смеси 1РР, УРР и многих других потенциально биоактивных пептидов, настоящий способ имеет целью продуцирование 1РР, предотвращая, таким образом, например, продуцирование УРР. Согласно настоящему изобретению в качестве исходных белков используются преимущественно белки с молекулярным весом ниже 20 кДа, предпочтительно ниже 10 кДа, включающих в свою аминокислотную последовательность 1-Р-Р-. Как упоминалось выше, предпочтительным белковым субстратом является СМР. Он может быть получен из каппа-казеина, как описано в заявке ниже. Предпочтительным источником каппа-казеина является коровье молоко. Можно также использовать молоко и других млекопитающих, например козье молоко, если СМР-часть молекулы каппа-казеина включает последовательность -1РР. Поскольку не все каппа-казеины могут быть расщеплены химозином быка, получение СМР-части может потребовать применения более подходящего свертывающего фермента.

В настоящем изобретении раскрывается применение белков (или смесей белков или пептидов), имеющих в своих аминокислотных последовательностях по меньшей мере в 6 раз больше присутствующих -Ι-Р-Р- по сравнению с -У-Р-Р- Предпочтительно, чтобы последовательность -У-Р-Р- отсутствовала в белковой или пептидной последовательности (или в последовательности белковых или пептидных сме

- 2 016396 сей, используемых в качестве субстрата для гидролиза). Предпочтительным источником белка является белок или пептид, не содержащий -У-Р-Р-, или смесь белков и пептидов, содержащих такой белок, который не содержит -У-Р-Р-. Таким образом, смесь предпочтительно содержит по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно не менее 95 вес.% белка(ов) или пептидов, которые не содержат -У-Р-Р-. Более предпочтительно, чтобы последовательность -У-Р-Р- была частью последовательности -Р-У-Р-Р- или -А-У-РР-. Предпочтительным примером такого белка является СМР (гликомакропептид), получаемый из коровьего молока.

Одной из целей настоящего изобретения является получение снижающего кровяное давление пептида 1РР в чистом состоянии, т.е. без значительного загрязнения пептидом УРР.

Другой целью настоящего изобретения является получение снижающего кровяное давление пептида 1РР в высококонцентрированной форме без применения дорогостоящих операций очистки.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение снижающего кровяное давление пептида 1РР в негорьком составе. Этот негорький состав обладает преимущественно интенсивностью горечи, равной 2 или меньше, как это определено в примере 8.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание ферментного способа, который избирательно извлекает 1РР из СМР-части каппа-казеина, предпочтительно с использованием пролинспецифичной протеазы, более предпочтительно пролинспецифичной эндопротеазы и наиболее предпочтительно пролинспецифичной эндопротеазы при кислотном оптимуме рН.

Целью настоящего изобретения является также создание ферментного способа, который селективно продуцируется 1РР из СМР и в котором СМР вначале инкубируют с аминопептидазой и затем (предпочтительно в условиях, при которых аминопептидаза теряет свою активность) с пролинспецифичной протеазой.

Целью настоящего изобретения является также создание композиции, содержащей 1РР, в составе которой не присутствуют опиоидные пептиды.

Целью настоящего изобретения является также создание композиции, содержащей 1РР в гипоаллергенном составе.

Целью настоящего изобретения является также создание композиции, содержащей 1РР в пептидной смеси со степенью гидролиза ниже 30%, предпочтительно ниже 20% и более предпочтительно ниже 15%.

Целью настоящего изобретения является также создание композиции, содержащей гидролизат, который содержит 1РР и характеризуется степенью гидролиза ниже 30%, предпочтительно ниже 20% и более предпочтительно ниже 15%. Гидролизат имеет предпочтительно степень гидролиза по меньшей мере 1% и более предпочтительно по меньшей мере 2%.

Целью настоящего изобретения является также создание композиции, содержащей 1РР и имеющей уровни свободных аминокислот, не превышающие 10 вес.%, предпочтительно не превышающие 7% и наиболее предпочтительно не превышающие 3%.

Целью настоящего изобретения является также создание способа выделения СМР-части каппаказеина из осажденного кислотой казеина.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает применение композиции настоящего изобретения или применение композиции, получаемой настоящим способом, в качестве нутрацевтика, предпочтительно лекарственного средства, для производства нутрацевтика, предпочтительно лекарственного средства, для улучшения здоровья или профилактики и/или лечения болезней или для производства нутрацевтика, предпочтительно лекарственного средства, для лечения или профилактики болезней, таких как высокое кровяное давление (гипертензия), сердечная недостаточность, потенциальный диабет или диабет, ожирение, нарушенная толерантность к глюкозе или стресс.

Композиция изобретения имеет преимущественно форму пищевой добавки, форму средства индивидуального ухода, включая сюда местное применение в виде лосьона, геля или эмульсии, или ингредиента пищи, корма или пищи для домашних животных.

Композиция изобретения может также использоваться для производства функционального пищевого продукта для поддержания здоровья сердечно-сосудистой системы, которое (поддержание здоровья сердечно-сосудистой системы) преимущественно включает ингибирование ангиотензинконвертирующего фермента или регуляцию уровней холестерина в крови.

Композиция изобретения может также использоваться в функциональном пищевом продукте, способном оказывать оздоровительное действие на его потребителя, преимущественно в виде профилактики ожирения, регуляции веса тела и поддержания здоровья сердечно-сосудистой системы.

Функциональный пищевой продукт преимущественно содержит один или более из витаминов В или от 3 до 25 вес.% стерола.

Изобретение предлагает также способ приготовления пищевого продукта, напитка или пищевой добавки, включающий приготовление композиции изобретения или композиции, получаемой способом изобретения, и введение указанной композиции в пищевой продукт, напиток или пищевую добавку.

Пищевой продукт, напиток или пищевую добавку выбирают преимущественно из группы маргаринов, паштетов, масла, молочных продуктов или напитков, содержащих молочную сыворотку, преимуще

- 3 016396 ственно продуктов на основе йогурта или молока, таких как йогурт или молоко.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу, в котором пептид ΙΡΡ образуется с высокими выходами из предпочтительно низкомолекулярного белка, имеющего в своей аминокислотной последовательности -Ι-Ρ-Ρ- в большем по сравнению с -У-Р-Р-количестве. Используют преимущественно каппа-казеин и более предпочтительно ΟΜΡ-часть каппа-казеина. Способ включает преимущественно одну стадию инкубации фермента. Хотя способ согласно изобретению высоко специфичен к используемому белковому субстрату, для получения снижающей кровяное давление активности в относительно чистом состоянии могут быть использованы различные протеолитические ферментные препараты. Могут использоваться подходящие протеолитические ферментные препараты, начиная от отдельного фермента до сложной ферментной смеси. Предпочтительно использование отдельного фермента, расщепляющего карбоксильный конец пролина и предпочтительно, чтобы этот фермент был пролинспецифичной протеазой или пролинспецифичной олигопептидазой. Молекула субстрата предпочтительно включает в себя последовательность -Α-Ι-Ρ-Ρ- или -Ρ-Ι-Ρ-Ρ-. Может быть также использована пролинспецифичная эндопротеаза в комбинации с подходящей аминопептидазой. В последнем случае вначале предпочтительно инкубируют ΟΜΡ-содержащую фракцию в условиях, предпочтительно близких к нейтральным, например при рН от 5 до 8, с аминопептидазой. Такой путь позволяет также использовать субстраты, включающие последовательность -Χ-Ι-Ρ-Ρ-, в которой X может представлять остаток любой аминокислоты. После инактивации аминопептидазы или в условиях рН, когда аминопептидаза не активна, усеченную по Ν-концу молекулу ΟΜΡ предпочтительно инкубируют с пролинспецифичной протеазой. Предпочтительно, чтобы протеаза, которая расщепляет карбоксиконец пролина, такая как пролинспецифичная протеаза, а также аминопептидазная активность не содержали каких-либо примесных эндопротеазных активностей. Пролинспецифичная эндопротеаза, не содержащая примесной эндопротеазной активности, представляет собой ферментный препарат, имеющий отношение пролинспецифичной активности к эндопротеазе преимущественно более 1, более предпочтительно выше 100. Аминопептидазная активность, которая не содержит примесной эндопротеазной активности, представляет собой ферментный препарат, имеющий отношение аминопротеаза/эндопротеаза преимущественно не менее 0,1, более предпочтительно не менее 0,5 и наиболее предпочтительно не менее 1. Пролинспецифичная эндопротеаза, которая не содержит примесной карбоксипептидазной активности, представляет собой ферментный препарат, имеющий отношение пролинспецифичной активности к карбоксипептидазе преимущественно не менее 1 и более предпочтительно не менее 10.

Аминопептидазная активность, которая не содержит примесной карбоксипептидазной активности, представляет собой ферментный препарат, имеющий отношение аминопептидаза/карбоксипептидаза преимущественно не менее 0,1 и более предпочтительно не менее 0,3. Приведенные выше отношения определены, как описано в примере 5.

Преимущественно по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60% и наиболее предпочтительно не менее 70% присутствующих в белке последовательностей -Ι-Ρ-Ρ- превращаются в пептид ΙΡΡ. Пролинспецифичная протеаза способна гидролизовать преимущественно большие белковые молекулы, подобные самому субстратному белку. Способ согласно изобретению включает, как правило, время инкубации менее 24 ч, предпочтительно же время инкубации составляет меньше 10 ч и более предпочтительно менее 4 ч. Температура инкубации, как правило, выше 30°С, предпочтительно выше 40°С и более предпочтительно выше 50°С. Другим аспектом настоящего изобретения является способ очистки содержащей ΙΡΡ пептидной смеси декантированием, центрифугированием или фильтрацией с образованием растворимого гидролизата.

Настоящее изобретение далее раскрывает пептидную композицию, содержащую от 1 до 5 мг/г ΙΡΡ (в расчете на сухой вес и на белок) или от 20 до 50 мг/г ΙΡΡ (в расчете на сухой вес и на белок) и пептидную композицию, включающую 15-90% (на сухой вес материала) пептидов, содержащих по меньшей мере 20 мг/г ΙΡΡ (в расчете на сухой вес и на белок), предпочтительно от 20 до 100 мг/г ΙΡΡ (в расчете на сухой вес и на белок).

В предшествующем уровне техники ΙΡΡ, ΜΡΡ и ΤΡΡ описаны как эффективные ингибиторы АСЕ. Насколько можно судить по известным аминокислотным последовательностям, сывороточные белки коровьего молока не содержат аминокислотные последовательности, соответствующие какому-либо из этих трех ингибирующих АСЕ трипептидов. Следовательно, пептиды ΙΡΡ, ΜΡΡ и ΕΡΡ не могут быть выделены из сывороточных белков. Однако эти пептиды, действительно, встречаются в казеиновой фракции коровьего молока. Например, бета-казеин включает последовательности -Ι-Ρ-Ρ- (74-76), -У-Ρ-Ρ- (8486), а также -Ь-Ρ-Ρ- (84-86). В то же время каппа-казеин включает -Ι-Ρ-Ρ-, но не включает две другие последовательности. Последовательность ΙΡΡ в каппа-казеине находится в положении 109-110, т.е. [на расстоянии] в несколько карбокситерминальных аминокислот от уникального химозинового центра расщепления в каппа-казеине: Ρ1ιο(105)-ΜοΙ(106). Таким образом, последовательность -Ι-Ρ-Ρ- находится в каппа-казеине в ΟΜΡ-части этой молекулы. Изобретателями было установлено, что в прокоагулировавшем под действием фермента молоке принадлежащий каппа-казеину фрагмент ΙΡΡ может находиться в осаж

- 4 016396 денной казеиновой фракции сырной сыворотки прокоагулировавшего под действием кислоты молока.

Несмотря на то что по весу каппа-казеин не представляет собой значительную фракцию казеина, изобретатели отметили, что с молекулярной точки зрения ее присутствие является вполне значимым. Например, бета-казеин присутствует в концентрации почти 400 ммоль на 1 м³ молока, а каппа-казеин - в концентрации 180 ммоль на 1 м³ молока. В сырной сыворотке СМР также представляет значительную фракцию. В то время как концентрация суммы сывороточных белков составляет 320 ммоль на 1 м³, СМР присутствует в концентрации 400 ммоль на 1 м³ сырной сыворотки.

Неожиданным образом оказалось, что СМР можно легко получить. Согласно настоящему изобретению, СМР может быть селективно высвобожден из осажденных кислотой казеинов с помощью ферментной обработки химозином в определенных пределах рН. Хотя выделение СМР из сырной сыворотки представляет большие трудности, известны промышленные способы, с помощью которых получают сывороточные фракции, обогащенные СМР. Эти промышленно доступные обогащенные СМР фракции, получаемые с помощью упомянутых известных способов, находят в настоящее время применение для разнообразных нутрацевтиков.

В настоящем изобретении описывается применение СМР в качестве предпочтительного исходного материала для получения понижающего кровяное давление 1РР в высокочистом состоянии.

Белковая фракция молока содержит, как правило, мицеллярную казеиновую фракцию и солюбилизированную фракцию сывороточных белков. Среди сывороточных белков наиболее значительными в количественном отношении являются бета-лактоглобулин и альфа-лактальбумин. Среди казеиновых белков количественно преобладают относительно гидрофобные альфа- и бета-казеины. Мицеллы казеина сохраняются в растворе с помощью каппа-казеина. Гидрофильная часть каппа-казеина, так называемый гликомакропептид (СМР), выступает над поверхностью мицелл, стабилизируя тем самым гидрофобные казеины в водном растворе.

Согласно ряду хорошо разработанных промышленных способов казеиновую фракцию можно выделять из молока, например при производстве сыра. В одном из таких способов молоко подкисляют, в результате чего казеиновая фракция избирательно отделяется из молока. Осажденный кислотой материал включает все казеины, т. е. альфа-, бета-, каппа- и гамма-казеины. Неосажденную фракцию подкисленного молока называют молочной сывороткой. Согласно другим способам молоко инкубируют с коагулирующим молоко ферментом, например химозином теленка (реннетом). Химозин представляет собой протеазу, которая очень селективно расщепляет пептидную связь Рйе(105)-Ме1(106) каппа-казеина. С помощью этой реакции гидрофильная СМР-часть каппа-казеина расщепляется, что приводит к немедленной агрегации и осаждению фракции мицеллярного казеина. В этом случае осажденную фракцию казеина называют творогом. В то время как в этом ферментном способе СМР-часть каппа-казеина отделяется, гидрофильный фрагмент СМР остается в растворе вместе с различными сывороточными белками, образуя так называемую сырную или сладкую сыворотку.

В различных публикациях заявляется о физиологических преимуществах употребления молочных фракций, обогащенных СМР. Кроме того, существуют многочисленные публикации, описывающие экономически выгодные способы выделения обогащенных СМР фракций сырной сыворотки. Например, в ЕР 1037537 описывается применение ультрафильтрации, а в И8 6787158 применение анионной смолы.

Один из аспектов настоящего изобретения связан с применением в качестве понижающего кровяное давление агента гидролизата СМР. Установлено, что относительно высокий уровень 1РР и других пептидов, имеющих карбокситерминальный пролин в СМР, может иметь отношение к эффекту снижения кровяного давления.

Под гидролизатом подразумевается продукт, который образуется при гидролизе субстратного белка (белковый гидролизат или гидролизованный белок) и при этом растворимым гидролизатом является (водо)растворимая фракция белкового гидролизата, которая описывается здесь как композиция, содержащая растворимый пептид, или композиция, содержащая растворимые пептиды, или смесь белкового гидролизата и растворимого гидролизата.

Пептид или олигопептид определяется в патенте как цепь по меньшей мере из двух аминокислот, которые соединены пептидными связями. Термины пептид или олигопептид рассматриваются как синонимы (как это обычно считается) и каждый из терминов может использоваться на основе взаимозаменимости, как того требует контекст. Полипептид или белок определяются в изобретении как цепь, содержащая более 30 аминокислотных остатков. Все формулы (олиго)пептидов и полипептидов или входящих в них последовательностей записаны слева направо в направлении от амино-конца к карбокси-концу, как это принято в широкой практике. Используемый в изобретении однобуквенный код широко принят в данной области знаний и может быть найден в ЗатЬтоок е1 а1. (Мо1еси1аг С1ошид: а 1аЬота1оту тапиа1, 2иб еб. Со1б Зртшд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬога1огу Ртезз, Со1б Зртшд НагЬог, ΝΥ, 1989).

Опиоидными пептидами являются пептиды, которые могут связываться с опиатными рецепторами.

Международно принятые схемы для классификации и номенклатуры всех ферментов из ГОМВ (Международный союз по биохимии и молекулярной биологии) включают протеазы. Обновленный текст 1ИМВ, касающийся ЕС-номеров для протеаз, можно найти на интернет-сайте:

- 5 016396

1Шр://\у\у\у.с11ет.с.|т\\7ас.ик/ц1ЬтЬ/епхуте/ЕС3/4/11/. В этой системе ферменты определяются тем фактом, что они катализируют единственную реакцию. Отсюда следует важный вывод, что несколько разных белков описываются как один и тот же фермент, а белок, который катализирует более чем одну реакцию, рассматривается как более чем один фермент. Система классифицирует протеазы как эндо- и экзопротеазы. Эндопротеазами являются такие ферменты, которые гидролизуют внутренние пептидные связи, а экзопротеазы гидролизуют пептидные связи, примыкающие к концевой α-аминогруппе (аминопетидазы), или пептидную связь между концевой карбоксильной группой и предпоследней аминокислотой (карбоксипептидазы). Эндопротеазы подразделяются на подклассы на основе каталитического механизма. Существуют подклассы сериновых эндопротеаз (ЕС 3.4.21), цистеиновых эндопротеаз (ЕС 3.4.22), аспарагиновых эндопротеаз (ЕС 3.4.23), металлоэндопротеаз (ЕС 3.4.24) и треониновых эндопротеаз (ЕС 3.4.25).

Аминопептидазы относятся к классу 3.4.11. Подразделение производится на основе относительной эффективности, с которой удаляются 20 различных аминокислот. Можно различать аминопептидазы с узкой и широкой специфичностью. Аминопептидазы могут последовательно удалять из белковых и пептидных субстратов одиночные аминоконцевые аминокислоты. Узкоспецифичные аминопептидазы проявляют сильное предпочтение к типу аминокислотного остатка в положении Р1, который отделяется от субстратного пептида. Аминопептидазы с широкой специфичностью способны отщеплять ряд различных аминокислот в Ν-концевом или Р1-положениях (согласно номенклатуре Шехтера: 8с11сс111сг I. Апб Вегдег А., 1967, Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип., 27, 157-162). Карбоксипептидазы могут последовательно удалять из белковых и пептидных субстратов одиночные карбоксиконцевые аминокислоты. Так же как и в ситуации с эндопептидазами, карбоксипептидазы подразделяются на подклассы на основе каталитического механизма. Карбоксипептидазы серинового типа относятся к классу ЕС 3.4.16, металлокарбоксипептидазы к классу ЕС 3.4.17 и карбоксипептидазы цистеинового типа к классу ЕС 3.4.18. Ценность спецификации ЕС для протеаз состоит в обеспечении стандартной терминологии для различных типов протеазной активности и в особенности в присвоении индивидуального идентификационного номера и рекомендуемого названия для каждой протеазы.

ОМР-часть молекулы каппа-казеина представляет собой полипептид длиной в 64 аминокислотных остатка. Если весь 1РР выделен количественно, получение чистого ОМР может дать концентрацию 1РР почти 5 вес.% без значительных примесей как УРР, так и БРР. В настоящем изобретении описаны несколько протеолитических способов выделения из полипептида ОМР трипептида 1РР, возможно в одну стадию и с высокими выходами. Таким образом, согласно способу изобретения можно получить композицию, содержащую 1РР, в которой концентрация 1РР достаточно высока для применения композиции непосредственно или непосредственно после стадии простой очистки, т. е. без необходимости в сложном и дорогостоящем процессе очистки типа хроматографического выделения или очистки.

Согласно первому протеолитическому способу выделенную молекулу ОМР инкубируют с комплексными препаратами микробного протеазного фермента типа Шпшхуте ЕР (8йш Νΐιοη). или Е1ауонгхуте (ΝΟνΟ), или итанн/уте (Атапо). Шпш/уте ЕР, Е1ауонг/уте и итанн/уте являются ферментными препаратами, содержащими различные эндопротеолитические ферменты плюс экзопротеолитические активности типа аминопептидаз и карбоксипептидаз. Путем тщательной подборки дозировки фермента и условий рН авторам удалось получить трипептид 1РР в одну инкубационную стадию с использованием либо препарата Шпш/уте ЕР, либо препарата Е1ауонг/уте. Однако недостатком этой первой протеолитической стратегии является то, что в результате присутствия различных ферментных активностей может образовываться ряд различных пептидов. Кроме того, образуются относительно большие количества аминокислот, которые в случае непроведения последующей очистки придадут конечному 1РР-содержащему продукту привкус мясного бульона.

Согласно второму протеолитическому способу выделенную молекулу ОМР инкубируют с пролинспецифичной олигопептидазой (ЕС 3.4.21.26) или пролинспецифичной эндопептидазой. Этим путем с успехом используется уникальная специфичность этих двух типов ферментов. Оба типа пролинспецифичных протеаз гидролизуют преимущественно пептидные связи С-концевых пролиновых остатков. Однако свойственная этим двум типам ферментов побочная активность направлена на гидролиз Сконцевых аланиновых остатков. Поскольку присутствующей в ОМР последовательности -1-Р-Р- предшествует с Ν-конца остаток аланина, инкубация ОМР с чистой пролинспецифичной олигопептидазой или чистой пролинспецифичной эндопептидазой непосредственно образует 1РР. Важным преимуществом такого пути является то, что получение 1РР не сопровождается образованием большого количества других пептидов, что могло бы стать причиной очень горьких привкусов и даже вызвать нежелательные проявления биоактивности. При этом в обсуждаемом процессе почти не образуются свободные аминокислоты, благодаря чему получают продукт с приятным вкусом, обладающий высокой концентрацией 1РР.

Согласно еще одному протеолитическому способу выделенную молекулу ОМР вначале инкубируют с аминопептидазой с целью удаления Ν-концевых аминокислот ОМР (Ме! и А1а), предшествующих в ОМР последовательности 1РР. Только после этой инкубации к реакционной смеси добавляют пролинспецифичную протеазу для отщепления пептида 1РР. Предпочтительно, чтобы во время или после инку

- 6 016396 бации с пролинспецифичной протеазой аминопептидаза уже не была активной. Нами было установлено, что такой путь приводит к более высоким выходам ΙΡΡ и при этом не приводит к образованию привкусов и вряд ли влияет на количество аминокислот, содержащихся в конечном продукте. Кроме того, ΙΡΡ присутствует в большом количестве по сравнению с другими пептидами, в частности по сравнению с трипептидами. Полученный ΙΡΡ может быть затем отделен от более крупных пептидов. Поскольку аминопептидазы могут последовательно удалять аминокислоты с Ν-концевой стороны пептидов, необходима аминопептидолитическая активность, которая может эффективно отщеплять остатки метионина (М) и аланина (А), предшествующие последовательности ΙΡΡ. Было установлено, что пептидные связи Ι-Ρ и Р-Р устойчивы к пептидному расщеплению и после инкубации интактной молекулы ΟΜΡ такая аминопептидолитическая активность должна отрезать Ν-конец молекулы ΟΜΡ, начиная с последовательности ΙΡΡ.

Коммерческим ферментным препаратом, обладающим желаемой аминопептидазной активностью, является Сого1а§е БАГ (АВ спхушсх). Сого1а§е ΕΆΡ представляет собой относительно чистую клонированную и сверхэкспрессированную лейциновую аминопептидазную активность из АкрегдШик. Так как этот препарат не обладает неспецифической эндопротеолитической и карбоксипептидолитической активностями, этим самым предотвращается нежелательное расщепление субстратной молекулы ΟΜΡ. Другой клонированной и сверхэкспрессированной аминопептидазой с относительно широкой специфичностью является аминопептидаза из А.шдет (ЗЕф ΙΌ 171 в ОТО 02/068623).

Наконец, авторами было отмечено, что ΟΜΡ также успешно применяется в процессах, в которых ΙΡΡ образуется ферментативным путем. Как это проиллюстрировано в примерах, инкубация ΟΜΡ со специфическими лактобактериями 1ас1оЬас1Ш производит ΙΡΡ без появления привкусов, что является характерным для процессов сбраживания цельного молока.

Все указанные выше аспекты представляют особенную важность в связи с тем, что они позволяют получать высокостандартизованный продукт без нежелательных биоактивностей или профилей вкуса или запаха. Такой высокостандартизованный продукт может вводиться без последующих операций очистки в различные пищевые изделия или в концентрированные пищевые продукты типа таблеток или лепешек. Путем избирательного удаления пептидов отличных от ΙΡΡ могут быть получены высокостандартизованные продукты с еще более высокими концентрациями ΙΡΡ, например, в виде таблеток или лепешек меньшего размера. Такое удаление пептидов без значительной снижающей кровяное давление активности может быть выполнено, например, осаждением этих неактивных пептидов с последующей операцией (ультра)фильтрации или декантации. Еще один путь предполагает дополнительное повышение концентрации биоактивных ингредиентов с помощью последующей очистки, в которой прибегают к использованию очень гидрофобного характера пептида ΙΡΡ. Эти способы очистки включают нанофильтрацию, экстракцию, например бутанолом с последующими испарением/осаждением, или введением полученного подкисленного гидролизата в контакт со связующими типа активированного угля или хроматографическими смолами из серии АшЬегШе ΧΆΌ (Войш). Можно также использовать бутилсефарозу, поставляемую, например, фирмой Ρΐιηηηηάη. Десорбцию снижающих кровяное давление пептидов с указанных материалов можно производить органическими растворителями, такими как метанол/этанольные смеси или пропанол. Для получения высокоочищенных биоактивных пептидов можно применять последующую сверхкритическую экстракцию с использованием СО₂ или Ν₂Ο.

В ЕР 1231279 описан чисто ферментный способ выделения трипептидов νΡΡ и ΙΡΡ из молочного казеина. Изобретение претендует на способ получения трипептидов путем переваривания материала, содержащего молочный казеин с помощью протеиназы и пептидазы через так называемый промежуточный пептид, выбираемый из группы, состоящей из пептида, содержащего последовательность -ν-Ρ-Ρ-, но не содержащего Бго кроме Ριό. содержащегося в этой последовательности, а также пептида, содержащего последовательность -Ι-Ρ-Ρ-, но не содержащего Ριό кроме Ριό. содержащегося в этой последовательности. Как описано в примере ЕР 1231279, способ включает в себя двухстадийный процесс. Прежде всего получают пептиды, включающие в себя либо ΕΡΡ, либо ΙΡΡ. Это осуществляется инкубированием казеина с подходящей протеиназой, согласно одному из примеров, при 37°С в течение 12-часового периода. Затем используемую протеиназу инактивируют нагреванием этого первого гидролизата в течение 3 мин до 100°С и после охлаждения добавляют другой ферментный препарат, а именно препарат с экзопротеолитической активностью. После последующей инкубации в течение 12 ч при 37°С с этим другим ферментным препаратом может быть продемонстрировано присутствие трипептидов νΡΡ и ΙΡΡ. Для получения более высоких выходов АСЕ-ингибирующих пептидов в ЕР 1231279 далее предлагается очищать и концентрировать промежуточный пептид перед тем, как воздействовать на него экзопротеолитической активностью. В ЕР 1231279 также предлагается возможность проведения при этом после получения промежуточного пептида и перед вводом промежуточного пептида в контакт с пептидазой разных операций, таких как удаление непрореагировавшего белка, например центрифугированием в течение 310 мин при 5000-20000 об/мин. Таким путем сложную смесь целевых трипептидов получают, используя довольно громоздкий для промышленного масштаба двухстадийный ферментный процесс. Поскольку каждая из ферментных инкубаций может занимать до 12 ч при рН от 4,5 до 7,0 и температуре от 25 до 50°С, является очевидным, что эта процедура неприемлема также и с микробиологической точки зрения.

- 7 016396

Такие большие времена инкубации в сочетании с низкой температурой инкубации (от 25 до 50°С) могут легко привести к инфицированию содержащего белок раствора.

По сравнению с описанными в ЕР 1231279 методами удобство операций изобретения, приведенных в данной заявке, становится очевидным. Прежде всего, в настоящей заявке описывается применение только фрагмента СМР каппа-казеина. В результате этого отщепляется только ΙΡΡ, а многие другие, потенциально очень горькие пептиды, содержащиеся, как это известно, в казеине, не образуются. Вовторых, инкубация согласно настоящему изобретению с использованием пролинспецифичной протеазы осуществляется в одной, чисто ферментной стадии. Благодаря очень избирательному характеру расщепления пролинспецифичной протеазой, что присуще этой специфической эндопротеазе, целевой пептид ΙΡΡ отщепляется немедленно вместе с очень ограниченным числом других пептидов. Неожиданным образом, не образуется никакого промежуточного пептида, о котором сообщается в ЕР 1231279. Втретьих, инкубация согласно настоящему изобретению, в котором СМР-фрагмент казеина вначале инкубируют с чистой аминопептидазой и затем с пролинспецифичной протеазой, существенно отличается от схемы, описанной в ЕР 1231279, и тем не менее очень эффективно отщепляет ΙΡΡ с минимальными уровнями примесных пептидов и свободных аминокислот. Инкубацию предпочтительно начинают не с протеиназы, а с аминопептидазы (пептидазы, согласно ЕР 1231279) и при этом не образуется промежуточного пептида. На следующей стадии вместо протеиназы используют эндопротеазу и вновь без образования промежуточного пептида.

Несмотря на все отмеченные для продуктов предшествующего уровня техники недостатки, сброженные молочные продукты нашли практическое применение в качестве применяемого внутрь вазодепрессанта. АСЕ-ингибирующие пептиды концентрируют из сброженных молочных продуктов с помощью электродиализа, диализа на мембранах полых волокон или хроматографических методов, позволяющих их отправку на рынок в виде концентрированных пищевых добавок типа таблеток или лепешек.

Одной из целей настоящего изобретения является получение пептида ΙΡΡ в чистом состоянии, т.е. без значительного загрязнения пептидами νΡΡ или ΕΡΡ.

Другой целью настоящего изобретения является получение пептида ΙΡΡ в высококонцентрированной форме без применения дорогостоящих операций очистки.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение снижающего кровяное давление пептида ΙΡΡ в негорьком составе.

Настоящее изобретение относится к пептидсодержащей композиции для применения в качестве нутрацевтика, предпочтительно лекарственного средства. Изобретение также относится к применению настоящей пептидсодержащей композиции для производства нутрацевтика, предпочтительно лекарственного средства, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для улучшения здоровья или профилактики и/или лечения болезней, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для производства нутрацевтика, предпочтительно лекарственного средства, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, таких как гипертензия и сердечная недостаточность, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для лечения потенциального диабета или диабета, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для лечения или профилактики ожирения, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для повышения инсулина плазмы или повышению чувствительности к инсулину плазмы, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для повышения инсулина плазмы или повышению чувствительности к инсулину плазмы диабета 2-го типа или потенциального диабета, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для снижения концентраций глюкозы в крови после принятия пищи при диабете 2-го типа или потенциальном диабете, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для повышения секреции инсулина в крови после принятия пищи при диабете 2-го типа или потенциальном диабете, к применению настоящей пептидсодержащей композиции, где настоящая пептидсодержащая композиция имеет форму пищевой добавки, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для производства функционального пищевого продукта для терапевтического лечения последствий стресса, к применению настоящей пептидсодержащей композиции для местного нанесения, преимущественно в качестве средства индивидуального ухода, и к применению настоящей пептидсодержащей композиции в пище и корме для домашних животных.

Кроме того, настоящее изобретение относится к методу лечения диабетов 1-го и 2-го типов и к профилактике диабета 2-го типа у лиц с потенциальным диабетом или нарушением толерантности к глюкозе (1СТ), который состоит в применении лицам, нуждающимся в таком лечении, настоящей пептидсодержащей композиции, и к методу лечения лиц, страдающих гипертензией или сердечной недостаточностью, или их профилактики, которые состоят в применении лицам, нуждающимся в таком лечении, настоящей пептидсодержащей композиции и, таким образом, к проявлению эффектов снижения кровяного давления. Ингибирование АСЕ приводит к уменьшению сужения сосудов, усиленному расширению сосудов, улучшенной экскреции натрия и воды, что, в свою очередь, приводит к снижению периферического сосудистого сопротивления кровяного давления при улучшенном местном кровотоке. Таким образом, пептидсодержащие гидролизаты настоящего изобретения особенно эффективны для профилактики и лечения болезней, на которые может влиять ингибирование АСЕ, в число которых входят (но не огра

- 8 016396 ничивают собой эти болезни) гипертензия, сердечная недостаточность, стенокардия, инфаркт миокарда, инсульт, обструктивное заболевание периферических артерий, атеросклероз, нефропатия, почечная недостаточность, эректильная дисфункция, эндотелиальная дисфункция, гипертрофия левого желудочка, диабетическая васкулопатия, отек и гиперальдостеронизм. Композиции могут также оказаться полезными для профилактики и лечения желудочно-кишечных расстройств (диарея, синдром раздраженной кишки), воспаление, сахарный диабет, слабоумие, эпилепсия, гериартрическая спутанность и болезнь Меньера. Кроме того, композиции могут усиливать когнитивную функцию и память (включая болезнь Альцгеймера), чувство насыщения, предельное ишемическое повреждение и предотвращать повторную закупорку артерии после байпасной хирургии и ангиопластики.

Сахарный диабет является широко распространенным хроническим заболеванием, которое до сих пор не излечивается. Степень распространения и частота случаев сахарного диабета возрастают экспоненциально, и он находится в числе наиболее частых метаболических расстройств в развитых и развивающихся странах. Сахарный диабет является комплексным заболеванием, происходящим от различных каузативных факторов и характеризующийся нарушением углеводного, белкового и жирового метаболизма, сопровождаемым недостаточной секрецией инсулина и/или резистентностью к инсулину. Результатом этого является повышенное голодание и возникающие после приема пищи концентрации сывороточной глюкозы, которые в отсутствие лечения приводят к осложнениям. Существуют две основные категории этого заболевания: инсулинозависимый сахарный диабет (ΙΌΌΜ, Τ1ΌΜ) и инсулиннезависимый сахарный диабет (ΝΙΌΌΜ, Τ2ΌΜ). ТЮМ=сахарный диабет первого типа, Т2ЭМ=сахарный диабет второго типа.

Диабеты Τ1ΌΜ и Τ2ΌΜ сопровождаются гипергликемией, гиперхолестеролемией и гиперлипидемией. Абсолютный дефицит инсулина и нечувствительность к инсулину при Τ1ΌΜ и Τ2ΌΜ соответственно приводят к снижению использования глюкозы печенью, мышечной и жировой тканью и к повышению уровней кровяной глюкозы. Неконтролируемая гипергликемия сопровождается повышенной и преждевременной смертностью, обусловленной повышенным риском микрососудистых и макрососудистых заболеваний, включая нефропатию, нейропатию, ретинопатию, гипертензию, инсульт и сердечную болезнь. Недавние свидетельства показали, что строгий гликемический контроль является основным фактором в профилактике этих осложнений как в случае Τ1ΌΜ, так и в случае Τ2ΌΜ. Следовательно, оптимальный гликемический контроль с помощью лекарственных средств и терапевтических режимов является важным направлением лечения диабета.

Терапия Τ2ΌΜ в своем начале включает изменения в питании и стиле жизни. Когда же эти меры более не обеспечивают гликемический контроль, больных лечат вводимыми внутрь гипогликемическими агентами и/или экзогенным инсулином. Существующие пероральные фармакологические агенты для лечения Τ2ΌΜ включают такие агенты, которые усиливают секрецию инсулина (сульфонилмочевинные агенты), агенты, которые улучшают действие инсулина в печени (бигуанидиновые агенты), инсулинсенсибилизирующие агенты (тиазолидиндионы), и агенты, которые ингибируют поглощение глюкозы (ингибиторы оглюкозидазы). Однако существующие в настоящее время агенты обычно не могут обеспечивать должный гликемический контроль в течение длительного времени из-за прогрессирующего обострения гипергликемии, приводящего к постепенной утрате функции панкреатических клеток. Доля пациентов, способных поддерживать требуемые уровни гликемии, резко падает во времени, что вынуждает применять дополнительные/альтернативные фармакологические агенты. Кроме того, лекарства могут проявлять нежелательные побочные эффекты и сопровождаются высокими степенями первичных и вторичных отказов. Наконец, применение гипогликемических лекарств может быть эффективным при контроле уровней кровяной глюкозы, но не может предотвратить все осложнения диабета. Таким образом, существующие методы лечения всех типов сахарного диабета не могут достичь идеалов нормогликемии и предотвратить диабетические осложнения. Следовательно, хотя предпочтительные методы терапии при лечении Τ1ΌΜ и Τ2ΌΜ основаны в основном на применении инсулина и пероральных гипогликемических лекарств, для лечения и профилактики диабета существует потребность в безопасной пищевой добавке с минимумом побочных эффектов. Многие пациенты заинтересованы в альтернативных методах терапии, которые бы свели к минимуму побочные эффекты, связанные с высокими дозами лекарств, и имели бы дополнительные клинические преимущества. Пациенты с сахарным диабетом особо заинтересованы в лечении, считающемся натуральным, с мягким антидиабетическим действием и без значительных побочных эффектов, которое можно было бы использовать в качестве адъювантного лечения. Τ2ΌΜ является прогрессирующей и хронической болезнью, которая обычно не распознаваема до тех пор, пока не возникнет значительное повреждение панкреатических клеток, ответственных за продукцию инсулина (β-клетки островков Лангерганса). Отсюда повышенный интерес к разработке пищевой добавки, которая могла бы быть использована для профилактики повреждений β-клеток и, таким образом, развития открытого Τ2ΌΜ у подверженных ему лиц, особенно у пожилых лиц с высоким риском развития Τ2ΌΜ. Защитить панкреатические β-клетки можно снижением кровяной глюкозы и/или уровнем липидов, так как глюкоза и липиды оказывают повреждающее действие на β-клетки. Снижения уровней кровяной глюкозы можно достичь с помощью различных механизмов, например усилением окисления ли

- 9 016396 пидов и/или депонирования липидов. Другой возможной стратегией защиты панкреатических β-клеток могло бы быть снижение окислительного стресса. Окислительный стресс также вызывает повреждение β-клеток с последующим прекращением секреции инсулина и развитием открытого Τ2ΌΜ.

Таким образом, Τ2ΌΜ является сложным заболеванием, возникающим в результате сосуществующих дефектов во множестве органных участков: резистентность к действию инсулина в мышечных и жировых тканях, нарушенная секреция панкреатического инсулина, избыточная продукция гепатической глюкозы. Эти дефекты часто сопровождаются липидными аномалиями и эндотелиальной дисфункцией. Вследствие многочисленных патофизиологических нарушений при Τ2ΌΜ привлекательным путем для их преодоления является комбинированная терапия.

Настоящее изобретение относится к новым нутрацевтическим композициям, включающим пептидсодержащую композицию настоящего изобретения. Нутрицевтические композиции, включающие пептидсодержащую композицию настоящего изобретения, могут также включать негидролизованные белки и углеводы в качестве активных ингредиентов для лечения и профилактики сахарного диабета или других состояний, связанных с нарушенной толерантностью к глюкозе, например синдрома X. В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению таких композиций в качестве пищевой добавки для указанного лечения или профилактики, например в качестве добавки к поливитаминным препаратам, включающим витамины и элементы, которые являются незаменимыми для поддержания нормальной метаболической функции, но не синтезируются в организме. В еще одном аспекте изобретение относится к методу лечения обоих типов 1 и 2 сахарного диабета и для профилактики Τ2ΌΜ у лиц с потенциальным диабетом или нарушенной толерантностью к глюкозе (ΙΟΤ) или ожирением, который (метод) включает введение лицу, нуждающемуся в таком лечении, пептидсодержащей композиции настоящего изобретения и белковых гидролизатов или негидролизованных белков и/или углеводов.

Композиции настоящего изобретения особенным образом предназначены для лечения как Τ1ΌΜ, так и Τ2ΌΜ и для профилактики Τ2ΌΜ у индивидуумов с потенциальным диабетом или нарушенной толерантностью к глюкозе (ΙΟΤ).

Установлено, что пептидсодержащие композиции могут быть использованы для диабета 2-го типа и для потенциального диабета, преимущественно для снижения концентраций глюкозы после приема пищи или для повышения секреции инсулина в крови после приема пищи.

Композиции, содержащие пептид и, возможно, углеводы, стимулируют секрецию инсулина и повышают расход глюкозы в чувствительных к инсулину тканях-мишенях, таких как жировые ткани, скелетные мышцы и печень и, таким образом, проявляют синергетические эффекты при лечении сахарного диабета.

Является общепризнанным, что обусловленные стрессом болезни и негативное действие стресса на организм в значительной степени затрагивают множество людей. В последние годы воздействие стресса и его участие в развитии различных заболеваний и состояний получило широкое признание медицинским и научным сообществом.

Потребитель в настоящее время становится все более и более осведомленным об этих потенциальных проблемах и становится все больше и больше заинтересованным в уменьшении или предупреждении негативного влияния стресса на свое здоровье.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание пищевого продукта или ингредиента, который может в него вводиться, который был бы пригоден для применения в качестве помощи организму, подверженному негативным эффектам стресса.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание пищевого продукта, включающего настоящую пептидсодержащую композицию, который оказывал бы благотворное влияние на здоровье, например, оказывая помощь организму, подверженному негативным эффектам стресса.

Используемый в изобретении термин нутрацевтический означает полезное действие как в пищевой, так и в фармацевтической области применения. Таким образом, нутрацевтические композиции могут найти применение в качестве добавки к пище или напиткам, а в качестве фармацевтических составов или лекарственных средств - для энтерального и парентерального применения, причем это могут быть твердые составы типа капсул или таблеток или жидкие составы, такие как растворы или суспензии. Как явствует из изложенного выше, выражение нутрацевтическая композиция также включает в себя пищу или напитки, включающие настоящую пептидсодержащую композицию и, возможно, углеводы, а также композиции добавок, например пищевые добавки, содержащие указанные выше ингредиенты.

Используемый в изобретении термин пищевая добавка означает принимаемый через рот продукт, который содержит пищевой ингредиент, предназначенный в качестве добавки к пище. Пищевыми ингредиентами в этих продуктах могут быть витамины, минералы, травы и другие ботанические материалы, аминокислоты и вещества, такие как ферменты, органные ткани, вещества желез и метаболиты. Пищевые добавки могут быть также экстрактами или концентратами и иметь при этом разные формы, такие как таблетки, капсулы, мягкие гели, желатиновые капсулки, жидкости и порошки. Они могут быть также и в других формах, таких как брусок, но в этом случае информация на этикетке пищевой добавки не будет, как правило, представлять продукт как обычную пищу или единственный компонент еды или диеты.

- 10 016396

С целью получения адекватного количества незаменимого питательного вещества, отсутствующего в некоторых диетах, к нутроцевтическим композициям настоящего изобретения можно добавлять какуюлибо поливитаминную или минеральную добавку. Поливитаминная или минеральная добавка может быть также полезной для профилактики болезни и защиты от пищевых потерь и недостаточности, обусловленных моделями образа жизни и в целом неадекватными моделями питания, наблюдаемыми иногда в случае диабета. Кроме того, в развитие резистентности к инсулину может оказаться вовлеченным оксидантный стресс. Реакционноспособные разновидности кислорода могут нарушать стимулируемое инсулином поглощение глюкозы, возмущая сигнальный каскад инсулинового рецептора. При лечении диабета может оказаться ценным контроль оксидантного стресса с помощью антиоксидантов, таких как отокоферол (витамин Е) и аскорбиновая кислота (витамин С). Таким образом, к названным выше активным веществам можно присовокупить прием поливитаминной добавки для поддержания хорошо сбалансированного питания.

Наряду с этим для улучшения здоровья и профилактики и/или лечения заболеваний, включающих (но не ограничиваемых ими) сердечно-сосудистые болезни и диабет, можно использовать сочетание настоящей пептидсодержащей композиции с минералами, такими как магний (Мд), кальций (Са⁴⁴) и/или калий (К⁴).

Согласно одному из предпочтительных аспектов изобретения нутроцевтическая композиция настоящего изобретения включает настоящие пептидсодержащие композиции. ΙΡΡ содержится в композиции согласно изобретению в количестве, обеспечивающем суточную дозу от примерно 0,001 до примерно 1 г на 1 кг веса тела индивидуума, которому предписано вводить эту дозу. Пища или напиток соответственным образом содержат от примерно 0,05 до примерно 50 г ΙΡΡ на один прием. Если нутроцевтическая композиция является фармацевтическим составом, такой состав может содержать ΙΡΡ в количестве от примерно 0,001 до примерно 1 г в дозировочной единице, например в капсуле или таблетке, или от примерно 0,035 до примерно 70 г в суточной дозе жидкого состава. Настоящие пептидсодержащие композиции присутствуют, таким образом, в композиции согласно изобретению в количестве, обеспечивающем суточную дозу от примерно 0,01 до примерно 3 г на 1 кг веса тела индивидуума, которому предписано вводить эту дозу. Пища или напиток соответственным образом содержат от примерно 0,1 до примерно 100 г белкового гидролизата на один прием. Если нутроцевтическая композиция является фармацевтическим составом, такой состав может содержать пептидсодержащие композиции в количестве от примерно 0,01 до примерно 5 г в дозировочной единице, например в капсуле или таблетке, или от примерно 0,7 до примерно 210 г в суточной дозе жидкого состава.

Согласно еще одному из предпочтительных аспектов настоящего изобретения композиция содержит настоящий пептид, как описано выше, и, возможно, углеводы. Углеводы содержатся в композиции согласно изобретению преимущественно в количестве, обеспечивающем суточную дозу от примерно 0,01 до примерно 7 г на 1 кг веса тела индивидуума, которому предписано вводить эту дозу. Пища или напиток соответственным образом содержат от примерно 0,5 до примерно 200 г белкового гидролизата на один прием. Если нутроцевтическая композиция является фармацевтическим составом, такой состав может содержать углеводы в количестве от примерно 0,05 до примерно 10 г в дозировочной единице, например в капсуле или таблетке, или от примерно 0,7 до примерно 490 г в суточной дозе жидкого состава.

Предельные дозировки (для реципиента весом 70 кг):

ΙΡΡ: 0,005-70 г/сутки (каждые);

Белковые гидролизаты: 0,07-210 г/сутки;

Негидролизованные белки: 0,07-210 г/сутки;

Углеводы: 0,1-490 г/сутки.

Одной из целей изобретения является создание съедобного материала, который можно было бы использовать для улучшения здоровья употребляющих его лиц. Еще одной целью изобретения является создание такого съедобного материала, который было бы удобно есть либо в отдельном виде, либо введенным в какой-либо пищевой продукт.

Еще одной целью изобретения является создание пищевого продукта или ингредиента, который может быть в него введен и который был бы пригоден для применения в программах регулирования веса тела.

Еще одной целью изобретения является создание пищевого продукта или ингредиента, который может быть в него введен, который бы мог способствовать поддержанию здоровья сердечно-сосудистой системы, например путем ингибирования АСЕ.

Еще одной целью изобретения является создание пищевого продукта или ингредиента, который может быть в него введен, который бы имел приемлемые стабильность и/или органолептические свойства, в частности приятный вкус при отсутствии или приемлемом уровне горечи.

Еще одной целью изобретения является создание пищевого продукта, имеющего высокую концентрацию улучшающего здоровье ингредиента, в частности способствующего предотвращению ожирения/регулирования веса тела и/или способствующего поддержанию здоровья сердечно-сосудистой системы.

- 11 016396

Неожиданным образом, одна или более из этих цели оказались достижимыми, согласно изобретению, путем применения настоящей пептидсодержащей композиции для приготовления пищевого продукта, который оказывает при его употреблении полезное действие на здоровье.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение предлагает применение настоящей пептидсодержащей композиции для приготовления функционального пищевого продукта для предотвращения ожирения или регулирования веса тела.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение предлагает применение настоящей пептидсодержащей композиции для приготовления функционального пищевого продукта для поддержания здоровья сердечно-сосудистой системы.

Особенно предпочтительно согласно настоящему изобретению, чтобы поддержание здоровья сердечно-сосудистой системы включало ингибирование ангиотензин-конвертирующего фермента (АСЕ) и/или контролирование уровней кровяной глюкозы.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение предлагает функциональный пищевой продукт, способный оказывать полезное действие на здоровье его потребителя, которым (полезным действием) может быть предотвращение ожирения, регулирование веса тела и поддержание здоровья сердечнососудистой системы, включающий пептидсодержащую композицию.

Еще одним преимуществом пептидсодержащей композиции согласно настоящему изобретению является то, что пептидсодержащая композиция может легко вводиться в пищевые продукты, в результате чего получают функциональные пищевые продукты без неприемлемого воздействия на стабильность и/или органолептические свойства.

Агентами, оказывающими полезное действие на здоровье, согласно настоящему изобретению являются материалы, которые оказывают полезное действие на здоровье, т. е. которые при их употреблении оказывают положительное влияние на аспект здоровья или которые способствуют поддержанию аспекта хорошего здоровья, причем этими аспектами хорошего здоровья являются предотвращение ожирения, регулирование веса тела и поддержание здоровья сердечно-сосудистой системы.

Полезное действие на здоровье означает положительное влияние на аспект здоровья или способствование поддержания аспекта хорошего здоровья.

Функциональные пищевые продукты определяются согласно настоящему изобретению, как пищевые продукты (включающие, чтобы избежать сомнений, и напитки), пригодные для употребления человеком, в которых пептидсодержащая композиция настоящего изобретения используется в качестве ингредиента в количестве достаточном для того, чтобы была достигнута ощутимая польза для здоровья потребителя этого пищевого продукта.

Используемое в изобретении выражение содержащий не подразумевает ограничения каким-либо указанным вслед за этим элементом, а, напротив, допускает включения не указанных элементов, обладающих большей или меньшей функциональной значимостью. Иными словами, стадии (операции), элементы или варианты не должны быть исчерпывающими. Используемые во всех случаях слова включающий или имеющий должны подразумевать эквивалент определенному выше выражению содержащий.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение ферментного способа, в котором из ОМР-части каппа-казеина избирательно вырезается ΙΡΡ, преимущественно с использованием пролинспецифичной протеазы, более предпочтительно пролинспецифичной эндопротеазы и наиболее предпочтительно пролинспецифичной эндопротеазы при кислотном оптимуме рН.

Целью настоящего изобретения является также предложение способа выделения ОМР-части каппаказеина из осажденного кислотой казеина.

Эффективно снижающий кровяное давление пептид ΙΡΡ имеет на своем карбокситерминальном конце два пролиновых остатка. Поскольку известно, что пептидные связи, в которые входят пролиновые остатки, устойчивы к протеолитическому расщеплению, наличие двух пролиновых остатков в пептидах, снижающих кровяное давление, должно придавать таким пептидам повышенную стойкость к протеолитическому распаду. Этот аспект увеличивает вероятность того, что соответствующий трипептид избежит полного гидролиза при инкубации с комплексными ферментными препаратами. Аналогичным образом, вероятно и то, что ΙΡΡ выдержит желудочно-кишечное переваривание, в результате чего эти пептиды обладают лучшим шансом достичь кровяного русла оставаясь интактными. Применение протеазы, способной производить расщепление на карбокситерминальной стороне пролиновых остатков, предлагает интересную возможность получения пептидов по меньшей мере с одним, но преимущественно с несколькими пролиновыми остатками на карбокситерминальном конце. Так называемые пролилолигопептидазы (ЕС 3.4.21.26) обладают уникальной способностью предпочтительно расщеплять пептиды на карбоксильной стороне пролиновых остатков и, хотя и с более низкой эффективностью, на карбоксильной стороне аланина. Во всех адекватным образом охарактеризованных пролинспецифичных протеазах, выделенных из материалов млекопитающих, а также из микробных источников, был идентифицирован уникальный домен пептидазы, который исключает большие пептиды из активного центра фермента. Фактически эти ферменты не способны разлагать полипептиды, содержащие более чем примерно 30 аминокислотных остатков, в связи с чем эти ферменты в настоящее время называют пролилолигопепти

- 12 016396 дазами (Еи1ор с1 а1.: Се11, νοί. 94, 161-179, 1и1у 24, 1998). Вследствие этого, для этих пролилолигопептидаз, прежде чем они смогут проявить свое гидролитическое действие, требуется продолжительный предварительный гидролиз с другими эндопротеазами. Однако, как описано в \УО 02/455234, даже комбинация пролилолигопептидазы с такого рода другой эндопротеазой дает гидролизаты, характеризующиеся значительно повышенной пропорцией пептидов с карбокситерминальным пролиновым остатком. Наряду с этим, такие гидролизаты представляют собой великолепный исходный материал для выделения пептидов с АСЕ-ингибирующими эффектами ίη νίίτο, а также повышенной стойкостью к гастроинтестинальному протеолитическому распаду. Несмотря на эти потенциальные преимущества, нам не известны заявки, в которых было бы описано применение пролинспецифичных протеаз для выделения снижающих кровяное давление пептидов, не говоря уже о селективном производстве ΙΡΡ.

В XV О 02/455234 описывается пролинспецифичная протеаза, которая может быть получена из АзрегдШиз шдег. Получаемый из А. шдег фермент расщепляет предпочтительно у карбоксильного конца пролина и, хотя и с более низкой эффективностью, у карбоксильного конца аланина. В XVО 02/455234 также сообщается, что между этим выделенным из А. шдег ферментом и известными пролилолигопептидазами из других микробных источников или материалов млекопитающих не существует четкой гомологии. В отличие от известных пролилолигопептидаз фермент из А. шдег имеет кислотный оптимум рН. Хотя известные пролилолигопептидазы, так же как и фермент, полученный из А. шдег, являются так называемыми сериновыми протеазами, в примере 1 нами показано, что фермент из А. шдег принадлежит к совершенно другому подсемейству. Секретируемый фермент из А. шдег является, судя по всему, членом семейства 828 сериновых пептидаз, а не семейства 89, в которое была занесена большая часть цитозольных пролилолигопептидаз (Ва\\'1тд5 Ν.Ό. апб ВаггеИ А.1., ВюсЫт. Вюрйуз. Ас1а 1298 (1996), 1-3).

В примере 2 нами показаны оптимумы рН и температуры полученной из А. шдег пролинспецифичной олигопептидазы в сравнении с пролинспецифичной олигопептидазой, свежеполученной из микроорганизма Е1ауоЬас!егшт тептдозербсит. Покрывающие белок водные растворы очень чувствительны к микробным инфекциям, особенно если их выдерживают в течение многих часов при значениях рН выше 5,0 и температурах 50°С или ниже. Особую потенциальную опасность для пищевых процессов представляют микробные токсины, которые могут образовываться во время таких продолжительных операций инкубации и способны выдерживать последующие операции нагрева. В отличие от условий, описанных в ЕР 1231279, в способе согласно настоящему изобретению применяется температура инкубации выше 50°С. В сочетании с одностадийным ферментным способом, в котором ферментную инкубацию проводят в течение периода менее 24 ч, предпочтительно менее 8 ч и более предпочтительно 4 ч, способ настоящего изобретения дает преимущество в отношении улучшенной микробиологической стабильности.

В примере 3 показано то, что получаемый из А. шдег ферментный препарат при его использовании в способе настоящего изобретения проявляет очень узкую субстратную специфичность, что свидетельствует об отсутствии значительной эндопротеолитической активности, отличной от той, которая направлена на пептидные связи, в которых задействован остаток пролина или аланина. В примере 4 настоящего изобретения нами показано, что фермент АзрегдШиз является не олигопептидазой, а настоящей эндопептидазой, способной гидролизовать интактные белки, большие пептиды, а также менее крупные пептидные молекулы без необходимости в дополнительной эндопротеазе. Это новое и неожиданное открытие позволяет нам избежать применения дополнительной эндопротеазы, благодаря чему могут образовываться гидролизаты с беспрецедентно высоким содержанием пептидов с карбокситерминальным пролиновым остатком. Кроме того, неприменение дополнительной эндопротеазы является предпочтительным, поскольку в этом случае образуется очень ограниченное число пептидов в результате гидролиза либо полипептидов, либо олигопептидов. Благодаря этому получаются относительно простые пептидные смеси, характеризующиеся тем, что большая часть присутствующих пептидов имеет карбокситерминальный остаток пролина.

В примере 5 охарактеризованы ферментные препараты, применяемые в категориях имеющихся эндопротеолитической, аминопептидолитической и карбоксипептидолитической активностей. В то время как пролинспецифичная эндопротеаза обладает незначительными побочными активностями, препараты 8и1шху1пе ΕΡ и Ркщоигхуте представляют собой богатый источник множества различных ферментных типов.

В примере 6 описан альтернативный путь к выделению ΟΜΡ, т.е. выделению из продажного казеината. Применяя пролинспецифичную эндопротеазу, извлекается также ΙΡΡ из выделенного таким образом ΟΜΡ. Тот факт, что получаемый из А. шдег фермент не содержит значительной аминопептидазной активности (см. пример 5), сильно свидетельствует о том, что образующийся ΙΡΡ отщепляется из содержащейся в каппа-казеине последовательности ^107-1108^109^110-. Предположительно пептидная связь, являющаяся карбокситерминальной от ΙΡΡ, расщепляется за счет главной активности пролилолигопептидазы из А. шдег. в то время как расщепление предшествующей связи А1а-11е осуществляется за счет А1а-специфичной побочной активности. Преимущество такого пути состоит в том, что после избирательного удаления ΟΜΡ оставшаяся казеинатная фракция может использоваться для альтернативных целей.

В примере 7 показано, что для высвобождения ΙΡΡ из продажного ΟΜΡ могут быть использованы

- 13 016396 как пролинспецифичная эндопротеаза, так и комплексный препарат διιιηίζνιηο ЕР. Такой состав преимущественно содержит от 0,1 до 100 мг/г 1РР (в расчете на сухой материал и на белок), более предпочтительно от 1 до 50 мг/г 1РР (в расчете на сухой материал и на белок) и наиболее предпочтительно от 2 до 35 мг/г 1РР (в расчете на сухой материал и на белок). Было также установлено, что в случае применения пролинспецифичной эндопротеазы гидролиз СМР приводит к композиции, содержащей трипептид 1РР и тетрапептид Т8ТР в почти идентичных количествах. Таким образом, настоящее изобретение относится также к композиции, содержащей 1РР и Т8ТР, в котором мольное отношение 1РР/Т8ТР составляет от 1,5 до 0,5, преимущественно от 1,3 до 0,7 и более предпочтительно от 1,2 до 0,8. Предпочтительно содержание в этой композиции от 0,1 до 100 мг/г 1РР (в расчете на сухой вес и на белок), более предпочтительно от 1 до 50 мг/г 1РР (в расчете на сухой вес и на белок) и наиболее предпочтительно от 2 до 35 мг/г 1РР (в расчете на сухой вес и на белок).

В примере 8 демонстрируются органолептические преимущества применения гидролизата СМР.

В примере 9 дается иллюстрация того, что применение СМР обеспечивает также возможность получения 1РР-содержащих продуктов ферментативным путем.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с предшествующем уровнем техники. Наиболее важным является то, что способ настоящего изобретения приводит к меньшему разнообразию водорастворимых пептидов, а из этих водорастворимых пептидов 1РР присутствует в преобладающих количествах. Это особенно важно в том случае, когда для продукта с приятным вкусом необходима высокая концентрация 1РР. Согласно настоящему способу, преимущественно не менее 20%, более предпочтительно не менее 30% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 40% присутствующей в белке последовательности -А-1-Р-Р- превращается в 1РР.

После гидролиза раствор может быть нагрет. рН раствора может быть изменен, либо же раствор может быть смешан с растворителями.

Согласно одному из аспектов изобретения растворимые пептиды, включая 1РР, которые образуются во время гидролиза источника белка, отделяют и при необходимости сушат. После, например, декантации, фильтрации и низкоскоростного центрифугирования для удаления образовавшегося осадка супернатанты, содержащие биологически активные растворимые пептиды, могут быть выделены с помощью, например, обратного осмоса или упаривания, возможно с дополнительной стадией фильтрации, за которой может следовать стадия распылительной сушки, что предоставляет экономичный путь для получения пасты или порошка пищевой категории с высокой биоактивностью и хорошей растворимостью в воде. После дигерирования подходящего субстратного белка с высокой концентрацией 1РР пролинспецифичной эндопротеазой получают белый непахучий порошок с высокой концентрацией 1РР и неожиданно низкой степенью гидролиза.

Гидролизаты изобретений с успехом используются в применениях в качестве нутрацевтиков, пищи и напитков. В применении в качестве нутрацевтиков, пищи и напитков могут быть использованы белковый гидролизат, растворимый гидролизат, а также их смесь. Благодаря высокому содержанию в нем активных пептидов предпочтительно использовать в применениях в качестве нутрацевтиков, пищи и напитков растворимый гидролизат.

При надлежащем разбавлении до нужной концентрации трипептидов получают универсальный исходный материал с прекрасной вкусовой привлекательностью, который может придавать всем типам пищи и напитков способность снижать кровяное давление.

Пептидная смесь, полученная либо до, либо после дополнительной стадии очистки, например хроматографии, может быть использована для ввода в пищевые продукты, которые широко потребляются на регулярной основе. Примерами таких продуктов являются маргарины, паштеты, различные молочные продукты, такие как масло или йогурты, или молоко, или напитки, содержащие молочную сыворотку, выпеченные изделия, такие как кексы и булочки, жидкая пища, такая как супы, а также леденцы, заменители сахара и кусковой сахар. Благодаря очень приятному вкусу 1РР-содержащих гидролизатов согласно изобретению возможно введение гидролизата во все виды напитков, включая бутылочную столовую воду, безалкогольные напитки, спортивные напитки, фруктовые соки, лимонады и быстрорастворимые чай и кофе.

Спортивный напиток представляет собой напиток, который предназначен для восстановления уровня влаги у спортсменов, а также для восполнения электролитов, сахара и других питательных компонентов. Спортивные напитки обычно являются изотоническими, что означает то, что они содержат те же самые пропорции питательных компонентов, которые содержатся в человеческом организме (источник: 1Шр://сп.\у|крсб1а.огд/\у|к|/8рог15_бппк).

Энергетические напитки представляют собой напитки, которые содержат (разрешенные) стимуляторы, витамины (в частности витамины В) и минералы с целью вызвать у пользователя прилив энергии. В число обычных ингредиентов входят кофеин, гуарана (кофеин из растения гуарана), таурин, разные формы женьшеня, мальтодекстрин, инозит, карнитин, креатин, глюкуронолактон и гинкго. Некоторые напитки могут содержать высокие уровни сахара или глюкозы. Многие из таких напитков содержат вкусоароматические добавки и/или красители (источник: Ьйр://еп/ет1креб1а.огд/^1к1/Епегду_бг1пк).

Безалкогольный напиток представляет собой напиток, который не содержит алкоголя в отличие от

- 14 016396 крепких напитков, которые его содержат. В основном это название применяется только к охлажденным напиткам. Горячий шоколад, чай и кофе не считаются безалкогольными напитками. Первоначально термин относился только к газированным напиткам и до сих пор все еще обычно применяется в этом смысле (источник: Ьйр://еп.те1креб1а.огд/те1к1/8ой_бг1ик).

Хотя такие композиции предназначаются, как правило, для людей, их можно также давать и животным, преимущественно млекопитающим, для смягчения гипертензии. Кроме того, высокая концентрация снижающего кровяное давление пептида в получаемых продуктах делает эти продукты очень полезными для введения в пищевые добавки в форме пилюль, таблеток или высококонцентрированных растворов, паст или порошков. Особый интерес представляют медленно высвобождающие пищевые добавки, обеспечивающие непрерывное высвобождение пептидов. Пептиды согласно изобретению могут быть сформулированы в виде сухого порошка, например, в форме пилюли, таблетки, гранулы, пакетика или капсулы. Альтернативным образом, пептидная смесь согласно изобретению может быть сформулирована в виде жидкости в виде, например, сиропа или капсулы. Композиции, применяемые в различных составах и содержащие ферменты согласно изобретению, могут включать в себя по меньшей мере одно соединение из группы, состоящей из физиологически приемлемого носителя, адъюванта, наполнителя, стабилизатора, буфера и разбавителя - термины, которые использованы здесь в их обычном смысле для указания веществ, которые способствуют упаковыванию, доставке, всасыванию, стабилизации или, в случае адъюванта, усилению физиологического эффекта. Необходимые сведения о различных соединениях, которые могут быть использованы в комбинации с пептидной смесью согласно изобретению в порошковой форме, можно найти в Рйагтасеийса1 Эокаде Еогтк, второе издание, тома 1, 2 и 3, ^ΒΝ 0-8247-8044-2 Магсе1 Эеккег. Шс. или в Кет1ид1ои'8 Рйагтасеибса1 8с1еисе5, 20-е издание, ^ййатк & ХУПкиъ. РА, И8А. Для применения внутрь преимущественно используются таблетки и капсулы, которые содержат подходящий связующий агент, например желатин или поливинилпирролидон, подходящий наполнитель, например лактозу или крахмал, подходящий смазочный агент, например стеарат магния, и, возможно, другие добавки.

Относительно новой формой для перорального применения являются разные типы желатиновых капсул или таблеток на основе желатина.

Дополнительным аспектом изобретения является получение гидролизата, который не содержит фенилаланина, триптофана и тирозина. При использовании в качестве исходного белка СМР получают гидролизат, в котором отсутствуют фенилаланин, триптофан и тирозин. Это делает гидролизат безопасным для индивидуумов с фенилкетоурией (РКИ).

С точки зрения пригодности природных пептидов для борьбы с гипертензией настоящий новый и экономичный способ предлагает новую основу для мягких гипотензивных пищевых или даже ветеринарных продуктов. Поскольку настоящий способ включает в себя простую стадию очистки, повышаются также возможности для снижающих кровяное давление пищевых добавок.

Способ согласно изобретению может быть осуществлен с использованием пролинспецифичной олиго- или эндопротеазы. Под пролинспецифичными олигопептидазами согласно изобретению или применяемыми согласно изобретению подразумеваются ферменты, относящиеся к ЕС 3.4.21.26. Под пролинспецифичной эндопротеазой согласно изобретению или применяемой согласно изобретению подразумевается пролинспецифичная эндопротеаза, принадлежащая к семейству 828 сериновых протеаз (Наибйоок ок Рго1ео1у11с Еи/ушек (Руководство по протеолитическим ферментам), редакторы ВаггеИ А.Й, Катейидк Ν.Ό, ^оеккиет ЙЕ., Асабетю Ргекк, йоибои, ИК, 1998, 369-415) или более предпочтительно полипептид, упоминаемый в пп.1-5, 11 и 13 в \УО 02/45524. Таким образом, эта пролинспецифичная эндопротеаза является полипептидом, который обладает пролинспецифичной эндопротеолитической активностью, выбираемым из группы, состоящей из:

(а) полипептида, который имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 40% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотами 2-526 последовательности 8ЕО ГО N0:2 или ее фрагмента;

(й) полипептида, который кодируется полинуклеотидом, гибридизующимся в слабо жестких условиях с (ί) нуклеотидной последовательностью 8ЕО ГО N0:1 или ее фрагментом, которые по меньшей мере на 80 или 90% идентичны по 60, предпочтительно по 100 нуклеотидам, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичны по 200 нуклеотидам или (и) нуклеотидной последовательностью комплементарной нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0: 1. 8Е0 ГО N0: 1 и 2 показаны в \УО 02/45524. Предпочтительно, чтобы полипептид был в изолированной форме.

Применяемый согласно настоящему изобретению предпочтительный полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% и еще более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичности с аминокислотами 2-526 8Е0 ГО N0: 2, или имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2.

Полипептид предпочтительно кодируется полинуклеотидом, гибридизующимся в слабо жестких условиях, более предпочтительно в средне жестких условиях и наиболее предпочтительно в очень жест

- 15 016396 ких условиях с (ί) нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0: 1 или ее фрагментом или (ίί) нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0:1.

Выражение способный гибридизоваться означает, что целевой полинуклеотид изобретения может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, используемой в качестве зонда (например, нуклеотидной последовательностью, представленной в 8Е0 ГО N0: 1 или ее фрагменте, или комплементе 8Е0 ГО N0: 1), на уровне значительно выше фонового. Изобретение включает также полинуклеотиды, которые кодируют пролинспецифичную эндопротеазу изобретения, а также нуклеотидные последовательности, ей комплементарные. Нуклеотидной последовательностью могут быть РНК и ДНК, включая геномную ДНК, синтетическую ДНК или сДНК. Предпочтительно, чтобы нуклеотидной последовательностью была ДНК и наиболее предпочтительно последовательность геномной ДНК. Как правило, полинуклеотид изобретения содержит непрерывную последовательность нуклеотидов, которая способна гибридизоваться в подобранных условиях с кодирующей последовательностью или комплементом к кодирующей последовательности 8Е0 ГО N0: 1. Такие нуклеотиды могут быть синтезированы согласно методам, хорошо известным в данной области техники.

Полинуклеотид изобретения может гибридизоваться с кодирующей последовательностью или комплементом к кодирующей последовательности 8Е0 ГО N0: 1 на уровне значительно выше фонового. Фоновая гибридизация может происходить, например, по причине присутствия в библиотеке сДНК других сДНК. Уровень сигнала, возникающего в результате взаимодействия между полинуклеотидами изобретения и кодирующей последовательностью или комплементом кодирующей последовательности 8Е0 ГО N0: 1, обычно по меньшей мере в 10 раз, преимущественно по меньшей мере в 20 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 50 раз и еще более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз интенсивнее взаимодействий между другими полинуклеотидами и кодирующей последовательностью 8Е0 ГО N0: 1. Интенсивность взаимодействия можно измерять, например, радиоактивным мечением образца, например с помощью ³²Р. Избирательной гибридизации можно достичь, используя слабо жесткие условия (0,3 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия при приблизительно 40°С), средне жесткие условия (например, 0,3 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия при приблизительно 50°С) и сильно жесткие условия (например, 0,3 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия при приблизительно 60°С).

Пакет и\УССС предоставляет программу ВЕ8ТНТ, которая может быть использована для расчета идентичности (например, при ее применении с ее установками по умолчанию).

Для расчета идентичности последовательности или для выстраивания последовательностей (как в случае идентифицирования эквивалентных или соответствующих последовательностей, например по их установкам по умолчанию) могут быть также использованы алгоритмы ΡΙΕΒυΡ и ВЬЛ8Т N.

Программное обеспечение для проведения анализов ВЬЛ8Т является общедоступным через Национальный центр биотехнологической информации (№1Еопа1 СсШсг Гог Вю1ес11по1оду шГогтайоп, ййр://те^ет.псЬ1.п1т.п1й.доу/). Этот алгоритм включает в себя предварительное идентифицирование пар последовательностей с высоким сродством (Η8Ρ§) путем идентифицирования коротких слов длиной в запрашиваемой последовательности, которая либо составляет пару, либо удовлетворяет некоторой положительно значимой пороговой оценке Т будучи выровненной со словом той же длины в последовательности базы данных. Т обозначает пороговую оценку соседнего слова. Эти начальные обращения к соседним словам выполняют роль затравок для начала поисков с целью найти содержащие их Η8Ρ§. Обращения к словам продлеваются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности пока повышается кумулятивная оценка выравнивания. Продление для обращения к словам в каждом направлении прекращается, когда кумулятивная оценка выравнивания падает на величину X от ее максимально достигнутого значения; кумулятивная оценка приближается к нулю или ниже вследствие накопления одного или более отрицательно оцениваемых выравниваний остатков; или при достижении конца какой-либо из последовательностей. Параметры ^, Т и X алгоритма ВЬЛ8Т определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе ВЬЛ8Т по умолчанию используется длина слова (^), равная 11, выравнивания с помощью оценочной матрицы ВЬ08иМ62 (В)=50, ожидание (Е)=10, М=5, N=4 и сравнение обеих цепей.

Алгоритм ВЬЛ8Т производит статистический анализ сходства между двумя последовательностями. Одной из мер сходства, которые предоставляет алгоритм ВЬЛ8Т, является наименьшая суммарная вероятность (ΡίΚ)), которая указывает на вероятность, с которой могло бы случайно произойти совпадение между нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, какая-либо последовательность считается подобной другой последовательности, если наименьшая суммарная вероятность в сравнении первой последовательности со второй последовательностью составляет величину менее примерно 1, предпочтительно менее примерно 0,1, более предпочтительно менее примерно 0,01 и наиболее предпочтительно менее примерно 0,001.

Штаммы рода ЛкрегдШшк имеют статус пищевой категории и считается, что получаемые из этих микроорганизмов ферменты имеют происхождение из безупречного источника пищевой категории. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления фермент секретируется продуцирующей его клеткой предпочтительнее чем несекретируемый так называемый цитозольный фермент. Этим путем ферменты могут выделяться из клеточного бульона в существенно чистом состоянии без дорогостоящих операций очистки. Фермент обладает преимущественно высоким сродством к субстрату в преобладаю

- 16 016396 щих условиях рН и температуры.

Описание фигур

Фиг. 1 - профили активности пролинспецифичной олигопептидазы Р.тгшпдокерйсит и пролинспецифичной эндопротеазы из А. шдег, измеренные на флуоресцентном субстрате 2-С1у-Рго-АМС в разных условиях рН. Флуоресценцию измеряли после выдержки в течение 30 мин при 37°С.

Фиг. 2 - профиль специфичности пролилэндопротеазы, полученной из А. шдег.

Фиг. 3 - гель-электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8О8-РАСЕ) интактного овальбумина и синтетического 27-мерного пептида после инкубации с хроматографически очищенной пролинспецифичной эндопротеазой из А. шдег.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Материалы и методы.

Съедобный натрий- и калий-казеинатный аэрозоль (88%) получен от ОМУ 1п1егпа1юпа1, Голландия. СМР получен от Апа, Дания (Ьасргобап ССМР-10. 1о1 по З340205). Синтетические хромогенные пептиды получали либо от Рерксап 8ук1етк В.У., Голландия, либо от ВасНет, Швейцария. Е1ауоигхуте 1000Ь Ва1сН НРИ00218 получен от ИОУОхутек (Дания), 8шшхуте РР от ЭНт №Ноп (Япония) и Сого1аке ЬАР СН.: 4123 от АВ Епхутек (Великобритания).

Пролинспецифичная эндопротеаза из А. шдег.

Сверхпродукция пролинспецифичной эндопротеазы из АкрегдШик пщег осуществлялась, как описано в \УО 02/45524. Активность фермента тестировали на синтетическом пептиде 2-С1у-Рго-рИа при 37°С в цитрат-фосфатном буфере, рН 4,6. За продуктом реакции следили спектрофотометрически при 405 нм. Единицу определяют как количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль п-нитроанилида в 1 мин при данных условиях тестирования и концентрации субстрата 0,37 мМ 2-С1у-Рго-рИа.

Хроматографическая очистка эндопротеазы, полученной из А. шдег.

Культуральный бульон, полученный при выращивании штамма пропродуцента А. шдег, был использован для хроматографической очистки протеазы с целью удаления возможно присутствующих там загрязняющих эндо- и экзопротеолитических активностей. С этой целью ферментационный бульон вначале центрифугируют для удаления основного объема грибковой массы, после чего супернатант пропускают через ряд фильтров с уменьшающимися размерами пор для удаления всех клеточных фрагментов. Наконец, полученный фильтрат разбавляют в десять раз 20 мМ ацетатом натрия, рН 5,1, и наносили на колонку с 0-8ерНагоке РР. Белки элюируют в градиенте от 0 до 0,4 М ИаС1 в 20 мМ ацетате натрия, рН 5,1. Пиковые фракции, проявляющие активность в отношении расщепления 2-С1у-Рго-рИа, собирают и объединяют согласно протоколу, описанному в \Уог1б 1оигпа1 МюгоЬю1оду & Вю1есНпо1оду 11, 209-212 (1995), но с несколько измененными условиями анализа. Принимая во внимание кислотный оптимум рН пролинспецифичной эндопротеазы из А. шдег, ферментный анализ проводят при рН 4,6 в цитратфосфатном буфере при 37°С. Объединение активных фракций с последующим концентрированием в конечном итоге дает препарат, который обладает единственной электрофоретической полосой в 808РАСЕ и одним хроматографическим пиком в НР 8ЕС (высокопроизводительная хроматография с исключенным объемом). Дополнительный анализ методом гидрофобной хроматографии подтвердил чистоту ферментного препарата.

Азот по Кьельдалю.

Общий азот по Кьельдалю измеряли с использованием проточно-инъекционного анализа. Аммиак, выделяющийся из содержащих белок растворов, количественно определяют при 590 нм, используя проточно-инъекционную систему ТесаЮг ΕΙΛ8ΤΛΚ 5000, оборудованную кассетой ΤΚΝ Ме1Ноб СаккеИе 5000-040, компьютером Репйит 4 с программой 8ОР1А и автоматическим пробоотборником ТесаЮг 5027 Аи!окатр1ег. Выбранное количество, соответствующее динамическому диапазону метода (от 0,5 до 20 мг Ν/л) помещают в варочную пробирку вместе с 95-97%-ной серной кислотой и запускают в аппарате (К|е11аЬ) программу дигерирования в течение 30 мин при 200°С и затем в течение 90 мин при 360°С. После ввода в систему Р1А8ТАК 5000 измеряют пик азота, на основании которого можно сделать заключение об измеренном количестве белка.

Аминокислотный анализ.

Точно взвешенный образец белкового материала растворяют в разбавленной кислоте и удаляют осадки центрифугированием на центрифуге Эппендорфа. Аминокислотный анализ проводят на прозрачном супернатанте согласно методу РюоТад, как это описывается в техническом руководстве Атшо Ас1б Апа1ук1к 8ук1ет оГ \Уа1ег (МйГогб МА, И8А). Для этой цели получают из жидкости подходящий образец, высушивают его и подвергают парофазному кислотному гидролизу, получая производные с помощью фенилизотиоцианата. Производные различных присутствующих аминокислот количественно определяют с помощью методов ВЭЖХ и производят подсчет суммарного уровня свободных аминокислот во взвешенном образце, включая производное 11е. Аминокислоты Сук и Тгр не включаются в данные, получаемые в этом анализе.

Хромато-масс-спектрометрический анализ ЬС/М8/М8.

Для количественного определения представляющих интерес пептидов, в том числе трипептидов 1РР, ЬРР и УРР, в ферментном белковом гидролизате, полученном с помощью ферментной смеси соглас

- 17 016396 но изобретению, использована ВЭЖХ с применением масс-спектрометра с ионной ловушкой (Т11сгтос.|ис51®. Вгеба, Голландия). Образующиеся пептиды разделяют на колонке с ΙηοΓίκίΙ 3 ΟΌ8 3,3 мм, 150x2,1 мм (Уапап Ве1дшт, Бельгия) в сочетании с градиентом 0,1%-ной муравьиной кислоты в воде Μίΐΐίρ (М1Шроге, ВебГогб, МА, И8А; Раствор А) и 0,1%-ной муравьиной кислоты в ацетонитриле (раствор В) для элюции. Градиент начинается со 100%-ного раствора А, поддерживаемого в течение 5 мин, после чего следует линейное повышение содержания раствора В до 5% в течение 10 мин, линейное повышение раствора В до 45% в течение 30 мин и незамедлительное возвращение к начальным условиям, которые с целью стабилизации выдерживаются в течение 15 мин. Вводимый отъем составлял 50 мкл, скорость потока 200 мкл/мин и температура колонки поддерживалась равной 55°С. Концентрация белка вводимого образца составляла приблизительно 50 мкг/мл.

Детальную информацию об индивидуальных пептидах получали с помощью предназначенного для представляющих интерес пептидов М8/М8 с использованием оптимальной энергии соударения, равной приблизительно 30%. Количественное определение проводили в режиме ЬС/М8/М8, используя с целью коррекции матричного эффекта режим положительной ионизации электрораспыления с ¹³С,¹⁵Ы-меченым стандартом, пользуясь калибровочной линией также на основе меченого внутреннего стандарта. Идентифицирование проводили по времени удерживания, иону-предшественнику и отношению характеристических фрагментаций.

Для настройки оптимальной чувствительности в М8-режиме и оптимальной фрагментации в М8/М8-режиме использовали трипептид ΕΡΡ (мол. масса 325,2), осуществляя постоянное вливание 5 мг/мл, что давало протонированную молекулу в М8-режиме и оптимальную энергию соударения примерно 30% в М8/М8-режиме, что приводило к образованию В- и Υ-ионных серий.

Перед проведением БС/М8/М8 ферментные белковые гидролизаты центрифугировали в течение 10 мин при комнатной температуре и 13000 об/мин, фильтровали через 0,22-мкм фильтр и разбавляли супернатант 1:100 водой МПКр.

Степень гидролиза (ЭН), получаемая при инкубации с разными протолитическими смесями, прослеживали с использованием быстрого теста ОРА (ΙΡ8, Уо1. 66, по. 5, 2001).

Пример 1.

Получаемый из А. шдег фермент представляет новый класс пролинспецифичных ферментов.

Из полной кодирующей последовательности предложенной в XVО 02/45524 пролинспецифичной эндопротеазы из А. шдег может быть выведена белковая последовательность из 526 аминокислот. Новизна фермента подтверждена ВЬАБТ-поисками баз данных, таких как δ^ίδδΡίΌΐ, ΡΙΒ и 1гЕМВЬ. К удивлению, между ферментом из А. шдег и известными пролилолигопептидазами нельзя было обнаружить четкой гомологии. Однако более детальное изучение аминокислотной последовательности выявило небольшую, но значимую гомологию с карбоксипептидазами Ριό-Х (ЕС 3.4.16.2) дипептидиламинопептидазами I (ЕС 3.4.14.2) и тимус-специфичной сериновой протеазой. Все эти ферменты были причислены к семейству 828 сериновых пептидаз (НапбЬоок оГ Ρ^оΐео1уΐ^с Епгушек, редакторы ВаггеИ А.к, ВаМтдк Ν.Ό., Vоеккηе^ Ι.Ρ., Асабетк ΡΐΌ55, Ьопбоп, ИК, 1998, 369-415). Между этими ферментами и эндопротеазой из А. шдег сохранена также конфигурация Οχ8ΥχΟ вокруг активного центра серина. Кроме того, члены семейства 828 имеют оптимум кислотного рН, имеют специфичность для расщепления карбокситерминальной стороны сериновых остатков и синтезируются с сигнальной последовательностью и пропептидом точно так же, как и пролинспецифичная эндопротеаза из А. шдег. Размер фермента из А. шдег также близок к размерам ферментов членов семейства 828. Таким образом, пролинспецифичная эндопротеаза из А. шдег, судя по всему, является членом семейства 828 сериновых протеаз, а не семейства 89, в которое входит большинство цитозольных пролилолигопептидаз, в том числе фермент, получаемый из Е1ауоЬас!егшт тттдокербсит. На основании этих структурных и физиологических признаков заключено, что фермент из А. шдег принадлежит к семейству сериновых протеаз 828, а не 89. Дополнительным признаком, который противоречит принадлежности фермента из пролилолигопептидаз, полученного из А. шдег, к семейству 89 является тот факт, что, несмотря на принадлежность цитозольных пролилэндопротеаз к последнему семейству, вновь идентифицированный фермент из А. шдег секретируется в ростовую среду. Настоящее сообщение является первым касательно выделения и охарактеризовывания члена семейства 828 из низшего эукариота.

Пример 2.

Спектры рН-активности пролинспецифичной эндопротеазы из А. шдег и пролинспецифичной олигопептидазы из Е. тешпдокербсит.

С целью продемонстрировать разницу в оптимумах рН, которая существует между пролинспецифичной эндопротеазой из АкрегдШик и пролинспецифичной олигопептидазой из Е1ауоЬас!егшт тешпдокерДсит, измерили их активности в различных условиях рН. Эндопротеаза из АкрегдШик была получена, как описано в разделе Материалы и методы. Олигопептидаза из Е1ауоЬас!егшт была приобретена у Ιί’Ν Вютебюа1к (35 единиц/мг, кат. № 32082, Огайо, США).

Для построения спектров рН-активности двух ферментов были приготовлены буферы с разными значениями рН. Буферы с диапазоном рН от 2,0 до 7,0 были приготовлены с использованием 0,1 М цит

- 18 016396 рата, буферы с диапазоном рН от 6,0 до 9,0 были приготовлены с использованием 0,1 М трис и буферы с диапазоном рН от 8,0 до 12,0 были приготовлены с использованием 0,2 М глицина. Требуемые значения рН подстраивали с помощью либо НС1, либо ΝαΟΗ. В качестве субстрата для обоих ферментов использован хромогенный синтетический пептид Ζ-ΟΕ-ΡΐΌ-ΑΜί.' (Ваейет, Швейцария). В каждую лунку (Сок(аг по. 3632 р1а1с5) вводили по 85 мкл буфера, 10 мкл раствора фермента и 5 мкл субстрата (4 мМ Ζ-61γΡΐΌ-ΛΜί.’ в 60%-ном метаноле). Конечная концентрация фермента из Р. Μеη^ηдο8еρΐ^еит составляла 0,21 мкг/мл (7,4 миллиединиц/мл). После смешения реакция протекала при 37,0°С в течение 30 мин и затем измеряли флуоресценцию на многолуночном планшетном считывающем устройстве СуЮПонг от ΡβΓδβρΐίνβ Вю5С1Спес5. Полученные сравнительные данные показаны на фиг. 1. Устанавливается также температурный оптимум пролилэндопротеазы. С этой целью очищенный ферментный препарат инкубируют в течение 2 ч в 0,1 М Να-ацетате, содержащем 0,02 моль/л СаС1₂, при рН 5,0 и разных температурах, используя в качестве субстрата Сакет РекогиГте (Коей νβΓδίοη 3), и количественно измеряют ферментную активность при 574 нм. Согласно полученным результатам пролинспецифичная эндопротеаза из Α. №дег имеет температурный оптимум в районе 50°С.

Пример 3.

Специфичность пролинспецифичной эндопротеазы из Α. №дег.

Как неочищенный, так и хроматографически очищенные образцы фермента, получаемого из штамма Α. шдег, содержащего множество копий кассеты экспрессии (см. \УО 02/45524), тестируют на ряде хромогенных пептидных субстратах с целью определения специфичности кодируемой эндопротеазы. Эндопротеолитическую активность фермента тестируют на субстрате ΑΑΧρΝΑ. ρΝΑ (пнитроанилидные) субстраты вызывают изменения окраски при разрыве пептидной связи Χ-ρΝΑ (X обозначает остатки разных природных аминокислот). Исходные растворы субстратов ΑΑΧρΝΑ (150 мМ) разбавляют в 100 раз 0,1 М ацетатным буфером, рН 4,0, содержащим 20 [ммоль/л] СаС1₂. Измерения в течение 10 мин при 40°С на считывающем устройстве ΊΈ£ΑΝ Сеток ΜΤΡ Реайег (Зальцбург, Вена) при 405 нм позволили отметить повышение оптической плотности, которое после обработки данных в Ехее1 дало картину, приведенную на фиг. 2. Из этих результатов ясно, что эндопротеаза из Α. шдег высокоспецифична в отношении пролильных пептидных связей с побочной активностью в отношении аланильных связей. Неочищенные и хроматографически очищенные препараты показали похожие профили активности. Удалось показать, что загрязнение эндопротеазы из Α. шдег аминопептидазами, карбоксипептидазами или не являющимися пролинспецифичными эндопротеазами является незначительным (см. пример 5).

Пример 4.

Пролинспецифичная эндопротеаза из Α. шдег может гидролизовать как крупные белки, так и небольшие пептиды изобретения, и является, таким образом, истиной эндопротеазой.

Благодаря своим специфическим структурным особенностям пролилолигопептидазы, относящиеся к семейству 828, не могут переваривать пептиды, содержащие более 30 аминокислот. Такое ограничение является явным недостатком для фермента, который предназначен для как можно более быстрого и эффективного гидролиза различных белков. С целью проверки, имеет ли пролинспецифичная эндопротеаза из Α. шдег такие же ограничения в отношении размера молекулы субстрата, инкубировали хроматографически очищенную пролилэндопептидазу из Α. шдег с небольшим синтетическим пептидом и с большой молекулой овальбумина и анализировали образовавшиеся продукты гидролиза методом 8Ό8-ΡΑΟΕ.

Синтетический пептид представлял собой 27-мер с последовательностью ΝΗ₂ΡΚΑ8ΌΝΏΚνΙΌΡ6Κ’νΈΤΕΤΙΚΚΕΗΙΡΚ^ΟΟΗ и был подарком компании Ρеρкеаη еοтρаηу (Ее1ук1аф Голландия). Как следует из его аминокислотной последовательности, этот пептид содержит два остатка пролина - один в середине и один близко к карбокситерминальному концу пептида.

Интактная молекула овальбумина (Легее ищеек ампулы, содержащие по 20 мг замороженного сухого материала) состоит из 385 аминокислот с молекулярным весом 42750 Да. Эта молекула содержит 14 остатков пролина, один из которых расположен у дальнего С-терминального конца молекулы и не может быть отщеплен пролинспецифичной эндопротеазой. Овальбумин и олигопептид инкубировали отдельно при 50°С с очищенной пролинспецифичной эндопротеазой из Α. шдег. Через определенные промежутки времени отбирали образцы и анализировали их с помощью 8Ό8-ΡΑΟΕ.

Хроматографически очищенную пролинспецифичную эндопротеазу из Α. шдег с активностью 4,5 единиц/мл разбавляют в 100 раз 0,1 М ацетатным буфером, рН 4, содержащим 10 ммоль/л СаС12. Овальбумин растворяют в ацетатном буфере, рН 4, до концентрации 1 мг/мл (22 мкмоль/л). 27-мер растворяют в том же буфере до достижения концентрации 0,48 мг/мл (152 мкмоль/л). Молярность растворов овальбумина и 27-мера подбирают таким образом, чтобы оба раствора обладали одинаковой молярностью по отщепляемым пролиновым остаткам. Овальбумин содержит 13 потенциальных центров отщепления пролина, в то время как 27-мерный пептид имеет их только два. От обоих субстратных растворов инкубируют по 0,5 мл с 10 мкл (0,45 миллиединиц) ферментного раствора при 50°С в термосмесителе Эппендорфа. Через определенные промежутки времени из инкубационной смеси отбирают 10-мкл образцы и выдерживают перед 8Ό8-ΡΑΟΕ при 20°С. Все используемые для 8Ό8-ΡΑΟΕ материалы и красители приобретены у фирмы ΙηνίΐΐΌ^η. Образцы приготовляли с использованием №1-додецилсульфатного буфера согласно инструкциям изготовителей. Окрашивание производилось с помощью синего красителя

- 19 016396

81тр1у В1ие 8а£е 8ΐ;·ιίη (Со11оШа1 Соотав51е 6250).

Как можно видеть на фиг. 3, овальбумин расщепляется ферментом, полученным из АврегдШа, на дискретную полосу приблизительно от 35 до 36 кДа в первые 4,75 ч инкубации (зона 3). Более продолжительное время инкубации приводит к дальнейшему распаду на более мелкие продукты с разными молекулярными весами (зона 7).

27-мерный пептид также распадается, о чем можно судить по большему числу слабых полос в зонах 4, 6 и 8 по сравнению с зоной 2. Очень небольшой сдвиг молекулярного веса продукта (сравни зоны 9 и 2) вероятнее всего обусловлен отщеплением аргининового остатка у карбоксильного конца пептида. Разница составляет примерно 200 (измерено с использованием программы А1рБа1тадег 3.3ά на системе А1рНа1тадег 2000), в то время как аргинин имеет молекулярный вес 174. Этот небольшой сдвиг молекулярного веса является, по-видимому, первой ступенью распада пептида.

Дальнейший распад продукта можно увидеть только по уменьшению полосы на 808-геле. Продукты дальнейшего распада не видны, так как окрашивание в геле компонентов с молекулярным весом примерно 1000 с помощью бриллиантового голубого фирмы Соотав51е невозможно. Из этого эксперимента можно заключить, что, несмотря на принадлежность известных пролилолигопептидаз к семейству 89, пролинспецифичная эндопротеаза из А. шдег не имеет специфического предпочтения к расщеплению небольших по размеру пептидов по сравнению с намного более крупными белками. Как таковой, фермент из А. шдег представляет собой истинную эндопротеазу и предпочтительный фермент для гидролиза различных типов белков.

Пример 5.

Количественное определение целевых и примесных ферментных активностей при продуцировании снижающих кровяное давление пептидов.

Согласно настоящему изобретению относительно чистый ΙΡΡ можно получать с помощью простого одностадийного способа получения ΙΡΡ из 6ΜΡ. ΙΡΡ-содержащую фракцию можно получать из 6ΜΡ с помощью ряда различных ферментных препаратов. Например, путем инкубирования 6ΜΡ либо с чистой пролинспецифичной эндопротеазой, либо с чистой пролинспецифичной эндопротеазой плюс чистая аминопептидаза, либо с чистой пролинспецифичной олигопептидазой в сочетании со следами какойлибо другой чистой эндопептидазы, такой как субтилизин или металлопротеаза (для расщепления 6ΜΡ на меньшие фрагменты, являющиеся лучшими субстратами для олигопептидазы), либо с чистой аминопетидазой в сочетании с пролинспецифичной трипептидиламинопептидазой (типа той, которая присутствует в продажном препарате итапи/уше фирмы Атапо, Япония), либо с комплексными ферментными препаратами, содержащими разные типы протеолитической активности. В этом примере три продажных ферментных препарата были протестированы на разные типы протеолитической активности, а именно Науоиг/уте 1000Б Ва1е11 ΗΡΝ00218 (Шуо/утев). 8ит1/уте ΡΡ (8Ып Шюп, Япония) и Со1огаве Б-ΛΡ СБ.: 4123 (АВ Епгутев, Великобритания). Известно, что как Пауоигхуте, так и 8ит1/уте ΕΡ являются комплексными ферментными препаратами, которые наряду с неспецифическими эндопротеолитической и карбоксипептидолитической активностями обладают несколькими аминопептидолитическими ферментными активностями. Со1огаве Б-ΛΡ представляет собой относительно чистую, клонированную и сверхэкспрессированную лейцин-аминопептидазную активность от АврегдШив.

Существенно чистая означает, что активность примесных эндопротеаз, так же как и примесных карбоксипептидаз или аминопептидаз в применяемых условиях инкубации являются минимальными или, что предпочтительно, отсутствуют. Для количественного определения таких примесных эндо-, амино- и карбоксипептидазных активностей была разработана следующая тест-процедура.

Основу этой тест-процедуры составляет подборка различных селективных хромогенных пептидов. Поскольку только пролинспецифичные олиго- и эндопротеазы могут отщеплять рNА от пептида ΖАААΡ-рNА, именно этот конкретный пептид был использован для количественной оценки желаемой пролинспецифичной эндопротеолитической активности. Поскольку многие эндопротеазы могут отщеплять рNА от пептидов Ζ-АААΡ-рNА и Ζ-АААΒ-рNА, эти два пептида были использованы для количественной оценки примесной, не являющейся пролинспецифичной эндопротеолитической активности. Поскольку для превращения присутствующих в молекуле бета-казеина пептидов 6ΝΙΡΡ и νννΡΡ в ΙΡΡ и νΡΡ соответственно требуются аминопептидазы, которые могут эффективно удалять остатки 61п и Vа1, для количественной оценки желаемых аминопептидазных активностей были выбраны пептиды ^-рNА и V-рNА. Так как многие карбоксипептидазы способны отщеплять от пептидов остатки Ρίκ и Агд, для количественной оценки примесных карбоксипептидазных активностей были выбраны пептиды, содержащие указанные остатки. Однако для измерения карбоксипептидазных активностей не имеется подходящих хромогенных групп, вследствие чего был разработан альтернативный метод с использованием синтетических пептидов Ζ-АЕ и Ζ-АК. Этот альтернативный метод приведен ниже. Во всех использованных синтетических пептидах Ζ означает бензилоксикарбонил, а рNА означает пара-анилидный хромофор. Все хромогенные пептиды получены от Ρер5саη (Ье1у51ай, Голландия). Пептиды Ζ-АЕ и Ζ-АК приобретены у ВасНет (Швейцария). Все инкубации проводили при 40°С. Разбавленные ферментные препараты пересчитывали на концентрацию продажного продукта.

- 20 016396

Измерение аминопептидазных активностей.

Исходные растворы 150 ммоль/л У-ρΝΑ и Ο-ρΝΑ в 100%-ном ДМСО разбавляют в 80 раз 0,1 М бис-трис-буфером, рН 6, получая 3,75 мМ V-ρNΑ + ρ-ρΝΑ-субстратный раствор, содержащий V-ρNΑ и Ο-ρΝΑ в соотношении 1:1. 200-мкл пробу этого аминопептидазного субстратного раствора вводят пипеткой в отдельные лунки микротитровальной планшеты (МТР). Эту МТР предварительно инкубируют при 40°С в Τοοαη Сешок МТР (Зальцбург, Вена), управляемой программой Μαβθ11αη4. Реакция начинается при добавлении 50 мкл соответствующего ферментного раствора, т.е. инкубация протекает при концентрации субстрата 3 ммоль/л. Как правило, для жидких ферментных образцов Пауоигхуте. Сого1аке ЬАР и пролинспецифичной эндопротеазы используют разбавление 1:50. Сухой продукт Бипн/уше ЕР использовали в виде 1%-ного раствора.

Желтая окраска, измеряемая при 405 нм с помощью Τесаη Сешок МТР и возникающая в результате расщепления связи аминокислота-ρΝΑ, прослеживалась в течение по меньшей мере 20 кинетических циклов (примерно 10 мин). Компьютерная программа выдавала получаемые данные в виде И₄₀₅/мин.

Измерение активности пролинспецифичной эндопротеазы.

Измерение проводили практически так же, как и при анализе аминопептидазы, но в данном случае Ζ-ΑΑΑΡ-ρΝΑ использовали в качестве единственного субстрата с конечной концентрацией 3 ммоль/л. Субстрат растворяли нагреванием суспензии в буфере с рН 6 до 50-55°С, в результате чего получали прозрачный раствор при комнатной температуре. Измерения проводили при 40°С.

Для жидких ферментных образцов Е1ауоигхуте и Сого1аке ΕΑΡ использовали, как правило, разбавление 1:50. Пролинспецифичную эндопротеазу использовали, как правило, при разбавлении 1:5000.

Компьютерная программа выдавала получаемые данные в виде И₄₀₅/мин.

Измерение активностей примесных, не являющихся пролинспецифичными эндопротеаз.

Это измерение также проводили практически так же, как и при анализе аминопептидазы, но в качестве субстрата в этом тесте использовали Ζ-ΑΑΑΕ-ρΝΑ и Ζ-ΑΑΑΚ-ρΝΑ при отношении 1:1 и с конечной концентрацией 3 ммоль/л. Субстрат Ζ-ΑΑΑΕ-ρΝΑ оказался плохо растворимым в используемых условиях теста при рН 6,0, но инкубация с субтилизином обеспечивала быструю солюбилизацию субстрата при одновременном отщеплении ρΝΑ. Измерения проводили при 40°С. Однако, чтобы скомпенсировать плохую растворимость, считывающее устройство МТР было запрограммировано на встряхивание между кинетическими циклами.

Компьютерная программа и в этом случае выдавала данные в виде И₄₀₅/мин.

Измерение примесных карбоксипептидазных активностей.

Поскольку для измерения карбоксипептидазных активностей не существует доступных чувствительных хромогенных пептидов, для количественного определения карбоксипептидазы С, был использован метод на основе протокола ВоеЬпидег.

Два 150 мМ исходных раствора Ζ-Α-Ε и Ζ-Α-В в этаноле разбавляют в 80 раз 0,1 мМ трис-буфером, рН 6, получая в результате этого 3,75 мМ Ζ-Α-Ε+Ζ-Α-В субстратный раствор, содержащий Ζ-Α-Ε и Ζ-ΑВ в соотношении 1:1. Затем 200 мкл субстратного раствора вводят с помощью пипетки в микропробирку Эппендорфа и предварительно инкубируют при 40°С. Реакция начинается при добавлении 50 мкл соответствующего ферментного разбавителя. Как правило, для жидких ферментных образцов Иауоигхуте, Сого1аке ΕΑΡ и пролинспецифичной эндопротеазы используют разбавление 1:50. 8иш1хуше ΕΡ использовали в виде 1%-ного раствора. Через 5 мин реакцию останавливают добавлением 250 мкл нингидринового реагента. Нингидриновый реагент был приготовлен из 400 мг нингидрина (Μе^ск) и 60 мг гидриндантина, растворенного в 15 мл ДМСО, к которым добавлялись 5 мл 4,0 М литий-ацетатного буфера, рН 5,2. 4,0 М литий-ацетатный буфер был получен растворением ЫОН (§1дта), после чего рН раствора доводился до 5,2 с помощью ледяной уксусной кислоты (Μе^ск).

После остановки реакции, чтобы ускорить образование окраски, каждый образец нагревают в течение 15 мин при 95°С и затем разбавляют в 10 раз чистым этанолом. Образовавшуюся окраску измеряют при 578 нм на спектрофотометре Иукой. Пустые образцы получают тем же самым путем, что и активные образцы, но с переменой очередности добавления нингидринного реагента и фермента. С целью количественной оценки количества аминокислот, образующихся за счет карбоксипептидазной активности, в качестве аминокислоты для создания калибровочной кривой был использован Ь-фенилаланин. Буферные растворы, рН 6, содержащие 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5 и 3,0 ммоль/л Ь-фенилаланина (81дта), обрабатывали так же, как и образцы, т.е. по 250 мкл в пробирке. На основе полученных значений И₅₇₈ в Ехсе1 построена кривая. С помощью этой кривой рассчитаны концентрации свободных аминокислот, присутствующих в образцах, содержащих субстраты Ζ-Α-Ε и Ζ-Α-В. Из полученных значений рассчитана карбоксипептидазная активность в микромолях в минуту на количество тестируемого фермента.

Расчет отношений активности.

С целью установления пригодности различных ферментных препаратов для способа согласно изобретению, были рассчитаны показатели соответствующих ферментных активностей. В анализах с помощью считывающего устройства МТР геайег ферментные активности охарактеризовывались с помощью отщепления ρΝΑ во времени, т.е. в виде АО₄₀₅/мин. Коэффициенты ферментных активностей, полученные с помощью считывающего устройства МТР геабег, рассчитывали простым делением полученных

- 21 016396 значений ΔΌ/мин на аналогичные величины для фермента.

Однако в случае карбоксипетидазного анализа получают Ό, которую нельзя непосредственно сравнивать с величиной ΔΌ/мин, получаемой в анализах на основе МТР-ρΝΑ. Измеряемую Ό превращают вначале в мкмоли высвободившейся в течение 1 мин аминокислоты (мкмоль/мин). Затем в мкмоль/мин превращают ΔΌ/мин для высвободившейся ρΝΑ. С этой целью создают калибровочную кривую в МТР геабег, в котором проводятся измерения следующих разбавлений чистого ρΝΑ (§1дта): 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312 и 0,015 ммоль/л с 250 мкл на лунку. На основе полученных данных в Ехсе1 была построена калибровочная кривая. С помощью калибровочной кривой ΔΌ/мин превращают в мкмоль/мин, благодаря чему измерения на основе ρΝΑ могут сравниваться с измерениями на основе нингидрина.

На основе полученных в упомянутых выше тестах данных были охарактеризованы различные использованные ферментные препараты. Данные по пролинспецифичным олиго- или эндопротеолитическим активностям, присутствующим в каждом из использованных ферментных препаратов, показаны в табл. 1 в колонке пролин-спец активность. Данные по целевым аминопептидазным активностям (АР/прол-сп акт) и примесным карбоксипептидазной (ΟΡΌ/прол-сп акт) и эндопротеолитической (ΕΝΌΘ/прол-сп акт) активностям показаны по отношению к имеющимся пролинспецифичным активностям. Отношение целевой аминопептидазной активности к имеющейся в каждом из препаратов примесной карбоксипептидазной активности представлено в виде ΑΡ/ΟΡΌ.

Является очевидным, что ни один из протестированных продажных ферментных препаратов не содержит какой-либо значительной пролинспецифичной олиго- или эндопротеолитической активности. Наряду с этим, все протестированные продажные ферментные препараты содержат карбоксипептидазную и эндопротеолитическую активности. Ферментная комбинация С1, которая состоит из смеси 4 единиц пролинспецифичной эндопротеазы и 130 мкл продажной Сото1аке ΕΑΡ и которую применяют в расчете на 1 г белкового субстрата, что дает высокие выходы АСЕ-ингибирующих пептидов ΙΡΡ, νΡΡ и ΕΡΡ, отличается очень низкими уровнями примесных карбоксипептидазной и эндопротеолитической активностей.

Таблица 1

	Прол-спец активность*	СРО/прол-сп акт	АР/прол-сп акт	ΕΝϋΟ/пролсп акт	АР/СРО

Зшпкугпе	0,004	21,7	1,2	1,7	0,06
Натоцггуте	0,00007	253,5	25,6	35,5	0,10
Сого1азе ЬАР	0,0				0,74
Прол-спец мз А.тпсг	100	0,005	0,00001	0,000004	0,00
С1	75	0,001	0.00031	0,000391	0,25

* Зниихуте мерили в 1%-ном растворе, Пауоигхуте и Сото1аке при разбавлении 1:50. Пролинспецифичная активность, происходящую из Α. шдет, измеряли при разбавлении 1:5000, а С1 при разбавлении 1:3773. Эти данные были затем пересчитаны на присутствующую в соответствующем продукте активность.

С учетом высокого содержания амино- и карбоксипептидазной активностей в комплексных ферментных смесях Зниихуте ΕΡ и Пауоигхуте при инкубации ΟΜΡ с этими смесями можно было ожидать возникновения высоких уровней свободных аминокислот. Можно было ожидать, что эти свободные аминокислоты придадут бульонный привкус в результате усиленных реакций Мэйларда. Кроме того, наличие не являющихся пролин- или аланин-специфичными эндопротеолитических активностей в этих ферментных препаратах должно привести к солюбилизации дополнительных и, возможно, биоактивных пептидов в конечном продукте, затемняя тем самым чистый снижающий кровяное давление эффект ΙΡΡ. Для сведения к минимуму этих нежелательных побочных реакций предпочтительна комбинация существенно чистой пролинспецифичной протеазы с существенно чистой пептидазой. Еще более предпочтительно применение одной существенно чистой пролинспецифичной эндопротеазы.

Пример 6.

Выделение ΟΜΡ и ΙΡΡ из казеината.

Имеющийся в продаже ΟΜΡ получен из сырной сыворотки. В этом процессе молоко инкубируют с химозином для выделения водорастворимой ΟΜΡ-части из каппа-казеина. В результате этого происходит осаждение казеината с образованием творога, в то время как ΟΜΡ-часть оказывается в сырной сыворотке, из которой она может быть выделена с помощью ряда различных способов. В этом примере нами описывается альтернативный путь выделения ΟΜΡ, т.е. выделения из продажного казеината. Преимущество этого пути состоит в том, что после избирательного удаления ΟΜΡ оставшуюся казеинатную фракцию можно использовать для альтернативных применений. Согласно настоящему способу (снятое) молоко подкисляют, применяя известные в технике способы, с целью селективного осаждения казеиновой фракции. Осажденная фракция включает в себя все казеины, т.е. альфа-, бета-, каппа- (включая ΟΜΡчасть) и гамма-казеины. Этот образовавшийся казеиновый творог отделяют от сладкой сывороточной фракции и промывают с целью удаления оставшихся компонентов сыворотки и ионов, возникающих в процессе подкисления. После обезвоживания казеиновый творог повторно растворяют с помощью ней- 22 016396 трализации, например с использованием КОН, получая в результате требуемый казеинат.

10%-ный (вес./об.) калий-казеинатный раствор (рН примерно 6,4) инкубируют 1 ч при 31°С с химозином теленка с целью выделения из каппа-казеина СМР-части. В этом случае на 1 г казеината применяют 2,2 1МСи Мах1геи (ЬЗМ Рооб ЗреааШез, Дельфт, Голландия). Образующийся при этом раствор подвергают одной или более операциям фильтрации, выделяя растворенную низкомолекулярную СМРчасть из высокомолекулярной фракции, содержащей как казеины, так и химозин. СМР-содержащий фильтрат подкисляют до рН 4,5 и добавляют пролинспецифичную эндопротеазу из А. шдег в концентрации 4 ед. на 1 г имеющегося белка. С целью получения максимальной активности фермента повышают температуру до 55°С и продолжают инкубацию в течение 3 ч. Образовавшийся раствор концентрируют упариванием и нагревают в течение 5 мин до 95°С с целью инактивировать пролинспецифичную эндопротеазу. Наконец, с целью удаления как можно большего количества осажденных белков нагретый концентрат подвергают ультрафильтрации и сушат распылением. С помощью хромато-массспектрометрического анализа ЬС/МЗ/МЗ высушенного распылением материала концентрация 1РР была количественно оценена и оказалась равной 0,6 мг на 1 г исходного казеинатного материала.

Пример 7.

Высвобождение 1РР из СМР с помощью одной стадии инкубации.

Чтобы продемонстрировать, что пролинспецифичная эндопротеаза из А. шдег и Зипи/уте РР являются подходящими для выделения из СМР снижающего кровяное давление трипептида, был проведен ряд инкубаций. В данном эксперименте использован продажный препарат СМР (Ьасргобаи ССМР-10, 1о1 ио. Р340205 от Аг1а, Дания). Согласно его техническим условиям получаемый порошок содержит приблизительно 85% белка с содержанием СМР примерно 80% (на имеющийся белок), т.е. 1 г Ьасргобаи ССМР-10 содержит приблизительно 0,85x0,8=0,7 г чистого СМР.

СМР растворяют в деминерализованной воде (50 г СМР в 450 мл). рН этого раствора равен 6,7. 135 мл этого раствора подкисляют до рН 4 с помощью 4н. НС1 и дополнительно добавляют воду до достижения объема 150 мл и концентрации СМР 10% (на сухой материал). Из раствора с рН 7 взято 45 мл с доведением рН до 6 с использованием 4н. НС1 и 90 мл с доведением рН до 8 с использованием 4н. КОН. К обоим растворам добавляют дополнительно воду, чтобы также достичь концентрации СМР 10% (на сухой материал). рН 4,0 при инкубации с пролинспецифичной эндопротеазой был выбран потому, что рН 4 представляет оптимум для этого фермента. Поскольку Зшт/уте РР состоит из смеси разных эндопротеаз, аминопептидаз и карбоксипептидаз, все из которых имеют свои собственные оптимумы рН, инкубацию проводят в различных условиях рН.

При использовании этих трех растворов, доведенных до разных значений рН, инкубацию с различными ферментами проводили, как показано в таблице. Пролинспецифичную эндопротеазу использовали в концентрации 0,4 ед./мл (~0,4 ед./г белка) и Зипи/уте РР в конечной концентрации 1 мг/мл (~10,4 мг/г белка). Все инкубации проводили в 50-мл конических пробирках Грайнера на водяной бане, термостатируемой в течение 4 ч при 40°С и легком встряхивании. После инкубации перед анализом ЬС/МЗ/МЗ все образцы хранили в замороженном состоянии при -20°С. Полученные при этом анализе данные приведены в таблице и оценены с использованием контрольных растворов 1РР, УРР и ЬРР.

Таблица 2

Инкубационная схема для растворов СМР с №1.х|Рго и Зиии/уте РР

Инкубация №	Мл 10%~ного раствора СМР	Мл раствора пролинспец фермента 10 ед/мл	Мл раствора йипнгуте РР 25 Мг/мл	рН инкубационной смеси
1	48	-		6,7
2	48	2		4
3	48	-	2	4
4	48	-	2	6
5	48	-	2	8

Таблица 3 Выход пептидов при ферментной инкубации разных растворов СМР

Инкубация	ΙΡΡ	УРР	ЬРР
№	рг/мл	рг/г	рг/мл	рг/г	рг/мл	рг/г
1	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о	н/о
2	1657	2367	н/о		н/о
3	41	59	3	4	6	9
4	389	556	36		н/о
5	570	814	44	63	н/о

мкг/мл=мг соответствующего трипептида на 1 мл 10%-ного раствора СМР; мкг/г=мг соответствующего трипептида на 1 г белка СМР;

н/о=не обнаруживается.

- 23 016396

Из полученных результатов ясно, что инкубация с чистой пролинспецифичной эндопротеазой дает ΙΡΡ-содержащий продукт, в котором отсутствуют пептиды νΡΡ и ΕΡΡ. Количество ΙΡΡ, отщепляющегося при такой неоптимизированной инкубации, составляет примерно 50% от присутствующего в ΟΜΡ фрагмента ΙΡΡ.

Наиболее существенно то, что инкубации с комплексным ферментом Зшшхуте ΕΡ также приводят к образованию ΙΡΡ из ΟΜΡ. Согласно нашим данным наиболее эффективно в условиях рН 8. Тот факт, что выходы ΙΡΡ с Зшшхуте ΕΡ ниже, чем при инкубации с пролинспецифичной эндопротеазой, просто отражает ситуацию слишком низкой дозировки фермента Зшшхуте ΕΡ в этом эксперименте. Совершенно неожиданным стало, что Зшшхуте ΕΡ не только производит из материала Ьасргокап ΙΡΡ, но также и νΡΡ и ΕΡΡ. Поскольку трипептиды νΡΡ и ΕΡΡ встречаются в бета-казеиновой аминокислотной последовательности, их присутствие четко иллюстрирует тот факт, что свежеполученный материал ΟΜΡ загрязнен бета-казеином.

Пример 8.

С целью продемонстрировать органолептические преимущества ΙΡΡ-содержащего гидролизата, полученного из ΟΜΡ, был проведен дегустационный эксперимент. В этом эксперименте три разных субстрата, а именно ΟΜΡ, казеинат калия и снятое молоко инкубировали с пролинспецифичной эндопротеазой из А. шдег. При использовании этого чистого фермента мог быть вырезан только ΙΡΡ, присутствующий в молекуле каппа-казеина (см. ОТО 2006/005757). Во всех трех инкубации использовали одну и ту же концентрацию белка равную 3,5 вес.% и одно и то же количество фермента, а именно 4 ед./г белка. С целью предотвратить осаждение казеинов рН растворов доводили до 6,2. Инкубацию проводили в течение 3 ч и заканчивали короткой тепловой обработкой.

Во всех трех гидролизатах присутствовал значительный осадок. После центрифугирования с целью удаления этих осадков прозрачные (содержащие ΙΡΡ) супернатанты дегустировала опытная комиссия, состоящая из 5 человек. Члены комиссии подготавливали себя на растворах хинин-сульфата со следующими концентрациями: 15 мг/л хинин-сульфата>интенсивность горького=1, 20 мг/л хининсульфата>интенсивность горького=2, 30 мг/л хинин-сульфата>интенсивность горького=3 и 50 мг/л хинин-сульфата>интенсивность горького=4. Комиссия проставляла баллы горечи каждого гидролизата по шкале от 0 (не горький) до 4 (очень горький). Образец сравнения с 15 мг/л хинин-сульфата выдавался членам комиссии перед сеансом дегустации и ему было присвоено значение интенсивности горького, равное 1. Казеиновый гидролизат был оценен как очень горький (т.е. баллом 4) всеми членами дегустационной комиссии. Гидролизат снятого молока был также оценен как горький баллом 3 всеми членами комиссии. После дегустации гидролизата ΟΜΡ комиссия единогласно дала оценку 1. С учетом того, что гидролизат ΟΜΡ, как предполагается, обладает наиболее высокой концентрацией ΙΡΡ, неожиданные преимущества способа согласно настоящему изобретению становятся очевидными.

Пример 9.

Высвобождение ΙΡΡ из ΟΜΡ с помощью ферментации.

Плохая вкусовая привлекательность сброженных молочных продуктов и многие трудности в процессе переработки, встречающиеся при выделении АСЕ-ингибирующих пептидов из сброженных бульонов, описаны в И8 6428812. В этом примере показывается, что молекула ΟΜΡ является также подходящим субстратом для получения ΙΡΡ с помощью ферментации.

В этом исследовании были использованы два штамма ЬасЮЬасШш: ЬасЮЬасШик ас1корЫ1и1и8 ЬАКП®Ь10 и ЬасЮЬасШш са^е! ЕА1Т[®Е26 (Ό8Μ Еоок 8рес1аШе5, Австралия). Оба штамма выращивают в анаэробных банках в атмосфере СОг+Ν (Апаегобеп™, ОхоШ) при 37°С в бульоне ΜΚ8 (ОхоМ) в течение 24 ч. Образовавшиеся первичные культуры инокулируют в ферментационном бульоне а или ферментационном бульоне ау. Ферментационный бульон а содержит: Т\уееп 80 (1 мл/л), Κ₂ΗΡΟ₄(2 г/л), №1Ас (3 г/л), ЩН₄)₃-цитрат (2 г/л), Μд8Ο₄·7Η₂Ο (0,05 г/л), глюкозу (20 г/л), 6ΜΡ (Ьасргокап, Апа, 22 г/л). Ферментационный бульон ау содержит, кроме того, дрожжевой экстракт (4,0 г/л). Вновь инокулированные ферментационные бульоны а и ау инкубируют еще 24 ч в указанных выше условиях. После этого ферментационные бульоны центрифугируют и супернатанты анализируют методом ЬС/Μδ на присутствие трипептидов ΙΡΡ, ΕΡΡ и νΡΡ. Как показано в табл. 4, только при инкубациях со штаммом Ь10 присутствие ΙΡΡ можно выявить при уровне 0,3 мг/л. ΕΡΡ и νΡΡ не присутствовали. Дегустация образцов 1 и 5 не выявила существенных привкусов.

Таблица 4

Высвобождение ΙΡΡ из ΟΜΡ с помощью ферментации

Пробирка	Ферментационный бульон	Штамм	Образование ΙΡΡ
	а	ЫО	Да
2	ау	ыо	да

3	а	Ь2б	не выявлен
4	ау	Ь26	не выявлен

5	а	Без прививочного материала в качестве контроля	не выявлен

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения пептидного гидролизата, содержащего ΙΡΡ, из белкового источника, включающего белок, содержащий последовательность -Ι-Ρ-Ρ- и имеющий в составе аминокислотной последовательности по меньшей мере в 6 раз больше последовательностей, содержащих -Ι-Ρ-Ρ- по сравнению с ν-Ρ-Ρ- (на молярной основе), включающий гидролиз белкового источника с целью высвобождения по меньшей мере 40% трипептида ΙΡΡ с помощью протеолитического фермента, предпочтительно пролинспецифичной эндопротеазы или пролинспецифичной олигопептидазы, более предпочтительно пролинспецифичной эндопротеазы, и, при необходимости аминопептидазы, причем в указанном белковом источнике по меньшей мере 50% (по весу) приходится на ΟΜΡ-часть молекулы казеина и 20% последовательности -Ι-Ρ-Ρ-, присутствующей в указанной ΟΜΡ-части молекулы казеина, превращается в трипептид ΙΡΡ.
2. Способ по п.1, в котором протеолитический фермент и аминопептидазу инкубируют совместно с источником белка предпочтительно в одну стадию.
3. Способ по п.1 или 2, в котором пролинспецифическая эндопротеаза и аминопептидаза используются в комбинации.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором белковый источник содержит смесь белков, включающую по меньшей мере 50% белка, в котором отсутствует -ν-Ρ-Ρ-.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором белковый источник содержит смесь белков, включающую по меньшей мере 80% белка, в котором отсутствует -ν-Ρ-Ρ-.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором белковый источник содержит смесь белков, включающую по меньшей мере 90% белка, в котором отсутствует -ν-Ρ-Ρ-.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором белковый источник содержит смесь белков, включающую по меньшей мере 95 вес.% белка, в котором отсутствует -ν-Ρ-Ρ-.
8. Способ по п.1, в котором по меньшей мере 80% (по весу) приходится на ΟΜΡ-часть молекулы казеина.
9. Способ по п.1, в котором по меньшей мере 90% (по весу) приходится на ΟΜΡ-часть молекулы казеина.
10. Способ по п.9, в котором по меньшей мере 40% последовательности -Ι-Ρ-Ρ-, присутствующей в ΟΜΡ-части молекулы казеина, превращается в трипептид ΙΡΡ.
11. Способ по п.1, в котором по меньшей мере 60% последовательности -Ι-Ρ-Ρ-, присутствующей в ΟΜΡ-части молекулы казеина, превращается в трипептид ΙΡΡ.
12. Способ по п.1, в котором по меньшей мере 70% последовательности -Ι-Ρ-Ρ-, присутствующей в ΟΜΡ-части молекулы казеина, превращается в трипептид ΙΡΡ.
13. Пептидный гидролизат, содержащий трипептид ΙΡΡ, полученный способом по любому из пп.112.
14. Применение пептидного гидролизата по п.13 в качестве нутрицевтика, предпочтительно в качестве лекарственного средства, для улучшения здоровья при таких заболеваниях, как высокое кровяное давление (гипертензия), сердечная недостаточность, преддиабет или диабет, ожирение, нарушенная толерантность к глюкозе или стресс.
15. Применение пептидного гидролизата по п.13 для производства нутрицевтика, предпочтительно для производства лекарственного средства, предназначенного для улучшения здоровья при таких заболеваниях, как высокое кровяное давление (гипертензия), сердечная недостаточность, преддиабет или диабет, ожирение, нарушенная толерантность к глюкозе или стресс.
16. Применение по п.15, в котором нутрицевтик, предпочтительно лекарственное средство, изготовлен в виде лосьона, геля или эмульсии или является ингредиентом пищевого продукта или корма для домашних животных.
17. Применение пептидного гидролизата по п.13 для производства функционального пищевого продукта, предназначенного для профилактики ожирения или регуляции веса тела.
18. Применение пептидного гидролизата по п.13 для производства функционального пищевого продукта, предназначенного для поддержания здоровья сердечно-сосудистой системы.
19. Применение по п.17 или 18, в котором поддержание здоровья сердечно-сосудистой системы включает ингибирование ангиотензин-конвертирующего фермента.
20. Применение по п.19, в котором поддержание здоровья сердечно-сосудистой системы включает регуляцию уровня холестерина в крови.
21. Функциональный пищевой продукт, предназначенный для профилактики ожирения, регуляции веса тела и поддержания здоровья сердечно-сосудистой системы, включающий пептидный гидролизат по п.13.
22. Функциональный пищевой продукт по п.21, где поддержание здоровья сердечно-сосудистой системы включает ингибирование ангиотензин-конвертирующего фермента или регуляцию уровня холестерина в крови.
23. Функциональный пищевой продукт по п.21 или 22, содержащий 50-200 ммоль/кг К⁺, и/или 15- 25 016396

60 ммоль/кг Са²⁺, и/или 6-25 ммоль/кг Мд²⁴.
24. Функциональный пищевой продукт по п.23, содержащий 110-135 ммоль/кг К⁺, и/или 35-45 ммоль/кг Са²⁺, и/или 13-20 ммоль/кг Мд²⁺.
25. Функциональный пищевой продукт по любому из пп.21 или 22, содержащий один или более витаминов группы В.
26. Функциональный пищевой продукт по п.22, содержащий фолевую кислоту, витамин В6 и витамин В12.
27. Функциональный пищевой продукт по любому из пп.21-26, включающий от 3 до 27 вес.% стерола.
28. Функциональный пищевой продукт по любому из пп.21-26, включающий от 7 до 15 вес.% стерола.
29. Способ получения пищевого продукта, напитка или пищевой добавки, включающий:

(a) получение пептидного гидролизата по п.13 и (b) введение указанного пептидного гидролизата в пищевой продукт, напиток или пищевую добавку.
30. Способ по п.29, в котором пищевой продукт, напиток или пищевая добавка выбраны из группы, включающей маргарин, паштет, масло, молочный продукт или напиток, содержащий молочную сыворотку, преимущественно продукт на основе йогурта или молока, или йогурт или молоко.
31. Пищевой продукт, полученный способом по п.29.
32. Напиток, полученный способом по п.29.
33. Пищевой продукт по п.31 или напиток по п.32, содержащий от 0,2 до 4 вес.% указанного пептидного гидролизата.
34. Применение пищевого продукта по п.31 или 33 для облегчения гипертензии у человека.
35. Применение напитка по п.32 или 33 для облегчения гипертензии у человека.