ES2327675T3 - Hidrolizados proteinicos que reducen la tension arterial. - Google Patents

Abstract

El el tripéptido ITP y/o una sal de MAP y/o una sal de ITP.

Description

Hidrolizados proteínicos que reducen la tensión arterial.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de nuevos péptidos.

Antecedentes de la invención

La hipertensión es un estado mórbido relativamente habitual en seres humanos, y presenta un factor de riesgo importante para enfermedades cardiovasculares, insuficiencia renal y apoplejía. La disponibilidad de un gran conjunto de productos farmacéuticos, tales como bloqueadores de calcio, beta-bloqueadores, diuréticos, alfa-bloqueadores, alfa-antagonistas centrales, antagonistas de la angiotensina II e inhibidores de ACE, ilustra que los mecanismos fisiológicos subyacentes de la hipertensión son complejos.

De los mecanismos fisiológicos para la hipertensión, especialmente el mecanismo renina-angiotensina ha recibido una gran atención científica. En este mecanismo, la angiotensina es segregada por el hígado y se escinde mediante la peptidasa renina para producir el decapéptido biológicamente inactivo angiotensina I. Puesto que la angiotensina I pasa a través de los capilares pulmonares, otra peptidasa, denominada enzima conversora de la angiotensina (en lo sucesivo denominada aquí como ACE), actúa sobre la angiotensina I eliminando los últimos dos restos de la angiotensina I (His-Leu), para formar el octapéptido angiotensina II. El octapéptido de la angiotensina II muestra una fuerte actividad vasoconstrictora, y por lo tanto eleva la tensión arterial. La inhibición de la ACE, que conduce a niveles más bajos de la angiotensina II, evita la vasoconstricción y, de este modo, tensiones arteriales elevadas.

Además de escindir la angiotensina I, la ACE también puede hidrolizar la bradicinina, un nonapéptido que también participa en la regulación de la tensión arterial. En este último mecanismo, la inhibición de la ACE conduce a un aumento de los niveles de bradicinina, lo que promueve la vasodilatación y asimismo reduce la tensión arterial. De este modo, la inhibición de la ACE conduce a efectos reductores de la tensión arterial, vía al menos dos mecanismos separados.

También se sabe que el octapéptido angiotensina II estimula la liberación de aldosterona por la corteza suprarrenal. El órgano diana para la aldosterona es el riñón, en el que la aldosterona promueve el aumento de reabsorción del sodio desde los túbulos renales. También, vía este tercer mecanismo, la inhibición de la ACE reduce la tensión arterial, pero en este caso disminuyendo la reabsorción de sodio.

Debido a sus múltiples efectos fisiológicos, la inhibición de la actividad proteolítica de ACE es una forma eficaz para reducir la tensión arterial. Esta observación ha dado como resultado un número de productos farmacéuticos eficaces que reducen la tensión arterial, tales como captopril y enalapril (Ondetti, M.A. et al., 1977, Science, Washington DC, 196, 441-444).

Debido a que la hipertensión es un estado mórbido relativamente habitual, sería ventajoso contrarrestar este resultado indeseable de estilo de vida moderno con ingredientes naturales levemente activos. Especialmente ingredientes naturales levemente activos que se pueden incorporar en productos alimentarios o de bebidas, debido a que tales productos se consumen regularmente. Como alternativa, tales ingredientes naturales levemente activos se podrían incorporar en suplementos dietéticos. Durante las últimas décadas se ha descubierto que péptidos específicos presentes en la leche fermentada tienen una capacidad inhibidora de la ACE, y pueden inducir reducciones de la tensión arterial en sujetos hipertensos. No obstante, numerosos ensayos in vitro y unos pocos ensayos con animales han demostrado efectos inhibidores de la ACE de diferentes péptidos obtenidos a partir de una variedad de fuentes proteínicas. Aunque los ensayos de inhibición de la ACE in vitro han revelado muchas secuencias peptídicas diferentes, se ha de enfatizar que los péptidos inhibidores de la ACE necesitan circular en la sangre para ejercer un efecto in vivo. La implicación es que los péptidos inhibidores de la ACE eficaces deberían de resistir la degradación por el sistema de digestión proteolítico gastrointestinal, y deberían permanecer intactos durante un transporte subsiguiente a lo largo de la pared intestinal.

Un estudio de la función de la estructura de los diversos péptidos que inhiben la ACE ha sugerido que a menudo poseen un Pro-Pro, Ala-Pro o Ala-Hyp en su secuencia C-terminal (Maruyama, S. y Suzuki, H., 1982; Agric. Biol. Chem., 46(5): 1393-1394). Este hallazgo se explica en parte por el hecho de que la ACE es una peptidildipeptidasa (EC3.4.15.1), incapaz de escindir enlaces peptídicos que impliquen prolina. De este modo, a partir de tripéptidos que tienen la estructura Xaa-Pro-Pro, el dipéptido Pro-Pro no se puede eliminar, debido a que el enlace Xaa-Pro no se puede escindir. Por lo tanto, es concebible que si está presente en concentraciones relativamente elevadas, los tripéptidos que tengan la estructura Xaa-Pro-Pro inhibirán la actividad de la ACE. Puesto que no sólo la ACE sino casi todas las enzimas proteolíticas tienen dificultades escindiendo los enlaces Xaa-Pro o Pro-Pro, la noción de que la presencia de (múltiples) restos de prolina en el extremo carboxi-terminal de péptidos da como resultado moléculas relativamente resistentes a proteasas es casi evidente por sí misma. De forma similar, los péptidos que contienen hidroxiprolina (Hyp) en lugar de prolina son relativamente resistentes a las proteasas. A partir de esto se puede inferir que los péptidos que posean uno o más restos de (hidroxi)prolina en su extremo carboxiterminal probablemente escaparán de la degradación proteolítica en el tubo digestivo. Estas conclusiones nos ayudarán a entender el notable efecto reductor de la tensión arterial in vivo de los péptidos específicos inhibidores de la ACE: no sólo satisfacen los requisitos estructurales para la inhibición de la ACE, sino también resisten a la degradación por el sistema de digestión proteolítico gastrointestinal, y permanecen intactos durante un transporte posterior a lo largo de la pared intestinal.

Se han dado a conocer potentes actividades inhibidoras de ACE para los tripéptidos Leu-Pro-Pro (documento JP 02036127), Val-Pro-Pro (documento EP 0583074) e Ile-Pro-Pro (J. Dairy Sci., 78:777-783 (1995)). Inicialmente, todos los péptidos inhibidores de la ACE se caracterizaron en base a su efecto in vitro sobre la actividad de la ACE, y los tripéptidos Ile-Pro-Pro (en lo sucesivo denominado aquí como IPP), Val-Pro-Pro (en lo sucesivo denominado aquí como VPP) y Leu-Pro-Pro (en lo sucesivo denominado aquí como LPP) destacaron debido a su potente efecto inhibidor de la ACE, que da como resultado valores relativamente bajos de IC_{50}. Más tarde, los efectos antihipertensivos supuestos de los tripéptidos VPP así como IPP se pudieron confirmar en ratas espontáneamente hipertensas (Nakamura et al., J. Dairy Sci., 78:1253-1257 (1995)). En estos experimentos, los tripéptidos inhibidores derivaron de leche fermentada con bacterias del ácido láctico. Durante la fermentación láctea, los péptidos deseables se produjeron mediante proteinasas producidas por las bacterias de ácido láctico en crecimiento. Los péptidos inhibidores de la ACE se concentraron a partir de productos lácteos fermentados tras la electrodiálisis, diálisis en membrana de fibra hueca o métodos cromatográficos, para permitir comercializarlos en forma de suplementos dietéticos concentrados, como comprimidos, o pastillas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a los nuevos tripéptidos MAP y/o ITP, o una sal de MAP y/o una sal de ITP.

La presente invención también se refiere a un hidrolizado proteínico que comprende MAP y/o ITP, o una sal de MAP y/o ITP. Preferiblemente, el hidrolizado proteínico tiene un grado de hidrólisis (DH) de 5 a 50%, más preferiblemente 10 a 40%, y lo más preferible un DH de 20 a 35%. Además, la presente invención se refiere a una mezcla peptídica que comprende MAP y/o ITP, o una sal de MAP y/o ITP. Preferiblemente, esta mezcla peptídica comprende al menos 1 mg de MAP/g de proteína, más preferiblemente al menos 2 mg/g, y lo más preferible 4 mg/g de proteína. Preferiblemente, la mezcla peptídica también comprende LPP y/o IPP. Por lo tanto, la mezcla peptídica comprende también preferiblemente al menos 1 mg de IPP/g de proteína, más preferiblemente al menos 2 mg/g, y lo más preferible al menos 4 mg/g de proteína, y/o la mezcla peptídica también comprende preferiblemente al menos 1 mg de LPP/g de proteína, más preferiblemente al menos 2 mg/g, y lo más preferible al menos 4 mg/g de proteína.

Estas mezclas peptídicas comprenden preferiblemente al menos 30% en peso (materia seca) de péptidos que tienen un MW menor que 500 Da, más preferiblemente 30 a 70% en peso (materia seca) de la mezcla peptídica son péptidos que tienen un MW menor que 500 Da.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un proceso enzimático para producir MAP y/o ITP, preferiblemente mediante hidrólisis enzimática de una fuente proteínica.

Descripción detallada de la invención

Como se muestra en la presente Solicitud, los tripéptidos MAP e ITP son bastante eficaces inhibiendo ACE. Estos efectos inhibidores corresponden a valores sorprendentemente bajos de IC_{50}, respectivamente 0,4 para MAP y 10 para ITP (en \mum), según se determina aquí en la parte experimental. Además, se encuentra que ambos tripéptidos MAP e ITP resisten la degradación proteolítica gastrointestinal, y de este modo se espera que sean estables en el tubo digestivo del ser humano. El tripéptido MAP y/o el tripéptido ITP, y sus sales, son por lo tanto muy adecuados para una inhibición eficaz de la ACE, y se pueden usar por ejemplo en alimento funcional, como un nutracéutico o como un medicamento. El término nutracéutico como se usa aquí representa la utilidad tanto en el campo de aplicación nutricional como farmacéutico. De este modo, las nuevas composiciones nutracéuticas que comprenden MAP y/o ITP pueden encontrar uso como suplemento para alimento y bebidas, y como formulaciones farmacéuticas o medicamentos para la aplicación entérica o parenteral, que pueden ser formulaciones sólidas tales como cápsulas o comprimidos, o formulaciones líquidas, tales como disoluciones, suspensiones o emulsiones.

Los tripéptidos MAP (Met-Ala-Pro) e ITP (Ile-Thr-Pro) se pueden obtener mediante una variedad de métodos, que incluyen síntesis química, hidrólisis enzimática y fermentación de disoluciones que contienen proteínas.

La identificación de péptidos biológicamente activos en mezclas complejas tales como hidrolizados proteínicos o líquidos que resultan de la fermentación es una tarea desafiante. Aparte de las cuestiones básicas: ¿estamos usando el sustrato proteínico correcto?, ¿estamos usando la enzima correcta?, ¿estamos usando el cultivo microbiano correcto?. es de esperar que varios péptidos biológicamente activos estén presentes en muestras complejas que contienen miles de péptidos. Los enfoques tradicionales de identificación, que emplean ciclos repetidos de fraccionamiento cromatográfico de líquidos de altas prestaciones (HPLC) y evaluación bioquímica, generalmente consumen tiempo y tienen tendencia a pérdidas de los péptidos biológicamente activos presentes, haciendo extremadamente difícil la detección de la bioactividad pertinente. En el presente trabajo, se usó un equipo muy sofisticado, y se identificaron muchos hidrolizados proteínicos diferentes y caldos de fermentación, conduciéndonos finalmente a la identificación de los dos nuevos péptidos MAP e ITP que tienen propiedades inhibidoras de ACE. En nuestro enfoque, se acopló en línea un ensayo bioquímico de flujo continuo a un sistema de fraccionamiento mediante HPLC. El efluente de la columna de HPLC se dividió entre un bioensayo de ACE de flujo continuo y una técnica de análisis químico (espectrometría de masas). Los hidrolizados y caldos de fermentación brutos se separaron mediante HPLC, después de lo cual se detectó la presencia de compuestos biológicamente activos por medio del ensayo bioquímico en línea. Los espectros de masas se registraron de forma continua, de forma que la información estructural estuvo inmediatamente disponible cuando un péptido muestra una señal positiva en el ensayo bioquímico.

Los tripéptidos MAP e ITP, como se identifican mediante el enfoque mencionado anteriormente, se pueden producir mediante diversos métodos, incluyendo rutas de producción económicamente viables. La producción vía síntesis química es posible usando técnicas convencionales como, por ejemplo, se describe en "Peptides: Chemistry and Biology" por N. Sewald y H.D. Jakubke, Eds. Wiley-VCH Verlag GmbH, 2002, Capítulo 4. Los métodos eficaces desde el punto de vista del coste particulares de síntesis peptídica química, adecuados para la producción a gran escala, se basan en el uso de cloroformiatos de alquilo o cloruro de pivaloilo para la activación del grupo carboxílico, combinado con el uso de ésteres metílicos para la protección C-terminal, y grupos benciloxicarbonilo (Z) o terc-butiloxicarbonilo para la N-protección. Por ejemplo, en el caso de MAP, se podría acoplar el éster metílico de la L-prolina con Z-Ala activado con cloroformiato de isobutilo; el dipéptido resultante se puede desproteger en Z a través de hidrogenolisis usando hidrógeno y Pd sobre C, y se puede acoplar nuevamente con Z-Met activado mediante cloroformiato de isobutilo; del tripéptido resultante, el éster metílico se hidroliza usando NaOH y, tras la desprotección de Z mediante hidrogenolisis, se obtiene el tripéptido Met-Ala-Pro. De forma similar, Ile-Thr-Pro se puede sintetizar pero durante las reacciones de acoplamiento la función hidroxi de Thr requiere la protección del bencilo; en la etapa final, este grupo se elimina entonces simultáneamente durante la desprotección de Z.

MAP y/o ITP también se pueden obtener mediante hidrólisis enzimática o mediante enfoques fermentativos, usando un sustrato proteínico que contiene la secuencia de aminoácidos de MAP y/o ITP. Ventajosamente, el sustrato proteínico contiene ambos fragmentos MAP e ITP. Los sustratos proteínicos preferidos para tales enfoques enzimáticos o fermentativos son leche bovina o la fracción caseínica de la leche bovina. Mediante la optimización de las condiciones de fermentación o hidrólisis, se puede maximizar la producción de las moléculas biológicamente activas de MAP y/o ITP. La persona experta que trate de maximizar la producción sabrá cómo ajustar los parámetros del proceso, tales como el tiempo de hidrólisis/fermentación, la temperatura de la hidrólisis/fermentación, tipo de enzima/microorganismo y concentración, etc.

MAP y/o ITP, o composiciones que comprenden MAP y/O ITP, son ventajosamente hidrolizados, y preferiblemente se obtienen según un procedimiento que implica las siguientes etapas:

(a)

hidrólisis enzimática de un sustrato proteínico adecuado que comprende MAP o ITP en su secuencia de aminoácidos, dando como resultado un producto proteínico hidrolizado, que comprende los tripéptidos MAP y/o ITP;

(b)

separación a partir del producto proteínico hidrolizado de una fracción rica en tripéptido MAP y/o el tripéptido ITP; y opcionalmente

(c)

concentrar y/o secar la fracción procedente de la etapa b), para obtener un líquido concentrado o un sólido rico en tripéptido MAP y/o en tripéptido ITP.

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La etapa (a) de hidrólisis enzimática puede ser cualquier tratamiento enzimático del sustrato proteínico adecuado, que conduzca a la hidrólisis de la proteína, dando como resultado la liberación de los tripéptidos MAP y/o ITP. Aunque se pueden usar varias combinaciones enzimáticas para liberar los tripéptidos deseados a partir del sustrato proteínico, la enzima preferida usada en el presente procedimiento es una endoproteasa específica para prolina, o una oligopeptidasa específica para prolina. Un sustrato proteínico adecuado puede ser cualquier sustrato que englobe la secuencia de aminoácidos de MAP y/o ITP. Los sustratos proteínicos que se sabe que engloban MAP son, por ejemplo, caseína, gluten de trigo, aislado proteínico de girasol, proteína del arroz, proteína de huevo. Los sustratos proteínicos adecuados engloban preferiblemente las secuencias de aminoácidos de AMAP o PMAP, como ocurre en la beta-caseína bovina, la fracción de alfa-gliadina del gluten de trigo, y en la fracción 2S del aislado de la proteína de girasol.

El sustrato caseínico puede ser cualquier material que contenga una cantidad sustancial de beta-caseína y de alfa-s2-caseína. Los ejemplos de sustratos adecuados son leche así como también caseína, caseína en polvo, concentrados de caseína en polvo, aislados de caseína en polvo, o beta-caseína, o alfa-s2-caseína. Preferiblemente, un sustrato que tiene un elevado contenido de caseína, tal como aislado de proteína caseínica (CPI).

La enzima puede ser cualquier enzima o combinación de enzimas que sea capaz de hidrolizar la proteína, tal como beta-caseína y/o alfa-s2-caseína, dando como resultado la liberación de uno o más de los tripéptidos de MAP y/o ITP.

La etapa de separación (b) se puede ejecutar de cualquier manera conocida por la persona experta, por ejemplo mediante precipitación, filtración, centrifugación, extracción o cromatografía, y sus combinaciones. Preferiblemente, la etapa (b) de separación se realiza usando técnicas de micro- o ultrafiltración. El tamaño de poros de las membranas usadas en la etapa de filtración, así como también la carga de la membrana, se puede usar para controlar la separación del tripéptido MAP y/o del tripéptido ITP. El fraccionamiento de hidrolizados proteínicos de caseína, usando membranas UF/NF cargadas, se describe en Y. Poilot et al., Journal of Membrane Science 158 (1999) 105-114.

La etapa (c) de concentración puede implicar la nanofiltración o evaporación de la fracción generada por la etapa (b), para producir un líquido altamente concentrado. Si se formula adecuadamente, por ejemplo con una actividad de agua baja (Aw), un pH bajo y preferiblemente un conservante tal como benzoato o sorbato, tales composiciones líquidas concentradas forman una forma atractiva de almacenamiento de los tripéptidos según la invención. Opcionalmente, la etapa de evaporación es seguida por una etapa de secado, por ejemplo mediante secado por pulverización o liofilización, para producir un sólido que contiene una concentración elevada de MAP y/o ITP.

El proceso enzimático comprende preferiblemente una única etapa de incubación enzimática. El proceso enzimático según la presente invención se refiere además al uso de una proteasa específica de prolina, que preferiblemente está libre de actividades enzimáticas contaminantes. Una proteasa específica de prolina se define como una proteasa que hidroliza un enlace peptídico en el lado carboxi-terminal de prolina. La proteasa específica de prolina preferida es una proteasa que hidroliza el enlace peptídico en el lado carboxiterminal de los restos de prolina y alanina. La proteasa específica de prolina es preferiblemente capaz de hidrolizar grandes moléculas proteínicas, como polipéptidos o la propia proteína. El procedimiento según la invención tiene en general un tiempo de incubación menor que 24 horas, preferiblemente el tiempo de incubación es menor que 10 horas, y más preferiblemente menor que 4 horas. La temperatura de incubación es en general mayor que 30ºC, preferiblemente mayor que 40ºC, y más preferiblemente mayor que 50ºC.

Otro aspecto de la presente invención es la purificación y/o separación de los tripéptidos MAP e ITP a partir de una proteína hidrolizada. La mayoría de la proteína hidrolizada según la invención es capaz preferiblemente de precipitar en condiciones de pH seleccionadas. Este proceso de purificación comprende alterar el pH hasta el pH en el que la mayoría de la proteína hidrolizada y no hidrolizada precipita, y separar las proteínas precipitadas de los tripéptidos (bioactivos) que permanecen en disolución.

Para obtener los presentes tripéptidos con un resto de prolina en su extremo carboxiterminal, una opción preferida la ofrece el uso de una proteasa que puede escindir en el lado carboxiterminal de los restos de prolina. Las denominadas proliloligopeptidasas (EC 3.4.21.26) tienen la posibilidad única de escindir preferentemente péptidos en el lado carboxílico de restos de prolina. Las proliloligopeptidasas también tienen la posibilidad de escindir péptidos en el lado carboxílico de restos de alanina, pero esta última reacción es menos eficaz que la escisión de enlaces peptídicos que implican restos de prolina. En todas las proteasas específicas de prolina caracterizadas adecuadamente, aisladas de mamíferos así como de fuentes microbianas, se ha identificado un único dominio de peptidasa que excluye grandes péptidos del sitio activo de la enzima. De hecho, estas enzimas son incapaces de degradar péptidos que contienen más de alrededor de 30 restos de aminoácidos, de forma que estas enzimas ahora se denominan como "proliloligopeptidasas" (Fulop et al.: Cell, Vol. 94, 161-170, 24 de julio de 1998). Como consecuencia, estas proliloligopeptidasas requieren una hidrólisis previa con otras endoproteasas, antes de que puedan ejercer su acción hidrolítica. Sin embargo, como se describe en el documento WO 02/45523, incluso la combinación de una proliloligopeptidasa con otra de tales endoproteasas da como resultado hidrolizados caracterizados por una proporción significativamente potenciada de péptidos con un resto de prolina carboxiterminal. Debido a esto, tales hidrolizados forman un excelente punto de partida para el aislamiento de los tripéptidos con efectos inhibidores de la ACE in vitro, así como con una resistencia mejorada a la degradación proteolítica gastrointestinal.

Un "péptido" u "oligopéptido" se define aquí como una cadena de al menos dos aminoácidos, que están enlazados a través de enlaces peptídicos. Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como se reconoce habitualmente), y cada término se puede usar de forma intercambiable según lo requiera el contexto. Un "polipéptido" se define aquí como una cadena que contiene más de 30 restos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de (oligo)péptidos y polipéptidos aquí se escriben de izquierda a derecha, en la dirección desde el término amino hacia el término carboxi, según la práctica habitual. El código de una letra de aminoácidos usado aquí es conocido habitualmente en la técnica, y se puede encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Una mezcla peptídica es una composición que contiene al menos 30% en peso (materia seca) de péptidos, determinado en base al nitrógeno de Kjeldahl, en combinación con la determinación del péptido que tiene un MW menor que
3500 Da.

Una endoproteasa se define aquí como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos en un polipéptido de manera endo, y pertenece al grupo EC 3.4. Las endoproteasas se dividen en sub-subclases, en base al mecanismo catalítico. Hay sub-subclases de serina endoproteasas (EC 3.4.21), cisteína endoproteasas (EC 3.4.22), aspártico endoproteasas (EC 3.4.23), metaloendoproteasas (EC 3.4.24), y treonina endoproteasas (EC 3.4.25). Las exoproteasas se definen aquí como enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos adyacentes a un grupo \alpha-amino terminal ("aminopeptidasas"), o un enlace peptídico entre el grupo carboxílico terminal y el penúltimo aminoácido ("carboxipeptidasas").

El documento WO 02/45524 describe una proteasa específica de prolina, obtenible de Aspergillus niger. La enzima derivada de A. niger escinde preferentemente en el término carboxi de prolina, pero también puede escindir en el término carboxi de hidroxiprolina y, con menor eficacia, en el termino carboxi de alanina. El documento WO 02/45524 también enseña que no existe una homología clara entre esta enzima derivada de A. niger y las proliloligopeptidasas conocidas procedentes de otras fuentes microbianas o de mamíferos. En contraste con las proliloligopeptidasas conocidas, la enzima de A. niger tiene un pH ácido óptimo. Aunque las proliloligopeptidasas conocidas así como también la enzima derivada de A. niger son denominadas serina proteasas, se muestra aquí (Ejemplo 1) que la enzima de A. niger pertenece a una subfamilia completamente diferente. La enzima de A. niger segregada parece ser un miembro de la familia S28 de serina peptidasas, en lugar de la familia S9 en la que se han agrupado la mayoría de las proliloligopeptidasas citosólicas (Rawling, N.D. y Barrett, A.J.; Biochim. Biophys. Acta 1298 (1996) 1-3). En el Ejemplo 2, se muestra el pH y temperatura óptimos de la proteasa específica de prolina, derivada de A. niger. En el Ejemplo 3 se ilustra la elevada preferencia de la endoproteasa específica de prolina, derivada de A. niger, para escindir restos carboxiterminales de prolina y alanina. Además, en este Ejemplo se demuestra que la preparación de la enzima derivada de A. niger, como se usa en el procedimiento de la presente invención, es de forma preferible esencialmente pura, queriendo decir que no hay ninguna actividad endoproteolítica significativa distinta de la actividad endoproteolítica inherente a la endoproteasa específica de prolina pura. También se demuestra que la preparación de la enzima derivada de A. niger usada preferiblemente según la invención no contiene ninguna actividad exoproteolítica, más específicamente ninguna actividad secundaria aminopeptidolítica. Preferiblemente, la actividad exoproteolítica está ausente en la preparación de la enzima derivada de A. niger usada en el procedimiento de la invención. En el documento WO 02/45524 se puede encontrar una prueba experimental para la noción de que la actividad endoproteolítica específica de prolina está esencialmente ausente en cepas de Aspergillus no recombinantes, y también se ilustra en el Ejemplo 3 de la presente Solicitud. Debido a que el procedimiento de la presente invención es posible incubando el sustrato caseínico con sólo la endoproteasa específica de prolina, se pueden seleccionar fácilmente las condiciones óptimas de incubación, como temperatura, pH, etc., y no se tienen que fijar en condiciones por debajo de las óptimas, como sería el caso si se aplicasen dos o más enzimas. Además, se evita la formación de productos secundarios indeseados, como por ejemplo péptidos no bioactivos adicionales, o aminoácidos libres que conducen a gustos caldosos extraños. El tener más grados de libertad a la hora de seleccionar las condiciones de reacción, hace más fácil la selección de otros posibles criterios. Por ejemplo, es mucho más fácil seleccionar ahora condiciones que son menos sensibles a infecciones microbianas y para optimizar las condiciones del pH con relación a las etapas subsiguientes de precipitación de la proteína. En el Ejemplo 4, se muestra que la enzima de Aspergillus no es una oligopeptidasa, sino una endopeptidasa verdadera capaz de hidrolizar proteínas intactas, grandes péptidos, así como también moléculas peptídicas más pequeñas, sin la necesidad de una endoproteasa adicional. Este nuevo y sorprendente hallazgo abre la posibilidad de usar la enzima de A. niger para preparar hidrolizados con contenidos elevados sin precedentes de péptidos con un resto de prolina carboxiterminal, debido a que no se requiere ninguna endoproteasa adicional. Tales nuevos hidrolizados se pueden preparar a partir de diferentes materiales de partida proteinosos, ya sean de origen vegetal o de origen animal. Los ejemplos de tales materiales de partida son caseínas, gelatina, proteínas de pescado o de huevo, gluten de trigo, proteína de soja y de guisante, así como proteína de arroz y proteína de girasol. Puesto que se sabe que el sodio desempeña un papel importante en la hipertensión, los sustratos preferidos para la producción de péptidos que inhiben la ACE son calcio y potasio en lugar de sales sódicas de estas proteínas.

El pH óptimo de la prolilendoproteasa derivada de A. niger es alrededor de 4,3 (véase figura 1). Debido a este óptimo de pH bajo, la incubación de caseinato de leche bovina con la prolilendoproteasa derivada de A. niger no es evidente por sí misma. El caseinato de leche bovina precipitará si el pH cae por debajo de 6,0, pero a pH 6,0 la enzima de A. niger tiene solamente una actividad limitada. Sin embargo, en el Ejemplo 5 se muestra que, incluso en esta condición más bien desfavorable, una incubación con la prolilendoproteasa derivada de A. niger puede producir varios péptidos conocidos inhibidores de la ACE, tales como IPP y LPP. De forma bastante sorprendente, en estas condiciones no se produce VPP. La caseína de leche bovina incorpora un número de diferentes proteínas, incluyendo beta-caseína y kappa-caseína. Según las secuencias amínicas conocidas, la beta-caseína engloba los tripéptidos IPP, VPP y LPP inhibidores de la ACE. La kappa-caseína sólo engloba IPP. El hecho de que la enzima derivada de A. niger no contenga ninguna actividad de aminopeptidasa medible, sugiere fuertemente que el IPP formado se libera a partir de la secuencia -A107-I108-P109-P110- presente en la kappa-caseína. Presumiblemente, el enlace peptídico carboxiterminal de IPP se escinde por la actividad principal de la prolilendoproteasa derivada de A. niger, mientras que la escisión del enlace de Ala-Ile precedente se logra mediante su actividad secundaria específica de Ala. De forma similar, la ausencia de VPP se puede explicar basándose en la ausencia de la actividad secundaria de aminopeptidasa. El VPP está contenido en beta-caseína en la secuencia -P_{81}-V_{82}-V_{83}-V_{84}-P_{85}-P_{86}-. Así, la endoproteasa específica de prolina corta la secuencia VVVPP, pero es incapaz de liberar VPP.

Estos resultados se obtienen incubando el caseinato con la endoproteasa derivada de A. niger, en un procedimiento enzimático simple de una sola etapa. Las disoluciones acuosas que contienen proteína son muy susceptibles a infecciones microbianas, especialmente si se mantienen durante muchas horas a valores de pH por encima de 5,0, y a temperaturas de 50 grados C o inferiores. Especialmente, toxinas microbianas que se pueden producir durante tales etapas prolongadas de incubación, y es probable que sobrevivan tras las etapas de calentamiento, y formen una amenaza potencial a los procesos de grado alimentario. La presente invención usa preferiblemente una temperatura de incubación por encima de 50 grados C. En combinación con el procedimiento enzimático de una sola etapa, en el que la incubación enzimática se lleva a cabo durante un período menor que 24 horas, preferiblemente menor que 8 horas, más preferiblemente menor que 4 horas, el proceso según la invención ofrece la ventaja de una estabilidad microbiológica mejorada. Usando la presente relación enzima-sustrato en combinación con las condiciones de alta temperatura, la escisión de IPP y LPP se completa dentro de un período de incubación de
3 horas.

Debido a que los péptidos IPP y LPP inhibidores de la ACE se pueden escindir de la caseína usando una endoproteasa única, esencialmente pura, la presente invención da como resultado un número más pequeño de péptidos solubles en agua que en los procedimientos de la técnica anterior. Entre estos péptidos solubles en agua, el IPP y LPP están presentes en cantidades importantes. Esto es especialmente importante en el caso de que se necesite una concentración elevada de tripéptidos inhibidores de la ACE sin muchos otros compuestos, a menudo menos activos.

Según el presente procedimiento, preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 30%, lo más preferible al menos 40% de una secuencia -I-P-P- o -L-P-P- presente en una proteína se convierte en el tripéptido IPP o LPP, respectivamente.

En el Ejemplo 6 se ilustra el efecto de la purificación de 5 veces de los péptidos bioactivos mediante una nueva y sorprendente etapa de purificación. La base de este procedimiento de purificación está formada por las propiedades únicas de la endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger. La incubación con esta enzima libera las partes más bioactivas de la molécula sustrato, en forma de tripéptidos solubles en agua. Las partes no o menos bioactivas de la molécula sustrato permanecen en gran medida en partes peptídicas o polipeptídicas no escindidas, y por lo tanto mucho más grandes, de las moléculas sustrato. Debido a las solubilidades limitadas en agua de estas partes peptídicas o polipeptídicas más grandes en condiciones de pH seleccionadas, estas partes nada o menos bioactivas de la molécula sustrato se separan fácilmente de los tripéptidos bioactivos mucho más solubles. En este proceso, el hidrolizado inicial se forma durante el breve período de incubación enzimática a 55 grados C, pH 6,0, y entonces se calienta opcionalmente hasta una temperatura por encima de 80 grados C para exterminar todos los microorganismos contaminantes e inactivar la prolilendoproteasa derivada de A. niger. Subsiguientemente, el hidrolizado se acidifica para obtener una caída de pH hasta 4,5, o al menos por debajo de 5,0. A este valor del pH, que no se puede usar para inactivar la prolilendopeptidasa derivada de A. niger, debido a que representa la condición óptima para la enzima, todos los grandes péptidos procedentes del caseinato precipitan, de forma que sólo permanecen en disolución los péptidos más pequeños. A medida que los caseinatos precipitados se pueden eliminar fácilmente mediante decantación o una etapa de filtración o una centrifugación a baja velocidad (es decir, por debajo de 5000 rpm), la fase acuosa contiene una proporción elevada de péptidos bioactivos, con relación a la cantidad de proteína presente. Según los datos de Kjeldahl, el 80 a 70% de la proteína del caseinato se elimina mediante la etapa de centrifugación a baja velocidad, lo que implica una purificación de cuatro a cinco veces de los péptidos inhibidores de la ACE. Se ha encontrado que este principio de purificación se puede aplicar ventajosamente para obtener asimismo péptidos biológicamente activos obtenidos a partir de material proteinoso distinto de caseína. También, no sólo se pueden separar y purificar según el presente procedimiento los hidrolizados producidos enzimáticamente, sino también las proteínas que son fermentadas mediante microorganismos adecuados. La incubación de la enzima y del sustrato a un valor del pH próximo al que el sustrato precipitará y al que la enzima es aún activa, permitirá esta etapa de purificación. Debido al óptimo de pH bajo de la prolinaendoproteasa derivada de A. niger, se pueden considerar precipitaciones del sustrato en el intervalo entre pH 1,5 a 6,5. A la vista de su comportamiento específico de precipitación, las precipitaciones de gluten por encima de pH 3,5, las precipitaciones de proteína de girasol por encima de pH 4,0 y por debajo de pH 6,0, y las precipitaciones de clara de huevo por encima de pH 3,5 y por debajo de pH 5,0 forman ejemplos de condiciones mediante las cuales se pueden separar los precipitados proteínicos hidrolizados y las proteínas precipitadas, a partir de las proteínas o péptidos hidrolizados.

Tras la decantación, filtración o centrifugación a baja velocidad, los sobrenadantes que contienen los péptidos biológicamente activos se pueden recuperar en un estado puro. Una etapa posterior de evaporación y de secado por pulverización producirá una ruta económica para obtener una pasta o polvo de grado alimentario, con una elevada bioactividad. Al digerir los caseinatos según el procedimiento como se describe, se obtiene un polvo blanco e inodoro, con una concentración elevada de péptidos inhibidores de la ACE. Como alternativa, se puede usar la evaporación o nanofiltración para concentrar posteriormente los péptidos bioactivos. La formulación apropiada de tal concentrado incrementando la actividad del agua (Aw) en combinación con un ajuste del pH, y la adición de un conservante de grado alimentario como un benzoato o un sorbato, producirá un concentrado líquido de grado alimentario microbiológicamente estabilizado de los péptidos reductores de la tensión arterial. Si se diluye apropiadamente hasta la concentración correcta de tripéptido, se obtiene un material de partida versátil adecuado para dotar a todo tipo de alimentos y bebidas con propiedades inhibidoras de la ACE. Si se requiere, el sobrenadante obtenido tras la decantación, filtración o centrifugación a baja velocidad se puede procesar adicionalmente para mejorar el sabor del producto final. Por ejemplo, el sobrenadante se puede poner en contacto con carbón activado en polvo, seguido de una etapa de filtración, para eliminar el carbón. Para minimizar la amargura del producto final, el sobrenadante obtenido tras la decantación, filtración o centrifugación a baja velocidad también se puede someter a una incubación con otra proteasa, tal como subtilisina, tripsina, una proteasa neutra o una endoproteasa específica de glutamato. Si se requiere, la concentración de los ingredientes bioactivos MAP y/o ITP se puede aumentar más todavía mediante etapas de purificación subsiguientes en las que se hace uso del carácter hidrófilo/hidrófobo específico de los tripéptidos MAP e ITP. Los métodos preferidos de purificación incluyen nanofiltración (separación por tamaño), extracción, por ejemplo con hexano o butanol seguido de evaporación/precipitación, o poniendo en contacto el hidrolizado acidificado según se obtiene con resinas cromatográficas de la gama Amberlite XAD (Roehm). También se pueden usar resinas de butil-sefarosa suministradas por Pharmacia.

En el Ejemplo 7 se describe la identificación de los nuevos péptidos MAP e ITP, inhibidores de la ACE, en un hidrolizado de caseína preparado usando la endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger, en combinación con el nuevo procedimiento de purificación peptídica. Sólo el uso de esta única (y esencialmente pura) endoproteasa, en combinación con la eliminación de una gran proporción de los péptidos no bioactivos y con un equipo de separación e identificación altamente sofisticado, ha permitido trazar e identificar estos nuevos tripéptidos inhibidores de la ACE. En los péptidos bioactivos derivados de caseína (CDBAP) preparados según el Ejemplo 7 (tras la precipitación), los tripéptidos MAP e ITP se identificaron en cantidades que corresponden con 2,9 mg de MAP/gramo de CDBAP (4,8 mg de MAP/gramo de proteína en CDBAP) y 0,9 mg de ITP/gramo de CDBAP (1,4 mg de ITP/gramo de proteína en CDBAP). Una característica adicional de CDBAP es su contenido extraordinariamente elevado de prolina, de 24% en base molar. Los ensayos descritos en este Ejemplo 7 ilustran los valores de IC_{50} muy bajos para los dos nuevos tripéptidos en el ensayo modificado de Matsui, es decir, 0,5 micromoles/l para MAP y 10 micromoles/l para ITP. Este hallazgo es incluso más sorprendente si observamos que IPP, uno de los péptidos naturales inhibidores de la ACE más eficaces conocidos, tiene un valor de IC_{50} en este ensayo de Matsui modificado de 2,0 micromoles/l.

Según el presente procedimiento, preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 30%, lo más preferible al menos 40% de una secuencia -M-A-P- o -I-T-P- presente en una proteína se convierte en el tripéptido MAP o ITP, respectivamente.

La utilidad de los recientemente identificados péptidos MAP e ITP inhibidores de la ACE se ilustra adicionalmente en el Ejemplo 8. En este último Ejemplo, se muestra que ambos péptidos sobreviven a las condiciones de incubación que simulan las condiciones digestivas encontradas típicamente en el tubo digestivo. Basándose en estos datos, se concluye que es probable que los nuevos tripéptidos sobrevivan en el tubo digestivo de los mamíferos (por ejemplo del ser humano), implicando un considerable potencial económico si se usan para tratar la hipertensión.

En el Ejemplo 9 se demuestra que el superior péptido MAP inhibidor de la ACE no sólo se puede producir en experimentos de hidrólisis enzimática, sino también es detectable en preparaciones lácteas fermentadas con un microorganismo de grado alimentario apropiado. Sin embargo, no se ha podido demostrar la presencia del péptido ITP en tal producto fermentado.

Los péptidos MAP y/o ITP, según se obtienen antes o después de etapas adicionales de purificación (por ejemplo cromatográficas), se pueden usar para la incorporación en productos alimentarios que se consuman ampliamente de forma regular. Los ejemplos de tales productos son margarinas, productos para untar, diversos productos lácteos tales como mantequilla o yogures o leche o bebidas que contengan suero. Aunque tales composiciones se administran típicamente a seres humanos, también se pueden administrar a animales, preferiblemente mamíferos, para aliviar la hipertensión. Adicionalmente, la elevada concentración de inhibidores de la ACE en estos productos según se obtienen hace a estos productos muy útiles para la incorporación en suplementos dietéticos en forma de pastillas, comprimidos, o disoluciones altamente concentradas o pastas o polvos. Son de particular interés los suplementos dietéticos de liberación lenta, que asegurarán una liberación continua de los péptidos inhibidores de la ACE. Los péptidos MAP y/o ITP según la invención se pueden formular como un polvo seco en, por ejemplo, una pastilla, un comprimido, un gránulo, un saquito o una cápsula. Como alternativa, las enzimas según la invención se pueden formular como un líquido en, por ejemplo, un jarabe o una cápsula. Las composiciones usadas en las diversas formulaciones y que contienen las enzimas según la invención también pueden incorporar al menos un compuesto del grupo que consiste en un vehículo, adyuvante, excipiente, estabilizante, tampón y diluyente fisiológicamente aceptables, términos los cuales son usados en el sentido normal para indicar sustancias que ayudan en el envasado, suministro, absorción, estabilización, o, en el caso de un adyuvante, potenciación del efecto fisiológico de las enzimas. Los antecedentes pertinentes sobre los diversos compuestos que se pueden usar en combinación con las enzimas según la invención en una forma de polvo se pueden encontrar en "Pharmaceutical Dosage Forms", segunda edición, Volúmenes 1, 2 y 3, ISBN 0-8247-8044-2 Marcel Dekker, Inc. Aunque los péptidos inhibidores de la ACE según la invención, formulados como un polvo seco, se pueden almacenar durante períodos más bien prolongados, se debería evitar el contacto con la humedad o aire húmedo escogiendo un envase adecuado tal como, por ejemplo, un blíster de aluminio. Una forma de aplicación oral relativamente nueva es el uso de diversos tipos de cápsulas de gelatina o de comprimidos a base de gelatina.

A la vista de la importancia de los péptidos naturales inhibidores de la ACE para luchar contra la hipertensión, la actual ruta nueva y económicamente eficaz ofrece un punto de partida para productos alimentarios, o incluso veterinarios, levemente hipotensores. Debido a que la actual ruta también incluye una etapa de purificación sorprendentemente simple, también aumentan las posibilidades de suplementos dietéticos concentrados que reducen la tensión arterial.

Mediante la endoproteasa específica de prolina usada según la invención se quiere decir el polipéptido como se menciona en las reivindicaciones 1-5, 11 y 13 del documento WO 02/45524. Por lo tanto, esta endoproteasa específica de prolina es un polipéptido que tiene una actividad endoproteolítica específica de prolina, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 40% con los aminoácidos 1 a 526 de SEQ ID NO:2 o un fragmento de la misma;

(b) un polipéptido que está codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de baja restricción con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:1 o un fragmento de la misma, que es al menos 80% o 90% idéntica a lo largo de 60, preferiblemente a lo largo de 100 nucleótidos, más preferiblemente al menos 90% idéntica a lo largo de 200 nucleótidos, o (ii) una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 son como se muestran en el documento WO 02/45524. Preferiblemente, el polipéptido está en forma aislada.

El polipéptido preferido usado según la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, e incluso más preferiblemente al menos 90%, lo más preferible al menos 95%, e incluso lo más preferible al menos alrededor de 97% de identidad con los aminoácidos 1 a 526 de SEQ ID NO:2, o que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

Preferiblemente, el polipéptido está codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de baja restricción, más preferiblemente en condiciones de restricción media, y lo más preferible en condiciones de alta restricción, con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:1 o un fragmento de la misma, o (ii) una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1.

La expresión "capaz de hibridarse" significa que el polinucleótido diana de la invención se puede hibridar con el ácido nucleico usado como sonda (por ejemplo, la secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO:1, o un fragmento de la misma, o el complemento de SEQ ID NO:1) en un nivel significativamente por encima del fondo. La invención también incluye el uso según las reivindicaciones de polinucleótidos que codifican la endoproteasa específica de prolina de la invención, así como secuencias nucleotídicas que son complementarias a aquellos. La secuencia nucleotídica puede ser ARN o ADN, incluyendo ADN genómico, ADN sintético o ADNc. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica es ADN, y lo más preferible una secuencia de ADN genómico. Típicamente, un polinucleótido de la invención comprende una secuencia contigua de nucleótidos que es capaz de hibridarse en condiciones selectivas a la secuencia codificante o al complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO:1. Tales nucleótidos se pueden sintetizar según métodos bien conocidos en la técnica.

Un polinucleótido de la invención se puede hibridar a la secuencia codificante o al complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO:1 a un nivel significativamente por encima del fondo. La hibridación de fondo puede producirse, por ejemplo, debido a otros ADNc presentes en la librería de ADNc. El nivel de señal generado mediante la interacción entre un polinucleótido de la invención y la secuencia codificante o complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO:1 es típicamente al menos 10 veces, preferiblemente al menos 20 veces, más preferiblemente al menos 50 veces, e incluso más preferiblemente al menos 100 veces, tan intensa como las interacciones entre otros polinucleótidos y la secuencia codificante de SEQ ID NO:1. La intensidad de interacción se puede medir, por ejemplo, radiomarcando la sonda, por ejemplo con 32P. La hibridación selectiva se puede lograr típicamente usando condiciones de baja restricción (cloruro de sodio 0,3 M y citrato de sodio 0,03 M a alrededor de 40ºC), restricción media (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3 M y citrato de sodio 0,03 M a alrededor de 50ºC) o de elevada restricción (por ejemplo, cloruro de sodio 0,3 M y citrato de sodio 0,03 M a alrededor de 60ºC).

El paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que se puede usar para calcular la identidad (por ejemplo usado con los valores que vienen por defecto).

También se pueden usar los algoritmos PILEUP y BLAST N para calcular la identidad de secuencias o para alinear las secuencias (tal como la identificación equivalente o secuencias correspondientes, por ejemplo en sus valores por defecto).

El programa de ordenador para llevar a cabo los análisis de BLAST está disponible públicamente a través de National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar identificar un par de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda que concuerda o satisface alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de bases de datos. T se denomina como el umbral de puntuación de palabra en la vecindad. Estos resultados de palabra en la vecindad iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar los HSP que los contienen. Los resultados de las palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como se pueda incrementar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las extensiones para los resultados de la palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación del alineamiento acumulativo cae en una cantidad X desde su valor máximo logrado; la puntuación acumulativa llega hasta cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos residuales de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como defecto una longitud de palabra (W) de 11, las alineaciones de matriz de puntuación BLOSUM62 (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación entre ambas
hebras.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual se puede producir por casualidad una concordancia entre dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de la suma más pequeña, en comparación con la primera secuencia con la segunda secuencia, es menor que alrededor de 1, preferiblemente menor que alrededor de 0,1, más preferiblemente menor que alrededor de 0,01, y lo más preferible menor que alrededor de 0,001.

Las cepas del género Aspergillus tienen un estatus de grado alimentario, y las enzimas derivadas de estos microorganismos se sabe que proceden de una fuente de grado alimentario no sospechosa. Según otra realización preferida, la enzima se segrega mediante su célula productora, en lugar de una denominada enzima citosólica no segregada. De esta manera, las enzimas se pueden recuperar del caldo celular en un estado esencialmente puro, sin etapas de purificación caras. Preferiblemente, la enzima tiene una elevada afinidad por su sustrato en las condiciones de pH y temperatura predominantes.

Descripción de las figuras

Figura 1: una representación gráfica del pH óptimo de la prolilendoproteasa derivada de A. niger.

Figura 2: perfil de especificidad de la prolilendoproteasa derivada de A. niger.

Figura 3: SDS-PAGE de ovoalbúmina intacta y un péptido 27-mer sintético tras la incubación con endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger, purificada cromatográficamente.

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Materiales y Métodos Materiales

La pulverización de caseinato de potasio comestible (88%) se obtuvo de DMV International, Países Bajos. Los péptidos cromogénicos sintéticos se obtuvieron de Pepscan Systems B. V. Países Bajos, o de Bachem, Suiza.

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Endoproteasa específica de prolina procedente de A. niger

La sobreproducción de la endoproteasa específica de prolina a partir de Aspergillus niger se logró como se describe en el documento WO 02/45524. La actividad de la enzima se ensayó en el péptido sintético Z-Gly-Pro-pNA a 37 grados C en un tampón de citrato/fosfato disódico, pH 4,6. El producto de la reacción se monitorizó espectrofotométricamente a 405 nm. Una unidad se define como la cantidad de enzima que libera 1 \mumol de p-nitroanilida por minuto en estas condiciones de ensayo.

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Purificación cromatográfica de la endoproteasa derivada de A. niger

El caldo de cultivo obtenido a partir de una cepa de A. niger sobreproductora se usó para la purificación cromatográfica de la proteasa, para eliminar cualquier actividad endo- y exoproteolítica contaminante. Para ese fin, el caldo de fermentación se centrifugó en primer lugar para eliminar el grueso de la masa fúngica, y el sobrenadante se hizo pasar entonces a través de un número de filtros con tamaños decrecientes de poros, para eliminar todos los fragmentos celulares. Finalmente, el ultrafiltrado obtenido se diluyó diez veces en 20 milimoles/litro de acetato de sodio, pH 5,1, y se aplicó en una columna Q-Sepharose FF. Las proteínas se eluyeron en un gradiente de 0 a 0,4 moles/litro de NaCl en 20 milimoles/litro de acetato de sodio pH 5,1. Las fracciones pico que presentan actividad frente a la escisión de Z-Gly-Pro-pNA se recogieron y se agruparon, según el protocolo descrito en World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209-212 (1995), pero en condiciones de ensayo ligeramente modificadas. Teniendo en cuenta el pH ácido óptimo de la endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger, el ensayo enzimático se llevó a cabo a pH 4,6 en un tampón de citrato/difosfato, a 37ºC. La reunión de las fracciones activas, seguido de la concentración, produjo finalmente una preparación que mostró sólo una única banda en SDS-PAGE y un pico en HP-SEC. Análisis posteriores mediante cromatografía de interacción hidrófoba confirmaron la pureza de la preparación enzimática
obtenida.

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Análisis de LC/MS/MS usado en la detección de IPP, LPP y VPP

Se usó HPLC, que usa un espectrómetro de masas de atrapamiento de iones (Thermoquest®, Breda, Países Bajos) acoplado a una bomba P4000 (Thermoquest®, Breda, Países Bajos), en la cuantificación de los péptidos de interés, entre estos los tripéptidos IPP, LPP y VPP, en los hidrolizados proteínicos enzimáticos producidos por la mezcla enzimática de la invención. Los péptidos formados se separaron usando una columna Inertsil 3 ODS 3, 3 \mum, 150\pm2,1 mm (Varian Belgium, Bélgica), en combinación con un gradiente de ácido fórmico al 0,1% en agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA; Disolución A) y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (Disolución B), para elución. El gradiente comenzó con 100% de Disolución A, se mantuvo así durante 5 minutos, aumentando linealmente hasta 5% de B en 10 minutos, seguido del incremento lineal hasta 45% de Disolución B en 3 minutos, y volviendo inmediatamente a las condiciones de partida, y se mantuvo así 15 minutos para la estabilización. El volumen de inyección usado fue 50 microlitros, el caudal fue 200 microlitros por minuto, y la temperatura de la columna se mantuvo a 55ºC. La concentración proteínica de la muestra inyectada fue aproximadamente 50 microgramos/mililitro.

Se obtuvo información detallada sobre los péptidos individuales usando MS/MS dedicada para los péptidos de interés, usando energía de colisión óptima de alrededor de 30%. La cuantificación de los péptidos individuales se realizó usando calibración externa, usando los iones de los fragmentos más abundantes observados en el modo MS/MS.

El tripéptido LPP (M = 325,2) se usó para ajustar la sensibilidad óptima en el modo MS, y para la fragmentación óptima en el modo MS/MS, llevando a cabo una infusión constante de 5 \mug/ml, dando como resultado una molécula protonada en el modo MS, y una energía de colisión óptima de alrededor de 30% en el modo MS/MS, generando una serie de iones B e Y.

Antes de la LC/MS/MS, los hidrolizados proteínicos enzimáticos se centrifugaron a temperatura ambiente y 13000 rpm durante 10 minutos, se filtraron a través de un filtro de 0,22 \mum, y el sobrenadante se diluyó 1:100 con agua
Milli Q.

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Nitrógeno de Kjeldahl

El nitrógeno de Kjeldahl total se midió mediante análisis de inyección de flujo. Usando un sistema de inyección de flujo Tecator FIASTAR 5000, equipado con un TKN Method Cassette 5000-040, un ordenador Pentium 4 con programa SOFIA, y un Tecator 5027 Autosampler, se cuantificó a 590 nm el amoníaco liberado a partir de las disoluciones que contienen proteína. Se coloca en el tubo de digestión una cantidad de muestra que corresponde al intervalo dinámico del método (0,5-20 mg N/l), junto con ácido sulfúrico al 95-97% y un Kjeltab sometido a un programa de digestión de 30 minutos a 200 grados C, seguido de 90 minutos a 360 grados C. Tras la inyección en el sistema FIASTAR 5000, se midió el pico de nitrógeno, a partir del cual se puede inferir la cantidad de proteína medida.

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Análisis de aminoácidos

Se disolvió una muestra pesada de forma precisa del material proteinoso en ácido diluido, y los precipitados se eliminaron mediante centrifugación en una centrífuga Eppendorf. El análisis de los aminoácidos se llevó a cabo sobre el sobrenadante claro, según el método PicoTag como se especifica en el manual de funcionamiento del sistema de análisis de aminoácidos de Waters (Milford MA, USA). Para este fin, se obtuvo una muestra adecuada a partir del líquido, después se secó y se sometió a hidrólisis ácida en fase de vapor, y se derivatizó usando isotiocianato de fenilo. Los diversos aminoácidos derivatizados presentes se cuantificaron usando métodos de HPLC, y se añadieron para calcular el nivel total de aminoácidos libres en la muestra pesada. Los aminoácidos Cys y Trp no están incluidos en los datos obtenidos en este análisis.

El grado de hidrólisis (DH) del hidrolizado proteínico se midió usando un ensayo OPA rápido, y se calculó como se describe (Nielsen et al., JFS, Vol. 66, NO 5, 642-646, 2001).

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Distribución de pesos moleculares de péptidos y proteínas presentes en los hidrolizados

El análisis de la distribución de tamaños de péptidos de muestras proteínicas tratadas con proteasa se realizó en un sistema de HPLC automatizado, equipado con una bomba de alta presión, un dispositivo de inyección capaz de inyectar 10-100 \mul de muestra, y un detector de UV, capaz de monitorizar el efluente de la columna a 214 nm.

La columna usada para este análisis fue una columna Superdex Peptide HR 10/300 GL (Amersham), equilibrada con un tampón de pH 7 de 20 mM de fosfato de sodio/250 mM de cloruro de sodio. Tras inyectar una muestra (típicamente 50 \mul), los diversos componentes se eluyeron a partir de la columna con tampón en 90 minutos a un caudal de 0,5 ml/min. El sistema se equilibró usando una mezcla de citocromo C (Mw 13500 Da), aprotinina (Mw 6510 Da) y tetraglicina (Mw 246 Da), como marcadores de pesos moleculares.

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Ejemplo 1 La enzima según se obtiene a partir de A. niger representa una nueva clase de enzimas específicas de prolina

A partir de toda la secuencia codificante de la endoproteasa específica de prolina, derivada de A. niger, según se proporciona en el documento WO 02/45524 se puede determinar una secuencia proteínica de 526 aminoácidos. La novedad de la enzima se confirmó mediante búsquedas BLAST de bases de datos, tales como SwissProt, PIR y trEMBL. Sorprendentemente, no se pudo detectar una homología clara entre la enzima de A. niger y las proliloligopeptidasas conocidas. Sin embargo, una inspección más detallada de la secuencia de aminoácidos reveló una homología baja pero significativa con Pro-X carboxipeptidasas (EC 3.4.16.2), dipeptidilaminopeptidasas I (EC 3.4.14.2), y serina proteasa específica del timo. Todas estas familias han sido asignadas a la familia S28 de serina peptidasas. También, la configuración GxSYxG alrededor de la serina de sitio activo se conserva entre estas enzimas y la endoproteasa derivada de A. niger. Adicionalmente, los miembros de la familia S28 tienen un pH ácido óptimo, tienen especificidad por la escisión en el lado carboxi-terminal de restos de prolina, y se sintetizan con una secuencia señal y propéptido justamente como la endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger. También, el tamaño de la enzima de A. niger es similar al de los miembros de la familia S28. Por lo tanto, parece que la endoproteasa específica de prolina de A. niger es un miembro de la familia S28 de serina proteasas, en lugar de la de la familia S9 en la que se han agrupado la mayoría de las proliloligopeptidasas citosólicas, incluyendo la enzima obtenida a partir de Flavobacterium meningosepticum. En base a estos rasgos estructurales y fisiológicos, se ha concluido que la enzima de A. niger pertenece a la familia S28 en lugar de la S9 de serina proteasas. Un rasgo adicional que discrimina la enzima derivada de A. niger de las proliloligopeptidasas que pertenecen a la familia S9 es el hecho de que, a diferencia de las prolilendoproteasas citosólicas que pertenecen a esta última familia, la enzima de A. niger recientemente identificada se segrega en el medio de crecimiento. Este es el primer informe sobre el aislamiento y caracterización de un miembro de la familia S28 procedente de una eucariota inferior.

Ejemplo 2 El pH y temperatura óptimos de la endoproteasa específica de prolina según se obtiene a partir de A. niger

Para establecer el pH óptimo de la endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger, se prepararon tampones con diferentes valores de pH. Se obtuvieron tampones de pH 4,0 - 4,5 - 4,8 - 5,0 - 5,5 y 6,0, usando 0,05 moles/l de acetato de sodio y 0,02 M de CaCl2; se obtuvieron tampones de pH 7,0 y 8,0 usando tampones de 0,05 M de Tris/HCl que contienen 0,02 M de CaCl2. Los valores del pH se ajustaron usando ácido acético y HCl, respectivamente. Como sustrato, se usó el péptido sintético cromógeno Z-Gly-Pro-pNA. La disolución de tampón, la disolución de sustrato y la predilución de prolilendoproteasas (en una actividad de 0,1 U/ml) se calentaron hasta exactamente 37,0ºC en un baño de agua. Después de mezclar, la reacción se siguió espectrofotométricamente a 405 nm a 37,0ºC durante 3,5 minutos, midiendo cada 0,5 minutos. A partir de los resultados mostrados en la Figura 1, está claro que la endoproteasa específica de prolina derivada de a. niger tiene un pH óptimo alrededor de 4.

También se estableció el óptimo de temperatura de la prolilendoproteasa. Con este fin, la preparación enzimática purificada se incubó en 0,1 ml/l de acetato de sodio que contiene 0,02 ml/l de CaCl2, a pH 5,0, durante 2 horas a diferentes temperaturas, usando como sustrato Caseine Resorufine (Roche versión 3), y la actividad enzimática se cuantificó midiendo a 574 nm. Según los resultados obtenidos, la endoproteasa específica de prolina procedente de A. niger tiene una temperatura óptima alrededor de 50 grados C.

Ejemplo 3 La especificidad y pureza de la endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger

Se ensayaron muestras de enzima bruta así como cromatográficamente purificada, según se obtienen a partir de una cepa de A. niger que contiene múltiples copias del casete de expresión (véase el documento WO 02/45524), frente a un conjunto de sustratos peptídicos cromógenos, para establecer la especificidad de la endoproteasa codificada. Usando diferentes conjuntos de péptidos cromógenos, se estableció la presencia de posibles actividades enzimáticas contaminantes. La especificidad endoproteolítica de la endoproteasa codificada se ensayó en diferentes sustratos Ala-Ala-XpNA (AAXpNA). En este contexto, "X" se refiere a los diferentes restos de aminoácidos naturales, y "pNA" a p-nitroanilida. La escisión del enlace peptídico entre el resto "X" y el resto de pNA de la molécula provoca un cambio de color que se puede monitorizar mediante un incremento en la absorbancia de la luz a lambda = 405 ó 410 nm. El sustrato AAXpNA. Con ese fin, se diluyeron 100 X disoluciones madre de sustratos AAX-pNA (150 mmoles/l) en tampón de acetato 0,1 M pH 4,0, que contiene 20 CaCl2. Las medidas de cinética de 10 minutos, en un lector TECAN Genios MTP (Salzburg, Viena), a 405 nm, registraron los incrementos de la densidad óptica que, vía el procesamiento de datos en Excel, produjeron el dibujo mostrado en la Figura 2. A partir del resultado, está claro que la endoproteasa derivada de A. niger es muy específica de enlaces de prolilpéptido, con una actividad secundaria con respecto a los enlaces de alanilo. Las preparaciones brutas y cromatográficamente purificadas mostraron perfiles de actividad similares.

Una posible contaminación de la endoproteasa derivada de A. niger con actividades enzimáticas extrañas condujo a un número de reacciones secundarias indeseables. Por ejemplo, la presencia de exoproteasas, tales como carboxipeptidasas o aminopeptidasas, da como resultado preparaciones peptídicas que tienen mayores niveles de aminoácidos libres. Estos aminoácidos libres extra diluyen las concentraciones relativas de los péptidos bioactivos presentes y, además, proporcionan sabores caldosos como resultado del aumento de las reacciones de Maillard. En el caso en que existan serios niveles de endoproteasas contaminantes en la preparación de la endoproteasa específica de prolina sobreexpresada, se introducen sitios de escisión en otras posiciones distintas de la carboxiterminal de los restos de prolina o alanina. Tales sitios de escisión extra generan péptidos extra, diluyendo también de ese modo la concentración de péptidos bioactivos que tienen restos de prolina carboxiterminales. Para minimizar todas estas reacciones secundarias indeseables, se prefiere el uso de una proteasa específica de prolina esencialmente pura. Esencialmente pura significa que la actividad de endoproteasas contaminantes, así como exopeptidasas contaminantes, en las condiciones de incubación usadas, son mínimas o no existen preferiblemente. Se ideó el siguiente procedimiento de ensayo para cuantificar tales actividades de endo- y exopeptidasas contaminantes.

La base para el procedimiento de ensayo está formada por una colección de diversos péptidos cromógenos selectivos. Debido a que sólo las oligo- y endopeptidasas específicas de prolina pueden liberar pNA del péptido Z-AAAP-pNA, se usó este péptido particular para cuantificar la actividad endoproteolítica específica de prolina deseada. Debido a que muchas endoproteasas pueden liberar pNA a partir de los péptidos Z-AAAF-pNA y Z-AAAR-pNA, se usaron estos dos péptidos para cuantificar la actividad endoproteolítica no específica de prolina, contaminante.

Debido a que muchas aminopeptidasas pueden liberar eficazmente Phe y Gln a partir de sustratos peptídicos, se usaron los péptidos cromógenos Q-pNA y V-pNA para cuantificar las actividades de aminopeptidasas contaminantes.

Debido a que muchas carboxipeptidasas pueden liberar restos de Phe y Arg a partir de sustratos peptídicos, se seleccionaron péptidos que contienen estos restos para cuantificar actividades de carboxipeptidasas contaminantes. Sin embargo, no existen grupos cromógenos adecuados para medir las actividades de carboxipeptidasas, de forma que se tuvo que desarrollar un método alternativo usando los péptidos sintéticos Z-AF y Z-AR. Este método alternativo se proporciona más abajo. En todos los péptidos sintéticos usados, "Z" representa benciloxicarbonilo, y "pNA" la para-nitroanilida cromófora. Todos los péptidos cromógenos se obtuvieron de Pepscan (Lelystad, Países Bajos). Los péptidos Z-AF y Z-AR se adquirieron de Bachem (Suiza). Todas las incubaciones se llevaron a cabo a 40ºC. Las preparaciones enzimáticas diluidas se recalcularon hasta la concentración del producto comercial.

Para ilustrar los niveles de las diversas actividades enzimáticas que están presentes regularmente en preparaciones enzimáticas industrialmente disponibles, en este Ejemplo se describe el ensayo de tres preparaciones enzimáticas comerciales en busca de sus diversas actividades proteolíticas, es decir: Flavourzyme 1000L Batch HPN00218 (Novozymes), Sumizyme FP (Shin Nihon, Japón) y Corolase LAP Ch.: 4123 (AB Enzymes, UK). Se sabe que tanto Flavourzyme como Sumizyme FP son preparaciones enzimáticas complejas que contienen varias actividades enzimáticas aminopeptidolíticas, además de actividades endoproteolíticas y carboxipeptidolíticas no especificadas. Corolase LAP representa una actividad de aminopeptidasa de leucina relativamente pura, clonada y sobreexpresada, procedente de Aspergillus.

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Medida de las actividades de aminopeptidasas

Se diluyeron 80 veces disoluciones madre de 150 mmoles/l de F-pNA y Q-pNA, en DMSO al 100%, en tampón de BisTris 0,1 M pH 6 para obtener una disolución sustrato de 3,75 mmoles/l de F-pNA + Q-pNA, que contiene F-pNA y Q-pNA en una relación 1:1. Se pipeteó una alícuota de 200 \mul de esta disolución de sustrato de aminopeptidasa en pocillos separados de una placa de microtitulación (MTP). La MTP se preincubó a 40ºC en Tecan Genios MTP (Salzburg, Viena), que funciona con el programa Magellan4. La reacción se inició añadiendo 50 \mul de la disolución enzimática apropiada, de forma que las incubaciones tuvieron lugar a una concentración de sustrato de 3 mM. Típicamente, se usó una dilución 1:50 de las muestras enzimáticas líquidas Flavourzyme, Corolase LAP y endoproteasa específica de prolina. Del producto Sumizyme FP seco, se usó una disolución al 1%.

El color amarillo, según se mide a 405 nm mediante el aparato Tecan Genios MTP, que se desarrolla como resultado de la escisión del enlace aminoácido-pNA, se siguió durante al menos 20 ciclos cinéticos (alrededor de 10 minutos). El programa de ordenador generó los datos obtenidos como OD_{405}/min.

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Medida de la actividad de endoproteasa específica de prolina

Esta medición se llevó a cabo esencialmente de la misma manera que el ensayo de aminopeptidasa, pero en este caso se usó Z-AAAP-pNA como el único sustrato, en una concentración final de 3 mmoles/l. Este sustrato se solubilizó calentando la suspensión, en tampón de pH 6, hasta 50-55ºC, dando como resultado una disolución clara a temperatura ambiente. Las medidas se llevaron a cabo a 40ºC.

Típicamente se usó una dilución 1:50 de las muestras enzimáticas líquidas Flavourzyme y Corolase LAP. La Sumizyme FP se usó en una disolución al 1%. La endoproteasa específica de prolina se usó típicamente en una dilución 1:5000.

El programa de ordenador generó los datos como OD_{405}/min.

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Medida de las actividades de endoproteasas no específicas de prolinas contaminantes

También esta medición se llevó a cabo esencialmente igual a como se describe para el ensayo de aminopeptidasas, pero en este ensayo se usaron como sustrato Z-AAAF-pNA y Z-AAAR-pNA en una relación 1:1 y en una concentración final de 3 mmoles/l. El sustrato Z-AAAF-pNA resultó ser poco soluble en las condiciones de ensayo a pH 6,0 usadas, pero su incubación de ensayo con subtilisina dio como resultado una solubilización rápida del sustrato concomitantemente con la liberación de pNA. Las mediciones se llevaron a cabo a 40ºC. Sin embargo, para compensar esta mala solubilidad, el lector de MTP se programó para una agitación entre los títulos cinéticos.

Nuevamente, el programa de ordenador generó los datos como OD_{405}/min.

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Medida de las actividades de carboxipeptidasas contaminantes

Debido a que no existen péptidos cromógenos sensibles para medir actividades de carboxipeptidasas, se usó un método basado en un protocolo de Boehringer para cuantificar la carboxipeptidasa C.

Se diluyeron 80 veces dos disoluciones madre de 150 mmoles/l en etanol de Z-A-F y Z-A-R en tampón 0,1 moles/l de BisTris pH 6, para obtener una disolución de sustrato de 3,75 mmoles/l de Z-A-F + Z-A-R, que contiene Z-A-F y Z-A-R en una relación 1:1. Después, se pipetearon 200 \mul de la disolución de sustrato en un vial de Eppendorf, y se preincubó a 40ºC. La reacción se inició añadiendo 50 \mul de una dilución enzimática apropiada. Típicamente, se usó una dilución 1:50 de Flavourzyme y Corolase LAP y la endoproteasa específica de prolina. Para Sumizym FR se usó una disolución al 1%. Después de 5 minutos, la reacción se detuvo añadiendo 250 \mul de reactivo de ninhidrina. El reactivo de ninhidrina se obtuvo de 400 mg de ninhidrina (Merck) y 60 mg de hidrindantina, disuelta en 15 ml de DMSO, al que se añadieron 5 ml de 4,0 moles/l de tampón de acetato de litio pH 5,2. El tampón de acetato de litio 4,0 moles/l se obtuvo disolviendo LiOH (Sigma), después de lo cual el pH de la disolución se ajustó hasta pH 5,2 usando ácido acético glacial (Merck).

Después de detener la reacción, cada muestra se calentó durante 15 minutos a 95ºC, para facilitar la formación de color, y subsiguientemente se diluyó 10 veces con etanol puro. El color formado se midió a 578 nm en un espectrofotómetro Uvikon. Los blancos se obtuvieron de la misma manera que las muestras de actividad, pero se invirtieron el reactivo de ninhidrina y la adición de enzima. Para cuantificar la cantidad de aminoácidos libres generados mediante la actividad de carboxipeptidasa, se usó el aminoácido L-fenilalanina para crear una curva de calibración. Disoluciones en tampón pH 6 que contiene 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5 y 3,0 mmoles/l de L-fenilalanina (Sigma) se trataron de la misma manera que las muestras, es decir, 250 \mul en un vial. A partir de los valores OD578 obtenidos, se construyó una curva en Excel. Las concentraciones de los aminoácidos libres presentes en las muestras que contienen los sustratos Z-A-F y Z-A-R se calcularon usando esta curva. A partir de los valores obtenidos, se calculó la actividad de carboxipeptidasa en micromoles por minuto por la cantidad de enzima ensayada.

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Cálculo de las relaciones de actividad

Para establecer la adecuabilidad de las diversas preparaciones enzimáticas para el procedimiento según la invención, se calcularon cocientes de las actividades enzimáticas relevantes. En los ensayos a base del lector de MTP, las actividades enzimáticas se caracterizaron por una liberación de pNA a lo largo del tiempo, es decir, como \DeltaOD_{405}/min. Los cocientes de las actividades enzimáticas obtenidas mediante el lector de MTP se calcularon dividiendo simplemente los valores de \DeltaOD/min. obtenidos entre cantidades idénticas de enzima.

Sin embargo, en el caso del ensayo de carboxipeptidasas, se genera una OD que no se puede comparar directamente con la \DeltaOD/min. generada mediante los ensayos a base de MTP-pNA. Aquí, la OD medida se convirtió primeramente en \mumoles de aminoácido liberado por min. (\mumol/min.). Después, la \DeltaOD/min. de pNA liberado se convirtió en \mumoles/min. Para tal fin, se generó una curva de calibración en el lector de MTP, en el que se midieron diluciones de pNA pura (Sigma) 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312 y 0,015 mmol/l y 250 \mul por pocillo. A partir de los datos obtenidos, se construyó una curva de calibración en Excel. A partir de esta curva de calibración, la \DeltaOD/min. se convirtió en \mumol/min., de forma que las medidas a base de pNA se pudiesen comparar con las medidas a base de ninhidrina.

Basándose en los datos generados en los ensayos mencionados anteriormente, se caracterizaron las diversas preparaciones enzimáticas usadas en términos de actividades específicas de prolina (y alanina) deseables y actividades contaminantes de endoproteasas, aminopeptidasas y carboxipeptidasas. En la Tabla 1, en la columna "Actividad Espec. de Prol", se muestran los datos de las actividades oligo- o endoproteolíticas específicas de prolina presentes en cada preparación enzimática. Los datos de las actividades de aminopeptidasas contaminantes (Act. Espec. de AP/Prol), de las actividades de carboxipeptidasas contaminantes (Act. Espec. de CPD/Prol) y de las actividades endoproteolíticas contaminantes (Act. Expec. Endo/Prol), se muestran con relación a las actividades específicas de prolina presentes. El nivel de la actividad de aminopeptidasa contaminante, con relación a la actividad de carboxipeptidasa contaminante presente en cada preparación, se muestra como (AP/CPD).

Es evidente que ninguna de las preparaciones enzimáticas comerciales ensayadas contiene ninguna actividad oligo- o endoproteolítica específica de prolina significativa. Además, todas las preparaciones enzimáticas comerciales ensayadas contienen actividades endo- o exoproteolíticas contaminantes significativas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Niveles de actividades de endoproteasas (específicas de prolina y alanina) deseadas, con relación a los niveles de actividades endo- y exoproteolíticas contaminantes

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Ejemplo 4

La endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger puede hidrolizar proteínas grandes así como péptidos pequeños, y de este modo es una endoproteasa verdadera.

Debido a un rasgo estructural específico, las proliloligopeptidasas que pertenecen a la familia S9 no pueden digerir péptidos mayores de 30 aminoácidos. Esta limitación es una desventaja obvia para una enzima, que está pensada para hidrolizar tan rápido y tan eficazmente como sea posible diferentes proteínas. Para ver si la endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger muestra las mismas limitaciones con respecto al tamaño de la molécula sustrato, se incubó prolilendoproteasa purificada cromatográficamente, procedente de A. niger, con un pequeño péptido sintético y con la gran molécula de ovoalbúmina, y se analizaron mediante SDS-PAGE los productos de la hidrólisis formados.

El péptido sintético usado fue un 27-mer de la secuencia NH2-FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR-COOH, y fue un obsequio de la compañía Pepscan (Lelystad, Países Bajos). Como se muestra mediante su secuencia de aminoácidos, este péptido contiene 2 restos de prolina, uno en el centro y uno en el extremo lejano del péptido.

La molécula de ovoalbúmina intacta (Pierce Imject, viales que contienen 20 mg de material liofilizado) consiste en 385 aminoácidos, con un peso molecular de 42750 Da. Esta molécula contiene 14 restos de prolina, uno de los cuales está localizado en el extremo C-terminal último de la molécula, y no se puede escindir mediante una endoproteasa específica de prolina.

Se incubaron separadamente a 50ºC ovoalbúmina y el oligopéptido con la endoproteasa específica de prolina, derivada de A. niger, purificada. A varios intervalos de tiempo, se tomaron muestras que se analizaron entonces usando SDS-PAGE.

Se diluyó 100 veces una endoproteasa específica de prolina, derivada de A. niger, cromatográficamente purificada, con una actividad de 4,5 unidades/ml, con tampón 0,1 M de acetato, pH 4, que contiene 20 mM de CaCl2. La ovoalbúmina se disolvió en tampón de acetato pH 4, hasta una concentración de 1 mg(ml (22 \muM). El 27-mer se disolvió en el mismo tampón, para alcanzar una concentración de 0,48 mg/ml (152 \muM). La molaridad de la ovoalbúmina y de la disolución del 27-mer se escogió de forma que ambas disoluciones contuviesen la misma molaridad en restos de prolina escindibles. La ovoalbúmina contiene 13 sitios de escisión de prolina potenciales, mientras que el péptido 27-mer sólo tiene dos. De ambas disoluciones del sustrato, se incubaron 0,5 ml con 10 \mul (0,45 miliU) de la disolución enzimática en un termomezclador Eppendorf, a 50ºC. A varios intervalos de tiempo, se extrajeron muestras de 10 \mul de la mezcla de incubación, y se mantuvieron a 20ºC hasta SDS-PAGE. Todos los materiales usados para SDS-PAGE y la tinción se obtuvieron de Invitrogen. Las muestras se prepararon usando tampón de LDS según las instrucciones del fabricante, y se separaron en geles al 12% de Bis-Tris, usando un sistema de tampón de MES-SDS según las instrucciones del fabricante. La tinción se realizó usando Simply Blue Safe Stain (Collodial Coomassie G250).

Como se puede observar en la Figura 3, la ovoalbúmina fue escindida por la enzima derivada de Aspergillus en una banda discreta de alrededor de 35 a 36 kD en las primeras 4,75 horas de incubación (línea 3). Períodos de incubación prolongados dieron como resultado una ruptura posterior en productos más pequeños, de diversos pesos moleculares (línea 7).

El péptido de 27-mer también se rompió, como se juzga por las bandas más borrosas en las líneas 4, 6 y 8, en comparación con la línea 2. Es muy probable que el desplazamiento muy pequeño del peso molecular del producto (compárense las líneas 9 y 8) sea debido a la escisión del resto de arginina en el extremo carboxílico del péptido. La diferencia es alrededor de 200D (medido usando el programa de ordenador Alphalmager 3.3d en un sistema Alphalmager 2000), y la arginina tiene un MW de 174. Este pequeño desplazamiento del peso molecular es probablemente la primera etapa en la ruptura del péptido.

El decaimiento posterior del producto sólo se puede observar mediante la disminución en la intensidad de la banda en el gel de SDS. Los productos del decaimiento posterior no son visibles, puesto que la tinción en gel de los componentes con un MW de alrededor de 1000 no es posible con azul brillante de Coomasie.

De este experimento se puede concluir que, a diferencia de las proliloligopeptidasas conocidas, que pertenecen a la familia S9, la endoproteasa específica de prolina, derivada de A. niger, no tiene preferencia específica para escindir péptidos de pequeño tamaño con respecto a proteínas mucho más grandes. Como tal, la enzima derivada de A. niger representa una endoproteasa verdadera, y una enzima preferida para hidrolizar diferentes tipos de proteínas. Este hallazgo condujo al uso sorprendente de la enzima, según se ilustra en el siguiente Ejemplo.

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Ejemplo 5

La incubación de caseinato de potasio con la endoproteasa específica de prolina procedente de A. niger produce rápidamente IPP y LPP, pero nada de VPP.

En este experimento, la endoproteasa específica de prolina sobreproducida y esencialmente pura, procedente de A. niger, se incubó con caseinato de potasio para ensayar la liberación de los péptidos IPP, VPP así como LPP, inhibidores de la ACE. La endoproteasa usada fue esencialmente pura, queriendo decir que no había ninguna actividad endoproteolítica significativa distinta de la actividad endoproteolítica inherente a la endoproteasa específica de prolina pura (es decir, escisión carboxiterminal de los restos de prolina y alanina). Además, la preparación enzimática está desprovista de actividades exoproteolíticas significativas, como se describe en el Ejemplo 3.

Para limitar tanto como sea posible la captación de sodio como resultado de la ingestión de los péptidos inhibidores de la ACE, en esta incubación se usó como sustrato caseinato de potasio.

El caseinato se suspendió en agua a 65 grados C, en una concentración de 10% (p/p) de proteína, después de lo cual el pH se ajustó hasta 6,0 usando ácido fosfórico. Después, la suspensión se enfrió hasta 55 grados C, y se añadió la endoproteasa específica de prolina, derivada de A. niger, en una concentración de 4 unidades/gramo de proteína (véase la sección Materiales y Métodos para la definición de unidad). En agitación continua, esta mezcla se incubó durante 24 horas. No se llevaron a cabo durante este período ajuste de pH adicionales. Se tomaron muestras después de 1, 2, 3, 4, 8 y 24 horas de incubación. De cada muestra, se terminó la actividad enzimática mediante calefacción inmediata de la muestra hasta 90 grados C durante 5 minutos. Tras enfriar, el pH de cada muestra se redujo rápidamente hasta 4,5 usando ácido fosfórico, después de lo cual la suspensión se centrifugó durante 5 minutos a 3000 rpm en una centrifugadora de mesa Hereaus. El sobrenadante completamente claro se usó para el análisis de LC/MS/MS, para cuantificar los péptidos VPP, IPP, LPP, VVVPP y VVVPPF en el sobrenadante (véase la sección Materiales y Métodos).

La caseína de leche bovina incorpora un número de diferentes proteínas, incluyendo beta-caseína y kappa-caseína. Según las secuencias de aminoácidos conocidas, la beta-caseína engloba los tripéptidos IPP, VPP y LPP inhibidores de la ACE. En la beta-caseína, IPP está contenido en la secuencia -P_{71}-Q_{72}-N_{73}-I_{74}-P_{75}-P_{76}-, VPP está contenido en la secuencia -P_{81}-V_{82}-V_{83}-V_{84}-P_{85}-P_{86}-, y LPP está contenido en la secuencia -P_{150}-L_{151}-P_{152}-P_{153}-. La kappa-caseína, que está presente en preparaciones de caseinato precipitado con ácido, en una relación molar de casi 50% de la concentración de beta-caseína, engloba sólo IPP. En la kappa-caseína, IPP está contenido en la secuencia -A_{107}-I_{108}-P_{109}-P_{110}-. Los otros constituyentes proteínicos de la caseína no contienen IPP, VPP ni LPP.

Las Tablas 2 y 3 muestran las concentraciones de los péptidos presentes en los sobrenadantes acidificados y centrifugados, según se calculan por gramo de caseinato de potasio añadido a la mezcla de incubación. Como se muestra en la Tabla 2, IPP alcanza su concentración máxima tras 1 hora de incubación. Más allá de eso, la concentración de IPP no aumenta más. La formación del pentapéptido VVVPP muestra la misma cinética que la generación de IPP. Como es de esperar teóricamente, el rendimiento molar de VVVPP es similar al rendimiento molar del péptido LPP. El rendimiento tanto de LPP como de VVVPP alcanza casi el 60% de lo que sería teóricamente factible. El hecho de que la concentración máxima de LPP se alcance sólo después de 3 horas de incubación sugiere que la escisión de esa parte particular de la molécula de beta-caseína es quizás en cierto modo más difícil. Al contrario que con VVVPP, el hexapéptido VVVPPF no se forma en absoluto. Esta observación sugiere que la endoproteasa específica de prolina escinde eficazmente el enlace -P-F, generando de ese modo VVVPP. El tripéptido IPP se forma inmediatamente, pero su rendimiento molar no es más de alrededor de un tercio del rendimiento molar máximo de VVVPP o LPP. Puesto que el tripéptido IPP está contenido tanto en la beta-caseína como en kappa-caseína, este resultado es inesperado. Una posible explicación para esta observación es que la proteasa específica de prolina puede generar IPP, pero sólo a partir del resto de kappa-caseína de los caseinatos. A la vista de la secuencia de aminoácidos relevante de kappa-caseína, esto sugiere que el enlace peptídico -A_{107}-I_{108}- es escindido por la actividad específica de alanina de la enzima. Si es cierto, la cantidad de IPP liberada alcanza aproximadamente 40% de la cantidad que está presente en kappa-caseína, pero no más de alrededor de 10% del IPP que está presente teóricamente en beta más kappa caseína. Este mecanismo de escisión para la liberación de IPP también explica por qué VPP no se puede formar a partir de su molécula precursora VVVPP: la actividad endoproteolítica requerida simplemente no está presente dentro de la preparación enzimática derivada de A. niger usada.

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TABLA 2 Contenidos peptídicos molares de sobrenadantes acidificados, calculados por gramo de proteína añadida

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TABLA 3 Concentraciones peptídicas en sobrenadantes acidificados, calculadas en mg/g de proteína añadida

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Ejemplo 6

La incorporación de una etapa de precipitación ácida de caseína da como resultado una concentración de 5 veces de los péptidos inhibidores de la ACE.

Como se describe en el Ejemplo 5, el caseinato de potasio, en una concentración de proteína al 10% (p/p), se sometió a una incubación con la endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger, a pH 6,0. Después de diversos períodos de incubación, las muestras se calentaron para detener la actividad enzimática posterior, tras lo cual el pH se redujo hasta 4,5 para minimizar la solubilidad de la caseína. No se eliminaron moléculas de caseína solubles mediante una centrifugación a baja velocidad. En las Tablas 2 y 3 se proporcionaron concentraciones de péptidos inhibidores de la ACE, calculadas en base a la concentración de partida de proteína al 10%. Sin embargo, como resultado de la acidificación y de la etapa de centrifugación subsiguiente, una gran proporción de la proteína añadida se había eliminado. Para tener en cuenta estos contenidos reducidos de proteína de los sobrenadantes acidificados, se llevaron a cabo análisis de nitrógeno (Kjeldahl). Según estos últimos datos, se encontró que los diversos sobrenadantes contenían los niveles de proteína mostrados en la Tabla 4.

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TABLA 4 Contenidos proteínicos de sobrenadantes acidificados

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Teniendo en cuenta estos datos, se recalculó la concentración de los péptidos inhibidores de la ACE presentes en cada sobrenadante, pero esta vez usando sus contenidos proteínicos reales. En la Tabla 5 se muestran estos datos recalculados.

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TABLA 5 Concentraciones peptídicas en sobrenadantes acidificados, calculadas por gramo de proteína presente

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La comparación de los datos presentados en las Tablas 3 y 5 muestra claramente que la etapa de acidificación simple, seguida de una etapa de decantación, filtración o centrifugación a baja velocidad, industrialmente viable, da como resultado un incremento de 5 veces en la concentración de los péptidos inhibidores de la ACE específicos.

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Ejemplo 7 Identificación de los nuevos y potentes tripéptidos MAP e ITP, inhibidores de la ACE, en hidrolizados de caseína concentrados

Para facilitar un análisis más a conciencia de los péptidos bioactivos presentes, se preparó a escala preparativa el hidrolizado de caseína obtenido mediante la digestión con endoproteasa específica de prolina derivada de A. niger pura, y purificada mediante precipitación ácida. Para tal fin, se suspendieron 3000 gramos de caseinato de potasio en 25 litros de agua de 75 grados C. Tras una homogeneización a conciencia, el pH se ajustó lentamente hasta 6,0 usando ácido fosfórico diluido. Tras enfriar hasta 55 grados C, se añadieron las endoproteasas específicas de prolina derivadas de A. niger, en una concentración de 4 unidades enzimáticas/gramo de caseinato (véase la sección Materiales y Métodos para la definición de unidad). Tras una incubación (con agitación) durante 3 horas a 55 grados C, el pH se redujo hasta 4,5 añadiendo lentamente ácido fosfórico concentrado. En esta preparación a mayor escala, se omitió la etapa del tratamiento térmico para inactivar la endoproteasa específica de prolina en esta parte del proceso. Después, la suspensión se enfrió rápidamente hasta 4 grados C, y se mantuvo toda la noche (sin agitación) a esta temperatura. A la mañana siguiente, la capa superior clara se decantó y se evaporó, para alcanzar un nivel de 40% de materia seca. Este último líquido concentrado se sometió a un tratamiento de UHT de 4 segundos a 140 grados C, y después se ultrafiltró a 50 grados C. Tras la filtración de los gérmenes, el líquido se secó por pulverización. Este material se denomina en lo sucesivo como péptidos bioactivos derivados de caseína (CDBAP). Usando los procedimientos de LC/MS esquematizados en la sección de Materiales y Métodos, se determinó el contenido de IPP, LPP y VPP del producto en polvo. Según su contenido de nitrógeno, el producto en polvo tiene un contenido proteínico de alrededor de 60% (usando un factor de conversión de 6,38). Los contenidos de IPP, LPP y VPP del polvo se proporcionan en la Tabla 6. En la Tabla 7 se proporciona la composición de aminoácidos del producto de CDBAP. Bastante notable es el incremento del contenido molar de prolina del material secado por pulverización obtenido tras la precipitación ácida: desde un 12% inicial hasta aproximadamente 24%.

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TABLA 6 Contenido de IPP, LPP y VPP de CDBAP

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TABLA 7 Composición de aminoácidos del material de partida de caseinato potásico y de CDBAP (contenidos de aminoácidos tras la hidrólisis ácida y mostrados como porcentajes del contenido molar de aminoácidos)

8

La presencia de nuevos péptidos inhibidores de la ACE en CDBAP se investigó usando separación cromatográfica bidimensional, combinada con un ensayo de inhibición de ACE en línea, y espectrometría de masas para la identificación. En el primer análisis, la mezcla peptídica se separó en una columna de cromatografía de líquidos (LC) ODS3, y se generaron perfiles de inhibición de la ACE a partir de las diversas fracciones obtenidas. En un segundo análisis, las fracciones procedentes de la primera columna, que muestran una inhibición elevada de la ACE, se separaron adicionalmente en una columna Biosuite LC, usando un perfil de gradiente diferente. Las fracciones recogidas a partir de esta segunda columna se dividieron en dos partes: una parte se usó para la medida de la inhibición de la ACE en línea, mientras que la otra parte se sometió a análisis de MS y MS-MS, para identificar los péptidos presentes.

Todos los análisis se realizaron usando un sistema de HPLC Alliance 2795 (Waters, Etten-Leur, Países Bajos), equipado con un detector de UV de traza dual. Para la identificación de los péptidos, el sistema de HPLC se acopló a un espectrómetro de masas Q-TOF del mismo proveedor. En los ensayos, se inyectaron 20 \mul de una disolución al 10% (p/v) de CDBAP en agua Milli-Q en una columna 150 x 2,1 Inertsil 5 ODS3, con un tamaño de partículas de 5 \mum (Varian, Middelburg, Países Bajos). La fase móvil A consistió en una disolución al 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), en agua Milli-Q. La fase móvil B consistió en una disolución al 0,1% de TFA en acetonitrilo. La composición del eluyente inicial fue 100% de A. El eluyente se mantuvo a 100% de A durante 5 minutos. Después, comenzó un gradiente lineal en 10 minutos hasta 5% de B, seguido de un gradiente lineal de 10 minutos hasta 30% de B. La columna se enjuagó aclarando la concentración de B hasta 70% en 5 minutos, y se mantuvo a 70% de B durante otros 5 minutos. Después de esto, el eluyente se cambió a 100% de A en 1 minuto, y se equilibró durante 9 minutos. El tiempo total del experimento fue 50 minutos. El caudal del efluente fue 0,2 ml min^{-1}, y la temperatura de la columna se ajustó a 60ºC. Se registró un cromatograma de UV a 215 nm. Las fracciones del eluyente se recogieron en una placa de 96 pocillos, usando un tiempo de intervalo de 1 minuto, dando como resultado volúmenes de fracción de 200 \mul. El efluente en los pocillos se neutralizó añadiendo 80 \mul de una disolución al 0,05% de hidróxido amónico acuoso (25%). El disolvente se evaporó hasta sequedad en nitrógeno, a 50ºC. Después de esto, el residuo se reconstituyó en 40 \mul de agua Milli-Q, y se mezcló durante 1 minuto.

Para el ensayo de inhibición de la ACE en línea, se añadieron 27 \mul de una ACE de 33,4 mU ml^{-1} (enzima obtenida de Sigma Chemicals) en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, con una concentración de cloruro de 260 mM, y la mezcla se dejó incubar durante 5 minutos en una mezcladora de placa de 96 pocillos, a 700 rpm. Después del período de incubación, se añadieron 13 \mul de una disolución 0,35 mM de ácido hipúrico-histidina-leucina (HHL) en tampón de PBS, y se mezcló durante 1 minuto a 700 rpm. La mezcla se dejó reaccionar durante 60 minutos a 50ºC en un horno de GC. Después de la reacción, la placa se enfrió en hielo fundente.

La placa de 96 pocillos se analizó entonces en una columna de HPLC ultrarrápida. De la mezcla de reacción de cada pocillo, se inyectaron 30 \mul en una columna de HPLC Chromlith Flash RP18e 25 x 4,6 mm (Merck, Darmstadt, Alemania), equipada con una columna de guarda de 10 x 4,6 mm RP18e del mismo proveedor. La fase móvil isocrática consistió en una disolución al 0,1% de TFA en agua/acetonitrilo 79/21. El caudal del eluyente fue 2 ml min^{-1}, y la temperatura de la columna fue 25ºC. Las inyecciones se llevaron a cabo con un intervalo de tiempo de 1 minuto. El ácido hipúrico (H) y HHL se monitorizaron a 280 nm. Se midieron las alturas de los picos de H y HHL, y se calculó la inhibición de la ACE (ACEI) de cada fracción según la ecuación:

100

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ACEI\alpha

Porcentaje de inhibición del analito

DC_{w}

Grado de escisión mediante ACE de HHL en H y HL en agua

DC_{a}

Grado de escisión de HHL en H y HL para el analito

\vskip1.000000\baselineskip

El grado de escisión se calculó expresando la altura del pico de H como una fracción de la suma de las alturas de los picos de H y HHL.

La mayor inhibición de la ACE se midió en las fracciones que eluyen entre 18 y 26 minutos. Esta región se recogió y se reinyectó en una columna 150 x 2,1 mm Biosuite, con un tamaño de partículas de 3 \mum (Waters, Etten-Leur, Países Bajos). La fase móvil A aquí consistió en una disolución al 0,1% de ácido fórmico (FA) en agua Milli-Q. La fase móvil B consistió en una disolución al 0,1% de FA en metanol. La composición del eluyente inicial fue 100% de A. El eluyente se mantuvo a 100% de A durante 5 minutos. Después de esto, se inició un gradiente lineal en 15 minutos hasta 5% de B, seguido de un gradiente lineal en 30 minutos hasta 60% de B. El eluyente se mantuvo a 60% de B durante otros 5 minutos. Finalmente, el eluyente se redujo hasta 100% de la fase móvil A en 1 minuto, y se equilibró durante 10 minutos. El tiempo total del experimento fue 65 minutos. El caudal del eluyente fue 0,2 ml min^{-1}, y la temperatura de la columna se ajustó a 60ºC. La traza de UV se registró a 215 nm. Las fracciones se recogieron de la columna Biosuite, a intervalos de tiempo de 10 segundos. Las fracciones se dividieron nuevamente en dos partes, una parte se usó para medir la actividad usando el método de inhibición de la ACE en línea descrito anteriormente, mientras que la otra parte se usó para identificar los péptidos activos usando MS y MS-MS.

Dos picos cromatográficos con iones moleculares de 326,2080 Da y otros dos picos con iones moleculares de 330,2029 Da y 318,1488 Da se correspondieron con el incremento de la inhibición de la ACE, medida en el área entre 18 y 26 minutos. Usando MS-MS, se identificaron estos péptidos como los isómeros estructurales IPP y LPP (-0,6 ppm), ITP (-4,8 ppm) y MAP (+2,8 ppm), respectivamente. Las fuentes proteínicas de los péptidos son kappa-caseína f108-110 (IPP), \beta-caseína f151-153 (LPP), \alpha-s2-caseína f119-121 (ITP) y \beta-caseína f102-104 (MAP). IPP y LPP se dieron a conocer desde hace tiempo como péptidos inhibidores de la ACE, con valores de IC_{50} de 5 y 9,6 \muM, respectivamente (Y. Nakamura, M. Yamamoto, K. Sakai., A. Okubo., S. Yamazaki, T. Takano, J. Dairy Sci. 78 (1995) 777-783; Y. Aryoshi, Trends in Food Science and Technol. 4 (1993) 139-144). Sin embargo, los tripéptidos ITP y MAP nunca se habían dado a conocer, según nuestro conocimiento, como potentes péptidos inhibidores de la
ACE.

MAP, ITP e IPP se sintetizaron químicamente, y la actividad de cada péptido se midió usando un ensayo de Matsui modificado descrito más adelante.

\newpage

La cuantificación de MAP e ITP en las diversas muestras se realizó en un instrumento Micromass Quattro II MS, operado en el modo de monitorización de reacción múltiple, con electropulverización positiva. El método de HPLC usado fue similar al descrito anteriormente. Los ajustes de MS (ESI+) fueron los siguientes: voltaje del cono 37 V, voltaje del capilar 4 kV, nitrógeno gaseoso secante a 300 l/h. Temperatura de la fuente y del nebulizador: 100ºC y 250ºC, respectivamente. Los péptidos sintetizados se usaron para preparar una línea de calibración usando el ion precursor 318,1 y los iones 227,2 y 347,2 del producto sumados, para MAP, y usando el ion precursor 320,2 y los iones 282,2 y 501,2 del producto sumados, para ITP. Según estos análisis, los nuevos tripéptidos MAP e ITP inhibidores de la ACE están presentes en el producto de CDBAP, en cantidades que corresponden a 2,9 mg de MAP/gramo de CDBAP, o 4,8 mg de MAP/gramo de proteína en CDBAP, y 0,9 mg de ITP/gramo de CDBAP en 1,4 mg de ITP/gramo de proteína en CDBAP.

Para determinar la actividad inhibidora de la ACE de MAP e ITP, los tripéptidos sintetizados químicamente se evaluaron según el método de Matsui et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56:517-518), con algunas modificaciones minoritarias. En la Tabla 8 se muestran las diversas incubaciones.

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TABLA 8 Procedimiento para el ensayo de inhibición de la ACE de Matsui. Los componentes se añadieron en un tubo de 1,5 ml, con un volumen final de 120 \mul

9

Cada una de las cuatro muestras contenía 75 \mul de hipurilhistidinleucina 3 mM (Hip-His-Leu, Sigma Chemicals) disuelto en una disolución 250 mM de borato que contiene 200 mM de NaCl, pH 8,3. La ACE se obtuvo de Sigma Chemicals. Las mezclas se incubaron a 37ºC, y se detuvieron después de 30 minutos añadiendo 125 \mul de HCl 0,5 M. Subsiguientemente, se añadieron 225 \mul de disolución de bicina/NaOH (1 M de NaOH:0,25 M de bicina (4:6)), seguido de 25 \mul de TNBS 0,1 M (ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico, Fluka, Suiza; en Na_{2}HPO_{4} 0,1 M). Tras la incubación durante 20 minutos a 37ºC, se añadieron 4 ml de Na_{2}SO_{3} 4 mM en NaH_{2}PO_{4} 0,2 M, y se midió la absorbancia de la luz a 416 nm con un espectrofotómetro UV/Vis (Shimadzu UV-1601 con un controlador de CPS, Países Bajos). La cantidad de actividad de inhibición de la ACE (ACEI) se calculó como un porcentaje de la inhibición, comparada con la velocidad de conversión de ACE en ausencia de un inhibidor, según la siguiente fórmula:

ACEI (%) = ((Control 1 - Control 2) - (Muestra 1 - Muestra 2)) / (Control 1 - Control 2))*100

en la que

Control 1 =

Absorbancia sin componente inhibidora de ACE (= actividad máx. de ACE) [AU].

Control 2 =

Absorbancia sin componente inhibidora de ACE, y sin ACE (fondo) [AU].

Muestra 1 =

Absorbancia en presencia de ACE y de la componente inhibidora de ACE [AU].

Muestra 2 =

Absorbancia en presencia de la componente inhibidora de ACE, pero sin ACE [AU].

En la Tabla 9 se muestran las IC_{50} de los tripéptidos MAP e ITP químicamente sintetizados según se obtienen, junto con los valores de IC_{50} obtenidos en las mediciones en línea usadas en la fase de identificación del experimento. Se incluye, como referencia interna para las diversas medidas, la medida de IPP sintetizado química.

TABLA 9 Inhibición de la ACE (valores de IC_{50}) de valores de MAP, ITP e IPP determinados mediante el ensayo de ACE en línea y el ensayo de Matsui modificado

10

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Ejemplo 8 Es probable que los nuevos péptidos MAP e ITP inhibidores de la ACE sobrevivan en el tubo digestivo humano

Tras el consumo, las proteínas y péptidos dietéticos se exponen a diversos procesos enzimáticos digestivos en el tubo digestivo. A fin de evaluar la estabilidad en el tubo digestivo humano de los péptidos bioactivos recientemente identificados, la preparación de CDBAP (preparada como se describe en el Ejemplo 7) se sometió a un tratamiento gastrointestinal (GIT) que simula las condiciones digestivas encontradas típicamente en el cuerpo humano. Las muestras obtenidas tras diversos tiempos de incubación en el sistema de modelo de GIT se analizaron usando el sistema HPLC-bioensayo-MS o HRS-MS en línea, para cuantificar cualquier péptido MAP e ITP residual. El crecimiento de GIT se realizó en un dispositivo de mezclamiento estándar, que incorpora un matraz de 100 ml (suministrado por Vankel, US). La temperatura del agua del baño se ajustó a 37,5ºC, y la velocidad de la pala se escogió de forma que la muestra se mantuvo en suspensión (100 rpm).

Se disolvieron/suspendieron alrededor de 3,4 gramos de CDBAP (nivel proteínico de aproximadamente 60%) en 100 ml de agua Milli-Q. Durante la simulación gástrica, se usó HCl 5 M para disminuir el pH. Al final de la simulación gástrica, y durante la fase duodenal, se usó NaOH 5 M para elevar el pH.

La suspensión de CDBAP se precalentó hasta 37,5ºC, y se retiraron 5 ml de la suspensión para disolver 0,31 g de pepsina (Fluka, nº de orden 77161). A t = 0 min., los 5 ml con la pepsina ahora disuelta se añadieron nuevamente a la suspensión. Después, el pH de la suspensión de CDBAP se ajustó lentamente a mano usando un pH-metro separado, según el siguiente esquema:

t = 20 min.

pH disminuyó hasta 3,5

t = 40 min.

pH hasta 3,0

t = 50 min.

pH hasta 2,3

t = 60 min.

pH hasta 1,8

t = 65 min.

pH se elevó hasta 2,7

t = 75 min.

pH hasta 3,7

t = 80 min.

pH hasta 5,3

A t = 90 min., se mezclaron cuidadosamente 0,139 g de 8 veces de pancreatina USP (Sigma, nº de orden P7545) en otros 5 ml de la suspensión de CDBAP, y se añadieron de nuevo inmediatamente. La incubación continuó según el siguiente esquema:

t = 93 min.

pH hasta 5,5

t = 95 min.

pH hasta 6,3

t = 100 min.

pH hasta 7,1

El experimento se detuvo a t = 125 min., y se comprobó el pH (aún era pH 7).

Después, las muestras se transfirieron a un vaso de precipitados, y se colocaron en un microondas hasta ebullición. Subsiguientemente, las muestras se transfirieron a tubos de vidrio, y se incubaron a 95ºC durante 60 minutos, para inactivar toda actividad de proteasa. Tras enfriar, las muestras se colocaron en tubos de Falcon, y se centrifugaron durante 10 minutos a 3000 x g. El sobrenadante se liofilizó. La concentración total N del polvo según se obtiene se determinó y se convirtió en nivel de proteína usando el factor de Kjeldahl de caseína (6,38). Según estos datos, el nivel de proteína de la preparación de CDBAP tras el procedimiento de GIT fue 48,4%. Los niveles de MAP e ITP que sobreviven al tratamiento proteolítico según el procedimiento de GIT se determinaron como se describe en el Ejemplo 7, y los datos obtenidos se muestran en la Tabla 10.

Según los resultados del experimento, tanto MAP como ITP muestran una elevada resistencia frente a la digestión del GIT. En combinación con los bajos valores de IC_{50} para estos tripéptidos (también como se determinan en el Ejemplo 7), los datos sugieren un potencial considerable para los dos nuevos péptidos inhibidores de la ACE como péptidos reductores de la tensión arterial.

TABLA 10 Concentraciones de MAP e ITP antes y después de hacerlos pasar a través de un tubo digestivo humano simulado (procedimiento de GIT)

12

Claims (7)

1. El el tripéptido ITP y/o una sal de MAP y/o una sal de ITP.

2. Un hidrolizado proteínico que comprende MAP y/o ITP, o una sal de MAP y/o una sal de ITP, que tiene un grado de hidrólisis (DH) de 5 a 50%, Preferiblemente 10 a 40%, más preferiblemente un DH de 20 a 35%.

3. Una mezcla peptídica que comprende MAP y/o ITP, o una sal de MAP y/o una sal de ITP, y que comprende

\quad

al menos 1 mg de MAP/gramo de proteína, preferiblemente

\quad

al menos 2 mg de MAP/gramo de proteína, más preferiblemente

\quad

al menos 4 mg de MAP/gramo de proteína.

4. Una mezcla peptídica según la reivindicación 3, mediante la cual la cantidad de péptidos que tienen un MW de menos de 500 Da es al menos 30% en peso (materia seca) de la mezcla peptídica, preferiblemente entre 35 y 70% en peso (materia seca) de la mezcla peptídica.

5. Una mezcla peptídica según la reivindicación 3 ó 4, o un hidrolizado proteínico según la reivindicación 2, que comprende además IPP o LPP.

6. Una mezcla peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o un hidrolizado proteínico según la reivindicación 2, que comprende 1 a 90% de agua, preferiblemente 1 a 30% de agua, más preferiblemente 1 a 15% de agua.

7. Un método para producir el tripéptido MAP y/o ITP y/o una sal de los mismos, que comprende la hidrólisis enzimática de una proteína, y opcionalmente convertir MAP y/o ITP en su sal, que comprende el uso de una proteasa específica de prolina, para hidrolizar una proteína adecuada.